CN108348578B - 用于治疗骨髓增生性病症的方法 - Google Patents

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Abstract

部分地，本公开内容涉及用于治疗、预防骨髓增生性病症(例如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和骨髓纤维化症)或骨髓增生性病症的一种或多种并发症或降低其严重性的方法。本公开内容还涉及用于治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其严重性的方法。在某些方面，本公开内容提供了TβRII拮抗剂，用于治疗、预防骨髓增生性病症(例如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和骨髓纤维化症)或Janus激酶相关病症或骨髓增生性病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症，或降低其严重性。

Description

用于治疗骨髓增生性病症的方法
相关申请
本申请要求2015年8月4日提交的美国临时申请号62/201,058和2015年12月4日提交的美国临时申请号62/263,603的优先权。每个前述申请的说明书通过引用以其整体并入本文。
发明背景
骨髓增生性病症(MPD)或肿瘤(MPN)是一组通常以一些或全部血细胞(血小板、白细胞和红细胞)长期增加为特征的病况[Talarico等. (1998) Patient Care 30:37–57;Yavorkovsky等. (2001) J Clin Oncol 19:3790–3792和Campbell等(2006) N Engl J Med 355:2452–2-466]。该组血液病症包括真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、骨髓纤维化症(例如原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)以及慢性髓细胞样白血病(CML)。PV的特征在于所有3种类型血细胞的生产增加，而ET表现为血小板升高。骨髓纤维化症(MF)是由于红细胞、白细胞和/或血小板的异常生成而在骨髓中形成纤维(瘢痕样)组织的疾病。CML的特征在于骨髓中主要是髓样细胞的增加和不受调节的生长以及这些细胞在外周血中的积聚。
通常认为MPD是由造血干细胞的转化引起的。事实上，CML现在由其致病分子病变BCR-ABL融合基因定义，其最常见由费城染色体易位(Ph)导致。因此，CML被表征为BCR-ABL阳性(+)骨髓增生性病症。这种确定的分子缺陷的发现导致治疗CML的药物伊马替尼甲磺酸盐(Gleevec; Novartis, Basel, Switzerland)的开发[Druker等. (2001) N Engl J Med344:1031–1037]。
其它三种骨髓增生性肿瘤(PV、ET和MF)表征为BCR-ABL阴性骨髓增生性病症。最近，有几个研究小组将酪氨酸激酶JAK2的功能获得性突变(JAK2V617F)鉴定为约90％PV患者、约50％ET患者和约50-60％MF患者的主要分子缺陷[Baxter等. (2005) Lancet 365:1054-1061; James等 (2005) Nature 434:1144-1148; Kralovics (2005) N. Engl. J. Med. 352:1770-1790]。有趣的是，最近的研究已经证明，从医院患者收集的血样中有近1％测试为JAK2V617F突变阳性[Xu等. (2007) Blood 109:339–342]。这些JAKV617F阳性患者大多数不符合诊断MPD的标准，但以高于JAKV617F阴性患者的比率发展血管疾病，包括血栓形成、冠心病、动脉硬化、脑缺血和脑梗塞。这些数据表明MPD和前MPD病况可能代表比最初预期更深刻的公共健康问题，并进一步强调了JAK2V617F以及其它Janus激酶突变的病理重要性。
同种异体造血干细胞移植是BCR-ABL阴性MPD的唯一已知疗法[Gupta等. (2012)Blood 120:1367-1379]。然而，干细胞治疗相关的死亡率很高，只有少数患者有资格接受移植。尽管JAK抑制剂的开发和使用代表了显著的治疗进展，但是它们在治疗BCR-ABL阴性MPD中的应用存在明显的限制。特别是，JAK抑制剂似乎可用于减少骨髓纤维化症患者中的脾肿大；然而，它们对疾病的影响在很大程度上却是姑息性的[Gupta等. (2012) Blood 120:1367-1379]。特别地，JAK抑制剂对疾病的许多表现(并发症)有很少至没有影响，所述表现包括例如血细胞减少症、输血依赖性、加速或急变期(blast phase)疾病和纤维化。此外，JAK抑制剂已显示在一些患者中促进或恶化血小板减少症、贫血症和嗜中性白细胞减少症。
因此，对于治疗MPD和Janus激酶相关病症的有效疗法存在高度未满足的需求。因此，本公开内容的目的是提供治疗、预防MPD或Janus激酶相关病症或MPD或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症，或降低其进展速率和/或严重性的方法。
发明内容
部分地，本公开内容涉及以下发现：TGFβ II型受体(TβRII)拮抗剂(抑制剂)可用于治疗骨髓纤维化症，特别是改善疾病的各种并发症，所述并发症包括例如纤维化、脾肿大和炎性并发症。具体而言，本文提供的数据显示TβRII多肽减少骨髓纤维化症的JAK2V617F模型中的纤维化、脾肿大和炎症。这些数据表明TβRII拮抗剂可用于治疗骨髓纤维化症(例如，原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症、以及原发性血小板减少症后的骨髓纤维化症)以及其它骨髓增生性病症，包括例如真性红细胞增多症和原发性血小板减少症。此外，来自JAK2V617F模型的数据表明可以使用TβRII拮抗剂治疗Janus激酶相关病症，特别是与升高的或组成型Janus激酶活性(例如升高的或组成型JAK2活性)相关的病症。因此，在某些方面，本公开涉及通过向有需要的患者施用有效量的一种或多种TβRII拮抗剂，任选地与用于治疗骨髓增生性病症或Janus激酶相关病症的一种或多种其它支持疗法或活性剂组合，用于治疗、预防骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)或Janus激酶相关病症或骨髓增生性病症的一种或多种并发症(例如纤维化、脾肿大和炎症)或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症，或降低其进展速率和/或严重性的组合物和方法。尽管TβRII多肽可以通过除TβRII拮抗作用以外的机制影响骨髓增生性病症和Janus激酶相关病症[例如，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一种或多种的抑制可能是药剂抑制一系列其它试剂，包括可能TGF-β超家族的其它成员的活性的趋势的指示剂，以及这种集体抑制可能导致对例如骨髓增生性病症和Janus激酶相关病症的所需效应]，但本公开内容仍然证明可以基于TβRII拮抗作用选择所需治疗剂。因此，虽然不希望受限于特定的作用机制，但预计其它TβRII拮抗剂[例如TβRII受体的拮抗剂，一种或多种TβRII-结合配体(例如TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)的拮抗剂，一种或多种TβRII相关I型受体(例如ALK5)的拮抗剂，一种或多种TβRII相关共同受体(β聚糖)的拮抗剂，一种或多种TβRII下游信号传导组分(例如Smads)的拮抗剂或这些拮抗剂组合]可用于治疗骨髓增生性病症或Janus激酶相关病症，特别是用于治疗、预防一种或多种骨髓增生性病症或Janus激酶相关病症并发症或降低其进展速率和/或严重性。这些药剂在本文中统称为“TβRII拮抗剂”或“TβRII抑制剂”。
因此，在某些方面，本公开内容涉及用于治疗Janus激酶相关病症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于预防Janus激酶相关病症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低Janus激酶相关病症的进展速率的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低Janus激酶相关病症的严重性的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于治疗Janus激酶相关病症的一种或多种并发症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于预防Janus激酶相关病症的一种或多种并发症的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低Janus激酶相关病症的一种或多种并发症的进展速率的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低Janus激酶相关病症的一种或多种并发症的严重性的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防以下的Janus激酶相关性病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法：无效造血、髓外造血(例如脾髓外造血、肝髓外造血、肺髓外造血和淋巴髓外造血)、炎性并发症、全血细胞减少症、纤维化(例如骨髓纤维化、脾纤维化和肝纤维化)、脾肿大、肝肿大、血小板减少症、贫血症、异型红细胞症、进行性肝脾肿大、疲劳、体重减轻、盗汗、发热、瘙痒症、骨痛、早饱、腹痛或不适、关节痛、肌痛、感觉异常、恶病质、脾梗塞、出血、炎症、嗜中性白细胞减少症、细胞因子水平升高、凝血障碍、IL-6介导的炎症或炎性并发症、骨硬化症和骨髓纤维化症。在一些实施方案中，Janus激酶相关病症与一种或多种功能获得性Janus激酶突变相关。在一些实施方案中，Janus激酶相关病症与选自JAK1、JAK2和JAK3的一种或多种Janus激酶中的一种或多种功能获得性Janus激酶突变相关。在一些实施方案中，Janus激酶相关病症与JAK2中的一种或多种功能获得性Janus激酶突变相关。在一些实施方案中，Janus激酶相关病症与一种或多种Janus激酶的升高的激酶活性(例如与例如相同年龄和性别的健康受试者相比升高的激酶活性)相关。在一些实施方案中，Janus激酶相关病症与一种或多种Janus激酶的组成型激酶活性相关。在一些实施方案中，Janus激酶相关病症与选自JAK1、JAK2或JAK3的一种或多种Janus激酶的升高的或组成型激酶活性相关。在一些实施方案中，Janus激酶相关病症与JAK2的升高的或组成型激酶活性相关。在一些实施方案中，Janus激酶相关病症是JAK2相关病症。在一些实施方案中，Janus激酶相关病症是JAK2V617F相关病症。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者具有骨髓纤维化症。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有原发性骨髓纤维化症。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于在具有骨髓纤维化症的患者中治疗、预防Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，所述并发症选自：无效造血、髓外造血(例如脾髓外造血、肝髓外造血、肺髓外造血和淋巴髓外造血)、炎性并发症、全血细胞减少症、纤维化(例如骨髓纤维化、脾纤维化和肝纤维化)、脾肿大、肝肿大、血小板减少症、贫血症、异型红细胞症、进行性肝脾肿大、疲劳、体重减轻、盗汗、发热、瘙痒症、骨痛、早饱、腹痛或不适、关节痛、肌痛、感觉异常、恶病质、脾梗塞、出血、炎症、嗜中性白细胞减少症、细胞因子水平升高、凝血障碍、IL-6介导的炎症或炎性并发症、骨硬化症、骨髓纤维化症和出血。在一些实施方案中，根据国际预后评分系统(IPSS)，具有Janus激酶相关病症的患者具有低风险的骨髓纤维化症。在一些实施方案中，根据IPSS，具有Janus激酶相关病症的患者具有中等-1风险的骨髓纤维化症。在一些实施方案中，根据IPSS，具有Janus激酶相关病症的患者具有中等-2风险的骨髓纤维化症。在一些实施方案中，根据IPSS，具有Janus激酶相关病症的患者具有高风险的骨髓纤维化症。在一些实施方案中，根据动态IPSS(DIPSS)，具有Janus激酶相关病症的患者具有低风险的骨髓纤维化症。在一些实施方案中，根据DIPSS，具有Janus激酶相关病症的患者具有中等-1风险的骨髓纤维化症。在一些实施方案中，根据DIPSS，具有Janus激酶相关病症的患者具有中等-2风险的骨髓纤维化症。在一些实施方案中，根据DIPSS，具有Janus激酶相关病症的患者具有高风险的骨髓纤维化症。在一些实施方案中，根据DIPSS-plus，具有Janus激酶相关病症的患者具有低风险的骨髓纤维化症。在一些实施方案中，根据DIPSS-plus，具有Janus激酶相关病症的患者具有中等-1风险的骨髓纤维化症。在一些实施方案中，根据DIPSS-plus，具有Janus激酶相关病症的患者具有中等-2风险的骨髓纤维化症。在一些实施方案中，根据DIPSS-plus，具有Janus激酶相关病症的患者具有高风险的骨髓纤维化症。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中所述患者具有真性红细胞增多症。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于在具有真性红细胞增多症的患者中治疗、预防Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，所述并发症选自：疲劳、瘙痒症、盗汗、骨痛、发热、和体重减轻、脾肿大、肝肿大、腹痛、早饱、恶心、腹部器官受压、门静脉高血压、血管事件、血栓栓塞事件、大出血、血栓形成、大血管并发症、头痛、头晕、视力障碍、远端感觉异常、手足发绀、红斑性肢痛、类红细胞过度增殖、髓样细胞过度增殖、巨核细胞过度增殖、高红细胞水平、高白细胞水平、高血小板水平、炎性细胞因子升高、炎性并发症和IL-6介导的炎性并发症。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有低风险的真性红细胞增多症。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有低风险的真性红细胞增多症并且没有血栓形成史。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有低风险的真性红细胞增多症并且具有或先前具有血栓形成史。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有高风险的真性红细胞增多症。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有高风险的真性红细胞增多症并且没有血栓形成史。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有高风险的真性红细胞增多症并且具有或先前具有血栓形成史。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有高风险的真性红细胞增多症并且对羟基脲治疗难治。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有高风险的真性红细胞增多症并且不耐受用羟基脲治疗。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者具有原发性血小板增多症。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于在具有原发性血小板增多症的患者中治疗、预防Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，所述并发症选自：血小板增多症、低白细胞计数、低血红蛋白水平、低乳酸脱氢酶(LDH)水平、疲劳、盗汗、恶心、麻木、视力障碍、体重减轻、微血管并发症、头痛、胸痛、头晕、红斑性肢痛、脾肿大、肝肿大、炎性并发症、IL-6炎性并发症、炎性细胞因子水平升高、IL-6水平升高和大出血。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有低风险的原发性血小板增多症。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有低风险的原发性血小板增多症并且没有血栓形成史。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有低风险的原发性血小板增多症并且具有或先前具有血栓形成史。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有高风险的原发性血小板增多症。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有高风险的原发性血小板增多症并且没有血栓形成史。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有高风险的原发性血小板增多症并且具有或先前具有血栓形成史。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有高风险的原发性血小板增多症并且对羟基脲治疗难治。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者具有高风险的原发性血小板增多症并且不耐受用羟基脲治疗。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者具有纤维化。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于在Janus激酶相关病症患者中治疗、预防纤维化或降低其进展速率和/或严重性的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于在Janus激酶相关病症患者中治疗、预防纤维化或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中所述纤维化在选自以下的一种或多种器官/组织中：脾、肝、肺、淋巴结和骨髓。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于在Janus激酶相关病症患者中治疗、预防脾纤维化或降低其进展速率和/或严重性的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于在Janus激酶相关病症患者中治疗、预防骨髓纤维化或降低其进展速率和/或严重性的方法。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者根据Bauermeister评分系统具有等级0骨髓纤维化。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者根据Bauermeister评分系统具有等级1骨髓纤维化。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者根据Bauermeister评分系统具有等级2骨髓纤维化。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者根据Bauermeister评分系统具有等级3骨髓纤维化。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者根据Bauermeister评分系统具有等级4骨髓纤维化。在一些实施方案中，本公开内容的方法涉及在具有Janus激酶相关病症的患者中将骨髓纤维化减少根据Bauermeister评分系统的至少1个等级(例如从4至3、4至2、4至1、4至0、3至2、3至1、3至0、2至1、2至0或1至0骨髓纤维化的等级降低)。在一些实施方案中，本公开内容的方法涉及在具有Janus激酶相关病症的患者中预防或延缓根据Bauermeister评分系统的骨髓纤维化等级进展(例如，预防或延缓骨髓纤维化从0至1、0至2、0至3、0至4、1至2、1至3、1至4、2至3、2至4或3至4的等级进展)。在一些实施方案中，根据欧洲共识评分系统，具有Janus激酶相关病症的患者具有等级1骨髓纤维化。在一些实施方案中，根据欧洲共识评分系统，具有Janus激酶相关病症的患者具有等级2骨髓纤维化。在一些实施方案中，根据欧洲共识评分系统，具有Janus激酶相关病症的患者具有等级3骨髓纤维化。在一些实施方案中，本公开内容的方法涉及在具有Janus激酶相关病症的患者中将骨髓纤维化减少根据欧洲共识评分系统的至少1个等级(例如从3至2、3至1、3至0、2至1、2至0或1至0骨髓纤维化的等级降低)。在一些实施方案中，本公开内容的方法涉及在具有Janus激酶相关病症的患者中预防或延缓根据欧洲共识评分系统的骨髓纤维化等级进展(例如，预防或延迟骨髓纤维化从0至1、0至2、0至3、1至2、1至3、2至3的等级进展)。在一些实施方案中，本公开内容涉及在Janus激酶相关病症患者中预防纤维化或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中TβRII拮抗剂在纤维化发作前施用。在一些实施方案中，本公开内容涉及在Janus激酶相关病症患者中治疗纤维化或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中TβRII拮抗剂在纤维化发作后施用。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者具有器官/组织增大(例如，与例如相同年龄和性别的健康受试者相比，增加的器官/组织尺寸和/或重量)。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防Janus激酶相关病症患者中器官/组织增大或降低其进展速率和/或严重性的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防Janus激酶相关病症患者的器官/组织增大或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中一种或多种器官/组织选自脾、肝、肺和淋巴结。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防Janus激酶相关病症患者的脾增大或降低其进展速率和/或严重性的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防Janus激酶相关病症患者的肝增大或降低其进展速率和/或严重性的方法。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者具有器官/组织炎症(例如，与例如相同年龄和性别的健康受试者相比，器官/组织炎症增加)。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防Janus激酶相关病症患者的器官/组织炎症或降低其进展速率和/或严重性的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症患者的器官/组织炎症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中一种或多种器官/组织选自：脾、肝、肺和淋巴结。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防Janus激酶相关病症患者的脾炎症或降低其进展速率和/或严重性的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防Janus激酶相关病症患者的肝炎症或降低其进展速率和/或严重性的方法。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者具有脾肿大。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防Janus激酶相关病症患者的脾肿大或降低其进展速率和/或严重性的方法。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者具有肝肿大。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防Janus激酶相关病症患者的肝肿大或降低其进展速率和/或严重性的方法。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者具有髓外造血。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防Janus激酶相关病症患者的髓外造血或降低其进展速率和/或严重性的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于在Janus激酶相关病症患者中治疗、预防髓外造血或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中一种或多种器官/组织选自：脾、肝、淋巴结和肺。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者具有升高的炎性细胞因子水平(例如与例如相同年龄和性别的健康受试者相比升高的炎性细胞因子水平)。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于降低Janus激酶相关病症患者的一种或多种器官/组织中的炎性细胞因子水平(例如，血清细胞因子水平)的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及降低Janus激酶相关病症患者的一种或多种器官/组织中IL-6水平的方法。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中所述患者具有低红细胞水平(例如，与例如相同年龄和性别的健康受试者相比，低红细胞水平)。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于增加Janus激酶相关病症患者的红细胞水平的方法。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者的血红蛋白水平低(例如，与例如相同年龄和性别的健康受试者相比，血红蛋白水平低)。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于增加Janus激酶相关病症患者中的血红蛋白水平的方法。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者具有贫血症。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防Janus激酶相关病症患者的贫血症或降低其进展速率和/或严重性的方法。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中在TβRII拮抗剂治疗开始之前已经给患者施用一次或多次血细胞输血。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者是血细胞输血依赖性的。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于降低具有Janus激酶相关病症的患者的血细胞输血负荷的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于降低具有Janus激酶相关病症的患者的血细胞输血负荷的方法，其中相对于TβRII拮抗剂治疗开始之前的相等时间，所述方法使血细胞输血减少大于约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，持续4至8周。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于降低具有Janus激酶相关病症的患者的血细胞输血负荷的方法，其中相对于TβRII拮抗剂治疗开始之前的相等时间，所述方法使血细胞输血减少大于约50％，持续4至8周。在某些方面，具有Janus激酶相关病症的患者具有铁过载。在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症患者的铁过载或降低其进展速率和/或严重性的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症患者的脾(脾的)铁过载或降低其进展速率和/或严重性的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防Janus激酶相关病症中的肝(肝的)铁过载或降低其进展速率和/或严重性的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症中的心脏(心脏的)铁过载或降低其进展速率和/或严重性的方法。在某些方面，本公开内容涉及减少Janus激酶相关病症患者的等位基因负荷的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及减少Janus激酶相关病症患者中一种或多种Janus激酶等位基因的等位基因负荷的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于减少Janus激酶相关病症患者中选自JAK1、JAK2和JAK3的一种或多种Janus激酶等位基因的等位基因负荷的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于减少Janus激酶相关病症患者中一个或多个JAK2等位基因的等位基因负荷的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于减少Janus激酶相关病症患者中与一个或多个突变相关的一种或多种Janus激酶等位基因的等位基因负荷的方法，所述一个或多个突变导致一种或多种Janus激酶的升高的(例如，与例如相同年龄和性别的健康受试者相比升高的Janus激酶活性)或组成型激活。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于减少Janus激酶相关病症患者中JAK2V617F的等位基因负荷的方法。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者已经用Janus激酶抑制剂治疗。在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者不耐受用Janus激酶抑制剂(例如鲁索替尼)治疗。在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者对Janus激酶抑制剂(例如鲁索替尼)治疗难治。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者已经用抑制至少JAK2的Janus激酶抑制剂治疗。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者已经用Janus激酶抑制剂治疗，所述Janus激酶抑制剂选自：鲁索替尼、fedratinib (SAR302503)、monoelotinib (CYT387)、pacritinib、来他替尼、AZD-1480、BMS-911543、NS-018、LY2784544、SEP-701、XL019和AT-9283。在一些实施方案中，具有Janus激酶相关病症的患者已经用鲁索替尼治疗。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者已经用羟基脲治疗。在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中所述患者不耐受用羟基脲治疗。在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗、预防Janus激酶相关病症或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中所述患者对用羟基脲治疗难治。
因此，在某些方面，本公开内容涉及用于治疗骨髓增生性病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于预防骨髓增生性病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低骨髓增生性病症的进展速率的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低骨髓增生性病症的严重性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于治疗骨髓增生性病症的一种或多种并发症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于预防骨髓增生性病症的一种或多种并发症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低骨髓增生性病症的一种或多种并发症的进展速率的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低骨髓增生性病症的一种或多种并发症的严重性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于治疗骨髓纤维化症(例如，原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症或原发性血小板减少症后的骨髓纤维化症)的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于预防骨髓纤维化症(例如，原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症或原发性血小板减少症后的骨髓纤维化症)的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低骨髓纤维化症(例如，原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症或原发性血小板减少症后的骨髓纤维化症)的进展速率的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低骨髓纤维化症(例如，原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症或原发性血小板减少症后的骨髓纤维化症)的严重性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于治疗骨髓纤维化症(例如，原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症或原发性血小板减少症后的骨髓纤维化症)的一种或多种并发症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于预防骨髓纤维化症(例如，原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症或原发性血小板减少症后的骨髓纤维化症)的一种或多种并发症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低骨髓纤维化症(例如，原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症或原发性血小板减少症后的骨髓纤维化症)的一种或多种并发症的进展速率的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低骨髓纤维化症(例如，原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症或原发性血小板减少症后的骨髓纤维化症)的一种或多种并发症的严重性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于治疗真性红细胞增多症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于预防真性红细胞增多症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低真性红细胞增多症的进展速率的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低真性红细胞增多症的严重性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于治疗真性红细胞增多症的一种或多种并发症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于预防真性红细胞增多症的一种或多种并发症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低真性红细胞增多症的一种或多种并发症的进展速率的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低真性红细胞增多症的一种或多种并发症的严重性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于治疗原发性血小板增多症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及预防原发性血小板增多症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低原发性血小板增多症的进展速率的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低原发性血小板增多症的严重性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于治疗原发性血小板增多症的一种或多种并发症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于预防原发性血小板增多症的一种或多种并发症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低原发性血小板增多症的一种或多种并发症的进展速率的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及用于降低原发性血小板增多症的一种或多种并发症的严重性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防骨髓纤维化症或骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中根据国际预后评分系统(IPSS)患者具有低风险的骨髓纤维化症。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防骨髓纤维化症或骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法骨髓纤维化症的并发症，其中根据IPSS患者具有中等-1风险的骨髓纤维化症。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防骨髓纤维化症或骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中根据IPSS患者具有中等-2风险的骨髓纤维化症。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防骨髓纤维化症或骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中根据IPSS患者具有高风险的骨髓纤维化症。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防骨髓纤维化症或骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中根据动态IPSS(DIPSS)患者具有低风险的骨髓纤维化症。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防骨髓纤维化症或骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中根据DIPSS所述患者具有中等-1风险的骨髓纤维化症。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防骨髓纤维化症或骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中根据DIPSS患者具有中等-2风险的骨髓纤维化症。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防骨髓纤维化症或骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中根据DIPSS患者具有高风险的骨髓纤维化症。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防骨髓纤维化症或骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中根据DIPSS-plus患者具有低风险的骨髓纤维化症。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防骨髓纤维化症或骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中根据DIPSS-plus患者具有中等-1风险的骨髓纤维化症。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防骨髓纤维化症或骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中根据DIPSS-plus患者具有中等-2风险的骨髓纤维化症。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防骨髓纤维化症或骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中根据DIPSS-plus患者具有高风险的骨髓纤维化症。在某些方面，根据用于骨髓纤维化症(例如，IPSS、DIPPS和DIPSS-plus)的任何公认的风险分层模型，TβRII拮抗剂可用于预防或延缓骨髓纤维化症的风险进展。例如，在一些实施方案中，根据IPSS、DIPPS或DIPSS-plus，TβRII拮抗剂可用于预防或延缓骨髓纤维化症从低风险至中等-1风险的风险进展。在其它实施方案中，根据IPSS、DIPPS或DIPSS-plus，TβRII拮抗剂可用于预防或延缓骨髓纤维化症从中级-1风险进展至中级-2风险的风险进展。在其它实施方案中，根据IPSS、DIPPS或DIPSS-plus，TβRII拮抗剂可以用于预防或延缓骨髓纤维化症从中级-2风险至高风险的风险进展。在某些方面，根据用于骨髓纤维化症(例如，IPSS、DIPPS和DIPSS-plus)的任何公认的风险分层模型，TβRII拮抗剂可用于促进或增加骨髓纤维化症风险消退。例如，在一些实施方案中，根据IPSS、DIPPS或DIPSS-plus，TβRII拮抗剂可用于促进或增加骨髓纤维化症从高风险至中等-2风险的风险消退。在其它实施方案中，根据IPSS、DIPPS或DIPSS-plus，TβRII拮抗剂可用于促进或增加骨髓纤维化症从中等-2风险至中等-1风险的风险消退。在其它实施方案中，根据IPSS、DIPPS或DIPSS-plus，TβRII拮抗剂可用于促进或增加骨髓纤维化症从中等-1风险至低风险的风险消退。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防真性红细胞增多症或真性红细胞增多症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者具有低风险的真性红细胞增多症。在一些实施方案中，患者具有低风险的真性红细胞增多症并且没有血栓形成史。在一些实施方案中，患者具有低风险的真性红细胞增多症并且具有或先前具有血栓形成。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防真性红细胞增多症或真性红细胞增多症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者具有高风险的真性红细胞增多症。在一些实施方案中，患者具有高风险的真性红细胞增多症并且没有血栓形成史。在一些实施方案中，患者具有高风险的真性红细胞增多症并且具有或先前具有血栓形成。在一些实施方案中，患者具有高风险的真性红细胞增多症并且对用羟基脲治疗难治或不耐受。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防原发性血小板减少症或原发性血小板减少症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者具有低风险的原发性血小板减少症。在一些实施方案中，患者具有低风险的原发性血小板减少症并且没有血栓形成史。在一些实施方案中，患者具有低风险的原发性血小板减少症并且具有或先前具有血栓形成。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防原发性血小板减少症或原发性血小板减少症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者具有高风险的原发性血小板减少症。在一些实施方案中，患者具有高风险的原发性血小板减少症并且没有血栓形成史。在一些实施方案中，患者具有高风险的原发性血小板减少症并且具有或先前具有血栓形成。在一些实施方案中，患者具有高风险的原发性血小板减少症并且对用羟基脲治疗难治或不耐受。在某些方面，本公开内容涉及使用TβRII拮抗剂治疗、预防骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板增多症)或骨髓增生性病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者包含一个或多个基因突变或与骨髓增生性病症相关的其它分子标志物。例如，在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防骨髓增生性病症或骨髓增生性病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性，其中所述骨髓增生性病症与选自IDH1、IDH2、EZH2、SRSF2、ASXL1、JAK1、JAK2、JAK3、TYK2、MPL、CALR、TET2、THPO和LNK的一个或多个基因中的一个或多个突变相关。在一些实施方案中，骨髓增生性病症与Janus激酶(JAK)(例如JAK1、JAK2和/或JAK3)中的一个或多个基因突变相关。在一些实施方案中，骨髓增生性病症与一个或多个JAK2突变相关。在一些实施方案中，骨髓增生性病症与一个或多个功能获得性Janus激酶突变相关。在一些实施方案中，骨髓增生性病症与一种或多种选自JAK1、JAK2和JAK3的Janus激酶中的一个或多个功能获得性Janus激酶突变相关。在一些实施方案中，骨髓增生性病症与JAK2中的一个或多个功能获得性Janus激酶突变相关。在一些实施方案中，骨髓增生性病症与一种或多种Janus激酶的升高的激酶活性(例如，与例如相同年龄和性别的健康受试者相比升高的激酶活性)相关。在一些实施方案中，骨髓增生性病症与一种或多种Janus激酶的组成型激酶活性相关。在一些实施方案中，骨髓增生性病症与选自JAK1、JAK2或JAK3的一种或多种Janus激酶的升高的或组成型激酶活性相关。在一些实施方案中，骨髓增生性病症与JAK2的升高的或组成型激酶活性相关。在一些实施方案中，骨髓增生性病症是JAK2相关病症。在一些实施方案中，骨髓增生性病症与选自以下的一种或多种遗传标志物有关：对于JAK2 46/1单倍型的缺合子性、JAK2V617F、CALR+ASXL1-、CALR-ASKL1+、CALR+ASKL1+和CALR-ASKL1-。在一些实施方案中，骨髓增生性病症与JAK2V617F突变相关。在一些实施方案中，所述方法降低患者中骨髓增生性病症相关等位基因负荷。在一些实施方案中，所述方法降低一个或多个JAK2突变的等位基因负荷。在一些实施方案中，该方法降低JAK2V617F的等位基因负荷。在一些实施方案中，所述方法降低选自IDH1、IDH2、EZH2、SRSF2、ASXL1、JAK1、JAK3、TYK2、MPL、CALR、TET2、THPO和LNK的一个或多个基因中的一个或多个突变的等位基因负荷。在一些实施方案中，所述方法降低选自选自以下的一种或多种遗传标志物的等位基因负荷：对于JAK2 46/1单倍型的缺合子性、CALR+ASXL1-、CALR-ASKL1+、CALR+ASKL1+和CALR-ASKL1-。在某些方面，本公开内容涉及使用TβRII拮抗剂治疗、预防骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板增多症)或骨髓增生性病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中骨髓纤维化症与一种或多种升高的血清标志物相关，所述升高的血清标志物选自：升高的血清IL-8水平，升高的血清IL-2R水平和升高的无血清轻链水平。在某些方面，本公开内容涉及使用TβRII拮抗剂治疗、预防骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板增多症)或骨髓增生性病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者已经用Janus激酶抑制剂治疗。在一些实施方案中，患者已经用JAK2抑制剂治疗。在一些实施方案中，患者已经用选自以下的Janus激酶抑制剂治疗：鲁鲁索替尼、fedratinib (SAR302503)、monoelotinib (CYT387)、pacritinib、来他替尼、AZD-1480、BMS-911543、NS-018、LY2784544、SEP-701、XL019和AT-9283。在一些实施方案中，患者已经用鲁索替尼治疗。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防骨髓增生性病症或骨髓增生性病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性，其中患者不耐受Janus激酶抑制剂。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防骨髓增生性病症或骨髓增生性病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性，其中患者对Janus激酶抑制剂的反应不足。在某些方面，本公开内容涉及使用TβRII拮抗剂治疗、预防骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板增多症)或骨髓增生性病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者已经用羟基脲治疗。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防骨髓增生性病症或骨髓增生性病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性，其中患者不耐受羟基脲。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防骨髓增生性病症或骨髓增生性病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性，其中患者对羟基脲的反应不足。
