KR102556991B1 - 액티빈-ActRII 길항제 및 빈혈 치료를 위한 용도 - Google Patents

액티빈-ActRII 길항제 및 빈혈 치료를 위한 용도 Download PDF

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케네스 엠. 아티에
크리스토퍼 로발디
아브데라만 라아뎀
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셀진 코포레이션
악셀레론 파마 인코포레이티드
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Abstract

본원에는 임의의 포유동물의 빈혈, RBC 수혈이 필요한 빈혈, 낮은 또는 중간-1-위험 골수이형성 증후군(MDS), 및/또는 비-증식성 만성 골수단핵구 백혈병(CMML)의 대상체의 치료를 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 액티빈- ActRII 신호전달 억제제를 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

Description

액티빈-ActRII 길항제 및 빈혈 치료를 위한 용도 {Activin-ActRII Antagonists and Uses for Treating Anemia}
1. 연관 출원에 대한 상호 참조
본 발명은 2014년 12월 3일에 출원된 미국 특허출원 제62/086,977호의 우선권의 이익을 주장한다. 또한, 본 발명은 2014년 12월 5일에 출원된 미국 특허출원 제62/088,478호; 2015년 4월 28일에 출원된 미국 특허출원 제62/153,872호; 2015년 6월 10일에 출원된 미국 특허출원 제62/173,782호; 2015년 9월 15일에 출원된 미국 특허출원 제62/218,728호의 우선권의 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용 전체가 본 명세서에 참고로서, 모든 목적을 위해 포함된다.
2. 서열 목록
본 출원은 2015년 11월 19일 제작된 93,638 바이트 크기의 파일명 "12827_978_228_Sequence_Listing.txt"로 제출된 서열 목록의 컴퓨터 가독 형태(CRF) 본(copy)과 함께 제출되었으며, 이는 서열 목록의 서류본과 동일하고, 그 내용 전체가 참고로서, 모든 목적을 위해 본 명세서에 포함된다.
3. 분야
본원에는 (i) 빈혈; (ii) RBC 수혈이 필요한 빈혈; (iii) 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome)(MDS); 및/또는 (iv) 비-증식성 만성 골수단핵구 백혈병(chronic myelomonocytic leukemia)(CMML)에 걸린 대상체의 장기 치료를 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 장기 치료가 필요한 대상체에게 액티빈-ActRII 신호전달 억제제(signaling inhibitor)를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 액티빈-ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달의 신호전달 억제제일 수 있다. 본원에는 (i) 빈혈; (ii) 적혈구(RBC) 수혈이 필요한 빈혈; (iii) MDS; 및/또는 (iv) 비-증식성 CMML에 걸린 대상체의 장기 치료 방법이 제공되며, 상기 환자는 고리 철적혈모구(ring sideroblast)를 갖는다.
2. 배경
빈혈은 적혈구 수의 감소 또는 혈액의 헤모글로빈의 정상 수량 미만이다. 또한, 빈혈은 헤모글로빈의 산소결합능 감소에 의해 야기될 수 있다. 빈혈은 혈액의 가장 일반적인 장애이다. 빈혈은 비효율적인 적혈구 생성(erythropoiesis)에 의해 야기될 수 있다. 비효율적인 적혈구 생성은 적혈구 생성이 활발하게 일어나지만 성숙한 적혈구가 적절한 비율(ratio)로 성장하지 못하는 경우에 존재한다. 전구세포는 성숙한 적혈구 단계에 도달하기 이전에 아포프토시스(apoptosis)를 겪는다. MDS는 비효율적인 조혈작용(hematopoiesis)이 특징인 조혈모세포 장애를 포함한다. 또한, MDS 장애는 고리 철적혈모구가 특징인 장애를 포함한다. 고리 철적혈모구는 비정상적인 적혈모구(erythroblast)이다. 또한, MDS와 연관된 특정 체세포 돌연변이가 고리 철적혈모구 형성 및 비효율적인 적혈구 생성을 야기한다. 스플라이싱(splicing) 인자 3B1(SF3B1)의 우성 돌연변이는 고리 철적혈모구의 형성과 연관되어 있다. 고리 철적혈모구는 핵 원주의 적어도 3분의 1을 차지하는 5개의 철-함유(철침착증의(siderotic)) 과립이 최소로 존재하는 적혈모구이다. 예를 들어, Mufti et al., 2008, Haematologica, 93(11): 1712-7을 참조한다. 고리 철적혈모구는 철-로딩된 미토콘드리아를 함유한다. 고리 철적혈모구의 존재는 프러시안 블루 염색 또는 가시화에 의해 검출될 수 있다. 고리 철적혈모구는 말초혈액 및/또는 골수 도말표본(bone marrow smear)에서 검출될 수 있다.
2개의 관련 II형 수용체인 ActRIIA 및 ActRIIB는 액티빈에 대한 II형 수용체로 확인되었다(Mathews and Vale, 1991, Cell 65:973-982; Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108). 액티빈 이외에, ActRIIA 및 ActRIIB는 BMP7, Nodal, GDF8, 및 GDF11을 비롯한, 여러 다른 TGF-베타 패밀리(family) 단백질과 생화학적으로 상호작용할 수 있다(Yamashita et al., 1995,1. Cell Biol. 130:217-226; Lee and McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311; Yeo and Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-957; Oh et al., 2002, Genes Dev. 16:2749-54). ALK4는 액티빈에 대해, 특히 액티빈 A에 대해 주요한 I형 수용체이고, ALK-7은 액티빈에 대한, 특히 액티빈 B에 대한 수용체로서 작용할 수 있다.
액티빈 수용체 IIA형(ActRIIA)의 세포외 도메인(extracellular domain)(ECD) 및 인간 IgG1 Fc 도메인으로 이루어진 인간화 융합 단백질은 내생성(endogenous) ActRIIA-수용체를 통해 신호전달을 차단하는 액티빈-A에 높은 친화성으로 결합한다. 액티빈-A는 RBC-성숙의 후기 단계에 영향을 미치는 적혈구-분화(differentiation)-인자이다(Murata M, Onomichi K, Eto Y, Shibai H, and Muramatsu M. Expression of erythroid differentiation factor in Chinese hamster ovary cells. Biochem Biophys Res Commun 1988; 151: 230-5.). ActRII 신호전달 억제제는 RBC 수준을 증가시키기 위해 기술되어 왔다(예를 들어, 특허출원 공개번호 제20110038831호; 제20100204092호; 제20100068215호; 제20100028332호; 제20100028331호; 및 제20090163417호).
5. 요약
본원에는 (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율(percentage)을 결정하는 단계; 및 (b) 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%가 고리 철적혈모구인 경우, 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈액-관련 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 빈혈, 골수이형성 증후군(MDS), 또는 비-증식성 만성 골수단핵구 백혈병(CMML)이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율은 제1 시점에서 결정된다. 특정 실시양태에서, 제1 시점은 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여한지 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월 이내이다.
본원에는 (i) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율과 비교해, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율의 장기 감소; 및/또는 (ii) 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 헤모글로빈 수준과 비교해, 대상체에서 헤모글로빈 수준의 장기 증가를 달성하기 위한 기간 동안 약제학적 유효량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈액-관련 장애를 치료하는 방법이 제공되고, 상기 약제학적 유효량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이며, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율은 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%이다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 빈혈, MDS, 또는 비-증식성 CMML이다. 본원에는 (i) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율과 비교해, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율의 장기 감소; 및/또는 (ii) 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 헤모글로빈 수준과 비교해, 대상체에서 헤모글로빈 수준의 장기 증가를 달성하기 위한 기간 동안 약제학적 유효량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 빈혈을 치료하는 방법이 제공되고, 상기 약제학적 유효량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이며, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율은 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RBC 수혈이 필요한 대상체이다. 본원에는 (i) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율과 비교해, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율의 장기 감소; 및/또는 (ii) 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 헤모글로빈 수준과 비교해, 대상체에서 헤모글로빈 수준의 장기 증가를 달성하기 위한 기간 동안 약제학적 유효량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 MDS를 치료하는 방법이 제공되고, 상기 약제학적 유효량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이며, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율은 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%이다. 본원에는 (i) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율과 비교해, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율의 장기 감소; 및/또는 (ii) 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 헤모글로빈 수준과 비교해, 대상체에서 헤모글로빈 수준의 장기 증가를 달성하기 위한 기간 동안 약제학적 유효량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 비-증식성 CMML을 치료하는 방법이 제공되고, 상기 약제학적 유효량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이며, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율은 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%이다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제 투여 기간은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개월이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율의 장기 감소는 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 유지된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율의 장기 감소는 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후에 적어도 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율의 적어도 1.5, 2.5, 5.0, 7.5, 또는 10.0배 미만이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 초기 헤모글로빈 수준은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 헤모글로빈 수준이다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체에서 초기 헤모글로빈 수준은 약 11 g/dL 미만이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 헤모글로빈 수준의 장기 증가는 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 유지된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 헤모글로빈 수준의 장기 증가는 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 대상체에서 약 11 g/dL 내지 18 g/dL 사이의 헤모글로빈 수준이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 적혈구 수혈이 필요하지 않다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 3주에 1회씩 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 (i) 28일에 1회씩; 또는 (ii) 42일에 1회씩 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 주사를 통해 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 피하 투여된다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간의 6, 12, 18, 및/또는 24개월 이후에 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 추가 백분율을 결정하는 단계를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율은 프러시안 블루 염색에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간의 6, 12, 18, 및/또는 24개월 이후에 대상체에서 추가 헤모글로빈 수준을 결정하는 단계를 더 포함한다.
또한, 본원에는 대상체에서 혈액-관련 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제1 백분율을 결정하는 단계; 및 (b)(i) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제1 백분율이 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%인 경우, 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 단기간 동안 대상체에게 투여하는 단계, 또는 (ii) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 10% 미만인 경우, 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 장기간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 살시양태에서, 혈액-관련 장애는 빈혈, 수혈이 필요한 빈혈, MDS, 또는 비-증식성 CMML이다. 또한, 본원에는 대상체에서 빈혈을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제1 백분율을 결정하는 단계; 및 (b)(i) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제1 백분율이 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%인 경우, 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 단기간 동안 대상체에게 투여하는 단계, 또는 (ii) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 10% 미만인 경우, 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 장기간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 수혈이 필요한 대상체이다. 또한, 본원에는 대상체에서 MDS를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제1 백분율을 결정하는 단계; 및 (b)(i) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제1 백분율이 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%인 경우, 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 단기간 동안 대상체에게 투여하는 단계, 또는 (ii) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 10% 미만인 경우, 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 장기간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 본원에는 대상체에서 비-증식성 CMML을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제1 백분율을 결정하는 단계; 및 (b)(i) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제1 백분율이 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%인 경우, 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 단기간 동안 대상체에게 투여하는 단계, 또는 (ii) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 10% 미만인 경우, 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 장기간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 단기간 동안 ActRII 신호전달 억제제가 투여된 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제1 백분율은 단기간의 ActRII 신호전달 억제제 투여 이후에 적어도 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 1% 미만으로 감소된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 헤모글로빈 수준은 약 11 g/dL 미만이다. 특정 실시양태에서, 단기간 동안 ActRII 신호전달 억제제가 투여된 대상체에서 헤모글로빈 수준은 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간의 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 이후에 약 11 g/dL 내지 18 g/dL 사이이다. 특정 실시양태에서, 단기간은 1, 2, 3, 4, 또는 5개월이다. 특정 실시양태에서, 장기간은 적어도 6, 12, 18, 또는 24개월이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 적혈구 수혈이 필요하지 않다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 3주에 1회씩 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 (i) 28일에 1회씩; 또는 (ii) 42일에 1회씩 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 주사를 통해 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 피하 투여된다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간의 6, 12, 18, 및/또는 24개월 이후에 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제2 백분율을 결정하는 단계를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율은 프러시안 블루 염색에 의해 결정된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간의 6, 12, 18, 및/또는 24개월 이후에 대상체에서 헤모글로빈 수준을 결정하는 단계를 더 포함한다.
또한, 본원에는 대상체에서 혈액-관련 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 적어도 20%인 것을 결정하는 단계; (b) 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계; (c) 일정 기간 이후에 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제2 백분율을 결정하는 단계; 및 (d) 임의로, 조절된 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 빈혈, 수혈이 필요한 빈혈, MDS, 또는 비-증식성 CMML이다. 또한, 본원에는 대상체에서 빈혈을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 적어도 20%인 것을 결정하는 단계; (b) 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계; (c) 일정 기간 이후에 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제2 백분율을 결정하는 단계; 및 (d) 임의로, 조절된 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 수혈이 필요한 대상체이다. 또한, 본원에는 대상체에서 MDS를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 적어도 20%인 것을 결정하는 단계; (b) 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계; (c) 일정 기간 이후에 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제2 백분율을 결정하는 단계; 및 (d) 임의로, 조절된 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 본원에는 대상체에서 비-증식성 만성 골수단핵구 백혈병(CMML)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 적어도 20%인 것을 결정하는 단계; (b) 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계; (c) 일정 기간 이후에 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제2 백분율을 결정하는 단계; 및 (d) 임의로, 조절된 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 일정 기간은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 초기 용량은 주사를 통해 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 용량은 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 용량은 3주에 1회씩 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 용량은 (i) 28일에 1회씩; 또는 (ii) 42일에 1회씩 투여된다.
특정 실시양태에서, 초기 용량은 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제1 백분율의 결정 직후 또는 이의 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 12개월 이내에 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 조절된 용량은 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제2 백분율의 결정 직후 또는 이의 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 12개월 이내에 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 고리 철적혈모구인 대상의 적혈모구의 제2 백분율이 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%인 경우, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 초기 용량에 비해 크다. 특정 실시양태에서, 조절된 용량은 초기 용량에 비해 약 0.05 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.15 mg/kg, 약 0.25 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.35 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 또는 약 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.33 mg/kg, 1.5 mg/kg, 또는 약 1.75 mg/kg 크다. 특정 실시양태에서, 조절된 용량은 초기 용량에 비해 더 자주 투여된다. 특정 실시양태에서, 조절된 용량은 5, 10, 15, 20, 25, 28, 30, 35, 또는 40일 마다 투여된다. 특정 실시양태에서, 조절된 용량은 주사를 통해 투여된다. 특정 실시양태에서, 조절된 용량은 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제2 백분율이 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 1% 미만인 경우, 조절된 용량은 대상체에게 투여되지 않는다. 특정 실시양태에서, 조절된 용량은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 동안 투여된다.
특정 실시양태에서, 대상체는 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 적혈구 수혈이 필요하지 않다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 3주에 1회씩 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 (i) 28일에 1회씩; 또는 (ii) 42일에 1회씩 투여된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율은 프러시안 블루 염색에 의해 결정된다.
또한, 본원에는 대상체에서 혈액-관련 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율을 결정하는 단계; (b) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 적어도 20%인 경우, 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계; (c) ActRII 신호전달 억제제가 대상체에게 투여된 이후에 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 결정하는 단계; 및 (d) 대상체에서 헤모글로빈의 수준이 적어도 11 g/dL인 경우, 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 투여를 중단시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 빈혈, 수혈이 필요한 빈혈, MDS, 또는 비-증식성 CMML이다. 또한, 본원에는 대상체에서 빈혈을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율을 결정하는 단계; (b) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 적어도 20%인 경우, 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계; (c) ActRII 신호전달 억제제가 대상체에게 투여된 이후에 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 결정하는 단계; 및 (d) 대상체에서 헤모글로빈의 수준이 적어도 11 g/dL인 경우, 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 투여를 중단시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RBC 수혈이 필요하다. 또한, 본원에는 대상체에서 MDS를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율을 결정하는 단계; (b) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 적어도 20%인 경우, 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계; (c) ActRII 신호전달 억제제가 대상체에게 투여된 이후에 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 결정하는 단계; 및 (d) 대상체에서 헤모글로빈의 수준이 적어도 11 g/dL인 경우, 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 투여를 중단시키는 단계를 포함한다. 또한, 본원에는 대상체에서 비-증식성 CMML을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율을 결정하는 단계; (b) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 적어도 20%인 경우, 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계; (c) ActRII 신호전달 억제제가 대상체에게 투여된 이후에 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 결정하는 단계; 및 (d) 대상체에서 헤모글로빈의 수준이 적어도 11 g/dL인 경우, 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 투여를 중단시키는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 3주에 1회씩 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 (i) 28일에 1회씩; 또는 (ii) 42일에 1회씩 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 주사를 통해 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 피하 투여된다.
특정 실시양태에서, 헤모글로빈의 수준은 ActRII 신호전달 억제제가 투여된 이후에 6, 12, 18, 및/또는 24개월 이내에 결정된다.
또한, 본원에는 (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율을 결정하는 단계; (b) 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 제1 기간 동안 대상체에게 투여하는 단계; (c) 제1 기간 이후에, 단계 (a)의 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%를 초과한 경우, 대상체에게 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 용량을 감소시키는 단계, 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제 투여의 빈도를 감소시키는 단계, 또는 ActRII 신호전달 억제제의 투여를 중단시키는 단계를 포함하는, 혈액-관련 장애를 가진 대상체에서 적혈구생성을 촉진시키는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 빈혈, 수혈이 필요한 빈혈, MDS, 또는 비-증식성 CMML이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (i) 제1 기간 동안 대상체에서 혈액학적 파라미터를 모니터링(monitoring)하는 단계; 및 (ii) 대상체에서 혈액학적 파라미터가 정상화된 경우, 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 투여를 감소 또는 중단시키는 단계를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (i) 제1 기간 동안 대상체에서 혈액학적 파라미터를 모니터링하는 단계; 및 (ii) 대상체에서 혈액학적 파라미터가 정상화된 경우, 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 투여량을 감소시키는 단계를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (i) 제1 기간 동안 대상체에서 혈액학적 파라미터를 모니터링하는 단계; 및 (ii) 대상체에서 혈액학적 파라미터가 정상화된 경우, 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (i) 제1 기간 동안 대상체에서 혈액학적 파라미터를 모니터링하는 단계; 및 (ii) 대상체에서 혈액학적 파라미터가 정상화된 경우, 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 투여를 중단시키는 단계를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 정상화된 혈액학적 파라미터는 기준 집단에서의 혈액학적 파리미터의 수준이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 정상화된 혈액학적 파라미터는 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 혈액학적 파라미터에 비해, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%까지의 대상체에서 혈액학적 파라미터의 개선이다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 혈액학적 파라미터는 헤모글로빈 수준, 헤마토크리트(hematocrit), 적혈구수 또는 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 3주에 1회씩 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 (i) 28일에 1회씩; 또는 (ii) 42일에 1회씩 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 주사를 통해 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 피하 투여된다.
특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%가 고리 철적혈모구인 경우, 대상체는 하나 이상의 혈액학적 파라미터의 정상화를 달성할 가능성이 증가한다. 특정 실시양태에서, 혈액학적 파라미터는 헤모글로빈 수준, 헤마토크리트, 적혈구수, 또는 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이다.
특정 실시양태에서, 정상화된 혈액학적 파라미터는 기준 집단에서의 혈액학적 파리미터의 수준이다. 특정 실시양태에서, 정상화된 혈액학적 파라미터는 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 혈액학적 파라미터에 비해, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%까지의 개선이다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다.
본원에는 (i) 대상체에서 정상 적혈모구에 대한 환상 철적혈모구(ringed sideroblast)의 초기 비율과 비교해, 대상체에서 정상 적혈모구에 대한 환상 철적혈모구 비율의 장기 감소; 및 (ii) ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전의 대상체에서 헤모글로빈 수준과 비교해, 대상체에서 헤모글로빈 수준의 장기 증가를 달성하기 위하여 약제학적 유효량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 억제제를 대상체에게 일정 기간 동안 투여하는 단계를 포함하고, 상기 약제학적 유효량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이며, 대상체에서 초기 환상 철적혈모구 대 정상 적혈모구 비율은 적어도 1:10, 적어도 1:7, 또는 적어도 1:5인, 대상체에서 빈혈의 장기 치료 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 수혈이 필요한 대상체이다.
본원에는 (i) 대상체에서 정상 적혈모구에 대한 환상 철적혈모구의 초기 비율과 비교해, 대상체에서 정상 적혈모구에 대한 환상 철적혈모구 비율의 장기 감소; 및 (ii) ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전의 대상체에서 헤모글로빈 수준과 비교해, 대상체에서 헤모글로빈 수준의 장기 증가를 달성하기 위하여 약제학적 유효량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 억제제를 대상체에게 일정 기간 동안 투여하는 단계를 포함하고, 상기 약제학적 유효량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이며, 대상체에서 초기 환상 철적혈모구 대 정상 적혈모구 비율은 적어도 1:10, 적어도 1:7, 또는 적어도 1:5인, 대상체에서 낮은 또는 중간-1-위험 골수이형성 증후군(MDS)의 장기 치료 방법이 제공된다.
본원에는 (i) 대상체에서 정상 적혈모구에 대한 환상 철적혈모구의 초기 비율과 비교해, 대상체에서 정상 적혈모구에 대한 환상 철적혈모구 비율의 장기 감소; 및 (ii) ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전의 대상체에서 헤모글로빈 수준과 비교해, 대상체에서 헤모글로빈 수준의 장기 증가를 달성하기 위하여 약제학적 유효량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 억제제를 대상체에게 일정 기간 동안 투여하는 단계를 포함하고, 상기 약제학적 유효량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이며, 대상체에서 초기 환상 철적혈모구 대 정상 적혈모구 비율은 적어도 1:10, 적어도 1:7, 또는 적어도 1:5인, 대상체에서 비-증식성 만성 골수단핵구 백혈병(CMML)의 장기 치료 방법이 제공된다.
또한, 본원에는 약제학적 유효량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 호중구의 수준을 증가시키기 위한 방법이 제공된다.
또한, 본원에는 약제학적 유효량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈소판의 수준을 증가시키기 위한 방법이 제공된다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다: (a) 서열(SEQ ID NO) 2에 대해 90% 동일; (b) 서열 2에 대해 95% 동일; (c) 서열 2에 대해 98% 동일; (d) 서열 2; (e) 서열 3에 대해 90% 동일; (f) 서열 3에 대해 95% 동일; (g) 서열 3에 대해 98% 동일; (h) 서열 3; (i) 서열 6에 대해 90% 동일; (j) 서열 6에 대해 95% 동일; (k) 서열 6에 대해 98% 동일; (l) 서열 6; (m) 서열 7에 대해 90% 동일; (n) 서열 7에 대해 95% 동일; (o) 서열 7에 대해 98% 동일; (p) 서열 7; (q) 서열 12에 대해 90% 동일; (r) 서열 12에 대해 95% 동일; (s) 서열 12에 대해 98% 동일; (t) 서열 12; (u) 서열 17에 대해 90% 동일; (v) 서열 17에 대해 95% 동일; (w) 서열 17에 대해 98% 동일; (x) 서열 17; (y) 서열 20에 대해 90% 동일; (z) 서열 20에 대해 95% 동일; (aa) 서열 20에 대해 98% 동일; (bb) 서열 20; (cc) 서열 21에 대해 90% 동일; (dd) 서열 21에 대해 95% 동일; (ee) 서열 21에 대해 98% 동일; (ff) 서열 21; (gg) 서열 25에 대해 90% 동일; (hh) 서열 25에 대해 95% 동일; (ii) 서열 25에 대해 98% 동일; 및 (jj) 서열 25.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 신호전달 억제제는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다: (a) 서열 2에 대해 90% 동일; (b) 서열 2에 대해 95% 동일; (c) 서열 2에 대해 98% 동일; (d) 서열 2; (e) 서열 3에 대해 90% 동일; (f) 서열 3에 대해 95% 동일; (g) 서열 3에 대해 98% 동일; (h) 서열 3; (i) 서열 6에 대해 90% 동일; (j) 서열 6에 대해 95% 동일; (k) 서열 6에 대해 98% 동일; (l) 서열 6; (m) 서열 7에 대해 90% 동일; (n) 서열 7에 대해 95% 동일; (o) 서열 7에 대해 98% 동일; 및 (p) 서열 7.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA의 세포외 도메인 및 인간 IgG1 Fc 도메인으로 이루어진 인간화 융합 단백질이다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB의 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIB 신호전달 억제제는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다: (a) 서열 17에 대해 90% 동일; (b) 서열 17에 대해 95% 동일; (c) 서열 17에 대해 98% 동일; (d) 서열 17; (e) 서열 20에 대해 90% 동일; (f) 서열 20에 대해 95% 동일; (g) 서열 20에 대해 98% 동일; (h) 서열 20; (i) 서열 21에 대해 90% 동일; (j) 서열 21에 대해 95% 동일; (k) 서열 21에 대해 98% 동일; (l) 서열 21; (m) 서열 25에 대해 90% 동일; (n) 서열 25에 대해 95% 동일; (o) 서열 25에 대해 98% 동일; 및 (p) 서열 25.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA의 세포외 도메인 및 인간 IgG1 Fc 도메인으로 이루어진 인간화 융합 단백질이다.
특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 0.1 내지 2.25 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 0.1 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 0.7 내지 2.25 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 약 0.1 mg/kg, 0.125 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.7 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.25 mg/kg, 1.33 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.75 mg/kg, 2.0 mg/kg, 또는 2.25 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 0.1 mg/kg 내지 0.5 mg/kg 사이, 0.3 mg/kg 내지 0.7 mg/kg 사이, 0.5 mg/kg 내지 1.0 mg/kg 사이, 0.7 mg/kg 내지 1.25 mg/kg 사이, 1.0 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이, 1.5 mg/kg 내지 2.25 mg/kg 사이이다.
6. 도면의 간단한 설명
도 1은 실시예 2의 투여방법(dosing regimen) 및 연구 설계를 나타낸 것이다. 8.2 부분을 참조한다. ActRIIA-I는 ActRIIA 신호전달 억제제(서열 7)를 지칭한다.
도 2는 고수혈 부담(high transfusion burden)(HTB) 대상체에 대해 56일 이상의 RBC 수혈 독립성(RBC-TI) 또는 저수혈 부담(LTB) 대상체에 대해 8주 무수혈 기간에 걸쳐 1.5 g/dL 이상의 평균 헤모글로빈(Hb)의 증가를 갖는 56일 이상의 RBC-TI를 달성한 대상체의 분율(proportion)을 나타낸 것이다. ActRIIA-I는 ActRIIA 신호전달 억제제(서열 7)를 지칭한다.
도 3은 1.0 mg/kg 용량의 ActRIIA(서열 7)를 투여받은 예시적 HTB 대상체가 받은 헤모글로빈 수준(Hb, g/dL) 및 RBC 수혈 유닛(transfusion unit)의 수를 도시한 것이다. 도 3은 예시적 HTB 대상체가 56일을 초과하는 동안의 RBC-TI를 달성한 것을 나타낸다.
도 4는 명시된 용량의 ActRIIA 신호전달 억제제(서열 7)를 이용한 치료 이후에 HTB 반응자들(n=19) 중 수혈 부담 반응의 최대 기간을 나타낸 것이다.
도 5는 명시된 용량의 ActRIIA 신호전달 억제제(서열 7)를 이용한 치료 이후에 56일 이상 동안 RBC-TI를 달성한 HTB 대상체들(n=5) 중 RBC-TI 반응의 최대 지속 기간을 나타낸 것이다. ActRIIA-I는 ActRIIA 신호전달 억제제(서열 7)를 지칭한다.
도 6은 명시된 용량의 ActRIIA 신호전달 억제제(서열 7)를 이용한 치료 이후에 56일 이상 동안의 RBC-TI 및 1.5 g/dL 이상의 평균 Hb 증가를 달성한 LTB 대상체들(n=9)의 분율을 나타낸 것이다. ActRIIA-I는 ActRIIA 신호전달 억제제(서열 7)를 지칭한다.
도 7은 명시된 용량의 ActRIIA(서열 7)를 이용한 치료 이후에 56일 이상 동안의 RBC-TI 및 1.5 g/dL 이상의 평균 Hb 증가를 달성한 LTB 대상체들(n=5) 중 RBC-TI 반응의 최대 기간을 나타낸 것이다. ActRIIA-I는 ActRIIA 신호전달 억제제(서열 7)를 지칭한다.
도 8은 실시예 2의 투여방법 및 연구 설계를 나타낸 것이다. 8.3 부분을 참조한다. BL=기준선(baseline). ActRIIA-I는 ActRIIB 신호전달 억제제(서열 7)를 지칭한다.
도 9는 명시된 용량의 ActRIIB 신호전달 억제제(서열 25)를 이용한 치료 이후에 LTB 대상체의 최대 헤모글로빈 증가를 나타낸 것이다.
도 10은 명시된 용량의 ActRIIB 신호전달 억제제(서열 25)를 이용한 치료 이후에 LTB 대상체의 망상적혈구(reticulocyte)의 증가를 나타낸 것이다.
도 11은 명시된 치료 방법에 따른 명시된 용량의 ActRIIB 신호전달 억제제(서열 25)가 투여된 예시적 LTB 대상체에서 헤모글로빈 수준을 나타낸 것이다. BL=기준선.
도 12는 명시된 치료 방법에 따른 명시된 용량의 ActRIIB 신호전달 억제제(서열 25)가 투여된 예시적 LTB 대상체에서 헤모글로빈 수준을 나타낸 것이다. BL=기준선.
도 13은 명시된 치료 방법에 따른 명시된 용량의 ActRIIB 신호전달 억제제(서열 25)가 투여된 예시적 LTB 대상체에서 헤모글로빈 수준을 나타낸 것이다. BL=기준선.
도 14는 1.0 mg/kg 용량의 ActRIIA-hFc(서열 7)를 투여받은 예시적 HTB 대상체가 받은 헤모글로빈 수준(Hb, g/dL) 및 RBC 수혈 유닛의 수를 도시한 것이다. 도 14는 ActRIIA-hFc(서열 7)를 이용한 치료의 개시 이후에, 예시적 HTB 대상체가 적어도 337일 동안 RBC-TI를 달성한 것을 나타낸다.
도 15는 1.0 mg/kg 용량의 ActRIIA(서열 7)를 투여받은 예시적 LTB 대상체가 받은 헤모글로빈 수준(Hb, g/dL) 및 RBC 수혈 유닛의 수를 도시한 것이다. 도 15는 ActRIIA-hFc(서열 7)를 이용한 치료의 개시 이후에, 예시적 LTB 대상체가 적어도 337일 동안 hb 수준의 지속된 증가를 달성한 것을 나타낸다.
도 16은 수혈 독립성을 이룰 수 있는 대상체에서 수혈 부담을 도시한 것이다. 대상체는 0.75 mg/kg 내지 1.75 mg/kg 사이의 ActRIIB-hFc를 이용해 치료되었다.
도 17은 ActRIIA-hFc 융합물(서열 7)을 투여받은 환자에서 8주 기간에 걸쳐 LTB 환자에 대해 1.5 g/dL 이상의 평균 헤모글로빈 증가를 갖는 RBC 수혈 독립성(RBC-TI)을 달성한 대상체의 분율을 나타낸 것이다. 짙은 회색 음영은 HTB를 나타내고, 밝은 회색 음영은 LTB를 나타낸다.
도 18은 12-개월의 ActRIIA-hFc(서열 7) 치료 연장 연구 과정에서 예시적 HTB 대상체의 헤모글로빈 반응을 도시한 것이다. 제 1 및 최종 치료 용량은 화살표로 나타내었다. 혈액 수혈 건들은 막대로 나타내었다. 헤모글로빈(Hgb) 결과(g/dL)는 시간(일)에 대해 도시되었다.
도 19는 12-개월의 ActRIIA-hFc(서열 7) 치료 연장 연구 과정에서 예시적 LHTB 대상체의 헤모글로빈 반응을 도시한 것이다. 헤모글로빈(Hgb)에서 평균 변화는 시간(개월)에 대해 도시되었다.
도 20은 1.0 mg/kg(하부 4개의 막대로 나타낸 대상체) 및 1.75 mg/kg(상부 막대로 나타낸 대상체)의 용량으로 ActRIIA-hFc(서열 7) 치료를 받는 동안, 12-개월의 ActRIIA-hFc(서열 7) 치료 연장 연구 과정에서 6명의 대상체에서 관찰된 수혈 독립성 반응을 도시한 것이다. 4명의 환자는 연구 동안 연속적인 수혈 독립성을 겪었다(중앙 4개의 막대). 1명의 환자는 ActRIIA-hFc(서열 7) 치료의 약 1개월 이후에 수혈 독립성을 획득하였다(상부 막대). 1명의 환자는 약 2개월 동안 간헐적으로 수혈 독립성을 겪었다(하부 막대).
7. 상세한 설명
7.1 개요
혈액-관련 장애를 가진 환자에서 고리 철적혈모구의 수준이 액티빈-ActRII 신호전달의 억제제를 이용한 치료에 반응하는 환자를 확인하기 위해 사용될 수 있다는 것이 예상외로 발견되었다. 상기 혈액-관련 장애는 (i) 빈혈; (ii) RBC 수혈이 필요한 빈혈; (iii) MDS; 및/또는 (iv) 비-증식성 CMML일 수 있다. 7.8 부분을 참조한다. 이론에 구애됨 없이, 혈액-관련 장애를 가진 환자에서 적혈모구의 약 15% 이상의 고리 철적혈모구는, 동일한 혈액-관련 장애를 가지나 적혈모구의 약 15% 미만의 고리 철적혈모구를 갖는 환자와 비교하여, 환자에서 액티빈-ActRII 신호전달의 억제제에 대해 개선된 임상 반응이 예측된다. 이러한 개선된 임상 반응은 혈액학적 파라미터[헤모글로빈 수준, 적혈구수, 및 헤마토크리트(hematocrit)와 같은]의 증가된 반응일 수 있다. 이러한 개선된 임상 반응은 감소된 수혈 부담면에서 분명하게 드러난다. 또한, 이러한 개선된 임상 반응은 액티빈-ActRII 신호전달 억제제의 지속적인 투여 없이, 환자에게 장기적인 이익을 가져올 수 있다. 다시 말해, 본원에서 제공되는 방법은 액티빈-ActRII 신호전달의 억제제의 투여를 중단한 이후에, 일정 기간 동안 환자에서 하나 이상의 혈액학적 파라미터의 개선을 야기할 수 있다.
따라서, 본원에는 혈액-관련 장애를 가진 환자를 치료하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 적혈모구 중 고리 철적혈모구의 백분율을 결정하는 단계; 및 적혈모구의 약 15% 이상이 고리 철적혈모구인 경우, 액티빈-ActRII 신호전달의 억제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 더욱 구체적으로, 본원에는 혈액-관련 장애를 가진 환자를 치료하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 환자에서 적혈모구 중 고리 철적혈모구의 백분율을 결정하는 단계; (b) 액티빈-ActRII 신호전달의 억제제를 환자에게 투여하는 단계; 및 (c) 적혈모구의 적어도 약 15%가 고리 철적혈모구인 경우, (i) 일정 기간 이후에 액티빈-ActRII 신호전달의 억제제의 투여량을 감소시키거나, 투여를 중단시키는 단계; 및/또는 (ii) 일정 기간 이후에 액티빈-ActRII 신호전달의 억제제의 투여 빈도를 감소시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법들의 상세한 설명은 7.3 및 7.4 부분에서 찾을 수 있다.
