JP7264580B2 - 骨髄線維症を処置するための方法および組成物 - Google Patents

骨髄線維症を処置するための方法および組成物 Download PDF

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Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１６年７月２７日に出願された米国仮出願番号第６２／３６７，２８９号に基づく優先権の利益を主張している。前述の出願の開示は、その全体が本明細書によって参考として援用される。
（発明の背景）
骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）は、主に高齢者に影響を及ぼす稀な疾患である。骨髄線維症は、新規に現れる（原発性）または真性赤血球増加症が先立つ（真性赤血球増加症後）もしくは本態性血小板血症が先立つ（本態性血小板血症後）場合がある、ＢＣＲ－ＡＢＬ１陰性の骨髄増殖性新生物である。臨床的特徴としては、進行性貧血、顕著な脾腫、線維症（例えば、骨髄線維症（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｉｂｒｏｓｉｓ））、全身症状（例えば、疲労、寝汗、骨痛、そう痒、および咳）、ならびに体重減少が挙げられる［Tefferi A（２０００年）N Engl J Med、３４２巻：１２５５～１２６５頁］。生存期間中央値は、現在同定されている予後因子に基づいて、２年未満から１５年より長くまでにわたる。ＪＡＫ２、ＭＰＬ、ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＩＤＨ１／ＩＤＨ２、ＣＢＬ、ＩＫＺＦ１、ＬＮＫ、およびＥＺＨ２が関与する変異が骨髄線維症の患者に関して記載されている［James Cら（２００５年）Nature、４３４巻：１１４４～１１４８頁、２００５年；Scott L Mら（２００７年）N Engl J Med、３５６巻：４５９～４６８頁、２００７年；Pikman Yら（２００６年）PLoS Med ３巻：ｅ２７０頁；Delhommeau Fら（２００９年）N Engl J Med、３６０巻：２２８９～２３０１頁；Carbuccia Nら（２００９年）Leukemia、２３巻：２１８３～２１８６頁；Green Aら（２０１０年）N Engl J Med、３６２巻：３６９～３７０頁；Tefferi Aら（２０１０年）Leukemia、２４巻：１３０２～１３０９頁；Grand F Hら（２００９年）Blood、１１３巻：６１８２～６１９２頁；Jager Rら（２０１０年）Leukemia、２４巻：１２９０～１２９８頁；Oh S Tら（２０１０年）Blood、１１６巻：９８８～９９２頁；およびErnst Tら、Nat Genet.、４２巻：７２２～７２６頁］。いくつかの変異は骨髄線維症において高頻度で生じ（例えば、約５０％の患者におけるＪＡＫ２変異）、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ過剰活性化を直接（例えば、ＪＡＫ２またはＭＰＬ変異）または間接的に（例えば、ＬＮＫまたはＣＢＬ変異）誘導する。
骨髄線維症の唯一の治療法は骨髄移植である。しかし、処置に関連する死亡率が高く、移植に適格であるのは少数の患者のみである。他の現在利用可能な処置の多くは、骨髄線維症が原発性疾患であろうと二次性疾患であろうと、そのプロセスを反転させるのに有効ではない。骨髄線維症の処置としては、例えば、細胞減少療法（例えば、ヒドロキシウレアを用いた処置）；アンドロゲンおよび／またはエリスロポエチンを用いた貧血の処置；ならびに脾摘出術が挙げられる。これらの療法は、生存の改善を実証しておらず、主に待期的であるとみなされている［Cervantes F.、Myelofibrosis: Biology and treatment options, European Journal of Haematology、２００７年、７９巻（補遺６８）１３～１７頁］。つい最近、骨髄線維症を処置するためにＪＡＫ阻害剤が使用された。ＪＡＫ阻害剤は、骨髄線維症患者における脾腫を低減するために有用であると思われるが、当該疾患に対するそれらの効果は、他の点では主に待期的なものである［Guptaら（２０１２年）Blood、１２０巻：１３６７～１３７９頁］。具体的には、ＪＡＫ阻害剤の、例えば、血球減少症、輸血依存性、促進期または急性転化期疾患、および線維症を含めた疾患の多くの顕在化（合併症）に対する効果はほとんどないか全くない。さらに、ＪＡＫ阻害剤は、一部の患者において血小板減少症、貧血、および好中球減少症を誘導するまたは悪化させることが示されている。
したがって、骨髄線維症を処置するのに有効な療法に対する未だ満たされていない高い必要性がある。したがって、本開示の目的は、骨髄線維症を処置または予防するため、特に骨髄線維症の１つまたは複数の合併症を処置または予防するための方法を提供することである。
Tefferi A（２０００年）N Engl J Med、３４２巻：１２５５～１２６５頁 James Cら（２００５年）Nature、４３４巻：１１４４～１１４８頁、２００５年 Scott L Mら（２００７年）N Engl J Med、３５６巻：４５９～４６８頁、２００７年 Pikman Yら（２００６年）PLoS Med ３巻：ｅ２７０頁 Delhommeau Fら（２００９年）N Engl J Med、３６０巻：２２８９～２３０１頁 Carbuccia Nら（２００９年）Leukemia、２３巻：２１８３～２１８６頁 Green Aら（２０１０年）N Engl J Med、３６２巻：３６９～３７０頁 Tefferi Aら（２０１０年）Leukemia、２４巻：１３０２～１３０９頁 Grand F Hら（２００９年）Blood、１１３巻：６１８２～６１９２頁 Jager Rら（２０１０年）Leukemia、２４巻：１２９０～１２９８頁 Oh S Tら（２０１０年）Blood、１１６巻：９８８～９９２頁 Ernst Tら、Nat Genet.、４２巻：７２２～７２６頁 Cervantes F.、Myelofibrosis: Biology and treatment options, European Journal of Haematology、２００７年、７９巻（補遺６８）１３～１７頁 Guptaら（２０１２年）Blood、１２０巻：１３６７～１３７９頁
（発明の要旨）
部分的に、本開示は、骨髄線維症を処置するため、特に、例えば、脾腫、髄外造血、および線維症を含めた当該疾患の種々の合併症を改善するためにＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（阻害剤）を使用することができるという発見に関する。具体的には、本明細書で提示されているデータは、ＧＤＦトラップポリペプチドにより、骨髄線維症のＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆモデルにおける脾腫、髄外造血、および線維症が低減することを示す。したがって、ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、任意選択で、骨髄線維症を処置するための１つまたは複数の他の支持療法または活性作用因子と組み合わせて投与することによって骨髄線維症を処置するため、特に、骨髄線維症の１つまたは複数の合併症（例えば、脾腫、髄外造血、貧血、および線維症）を処置または予防するための組成物および方法に関する。ＧＤＦトラップポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢ拮抗作用以外の機構を通じて骨髄線維症に影響を及ぼす可能性があるが［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＢ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数の阻害は、おそらくＴＧＦ－ベータスーパーファミリーの他のメンバーも含む広範な追加の作用因子の活性を阻害する作用因子の傾向の指標になり得、このような集合的な阻害により、例えば骨髄線維症に対する所望の効果がもたらされる可能性がある］、本開示は、それにもかかわらず、ＡｃｔＲＩＩＢ拮抗作用に基づいて望ましい治療剤を選択することができることを実証する。したがって、特定の作用機序に束縛されることは望まないが、他のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト［例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体のアンタゴニスト、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＢ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０）のアンタゴニスト、１つもしくは複数のＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）のアンタゴニスト、１つもしくは複数の補助受容体のアンタゴニスト、および／または１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩＢ下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ）のアンタゴニスト］、またはこのようなアンタゴニストの組み合わせ］が骨髄線維症の処置、特に、１つまたは複数の骨髄線維症の合併症（例えば、脾腫、髄外造血、貧血、および線維症）の処置または予防に有用であることが予想される。このような作用因子は、本明細書では集合的に「ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト」または「ＡｃｔＲＩＩＢ阻害剤」と称される。