如本文所述的骨髓增生性病症是造血系统的克隆性肿瘤疾病，其与在患者疾病进展过程中可能出现的各种临床并发症有关。本公开内容的实施例证明可以使用TβRII拮抗剂来减轻众多的这些临床并发症，表明相对于许多目前的骨髓增生性病症疗法(其仅治疗一种或有限数量的疾病并发症)，TβRII拮抗剂可以用于更广泛地治疗骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的各种并发症。因此，在某些方面，TβRII拮抗剂可用于在具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者中治疗、预防一种或多种体质症状(例如，疲劳、体重减轻、盗汗、发热、瘙痒症、早饱、腹痛或不适、关节痛、肌痛、感觉异常、恶心、腹部器官受压、头痛和恶病质)，或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于在具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者中治疗、预防骨痛或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者的视力障碍或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，本公开内容涉及治疗、预防骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症))或骨髓增生性病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者具有纤维化。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防骨髓增生性病症患者的纤维化或降低其进展速率和/或严重性的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防骨髓增生性病症患者的纤维化或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中纤维化在选自以下的一种或多种器官/组织中：脾、肝、肺、淋巴结和骨髓。在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗、预防骨髓增生性病症患者的脾纤维化或降低其进展速率和/或严重性的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及用于治疗、预防骨髓增生性病症患者的骨髓纤维化或降低其进展速率和/或严重性的方法。在一些实施方案中，根据Bauermeister评分系统，具有骨髓增生性病症的患者具有等级0骨髓纤维化。在一些实施方案中，根据Bauermeister评分系统，具有骨髓增生性病症的患者具有等级1骨髓纤维化。在一些实施方案中，根据Bauermeister评分系统，具有骨髓增生性病症的患者具有等级2骨髓纤维化。在一些实施方案中，根据Bauermeister评分系统，具有骨髓增生性病症的患者具有等级3骨髓纤维化。在一些实施方案中，根据Bauermeister评分系统，具有骨髓增生性病症的患者具有等级4骨髓纤维化。在一些实施方案中，本公开内容的方法涉及在具有骨髓增生性病症的患者中将骨髓纤维化减少根据Bauermeister评分系统的至少1个等级(例如从4至3、4至2、4至1、4至0、3至2、3至1、3至0、2至1、2至0或1至0骨髓纤维化的等级降低)。在一些实施方案中，本公开内容的方法涉及在具有骨髓增生性病症的患者中预防或延缓根据Bauermeister评分系统的骨髓纤维化等级进展(例如，预防或延缓骨髓纤维化从0至1、0至2、0至3、0至4、1至2、1至3、1至4、2至3、2至4或3至4的等级进展)。在一些实施方案中，根据欧洲共识评分系统，具有骨髓增生性病症的患者具有等级1骨髓纤维化。在一些实施方案中，根据欧洲共识评分系统，具有骨髓增生性病症的患者具有等级2骨髓纤维化。在一些实施方案中，根据欧洲共识评分系统，具有骨髓增生性病症的患者具有等级3骨髓纤维化。在一些实施方案中，本公开内容的方法涉及在具有骨髓增生性病症的患者中将骨髓纤维化减少根据欧洲共识评分系统的至少1个等级(例如从3至2、3至1、3至0、2至1、2至0或1至0骨髓纤维化的等级降低)。在一些实施方案中，本公开内容的方法涉及在具有骨髓增生性病症的患者中预防或延缓根据欧洲共识评分系统的骨髓纤维化等级进展(例如，预防或延迟骨髓纤维化从0至1、0至2、0至3、1至2、1至3、2至3的等级进展)。在一些实施方案中，本公开内容涉及预防骨髓增生性病症中的纤维化或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中TβRII拮抗剂在纤维化发作前施用。在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗骨髓增生性病症患者中的纤维化或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中TβRII拮抗剂在纤维化发作后施用。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于在具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者中治疗、预防器官/组织(例如脾、肝、淋巴结和肺)炎症(例如，与例如相同年龄和性别的健康受试者相比增加的器官/组织尺寸)和/或增大(例如，与例如相同年龄和性别的健康受试者相比增加的器官/组织大小和/或重量)或降低其进展速率和/或严重性。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于在具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者中治疗、预防脾肿大或降低其进展速率和/或严重性。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于在具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者中治疗、预防肝肿大或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于在具有骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者中治疗、预防脾梗塞或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于在具有骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者中治疗、预防一种或多种炎性并发症或降低其进展速率和/或严重性。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于降低具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者中的炎性细胞因子水平。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于降低具有骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者的IL6水平。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者中一种或多种IL6相关并发症或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者的髓外造血(例如，脾髓外造血、肝外髓血造血、肺外髓造血和淋巴髓外造血)或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者的血管并发症或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者中的血栓形成或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者的大出血或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者的无效红细胞生成或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者的无效红细胞生成或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者的全血细胞减少症或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者的全血细胞减少症或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者的血小板减少症或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者的贫血症或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者中的异型红细胞症或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者的嗜中性白细胞减少症或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者的骨硬化症或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者中骨髓纤维化症或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如真性红细胞增多症)的患者的一种或多种血细胞(例如，类红细胞、髓样细胞和巨核细胞)的过度增殖或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于降低具有骨髓增生性病症(例如真性红细胞增多症)的患者中的红细胞水平。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于降低具有骨髓增生性病症(例如真性红细胞增多症)的患者中的白细胞水平。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于降低具有骨髓增生性病症(例如真性红细胞增多症和原发性血小板增多症)的患者的血小板水平。在某些方面，本公开内容涉及通过施用有效量的TβRII拮抗剂来增加具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者的红细胞水平。在某些方面，公开内容涉及通过施用有效量的TβRII拮抗剂来增加具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者的血红蛋白水平。在某些方面，根据本文所述方法治疗的具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者具有贫血症。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者的贫血症或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，本公开内容涉及使用TβRII拮抗剂治疗、预防已经施用一次或多次血细胞输血(全血或红细胞输血)的患者中的骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)或骨髓增生性病症并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法。在一些实施方案中，本公开内容涉及使用TβRII拮抗剂治疗、预防血细胞输血依赖性患者中骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)或骨髓增生性病症并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于降低(减少)具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者的血细胞输血负荷。例如，TβRII拮抗剂可用于在具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者中相对于TβRII拮抗剂治疗开始之前的相等时间，使血细胞输血减少大于约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，持续4至8周。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于在具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者中相对于TβRII拮抗剂治疗开始之前的相等时间，使血细胞输血减少大于约50％，持续4至8周。在某些方面，TβRII拮抗剂可用于降低具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者的铁过载。例如，TβRII拮抗剂可用于降低具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者的器官和/或组织中的铁过载。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于降低具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者脾中的铁过载。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于降低具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者肝中的铁过载。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于降低具有骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症)的患者心脏中的铁过载。
部分地，本公开内容涉及治疗、预防JAK2激酶相关病症或降低其严重性或进展速率的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。在一些实施方案中，患者具有JAK2V617F突变相关病症。在某些方面，本公开内容涉及用于治疗、预防JAK2激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂。例如，在一些实施方案中，JAK2激酶相关病症的一种或多种并发症选自：无效造血、髓外造血(例如脾髓外造血、肝髓外造血、肺髓外造血和淋巴髓外造血)、炎性并发症、全血细胞减少症、纤维化(例如骨髓纤维化、脾纤维化和肝纤维化)、脾肿大、肝肿大、血小板减少症、贫血症、异型红细胞症、进行性肝脾肿大、疲劳、体重减轻、盗汗、发热、瘙痒症、骨痛、早饱、腹痛或不适、关节痛、肌痛、感觉异常、恶病质、脾梗塞、出血、炎症、中性白细胞减少症、细胞因子水平升高、凝血障碍、IL-6介导的炎症或炎性并发症、骨硬化症和骨髓纤维化症。在某些方面，本公开内容涉及使用TβRII拮抗剂来治疗、预防JAK2激酶相关病症或JAK2激酶相关病症(例如，JAK2功能获得性相关病症)的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性，其中患者进一步包含一个或多个额外的基因突变或与骨髓增生性病症相关的其它分子标志物。例如，在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防JAK2激酶相关病症或JAK2激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性，其中骨髓增生性病症疾病进一步与选自IDH1、IDH2、EZH2、SRSF2、ASXL1、TYK2、MPL、CALR、TET2、THPO和LNK的一个或多个基因中的一个或多个突变相关。在一些实施方案中，JAK2激酶相关病症进一步与选自以下的一种或多种遗传标志物相关：对于JAK246/1单倍型的缺合子性、JAK2V617F、CALR+ASXL1-、CALR-ASKL1+、CALR+ASKL1+和CALR-ASKL1-。在一些实施方案中，所述方法降低患者中JAK2相关病症等位基因负荷。在一些实施方案中，所述方法降低一个或多个JAK2突变的等位基因负荷。在一些实施方案中，所述方法降低JAK2V617F的等位基因负荷。在一些实施方案中，所述方法降低选自IDH1、IDH2、EZH2、SRSF2、ASXL1、JAK1、JAK3、TYK2、MPL、CALR、TET2、THPO和LNK的一个或多个基因中的一个或多个突变的等位基因负荷。在一些实施方案中，所述方法降低选自以下的一种或多种遗传标志物的等位基因负荷：对于JAK2 46/1单倍型的缺合子性、CALR+ASXL1-、CALR-ASKL1+、CALR+ASKL1+和CALR-ASKL1-。在某些方面，本公开内容涉及使用TβRII拮抗剂治疗、预防JAK2激酶相关病症或JAK2激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中JAK2激酶相关病症进一步与一种或多种升高的血清标志物相关，所述升高的血清标志物选自：升高的血清IL-8水平、升高的血清IL-2R水平和升高的无血清轻链水平。在某些方面，本公开内容涉及使用TβRII拮抗剂来治疗、预防JAK2激酶相关病症或JAK2激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者已经用Janus激酶抑制剂治疗。在一些实施方案中，患者已经用JAK2抑制剂治疗。在一些实施方案中，患者已经用选自以下的Janus激酶抑制剂治疗：鲁索替尼、fedratinib (SAR302503)、monoelotinib (CYT387)、pacritinib、来他替尼、AZD-1480、BMS-911543、NS-018、LY2784544、SEP-701、XL019和AT-9283。在一些实施方案中，患者已经用鲁索替尼治疗。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防JAK2激酶相关病症或JAK2激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性，其中患者不耐受Janus激酶抑制剂。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防JAK2激酶相关病症或JAK2激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性，其中患者对Janus激酶抑制剂的反应不足。在某些方面，本公开内容涉及使用JAK2激酶相关病症治疗、预防JAK2激酶相关病症或JAK2激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，其中患者已经用羟基脲治疗。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防JAK2激酶相关病症或JAK2激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性，其中患者不耐受羟基脲。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂可用于治疗、预防JAK2激酶相关病症或JAK2激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性，其中患者对羟基脲的反应不足
在本文描述的任何方法和用途中，除了施用一种或多种TβRII拮抗剂外，还可以向具有骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)的患者和/或具有Janus激酶相关病症(例如，JAK2激酶相关病症)的患者施用一种或多种另外的活性剂和/或支持疗法来治疗、预防骨髓增生性病症和/或Janus激酶相关病症或骨髓增生性病症和/或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症，或降低其进展速率和/或严重性。例如，在一些实施方案中，可以向患者进一步施用一种或多种支持疗法或活性剂，所述支持疗法或活性剂选自：输血(全血或红细胞输血)、红细胞生成刺激剂[例如ESA如促红细胞生成素(EPO)及其衍生物]、雄激素(例如庚酸睾酮和氟甲睾酮)、泼尼松、达那唑、沙利度胺、泼尼松、来那度胺、铁螯合剂、去铁胺、去铁酮、地拉罗司、羟基脲、克拉屈滨、鲁索替尼、SAR302503、CYT387、pacritinib、AZD-1480、BMS-911543、NS-018、LY2784544、来他替尼、SEP-701、AT-9283、Janus激酶抑制剂(例如JAK1、JAK2和JAK3的一种或多种的抑制剂)、脾切除术、放射疗法、阿司匹林、免疫调节药物、PI3K/mTOR抑制剂、表观遗传因子调节剂、pomalidonmide、雷帕霉素、西罗莫司、deforolimus、依维莫司、temsirolimus、NVP-BEZ235、BGT226、SF1126、PK1-587、INK128、AZD8055、AZD2014、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、givinostat、panobinostat、pracinostat、皮质类固醇，γ-干扰素、环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、青霉胺、环孢菌素、秋水仙碱、抗胸腺细胞球蛋白、霉酚酸酯、羟基氯喹、钙通道阻断剂、硝苯地平、血管紧张素转化酶抑制剂、对氨基苯甲酸、二甲亚砜、白细胞介素-5(IL-5)抑制剂、泛胱天蛋白酶抑制剂、凝集素、秋水仙碱、硫唑嘌呤、环磷酰胺、泼尼松、沙利度胺、己酮可可碱和茶碱。
在某些方面，本公开内容涉及用于治疗、预防骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)和/或Janus激酶相关病症(例如JAK2激酶相关病症)或骨髓增生性病症和/或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症的患者，或降低其进展速率和/或严重性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用：a)Janus激酶抑制剂；和b)TβRII拮抗剂，其中Janus激酶抑制剂和TβRII拮抗剂以有效量施用。在一些实施方案中，在用Janus激酶抑制剂治疗之前施用TβRII拮抗剂。在其它实施方案中，在用Janus激酶抑制剂治疗后施用TβRII拮抗剂。在其它实施方案中，TβRII拮抗剂与Janus激酶抑制剂同时施用。根据本文所述的方法使用的Janus激酶抑制剂可以是抑制选自JAK1、JAK2和JAK3的一种或多种Janus激酶的药剂。例如，Janus激酶抑制剂可以是在基于细胞的测定中抑制JAK1、JAK2和JAK3中的一种或多种的信号传导的药剂。在一些实施方案中，根据本文所述方法使用的Janus激酶抑制剂选自鲁索替尼、fedratinib (SAR302503)、monoelotinib (CYT387)、pacritinib、来他替尼、AZD-1480、BMS-911543、NS-018、LY2784544、SEP-701、XL019和AT-9283。在一些优选的实施方案中，根据本文所述方法使用的Janus激酶抑制剂是鲁索替尼。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制TGFβ1的药剂(例如TGFβ1拮抗剂)。例如，可以使用包括本文所述的基于细胞的测定(例如，Smad信号传导测定)来测定对TGFβ1抑制的作用。因此，在一些实施方案中，本公开内容的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少与TGFβ1结合。例如，可以使用包括本文所述的那些的结合亲和力测定来测定配体结合活性。在一些实施方案中，本公开内容的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合至少与TGFβ1以至少1 x 10-7 M (例如至少1 x 10-8 M、至少1 x 10-9M、至少1 x 10-10 M、至少1 x 10-11 M或至少1 x 10-12 M)的KD结合。如本文所述，可根据本文所述的方法和用途使用抑制TGFβ1的各种TβRII拮抗剂，包括例如配体诱捕物(ligandtrap)(例如TβRII多肽及其变体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制TGFβ1的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合可进一步抑制TGFβ2、TGFβ3、TβRII、ALK5和β聚糖中的一种或多种。在一些实施方案中，抑制TGFβ1的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合进一步抑制TGFβ3。在一些实施方案中，抑制TGFβ1的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合不抑制或基本上不抑制TGFβ2。在一些实施方案中，抑制TGFβ1的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合进一步抑制TGFβ3，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制TGFβ2的药剂(例如TGFβ2拮抗剂)。例如，可以使用包括本文所述的基于细胞的测定(例如，Smad信号传导测定)来测定对TGFβ2抑制的作用。因此，在一些实施方案中，本公开内容的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少与TGFβ2结合。例如，可以使用包括本文所述的那些的结合亲和力测定来测定配体结合活性。在一些实施方案中，本公开内容的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合至少与TGFβ2以至少1 x 10-7 M (例如至少1 x 10-8 M、至少1 x 10-9M、至少1 x 10-10 M、至少1 x 10-11 M或至少1 x 10-12 M)的KD结合。如本文所述，可根据本文所述的方法和用途使用抑制TGFβ2的各种TβRII拮抗剂，包括例如配体诱捕物(ligandtrap)(例如TβRII多肽及其变体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制TGFβ2的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合可进一步抑制TGFβ1、TGFβ3、TβRII、ALK5和β聚糖中的一种或多种。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制TGFβ3的药剂(例如TGFβ3拮抗剂)。例如，可以使用包括本文所述的基于细胞的测定(例如，Smad信号传导测定)来测定对TGFβ3抑制的作用。因此，在一些实施方案中，本公开内容的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少与TGFβ3结合。例如，可以使用包括本文所述的那些的结合亲和力测定来测定配体结合活性。在一些实施方案中，本公开内容的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合至少与TGFβ3以至少1 x 10-7 M (例如至少1 x 10-8 M、至少1 x 10-9M、至少1 x 10-10 M、至少1 x 10-11 M或至少1 x 10-12 M)的KD结合。如本文所述，可根据本文所述的方法和用途使用抑制TGFβ3的各种TβRII拮抗剂，包括例如配体诱捕物(ligandtrap)(例如TβRII多肽及其变体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制TGFβ3的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合可进一步抑制TGFβ1、TGFβ2、TβRII、ALK5和β聚糖中的一种或多种。在一些实施方案中，抑制TGFβ3的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合进一步抑制TGFβ1。在一些实施方案中，抑制TGFβ3的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合不抑制或基本上不抑制TGFβ2。在一些实施方案中，抑制TGFβ3的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合进一步抑制TGFβ1，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制TβRII的药剂(例如TβRII受体拮抗剂)。例如，可以使用包括本文所述的基于细胞的测定(例如，Smad信号传导测定)来测定对TβRII抑制的作用。因此，在一些实施方案中，本公开内容的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少结合TβRII。例如，可以使用包括本文所述的那些的结合亲和力测定来测定配体结合活性。在一些实施方案中，本公开内容的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合至少与TβRII以至少1 x 10-7 M (例如至少1 x 10-8 M、至少1 x 10-9 M、至少1 x 10-10 M、至少1 x 10-11 M或至少1 x 10-12 M)的KD结合。如本文所述，可根据本文所述的方法和用途使用抑制TβRII的各种TβRII拮抗剂，包括例如配体诱捕物(ligandtrap)(例如TβRII多肽及其变体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制TβRII的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合可进一步抑制TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、ALK5和β聚糖中的一种或多种。在一些实施方案中，抑制TβRII的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合不抑制或基本上不抑制TGFβ2。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制ALK5的药剂(例如ALK5拮抗剂)。例如，可以使用包括本文所述的基于细胞的测定(例如，Smad信号传导测定)来测定对ALK5抑制的作用。因此，在一些实施方案中，本公开内容的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少与ALK5结合。例如，可以使用包括本文所述的那些的结合亲和力测定来测定配体结合活性。在一些实施方案中，本公开内容的ALK5拮抗剂或拮抗剂的组合至少与ALK5以至少1 x 10-7 M (例如至少1 x 10-8 M、至少1 x 10-9 M、至少1 x 10-10 M、至少1 x 10-11 M或至少1 x 10-12 M)的KD结合。如本文所述，可根据本文所述的方法和用途使用抑制ALK5的各种TβRII拮抗剂，包括例如配体诱捕物(ligand trap)(例如TβRII多肽及其变体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制ALK5的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合可进一步抑制TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TβRII和β聚糖中的一种或多种。在一些实施方案中，抑制ALK5的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合不抑制或基本上不抑制TGFβ2。
在某些方面，根据本文所述的方法和用途使用的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合是至少抑制β聚糖的药剂(例如β聚糖拮抗剂)。例如，可以使用包括本文所述的基于细胞的测定(例如，Smad信号传导测定)来测定对Β聚糖抑制的作用。因此，在一些实施方案中，本公开内容的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合可以至少与β聚糖结合。例如，可以使用包括本文所述的那些的结合亲和力测定来测定配体结合活性。在一些实施方案中，本公开内容的β聚糖拮抗剂或拮抗剂的组合至少与β聚糖以至少1 x 10-7 M (例如至少1 x 10-8 M、至少1 x 10-9 M、至少1 x 10-10 M、至少1 x 10-11 M或至少1 x 10-12 M)的KD结合。如本文所述，可根据本文所述的方法和用途使用抑制β聚糖的各种TβRII拮抗剂，包括例如配体诱捕物(ligandtrap)(例如TβRII多肽及其变体)、抗体、小分子、核苷酸序列及其组合。在某些实施方案中，抑制β聚糖的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合可进一步抑制TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TβRII和ALK5中的一种或多种。在一些实施方案中，抑制β聚糖的TβRII拮抗剂或拮抗剂的组合不抑制或基本上不抑制TGFβ2。
在某些方面，本公开内容提供了TβRII多肽以及此类TβRII多肽作为TGFβ1和/或TGF-β3的选择性拮抗剂的用途。如本文所述，包含部分或全部TβRII胞外结构域(ECD)(具有或不具有其它突变)的多肽以不同亲和力结合和/或抑制TGFβ1和/或TGFβ3。因此，在某些方面，本公开内容提供了用于选择性抑制TGFβ超家族相关病症的TβRII多肽。
在某些方面，本公开内容提供了在TβRII的胞外结构域中包含突变和/或截短的多肽。在某些方面，本公开内容提供了TβRII融合多肽，其包含来自TβRII的胞外结构域的第一氨基酸序列和异源氨基酸序列，其中第一氨基酸序列包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：其与a) 起始于SEQ ID NO: 5的23至35的任一位置和终止于SEQ ID NO: 5的153至159的任一位置的序列或b) 起始于SEQ ID NO: 6的23至60的任一位置和终止于SEQ IDNO: 6的178至184的任一位置的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性。
在某些方面，本公开内容提供了包含融合至人IgG2的Fc结构域的至少一部分的TβRII的野生型或改变和/或截短的胞外结构域的多肽。因此，在某些方面，本公开内容提供了包含来自TβRII胞外结构域的第一氨基酸序列和异源氨基酸序列的TβRII融合多肽，其中第一氨基酸序列包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：其与a) 起始于SEQ ID NO:5的23至35的任一位置和终止于SEQ ID NO: 5的153至159的任一位置的序列或b) 起始于SEQ ID NO: 6的23至60的任一位置和终止于SEQ ID NO: 6的178至184的任一位置的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性，并且其中所述多肽包含第二多肽序列，所述第二多肽序列包含人IgG2的至少一个恒定结构域并且可以任选地包含与SEQ ID NO: 19具有至少80%、至少85%、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且其中接头任选位于第一多肽和第二多肽之间。其实例作为SEQ ID NO: 50提供，并且由SEQ ID NO: 51的核酸序列编码。在某些实施方案中，本公开内容提供了多肽，其氨基酸序列包含与SEQ IDNO: 50的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%. 98%、99%或100%同一性的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，本公开内容提供了由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列包含与SEQ ID NO: 51的核酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核酸序列或由其组成。
在某些方面，本公开内容提供了包含融合至人IgG1、IgG3或IgG4的Fc结构域的至少一部分的TβRII的野生型或改变和/或截短的胞外结构域的多肽。
在某些方面，本公开内容提供了包含融合至人IgG1的Fc结构域的至少一部分的TβRII的野生型或改变和/或截短的胞外结构域的多肽。因此，在某些方面，本公开内容提供了包含来自TβRII胞外结构域的第一氨基酸序列和异源氨基酸序列的TβRII融合多肽，其中第一氨基酸序列包含与SEQ ID NO: 13的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成和其中接头任选位于第一多肽和第二多肽之间。另一TβRII融合多肽的实例作为SEQ IDNO: 101提供和由SEQ ID NO: 102的核酸序列编码。在某些实施方案中，本公开内容提供多肽，其氨基酸序列包含与SEQ ID NO: 101的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，本公开内容提供多肽，其氨基酸序列包含与SEQ ID NO: 103的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，本公开内容提供氨基酸序列，其与起始于SEQ ID NO: 101的氨基酸25-46的任一个(例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或46)和终止于SEQ ID NO: 101的氨基酸170-186的任一个(例如170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185或186)的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。在某些实施方案中，本公开内容提供由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列包含与SEQ ID NO: 102的核酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核酸序列或由其组成。在某些实施方案中，本公开内容提供核酸序列，其包含与SEQ ID NO: 102的核酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含起始于SEQ ID NO: 5的位置23和终止于SEQ ID NO: 5的位置159的序列或由其组成。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含起始于SEQ ID NO: 5的位置29和终止于SEQ ID NO: 5的位置159的序列或由其组成。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含起始于SEQ ID NO: 5的位置35和终止于SEQ ID NO: 5的位置159的序列或由其组成。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含起始于SEQ ID NO: 5的位置23和终止于SEQ ID NO: 5的位置153的序列或由其组成。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含起始于SEQ ID NO: 5的位置29和终止于SEQ ID NO: 5的位置153的序列或由其组成。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含起始于SEQ ID NO: 5的位置35和终止于SEQID NO: 5的位置153的序列或由其组成。
在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含起始于SEQ ID NO: 6的位置23和终止于SEQ ID NO: 6的位置184的序列或由其组成。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含起始于SEQ ID NO: 6的位置29和终止于SEQ ID NO: 6的位置184的序列或由其组成。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含起始于SEQ ID NO: 6的位置23和终止于SEQ ID NO: 6的位置178的序列或由其组成。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含起始于SEQ ID NO: 6的位置29和终止于SEQ ID NO: 6的位置178的序列或由其组成。
在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含在对应于SEQ ID NO: 47的位置36的位置具有D和/或在对应于SEQ ID NO: 47的位置76的位置具有K的序列或由其组成。
在某些方面，本公开内容提供包含第一氨基酸序列或其活性片段和第二异源部分的TβRII融合多肽，所述第一氨基酸序列与SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 13的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性，其中第一氨基酸序列在对应于SEQ ID NO: 47的位置36的位置具有D和/或在对应于SEQ ID NO: 47的位置76的位置具有K。
在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO: 7的氨基酸1-12的1-12个氨基酸，或对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸1-37的1-37个氨基酸的N-末端截短。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 13的氨基酸1-6的6个氨基酸的N-末端截短。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO: 7的氨基酸1-12的12个氨基酸或对应于SEQ ID NO: 13的氨基酸1-37的37个氨基酸的N-末端截短。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含对应于 SEQ ID NO: 7的氨基酸137-132或SEQID NO: 13的氨基酸162-157的1-6个氨基酸的C-末端截短。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO: 7的氨基酸132-137或SEQ ID NO: 13的氨基酸157-162的6个氨基酸的C-末端截短。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含在对应于SEQ ID NO: 47的位置117和118残基之间对应于SEQ ID NO: 18的插入。
在一些实施方案中，异源部分包含一个或多个增强以下一种或多种的多肽部分：体内稳定性、体内半衰期、摄取/给药，组织定位或分布，蛋白质复合物的形成和/或纯化。在一些实施方案中，异源部分包含选自以下的多肽部分：免疫球蛋白Fc结构域和血清白蛋白。在进一步的实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域通过接头连接至TβRII多肽。
在一些实施方案中，多肽包括选自以下的一个或多个修饰的氨基酸残基：糖基化氨基酸、PEG化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、缀合至脂质部分的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。在一些实施方案中，多肽是糖基化的。