7.2 용어 및 약자
본원에서 사용된 바와 같이, "ActRII"는 액티빈 수용체 II형을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "ActRIIA"는 액티빈 수용체 IIA형을 지칭한다. 예를 들어, Mathews and Vale, 1991, Cell 65:973-982를 참조한다. GenBankTM 등록번호 NM_001278579.1은 예시적인 인간 ActRIIA 핵산 서열을 제공한다. GenBankTM 등록번호 NP_001265508.1은 예시적인 인간 ActRIIA 아미노산 서열을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "ActRIIB"는 액티빈 수용체 IIB형을 지칭한다. 예를 들어, Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108을 참조한다. GenBankTM 등록번호 NM_001106.3은 예시적인 인간 ActRIIB 핵산 서열을 제공한다. GenBankTM 등록번호 NP_001097.2는 예시적인 인간 ActRIIB 아미노산 서열을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "ActRIIA-mFc" 또는 "mActRIIA-Fc"는 마우스 액티빈 IIA형 수용체-IgG1 융합 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 미국 특허번호 제8,173,601호를 참조한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "mActRIIB-Fc" 또는 "ActRIIB-mFc"는 마우스 액티빈 IIB형 수용체-IgG1 융합 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 미국 특허번호 제8,173,601호를 참조한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "hActRIIA-Fc" 또는 "ActRIIA-hFc"는 인간 액티빈 IIA형 수용체-IgG1 융합 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 미국 특허번호 제8,173,601호를 참조한다. 구체적 실시양태에서, hActRIIA-Fc는 소타터셉트(sotatercept)(서열 7)이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "hActRIIB-Fc" 또는 "ActRIIB-hFc"는 인간 액티빈 IIB형 수용체-IgG1 융합 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 미국 특허번호 제8,173,601호를 참조한다. 구체적 실시양태에서, hActRIIB-Fc는 루스패터셉트(luspatercept)(서열 25)이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "ALK"는 역형성 림프종 키나아제(anaplastic lymphoma kinase)를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "BL"은 기준선을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "BMP7"은 뼈 형성(bone morphogenetic) 단백질 7을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "CMML"은 만성 골수단핵구 백혈병을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "DEXA"는 이중-에너지 X-선 흡수 계측법(dual-energy X-ray absorptiometry)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "DNMT3A"는 DNA(시토신-5)-메틸전달효소 3A를 지칭한다. GenBankTM 등록번호 NM_153759.3, NM_022552.4, NM_175629.2, 및 NM_175630.1은 인간 DNMT3A에 대한 예시적인 핵산 서열을 제공한다. GenBankTM 등록번호 NP_715640.2, NP_783329.1, NP_783328.1, 및 NP_072046.2는 인간 DNMT3A에 대한 예시적인 아미노산 서열을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "ECD"는 세포외 도메인을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "EPO"는 적혈구생성인자(erythropoietin)를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "ESA"는 적혈구생성-자극제를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "G-CSF"는 과립구 집락 자극인자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "GM-CSG"는 과립구 대식세포 집락 자극인자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Hb"는 헤모글로빈을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "MBML"은 꿀벌 멜리틴을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "HI-E"는 적혈구의 혈액학적 개선을 지칭한다. 특정 실시양태에서, HI-E는 IWG에 의해 정의된 바와 같다. 특정 실시양태에서, HI-E는 변형된 2006 IWG에 의해 정의된 바와 같다. 특정 실시양태에서, 저수혈 부담 환자에 대한 HI-E는 적어도 8주 동안 환자에서 적어도 1.5 g/dL의 헤모글로빈 농도의 증가이다. 특정 실시양태에서, 고수혈 부담 환자에 대한 HI-E는 8주에 걸친 RBC 수혈의 적어도 4 유닛 감소이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "HTB"는 고수혈 부담을 지칭한다. 특정 실시양태에서, HTB 대상체는 8주의 과정에 걸쳐 4 RBC 유닛 이상을 받는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "IgG"는 면역글로불린 G를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Int-1"은 중간체 1의 IPSS 점수를 지칭한다. 7.8 부분을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "IPSS"는 국제 예후 점수 체계(International Prognostic Scoring System)를 지칭한다. 7.8 부분을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "IWG"는 국제간 작업 그룹(International Working Group)을 지칭한다. 예를 들어, Cheson et al. Blood. 2000 96:3671-3674를 참조한다. 특정 실시양태에서, IWG는 수정된 2006 기준을 지칭한다. 예를 들어, Cheson et al., 2006, Blood, 108(2)을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "LTB"는 저수혈 부담을 지칭한다. 특정 실시양태에서, LTB 대상체는 8주의 과정에 걸쳐 4 RBC 유닛 미만을 받는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "MDS"는 골수이형성 증후군을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "PD"는 약역학(pharmacodynamic)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "PK"는 약동학(pharmacokinetic)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "qCT"는 정량적 컴퓨터 단층촬영을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "RARS"는 고리 철적혈모구를 갖는 불응성 빈혈을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "RBC"는 적혈구를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "RBC-TI"는 적혈구 수혈 독립성을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "RCMD-RS"는 고리 철적혈모구를 갖는 다계열 이형성 불응성 혈구감소증(cytopenia)을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "RS"는 고리 철적혈모구를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "SC"는 피하를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "SETBP1"은 SET 결합 단백질 1을 지칭한다. GenBankTM 등록번호 NM_015559.2 및 NM_001130110.1은 인간 SETBP1에 대한 예시적인 핵산 서열을 제공한다. GenBankTM 등록번호 NP_056374.2 및 NP_001123582.1은 인간 SETBP1에 대한 예시적인 아미노산 서열을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "SF3B1"은 스플라이싱 인자 3B1을 지칭한다. GenBankTM 등록번호 NM_012433.3, NM_001005523.2, 및 NM_001308824.1은 인간 SF3B1에 대한 예시적인 핵산 서열을 제공한다. GenBankTM 등록번호 NP_001295753.1, NP_001005526.1, 및 NP_036565.2는 인간 SF3B1에 대한 예시적인 아미노산 서열을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "SPR"은 표면 플라스몬 공명을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "SRSF2"는 세린/아르기닌이 풍부한(rich) 스플라이싱 인자 2이다. GenBankTM 등록번호 NM_003016.4 및 NM_001195427.1은 인간 SRSF2에 대한 예시적인 핵산 서열을 제공한다. GenBankTM 등록번호 NP_001182356.1 및 NP_003007.2는 인간 SRSF2에 대한 예시적인 아미노산 서열을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "TET2"는 메틸시토신 디옥시나제 2를 지칭한다. GenBankTM 등록번호 NM_001127208.2 및 NM_017628.4는 인간 TET2에 대한 예시적인 핵산 서열을 제공한다. GenBankTM 등록번호 NP_001120680.1 및 NP_060098.3은 인간 TET2에 대한 예시적인 아미노산 서열을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "TGF"는 형질전환 생장 인자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "TPA"는 조직 플라스미노겐 활성인자를 지칭한다.
7.3 치료 방법
특정 실시양태에서, 본원에는 혈액-관련 장애를 가진 대상체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율을 결정하는 단계; 및 (b) 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%가 고리 철적혈모구인 경우, 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구인 경우, ActRII 신호전달의 억제제가 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율은 제1 시점에서 결정된다. 특정 실시양태에서, 제1 시점은 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에 투여한지 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월 이내이다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 혈액-관련 장애이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 11 g/dL 미만의 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 기준 집단에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 7.10 부분에 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, 대상체는 빈혈을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RBC 수혈이 필요한 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 MDS를 갖는다. 특정 실시양태에서, 비-증식성 CMML을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%가 고리 철적혈모구인 경우, 대상체는 하나 이상의 혈액학적 파라미터의 정상화를 달성할 가능성이 증가한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구인 경우, 대상체는 하나 이상의 혈액학적 파라미터의 정상화를 달성할 가능성이 증가한다. 특정 실시양태에서, 혈액학적 파라미터는 헤모글로빈 수준이다. 특정 실시양태에서, 혈액학적 파라미터는 헤마토크리트이다. 특정 실시양태에서, 혈액학적 파라미터는 적혈구수이다. 특정 실시양태에서, 혈액학적 파라미터는 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이다. 특정 실시양태에서, 정상화된 혈액학적 파라미터는 기준 집단에서의 혈액학적 파리미터의 수준이다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 7.10 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단이다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 혈액학적 파라미터의 정상화는 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 일정 기간 이전의 대상체에서 혈액학적 파라미터에 비해, 대상체에서 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%까지의 혈액학적 파라미터의 개선이다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율은 7.10 부분에 기재된 바와 같은 에세이(assay)에 따라 결정된다. 특정 실시양태에서, 고리 철적혈모구는 7.10 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 따라 확인된다. 특정 실시양태에서, 고리 철적혈모구는 프러시안 블루 염색에 따라 확인된다. 특정 실시양태에서, 적혈모구는 7.10 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 따라 확인된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 헤모글로빈 수준은 7.10 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 따라 결정된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 용량이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 초기 용량이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 조절된 용량이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.11 부분에 기재된 바와 같은 조성물로서 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.9 부분에 기재된 바와 같은 ActRII 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA-hFc(예를 들어, 서열 7)와 같은 ActRIIA-Fc이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIB 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB-hFc(예를 들어, 서열 25)와 같은 ActRII-Fc이다.
특정 실시양태에서, 본원에는 (i) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율과 비교해, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율의 장기 감소; 및 (ii) 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 헤모글로빈 수준과 비교해, 대상체에서 헤모글로빈 수준의 장기 증가를 달성하기 위하여 약제학적 유효량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제를 대상체에게 일정 기간 동안 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈액-관련 장애를 치료하는 방법이 제공되고; 상기 약제학적 유효량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이며, 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 혈액-관련 장애이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 15%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RBC 수혈이 필요한 대상체이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "고리 철적혈모구" 및 "환상 철적혈모구" 및 "RS"는 호환적으로 사용된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 동안 투여된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율의 장기 감소는 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 유지된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율의 장기 감소는 최종 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 투여한 이후에 ActRII 신호전달 억제제의 추가 투여 없이, 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 유지된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율의 장기 감소는 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후에 적어도 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율의 적어도 1.5, 2.5, 5.0, 7.5, 또는 10.0배 미만이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 헤모글로빈 수준의 장기 증가는 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 유지된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 헤모글로빈 수준의 장기 증가는 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 대상체에서 약 11 g/dL 내지 18 g/dL 사이의 헤모글로빈 수준이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 RBC 수혈이 필요하지 않다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 ActRII 신호전달 억제제 투여 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 대상체에서 RBC 수혈에 대한 필요를 제거한다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율의 장기 감소는 최종 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 투여한 이후에 ActRII 신호전달 억제제의 추가 투여 없이, 적어도 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율의 적어도 1.5, 2.5, 5.0, 7.5, 또는 10.0배 미만이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 헤모글로빈 수준의 장기 증가는 최종 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 투여한 이후에 ActRII 신호전달 억제제의 추가 투여 없이, 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 유지된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 헤모글로빈 수준의 장기 증가는 최종 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 투여한 이후에 ActRII 신호전달 억제제의 추가 투여 없이, 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 대상체에서 약 11 g/dL 내지 18 g/dL 사이의 헤모글로빈 수준이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 최종 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 투여한 이후에 ActRII 신호전달 억제제의 추가 투여 없이, 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 RBC 수혈이 필요하지 않다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 최종 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 투여한 이후에 ActRII 신호전달 억제제의 추가 투여 없이, 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 대상체에서 RBC 수혈에 대한 필요를 제거한다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간의 6, 12, 18, 및/또는 24개월 이후에 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 추가 백분율을 결정하는 단계를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간의 6, 12, 18, 및/또는 24개월 이후에 대상체에서 추가 헤모글로빈 수준을 결정하는 단계를 더 포함한다.
특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율은 7.10 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 따라 결정된다. 특정 실시양태에서, 고리 철적혈모구는 7.10 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 따라 확인된다. 특정 실시양태에서, 고리 철적혈모구는 프러시안 블루 염색에 따라 확인된다. 특정 실시양태에서, 적혈모구는 7.10 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 따라 확인된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 헤모글로빈 수준은 7.10 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 따라 결정된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 11 g/dL 미만의 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 기준 집단에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 7.10 부분에 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, 대상체는 빈혈을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RBC 수혈이 필요한 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 MDS를 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 비-증식성 CMML을 갖는다.
특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 용량이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 초기 용량이다. 특정 실시양태에서, 초기 용량은 7.4 부분에 기재된 바와 같은 방법에 따라 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 조절된 용량이다. 특정 실시양태에서, 조절된 용량은 7.4 부분에 기재된 바와 같은 방법에 따라 투여된다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.11 부분에 기재된 바와 같은 조성물로서 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.9 부분에 기재된 바와 같은 ActRII 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA-hFc(예를 들어, 서열 7)와 같은 ActRIIA-Fc이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIB 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB-hFc(예를 들어, 서열 25)와 같은 ActRII-Fc이다.
특정 실시양태에서, 본원에는 대상체에서 혈액-관련 장애를 치료하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율을 결정하는 단계; 및 (b) (i) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%인 경우, 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 단기간 동안 대상체에게 투여하는 단계, 또는 (ii) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1 % 미만인 경우, 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 장기간 동안 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 혈액-관련 장애이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 대상체이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RBC 수혈이 필요한 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제 투여의 단기간은 1, 2, 3, 4, 또는 5개월이다. 특정 실시양태에서, 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제 투여의 장기간은 적어도 6, 12, 18, 또는 24개월이다. 구체적 실시양태에서, 단기간의 투여 이후 ActRII 신호전달 억제제를 최종 투여한지 적어도 0, 3, 4, 5, 6, 12, 28, 24, 또는 48개월 이후에 고리 철적혈모구의 수준을 검사한다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.9 부분에 기재된 바와 같은 ActRII 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA-hFc(예를 들어, 서열 7)와 같은 ActRIIA-Fc이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIB 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB-hFc(예를 들어, 서열 25)와 같은 ActRII-Fc이다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간의 6, 12, 18, 및/또는 24개월 이후에 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 추가 백분율을 결정하는 단계를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간의 6, 12, 18, 및/또는 24개월 이후에 대상체에서 추가 헤모글로빈 수준을 결정하는 단계를 더 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간의 6, 12, 18, 및/또는 24개월 이후에 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 추가 백분율을 결정하는 단계를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간의 6, 12, 18, 및/또는 24개월 이후에 대상체에서 헤모글로빈 수준을 결정하는 단계를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 ActRII 신호전달 억제제 투여 이후 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 대상체의 적혈구 수혈에 대한 필요를 제거한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 최종 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 투여한 이후에 ActRII 신호전달 억제제의 추가 투여 없이, 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 대상체의 적혈구 수혈에 대한 필요를 제거한다.
특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율은 7.10 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 따라 결정된다. 특정 실시양태에서, 고리 철적혈모구는 7.10 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 따라 확인된다. 특정 실시양태에서, 고리 철적혈모구는 프러시안 블루 염색에 따라 확인된다. 특정 실시양태에서, 적혈모구는 7.10 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 따라 확인된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 헤모글로빈 수준은 7.10 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 따라 결정된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 헤모글로빈 수준은 7.10 부분에 기재된 바와 같은 에세이에 따라 결정된다.
특정 실시양태에서, 대상체는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 11 g/dL 미만의 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 기준 집단에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 7.10 부분에 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, 대상체는 빈혈을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RBC 수혈이 필요한 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 MDS를 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 비-증식성 CMML을 갖는다.
특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 용량이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 초기 용량이다. 특정 실시양태에서, 초기 용량은 7.4 부분에 기재된 바와 같은 방법에 따라 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 조절된 용량이다. 특정 실시양태에서, 조절된 용량은 7.4 부분에 기재된 바와 같은 방법에 따라 투여된다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.11 부분에 기재된 바와 같은 조성물로서 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.9 부분에 기재된 바와 같은 ActRII 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA-hFc(예를 들어, 서열 7)와 같은 ActRIIA-Fc이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIB 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB-hFc(예를 들어, 서열 25)와 같은 ActRII-Fc이다.
특정 실시양태에서, 본원에는 약제학적 유효량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈액-관련 장애를 치료하기 위한 방법이 제공되며, 상기 대상체는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 비-코딩 영역에 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 코딩 영역에 있다. 특정 실시양태에서, SF3B1은 SF3B1 단백질이다. 특정 실시양태에서, SF3B1은 SF3B1을 코딩하는 유전자이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 대상체이다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 혈액-관련 장애이다. 특정 실시양태에서, SF3B1의 하나 이상의 돌연변이는 7.8 부분에 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 11 g/dL 미만의 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 기준 집단에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 7.10 부분에 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, 대상체는 빈혈을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RBC 수혈이 필요한 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 MDS를 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 비-증식성 CMML을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법에 따라 치료되는 대상체는 혈소판감소증을 갖는다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 용량이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 ActRII 신호전달 억제제의 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 ActRII 신호전달 억제제의 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 초기 용량이다. 특정 실시양태에서, 초기 용량은 7.4 부분에 기재된 바와 같은 방법에 따라 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 조절된 용량이다. 특정 실시양태에서, 조절된 용량은 7.4 부분에 기재된 바와 같은 방법에 따라 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.11 부분에 기재된 바와 같은 조성물로서 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.9 부분에 기재된 바와 같은 ActRII 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA-hFc(예를 들어, 서열 7)와 같은 ActRIIA-Fc이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIB 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB-hFc(예를 들어, 서열 25)와 같은 ActRII-Fc이다. 호중구 수준을 증가시킬 필요가 있는 대상체는 고리 철적혈모구, 빈혈, RBC 수혈이 필요한 빈혈, 비-증식성 CMML 및/또는 MDS를 가진 대상체일 수 있다.
7.3.1 유전자 마커(Genetic Marker)
특정 실시양태에서, 본원에는 약제학적 유효량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈액-관련 장애를 치료하기 위한 방법이 제공되며, 대상체는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 비-코딩 영역에 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 코딩 영역에 있다. 특정 실시양태에서, SF3B1은 SF3B1 단백질이다. 특정 실시양태에서, SF3B1은 SF3B1을 코딩하는 유전자이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 대상체이다. 특정 실시양태에서, SF3B1의 하나 이상의 돌연변이는 7.8 부분에 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 11 g/dL 미만의 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 기준 집단에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 7.10 부분에 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, 대상체는 빈혈을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RBC 수혈이 필요한 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 MDS를 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 비-증식성 CMML을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법에 따라 치료되는 대상체는 혈소판감소증을 갖는다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 용량이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 ActRII 신호전달 억제제의 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 ActRII 신호전달 억제제의 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 초기 용량이다. 특정 실시양태에서, 초기 용량은 7.4 부분에 기재된 바와 같은 방법에 따라 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 조절된 용량이다. 특정 실시양태에서, 조절된 용량은 7.4 부분에 기재된 바와 같은 방법에 따라 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.11 부분에 기재된 바와 같은 조성물로서 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.9 부분에 기재된 바와 같은 ActRII 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA-hFc(예를 들어, 서열 7)와 같은 ActRIIA-Fc이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIB 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB-hFc(예를 들어, 서열 25)와 같은 ActRII-Fc이다. 호중구 수준을 증가시킬 필요가 있는 대상체는 고리 철적혈모구, 빈혈, RBC 수혈이 필요한 빈혈, 비-증식성 CMML 및/또는 MDS를 가진 대상체일 수 있다.
7.4 조절된 투여 방법
특정 실시양태에서, 본원에는 대상체에서 혈액-관련 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 적어도 20%가 고리 적철모구인 것을 결정하는 단계; (b) 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계; (c) 일정 기간 이후에, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제2 백분율을 결정하는 단계; 및 (d) 임의로, 조절된 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 혈액-관련 장애이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 대상체이다. 특정 실시양태에서, 초기 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RBC 수혈이 필요한 대상체이다. 특정 실시양태에서, 초기 용량은 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제1 백분율의 결정 직후 또는 이의 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 12개월 이내에 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 초기 용량을 대상체에게 투여하는 단계와 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제2 백분율을 결정하는 단계 사이의 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 12개월이다. 특정 실시양태에서, 조절된 용량은 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제2 백분율의 결정 직후 또는 이의 최대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 12개월 이내에 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제2 백분율이 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%인 경우, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 초기 용량에 비해 작다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제2 백분율은 적어도 15%이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제2 백분율이 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만인 경우, 조절된 용량은 대상체에게 투여되지 않는다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 ActRII 신호전달 억제제 투여 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 대상체의 적혈구 수혈에 대한 필요를 제거한다.
특정 실시양태에서, 대상체는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 11 g/dL 미만의 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 기준 집단에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 7.10 부분에 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, 대상체는 빈혈을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RBC 수혈이 필요한 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 MDS를 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 비-증식성 CMML을 갖는다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 초기 용량이다. 특정 실시양태에서, 용량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 조절된 용량이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 조절된 용량이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.11 부분에 기재된 바와 같은 조성물로서 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.9 부분에 기재된 바와 같은 ActRII 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA-hFc(예를 들어, 서열 7)와 같은 ActRIIA-Fc이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIB 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB-hFc(예를 들어, 서열 25)와 같은 ActRII-Fc이다.
특정 실시양태에서, 본원에는 (a) 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율을 결정하는 단계; (b) 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 제1 기간 동안 대상체에게 투여하는 단계; 및 (c) 제1 기간 이후에, 단계 (a)의 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%를 초과한 경우, 대상체에게 투여되는 ActRII 신호전달 억제제의 용량을 감소시키는 단계, 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제 투여의 빈도를 감소시키는 단계, 또는 ActRII 신호전달 억제제의 투여를 중단시키는 단계를 포함하는, 혈액-관련 장애를 가진 대상체에서 적혈구생성을 촉진시키는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (i) 제1 기간 동안 대상체에서 혈액학적 파라미터를 모니터링하는 단계; 및 (ii) 대상체에서 혈액학적 파라미터가 정상화된 경우, 예를 들어 대상체에서 혈액학적 파라미터가 적어도 기준 집단에서의 혈액학적 파라미터의 수준인 경우, 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 투여를 감소(예를 들어, 용량을 감소시키거나 빈도를 감소) 또는 중단시키는 단계를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 7.10 부분에 기재된 바와 같은 기준 집단이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (i) 제1 기간 동안 대상체에서 혈액학적 파라미터를 모니터링하는 단계; 및 (ii) 대상체에서 혈액학적 파라미터가 정상화된 경우, 예를 들어, 대상체에서 혈액학적 파라미터가 제 2 기간의 대상체에서 혈액학적 파라미터에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%까지 개선된 경우, 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 투여를 감소(예를 들어, 용량을 감소시키거나 빈도를 감소) 또는 중단시키는 단계를 더 포함하고, 상기 제 2 기간은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계 이전의 기간이다. 특정 실시양태에서, 제1 기간은 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 또는 1년이다. 특정 실시양태에서, 제 2 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 혈액학적 파라미터는 헤모글로빈 수준이다. 특정 실시양태에서, 혈액학적 파라미터는 헤마토크리트이다. 특정 실시양태에서, 혈액학적 파라미터는 적혈구수이다. 특정 실시양태에서, 혈액학적 파라미터는 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 감소된 용량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 용량이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제를 투여하는 감소된 빈도는 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도이다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 혈액-관련 장애이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 대상체이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 초기 용량이다. 특정 실시양태에서, 용량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 조절된 용량이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 조절된 용량이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.11 부분에 기재된 바와 같은 조성물로서 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.9 부분에 기재된 바와 같은 ActRII 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA-hFc(예를 들어, 서열 7)와 같은 ActRIIA-Fc이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIB 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB-hFc(예를 들어, 서열 25)와 같은 ActRII-Fc이다.
7.5 호중구 수준을 증가시키는 방법
특정 실시양태에서, 본원에는 약제학적 유효량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 호중구의 수준을 증가시킬 필요가 있는 대상체에서 호중구의 수준을 증가시키기 위한 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 호중구 수준은 절대 호중구 수이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 호중구의 수준은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 호중구 수준에 비해 적어도 리터(liter) 당 0.1 x 109, 리터 당 0.5 x 109, 리터 당 1.0 x 109, 리터 당 5 x 109, 리터 당 1.0 x 1010, 리터 당 5 x 1010, 또는 1.0 x 1011까지 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 호중구의 수준은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 호중구 수준에 비해 적어도 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배까지 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 호중구의 수준은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 호중구 수준에 비해 최대 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배까지 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 호중구의 수준은 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여한 이후에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 동안 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체의 호중구의 수준은 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에 투여한 이후에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 동안 증가된다. 또한, 7.4 부분을 참조한다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 호중구 수준은 7.10 부분에 기재된 바와 같이 결정된다. 특정 실시양태에서, 절대 호중구 수는 7.10 부분에 기재된 바와 같이 결정된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 11 g/dL 미만의 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 기준 집단에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 7.10 부분에 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, 대상체는 빈혈을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RBC 수혈이 필요한 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 MDS를 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 비-증식성 CMML을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법에 따라 치료되는 대상체는 혈소판감소증을 갖는다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 용량이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 초기 용량이다. 특정 실시양태에서, 초기 용량은 7.4 부분에 기재된 바와 같은 방법에 따라 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 조절된 용량이다. 특정 실시양태에서, 조절된 용량은 7.4 부분에 기재된 바와 같은 방법에 따라 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.11 부분에 기재된 바와 같은 조성물로서 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.9 부분에 기재된 바와 같은 ActRII 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA-hFc(예를 들어, 서열 7)와 같은 ActRIIA-Fc이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIB 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB-hFc(예를 들어, 서열 25)와 같은 ActRII-Fc이다. 호중구 수준을 증가시킬 필요가 있는 대상체는 고리 철적혈모구, 빈혈, RBC 수혈이 필요한 빈혈, 비-증식성 CMML 및/또는 MDS를 가진 대상체일 수 있다.
7.6 혈소판 수준을 증가시키는 방법
특정 실시양태에서, 본원에는 약제학적 유효량의 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈소판의 수준을 증가시킬 필요가 있는 대상체에서 혈소판의 수준을 증가시키기 위한 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 혈소판의 수준은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 혈소판 수준에 비해 적어도 리터 당 1 x 1010, 리터 당 3 x 1010, 리터 당 5 x 1010, 리터 당 1 x 1011, 리터 당 5 x 1011, 또는 적어도 리터 당 1 x 1012까지 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 혈소판의 수준은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 혈소판 수준에 비해 적어도 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배까지 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 혈소판의 수준은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 혈소판 수준에 비해 최대 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 또는 10배까지 증가된다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 혈소판의 수준은 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여한 이후에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 동안 증가된다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 혈소판의 수준은 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에 투여한 이후에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 동안 증가된다. 또한, 7.4 부분을 참조한다. 특정 실시양태에서, 혈소판은 7.10 부분에 따라 결정된다.
특정 실시양태에서, 대상체는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%는 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 11 g/dL 미만의 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 기준 집단에 비해 감소된 헤모글로빈 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 7.10 부분에 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, 대상체는 빈혈을 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RBC 수혈이 필요한 대상체이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 MDS를 갖는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 비-증식성 CMML을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법에 따라 치료되는 대상체는 호중구감소증(neutropenia)을 갖는다.
특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 용량이다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 초기 용량이다. 특정 실시양태에서, 초기 용량은 7.4 부분에 기재된 바와 같은 방법에 따라 투여된다. 특정 실시양태에서, 약제학적 유효량은 조절된 용량이다. 특정 실시양태에서, 조절된 용량은 7.4 부분에 기재된 바와 같은 방법에 따라 투여된다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.11 부분에 기재된 바와 같은 조성물로서 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같은 빈도로 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 7.7 부분에 기재된 바와 같이 투여된다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.9 부분에 기재된 바와 같은 ActRII 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA-hFc(예를 들어, 서열 7)와 같은 ActRIIA-Fc이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRIIB 신호전달 억제제는 21일에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIB-hFc(예를 들어, 서열 25)와 같은 ActRII-Fc이다.
호중구 수준을 증가시킬 필요가 있는 대상체는 고리 철적혈모구, 빈혈, RBC 수혈이 필요한 빈혈, 비-증식성 CMML 및/또는 MDS를 가진 대상체일 수 있다.
7.7 용량
본원에는 혈액-관련 장애(예를 들어, 빈혈, RBC 수혈이 필요한 빈혈, MDS 및/또는 비-증식성 CMML)를 갖는 대상체의 치료 방법이 제공되며, 상기 방법은 약제학적 유효량의 ActRII의 신호전달 억제제를 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다(7.9 부분 참조). 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.9.1 부분에 기재된 바와 같은 ActRIIA의 신호전달 억제제이다. 다른 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 7.9.2 부분에 기재된 바와 같은 ActRIIB의 신호전달 억제제이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 ActRIIA 신호전달 억제제와 ActRIIB 신호전달 억제제의 조합이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 서열 7이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 서열 25이다.
본원에서 제공되는 용량은, 예를 들어 빈혈, RBC 수혈이 필요한 빈혈, MDS 및/또는 비-증식성 CMML과 같은 혈액 관련 질병의 치료에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 용량은 약제학적 유효량이다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효량은 빈혈의 하나 이상의 증상을 개선하기에 충분한 용량이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효량은 빈혈의 적어도 하나의 증상이 악화되는 것을 예방하기에 충분한 용량이다. 빈혈의 비-제한적인 예는 피로, 에너지 소모, 빠른 심장박동, 숨가쁨, 두통, 집중 곤란, 어지럼증, 창백한 피부, 다리 경련, 및 불면증을 포함한다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효량은 비-증식성 CMML의 하나 이상의 증상을 개선하기에 충분한 용량이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효량은 비-증식성 CMML의 적어도 하나의 증상이 악화되는 것을 예방하기에 충분한 용량이다. 비-증식성 CMML의 비-제한적인 예는 비종, 간비대, 빈혈, 피로, 숨가쁨, 백혈구감소증(leukopenia), 빈번한 감염, 혈소판감소증, 잦은 멍 또는 출혈, 열, 체중 감소, 창백한 피부 및 식욕 부진을 포함한다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효량은 MDS의 하나 이상의 증상을 개선하기에 충분한 용량이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효량은 MDS의 적어도 하나의 증상이 악화되는 것을 예방하기에 충분한 용량이다. MDS의 비-제한적인 예는 빈혈, 숨가쁨, 피로, 창백한 피부, 백혈구감소증, 빈번한 감염, 호중구감소증, 혈소판감소증, 잦은 멍 또는 출혈, 체중 감소, 열, 식욕 부진, 쇄약(weakness), 및 뼈통증(bone pain)을 포함한다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 간격을 두고, 0.2 마이크로그램/kg 또는 그 이상의 혈청 농도, 예를 들어 1 마이크로그램/kg 또는 2 마이크로그램/kg 또는 그 이상의 혈청 수준을 달성하기에 충분한 양으로 투여된다. 투여요법은 0.2 내지 15 마이크로그램/kg 사이, 및 임의로 1 내지 5 마이크로그램/kg 사이의 혈청 농도에 도달하도록 설계될 수 있다. 인간에서, 0.2 마이크로그램/kg의 혈청 수준은 0.1 mg/kg 또는 그 이상의 단일 용량으로 달성될 수 있으며, 1 마이크로그램/kg의 혈청 수준은 0.3 mg/kg 또는 그 이상의 단일 용량으로 달성될 수 있다. 분자의 관찰된 혈청 반감기는 실질적으로 대부분의 Fc 융합 단백질에 비해 긴 약 20 내지 30일 사이이고, 이에 따라 지속된 유효 혈청 수준은, 예를 들어 매주 또는 격주로 0.2-0.4 mg/kg을 투여함으로써 달성될 수 있거나, 더 높은 용량이 투여 사이의 보다 긴 간격으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 1-3 mg/kg의 용량이 매달 또는 2개월마다 사용될 수 있고, 뼈에 대한 효과는 투여가 3, 4, 5, 6, 9, 12 또는 그 이상의 개월마다 1회씩만 필요할 정도로 충분히 지속적일 수 있다. ActRII 신호전달 억제제의 혈청 수준은 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, ActRII 신호전달 억제제에 대한 항체는, 예를 들어 ELISA를 사용해 ActRII 신호전달 억제제의 혈청 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 구체적 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법은 뼈 밀도 및 강도에 대해 유의미한 효과를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 약 0.1 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.75 mg/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 1.25 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 1.75 mg/kg, 약 2.0 mg/kg, 또는 약 2.25 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 2.25 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 1 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 약 0.3 mg/kg 내지 1.25 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 약 0.5 mg/kg 내지 1.5 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 약 0.75 mg/kg 내지 1.0 mg/kg 사이, 1.0 mg/kg 내지 1.25 mg/kg 사이, 1.25 mg/kg 내지 1.5 mg/kg 사이, 1.5 mg/kg 내지 1.75 mg/kg 사이, 또는 1.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 약제학적 유효량이다. 본원에서 제공되는 용량(예를 들어, ActRII 신호전달 억제제의 용량 또는 제 2 활성제의 용량)과 결합되어 사용될 때, 단어 "약"은 참조된 수의 1, 5 또는 10% 이내의 임의의 수를 지칭한다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 약제학적 유효량이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효량은 약 0.1 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.75 mg/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 1.25 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 1.75 mg/kg, 약 2.0 mg/kg, 또는 약 2.25 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효량은 약 0.1 mg/kg 내지 2.25 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효량은 약 0.1 mg/kg 내지 1 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효량은 약 0.3 mg/kg 내지 1.25 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효량은 약 0.5 mg/kg 내지 1.5 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효량은 약 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 약제학적 유효량은 약 0.75 mg/kg 내지 1.0 mg/kg 사이, 1.0 mg/kg 내지 1.25 mg/kg 사이, 1.25 mg/kg 내지 1.5 mg/kg 사이, 1.5 mg/kg 내지 1.75 mg/kg 사이, 또는 1.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 초기 용량은 약 0.1 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.75 mg/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 1.25 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 1.75 mg/kg, 약 2.0 mg/kg, 또는 약 2.25 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 초기 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 2.25 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 초기 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 1 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 초기 용량은 약 0.3 mg/kg 내지 1.25 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 초기 용량은 약 0.5 mg/kg 내지 1.5 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 초기 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 초기 용량은 약 0.75 mg/kg 내지 1.0 mg/kg 사이, 1.0 mg/kg 내지 1.25 mg/kg 사이, 1.25 mg/kg 내지 1.5 mg/kg 사이, 1.5 mg/kg 내지 1.75 mg/kg 사이, 또는 1.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 초기 용량은 (i) 28일에 1회씩; 또는 (ii) 42일에 1회씩 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 초기 용량은 3주에 1회씩 투여된다.
특정 실시양태에서, 용량은 조절된 용량이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 약 0.1 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 0.75 mg/kg, 약 1.0 mg/kg, 약 1.25 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 1.75 mg/kg, 약 2.0 mg/kg, 또는 약 2.25 mg/kg이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 2.25 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 1 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 약 0.3 mg/kg 내지 1.25 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 약 0.5 mg/kg 내지 1.5 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 약 0.75 mg/kg 내지 1.0 mg/kg 사이, 1.0 mg/kg 내지 1.25 mg/kg 사이, 1.25 mg/kg 내지 1.5 mg/kg 사이, 1.5 mg/kg 내지 1.75 mg/kg 사이, 또는 1.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 (i) 28일에 1회씩; 또는 (ii) 42일에 1회씩 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 3주에 1회씩 투여된다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 초기 용량에 비해 크다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 초기 용량에 비해 약 2.5 mg, 약 5 mg, 약 10 mg, 약 15 mg, 약 20 mg, 또는 약 35 mg 많거나, ActRII 신호전달 억제제의 초기 용량에 비해 약 0.05 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.15 mg/kg, 약 0.25 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.35 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 또는 약 0.5 mg/kg 많다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 초기 용량에 비해 더 자주 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 5, 10, 15, 20, 25, 28, 30, 35, 또는 40일 마다 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 1 또는 2주 마다 투여된다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 초기 용량에 비해 적다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 초기 용량에 비해 약 2.5 mg, 약 5 mg, 약 10 mg, 약 15 mg, 약 20 mg, 또는 약 35 mg 적거나, ActRII 신호전달 억제제의 초기 용량에 비해 약 0.05 mg/kg, 약 0.1 mg/kg, 약 0.15 mg/kg, 약 0.25 mg/kg, 약 0.3 mg/kg, 약 0.35 mg/kg, 약 0.4 mg/kg, 또는 약 0.5 mg/kg 적다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 초기 용량에 비해 덜 빈번하게 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 30, 35, 40, 42, 50, 60, 70, 80, 또는 90일 마다 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 조절된 용량은 4, 5, 6, 7, 또는 8주 마다 투여된다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 주사를 통해 투여된다. ActRII 신호전달 억제제의 용량은 28일에 1회씩, 또는 42일에 1회씩 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 21일에 1회씩 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 서열 7이다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 주사를 통해 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제의 용량은 3주에 1회씩 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제는 서열 25이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100%까지 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율에 비해 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100%까지 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 또는 48개월 동안 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 무기한적으로 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율은 7.10 부분에 기재된 에세이에 따라 결정된다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 고리 철적혈모구의 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100%까지 대상체에서 고리 철적혈모구의 수준을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 고리 철적혈모구의 수준에 비해 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100%까지 대상체에서 고리 철적혈모구의 수준을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 또는 48개월 동안 대상체에서 고리 철적혈모구의 수준을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 무기한적으로 대상체에서 고리 철적혈모구의 수준을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 고리 철적혈모구의 수준은 7.10 부분에 기재된 에세이에 따라 결정된다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 헤모글로빈 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 또는 적어도 500%까지 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 헤모글로빈 수준에 비해 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 또는 최대 500%까지 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 헤모글로빈 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 또는 적어도 60%까지 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 헤모글로빈 수준에 비해 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 또는 최대 60%까지 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 헤모글로빈 수준에 비해 적어도 0.5 g/dL, 1.0 g/dL, 1.1 g/dL, 1.3 g/dL, 1.5 g/dL, 1.8 g g/dL, 2.0 g/dL, 2.2 g/dL, 2.4 g/dL, 2.6 g/dL, 2.8 g/dL, 3.0 g/dL, 3.2 g/dL, 3.4 g/dL, 3.6 g/dL, 3.8 g/dL, 4.0 g/dL, 4.2 g/dL, 4.4 g/dL, 또는 적어도 4.6 g/dL까지 헤모글로빈의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 헤모글로빈 수준에 비해 최대 0.5 g/dL, 1.0 g/dL, 1.1 g/dL, 1.3 g/dL, 1.5 g/dL, 1.8 g g/dL, 2.0 g/dL, 2.2 g/dL, 2.4 g/dL, 2.6 g/dL, 2.8 g/dL, 3.0 g/dL, 3.2 g/dL, 3.4 g/dL, 3.6 g/dL, 3.8 g/dL, 4.0 g/dL, 4.2 g/dL, 4.4 g/dL, 또는 최대 4.6 g/dL까지 헤모글로빈의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 또는 48개월 동안 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 무기한적으로 대상체에서 헤모글로빈의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체의 망상적혈구 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%까지 대상체의 망상적혈구의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체의 망상적혈구 수준에 비해 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 또는 최대 500%까지 대상체의 망상적혈구의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 또는 48개월 동안 대상체의 망상적혈구의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 무기한적으로 대상체의 망상적혈구의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 적혈구 수혈 의존성에 비해 대상체의 적혈구 의존성을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체의 적혈구 수혈 빈도에 비해 대상체의 적혈구 수혈 빈도를 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 100%까지 적혈구 수혈을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 최대 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 최대 100%까지 적혈구 수혈을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체의 수혈되는 적혈구의 유닛에 비해 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 또는 13 유닛까지 대상체의 수혈되는 적혈구의 유닛을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%까지, 또는 100%까지 적혈구 수혈의 빈도를 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 최대 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%까지, 또는 100%까지 적혈구 수혈의 빈도를 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 또는 48개월 동안 대상체의 적혈구 수혈에 대한 필요성을 폐지하기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 무기한적으로 대상체의 적혈구 수혈에 대한 필요성을 폐지하기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 하나의 RBC 유닛은 약 150 mL, 200 mL, 250 mL, 300 mL, 350 mL, 100-200 mL, 150-250 mL, 200-300 mL, 또는 250-350 mL의 RBC를 지칭한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체의 수혈 부담에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100%까지 대상체의 수혈 부담을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체의 수혈 부담에 비해 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100%까지 대상체의 수혈 부담을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체의 수혈 부담에 비해 적어도 33%까지 대상체의 수혈 부담을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체의 수혈 부담에 비해 적어도 50%까지 대상체의 수혈 부담을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 또는 48개월 동안 대상체의 수혈 부담을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 무기한적으로 대상체의 수혈 부담을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체의 철 킬레이트화 요법(예를 들어, 용량 또는 빈도)에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 적어도 100%까지 대상체의 철 킬레이트화 요법(예를 들어, 용량 또는 빈도)을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체의 철 킬레이트화 요법(예를 들어, 용량 또는 빈도)에 비해 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100%까지 대상체의 철 킬레이트화 요법(예를 들어, 용량 또는 빈도)을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 또는 48개월 동안 대상체의 철 킬레이트화 요법(예를 들어, 용량 또는 빈도)을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 무기한적으로 대상체의 철 킬레이트화 요법(예를 들어, 용량 또는 빈도)을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체의 혈청 페리틴(ferritin) 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 적어도 50%까지 대상체의 혈청 페리틴 수준을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체의 혈청 페리틴 수준에 비해 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%까지 대상체의 혈청 페리틴 수준을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 또는 48개월 동안 대상체의 혈청 페리틴 수준을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 무기한적으로 대상체의 혈청 페리틴 수준을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체의 적혈구의 혈액학적 개선에 비해 적어도 1.5 g/dL, 1.8 g/dL, 2.0 g/dL, 2.2 g/dL, 2.4 g/dL, 2.6 g/dL, 2.8 g/dL, 3.0 g/dL, 3.2 g/dL, 3.4 g/dL, 3.6 g/dL, 3.8 g/dL, 또는 적어도 4.0 g/dL까지 대상체의 적혈구의 혈액학적 개선을 야기시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 또는 48개월 동안 대상체의 적혈구의 혈액학적 개선을 야기시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 무기한적으로 대상체의 적혈구의 혈액학적 개선을 야기시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 저수혈 부담 환자에 대한 적혈구의 혈액학적 개선은 적어도 8주 동안 적어도 1.5 g/dL의 환자의 헤모글로빈 농도의 증가이다. 특정 실시양태에서, 고수혈 부담 환자에 대한 적혈구의 혈액학적 개선은 8주에 걸친 RBC 수혈의 적어도 4 유닛 감소이다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체의 호중구 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 또는 적어도 500%까지 대상체의 호중구의 수준을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체의 호중구 수준에 비해 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 또는 최대 500%까지 대상체의 호중구의 수준을 감소시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제 투여의 일정 기간 이전의 대상체의 호중구 수준에 비해 적어도 리터 당 0.1 x 109, 리터 당 0.5 x 109, 리터 당 1.0 x 109, 리터 당 5 x 109, 리터 당 1.0 x 1010, 리터 당 5 x 1010, 또는 리터 당 1.0 x 1011까지 호중구의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 또는 48개월 동안 대상체에서 호중구의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제의 투여 이후에 무기한적으로 대상체에서 호중구의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 혈소판 수준에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 또는 최대 500%까지 대상체에서 혈소판의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 혈소판 수준에 비해 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 또는 최대 500%까지 대상체에서 혈소판의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 혈소판 수준에 비해 적어도 리터 당 1 x 1010, 리터 당 3 x 1010, 리터 당 5 x 1010, 리터 당 1 x 1011, 리터 당 5 x 1011, 또는 적어도 리터 당 1 x 1012까지 혈소판의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 이전 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 또는 6개월이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제를 투여한 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 또는 48개월 동안 대상체에서 혈소판의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 대상체에게 투여된 ActRII 신호전달 억제제의 용량은 ActRII 신호전달 억제제를 투여한 이후에 무기한적으로 대상체에서 혈소판의 수준을 증가시키기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.1 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다. 특정 실시양태에서, 용량은 0.75 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이이다.