したがって、ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症を処置するための方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することを含む、方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、骨髄線維症の１つまたは複数の合併症を処置するための方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することを含む、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症を予防する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することを含む、方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、骨髄線維症の１つまたは複数の合併症を予防する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することを含む、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症の進行速度を低減する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することを含む、方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、骨髄線維症の１つまたは複数の合併症の進行速度を低減する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することを含む、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症の重症度を低減する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することを含む、方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、骨髄線維症の１つまたは複数の合併症の重症度を低減する方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することを含む、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、原発性骨髄線維症を有する、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、真性赤血球増加症後骨髄線維症を有する、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、本態性血小板血症後骨髄線維症を有する、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、国際予後スコア化システム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＩＰＳＳ）による低リスクの骨髄線維症を有する、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、ＩＰＳＳによる中間１リスクの骨髄線維症を有する、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、ＩＰＳＳによる中間２リスクの骨髄線維症を有する、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、ＩＰＳＳによる高リスクの骨髄線維症リスクの骨髄線維症を有する、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、動的ＩＰＳＳ（ＤＩＰＳＳ）による低リスクの骨髄線維症を有する、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、ＤＩＰＳＳによる中間１リスクの骨髄線維症を有する、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、ＤＩＰＳＳによる中間２リスクの骨髄線維症を有する、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、ＤＩＰＳＳによる高リスクの骨髄線維症リスクの骨髄線維症を有する、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、ＤＩＰＳＳ－ｐｌｕｓによる低リスクの骨髄線維症を有する、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、ＤＩＰＳＳ－ｐｌｕｓによる中間１リスクの骨髄線維症を有する、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、ＤＩＰＳＳ－ｐｌｕｓによる中間２リスクの骨髄線維症を有する、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、ＤＩＰＳＳ－ｐｌｕｓによる高リスクの骨髄線維症リスクの骨髄線維症を有する、方法に関する。ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症についての認められているリスク層別化モデル（例えば、ＩＰＳＳ、ＤＩＰＰＳ、およびＤＩＰＰＳ－ｐｌｕｓ）のいずれかによる骨髄線維症のリスクの進行を予防または遅延することができる。例えば、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、ＩＰＳＳ、ＤＩＰＰＳ、またはＤＩＰＰＳ－ｐｌｕｓによる低リスクから中間１リスクへの骨髄線維症リスクの進行を予防または遅延することができる。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、ＩＰＳＳ、ＤＩＰＰＳ、またはＤＩＰＰＳ－ｐｌｕｓによる中間１リスクから中間２リスクへの骨髄線維症リスクの進行を予防または遅延することができる。さらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、ＩＰＳＳ、ＤＩＰＰＳ、またはＤＩＰＰＳ－ｐｌｕｓによる中間２リスクから高リスクへの骨髄線維症リスクの進行を予防または遅延することができる。ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症についての認められているリスク層別化モデル（例えば、ＩＰＳＳ、ＤＩＰＰＳ、およびＤＩＰＰＳ－ｐｌｕｓ）のいずれかによる骨髄線維症リスクの後退を促進または増大することができる。例えば、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、ＩＰＳＳ、ＤＩＰＰＳ、またはＤＩＰＰＳ－ｐｌｕｓによる高リスクから中間２リスクへの骨髄線維症リスクの後退を促進または増大することができる。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、ＩＰＳＳ、ＤＩＰＰＳ、またはＤＩＰＰＳ－ｐｌｕｓによる中間２リスクから中間１リスクへの骨髄線維症リスクの後退を促進または増大することができる。さらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、ＩＰＳＳ、ＤＩＰＰＳ、またはＤＩＰＰＳ－ｐｌｕｓによる中間１リスクから低リスクへの骨髄線維症リスクの後退を促進または増大することができる。ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、骨髄線維症に関連する１つまたは複数の遺伝子変異を含む、方法に関する。例えば、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができ、骨髄線維症は、ＪＡＫ２ ４６／１ハプロタイプのヌル欠損、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＥＺＨ２、ＳＲＳＦ２、ＡＳＸＬ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２、ＭＰＬ、ＣＡＬＲ、ＣＡＬＲ＋ＡＳＸＬ１－、ＣＡＬＲ－ＡＳＫＬ１＋、ＣＡＬＲ＋ＡＳＫＬ１＋、ＣＡＬＲ－ＡＳＫＬ１－、ＴＥＴ２、ＴＨＰＯ、およびＬＮＫからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子変異に関連する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができ、骨髄線維症は、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）（例えば、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、および／またはＪＡＫ３）の１つまたは複数の遺伝子変異に関連する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができ、骨髄線維症は、ＪＡＫ２の１つまたは複数の遺伝子変異に関連する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができ、骨髄線維症は、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異に関連する。ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、骨髄線維症が、血清ＩＬ－８レベルの増加、血清ＩＬ－２Ｒレベルの増加、および血清遊離軽鎖レベルの増加からなる群から選択される１つまたは複数の血清マーカーの上昇に関連する、方法に関する。ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、ヤヌスキナーゼ阻害剤（例えば、ルクソリチニブ、フェドラチニブ（ＳＡＲ３０２５０３）、モメロチニブ（monoelotinib）（ＣＹＴ３８７）、パクリチニブ、レスタウルチニブ、ＡＺＤ－１４８０、ＢＭＳ－９１１５４３、ＮＳ－０１８、ＬＹ２７８４５４４、ＳＥＰ－７０１、ＸＬ０１９、およびＡＴ－９２８３）を用いて処置されている、方法に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができ、患者は、ヤヌスキナーゼ阻害剤に不寛容である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができ、患者は、ヤヌスキナーゼ阻害剤に対して不十分な応答を有する。ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、患者が、ヒドロキシウレアを用いて処置されている、方法に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができ、患者は、ヒドロキシウレアに不寛容である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症