在某些方面，本公开内容提供包含第一氨基酸序列和第二异源部分的TβRII融合多肽，所述第一氨基酸序列由TβRII胞外结构域的一部分组成，其包含与选自SEQ ID NOs:7-17和47-49的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%同一性的氨基酸序列。在某些方面，本公开内容提供包含第一氨基酸序列和第二异源部分的TβRII融合多肽，所述第一氨基酸序列由TβRII胞外结构域的一部分组成，其包含与选自SEQ ID NOs: 7-17和47-49的氨基酸序列具有至少96%同一性的氨基酸序列。在某些方面，本公开内容提供包含第一氨基酸序列和第二异源部分的TβRII融合多肽，所述第一氨基酸序列由TβRII胞外结构域的一部分组成，其包含与选自SEQ ID NOs: 7-17和47-49的氨基酸序列具有至少97%同一性的氨基酸序列。在某些方面，本公开内容提供包含第一氨基酸序列和第二异源部分的TβRII融合多肽，所述第一氨基酸序列由TβRII胞外结构域的一部分组成，其包含与选自SEQID NOs: 7-17和47-49的氨基酸序列具有至少98%同一性的氨基酸序列。在某些方面，本公开内容提供包含第一氨基酸序列和第二异源部分的TβRII融合多肽，所述第一氨基酸序列由TβRII胞外结构域的一部分组成，其包含与选自SEQ ID NOs: 7-17和47-49的氨基酸序列具有至少99%同一性的氨基酸序列。在某些方面，本公开内容提供包含第一氨基酸序列和第二异源部分的TβRII融合多肽，所述第一氨基酸序列由TβRII胞外结构域的一部分组成，其包含为选自SEQ ID NOs: 7-17和47-49的氨基酸序列的氨基酸序列。
在某些方面，本公开内容提供多肽，其包含与选自SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33、35、37、39、41和43或其部分(前导序列去除)的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%同一性的氨基酸序列或由其组成，例如包含与选自SEQ ID NOs: 53、54、55、56、57、58、59、60、61和62的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%同一性的氨基酸序列或由其组成的多肽。在某些方面，本公开内容提供多肽，其包含与选自SEQ IDNOs: 25、27、29、31、33、35、37、39、41和43或其部分(前导序列去除)的氨基酸序列具有至少96%同一性的氨基酸序列或由其组成，例如包含与选自SEQ ID NOs: 53、54、55、56、57、58、59、60、61和62的氨基酸序列具有至少96%同一性的氨基酸序列或由其组成的多肽。在某些方面，本公开内容提供多肽，其包含与选自SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33、35、37、39、41和43或其部分(前导序列去除)的氨基酸序列具有至少97%同一性的氨基酸序列或由其组成，例如包含与选自SEQ ID NOs: 53、54、55、56、57、58、59、60、61和62的氨基酸序列具有至少97%同一性的氨基酸序列或由其组成的多肽。在某些方面，本公开内容提供多肽，其包含与选自SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33、35、37、39、41和43或其部分(前导序列去除)的氨基酸序列具有至少98%同一性的氨基酸序列或由其组成，例如包含与选自SEQ ID NOs: 53、54、55、56、57、58、59、60、61和62的氨基酸序列具有至少98%同一性的氨基酸序列或由其组成的多肽。在某些方面，本公开内容提供多肽，其包含与选自SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33、35、37、39、41和43或其部分(前导序列去除)的氨基酸序列具有至少99%同一性的氨基酸序列或由其组成，例如包含与选自SEQ ID NOs: 53、54、55、56、57、58、59、60、61和62的氨基酸序列具有至少99%同一性的氨基酸序列或由其组成的多肽。在某些方面，本公开内容提供多肽，其包含选自SEQ ID NOs: 25、27、29、31、33、35、37、39、41和43或其部分(前导序列去除)的氨基酸序列或由其组成，例如包含选自SEQ ID NOs: 53、54、55、56、57、58、59、60、61和62的氨基酸序列或由其组成的多肽。
在某些方面，本公开内容提供TβRII多肽，其包含由在严格条件下与选自SEQ IDNOs: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42和44的核苷酸序列的互补序列杂交的核酸序列编码的氨基酸序列。
在前述的每一种中，可以选择TβRII多肽，使其不包含全长TβRII ECD。TβRII多肽可以作为单体蛋白质或以二聚化形式使用。TβRII多肽也可以与第二多肽部分融合以提供改善的性质，例如增加的半衰期或更容易的生产或纯化。融合可以是直接的，或者可以在TβRII多肽和任何其它部分之间插入接头。接头可以是结构化的或非结构化的，并且可以由1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 50个或更多个氨基酸组成，任选地相对不含二级结构。
在一些实施方案中，本公开内容的TβRII多肽具有CHO细胞中多肽表达特征性的糖基化模式。
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含两个本公开内容的TβRII多肽的同二聚体。
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含本公开内容的TβRII多肽的编码序列的分离的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含与分离的多核苷酸可操作连接的启动子序列的重组多核苷酸。在一些实施例中，本公开内容提供用本发明的分离的多核苷酸或重组多核苷酸转化的细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是CHO细胞或人类细胞。在一些实施方案中，细胞是HEK-293细胞。
在某些方面，本公开内容提供了包含本公开内容的TβRII多肽或同二聚体和药学上可接受的赋形剂的药物制剂。
在某些方面，TβRII拮抗剂是抗体或抗体组合。在某些方面，抗体至少结合TβRII。在一些实施方案中，结合TβRII的TβRII拮抗剂抗体抑制TβRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定例如本文所述的测定中测量的。在一些实施方案中，结合TβRII的TβRII拮抗剂抗体抑制一种或多种TGF-β超家族配体、TGFβ超家族I型受体或TGFβ超家族共同受体结合TβRII。在一些实施方案中，结合TβRII的TβRII拮抗剂抗体抑制一种或多种TGF-β超家族配体与选自TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的TβRII结合。在某些方面，抗体至少结合ALK5。在一些实施方案中，结合ALK5的TβRII拮抗剂抗体抑制ALK5信号传导，任选地如在基于细胞的测定例如本文所述的测定中测量的。在一些实施方案中，结合ALK5的TβRII拮抗剂抗体抑制一种或多种TGF-β超家族配体、TGFβ超家族II型受体或TGFβ超家族共同受体与ALK5的结合。在一些实施方案中，结合ALK5的TβRII拮抗剂抗体抑制一种或多种TGF-β超家族配体结合选自TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的ALK5。在某些方面，抗体至少结合β聚糖。在一些实施方案中，结合β聚糖的TβRII拮抗剂抗体抑制β聚糖信号传导，任选地如在基于细胞的测定例如本文所述的测定中测量的。在一些实施方案中，结合β聚糖的TβRII拮抗剂抗体抑制一种或多种TGF-β超家族配体、TGFβ超家族I型受体或TGFβ超家族II型受体结合β聚糖。在一些实施方案中，结合β聚糖的TβRII拮抗剂抗体抑制一种或多种TGF-β超家族配体结合选自TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的β聚糖。在某些方面，TβRII拮抗剂抗体至少结合TGFβ1。在一些实施方案中，结合TGFβ1的TβRII拮抗剂抗体抑制TβRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定例如本文所述的测定中测量的。在一些实施方案中，结合TGFβ1的TβRII拮抗剂抗体抑制TGFβ1-TβRII、TGFβ1-ALK5和/或TGFβ1-β聚糖结合。在某些方面，TβRII拮抗剂抗体至少结合TGFβ2。在一些实施方案中，结合TGFβ2的TβRII拮抗剂抗体抑制TβRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定例如本文所述的测定中测量的。在一些实施方案中，结合TGFβ2的TβRII拮抗剂抗体抑制TGFβ2-TβRII、TGFβ1-ALK5和/或TGFβ1-β聚糖结合。在某些实施方案中，TβRII拮抗剂抗体至少结合TGFβ3。在一些实施方案中，结合TGFβ3的TβRII拮抗剂抗体抑制TβRII信号传导，任选地如在基于细胞的测定例如本文所述的测定中测量的。在一些实施方案中，结合TGFβ3的TβRII拮抗剂抗体抑制TGFβ3-TβRII、TGFβ1-ALK5和/或TGFβ1-β聚糖结合。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂抗体是多特异性抗体或多特异性抗体的组合，在基于细胞的测定中抑制TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TβRII、ALK5和β聚糖中的一种或多种的信号传导。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗体是单链抗体、F(ab')2片段、单链双抗体、串联单链Fv片段、串联单链双抗体或融合蛋白，其包含单链双链体和至少一部分免疫球蛋白重链恒定区。
在某些方面，TβRII拮抗剂是小分子抑制剂或小分子抑制剂的组合。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂小分子抑制剂是至少TβRII的抑制剂。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂小分子抑制剂是至少ALK5的抑制剂。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂小分子抑制剂是至少β聚糖的抑制剂。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂小分子抑制剂是至少TGFβ1的抑制剂。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂小分子抑制剂是至少TGFβ2的抑制剂。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂小分子抑制剂是至少TGFβ3的抑制剂。
在某些方面，TβRII拮抗剂是核酸抑制剂或核酸抑制剂的组合。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂核酸抑制剂是至少TβRII的抑制剂。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂核酸抑制剂是至少ALK5的抑制剂。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂核酸抑制剂是至少β聚糖的抑制剂。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂核酸抑制剂是至少TGFβ1的抑制剂。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂核酸抑制剂是至少TGFβ2的抑制剂。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂核酸抑制剂是至少TGFβ3的抑制剂。
在某些方面，本公开内容提供了调节细胞对TGFβ超家族成员的反应的方法，所述方法包括使细胞暴露于本公开内容的TβRII多肽或同二聚体。
在某些方面，本公开内容提供了调节细胞对TGFβ超家族成员的反应的方法，所述方法包括使细胞暴露于本公开内容的TβRII多肽或同二聚体。
在某些方面，本公开内容涉及一种或多种TβRII拮抗剂，任选地与一种或多种用于治疗骨髓增生性病症的其它支持疗法或活性剂组合，在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防本文所述的骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)、骨髓增生性病症的一种或多种并发症(例如纤维化、脾肿大和炎症)或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，本公开内容涉及一种或多种TβRII拮抗剂，任选地与一种或多种用于治疗Janus激酶相关病症(例如，JAK2激酶相关病症)的其它支持疗法或活性剂组合，在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防本文所述的Janus激酶相关病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)、Janus激酶相关病症的一种或多种并发症(例如，纤维化、脾肿大和炎症)或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，本公开内容涉及一种或多种TβRII拮抗剂，任选地与一种或多种用于治疗骨髓增生性病症的其它支持疗法或活性剂组合，用于治疗、预防本文所述的骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)、骨髓增生性病症的一种或多种并发症(例如纤维化、脾肿大和炎症)或降低其进展速率和/或严重性。在某些方面，本公开内容涉及一种或多种TβRII拮抗剂，任选地与一种或多种用于治疗Janus激酶相关病症的其它支持疗法或活性剂组合，用于治疗、预防本文所述的Janus激酶相关病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)、Janus激酶相关病症的一种或多种并发症(例如，纤维化、脾肿大和炎症)或降低其进展速率和/或严重性。
附图说明
本专利或申请文件至少包含一张彩色制成的附图。具有彩色附图的该专利或专利申请公开文本的副本将由专利局根据请求并支付必要费用提供。
图1显示人TGFβ受体II型(hTβRII)的B(短)同种型的天然前体的氨基酸序列(NP_003233.4)。实线下划线表示成熟胞外结构域(ECD)(残基23-159)，双下划线表示在A(长)同种型中被置换的缬氨酸。虚线下划线表示前导序列(残基1-22)。
图2显示人TβRII的A(长)同种型的天然前体的氨基酸序列(NP_001020018.1)。实线下划线表示成熟ECD(残基23-184)，双下划线表示剪接产生的异亮氨酸置换。虚线下划线表示前导序列(残基1-22)。
图3显示hTβRII短截短和它们的hTβRII长对应物的N末端比对。存在于hTβRII长截短中的25个氨基酸插入加下划线。请注意，剪接过程导致短同种型中插入位点侧翼的缬氨酸被长同种型中的异亮氨酸置换。加框序列表示前导序列。
图4A、4B和4C显示来自媒介物治疗的JAK2V617F小鼠(图4B)，mTβRII-Fc治疗的JAK2V617F小鼠(图4C)和年龄匹配的野生型小鼠(图4A)的骨活检。与对照JAK2V617F小鼠相比，来自mTβRII-Fc治疗的JAK2V617F小鼠的骨髓样品中纤维化减少。
图5A和5B显示mTβRII-Fc对JAK2V617F小鼠中红细胞水平(图5A)和脾重量(图5B)的影响。与媒介物治疗的小鼠相比，mTβRII-Fc治疗对RBC水平具有适度影响并显著降低脾重量(-29％; p <0.01)。
图6A和6B显示来自媒介物治疗的JAK2V617F小鼠(图6A)和mTβRII-Fc治疗的JAK2V617F小鼠(图6B)的脾活检。与对照JAK2V617F小鼠相比，来自mTβRII-Fc治疗的JAK2V617F小鼠的脾样品中纤维化减少。
图7A和7B显示mTβRII-Fc和鲁索替尼对JAK2V617F小鼠中红细胞水平(图7A)和脾重量(图7B)的影响。与媒介物治疗的小鼠相比，单独或与mTβRII-Fc组合的Rux治疗显著降低RBC水平和降低脾重量(* P<0.05; ** P<0.01; ***P<0.001相对于媒介物)。单独的mTβRII-Fc治疗对RBC水平和脾重量具有更适度的影响(* P<0.05和** P<0.01相对于媒介物)。
图8A、8B、8C和8D显示来自媒介物治疗的JAK2V617F小鼠(图8A)、鲁索替尼治疗的JAK2V617F小鼠(图8B)、mTβRII-Fc治疗的JAK2V617F小鼠(图8C)和用mTβRII-Fc和鲁索替尼两者治疗的JAK2V617F小鼠(图8D)的骨活检。与对照JAK2V617F小鼠相比，在来自mTβRII-Fc治疗的JAK2V617F小鼠以及用mTβRII-Fc和鲁索替尼两者治疗的JAK2V617F小鼠的骨髓样品中纤维化减少。
发明详述
1. 概述
除非另有说明，本文所述的蛋白质是人形式。蛋白质的NCBI参考如下：人TβRII同种型A (hTβRII长), NP_001020018.1和人TβRII同种型B (hTβRII短), NP_003233.4。天然人TβRII蛋白的序列如图1-2所示。
TGFβ超家族含有多种生长因子，其共享相同的序列元件和结构基序。已知这些蛋白质对脊椎动物和无脊椎动物中的大量细胞类型发挥生物学作用。超家族成员在胚胎发育的模式形成和组织分化过程中发挥重要作用，并且可以影响多种分化过程，包括脂肪形成、肌细胞生成、软骨形成、心脏发生、造血、神经发生和上皮细胞分化。通过操纵TGFβ家族成员的活性，通常可能在生物体中引起显著的生理变化。例如，Piedmontese和Belgian Blue牛品种在GDF8(也称为肌生长抑制素)基因中携带功能丧失突变，导致肌肉量明显增加[Grobet等. (1997) Nat Genet 17(1):71-4]。同样，在人类中，GDF8的无活性等位基因与增加的肌肉量相关，并据报道与非凡的强度相关[Schuelke等. (2004) N Engl J Med350:2682-8]。
TGFβ信号由I型(例如TβRI)和II型(例如TβRII)丝氨酸/苏氨酸激酶受体的异聚复合物介导，其在配体刺激后磷酸化并活化下游SMAD蛋白[Massagué (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178]。这些I型和II型受体是跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸的区域的配体结合胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸特异性的胞质结构域构成。I型受体对信号传导至关重要；而II型受体是结合配体和表达I型受体所必需的。I型和II型受体在配体结合后形成稳定的复合物，导致I型受体被II型受体磷酸化。TGFβ具有三种哺乳动物同种型，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，各自在体内具有不同的功能。TGFβ结合TβRII是启动TGFβ信号传导途径激活，导致SMAD2磷酸化，以及激活的SMAD2/SMAD4复合物易位至细胞核以调节基因表达的关键步骤。
TβRII是TGFβ的已知II型受体并以高亲和力与TGFβ1和TGFβ3结合。人TβRII以至少两种同种型天然存在-通过胞外结构域(ECD)中的可变剪接产生的A(长)和B(短)-(图2和1以及SEQ ID NOS: 6和5)。长的同种型具有25个氨基酸的插入，并且剪接过程导致短同种型中插入位点侧翼的缬氨酸被长同种型中的异亮氨酸置换。可溶性受体胞外域可用作清除剂或配体诱捕物以抑制配体-受体相互作用。配体诱捕物，例如掺入天然TβRII胞外结构域(胞外域)的可溶性TβRII-Fc融合蛋白，将起到针对TβRII配体(包括TGFβ1和TGFβ3)的泛抑制剂的作用。虽然在一些治疗场景中，这种更宽范围的配体结合和信号抑制可能是有利的，但在其它场景下，更具选择性的分子可能更优。配体诱捕物如TβRII胞外域多肽显示选择性配体结合特征是非常理想的。因此，在某些方面，本公开内容提供TβRII多肽作为TGFβ1或TGFβ3的拮抗剂，用于治疗各种TGFβ1或TGFβ3相关病症。虽然不希望受到任何特定作用机制的束缚，但预计这些多肽通过与TGFβ1或TGFβ3结合并抑制这些配体形成三元信号传导复合物的能力起作用。
骨髓增生性病症是一组病症，其特征部分在于一些或全部血细胞(血小板、白细胞和红细胞)的慢性增加。这组血液病症包括真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、骨髓纤维化症(如原发性骨髓纤维化症(PMF)、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)和慢性髓细胞样白血病(CML)。通常认为骨髓增生性病症是由造血干细胞转化引起的。事实上，CML由其致病分子病变BCR-ABL融合物定义，其最常见由费城染色体易位导致。最近，有几个研究小组将功能获得性酪氨酸激酶JAK2(JAK2V617F)鉴定为BCR-ABL-阴性骨髓增生性病症PV、ET和骨髓纤维化症(MF)患者的主要分子缺陷。JAK2V617F小鼠发展的病理学非常类似于人原发性血小板增多症和真性红细胞增多症[Xing等. (2008) Blood 111: 5109-5117]。随着年龄的增长，这些JAK2V617F小鼠也会发展原发性骨髓纤维化症样病理。如本文所公开的，已经发现TβRII-Fc治疗可以减少JAK2V617F疾病模型中的脾肿大、纤维化和其它疾病。
本文呈现的数据证明TβRII拮抗剂可用于治疗或预防由JAK2V617F突变引起的并发症，这表明这些治疗剂可用于治疗骨髓增生性病症(例如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和骨髓纤维化症)以及Janus激酶相关病症(例如，JAK2激酶相关病症)。鉴于对早期(例如脾肿大)的作用和减少/延缓晚期疾病病理学(例如纤维化和促炎细胞因子)的发作，TβRII拮抗剂可特别适用于治疗真性红细胞增多症和原发性血小板增多症以预防/延缓纤维化和其它晚期疾病并发症的发作或降低其严重性，从而预防/延缓转变为继发性骨髓纤维化症疾病(分别为真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)。而且，TβRII拮抗剂在骨髓纤维化症患者中清楚地显示出在治疗的末期纤维化和炎症中的积极作用。
本说明书中使用的术语通常具有它们在本领域中，在本发明的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中的普通含义。某些术语在下面或说明书的其它地方讨论，以向实践人员提供在描述本发明的组合物和方法以及如何制造和使用它们方面的额外指导。任何术语使用的范围或含义将从该术语所使用的特定上下文中显而易见。
在所有其语法形式和拼写变化中，“同源的”是指两种蛋白质之间的关系，其具有“共同进化起源”，包括来自同一种生物体的超家族的蛋白质，以及来自不同物种生物体的同源蛋白质。这些蛋白质(及其编码核酸)具有序列同源性，如其序列相似性所反映的，无论是在同一性百分比方面还是根据特定残基或基序和保守位置的存在。术语“序列相似性”，在所有其语法形式中是指可能共享或可能不共享共同进化起源的核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应性程度。然而，在通常的用法和本申请中，当用诸如“高度”的副词修饰时，术语“同源的”可以指序列相似性，并且可能涉及或可能不涉及共同进化起源。
相对于参考多肽(或核苷酸)序列的“百分比(%)序列同一性”定义为在序列比对和如果需要引入空位以实现最大百分比序列同一性之后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分，候选序列中与参考多肽(核苷酸)序列中的氨基酸残基(或核酸)相同的氨基酸残基(或核酸)的百分比。为了确定百分比氨基酸序列同一性的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可用的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括为了在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸(核酸)序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech, Inc.创作，并且源代码已经在U.S. Copyright Office, Washington D.C.,20559，以U.S. Copyright Registration No. TXU510087注册的用户文档中提交。ALIGN-2程序可从Genentech, Inc., South San Francisco, Calif.获得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应该被编译用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有的序列比较参数都由ALIGN-2程序设定，并且不会改变。
“激动”在所有其语法形式中是指激活蛋白质和/或基因(例如通过激活或扩增该蛋白质的基因表达或通过诱导失活的蛋白质进入活性状态)或增加蛋白质和/或基因的活性的过程。
“拮抗”在所有其语法形式中是指抑制蛋白质和/或基因(例如通过抑制或降低该蛋白质的基因表达或通过诱导活性蛋白质进入失活状态)或降低蛋白质和/或基因的活性的过程。
结合整个说明书和权利要求中的数值所使用的术语“约”和“大约”表示本领域技术人员熟知且可接受的准确性区间。一般来说，这种准确性区间是±10％。或者，特别是在生物系统中，术语“约”和“大约”可以是指在给定值的一个数量级内，优选≤5倍，更优选≤2倍的值。
本文公开的数字范围包括限定所述范围的数字。
术语“一个”和“一种”包括复数指代，除非使用该术语的上下文另有明确规定。术语“一个”(或“一种”)以及术语“一个或多个”和“至少一个”可以在本文中互换使用。此外，本文使用的“和/或”被认为是具有或不具有另一个的两个或更多个指定特征或组分中的每一个的具体公开。因此，本文中诸如"A和/或B"等短语中使用的术语“和/或”旨在包括"A和B," "A或B," "A" (单独)和"B" (单独)。同样地，在诸如"A, B,和/或C"的短语中使用的术语"和/或"旨在包括以下各方面：A, B和C; A, B或C; A或C; A或B; B或C; A和C; A和B; B和C; A (单独); B (单独);和C (单独)。
在本说明书全文中，词语“包含”或变型例如“包括”或“含有”将被理解为暗示包含所述整体或整体组，但不排除任何其它整体或整体组。
2.TβRII拮抗剂
部分地，本文呈现的数据证明TβRII拮抗剂(抑制剂)可用于治疗骨髓增生性病症(例如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和骨髓纤维化症)和/或Janus激酶相关病症(例如JAK2激酶相关病症)的患者。特别地，已显示TβRII多肽有效改善各种骨髓增生性疾病并发症，包括例如脾肿大、高炎性细胞因子水平和纤维化。因此，本公开内容部分地提供了各种TβRII拮抗剂，其可单独使用或与一种或多种另外的活性剂和/或支持疗法组合使用以治疗、预防骨髓增生性病症和/或Janus激酶相关病症或骨髓增生性病症和/或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症的患者，或降低其进展速率和/或严重性。尽管TβRII多肽可以通过除抑制TβRII配体以外的机制影响骨髓增生性疾病和/或Janus激酶相关病症的患者[例如，TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3的一种或多种的抑制可能是药剂抑制一系列其它药剂，可能包括TGF-β超家族的其它成员的活性的趋势的指示以及这种集体抑制可能导致对例如骨髓增生性疾病和/或Janus激酶相关病症的期需作用]，其它类型的TGFβ拮抗剂[例如TβRII受体的拮抗剂，一种或多种TβRII配体(例如TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)的拮抗剂，一种或多种TβRII相关的I型受体(例如ALK5)的拮抗剂，一种或多种TβRII相关共同受体(例如β聚糖)的拮抗剂，一种或多种TβRII下游信号传导组分(Smads)的拮抗剂或这些拮抗剂的组合]可用于治疗骨髓增生性病症和/或Janus激酶相关病症，特别是治疗、预防骨髓增生性病症和/或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性。这样的拮抗剂包括，例如TβRII多肽及其变体、抗TGFβ抗体、抗ALK5抗体、抗β聚糖抗体和抗TβRII抗体；抑制TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、ALK5、β聚糖和TβRII的一种或多种的活性或表达(例如转录、翻译、自细胞分泌或其组合)的核酸；以及抑制TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、ALK5、β聚糖和TβRII的一种或多种的活性或表达(例如转录、翻译、自细胞分泌或其组合)的小分子。
A.TβRII多肽
在某些方面，根据本文公开的方法和用途使用的TβRII拮抗剂是TβRII多肽或其变体(TβRII拮抗剂多肽)。TβRII多肽或多肽的组合可以抑制例如一种或多种TβRII配体(例如TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)，TβRII受体、TβRII相关的I型受体(例如ALK5)和/或TβRII相关的共同受体(例如β聚糖)。在一些实施方案中，在基于细胞的测定中测定TβRII多肽或多肽组合抑制信号传导(例如Smad信号传导)的能力，所述测定包括例如本文所述的那些。TβRII多肽或多肽的组合可以单独使用或与一种或多种另外的支持疗法或活性剂组合使用，以治疗、预防骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板增多症)和/或Janus激酶相关病症或骨髓增生性病症和/或Janus激酶相关病症(例如JAK2激酶相关病症)的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性。
天然存在的TβRII蛋白是跨膜蛋白，一部分蛋白位于细胞外(胞外部分)，一部分蛋白位于细胞内(胞内部分)。本公开内容的方面包括在TβRII的胞外结构域和/或胞外结构域的截短部分中包含突变的变体TβRII多肽。如上所述，人TβRII以至少两种同种型A(长)和B(短)天然存在(图2和1以及SEQ ID NOS: 6和5)-胞外结构域(ECD)中的可变剪接产生。对应于SEQ ID NO: 5的残基23-159的SEQ ID NO: 7描述了TβRII的短同种型的天然全长胞外结构域。对应于SEQ ID NO: 6的残基23-184的SEQ ID NO: 13描述了TβRII的长同种型的天然全长胞外结构域。除非另有说明，否则关于基于TβRII短和长同种型的变体的氨基酸位置编号分别指天然前体SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6中的相应位置。
在某些实施方案中，本公开内容提供了变体TβRII多肽。本公开内容的TβRII多肽可以结合并抑制TGFβ超家族成员的功能，例如但不限于TGFβ1或TGFβ3。TβRII多肽可包括由以下氨基酸序列组成或包含以下氨基酸序列的多肽：与天然存在的TβRII多肽的截短ECD结构域(其C-末端存在于SEQ ID NO: 5的氨基酸153-159 (例如153, 154, 155, 156, 157,158或159)的任一个)具有至少80%同一性和任选至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列。TβRII多肽可包括由以下氨基酸序列组成或包含以下氨基酸序列的多肽：与天然存在的TβRII多肽的截短ECD结构域(其C-末端存在于SEQ ID NO: 6的氨基酸178-184 (例如178, 179, 180, 181, 182, 183或184)的任一个)具有至少80%同一性和任选至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%,98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列。任选地，TβRII多肽不包括来自由SEQ ID NO: 5的氨基酸160-567组成的序列或来自由SEQ ID NO: 6的氨基酸185-592组成的序列的多于5个连续氨基酸，或多于10, 20, 30, 40, 50, 52, 60, 70, 80, 90, 100, 150或200个或更多个连续氨基酸。未经加工的TβRII多肽可以包括或排除任何信号序列，以及信号序列N末端的任何序列。如本文中详细描述的，成熟(加工的)TβRII多肽的N末端可以存在于SEQ IDNO: 5的氨基酸23-35或SEQ ID NO: 6的氨基酸23-60中的任一个。成熟TβRII多肽的实例包括但不限于：SEQ ID NO: 5的氨基酸23-159(示于SEQ ID NO: 7), SEQ ID NO: 5的氨基酸29-159(示于SEQ ID NO: 105), SEQ ID NO: 5的氨基酸35-159(示于SEQ ID NO: 10),SEQ ID NO: 5的氨基酸23-153(示于SEQ ID NO: 11), SEQ ID NO: 5 的氨基酸29-153(示于SEQ ID NO: 48), SEQ ID NO: 5的氨基酸35-153(示于SEQ ID NO: 47), SEQ ID NO: 6的氨基酸23-184 (示于SEQ ID NO: 13), SEQ ID NO: 6的氨基酸29-184 (示于SEQ IDNO: 15), SEQ ID NO:6的氨基酸35-184(示于SEQ ID NO: 10), SEQ ID NO: 6的氨基酸23-178(示于SEQ ID NO: 16), SEQ ID NO: 6的氨基酸29-178(示于SEQ ID NO: 49)和SEQID NO: 6的氨基酸35-178(示于SEQ ID NO: 47)。同样地，TβRII多肽可以包含由SEQ IDNO: 30的核苷酸73-465，SEQ ID NO: 34的核苷酸73-447，SEQ ID NO: 38的核苷酸73-465，SEQ ID NO: 38的核苷酸91-465，或SEQ ID NO: 38的核苷酸109-465，或其沉默变体或在严格杂交条件下(通常，这样的条件是本领域已知的，但可以例如，包括在65℃下在50％v/v甲酰胺，5x SSC，2％w/v封闭剂，0.1％N-月桂酰肌氨酸和0.3％SDS中杂交过夜并在例如5xSSC中在约65℃洗涤)与其互补序列杂交的核酸编码的多肽。本领域技术人员将理解，基于TβRII的长同种型的相应变体将包括编码25个氨基酸插入以及在插入的C末端侧翼位置处的保守Val-Ile置换的核苷酸序列。因此，TβRII多肽可以包括TβRII多肽的分离的细胞外部分，包括短和长同种型，其变体(包括变体，其在对应于SEQ ID NO: 5的氨基酸23-159或SEQID NO: 6的氨基酸23-184的序列中包含例如不超过2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30或35个氨基酸置换)，其片段和包含前述任一种的融合蛋白，但在每种情况下，优选任何前述TβRII多肽将保留对TGFβ1或TGFβ3中的至少一种的实质亲和力。通常，TβRII多肽将被设计成在生物相关温度、pH水平和渗透压下可溶于水溶液中。
在一些实施方案中，本公开内容的变体TβRII多肽包含赋予改变的配体结合特征的胞外结构域中的一个或多个突变。相对于天然存在的TβRII多肽的相应部分，TβRII多肽可以在氨基酸序列中包括一个、两个、五个或更多个改变。在一些实施方案中，所述突变导致在对应于SEQ ID NO: 5的位置70的位置处的置换、插入或缺失。在一些实施方案中，所述突变导致在对应于SEQ ID NO: 5的位置110的位置处的置换、插入或缺失。实例包括但不限于分别对应于SEQ ID NO: 5的位置70和110的位置的N至D置换或D至K置换。这样的变体TβRII多肽的实例包括但不限于SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO: 12和SEQ IDNO: 17中所示的序列。TβRII多肽可以包含多肽或其部分，其由SEQ ID NO: 26的核苷酸73-483、SEQ ID NO: 42的核苷酸73-465或其沉默变体或在严格杂交条件下与其互补序列杂交的核酸编码。
在一些实施方案中，本公开内容的变体TβRII多肽还包含位于人TβRII ECD的C-末端附近的谷氨酸残基对(SEQ ID NO: 5的位置151和152或SEQ ID NO: 6的位置176和177)之间的36个氨基酸插入(SEQ ID NO: 18)，如在人TβRII同种型C中天然存在的(Konrad等.,BMC Genomics 8:318, 2007)。
本公开内容进一步证明TβRII多肽可经修饰以选择性拮抗TβRII配体。此处显示的数据表明包含TβRII多肽的较短N末端和C末端截短变体的Fc融合蛋白对由TGFβ1和TGFβ3介导的细胞信号传导显示出不同的抑制作用。具体地，发现与TβRII短同种型的全长胞外结构域相比，起始于SEQ ID NO: 5的氨基酸29或35并分别携带胞外结构域的6或12个氨基酸N末端截短的N末端截短的变体显著降低抑制TGFβ3的效力，同时保持中等程度的TGFβ1抑制。终止于SEQ ID NO: 5的氨基酸153并携带胞外结构域的6个氨基酸C-末端截短的C-末端截短的变体对配体结合没有实质影响，因此可以与全长形式互换使用。发现在对应于SEQ IDNO: 5的位置70的位置的N至D置换可以有效抑制TGFβ3和对TGFβ1的可忽略作用。N70残基代表潜在的糖基化位点。此外，发现与TβRII短同种型的全长胞外结构域相比，在对应于SEQID NO: 5的位置110的位置包含D至K置换的Fc融合蛋白显著降低抑制TGFβ1的效力，同时保持中等程度的TGFβ3抑制。位置110附近的区域与已知的TβRII配体TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的选择性没有关联。因此，出乎意料地，在ECD中含有突变，例如但不限于N70D和D110K(其残基的编号对应于SEQ ID NO: 5的编号)，和/或在氨基酸29和35之间开始和/或在氨基酸153和氨基酸159之间终止的TβRII多肽均预期是活性的并且对不同配体表现出广泛不同的抑制效力。取决于临床或实验设置，任何这些截短的变体形式都可能是期望使用的。
在某些实施方案中，TβRII多肽结合TGFβ1，并且TβRII多肽不显示与TGFβ3的实质结合。在某些实施方案中，TβRII多肽结合TGFβ3，并且TβRII多肽不显示与TGFβ1的实质结合。可以例如使用溶液中或表面等离子体共振系统(例如BiacoreTM系统)中的纯化蛋白来评估结合。
在某些实施方案中，TβRII多肽抑制TGFβ1细胞信号传导，并且TβRII多肽对TGFβ3具有中等或有限抑制作用。在某些实施方案中，TβRII多肽抑制TGFβ3细胞信号传导，并且TβRII多肽对TGFβ1具有中等或有限抑制作用。可以通过本领域已知的方法测定对细胞信号传导的抑制作用。
总之，TβRII多肽的活性部分可以包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列23-153, 23-154, 23-155, 23-156, 23-157或23-158，以及起始于SEQ ID NO: 5的氨基酸24-35的任一个的这些序列的变体。类似地，TβRII多肽的活性部分可以包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列23-178, 23-179, 23-180, 23-181, 23-182或23-183，以及起始于SEQ ID NO: 6的氨基酸24-60的任一个的这些序列的变体。示例性的TβRII多肽包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列29-159, 35-159, 23-153, 29-153和35-153或SEQ ID NO: 6的氨基酸序列29-184, 60-184, 23-178, 29-178和60-178。也考虑这些范围内的变体，特别是与SEQ ID NO: 5或SEQID NO: 6的相应部分具有至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%,99%或100%同一性的那些。可以选择TβRII多肽，其不包括由SEQ ID NO:5的氨基酸160-567或SEQ ID NO:6的氨基酸185-592组成的序列。
如上所述，本公开内容提供了与天然存在的TβRII多肽共享特定程度的序列同一性或相似性的TβRII多肽。为了确定两个氨基酸序列的同一性百分比，将序列进行比对以达到最佳比较目的(例如，可以将空位引入第一个和第二个氨基酸或核酸序列中的一个或两个以获得最佳比对和为了比较目的非同源序列可以忽略)。然后比较相应氨基酸位置上的氨基酸残基。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基占据时，则该分子在该位置是相同的(如本文所用，氨基酸“同一性”等同于氨基酸“同源性”)。两个序列之间的百分比同一性是由序列共享的相同位置的数目的函数，考虑到空位的数目以及每个空位的长度，需要将其引入以最佳比对两个序列。
可以使用数学算法完成序列比较和两个序列之间百分比同一性和相似性的确定(Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press,New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.,ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994;Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987;and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M StocktonPress, New York, 1991)。
在一个实施方案中，使用Needleman and Wunsch (J Mol. Biol. (48):444-453(1970))算法确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性，所述算法已并入GCG软件包中的GAP程序(可从http://www.gcg.com获得)。在一个具体实施方案中，在GAP程序中使用以下参数：Blosum62矩阵或PAM250矩阵，以及16, 14, 12, 10, 8, 6或4的空位权重和1, 2, 3,4, 5或6的长度权重。在另一个实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序确定两个核苷酸序列之间的百分比同一性(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Res. 12(1):387(1984)) (可从http://www.gcg.com获得)。示例性的参数包括使用NWSgapdna.CMP矩阵和40, 50, 60, 70或80的空位权重和1, 2, 3, 4, 5或6的长度权重。除非另外指明，否则两个氨基酸序列之间的同一性百分比使用Blosum 62矩阵，10的GAP权重和3的长度权重的GAP程序来确定，并且如果此类算法不能计算期望的百分比同一性，则应当选择本文公开的合适的替代方案。
在另一个实施方案中，两个氨基酸序列之间的百分比同一性使用已经并入ALIGN程序(版本2.0)中的E. Myers和W. Miller的算法(CABIOS, 4:11-17 (1989))，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分12，空位罚分4确定。
用于确定两个氨基酸序列之间的最佳整体比对的另一个实施方案可以使用基于Brutlag等(Comp. App. Biosci., 6:237-245 (1990))的算法的FASTDB计算机程序来确定。在序列比对中，查询和主题序列都是氨基酸序列。所述全局序列比对的结果以百分比同一性表示。在一个实施方案中，使用基于Brutlag等(Comp. App. Biosci., 6:237-245(1990))的算法的FASTDB计算机程序执行氨基酸序列同一性。在具体的实施方案中，用于计算氨基酸比对的百分比同一性和相似性的参数包括：矩阵= PAM150，k-元组= 2，错配罚分=1，联合罚分= 20，随机化组长度= 0，截止分数= 1，空位罚分= 5和空位大小罚分= 0.05。
TβRII多肽可以另外在N-末端包含各种前导序列的任一种。这样的序列将允许肽在真核系统中表达并靶向分泌途径。参见例如Ernst等，美国专利号5,082,783(1992)。或者，天然的TβRII信号序列可用于实现从细胞的挤出。可能的前导序列包括天然的前导序列，组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)和蜜蜂蜂毒肽(honeybee mellitin)(分别为SEQID NO: 22-24)。掺入TPA前导序列的TβRII-Fc融合蛋白的实例包括SEQ ID NOs: 25, 27,29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 101和103。信号肽的加工可根据所选择的前导序列、使用的细胞类型和培养条件以及其它变量而变化，因此成熟TβRII多肽的实际N末端起始位点可以在N末端或C末端方向偏移1、2、3、4或5个氨基酸。TβRII-Fc融合蛋白的实例包括SEQID NOs: 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 50, 53, 54, 55, 56, 57, 58,59, 60, 61, 62, 101和103，如本文所示，其中TβRII多肽部分用下划线表示(参见实施例)。本领域技术人员将理解，基于TβRII的长同种型的相应变体将包括25个氨基酸的插入以及在插入的C末端侧翼位置的保守Val-Ile置换。在某些方面，本公开内容涉及TβRII多肽，其包含SEQ ID NO: 101的氨基酸序列具有至少80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性，以及其根据本文所述方法的用途。在某些方面，本公开内容涉及TβRII多肽，其包含SEQ ID NO: 103的氨基酸序列具有至少80%, 85%,90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性，以及其根据本文所述方法的用途。在某些方面，本公开内容涉及TβRII多肽，其包含与起始于SEQ ID NO: 101的氨基酸25-46任一个(例如25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45或46)和终止于SEQ ID NO: 101的氨基酸170-186任一个(例如170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183,184, 185或186)的氨基酸序列具有至少80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列，以及其根据本文所述方法的用途。