본원에서 제공되는 용량(예를 들어, ActRII 신호전달 억제제의 용량 또는 제 2 활성제의 용량)과 결합되어 사용될 때, 단어 "약"은 참조된 수의 1, 5 또는 10% 이내의 임의의 수를 지칭한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 ActRII 신호전달 억제제는 피하 또는 정맥 투여된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 ActRII 신호전달 억제제는 3주에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRIIA-hFC(서열 7; 또한 소타터셉트로 지칭됨)는 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체에 3주에 1회씩 피하 투여된다. 특정 실시양태에서, ActRIIB-hFC(서열 25; 또한 루스패터셉트로 지칭됨)는 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체에 3주에 1회씩 피하 투여된다.
7.8 환자 집단
본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 설치류 및 영장류와 같은 임의의 포유동물일 수 있으며, 바람직한 실시양태에서, 인간일 수 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 기재된 방법은 설치류 및 영장류와 같은 임의의 포유동물, 바람직한 실시양태에서, 인간 대상체의 빈혈, RBC 수혈이 필요한 빈혈, MDS 및/또는 비-증식성 CMML을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 설치류 및 영장류와 같은 임의의 포유동물, 바람직한 실시양태에서, 인간 대상체에서 호중구의 수준을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 설치류 및 영장류와 같은 임의의 포유동물, 바람직한 실시양태에서, 인간 대상체에서 혈소판의 수준을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율은 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율은 적어도 15%이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율은 약 15%이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율은 약 10% 내지 약 20% 사이이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체에서 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율은 약 12% 내지 약 17% 사이이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 적어도 1:10, 적어도 1:7, 또는 적어도 1:5의 환상 철적혈모구 대 정상 적혈모구 비율을 갖는다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 혈액-관련 장애를 갖는다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 빈혈이다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 수혈이 필요한 빈혈이다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 MDS이다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 비-증식성 CMML이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 빈혈로 진단되었다. 일부 양태에서, 빈혈 대상체는 9.0 g/dL 이하의 Hb 수준을 갖는다. 일부 양태에서, 빈혈 대상체는 본원에서 제공되는 방법에 따른 치료 이전의 84일 내에 2 유닛 이상의 RBC 수혈이 필요하다. 특정 실시양태에서, 대상체는 고수혈 부담(HTB)을 갖는다. HTB 대상체는 56일 당 적어도 4 유닛의 RBC 수혈이 필요하다. 특정 실시양태에서, 대상체는 저수혈 부담(LTB)을 갖는다. LTB 대상체는 56일 당 4 유닛 미만의 RBC 수혈이 필요하다. 특정 실시양태에서, 대상체는 RBC 수혈이 필요한 대상체이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는, 예를 들어 X-연결 철적혈모구성 빈혈, 상염색체 열성 피리독신-불응성 철적혈모구성 빈혈, X-연결 철적혈모구성 빈혈 및 유전성 실조증, 근육병, 젖산증 및 철적혈모구성 빈혈, 근육병, 젖산증 및 철적혈모구성 빈혈, 티아민-반응성 거대적혈모구 빈혈, 피어슨 골수-췌장 증후근, 고리 철적혈모구를 갖는 불응성 빈혈, 고리 철적혈모구 및 뚜렷한 혈소판 증가증을 갖는 불응성 빈혈, 및 에탄올-유도 및 약물-유도 철적혈모구성 빈혈과 같은 철적혈모구성 빈혈을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 빈혈로 진단되었으며, 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%가 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 IPSS-규정된 MDS로 진단되었다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 IPSS-규정된 MDS로 진단되었으며, 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%가 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이다.
IPSS는 국제 예후 점수 체계를 지칭하며, 이는 골수이형성 증후군의 예후를 평가하는데 활용된다. 예를 들어, Greenberg et al., Blood, 1997; 89(6):2079-2088, 및 Erratum in Blood, 1998; 91:1100을 참조한다. IPSS는 저위험(0점; 5.7년의 생존기간 중앙치), 중간 1(0.5-1점; 3.5년의 생존기간 중앙치); 중간 2 위험(1.5-2.0점; 1.2년의 생존기간 중앙치); 또는 고위험(2.5-3.5점; 0.4년의 생존기간 중앙치)으로 골수이형성 증후군 환자 결과를 특징화하기 위한 기준 점수 체계를 활용한다. 점수 체계는 (i) 대상체의 골수 블라스트(bone marrow blast)의 백분율; (ii) 대상체의 핵형; 및 (iii) 및 대상체의 혈구감소증(10 g/dL 미만의 헤모글로빈 농도, 1,800/μL 미만의 절대 호중구 수, 및 100,000/μL 미만의 혈소판 수로 정의됨)을 평가한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 IPSS-R-규정된 MDS로 진단되었다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 IPSS-R-규정된 MDS로 진단되었으며, 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%가 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이다.
IPSS-R은 국제 예후 점수 체계-수정판을 지칭하며, 이는 골수이형성 증후군의 예후를 평가하는데 활용된다. 예를 들어, Greenberg et al., Blood, 2012; 120(12):2454-2465, 및 Erratum in Blood, 1998; 91 :1100을 참조한다. IPSS-R은 매우 저위험(1.5점 이하; 8.8년의 생존기간 중앙치), 저위험(1.5점 초과, 3점 이하; 5.3년의 생존기간 중앙치); 중간 위험(3점 초과, 4.5점 이하; 3년의 생존기간 중앙치); 고위험(4.5점 초과, 6점 이하; 1.6년의 생존기간 중앙치); 또는 매우 높음(6점 초과; 0.8년의 생존기간 중앙치)으로 골수이형성 증후군 환자 결과를 특징화하기 위한 기준 점수 체계를 활용한다. 점수 체계는 그 중에서도, (i) 대상체의 골수 블라스트의 백분율; (ii) 대상체의 핵형; 및 (iii) 및 대상체의 혈구감소증(10 g/dL 미만의 헤모글로빈 농도, 1,800/μL 미만의 절대 호중구 수, 및 100,000/μL 미만의 혈소판 수로 정의됨)을 평가한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 비-증식성 CMML로 진단되었다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 비-증식성 CMML로 진단되었으며, 대상체에서 적혈모구의 적어도 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 적어도 20%가 고리 철적혈모구이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 MDS를 갖는다. 특정 실시양태에서, MDS는 IPSS-규정된 저위험 MDS이다. 특정 실시양태에서, MDS는 IPSS-규정된 중간-1 위험 MDS이다. 특정 실시양태에서, MDS는 IPSS-규정된 중간-2 위험 MDS이다. 특정 실시양태에서, MDS는 IPSS-규정된 고위험 MDS이다. 특정 실시양태에서, MDS는 IPSS-R-규정된 매우 저위험 MDS이다. 특정 실시양태에서, MDS는 IPSS-R-규정된 저위험 MDS이다. 특정 실시양태에서, MDS는 IPSS-R-규정된 중간 위험 MDS이다. 특정 실시양태에서, MDS는 IPSS-R-규정된 고위험 MDS이다. 특정 실시양태에서, MDS는 IPSS-R-규정된 매우 고위험 MDS이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) MDS를 갖고, (ii) RARS를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) MDS를 갖고, (ii) RCMD-RS를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) MDS를 갖고, (ii) RARS를 가지며, (iii) RCMD-RS를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) MDS를 갖고, (ii) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) MDS를 갖고, (ii) RARS를 가지며, (iii) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) MDS를 갖고, (ii) RCMD-RS를 가지며, (iii) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) MDS를 갖고, (ii) RARS를 가지며, (iii) RCMD-RS를 갖고, (iv) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) MDS를 갖고, (ii) RARS를 가지며, (iii) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) MDS를 갖고, (ii) RCMD-RS를 가지며, (iii) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) MDS를 갖고, (ii) RARS를 가지며, (iii) RCMD-RS를 갖고, (iv) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) MDS를 갖고, (ii) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이며, (iii) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) MDS를 갖고, (ii) RARS를 가지며, (iii) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이고, (iv) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) MDS를 갖고, (ii) RCMD-RS를 가지며, (iii) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이고, (iv) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) MDS를 갖고, (ii) RARS를 가지며, (iii) RCMD-RS를 갖고, (iv) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이며, (v) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 비-증식성 CMML을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 비-증식성 CMML을 갖고, (ii) RARS를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 비-증식성 CMML을 갖고, (ii) RCMD-RS를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 비-증식성 CMML을 갖고, (ii) RARS를 가지며, (iii) RCMD-RS를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 비-증식성 CMML을 갖고, (ii) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 비-증식성 CMML을 갖고, (ii) RARS를 가지며, (iii) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 비-증식성 CMML을 갖고, (ii) RCMD-RS를 가지며, (iii) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 비-증식성 CMML을 갖고, (ii) RARS를 가지며, (iii) RCMD-RS를 갖고, (iii) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 비-증식성 CMML을 갖고, (ii) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 비-증식성 CMML을 갖고, (ii) RARS를 가지며, (iii) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 비-증식성 CMML을 갖고, (ii) RCMD-RS를 가지며, (iii) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 비-증식성 CMML을 갖고, (ii) RARS를 가지며, (iii) RCMD-RS를 갖고, (iv) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 비-증식성 CMML을 갖고, (ii) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이며, (iii) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 비-증식성 CMML을 갖고, (ii) RARS를 가지며, (iii) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이고, (iv) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 비-증식성 CMML을 갖고, (ii) RCMD-RS를 가지며, (iii) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이고, (iv) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 (i) 비-증식성 CMML을 갖고, (ii) RARS를 가지며, (iii) RCMD-RS를 갖고, (iv) 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구이며, (v) 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 비효율적인 적혈구 생성과 연관된 돌연변이를 갖는 유전자를 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 하나 이상의 스플라이싱 인자 유전자를 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 비-코딩 영역에 있다. 특정 실시양태에서, SF3B1은 SF3B1을 코딩하는 유전자이다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 코딩 영역에 있다. 특정 실시양태에서, SF3B1은 SF3B1 단백질이다. 특정 실시양태에서, SF3B1 단백질의 하나 이상의 돌연변이는 E622D, R625C, H662Q, H662D, K66N, K666T, K666Q, K666E, A672D, K700E, I704N으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 돌연변이 E662D를 갖는 SF3B1 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 돌연변이 R625C를 갖는 SF3B1 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 돌연변이 H662Q를 갖는 SF3B1 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 돌연변이 H662D를 갖는 SF3B1 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 돌연변이 K66N을 갖는 SF3B1 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 돌연변이 K666T를 갖는 SF3B1 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 돌연변이 K666Q를 갖는 SF3B1 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 돌연변이 K666E를 갖는 SF3B1 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 돌연변이 A672D를 갖는 SF3B1 단백질을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 돌연변이 K700E를 갖는 SF3B1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 돌연변이 I704N을 갖는 SF3B1 단백질을 발현한다. 구체적 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SRSF2를 발현한다. 구체적 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 DNMT3A를 발현한다. 구체적 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 TET2를 발현한다. 구체적 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 SETBP1을 발현한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 혈소판감소증을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 리터 당 1 x 1011개 미만의 혈소판을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 호중구감소증을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 리터 당 1 x 109개 미만의 절대 호중구 수를 갖는다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 μL 당 13,000개 미만의 백혈구, μL 당 12,000개 미만의 백혈구, μL 당 11,000개 미만의 백혈구, μL 당 10,000개 미만의 백혈구, μL 당 7,500개 미만의 백혈구, μL 당 500개 미만의 백혈구를 갖는다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체에서 헤모글로빈 수준은 10 g/dL, 9 g/dL, 8 g/dL, 또는 7 g/dL 미만이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체에서 헤모글로빈 수준은 7 g/dL 내지 7.5 g/dL 사이, 7.5 g/dL 내지 8 g/dL 사이, 8 g/dL 내지 8.5 g/dL 사이, 8.5 g/dL 내지 9.0 g/dL 사이, 9.0 g/dL 내지 9.5 g/dL 사이, 또는 9.5 g/dL 내지 10.0 g/dL 사이이다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 저수혈 부담을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는, 저수혈 부담을 갖는 대상체는 8주 당 최대 0, 1, 2, 또는 3 유닛의 적혈구가 필요하다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 고수혈 부담을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는, 고수혈 부담을 갖는 대상체는 8주 당 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13 유닛의 적혈구가 필요하다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 하나 이상의 ESA에 대해 비 반응, 반응의 손실, 또는 낮은 확률의 반응을 갖는다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 하나 이상의 ESA를 이용한 사전 치료를 받았거나, 하나 이상의 ESA를 이용한 사전 치료를 현재 받고 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 저메틸화제(hypomethylating agent)를 이용한 사전 치료를 받았다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 레날리도민(lenalidomine)을 이용한 사전 치료를 받았다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 아자시티딘(azacitidine), 데시타빈(decitabine), ESA, G-CSF, GM-CSG, 또는 레날리도민을 이용한 사전 치료를 받지 않았다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 하나 이상의 ESA를 이용한 치료에 대해 반응하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 하나 이상의 ESA를 이용한 치료에 대해 불응성이다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 하나 이상의 ESA를 이용한 치료에 대해 불응성이 된다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 사전 ESA 치료에 대해 불응성이다. 특정 실시양태에서, 사전 ESA 치료에 대해 불응성인 대상체는 단일 제제 또는 조합(예를 들어, G-CSF와 조합)으로서, 사전 ESA-함유 요법에 대해 비-반응 또는 더 이상 유지되지 않는 반응을 기록하였다; ESA 요법은 (a) 적어도 8회 투여 동안 40,000 IU/주를 초과하는 재조합 인간 적혈구생성인자 또는 등가물, 또는 (b) 적어도 4회 투여 동안 3주에 1회씩 500 μg을 초과하는 다베포에틴 알파(darbepoetin alpha) 또는 등가물이었다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 사전 ESA-치료에 대해 과민성(intolerant)이다. 특정 실시양태에서, 사전 ESA-치료에 대해 과민성인 대상체는 과민성 또는 부작용(adverse event)으로 인해 도입 이후 임의의 시점에 단일 제제 또는 조합(예를 들어, G-CSF와 조합)으로서, 사전 ESA-함유 요법의 중단을 기록하였다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 ESA-부적격이다. 특정 실시양태에서, ESA-부적격인 대상체는 ESA로 사전에 치료되지 않은 대상체에 대해 200 U/L을 초과하는 내생성 혈청 적혈구생성인자 수준에 기반하여 ESA에 대한 낮은 확률의 반응을 갖는다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 임의의 연령일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 18세 미만이다. 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 13세 미만이다. 다른 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 12세 미만, 11세 미만, 10세 미만, 9세 미만, 8세 미만, 7세 미만, 6세 미만, 또는 5세 미만이다. 다른 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 1-3세, 3-5세, 5-7세, 7-9세, 9-11세, 11-13세, 13-15세, 15-20세, 20-25세, 25-30세, 또는 30세 초과이다. 다른 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 30-35세, 35-40세, 40-45세, 45-50세, 50-55세, 55-60세, 또는 60세 초과이다. 다른 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 60-65세, 65-70세, 70-75세, 75-80세, 또는 80세 초과이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 MDS를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 MDS 및 무손상의 염색체 5q를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 MDS, 무손상의 염색체 5q를 가지며, 레날리도미드(lenalidomide)를 이용한 치료 실패를 기록하지 않았다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 MDS, 무손상의 염색체 5q를 가지며, 레날리도미드를 이용한 치료 실패를 기록하였다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 치료되는 대상체는 염색체 5q 결실을 갖는 MDS를 갖는다. 염색체 5q 결실을 갖는 MDS는 염색체 5의 긴 암(arm)의 결실을 포함하며, 그 중에서도, 계란형 대적혈구를 갖는 대구성 빈혈, 정상에서 약간 감소된 백혈구 수, 정상에서 증가된 혈소판 수, 및 골수 및 혈액의 5% 미만의 블라스트에 특징이 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 염색체 5q 결실을 갖는 MDS를 가지며, 레날리도미드를 이용한 치료 실패를 기록하지 않았다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 염색체 5q 결실을 갖는 MDS를 가지며, 레날리도미드를 이용한 치료 실패를 기록하였다. 특정 실시양태에서, 레날리도미드를 이용한 치료 실패는 레날리도미드에 대한 반응의 손실, 레날리도미드를 이용한 치료의 4개월 이후에 레날리도미드에 대한 비반응, 레날리도미드를 이용한 치료에 대한 과민성, 또는 레날리도미드를 이용한 치료를 불가능하게 하는 혈구감소증을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 골수 및 혈액의 5% 미만의 블라스트를 갖는다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 500 mIU/mL을 초과하는 EPO 혈청 농도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 방법에 따라 치료되는 대상체는 200 mIU/mL을 초과하는 EPO 혈청 농도를 갖는다.
7.9 ACTRII 수용체의 신호전달 억제제
본원에 포함되는 ActRII 수용체의 억제제는 ActRIIA 신호전달 억제제 및 ActRIIB 신호전달 억제제를 포함한다(아래 참조). 특정 실시양태에서, ActRII 수용체 신호전달 억제제는 ActRIIA에 대해 특이적이다. 다른 실시양태에서, ActRII 수용체 신호전달 억제제는 ActRIIB에 대해 특이적이다. 특정 실시양태에서, ActRII 수용체 신호전달 억제제는 ActRIIA를 우선적으로 억제한다. 다른 실시양태에서, ActRII 수용체 신호전달 억제제는 ActRIIB를 우선적으로 억제한다. 특정 실시양태에서, ActRII 수용체 신호전달 억제제는 ActRIIA 및 ActRIIA 양측을 억제한다.
특정 실시양태에서, ActRII 수용체의 신호전달 억제제는 ActRII의 액티빈-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 상기 액티빈-결합 도메인은 폴리펩티드 시퀘스터(sequester) 액티빈을 포함하며, 이에 따라 액티빈 신호전달을 예방한다. 폴리펩티드를 포함하는 이러한 액티빈-결합 도메인은 ActRII 수용체의 세포외 도메인 전부 또는 일부(ActRIIA의 세포외 도메인의 전부 또는 일부 또는 ActRIIB의 세포외 도메인의 전부 또는 일부)를 포함할 수 있다. 구체적 실시양태에서, ActRII 수용체의 세포외 도메인은 가용성이다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드를 포함하는 액티빈-결합 도메인은 항체의 Fc 부분에 연결된다(즉, ActRII 수용체의 폴리펩티드를 포함하는 액티빈-결합 도메인 및 항체의 Fc 부분을 포함하는 콘쥬게이트(conjugate)가 생성된다). 이론에 구애됨 없이, 항체 부위는 콘쥬게이트에 대한 증가된 안정성을 부여한다. 특정 실시양태에서, 액티빈-결합 도메인은 링커(linker), 예를 들어 펩티드 링커를 통해 항체의 Fc 부분에 연결된다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용되는 ActRII 수용체의 신호전달 억제제는 세포외적으로 또는 세포내적으로, 직접적으로 또는 간접적으로 ActRIIA 및/또는 ActRIIB를 억제하는 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용되는 ActRIIA 및/또는 ActRIIB의 신호전달 억제제는 수용체(들) 자체와의 상호작용을 통해 ActRIIA 및/또는 ActRIIB를 억제한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용되는 ActRIIA 및/또는 ActRIIB의 신호전달 억제제는 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 리간드, 예를 들어 액티빈과의 상호작용을 통해 ActRIIA 및/또는 ActRIIB를 억제한다.
7.9.1 ACTRIIA의 신호전달 억제제
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "ActRIIA"는 임의의 종으로부터의 액티빈 수용체 IIa형(ActRIIA) 단백질 및 돌연변이유발 또는 다른 변형에 의해 상기 ActRIIA 단백질로부터 유래된 변이체의 패밀리를 지칭한다. 본원의 ActRIIA에 대한 참조는 현재 확인된 형태 중 어느 하나에 대한 참조임을 이해해야 한다. ActRIIA 패밀리의 구성원은 일반적으로 시스테인이 풍부한 영역을 갖는 리간드-결합 세포외 도메인, 막관통(transmembrane) 도메인, 및 예측된 세린-트레오닌 키나아제 활성을 갖는 세포질 도메인으로 구성된 막관통 단백질이다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용될 ActRIIA 신호전달 억제제는, 비제한적으로, 액티빈-결합 가용성 ActRIIA 폴리펩티드; 액티빈(특히 액티빈 A 또는 B 서브유닛, 또한 βA 또는 βB로 지칭됨)에 결합하고 ActRIIA 결합을 방해하는 항체; ActRIIA에 결합하고 액티빈 결합을 방해하는 항체; 액티빈 또는 ActRIIA 결합을 위해 선택된 비-항체 단백질(예를 들어, WO/2002/088171, WO/2006/055689, WO/2002/032925, WO/2005/037989, US 2003/0133939, 및 US 2005/0238646, 이들 각각은 그 전체가, 예를 들어 상기 단백질 및 이의 설계 및 선택을 위한 방법이 참고로서 본원에 포함된다); 및 액티빈 또는 ActRIIA 결합을 위해 선택되며, Fc 도메인에 콘쥬게이트될 수 있는 무작위 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 액티빈 또는 ActRIIA 결합 활성을 갖는 2 이상의 상이한 단백질[또는 다른 모이어티(moiety)], 특히 I형(예를 들어, 가용성 I형 액티빈 수용체) 및 II형(예를 들어, 가용성 II형 액티빈 수용체) 결합 부위를 각각 차단하는 액티빈 바인더(binder)는 ActRIIA를 억제하는 이기능적(bifunctional) 또는 다기능적 결합 분자를 형성하기 위해 함께 연결될 수 있고, 이에 따라 본원에 기재된 조성물 및 이를 포함하는 방법에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, ActRIIA를 억제하는 액티빈-ActRIIA 신호전달 축 길항제는 핵산 앱타머(aptamer), 소분자 및 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 다른 약제(agent)를 포함한다.
(a) ActRIIA 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIA 신호전달 억제제
용어 "ActRIIA 폴리펩티드"는 ActRIIA 패밀리 구성원의 임의의 천연 산출 폴리펩티드뿐만 아니라, 유용한 활성을 유지하는 이의 임의의 변이체[변종(mutant), 단편(fragment), 융합체, 및 펩티도미메틱(peptidomimetic) 형태를 포함한다]를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드의 서열에 대해 적어도 약 80%가 동일한 서열을 갖고, 임의로 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 임의의 공지된 ActRIIA의 서열로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드는 ActRIIA 단백질 및/또는 액티빈에 결합하고, 이의 기능을 억제할 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드는 뼈 성장 및 뼈 무기질화(mineralization)를 촉진시키는 그의 능력으로 인해 선택될 수 있다. ActRIIA 폴리펩티드의 예는 인간 ActRIIA 전구체 폴리펩티드(서열 1) 및 가용성 인간 ActRIIA 폴리펩티드(예를 들어, 서열 2, 3, 7 및 12)를 포함한다. 아미노산 서열이 서열 1에 도시된 ActRIIA 전구체 폴리펩티드에 대해, 인간 ActRIIA 전구체 폴리펩티드의 시그널 펩티드는 아미노산 위치 1 내지 20에 위치해 있으며; 세포외 도메인은 아미노산 위치 21 내지 135에 위치해 있고, 인간 ActRIIA 전구체 폴리펩티드(서열 1)의 N-연결 글리코실화(glycosylation) 부위는 서열 1의 아미노산 위치 43 및 56에 위치해 있다. 서열 1의 인간 ActRIIA 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 서열 4[Genbank 엔트리(entry) NM_001616의 뉴클레오티드 164-1705]로 개시되어 있다. 서열 2의 가용성 인간 ActRIIA 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 서열 5로 개시되어 있다. 서열의 기재에 대해 표 21을 참조한다.
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRIIA 폴리펩티드는 가용성 ActRIIA 폴리펩티드이다. ActRIIA 단백질의 세포외 도메인은 액티빈에 결합될 수 있고, 일반적으로 가용성이므로, 가용성, 액티빈-결합 ActRIIA 폴리펩티드로 지칭될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "가용성 ActRIIA 폴리펩티드"는 일반적으로 ActRIIA 단백질의 임의의 천연 산출 세포외 도메인뿐만 아니라, 이의 임의의 변이체(변종, 단편, 및 펩티도미메틱 형태를 포함한다)를 비롯한, ActRIIA 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 가용성 ActRIIA 폴리펩티드는 액티빈에 결합될 수 있다; 그러나, 야생형 ActRIIA 단백질은 GDF8/11에 비해 액티빈에 대한 결합에 유의미한 선택성을 나타내지 않는다. 천연의(native) 또는 변경된 ActRIIA 단백질은 이들과 제2, 액티빈-선택적 결합제(binding agent)의 커플링에 의해 액티빈에 대한 추가적 특이성을 가질 수 있다. 가용성, 액티빈-결합 ActRIIA 폴리펩티드의 예는 서열 2, 3, 7, 12 및 13에 예시된 가용성 폴리펩티드를 포함한다. 가용성, 액티빈-결합 ActRIIA 폴리펩티드의 다른 예는 ActRIIA 단백질의 세포외 도메인 이외에 시그널 서열, 예를 들어 꿀벌 멜리틴 리더(leader) 서열(서열 8), 조직 플라스미노겐 활성인자(TPA) 리더(서열 9) 또는 천연 ActRIIA 리더(서열 10)를 포함한다. 서열 13에 예시된 ActRIIA-hFc 폴리펩티드는 TPA 리더를 사용한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRIIA의 신호전달 억제제는 항체의 Fc 부분에 연결된 ActRIIA의 액티빈-결합 도메인을 포함하는 콘쥬게이트/융합 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 액티빈-결합 도메인은 링커, 예를 들어 펩티드 링커를 통해 항체의 Fc 부분에 연결된다. 임의로, Fc 도메인은 Asp-265, lysine 322, 및 Asn-434와 같은 잔기에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 특정 경우에, 하나 이상의 이러한 돌연변이(예를 들어, Asp-265 돌연변이)를 갖는 변종 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비해 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합 능력을 갖는다. 다른 경우에, 하나 이상의 이러한 돌연변이(예를 들어, Asn-434 돌연변이)를 갖는 변종 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비해 MHC 클래스 I-관련 Fc 수용체(FcRN)에 대한 증가된 결합 능력을 갖는다. Fc 도메인에 융합되는 ActRIIA의 가용성 세포외 도메인을 포함하는 예시적인 융합 단백질은 서열 6, 7, 12, 및 13에 기재되어 있다.
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRIIA 신호전달 억제제는 ActRIIA의 세포외 도메인, 또는 항체의 Fc 부분에 연결된 그의 일부를 포함하고, 상기 ActRIIA 신호전달 억제제는 서열 6, 7, 12, 및 13으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 75%가 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRIIA 신호전달 억제제는 ActRIIA의 세포외 도메인, 또는 항체의 Fc 부분에 연결된 그의 일부를 포함하고, 상기 ActRIIA 신호전달 억제제는 서열 6, 7, 12, 및 13으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRIIA의 신호전달 억제제는 ActRIIA의 세포외 도메인의 절단(truncated) 형태를 포함한다. 절단은 ActRIIA 폴리펩티드의 카르복시 말단 및/또는 아미노 말단에 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, 절단은 성숙한 ActRIIA 폴리펩티드 세포외 도메인에 대하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 아미노산 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 절단은 성숙한 ActRIIA 폴리펩티드 세포외 도메인의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 N-말단 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, 절단은 성숙한 ActRIIA 폴리펩티드 세포외 도메인의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 C-말단 아미노산일 수 있다. 예를 들어, ActRIIA의 절단 형태는 아미노산 20-119; 20-128; 20-129; 20-130; 20-131; 20-132; 20-133; 20-134; 20-131; 21-131; 22-131; 23-131; 24-131; 및 25-131을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 상기 아미노산 위치는 서열 1의 아미노산 위치를 지칭한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRIIA의 신호전달 억제제는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 ActRIIA의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRIIA의 신호전달 억제제는 또한 아미노산 치환을 수반하는 ActRIIA 세포외 도메인의 절단 형태를 포함한다.
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 ActRIIA 신호전달 억제제는 인간 ActRIIA 수용체의 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질이다. 다른 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 ActRIIA 신호전달 억제제는 인간 ActRIIA 수용체의 절단된 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질이다. 다른 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 ActRIIA 신호전달 억제제는 인간 ActRIIA 수용체의 절단된 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질이고, 상기 인간 ActRIIA 수용체의 절단된 세포외 도메인은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
ActRIIA 폴리펩티드의 기능적 활성 단편은, 예를 들어 ActRIIA 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 대응 단편(fragment)으로부터 재조합적으로 생산된 폴리펩티드를 스크리닝(screening)함으로써 수득될 수 있다. 또한, 단편은 종래의 메리필드 고상 f-Moc 또는 t-Boc 화학법과 같은 당업계에 공지된 기술을 사용해 화학적으로 합성될 수 있다. 단편은 ActRIIA 단백질의 길항제(억제제) 또는 액티빈에 의해 매개되는 신호전달의 길항제(억제제)로서 기능할 수 있는 펩티드 단편을 확인하기 위해 (재조합적으로 또는 화학적 합성에 의해) 생산 및 검사될 수 있다.
또한, ActRIIA 폴리펩티드의 기능적 활성 변이체는, 예를 들어 ActRIIA 폴리펩티드를 코딩하는 대응 돌연변이화 핵산으로부터 재조합적으로 생산된 변형 폴리펩티드의 라이브러리(library)를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 상기 변이체는 ActRIIA 단백질의 길항제(억제제) 또는 액티빈에 의해 매개되는 신호전달의 길항제(억제제)로서 기능할 수 있는 것들을 확인하기 위해 생산 및 검사될 수 있다. 특정 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드의 기능적 변이체는 서열 2 또는 3으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 경우에, 상기 기능적 변이체는 서열 2 또는 3으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
기능적 변이체는, 예를 들어 치료상 효능(efficacy), 또는 안정성[예를 들어, 생체외(ex vivo) 저장 수명 및 생체내(in vivo) 단백질 분해(proteolytic degradation)에 대한 저항성]을 향상시키는 것과 같은 목적을 위해 ActRIIA 폴리펩티드의 구조를 변형함으로써 생성될 수 있다. 액티빈 결합을 유지하기 위해 선택될 때, 상기 변형 ActRIIA 폴리펩티드는 천연 산출 ActRIIA 폴리펩티드의 기능적 등가물로 간주된다. 또한, 변형 ActRIIA 폴리펩티드는, 예를 들어 아미노산 치환, 결실, 또는 첨가에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 이소류신 또는 발린을 이용한 류신의 치환, 글루타메이트를 이용한 아스파테이트(aspartate)의 치환, 세린을 사용한 트레오닌의 치환, 또는 구조적으로 관련된 아미노산을 이용한 아미노산의 유사한 치환(예를 들어, 보존성 돌연변이)이, 결과로 생긴 분자의 생물학적 활성에 대해 주요한 효과를 갖지 않을 것이라고 예상하는 것은 타당하다. 보존성 치환은 그 측쇄와 관련된 아미노산 패밀리 내에 발생하는 것이다. ActRIIA 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변화가 기능적 상동체를 야기하는지 여부는 야생형 ActRIIA 폴리펩티드와 유사한 방식으로 세포 반응을 생성하는 변이체 ActRIIA 폴리펩티드의 능력을 평가함으로써 손쉽게 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에는 폴리펩티드의 글리코실화를 변경시킬 수 있는 ActRIIA 폴리펩티드의 특정 돌연변이가 제공된다. 상기 돌연변이는 O-연결 또는 N-연결 글리코실화 부위와 같은 하나 이상의 글리코실화 부위를 도입 또는 제거하도록 선택될 수 있다. 아스파라긴-연결 글리코실화 인식 부위는 일반적으로 적절한 세포 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌(또는 아스파라긴-X-세린)(여기서, "X"는 임의의 아미노산이다)을 포함한다. 또한, 상기 변경은 야생형 ActRIIA 폴리펩티드의 서열에 대한(O-연결 글리코실화 부위에 대한) 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가, 또는 이에 의한 치환에 의해 이루어질 수 있다. 글리코실화 인식 부위의 제 1 또는 제 3 아미노산 위치 중 하나 또는 양측에서 다양한 아미노산 치환 또는 결실(및/또는 제 2 위치에서의 아미노산 결실)은 변형된 트리펩티드 서열에서 비-글리코실화를 야기한다. ActRIIA 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 수량을 증가시키는 다른 수단은 ActRIIA 폴리펩티드에 대하여 글리코시드를 화학적 또는 효소적으로 결합시키는 것에 의한 것이다. 사용된 결합 방식에 따라, 당(sugar)(들)이 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 유리(free) 카르복시기; (c) 시스테인의 것과 같은 유리 설프히드릴기; (d) 세린, 트레오닌, 또는 히드록시프롤린의 것과 같은 유리 히드록시기; (e) 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 것과 같은 방향족 잔기; 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 이러한 방법은 본원에 참고로 포함되는, 1987년 9월 11일에 공개된 WO 87/05330, 및 Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306에 개시되어 있다. ActRIIA 폴리펩티드에 존재하는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적 및/또는 효소적으로 수행될 수 있다. 화학적 탈글리코실화(deglycosylation)는, 예를 들어 트리플루오로메탄술폰산 화합물, 또는 등가 화합물에 ActRIIA 폴리펩티드를 노출시키는 것을 포함한다. 이러한 처리는 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분의 또는 모든 당의 절단(cleavage)을 야기하는 반면에, 아미노산 서열은 무손상으로 남겨둔다. 화학적 탈글리코실화는 Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131에 의해 더 기재되어 있다. ActRIIA 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350에 의해 기재된 바와 같이 다양한 내생(endo)- 및 외생(exo)-글리코시다아제의 사용에 의해 달성될 수 있다. 포유동물, 효모, 곤충 및 식물 세포는 모두 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받을 수 있는 상이한 글리코실화 패턴을 도입할 수 있으므로, ActRIIA 폴리펩티드의 서열은 사용된 발현계의 유형에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 일반적으로, 다른 포유동물 발현 세포주, 조작된(engineered) 글리코실화 효소를 갖는 효모 세포주 및 곤충 세포와 같은 다른 발현계도 유용할 것으로 예상되나, 인간에 사용하기 위한 ActRIIA 단백질은 HEK293 또는 CHO 세포주와 같은 적합한 글리코실화를 제공하는 포유동물 세포주에서 발현될 것이다.
본원에는 변종, 특히 ActRIIA 폴리펩티드의 조합적 변종의 세트, 및 절단 변종을 생성하는 방법이 더 제공되며; 조합적 변종의 풀(pool)은 기능적 변이체 서열을 확인하는데 특히 유용하다. 상기 조합적 라이브러리(combinatorial library)를 스크리닝하는 목적은, 예를 들어 작용제 또는 길항제로서 작용할 수 있거나, 대안적으로 다 함께 신규한 활성을 보유하는 ActRIIA 폴리펩티드 변이체를 생성하기 위한 것이다. 다양한 스크리닝 에세이가 아래에 제공되며, 이러한 에세이는 변이체를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드 변이체는 ActRIIA 리간드에 결합하는 능력, ActRIIA 폴리펩티드에 대한 ActRIIA 리간드의 결합을 예방하는 능력 또는 ActRIIA 리간드에 의해 야기된 신호전달을 방해하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.