の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができ、患者は、ヒドロキシウレアに対して不十分な応答を有する。
本明細書に記載される通り、骨髄線維症は、患者において疾患の進行中に顕在化する可能性がある種々の臨床的合併症に関連する造血のクローン性新生物障害である。本開示の実施例により、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、いくつかのこれらの臨床的合併症を軽減できることが実証され、これにより、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、当該疾患の１つまたは限られた数の合併症のみを処置する現行の骨髄線維症の治療の多くとは対照的に、骨髄線維症の種々の合併症をより広範に処置できることが示される。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における無効造血の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における髄外造血の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における脾臓での髄外造血（脾髄外造血）の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における肝臓での髄外造血（肝髄外造血）の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。さらなる他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における肺での髄外造血（肺髄外造血）の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。さらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者におけるリンパ節での髄外造血（リンパ性髄外造血）の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症患者における臓器または組織の炎症および／または腫大（サイズ）の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者の脾臓の炎症および／または腫大（サイズ）の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者の肝臓の炎症および／または腫大（サイズ）の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者の肺（複数可）の炎症および／または腫大（サイズ）の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者のリンパ節（複数可）の炎症および／または腫大（サイズ）の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における脾腫の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における肝腫大の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者において骨髄線維症（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における脾線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における肝線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における肺線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者におけるリンパ節線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における骨硬化症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨骨髄線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の１つまたは複数の血液関連合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における貧血の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における血小板減少症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における汎血球減少の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における変形赤血球症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における出血の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症（例えば、疲労、そう痒、体重減少、寝汗、発熱、腹痛または不快感、感覚異常症、および早期満腹）の１つまたは複数の全身症状の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における組織および／または臓器の疼痛の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における骨痛の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における関節痛の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における筋痛の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における悪液質の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。ある特定の態様では、本開示は、有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することにより、骨髄線維症患者における赤血球レベルを増加させることに関する。ある特定の態様では、本開示は、有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することにより、骨髄線維症患者におけるヘモグロビンレベルを増加させることに関する。ある特定の態様では、本明細書に記載される方法に従って処置される骨髄線維症患者は、貧血を有する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における貧血の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減することができる。ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、１回または複数回の血液細胞輸血（全血輸血または赤血球輸血）が施されている患者において骨髄線維症または骨髄線維症の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、血液細胞輸血依存性である患者において骨髄線維症または骨髄線維症の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法に関する。ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における血液細胞輸血負荷を低下させることができる。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、血液細胞輸血を、４～８週間にわたって、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストによる処置の開始前の同等の時間と比べて約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％より大きく低下させることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における血液細胞輸血を、４～８週間にわたって、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストによる処置の開始前の同等の時間と比べて、約５０％より大きく低下させることができる。ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者における鉄過剰負荷を低下させることができる。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者の臓器または組織における鉄過剰負荷を低下させることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者の脾臓における鉄過剰負荷を低下させることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者の肝臓における鉄過剰負荷を低下させることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、骨髄線維症の患者の心臓における鉄過剰負荷を低下させることができる。