在某些实施方案中，本公开内容考虑了TβRII多肽的特定突变以改变多肽的糖基化。可以选择这样的突变以便引入或消除一个或多个糖基化位点，例如O-连接或N-连接的糖基化位点。天冬酰胺连接的糖基化识别位点通常包含三肽序列天冬酰胺-X-苏氨酸(或天冬酰胺-X-丝氨酸)(其中“X”是任何氨基酸)，其被适当的细胞糖基化酶特异性识别。该改变还可以通过向野生型TβRII多肽的序列(对于O-连接的糖基化位点)添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的置换来进行。在糖基化识别位点的第一或第三个氨基酸位置中的一个或两个处的多种氨基酸置换或缺失(和/或第二位置处的氨基酸缺失)导致修饰的三肽序列处的非糖基化。增加TβRII多肽上碳水化合物部分数量的另一种方法是通过糖苷与TβRII多肽的化学或酶促偶联。根据所用的偶联方式，糖可连接至(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基，例如半胱氨酸的游离巯基；(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的游离羟基；(e)芳族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法描述于1987年9月11日公布的WO 87/05330和Aplin和Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306，在此引入作为参考。存在于TβRII多肽上的一个或多个碳水化合物部分的去除可以通过化学法和/或酶促法完成。化学去糖基化可涉及例如将TβRII多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。该处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大部分或全部糖切割，同时使氨基酸序列保持完整。Hakimuddin等. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52和Edge等. (1981) Anal. Biochem. 118:131进一步描述了化学去糖基化。TβRII多肽上碳水化合物部分的酶促切割可以通过使用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现，如Thotakura等.(1987) Meth. Enzymol. 138:350所述。适当时，取决于所用表达系统的类型，可调整TβRII多肽的序列，因为哺乳动物、酵母、昆虫和植物细胞均可引入可受肽的氨基酸序列影响的不同糖基化模式。通常，用于人类的TβRII多肽将在提供适当糖基化的哺乳动物细胞系如HEK293或CHO细胞系中表达，但预期其它哺乳动物表达细胞系，具有工程化糖基化酶的酵母细胞系和昆虫细胞也是有用的。
本公开内容进一步考虑了产生突变体，特别是TβRII多肽的组合突变体的组，以及截短突变体的方法；组合突变体库对于鉴定功能变体序列特别有用。筛选此类组合文库的目的可以是产生例如TβRII多肽变体，其可以充当激动剂或拮抗剂，或者备选地同时具有新的活性。下面提供了各种筛选测定，并且这样的测定可以用于评估变体。例如，可筛选TβRII多肽变体与TβRII配体结合的能力，以防止TβRII配体与TβRII多肽结合或干扰由TβRII配体引起的信号传导。TβRII多肽或其变体的活性还可以在基于细胞或体内的测定中，特别是在实施例中公开的任何测定中测试。
可以产生组合衍生的变体，其相对于包含天然存在的TβRII多肽的胞外结构域的TβRII多肽具有选择性或通常增加的效力。同样，诱变可产生血清半衰期显著不同于相应野生型TβRII多肽的变体。例如，可以使改变的蛋白质对蛋白水解降解或导致天然TβRII多肽破坏或以其它方式消除或失活的其它过程更稳定或更不稳定。可以利用这些变体和编码它们的基因，通过调节TβRII多肽的半衰期来改变TβRII多肽水平。例如，短的半衰期可以引起更短暂的生物效应并且可以允许更严格地控制患者体内的重组TβRII多肽水平。在Fc融合蛋白中，可以在接头(如果有的话)和/或Fc部分中进行突变以改变蛋白质的半衰期。
组合文库可以通过编码多肽文库的基因的简并文库产生，所述多肽各自包含至少一部分潜在的TβRII多肽序列。例如，可以将合成寡核苷酸的混合物酶促连接到基因序列中，使得潜在的TβRII多肽核苷酸序列的简并组可以表达为单个多肽，或者备选地，表达为较大的融合蛋白组(例如用于噬菌体展示)。
有许多方式可以从简并寡核苷酸序列产生潜在的TβRII多肽变体的文库。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行，然后将合成基因连接到合适载体中用于表达。简并寡核苷酸的合成在本领域是众所周知的(参见例如Narang, SA (1983)Tetrahedron 39:3; Itakura等., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd ClevelandSympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura等., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura等., (1984) Science 198:1056;Ike等., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477)。这些技术已被用于其它蛋白质的定向进化中(参见例如, Scott等., (1990) Science 249:386-390; Roberts等., (1992) PNASUSA 89:2429-2433; Devlin等., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla等., (1990)PNAS USA 87: 6378-6382; 以及美国专利号5,223,409, 5,198,346和5,096,815)。
或者，其它形式的诱变可用于产生组合文库。例如，TβRII多肽变体可以通过使用例如丙氨酸扫描诱变等(Ruf等., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang等.,(1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint等., (1993) Gene 137:109-118;Grodberg等., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima等., (1993) J.Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman等., (1991) Biochemistry 30:10832-10838;和Cunningham等., (1989) Science 244:1081-1085),通过接头扫描诱变(Gustin等.,(1993) Virology 193:653-660; Brown等., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652;McKnight等., (1982) Science 232:316); 通过饱和诱变(Meyers等., (1986) Science232:613); 通过PCR诱变(Leung等., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19);或通过随机诱变，包括化学诱变等(Miller等., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics,CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY;和Greener等., (1994) Strategies in MolBiol 7:32-34)从文库产生和分离。接头扫描诱变，特别是在组合环境中，是鉴定截短(生物活性)形式的TβRII多肽的有吸引力的方法。
本领域已知各种各样的技术用于筛选通过点突变和截短制备的组合文库的基因产物，并且就此而言用于筛选具有某种性质的基因产物的cDNA文库。这种技术通常适用于快速筛选由TβRII多肽组合诱变产生的基因文库。用于筛选大基因文库的最广泛使用的技术通常包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用得到的载体文库转化适当的细胞，并且在期望活性的检测有利于相对容易地分离编码其产物被检测的基因的载体的条件下表达组合基因。优选的测定法包括TβRII配体结合测定法和配体介导的细胞信号传导测定法。
在某些实施方案中，除TβRII多肽中天然存在的任何修饰之外，本公开内容的TβRII多肽还可以包含翻译后修饰。这种修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化、PEG化(聚乙二醇)和酰化。结果，修饰的TβRII多肽可含有非氨基酸元件，如聚乙二醇、脂质、单糖或多糖和磷酸。这种非氨基酸元件对TβRII多肽功能性的影响可以如本文对其它TβRII多肽变体所述进行测试。当通过切割新生形式的TβRII多肽在细胞中产生TβRII多肽时，翻译后加工对于蛋白质的正确折叠和/或功能也可能是重要的。不同的细胞(如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK-293)具有此类翻译后活性的特定细胞机器和特征机制，并且可以选择以确保TβRII多肽的正确修饰和加工。
在某些方面，TβRII多肽的功能变体或修饰形式包括具有至少一部分TβRII多肽和一个或多个融合结构域的融合蛋白。这种融合结构域的众所周知的实例包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可以选择融合结构域以赋予期望的性质。例如，一些融合结构域对于通过亲和层析分离融合蛋白特别有用。为了亲和纯化的目的，使用亲和层析的相关基质，例如谷胱甘肽、淀粉酶和镍或钴共轭树脂。许多这样的基质可以以“试剂盒”形式获得，例如可用于(HIS6)融合配偶体的Pharmacia GST纯化系统和QIAexpressTM系统(Qiagen)。作为另一实例，可以选择融合结构域以便于检测TβRII多肽。这种检测结构域的实例包括各种荧光蛋白(例如GFP)以及“表位标签”，其通常是可得到特异性抗体的短肽序列。众所周知的特异性单克隆抗体容易获得的表位标签包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，融合结构域具有蛋白酶切割位点，例如因子Xa或凝血酶，其允许相关蛋白酶部分消化融合蛋白并由此从中释放重组蛋白。然后通过随后的层析分离将释放的蛋白质从融合结构域中分离出来。在某些优选的实施方案中，TβRII多肽与体内稳定TβRII多肽的结构域(“稳定剂”结构域)融合。“稳定”是指增加血清半衰期的任何事物，不管这是由于破坏减少、肾清除减少还是其它药代动力学效应。已知与免疫球蛋白的Fc部分的融合物对广泛范围的蛋白质赋予所需的药代动力学性质。同样，与人血清白蛋白的融合物可赋予期望的性质。可以选择的其它类型的融合结构域包括多聚化(例如，二聚化、四聚化)结构域和功能结构域。
作为具体实例，本公开内容提供了融合蛋白，其包含与三个Fc结构域序列(例如SEQ ID NOs: 19, 20和21以及与SEQ ID NOs: 19, 20和21具有85%, 90%, 91%, 92%,93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性的序列)中的一个融合的TβRII多肽的变体。任选地，Fc结构域在残基例如Asp-265、Lys-322和Asn-434(根据相应的全长IgG编号)处具有一个或多个突变。在某些情况下，具有一个或多个这些突变(例如Asp-265突变)的突变Fc结构域相对于野生型Fc结构域具有降低的与Fcγ受体结合的能力。在其它情况下，具有一个或多个这些突变(例如Asn-434突变)的突变Fc结构域相对于野生型Fc结构域具有增加的与MHC I类相关Fc受体(FcRN)结合的能力。
应理解可以以与期望的功能一致的任何方式排列融合蛋白的不同元件。例如，TβRII多肽可以置于异源结构域的C末端，或者备选地，异源结构域可以置于TβRII多肽的C末端。TβRII多肽结构域和异源结构域不需要在融合蛋白中相邻，并且其它结构域或氨基酸序列可以包括在结构域的C-或N-末端或结构域之间。
如本文所用，术语“免疫球蛋白Fc结构域”或简称“Fc”应理解为是指免疫球蛋白链恒定区，优选免疫球蛋白重链恒定区或其部分的羧基端部分。例如，免疫球蛋白Fc区可以包含1)CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，2)CH1结构域和CH2结构域，3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，或5)两个或更多个结构域和免疫球蛋白铰链区的组合。在一个优选的实施方案中，免疫球蛋白Fc区至少包含免疫球蛋白铰链区、CH2结构域和CH3结构域，并且优选缺少CH1结构域。
在一个实施方案中，重链恒定区来源的免疫球蛋白的种类是IgG(Igγ)(γ亚类1、2、3或4)。可以使用其它类别的免疫球蛋白，IgA (Igα), IgD (Igδ), IgE (Igε)和IgM (Igμ)。合适的免疫球蛋白重链恒定区的选择在美国专利号5,541,087和5,726,044中详细讨论。认为来自某些免疫球蛋白类别和亚类的特定免疫球蛋白重链恒定区序列的选择以实现特定结果在本领域技术水平内。编码免疫球蛋白Fc区的DNA构建体的部分优选包含铰链结构域的至少一部分，并且优选包含Fcγ的CH3结构域或IgA、IgD、IgE或IgM中的任何一个中的同源结构域的至少一部分。
此外，预期免疫球蛋白重链恒定区内氨基酸的置换或缺失可用于实施本文公开的方法和组合物。一个实例是在上部CH2区引入氨基酸置换以产生对Fc受体具有降低的亲和力的Fc变体(Cole等. (1997) J. Immunol. 159:3613)。
本申请进一步提供具有工程化或变体Fc区的TβRII-Fc融合蛋白。此类抗体和Fc融合蛋白可用于例如调节效应子功能，例如抗原依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。另外，所述修饰可以提高抗体和Fc融合蛋白的稳定性。抗体和Fc融合蛋白的氨基酸序列变体通过将合适的核苷酸改变引入DNA或通过肽合成来制备。这样的变体包括，例如，本文公开的抗体和Fc融合蛋白的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或置换。只要最终构建体具有所需的特征，就可以进行缺失、插入和置换的任意组合，以得到最终构建体。氨基酸改变还可以改变抗体和Fc融合蛋白的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。
可以通过在氨基酸序列中引入改变来产生具有降低的效应子功能的抗体和Fc融合蛋白，包括但不限于Bluestone等描述的Ala-Ala突变(参见WO 94/28027和WO 98/47531;也参见Xu等. 2000 Cell Immunol 200; 16-26)。因此，在某些实施方案中，具有包括Ala-Ala突变的恒定区内的突变的本公开内容的抗体和Fc融合蛋白可用于减少或消除效应子功能。根据这些实施方案，抗体和Fc融合蛋白可包含234位至丙氨酸的突变或235位至丙氨酸的突变或其组合。在一个实施方案中，抗体或Fc融合蛋白包含IgG4构架，其中Ala-Ala突变将描述234位从苯丙氨酸至丙氨酸的突变和/或235位从亮氨酸至丙氨酸的突变。在另一个实施方案中，抗体或Fc融合蛋白包含IgG1构架，其中Ala-Ala突变将描述234位从亮氨酸至丙氨酸的突变和/或235位从亮氨酸至丙氨酸的突变。抗体或Fc融合蛋白可以备选地或另外地携带其它突变，包括CH2结构域中的点突变K322A (Hezareh等. 2001 J Virol. 75:12161-8)。
在具体的实施方案中，可修饰抗体或Fc融合蛋白以增强或抑制补体依赖性细胞毒性(CDC)。调节的CDC活性可以通过在Fc区中引入一个或多个氨基酸置换、插入或缺失来实现(参见例如美国专利号6,194,551)。备选地或另外地，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，由此允许在该区域中形成链间二硫键。由此产生的同二聚体抗体可具有改善的或降低的内化能力和/或增加或减少的补体介导的细胞杀伤。参见Caron等., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)和Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992), WO99/51642, Duncan& Winter Nature 322: 738-40 (1988); 美国专利号5,648,260; 美国专利号5,624,821;和WO94/29351。
在某些实施方案中，本公开内容可获得分离和/或纯化形式的TβRII多肽，其与其它蛋白质和/或其它TβRII多肽物类分离，或另外基本上不含(例如至少80%, 90%, 95%,96%, 97%, 98%或99%不含)其它蛋白质和/或其它TβRII多肽物类。通常通过从重组核酸表达产生TβRII多肽。
在某些实施方案中，本公开内容包括编码可溶性TβRII多肽的核酸，其包含TβRII蛋白的细胞外部分的编码序列。在进一步的实施方案中，本公开内容还涉及包含此类核酸的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本公开内容的多肽可以在细菌细胞例如大肠杆菌、昆虫细胞(例如使用杆状病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞中表达。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。因此，本公开内容的一些实施方案进一步涉及产生TβRII多肽的方法。
B. 编码TβRII多肽的核酸
在某些方面，本公开内容提供编码任何TβRII多肽，包括本文公开的片段、功能变体和融合蛋白的分离的和/或重组的核酸。SEQ ID NO: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38,40, 42, 44和102编码与IgG2 Fc或N末端截短的IgG1 Fc结构域融合的TβRII胞外结构域的变体。主题核酸可以是单链或双链的。这样的核酸可以是DNA或RNA分子。这些核酸可用于例如制备TβRII多肽的方法或作为直接治疗剂(例如，在反义、RNAi或基因治疗方法中)。
在某些方面，编码TβRII多肽的主题核酸进一步被理解为包括为SEQ ID NOs: 26,28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44和102的变体的核酸。变体核苷酸序列包括通过一个或多个核苷酸置换、添加或缺失而不同的序列，例如等位基因变体。
在某些实施方案中，本公开内容提供分离的或重组的核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NOs: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44和102具有至少80%, 85%, 90%,91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性。本领域普通技术人员将会理解，与SEQ ID NOs: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44和102互补的核酸序列以及SEQ ID NOs: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44和102的变体也在本公开内容的范围内。在进一步的实施方案中，本公开内容的核酸序列可以是分离的、重组的和/或与异源核苷酸序列融合或在DNA文库中。
在其它实施方案中，本公开内容的核酸还包括在高度严格条件下与SEQ ID NOs:26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44和102指定的核苷酸序列、SEQ ID NOs: 26,28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44和102的互补序列，或其片段杂交的核苷酸序列。如上所述，本领域的普通技术人员将容易理解，促进DNA杂交的合适严格性条件可以变化。例如，可以在约45℃下在6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行杂交，然后在50℃下2.0×SSC洗涤。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以选自50℃时约2.0×SSC的低严格性至50℃时约0.2×SSC的高严格性。另外，洗涤步骤中的温度可以从室温约22℃的低严格性条件增加到约65℃的高严格性条件。温度和盐都可以改变，或者温度或盐浓度可以保持恒定，而另一个变量改变。在一些实施方案中，本公开内容提供核酸，其在室温下在6×SSC的低严格性条件下杂交，然后在室温以2×SSC洗涤。
由于遗传密码中的简并性不同于SEQ ID NOs: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38,40, 42, 44和102所示核酸的分离核酸也在本公开内容的范围内。例如，许多氨基酸由多于一个三联体标明。指定相同氨基酸的密码子或同义词(例如，CAU和CAC是组氨酸的同义词)可导致“沉默”突变，其不影响蛋白质的氨基酸序列。然而，预期在哺乳动物细胞中存在确实导致主题蛋白质的氨基酸序列变化的DNA序列多态性。本领域技术人员会理解，由于天然等位基因变异，编码特定蛋白质的核酸的一个或多个核苷酸(至多约3-5％的核苷酸)的这些变异可能存在于给定物种的个体中。任何和所有这些核苷酸变异和所得到的氨基酸多态性都在本公开内容的范围内。
本领域技术人员将会理解，基于TβRII的长同种型的相应变体将包括编码25个氨基酸插入和在插入的C末端侧翼位置的保守Val-Ile置换的核苷酸序列。还将认识到，基于TβRII的长(A)或短(B)同种型的相应变体将包括变体核苷酸序列，其在对于天然存在TβRII同种型C所述的相同位置处包含编码36个氨基酸插入(SEQ ID NO: 18)的108个核苷酸插入(参见实施例)。
在某些实施方案中，本公开内容的重组核酸可以与表达构建体中的一个或多个调控核苷酸序列可操作地连接。调控核苷酸序列通常适合于用于表达的宿主细胞。用于多种宿主细胞的许多类型的合适的表达载体和合适的调控序列在本领域中已知。通常，所述一个或多个调控核苷酸序列可包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。如本领域已知的组成型或诱导型启动子是本公开内容所考虑的。启动子可以是天然存在的启动子或组合多于一个启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可以存在于附加体例如质粒上的细胞中，或者表达构建体可以插入染色体中。在优选的实施方案中，表达载体含有选择标记基因以允许选择转化的宿主细胞。选择标记基因在本领域中是众所周知的，并且将随着所用的宿主细胞而变化。
在本文公开的某些方面，主题核酸在包含编码TβRII多肽的核苷酸序列的表达载体中提供，并且可操作地连接至至少一种调控序列。调控序列是本领域公认的并且被选择以指导TβRII多肽的表达。因此，术语调控序列包括启动子、增强子和其它表达控制元件。示例性调控序列描述于Goeddel; Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Academic Press, San Diego, CA (1990)。例如，在这些载体中可以使用与其可操作连接时控制DNA序列表达的各种各样表达控制序列中的任何一种来表达编码TβRII多肽的DNA序列。这些有用的表达控制序列包括例如SV40的早期和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、RSV启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、其表达是由T7RNA聚合酶指导的T7启动子、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子例如Pho5、酵母α-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多角体启动子和已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其它序列及其各种组合。应该理解，表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择和/或期望表达的蛋白质的类型等因素。此外，还应考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力以及载体编码的任何其它蛋白质(例如抗生素标记)的表达。
包括在本公开内容中的重组核酸可通过将克隆的基因或其部分连接到适于在原核细胞、真核细胞(酵母、禽、昆虫或哺乳动物)中或两者中表达的载体中来产生。用于产生重组TβRII多肽的表达载体包括质粒和其它载体。例如，合适的载体包括以下类型的质粒：用于在原核细胞例如大肠杆菌中表达的pBR322衍生质粒、pEMBL衍生质粒、pEX衍生质粒、pBTac衍生质粒和pUC衍生质粒。
一些哺乳动物表达载体同时含有促进载体在细菌中增殖的原核序列和一个或多个在真核细胞中表达的真核转录单元。pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt,pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo和pHyg衍生的载体是适于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。这些载体中的一些用来自细菌质粒(例如pBR322)的序列修饰，以促进原核细胞和真核细胞中的复制和耐药性选择。或者，可以使用诸如牛乳头瘤病毒(BPV-1)或爱泼斯坦-巴尔病毒(pHEBo、pREP衍生的和p205)的病毒的衍生物以在真核细胞中瞬时表达蛋白质。其它病毒(包括逆转录病毒)表达系统可以在以下基因治疗递送系统的描述中找到。用于制备质粒和转化宿主生物体的各种方法在本领域中是众所周知的。对于原核和真核细胞的其它合适的表达系统以及一般的重组程序，参见MolecularCloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch和Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)。在一些情况下，可能需要通过使用杆状病毒表达系统来表达重组多肽。这样的杆状病毒表达系统的实例包括pVL衍生的载体(例如pVL1392, pVL1393和pVL941), pAcUW衍生的载体(例如pAcUW1)和pBlueBac衍生的载体(例如含ß-gal的pBlueBac III)。
在某些实施方案中，载体经设计以在CHO细胞中生产主题TβRII多肽，例如Pcmv-Script载体(Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4载体(Invitrogen, Carlsbad,Calif.)和pCI-neo载体(Promega, Madison, Wisc.)。在优选的实施方案中，载体经设计以在HEK-293细胞中生产主题TβRII多肽。显而易见，主题基因构建体可用于在培养中繁殖的细胞中引起主题TβRII多肽的表达，例如产生用于纯化的蛋白质，包括融合蛋白或变体蛋白。
本公开内容还涉及用重组基因包括一种或多种主题TβRII多肽的编码序列(例如SEQ ID NOs: 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44和102)转染的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本文公开的TβRII多肽可以在细菌细胞例如大肠杆菌、昆虫细胞(例如使用杆状病毒表达系统)，酵母或哺乳动物细胞中表达。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
因此，本公开内容还涉及生产主题TβRII多肽的方法。例如，用编码TβRII多肽的表达载体转染的宿主细胞可以在合适的条件下培养以使TβRII多肽发生表达。TβRII多肽可以从含有TβRII多肽的细胞和培养基的混合物中分泌和分离。或者，可以将TβRII多肽保留在细胞质或膜部分中，收获细胞，裂解并分离蛋白质。细胞培养物包括宿主细胞和培养基。用于细胞培养的合适培养基在本领域中是众所周知的。使用本领域已知的用于纯化蛋白质的技术，包括离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤、电泳、用对TβRII多肽特定表位具有特异性的抗体的免疫亲和纯化，和用结合与TβRII多肽融合的结构域的试剂的亲和纯化(例如蛋白A柱可用于纯化TβRII-Fc融合物)，可以从细胞培养基、宿主细胞或两者中分离主题TβRII多肽。在一个优选的实施方案中，TβRII多肽是含有促进其纯化的结构域的融合蛋白。作为实例，纯化可以通过一系列柱层析步骤实现，包括例如以任何顺序的以下三种或更多种：蛋白A层析、Q琼脂糖凝胶层析、苯基琼脂糖凝胶层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以通过病毒过滤和缓冲液交换完成。
在另一个实施方案中，编码重组TβRII多肽的期望部分的N末端的纯化前导序列(例如多-(His)/肠激酶切割位点序列)的融合基因可以允许通过使用Ni2+金属树脂的亲和层析，纯化表达的融合蛋白。然后可以通过用肠激酶处理除去纯化前导序列以提供纯化的TβRII多肽(例如参见Hochuli等., (1987) J. Chromatography 411:177;和Janknecht等.,PNAS USA 88:8972)。
制备融合基因的技术是众所周知的。基本上，编码不同多肽序列的各种DNA片段的连接根据常规技术进行，使用平末端或交错末端进行连接，限制性内切酶消化以提供适当的末端，视情况填入粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不希望的连接和酶促连接。在另一个实施方案中，融合基因可以通过常规技术合成，包括自动DNA合成仪。或者，可以使用在两个连续基因片段之间产生互补突出端的锚定引物进行基因片段的PCR扩增，其随后可经退火以产生嵌合基因序列(参见例如Current Protocols in Molecular Biology, eds.Ausubel等., John Wiley & Sons: 1992)。
作为TβRII、TGFβ1和TGFβ3拮抗剂的核酸化合物的类别的实例包括反义核酸、RNAi构建体和催化性核酸构建体。核酸化合物可以是单链或双链的。双链化合物还可以包括突出端或非互补性区域，其中链中的一个或另一个是单链的。单链化合物可以包括自身互补性区域，意思是该化合物形成具有双螺旋结构区域的所谓的“发夹”或“茎环”结构。核酸化合物可以包含与由全长TβRII核酸序列或配体核酸序列的不超过1000, 不超过500, 不超过250, 不超过100或不超过50, 35, 30, 25, 22, 20或18个核苷酸组成的区域互补的核苷酸序列。互补性区域优选为至少8个核苷酸，并且任选地至少10或至少15个核苷酸，例如15至25个核苷酸。互补性区域可以落在目标转录物的内含子、编码序列或非编码序列内，例如编码序列部分。通常，核酸化合物的长度将为约8至约500个核苷酸或碱基对，例如约14至约50个核苷酸。核酸可以是DNA(特别用作反义)、RNA或RNA: DNA杂合物。任何一条链都可以包含DNA和RNA的混合物，以及不易被分类为DNA或RNA的修饰形式。同样，双链化合物可以是DNA:DNA, DNA:RNA或RNA:RNA，并且任何一条链也可以包括DNA和RNA的混合物，以及不易被分类为DNA或RNA的修饰形式。核酸化合物可以包括多种修饰中的任一种，包括对主链(天然核酸中的糖-磷酸部分，包括核苷酸间连键)或碱基部分(天然核酸的嘌呤或嘧啶部分)的一种或多种修饰。反义核酸化合物优选具有约15至约30个核苷酸的长度，并且通常含有一种或多种修饰以改善特征，例如血清中、细胞中或可能递送化合物的地方的稳定性，例如口服递送化合物情况下的胃和对于吸入化合物的肺。在RNAi构建体的情况下，与目标转录本互补的链通常是RNA或其修饰。另一条链可以是RNA、DNA或任何其它变体。双链或单链“发夹”RNAi构建体的双链体部分优选具有18至40个核苷酸的长度，并且任选长度为约21至23个核苷酸，只要其用作Dicer底物。催化或酶促核酸可以是核酶或DNA酶，也可以含有修饰形式。当在生理条件下和在无义或有义对照几乎没有影响或无影响的浓度下与细胞接触时，核酸化合物可以抑制靶标表达约50％、75％、90％或更多。用于测试核酸化合物的作用的优选浓度是1、5和10微摩尔。还可以测试核酸化合物对例如血管生成的作用。
C. 抗体拮抗剂
在某些方面，根据本文公开的方法和用途使用的TβRII拮抗剂是抗体(TβRII拮抗剂抗体)或抗体组合。TβRII拮抗剂抗体或抗体组合可以抑制和/或结合例如一种或多种TβRII配体(例如TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)、TβRII受体、TβRII相关的I型受体(例如ALK5)和/或TβRII共同受体(例如β聚糖)。在一些实施方案中，在体外或基于细胞的测定中确定TβRII拮抗剂抗体或抗体组合抑制信号传导(例如Smad信号传导)和/或与靶标结合的能力，包括例如本文描述的那些。如本文所述，TβRII拮抗剂抗体或拮抗剂抗体组合可以单独使用或与一种或多种另外的支持疗法或活性剂组合使用以治疗、预防骨髓增生性病症(例如骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板增多症)和/或Janus激酶相关病症(例如JAK2激酶相关病症)或骨髓增生性病症和/或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症，或降低其进展速率和/或严重性。
在某些实施方案中，TβRII拮抗剂抗体或抗体组合是至少抑制TGFβ1的抗体。因此，在一些实施方案中，TβRII拮抗剂抗体或抗体组合至少结合TGFβ1。如本文所用，TGFβ1抗体(抗TGFβ1抗体)通常是指能够以足够的亲和力结合TGFβ1的抗体，使得该抗体可用作靶向TGFβ1的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗TGFβ1抗体与无关的非TGFβ1蛋白的结合程度为抗体与TGFβ1结合的小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于1％，例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，抗TGFβ1抗体结合在来自不同物种的TGFβ1中保守的TGFβ1的表位。在某些优选的实施方案中，抗TGFβ1抗体结合人TGFβ1。在一些实施方案中，TGFβ1抗体可抑制TGFβ1与I型、II型和/或共同受体(例如TβRII、ALK5和/或β聚糖)结合并因此抑制TGFβ1信号传导(例如Smad信号传导)。应注意的是，TGFβ1与TGFβ2和TGFβ3具有一定的序列同源性。因此，在一些实施方案中，结合TGFβ1的抗体也可以结合TGFβ2和/或TGFβ3。在一些实施方案中，本公开内容涉及结合TGFβ1并进一步结合例如一种或多种另外的TβRII配体(例如TGFβ2、TGFβ3或TGFβ2和TGFβ3)、一种或多种I型和/或II型受体(例如TβRII和ALK5)和/或一种或多种共同受体(例如β聚糖)的多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其用途。在一些实施方案中，结合TGFβ1的多特异性抗体不结合TGFβ2或基本上不结合TGFβ2(例如以大于1×10-7M的KD结合TGFβ2或具有相对适中的结合，例如约1×10-8M或约1×10-9M)。在一些实施方案中，结合TGFβ1的多特异性抗体进一步结合TGFβ3但不结合TGFβ2或基本上不结合TGFβ2(例如以大于1×10-7M的KD结合TGFβ2或具有相对适中的结合，例如约1×10-8M或约1×10-9M)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体组合以及其用途，其中抗体组合包含TGFβ1抗体和一种或多种结合例如一种或多种另外的TβRII配体(例如TGFβ2、TGFβ3或TGFβ2和TGFβ3)，一种或多种I型和/或II型受体(例如TβRII和ALK5)和/或一种或多种共同受体(例如β聚糖)的另外的抗体。在一些实施方案中，包含TGFβ1抗体的抗体组合不包含TGFβ2抗体。在一些实施方案中，包含TGFβ1抗体的抗体组合还包含TGFβ3抗体但不包含TGFβ2抗体。
在某些实施方案中，TβRII拮抗剂抗体或抗体组合是至少抑制TGFβ2的抗体。因此，在一些实施方案中，TβRII拮抗剂抗体或抗体组合至少结合TGFβ2。如本文所用，TGFβ2抗体(抗TGFβ2抗体)通常是指能够以足够的亲和力结合TGFβ2的抗体，使得该抗体可用作靶向TGFβ2的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗TGFβ2抗体与无关的非TGFβ2蛋白的结合程度为抗体与TGFβ2结合的小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于1％，例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，抗TGFβ2抗体结合在来自不同物种的TGFβ2中保守的TGFβ2的表位。在某些优选的实施方案中，抗TGFβ2抗体结合人TGFβ2。在一些实施方案中，TGFβ2抗体可抑制TGFβ2与I型、II型和/或共同受体(例如TβRII、ALK5和/或β聚糖)结合并因此抑制TGFβ2信号传导(例如Smad信号传导)。应注意的是，TGFβ2与TGFβ1和TGFβ3具有一定的序列同源性。因此，在一些实施方案中，结合TGFβ2的抗体也可以结合TGFβ1和/或TGFβ3。在一些实施方案中，本公开内容涉及结合TGFβ2并进一步结合例如一种或多种另外的TβRII配体(例如TGFβ1、TGFβ3或TGFβ1和TGFβ3)、一种或多种I型和/或II型受体(例如TβRII和ALK5)和/或一种或多种共同受体(例如β聚糖)的多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体组合以及其用途，其中抗体组合包含TGFβ2抗体和一种或多种结合例如一种或多种另外的TβRII配体(例如TGFβ1、TGFβ3或TGFβ1和TGFβ3)，一种或多种I型和/或II型受体(例如TβRII和ALK5)和/或一种或多种共同受体(例如β聚糖)的另外的抗体。
在某些实施方案中，TβRII拮抗剂抗体或抗体组合是至少抑制TGFβ3的抗体。因此，在一些实施方案中，TβRII拮抗剂抗体或抗体组合至少结合TGFβ3。如本文所用，TGFβ3抗体(抗TGFβ3抗体)通常是指能够以足够的亲和力结合TGFβ3的抗体，使得该抗体可用作靶向TGFβ3的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗TGFβ3抗体与无关的非TGFβ3蛋白的结合程度为抗体与TGFβ3结合的小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于1％，例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，抗TGFβ3抗体结合在来自不同物种的TGFβ3中保守的TGFβ3的表位。在某些优选的实施方案中，抗TGFβ3抗体结合人TGFβ3。在一些实施方案中，TGFβ3抗体可抑制TGFβ3与I型、II型和/或共同受体(例如TβRII、ALK5和/或β聚糖)结合并因此抑制TGFβ3信号传导(例如Smad信号传导)。应注意的是，TGFβ3与TGFβ2和TGFβ1具有一定的序列同源性。因此，在一些实施方案中，结合TGFβ3的抗体也可以结合TGFβ2和/或TGFβ1。在一些实施方案中，本公开内容涉及结合TGFβ3并进一步结合例如一种或多种另外的TβRII配体(例如TGFβ2、TGFβ1或TGFβ2和TGFβ1)、一种或多种I型和/或II型受体(例如TβRII和ALK5)和/或一种或多种共同受体(例如β聚糖)的多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其用途。在一些实施方案中，结合TGFβ3的多特异性抗体不结合TGFβ2或基本上不结合TGFβ2(例如以大于1×10-7M的KD结合TGFβ2或具有相对适中的结合，例如约1×10-8M或约1×10-9M)。在一些实施方案中，结合TGFβ3的多特异性抗体进一步结合TGFβ3但不结合TGFβ2或基本上不结合TGFβ2(例如以大于1×10-7M的KD结合TGFβ2或具有相对适中的结合，例如约1×10-8M或约1×10-9M)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体组合以及其用途，其中抗体组合包含TGFβ3抗体和一种或多种结合例如一种或多种另外的TβRII配体(例如TGFβ2、TGFβ1或TGFβ2和TGFβ1)，一种或多种I型和/或II型受体(例如TβRII和ALK5)和/或一种或多种共同受体(例如β聚糖)的另外的抗体。在一些实施方案中，包含TGFβ3抗体的抗体组合不包含TGFβ2抗体。在一些实施方案中，包含TGFβ3抗体的抗体组合还包含TGFβ1抗体但不包含TGFβ2抗体。
在某些方面，TβRII拮抗剂抗体或抗体组合是至少抑制TβRII的抗体。因此，在一些实施方案中，TβRII拮抗剂抗体或抗体组合至少结合TβRII。如本文所用，TβRII抗体(抗TβRII抗体)通常是指能够以足够的亲和力结合TβRII的抗体，使得该抗体可用作靶向TβRII的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗TβRII抗体与无关的非TβRII蛋白的结合程度为抗体与TβRII结合的小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定法测量的。在某些实施方案中，抗TβRII抗体结合在来自不同物种的TβRII中保守的TβRII的表位。在某些优选的实施方案中，抗TβRII抗体结合人TβRII。在一些实施方案中，抗TβRII抗体可抑制一种或多种TβRII配体[例如TGFβ1; TGFβ2; TGFβ3; TGFβ1和TGFβ3; TGFβ1和TGFβ2; TGFβ2和TGFβ3;或TGFβ1, TGFβ2和TGFβ3]与TβRII结合。在一些实施方案中，抗TβRII抗体是结合TβRII和一种或多种TβRII配体[例如TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3]、I型受体(例如ALK5)和/或共同受体(例如β聚糖)的多特异性抗体(例如双特异性抗体)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体组合以及其用途，其中抗体组合包含抗TβRII抗体和一种或多种结合例如一种或多种TβRII配体(例如TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)，I型受体(例如ALK5)和/或共同受体(例如β聚糖)的另外的抗体。
在某些方面，TβRII拮抗剂抗体或抗体组合是至少抑制ALK5的抗体。因此，在一些实施方案中，TβRII拮抗剂抗体或抗体组合至少结合ALK5。如本文所用，ALK5抗体(抗ALK5抗体)通常是指能够以足够的亲和力结合ALK5的抗体，使得该抗体可用作靶向ALK5的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗ALK5抗体与无关的非ALK5蛋白的结合程度为抗体与ALK5结合的小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定法测量的。在某些实施方案中，抗ALK5抗体结合在来自不同物种的ALK5中保守的ALK5的表位。在某些优选的实施方案中，抗ALK5抗体结合人ALK5。在一些实施方案中，抗ALK5抗体可抑制一种或多种TβRII配体[例如TGFβ1; TGFβ2; TGFβ3; TGFβ1和TGFβ3; TGFβ1和TGFβ2; TGFβ2和TGFβ3;或TGFβ1, TGFβ2和TGFβ3]与ALK5结合。在一些实施方案中，抗ALK5抗体是结合ALK5和一种或多种TβRII配体[例如TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3]、I型受体(例如TβRII)和/或共同受体(例如β聚糖)的多特异性抗体(例如双特异性抗体)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体组合以及其用途，其中抗体组合包含抗ALK5抗体和一种或多种结合例如一种或多种TβRII配体(例如TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)，II型受体(例如TβRII)和/或共同受体(例如β聚糖)的另外的抗体。
在某些方面，TβRII拮抗剂抗体或抗体组合是至少抑制β聚糖的抗体。因此，在一些实施方案中，TβRII拮抗剂抗体或抗体组合至少结合β聚糖。如本文所用，β聚糖抗体(抗β聚糖抗体)通常是指能够以足够的亲和力结合β聚糖的抗体，使得该抗体可用作靶向β聚糖的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗β聚糖抗体与无关的非β聚糖蛋白的结合程度为抗体与β聚糖结合的小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％，例如通过放射免疫测定法(RIA)、Biacore或其它蛋白-蛋白相互作用或结合亲和力测定法测量的。在某些实施方案中，抗β聚糖抗体结合在来自不同物种的β聚糖中保守的β聚糖的表位。在某些优选的实施方案中，抗β聚糖抗体结合人β聚糖。在一些实施方案中，抗β聚糖抗体可抑制一种或多种TβRII配体[例如TGFβ1; TGFβ2; TGFβ3; TGFβ1和TGFβ3; TGFβ1和TGFβ2; TGFβ2和TGFβ3;或TGFβ1, TGFβ2和TGFβ3]与β聚糖结合。在一些实施方案中，抗β聚糖抗体是结合β聚糖和一种或多种TβRII配体[例如TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3]、I型受体(例如ALK5)和/或II型受体(例如TβRII)的多特异性抗体(例如双特异性抗体)。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体组合以及其用途，其中抗体组合包含抗β聚糖抗体和一种或多种结合例如一种或多种TβRII配体(例如TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)，I型受体(例如ALK5)和/或II型受体(例如TβRII)的另外的抗体。
术语抗体在本文中以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性。抗体片段是指非完整抗体的分子，其包含与完整抗体所结合的抗原结合的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 双抗体(diabodies); 线性抗体; 单链抗体分子(例如scFv);和由抗体片段形成的多特异性抗体。参见例如Hudson等. (2003) Nat. Med. 9:129-134; Plückthun, inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg和Moore eds.,(Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); WO 93/16185;和U.S. Pat. Nos.5,571,894, 5,587,458和5,869,046。本文公开的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在某些实施方案中，本公开内容的抗体包含与其连接并能够被检测的标记(例如，标记可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。在优选的实施方案中，本公开内容的抗体是分离的抗体。双抗体是具有可以是二价或双特异性的两个抗原结合位点的抗体片段。参见例如EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson等. (2003) Nat. Med. 9:129-134 (2003);和Hollinger等. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448。三抗体(Triabodies)和四抗体(tetrabodies)也描述于Hudson等. (2003) Nat. Med. 9:129-134。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。参见，例如，美国专利号6,248,516。如本文所述，可以通过各种技术来制备抗体片段，所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的产生。
本文的抗体可以是任何类别。抗体的类别是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域称为α、δ、ε、γ和μ。