천연 산출 ActRIIA 폴리펩티드에 비해 선택적 또는 일반적으로 증가된 효력(potency)을 갖는 조합적-유래 변이체가 생성될 수 있다. 마찬가지로, 돌연변이유발은 대응 야생형 ActRIIA 폴리펩티드와 극적으로 상이한 세포내 반감기를 갖는 변이체를 야기할 수 있다. 예를 들어, 변경된 단백질은 단백질 분해 또는 천연 ActRIIA 폴리펩티드의 파괴 또는 그외에 불활성화를 야기하는 다른 세포 과정에 대해 더 안정되거나 덜 안정될 수 있다. 이러한 변이체, 및 이를 코딩하는 유전자는 ActRIIA 폴리펩티드의 반감기를 조절함으로써 ActRIIA 폴리펩티드 수준을 변경시키기 위해 활용될 수 있다. 예를 들어, 짧은 반감기는 더 많은 일시적인 생물학적 효과를 야기할 수 있으며, 대상체에서 재조합 ActRIIA 폴리펩티드 수준의 더 엄격한 조절을 허용할 수 있다. Fc 융합 단백질에서, 돌연변이는 단백질의 반감기를 변경시키기 위해 링커 (존재한다면) 및/또는 Fc 부분에서 이루어질 수 있다.
조합적 라이브러리는 잠재적 ActRIIA 폴리펩티드 서열의 적어도 일부를 각각 포함하는 폴리펩티드의 라이브러리를 코딩하는 유전자의 축퇴(degenerate) 라이브러리의 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 잠재적 ActRIIA 폴리펩티드 뉴클레오티드 서열의 축퇴 세트가 개별 폴리펩티드로서, 또는 대안적으로 더 큰 융합 단백질의 세트(파지 디스플레이(phage display)에 대해)로서 발현 가능하도록, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물은 유전자 서열로 효소적으로 결찰(ligate)될 수 있다.
잠재적 상동체(homolog)의 라이브러리가 축퇴 올리고뉴클레오티드 서열로부터 생성될 수 있는 많은 방법이 있다. 축퇴 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 수행될 수 있으며, 이후에 합성 유전자는 발현을 위해 적절한 벡터에 결찰될 수 있다. 축퇴 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 공지되어 있다[예를 들어, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp 273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477 참조]. 이러한 기술은 다른 단백질의 지향성 진화(directed evolution)에 이용되었다[예를 들어, Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; 및 미국 특허 제5,223,409호, 제5,198,346호, 및 제5,096,815호 참조].
대안적으로, 조합적 라이브러리를 생성하기 위해 돌연변이유발의 다른 형태가 활용될 수 있다. 예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드 변이체는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 등을 사용한 스크리닝[Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; 및 Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085]에 의해, 링커 스캐닝 돌연변이유발[Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316]에 의해; 포화 돌연변이유발[Meyers et al., (1986) Science 232:613]에 의해; PCR 돌연변이유발[Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1 :11-19]에 의해; 또는 화학적 돌연변이유발 등을 비롯한, 무작위 돌연변이유발[Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; 및 Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]에 의해 라이브러리로부터 생성 및 단리될 수 있다. 링커 스캐닝 돌연변이유발은, 특히 조합적 세팅에서, ActRIIA 폴리펩티드의 절단[생체활성(bioactivity)] 형태를 확인하기 위한 매력적인 방법이다.
점 돌연변이 및 절단에 의해 제조된 조합적 라이브러리의 유전자 산물을 스크리닝하고, 특정 특성을 갖는 유전자 산물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 광범위한 수법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 수법은 ActRIIA 폴리펩티드의 조합적 돌연변이유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝을 위해 일반적으로 변경될 수 있다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위해 가장 광범위하게 사용되는 수법은 복제 가능한 발현 벡터에 유전자 라이브러리를 클로닝(cloning)하는 단계, 생성된 벡터의 라이브러리를 이용해 적절한 세포를 형질전환시키는 단계, 및 소망하는 활성의 검출이, 산물이 검출된 유전자를 코딩하는 벡터의 비교적 용이한 단리를 촉진시키는 조건에서 조합 유전자를 발현하는 단계를 전형적으로 포함한다. 바람직한 에세이는 액티빈 결합 에세이 및 액티빈-매개 세포 신호전달 에세이를 포함한다.
특정 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드에 자연적으로 존재하는 임의의 것 이외에 번역후 변형(post-translational modification)을 더 포함할 수 있다. 이러한 변형은 아세틸화, 카르복시화, 글리코실화, 인산화, 지질화, 및 아실화를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 결과적으로, 변형 ActRIIA 폴리펩티드는 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 다당류 또는 단당류, 및 포스페이트와 같은 비-아미노산 요소를 함유할 수 있다. ActRIIA 폴리펩티드의 기능에 대한 상기 비-아미노산 요소의 효과는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 검사될 수 있다. ActRIIA 폴리펩티드의 초기 형태를 절단함으로써, ActRIIA 폴리펩티드가 세포에서 생성될 때, 번역후 프로세싱(post-translational processing)은 또한, 단백질의 정확한 폴딩(folding) 및/또는 기능을 위해 중요할 수 있다. 상이한 세포들(CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3 또는 HEK293과 같은)은 상기 번역후 활성을 위해 특이적 세포 기구 및 특징적 기전을 가지며, ActRIIA 폴리펩티드의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하기 위해 선택될 수 있다.
특정 양태에서, ActRIIA 폴리펩티드의 기능적 변이체 또는 변형된 형태는 ActRIIA 폴리펩티드의 적어도 일부 및 하나 이상의 융합 도메인을 갖는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 융합 도메인의 공지된 예는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S 전달효소(GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 중쇄 불변 영역(Fc), 말토오스 결합 단백질(MBP), 또는 인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 융합 도메인은 소망하는 특성을 부여하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 융합 도메인은 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리를 위해 특히 유용하다. 친화성 정제(affinity purification)의 목적을 위해, 글루타티온-, 아밀라아제-, 및 니켈- 또는 코발트-콘쥬게이트된 수지(resin)와 같은 친화성 크로마토그래피에 대한 관련 매트릭스(matrix)가 사용된다. 수많은 상기 매트릭스는 파마시아(Pharmacia) GST 정제 시스템 및 (HIS6) 융합 파트너로 유용한 QIAexpress.TM. 시스템[퀴아젠(Qiagen)]과 같은 "키트" 형태로 이용 가능하다. 다른 예로서, 융합 도메인은 ActRIIA 폴리펩티드의 검출을 가능하게 하기 위해 선택될 수 있다. 상기 검출 도메인의 예는 다양한 형광성 단백질(예를 들어, GFP)뿐만 아니라, 특이적 항체가 이용 가능한 보통 짧은 펩티드 서열인 "에피토프 태그(epitope tag)"를 포함한다. 특이적 단일클론 항체가 손쉽게 이용 가능한 공지된 에피토프 태그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 혈구응집소(hemagglutinin)(HA), 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에, 융합 도메인은 인자 Xa 또는 트롬빈과 같은 프로테아제 절단 부위를 가지며, 이는 관련 프로테아제가 부분적으로 융합 단백질을 분해시켜, 이로부터 재조합 단백질을 유리시킨다. 유리된 단백질은 이후에, 후속 크로마토그래피 분리에 의해 융합 도메인으로부터 단리될 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드를 생체내에서 안정화시키는 도메인("안정제" 도메인)과 융합된다. "안정화"란 파괴감소, 신장 클리어란스(clearance) 감소, 또는 다른 약동학적 효과 때문인지 여부에 관계 없이, 혈청 반감기를 증가시키는 모든 것을 의미한다. 면역글로불린의 Fc 부분과의 융합은 광범위한 단백질 상에 소망하는 약동학적 특성을 부여하는 것으로 공지되어 있다. 마찬가지로, 인간 혈청 알부민에 대한 융합은 소망하는 특성을 부여할 수 있다. 선택될 수 있는 다른 유형의 융합 도메인은 다량화(예를 들어, 이량화, 4량화) 도메인 및 기능적 도메인(소망하는 바와 같이, 뼈 성장 또는 근육 성장의 추가 자극과 같은 추가의 생물학적 기능을 부여한다)을 포함한다.
융합 단백질의 상이한 요소는 소망하는 기능성과 일치하는 임의의 방식으로 배열될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드는 이종 도메인에 대해 C-말단에 위치할 수 있거나, 대안적으로 이종 도메인은 ActRIIA 폴리펩티드에 대해 C-말단에 위치할 수 있다. ActRIIA 폴리펩티드 도메인과 이종 도메인이 융합 단백질에서 인접할 필요는 없으며, 추가 도메인 또는 아미노산 서열은 어느 하나의 도메인 또는 도메인들 사이에 대해 C- 또는 N-말단에 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 ActRIIA 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드를 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 변형을 함유한다. 예를 들어, 이러한 변형은 ActRIIA 폴리펩티드의 시험관내(in vitro) 반감기를 향상, ActRIIA 폴리펩티드의 순환 반감기를 향상, 또는 ActRIIA 폴리펩티드의 단백질 분해를 감소시킨다. 이러한 안정화 변형은 융합 단백질(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드 및 안정제 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함), 글리코실화 부위의 변형(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 첨가를 포함), 및 탄수화물 모이어티의 변형(예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드로부터 탄수화물 모이어티의 제거를 포함)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 융합 단백질의 경우에, ActRIIA 폴리펩티드는 IgG 분자(예를 들어, Fc 도메인)와 같은 안정제 도메인에 융합된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "안정제 도메인"은 융합 단백질의 경우로서 융합 도메인(예를 들어, Fc)을 지칭할뿐 아니라, 탄수화물 모이어티와 같은 비단백질성 변형, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비단백질성 고분자를 포함한다.
특정 실시양태에서, 다른 단백질로부터 단리되거나, 그 이외에 다른 단백질이 실질적으로 없는, ActRIIA 폴리펩티드의 단리된 및/또는 정제된 형태는 본원에 기재된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. ActRIIA 폴리펩티드는 일반적으로 재조합 핵산으로부터의 발현에 의해 생산될 것이다.
특정 양태에서, 본원에는 본원에 기재된 단편, 기능적 변이체 및 융합 단백질을 비롯한, 임의 ActRIIA 폴리펩티드(예를 들어, 가용성 ActRIIA 폴리펩티드)를 코딩하는 단리된 및/또는 재조합 핵산이 제공된다. 예를 들어, 서열 4는 천연 산출 인간 ActRIIA 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 반면에, 서열 5는 ActRIIA의 가공된(processed) 세포외 도메인을 코딩한다. 본 핵산은 단일-가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이러한 핵산은, 예를 들어 ActRIIA 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법에서, 또는 직접 치료제로서(예를 들어, 유전자 치료 접근법에서) 사용될 수 있다.
특정 양태에서, ActRIIA 폴리펩티드를 코딩하는 상기 핵산은 서열 4 또는 5의 변이체인 핵산을 포함하는 것으로 더 이해된다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 대립형질 변이체(allelic variant)와 같은 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실에 의해 상이한 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에는 서열 4 또는 5에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 단리된 또는 재조합 핵산 서열이 제공된다. 당업자는 서열 4 또는 5에 대해 상보적인 핵산 서열, 및 서열 4 또는 5의 변이체 또한 본원에 포함됨을 인지할 것이다. 추가적 실시양태에서, 본원에서 제공되는 핵산 서열은 단리되고, 재조합이며 이종 뉴클레오티드 서열과, 또는 DNA 라이브러리에서 융합될 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에서 제공되는 핵산은 또한, 매우 엄격한(stringent) 조건에서 서열 4 또는 5에 표시된 뉴클레오티드 서열, 서열 4 또는 5의 보체 서열, 또는 그의 단편에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 당업자는 DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄격한 조건이 다양해질 수 있음을 손쉽게 이해할 것이다. 당업자는 DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄격(stringency) 조건이 다양해질 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 당업자는 약 45℃에서 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)으로 혼성화를 6회 수행하고, 이어서 50℃에서 SSC의 세척을 2회 수행할 수 있다. 예를 들어, 세척 단계의 염 농도는 50℃에서 SSC로 약 2회의 낮은 엄격도로부터 50℃에서 SSC로 2회의 높은 엄격도까지 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계의 온도는 약 22℃인 실온의 낮은 엄격도 조건으로부터 약 65℃의 높은 엄격도 조건까지 증가될 수 있다. 온도 및 염 양측은 다양해질 수 있거나, 다른 변수는 변경되는 반면, 온도 또는 염 농도는 일정하게 유지될 수 있다. 일 실시양태에서, 실온에서 SSC로 6회에 이은 실온에서 SSC로 2회 세척의 낮은 엄격도 조건 하에서 혼성화되는 핵산은 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.
또한, 유전자 코드의 축퇴(degeneracy)로 인해 서열 4 또는 5에 개시된 핵산과 상이한, 단리된 핵산이 본원에 포함된다. 예를 들어, 수많은 아미노산이 하나를 초과하는 트리플렛(triplet)으로 표기된다. 동일한 아미노산, 또는 동의어(예를 들어, CAU 및 CAC는 히스티딘에 대한 동의어이다)를 명시하는 코돈은 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 "침묵" 돌연변이를 야기할 수 있다. 그러나, 본 단백질의 아미노산 서열의 변화를 초래하는 DNA 서열 다형성(polymorphism)이 포유동물 세포 중에 존재할 것으로 예상된다. 당업자는 특정 단백질을 코딩하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드(뉴클레오티드의 약 3-5%를 초과)의 이러한 변이가 천연의 대립형질 변이로 인해 소정 종의 개체들 중에 존재할 수 있음을 인식할 것이다. 임의의 그리고 모든 상기 뉴클레오티드 변이 및 결과적인 아미노산 다형성이 본원에 포함된다.
특정 실시양태에서, 재조합 핵산은 발현 작제물(expression construct)의 하나 이상의 조절(regulatory) 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결(operably linked)될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 발현을 위해 사용된 숙주세포에 대해 적절할 것이다. 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열의 많은 유형이 다양한 숙주세포에 대해 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 상기 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더(leader) 또는 시그널 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서(enhancer) 또는 활성인자(activator) 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 당업계에 공지된 구성 또는 유도성 프로모터가 본원에서 고려된다. 프로모터는 천연 산출 프로모터이거나, 하나 이상의 프로모터 요소들을 조합한 혼성 프로모터일 수 있다. 발현 작제물은 플라스미드와 같은 에피솜 상의 세포에 존재할 수 있거나, 발현 작제물은 염색체에 삽입될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주세포의 선택을 허용하도록 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 선택가능한 마커 유전자는 당업계에 공지되어 있으며 사용되는 숙주세포에 따라 변경될 것이다.
특정 양태에서, ActRIIA 폴리펩티드를 코딩하고 적어도 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 내에 본 핵산이 제공된다. 조절 서열은 당업계에 공지되어 있으며, ActRIIA 폴리펩티드의 발현을 지시하기 위해 선택된다. 따라서, 용어 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현 조절 요소들을 포함한다. 예시적 조절 서열은 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 기재되어 있다. 예를 들어, 작동가능하게 연결되었을 때, DNA 서열의 발현을 조절하는 임의의 다양한 발현 조절 서열은 ActRIIA 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 발현시키기 위해 이들 벡터에서 사용될 수 있다. 이러한 유용한 발현 조절 서열은, 예를 들어 SV40의 초기 및 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 거대세포바이러스(cytomegalovirus) 즉시 초기(immediate early) 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, 발현이 T7 RNA 폴리메라아제(polymerase)에 의해 지시되는 T7 프로모터, 파지 람다(phage lambda)의 주요 오퍼레이터(operator) 및 프로모터 영역, fd 외피단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 당분해 효소(glycolytic enzyme)에 대한 프로모터, 산성 포스파타아제의 프로모터, 예를 들어, Pho5, 효모 .알파.-메이팅(mating) 인자의 프로모터, 배큘로바이러스(baculovirus)계의 폴리헤드론(polyhedron) 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 공지된 다른 서열, 및 이들의 다양한 조합을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및/또는 발현되기를 소망하는 단백질의 유형과 같은 인자에 의존할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 벡터의 복제 개수, 항생제 마커와 같은 벡터에 의해 코딩되는 임의의 다른 단백질의 복제 개수와 발현을 조절하는 능력 역시 고려되어야 한다.
본원에서 제공되는 재조합 핵산은 원핵 세포, 진핵 세포(효모, 조류, 곤충 또는 포유동물) 중 어느 하나, 또는 양측의 발현에 적합한 벡터내로 클로닝된 유전자, 또는 이의 일부를 결찰시킴으로써 생산될 수 있다. 재조합 ActRIIA 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 비히클(vehicle)은 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 예를 들어, 적합한 벡터는 다음 유형의 플라스미드를 포함한다: pBR322-유래 플라스미드, pEMBL-유래 플라스미드, pEX-유래 플라스미드, pBTac-유래 플라스미드 및 대장균(E. coli)과 같은 원핵 세포의 발현을 위한 pUC-유래 플라스미드.
일부 포유동물 발현 벡터는 세균내 벡터의 번식을 가능하게 하기 위한 원핵 서열, 및 진핵 세포에서 발현되는 하나 이상의 진핵 전사 유닛 양측을 함유한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유래 벡터는 진핵 세포의 형질감염(transfection)에 적합한 포유동물 발현 벡터의 예이다. 이러한 벡터의 일부는 원핵 및 진핵 세포 양측의 복제 및 약제 내성 선택을 가능하게 하기 위해, pBR322와 같은 세균 플라스미드로부터의 서열을 이용하여 변형된다. 대안적으로, 소유두종 바이러스(bovine papilloma virus)(BPV-1), 또는 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus)(pHEBo, pREP-유래 및 p205)와 같은 바이러스의 파생물이 진핵 세포에서 단백질의 일과성(trasient) 발현을 위해 사용될 수 있다. 다른 바이러스성(레트로바이러스성 포함) 발현계의 예는 유전자 치료 전달계의 하기 기재에서 발견될 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 유기체의 형질전환에 이용되는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 원핵 및 진핵 세포 양측에 적합한 발현계뿐 아니라, 일반적인 재조합 절차에 대해, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)를 참조한다. 일부 예에서, 배큘로바이러스 발현계의 사용에 의해 재조합 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 배큘로바이러스 발현계의 예는 pVL-유래 벡터(pVL1392, pVL1393 및 pVL941과 같은), pAcUW-유래 벡터(pAcUW1과 같은), 및 pBlueBac-유래 벡터(.베타.-gal 함유 pBlueBac III과 같은)를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 벡터는 Pcmv-스크립트(Script) 벡터(Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 벡터(Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 및 pCI-neo 벡터(Promega, Madison, Wis.)와 같이, CHO 세포에서 ActRIIA 폴리펩티드의 생산을 위해 설계될 수 있다. 명백한 바와 같이, 상기 유전자 작제물은 배양액(culture)에서 증식된 세포에서 ActRIIA 폴리펩티드의 발현을 야기하기 위해, 예를 들어 정제를 위한 융합 단백질 및 변이체 단백질을 비롯한, 단백질을 생산하기 위해, 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 상기 ActRIIA 폴리펩티드에 대한 코딩 서열(예를 들어, 서열 4 또는 5)을 포함하는 재조합 유전자에 의해 형질감염된 숙주 세포와 관련되어 있다. 숙주세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 ActRIIA 폴리펩티드는 대장균(E. coli)과 같은 세균 세포, 곤충 세포(예를 들어, 배큘로바이러스 발현계를 사용), 효모, 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주세포는 당업계에 공지되어 있다.
따라서, 본원에는 ActRIIA 폴리펩티드를 생산하는 방법이 제공된다. 예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포는 ActRIIA 폴리펩티드의 발현이 생기게하는 적절한 조건 하에서 배양될 수 있다. ActRIIA 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드를 함유한 세포와 배지의 혼합물로부터 분비 및 단리될 수 있다. 대안적으로, ActRIIA 폴리펩티드는 세포질로, 또는 막 분획 내에 보유될 수 있고, 세포는 수확되어 용해되며, 단백질은 단리된다. 세포 배양액은 숙주세포, 배지 및 다른 부산물을 포함한다. 세포 배양에 적합한 배지는 당업계에 공지되어 있다. 상기 ActRIIA 폴리펩티드는 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과(ultrafiltration), 전기영동, ActRIIA 폴리펩티드의 특정 에피토프에 대해 특이적인 항체를 이용한 면역친화성 정제 및 ActRIIA 폴리펩티드에 융합된 도메인에 결합하는 제제를 이용한 친화성 정제[예를 들어, 단백질 A 칼럼(column)은 ActRIIA-Fc 융합물을 정제하기 위해 사용될 수 있다]를 비롯해, 단백질을 정제하기 위해 당업계에 공지된 기술을 사용해 세포 배양 배지, 숙주세포, 또는 양측으로부터 단리될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, ActRIIA 폴리펩티드는 정제를 용이하게 하는 도메인을 함유한 융합 단백질이다. 바람직한 실시양태에서, 정제는 예를 들어, 임의의 순서로 다음 중 3개 이상을 포함하는 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로오스 크로마토그래피, 페닐세파로오스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스성 여과 및 버퍼 교환으로 완료될 수 있다. 본원에서 나타내는 바와 같이, ActRIIA-hFc 단백질은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 바와 같이 >98%의 순도 및 SDS PAGE에 의해 결정된 바와 같이 >95%의 순도로 정제된다. 정제의 이러한 수준은 마우스의 뼈에 대해 소망하는 효과 및 마우스, 래트 및 비-인간 영장류의 허용가능한 안전성 프로파일을 달성하기에 충분하다.
다른 실시양태에서, 재조합 ActRIIA 폴리펩티드의 소망하는 부분의 N-말단의 폴리-(His)/엔테로키나아제 절단 부위와 같은, 정제 리더 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni2+ 금속 수지를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의한 발현 융합 단백질의 정제를 허용할 수 있다. 그 후에, 정제 리더 서열은 정제된 ActRIIA 폴리펩티드를 형성하기 위한 엔테로키나아제를 이용한 처리에 의해 순차적으로 제거될 수 있다[예를 들어, Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411: 177; 및 Janknecht et al., PNAS USA 88:8972 참조].
융합 유전자를 제조하기 위한 기술은 공지되어 있다. 근본적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 다양한 DNA 단편을 연결하는 것은 결찰용 블런트(blunt)-종결 또는 스태거(stagger)-종결 말단, 적절한 말단을 형성하기 위한 제한효소 분해, 부착성 말단의 적절한 채우기(filling-in), 소망하지 않는 연결을 피하기 위한 알칼리 포스파타아제 처리, 및 효소 결찰을 이용한 종래의 기술에 따라 수행된다. 다른 실시양태에서, 융합 유전자는 자동 DNA 합성기를 포함한 종래의 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 키메라 유전자 서열을 생성하기 위해 순차적으로 어닐링될 수 있는 2개의 연속적 유전자 단편 사이에 상보적 오버행(overhang)을 야기하는 앵커 프라이머(anchor primer)를 사용해 수행될 수 있다[예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992 참조].
ActRIIA-Fc 융합 단백질은 서열 9의 조직 플라스미노겐 리더 서열을 사용해, pAID4 벡터(SV40 ori/인핸서, CMV 프로모터)로부터 안정적으로 형질감염된 CHO-DUKX Bl 1 세포에서 발현될 수 있다. Fc 영역은 서열 7에 나타낸 바와 같은 인간 IgG1 Fc 서열이다. 특정 실시양태에서, 발현시에, 함유된 단백질은 평균적으로 ActRIIA-Fc 융합 단백질의 분자당 약 1.5 내지 2.5몰 사이의 시알산을 갖는다.
특정 실시양태에서, ActRIIA-Fc 융합물의 긴 혈청 반감기는 인간 대상체에서 25-32일일 수 있다. 또한, CHO 세포 발현 물질은 인간 293 세포에서 발현된 ActRIIA-hFc 융합 단백질에 대해 보고된 것[del Re et al., J Biol Chem. 2004 Dec 17;279(51):53126-35]보다 액티빈 B 리간드에 대해 더 높은 친화성을 가질 수 있다. 또한, 이론에 구애됨 없이, 다른 리더 서열에 비해 많은 생산이 제공되는 TPA 리더 서열의 사용은, 천연 리더를 이용해 발현된 ActRIIA-Fc와 달리, 매우 순수한 N-말단 서열을 제공할 수 있다. 천연 리더 서열의 사용은 각각 상이한 N-말단 서열을 갖는 ActRIIA-Fc의 2개의 주요 종들을 야기할 수 있다.
7.9.2 ACTRIIB의 신호전달 억제제
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "ActRIIB"는 돌연변이유발 및 다른 변형에 의해 ActRIIB 단백질로부터 유래된 임의의 종 및 변이체로부터의 액티빈 수용체 IIB형(ActRIIB) 단백질 패밀리를 지칭한다. 본원의 ActRIIB에 대한 참조는 수용체의 현재 확인된 형태 중 어느 하나에 대한 참조임을 이해해야 한다. ActRIIB 패밀리의 구성원은 일반적으로 시스테인이 풍부한 영역을 가진 리간드-결합 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 예측된 세린-트레오닌 키나아제 활성을 갖는 세포질 도메인으로 구성된 막관통 단백질이다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용될 ActRIIB 신호전달 억제제는, 비제한적으로, 액티빈-결합 가용성 ActRIIB 폴리펩티드; 액티빈(특히 액티빈 A 또는 B 서브유닛, 또한 βA 또는 βB로 지칭됨)에 결합하고 ActRIIB 결합을 방해하는 항체; ActRIIB에 결합하고 액티빈 결합을 방해하는 항체; 액티빈 또는 ActRIIB 결합을 위해 선택된 비-항체 단백질; 및 액티빈 또는 ActRIIB 결합을 위해 선택되고 Fc 도메인에 콘쥬게이트될 수 있는 무작위 펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 액티빈 또는 ActRIIB 결합 활성, 특히 I형(예를 들어, 가용성 I형 액티빈 수용체) 및 II형(예를 들어, 가용성 II형 액티빈 수용체) 결합 부위를 각각 차단하는 액티빈 바인더를 갖는 2 이상의 상이한 단백질(또는 다른 모이어티)은 ActRIIB를 억제하는 이기능적 또는 다기능적 결합 분자를 형성하기 위해 함께 연결될 수 있고, 이에 따라 본원에 기재된 조성물 및 이를 포함하는 방법에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, ActRIIB를 억제하는 액티빈-ActRIIB 신호전달 축 길항제는 핵산 앱타머, 소분자 및 본원에 기재된 조성물 및 이를 포함하는 방법에 사용되는 다른 약제(agent)를 포함한다.
(a) ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 ActRIIB 신호전달 억제제
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "ActRIIB 폴리펩티드"는 ActRIIB 패밀리 구성원의 임의의 천연 산출 폴리펩티드뿐만 아니라, 유용한 활성을 유지하는 이의 임의의 변이체(변종, 단편, 융합체, 및 펩티도미메틱 형태를 포함한다)를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드의 서열에 대해 적어도 약 80%가 동일한 서열을 갖고, 임의로 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 임의의 공지된 ActRIIB의 서열로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 단백질 및/또는 액티빈에 결합하고, 이의 기능을 억제할 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드의 예는 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드(서열 16 또는 서열 28)를 포함한다. 아미노산 서열이 서열 16 또는 서열 28에 도시된 ActRIIB 전구체 폴리펩티드(즉, 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드)에 대해, ActRIIB 전구체 폴리펩티드의 신호 펩티드는 아미노산 1 내지 18에 위치해 있으며; 세포외 도메인은 아미노산 19 내지 134에 위치해 있고, 잠재적 N-연결 글리코실화 부위는 아미노산 위치 42 및 65에 위치해 있다. 서열 16의 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 서열 19로 개시되어 있다(서열 19는 아미노산 위치 64에 대응하는 코돈에서 알라닌을 제공하나, 아미노산 위치 64에 대응하는 코돈에 대신해 아르기닌을 제공하기 위해 당업계에 공지된 방법을 사용해 당업자에 의해 손쉽게 변형될 수 있다). 서열의 기재에 대해 표 21을 참조한다.
구체적으로 달리 표기되지 않는 한, 본원에 기재된 모든 ActRIIB-관련 폴리펩티드에 대한 아미노산의 넘버링(numbering)은 서열 16 및 서열 28에 대한 아미노산 넘버링을 기본으로 한다(위치 64에서 발현된 아미노산에서만 상이). 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드가 아미노산 위치 79에서 치환/돌연변이를 갖는 것으로 기재된 경우에, 그 후 위치 79는 ActRIIB 폴리펩티드가 유래되는 서열 16 또는 서열 28의 79번째 아미노산을 지칭하는 것으로 이해해야 한다. 마찬가지로, ActRIIB 폴리펩티드가 아미노산 위치 64에서 알라닌 또는 아르기닌을 갖는 것으로 기재된 경우에, 그 후 위치 64는 ActRIIB 폴리펩티드가 유래되는 서열 16 또는 서열 28의 64번째 아미노산을 지칭하는 것으로 이해해야 한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRIIB의 신호전달 억제제는 ActRIIB의 액티빈-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ActRIIB의 액티빈-결합 도메인은 ActRIIB의 세포외 도메인, 또는 그의 일부를 포함한다. 구체적 실시양태에서, ActRIIB의 세포외 도메인 또는 그의 일부는 가용성이다. ActRIIB의 도시된 변형 형태는 미국 특허출원 공개 제20090005308호 및 제 20100068215호에 개시되어 있으며, 이의 개시 내용은 그 전체가 참고로서 본원에 포함된다.
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRIIB 폴리펩티드는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드이다. 용어 "가용성 ActRIIB 폴리펩티드"는 일반적으로 ActRIIB 단백질의 임의의 천연 산출 세포외 도메인뿐만 아니라, 이의 임의의 변이체(변종, 단편, 및 펩티도미메틱 형태를 포함한다)를 비롯한, ActRIIB 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 가용성 ActRIIB 폴리펩티드는 액티빈에 결합될 수 있다; 그러나, 야생형 ActRIIB 단백질은 GDF8/11에 비해 액티빈에 대한 결합에 유의미한 선택성을 나타내지 않는다. 특정 실시양태에서, 상이한 결합 특성을 갖는 ActRIIB의 변경된 형태가 본원에 제공되는 방법에 사용될 수 있다. 상기 변경된 형태는, 예를 들어 국제특허출원 공개 WO 2006/012627 및 WO 2010/019261에 개시되어 있으며, 이의 개시 내용은 그 전체가 참고로서 본원에 포함된다. 천연 또는 변경된 ActRIIB 단백질은 이를 제2, 액티빈-선택적 결합제와 결합시킴으로써 액티빈에 대한 추가된 특이성을 가질 수 있다. 예시적 가용성 ActRIIB 폴리펩티드는 인간 ActRIIB 폴리펩티드의 세포외 도메인(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43)을 포함한다.
ActRIIB 전구체 아미노산 서열의 아미노산 64에 대응하는 위치의 알라닌, 즉 서열 16(본원에서 "A64"로 지칭한다)을 갖는, Hilden et al. [Blood, 1994, 83(8):2163-70]에 개시된 ActRIIB 세포외 서열을 갖는 Fc 융합 단백질은 액티빈 및 GDF-11에 대해 상대적으로 낮은 친화성을 갖는 것으로 설명되었다. 반면에, ActRIIB 전구체 아미노산 서열의 위치 64의 아르기닌(본원에서 "R64"로 지칭한다)을 갖는 Fc 융합 단백질은 낮은 나노몰(nanomolar)에서 높은 피코몰(picomolar) 범위까지 액티빈 및 GDF-11에 대한 친화성을 갖는다(예를 들어, 개시 내용 그 전체가 본원에 포함되는 미국 특허출원 공개 제20100068215호 참조). 위치 64의 아르기닌을 갖는 ActRIIB 전구체 아미노산 서열은 서열 28에 제시되어 있다. 이와 같이, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 따라 사용되는 ActRIIB 폴리펩티드는 (i) ActRIIB 전구체 아미노산 서열, 즉 서열 16의 아미노산 64에 대응하는 위치에서 알라닌; 또는 (ii) ActRIIB 전구체 아미노산 서열, 즉 서열 28의 위치 64에서 아르기닌을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 따라 사용되는 ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 전구체 아미노산 서열, 즉 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 64에 대응하는 위치에 알라닌 또는 아르기닌이 아닌 아미노산을 포함할 수 있다.
ActRIIB의 세포외 도메인의 C-말단에서 프롤린 매듭(knot)의 결실은 액티빈에 대한 수용체의 친화성을 감소시킨다는 것이 입증되었다[예를 들어, Attisano et al., Cell, 1992,68(1):97-108 참조]. 서열 28의 아미노산 20-119(즉, 서열 32)를 함유하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질, "ActRIIB(20-119)-Fc"는 서열 28의 아미노산 20-134(즉, 서열 31)를 함유하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질, 프롤린 매듭 영역 및 완전한 막근접(juxtamembrane) 도메인을 포함한 "ActRIIB(20-134)-Fc"에 비해 GDF-11 및 액티빈에 대해 감소된 결합을 갖는다. 그러나, 서열 28의 아미노산 20-129를 함유하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질, "ActRIIB(20-129)-Fc"는 프롤린 매듭 영역이 파쇄되더라도, ActRIIB의 비-절단된 세포외 도메인에 비해 유사하나, 다소 감소된 활성을 유지한다. 따라서, 서열 28(또는 서열 16)의 아미노산 134, 133, 132, 131, 130 및 129에서 중단되는 세포외 도메인을 포함하는 ActRIIB 폴리펩티드는 모두 활성일 것으로 예상되지만, 아미노산 134 또는 133에서 중단되는 작제물이 가장 활성일 수 있다. 유사하게는, 서열 28의 P129 및 P130의 돌연변이가 리간드 결합을 실질적으로 감소시키지 않는 것으로 나타난 바와 같이, 잔기 129-134에서의 돌연변이는 리간드 결합 친화성을 크게 변경시킬 것으로 예상되지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 따라 사용되는 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 28(또는 서열 16)의 아미노산 109(즉, 최종 시스테인)만큼 초기에 종결될 수 있으나, 서열 28(또는 서열 16)의 아미노산 위치 109 및 119에서, 또는 이들 사이에서 종결하는 형태는 감소된 리간드 결합 능력을 가질 것으로 예상된다.
서열 16 및 서열 28의 아미노산 29는 ActRIIB 전구체 서열의 초기 시스테인을 나타낸다. 서열 16 또는 서열 28의 N-말단의 아미노산 29에서, 또는 이러한 아미노산 위치 이전에서 시작하는 ActRIIB 폴리펩티드는 리간드 결합 활성을 유지할 것으로 예상된다. 서열 16 또는 서열 28의 위치 24의 알라닌에서 아스파라긴으로의 돌연변이는 리간드 결합에 대한 실질적인 영향 없이, N-연결 글리코실화 서열을 유도한다. 이는 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-29에 대응하는 단일 절단 펩티드와 시스테인 교차결합 영역 사이의 영역에서의 돌연변이가 잘 용인(tolerated)된다는 것을 확인시켜 준다. 특히, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 20, 21, 22, 23 및 24에서 시작하는 ActRIIB 폴리펩티드는 활성을 유지할 것이며, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 25, 26, 27, 28 및 29에서 시작하는 ActRIIB 폴리펩티드 또한, 활성을 유지할 것으로 예상된다. 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 22, 23, 24 또는 25에서 시작하는 ActRIIB 폴리펩티드는 최대 활성을 가질 것이다.
종합하면, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 따라 사용될 ActRIIB 전구체 단백질(즉, 서열 16 또는 서열 28)의 활성 부분(즉, ActRIIB 폴리펩티드)은 일반적으로 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 29-109를 포함할 것이며, 이러한 ActRIIB 폴리펩티드는, 예를 들어 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 19-29 중 어느 하나에 대응하는 잔기에서 시작하고, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 109-134 중 어느 하나에 대응하는 위치에서 종결한다. 본원에 포함되는 ActRIIB 폴리펩티드의 구체적인 예는 서열 16 또는 서열 28의 19-29, 20-29 또는 21-29로부터의 아미노산 위치에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 119-134, 119-133 또는 129-134, 129-133으로부터의 아미노산 위치에서 종결되는 것들을 포함한다. 본원에 포함되는 ActRIIB 폴리펩티드의 다른 구체적인 예는 서열 16 또는 서열 28의 20-24(또는 21-24, 또는 22-25)로부터의 아미노산 위치에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 109-134(또는 109-133), 119-134(또는 119-133) 또는 129-134(또는 129-133)로부터의 아미노산 위치에서 종결되는 것들을 포함한다. 또한, 이러한 범위에 포함되는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드는, 특히 서열 16 또는 서열 28의 대응 부분에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성 또는 서열 상동성을 갖는 것들이 고려된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRIIB의 신호전달 억제제는 ActRIIB의 세포외 도메인의 절단 형태를 포함한다. 절단은 ActRIIB 폴리펩티드의 카르복시 말단 및/또는 아미노 말단에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 절단은 성숙한 ActRIIB 폴리펩티드 세포외 도메인에 대하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 아미노산 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 절단은 성숙한 ActRIIB 폴리펩티드 세포외 도메인의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 N-말단 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, 절단은 성숙한 ActRIIB 폴리펩티드 세포외 도메인의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 C-말단 아미노산일 수 있다. 예를 들어, ActRIIB의 절단 형태는 아미노산 20-119; 20-128; 20-129; 20-130; 20-131; 20-132; 20-133; 20-134; 20-131; 21-131; 22-131; 23-131; 24-131; 및 25-131을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 상기 아미노산 위치는 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치를 지칭한다.