本明細書に記載される方法のいずれかでは、骨髄線維症患者に、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するための１つまたは複数の追加の活性作用因子および／または支持療法（１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの投与に加えて）をさらに投与することができる。例えば、一部の実施形態では、患者に、輸血（全血または赤血球輸血）、鉄キレーター（例えば、デフェロキサミン、デフェリプロンおよびデフェラシロクス）、コルチコステロイド、プレドニゾン、ＥＳＡ（例えば、エリスロポエチン、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、ダルベポエチンアルファ、およびメトキシポリエチレングリコール－エポエチンベータ）、アンドロゲン、ダナゾール、サリドマイド、レナリドミド、細胞減少剤、ヒドロキシウレア、ブスルファン、メルファラン（melphalm）、クラドリビン、脾摘出術、照射療法、アスピリン、ポマリドミド（pomalidonmide）、ヤヌスキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン、シロリムス、デフォロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＰＫ１－５８７、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、およびＡＺＤ２０１４）、およびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（例えば、ギビノスタット、パノビノスタット、およびプラシノスタット）からなる群から選択される１つまたは複数の支持療法または活性作用因子をさらに投与することができる。ある特定の態様では、本開示は、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するための方法であって、それを必要とする患者に、ａ）ヤヌスキナーゼ阻害剤；およびｂ）ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを有効量で投与することを含み、ヤヌスキナーゼ阻害剤およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが有効量で投与される、方法に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いた処置の前に投与される。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いた処置の後に投与される。さらなる他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、ヤヌスキナーゼ阻害剤と同時に投与される。本明細書に記載される方法に従って使用されるヤヌスキナーゼ阻害剤は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、およびＪＡＫ３からなる群から選択される１つまたは複数のヤヌスキナーゼを阻害する作用因子であり得る。例えば、ヤヌスキナーゼ阻害剤は、細胞ベースのアッセイにおいてＪＡＫ１、ＪＡＫ２、およびＪＡＫ３の１つまたは複数のシグナル伝達を阻害する作用因子であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って使用されるヤヌスキナーゼ阻害剤は、ルクソリチニブ、フェドラチニブ（ＳＡＲ３０２５０３）、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、パクリチニブ、レスタウルチニブ、ＡＺＤ－１４８０、ＢＭＳ－９１１５４３、ＮＳ－０１８、ＬＹ２７８４５４４、ＳＥＰ－７０１、ＸＬ０１９、およびＡＴ－９２８３からなる群から選択される。一部の好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法に従って使用されるヤヌスキナーゼ阻害剤は、ルクソリチニブである。
ヤヌスキナーゼ阻害剤（例えば、ルクソリチニブ）は、例えば骨髄線維症を含めた種々の障害の処置に関して承認されている。さらに、ヤヌスキナーゼ阻害剤の、種々の他の疾患を処置する効力を決定するためのいくつかの他の臨床的調査が進行中である。ヤヌスキナーゼ阻害剤療法の一般的な有害な副作用は貧血である。血液細胞輸血およびＥＰＯ受容体活性化因子療法を使用して、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者における貧血を処置することができるが、これらの貧血療法にも、患者における有害作用が伴う（例えば鉄過剰負荷の促進または増大、ＥＰＯに対する不十分な応答、およびＥＰＯ不寛容）。したがって、当技術分野において、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者における赤血球／ヘモグロビンレベルを増加させ、貧血を処置する代替的方法が必要とされている。部分的に、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（阻害剤）を使用して、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者における赤血球およびヘモグロビンレベルを増加させることができるという発見に関する。したがって、ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、任意選択で貧血を処置するための１つまたは複数の他の支持療法または活性作用因子と組み合わせて投与することにより、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者における赤血球／ヘモグロビンレベルを増加させ、貧血を処置または予防するための組成物および方法に関する。ＧＤＦトラップポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢ拮抗作用以外の機構を通じて赤血球および／またはヘモグロビンレベルに影響を及ぼす可能性があるが［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＢ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数の阻害は、おそらくＴＧＦ－ベータスーパーファミリーの他のメンバーを含む広範な追加の作用因子の活性を阻害する作用因子の傾向の指標になり得、このような集合的な阻害により、例えば、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者における赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルに対する所望の効果がもたらされる可能性がある］、本開示は、それにもかかわらず、ＡｃｔＲＩＩＢ拮抗作用に基づいて望ましい治療剤を選択することができることを実証する。したがって、特定の作用機序に束縛されることは望まないが、他のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト［例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体のアンタゴニスト、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＢ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０）のアンタゴニスト、１つもしくは複数のＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）のアンタゴニスト、１つもしくは複数の補助受容体のアンタゴニスト、および／または１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩＢ下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ）のアンタゴニスト］、またはこのようなアンタゴニストの組み合わせ］が、ヤヌスキナーゼを用いて処置された患者の処置、特に、ヤヌスキナーゼ療法に関連する１つまたは複数の合併症（例えば、貧血、血小板減少症、および／または好中球減少症）の処置または予防に有用であることが予想される。このような作用因子は、本明細書では集合的に「ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト」または「ＡｃｔＲＩＩＢ阻害剤」と称される。
ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者に有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することにより、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者における赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルを増加させるための方法に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者における貧血を処置または予防することができる。一部の実施形態では、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者に、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストによる処置の開始前に１つまたは複数の血液細胞輸血を投与することができる。一部の実施形態では、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者は、血液細胞輸血依存性である。ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者における血液細胞輸血負荷を低減する方法に関する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者における血液細胞輸血を、４～８週間にわたって、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストによる処置の開始前の同等の時間と比べて、約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％より大きく低下させることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者における血液細胞輸血を、４～８週間にわたって、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストによる処置の開始前の同等の時間と比べて、約５０％より大きく低下させることができる。ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者における鉄過剰負荷を低下させる方法に関する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者の肝臓中の鉄含有量を低下させることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者の脾臓中の鉄含有量を低下させることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用して、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者の心臓中の鉄含有量を低下させることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いた処置の前に投与される。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いた処置の後に投与される。さらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、ヤヌスキナーゼ阻害剤と同時に投与される。ある特定の態様では、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、およびＪＡＫ３からなる群から選択されるヤヌスキナーゼのうちの１つまたは複数を阻害する作用因子を用いて処置されている。一部の実施形態では、ヤヌスキナーゼ阻害剤は、細胞ベースのアッセイにおいてＪＡＫ１、ＪＡＫ２、およびＪＡＫ３の１つまたは複数のシグナル伝達を阻害する。例えば、患者を、ルクソリチニブ、フェドラチニブ（ＳＡＲ３０２５０３）、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、パクリチニブ、レスタウルチニブ、ＡＺＤ－１４８０、ＢＭＳ－９１１５４３、ＮＳ－０１８、ＬＹ２７８４５４４、ＳＥＰ－７０１、ＸＬ０１９、およびＡＴ－９２８３からなる群から選択される１つまたは複数のヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置することができる。一部の実施形態では、患者を、ルクソリチニブを用いて処置することができる。