一般而言，用于本文公开的方法中的抗体特异性结合其靶抗原，优选具有高结合亲和力。亲和力可以表示为KD值并反映内在结合亲和力(例如，具有最小的亲合力效应)。通常，体外测量结合亲和力，无论是在无细胞或细胞相关的环境中。可以使用本领域已知的许多测定法中的任一种，包括本文公开的测定法来获得结合亲和力测量值，包括例如表面等离子体共振(BiacoreTM测定法)、放射性标记的抗原结合测定法(RIA)和ELISA。在一些实施方案中，本公开内容的抗体与其靶抗原(例如TGFβ1、TGFβ2、TGFβ2、ALK5、β聚糖和TβRII)结合，其KD为1x 10-7或更强, 1x10-8或更强, 1x10-9或更强, 1x10-10或更强, 1x10-11或更强,1x10-12或更强, 1x10-13或更强或1x10-14或更强。
在某些实施方案中，KD通过RIA测量，用Fab形式的目的抗体及其靶抗原进行，如下述测定所述。Fab对抗原的溶液结合亲和力通过在滴定系列的未标记抗原存在下用最小浓度的放射性标记的抗原(例如125I标记的)平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板俘获结合的抗原而测量[参见，例如Chen等. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881]。为了建立测定的条件，用捕获性抗Fab抗体(例如来自Cappel Labs)包被(例如过夜)多孔板(例如来自Thermo Scientific的MICROTITER®)，并且随后用牛血清白蛋白封闭，优选在室温下(例如约23℃)。在非吸附板中，放射性标记的抗原与连续稀释的目的Fab混合[例如与Presta等.,(1997) Cancer Res. 57:4593-4599的抗VEGF抗体, Fab-12评价一致]。然后孵育目的Fab，优选过夜，但孵育可以持续较长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕获板以进行孵育，优选在室温下约1小时。然后去除溶液并将板洗涤数次，优选用聚山梨酯20和PBS混合物洗涤。当板干燥后，加入闪烁体(例如来自Packard的MICROSCINT®)，并在γ计数器(例如来自Packard的TOPCOUNT®)上计数板。
根据另一个实施方案，使用表面等离子体共振测定法，使用例如BIACORE®2000或BIACORE® 3000 (Biacore, Inc., Piscataway, N.J.)以约10个反应单位(RU)，用固定抗原CM5芯片来测量KD。简言之，根据供应商的说明书，用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,Biacore, Inc.)。例如，在以5μl/分钟的流速注射之前，抗原可以用10mM乙酸钠，pH4.8稀释至5μg/ ml(约0.2μM)，以实现偶联蛋白的约10个反应单位(RU)。注射抗原后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，将Fab的两倍系列稀释液(0.78nM至500nM)以约25μl/分钟的流速注入含有0.05％聚山梨酯20 (TWEEN-20®) (表面活性剂)(PBST)的PBS中。结合速率(kon)和解离速率(koff)通过同时拟合结合和解离传感图，使用例如简单的一对一Langmuir结合模型(BIACORE® Evaluation Software version 3.2)来计算。平衡解离常数(KD)计算为比率koff / kon [参见例如Chen等., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881]。如果通过上述表面等离子体共振测定法测定的结合速率超过例如106 M-1 s-1，则可以通过使用在PBS中在递增浓度的抗原存在下测量20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减少的荧光淬灭技术来确定结合速率(例如激发= 295nm;发射= 340nm，16nm带通)，如在光谱仪例如停-流配备的分光光度计(Aviv Instruments)或具有搅拌比色皿的8000-系列SLM-AMINCO®分光光度计(ThermoSpectronic)测量的。
TβRII、ALK5、β聚糖、TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的核酸和氨基酸序列，特别是人序列在本领域是众所周知的，因此根据本公开内容使用的抗体拮抗剂可以由技术人员基于本领域的知识和本文提供的教导常规地制备。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。嵌合抗体指其中重链和/或轻链的一部分来自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来自不同来源或物种的抗体。某些嵌合抗体描述于，例如美国专利号4,816,567;和Morrison等., (1984) Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 81:6851-6855。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物如猴的可变区)和人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变。通常，嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本文提供的嵌合抗体是人源化抗体。人源化抗体是指包含来自非人高变区(HVR)的氨基酸残基和来自人构架区(FR)的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个，并且通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且全部或基本上全部的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。
人源化抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson (2008) Front.Biosci. 13:1619-1633并进一步描述于例如Riechmann等., (1988) Nature 332:323-329; Queen等. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; 美国专利号5,821,337, 7,527,791, 6,982,321和7,087,409; Kashmiri等., (2005) Methods 36:25-34 [描述SDR (a-CDR)嫁接]; Padlan, Mol. Immunol. (1991) 28:489-498 (描述"表面重塑"); Dall'Acqua等. (2005) Methods 36:43-60 (描述"FR改组"); Osbourn等.(2005) Methods 36:61-68;和Klimka等. Br. J. Cancer (2000) 83:252-260 (描述FR改组的“引导选择”方法)。
可用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最适合”方法选择的构架区[参见例如Sims等. (1993) J. Immunol. 151:2296 ];衍生自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的构架区[参见例如Carter等. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:4285;和Presta等. (1993) J. Immunol., 151:2623];人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区[参见例如Almagro和Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633];和来源于筛选FR文库的构架区[参见例如Baca et cd., (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684;和Rosok et cd., (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618]。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是人抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术来生产。人抗体一般性描述于Dijk和van de Winkel (2001) Curr. Opin.Pharmacol. 5: 368-74和Lonberg (2008) Curr. Opin. Immunol. 20:450-459。
人抗体可以通过将免疫原(例如TβRII、ALK5、β聚糖、TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3多肽)给予转基因动物，其已被修饰以响应抗原攻击而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。这些动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，其替代内源性免疫球蛋白基因座，或者其存在于染色体外或随机整合到动物染色体中。在这种转基因动物中，内源性免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见例如Lonberg(2005) Nat. Biotechnol. 23:1117-1125; 美国专利号6,075,181和6,150,584 (描述XENOMOUSE™技术); 美国专利号5,770,429 (描述HuMab®技术); 美国专利号7,041,870(描述K-M MOUSE®技术);和美国专利申请公开号2007/0061900 (描述VelociMouse®技术)。例如，可以通过与不同的人恒定区组合来进一步修饰由这些动物产生的完整抗体的人可变区。
本文提供的人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系[参见例如Kozbor J. Immunol.,(1984) 133: 3001; Brodeur等. (1987) Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York;和Boerner等.(1991) J. Immunol., 147: 86]。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等.,(2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562。另外的方法包括例如描述于美国专利号7,189,826 (描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人类IgM抗体)和Ni, XiandaiMianyixue (2006) 26(4):265-268 (2006) (描述人-人杂交瘤)。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein (2005) Histol. Histopathol., 20(3):927-937(2005)和Vollmers和Brandlein (2005) Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 27(3):185-91。
本文提供的人抗体也可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生。然后可以将这样的可变结构域序列与期望的人恒定域组合。本文描述了用于从抗体文库选择人抗体的技术。
例如，可以通过筛选组合文库中具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本公开内容的抗体。本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选文库中具有所需结合特征的抗体。例如，这样的方法综述于例如Hoogenboom等. (2001) in Methods inMolecular Biology 178:1-37, O'Brien等., ed., Human Press, Totowa, N.J.和进一步描述于例如McCafferty等. (1991) Nature 348:552-554; Clackson等., (1991)Nature 352: 624-628; Marks等. (1992) J. Mol. Biol. 222:581-597; Marks和Bradbury (2003) in Methods in Molecular Biology 248:161-175, Lo, ed., HumanPress, Totowa, N.J.; Sidhu等. (2004) J. Mol. Biol. 338(2):299-310; Lee等.(2004) J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093; Fellouse (2004) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 101(34):12467-12472;和Lee等. (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和VL基因库，并在噬菌体文库中随机重新组合，然后可以如Winter等. (1994) Ann. Rev. Immunol., 12:433-455所述筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。来自免疫源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体(例如TβRII、TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3多肽)，而不需要构建杂交瘤。或者，可以克隆(例如来自人)幼稚库，以提供针对广泛范围的非自身以及自身抗原的单一抗体来源而无需任何免疫接种，如Griffiths等.(1993) EMBO J, 12: 725-734所述。最后，通过克隆来自干细胞的未重排的V基因区段并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外完成重排，也可以合成制备幼稚文库，如Hoogenboom和Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381-388所述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括，例如：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936和2009/0002360。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体(通常是单克隆抗体)对于一种或多种(例如2、3、4、5、6或更多种)抗原的至少两个不同表位(例如2、3、4、5或6或更多个)具有结合特异性。
本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)。
在某些实施方案中，本文公开的抗体是单克隆抗体。单克隆抗体是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即除了可能的变体抗体，例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物生产过程中产生的变体抗体(这些变体通常以少量存在)以外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包含针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制备物相比，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单个表位。因此，修饰语“单克隆”表示抗体从基本上均质的抗体群获得的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明方法使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，用于制备单克隆抗体的这样的方法和其它示例性方法在本文描述。
例如，通过使用来源于TβRII的免疫原，抗蛋白/抗肽抗血清或单克隆抗体可通过标准方案制备[参见例如Antibodies: A Laboratory Manual (1988) ed. by Harlow和Lane, Cold Spring Harbor Press]。可以用免疫原性形式的TβRII多肽，能够引发抗体反应的抗原性片段或融合蛋白免疫哺乳动物，例如小鼠、仓鼠或兔。赋予蛋白质或肽免疫原性的技术包括与载体缀合或本领域众所周知的其它技术。TβRII多肽的免疫原性部分可以在佐剂存在下施用。可以通过检测血浆或血清中的抗体滴度来监测免疫的进展。标准ELISA或其它免疫测定可以与作为抗原的免疫原一起以评估抗体产生水平和/或结合亲和力水平。
在用TβRII的抗原制备物免疫动物后，可以获得抗血清，并且如果需要，可以从血清中分离多克隆抗体。为了产生单克隆抗体，可以从免疫的动物中收获产生抗体的细胞(淋巴细胞)，并通过标准体细胞融合程序与永生化细胞例如骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞。这些技术在本领域中是众所周知的，并且包括例如杂交瘤技术[参见例如Kohler和Milstein (1975) Nature, 256: 495-497], 人B细胞杂交瘤技术[参见例如Kozbar等.(1983) Immunology Today, 4:72]和用于产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术[Cole等.(1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96]。可以免疫化学筛选杂交瘤细胞以产生与TβRII多肽特异性反应的抗体，以及从包含此类杂交瘤细胞的培养物分离的单克隆抗体。
在某些实施方案中，可将一种或多种氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，从而产生Fc-区变体。Fc-区变体可以包含在一个或多个位置上包含氨基酸修饰(例如，置换、缺失和/或添加)的人Fc-区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
例如，本公开内容考虑了具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使得其成为其中抗体体内半衰期很重要，然而某些效应子功能[例如，补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)]是不必要的或有害的应用的理想候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以证实CDC和/或ADCC活性的减少/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留了FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在例如Ravetch和Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492。用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362; Hellstrom, I.等. (1986) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063;Hellstrom, I等. (1985) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502; 美国专利号5,821,337;和Bruggemann, M.等. (1987)J. Exp. Med. 166:1351-1361。或者，可以使用非放射性测定方法(例如ACTI™, 用于流式细胞术的非放射性细胞毒性测定法, Inc.Mountain View, Calif.;和CytoTox 96®非放射性细胞毒性测定法, Promega, Madison,Wis.)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤细胞(NK)。或者，或另外，目标分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在动物模型中，如在Clynes等.(1998) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656中公开的动物模型中。还可以进行C1q结合测定以证实抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性[参见例如WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA]。为了评估补体激活，可以进行CDC测定[参见例如Gazzano-Santoro等. (1996) J. Immunol. Methods 202:163; Cragg, M. S.等. (2003)Blood 101:1045-1052;和Cragg, M. S和M. J. Glennie (2004) Blood 103:2738-2743]。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定[参见例如Petkova,S. B.等. (2006) Int. Immunol. 18(12):1759-1769]。
具有降低的效应子功能的本公开内容的抗体包括具有Fc区残基238, 265, 269,270, 297, 327和329中的一个或多个的置换的抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在265, 269, 270, 297和327的两个或更多个氨基酸位置上具有置换的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其中残基265和297被置换为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸改造的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，置换的残基出现在抗体的可接近位点处。通过用半胱氨酸置换那些残基，反应性巯基因此位于抗体的可接近位点处并可用于将抗体与其它部分(例如药物部分或接头-药物部分)缀合以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在某些实施方案中，任何一个或多个以下残基可被半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400 (EU编号)。半胱氨酸改造的抗体可以按照例如在美国专利号5,399,499中所述的方法产生。
此外，用于筛选抗体以鉴定所需抗体的技术可能会影响所获得抗体的性质。例如，如果将抗体用于在溶液中结合抗原，则可能需要测试溶液结合。多种不同的技术可用于测试抗体与抗原之间的相互作用以鉴定特别期望的抗体。这些技术包括ELISA、表面等离子体共振结合测定法(例如，BiacoreTM结合测定法，Biacore AB, Uppsala, Sweden)，夹心测定法(例如，IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland的顺磁珠系统)、蛋白质印迹、免疫沉淀测定法和免疫组织化学。
在某些实施方案中，考虑了本文提供的抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善抗体和/或结合多肽的结合亲和力和/或其它生物学性质。抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码抗体和/或结合多肽的核苷酸序列中，或通过肽合成来制备。这样的修饰包括，例如，抗体和/或结合多肽的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或置换。只要最终构建物具有所需的特征，例如靶标结合(TβRII、ALK5、β聚糖、TGFβ1、TGFβ2和/或TGFβ3)，可以制备缺失、插入和置换的任何组合以得到最终构建体。
例如，可以在HVR中进行改变(例如置换)以改善抗体亲和力。这种改变可以在HVR“热点”中进行，即由在体细胞成熟过程中以高频率发生突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury (2008) Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)),和/或SDRs (a-CDRs)，测试所得变体VH或VL的结合亲和力。本领域已经描述了通过构建次级文库和从中重新选择的亲和力成熟[参见例如Hoogenboom等., in Methods in Molecular Biology 178:1-37,O'Brien等., ed., 人Press, Totowa, N.J., (2001)]。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或者寡核苷酸定向诱变)将多样性引入选择用于成熟的可变基因。然后创建次级文库。然后筛选文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR引导的方法，其中几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)被随机化。参与抗原结合的HVR残基可以被特异性鉴定，例如使用丙氨酸扫描诱变或建模。特别是CDR-H3和CDR-L3经常被靶向。
在某些实施方案中，置换、插入或缺失可以发生在一个或多个HVR内，只要这种改变不会显著降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，本文提供的保守置换)。这种改变可能在HVR“热点”或SDR之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR未改变，或者包含不超过1、2或3个氨基酸置换。
用于鉴定可被靶向用于诱变的抗体和/或结合多肽的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells (1989) Science, 244:1081-1085所述。在该方法中，鉴定残基或目标残基组(例如，带电荷的残基例如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)置换以确定抗体或结合多肽与抗原的相互作用是否受到影响。进一步的置换可以在对最初置换显示出功能敏感性的氨基酸位置引入。或者或另外，抗原-抗体复合物的晶体结构可用于鉴定抗体与抗原之间的接触点。作为置换的候选物，这种接触残基和相邻残基可以被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否包含期望的性质。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N-或C-末端与提高抗体血清半衰期的酶(例如用于ADEPT)或多肽的融合物。
在某些实施方案中，本文提供的抗体和/或结合多肽可以进一步修饰以含有本领域已知且容易获得的额外的非蛋白质部分。适合衍生抗体和/或结合多肽的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可能具有优势。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支或不分支的。连接到抗体和/或结合多肽上的聚合物的数量可以变化，并且如果连接多于一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑因素来确定，包括但不限于待改进的抗体和/或结合多肽的特定性质或功能，抗体衍生物和/或结合多肽衍生物是否将用于在限定条件下的治疗中。
本文公开的任何TβRII拮抗剂抗体可以与一种或多种另外的TβRII拮抗剂组合以实现期望效果[治疗、预防脊髓发育不良病症或脊髓发育不良病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性]。例如，TβRII拮抗剂抗体可以与i)一种或多种另外的TβRII拮抗剂抗体，ii)一种或多种TβRII多肽及其变体；iii)一种或多种TβRII拮抗剂小分子；和iv)一种或多种TβRII拮抗剂多核苷酸组合使用。
D. 小分子拮抗剂
在某些方面，根据本文公开的方法和用途使用的TβRII拮抗剂是小分子(TβRII拮抗剂小分子)或小分子的组合。TβRII拮抗剂小分子或小分子组合可抑制例如一种或多种TβRII配体(例如TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)、TβRII受体、TβRII相关的I型受体(例如ALK5)，TβRII相关的共同受体(例如β聚糖)和/或下游信号传导成分(例如Smads)。在一些实施方案中，在基于细胞的测定包括例如本文所述的那些中测定TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制信号传导(例如Smad信号传导)的能力。TβRII拮抗剂小分子或小分子组合可以单独使用或与一种或多种另外的支持疗法或活性剂组合使用以治疗、预防骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板增多症)和/或Janus激酶相关病症(例如JAK2激酶相关病症)或骨髓增生性病症和/或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性。
在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合至少抑制TGFβ1(例如抑制Smad信号传导)。因此，在一些实施方案中，TGFβ1的小分子抑制剂结合TGFβ1。在一些实施方案中，TGFβ1的小分子抑制剂抑制TGFβ1的表达(例如，转录、翻译、分泌或其组合)。在一些实施方案中，TGFβ1的小分子抑制剂进一步抑制TGFβ2、TGFβ3、TβRII、ALK5和β聚糖中的一种或多种。在一些实施方案中，TGFβ1的小分子抑制剂不抑制或基本上不抑制TGFβ2。在一些实施方案中，TGFβ1的小分子抑制剂进一步抑制TGFβ3，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合至少抑制TGFβ2(例如抑制Smad信号传导)。因此，在一些实施方案中，TGFβ2的小分子抑制剂结合TGFβ2。在一些实施方案中，TGFβ2的小分子抑制剂抑制TGFβ2的表达(例如，转录、翻译、分泌或其组合)。在一些实施方案中，TGFβ2的小分子抑制剂进一步抑制TGFβ3、TGFβ1、TβRII、ALK5和β聚糖中的一种或多种。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合至少抑制TGFβ3(例如抑制Smad信号传导)。因此，在一些实施方案中，TGFβ3的小分子抑制剂结合TGFβ3。在一些实施方案中，TGFβ3的小分子抑制剂抑制TGFβ3的表达(例如，转录、翻译、分泌或其组合)。在一些实施方案中，TGFβ3的小分子抑制剂进一步抑制TGFβ2、TGFβ1、TβRII、ALK5和β聚糖中的一种或多种。在一些实施方案中，TGFβ3的小分子抑制剂不抑制或基本上不抑制TGFβ2。在一些实施方案中，TGFβ3的小分子抑制剂进一步抑制TGFβ1，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合至少抑制TβRII(例如抑制Smad信号传导)。因此，在一些实施方案中，TβRII的小分子抑制剂结合TβRII。在一些实施方案中，TβRII的小分子抑制剂抑制TβRII的表达(例如，转录、翻译、分泌或其组合)。在一些实施方案中，TβRII的小分子抑制剂进一步抑制TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、ALK5和β聚糖中的一种或多种。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ1结合TβRII。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ2结合TβRII。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ3结合TβRII。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ1和TGFβ3结合TβRII。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3结合TβRII。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ1结合TβRII但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合TβRII。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ3结合TβRII但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合TβRII。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ1和TGFβ3结合TβRII，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合TβRII。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合至少抑制ALK5(例如抑制Smad信号传导)。因此，在一些实施方案中，ALK5的小分子抑制剂结合ALK5。在一些实施方案中，ALK5的小分子抑制剂抑制ALK5的表达(例如，转录、翻译、分泌或其组合)。在一些实施方案中，ALK5的小分子抑制剂进一步抑制TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TβRII和β聚糖中的一种或多种。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ1结合ALK5。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ2结合ALK5。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ3结合ALK5。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ1和TGFβ3结合ALK5。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3结合ALK5。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ1结合ALK5，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合ALK5。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ3结合ALK5，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合ALK5。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ1和TGFβ3结合ALK5，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合ALK5。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合至少抑制β聚糖(例如抑制Smad信号传导)。因此，在一些实施方案中，β聚糖的小分子抑制剂结合β聚糖。在一些实施方案中，β聚糖的小分子抑制剂抑制β聚糖的表达(例如，转录、翻译、分泌或其组合)。在一些实施方案中，β聚糖的小分子抑制剂进一步抑制TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TβRII和ALK5中的一种或多种。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ1结合β聚糖。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ2结合β聚糖。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ3结合β聚糖。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ1和TGFβ3结合β聚糖。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3结合β聚糖。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ1结合β聚糖，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合β聚糖。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ3结合β聚糖，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合β聚糖。在某些方面，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合抑制TGFβ1和TGFβ3结合β聚糖，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合β聚糖。
TβRII拮抗剂小分子可以是直接或间接抑制剂。例如，TβRII拮抗剂小分子或小分子组合可以抑制TβRII、ALK5、β聚糖、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3中的至少一种或多种和/或一种或多种下游TβRII信号传导因子(Smads)的表达(例如，转录、翻译、细胞分泌或其组合)。或者，直接TβRII拮抗剂小分子或小分子组合可以直接结合例如TβRII、ALK5、β聚糖、TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3中的一种或多种或一种或多种下游TβRII信号传导因子。根据本文公开的方法可以使用一种或多种间接和一种或多种直接TβRII拮抗剂小分子的组合。
本公开内容的结合有机小分子拮抗剂可以使用已知方法鉴定和化学合成(参见例如PCT公开号WO 00/00823和WO 00/39585)。一般而言，本公开内容的小分子拮抗剂的大小通常小于约2000道尔顿，或者大小小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中这样的有机小分子能够结合，优选特异性结合本文所述的多肽(例如，TβRII、ALK5、β聚糖、TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)。使用众所周知的技术可以在没有过度实验的情况下鉴定这样的小分子拮抗剂。就此而言，注意到用于筛选有机小分子文库中的能够结合多肽靶的分子的技术在本领域中是众所周知的(参见例如国际专利公开号WO00/00823和WO00/39585)。
本公开内容的结合有机小分子可以例如是醛、酮、肟、腙、缩氨基脲、卡巴肼、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、硫缩酮、缩醛、硫代缩醛、芳基卤化物、芳基磺酸酯、烷基卤化物、烷基磺酸酯、芳香族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、环氧化物、氮丙啶、异氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物和酰氯。
本文公开的任何TβRII拮抗剂小分子可以与一种或多种另外的TβRII拮抗剂组合以达到期需的。例如，TβRII拮抗剂小分子可以与i)一种或多种另外的TβRII拮抗剂小分子，ii)本文公开的一种或多种TβRII拮抗剂抗体；iii)一种或多种TβRII多肽，包括其变体；和/或iv)一种或多种TβRII拮抗剂多核苷酸组合使用。
E. 拮抗剂多核苷酸
在某些方面，根据本文公开的方法和用途使用的TβRII拮抗剂是多核苷酸(TβRII拮抗剂多核苷酸)或多核苷酸的组合。TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合可抑制例如一种或多种TβRII配体(例如TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)、TβRII受体、TβRII相关的I型受体(例如ALK5)，TβRII相关的共同受体(例如β聚糖)和/或下游信号传导成分(例如Smads)。在一些实施方案中，在基于细胞的测定包括例如本文所述的那些中测定TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制信号传导(例如Smad信号传导)的能力。TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合可以单独使用或与一种或多种另外的支持疗法或活性剂组合使用以治疗、预防骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板增多症)和/或Janus激酶相关病症(例如JAK2激酶相关病症)或骨髓增生性病症和/或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性。
在某些方面，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合至少抑制TGFβ1(例如抑制Smad信号传导)。因此，在一些实施方案中，TGFβ1的多核苷酸抑制剂结合TGFβ1。在一些实施方案中，TGFβ1的多核苷酸抑制剂抑制TGFβ1的表达(例如，转录、翻译、分泌或其组合)。在一些实施方案中，TGFβ1的多核苷酸抑制剂进一步抑制TGFβ2、TGFβ3、TβRII、ALK5和β聚糖中的一种或多种。在一些实施方案中，TGFβ1的多核苷酸抑制剂不抑制或基本上不抑制TGFβ2。在一些实施方案中，TGFβ1的多核苷酸抑制剂进一步抑制TGFβ3，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2。在某些方面，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合至少抑制TGFβ2(例如抑制Smad信号传导)。因此，在一些实施方案中，TGFβ2的多核苷酸抑制剂结合TGFβ2。在一些实施方案中，TGFβ2的多核苷酸抑制剂抑制TGFβ2的表达(例如，转录、翻译、分泌或其组合)。在一些实施方案中，TGFβ2的多核苷酸抑制剂进一步抑制TGFβ3、TGFβ1、TβRII、ALK5和β聚糖中的一种或多种。在某些方面，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合至少抑制TGFβ3(例如抑制Smad信号传导)。因此，在一些实施方案中，TGFβ3的多核苷酸抑制剂结合TGFβ3。在一些实施方案中，TGFβ3的多核苷酸抑制剂抑制TGFβ3的表达(例如，转录、翻译、分泌或其组合)。在一些实施方案中，TGFβ3的多核苷酸抑制剂进一步抑制TGFβ2、TGFβ1、TβRII、ALK5和β聚糖中的一种或多种。在一些实施方案中，TGFβ3的多核苷酸抑制剂不抑制或基本上不抑制TGFβ2。在一些实施方案中，TGFβ3的多核苷酸抑制剂进一步抑制TGFβ1，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2。在某些方面，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合至少抑制TβRII(例如抑制Smad信号传导)。因此，在一些实施方案中，TβRII的多核苷酸抑制剂结合TβRII。在一些实施方案中，TβRII的多核苷酸抑制剂抑制TβRII的表达(例如，转录、翻译、分泌或其组合)。在一些实施方案中，TβRII的多核苷酸抑制剂进一步抑制TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、ALK5和β聚糖中的一种或多种。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ1结合TβRII。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ2结合TβRII。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ3结合TβRII。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ1和TGFβ3结合TβRII。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3结合TβRII。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ1结合TβRII但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合TβRII。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ3结合TβRII但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合TβRII。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ1和TGFβ3结合TβRII，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合TβRII。在某些方面，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合至少抑制ALK5(例如抑制Smad信号传导)。因此，在一些实施方案中，ALK5的多核苷酸抑制剂结合ALK5。在一些实施方案中，ALK5的多核苷酸抑制剂抑制ALK5的表达(例如，转录、翻译、分泌或其组合)。在一些实施方案中，ALK5的多核苷酸抑制剂进一步抑制TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TβRII和β聚糖中的一种或多种。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ1结合ALK5。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ2结合ALK5。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ3结合ALK5。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ1和TGFβ3结合ALK5。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3结合ALK5。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ1结合ALK5，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合ALK5。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ3结合ALK5，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合ALK5。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ1和TGFβ3结合ALK5，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合ALK5。在某些方面，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合至少抑制β聚糖(例如抑制Smad信号传导)。因此，在一些实施方案中，β聚糖的多核苷酸抑制剂结合β聚糖。在一些实施方案中，β聚糖的多核苷酸抑制剂抑制β聚糖的表达(例如，转录、翻译、分泌或其组合)。在一些实施方案中，β聚糖的多核苷酸抑制剂进一步抑制TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TβRII和ALK5中的一种或多种。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ1结合β聚糖。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ2结合β聚糖。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ3结合β聚糖。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ1和TGFβ3结合β聚糖。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3结合β聚糖。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ1结合β聚糖，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合β聚糖。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ3结合β聚糖，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合β聚糖。在一些实施方案中，TβRII拮抗剂多核苷酸或多核苷酸组合抑制TGFβ1和TGFβ3结合β聚糖，但不抑制或基本上不抑制TGFβ2结合β聚糖。