ActRIIB의 추가적인 예시적 절단 형태는 (i) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 21-29 중 임의의 아미노산에서 시작하고(임의로 서열 16 또는 서열 28의 22-25에서 시작), 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-134 중 임의의 것에서 종결하는 폴리펩티드; (ii) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-29 중 임의의 것에서 시작하고(임의로 서열 16 또는 서열 28의 22-25에서 시작), 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 109-133 중 임의의 것에서 종결하는 폴리펩티드; (iii) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-24 중 임의의 것에서 시작하고(임의로 서열 16 또는 서열 28의 22-25에서 시작), 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 109-133 중 임의의 것에서 종결하는 폴리펩티드; (iv) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 21-24 중 임의의 것에서 시작하고, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 109-134 중 임의의 것에서 종결하는 폴리펩티드; (v) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-24 중 임의의 것에서 시작하고, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 118-133 중 임의의 것에서 종결하는 폴리펩티드; (vi) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 21-24 중 임의의 것에서 시작하고, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 118-134 중 임의의 것에서 종결하는 폴리펩티드; (vii) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-24 중 임의의 것에서 시작하고, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 128-133 중 임의의 것에서 종결하는 폴리펩티드; (viii) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-24 중 임의의 것에서 시작하고, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 128-133 중 임의의 것에서 종결하는 폴리펩티드; (ix) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 21-29 중 임의의 것에서 시작하고, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 118-134 중 임의의 것에서 종결하는 폴리펩티드; (x) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-29 중 임의의 것에서 시작하고, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 118-133 중 임의의 것에서 종결하는 폴리펩티드; (xi) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 21-29 중 임의의 것에서 시작하고, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 128-134 중 임의의 것에서 종결하는 폴리펩티드; 및 (xii) 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-29 중 임의의 것에서 시작하고, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 128-133 중 임의의 것에서 종결하는 폴리펩티드를 포함한다. 구체적 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 25에서 시작하고 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 131에서 종결하는 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 이들로 구성되거나, 또는 이들로 구성된다. 다른 구체적 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 또는 43의 아미노산 서열로 구성되거나, 이들로 필수적으로 구성된다.
본원에 기재된 ActRIIB 폴리펩티드 중 일부는 호모다이머(homodimer)로 생산될 수 있다. 본원에 기재된 ActRIIB 폴리펩티드 중 일부는 Fc 도메인과 같은 IgG 중쇄로부터의 불변 영역을 포함하는 이종 부분을 갖는 융합 단백질로 형성될 수 있다. 본원에 기재된 ActRIIB 폴리펩티드 중 일부는, 경우에 따라 서열 16 또는 서열 28에 비해 하나 이상의 추가적인 아미노산 치환, 결실 또는 삽입과 조합되어, 서열 16 또는 서열 28의 위치 79에 대응하는 위치에 산성 아미노산을 포함할 수 있다.
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRIIB의 신호전달 억제제는 하나 이상의 아미노산 치환/돌연변이를 갖는 ActRIIB의 세포외 도메인을 포함한다. 상기 아미노산 치환/돌연변이는, 예를 들어 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 79에서 류신으로부터 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 산성 아미노산으로의 교환일 수 있다. 예를 들어, 서열 16 또는 서열 28의 위치 L79는 변경된 액티빈-마이오스태틴(GDF-11) 결합 특성을 부여하기 위해 ActRIIB 세포외 도메인 폴리펩티드에서 변경될 수 있다. L79A 및 L79P 돌연변이는 액티빈 결합에 비해 큰 범위로 GDF-11 결합을 감소시킨다. L 79E 및 L 79D 돌연변이는 크게 감소된 액티빈 결합을 나타내는 반면에, GDF-11 결합은 유지한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRIIB의 신호전달 억제제는 또한, 아미노산 치환, 예를 들어 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 79에서 류신으로부터 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 산성 아미노산으로의 교환을 수반하는 ActRIIB 세포외 도메인의 절단 형태를 포함한다. 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 아미노산 치환을 또한 수반하는 ActRIIB 폴리펩티드의 세포외 도메인의 절단된 형태는 서열 23이다. 절단된 및/또는 하나 이상의 아미노산 치환을 수반하는 ActRIIB의 형태는 상기 논의된 항체의 Fc 도메인에 연결될 수 있다.
ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 활성 단편은, 예를 들어 ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 대응 단편으로부터 재조합적으로 생산된 폴리펩티드를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 또한, 상기 단편은 종래의 메리필드 고상 f-Moc 또는 t-Boc 화학법과 같은 당업계에 공지된 기술을 사용해 화학적으로 합성될 수 있다. 단편은 ActRIIB 단백질 또는 액티빈에 의해 매개되는 신호전달의 길항제(억제제)로서 기능할 수 있는 그의 펩티드 단편을 확인하기 위해 (재조합적으로 또는 화학적 합성에 의해) 생산 및 검사될 수 있다.
또한, ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 활성 변이체는, 예를 들어 ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하는 대응 돌연변이화 핵산으로부터 재조합적으로 생산된 변형 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 변이체는 ActRIIB 단백질 또는 액티빈에 의해 매개되는 신호전달의 길항제(억제제)로서 기능할 수 있는 것들을 확인하기 위해 생산 및 검사될 수 있다. 특정 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 변이체는 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 기능적 변이체는 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
기능적 변이체는, 예를 들어 치료상 효능, 또는 안정성(예를 들어, 생체외 저장 수명 및 생체내 단백질 분해에 대한 저항성)을 향상시키는 것과 같은 목적을 위해 ActRIIB 폴리펩티드의 구조를 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 액티빈 결합을 유지하기 위해 선택될 때, 상기 변형 ActRIIB 폴리펩티드는 천연 산출 ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 등가물로 간주된다. 또한, 변형 ActRIIB 폴리펩티드는, 예를 들어 아미노산 치환, 결실, 또는 첨가에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 이소류신 또는 발린을 이용한 류신의 치환, 글루타메이트를 이용한 아스파테이트의 치환, 세린을 이용한 트레오닌의 치환, 또는 구조적으로 관련된 아미노산을 이용한 유사한 치환(예를 들어, 보존적 돌연변이)이 결과로 생성된 분자의 생물학적 활성에 대해 주요한 효과를 갖지 않을 것이라고 예상하는 것은 타당하다. 보존적 치환은 그 측쇄와 관련된 아미노산 패밀리 내에 발생하는 것이다. ActRIIB 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변화가 기능적 상동체를 야기하는지 여부는 세포의 반응을 생성하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드의 능력을 야생형 ActRIIB 폴리펩티드와 유사한 방식으로 평가함으로써 손쉽게 결정될 수 있다.
본원에는 변종, 특히 ActRIIB 폴리펩티드의 조합적 변종의 세트, 및 절단된 변종을 생성하는 방법이 제공되며; 조합적 변종의 풀은 기능적 변이체 서열을 확인하기 위해 특히 유용하다. 상기 조합적 라이브러리를 스크리닝하는 목적은, 예를 들어 작용제 또는 길항제로서 작용할 수 있거나, 대안적으로 다 함께 신규한 활성을 포함하는 ActRIIB 폴리펩티드 변이체를 생성하기 위한 것이다.
ActRIIB의 리간드 결합 포켓(pocket)은 서열 16 또는 서열 28의 잔기 Y31, N33, N35, L38 내지 T41, E47, E50, Q53 내지 K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 내지 N83, Y85, R87, A92, 및 E94 내지 F101에 의해 정의된다는 것이 입증되었다. 이들 위치에서, 위치 L79에서의 R40A, K55A, F82A 및 돌연변이와 같이, K74A 돌연변이가 잘 용인되더라도, 보존적 돌연변이는 용인될 것으로 예상된다. R40은, 이 위치의 기초 아미노산이 용인될 것임을 나타내는 제노푸스(Xenopus)의 K이다. Q53은 소(bovine) ActRIIB의 R 및 제노푸스 ActRIIB의 K이고, 이에 따라 R, K, Q, N 및 H를 비롯한 아미노산은 이 위치에서 용인될 것이다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용되기 위한 ActRIIB 폴리펩티드에 대한 일반적 처방(formula)은 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 29-109를 포함하나, 임의로 서열 16 또는 서열 28의 20-24 또는 22-25에 걸친 아미노산 위치에서 시작하고 서열 16 또는 28의 129-134에 걸친 아미노산 위치에서 종결되며, 리간드 결합 포켓에서 1, 2, 5, 또는 15개를 초과하지 않는 보존적 아미노산 변경, 및 리간드 결합 포켓에서 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 위치 40, 53, 55, 74, 79 및/또는 82에서의 0, 1 또는 그 이상의 비-보존적 변경을 포함하는 것이다. 이러한 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 29-109의 서열에 대해 80%, 90%, 95% 또는 99%를 초과하는 서열 동일성 또는 서열 상동성을 유지할 수 있다. 가변성이 특히 잘 용인될 수 있는 결합 포켓 외부 부위는 ActRIIB의 세포외 도메인의 아미노 및 카르복시 말단, 및 위치 42-46 및 65-73을 포함한다. 서열 16 또는 서열 28의 위치 65(N65A)의 아스파라긴에서 알라닌으로의 변경은 A64 백그라운드(background)의 리간드 결합을 실제적으로 개선하고, 이에 따라 R64 백그라운드의 리간드 결합에 대한 유해한 효과를 갖지 않을 것으로 예상된다. 이러한 변경은 아마도 A64 백그라운드의 N65에서 글리코실화를 제거하므로, 이 영역에서 유의미한 변화가 용인될 개연성이 있음을 나타낸다. R64A 변화가 열악하게 용인되는 반면에, R64K는 잘 용인되므로, H와 같은 다른 기초 잔기는 위치 64에서 용인될 수 있다.
리간드 결합 도메인에서 돌연변이를 갖는 ActRIIB 폴리펩티드의 구체적 예로서, ActRIIB의 리간드-결합 도메인의 양전하를 띤 아미노산 잔기 Asp(D80)는, 변이체 ActRIIB 폴리펩티드가 액티빈이 아닌, GDF 8에 우선적으로 결합하도록 상이한 아미노산 잔기로 돌연변이 될 수 있다. 구체적 실시양태에서, D80 잔기는 비하전(uncharged) 아미노산 잔기, 음성 아미노산 잔기, 및 소수성 아미노산 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기로 변경된다. 추가의 구체적인 실시예로서, 소수성 잔기 L79는 GDF11 결합을 유지하는 반면, 액티빈 결합을 크게 감소시키기 위해 산성 아미노산 아스파르트산 또는 글루탐산으로 변경될 수 있다. 당업자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 대부분의 기재된 돌연변이, 변이체 또는 변형은, 핵산 수준에서, 또는 일부 경우에 변역후 변형 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 수법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRIIB의 신호전달 억제제는 항체의 Fc 부분에 연결된 ActRIIB 수용체의 세포외 도메인(예를 들어, 액티빈-결합 도메인)을 포함하는 콘쥬게이트/융합 단백질을 포함한다. 상기 콘쥬게이트/융합 단백질은 본원에 기재된 ActRIIB 폴리펩티드(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 또는 43 중 임의의 것), 당업계에 공지된 임의의 ActRIIB 폴리펩티드, 또는 당업계에 공지되고/되거나 본원에서 제공되는 방법을 사용해 생성된 임의의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
구체적 실시양태에서, 세포외 도메인은 링커, 예를 들어 펩티드 링커를 통해 항체의 Fc 부분에 연결된다. 예시적인 링커는, 예를 들어 Gly-Gly-Gly 링커와 같은 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 아미노산 잔기(예를 들어, 글리신 잔기)와 같은 짧은 폴리펩티드 잔기를 포함한다. 구체적 실시양태에서, 상기 링커는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly(GGG)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 링커는 아미노산 서열 Thr-Gly-Gly-Gly (TGGG)를 포함한다. 임의로, Fc 도메인은 Asp-265, lysine 322, 및 Asn-434와 같은 잔기에 하나 이상의 돌연변이를 갖는다. 특정 경우에, 하나 이상의 이러한 돌연변이(예를 들어, Asn-265 돌연변이)를 갖는 변종 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비해 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합 능력을 갖는다. 다른 경우에, 하나 이상의 이러한 돌연변이(예를 들어, Asn-434 돌연변이)를 갖는 변종 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비해 MHC I류-관련 Fc 수용체(FcRN)에 대한 증가된 결합 능력을 갖는다. Fc 도메인에 융합되는 ActRIIB의 가용성 세포외 도메인을 포함하는 예시적인 융합 단백질은 서열 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, 및 47에 기재되어 있다.
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRIIB 신호전달 억제제는 ActRIIB의 세포외 도메인, 또는 항체의 Fc 부분에 연결된 그의 일부를 포함하고, 상기 ActRIIB 신호전달 억제제는 서열 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, 및 47로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 75%가 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRIIB 신호전달 억제제는 ActRIIB의 세포외 도메인, 또는 항체의 Fc 부분에 연결된 그의 일부를 포함하고, 상기 ActRIIB 신호전달 억제제는 서열 20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41, 44, 46, 및 47로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 ActRIIB 신호전달 억제제는 인간 ActRIIB 수용체의 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질이다. 다른 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 ActRIIB 신호전달 억제제는 인간 ActRIIB 수용체의 절단된 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질이다. 다른 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 ActRIIB 신호전달 억제제는 인간 ActRIIB 수용체의 절단된 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질이고, 인간 ActRIIB 수용체의 절단된 세포외 도메인은 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 79에 대응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 포함한다. 일 실시양태에서, 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 79에 대응하는 아미노산 위치에서의 아미노산 치환은 아스파르트산에 대한 류신의 치환(즉, L 79D 돌연변이)이다.
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 ActRIIB 신호전달 억제제는 인간 ActRIIB 수용체의 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질을 나타내는 서열 24 또는 25이고, 상기 ActRIIB 세포외 도메인은 L79D 돌연변이를 갖는 서열 28의 아미노산 25-131을 포함한다. 서열 24의 ActRIIB-Fc 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 서열 45에 제시되어 있다.
다른 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 ActRIIB 신호전달 억제제는 인간 ActRIIB 수용체의 세포외 도메인과 IgG1의 Fc 부분 사이의 융합 단백질을 나타내는 서열 34 또는 35이고, 상기 ActRIIB 세포외 도메인은 L79D 돌연변이를 갖는 서열 16의 아미노산 25-131을 포함한다.
아스파라긴-연결 글리코실화 인식 부위는 일반적으로 적절한 세포 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌(또는 아스파라긴-X-세린)(여기서, "X"는 임의의 아미노산이다)을 포함한다. 또한, 상기 변경은 야생형 ActRIIB 폴리펩티드의 서열에 대한(O-연결 글리코실화 부위에 대한) 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가, 또는 치환에 의해 이루어질 수 있다. 글리코실화 인식 부위의 제 1 또는 제 3 아미노산 위치 중 하나 또는 양측의 다양한 아미노산 치환 또는 결실(및/또는 제 2 위치에서의 아미노산 결실)은 변형 트리펩티드 서열에서 비-글리코실화를 야기한다. ActRIIB 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 수량을 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 ActRIIB 폴리펩티드에 화학적 또는 효소적으로 결합시키는 것에 의한 것이다. 사용된 결합 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 유리 카르복시기; (c) 시스테인과 같은 유리 설프히드릴기; (d) 세린, 트레오닌, 또는 히드록시프롤린과 같은 유리 히드록시기; (e) 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판과 같은 방향족 잔기; 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착될 수 있다. 이러한 방법은 본원에 참고로 결합되는, 1987년 9월 11일에 공개된 국제특허출원 WO 87/05330, 및 Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306에 개시되어 있다. ActRIIB 폴리펩티드에 존재하는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적 및/또는 효소적으로 수행될 수 있다. 화학적 탈글리코실화는, 예를 들어 ActRIIB 폴리펩티드를 트리플루오로메탄술폰산 화합물, 또는 등가 화합물에 대한 노출시키는 것을 포함한다. 이러한 처리는 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당의 절단을 야기하는 반면에, 아미노산 서열은 무손상으로 남겨둔다. 화학적 탈글리코실화는 Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131에 의해 더 기재되어 있다. ActRIIB 폴리펩티드에 대한 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350에 의해 기재된 바와 같이 다양한 내생- 및 외생-글리코시다아제의 사용에 의해 달성될 수 있다. 포유동물, 효모, 곤충 및 식물 세포가 모두 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받을 수 있는 상이한 글리코실화 패턴을 도입할 수 있으므로, ActRIIB 폴리펩티드의 서열은 사용된 발현계의 유형에 따라 적절하게 조절될 수 있다. 일반적으로, 다른 포유동물 발현 세포주, 조작된 글리코실화 효소를 갖는 효모 세포주 및 곤충 세포와 같은 다른 발현계도 유용할 것으로 예상되나, 인간에 사용하기 위한 ActRIIB 단백질은 HEK293 또는 CHO 세포주와 같은 적합한 글리코실화를 제공하는 포유동물 세포주에서 발현될 것이다.
구체적 실시양태에서, 본원에는 ActRIIB(R64)-Fc 형태에 비해 ActRIIB-Fc 융합 단백질의 혈청 반감기를 증가시키는 추가의 N-연결 글리코실화 부위(N-X-S/T)의 첨가를 포함하는 돌연변이된 ActRIIB 폴리펩티드가 포함된다. 구체적 실시양태에서, 서열 16 또는 서열 28의 위치 24(A24N)에서 아스파라긴의 도입은 더 긴 반감기를 부여하는 NXT 서열의 형성을 야기한다. 다른 NX(T/S) 서열은 42-44(NQS) 및 65-67(NSS)에서 발견될 수 있으나, 후자는 위치 64(즉, R64 폴리펩티드의)의 R을 이용해 유효하게 글리코실화될 수 없다. N-X-S/T 서열은 일반적으로 상기 기재된 ActRIIB의 리간드 결합 포켓 외부의 위치에 도입될 수 있다. 비-내생성 N-X-S/T 서열의 도입을 위해 특히 적합한 부위는 서열 16 또는 서열 28의 아미노산 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 또는 129-134를 포함한다. 또한, N-X-S/T 서열은 ActRIIB 서열과 Fc 또는 다른 융합 구성요소 사이의 링커로 도입될 수 있다. 이러한 부위는 선재하는(pre-existing) S 또는 T에 대해 정확한 위치에 N을 도입하거나, 선재하는 N에 대응하는 위치에 S 또는 T를 도입함으로써, 최소의 노력으로 도입될 수 있다. 따라서, N-연결 글리코실화 부위를 형성할 소망하는 변경은 A24N, R64N, S67N(N65A 변경과 조합 가능), E106N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S 및 R112T(서열 16 또는 서열 28에서 그것들이 발견될 수 있는 위치에 대응하는 모든 아미노산 위치를 가짐)이다. 글리코실화 될 것으로 예측되는 임의의 S는 글리코실화에 의해 제공되는 보호 때문에, 면역성 부위의 형성 없이, T로 변경될 수 있다. 마찬가지로, 글리코실화 될 것으로 예측되는 임의의 T는 S로 변경될 수 있다. 따라서, 변경 S67T 및 S44T가 본원에 포함된다. 마찬가지로, A24N 변이체에서, S26T 변경이 사용될 수 있다. 따라서, ActRIIB 폴리펩티드는 하나 이상의 추가적인 비-내생성 N-연결 글리코실화 콘센서스(consensus) 서열을 포함할 수 있다.
다양한 스크리닝 에세이가 본원에서 제공되며, 상기 에세이는 ActRIIB 폴리펩티드 변이체를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드 변이체는 ActRIIB 리간드에 결합하는 능력, ActRIIB 폴리펩티드에 대한 ActRIIB 리간드의 결합을 예방하는 능력 또는 ActRIIB 리간드에 의해 야기된 신호전달을 방해하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 또한, ActRIIB 폴리펩티드 또는 그 변이체의 활성은 세포-기반 또는 생체내 에세이로 검사될 수 있다.
천연 산출 ActRIIB 폴리펩티드에 비해 선택적 또는 일반적으로 증가된 효력을 갖는 조합적-유래 변이체가 생성될 수 있다. 마찬가지로, 돌연변이유발은 대응 야생형 ActRIIB 폴리펩티드와 극적으로 상이한 세포내 반감기를 갖는 변이체를 야기할 수 있다. 예를 들어, 변경된 단백질은 단백질 분해 또는 천연 ActRIIB 폴리펩티드의 파괴, 또는 그외에 불활성화를 야기하는 다른 세포 과정에 대해 더 안정되거나 덜 안정될 수 있다. dlfjgks 변이체, 및 이를 코딩하는 유전자는 ActRIIB 폴리펩티드의 반감기를 조절함으로써 ActRIIB 폴리펩티드 수준을 변경시키기 위해 활용될 수 있다. 예를 들어, 짧은 반감기는 더 많은 일시적인 생물학적 효과를 야기할 수 있으며, 대상체에서 재조합 ActRIIB 폴리펩티드 수준의 더 엄격한 조절을 허용할 수 있다. Fc 융합 단백질에서, 돌연변이는 단백질의 반감기를 변화시키기 위해 링커 (존재한다면) 및/또는 Fc 부분에서 이루어질 수 있다.
조합적 라이브러리는 잠재적 ActRIIB 폴리펩티드 서열의 적어도 일부를 각각 포함하는 폴리펩티드의 라이브러리를 코딩하는 유전자의 축퇴 라이브러리에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 잠재적 ActRIIB 폴리펩티드 뉴클레오티드 서열의 축퇴 세트가 개별 폴리펩티드로서, 또는 대안적으로 더 큰 융합 단백질의 세트(파지 디스플레이에 대해)로서 발현 가능하도록, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물은 유전자 서열로 효소적으로 결찰될 수 있다.
잠재적 상동체의 라이브러리가 축퇴 올리고뉴클레오티드 서열로부터 생성될 수 있는 많은 방법이 있다. 축퇴 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 수행될 수 있으며, 이후에 합성 유전자는 발현을 위해 적절한 벡터에 결찰될 수 있다. 축퇴 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 공지되어 있다[예를 들어, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp 273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477 참조]. 상기 기술은 다른 단백질의 지향성 진화에 이용되었다[예를 들어, Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; 및 미국 특허 제5,223,409호, 제5,198,346호, 및 제5,096,815호 참조].
대안적으로, 돌연변이유발의 다른 형태는 조합적 라이브러리를 생성하기 위해 활용될 수 있다. 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드 변이체는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 등을 사용한 스크리닝[Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; 및 Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085]에 의해, 링커 스캐닝 돌연변이유발[Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316]에 의해; 포화 돌연변이유발[Meyers et al., (1986) Science 232:613]에 의해; PCR 돌연변이유발[Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1 :11-19]에 의해; 또는 화학적 돌연변이유발 등을 비롯한, 무작위 돌연변이유발[Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; 및 Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]에 의해 라이브러리로부터 생성 및 단리될 수 있다. 링커 스캐닝 돌연변이유발은, 특히 조합적 세팅에서, ActRIIB 폴리펩티드의 절단(생체활성) 형태를 확인하기 위한 매력적인 방법이다.
점 돌연변이 및 절단에 의해 제조된 조합적 라이브러리의 유전자 산물을 스크리닝하고, 그 물질에 대해 특정 특성을 갖는 유전자 산물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 광범위한 기술이 당업계에 공지되어 있다. 상기 기술은 ActRIIB 폴리펩티드의 조합적 돌연변이유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝을 위해 일반적으로 조정될 수 있다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위해 가장 광범위하게 사용되는 수법은 유전자 라이브러리를 복제 가능한 발현 벡터에 클로닝하는 단계, 생성한 벡터 라이브러리를 이용해 적절한 세포를 형질전환시키는 단계, 및 소망하는 활성 검출이, 산물이 검출된 유전자를 코딩하는 벡터의 비교적 용이한 단리를 가능하게 하는 조건에서 조합 유전자를 발현하는 단계를 전형적으로 포함한다. 바람직한 에세이는 액티빈 결합 에세이 및 액티빈-매개 세포 신호전달 에세이를 포함한다.
특정 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드에 천연적으로 존재하는 것 이외에 번역후 변형을 더 포함할 수 있다. 상기 변형은 아세틸화, 카르복시화, 글리코실화, 인산화, 지질화, 및 아실화를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 결과적으로, 변형된 ActRIIB 폴리펩티드는 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 다당류 또는 단당류, 및 포스페이트와 같은 비-아미노산 요소를 함유할 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드의 기능성에 대한 이러한 비-아미노산 요소의 효과는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 검사될 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드의 초기 형태를 절단함으로써, ActRIIA 폴리펩티드가 세포에서 생산될 때, 번역후 프로세싱은 또한, 단백질의 정확한 폴딩 및/또는 기능을 위해 중요할 수 있다. 상이한 세포들(CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3 또는 HEK293과 같은)은 상기 번역후 활성을 위해 특이적 세포 기구 및 특징적 기전을 가지며, ActRIIB 폴리펩티드의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하기 위해 선택될 수 있다.
특정 양태에서, ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 변이체 또는 변형된 형태는 ActRIIB 폴리펩티드의 적어도 일부 및 하나 이상의 융합 도메인을 갖는 융합 단백질을 포함한다. 상기 융합 도메인의 공지된 예는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타치온 S 전달효소(GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 중쇄 불변 영역(Fc), 말토오스 결합 단백질(MBP), 또는 인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 융합 도메인은 소망하는 특성을 부여하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 융합 도메인은 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리를 위해 특히 유용하다. 친화성 정제의 목적을 위해, 글루타치온-, 아밀라아제-, 및 니켈- 또는 코발트-콘쥬게이트된 수지와 같은 친화성 크로마토그래피에 대한 관련 기재가 사용된다. 이러한 매트릭스의 다수는 파마시아 GST 정제 시스템 및 (HIS6) 융합 파트너로 유용한 QIAexpress TM 시스템(퀴아젠)과 같은 "키트" 형태로 이용 가능하다. 다른 예로서, 융합 도메인은 ActRIIB 폴리펩티드의 검출을 가능하게 하기 위해 선택될 수 있다. 상기 검출 도메인의 예는 다양한 형광성 단백질(예를 들어, GFP)뿐만 아니라, 특이적 항체가 이용 가능한 보통 짧은 펩티드 서열인 "에피토프 태그"를 포함한다. 특이적 단일클론 항체가 손쉽게 이용 가능한 공지된 에피토프 태그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 혈구응집소(HA), 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에, 융합 도메인은 인자 Xa 또는 트롬빈과 같은 프로테아제 절단 부위를 가지며, 이는 관련 프로테아제가 부분적으로 융합 단백질을 분해시켜, 이로부터 재조합 단백질을 유리시키도록 허용한다. 유리된 단백질은 이후에, 후속 크로마토그래피 분리에 의해 융합 도메인으로부터 단리될 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드를 생체내에서 안정화시키는 도메인("안정제" 도메인)과 융합된다. "안정화"는 이것이 신장에 의해 감소된 파괴, 감소된 클리어란스, 또는 다른 약동학적 효과 때문인지 여부에 관계 없이, 혈청 반감기를 증가시키는 모든 것을 의미한다. 면역글로불린의 Fc 부분과의 융합은 광범위한 단백질에 소망하는 약동학적 특성을 부여하는 것으로 공지되어 있다. 마찬가지로, 인간 혈청 알부민에 대한 융합은 소망하는 특성을 부여할 수 있다. 선택될 수 있는 다른 유형의 융합 도메인은 다량화(예를 들어, 이량화, 4량화) 도메인 및 기능적 도메인(소망하는 바와 같이, 뼈 성장 또는 근육 성장의 추가 자극과 같은 추가의 생물학적 기능을 부여한다)을 포함한다.
융합 단백질의 상이한 요소는 소망하는 기능성과 일치하는 임의의 방식으로 배열될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드는 이종 도메인에 대해 C-말단에 위치할 수 있거나, 대안적으로 이종 도메인은 ActRIIB 폴리펩티드에 대해 C-말단에 위치할 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드 도메인과 이종 도메인이 융합 단백질에서 인접할 필요는 없으며, 추가 도메인 또는 아미노산 서열은 어느 하나의 도메인 또는 도메인들 사이에 대해 C- 또는 N-말단에 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드를 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 변형을 함유한다. 예를 들어, 상기 변형은 ActRIIB 폴리펩티드의 시험관내 반감기를 향상, ActRIIB 폴리펩티드의 순환 반감기를 향상, 또는 ActRIIB 폴리펩티드의 단백질 분해를 감소시킨다. 상기 안정화 변형은 융합 단백질(예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드 및 안정제 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함), 글리코실화 부위의 변형(예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 첨가를 포함), 및 탄수화물 모이어티의 변형(예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드로부터 탄수화물 모이어티의 제거를 포함)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 융합 단백질의 경우에, ActRIIB 폴리펩티드는 IgG 분자(예를 들어, Fc 도메인)와 같은 안정제 도메인에 융합된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "안정제 도메인"은 융합 단백질의 경우로서 융합 도메인(예를 들어, Fc)을 지칭할뿐 아니라, 탄수화물 모이어티와 같은 비단백질성 변형, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비단백질성 고분자를 포함한다.
특정 실시양태에서, 다른 단백질로부터 단리되거나, 그 이외에 다른 단백질이 실질적으로 없는, ActRIIB 폴리펩티드의 단리된 및/또는 정제된 형태는 본원에 기재된 방법 및 조성물로 사용될 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드는 일반적으로 재조합 핵산으로부터의 발현에 의해 생산될 것이다.
특정 양태에서, 본원에는 본원에 기재된 단편, 기능적 변이체 및 융합 단백질을 비롯한, ActRIIB 폴리펩티드(예를 들어, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드)를 코딩하는 단리된 및/또는 재조합 핵산이 제공된다. 예를 들어, 서열 19는 천연 산출 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드를 코딩한다. 본 발명의 핵산은 단일-가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 상기 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이러한 핵산은, 예를 들어 ActRIIB 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법에서, 또는 직접 치료제로서(예를 들어, 유전자 치료 접근법에서) 사용될 수 있다.
특정 양태에서, ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명의 핵산은 서열 19의 변이체인 핵산뿐 아니라, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 변이체(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 코딩하는 핵산)를 포함하는 것으로 더 이해된다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 대립형질 변이체와 같은 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실에 의해 상이한 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 사용될 수 있는 단리된 또는 재조합 핵산 서열은 서열 19 또는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 코딩하는 핵산)에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 당업자는 서열 19 또는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 코딩하는 핵산)에 대해 상보적인 핵산 서열, 및 서열 19 또는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 코딩하는 핵산)의 변이체가 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 추가적 실시양태에서, 핵산 서열은 이종 뉴클레오티드 서열과, 또는 DNA 라이브러리에서 단리, 재조합, 및/또는 융합될 수 있다.
다른 실시양태에서, 사용될 수 있는 핵산은 또한 매우 엄격한 조건에서 서열 19 또는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 코딩하는 핵산)로 표시된 뉴클레오티드 서열, 서열 19 또는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 코딩하는 핵산)의 보체 서열, 또는 그의 단편에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 당업자는 DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄격한 조건이 다양해질 수 있음을 손쉽게 이해할 것이다. 당업자는 DNA 혼성화를 촉진하는 적절한 엄격도(stringency) 조건이 다양해질 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 당업자는 약 45℃에서 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)으로 혼성화를 6회 수행하고, 이어서 50℃에서 SSC로 2회의 세척을 수행할 수 있다. 예를 들어, 세척 단계의 염 농도는 50℃에서 SSC로 2회의 낮은 엄격도로부터 50℃에서 SSC로 약 0.2회의 높은 엄격도까지 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계의 온도는 약 22℃인 실온의 낮은 엄격도 조건으로부터 약 65℃의 높은 엄격도 조건까지 증가될 수 있다. 온도 및 염 양측은 다양해질 수 있거나, 다른 변수는 변경되는 반면, 온도 또는 염 농도는 일정하게 유지될 수 있다. 일 실시양태에서, 실온에서 SSC로 6회에 이은 실온에서 SSC로 2회 세척의 낮은 엄격도 조건 하에서 혼성화하는 핵산은 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.
또한, 유전자 코드의 축퇴로 인해, 서열 19 또는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 코딩하는 핵산)에 개시된 핵산과 상이한, 단리된 핵산이 사용될 수 있다. 예를 들어, 수많은 아미노산이 하나 이상의 트리플렛으로 표기된다. 동일한 아미노산, 또는 동의어(예를 들어, CAU 및 CAC는 히스티딘에 대한 동의어이다)를 명시하는 코돈은 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 "침묵" 돌연변이를 야기할 수 있다. 그러나, 단백질의 아미노산 서열의 변화를 초래하는 DNA 서열 다형성이 포유동물 세포 중에 존재할 것으로 예상된다. 당업자는 특정 단백질을 코딩하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드(뉴클레오티드의 약 3-5%를 초과)에서 이러한 변이가 천연 대립형질 변이로 인해 주어진 종의 개체들 중에 존재할 수 있음을 인식할 것이다. 임의의 그리고 모든 상기 뉴클레오티드 변이 및 결과적인 아미노산 다형성이 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 핵산은 발현 작제물의 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 발현을 위해 사용된 숙주세포에 대해 적절할 것이다. 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열의 많은 유형이 다양한 숙주세포에 대해 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 상기 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 시그널 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성인자 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 당업계에 공지된 구성적 또는 유도성 프로모터가 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 프로모터는 천연 산출 프로모터이거나, 하나 이상의 프로모터 요소를 조합한 혼성 프로모터일 수 있다. 발현 작제물은 플라스미드와 같은 에피솜 상의 세포에 존재할 수 있거나, 발현 작제물은 염색체에 삽입될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주세포의 선택을 허용하도록 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 선택가능한 마커 유전자는 당업계에 공지되어 있으며 사용되는 숙주세포에 따라 변경될 것이다.
특정 양태에서, ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하고 적어도 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 내에 핵산이 제공된다. 조절 서열은 당업계-인식되어 있으며, ActRIIB 폴리펩티드의 발현을 지시하기 위해 선택된다. 따라서, 용어 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현 조절 요소들을 포함한다. 예시적 조절 서열은 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 기재되어 있다. 예를 들어, 작동가능하게 연결되었을 때, DNA 서열의 발현을 조절하는 임의의 다양한 발현 조절 서열은 ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 발현시키기 위해 이러한 벡터에서 사용될 수 있다. 상기 유용한 발현 조절 서열은, 예를 들어 SV40의 초기 및 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 거대세포바이러스 즉시 초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, 발현이 T7 RNA 폴리메라아제에 의해 지시되는 T7 프로모터, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 외피단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 당분해 효소에 대한 프로모터, 산성 포스파타아제의 프로모터, 예를 들어, Pho5, 효모 .알파.-메이팅 인자의 프로모터, 배큘로바이러스계의 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 공지된 다른 서열, 및 이들의 다양한 조합을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및/또는 발현되기를 소망하는 단백질의 유형과 같은 인자에 의존할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 벡터의 복제 개수, 항생제 마커와 같은 벡터에 의해 코딩되는 임의의 다른 단백질의 복제 개수와 발현을 조절하는 능력 역시 고려되어야 한다.
재조합 핵산은 클로닝된 유전자, 또는 이의 일부를 원핵 세포, 진핵 세포(효모, 조류, 곤충 또는 포유동물) 중 어느 하나, 또는 양측의 발현에 적합한 벡터내에 결찰시킴으로써 생산될 수 있다. 재조합 ActRIIB 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 비히클은 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 예를 들어, 적합한 벡터는 다음 유형의 플라스미드를 포함한다: pBR322-유래 플라스미드, pEMBL-유래 플라스미드, pEX-유래 플라스미드, pBTac-유래 플라스미드 및 대장균(E. coli)과 같은 원핵 세포의 발현을 위한 pUC-유래 플라스미드.
일부 포유동물 발현 벡터는 세균내 벡터의 증식을 가능하게 하기 위한 원핵 서열, 및 진핵 세포에서 발현되는 하나 이상의 진핵 전사 유닛 양측을 함유한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유래 벡터는 진핵 세포의 형질감염에 적합한 포유동물 발현 벡터의 예이다. 이러한 벡터의 일부는 원핵 및 진핵 세포 양측의 복제 및 약제 내성을 가능하게 하기 위해, pBR322와 같은 세균 플라스미드로부터의 서열을 이용해 변형된다. 대안적으로, 소유두종 바이러스(BPV-1), 또는 엡스타인-바 바이러스(pHEBo, pREP-유래 및 p205)와 같은 바이러스의 파생물이 진핵 세포에서 단백질의 일과성 발현을 위해 사용될 수 있다. 다른 바이러스성(레트로바이러스성 포함) 발현계의 예는 유전자 치료 전달계의 하기 기재에서 발견될 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 유기체의 형질전환에 이용되는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 원핵 및 진핵 세포 양측에 적합한 발현계뿐 아니라, 일반적인 재조합 절차에 대해, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)를 참조한다. 일부 예에서, 배큘로바이러스 발현계의 사용에 의해 재조합 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 상기 배큘로바이러스 발현계의 예는 pVL-유래 벡터(pVL1392, pVL1393 및 pVL941과 같은), pAcUW-유래 벡터(pAcUW1과 같은), 및 pBlueBac-유래 벡터(.베타.-gal 함유 pBlueBac III과 같은)를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 벡터는 Pcmv-스크립트 벡터(Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 벡터(Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 및 pCI-neo 벡터(Promega, Madison, Wis.)와 같은 CHO 세포에서 ActRIIB 폴리펩티드의 생산을 위해 설계될 수 있다. 명백한 바와 같이, 유전자 작제물은 배양액에서 증식된 세포에서 ActRIIB 폴리펩티드의 발현을 야기하기 위해, 예를 들어 정제를 위한 융합 단백질 및 변이체 단백질을 비롯한 단백질을 생산하기 위해, 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 ActRIIB 폴리펩티드에 대한 코딩 서열[예를 들어, 서열 19 또는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 서열 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42, 및 43을 코딩하는 핵산)]을 포함하는 재조합 유전자에 의해 형질감염된 숙주 세포에도 관한 것이다. 숙주세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드는 대장균(E. coli)과 같은 세균 세포, 곤충 세포(예를 들어, 배큘로바이러스 발현계를 사용), 효모, 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주세포는 당업계에 공지되어 있다.