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ１１を阻害する作用因子（例えば、ＧＤＦ１１アンタゴニスト）である。ＧＤＦ１１阻害への作用は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた細胞ベースのアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ１１に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた結合アフィニティーアッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ１１に、少なくとも１×１０－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、少なくとも１×１０－１０Ｍ、少なくとも１×１０－１１Ｍ、または少なくとも１×１０－１２Ｍ）のＫＤで結合する。本明細書に記載される通り、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、およびＦＬＲＧポリペプチド）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびこれらの組み合わせを含めた、ＧＤＦ１１を阻害する種々のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、本明細書に記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１１を阻害するＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害することができる。
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ８を阻害する作用因子（例えば、ＧＤＦ８アンタゴニスト）である。ＧＤＦ８阻害への作用は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた細胞ベースのアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ８に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた結合アフィニティーアッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ８に、少なくとも１×１０－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、少なくとも１×１０－１０Ｍ、少なくとも１×１０－１１Ｍ、または少なくとも１×１０－１２Ｍ）のＫＤで結合する。本明細書に記載される通り、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、およびＦＬＲＧポリペプチド）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびこれらの組み合わせを含めた、ＧＤＦ８を阻害する種々のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、本明細書に記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ８を阻害するＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害することができる。
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ３を阻害する作用因子（例えば、ＧＤＦ３アンタゴニスト）である。ＧＤＦ３阻害への作用は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた細胞ベースのアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ３に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた結合アフィニティーアッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ３に、少なくとも１×１０－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、少なくとも１×１０－１０Ｍ、少なくとも１×１０－１１Ｍ、または少なくとも１×１０－１２Ｍ）のＫＤで結合する。本明細書に記載される通り、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、およびＦＬＲＧポリペプチド）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびこれらの組み合わせを含めた、ＧＤＦ３を阻害する種々のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、本明細書に記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ３を阻害するＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害することができる。
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＢＭＰ６を阻害する作用因子（例えば、ＢＭＰ６アンタゴニスト）である。ＢＭＰ６阻害への作用は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた細胞ベースのアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＢＭＰ６に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた結合アフィニティーアッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＢＭＰ６に、少なくとも１×１０－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、少なくとも１×１０－１０Ｍ、少なくとも１×１０－１１Ｍ、または少なくとも１×１０－１２Ｍ）のＫＤで結合する。本明細書に記載される通り、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、およびＦＬＲＧポリペプチド）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびこれらの組み合わせを含めた、ＢＭＰ６を阻害する種々のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、本明細書に記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ６を阻害するＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害することができる。
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＢＭＰ１０を阻害する作用因子（例えば、ＢＭＰ１０アンタゴニスト）である。ＢＭＰ１０阻害への作用は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた細胞ベースのアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＢＭＰ１０に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた結合アフィニティーアッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＢＭＰ１０に、少なくとも１×１０－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、少なくとも１×１０－１０Ｍ、少なくとも１×１０－１１Ｍ、または少なくとも１×１０－１２Ｍ）のＫＤで結合する。本明細書に記載される通り、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、およびＦＬＲＧポリペプチド）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびこれらの組み合わせを含めた、ＢＭＰ１０を阻害する種々のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、本明細書に記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０を阻害するＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害することができる。