本公开内容的多核苷酸拮抗剂可以是反义核酸、RNAi分子[例如、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)]，适配体和/或核酶。人TβRII、ALK5、β聚糖、TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的核酸和氨基酸序列在本领域中是已知的，因此根据本领域的知识和本文提供的教导，本领域技术人员可常规制备本公开内容的方法使用的多核苷酸拮抗剂。
例如，反义技术可用于通过反义DNA或RNA或通过三重螺旋形成来控制基因表达。反义技术论述于例如Okano (1991) J. Neurochem. 56:560; Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)。三重螺旋形成论述于例如Cooney等. (1988) Science 241:456;和Dervan等., (1991)Science 251:1300。该方法基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。在一些实施方案中，反义核酸包含与所需基因的RNA转录物的至少一部分互补的单链RNA或DNA序列。然而，绝对互补性虽然是优选的，但并不是必需的。
“与RNA的至少一部分互补”的序列，在本文中是指具有足够互补性以能够与RNA杂交，形成稳定双链体的序列；在本文公开的基因的双链反义核酸的情况下，因此可以测试双链体DNA的单链，或者可以测定三链体形成。杂交的能力将取决于互补性的程度和反义核酸的长度。一般而言，杂交核酸越大，其与RNA可能含有的碱基错配越多并且仍然形成稳定的双链体(或视情况可能是三链体)。本领域技术人员可以通过使用标准程序确定可容许的错配程度以确定杂交复合物的熔点。
与信使RNA 5'末端互补的多核苷酸，例如直至并包括AUG起始密码子的5'非翻译序列，应该在抑制翻译方面最有效地起作用。然而，与mRNA的3'-非翻译序列互补的序列已经显示出对抑制mRNA的翻译也是有效的[参见例如Wagner, R., (1994) Nature 372:333-335]。因此，与本公开内容的基因的5'或3'非翻译、非编码区互补的寡核苷酸可用于反义方法以抑制内源mRNA的翻译。与mRNA的5'非翻译区互补的多核苷酸应该包括AUG起始密码子的互补序列。与mRNA编码区互补的反义多核苷酸是较不有效的翻译抑制剂，但可以根据本公开内容的方法使用。无论设计成与本公开内容的mRNA的5'非翻译区、3'非翻译区或编码区杂交，反义核酸的长度应至少为6个核苷酸，并且优选为在6个核苷酸至约50个核苷酸范围内的寡核苷酸长度。在具体的方面，寡核苷酸是至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。
在一个实施方案中，本公开内容的反义核酸是通过从外源序列转录而在细胞内产生的。例如，转录载体或其部分，产生本公开内容的基因的反义核酸(RNA)。这种载体将含有编码所需反义核酸的序列。这种载体可以保持附加型或变成染色体整合，只要它可以被转录以产生所需的反义RNA。这种载体可以通过本领域标准重组DNA技术方法构建。载体可以是质粒、病毒或本领域已知的用于在脊椎动物细胞中复制和表达的其它载体。编码本公开内容所需基因或其片段的序列的表达可以通过本领域已知的任何启动子在脊椎动物，优选人细胞中起作用。这种启动子可以是诱导型或组成型的。这种启动子包括但不限于SV40早期启动子区[参见例如Benoist和Chambon (1981) Nature 29:304-310]、包含在劳斯肉瘤病毒的3'长末端重复中的启动子[参见例如Yamamoto等. (1980) Cell 22:787-797]、疱疹胸苷启动子[参见例如Wagner等. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445]和金属硫蛋白基因的调控序列[参见例如Brinster,等. (1982) Nature 296:39-42]。
在一些实施方案中，多核苷酸拮抗剂是靶向一种或多种基因表达的干扰RNA或RNAi分子。RNAi是指干扰靶向mRNA表达的RNA的表达。具体而言，RNAi经由通过siRNA(小干扰RNA)与特定mRNA相互作用使靶向基因沉默。然后靶向ds RNA复合物以被细胞降解。siRNA分子是长度为10至50个核苷酸的双链RNA双链体，其干扰足够互补(例如与该基因至少80％同一性)的靶基因的表达。在一些实施方案中，siRNA分子包含与靶基因的核苷酸序列具有至少85, 90, 95, 96, 97, 98, 99或100%同一性的核苷酸序列。
另外的RNAi分子包括短发夹RNA (shRNA)；以及短干扰发夹和微小RNA(miRNA)。shRNA分子含有来自通过环连接的靶基因的有义和反义序列。shRNA从细胞核转运到细胞质中，并且随mRNA一起被降解。Pol III或U6启动子可用于表达RNAi的RNA。Paddison等.[Genes & Dev. (2002) 16:948-958, 2002]使用折叠成发夹的小RNA分子作为实现RNAi的手段。因此，此类短发夹RNA(shRNA)分子也有利地用于本文所述的方法中。功能性shRNA的茎和环的长度可变；茎长度可以在约25至约30nt范围内的任一个，环大小可以在4至约25nt之间，而不影响沉默活性。虽然不希望受任何特定理论的约束，但相信这些shRNA类似于DICER RNA酶的双链RNA(dsRNA)产物，并且无论如何都具有抑制特定基因表达的相同能力。shRNA可以从慢病毒载体表达。miRNA是约10至70个核苷酸长度的单链RNA，其最初转录为以“茎-环”结构为特征的前-miRNA，并且随后通过RISC进一步加工后加工成成熟miRNA。
介导RNAi的分子，包括但不限于siRNA，可以通过化学合成(Hohjoh, FEBS Lett521:195-199, 2002), dsRNA的水解(Yang等., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947,2002), 通过用T7RNA聚合酶进行体外转录(Donzeet等., Nucleic Acids Res 30:e46,2002; Yu等., Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052, 2002)和通过使用核酸酶例如大肠杆菌RNA酶III水解双链RNA(Yang等., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002)而体外产生。
根据另一方面，本公开内容提供了多核苷酸拮抗剂，包括但不限于诱饵DNA、双链DNA、单链DNA、复合DNA、封装的DNA、病毒DNA、质粒DNA、裸RNA、封装的RNA、病毒RNA、双链RNA、能够产生RNA干扰的分子或其组合。
在一些实施方案中，本公开内容的多核苷酸拮抗剂是适配体。适配体是核酸分子，包括双链DNA和单链RNA分子，其结合靶分子并形成特异性结合靶分子的三级结构，所述靶分子例如TβRII、TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3多肽。适配体的产生和治疗用途在本领域中已经充分建立。参见，例如，美国专利号5,475,096。关于适配体的额外信息可以在美国专利申请公开号20060148748中找到。使用本领域已知的方法选择核酸适配体，例如通过指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)(SELEX)过程。SELEX是一种体外进化核酸分子的方法，其具有与靶分子的高度特异性结合，如例如美国专利号5,475,096, 5,580,737, 5,567,588, 5,707,796, 5,763,177, 6,011,577和6,699,843所述。另一种鉴定适配体的筛选方法描述于美国专利号5,270,163。SELEX过程基于核酸形成各种二维和三维结构的能力，以及核苷酸单体内可用作几乎任何化合物(无论是单体还是聚合体，包括其它核酸分子和多肽)的配体(形成特异性结合对)的化学多功能性。任何大小或组成的分子都可以作为靶标。SELEX方法包括从候选寡核苷酸的混合物中进行选择，并使用相同的一般选择方案逐步重复结合、分隔和扩增，以获得所需的结合亲和力和选择性。从可包含一段随机化序列的核酸混合物开始，SELEX方法包括以下步骤：在有利于结合的条件下使混合物与靶标接触；将未结合的核酸与特异性结合靶标分子的那些核酸分隔；解离核酸-靶标复合物；扩增从核酸-靶标复合物解离的核酸以产生富含配体的核酸混合物。将结合、分隔、解离和扩增的步骤重复进行所需的多个循环，以产生针对靶标分子的高度特异性高亲和力核酸配体。
通常，将这样的结合分子分别给予动物[参见例如O'Connor (1991) J.Neurochem. 56:560]，但是这样的结合分子也可以由宿主细胞摄取的多核苷酸在体内表达并在体内表达[参见例如Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)]。
任何TβRII拮抗剂多核苷酸可以与一种或多种另外的TβRII拮抗剂组合以实现所需的效果。例如，TβRII拮抗剂多核苷酸可以与i)一种或多种另外的TβRII拮抗剂多核苷酸，ii)一种或多种TβRII多肽及其变体；iii)一种或多种TβRII拮抗剂抗体；和/或iv)一种或多种TβRII拮抗剂小分子组合使用。
5. 筛选测定法
在某些方面，本发明涉及TβRII多肽(例如可溶性TβRII多肽)用于鉴定作为TGFβ-TβRII信号传导途径的激动剂或拮抗剂的化合物(试剂)的用途。通过该筛选鉴定的化合物可以被测试以评估它们在体外调节TGFβ信号传导活性的能力。任选地，可以在动物模型中进一步测试这些化合物以评估它们调节体内组织生长的能力。
有许多方法用于通过靶向TGFβ和TβRII多肽筛选用于调节组织生长的治疗剂。在某些实施方案中，可以进行化合物的高通量筛选以鉴定干扰TGFβ或TβRII介导的细胞信号转导的试剂。在某些实施方案中，进行测定以筛选和鉴定特异性抑制或减少TβRII多肽与TGFβ结合的化合物。或者，该测定可用于鉴定增强TβRII多肽与TGFβ结合的化合物。在另一个实施方案中，化合物可以通过它们与TGFβ或TβRII多肽相互作用的能力来鉴定。
各种测定形式将是足够的，并且根据本公开内容，本文中未明确描述的那些将被本领域普通技术人员理解。如本文所述，本发明的测试化合物(试剂)可以通过任何组合化学方法产生。或者，主题化合物可以是体内或体外合成的天然存在的生物分子。可以通过例如细菌、酵母、植物或其它生物体(例如天然产物)，以化学方式产生(例如小分子，包括肽模拟物)或重组产生，产生待测试其作为组织生长调节剂的能力的化合物(试剂)。本发明考虑的测试化合物包括非肽基有机分子、肽、多肽、肽模拟物、糖、激素和核酸分子。在具体的实施方案中，测试剂是分子量小于约2,000道尔顿的有机小分子。
可以提供本发明的测试化合物作为单一的离散实体，或者以更复杂的文库提供，例如通过组合化学制备。这些文库可以包含例如醇、烷基卤、胺、酰胺、酯、醛、醚和其它种类的有机化合物。测试化合物向测试系统的呈现可以是分离形式或作为化合物的混合物，特别是在初始筛选步骤中。任选地，化合物可以任选地用其它化合物衍生化并具有促进化合物分离的衍生化基团。衍生化基团的非限制性实例包括生物素、荧光素、地高辛、绿色荧光蛋白、同位素、聚组氨酸、磁珠、谷胱甘肽S转移酶(GST)、可光活化交联剂或其任何组合。
在测试化合物和天然提取物文库的许多药物筛选程序中，高通量测定法是合乎需要的，以使在给定的时间段内研究的化合物的数量最大化。在无细胞系统中进行的测定法(例如可以用纯化或半纯化蛋白衍生)通常优选作为“主要”筛选，因为它们可以被生成以允许快速产生并相对容易地检测由测试化合物介导的分子靶标的改变。此外，测试化合物的细胞毒性影响作用或生物利用度通常可以在体外系统中被忽略，测定反而主要集中在药物对分子靶标的作用上，这可表现为TβRII多肽与TGFβ之间的结合亲和力改变。
仅仅为了说明，在本发明的示例性筛选测定中，使目的化合物与通常能够结合TGFβ的分离和纯化的TβRII多肽接触。然后向该化合物和TβRII多肽的混合物中加入含有TβRII配体的组合物。TβRII/TGFβ复合物的检测和定量提供了确定化合物抑制(或加强)TβRII多肽和TGFβ之间复合物形成的功效的手段。可以通过从使用各种浓度的测试化合物获得的数据产生剂量反应曲线来评估化合物的功效。此外，还可以进行对照测定以提供用于比较的基线。例如，在对照测定中，将分离的和纯化的TGFβ加入到含有TβRII多肽的组合物中，并且在不存在测试化合物的情况下定量TβRII/TGFβ复合物的形成。应该理解，通常，可以改变反应物可混合的顺序，并且可以同时混合。此外，代替纯化的蛋白质，细胞提取物和裂解物可用于提供合适的无细胞测定系统。
TβRII多肽和TGFβ之间的复合物形成可通过多种技术检测。使用例如可检测标记的蛋白质，例如放射性标记的(例如32P, 35S, 14C或3H)，荧光标记的(例如FITC)或酶促标记的TβRII多肽或TGFβ，通过免疫测定或通过层析检测来定量复合物形成的调节。
在某些实施方案中，本发明考虑使用荧光偏振测定法和荧光共振能量转移(FRET)测定法来直接或间接测量TβRII多肽与其结合蛋白之间的相互作用程度。此外，诸如基于光波导(PCT公开WO 96/26432和美国专利5,677,196)、表面等离子体共振(SPR)、表面电荷传感器和表面力传感器的其它检测模式适合于本发明的许多实施方案。
此外，本发明考虑使用相互作用捕获测定法(也称为“双杂交测定法”)来鉴定破坏或加强TβRII多肽与其结合蛋白之间相互作用的试剂。参见例如，美国专利号5,283,317;Zervos等. (1993) Cell 72:223-232; Madura等. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel等. (1993) Biotechniques 14:920-924;和Iwabuchi等. (1993)Oncogene 8:1693-1696)。在具体实施方案中，本发明考虑使用反向双杂交系统来鉴定解离TβRII多肽与其结合蛋白之间的相互作用的化合物(例如小分子或肽)。参见例如，Vidal和Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal和Legrain, (1999) TrendsBiotechnol 17:374-81;和U.S. Pat. Nos. 5,525,490; 5,955,280;和5,965,368。
在某些实施方案中，主题化合物通过它们与本发明的TβRII或TGFβ多肽相互作用的能力来鉴定。化合物与TβRII或TGFβ多肽之间的相互作用可以是共价或非共价的。例如，可以使用体外生物化学方法(包括光交联、放射性标记的配体结合和亲和层析)在蛋白质水平上鉴定这种相互作用(Jakoby WB等., 1974, Methods in Enzymology 46: 1)。在某些情况下，可以在基于机制的测定法中筛选化合物，例如检测结合TGFβ或TβRII多肽的化合物的测定法。这可能包括固相或流体相结合事件。或者，编码TGFβ或TβRII多肽的基因可以用报道系统(例如β-半乳糖苷酶、荧光素酶或绿色荧光蛋白)转染到细胞中并优选通过高通量筛选而筛选文库或用单个文库成员筛选。可以使用其它基于机制的结合测定法，例如检测自由能变化的结合测定法。可以将靶标固定到孔、珠或芯片上或用固定化抗体捕获或通过毛细管电泳分辨靶标来进行结合测定法。通常可以使用比色或荧光或表面等离子体共振来检测结合的化合物。
在某些方面，本发明提供了用于调节(刺激或抑制)TGFβ介导的细胞信号传导的方法和药剂。因此，可以在体外或体内在全细胞或组织中测试鉴定的任何化合物，以确认其调节TGFβ信号传导的能力。本领域已知的各种方法可用于此目的。
6. 示例性治疗用途
骨髓增生性肿瘤(MPN)起因于异常造血干细胞增殖并包括骨髓纤维化症(PMF)、真性红细胞增多症(PV)和原发性血小板增多症(ET)[Mesa, R.A. (2013 Leuk Lymphoma 54(2):242-251]。ET和PV能够发展成骨髓纤维化症(分别为ET后相关的骨髓纤维化症和PV后相关的骨髓纤维化症)[Thiele等. (2008) WHO Classification of Tumours ofHaematopoietic and Lymphoid Tissues. IARC Lyon: World Health Organization,44–7;和Cervantes等. (2009) Blood 113(13):2895–901]。尽管有某些特质的特征，但这些骨髓纤维化疾病具有显著的表型和临床共同性，例如它们倾向于发展血栓性和出血性并发症并进展为急性骨髓性白血病[Spivak, J.L. (2002) Blood 100:4272-4290; Finazzi等. (2007) Blood 190:5104-5111;和Passamnoti等. (2010) Blood 115:1703-1708]。在食品和药物管理局(FDA)批准鲁索替尼(例如Jakafi)之前，除了造血干细胞移植(HSCT)以外没有批准的用于治疗MF的治疗法。对疾病生物学的改进理解导致了增加评估潜在的新型治疗药的临床试验。然而，对于骨髓增生性病症的治疗仍然存在显著的未满足的需要。
在某些方面，本公开内容提供用于治疗、预防骨髓增生性病症(例如BCR-ABL阴性骨髓增生性肿瘤，包括原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症、隐性红细胞增多症、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)或骨髓增生性病症的一种或多种并发症(例如纤维化、脾肿大、炎症、贫血症和髓外造血)，或降低其进展速率和/或严重性，包括向有需要的患者施用有效量的一种或多种TβRII拮抗剂(例如TβRII多肽，所述TβRII多肽包含与SEQ ID NOs: 5-17, 25, 27, 29, 31,33, 35, 37, 39, 41, 43, 47-49, 53-62, 101和103-105的任一个的氨基酸序列具有至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成)，任选地与一种或多种用于治疗骨髓增生性病症的额外的支持疗法和/或活性剂(例如Janus激酶抑制剂，例如鲁索替尼)组合。
在某些方面，本公开内容提供治疗、预防Janus激酶相关病症(例如JAK2激酶相关病症)或Janus激酶相关病症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法，包括向有需要的患者施用有效量的一种或多种TβRII拮抗剂(例如TβRII多肽，所述TβRII多肽包含与SEQ ID NOs: 5-17, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 47-49, 53-62, 101和103-105的任一个的氨基酸序列具有至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%,96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成)，任选地与一种或多种用于治疗Janus激酶相关病症的额外的支持疗法和/或活性剂(例如Janus激酶抑制剂，例如鲁索替尼)组合。可通过本公开内容的方法治疗或预防的Janus激酶相关病症包括例如骨髓增生性病症(例如原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症、隐性红细胞增多症、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症、原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症和CML)，与Janus激酶相关病症相关的其它血液学病症以及与Janus激酶相关病症相关的克隆性(clonal)病症以及由此引起的并发症。
本文使用的“预防”病症或病况的治疗剂是指在统计学样品中相对于未治疗的对照样品减少经处理的样品中的病症或病况的发生，或相对于未治疗的对照样品延迟发作或减少病症或病况的一种或多种症状的严重性。
本文使用的术语“治疗”包括一旦其已经确定就改善或消除病况。在任一种情况下，可以在由医生或其它医疗保健提供者提供的诊断和治疗剂给药的预期结果中辨别预防或治疗。
通常，如本公开内容所述的治疗或预防病症或病况通过以有效量施用TβRII拮抗剂来实现。有效量的药剂是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需治疗或预防结果的量。本公开内容的药剂的治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及药剂在个体中引起期望的反应的能力等因素而变化。预防有效量是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需预防结果的量。
骨髓纤维化症是造血作用的克隆性肿瘤病症，其一般特征在于进行性骨髓纤维化，导致越来越无效的造血、髓外造血、各种炎性并发症和缩短生存期[Mascarenhas等.(2012) Curr Med Chem 19:4399-4413;和Vannucchi等. (2011) Hematol Am Soc Hematol Educ Prog 2011:222-230]。它是产生过量细胞的骨髓的骨髓增生性病症之一。由异常造血细胞克隆产生细胞因子例如成纤维细胞生长因子导致通过胶原纤维化由结缔组织替代骨髓的造血组织。造血组织的减少损害了患者产生新血细胞的能力，导致进行性全血细胞减少症(所有血型短缺)。然而，成纤维细胞增殖和胶原蛋白沉积是次要现象，并且成纤维细胞本身不是异常细胞克隆的一部分。作为骨髓进行性瘢痕形成或纤维化的结果，因为造血细胞被迫迁移到其它区域，特别是肝和脾，因此患者会发生髓外造血。这导致这些器官的扩大。在肝中，这种情况称为肝肿大。脾扩大称为脾肿大，这也造成全血细胞减少症，特别是血小板减少症和贫血症。也有关于肺和淋巴结发生髓外造血的报道。髓外造血的另一个并发症是存在形状异常红细胞的异型红细胞症。骨髓纤维化症的常见临床表现包括进行性肝脾肿大、血液计数异常和虚弱症状例如疲劳、体重减轻、盗汗、发热、瘙痒症、骨痛、早饱、腹痛或不适、关节痛、肌痛、感觉异常、恶病质、脾梗塞和出血。直到最近，对疾病进展有明确证明的影响的唯一治疗是异基因造血干细胞移植alloHSCT，但与治疗相关的死亡率很高，只有少数患者有资格接受这种强化疗法[Gupta等. (2012) Blood 120: 1367–1379]。
在某些方面，TβRII拮抗剂可以单独使用或与一种或多种支持疗法或活性剂组合使用以治疗、预防骨髓纤维化症(例如原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症或降低其进展速率和/或严重性)。具体而言，TβRII拮抗剂可以单独使用或与一种或多种支持疗法或活性剂组合使用以治疗、预防骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性，所述并发症包括例如无效造血、贫血症、炎症、纤维化(例如骨髓纤维化、脾纤维化和肝纤维化)、全血细胞减少症、嗜中性白细胞减少症、细胞因子升高、凝血障碍、炎性并发症、IL-6介导的炎症或炎性并发症、血小板减少症、髓外造血(例如脾髓外造血、肝髓外造血、肺髓外造血和淋巴髓外造血)、肝肿大、脾肿大、骨硬化症、骨髓纤维化症、异型红细胞症、疲劳、体重减轻、盗汗、发热、瘙痒症、骨痛、早饱、腹痛或不适、关节痛、肌痛、感觉异常、恶病质、脾梗塞和出血。
目前诊断原发性骨髓纤维化症(PMF)是基于世界卫生组织(WHO)的标准，并且涉及临床和实验室特征的综合评估[Tefferi A等. (2007) Blood. 110:1092–1097]。WHO诊断主要标准有三个：1)巨核细胞增殖和异型性(小至大的巨核细胞，伴随核/细胞质比率异常，含染色质多的和不规则折叠的核和密集簇集)，伴有网硬蛋白和/或胶原纤维化；或在不存在网硬蛋白纤维化时，巨核细胞变化必须伴随着髓细胞性增多，粒细胞增殖，并且通常红细胞生成减少(即前纤维化原发性骨髓纤维化症)，2)不符合WHO关于慢性髓细胞性白血病、真性红细胞增多症、骨髓增生性综合征或其它髓样肿瘤的标准，和3)显示JAK2V617F或其它克隆性标记或没有反应性骨髓纤维化的证据。此外，WHO诊断次要标准有四个：1)成白红细胞增多病(leukoerythroblastosis)，2)血清LDH水平升高，3)贫血症，4)可触及的脾肿大。外周血成白红细胞增多病(即，存在有核红细胞、未成熟粒细胞和泪细胞(dacryocyte))是PMF的典型但不恒定的特征；前纤维化PMF可能不显示明显的成白红细胞增多病[Kvasnicka等.(2010) Am J Hematol. 85:62–69]。PMF中的骨髓纤维化通常与JAK2V617F或突变型CALR，或MPL，三体性9或del(13q)相关[Hussein等. (2009) Eur J Haematol. 82:329–338]。因此，在与骨髓纤维化相关的髓样肿瘤存在下，这些遗传标志物的存在强烈支持诊断PMF。在某些方面，本公开内容涉及TβRII拮抗剂治疗、预防原发性骨髓纤维化症或降低其进展速率和/或严重性，特别是治疗、预防原发性骨髓纤维化症的一种或多种并发症，或降低其进展速率和/或严重性的方法和用途。
目前诊断真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症(post-PV MF)和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症(post-ET MF)是基于国际MPN研究和治疗工作组(IWG-MRT)发布的标准[Barosi G等. (2008) Leukemia. 22:437–438]。对于post-PV MF有两个IWG-MRT主要标准：1)按WHO标准定义的先前诊断为真性红细胞增多症的证明文件，和2)骨髓纤维化等级2-3 (0-3量表)或等级3-4(0-4量表)。根据欧洲分类等级2-3：弥漫性，通常粗纤维网络，没有胶原化迹象(阴性三色染色)或弥漫性，粗纤维网络，具有胶原化区域(阳性三色染色)[Thiele等. (2005) Haematologica. 90:1128–1132]。根据标准分类等级3-4：具有广泛交叉的网硬蛋白弥漫性和密集性增加，偶尔仅有局灶性束的胶原和/或局灶性骨硬化症，或具有广泛交叉的网硬蛋白弥漫性和密集性增加，具有粗糙胶原束，通常伴随明显的骨硬化症[Manoharan等. (1979) Br J Haematol 43:185–190]。此外，IWG-MRT诊断性次要标准还有四个，其中两个必须连同post-PV MF诊断的IWG-MRT主要标准在患者中检测：1)在不存在细胞减灭性疗法下贫血症或持续失去对静脉切开放血术的要求，2)成白红细胞增多的外周血图片，3)脾肿大增加，定义为≥5cm的可触及的脾肿大增加或出现新的可触及的脾肿大，4)发展≥3个体质症状：6个月内体重下降> 10％，盗汗，不明原因的发热。post-ET MF有两个IWG-MRT主要标准：1)先前诊断为WHO标准定义的真性红细胞增多症的证据，2)骨髓纤维化症等级2-3(0-3量表)或等级3-4(0-4量表)。此外，IWG-MRT诊断次要标准还有五个，其中两项必须连同post-ET MF诊断的IWG-MRT主要标准在患者中检测：1)贫血症和≥2 g/dL的从基线血红蛋白水平降低，2)成白红细胞增多的外周血图片，3)脾肿大增加，定义为≥5cm的可触及的脾肿大增加或出现新的可触及的脾肿大，4)乳酸脱氢酶增加，和5)发展≥1个体质症状：6个月内体重下降> 10％，盗汗，不明原因的发热。在某些方面，本公开内容涉及TβRII拮抗剂治疗、预防真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症或降低其进展速率和/或严重性，特别是治疗、预防真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法和用途。在某些方面，本公开内容涉及TβRII拮抗剂治疗、预防原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症或降低其进展速率和/或严重性，特别是治疗、预防血小板增多症后的骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法和用途。
骨髓纤维化症的稳健预后建模始于2009年国际预后评分系统(IPSS)的开发[Cervantes F等. (2009) Blood 113:2895–2901]。骨髓纤维化症的IPSS适用于初次诊断时评估的患者，并使用5个独立的低生存预测因素：年龄> 65岁，血红蛋白<10 g/dL，白细胞计数> 25×109/L，循环母细胞(blast)≥1％ ，并存在体质症状。0、1、2和≥3个不利因素的存在分别定义低、中等-1、中等-2和高风险疾病。相应的中位生存期分别为11.3、7.9、4和2.3年。在某些方面，本公开内容涉及TβRII拮抗剂治疗、预防根据IPSS具有低、中等-1、中等-2和/或高风险骨髓纤维化症的患者的骨髓纤维化症或降低其进展速率和/或严重性的方法和用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及TβRII拮抗剂预防或延迟根据IPSS的骨髓纤维化症风险进展的方法和用途(例如，根据IPSS预防或延迟从低至中等-1风险、中等-1至中等-2风险和/或中等-2至高风险的风险进展)。在一些实施方案中，本公开内容涉及TβRII拮抗剂促进或增加根据IPSS的骨髓纤维化症风险消退的方法和用途(例如，根据IPSS促进或增加从高至中等-2风险、中等-2至中等-1风险和/或中等-1至低风险的消退)。
IWG-MRT随后开发了一种动态预后模型(动态国际预后评分系统[DIPSS])，该模型使用IPSS中使用的相同预后变量，但可以在疾病过程中随时应用[Passamonti F等.(2010) Blood. 115:1703–1708]。DIPSS为血红蛋白<10 g/dL分配两个而不是一个不利点，并相应修改风险分类：低(0个不利点)，中等-1(1或2个点)，中等-2(3或4个点)，高(5或6个点)。未达到相应的中位生存期，14.2、4和1.5年。在某些方面，本公开内容涉及TβRII拮抗剂治疗、预防根据DIPSS具有低、中等-1、中等-2和/或高-风险骨髓纤维化症的患者的骨髓纤维化症或降低其进展速率和/或严重性的方法和用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及TβRII拮抗剂预防或延迟根据DIPSS的骨髓纤维化症风险进展(例如根据DIPSS防止或延迟从低至中等-1风险、中等-1至中等-2风险和/或中等-2至高风险的风险进展)的方法和用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及TβRII拮抗剂促进或增加根据DIPSS的骨髓纤维化症风险消退的方法和用途(例如根据DIPSS促进或增加从高至中等-2风险、中等-2至中等-1风险和/或中等-1至低风险的消退)。
骨髓纤维化症存活的IPSS-和DIPSS-独立的风险因素随后被鉴定并包括不利的核型(即，复杂的核型或单一或两种异常，包括+8, −7/7q−, i(17q), inv(3), −5/5q−, 12p−或11q23重排) [Hussein等. (2010) Blood. 115:496–499], 红细胞输血需求[Tefferi等. (2009) Am J Hematol. 85:14–17]和血小板计数<100 × 109/L [Patnaik等.(2010) Eur J Haematol. 84:105–108]。因此，将DIPSS修改为DIPSS-plus，纳入了这另外三个DIPSS独立的风险因素：血小板计数<100×109/L，红细胞输血需求和不利的核型。基于上述八个风险因素的四个DIPSS-plus风险类别为低(无风险因素), 中等-1 (一个风险因素), 中等-2 (两个或三个风险因素)和高(四个或更多个风险因素)，其中位生存期分别为15.4, 6.5, 2.9和1.3年。在某些方面，本公开内容涉及TβRII拮抗剂治疗、预防根据DIPSS-plus具有低, 中等-1, 中等-2和/或高-风险骨髓纤维化症的患者的骨髓纤维化症或降低其进展速率和/或严重性的方法和用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及TβRII拮抗剂预防或延迟根据DIPSS-plus的骨髓纤维化症风险进展(例如根据DIPSS-plus防止或延迟从低至中等-1风险, 中等-1至中等-2风险和/或中等-2至高风险的风险进展)的方法和用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及TβRII拮抗剂促进或增加根据DIPSS-plus的骨髓纤维化症风险消退(例如根据DIPSS-plus促进或增加从高至中等-2风险, 中等-2至中等-1风险和/或中等-1至低风险的消退)的方法和用途。
自DIPSS-plus发布以来，已经发表了一些研究，提示额外的预后信息。例如，单体核型，inv(3)/ i(17q)异常，或任何两种循环母细胞> 9％，白细胞≥40×109/L或其它不利核型预测骨髓纤维化症的2年死亡率> 80％ [Tefferi等. (2011) Blood. 118:4595–4598.]。类似地，骨髓纤维化症中较差的存活与JAK2 46/1单倍型的缺合子性、低JAK2V617F等位基因负荷，或存在IDH、EZH2、SRSF2或ASXL1突变有关[Tefferi, Ayalew (2014) Am.J. Hematol. 89:916-925]。相反，JAK2V617F、MPL或TET2突变的存在或不存在似乎不影响存活。骨髓纤维化症中的存活也受到血清IL-8和IL-2R水平以及无血清轻链水平的增加的影响，二者均独立于DIPSS-plus。最近，Tefferi等人研究了254名骨髓纤维化症患者，并报告了JAK2的突变频率为58％、CALR的突变频率为25％、MPL的突变频率为8％和对于所有三种突变9％野生型(即三重阴性)[Tefferi等. (2014) Leukemia. 预发表为DOI 10.1038/leu.2014.3]。JAK2/MPL-未突变病例中CALR突变频率为74％。CALR突变与更年轻的年龄、更高的血小板计数和更低的DIPSS-plus评分相关。CALR突变的患者也不太可能贫血、需要输血或显示白细胞增多。在CALR突变的患者中，剪接体突变并不常见。在随后的570例患者的国际研究中，作者报道CALR + ASXL1-患者的存活时间最长(中位数为10.4年)，CALR-ASXL1+患者的存活时间最短(中位数为2.3年)[Tefferi等. (2014) Leukemia. 预发表为DOI10.1038/leu.2014.57]。CALR + ASXL1 +和CALR-ASXL1-患者具有相似的生存率，并被一起归入中等风险类别(中位生存期为5.8年)。随着总生存期的逐渐显现，携带某些突变(包括IDH和SRSF2)的患者的无白血病生存期也显著降低[Tefferi等. (2012) Leukemia. 26:475–480; Lasho等. (2012) Blood. 120:4168–4171]。另外，LNK和THPO的突变也与骨髓纤维化症相关。
在某些方面，本公开内容涉及TβRII拮抗剂治疗、预防具有以下一种或多种的患者的骨髓纤维化症或降低其进展速率和/或严重性的方法和用途：单体核型, inv(3)/i(17q)异常, 循环母细胞>9%和/或白细胞≥40 × 109/L, 对于JAK2 46/1单倍型的缺合子性、JAK2V617F突变、IDH1突变、IDH2突变、EZH2突变、SRSF2突变、ASXL1突变、增加的血清IL-8水平、增加的血清IL-2R水平、增加的游离轻链水平、JAK1突变、JAK2突变、JAK3突变、TYK2突变、MPL突变、CALR突变、CALR+ASXL1-、CALR-ASKL1+、CALR+ASKL1+、CALR-ASKL1-、TET2突变、THPO突变和LNK突变。
一般而言，PV的特征是红细胞质量增加[Vardiman等. (2009) Blood. 114:937–951; Stuart等. (2004) Am Fam Physician 69:2139–2144; Hensley等. (2013)ExpertOpin Pharmacother 14:609–617; Passamonti F. (2012) Blood 120:275–2845;和Vannucchi A.M. (2010) Intern Emerg Med. 5:177–184]。PV患者通常在骨髓中不仅增殖类红细胞，而且增殖髓样和巨核细胞成分，导致高红细胞、白细胞(WBC)和血小板计数。PV患者生活质量的通常下降，并有转化为继发性MF和急性髓细胞性白血病(AML)的风险。治疗选择是有限的(例如，低剂量阿司匹林、静脉切开术和羟基脲)，主要是姑息治疗，重点在于预防血栓形成的发生和改善与类红细胞、髓样和/或巨核细胞水平升高相关的症状。
PV的发病率高于MF(分别为44–57每100,000人vs 4–6每100,000)和PV患者的死亡风险高于一般人群[Mehta等. (2014) Leuk Lymphoma 55:595–600;和Passamonti等. (2004) Am J Med. 117:755–761]。PV影响男性多于女性，诊断年龄中位数为60岁；然而，约20-25％的患者年龄小于40岁PV[Tibes等. (2013) Expert Opin Emerg Drugs. 18:393–404]。PV患者的中位生存期为约14年，但60岁以上和/或有血栓形成史的患者的中位生存期要低得多(约8年)[Tefferi等. (2013) Leukemia 27:1874–1881]。
在大多数PV患者中发现JAK2激活突变后，对PV发病机制的了解大大改善[LevineRL, Pardanani A, Tefferi等. (2007) NatRev Cancer 7:673–683; Tefferi A. (2011)Leukemia 25:1059–1063;和Sever等. (2014) Leuk Lymphoma 55:2685–2690]。经典的JAK2 V617F突变在大约96％的PV患者中出现，约3％的PV患者出现JAK2外显子12突变。JAK2的过度激活自主激活下游途径，包括JAK-STAT，导致不受调节的造血。这些发现有助于形成诊断和治疗的标准。JAK2V617F突变的存在是诊断PV的主要标准，几种JAK2抑制剂正在开发中作为PV的靶向分子治疗[Hensley等. (2013) ExpertOpin Pharmacother 14:609–617]。
PV诊断目前基于2008年世界卫生组织(WHO)的诊断标准[Vardiman等. (2009)Blood. 114:937–951]。WHO诊断标准强调实验室值、形态特征和遗传数据，红细胞增多是第一个主要标准。根据WHO，红细胞增多的证据包括血红蛋白(Hgb)水平升高(男性> 18.5 g/dL，女性> 16.5 g/dL)，但其它组，例如英国血液学标准委员会和真性红细胞增多症研究组强调使用升高的血细胞比容(Hct)值(女性> 48％，男性> 52％)或红细胞质量测量[McMullin等. (2007) Br J Haematol 138:821–822;和Murphy S. (1999) Semin Hematol 36:9–13]。最近，一些研究者提出修订WHO标准，特别是在PV患者亚组中鉴定隐性PV(mPV)后[Barbui T等. (2014) Leukemia 28:1191–1195;和Barbui等. (2014) Am J Hematol 89:199–202]。与具有明显PV的患者不同，mPV患者倾向于具有正常或临界的Hgb和Hct值，但通常对JAK2突变为阳性，具有与PV一致的骨髓特征并具有低血清促红细胞生成素水平。已提出修订现行的WHO诊断标准，强调较低的Hgb阈值和/或使用Hct阈值，可能有助于准确诊断mPV患者，并可以对这些患者进行适当和及时的治疗。
在当前的风险分层模型中，年龄≥60岁和血栓形成史是用于将PV患者分为低风险组(0个风险因素)和高风险组(1或2个风险因素)的两个风险因素。在某些方面，本公开内容涉及TβRII拮抗剂在具有低或高风险PV的患者中治疗、预防或PV或PV的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法和用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及TβRII拮抗剂预防或延迟PV风险进展(例如，预防或延迟从低风险到高风险PV的风险进展)的方法和用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及TβRII拮抗剂促进或增加PV风险消退(例如，促进或增加从高风险到低风险PV的消退)的方法和用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及TβRII拮抗剂预防或延迟PV进展为骨髓纤维化症(PV后的骨髓纤维化症)的方法和用途。PV还具有转变成急性白血病的风险[Vannucchi A.M. (2010) Intern Emerg Med. 5:177–184]。PV患者在疾病10年后转变为AML的发生率为5％-15％，随着时间推移逐渐增加[Finazzi等. (2005) Blood 105:2664–2670]。高龄、女性、以及使用烷化药物、放射或细胞减灭性(cytoreductive)药物的组合与白血病转化的风险较高有关。在一些实施方案中，本公开内容涉及TβRII拮抗剂预防或延迟PV进展为AML的方法和用途。
PV的症状性负荷通常是严重的并且存在于具有该疾病的大多数患者中[Scherber等. (2011) Blood 118:401–408;和Hensley等. (2013) ExpertOpin Pharmacother 14:609–617]。最常见的不适是疲劳(88％的患者报告)、瘙痒症(62％)、盗汗(52％)、骨痛(50％)、发热(18％)和体重减轻(31％)、瘙痒症和疲劳是最普遍和麻烦的症状。瘙痒症表现为全身性烧灼感、刺痛、麻刺感或瘙痒，并且经常在与水接触(水生性瘙痒症)报道，大的体温变化、饮酒或运动后可引起类似症状。由于循环细胞因子(例如肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1和白细胞介素-6)升高，已经鉴定疲劳。此外，大约35至45％的患者发展为脾肿大，尽管其存在通常表示晚期疾病[Tefferi等. (2013) Leukemia 27:1874–1881]。脾肿大通常导致继发症状，包括腹痛、早饱、体重减轻和恶心，并且并发症可导致腹部器官受压和门静脉高血压。70％的患者存在PV相关的体质症状和与脾肿大相关的症状，并影响生活质量[Scherber等. (2011) Blood 118:401–408; Hensley等. (2013) ExpertOpin Pharmacother 14:609–617;和Abelsson等. (2013) Leuk Lymphoma 54:2226–2230]，如通过例如European Organisation for Research and Treatment of Cancer Quality ofLife Questionnaire Core 30和/或MPN-Symptom Assessment Form (SAF)问卷的工具所评估的。MPN-SAF Total Symptom Score是一种关注疲劳、注意力、早饱、不活动性、盗汗、瘙痒、骨痛、腹部不适、体重减轻和发热的十项评分工具。基于这些工具，发现PV患者诊断时的症状负荷与新诊断的原发性MF患者所观察到的症状负荷相当或更差。
一些最常见的PV并发症是血管和血栓栓塞事件和大出血[Vannucchi A.M.(2010) Intern Emerg Med. 5:177–184]。血栓形成是诊断PV时高达39％的患者中观察到的主要症状[Tefferi等. (2007) Semin Thromb Hemost 33:313–320; and Barbui T et al. (2012) Blood Rev 26:205–211]。最常见的主要血栓形成类型包括中风、短暂性脑缺血发作、心肌梗塞、外周动脉血栓形成、深静脉血栓形成，门静脉血栓形成和引起Budd-Chiari综合征的肝静脉血栓形成。除大血管并发症外，患者可能会出现微血管症状(如头痛、头晕、视力障碍、远端感觉异常、手足发绀)，其中红斑性肢痛是最典型的障碍，由四肢充血、发红和灼痛引起。在极度血小板增多症(例如，> 1500×109/L)的情况下，患者可能处于发生获得性von Willebrand综合征的风险中，其导致出血素质[Chou YS等. (2013) Eur J Haematol 90:228–236]。大出血也是PV患者发病率和死亡率的重要原因，累计发生率为39.6％(每人-年6.2％)。另外，已发现在大出血患者中总体存活显著短于没有这种并发症的患者(中位总存活期，约95个月)。
在某些方面，TβRII拮抗剂(例如TβRII多肽，所述TβRII多肽包含与SEQ ID NOs:5-17, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 47-49, 53-62, 101和103-105的任一个的氨基酸序列具有至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成)可以单独使用或与一种或多种支持疗法或活性剂(例如Janus激酶抑制剂，例如鲁索替尼)组合使用以治疗、预防真性红细胞增多症或降低其进展速率和/或严重性。具体而言，TβRII拮抗剂可单独使用或与一种或多种支持疗法或活性剂组合使用，以治疗、预防真性红细胞增多症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性。可根据本文公开的方法治疗的真性红细胞增多症的并发症包括例如类红细胞过度增殖、髓样细胞过度增殖、巨核细胞过度增殖、高红细胞水平、高白细胞水平、高血小板水平、疲劳、瘙痒症、盗汗、骨痛、发热和体重减轻、炎性细胞因子(例如IL-6)升高、炎性并发症、IL-6介导的炎性并发症、脾肿大、腹痛、早饱、体重下降、恶心、腹部器官受压、门静脉高血压、体质症状、血管并发症、血栓形成、微血管并发症和大血管并发症。
2008年发布的新的世界卫生组织(WHO)关于原发性血小板增多症(ET)的诊断标准在真性ET和早期骨髓纤维化症之间进行了重要区分，从而有助于确定更加均一的诊断人群，其部分特征在于更长生存期和较少转变为明显的MF。血小板增多症是诊断ET的先决条件，但这类事件也可能在PV和PMF患者中表现出来，但更少见[Birgegard G. (2015) TherAdv Hematol 6(3):142-156]。此外，ET的特征是白细胞计数较低、血红蛋白水平较低、血浆乳酸脱氢酶(LDH)水平低，而且重要的是早期骨髓纤维化症患者的预后较好[Barbui等.(2012) Blood 120: 569–571.]。最近针对WHO分类ET的预后模型指出，高风险患者自诊断的预期存活率为13.7年，中间组为24.5年，低风险患者为> 25年[Passamonti等. (2012)Blood 120: 1197–1201]。到目前为止，真正的ET和早期MF之间的区别对药物治疗没有很大的影响，因为这是由血栓出血事件的风险分层来引导的，但是它在与患者的交流中当然是重要的，并且可能很快对于采用开发中的新药的治疗决定是非常重要的。