따라서, 본원에는 ActRIIB 폴리펩티드를 생산하는 방법이 제공된다. 예를 들어, ActRIIB 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포는 ActRIIB 폴리펩티드의 발현이 발생하게 하는 적절한 조건 하에서 배양될 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드를 함유한 세포와 배지의 혼합물로부터 분비 및 단리될 수 있다. 대안적으로, ActRIIA 폴리펩티드는 세포질로, 또는 막 분획 내에 보유될 수 있고 세포는 수확되어 용해되며, 단백질은 단리된다. 세포 배양액은 숙주세포, 배지 및 다른 부산물을 포함한다. 세포 배양액은 숙주세포, 배지 및 다른 부산물을 포함한다. 세포 배양에 적합한 배지는 당업계에 공지되어 있다. ActRIIB 폴리펩티드는 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동, ActRIIB 폴리펩티드의 특정 에피토프에 대해 특이적인 항체를 이용한 면역친화성 정제 및 ActRIIB 폴리펩티드에 융합된 도메인에 결합하는 물질을 이용한 친화성 정제(예를 들어, ActRIIB-Fc 융합물을 정제하기 위해 단백질 A 칼럼이 사용될 수 있다)를 비롯해, 단백질을 정제하기 위해 당업계에 공지된 기술을 사용해 세포 배양 배지, 숙주세포, 또는 양측으로부터 단리될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, ActRIIB 폴리펩티드는 정제가 가능한 도메인을 함유한 융합 단백질이다. 바람직한 실시양태에서, 정제는 예를 들어, 임의의 순서로 다음 중 3개 이상을 포함하는 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로오스 크로마토그래피, 페닐세파로오스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 정제는 바이러스성 여과 및 버퍼 교환으로 완료될 수 있다. 본원에서 나타내는 바와 같이, ActRIIB-hFc 단백질은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 바와 같이 >98%의 순도 및 SDS PAGE에 의해 결정된 바와 같이 >95%의 순도로 정제된다. 정제의 이러한 수준은 마우스에서 뼈에 대해 소망하는 효과 및 마우스, 래트 및 비-인간 영장류의 허용가능한 안전성 프로파일을 달성하기에 충분하다.
다른 실시양태에서, 재조합 ActRIIB 폴리펩티드의 소망하는 부분의 N-말단의 폴리-(His)/엔테로키나아제 절단 부위와 같은, 정제 리더 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni2+ 금속 수지를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의한 발현된 융합 단백질의 정제를 허용할 수 있다. 이어, 정제 리더 서열은 엔테로키나아제를 이용한 처리에 의해 순차적으로 제거되어 정제된 ActRIIB 폴리펩티드를 제공할 수 있다[예를 들어, Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411: 177; 및 Janknecht et al., PNAS USA 88:8972 참조].
융합 유전자를 제조하기 위한 기술은 공지되어 있다. 근본적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 다양한 DNA 단편의 연결은 결찰을 위한 블런트-종결 또는 스태거-종결 말단, 적절한 말단을 형성하기 위한 제한효소 분해, 부착 말단의 적절한 채우기, 소망하지 않는 연결을 피하기 위한 알칼리 포스파타아제 처리, 및 효소 결찰을 이용한 종래의 기술에 따라 수행된다. 다른 실시양태에서, 융합 유전자는 자동 DNA 합성기를 포함한 종래의 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 키메라 유전자 서열을 생성하기 위해 순차적으로 어닐링될 수 있는 2개의 연속적 유전자 단편 사이에 상보적 오버행을 야기하는 앵커 프라이머를 사용해 수행될 수 있다(예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992 참조).
ActRIIB-Fc 융합 단백질은 서열 8의 조직 플라스미노겐 리더 서열을 사용해, pAID4 벡터(SV40 ori/인핸서, CMV 프로모터)로부터 안정적으로 형질감염된 CHO-DUKX Bl 1 세포에서 발현될 수 있다. Fc 부분은 서열 7에 나타낸 바와 같은 인간 IgG1 Fc 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 발현시에, 함유된 단백질은 평균적으로 ActRIIB-Fc 융합 단백질의 분자당 약 1.5 내지 2.5몰 사이의 시알산을 갖는다.
특정 실시양태에서, ActRIIB-Fc 융합체의 긴 혈청 반감기는 인간 대상체에서 25-32일일 수 있다. 또한, CHO 세포 발현 물질은 인간 293 세포에서 발현된 ActRIIB-hFc 융합 단백질에 대해 보고된 것[del Re et al., J Biol Chem. 2004 Dec 17;279(51):53126-35]보다 액티빈 B 리간드에 대해 더 높은 친화성을 가질 수 있다. 또한, 이론에 구애됨 없이, 다른 리더 서열에 비해 많은 생산이 제공되는 TPA 리더 서열의 사용은, 천연 리더에 의해 발현된 ActRIIB-Fc와 달리, 매우 순수한 N-말단 서열을 제공할 수 있다. 천연 리더 서열의 사용은 각각 상이한 N-말단 서열을 갖는 ActRIIB-Fc의 2개의 주요 종들을 야기할 수 있다.
7.9.3 다른 ACTRII 수용체 신호전달 억제제
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용되는 ActRII 수용체의 신호전달 억제제는 핵산 화합물이다.
ActRII 수용체를 억제하는 핵산 화합물의 범주의 예는 안티센스(antisense) 핵산, siRNA 또는 RNAi 작제물 및 촉매 핵산 작제물을 포함한다. 핵산 화합물은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 또한, 이중가닥 화합물은 오버행 또는 비-상보성의 영역을 포함할 수 있으며, 가닥들 중의 하나 또는 나머지 가닥은 단일가닥이다. 단일가닥 화합물은 자기 상보성의 영역을 포함할 수 있으며, 이는 화합물이 이중 나선 구조의 영역을 갖는 소위 "헤어핀(hairpin)" 또는 "스템-루프(stem-loop)" 구조를 형성할 수 있음을 의미한다.
특정 실시양태에서, ActRII 수용체를 억제하는 핵산 화합물은 전장(full-length) ActRII 수용체 핵산 서열 또는 액티빈 핵산 서열(예를 들어, βA 또는 βB로도 지칭되는 액티빈 A 또는 액티빈 B 서브유닛의 핵산 서열)의 1000개 이하, 500개 이하, 250개 이하, 100개 이하 또는 50개, 35개, 30개, 25개, 22개, 20개 또는 18개 이하의 뉴클레오티드로 구성된 영역에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 상보성 영역은 적어도 8개의 뉴클레오티드, 및 임의로 적어도 10개 또는 적어도 15개의 뉴클레오티드, 및 임의로 15개 내지 25개 사이의 뉴클레오티드일 수 있다. 상보성 영역은 인트론(intron), 코딩 서열 일부와 같은 표적 전사물(target transcript)의 코딩 서열 또는 비코딩(non-coding) 서열에 속할 수 있다. 일반적으로, ActRII 수용체를 억제하는 핵산 화합물은 약 8개 내지 약 500개 길이의 뉴클레오티드 또는 염기쌍 길이를 가질 것이며, 임의로 상기 길이는 약 14개 내지 약 50개의 뉴클레오티드일 것이다. ActRII 수용체를 억제하는 핵산 화합물은 DNA(특히 안티센스로서의 사용을 위한), RNA, 또는 RNA:DNA 혼성일 수 있다. 어느 하나의 가닥은 DNA와 RNA의 혼합물뿐 아니라, DNA 또는 RNA로 손쉽게 분류될 수 없는 변형된 형태를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 이중 가닥 핵산 화합물은 DNA:DNA, DNA:RNA, 또는 RNA:RNA일 수 있으며, 또한 어느 하나의 가닥은 DNA와 RNA의 혼합물뿐 아니라, DNA 또는 RNA로 손쉽게 분류될 수 없는 변형된 형태를 포함할 수 있다.
ActRII 수용체를 억제하는 핵산 화합물은 백본(backbone)(뉴클레오티드간 연결을 포함한, 천연 핵산의 당-인산염 부분) 또는 염기 부분(천연 핵산의 퓨린 또는 피리미딘 부분)에 대한 하나 또는 변형을 비롯한, 다양한 변형 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 핵산 화합물은 약 15개 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이를 가질 것이며, 혈청에서 안정성, 세포에서 안정성, 또는 예를 들어, 구강 전달된 화합물의 경우의 위 및 흡입된 화합물에 대한 폐와 같이, 화합물이 전달될 개연성이 있는 장소에서의 안정성과 같은 특정 특성을 개선하기 위해 종종 하나 이상의 변형을 함유할 것이다. RNAi 작제물의 경우에, 표적 전사물에 대해 상보적인 가닥은 일반적으로 RNA 또는 이의 변형체일 수 있다. 나머지 가닥은 RNA, DNA, 또는 임의의 다른 변이일 수 있다. 이중 가닥 또는 단일 가닥 "헤어핀" RNAi 작제물의 듀플렉스(duplex) 부분은, 특정 실시양태에서, 다이서(Dicer) 기질로서 작용하는 한, 18개 내지 40개 길이의 뉴클레오티드 및 임의로 약 21개 내지 23개 길이의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 촉매 또는 효소 핵산은 리보자임 또는 DNA 효소일 수 있으며, 또한 변형된 형태를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, ActRII 수용체를 억제하는 핵산 화합물은 넌센스 또는 센스 조절이 거의 또는 전혀 효과가 없는 생리적 조건 및 농도에서 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상까지 그의 표적의 발현을 억제할 수 있다. 핵산 화합물의 효과를 검사하기 위한 농도는 1, 5, 10 마이크로몰, 또는 그 이상을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRII 수용체의 신호전달 억제제는 항체이다. 이러한 항체는 액티빈(특히, βA 또는 βB로도 지칭되는 액티빈 A 또는 B 서브유닛)에 결합하고, ActRII 수용체 결합을 방해하는 항체; 및 ActRII 수용체 폴리펩티드(예를 들어, 가용성 ActRIIA 또는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드)에 결합하고, 액티빈 결합을 방해하는 항체를 포함한다.
ActRII 수용체 폴리펩티드 또는 액티빈 폴리펩티드로부터 유래된 면역원을 사용함으로써, 항-단백질/항-펩티드 항혈청 또는 단일클론 항체는 표준 프로토콜[예를 들어, Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988) 참조]에 의해 제조될 수 있다. 마우스, 햄스터 또는 래빗(rabbit)과 같은 포유동물은 ActRII 수용체 폴리펩티드, 항체 반응을 유도할 수 있는 항원성 단편, 또는 융합 단백질의 면역원성 형태를 이용해 면역될 수 있다. 단백질 또는 펩티드에 대해 면역원성을 부여하기 위한 기술은 담체에 대한 콘쥬게이션(conjugation) 또는 당업계에 공지된 다른 기술을 포함한다. ActRII 수용체 또는 액티빈 폴리펩티드의 면역원성 부분은 보조제의 존재하에 투여될 수 있다. 면역화의 진행은 혈장 또는 혈청의 항체 역가(titer)의 검출에 의해 모니터링 될 수 있다. 항체의 수준을 평가하기 위한 항원으로서 면역원과 함께 표준 ELISA 또는 다른 면역에세이가 이용될 수 있다.
ActRII 수용체 폴리펩티드의 항원 제조를 이용한 동물의 면역화에 이어서, 항혈청이 수득될 수 있으며, 소망하는 경우, 다클론 항체가 혈청으로부터 단리될 수 있다. 단일클론 항체를 생산하기 위해, 면역된 동물로부터 항체-생산 세포(림프구)가 수확되고, 골수종세포와 같은 불멸(immortalizing) 세포를 이용한 표준 체세포 융합 절차에 의해 융합되어 하이브리도마 세포를 수득할 수 있다. 상기 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 하이브리도마 기술[Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497에 의해 원천 개발됨], 인간 B 세포 하이브리도마 기술[Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72], 및 인간 단일클론 항체를 생산하기 위한 EBV-하이브리도마 기술[Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96]을 포함한다. 하이브리도마 세포는 ActRII 수용체 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 항체 및 그러한 하이브리도마 세포를 포함하는 배양액으로부터 단리된 단일클론 항체를 생산하기 위해 면역화학적으로 스크리닝 될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 또한, 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 그의 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 항체는 통상의 기술을 사용하여 단편화 될 수 있으며, 이들 단편은 전체 항체에 대해 상기 기재된 바와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, F(ab)2 단편은 항체를 펩신으로 처리함으로써 제조될 수 있다. 생성한 F(ab)2 단편은 이황화물 브릿지(disulfide bridge)를 감소시키는 처리를 받아 Fab 단편을 생성할 수 있다. 항체는 항체의 적어도 하나의 CDR 영역에 의해 부여되는 ActRII 수용체 또는 액티빈 폴리펩티드에 대한 친화성을 갖는 2중 특이성, 단일-쇄, 키메라, 인간화 및 완전 인간 분자를 포함하는 것으로 더 의도된다. 항체는 그에 부착되어 검출될 수 있는 표지(label)를 더 포함할 수 있다(예를 들어, 표지는 방사성 동위원소, 형광성 화합물, 효소 또는 효소 보조-인자일 수 있다).
특정 실시양태에서, 항체는 재조합 항체이고, 상기 용어는 CDR-이식 또는 키메라 항체, 라이브러리-선택 항체 도메인으로부터 조립된 인간 또는 다른 항체, 단일 쇄 항체 및 단일 도메인 항체(예를 들어, 인간 VH 단백질 또는 낙타과 VHH 단백질)을 비롯한, 분자 생물학의 기술에 의해 부분적으로 제조된 임의의 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 단일클론 항체일 수 있으며, 특정 실시양태에서, 예를 들어 ActRII 수용체 폴리펩티드 또는 액티빈 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제조하기 위한 방법은 검출가능한 면역 반응을 자극하기에 효과적인 항원 폴리펩티드를 포함하는 상당량의 면역원성 조성물을 마우스에 투여하는 단계, 마우스로부터 항체-생산 세포(예를 들어, 비장으로부터의 세포)를 수득하는 단계 및 상기 항체-생산 세포를 골수종세포와 융합시켜 항체-생산 하이브리도마를 수득하는 단계, 및 상기 항체-생산 하이브리도마를 검사하여 항원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 일단 수득되면, 하이브리도마는 임의로 하이브리도마-유래 세포가 항원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 배양 조건하의 세포 배양액에서 증식될 수 있다. 단일클론 항체는 세포 배양액으로부터 정제될 수 있다.
항체에 대해 참조로 사용된 바와 같은 형용사 "특이적으로 반응"은 일반적으로 당업계에서 이해되는 바와 같이, 관심 항원(예를 들어, ActRII 수용체 폴리펩티드) 및 항체가 최소한 특정 유형의 생물학적 샘플에서 관심 항원의 존재를 검출하는데 유용한 무관심인 다른 항원 사이에 항체가 충분히 선택적이라는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 치료 적용과 같이, 항체를 이용하는 특정 방법에서, 높은 정도의 결합의 특이성이 바람직하다. 단일클론 항체는 일반적으로 소망하는 항원과 교차 반응성 폴리펩티드 사이를 효과적으로 구별하는 큰 경향(다클론 항체에 비해)을 갖는다. 항체:항원 상호작용의 특이성에 영향을 주는 하나의 특징은 항원에 대한 항체의 친화성이다. 소망하는 특이성이 상이한 친화성의 범위에 도달하더라도, 일반적으로 바람직한 항체는 약 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 또는 그 미만의 친화성(해리상수)을 가질 것이다. 액티빈과 ActRII 수용체 사이의 단단한 결합이 주어지면, 중화 항-액티빈 또는 항-ActRII 수용체 항체는 일반적으로 10-10 또는 그 미만의 해리상수를 가질 것이다.
또한, 소망하는 항체를 확인하기 위해 항체를 스크리닝하는데 사용되는 기술은 수득된 항체의 특성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 항체가 용액 중의 항원에 결합하기 위해 사용되어야 하는 경우, 용액 결합을 검사하는 것이 바람직할 수 있다. 특히 소망하는 항체를 확인하기 위하여 항체와 항원 사이의 상호작용을 검사하는데 다양한 상이한 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술은 ELISA, 표면 플라스몬 공명 결합 에세이(예를 들어, Biacore.TM. 결합 에세이, Biacore AB, Uppsala, Sweden), 샌드위치 에세이(예를 들어, IGEN International, Inc., Gaithersburg, Md.의 상자성 비드 시스템), 웨스턴 블롯(Western blot), 면역침강 에세이, 및 면역조직화학법을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 ActRII 수용체 신호전달 억제제는 액티빈의 변경 형태를 포함하고, 특히 I형 수용체 결합 도메인에서의 변경을 갖는 것은 II형 수용체에 결합할 수 있으며, 활성 삼원(ternary) 복합체를 형성하지 못한다. 특정 실시양태에서, 액티빈 A, B, C 또는 E, 또는 특히 ActRII 수용체 발현을 억제하는 안티센스 분자, siRNA 또는 리보자임과 같은 핵산은 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 ActRII 수용체 신호전달 억제제는 TGF-베타 패밀리의 다른 구성원들에 대한, 특히 GDF8 및 GDF 11에 대한 액티빈-매개 신호전달을 억제하기 위한 선택성을 나타낸다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용되는 ActRII 수용체의 신호전달 억제제는 인히빈(즉, 인히빈 알파 서브유닛), 폴리스타틴(예를 들어, 폴리스타틴-288 및 폴리스타틴-315), 케르베로스(Cerberus), 폴리스타틴 관련 단백질("FSRP"), 엔도글린(endoglin), 액티빈 C, 알파(2)-마크로글로불린, 및 M108A(위치 108에서 메티오닌의 알라닌으로의 변화) 변종 액티빈 A를 비롯한, ActRII 수용체 길항제 활성을 갖는 비-항체 단백질이다.
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 ActRII 수용체 신호전달 억제제는 액티빈 생체활성을 길항하고/하거나 액티빈에 결합하는 폴리스타틴 폴리펩티드이다. 용어 "폴리스타틴 폴리펩티드"는 폴리스타틴의 천연 산출 폴리펩티드뿐 아니라, 유용한 활성을 함유하는 이의 변이체(변종, 단편, 융합물, 및 펩티도미메틱 형태를 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 폴리스타틴의 기능성 모노머 또는 멀티머(multimer)를 더 포함한다. 액티빈 결합 특성을 함유하는 폴리스타틴 폴리펩티드의 변이체는 폴리스타틴과 액티빈 상호작용을 포함한 선행 연구에 기반하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 참고로서 그 전체가 본원에 포함되는 W02008/030367은 액티빈 결합에 대해 중요한 것으로 나타나는 특이적 폴리스타틴 도메인("FSD")을 개시하고 있다. 폴리스타틴 폴리펩티드는 폴리스타틴 폴리펩티드의 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한 서열, 및 임의로 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 공지 폴리스타틴의 서열로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다. 폴리스타틴 폴리펩티드의 예는, 예를 들어 참고로서 그 전체가 본원에 포함되는 W02005/025601에 기재된 바와 같은, 성숙 폴리스타틴 폴리펩티드 또는 인간 폴리스타틴 전구체 폴리펩티드의 짧은 동형(isoform) 또는 다른 변이체를 포함한다.
구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 ActRII 수용체 신호전달 억제제는 액티빈 생체활성을 길항하고/하거나 액티빈에 결합하는 폴리스타틴-유사 관련 유전자(FLRG)이다. 용어 "FLRG 폴리펩티드"는 FLRG의 천연 산출 폴리펩티드뿐 아니라, 유용한 활성을 함유하는 이의 변이체(변종, 단편, 융합물, 및 펩티도미메틱 형태를 포함한다)를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 액티빈 결합 특성을 함유하는 FLRG 폴리펩티드의 변이체는 FLRG와 액티빈 상호작용을 에세이하기 위한 통상의 방법을 사용해 확인될 수 있다. 예를 들어, 참조로서 그 전체가 본원에 포함되는 미국 특허 제6,537,966호를 참조한다. FLRG 폴리펩티드는 FLRG 폴리펩티드의 서열에 대해 적어도 약 80% 동일한 서열, 및 임의로 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 공지된 FLRG의 서열로부터 유래된 폴리펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리스타틴 폴리펩티드 및 FLRG 폴리펩티드의 기능성 변이체 또는 변형된 형태는 폴리스타틴 폴리펩티드 또는 FLRG 폴리펩티드의 적어도 일부 및 예를 들어, 폴리펩티드의 단리, 검출, 안정화 또는 다중화(multimerization)가 가능한 도메인과 같은 하나 이상의 융합 도메인을 갖는 융합 단백질을 포함한다. 적합한 융합 도메인은 ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드에 대한 참조와 함께 앞서 상세하게 논의되었다. 일 실시양태에서, ActRII 수용체 신호전달 억제제는 Fc 도메인에 융합되는 폴리스타틴 폴리펩티드의 액티빈 결합 부분을 포함하는 융합 단백질이다. 다른 실시양태에서, ActRII 수용체 신호전달 억제제는 Fc 도메인에 융합되는 FLRG 폴리펩티드의 액티빈 결합 부분을 포함하는 융합 단백질이다.
7.10 에세이
다양한 ActRII 폴리펩티드 변이체, 또는 가용성 ActRII 폴리펩티드 변이체는 ActRII를 억제하는 그들의 능력에 대해 검사될 수 있다. 또한, 화합물은 ActRII를 억제하는 그의 능력에 대해 검사될 수 있다. 일단 ActRII의 신호전달 억제제 활성이 입증되면, 이러한 화합물은 본원의 방법과 함께 사용될 수 있다. ActRII는 ActRIIA 또는 ActRIIB일 수 있다. 하기 에세이는 ActRIIA에 대해 기재되나, ActRIIB에 대해 유사하게 수행될 수 있다. 이러한 에세이는 (i) 대상체에서 빈혈, RBC 수혈이 필요한 빈혈, MDS, 및/또는 비-증식성 CMML 환자 아집단(subpopulation)을 확인하기 위해; (ii) 대상체에서 빈혈, RBC 수혈이 필요한 빈혈, MDS, 및/또는 비-증식성 CMML 환자를 진단하기 위해; (iii) 대상체에서 빈혈, RBC 수혈이 필요한 빈혈, MDS, 및/또는 비-증식성 CMML 질병 지속 및/또는 진전을 모니터링하기 위해; (iv) 대상체에서 빈혈, RBC 수혈이 필요한 빈혈, MDS, 및/또는 비-증식성 CMML을 치료하기 위해 본원에서 제공되는 방법의 효능을 대상체에서 모니터링하기 위해; 및/또는 (v) 대상체에서 본원에 기재된 ActRII 신호전달 억제제의 효능을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
7.10.1 기준 집단
특정 실시양태에서, 기준 집단의 크기는 약 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 또는 1000명의 개인일 수 있다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 무작위 지원자들로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 건강한 사람으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 7.8 부분에 기재된 바와 같은 환자 집단과 같이 동일 연령, 체중, 및/또는 성별의 사람으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 혈액-관련 장애가 없는 사람으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 혈액-관련 장애를 가진 사람으로 구성되며, 기준 집단의 인간들은 고리 철적혈모구를 갖지 않는다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 혈액-관련 장애를 가진 사람으로 구성되며, 사람들에서 적혈모구의 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만이 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 혈액-관련 장애를 가진 사람으로 구성되며, 사람들에서 적혈모구의 15% 미만이 고리 철적혈모구이다. 특정 실시양태에서, 혈액-관련 장애는 7.8 부분에 기재된 바와 같은 혈액-관련 장애이다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 빈혈이 없는 사람으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 RBC 수혈이 필요한 빈혈이 없는 사람으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 MDS가 없는 사람으로 구성된다. 특정 실시양태에서, 기준 집단은 비-증식성 CMML이 없는 사람으로 구성된다.
7.10.2 고리 철적혈모구
고리 철적혈모구는 비정상적인 적혈모구이다. 또한, MDS와 연관된 특정 체세포 돌연변이는 고리 철적혈모구 형성 및 비효율적인 적혈구생성을 야기한다. 스플라이싱 인자 3B1(SF3B1)의 우성 돌연변이가 고리 철적혈모구의 형성과 연관되어 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "RS+"는 대상체에서 적혈모구의 적어도 15%가 고리 철적혈모구인 대상체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 고리 철적혈모구의 백분율은 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이다. 특정 실시양태에서, 고리 철적혈모구의 백분율은 고리 철적혈모구인 적혈구 전구체의 백분율이다. 고리 철적혈모구는 핵 원주의 적어도 3분의 1을 차지하는 5개의 철-함유(철침착증의) 과립이 최소로 존재하는 적혈모구이다. 샘플에서 고리 철적혈모구 확인을 설명하기 위해 Mufti et al., 2008, Haematologica, 93(11): 1712-7을 참조한다. 고리 철적혈모구에서, 철-로딩된 미토콘드리아는 프러시안 블루로 염색되었을 때 청색 과립의 핵주위 고리로서 가시화된다. 고리 철적혈모구는 말초혈액 및/또는 골수 도말표본에서 검출될 수 있다. 본원에서 제공되는 방법의 특별한 양태에서, 고리 철적혈모구는 골수 천자액(aspirate)이다.
7.10.3 스크리닝 에세이
다양한 ActRII 폴리펩티드 변이체, 또는 가용성 ActRII 폴리펩티드 변이체는 ActRII를 억제하는 그들의 능력에 대해 검사될 수 있다. 또한, 화합물은 ActRII를 억제하는 그의 능력에 대해 검사될 수 있다. 일단 ActRII의 신호전달 억제제 활성이 입증되면, 이러한 화합물은 본원에서 제공되는 방법에 사용될 수 있다. ActRII는 ActRIIA 또는 ActRIIB일 수 있다. 하기 에세이는 ActRIIA에 대해 기재되나, ActRIIB에 대해 유사하게 수행될 수 있다.
예를 들어, 뼈 형성 또는 뼈 파괴에 관여하는 유전자의 발현에 대한 ActRIIA 폴리펩티드 변이체의 효과가 평가될 수 있다. 이는 필요에 따라, 하나 이상의 재조합 ActRIIA 리간드 단백질(예를 들어, 액티빈)의 존재하에 수행될 수 있으며, 세포는 ActRIIA 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체, 및 ActRIIA 리간드를 생산하기 위해 형질감염될 수 있다. 마찬가지로, ActRIIA 폴리펩티드는 마우스 또는 다른 동물에 투여될 수 있으며, 밀도 또는 체적(volume)과 같은 하나 이상의 뼈 특성이 평가될 수 있다. 또한, 뼈 골절에 대한 치유 비율이 평가될 수 있다. 이중-에너지 X-선 흡수 계측법(DEXA)은 동물에서 뼈 밀도를 평가하기 위한 잘 수립된, 비-외과적인, 정량적 기술이다. 인간의 경우, 중추 DEXA 시스템은 척추 및 골반에서 뼈 밀도를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이들은 전체 뼈 밀도의 최고의 예측 변수이다. 말초 DEXA 시스템은, 예를 들어 손, 손목, 발목 및 발의 뼈를 비롯한, 말초 뼈를 평가하기 위해 사용될 수 있다. CAT 스캔을 포함한, 전통적인 x-선 이미지 시스템은 뼈 성장 및 골절 치유를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 뼈 밀도는 정량적 컴퓨터 단층촬영(qCT)을 사용해 측정(measure)될 수 있다, 또한, 뼈의 기계적 강도가 평가될 수 있다.
특정 양태에서, 본원에는 액티빈-ActRIIA 신호전달 경로의 작용제 또는 길항제인 화합물(약제)을 확인하기 위한 ActRIIA 폴리펩티드(예를 들어, 가용성 ActRIIA 폴리펩티드) 및 액티빈 폴리펩티드의 용도가 제공된다. 이러한 스크리닝을 통해 확인된 화합물은 시험관내 뼈 성장 또는 무기화를 조절하는 그의 능력을 평가하기 위해 검사될 수 있다. 임의로, 이들 화합물은 생체내에서 조직 성장을 조절하는 그의 능력을 평가하기 위해 동물 모델에서 더 검사될 수 있다.
액티빈 및 ActRIIA 폴리펩티드를 표적화함으로써, 조직 성장을 조절하기 위한 치료제를 스크리닝하기 위한 수많은 접근법이 존재한다. 특정 실시양태에서, 화합물의 높은-처리량 스크리닝은 뼈에 대한 액티빈 또는 ActRIIA-매개 효과를 교란시키는 약제를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 에세이는 액티빈에 대한 ActRIIA 폴리펩티드의 결합을 특이적으로 억제하거나 감소시키는 화합물을 스크리닝 및 확인하기 위해 수행된다. 대안적으로, 에세이는 액티빈에 대한 ActRIIA 폴리펩티드의 결합을 향상시키는 화합물을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 추가적 실시양태에서, 화합물은 액티빈 또는 ActRIIA 폴리펩티드와 상호작용하는 그의 능력에 의해 확인될 수 있다.
다양한 에세이 포맷(format)은 충분할 것이며, 본 발명의 측면에서, 본원에 명확히 기재되지 않은 것들은 그럼에도 불구하고, 당업자에 의해 이해될 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 본원에서 사용되는 검사 화합물(약제)은 임의의 조합적인 화학적 방법에 의해 형성될 수 있다. 대안적으로, 상기 화합물은 생체내 또는 시험관내에서 합성된 천연 산출 생체분자일 수 있다. 조직 성장의 조절제로서 작용하는 그의 능력에 대해 검사될 화합물(약제)은, 예를 들어 세균, 효모, 식물 또는 다른 생물(예를 들어, 천연 산물)에 의해 생산될 수 있거나 화학적으로 생산되거나(예를 들어, 펩티도미메틱을 포함한 소분자), 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. 본원에서 고려되는 검사 화합물은 비-펩티드 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티도미메틱, 당, 호르몬, 및 핵산 분자를 포함한다. 구체적 실시양태에서, 검사 약제는 약 2,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 작은 유기 분자이다.
검사 화합물은 단일한 개별 실체들로 제공되거나, 결합 화학에 의해 제조된 바와 같이, 복잡한 라이브러리로 제공될 수 있다. 이러한 라이브러리는, 예를 들어 알코올, 할로겐화 알킬, 아민, 아미드, 에스테르, 알데히드, 에테르 및 다른 부류의 유기 화합물을 포함한다. 검사 시스템에 검사 화합물의 제공은, 특히 초기 스크리닝 단계에서 화합물의 단리된 형태 또는 혼합물 일 수 있다. 임의적으로, 화합물은 다른 화합물들을 이용해 유도체화될 수 있으며, 화합물의 단리를 가능하게 하는 유도체화 기를 가질 수 있다. 유도체화 기의 비-제한적인 예는 비오틴, 플루오레세인, 디곡시게닌(digoxygenin), 녹색 형광 단백질, 동위원소, 폴리히스티딘, 자성 비드, 글루타치온 S 전달효소(GST), 광활성화 가교제 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
화합물 및 천연 추출물의 라이브러리를 검사하는 많은 약물 스크리닝 프로그램에서는, 주어진 기간에 조사된 화합물의 수량을 최대화하기 위해 고 처리량 에세이가 바람직하다. 정제 또는 반-정제 단백질로 유래된 바와 같은, 무세포계에서 수행된 에세이는 검사 화합물에 의해 중재되는 분자 표적에서의 변화의 신속한 개발 및 비교적 용이한 검출을 허용하도록 생성될 수 있는 점에서 "주요" 스크리닝으로서 바람직하다. 또한, 검사 화합물의 세포 독성 또는 생체이용률의 효과는 일반적으로 시험관내 계에서 무시될 수 있으며, 대신에 상기 에세이는 ActRIIA 폴리펩티드와 액티빈 사이의 결합 친화성의 변경으로 드러나는 바와 같은, 분자 표적에 대한 약물의 효과에 주로 초점이 맞추어져 있다.
단지 설명을 위한 것으로, 예시적인 스크리닝 에세이에서, 관심 화합물은 보통 액티빈에 결합할 수 있는 단리 및 정제된 ActRIIA 폴리펩티드와 접촉된다. 이어, 화합물과 ActRIIA 폴리펩티드의 혼합물에 ActRIIA 리간드를 함유하는 조성물을 첨가한다. ActRIIA/액티빈 복합체의 검출 및 정량화는 ActRIIA 폴리펩티드와 액티빈 사이의 복합체 형성을 억제(또는 강화)하는 화합물의 효능을 결정하기 위한 수단을 제공한다. 화합물의 효능은 다양한 농도의 검사 화합물을 사용해 수득된 데이터로부터 용량 반응 곡선을 생성함으로써 평가할 수 있다. 또한, 대조 에세이는 비교를 위한 기준선을 제공하기 위해 수행할 수도 있다. 예를 들어, 대조 에세이에서, 단리 또는 정제된 액티빈은 ActRIIA 폴리펩티드를 함유하는 조성물에 첨가되고, ActRIIA/액티빈 복합체의 형성은 검사 화합물의 부재하에 정량화된다. 일반적으로, 반응물이 혼합될 수 있는 순서는 변화될 수 있으며, 동시에 혼합될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 정제된 단백질 대신에, 세포 추출물 및 용해물(lysate)을 사용하여 적합한 무세포 에세이 시스템을 형성할 수 있다.
ActRIIA 폴리펩티드와 액티빈 사이의 복합체 형성은 다양한 기술에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 복합체 형성의 변화는, 예를 들어 면역에세이, 또는 크로마토그래피 검출에 의해, 방사성 표지(예를 들어, 32P, 35S, 14C 또는 3H), 형광성으로 표지(예를 들어, FITC), 또는 효소적으로 표지된 ActRIIA 폴리펩티드 또는 액티빈과 같은 검출가능하게 표지된 단백질을 사용해 정량화될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에서는 ActRIIA 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 사이의 상호작용 정도를 직접적으로 또는 간접적으로 측정하는데 형광 편광 에세이 및 형광 공명 에너지 전이(FRET) 에세이의 사용이 고려된다. 또한, 광도파로(PCT 공개 WO 96/26432 및 미국 특허 제5,677,196호), 표면 플라스몬 공명(SPR), 표면 전하 센서, 및 표면력 센서에 기반한 것들과 같은, 다른 방식의 검출이 본원에 기재된 많은 실시양태들과 호환가능하다.
또한, "2 혼성 에세이(two hybrid assay)"로 공지된 상호작용 트랩(trap) 에세이는 ActRIIA 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 사이의 상호작용을 방해하거나 강화하는 약제를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,283,317호; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; 및 Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696)를 참조한다. 구체적 실시양태에서, 본원에서는 ActRIIA 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 사이의 상호작용을 분리하는 화합물(예를 들어, 소분자 또는 펩티드)을 확인하기 위한 반전 2 혼성계(reverse two hybrid system)의 사용이 고려된다. 예를 들어, Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; 및 미국 특허 제5,525,490호; 제5,955,280호; 및 제5,965,368호를 참조한다.
특정 실시양태에서, 상기 화합물은 ActRIIA 또는 액티빈 폴리펩티드와 상호작용하는 그의 능력에 의해 확인된다. 화합물과 ActRIIA 또는 액티빈 폴리펩티드 사이의 상호작용은 공유결합 또는 비-공유결합일 수 있다. 예를 들어, 상기 상호작용은 광-가교, 방사능 표지된 리간드 결합, 및 친화성 크로마토그래피(Jakoby W Bet al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1)를 비롯한, 시험관내 생화학적 방법을 사용해 단백질 수준에서 확인될 수 있다. 특정 경우에, 화합물은 액티빈 또는 ActRIIA 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 검출하기 위한 에세이와 같은 메카니즘 기반 에세이로 스크리닝될 수 있다. 이는 고상 또는 유체상 결합 경우를 포함할 수 있다. 대안적으로, 액티빈 또는 ActRIIA 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 리포터(reporter) 시스템(예를 들어, β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 또는 녹색 형광 단백질)을 이용해 세포내로 형질감염될 수 있으며, 바람직하게는 고 처리량 스크리닝에 의하거나, 라이브러리의 개별 구성원을 이용해 라이브러리에 대해 스크리닝될 수 있다. 다른 메카니즘 기반 결합 에세이, 예를 들어 자유 에너지의 변화를 검출하는 결합 에세이가 사용될 수 있다. 결합 에세이는 웰(well), 비드 또는 칩에 고정되거나, 고정된 항체에 의해 포획되거나, 모세관 전기이동에 의해 용해된 표적을 이용해 수행될 수 있다. 결합된 화합물은 크로마토그래피 또는 비색(colorimetric) 또는 형광 또는 표면 플라스몬 공명을 사용해 보통 검출될 수 있다.
특정 양태에서, 본원에는 뼈 형성을 조절(자극 또는 억제)하고 골량(bone mass)을 증가시키기 위한 방법 및 제제가 제공된다. 따라서, 확인된 임의의 화합물이 뼈 성장 또는 무기화를 조절하는 그의 능력을 입증하기 위해 시험관내 또는 생체내에서, 전체 세포 또는 조직에서 검사될 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 방법은 이러한 목적을 위해 활용될 수 있다. 특히, 화합물은 뼈 교체율을 증가시키는 이의 능력에 대해 검사될 수 있다.
예를 들어, 뼈 또는 연골 성장에 대한 ActRIIA 또는 액티빈 폴리펩티드 또는 검사 화합물의 효과는 세포 기반 에세이에서 Msx2의 유도 또는 조골세포(osteoblast) 내로의 골전구 세포(osteoprogenitor cell)의 분화를 결정함으로써 결정될 수 있다[예를 들어, Daluiski et al., Nat Genet. 2001,27(1):84-8; Hino et al., Front Biosci. 2004,9:1520-9 참조]. 세포-기반 에세이의 다른 예는 간엽전구세포(mesenchymal progenitor) 및 골형성 세포(osteoblastic cell)에서 ActRIIA 또는 액티빈 폴리펩티드 및 검사 화합물의 골형성 활성을 분석하는 단계를 포함한다. 설명을 위해, 액티빈 또는 ActRIIA 폴리펩티드를 발현하는 재조합 아데노바이러스는 다능성 간엽전구세포 C3H10T1/2 세포, 선 골형성(preosteoblastic) C2Cl2 세포, 및 골형성 TE-85 세포를 형질감염시키도록 구성될 수 있다. 그 후에, 골형성 활성은 알칼리 포스파타아제, 오스테오칼신, 및 매트릭스 무기질화의 유도를 측정함으로써 결정된다[예를 들어, Cheng et al., J bone Joint Surg Am. 2003, 85-A(8): 1544-52 참조].