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）（例えば、アクチビンアンタゴニスト）を阻害する作用因子である。アクチビン阻害への作用は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた細胞ベースのアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともアクチビンに結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた結合アフィニティーアッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともアクチビンに、少なくとも１×１０－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、少なくとも１×１０－１０Ｍ、少なくとも１×１０－１１Ｍ、または少なくとも１×１０－１２Ｍ）のＫＤで結合する。本明細書に記載される通り、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、およびＦＬＲＧポリペプチド）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびこれらの組み合わせを含めた、アクチビンを阻害する種々のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを本明細書に記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、アクチビンを阻害するＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害することができる。ある特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともアクチビンＢを阻害する作用因子である。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡに実質的に結合しないか（例えば、アクチビンＡに１×１０－７Ｍより高いＫＤで結合するか、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）、および／またはアクチビンＡ活性を阻害する。ある特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともアクチビンＢを阻害するが、アクチビンＡに実質的に結合しないか（例えば、アクチビンＡに１×１０－７Ｍより高いＫＤで結合するか、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）、および／またはアクチビンＡ活性を阻害する、作用因子である。
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害する作用因子（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト）である。ＡｃｔＲＩＩＢ阻害への作用は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた細胞ベースのアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢに結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた結合アフィニティーアッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢに、少なくとも１×１０－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、少なくとも１×１０－１０Ｍ、少なくとも１×１０－１１Ｍ、または少なくとも１×１０－１２Ｍ）のＫＤで結合する。本明細書に記載される通り、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、およびＦＬＲＧポリペプチド）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびこれらの組み合わせを含めた、ＡｃｔＲＩＩＢを阻害する種々のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、本明細書に記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢを阻害するＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害することができる。
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ４を阻害する作用因子（例えば、ＡＬＫ４アンタゴニスト）である。ＡＬＫ４阻害への作用は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた細胞ベースのアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ４に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた結合アフィニティーアッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ４に、少なくとも１×１０－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、少なくとも１×１０－１０Ｍ、少なくとも１×１０－１１Ｍ、または少なくとも１×１０－１２Ｍ）のＫＤで結合する。本明細書に記載される通り、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、およびＦＬＲＧポリペプチド）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびこれらの組み合わせを含めた、ＡＬＫ４を阻害する種々のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、本明細書に記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４を阻害するＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害することができる。
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ５を阻害する作用因子（例えば、ＡＬＫ５アンタゴニスト）である。ＡＬＫ５阻害への作用は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた細胞ベースのアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ５に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた結合アフィニティーアッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ５に、少なくとも１×１０－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、少なくとも１×１０－１０Ｍ、少なくとも１×１０－１１Ｍ、または少なくとも１×１０－１２Ｍ）のＫＤで結合する。本明細書に記載される通り、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、およびＦＬＲＧポリペプチド）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびこれらの組み合わせを含めた、ＡＬＫ５を阻害する種々のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、本明細書に記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ５を阻害するＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害することができる。
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ７を阻害する作用因子（例えば、ＡＬＫ７アンタゴニスト）である。ＡＬＫ７阻害への作用は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた細胞ベースのアッセイ（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達レポーターアッセイ）を使用して決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ７に結合することができる。リガンド結合活性は、例えば、本明細書に記載されるものを含めた結合アフィニティーアッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ７に、少なくとも１×１０－７Ｍ（例えば、少なくとも１×１０－８Ｍ、少なくとも１×１０－９Ｍ、少なくとも１×１０－１０Ｍ、少なくとも１×１０－１１Ｍ、または少なくとも１×１０－１２Ｍ）のＫＤで結合する。本明細書に記載される通り、例えば、リガンドトラップ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップ、フォリスタチンポリペプチド、およびＦＬＲＧポリペプチド）、抗体、小分子、ヌクレオチド配列、およびこれらの組み合わせを含めた、ＡＬＫ７を阻害する種々のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、本明細書に記載される方法および使用に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ７を阻害するＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ４のうちの１つまたは複数をさらに阻害することができる。