ET和其它骨髓纤维化症病况中驱动突变的检测极大地增加了对该病的病理生理学的理解。如前所述，当发现JAK2基因的假性激酶结构域中的突变存在于大部分骨髓纤维化症患者中时，在骨髓纤维化症研究中取得突破。有趣的是，虽然约95％的PV患者携带JAK2V617F突变，但仅有约50％的ET患者是JAK2突变阳性[Campbell等. (2005) Lancet366:1945-1953]。此外，JAK2V617F + ET患者表现出与JAK2V617F-ET患者略有不同的表型模式，表现出更高的Hb和WBC水平，更低的血清促红细胞生成素和更低的血小板。几项研究表明，与JAK2V617F-ET患者相比，JAK2V617F + ET患者血栓形成的风险增加[Ziakas P.(2008) Haematologica 93:1412–1414; Dahabreh等. (2009) Leuk Res 33: 67–73;和Lussana等. (2009) Thromb Res 124: 409–417]。最近的一项研究表明，JAK2V617F等位基因负荷的进展，特别是在高稳定水平下，与MF的发展显著相关[Alvarez-Larran A等.(2014b) Am J Hematol 89: 517–523]。
最近在骨髓纤维化症中突变模式的添加是检测CALR的驱动突变，CALR是一种功能部分未知的高度保守的多功能内质网蛋白。在ET和PMF患者中发现该突变，但几乎只在没有JAK2或MPL突变的那些患者中发现[Klampfl等. (2013) N Engl J Med 369: 2379–2390;Nangalia等. (2013) N Engl J Med 369: 2391–2405.]。ET和PMF的频率均为约20％，这意味着约85％的ET患者现在可以用分子标记诊断。有趣的是，ET中的CALR突变产生与JAK2V617F+患者明显不同的表型特征。与JAK2V617F+患者相比，CALR +患者更年轻，更常见的是男性，血小板水平更高，白细胞水平更低[Gangat等. (2014) Eur J Haematol 94:31–36; Rotunno等. (2014) Blood 123: 1552–1555; Rumi等. (2014) Blood 123:2416–2419; Tefferi等. (2014c) Leukemia 28: 2300–2303]。此外，血栓形成率的差异非常明显：10年累积发生率分别为5.1％(JAK2V617F +患者)和14.5％(CALR +患者)，相应地，15年累积发生率为10.5％(JAK2V617F +患者)和25.1％(CALR +患者)。
在当前的风险分层模型中，年龄≥60岁和血栓形成史是用于将ET分为低风险组(0个风险因素)和高风险组(1或2个风险因素)的两个风险因素。在某些方面，本公开内容涉及TβRII拮抗剂在具有低或高风险ET的患者中治疗、预防ET或ET的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性的方法和用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及TβRII拮抗剂预防或延迟ET风险进展(例如，预防或延迟从低风险到高风险ET的风险进展)的方法和用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及TβRII拮抗剂促进或增加ET风险消退(例如，促进或增加从高风险到低风险ET的消退)的方法和用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及TβRII拮抗剂预防或延迟ET进展成骨髓纤维化症(ET后的骨髓纤维化症)的方法和用途。ET也有风险转化为急性白血病[Vannucchi A.M. (2010) Intern Emerg Med. 5:177–184]。在一些实施方案中，本公开内容涉及TβRII拮抗剂预防或延缓ET进展为AML的方法和用途。
研究已经显示ET患者具有明显的症状负荷并对生活质量产生影响。在国际努力中，特异性针对MPN群体的症状评估工具已经开发并验证[Emanuel等. (2012) J ClinOncol 30: 4098–4103;和Scherber等. (2011) Blood 118: 401–408]。ET的症状/并发症包括，例如：疲劳、盗汗、恶心、麻木、视力障碍和体重减轻，以及由微血管并发症如头痛、胸痛、头晕和红斑性肢痛所致的症状/并发症。此外，约20％的ET患者在诊断前或诊断时已经发生血栓形成。在ET患者中也经常观察到轻度脾肿大。
在某些方面，TβRII拮抗剂(例如TβRII多肽，所述TβRII多肽包含与SEQ ID NOs:5-17, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 47-49, 53-62, 101和103-105的任一个的氨基酸序列具有至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成)可单独使用或与一种或多种支持疗法或活性剂(例如Janus激酶抑制剂，例如鲁索替尼)组合使用以治疗、预防原发性血小板增多症或降低其进展速率和/或严重性。具体而言，TβRII拮抗剂可单独使用或与一种或多种支持疗法或活性剂组合使用，以治疗、预防原发性血小板增多症的一种或多种并发症或降低其进展速率和/或严重性。可以根据本文公开的方法治疗的原发性血小板增多症的并发症包括，例如血小板增多症、疲劳、盗汗、恶心、麻木、视力障碍、体重减轻、微血管并发症、大血管并发症、头痛、胸痛、头晕、红斑性肢痛、血栓形成、脾肿大、炎性细胞因子升高、炎性并发症、IL-6炎性并发症、炎性细胞因子水平升高、IL-6水平升高、脉管系统并发症和大出血。
如上所讨论的，Janus激酶2(JAK2)的功能获得性突变JAK2V617F的发现已使得显著改进对骨髓纤维化症的基础性生物学的理解，以及JAK2抑制剂鲁索替尼的发展，鲁索替尼是FDA批准用于治疗骨髓纤维化症的第一种药物[Baxter等. (2005) Lancet 365:1054–1061; James C.等. (2005) Nature 434:1144–1148; Kralovics等. (2005) N Engl J Med. 352:1779–1790;和Levine等. (2005) Cancer Cell 7:387–397]。JAK2V617F存在于绝大多数骨髓纤维化症(50-60％)和PV(95％)患者和约一半ET(约50％)患者中[Baxter等. (2005) Lancet 365:1054–1061; James C.等. (2005) Nature 434:1144–1148;Kralovics等. (2005) N Engl J Med. 352:1779–1790; Levine等. (2005) Cancer Cell7:387–397;和Quintas-Cardama等. (2011) Nat Rev Drug Discov 10:127–140]。已经在具有骨髓增生性病症的患者中鉴定出与JAK-STAT途径相关的额外突变，包括例如MPL,CALR, LNK, TET2, IDH1, IDH2,THPO和ASXL1 [Pikman等. (2006) PLoS Med 3:e270; Oh等. (2010) Blood 116:988–992; Delhommeau等. (2009) N Engl J Med 360:2289–2301;和Carbuccia等. (2009) Leukemia 23:2183–2186]。JAK2V617F和其它突变可能同时发生在同一患者中，并且单个患者可能发生具有不同突变概况的多个克隆。JAK2V617F的存在与骨髓增生性疾病的症状和进展阶段恶化至晚期相关[Barosi等. (2007) Blood 110:4030–4036;和Tefferi等. (2005) Br J Haematol 131:320–328。
随着这些遗传标志物的发现，新的治疗策略部分集中于实现骨髓增生性疾病相关等位基因负荷的减少。在骨髓增生性疾病的情况下，等位基因负荷一般被定义为给定患者的突变体拷贝数(例如JAK2V617F)与总基因拷贝数(例如JAK2V617F/JAK2V617F +野生型JAK2])的比率。在一些研究中，低等位基因负荷的患者比高等位基因负荷的患者预后更好。几项MF研究已将高等位基因负荷与疾病进展联系起来，例如，一项研究显示，某些突变基因的较高等位基因负荷与AML进展相关，这与观察到大多数白血病患者对于JAK2V617F是纯合的观察一致[Barosi等. (2007) Blood 110:4030–4036;和Passamonti等. (2010)Leukemia 24:1574–1579]。此外，研究已经一致地证明等位基因负荷增加和脾肿大恶化和髓细胞生成增加之间的关联[Passamonti等. 2009) Haematologica 94:7–10]。
在某些方面，本公开内容提供了用于治疗、预防骨髓增生性病症[例如骨髓纤维化症(例如原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)、真性红细胞增多症(例如隐性真性红细胞增多症)和原发性血小板增多症]或骨髓增生性病症的一种或多种并发症(例如纤维化、脾肿大、炎症、贫血症和髓外造血)，或降低其进展速率和/或严重性的方法，包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂(例如TβRII多肽，所述TβRII多肽包含与SEQ ID NOs: 5-17, 25, 27, 29, 31, 33,35, 37, 39, 41, 43, 47-49, 53-62, 101和103-105的任一个的氨基酸序列具有至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成)，任选地与用于治疗骨髓增生性病症的一种或多种另外的支持疗法和/或活性剂(例如Janus激酶抑制剂，例如鲁索替尼)组合，其中患者具有一种或多种骨髓增生相关等位基因(例如JAK2, MPL, CALR, LNK, TET2, IDH1, IDH2, THPO和ASXL1)。在一些实施方案中，所述方法减少患者中一种或多种骨髓增生相关等位基因(例如JAK2, MPL, CALR, LNK, TET2, IDH1, IDH2, THPO和ASXL1)的等位基因负荷。在一些实施方案中，患者具有一种或多种骨髓增生相关JAK2等位基因。在一些实施方案中，所述方法减少一种或多种骨髓增生相关JAK2等位基因的等位基因负荷。在一些实施方案中，患者具有JAK2V617F骨髓增生相关等位基因。在一些实施方案中，所述方法减少JAK2V617F骨髓增生相关等位基因负荷。
在某些方面，本公开内容提供用于减少具有骨髓增生性病症[例如骨髓纤维化症(例如原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)、真性红细胞增多症(例如隐性真性红细胞增多症)和原发性血小板增多症]的患者的骨髓增生相关等位基因负荷的方法：通过向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂(例如TβRII多肽，所述TβRII多肽包含与SEQ ID NOs: 5-17, 25, 27, 29, 31,33, 35, 37, 39, 41, 43, 47-49, 53-62, 101和103-105的任一个的氨基酸序列具有至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成)，任选地与用于治疗骨髓增生性病症的一种或多种另外的支持疗法和/或活性剂组合(例如Janus激酶抑制剂，例如鲁索替尼)。在一些实施方案中，患者具有一种或多种选自JAK2, MPL, CALR, LNK, TET2, IDH1, IDH2, THPO和ASXL1的骨髓增殖相关等位基因。在一些实施方案中，患者具有一种或多种JAK2骨髓增生相关等位基因。在一些实施方案中，患者具有JAK2V617F骨髓增生性相关等位基因。
根据本文所述的方法，TβRII拮抗剂(例如TβRII多肽，所述TβRII多肽包含与SEQID NOs: 5-17, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 47-49, 53-62, 101和103-105的任一个的氨基酸序列具有至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%,98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成)可以单独施用于受试者，或者与一种或多种另外的活性剂或支持疗法组合施用，例如可用于治疗骨髓增生性病症(例如，原发性骨髓纤维化症性、真性红细胞增多症、隐性红细胞增多症、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)，以及骨髓增生性病症的一种或多种并发症的活性剂或支持疗法。
如本文所用，“与...组合”，“的组合”，“与...联合”或“联合”施用是指任何形式的施用，使得另外的疗法(例如第二、第三、第四等)仍然在身体中有效(例如，多种化合物在患者中同时有效，其可包括所述化合物的协同效应)。有效性可能与血液、血清或血浆中可测量的药剂浓度无关。例如，不同的治疗化合物可以在相同的制剂中或在分开的制剂中同时或顺序地以不同的时间表施用。因此，接受这种治疗的个体可以从不同疗法的组合效应中受益。本公开内容的一种或多种TβRII拮抗剂可与一种或多种其它另外的药剂或支持疗法同时，在其之前或之后施用。通常，每种治疗剂将以针对该特定药剂确定的剂量和/或时间表来施用。用于方案的特定组合将考虑本公开内容的TβRII拮抗剂与疗法和/或所需效果的相容性。
贫血症的管理可能是治疗骨髓纤维化症患者的最具挑战性的方面之一[TefferiA. (2011) Blood 117(13):3949-3504; Barosi等.(2011) Expert Opin Pharmacother12(10):1597-1611]。输血(全血或红细胞输血)是症状性贫血症的骨髓纤维化症患者的标准疗法。除输血外，还有多种常规药剂用于治疗这些患者的贫血症。例如，红细胞生成刺激剂[例如ESA如促红细胞生成素(EPO)及其衍生物]、雄激素(如庚酸睾酮和氟甲睾酮)、泼尼松、达那唑、沙利度胺、泼尼松和来那度胺常用于治疗骨髓纤维化症的贫血症。一般来说，ESA用于中度，非输血依赖性贫血症和血清促红细胞生成素水平低的患者。反应率在20-60％变化，对于达贝泊汀-α与常规重组促红细胞生成素没有明确支持。ESA反应通常是短暂的(约1年)。如果ESA不起作用或疗效差，达那唑或雄激素制剂通常用于治疗贫血症患者，其反应率为约20％。与减量泼尼松联合的小剂量沙利度胺已在约20-40％的患者中产生对贫血症的反应[Thapaliya等. (2011) Am J Hematol 86(1):86-98]。然而，沙利度胺治疗通常对周围神经病变、便秘和嗜睡的耐受性差，导致在大多数患者中停止药物。在del(5q31)相关性贫血症的骨髓纤维化症患者中，来那度胺是推荐的一线疗法，因为已经报道了显著的改善，贫血症消除和偶尔证实的分子缓解[Tefferi等. (2007) Leukemia 21(8):1827-1828]。
在某些方面，本公开内容涉及TβRII拮抗剂在具有贫血症的患者中治疗、预防骨髓纤维化症或降低其进展速率和/或严重性的方法和用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及TβRII拮抗剂治疗、预防骨髓纤维化症患者中的贫血症或降低其进展速率和/或严重性的方法和用途。在一些实施方案中，本公开内容涉及在有需要的患者中治疗、预防骨髓纤维化症或骨髓纤维化症的一种或多种并发症(例如贫血症)或降低其进展速率和/或严重性的方法，包括与一种或多种选自以下的另外的活性剂联合施用一种或多种TβRII拮抗剂：红细胞生成刺激剂[例如ESA如促红细胞生成素(EPO)及其衍生物]、雄激素(例如庚酸睾酮和氟甲睾酮)、泼尼松、达那唑、沙利度胺、泼尼松和来那度胺。在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗、预防有需要的骨髓纤维化症患者中的贫血症或降低其进展速率和/或严重性的方法，包括与一种或多种选自以下的另外的活性剂联合施用一种或多种TβRII拮抗剂：促红细胞生成剂[例如ESA如促红细胞生成素(EPO)及其衍生物]、雄激素(如庚酸睾酮和氟甲睾酮)、泼尼松、达那唑、沙利度胺、泼尼松和来那度胺。在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗、预防有需要的骨髓纤维化症患者中的贫血症或降低其进展速率和/或严重性的方法，包括与输血(全血或红细胞输血)联合施用一种或多种TβRII拮抗剂。
本公开内容的一种或多种TβRII拮抗剂可以与EPO受体激活剂组合使用，以实现红细胞增加，特别是在较低剂量范围内。这可有利于减少与高剂量EPO受体激活剂相关的已知的脱靶效应和风险。ESA的主要不良反应包括例如血细胞比容或血红蛋白水平的过度增加和红细胞增多症。血细胞比容水平升高可导致高血压(更特别是高血压加重)。已经报道的ESA的其它不良反应(其中一些与高血压有关)是头痛、流感样综合征、分流阻塞、由于血栓形成的脑惊厥和心肌梗塞、高血压性脑病和红细胞血细胞发育不全。参见例如Singibarti(1994) J. Clin Investig 72(suppl 6), S36-S43; Horl等. (2000) Nephrol DialTransplant 15(suppl 4), 51-56; Delanty等. (1997) Neurology 49, 686-689;和Bunn(2002) N Engl J Med 346(7), 522-523)。在某些实施方案中，本公开内容提供通过向患者施用治疗有效量的一种或多种TβRII拮抗剂和EPO受体激活剂来治疗或预防骨髓纤维化症患者中的贫血症的方法。在某些实施方案中，本公开内容的TβRII拮抗剂可以与EPO受体激活剂组合使用，以降低对ESA的不良反应敏感的患者中这些激活剂的所需剂量。这些方法可以用于患者的治疗性和预防性治疗。
当监测人血红蛋白和/或血细胞比容水平时，对于适当年龄和性别类别的低于正常水平可能指示贫血症，尽管考虑到个体差异。例如，在健康成人中血红蛋白水平为10-12.5g/dl，通常约为11.0g/dl被认为在正常范围内，尽管就治疗而言，较低的目标水平可能导致较少的心血管副作用。参见例如Jacobs等(2000)Nephrol Dial Transplant 15,15-19。或者，血细胞比容水平(由细胞占据的血液样本的体积百分比)可以用作贫血症的量度。健康个体的血细胞比容水平为成年男性约41-51％，成年女性35-45％。在某些实施方案中，患者可以用剂量方案(例如TβRII拮抗剂，任选地与一种或多种另外的活性剂或支持疗法组合)治疗，所述剂量方案旨在使患者恢复至红细胞、血红蛋白和/或红细胞比容的目标水平或允许减少或消除红细胞输血(减少输血负荷)，同时保持红细胞、血红蛋白和/或血细胞比容的可接受水平。由于血红蛋白和血细胞比容水平因人而异，最佳情况下，目标血红蛋白和/或血细胞比容水平可针对每个患者个体化。
在接受频繁输注全血或红细胞的患者中，铁稳态的正常机制可能不堪重负，最终导致重要组织如心脏、肝和内分泌腺体中铁的毒性和潜在致命的累积。定期的红细胞输血输血需要暴露于不同的献血者单位，因此具有更高的同种免疫风险。血管通路困难、铁螯合作用的可用性和依从性以及高成本是限制红细胞输血次数有益的一些原因。
在某些方面，任选地与EPO受体激活剂组合的一种或多种TβRII拮抗剂可以与一种或多种铁螯合剂组合使用，以治疗、预防骨髓纤维化症患者中铁过载或降低其进展速率和/或严重性。在一些实施方案中，任选地与EPO受体激活剂组合的一种或多种TβRII拮抗剂可以与一种或多种铁螯合剂组合使用以治疗、预防骨髓纤维化症患者的组织铁过载[例如脾(脾的)，肝(肝的)，心脏(心脏的)铁过载]或降低其进展速率和/或严重性。有效的铁螯合剂应该能够选择性地结合和中和三价铁，这是非转铁蛋白结合的铁的氧化形式，其可能通过催化产生羟基自由基和氧化产物而导致大多数铁毒性[参见例如Esposito等. (2003)Blood 102:2670-2677]。这些药剂在结构上是多样的，但都具有氧或氮供体原子，能够以1:1(六齿剂)、2: 1(三齿)或3: 1(二齿)化学计量形式与各个铁原子形成中和性八面体配位络合物[Kalinowski等. (2005) Pharmacol Rev 57:547-583]。通常，有效的铁螯合剂也具有相对低的分子量(例如小于700道尔顿)，在水和脂质中都具有溶解性，从而能够接近受影响的组织。铁螯合分子的具体实例包括去铁胺，需要每日肠胃外给药的细菌来源的六齿剂，和口服活性合成剂去铁酮(二齿)和地拉罗西(三齿)。由同一天施用两种铁螯合剂组成的联合疗法在对螯合单一疗法没有反应的患者中显示出希望，并且也在克服单独去铁胺的患者依从性差的问题中显示出希望[Cao等. (2011) Pediatr Rep 3(2):e17;和Galanello等.(2010) Ann NY Acad Sci 1202:79-86]。
在对骨髓增生性病症(例如，骨髓纤维化症、真性红细胞增多症和原发性血小板减少症)患者的管理中，细胞减灭剂(cytoreductive agent)已成为用于大多数症状性脾肿大患者的治疗选择。羟基尿素(羟基脲，HC)是最常用的细胞减灭剂，其在较高剂量下通常产生适度的反应。然而，HC通常会加重血细胞减少，因此通常不能很好耐受。据报道，高达35％的用HC治疗的患者的脾尺寸减小25％-50％[Martínez-Trillos等. (2010) Ann Hematol.89(12):1233–1237]。在对HC无反应的患者中，可使用白消安或美法仑，尤其是在老年患者中，因为有证据表明这些药剂可增加白血病转化的频率。脾对低剂量沙利度胺的反应很低(<20％)。然而，来那度胺已显示在包括一些对在先沙利度胺治疗失败的患者的研究中导致33％的反应率。对于极大的顽固性脾肿大的情况，每月静脉注射克拉屈滨疗程产生的反应高达50％，其中严重但可逆的血细胞减少是主要毒性[Faoro等. (2005) Eur J Haematol74(2):117–120]。在最近的研究中，鲁索替尼已被证明优于HC，因此正成为控制症状性或进行性脾肿大的一线药剂。正在评估其它JAK抑制剂(例如SAR302503, CYT387, pacritinib,AZD-1480, BMS-911543, NS-018, LY2784544, 来他替尼, SEP-701和AT-9283)用于治疗MF、ET和PV，因此可有助于减少此类患者的脾肿大。
尽管用脾切除术管理骨髓增生性疾病相关的脾肿大是充分建立的，但手术伴随的发病率和死亡率分别为约31％和9％[Mesa RA. (2009) Blood 113(22):5394–5400]。有时会导致肝脏迅速增大的肝髓外造血是脾切除术后罕见但公认的并发症，如同血栓形成风险增加。其结果是，脾切除术通常只限于所选具有难治性溶血或贫血症，症状性脾肿大，显著脾梗塞，严重的门静脉高血压，和/或严重分解代谢过度症状的患者。放射疗法可以替代具有症状性脾肿大和足够血小板计数的患者的脾切除术。然而，研究表明，44％的患者在放射疗法后出现血细胞减少，其中13％是致命的[Elliott MA等. (1999) Blood Rev. 13(3):163–170]。低剂量放射疗法仍然是非脾髓外造血的优选治疗法，包括腹膜和胸膜累及，伴随作为结果的腹水和胸腔积液。
在某些方面，本公开内容提供用于治疗、预防骨髓增生性病症(例如原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症、隐性红细胞增多症、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)或骨髓增生性病症的一种或多种并发症，或降低其进展速率和/或严重性，包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂(例如TβRII多肽，所述TβRII多肽包含与SEQ ID NOs: 5-17, 25, 27, 29, 31, 33,35, 37, 39, 41, 43, 47-49, 53-62, 101和103-105的任一个的氨基酸序列具有至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成)与一种或多种用于治疗脾肿大和/或髓外造血的活性剂或支持疗法组合。用于治疗脾肿大和/或髓外造血的活性剂或支持疗法包括例如细胞减灭剂、沙利度胺(例如Immunoprin、Talidex、Talizer和Thalomid)、来那度胺(例如Revlimid)、羟基脲(例如Apo-羟基脲、Droxia和Hydrea)、白消安(例如Myleran和Busulfex IV)、美法仑(例如Alkeran和Sarcolysin)、克拉屈滨(例如Leustatin、Litak和Movectro)、脾切除术、放射疗法、JAK抑制剂(例如鲁索替尼、SAR302503、CYT387、pacritinib、AZD-1480、BMS-911543、NS-018、LY2784544、来他替尼、SEP-701和AT-9283)。
具有骨髓增生性病症(例如，原发性骨髓纤维化症性、真性红细胞增多症，隐性红细胞增多症，原发性血小板增多症，真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)的患者遭受风险增加的主要心血管事件[Barbui等. (2010)Blood 115(4):778-782]。包括在多机构系列的7.2％ PMF患者报告了致死性和非致死性血栓形成，其比率为1.75％患者-年，与ET(1％-3％患者-年)报告的没有不同。血栓形成的风险因素是年龄> 60岁和JAK2V617F突变状态，尤其是如果后者与白细胞增多有关。通常处方羟基脲和低剂量阿司匹林以治疗或预防MF患者中的血栓形成。
在某些方面，本公开内容提供治疗、预防骨髓增生性病症(例如原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症，隐性红细胞增多症，原发性血小板增多症，真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)或骨髓增生性病症的一种或多种并发症，或降低其进展速率和/或严重性的方法，包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂(例如TβRII多肽，所述TβRII多肽包含与SEQ ID NOs: 5-17, 25, 27, 29, 31, 33,35, 37, 39, 41, 43, 47-49, 53-62, 101和103-105的任一个的氨基酸序列具有至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成)与治疗血栓形成的一种或多种活性剂或支持疗法组合。用于治疗血栓形成的活性剂或支持疗法包括例如羟基脲(例如Apo-羟基脲、Droxia和Hydrea)和阿司匹林。
在某些方面，本公开内容提供治疗、预防骨髓增生性病症(例如原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症，隐性红细胞增多症，原发性血小板增多症，真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)或骨髓增生性病症的一种或多种并发症，或降低其进展速率和/或严重性的方法，包括给予有需要的患者有效量的TβRII拮抗剂(例如TβRII多肽，所述TβRII多肽包含与SEQ ID NOs: 5-17, 25, 27, 29, 31, 33,35, 37, 39, 41, 43, 47-49, 53-62, 101和103-105的任一个的氨基酸序列具有至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成)与一种或多种JAK抑制剂组合。可根据本公开内容的方法使用的JAK抑制剂包括例如鲁索替尼、fedratinib (SAR302503)、monoelotinib (CYT387)、pacritinib、来他替尼、AZD-1480、BMS-911543、NS-018、LY2784544、SEP-701、XL019和AT-9283。
除了JAK2抑制之外，正在研究用于治疗骨髓增生性病症的其它几种治疗策略，包括免疫调节药物(IMiD)、雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)途径的抑制剂和表观遗传因子调节剂[Mascarenhas等. (2013) Haematologica 98(10):1499-1509]。
Pomalidomide是正在一系列剂量范围内进行评估的第二代免疫调节药物，用于治疗MF、PV和ET[Begna等. (2011) Leukemia 25:301–304;和Mesa等. (2010) Am J Hematol85:129–130]。在58例患者中评估低剂量pomalidomide和泼尼松的2期试验报道了24％的JAK2V617F阳性患者有贫血症反应。没有突变的患者中不存在贫血症反应，并且通过pomalidomide诱导的嗜碱性粒细胞增多和没有明显的脾肿大来预测。对2007至2010年招募的连续三期进行1期和2期临床试验的82例可评估MF患者进行分析，根据IWG-MRT标准，27％的患者显示贫血症反应。在治疗的前6个月中，在JAK2V617F存在下以及在没有明显的脾肿大的情况下，最常发生贫血症反应。
在某些方面，本公开内容提供治疗、预防骨髓增生性病症(例如原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症，隐性红细胞增多症，原发性血小板增多症，真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)或骨髓增生性病症的一种或多种并发症，或降低其进展速率和/或严重性的方法，包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂(例如TβRII多肽，所述TβRII多肽包含与SEQ ID NOs: 5-17, 25, 27, 29, 31, 33,35, 37, 39, 41, 43, 47-49, 53-62, 101和103-105的任一个的氨基酸序列具有至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成)与一种或多种免疫调节剂组合。可根据本公开内容的方法使用的免疫调节剂包括例如pomalidomide(例如Pomalyst和Imnovid)。
除JAK/STAT之外，已发现其它相关途径，例如磷脂酰肌醇3-激酶/雷帕霉素的哺乳动物靶标(PI3K/mTOR)途径在骨髓增生性病症患者中失调[Tefferi A. (2011) Am JHematol 86(12):1017–1026]。在一些研究中，已经显示当用mTOR抑制剂依维莫司治疗时JAK2V617F阳性细胞的增殖减少[Guglielmelli等. (2011) Blood 118(8):2069–2076;和Vannucchi等. (2009) Blood 114(22):2914]。也报道了39例用依维莫司治疗的PMF或post-PV/ET MF的高风险或中等风险患者的I/II期研究结果。在30例可评估的患者中，69％和80％分别经历了全身症状和瘙痒症的完全消退。当应用欧洲骨髓纤维化症网络标准(8个主要，7个中等和3个轻微反应)时，反应率为60％，或当使用国际骨髓纤维化症研究和治疗工作组标准(一个部分反应，6个临床改善)时，反应率为23％。这些结果提供了概念证明，即靶向mTOR途径在骨髓增生性肿瘤患者中可具有临床相关性。
在某些方面，本公开内容提供治疗、预防骨髓增生性病症(例如原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症，隐性红细胞增多症，原发性血小板增多症，真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)或骨髓增生性病症的一种或多种并发症，或降低其进展速率和/或严重性的方法，包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂(例如TβRII多肽，所述TβRII多肽包含与SEQ ID NOs: 5-17, 25, 27, 29, 31, 33,35, 37, 39, 41, 43, 47-49, 53-62, 101和103-105的任一个的氨基酸序列具有至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成)与一种或多种mTOR抑制剂组合。可根据本公开内容的方法使用的mTOR抑制剂包括例如雷帕霉素、西罗莫司、deforolimus、依维莫司、替西罗莫司、NVP-BEZ235、BGT226、SF1126、PK1-587、INK128、AZD8055和AZD2014。
组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制对JAK-STAT途径具有抑制作用，并且HDAC抑制剂givinostat (ITF2357), panobinostat (LBH589)和pracinostat (SB939)目前都在进行MF研究[Quintas-Cardama等. (2011) Therapy Blood 118(Suppl. 1); Mascarenhas等.(2011) Blood. 118(Suppl. 1);和Rambaldi等. (2011) Blood 118(Suppl. 1)]。据报道，用pracinostat治疗使得27％患者的脾脏大小减小，并在约10％ MF患者中产生IWG标准贫血症反应。剂量为20、25和30 mg每日三次的Panobinostat在1/2期试验结果中也显示出促进活性。根据IWG标准报告了脾肿大的持久(> 6个月)反应、成白红细胞增多病(leukoerythroblastosis)和贫血症反应。基于对羟基脲无反应的PV患者的随机2期临床试验的结果，Givinostat亦显示出前景。在约50％的患者中观察到完全或部分的反应，并且组合通常良好耐受。
在某些方面，本公开内容提供治疗、预防骨髓增生性病症(例如原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症，隐性红细胞增多症，原发性血小板增多症，真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)或骨髓增生性病症的一种或多种并发症，或降低其进展速率和/或严重性的方法，包括向有需要的患者施用有效量的TβRII拮抗剂(例如TβRII多肽，所述TβRII多肽包含与SEQ ID NOs: 5-17, 25, 27, 29, 31, 33,35, 37, 39, 41, 43, 47-49, 53-62, 101和103-105的任一个的氨基酸序列具有至少85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%或100%同一性的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成)与一种或多种组蛋白脱乙酰酶抑制剂组合。可以根据本公开内容的方法使用的组蛋白脱乙酰酶抑制剂包括例如givinostat、panobinostat和pracinostat。
本公开内容预期TβRII拮抗剂与一种或多种用于治疗纤维化病症的疗法组合使用。例如，可将TβRII拮抗剂与细胞毒素、免疫抑制剂、放射性毒性剂和/或治疗性抗体组合(即共同)施用。本发明考虑的具体的共治疗剂包括但不限于类固醇类(例如皮质甾类，例如泼尼松)、免疫抑制药和/或抗炎药(例如γ-干扰素、环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、青霉胺、环孢菌素、秋水仙碱、抗胸腺细胞球蛋白、麦考酚酸酯和羟氯喹)、细胞毒性药物、钙通道阻断剂(例如硝苯地平)、血管紧张素转化酶抑制剂(ACE)抑制剂、对-氨基苯甲酸(PABA)、二甲亚砜、转化生长因子β (TGFβ)抑制剂、白介素-5 (IL-5)抑制剂和泛胱天蛋白酶抑制剂。可与TβRII拮抗剂联用的其它抗纤维化药包括但不限于凝集素(如描述于例如美国专利号：7,026,283，其完整内容通过引用结合到本文中)，以及Wynn等(2007，J Clin Invest 117:524-529，其完整内容通过引用结合到本文中)描述的抗纤维化药。例如，其它抗纤维化药和疗法包括但不限于各种抗炎药/免疫抑制药/细胞毒性药(包括秋水仙碱、硫唑嘌呤、环磷酰胺、泼尼松、沙利度胺、己酮可可碱和茶碱)、TGFβ信号传导调节剂(包括松弛素、SMAD7、HGF和BMP7以及TGFβl、TβRI、TβRII、EGR-I和CTGF抑制剂)、细胞因子和细胞因子受体拮抗剂(IL-lβ、IL-5、IL-6、IL-13、IL-21、IL-4R、IL-13Rαl、GM-CSF、TNF-α、制癌蛋白M、WlSP-I和PDGF的抑制剂)、细胞因子和趋化因子(IFN-γ、IFN-α/β、IL-12、IL-10、HGF、CXCLl0和CXCL11)、趋化因子拮抗剂(CXCLl、CXCL2、CXCL12、CCL2、CCL3、CCL6、CCL17和CCL18的抑制剂)、趋化因子受体拮抗剂(CCR2、CCR3、CCR5、CCR7、CXCR2和CXCR4的抑制剂)、TLR拮抗剂(TLR3、TLR4和TLR9的抑制剂)、血管生成拮抗剂(VEGF特异性抗体和腺苷脱氨酶替代疗法)、抗高血压药(ANG 11、ACE和醛固酮的β阻断剂和抑制剂)、血管活性物质(ET-1受体拮抗剂和bosetan)、合成和加工胶原的酶的抑制剂(脯氨酰羟化酶抑制剂)、B细胞拮抗剂(利妥昔单抗)、整联蛋白/粘附分子拮抗剂(阻断αlβl和αvβ6整联蛋白的分子以及整联蛋白相关激酶抑制剂和ICAM-I和VCAM-I的特异性抗体)、靶向成肌纤维细胞的促凋亡药物、MMP抑制剂(MMP2、MMP9和MMP12的抑制剂)和TlMP抑制剂(TIMP-1的特异性抗体)。
在某些实施方案中，主题方法可与针对增殖性病症(例如肿瘤)的治疗或预防的其它常规抗癌治疗方法联用。例如，这类方法可用于预防性癌症预防、手术后癌症复发和转移预防，并可用作其它常规癌症疗法的辅助剂。本公开内容认识到可通过使用主题拮抗剂治疗剂提高常规癌症疗法(例如化学疗法、放射疗法、光线疗法、免疫疗法和手术)的疗效。
当本文公开的治疗剂与另一种常规抗肿瘤药组合同时或序贯施用时，这类治疗剂可提高抗肿瘤药的治疗作用或克服细胞对所述抗肿瘤药的抗性。这允许降低抗肿瘤药的剂量，从而降低不期望的副作用或恢复抗性细胞中抗肿瘤药的疗效。按照本公开内容，本文所述TβRII拮抗剂可与用于治疗疾病的其它组合物和方法联用。例如，可用与TβRII拮抗剂组合的手术、放射或化学疗法按常规治疗肿瘤，然后可将TβRII拮抗剂随后施用患者以延长微转移的蜇伏并稳定任何残留的原发性肿瘤。
在本发明的某些方面，可用于与TβRII拮抗剂和一种或多种癌症疗法的组合疗法的其它治疗剂：例如手术、细胞毒性剂、包括辐射或施用放射性物质的放射治疗、化学治疗剂、抗激素药、生长抑制药、抗瘤组合物和用本文所列和本领域已知的抗癌药治疗或其组合。
本文所用术语“细胞毒性剂”是指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化学治疗剂，例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花属生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它嵌入剂、酶和其片段(例如溶核酶)、抗生素和毒素(例如小分子毒素)或细菌、真菌、植物或动物源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体，以及下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。下面描述了其它细胞毒性剂。杀肿瘤剂致使肿瘤细胞遭破坏。
“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂，例如塞替派和CYTOXAN®环磷酰胺；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖丙啶类，例如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和methylamelamines，包括六甲蜜胺、曲他胺、三乙烯磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；acetogenins (尤其是bullatacin和bullatacinone)；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚、MARINOL®)；β-lapachone；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物托泊替康(HYCAMTIN®)、CPT-11 (伊立替康、CAMPTOSAR®)、乙酰基喜树碱、东莨菪亭和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065 (包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；念珠藻环肽(特别是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；duocarmycin (包括合成类似物、KW-2189和CBl-TMl)；艾榴素；pancratistatin；匍枝珊瑚醇；海绵素；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔类抗生素(例如卡奇霉素、特别是卡奇霉素γll和卡奇霉素ωll (参见例如Agnew, Chem Intl. Ed. Engl.,33: 183-186 (1994))；烯二炔蒽环类抗生素，包括烯二炔蒽环类抗生素A；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、authramycin、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、去甲柔红霉素、嗜癌霉素、chromomycinis、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN®多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉子基(pyrrolino)-多柔比星和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、马赛罗霉素、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、thiamiprine、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素药(anti-adrenals)，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美坦生类化合物，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁；phenamet；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK®多糖复合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生；利索新；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢菌霉素(尤其T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和anguidine)；乌拉坦；长春地辛(ELDISINE®、FILDESIN®)；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷C (“Ara-C”)；塞替派；紫杉醇类，例如TAXOL®紫杉醇(Bristol-Myers SquibbOncology, Princeton, N.J.)、ABRAXANE™ Cremophor-free、紫杉醇的白蛋白工程化纳米粒制剂(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)和TAXOTERE®doxetaxel (Rhόne-Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(GEMZAR®)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱(VELBAN®)；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(ONCOVIN®)；奥沙利铂；leucovovin；长春瑞滨(NAVELBINE®)；诺安托；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨(XELODA®)；上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合，例如CHOP，一个环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙组合疗法的缩略语，以及FOLFOX，一个与5-FU和leucovovin组合的奥沙利铂(ELOXATIN™)治疗方案的缩略语。
该定义中还包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素的作用，且常常呈系统或全身治疗形式的抗激素药。它们可以是激素本身。实例包括抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括NOLVADEX®他莫昔芬)、EVISTA®雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LYl 17018、奥那司酮和FARESTON®托瑞米芬；抗黄体酮；雌激素受体下调剂(ERD)；起抑制或中断卵巢作用的作用剂，例如促性腺素释放素(LHRH)激动剂，例如LUPRON®和ELIGARD®醋酸亮丙立德、醋酸戈舍瑞林、醋酸布舍瑞林和曲普瑞林(tripterelin)；其它抗雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；以及抑制芳香酶(其调节肾上腺的雌激素产生)的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、MEGASE®醋酸甲地孕酮、AROMASIN®依西美坦、福美坦、法倔唑、RIVIS OR®伏氯唑、FEMARA®来曲唑和ARIMIDEX®阿那曲唑。另外，化学治疗剂的这类定义包括二膦酸盐，例如氯膦酸盐(例如BONEFOS®或OSTAC®)、DIDROC AL®依替膦酸、NE-58095、ZOMET A®唑来膦酸/唑来膦酸盐、FOSAMAX®阿伦膦酸盐、AREDIA®帕米膦酸盐、SKELID®替鲁膦酸盐或ACTONEL®利塞膦酸盐；以及曲沙他滨(一种1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制参与异常细胞增殖的信号转导途径的基因表达的反义寡核苷酸，例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，例如THERATOPE®疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗和VAXID®疫苗；LURTOTECAN®拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIX® rmRH；托西拉帕替尼(一种ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，亦称GW572016)和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