또한, 본원에는 뼈 또는 연골 성장을 결정하기 위한 생체내 에세이가 제공된다. 예를 들어, Namkung-Matthai et al., Bone, 28:80-86 (2001)는 골절 이후 초기 기간 동안의 뼈 회복이 연구된 래트 골형성 모델을 개시하고 있다. 또한, Kubo et al., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68: 197 -202 (1999)는 골절 이후 후기 기간 동안의 뼈 회복이 연구된 래트 골형성 모델을 개시하고 있다. Andersson et al., J. Endocrinoi. 170:529-537은 마우스가 난소 절제된 마우스 골다공증 모델을 기재하고 있으며, 이는 골광물 밀도(bone mineral density)의 대략 50%가 손실된 소주골(trabecular bone)과 함께, 실질적인 골광물량 및 골광물 밀도의 손실을 마우스에게 야기시킨다. 뼈 밀도는 부갑상선 호르몬과 같은 인자의 투여에 의해 난소 절제된 마우스에서 증가될 수 있다. 특정 양태에서, 당업계에 공지된 골절 치유 에세이가 사용될 수 있다. 이러한 에세이는 골절 기술, 조직학적 분석, 및 생체역학적 분석을 포함하며, 이는 예를 들어, 참고로서 골절 및 회복 과정의 정도를 야기하고 결정하기 위한 실험적 프로토콜의 개시 내용에 대해 그 전체가 본원에 포함되는 미국 특허 제6,521,750호에 기재되어 있다.
7.11 약제학적 조성물
특정 실시양태에서, 액티빈-ActRII 길항제 (예를 들어, ActRII 폴리펩티드)는 본원에 제공된 방법으로 사용하기 위해 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된다. 예를 들어, ActRII 폴리펩티드는 단독으로 투여되거나 또는 약제학적 제형 (치료 조성물)의 한 성분으로서 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 인간 또는 동물 의학에 사용하기 위해 임의의 종래의 방법으로 투여할 수 있도록 제형화될 수 있다. ActRII는 ActRIIA이거나 또는 ActRIIB일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 치료 방법은 상기 조성물을 임플란트 또는 디바이스로 전신에 또는 국소적으로 투여하는 단계를 포함한다. 투여할 때, 물론 본 발명에 사용하기 위한 치료 조성물은 발열원을 함유하지 않고, 생리적으로 허용가능한 형태이다. 또한 상기 기술된 조성물에 선택적으로 포함될 수 있는, ActRII 길항제 이외의 치료학적으로 유용한 약제가 본 발명의 화합물과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다 (예를 들어, ActRII 폴리펩티드, 예컨대 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 폴리펩티드 (7.9 부분 참조)).
전형적으로, ActRII 길항제는 비경구적으로 투여될 것이다. 비경구 투여에 적절한 약제학적 조성물은 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드를 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 멸균 등장 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 가공될 수 있는 멸균 파우더와 함께 포함할 수 있고, 이는 산화방지제, 완충제, 정균제, 제형을 의도하는 수용자의 혈액과 등장으로 만들어줄 수 있는 용질, 또는 현탁액 또는 증점제를 함유할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체의 예에는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적절한 혼합물, 식물성 오일, 예컨대 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트가 포함된다. 적당한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지함으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 표적 조직 부위 (예를 들어, 뼈)로 전달하기 위한 형태로 캡슐화되거나 주사될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물은, 하나 이상의 치료 화합물 (예를 들어, ActRIIA 폴리펩티드)을 표적 조직 부위(예를 들어, 뼈)로 전달할 수 있고, 발달되는 조직을 위한 구조를 제공하고, 그리고 체내로 최적으로 재흡수될 수 있는 매트릭스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 매트릭스는 ActRIIA 폴리펩티드를 느리게 방출할 수 있다. 이러한 매트릭스는 다른 임플란트 의료 응용에 현재 사용되는 물질로 형성될 수 있다.
매트릭스 물질은 생체적합성, 생물분해성, 기계적 특성, 미적 외관 및 계면 특성을 기준으로 선택한다. 본 발명의 조성물의 특정 용도에 따라 적합한 제형이 규명될 것이다. 상기 조성물에 가능한 기질은 생물분해가능하고 화학적으로 규명된 칼슘 설페이트, 트리칼슘포스페이트, 히드록시아파타이트, 폴리락트산 및 폴리산 무수물일 수 있다. 다른 가능한 물질은 생물분해가능하고 생물학적으로 잘 규명된, 예컨대 뼈 또는 피부 콜라겐이다. 추가의 매트릭스는 순수 단백질 또는 세포외 기질 성분으로 구성된다. 다른 가능한 매트릭스는 생물분해가능하지 않고 화학적으로 규명된, 예컨대 소결된 히드록시아파타이트, 바이오글라스, 알루미네이트, 또는 다른 세라믹이다. 매트릭스는 상기 언급된 유형의 임의의 물질의 조합, 예컨대 폴리락트산과 히드록시아파타이트 또는 콜라겐과 트리칼슘포스페이트로 구성될 수 있다. 바이오세라믹은 조성물로, 예컨대 칼슘-알루미네이트-포스페이트로 변형될 수 있고, 기공 크기, 입자 크기, 입자 형상 및 생물분해성이 변화되도록 가공할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 예를 들어 캡슐, 카세제, 알약, 정제, 로젠지(향이 나는 기제, 통상적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트를 사용함), 파우더, 과립 형태로, 또는 수성 또는 비수성 액체에 용액 또는 현탁액으로, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼으로, 또는 엘릭시르제 또는 시럽으로, 또는 캔디(pastille) (불활성 기제, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아를 사용함)로서 및/또는 구강 청정제 등으로서, 경구적으로 투여될 수 있고, 각각 소정량의 약제를 활성 성분으로서 함유한다. 약제는 또한 덩어리, 연질약 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 투여 형태에서 (캡슐, 정제, 알약, 드라제(dragee), 분말, 과립 등), 본원에 제공된 하나 이상의 치료 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트, 및/또는 임의의 다음 물질과 혼합될 수 있다: (1) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 및/또는 규산; (2) 결합제, 예컨대 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스, 및/또는 아카시아; (3) 보습제, 예컨대 글리세롤; (4) 붕해제, 예컨대 한천, 칼슘 카르보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 및 소듐 카르보네이트; (5) 용해 지연제, 예컨대 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예컨대 제4급 암모늄 화합물; (7) 습윤제, 예컨대 예를 들어, 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예컨대 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고형 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트, 및 그의 혼합물; 및 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 알약의 경우, 약제학적 조성물은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고형 조성물이 또한 락토스 또는 유당 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하는 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용될 수 있다.
경구 투여의 액체 투여 형태는 약제학적으로 허용가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽, 및 엘릭시르제를 포함한다. 활성 성분에 덧붙여, 액체 투여 형태는 당업계에 통상 사용되는 불활성 희석제, 예컨대 물 또는 다른 용매, 용해제 및 유화제, 예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유, 및 참기름), 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 그의 혼합물을 함유할 수 있다. 불활성 희석제 외에도, 경구 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 풍미제, 착색제, 향신제 및 방부제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.
현탁액은 활성 화합물에 덧붙여 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 및 소르비탄 에스테르, 미세결정성 셀룰로스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천 및 트래거캔스, 및 그의 혼합물과 같은 현탁제를 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 보조제, 예컨대 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함함으로써 미생물의 작용을 확실히 막을 수 있다. 또한 등장화제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 게다가, 흡수를 지연시키는 약제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함함으로써 주사가능한 약제학적 형태를 장기적으로 흡수시킬 수 있다.
투여요법은 본 발명의 화합물의 작용을 변형시키는 다양한 인자를 고려하여 주치의에 의해 결정될 것으로 이해된다(예를 들어, ActRII 폴리펩티드, 예컨대 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 폴리펩티드 (7.9 부분 참조)). 다양한 인자들에는 형성되어야 할 원하는 뼈의 양, 골밀도 손실 정도, 뼈 손상 부위, 손상된 뼈의 상태, 대상체의 연령, 성별 및 식이요법, 뼈 손실에 기여할 수 있는 임의의 질병의 중증도, 투여 시간, 및 다른 임상적 인자들이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 선택적으로, 투여량은 가공에 사용된 기질의 유형 및 조성물에서 화합물의 유형에 따라 다양할 수 있다. 최종 조성물에 다른 공지된 성장 인자를 부가하는 것이 또한 투여량에 영향을 미칠 수 있다. 뼈 성장 및/또는 복원의 주기적 평가, 예를 들어, X-선 (DEXA 포함), 히스토모르포메트릭 결정(histomorphometric determination), 및 테트라사이클린 표지(tetracycline labeling)에 의해 진행을 모니터링한다.
특정 실시양태에서, ActRII 폴리펩티드의 생체내 제조를 위한 유전자 요법이 본원에 제공된다. 이러한 요법은 ActRII 폴리뉴클레오티드 서열을 상기 열거한 질병을 갖는 세포 또는 조직 안으로 도입함으로써 그의 치료효과를 달성할 것이다. ActRII 폴리뉴클레오티드 서열은 키메라 바이러스와 같은 재조합 발현 벡터 또는 콜로이드성 분산계를 사용하여 전달할 수 있다. ActRII 폴리뉴클레오티드 서열의 치료적 전달을 위해 표적화된 리포좀을 사용하는 것이 바람직하다. ActRII 폴리펩티드는 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 폴리펩티드일 수 있다 (7.9 부분 참조).
본원에 교시된 유전자 요법을 위해 사용할 수 있는 다양한 바이러스성 벡터에는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두, 또는 바람직하게는, RNA 바이러스, 예컨대 레트로바이러스가 포함된다. 바람직하게는, 레트로바이러스성 벡터는 설치류나 조류의 레트로바이러스의 유도체이다. 단일 외래 유전자가 삽입될 수 있는 레트로바이러스성 벡터의 예에는 다음과 같은 것이 있으며, 다만 이에 한정되는 것은 아니다: 몰로니(Moloney) 설치류 백혈병 바이러스 (MoMuLV), 하비(Harvey) 설치류 육종 바이러스 (HaMuSV), 설치류 유방암 바이러스 (MuMTV), 및 라우스(Rous) 육종 바이러스 (RSV). 수많은 부가적인 레트로바이러스성 벡터가 동의 유전자를 도입할 수 있다. 형질도입된 세포가 확인되고 발생하도록 이들 모든 벡터는 선택 표지를 위한 유전자를 이식하거나 도입한다. 레트로바이러스성 벡터는, 예를 들어, 당, 당지질, 또는 단백질을 부착시켜 표적-특이성으로 만들 수 있다. 바람직한 표적화는 항체를 사용함으로써 달성된다. 당업자라면 특이적 폴리뉴클레오티드 서열이 레트로바이러스성 게놈 안으로 삽입되거나 바이러스성 인벨롭(viral envelope)에 부착되어 ActRII 폴리뉴클레오티드를 함유하는 레트로바이러스성 벡터의 표적 특이적 전달을 가능하게 한다는 것을 인지할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 벡터는 뼈 또는 연골에 표적화된다.
대안적으로, 조직 배양 세포가, 통상의 칼슘 포스페이트 형질감염에 의해, 레트로바이러스성 구조유전자 gag, pol 및 env를 코딩하는 플라스미드로 직접 형질감염될 수 있다. 이어서 이들 세포들은 관심 유전자를 함유하는 벡터 플라스미드에 의해 형질감염된다. 생성된 세포는 레트로바이러스성 벡터를 배양 배지로 방출한다.
ActRII 폴리뉴클레오티드를 위한 또 다른 표적화된 전달계는 콜로이드성 분산계이다. 콜로이드성 분산계는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미세구, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포좀을 포함하는 지질계 계통을 포함한다. 본 발명의 바람직한 콜로이드계는 리포좀이다. 리포좀은 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 유용한 인공막 수포이다. RNA, DNA 및 무손상 비리온을 수성 내부 안에 캡슐화하여 생물학적 활성 형태로 세포에 전달할 수 있다 [예를 들어, 문헌(Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981) 참조]. 리포좀 비히클을 사용하는 효율적인 유전자 전달 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 다음 문헌을 참조한다 (Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988). 리포좀의 조성은 통상적으로 인지질의 조합, 통상적으로 스테로이드, 특히 콜레스테롤과의 조합이다. 다른 인지질 또는 다른 지질이 또한 사용될 수 있다. 리포좀의 물리적 특성은 pH, 이온 세기, 및 2가 양이온의 존재에 달려 있다.
리포좀 생산에 유용한 지질의 예에는 포스파티딜 화합물, 예컨대 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로시드, 및 강글리오시드가 포함된다. 예시적 인지질에는 난(egg) 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 및 디스테아로일포스파티딜콜린이 포함된다. 리포좀의 표적화는 또한 가능하게는 예를 들어 장기-특이성, 세포-특이성, 및 세포소기관-특이성을 기준으로 하고 당업계에 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, ActRII 신호 억제제는 약제학적 조성물에서 실질적으로 순수하다. 구체적으로, 약제학적 조성물에서 화합물의 최대 20%, 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0.1%, 또는 최대 0.05%는 ActRII 신호 억제제 이외의 화합물 및 약제학적 허용가능한 담체이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 약제학적 조성물은 피하 투여를 위해 제형화된다.
8. 실시예
8.1 실시예 1
8.1.1 ActRIIA - Fc 융합 단백질
인간 또는 마우스 Fc 도메인에게 융합된 인간 ActRIIA의 세포외 도메인을 그들 사이에 최소 링커와 함께 갖는 가용성 ActRIIA 융합 단백질이 제공된다. 상기 작제물은 각각 ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc로 지칭한다. ActRIIA-hFc는 서열 7로서 제공된다.
ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc 단백질은 CHO 세포주에서 발현되었다. 세 개의 상이한 리더 서열(leader sequence)이 고려되었다:
(i) 꿀벌 멜리틴 (HBML) : 서열 8
(ii) 조직 플라스미노겐 활성자 (TPA): 서열 9
(iii) 천연 ActRIIA: 서열 10
상기 선택된 형태는 TPA 리더를 사용하고 서열 13에 설명된 가공되지 않은 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 폴리펩티드는 서열 14에 의해 코딩된다.
8.1.2 ActRIIB - Fc 융합 단백질
인간 Fc 도메인에 융합된 인간 ActRIIB의 세포외 도메인 및 액티빈의 결정 구조는 리간드 결합시 상기 세포외 도메인의 최종 (C-말단) 15개 아미노산 (본원에서 "테일(tail)"로 칭함)에 대해 어떠한 역할도 나타내지 않았다. 이러한 서열은 결정 구조에 대해 분석하지 못하였으며, 이는 이들 잔기가 결정에서 균일하게 층을 이루지 않는 가요성 루프 안에 존재한다는 것을 제시한다. 문헌[Thompson et al. EMBO J. 2003 Apr 1; 22(7): 1555-66]. 이러한 서열은 또한 ActRIIB와 ActRIIA 사이에서 열악하게 보존된다. 따라서, 이러한 잔기는 기본 또는 백그라운드의 ActRIIB-Fc 융합 작제물에서 생략하였다. 부가적으로, 백그라운드 형태에서 위치 64는 알라닌이 차지하는데, 이는 비록 A64R 대립유전자가 천연적으로 생기긴 하지만, 일반적으로 "야생형" 형태로 간주한다. 이렇게, 백그라운드 ActRIIB-Fc 융합은 서열 21로서 개시된 서열을 갖는다.
놀랍게도, C-말단 테일은 액티빈 및 GDF-11 결합을 향상시키는 것으로 밝혀졌고, 이렇게 ActRIIB-Fc의 바람직한 버젼은 서열 20의 서열을 갖는다.
본원에 개시된 방법에 따라 사용될 수 있는 다양한 ActRIIB 변이체가, 그 내용 전체가 본원에서 참고로 포함된 국제 공개 특허출원 WO2006/012627 (예를 들어, pp. 59-60 참조)에 개시되어 있다.
8.2 실시예 2: 저- 또는 중간-1( Int -l)-위험 MDS 또는 비-증식성 CMML 및 RBC 수혈이 필요한 빈혈을 갖는 대상체의 ActRIIA -hFc(서열 7)의 오픈-표지, 2상 , 용량 결정 연구(Open-Label, Phase 2, Dose-Finding Study)
8.2.1 서론
MDS의 전형적인 특징인 빈혈은 특히 적혈구생성-자극제 (ESA)의 실패 후 치료하기 어렵다. ActRIIA-hFc (서열 7; "소타터셉트")는, 후기 적혈구생성에 작용하여 성숙한 적혈구의 순환방출을 증가시키는 액티빈 유형 IIA 수용체 융합 단백질이다 [문헌(Carrancio et al. Br J Haematol 2014;165:870-82)]. 대상체를 ActRIIA-hFc (서열 7)로 치료하면 건강한 대상체에게서 적혈구생성이 자극되었고 헤모글로빈 (Hb) 수준이 상당히 증가하였으며 [문헌(Sherman et al. J Clin Pharmacol 2013;53: 1121-30)), 이는 저-위험 MDS를 갖는 대상체의 빈혈 치료에 임상학적 발전이 있다는 사실을 뒷받침해준다.
8.2.2 물질 및 방법
본 실시예의 일차적인 목적은, 빈혈 및 IPSS-규정된 저- 또는 중간-1-위험 MDS 또는 비-증식성 CMML (백혈구 < 13,000/μL)을 갖는 대상체에 있어서, 적혈구 혈액학적 개선 (HI-E; 개정된 IWG 2006 기준)을 달성할 수 있는 ActRIIA-hFc (서열 7)의 안전하고, 용인성이며, 효과적인 용량을 결정하는 것이다. 두 번째 목적은 8주 이상의 RBC-수혈 독립성 (RBC-TI)을 포함한다. 자격이 되는 대상체는 빈혈(9.0 g/dL 이하의 Hb에 대해 등록하기 12주 전에 2 RBC 유닛 이상의 수혈이 요구됨)을 앓고 있으며, ESA에 반응이 없거나, 반응이 낮거나 또는 반응할 확률이 낮았다(500 mIU/mL 초과의 혈청 적혈구생성인자[EPO]). 본 실시예에서 연구된 대상체에 대한 상세사항에 대해 표 1을 참조한다. 대상체는 3주마다 한 번씩 0.1, 0.3, 0.5, 또는 1.0 mg/kg의 용량으로 ActRIIA-hFc (서열 7)를 피하 투여받았다. 연구 설계의 개요에 대해 도 1을 참고한다.
8.2.3 결과
총 54명의 MDS 대상체를 연구하였다: 7명, 6명, 21명, 및 20명 각각 ActRIIA-hFc (서열 7) 0.1, 0.3, 0.5, 및 1.0 mg/kg 용량 그룹. 평균 연령은 71세였고 (56세 내지 86세 범위), 진단받은 평균 시간은 4년이었다 (0 내지 31년 범위); 대부분의 대상체는 남성이었다 (70%). 대상체들은 치료를 시작하기 전 8주 안에 평균 6 RBC 유닛 (0 내지 18 범위)을 받았다. 45명의 대상체 (83%)는 치료가 시작되기 전 8주 안에 4 RBC 유닛 이상을 받았고(고수혈부담; high transfusion burden, HTB), 9명의 대상체 (17%)는 치료가 시작되기 전에 8주 안에 4 유닛 미만을 받았다 (저수혈부담; LTB). 19명의 대상체 (35%)는 IPSS 저위험을, 34명의 대상체 (63%)는 IPSS Int-l-위험 MDS를 가졌다; IPSS 위험 데이터는 1명의 환자에 대해 없었다. 51명의 대상체 (94%)는 ESA로 미리 치료되었고, 30명 (56%)은 저메틸화제로, 26명 (48%)은 레날리도미드로, 그리고 26명 (48%)은 다른 MDS 치료로 미리 치료되었다; 15명 대상체 (28%)는 혈청 EPO > 500 mIU/mL였다.
효능에 대해 평가할 수 있는 53명의 대상체 중, 총 21명(40%)의 대상체에서 HI-E가 관찰되었다: 0, 4 (67%), 8 (40%), 및 9명의 대상체 (45%) 각각 ActRIIA-hFc (서열 7) 0.1, 0.3, 0.5, 및 1.0 mg/kg 용량 그룹. 44명의 HTB 대상체 중 19명이 4 RBC 유닛/8주 이상 수혈 부담 감소로 반응하였다; 수혈 반응의 지속시간은 용량에 의존하는 것으로 보였다. ActRIIA-hFc로 치료 후 56일 초과 동안 RBC-TI를 달성한 예시적인 HTB 대상체에 대해 도 3을 참조한다. ActRIIA-hFc (서열 7)로 치료 후, HTB 반응자 가운데 수혈 부담 반응의 최대 지속시간을 나타내는 도 4를 참조한다. 다섯 명의 HTB 대상체는 8주 이상의 RBC-TI를 달성하였고, RBC-TI 지속시간은 59 내지 345+ 일이었다. ActRIIA-hFc (서열 7)로 치료 후 56일 이상 동안 RBC-TI를 달성하는 HTB 대상체 가운데 RBC-TI 반응의 최대 지속기간을 나타내는 도 5를 참조한다. 표 2를 또한 참조한다.
8주 이상의 RBC-TI를 달성하는 HTB 대상체의 아집단은 ActRIIA-hFc (서열 7)로 치료하기 전에 고리 철적혈모구였던 적혈구를 증가된 백분율로 가졌다.
9명의 LTB 대상체 중 8명이 수혈에 의해 영향을 받지 않고 Hb 증가, 1.3 내지 3.8 g/dL를 나타냈다. 이들 중, 2명의 대상체는 8주 이상 동안 지속된 1.5 g/dL 이상의 Hb 증가를 나타냈다. 11.0 g/dL 초과의 Hb를 갖는 대상체는 프로토콜에 따라 투약 지연을 겪었으며, 이것이 Hb 증가 지속가능성에 영향을 미쳤을 수 있다. 8주 이상의 RBC-TI가 6명의 LTB 대상체에서 달성되었다. ActRIIA-hFc (서열 7)로 치료 후 56일 이상 동안 RBC-TI와 1.5 g/dL 이상의 평균 Hb 증가를 달성한 LTB 대상체의 분율을 나타내는 도 6을 참조한다. ActRIIA-hFc (서열 7)를 이용한 치료 후에 56일 이상 동안의 RBC-TI 및 1.5 g/dL 이상의 평균 Hb 증가를 달성한 LTB 가운데 RBC-TI 반응의 최대 지속시간을 나타내는 도 7을 참조한다. 혈소판과 호중구 수준의 증가가 각각 기저 저혈소판증을 갖는 대상체와 기저 호중구 감소증을 갖는 대상체에서 발견되었다.
ActRIIA-hFc (서열 7)는 일반적으로 잘 용인되었다. 20명의 대상체 (37%)가 치료와 관련된 것으로 의심되는 1개 이상의 부작용(AE)을 보고하였고; 피로 (11%), 두통 (9.3%), 식욕감퇴 (7.4%), 및 구역질 (7.4%)이 가장 공통된 것이었다.
치료를 중단한 35명의 대상체 (65%)중, 28명이 치료 효과가 없어서 중단하였고 4명은 AE 때문에 중단하였다. 치료를 중단한 AE를 갖는 환자 중, 3명은 치료와 관련된 것으로 의심되었다: 2급 용혈 빈혈이 있는 환자 1명, 3급 고혈압이 있는 환자 l명, 및 2급 근력 약화가 있는 환자 1명, 각각 ActRIIA-hFc (서열 7) 0.3, 0.5, 및 1.0 mg/kg 투여 그룹. 중단의 다른 이유는 동의 철회 (n = 2; 4%)와 환자 결정 (n = 1; 2%)이었다.
8.2.4 결론
ActRIIA-hFc (서열 7)는 시험된 용량 수준에서 저-위험 MDS 대상체에게 잘 용인되고, ESA-불응성, 빈혈성, 더 낮은-위험의 MDS 대상체로 이루어진 이러한 대규모 HTB 코호트에서 임상적 활성을 갖는다는 유력한 증거를 제공한다. 또한, 이러한 데이터는, ActRII 억제제, 예를 들어, ActRIIA-hFc (서열 7)로 치료하기 전에 대상체에서 고리 철적혈모구의 존재가 장기간 치료, RBC 수혈 독립성 및 장시간 헤모글로빈 수준 상승에 대한 지시자가 될 수 있다는 것을 나타낸다.
8.3 실시예 3: 저- 또는 중간-1 위험 MDS를 갖는 대상체에 있어서 ActRIIB -hFc는 헤모글로빈을 증가시키고 수혈 부담을 감소시킨다: 2상 연구로부터 예비 결과
8.3.1 서론
ActRIIB-hFc (서열 25; 루스패터셉트로 지칭함), 변형된 액티빈 수용체 유형 IIB 및 IgG Fc를 함유하는 재조합 융합 단백질을 비효율적인 적혈구생성, 예컨대 MDS로 기인한 빈혈을 치료하기 위해 사용하였다. MDS를 갖는 대상체는 종종 증가된 수준의 적혈구생성인자 (EPO)를 갖고, 적혈구생성-자극제 (ESA)에 비-반응성이거나 또는 불응성일 수 있다. MDS 대상체는 또한 골수에서 증가된 혈청 GDF11 수준 (Suragani R et al., Nature Medicine 2014)을 갖고 증가된 스매드(Smad) 2/3 신호를 갖는 것으로 (Zhou L et al., Blood 2008) 나타났다. ActRIIB-hFc (서열 25)는 GDF11를 포함한 TGF-β 상과(superfamily)에 있는 리간드에 결합하고, 스매드 2/3 신호를 억제하고, ESA와는 다른 메카니즘으로 후기 적혈구 분화를 촉진한다. mActRIIB-Fc (ActRIIB- hFc (서열 25)의 설치류 버젼)는 스매드 2 신호를 감소시켰고, 헤모글로빈 (Hb) 수준을 증가시켰고 MDS의 마우스 모델에서 골수 적혈구 과형성(hyperplasia)을 감소시켰다 (Suragani R et al., Nature Medicine 2014). 건강한 지원자 연구에서, ActRIIB-hFc (서열 25)는 잘 용인되었고 Hb 수준을 증가시켰다 (Attie K et al., Am J Hematol 2014).
8.3.2 물질 및 방법
본 실시예는, 고수혈부담을 갖거나[HTB, (4 유닛 RBC 이상)/(기준선 전에 8주)로서 정의됨] 또는 저수혈부담을 갖는[LTB, (4 유닛 RBC 미만)/(기준선 전에 8주)로서 정의됨], 저- 또는 중간-1 위험 MDS를 갖는 대상체에서 빈혈에 미치는 ActRIIB-hFc (서열 25)의 영향을 평가하기 위한 용량-결정 데이터를 나타낸다 (표 3 및 표 4 참조). 결과는 적혈구 반응 (LTB 대상체에서 Hb 증가 또는 HTB 대상체에서 감소된 수혈 부담), 안전성, 용인성, PK, 및 PD 생물표지자를 포함한다.
포함기준은 저- 또는 중간-1 위험 MDS, 18세 이상 연령, 빈혈 (HTB 대상체이거나 LTB 대상체에서 10.0 g/dL 미만의 기준선 Hb를 갖는 것으로 정의됨), 500 U/L 초과의 EPO 또는 ESA에 비반응성/불응성, 아자사이티딘 또는 데시타빈 사전에 사용 안함, ESA, G-CSF, GM-CSF, 또는 레날리도미드로 현재 치료하지 않음을 포함하다. 용량 증가 단계에서, ActRIIB-hFc (서열 25)은, 0.125, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.33 및 1.75 mg/kg의 용량 수준으로, 7개의 순차적 코호트(n=3-6)에 3주마다 1회씩, 5회까지의 투여로, 피하(SC) 주입에 의해 투여하였고 3-개월 추적검사하였다. 연장 코호트(n=30)를 계획하고, 이 연구를 완료한 모든 대상체는 12개월 연장 연구에 등록할 수 있다. 실험적 설계와 투여요법에 대한 상세한 설명에 대해 도 8을 참조한다.
8.3.3 결과
26명의 대상체 (7 LTB/19 HTB)에 대한 데이터가 입수되었다. 평균 연령은 71세였고 (범위: 27 내지 88세), 50%가 여성이었으며, 54%는 사전 EPO 요법을 받았고, 15%가 사전 레날리도미드를 받았다. 69%는 WHO 아형 RCMD이었고, 남아 있는 대상체는 del(5q), RARS, 또는 RAEB-1이었다. LTB 대상체 (n=7)에 대한 평균 (SD) 기준선 Hb는 9.1 (0.4) g/dL이었다. 치료 전 8주 안에 수혈된 평균 (SD) 유닛 RBC는 LTB 대상체에 대해 0.9 (1.1) 유닛이었고 HTB 대상체에 대해 6.3 (2.4) 유닛이었다. 표 3 및 표 4 참조.
7명 LTB 대상체 중 2명은 기준선과 비교했을 때 8주에 걸쳐 평균 Hb ≥1.5 g/dL의 증가를 나타냈다. LTB 대상체에서 평균 최대 Hb 증가는 0.125 (n=l), 0.25 (n=l), 0.75 (n=3), 및 1.75 (n=2) mg/kg 투여 그룹에서 각각 0.8, 1.0, 2.2, 및 2.7 g/dL였다. ActRIIB-hFc (서열 25)를 이용한 치료 이후에 LTB 대상체의 최대 헤모글로빈 증가를 나타내는 도 9를 참조한다. ActRIIB-hFc (서열 25)가 투여된 LTB 대상체는 증가된 망상적혈구 및 헤모글로빈 수준을 나타냈다. 도 10 내지 12, 및 표 5를 참조한다. 7명의 LTB 대상체 중 6명이 연구 중에 8주 이상 동안 RBC 수혈 독립성 (RBC-TI)을 달성하였다.
19명의 HTB 대상체 중 6명이 치료 전 8주와 비교하여 치료 기간 동안 8주 간격에 걸쳐 수혈된 RBC 유닛에서 ≥4 유닛 또는 ≥50% 감소를 가졌다; 이들 6명의 대상체 중 다섯 명은 연구 중에 RBC-TI≥8주 (71 내지 152일 범위)를 달성하였다. 헤모글로빈 수준 증가가 ActRIIB-hFc (서열 25)를 투여한 HTB 대상체에서 관찰되었다. 예를 들어 도 13을 참조한다. 연구 약물 투여 후 호중구 개수 증가가 일부 대상체에서 관찰되었다. 8주 이상의 RBC-TI를 달성하는 대상체 아집단은 대상체를 ActRIIB-hFc (서열 25)로 치료하기 전 고리 철적혈모구였던 적혈모구를 증가된 백분율로 가졌다. 표 7 참조.
ActRIIB-hFc (서열 25)는 일반적으로 잘 용인되었다. 인과성과 무관한 가장 빈번한 부작용은 다음과 같았다: 설사 (n=4, 1/2급), 뼈에 통증, 피로, 근육 연축, 근육통, 및 비인두염 (n=3 각각, 1/2급).
8.3.4 결론
저- 또는 중간-1 MDS 대상체에서 예비 데이터를 기준으로, 3주마다 5회까지 피하 투여된 ActRIIB-hFc (서열 25)는 Hb 수준을 증가시키거나 수혈 필요성을 더 유리한 안전 프로필로 감소시켰다. 이러한 데이터는 ActRIIB-hFc (서열 25)로 장기간 치료한 MDS를 갖는 대상체의 추가의 평가를 강하게 뒷받침한다.
8.4 실시예 4: ActRIIB -hFc (서열 25)는 저- 또는 중간-1 위험 MDS를 갖는 대상체에 있어서 헤모글로빈을 증가시키고 수혈 부담을 감소시킨다: 2상 PACE-MDS 연구로부터 예비 결과
8.4.1 서론
ActRIIB-hFc (서열 25)는 비효율적인 적혈구생성으로 인한 빈혈을 치료하기 위해 현재 조사되고 있는 융합 단백질 (변형된 액티빈 수용체 IIB/IgG Fc)이다. MDS 대상체는 골수에서 증가된 GDF11 수준 (Suragani, Nat Med 2014) 및 이상(aberrant) 스매드 2,3 신호를 갖는다. ActRIIB-hFc (서열 25)는, ESA와는 달리, GDF11, 액티빈 B, 및 BMP6을 포함한 TGF-β 상과 리간드를 결합시키고, 스매드2,3 신호를 억제하고, 후기 적혈구 분화를 촉진한다. 건강한 지원자 연구에서, ActRIIB-hFc (서열 25)는 잘 용인되었고, Hb 수준이 증가하였다 (Attie, Am J Hematol 2014).
8.4.2 목표
본 실시예에 제시된 데이터는, 수혈-의존적 (TD) 또는 비-수혈 의존적 (NTD) 저- 또는 중간-1 위험 MDS를 갖는 대상체에서 빈혈에 미치는 ActRIIB-hFc (서열 25)의 영향을 평가하기 위한, 현재 진행되고 있는 2상 멀티센터(multicenter), 오픈-표지, 용량-결정 연구로부터 얻는 것이다. 연구 결과는 적혈구 반응, 안전성, 용인성, 약역학적 생물표지자 및 약물역학적 생물표지자를 포함하였다. 저수혈부담 (LTB) 대상체에서, 적혈구 반응은 헤모글로빈 농도 증가로 정의되었다. 고수혈부담 (HTB) 대상체에서, 적혈구 반응은 감소된 수혈 부담으로 정의되었다.
8.4.3 방법
포함기준은 저- 또는 중간-1 위험 MDS, 연령≥18세, Hb < 10.0 g/dL (LTB, <4 RBC 유닛/기준선 전 8주로 정의됨) 또는 ≥4 RBC 유닛/기준선 전 8주(HTB)로 정의된 빈혈, EPO>500 U/L 또는 ESA에 비반응성/불응성, 아자사이티딘 또는 데시타빈 사전에 사용 안함, ESA, G-CSF, GM-CSF, 또는 레날리도미드로 현재 치료하지 않음을 포함하다. ActRIIB-hFc (서열 25)은, 0.125 내지 1.75 mg/kg의 용량 수준으로, 순차적 코호트(n=3-6 각각)에 3주마다 1회씩 피하(SC) 주입에 의해 5회 투여까지 투여하고, 3-개월 추적검사하였다. 연장 코호트(n=30)는 계속되고, 반응에 대한 대상체 개개인의 용량 적정이 허용되었다. 이러한 연구를 완료한 대상체는 12개월 연장 연구에 등록할 수 있다.
8.4.4 결과
본 실시예는 II상 연구에 등록한 58명의 대상체 중 44명의 대상체 (19명 여성, 25명 남성; 15명 LTB 대상체, 29명 HTB 대상체)에 대한 예비 안전성 및 효능 데이터를 제공한다. 대상체의 평균 연령은 71세였고, 대상체의 61%는 사전 EPO 요법을 받았다. 대상체의 21%는 사전 레날리도미드 요법을 받았다. 대상체의 73%는 RARS 또는 RCMD-RS를 받았다. 대상체의 80%는 골수에 15% 초과의 고리 철적혈모구를 가졌다.
0.75 mg/kg 내지 1.75 mg/kg (n=13)의 ActRIIB-hFc (서열 25)로 치료된 LTB 대상체는 1차 종말점에 대해 77% 반응률 (Hb 증가≥1.5 g/dL ≥2주 동안) 및 62% IWG HI-E (International Working Group erythroid hematological improvement) 반응률 (Hb 증가≥1.5 g/dL ≥8주 동안)을 가졌다. 헤모글로빈에서 평균 (표준 편차) 최대 변화는 더 낮은 용량 그룹에서 0.9 (표준편차: 0.1) g/dL와 비교하여 고용량 그룹에서 2.7 (표준편차: 1.1) g/dL이었다.
0.75 mg/kg 내지 1.75 mg/kg (n=13)의 ActRIIB-hFc (서열 25)로 치료된 HTB 대상체는 50% HI-E 반응률을 가졌다 (≥4 RBC 유닛/8주 감소). HI-E 반응률은 ≥15% 고리 철적혈모구를 갖는 대상체(n=30)에 대해 63%이었고, SF3B1 돌연변이를 갖는 대상체(n=10)에 대해 80%이었다. ActRIIB-hFc (서열 25)는 일반적으로 잘 용인되었다. 인과성과 무관하게 가장 빈번한 부작용은 설사, 비인두염, 근육통, 뼈의 통증, 기관지염, 두통 및 근육 연축이었다.
8.4.5 결론
저-/중간-1 MDS 대상체에서 예비 데이터를 기준으로, ActRIIB-hFc (서열 25) 치료를 하면 3개월 동안 치료 용량 수준으로 대상체의 54%에서 증가된 Hb 수준 및/또는 감소된 수혈 필요성 쪽으로의 HI-E 반응을, 유리한 안전 프로필로, 유도하였다. 더 높은 반응률이 고리 철적혈모구 및 SF3B1 돌연변이를 갖는 대상체에서 관찰되었다. 이들 데이터는 MDS를 갖는 대상체에서 ActRIIB-hFc (서열 25)를 사용한 효과적인 치료를 위한 생물표지자로서, 고리 철적혈모구 수준과 SF3B1 돌연변이 유병률의 이용을 강하게 뒷받침한다.
8.5 실시예 5: 저- 또는 중간-1( Int -1)-위험 MDS 또는 비-증식성 CMML 및 RBC 수혈이 필요한 빈혈을 갖는 대상체에 있어서 ActRIIA -hFc (서열 7)의 오픈-표지, 2상 , 용량 결정 연구
8.5.1 서론
실시예 2(8.2 부분)에 대한 서론 (8.2.1 부분) 및 물질 및 방법 (8.2.2 부분)을 참조한다. 본 실시예는 상기 2상 연구에서 후기 날짜에 입수된 실시예 2(8.2 부분)로부터의 부가적인 데이터를 나타낸다.
8.5.2 결과
59명의 MDS 대상체 모두를 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 또는 2.0 mg/kg의 ActRIIA-hFc (서열 7)로 치료하였다. 표 8은 각각의 치료 그룹에 대해 대상체의 기준선 특징을 제공한다.
효능에 대해 평가할 수 있는 53명의 대상체 중, 총 23명의 대상체 (43%)에서 HI-E가 관찰되었다: 0명, 4명(67%), 9명(45%), 및 10명(50%) 대상체에 각각 ActRIIA-hFc (서열 7) 0.1, 0.3, 0.5, 및 1.0 mg/kg 용량 그룹. 게다가, HTB 대상체를 0.3 mg/kg만큼 적은 ActRIIA-hFc (서열 7)로 치료하면 4 RBC 유닛/8주 이상의 수혈 부담 감소가 이루어졌다 (표 9 참조). 수혈 반응의 지속시간은 용량-의존적인 것으로 보였다. 또한, 45명의 평가가능한 HTB 대상체 중에, 6명 (13)이 8주 이상 동안 RBC-TI를 달성하였다 (표 9 참조). 1.0 mg/kg 용량의 ActRIIA-hFc (서열 7)로 치료를 개시한 지 337일 이상 동안 RBC-TI를 달성한 예시적인 HBT 대상체에 대해 도 13을 참조한다.