部分的に、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドであるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストに関する。用語「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、集合的に、天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにそれらの短縮型および改変体、例えば本明細書に記載されるものなど（例えば、ＧＤＦトラップポリペプチド）を指す。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの修飾された（改変体）形態のリガンド結合ドメインを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなることが好ましい。例えば、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合ドメイン、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの一部分を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。本明細書に記載される方法に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、可溶性ポリペプチドであることが好ましい。
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む組成物およびその使用に関する。例えば、一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９～１０９の配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９～１０９の配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に照らして７９位に酸性アミノ酸［天然に存在する（ＥまたはＤ）または人工酸性アミノ酸］を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５～１３１の配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５～１３１の配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に照らして７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に照らして７９位に酸性アミノ酸を含む。さらなる他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に照らして７９位に酸性アミノ酸を含む。さらに他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に照らして７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４に照らして７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４に照らして７９位に酸性アミノ酸を含む。他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４に照らして７９位に酸性アミノ酸を含む。なおさらなる他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。なおさらなる他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。なおさらなる他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。なおさらなる他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に照らして７９位に酸性アミノ酸を含む。なおさらなる他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に照らして７９位に酸性アミノ酸を含む。なおさらなる他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に照らして７９位に酸性アミノ酸を含む。なおさらなる他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号４５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に照らして７９位に酸性アミノ酸を含む。なおさらなる他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に照らして７９位に酸性アミノ酸を含む。なおさらなる他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に照らして７９位に酸性アミノ酸を含む。なおさらなる他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１に照らして７９位に酸性アミノ酸を含む。なおさらなる他の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号５８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のＬ７９に対応する位置に酸性アミノ酸を含まない。
本明細書に記載される通り、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびそれらの改変体（ＧＤＦトラップ）は、ホモ多量体、例えば、ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体、ホモ五量体、およびより高次のホモ多量体複合体であり得る。ある特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびそれらの改変体は、ホモ二量体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＡｃｔＲＩＩポリペプチド二量体は、第１のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、第２のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに共有結合または非共有結合したものを含み、第１のポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢドメインおよび相互作用対（例えば、免疫グロブリンの定常ドメイン）の第１のメンバー（または第２のメンバー）のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび相互作用対の第２のメンバー（または第１のメンバー）のアミノ酸配列を含む。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、それらの改変体（例えば、ＧＤＦトラップ）を含め、融合タンパク質であってもよい。例えば、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインおよび１つまたは複数の異種（非ＡｃｔＲＩＩＢ）ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質であってもよい。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つのドメインとして、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド由来のアミノ酸配列（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体またはそれらの改変体のリガンド結合ドメイン）と、所望の特性、例えば改善された薬物動態、より簡単な精製、特定の組織への標的化などをもたらす１つまたは複数の異種ドメインとを有する融合タンパク質であってもよい。例えば、融合タンパク質のドメインは、インビボにおける安定性、インビボにおける半減期、取込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、融合タンパク質の多量体化、および／または精製のうちの１つまたは複数を増強し得る。任意選択で、融合タンパク質のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインは、１つまたは複数の異種ポリペプチドドメインに直接接続（融合）されているか、または、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列と１つまたは複数の異種ドメインのアミノ酸配列の間に介在配列、例えばリンカーなどが配置されていてもよい。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、異種ドメインとＡｃｔＲＩＩＢドメインの間に配置された比較的構造化されていないリンカーを含む。この構造化されていないリンカーは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端（「尾部」）のおよそ１５アミノ酸の構造化されていない領域に対応するものであってもよく、二次構造が比較的自由な３アミノ酸から１５アミノ酸、２０アミノ酸、３０アミノ酸、５０アミノ酸またはそれより多くのアミノ酸の間の人工配列であってもよい。リンカーは、グリシンおよびプロリン残基リッチであってもよく、例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの反復配列を含有し得る。リンカーの例としては、これらに限定されないが、配列ＴＧＧＧ（配列番号１８）、ＳＧＧＧ（配列番号１９）、ＴＧＧＧＧ（配列番号１６）、ＳＧＧＧＧ（配列番号１７）、ＧＧＧＧＳ（配列番号２０）、ＧＧＧＧ（配列番号１５）、およびＧＧＧ（配列番号１４）が挙げられる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分を含めた、免疫グロブリンの定常ドメインを含み得る。例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、ＩｇＥ、またはＩｇＭ免疫グロブリンのＦｃドメイン由来のアミノ酸配列。例えば、免疫グロブリンドメインのＦｃ部分は、配列番号９～１３のいずれか１つと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよく、これらから本質的になっていてもよく、またはこれらからなっていてもよい。このような免疫グロブリンドメインは、変更されたＦｃ活性を付与する、例えば、１つまたは複数のＦｃエフェクター機能を低下させる１つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、欠失、付加、および／または置換）を含み得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、式Ａ－Ｂ－Ｃに示されるアミノ酸配列を含む。例えば、Ｂ部分は、本明細書に記載される通りＮおよびＣ末端が短縮されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである。ＡおよびＣ部分は、独立に、０、１または１を超えるアミノ酸であってもよく、ＡおよびＣ部分の両方は、Ｂに対して異種である。Ａおよび／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に付加され得る。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、リーダー配列を含む。リーダー配列は、天然ＡｃｔＲＩＩＢリーダー配列であっても異種リーダー配列であってもよい。ある特定の実施形態では、リーダー配列は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダー配列である。