“生长抑制剂”当在本文使用时是指体外或体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期中细胞的百分比的生长抑制剂。生长抑制药的实例包括阻断细胞周期过程(处于S期以外的位置)的抑制剂，例如引起Gl停滞和M期停滞的抑制剂。经典的M期阻断剂包括长春花属生物碱(长春新碱和长春碱)、紫杉烷类和拓扑异构酶II抑制剂，例如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。阻滞Gl的那些抑制剂也可波及到S期停滞，例如DNA烷化剂，例如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。更多的信息可参见The Molecular Basis of Cancer,Mendelsohn和Israel编辑, 第1章, Murakami等标题为“Cell cycle regulation,oncogenes, and antineoplastic drugs (“细胞周期调节、癌基因和抗肿瘤药)”(WBSaunders: Philadelphia, 1995)，尤其第13页。紫杉烷类(紫杉醇和多西他赛)是均来源于紫杉树的抗癌药。来源于欧洲紫杉的多西他赛(TAXOTERE®，Rhone -Poulenc Rorer)是紫杉醇(TAXOL®，Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进从微管蛋白二聚体装配成微管，并通过防止解聚稳定微管，这导致在细胞中抑制有丝分裂。
7. 药物组合物
可将本文所述治疗剂(例如TβRII多肽，所述TβRII多肽包含SEQ ID NOs: 7-17,25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 47-50, 52-62, 101和103-105的任一个的氨基酸序列，基本上由其组成，或由其组成)配制成药物组合物。可以常规方式使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂配制按照本公开内容使用的药物组合物。这类制剂一般将是基本无热原的，与大部分管理机构的要求相容。
在某些实施方案中，本公开内容的治疗方法包括全身或者以植入物或装置局部给予组合物。当给药时，用于本公开内容的治疗组合物呈无致热原的生理学上可接受的形式。还可任选包含在上述组合物中的TβRII信号转导拮抗剂以外的治疗上有用的物质，在本文公开的方法中可与主题化合物(例如TβRII多肽)同时或序贯给予。
通常可胃肠外(特别是静脉内或皮下)给予本文公开的蛋白质治疗剂。适于胃肠外给予的药物组合物可包含一种或多种TβRII拮抗剂以及一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性溶液或非水性溶液、分散体、混悬液或乳液或者无菌粉剂(所述粉剂可在临用前重构成无菌注射用溶液或分散体)，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者血液等渗的溶质或者助悬剂或增稠剂。可用于本公开内容的药物组合物的合适水性载体和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和注射用有机酯(例如油酸乙酯)。可通过例如使用包衣材料(例如卵磷脂)，在分散体的情况下通过保持所需要的粒径，以及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。
如有需要，组合物和制剂可以可装有一个或多个含有活性成分的单位剂型的药包或分配装置提供。药包可例如包含金属箔或塑料薄片，例如泡罩包装。药包或分配装置可附有给药说明书。
另外，组合物可以递送至靶组织部位的形式装入胶囊或注射。在某些实施方案中，本发明的组合物可包含基质，其能够将一种或多种治疗化合物(例如TβRII多肽)递送到靶组织部位，为发育组织提供结构，并且最好能够被吸收进体内。例如，基质可提供慢释的TβRII拮抗剂。这类基质可由目前用于其它植入医学应用的材料形成。
基质材料的选择取决于生物相容性、生物降解能力、机械性能、美容外观和界面性质。主题组合物的具体应用将界定适当的制剂。组合物可能的基质可以是生物可降解的和化学成分确定的硫酸钙、磷酸三钙、羟磷灰石、聚乳酸和聚酐。其它可能的材料是生物可降解的和生物学上明确限定的，例如骨或真皮胶原。其它基质由纯的蛋白质或胞外基质组分组成。其它可能的基质是非生物可降解的和化学上确定的，例如烧结羟磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其它陶瓷。基质可由任何上述类型的材料的组合组成，例如聚乳酸和羟磷灰石或胶原和磷酸三钙。生物陶瓷可在组成方面改变，例如呈钙-铝酸盐-磷酸盐，并进行加工以改变孔径、颗粒大小、颗粒形状和生物降解能力。
在某些实施方案中，本发明的方法可以例如以下形式口服给予：胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基料，一般为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)、散剂、颗粒剂，或者作为水性液体或非水性液体中的溶液剂或混悬剂、或作为水包油或油包水液体乳剂、或作为酏剂或糖浆剂、或作为软锭剂(使用惰性基料，例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口剂等，各自含有预定量的物质作为活性成分。药剂还可作为大丸剂、药糖剂或糊剂给予。
在口服给药的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖衣丸、散剂、颗粒剂等)中，可将一种或多种本发明的治疗化合物与一种或多种药学上可接受的载体例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下的任一种混合：(1)填充剂或增充剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物；和(10)着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可包含缓冲剂。在使用诸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软充填和硬充填明胶胶囊剂中，相似类型的固体组合物也可用作填充剂。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除活性成分以外，液体剂型可含有常用于本领域的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(具体地说为棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂以外，口服组合物还可包含辅料，例如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除活性化合物以外，混悬剂可含有助悬剂，例如乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨糖醇和失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂和西黄蓍胶及其混合物。
本发明的组合物还可含有辅料，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过加入多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，来确保防止微生物的作用。组合物中还可能需要包含等渗剂(例如糖、氯化钠等)。另外，可通过加入延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝和明胶)，使可注射药物形式的吸收延长。
要了解，主治医师在考虑修正本发明的主题化合物(例如TβRII多肽)的作用的各种因素后，可确定剂量方案。各种因素包括但不限于患者的年龄、性别和饮食、疾病严重程度、给药时间和其它临床因素。任选剂量可随用于重构的基质类型和组合物中化合物的类型而改变。向最终组合物中加入其它已知的生长因子也可影响剂量。可通过定期评价骨生长和/或修复，例如X射线(包括DEXA)、组织形态学测定和四环素标记，来监测进程。
在某些实施方案中，本发明还提供用于体内产生TβRII拮抗剂的基因疗法。这类疗法可通过将TβRII多核苷酸序列引入受累于上文所列病症的细胞或组织中，来达到其治疗效果。可使用重组表达载体(例如嵌合病毒或胶体分散系统)实现TβRII多核苷酸序列的递送。优选的TβRII多核苷酸序列的治疗递送是使用靶向脂质体。
可用于本文教导的基因疗法的各种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒或优选RNA病毒(例如反转录病毒)。优选反转录病毒载体是鼠或禽反转录病毒的衍生物。可插入单一外源基因的反转录病毒载体的实例包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)和劳斯肉瘤病毒(Rous sarcomavirus, RSV)。许多其它的反转录病毒载体可掺入多个基因。所有的这些载体可转移或整合选择标记的基因，使得可鉴定和产生转导细胞。可通过连接例如糖、糖脂或蛋白质，使反转录病毒载体具有靶标特异性。通过使用抗体来完成优选的打靶。本领域的技术人员应认识到，可将特异性多核苷酸序列插入反转录病毒基因组或与病毒包膜连接，以供含有TβRII多核苷酸的反转录病毒载体的靶标特异性递送。在一个优选的实施方案中，载体靶定骨或软骨。
或者，可通过常规磷酸钙转染，将组织培养细胞用编码反转录病毒结构基因gag、pol和env的质粒直接转染。然后将这些细胞用含有目标基因的载体质粒转染。所得细胞释放反转录病毒载体到培养基中。
TβRII拮抗剂多核苷酸的另一种靶定递送系统是胶体分散系统。胶体分散系统包括大分子复合体、纳米囊、微球、珠粒和脂质型系统，其包括水包油乳液、微团、混合微团和脂质体。优选的本发明的胶体系统是脂质体。脂质体是可体外和体内用作递送载体的人工膜囊泡。RNA、DNA和完整病毒体可包封在水性内部，并以生物活性形式递送至细胞(参见例如Fraley等, Trends Biochem. Sci., 6:77，1981)。使用脂质体载体的有效基因转移方法是本领域已知的，参见例如Mannino等, Biotechniques, 6:682, 1988。脂质体的组成一般是磷脂的组合，一般与类固醇(尤其是胆固醇)组合。也可以使用其它磷脂或其它脂质。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在情况。
可用于产生脂质体的脂质的实例包括磷脂酰化合物，例如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。说明性的磷脂包括蛋黄磷脂酰胆碱(egg phosphatidylcholine)、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。根据例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性靶定脂质体也是可行的，并且是本领域已知的。
本公开内容提供可以改变成包括酸和碱以调节pH以及缓冲剂以保持pH在窄范围内的制剂。
实例
现对本发明进行了大致描述，通过参照下列实施例可更容易地理解本发明，包括了所述实施例仅为了说明本发明的某些实施方案的目的，并无意限制本发明。
实施例1. 产生受体融合蛋白变体
TβRII ECD变体
人TβRII以至少两种同种型--A(长)和B(短)--天然存在，它们通过胞外结构域(ECD)中的可变剪接产生(图1和2)。TβRII与TGFβ1和TGFβ3以高亲和力结合。虽然在一些治疗场景中这种配体结合谱可能是有利的，但在其它场景下，更具选择性的分子可更优。如下文详述的，申请人产生并预期包含TβRII长或短同种型(TβRII长或TβRII短)及其变体的胞外结构域的各种TβRII多肽和Fc融合蛋白。
野生型hTβRII长(23-184)序列如下所示(SEQ ID NO: 13)，其中25个氨基酸插入以下划线表示。注意剪接导致在插入的C末端侧翼位置处的保守氨基酸置换(Val→Ile)。几个hTβRII短变体及其hTβRII长对应物中的序列关系示于图3。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
申请人产生了hTβRII长(23 -184)-Fc融合蛋白，其中hTβRII长(23-184)结构域在C-末端(通过最小接头)与人IgG1 Fc结构域融合并在N末端与TPA前导序列融合，其具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO: 101)：
Figure 551953DEST_PATH_IMAGE002
N-末端前导序列和C末端Fc结构域由单下划线表示，接头结构域由双下划线表示。编码hTβRII长(23-184)-Fc融合蛋白的核苷酸序列具有下列核苷酸序列(SEQ ID NO: 102)：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Figure 328148DEST_PATH_IMAGE004
hTβRII长(23-184)-Fc融合蛋白的加工形式具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:103)：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
为在本文描述的某些动物模型中使用，本申请人产生了包含来自小鼠TβRII同种型1的成熟的、全长ECD的Fc融合蛋白，其在本文中被称为mTβRII-Fc。小鼠TβRII同种型1与人TβRII同种型A(长型)同源，因此是上述hTβRII长(23-184)-Fc融合蛋白的小鼠等效形式。对于人类形式而言，确定mTβRII-Fc以高亲和力(皮摩尔)与TGFβ1和TGFβ3结合，但不结合TGFβ2。此外，在如下所述的基于细胞的测定中，确定hTβRII长(23-184)-Fc融合蛋白和mTβRII-Fc是TGFβ1和TGFβ3活性的有效抑制剂，但不抑制TGFβ2活性。
基于(SEQ ID NO: 13)中所示的野生型hTβRII长(23-184)序列及其Fc融合蛋白，申请人还预期五种相应的变体(SEQ ID NO: 14-17)。
(1) 如下所示的hTβRII长(23-184/D135K)氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)，其中置换的残基加双下划线。
Figure 107885DEST_PATH_IMAGE006
(2) 如下所示的N-末端截短的hTβRII长(29-184)氨基酸序列(SEQ ID NO: 15)。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
(3)如下所示的N-末端截短的hTβRII长(60-184)氨基酸序列(SEQ ID NO: 104)。
Figure 706356DEST_PATH_IMAGE008
(4)如下所示的C-末端截短的hTβRII长(23-178)氨基酸序列(SEQ ID NO: 16)。
Figure DEST_PATH_IMAGE009
(5)如下所示的C-末端截短的hTβRII长(23-178/N95D)氨基酸序列(SEQ ID NO:17)，其中置换的残基加双下划线。
Figure 143897DEST_PATH_IMAGE010
如下所示的野生型hTβRII短(23-159)序列(SEQ ID NO: 7)用作以下列出的五种受体ECD变体(SEQ ID NO: 8-12)的基础。将野生型hTβRII短(23-159)融合至IgG2的Fc部分融合以产生新的基础Fc融合构建体。参见下面的SEQ ID Nos. 50, 51和52。
Figure DEST_PATH_IMAGE011
(1)如下所示的hTβRII短(23-159/D110K)氨基酸序列(SEQ ID NO: 8)，其中置换的残基加下划线。
Figure 966360DEST_PATH_IMAGE012
(2)如下所示的N-末端截短的hTβRII短(29-159)氨基酸序列(SEQ ID NO: 9)。
Figure DEST_PATH_IMAGE013
(3)如下所示的N-末端截短的hTβRII短(35-159)氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)。
Figure 92448DEST_PATH_IMAGE014
(4)如下所示的C-末端截短的hTβRII短(23-153)氨基酸序列(SEQ ID NO: 11)。
Figure DEST_PATH_IMAGE015
(5)如下所示的C-末端截短的hTβRII短(23-153/N70D)氨基酸序列(SEQ ID NO:12)，其中置换的残基加下划线。
Figure 291348DEST_PATH_IMAGE016
另外的TβRII ECD变体包括：
(A)如下所示的N-和C-末端截短的hTβRII短(35-153)或hTβRII长(60-178)氨基酸序列(SEQ ID NO: 47)。
Figure DEST_PATH_IMAGE017
Figure 225806DEST_PATH_IMAGE018
(B)如下所示的N-和C-末端截短的hTβRII短(29-153)氨基酸序列(SEQ ID NO:48)。
Figure DEST_PATH_IMAGE019
(C)如下所示的N-和C-末端截短的hTβRII长(29-178)氨基酸序列(SEQ ID NO:49)。
Figure 969902DEST_PATH_IMAGE020
任何上述变体(例如SEQ ID NO: 8-12, 14-17和47-49)可以在位于hTβRII ECD的C-末端附近的谷氨酸残基对(SEQ ID NO: 5的位置151和152，或SEQ ID NO: 6的位置176和177)之间掺入36个氨基酸(SEQ ID NO: 18)插入，如在hTβRII同种型C中天然存在一样[Konrad等. (2007) BMC Genomics 8:318]。
Figure DEST_PATH_IMAGE021
作为一个实例，对于hTβRII短(29-159)变体(SEQ ID NO: 105)，下面示出(下划线)侧翼为任选插入位点的配对谷氨酸残基。
Figure 540211DEST_PATH_IMAGE022
部分地，申请人通过产生包含人TβRII ECD变体的融合蛋白来寻求对TGFβ1或TGFβ3的选择性提高或降低的多肽。以下所示的野生型hTβRII短(23-159)序列(SEQ ID NO: 7)用作下面列出的5种受体ECD变体(SEQ ID NO: 8-12)的基础。将野生型hTβRII短(23-159)与IgG2的Fc部分融合以产生新的基础Fc融合构建体。参见下文的SEQ ID Nos.50、51和52。
基于如下所示的野生型hTβRII长(23-184)序列(SEQ ID NO: 13)，申请人预期5个相应变体(SEQ ID NO: 14-17)，其中25个氨基酸插入加下划线。注意剪接导致在插入的C末端侧翼位置处的保守氨基酸置换(Val→Ile)。几种hTβRII短变体及其hTβRII长对应物之间的序列关系示于图3。
Fc结构域变体
产生hTβRII-hFc融合蛋白，其中上述5种hTβRII短变体各自在其C端(通过最小接头)与人IgG2 Fc结构域融合，其具有下列氨基酸序列(SEQ ID NO: 19)：
Figure DEST_PATH_IMAGE023
申请人预期包含Fc结构域(包括上述全长人IgG2 Fc结构域，IgG1 Fc (hG1Fc)(SEQ ID NO: 20，见下)和N端截短的人IgG1 Fc (hG1Fc短) (SEQ ID NO: 21，见下))的hTβRII(长和短)-hFc融合蛋白。任选可连接与Fc结构域无关的多肽以替换Fc结构域。
Figure 277222DEST_PATH_IMAGE024
Figure DEST_PATH_IMAGE025
前导序列变体
考虑了下列3个前导序列：
(1) 天然：MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIAS (SEQ ID NO: 22)
(2) 组织纤溶酶原激活物(TPA)：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 23)
(3)蜜蜂蜂毒肽(HBML)：MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 24)
hTβRII-hFc融合蛋白的表达
将选择的hTβRII-hFc蛋白变体掺入TPA前导序列，并具有SEQ ID NOs: 25, 29,33, 37, 41和101所示未加工的氨基酸序列(参见实施例3)。这些变体相应的核苷酸序列为SEQ ID NOs: 26, 30, 34, 38, 42和102。使所选择的各含G2Fc结构域(SEQ ID NO: 19)的hTβRII-hFc变体在HEK-293细胞中表达，通过过滤和A蛋白层析法从条件培养基中纯化。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析评价用于报道基因测定法的样品的纯度。
申请人预期具有SEQ ID NOs: 27, 31, 35, 39, 43和101所示未加工的氨基酸序列和SEQ ID NOs: 28, 32, 36, 40, 44和101所示相应的核苷酸序列的其它hTβRII-hFc蛋白变体。
野生型短构建体hTβRII短(23-159)-hG2Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO: 50)显示如下。
Figure 426706DEST_PATH_IMAGE026
该蛋白质从如下所示包括TPA前导序列的构建体(SEQ ID NO:52)表达。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE027
编码SEQ ID NO:52的核酸序列显示如下：
Figure 794234DEST_PATH_IMAGE028
实施例2. 在基于细胞的测定法中通过受体融合蛋白变体的差异配体抑制
采用A549细胞中的报道基因测定法测定hTβRII-hFc变体抑制TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3的活性的能力。该测定法基于pGL3(CAGA)12报道质粒(Dennler等, 1998, EMBO 17:3091-3100)以及Renilla报道质粒(pRLCMV) (以控制转染效率)转染的人肺癌细胞系。CAGA基序存在于TGFβ-反应基因(例如PAI-1)的启动子中，使得该载体通用于通过SMAD2和SMAD3信号转导的因子。
在测定的第一天，以6.5x104个细胞/孔将A549细胞(ATCC®：CCL-185™)分布在48孔板中。在第二天，使含有10 µg pGL3(CAGA)12、100ng pRLCMV、30 µl X-tremeGENE 9(Roche Applied Science)和970 µl OptiMEM (Invitrogen)的溶液预温育30分钟，然后加入补充0.1% BSA的Eagle最小必需培养基(EMEM，ATCC®)中，将其加入铺板细胞(500 µl/孔)中用于在室温下温育过夜。在第三天，除去培养基，使细胞与如下所述制备的配体和抑制剂的混合物一起在37℃下温育过夜。
在48孔板上在200 µl体积的测定缓冲液(EMEM + 0.1 % BSA)中制备连续稀释的试验品。加入含有试验配体的等体积的测定缓冲液，得到等于之前测定的EC50的最终配体浓度。人TGFβ1、人TGFβ2和人TGFβ3获自PeproTech。使试验溶液在37℃下温育30分钟，然后将250 µl混合物加入所有孔中。一式两份测定各浓度的试验品。在与试验溶液温育过夜后，将细胞用磷酸缓冲盐水漂洗，然后用被动裂解缓冲液(Promega E1941)裂解，并在-70℃下保存过夜。在第4和最后一天，在轻轻振荡的同时使板升温至室温。将细胞裂解物一式两份转移到化学发光板(96孔)上，在发光计中用来自Dual-Luciferase Reporter Assay系统(Promega E1980)的试剂分析以确定归一化萤光素酶活性。
采用该测定法针对通过TβRII配体对细胞信号转导的可能的抑制作用筛选受体融合蛋白变体。与之前有关野生型TβRII短-Fc和TβRII长-Fc的报告[del Re等. (2004) J Biol Chem 279:22765]一致，受测变体甚至在高浓度下无一能够抑制TGFβ2。然而hTβRII-hFc变体料想不到地显示由TGFβ1和TGFβ3介导的细胞信号转导的差异抑制。与野生型TβRII短(23-159)-G2Fc相比，TβRII短(23-159/D110K)-G2Fc变体显示丧失TGFβ1的抑制，但保持TGFβ3的中等抑制(参见下表)。第110位位于TβRII的“钩”区[Radaev等. (2010) J Biol Chem 285:14806]，但并未表明在公认的TβRII配体TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3之间提供选择性。因此，该变体显示差异配体抑制的特征，其中一些TGFβ3抑制得到保持，并且该变体对TGFβ1活性具有很少至没有作用。
Figure DEST_PATH_IMAGE029
在第2个实验中，将具有N端截短的TβRII ECD的变体的效能与全长野生型TβRIIECD的进行比较。如下表所示，TβRII短(29-159)-G2Fc和TβRII短(35-159)-G2Fc显示抑制TGFβ3的能力大大减弱，但维持一些TGFβ1抑制剂作用。
Figure 783662DEST_PATH_IMAGE030
在第3个实验中，我们测定了C端截短的TβRII ECD中的N70D置换对效能的作用。该天冬氨酸残基表示可能的糖基化位点。如下表所示，TβRII短(23-153/N70D)-G2Fc显示与TβRII短(23-153)-G2Fc相比，抑制TGFβ1的能力大大减弱，而抑制TGFβ3的能力几乎未减弱。因此，具有N70D置换的C端截短变体显示差异配体抑制的特征，其中TGFβ3最有效地被抑制，但抑制TGFβ1的效能大大减弱。
Figure DEST_PATH_IMAGE031
总起来，这些结果表明，申请人产生了显示极不同的配体结合特征的TβRII ECD的截短物和突变物。这些变体的活性特征可概括于下表。
Figure 245736DEST_PATH_IMAGE032
我们预测，这些TβRII短ECD变体的TβRII长ECD对应物将显示类似的配体选择性。另外，C’Δ6截短的ECD (例如对于TβRII短和TβRII长同种型分别为SEQ ID NO: 11和16)可用作其中引入突变和N端截短的TβRII短或TβRII长的基础序列。
实施例3. 示例性hTβRII-hFc核酸和蛋白质
该实施例概述了可用于按照本文提供的方法在HEK-293或CHO细胞中表达TβRII构建体以提供从细胞培养物中分离的蛋白质的核酸构建体。在各种情况下，可使从细胞培养物中分离的成熟蛋白质除去前导序列(以下各序列中的虚线下划线)。
第1项显示hTβRII短(23-159/D110K)-hG2Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO: 25)。双下划线表示D110K置换。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE033
第2项显示编码hTβRII短(23-159/D110K)-hG2Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO: 26)。双下划线表示D110K置换。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure 515306DEST_PATH_IMAGE034
Figure DEST_PATH_IMAGE035
第3项显示hTβRII短(23-159/D110K)-hG1Fc短的氨基酸序列(SEQ ID NO: 27)。双下划线表示D110K置换。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure 975106DEST_PATH_IMAGE036
第4项显示编码hTβRII短(23-159/D110K)-hG1Fc短的核苷酸序列(SEQ ID NO: 28)。双下划线表示D110K置换。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE037
Figure 704027DEST_PATH_IMAGE038
第5项显示hTβRII短(29-159)-hG2Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO: 29)。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE039
第6项显示编码hTβRII短(29-159)-hG2Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO: 30)。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure 361272DEST_PATH_IMAGE040
Figure DEST_PATH_IMAGE041
第7项显示hTβRII短(29-159)-hG1Fc短的氨基酸序列(SEQ ID NO: 31)。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure 859250DEST_PATH_IMAGE042
第8项显示编码hTβRII短(29-159)-hG1Fc短的核苷酸序列(SEQ ID NO: 32)。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE043
Figure 817847DEST_PATH_IMAGE044
第9项显示hTβRII短(35-159)-hG2Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO: 33)。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE045
第10项显示编码hTβRII短(35-159)-hG2Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO: 34)。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure 394584DEST_PATH_IMAGE046
Figure DEST_PATH_IMAGE047
第11项显示hTβRII短(35-159)-hG1Fc短的氨基酸序列(SEQ ID NO: 35)。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure 401723DEST_PATH_IMAGE048
第12项显示编码hTβRII短(35-159)-hG1Fc短的核苷酸序列(SEQ ID NO: 36)。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE049
Figure 754207DEST_PATH_IMAGE050
第13项显示hTβRII短(23-153)-hG2Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO: 37)。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE051
第14项显示编码hTβRII短(23-153)-hG2Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO: 38)。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure 444558DEST_PATH_IMAGE052
Figure DEST_PATH_IMAGE053
第15项显示hTβRII短(23-153)-hG1Fc短的氨基酸序列(SEQ ID NO: 39)。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure 823106DEST_PATH_IMAGE054
第16项显示编码hTβRII短(23-153)-hG1Fc短的核苷酸序列(SEQ ID NO: 40)。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE055
Figure 932138DEST_PATH_IMAGE056
第17项显示hTβRII短(23-153/N70D)-hG2Fc的氨基酸序列(SEQ ID NO: 41)。双下划线表示N70D置换。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE057
第18项显示编码hTβRII短(23-153/N70D)-hG2Fc的核苷酸序列(SEQ ID NO: 42)。双下划线表示N70D置换。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure 271285DEST_PATH_IMAGE058
Figure DEST_PATH_IMAGE059
第19项显示hTβRII短(23-153/N70D)-hG1Fc短的氨基酸序列(SEQ ID NO: 43)。双下划线表示N70D置换。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure 200714DEST_PATH_IMAGE060
第20项显示编码hTβRII短(23-153/N70D)-hG1Fc短的核苷酸序列(SEQ ID NO: 44)。双下划线表示N70D置换。虚线下划线表示前导序列，实线下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE061
第21项显示hTβRII短(23-159/D110K)-hG2Fc的成熟氨基酸序列(即无前导序列)(SEQ ID NO: 53)。双下划线表示D110K置换。单下划线表示接头。
Figure 125944DEST_PATH_IMAGE062
第22项显示hTβRII短(23-159/D110K)-hG1Fc短的成熟氨基酸序列(即无前导序列)(SEQ ID NO: 54)。双下划线表示D110K置换。单下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE063
第23项显示hTβRII短(29-159)-hG2Fc的成熟氨基酸序列(即无前导序列) (SEQ IDNO: 55)。单下划线表示接头。
Figure 287935DEST_PATH_IMAGE064
第24项显示hTβRII短(29-159)-hG1Fc短的成熟氨基酸序列(即无前导序列) (SEQID NO: 56)。单下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE065
第25项显示hTβRII短(35-159)-hG2Fc的成熟氨基酸序列(即无前导序列) (SEQ IDNO: 57)。单下划线表示接头。
Figure 97235DEST_PATH_IMAGE066
第26项显示hTβRII短(35-159)-hG1Fc短的成熟氨基酸序列(即无前导序列) (SEQID NO: 58)。单下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE067
第27项显示hTβRII短(23-153)-hG2Fc的成熟氨基酸序列(即无前导序列) (SEQ IDNO: 59)。单下划线表示接头。
Figure 319269DEST_PATH_IMAGE068
第28项显示hTβRII短(23-153)-hG1Fc短的成熟氨基酸序列(即无前导序列) (SEQID NO: 60)。单下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE069
第29项显示hTβRII短(23-153/N70D)-hG2Fc的成熟氨基酸序列(即无前导序列)(SEQ ID NO: 61)。双下划线表示N70D置换。单下划线表示接头。
Figure 544845DEST_PATH_IMAGE070
第30项显示hTβRII短(23-153/N70D)-hG1Fc短的成熟氨基酸序列(即无前导序列)(SEQ ID NO: 62)。双下划线表示N70D置换。单下划线表示接头。
Figure DEST_PATH_IMAGE071
实施例4. JAK2V617F动物模型中TβRII-Fc的作用
骨髓增生性病症是部分由血细胞异常(例如血小板、白细胞和红细胞中的一种或多种的异常水平)表征的一组病况。这组病症包括真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)和骨髓纤维化症(MF)。最近，几个研究小组将酪氨酸激酶JAK2的功能获得性突变(JAK2V617F)鉴定为PV、ET和MF患者的主要分子缺陷[例如Kralovics等 (2005) N Engl JMed 2005;352:1779-1790]。该突变导致JAK2的组成型活化，其与骨髓增生性疾病的发展或恶化有关。最近JAK2抑制剂(鲁索替尼)已被批准用于治疗MF和PV。
JAK2V617F骨髓增生性疾病模型已经被开发，其非常类似于人类肿瘤[Xing等.(2008) Blood 111: 5109-5117]。特别是，JAK2V617F小鼠在年幼时发展出与人PV或ET非常相似的病理，并且疾病随着年龄增长而进展，导致骨髓纤维化症。申请人已经评估了该骨髓增生性疾病的JAK2V617F模型中TβRII长-Fc融合蛋白的作用。
转基因JAK2V617F突变体小鼠[如Xing等. (2008) Blood 111: 5109-5117所述的A系]和年龄匹配的野生型(对照)小鼠(C57BL/6小鼠)用于这些研究。为了理解骨髓纤维化疾病的发作和进展，将JAK2V617F小鼠的全血细胞计数和纤维化程度在不同年龄段与从对照动物获得的数据进行比较。与野生型相比，所有年龄的JAK2V617F小鼠的红细胞(RBC)和血小板水平均升高，突变体动物的水平在2至5个月之间有增加的趋势，随后在8至14个月之间逐渐减少。约5个月开始JAK2V617F小鼠骨髓中可检测到纤维化，随年龄增长而恶化。JAK2V617F小鼠还表现出脾肿大，随着年龄增长也会恶化。有趣的是，与年龄较大的JAK2V617F小鼠相比，较年幼的JAK2V617F小鼠(2-5个月)的血清TGFβ1、TGFβ2和各种骨代谢细胞因子(例如OPG、OPN、aFGF和Trance)水平更高，这与观察到的RBC和血小板水平增加一致。在纤维化发作(约5个月)时观察到这些蛋白质的峰值血清水平。类似地，炎性细胞因子(例如IL-6、IL-1b和TNFα)在年龄较大时升高。相应地，JAK2V617F小鼠在年龄较小(约2-5个月龄)时显示PV或ET病理并随着年龄的增长(约5-8个月龄后)发展MF病理。
对于TβRII-Fc研究，在4个月龄时开始治疗，这对应于血清TGFβ1升高，但是在纤维化发作之前(约5个月龄时)。将小鼠置于三组之一中：i)用10mg/kg每周两次的给药方案，如上所述用鼠TβRII长-Fc(mTβRII-Fc)治疗JAK2V617F小鼠；ii)用媒介物(TBS)每周两次治疗JAK2V617F小鼠；和iii)媒介物治疗的野生型小鼠(C57BL/6小鼠)。治疗6个月后，与野生型小鼠相比，媒介物治疗的JAK2V617F小鼠显示升高的RBC水平(+ 37.1％，P <0.001)，血小板升高(+ 74.5％，P <0.001)和脾重量增加(+ 9.5倍，P <0.001)。另外，与野生型小鼠(参见图4A)相比，来自媒介物治疗的JAK2V617F小鼠的骨髓切片(参见图4B)显示出严重的纤维化。与媒介物相比，mTβRII-Fc JAK2V617F小鼠倾向于较低的RBC水平(参见图5A)，并且流式细胞术分析显示骨髓和脾样品中Ter119+类红细胞前体细胞的水平降低(-15％，P <0.05)。治疗对脾肿大也具有显著作用，其中与媒介物治疗相比，mTβRII-Fc治疗的JAK2V617F小鼠具有降低的脾重量(-29％，P <0.01)(图5B)，和治疗对纤维化也具有显著作用，其中与媒介物治疗相比，mTβRII-Fc治疗的JAK2V617F小鼠具有降低的骨髓纤维化(参见图4C)和脾纤维化(参见图6A和6B)。与纤维化的降低一致，与媒介物治疗的小鼠相比，mTβRII-Fc治疗的JAK2V617F小鼠显示出降低的IL-6水平(-48.9％，P <0.05)。
因此，数据显示高血清TGFβ水平与该JAK2V617F疾病模型(约5个月龄)的发作纤维化相关，并且用TβRII-Fc融合蛋白治疗导致纤维化和脾肿大以及其它与该疾病相关的病状的减少(例如炎性细胞因子水平降低)。总之，这些数据证明TβRII-Fc多肽可用于治疗或预防由JAK2V617F突变引起的疾病，这表明这些治疗剂可用于治疗骨髓增生性病症(例如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、和原发性骨髓纤维化症，真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)和其它Janus激酶相关病症。鉴于对早期(例如脾肿大和血细胞水平升高)和晚期(例如纤维化和促炎性细胞因子)疾病病理的积极影响，TβRII-Fc多肽可特别适合于治疗PV、ET和MF患者。例如，TβRII-Fc治疗减轻PV和ET病理，并且预防纤维化和其它晚期疾病并发症的发作/延迟或降低其严重性。TβRII-Fc治疗也可用于预防/延迟PV和/或ET向继发性骨髓纤维化疾病(真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症和原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症)的转变。
实施例5. TβRII-Fc和鲁索替尼在JAK2V617F动物模型的作用
上述转基因JAK2V617F突变小鼠模型进一步用于比较mTβRII-Fc和鲁索替尼(rux)单独和组合对骨髓纤维化症的作用。与实施例4相反，本研究中的治疗开始于12个月龄，这对应于骨髓纤维化症的晚期，其中与年龄较小的JAK2V617小鼠(例如2-5个月龄)相比，小鼠通常在各种组织(例如骨髓和脾)中具有增加的纤维化水平和减少的红细胞水平。将小鼠置于四组之一中：i)用媒介物(TBS)每周两次治疗JAK2V617F小鼠；ii)用10mg/kg每周两次的给药方案，如上所述用mTβRII-Fc治疗JAK2V617F小鼠；iii)用60mg/kg每天两次的给药方案用rux治疗JAK2V617F小鼠；和iv)用10mg/kg每周2次的mTβRII-Fc和每天60mg/kg的rux治疗JAK2V617F小鼠。经过三周的治疗后，与媒介物治疗的小鼠相比，单独或与mTβRII-Fc组合的rux治疗显著降低RBC水平和降低脾重量(参见图7A和7B)。单独的mTβRII-Fc治疗对年龄较大的JAK2V617F小鼠中的RBC水平和脾重量具有更适度的作用。治疗三周后也评估骨髓纤维化。Rux和媒介物治疗的小鼠具有相似的高水平的骨髓纤维化，这与rux显示出不能改善人类患者的骨髓纤维化的观察结果一致(分别参见图8B和8A)。令人惊讶的是，单独或与rux组合的mTβRII-Fc治疗显示出至少在开始治疗后早至三周内减少骨髓纤维化(分别参见图8C和8D)，表明mTβRII-Fc治疗实际上可以在晚期骨髓纤维化症患者中逆转纤维化瘢痕。
如数据所证明的，骨髓纤维化症是一种复杂的疾病，其中患者患有许多不同的并发症，包括例如类红细胞增生、脾肿大，增加的炎性细胞因子水平和组织纤维化。Rux是目前用于治疗骨髓纤维化症的批准治疗药。虽然rux已显示减少脾肿大，但其并不治疗疾病的其它并发症，包括例如骨髓纤维化。在早期和晚期骨髓纤维化症研究中，申请人已经证明，单独用TβRII-Fc融合蛋白治疗可以用于减少组织纤维化并且对骨髓增生性病症具有其它积极作用(例如减少脾肿大和血细胞水平，特别是在疾病的PV和ET阶段)。因此TβRII拮抗剂治疗对治疗某些不受rux影响的骨髓纤维化症并发症具有有益作用。因此，申请人已经证明TβRII-Fc融合蛋白可以用作单一疗法以及与rux的联合疗法来治疗骨髓纤维化症以及Janus激酶相关病症。此外，这些数据表明TβRII拮抗剂可以在治疗、预防骨髓增生性病症或降低其进展速率和/或严重性，特别是在治疗、预防MF、PV和/或ET的一种或并发症或降低其进展速率和/或严重性方面具有各种有益作用。
通过引用结合
本文提及的所有出版物和专利均通过引用以其整体结合到本文中，就像每个独立出版物或专利具体而单独指明通过引用结合一样。
虽然论述了主题的具体实施方案，但上述说明书是说明性的而非限制性的。当回顾本说明书和随附权利要求书时，许多变动对本领域技术人员而言将变得显而易见。应参照权利要求书及其等同内容的整个范围和说明书及这类变化来确定本发明的整个范围。
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Figure IDA0001616747060000561

Claims (16)

1.一种组合物在制备用于在有需要的患者中治疗、预防骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低骨髓纤维化症的进展速率和/或严重性的方法的药物中的用途，其中所述组合物包含有效量的转化生长因子βII型受体(TβRII)拮抗剂，其中所述TβRII拮抗剂是TβRII-Fc融合蛋白，其包含：
(a) 由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成的TβRII多肽；
(b) 接头；和
(c) 免疫球蛋白Fc结构域，
其中所述骨髓纤维化症与相比于相同年龄和性别的健康患者的升高的JAK2激酶活性相关，并且其中所述患者正在用Janus激酶抑制剂治疗或者已经用Janus激酶抑制剂治疗。
2.权利要求1的用途，其中所述组合物用于与Janus激酶抑制剂组合使用。
3.权利要求1或2的用途，其中所述TβRII-Fc融合蛋白抑制TGFβ1和TGFβ3。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述TβRII-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO: 103的氨基酸序列。
5.权利要求1-4中任一项的用途，其中所述骨髓纤维化症是原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症或原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症。
6.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述患者对用Janus激酶抑制剂治疗不耐受或难治。
7.权利要求6的用途，其中所述Janus激酶抑制剂选自鲁索替尼、fedratinib(SAR302503)、monoelotinib (CYT387)、pacritinib、来他替尼、AZD-1480、BMS-911543、NS-018、LY2784544、SEP-701、XL019和AT-9283。
8.权利要求7的用途，其中所述Janus激酶抑制剂是鲁索替尼。
9.权利要求1的用途，其中所述TβRII多肽氨基酸序列由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成。
10.权利要求9的用途，其中所述免疫球蛋白Fc结构域包含选自SEQ ID NO: 19、20和21的氨基酸序列。
11.药剂的组合在制备用于在有需要的患者中治疗、预防骨髓纤维化症的一种或多种并发症或降低骨髓纤维化症的进展速率和/或严重性的方法的药物中的用途，其中所述药剂的组合包含有效量的鲁索替尼与有效量的转化生长因子βII型受体(TβRII)拮抗剂的组合，其中所述TβRII拮抗剂是TβRII-Fc融合蛋白，其包含：
(a) 由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成的TβRII多肽；
(b) 接头；和
(c) 免疫球蛋白Fc结构域，
其中所述骨髓纤维化症与相比于相同年龄和性别的健康患者的升高的JAK2激酶活性相关。
12.权利要求11的用途，其中所述TβRII-Fc融合蛋白抑制TGFβ1和TGFβ3。
13.权利要求11或12的用途，其中所述TβRII-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO: 103的氨基酸序列。
14.权利要求11-13中任一项的用途，其中所述骨髓纤维化症是原发性骨髓纤维化症、真性红细胞增多症后的骨髓纤维化症或原发性血小板增多症后的骨髓纤维化症。
15.权利要求11的用途，其中所述TβRII多肽氨基酸序列由SEQ ID NO: 13的氨基酸序列组成。
16.权利要求15的用途，其中所述免疫球蛋白Fc结构域包含选自SEQ ID NO: 19、20和21的氨基酸序列。
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