부가적으로, ActRIIA-hFc (서열 7)로 치료된 8명의 LTB 대상체 중, 5명 (63%)이 임의의 수혈 없는 8주의 기간에 걸쳐 1.5 g/dL 이상의 평균 Hb 증가와 함께 RBC-TI를 달성하였다. 특히, 0.5 mg/kg의 ActRIIA- hFc (서열 7)로 치료된 LTB 대상체의 33% 및 1.0 mg/kg의 ActRIIA-hFc (서열 7)로 치료된 LTB 대상체의 80%가 임의의 수혈 없는 8주의 기간에 걸쳐 1.5 g/dL 이상의 평균 Hb 증가와 함께 RBC-TI를 달성하였다. ActRIIA-hFc (서열 7)로 치료된 LTB 대상체에 있어서 최대 평균 Hb 증가는 1.45 g/dL 내지 4.44 g/dL이었다. ActRIIA-hFc (서열 7)로 치료된 LTB 대상체에서 RBC-TI의 지속시간은 76 내지 472일이었다. 11.0 g/dL보다 큰 Hb 수준을 갖는 LTB 대상체는 투약 지연이 일어났고, 이것이 Hb 수준 증가의 지속시간의 평가에 영향을 미쳤을 수 있다. ActRIIA-hFc (서열 7) 1.0 mg/kg의 용량으로 치료를 개시한 후 RBC-TI를 달성하고 358일 이상 동안 헤모글로빈 수준이 지속적으로 증가한 예시적인 LTB 대상체에 대한 도 14를 참조한다.
또한, 기준선에서 치료 효능과 고리 철적혈모구 (RS)의 존재 사이에 연관성이 평가되었다 (표 10 참조). RS-양성 대상체의 50%에서 HI-E가 달성되었다. 대조적으로, RS-음성 대상체의 10%에서만 HI-E가 달성되었다.
ActRIIA-hFc (서열 7)은 일반적으로 잘 용인되었다. 표 11 참조. 4명의 대상체가 치료와 관련된 것으로 의심되는 부작용에 기인하여 치료를 중단하였다: 대상체 A (0.3 mg/kg 용량 그룹), 2급 용혈 빈혈; 대상체 B (0.5 mg/kg 용량 그룹), 3급 고혈압; 대상체 C (1.0 mg/kg 용량 그룹), 2급 근력 약화; 대상체 D (2.0 mg/kg 용량 그룹), 및 2급 증가된 혈압과 2급 설사.
8.5.3 결론
ActRIIA-hFc (서열 7)는 시험된 용량 수준에서 저-위험 MDS 대상체에게 잘 용인되었고, ESA-불응성, 빈혈성, 더 낮은-위험의 MDS 대상체의 이러한 대규모 HTB 코호트에서 임상적 활성을 갖는다는 유력한 증거를 제공한다. 또한, 이들 데이터는 ActRII 신호 억제제, 예를 들어, ActRIIA- hFc (서열 7)로 치료하기 전 대상체에서 고리 철적혈모구의 존재가 장기간 치료 RBC 수혈 독립성, 헤모글로빈 수준의 장기간 증가 및 치료의 증가된 효능에 대한 지시자가 될 수 있다는 것을 나타낸다.
8.6 실시예 6: 저- 또는 중간-1 위험 MDS를 갖는 대상체에 있어서 ActRIIB -hFc는 헤모글로빈을 증가시키고 수혈 부담을 감소시킨다: 2상 연구로부터 예비 결과
8.6.1 서론
실시예 3 (8.3 부분)에 대한 서론 (8.3.1 부분), 및 물질 및 방법 (8.3.2 부분)을 참조한다. 본 실시예는 2상 연구의 후기 날짜에 입수된 실시예 3 (8.3 부분)으로부터 부가적인 데이터를 나타낸다.
8.6.2 결과
44명 대상체 (15 LTB/29 HTB)에 대해 데이터가 입수되었다. 표 12는 본 실시예에서 연구된 대상체의 기준선 특징을 제공한다.
ActRIIB-hFc (서열 25)로 치료된 대상체에서 적혈구 반응을 평가하였다. LTB 대상체에 대해, 1차 종말점은 2주 이상 동안 1.5 g/dL 이상의 헤모글로빈 증가였다. HTB 대상체에 대해, 1차 종말점은 8주에 걸친 RBC 수혈의 4 유닛 이상 또는 50% 이상의 감소였다. 더 낮은 용량(0.125-0.5 mg/kg의 ActRIIB-hFc (서열 25))으로 투여된 대상체의 33% (3/9)가 1차 종말점을 달성한 한편, 더 높은 용량 (0.75-1.75 mg/kg의 ActRIIB-hFc (서열 25))으로 투여된 대상체의 63% (22/35)가 1차 종말점을 달성하였다.
또한, IWG HI-E가 평가되었다. LTB 대상체에 대해, IWG HI-E는 8주 이상 동안 1.5 g/dL 이상의 헤모글로빈 증가이다. HTB 대상체에 대해, IWG HI-E는 8주에 걸쳐 RBC 수혈에서 4 유닛 이상의 감소이다. 더 낮은 용량(0.125-0.5 mg/kg의 ActRIIB-hFc (서열 25))이 투여된 대상체의 22% (2/9)이 IWG HI-E를 달성한 한편, 더 높은 용량 (0.75-1.75 mg/kg의 ActRIIB-hFc (서열 25))이 투여된 대상체의 54% (19/35)가 IWG HI-E를 달성하였다.
고리 철적혈모구는 비정상적인 적혈모구이다. 또한, MDS와 관련된 특정 체세포 돌연변이는 고리 철적혈모구 형성 및 비효율적인 적혈구생성을 야기한다. 스플라이싱 인자(splicing factor) 3B1 (SF3B1)에서 우성 돌연변이는 고리 철적혈모구의 형성과 관련된다. 본원에 사용될 때, "RS+"란 15% 이상의 고리 철적혈모구를 말한다. 이렇게, 고리 철적혈모구의 존재, 체세포 돌연변이, 및 비효율적인 적혈구생성과 적혈구 반응 및 수혈 독립성 사이의 연관성을 더 높은 용량 (0.75 mg/kg-1.75 mg/kg)의 ActRIIB-hFc (서열 25)로 치료된 대상체에게서 평가하였다 (표 13 및 표 14 참조). ActRIIB-hFc로 치료된 대상체는 IWG HI-E 및 수혈 독립성을 달성하였다 (표 13, 표 14 및 도 16 참조). 이들 데이터는, 대상체가 RS+이었고/RS+이었거나 SF3B1 돌연변이를 가졌을 때 ActRIIB-hFc (서열 25)로 치료된 대상체에서 증가된 적혈구 반응이 있었음을 지시한다.
8.6.3 결론
ActRIIB-hFc (서열 25)를 3주마다 MDS 대상체에게 투여하는 것은 일반적으로 안전하고 잘 용인되었다. 0.75 mg/kg 이상의 ActRIIB-hFc (서열 25)의 용량으로 치료된 대상체의 54%에서 적혈구 반응 (IWG HI-E)이 달성되었다. 또한, 더 높은 적혈구 반응률이 고리 철적혈모구 또는 SF3B1에서 돌연변이를 갖는 대상체에서 발견되었다. 덧붙여, ActRIIB-hFc (서열 25) 0.75 mg/kg 이상의 용량으로 치료된 대상체의 36%에서 수혈 독립성이 달성되었다.
8.7 실시예 7: 더 낮은-위험 MDS 및 수혈이 필요한 빈혈을 갖는 환자에 있어서 ActRIIA -hFc (서열 7)의 2상 , 용량 결정 연구
실시예 2 (8.2 부분)에 대한 서론 (8.2.1 부분), 및 물질 및 방법 (8.2.2 부분)을 참조한다. 본 실시예는 2상 연구에서 후기 날짜에 입수된 실시예 2 (8.2 부분)로부터 부가적인 데이터를 나타낸다.
치료 효능과 기준선에서 고리 철적혈모구 (RS)의 존재 사이에 연관성이 추가로 평가되었다 (표 15 참조).
임의의 8주 기간에 걸쳐 RBC-TI (LTB 환자에 대해 평균 Hb 증가 ≥ 1.5 g/dL) 달성을 도 17에 나타낸다.
8.8 실시예 8: 저 또는 중간-1 위험 MDS를 갖는 대상체에서 ActRIIB -hFc는 헤모글로빈을 증가시키고 수혈 부담을 감소시킨다: 2상 연구로부터 예비 결과 (계속)
8.8.1 서론
실시예 3 (8.3 부분)에 대한 서론 (8.3.1 부분), 및 물질 및 방법 (8.3.2 부분)을 참조한다. 본 실시예는 2상 연구의 후기 날짜에 입수한 실시예 3 (8.3 부분)으로부터 부가적인 데이터를 나타낸다.
8.8.2 결과
총 49명의 MDS 대상체를 연구하였다. 표 16에서 알 수 있듯이, 49명의 MDS 대상체 중 27명이 3개월 ActRIIB-hFc (서열 25) 용량 증가 연구 (0.125 mg/kg - 1.75 mg/kg)에 등록하였고, 22명의 대상체가 후속적 연장 연구에 등록하였다. 표 17은 본 실시예에서 연구되는 대상체의 기준선 특징을 제공한다.
3개월 용량 증가 연구
ActRIIB-hFc (서열 25)로 치료된 대상체에서 적혈구 반응을 평가하였다. 표 18 참조. LTB 대상체에 대해, 1차 종말점은 2주 이상 동안 1.5 g/dL 이상의 헤모글로빈 증가였다. HTB 대상체에 대해, 1차 종말점은 8주에 걸쳐 RBC 수혈에서 4 유닛 이상 또는 50% 이상의 감소였다. 낮은 용량(0.125-0.5 mg/kg의 ActRIIB-hFc (서열 25))이 투여된 대상체의 33% (3/9)가 1차 종말점을 달성한 한편, 더 높은 용량(0.75-1.75 mg/kg의 ActRIIB-hFc (서열 25))이 투여된 대상체의 58% (23/40)이 1차 종말점을 달성하였다.
또한, IWG HI-E가 평가되었다. 표 18 참조. LTB 대상체에 대해, IWG HI-E는 8주 이상 동안 1.5 g/dL 이상의 헤모글로빈 증가이다. HTB 대상체에 대해, IWG HI-E는 8주에 걸쳐 RBC 수혈에서 4 유닛 이상의 감소이다. 더 낮은 용량 (0.125-0.5 mg/kg의 ActRIIB-hFc (서열 25))이 투여된 대상체의 22% (2/9)가 IWG HI-E를 달성한 한편, 더 높은 용량 (0.75-1.75 mg/kg의 ActRIIB-hFc (서열 25))이 투여된 대상체의 48% (19/40)가 IWG HI-E를 달성하였다.
또한, 수혈 독립성이 평가되었다. 표 18을 참조한다. ActRIIB-hFc (서열 25) 요법 전에 2 RBC 유닛 이상을 받은 대상체에 대해, 수혈 독립성은 ActRIIB-hFc (서열 25) 치료를 받으면서 수혈 없이도 8주 이상을 달성한 것으로 정의된다. 더 낮은 용량 (0.125-0.5 mg/kg의 ActRIIB-hFc (서열 25))이 투여된 대상체의 14% (1/7)가 수혈 독립성을 달성한 한편, 더 높은 용량 (0.75-1.75 mg/kg의 ActRIIB-hFc (서열 25))을 투여한 대상체의 37%(11/30)가 수혈 독립성을 달성하였다. 4/6 LTB 대상체 및 7/24 HTB 대상체가 수혈 독립성을 달성하였다. 11명의 수혈 독립 환자 중 10명이 ActRIIB-hFc (서열 25)로 치료한지 첫 6주 후에 발병하였다.
고리 철적혈모구의 존재, 체세포 돌연변이, 및 비효율적인 적혈구생성과 적혈구 반응 및 수혈 독립성 사이의 연관성을, 더 높은 용량 (0.75 mg/kg-1.75 mg/kg)의 ActRIIB-hFc (서열 25)로 치료된 대상체에서 평가하였다. 표 19 참조. 더 높은 용량 그룹에서 대상체 모두의 19/40 (48%)이 IWG HI-E를 달성하였다. 고리 철적혈모구 (RS) 양성 대상체 (골수에서 15% 이상의 적혈구 전구체를 갖는 것으로 정의됨)의 19/35(54%)가 IWG HI-E를 달성하였고, RS 음성 대상체의 0/4 (0%)이 IWG HI-E를 달성하였다. 200 mU/mL 미만의 EPO 수준을 갖는 14/23 (61%) RS 양성 대상체가 IWG HI-E를 달성하였고, 200 mU/mL 미만의 EPO 수준을 갖는 5/12 (42%) RS 양성 대상체가 IWG HI-E를 달성하였다. 16/26 (62%) SF3B1 돌연변이를 수반하는 대상체 및 3/13 (23%) SF3B1 돌연변이를 수반하지 않는 대상체가 IWG HI-E를 달성하였다.
요컨대, 본 실시예에 나타낸 상기 결과는, ActRIIB-hFc (서열 25) 치료가 특히 더 높은 용량 그룹의 대상체에 있어서, 활발한 적혈구 반응 및 수혈 독립성을 만들어 냈다는 것을 입증하였다. 게다가, 왕성한 적혈구 반응이 RS+ 양성 및 SF3B1 돌연변이 양성 대상체에서 발견되었다.
ActRIIA-hFc (서열 7)는 일반적으로 잘 용인되었다. 표 20 참조. 대부분의 부작용 (AE)은 1 또는 2급이었다. 두 가지 관련있을 수 있는 중증 부작용 (SAE, serious adverse event)이 관찰되었다: 3급 근육통 (발병일 90) 및 3급 일반적인 상태 악화 (발병일 44, 재발일 66, 무관함). 한 가지 관련있을 수 있는 심각하지 않은 3급 모세포 개수의 AE가 관찰되었다.
연장 연구
3개월 용량 증가 시험을 완료한 대상체가 후속적인 12개월 연장 연구에 등록할 자격이 되었다. ActRIIB-hFc (서열 25)의 출발 용량 수준은 그 치료가 3개월 이상 동안 중단되었던 대상체에 대해 1.0 mg/kg이었다. ActRIIB-hFc (서열 25) 치료가 중단되지 않았던 대상체는 3개월 치료 프로토콜에서 그 마지막 용량과 동일한 용량 수준으로 그 치료를 계속하였다.
총 58명의 대상체가 3개월 치료 연구에 등록하였다. 이들 중, 22명의 대상체가 12개월 연장 연구에 등록하였고, 9명의 저수혈부담 환자 및 13명의 고수혈부담 환자가 있었다. 연장 연구에서, 17/22 대상체가 중단되지 않고 그들의 ActRIIB-hFc (서열 25) 치료를 계속하였고, 5/22 대상체가 >3개월의 중단 후 들어갔다.
9명의 저수혈부담 환자에 대해, 한 달째에서 평균 헤모글로빈 증가는 대략 2 g/dL이었고, 2.5 내지 3.0 g/dL까지 증가하였고 6개월 기간 동안 유지되었으며, 그동안 데이터가 입수가능하다.
13명의 고수혈부담 환자에 대해, 43%가 수혈 독립성을 달성했는데, 몇몇 환자는 이러한 수혈 독립성을 6개월 이상 동안 유지하였고, 가장 길게 가는 수혈 독립성 환자는 거의 8개월이었다. 이들 환자 모두 연구에 남았다.
도 18은 예시적인 대상체에 대한 결과를 나타낸다. RS-양성 HTB 대상체를 초기 3개월 치료 연구에서 0.75 mg/kg 용량의 ActRIIB-hFc (서열 25)로 치료하였고, 11개월 ActRIIB-hFc (서열 25) 치료 중단(그동안 상기 대상체가 EPO를 받았다) 이후 12-개월 연장 연구에 등록하였다.
지속성이 있는 헤모글로빈 반응이 LTB 대상체에서 관찰되었다. 8/9 대상체가 IWG HI-E를 달성하였다. 도 19는 예시적 대상체의 헤모글로빈 반응을 나타낸다.
12-개월 연장 연구에서 대상체는 지속가능한 수혈 독립성 반응을 나타냈다. 도 20은 6명의 대상체의 결과를 설명한다. 5명의 대상체는 ActRIIB-hFc (서열 25) 치료를 1.0 mg/kg의 용량으로 (4명의 대상체) 그리고 1.75 mg/kg의 용량으로 (1명 대상체) 받는 동안 2 내지 7개월 후 계속되는 수혈 독립 반응을 나타낸다. 한 대상체 (도 20에서 마지막 열)는, 1.0 mg/kg로부터 1.33 mg/kg 및 1.75 mg/kg까지 두 가지 용량 적정을 하였다. 이 후자의 대상체는 약 2개월 동안 간헐적으로 수혈 독립성을 경험하였고, 계속해서 IWG HI-E 반응을 달성한다.
결론적으로, 본 실시예에 나타낸 상기 결과는, ActRIIB-hFc (서열 25)로 치료된 저 위험 RS-양성 MDS 대상체가 특히 ≥ 0.75 mg/kg의 용량으로 치료될 때 활발한 혈액학적 개선을 입증하였다는 것을 입증하였다. ActRIIB-hFc (서열 25) 치료는 일반적으로 잘 용인되었다. ActRIIB-hFc (서열 25)를 사용한 장기간 치료는 헤모글로빈 수준에서 지속적인 증가를 보여주었고 수혈 독립성을 유지하였다.
8.9 실시예 9: IPSS -R 초저 -, 저-, 또는 중간-위험 MDS에 기인한 빈혈을 치료하기 위한 ActRIIB -hFc (서열 25)의 III상 연구
본 실시예는 RBC 수혈이 필요한 고리 철적혈모구 (적혈모구의 15% 이상이 고리 철적혈모구임)를 갖는 대상체에서 IPSS-R 초저-, 저-, 또는 중간-위험 MDS에 기인한 빈혈의 치료를 위한 ActRIIB-hFc (서열 25)의 효능 및 안전성을 결정하기 위한 3상, 더블 블라인드(double blind), 플라시보-대조된 멀티센터의 무작위한 연구의 개요를 제공한다.
빈혈은 골수이형성 증후군 (적혈구, 백혈구, 및/또는 혈소판의 비효율적인 생산과 관련된 장애를 설명할 때 사용되는 포괄적 용어임)을 앓는 환자에게 가장 일반적인 혈구감소증 중 하나로 간주된다. 경증(증상없는)에서 중증까지의 중증도 범위에 걸쳐, 빈혈은 RBC 수혈이 필요한 환자를 만들어 내고, 이는 철 과잉으로부터 추가의 합병증을 유도할 수 있다. 이러한 연구의 목표는 IPSS-R 초저-, 저-, 또는 중간-위험 MDS으로 분류되고, 고리 철적혈모구가 존재하며, RBC 수혈을 필요로 하는 빈혈 환자에게 있어서 ActRIIB-hFc (서열 25) 대 플라시보의 안전성 및 효능을 평가하는 것이다. 본 연구의 설계는 환자에게 ActRIIB-hFc (서열 25) 또는 플라시보 암(placebo arm)으로 초기 무작위화하는 기간을 허여하고, 이어서 더블-블라인드 치료 기간, 및 이어서 MDS 질병 평가 방문이 이어질 것이다. 상기 연구로부터 판단했을 때 임상적 효과를 경험한 것으로 결정된 환자의 경우, 질병 평가 조사원이 방문하고, 그 환자들은 상기 연구의 더블-블라인드 연장 상으로 들어갈 수 있게 된다. 일단 환자가 연구 치료를 중단하면, 치료 후 추적 관찰 기간에 들어갈 것이다.
8.9.1 연구 설계
대상체에 3주마다 한 번씩 초기 용량 1.0 mg/kg의 ActRIIB-hFc (서열 25)를 피하 투여한다. 대조군 대상체는 3주마다 한 번씩 플라시보로 피하 투여될 것이다.
(a) 포함 기준
이러한 연구에서 대상체 참여에 대한 포함 기준은 다음을 포함한다: (1) 대상체는 공지된 동의서에 서명할 당시의 연령이 ≥18세이고; (2) 대상체는 초저-, 저- 또는 중간 위험-질병의 국제 예후 점수 체계 수정판(IPSS-R) 분류를 만족하고, (a) 골수에서 적혈구 전구체의 15% 초과가 고리 철적혈모구이고, (b) 골수에서 5% 미만 모세포를 갖는 MDS 진단을 받고; (3) 대상체는 8주 기간 안에 2 유닛 초과의 적혈구 수혈을 필요로 하고; (4) ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) 점수가 0, 1, 또는 2이고; (5) 사전 ESA 치료에 불응성이고/비용인적이고/적용불가능인 환자; 사전 ESA-치료에 불응성은 사전 ESA-함유 요법에, 단일 약물로서나 또는 조합 (예를 들어, G-CSF와)으로서나, 무반응 또는 더 이상 유지되지 않는 반응이라는 문서제시가 필요하다; ESA 요법은 (a) 8회 이상 투약에 대해 40,000 IU/주 초과의 재조합 인간 적혈구생성인자이었거나, 또는 (b) 4회 이상의 투약에 대해 3주마다 1회씩 500 μg 초과의 다르베포에틴 알파이었어야 하고; 사전 ESA-치료에 비용인적은, 비용인성 또는 부작용으로 인해 도입 후 어느 시점에서든, 사전 ESA-함유 요법을 단일 약물로서나 또는 조합(예를 들어, G-CSF와)으로서나 중단했다고 하는 문서제시가 필요하다; ESA-적용불가능은 ESA로 미리 치료되지 않은 대상체에 대해 200 U/L 초과의 내인성 혈청 적혈구생성인자 수준을 기준으로 ESA에 반응할 낮은 확율을 필요로 한다.
(b) 배제 기준
다음 중 하나라도 존재하면 환자는 연구 등록에서 배제될 것이다: (1) 질병 조절 치료제 (예를 들어, 면역조절 약물, 저메틸화제, 또는 면역억제 요법) 또는 기저 MDS 질병을 위한 실험용 약제로 사전 요법; (2) del 5q 염색체 이상과 관련된 MDS; (3) 2차 MDS, 즉 화학적 손상 또는 다른 질병에 대한 화학요법 및/또는 방사선을 이용한 치료의 결과로 발생한 것으로 알려진 MDS; (4) 철, 비타민 B12, 또는 엽산염 결핍, 또는 자가면역 또는 유전적 용혈빈혈, 또는 위장관 출혈에 기인한 임상적으로 유의미한 것으로 알려진 빈혈; 철 결핍은 트랜스페린 포화도 (철/총 철 결합 용량)≤20%, 또는 혈청 페리틴 ≤ 15 μg/L으로 계산된, 철에 대한 골수 흡인물 염색(bone marrow aspirate stain)에 의해 결정될 것이다; (6) 사전 동종 또는 자가 줄기세포 이식; (7) 급성 골수 백혈병(AML) 진단을 받은 알려진 병력; (8) 무작위화되기 전 5주 안에 다음 중 어느 것이든 사용: 항암 세포독성 화학요법제 또는 치료, MDS 이외의 의학적 질환에 대해 무작위화 전 1주 이상 동안 안정한 또는 감소하는 용량을 받은 대상체를 제외하고 코르티코스테로이드, 무작위화 전 8주 이상 동안 안정한 또는 감소하는 용량을 받은 대상체를 제외하고 철-킬레이트제, 다른 RBC 혈액생성 성장 인자 (예를 들어, 인터루킨-3); (9) 대상체가 5년 이상 동안 질병이 없지 않았다면, MDS 이외의 암 사전 병력; 다음의 병력/동시질환을 갖는 대상체는 허용된다: 피부의 기저세포 또는 편평세포 암종, 자궁경부 상피내암종(carcinoma in situ of the cervix), 유방 상피내암종(carcinoma in situ of the breast), 부수적인 전립선암의 조직 소견 (종양, 결절, 전이 임상 병기분류 시스템을 사용한 Tla 또는 T1b); 또는 (10) 무작위화 전 8주 안에 큰 수술; 환자는 무작위화 전에 어떠한 이전 수술로부터도 완전히 회복했어야 한다.
(c) 결과 결정
본 연구에 대한 1차 결과 결정은 임의의 연속적인 56일 기간 동안 RBC 수혈 독립적인 (즉, RBC 수혈이 필요하지 않은) ActRIIB-hFc (서열 25)가 투여된 대상체의 분율의 결정이다.
2차 결과 결정은 ActRIIB-hFc (서열 25)의 투여 후 임의의 연속적인 84일 기간 동안 RBC 수혈 독립적인 (즉, RBC 수혈을 필요로 하지 않은) ActRIIB-hFc (서열 25)을 투여한 대상체의 분율의 결정을 포함한다. ActRIIB-hFc (서열 25)의 투여 후 16주 기간에 걸쳐 수혈된 RBC 유닛의 개수가 감소된, ActRIIB-hFc (서열 25)가 투여된 대상체의 분율이 또한 결정될 것이다. 또한, ActRIIB-hFc (서열 25)가 투여된 대상체에서 RBC 수혈 독립성의 최장 기간이 또한 결정될 것이다. 최종적으로, ActRIIB-hFc (서열 25)가 투여된 대상체가 RBC 수혈 독립성에 도달하는 데에 요구되는 시간이 또한 결정될 것이다; RBC 수혈 독립성까지의 시간은 무작위화와 수혈 독립성이 처음 관찰된 날짜 (예를 들어, 어떠한 RBC 수혈도 없는 56일중 첫 날) 사이의 시간으로서 정의된다.
ActRIIB-hFc (서열 25) 투여 후 임의의 연속적인 56일에 걸쳐 수정된 적혈구 혈액학적 개선을 달성하는, ActRIIB-hFc (서열 25) 투여된 대상체의 분율이 또한 결정될 것이다. 특정 측면에서, 적혈구 혈액학적 개선은 IWG에 의해 정의된 바와 같다. 특정 측면에서, 적혈구 혈액학적 개선은 수정된 2006 IWG에 의해 정의된 바와 같다. 특정 측면에서, 저수혈부담 환자에 대한 적혈구 혈액학적 개선은 8주 이상 동안 환자에서 1.5 g/dL 이상의 헤모글로빈 농도 증가이다. 특정 측면에서, 고수혈부담 환자에 대한 적혈구 혈액학적 개선은 8주에 걸쳐 RBC 수혈에서 4 유닛 이상의 감소이다.
ActRIIB-hFc (서열 25)가 투여되고, RBC 수혈의 부재하에 임의의 연속적인 56일 기간에 걸쳐 1.0 g/dL 이상의 헤모글로빈 증가 (대상체에 ActRIIB-hFc (서열 25)를 투여하기 전 대상체에서 헤모글로빈 농도와 비교하여)를 달성한 대상체의 분율이 결정될 것이다.
ActRIIB-hFc (서열 25) 투여 전 혈청 페리틴 수준과 비교했을 때, ActRIIB-hFc (서열 25)가 투여된 대상체에서 혈청 페리틴 수준의 평균 감소가 결정될 것이다. 그룹들 사이에 치료 차이를 비교하기 위해 공분산분석 (ANCOVA)이, 공변량으로서 층화 인자(stratification factor) 및 기준선 (사전-ActRIIB-hFc (서열 25) 투여) 혈청 페리틴 값과 함께, 사용될 것이다.
ActRIIB-hFc (서열 25) 투여 전에 철 킬레이트화 요법 사용과 비교했을 때, ActRIIB-hFc (서열 25) 투여된 대상체에서 철 킬레이트화 요법 사용에서의 평균 감소가 결정될 것이다. 각각의 대상체에 대해 매일의 철 킬레이트화 요법에서 변화가 기준선 후 매일 용량과 기준선 평균 매일 용량의 차이로서 계산된다. 그룹들 사이에 치료 차이를 비교하기 위해 공분산분석(ANCOVA)이, 층화 인자 및 기준선 철 킬레이트화 요법 값 및 공변량과 함께 사용될 것이다.
ActRIIB-hFc (서열 25) 투여 후 임의의 연속적인 56일 기간 동안 호중구 혈액학적 개선을 달성한 ActRIIB-hFc (서열 25) 투여된 대상체의 분율이 또한 결정될 것이다. 특정 측면에서, 호중구 혈액학적 개선은 IWG에 의해 정의된 바와 같다. 특정 측면에서, 호중구 혈액학적 개선은 대상체에 ActRIIB-hFc (서열 25)를 투여한 후 대상체에서 56일의 연속적인 기간에 걸쳐 100% 이상 그리고 500/μL 초과만큼 호중구의 증가이다.
급성 골수 백혈병으로 진행하는 대상체의 분율이 또한 결정될 것이다.
유럽 암 연구 및 치료 기관(The European Organization for Research and Treatment of Cancer)의 암환자 생활의 질 설문지를 또한 활용하여 평가할 것이다.
부작용, 총 생존율, 집단 약동학 및 부작용을 또한 평가할 것이다.
9. 서열 설명
10. 등가물
비록 본 발명이 그의 구체적인 실시양태를 참조로 하여 상세히 설명되지만, 기능적으로 등가인 변이는 본 발명의 범주 안에 있는 것으로 이해해야 할 것이다. 실제로, 당업계에 숙련된 자에게는, 본원에 나타내고 기술한 것에 덧붙여 다양한 본 발명의 변형이, 상기 명세서와 첨부된 도면으로부터 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구의 범위의 범주 안에 포함시키고자 한다. 당업계에 숙련된 자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 개시된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 모든 등가물은 첨부된 다음 청구항에 포함시키고자 한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 마치 본원에서 각각의 개별적인 간행물, 특허 또는 특허 출원을 그 전문이 본원에 참조로서 포함되도록 구체적으로 그리고 개별적으로 지시한 것 같이, 그와 동일한 정도로 명세서에 참조로서 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Celgene Corporation Acceleron Pharma Inc. <120> ACTIVIN-ACTRII ANTAGONISTS AND USES FOR TREATING ANEMIA <130> 12827-978-228 <140> To be assigned <141> On even date herewith <150> 62/086,977 <151> 2014-12-03 <150> 62/088,478 <151> 2014-12-05 <150> 62/153,872 <151> 2015-04-28 <150> 62/173,782 <151> 2015-06-10 <150> 62/218,728 <151> 2015-09-15 <160> 47 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 513 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> human ActRIIA precursor polypeptide <400> 1 Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe 20 25 30 Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu 35 40 45 Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp 50 55 60 Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu 65 70 75 80 Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp 85 90 95 Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu 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ctaccctcct gtacttgttc caactcaaga cccaggacca 540 cccccacctt ctccattact agggttgaaa ccactgcagt tattagaagt gaaagcaagg 600 ggaagatttg gttgtgtctg gaaagcccag ttgcttaacg aatatgtggc tgtcaaaata 660 tttccaatac aggacaaaca gtcatggcaa aatgaatacg aagtctacag tttgcctgga 720 atgaagcatg agaacatatt acagttcatt ggtgcagaaa aacgaggcac cagtgttgat 780 gtggatcttt ggctgatcac agcatttcat gaaaagggtt cactatcaga ctttcttaag 840 gctaatgtgg tctcttggaa tgaactgtgt catattgcag aaaccatggc tagaggattg 900 gcatatttac atgaggatat acctggccta aaagatggcc acaaacctgc catatctcac 960 agggacatca aaagtaaaaa tgtgctgttg aaaaacaacc tgacagcttg cattgctgac 1020 tttgggttgg ccttaaaatt tgaggctggc aagtctgcag gcgataccca tggacaggtt 1080 ggtacccgga ggtacatggc tccagaggta ttagagggtg ctataaactt cgaaagggat 1140 gcatttttga ggatagatat gtatgccatg ggattagtcc tatgggaact ggcttctcgc 1200 tgtactgctg cagatggacc tgtagatgaa tacatgttgc catttgagga ggaaattggc 1260 cagcatccat ctcttgaaga catgcaggaa gttgttgtgc ataaaaaaaa gaggcctgtt 1320 ttaagagatt attggcagaa acatgctgga 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ccccgaagcc 360 ggcgggcccg aggtgaccta tgaacccccg cccaccggtg gtggaactca cacatgccca 420 ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 480 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 540 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 600 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 660 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 720 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 780 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 840 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 900 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctat 960 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1020 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 1080 tga 1083 <210> 46 <211> 344 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein comprising a soluble extracellular domain of ActRIIB (R64; SEQ ID NO:29) fused to an Fc domain <400> 46 Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala 1 5 10 15 Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu 20 25 30 Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser 35 40 45 Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe 50 55 60 Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln 65 70 75 80 Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr 85 90 95 His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro 100 105 110 Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 115 120 125 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 130 135 140 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 145 150 155 160 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 165 170 175 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 180 185 190 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 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Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 290 295 300 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 1

Claims (117)

  1. 대상체에서 골수이형성 증후군(MDS)을 치료하기 위한 액티빈 수용체 II형(ActRII) 신호전달 억제제를 포함하는 약학 조성물로서,
    상기 약학 조성물이 0.3 mg/kg 내지 2.0 mg/kg 사이의 약제학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 위해 사용되고,
    상기 투여 전에, 대상체에서 적어도 15%의 적혈모구(erythroblast)가 고리 철적혈모구(ring sideroblast)이고,
    상기 ActRII 신호전달 억제제가
    (i) 액티빈 수용체 IIB형(ActRIIB)의 세포외 도메인(extracellular domain)의 단편, (ii) 링커 및 (iii) IgG의 Fc를 포함하고, 상기 단편은 서열 23의 아미노산 서열로 이루어지는, 폴리펩티드
    인, 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 대상체에서의 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율 대비, 대상체에서의 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율의 장기 감소로서, ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18 또는 24개월 동안 유지되는 적혈모구의 백분율의 감소인, 장기 감소; 및/또는
    (b) 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 전의 기간에 대상체에서의 헤모글로빈 수준인 대상체의 초기 헤모글로빈 수준 대비, 대상체의 헤모글로빈 수준의 장기 증가로서, ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 유지되는 헤모글로빈 수준의 증가인 장기 증가
    를 달성하고, 상기 백분율은 적혈구 수에 기초한 대상체에서의 고리 철적혈모구인 적혈모구의 수를 나타내는 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    1, 2, 3, 4 또는 5개월의 단기간 동안 ActRII 신호전달 억제제를 투여하기 위해 사용되는 약학 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    일정 기간, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 이후에 대상체에서의 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제2 백분율을 결정하기 위해 사용되고, 상기 백분율은 적혈구 수에 기초한 대상체에서의 고리 철적혈모구인 적혈모구의 수를 나타내는 것인,
    약학 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    대상체에서의 헤모글로빈 수준이 적어도 11 g/dL인 경우, 대상체에 대한 ActRII 신호전달 억제제의 투여를 중단하기 위해 사용되는 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    약학적 유효량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여한 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월 이내에 대상체에서의 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율을 결정하기 위해 사용되고, 상기 백분율은 적혈구 수에 기초한 대상체에서의 고리 철적혈모구인 적혈모구의 수를 나타내는 것인, 약학 조성물.
  7. 제2항에 있어서,
    대상체에서의 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율의 장기 감소는 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후 적어도 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 대상체에서의 고리 철적혈모구인 적혈모구의 초기 백분율의 적어도 1.5, 2.5, 5.0, 7.5 또는 10.0배 낮고, 상기 백분율은 적혈구 수에 기초한 대상체에서의 고리 철적혈모구인 적혈모구의 수를 나타내는 것인, 약학 조성물.
  8. 제2항에 있어서,
    대상체에서 헤모글로빈 수준의 장기 증가는 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 또는 24개월 동안 대상체에서 약 11 g/dL 내지 18 g/dL 사이의 헤모글로빈 수준인 약학 조성물.
  9. 제3항에 있어서,
    (a) 단기간 동안 ActRII 신호전달 억제제가 투여된, 대상체에서의 고리 철적혈모구인 적혈모구의 제1 백분율은 단기간의 ActRII 신호전달 억제제 투여 이후 적어도 6, 12, 18 또는 24개월 동안 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만 또는 1% 미만으로 감소되고/되거나;
    (b) 단기간 동안 ActRII 신호전달 억제제가 투여된 대상체에서의 헤모글로빈 수준은 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18 또는 24개월에 약 11 g/dL 내지 18 g/dL이고;
    상기 백분율은 적혈구 수에 기초한 대상체에서의 고리 철적혈모구인 적혈모구의 수를 나타내는 것인,
    약학 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    고리 철적혈모구인 적혈모구를 15% 이하로 갖는 대상체 대비, 대상체에서의 적혈모구의 적어도 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%가 고리 철적혈모구인 경우, 대상체가 하나 이상의 혈액학적 파라미터의 정상화를 달성할 수 있고, 상기 대상체에서 하나 이상의 혈액학적 파라미터의 정상화는 초기 용량의 ActRII 신호전달 억제제를 대상체에게 투여하기 일정 기간 이전의 대상체에서 하나 이상의 혈액학적 파라미터에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%까지의 대상체에서의 하나 이상의 혈액학적 파라미터의 개선인 것인, 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    혈액학적 파라미터는 헤모글로빈 수준, 헤마토크리트, 적혈구 수, 또는 대상체에서의 고리 철적혈모구인 적혈모구의 백분율이고, 상기 백분율은 적혈구 수에 기초한 대상체에서의 고리 철적혈모구인 적혈모구의 수를 나타내는, 약학 조성물.
  12. 제2항에 있어서,
    대상체는 ActRII 신호전달 억제제 투여 기간 이후에 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18 또는 24개월 동안 적혈구 수혈이 필요하지 않은 약학 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    ActRII 신호전달 억제제를 (a) (i) 3주 마다 1회 (ii) 28일 마다 1회; 또는 (iii) 42일 마다 1회; (b) 주사, 및/또는 (c) 피하 주사를 통해 투여하기 위해 사용되는 약학 조성물.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    ActRII 신호전달 억제제는 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 약학 조성물.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    대상체는 사람인 약학 조성물.
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