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、それらの改変体（例えば、ＧＤＦトラップ）を含め、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、およびＧＳＴ融合などの精製部分配列を含み得る。任意選択で、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、および／または脂質部分に結合体化したアミノ酸から選択される、１つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、少なくとも１つのＮ－連結糖を含んでいてもよく、２つ、３つまたはそれより多くのＮ－連結糖を含んでいてもよい。このようなポリペプチドはまた、Ｏ－連結糖を含んでいてもよい。一般に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、患者における好ましくない免疫応答の可能性を低減するためにポリペプチドの天然グリコシル化を適切に媒介する哺乳動物細胞株内で発現させることが好ましい。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、操作された昆虫または酵母細胞、ならびに哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞およびＮＳＯ細胞などの、患者への使用に適した様式でタンパク質をグリコシル化する種々の細胞株で産生させることができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、グリコシル化されており、かつチャイニーズハムスター卵巣細胞株から得ることができるグリコシル化パターンを有する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において少なくとも４、６、１２、２４、３６、４８、または７２時間の血清中半減期を呈示する。任意選択で、ＡｃｔＲＩＩＢは、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）において少なくとも６、８、１０、１２、１４、２０、２５、または３０日の血清中半減期を呈示していてもよい。
ある特定の態様では、本開示は、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストおよび薬学的に許容されるキャリアを含む医薬調製物を提供する。医薬調製物は、１つまたは複数の追加の活性作用因子、例えば、骨髄線維症を処置するため、特に、骨髄線維症の１つまたは複数の合併症（例えば、脾腫、髄外造血、貧血、および線維症）、ならびに／またはヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者の処置または予防に使用される化合物も含み得る。一般に、医薬調製物は、発熱物質非含有であることが好ましい（治療への使用のための製品の品質を支配する規制により必要とされる程度に発熱物質非含有であることを意味する）。
ある特定の例では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストまたはアンタゴニストの組み合わせを本明細書に記載される障害または状態に対して投与する場合、赤血球に対する望ましくない影響を低減するために、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与している間、赤血球に対する影響をモニタリングすること、またはＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの投薬を決定もしくは調整することが望ましい場合がある。例えば、赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、またはヘマトクリットレベルが増加すると、望ましくない血圧の増加を引き起こす可能性がある。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、抗体または抗体の組み合わせである。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＡｃｔＲＩＩＢに結合する。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体は、任意選択で、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定して、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体は、１つまたは複数のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンド、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーＩ型受容体、またはＴＧＦ－ベータスーパーファミリー補助受容体がＡｃｔＲＩＩＢに結合するのを阻害する。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体は、１つまたは複数のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンドが、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、およびＢＭＰ５からなる群から選択されるＡｃｔＲＩＩＢに結合するのを阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＧＤＦ１１に結合する。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１１に結合する抗体は、任意選択で、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定して、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１１に結合する抗体は、ＧＤＦ１１－ＡｃｔＲＩＩＢ結合を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＧＤＦ８に結合する。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ８に結合する抗体は、任意選択で、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定して、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ８に結合する抗体は、ＧＤＦ８－ＡｃｔＲＩＩＢ結合を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＢＭＰ６に結合する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ６に結合する抗体は、任意選択で、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定して、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ６に結合する抗体は、ＢＭＰ６－ＡｃｔＲＩＩＢ結合を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、ＢＭＰ１０に結合する。ある特定の実施形態では、少なくともＢＭＰ１０に結合する抗体は、任意選択で、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定して、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０に結合する抗体は、ＢＭＰ１０－ＡｃｔＲＩＩＢ結合を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＧＤＦ３に結合する。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ３に結合する抗体は、任意選択で、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定して、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ３に結合する抗体は、ＧＤＦ３－ＡｃｔＲＩＩＢ結合を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）に結合する。ある特定の実施形態では、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）に結合する抗体は、任意選択で、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定して、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）に結合する抗体は、アクチビン－ＡｃｔＲＩＩＢ結合を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、アクチビンＢに結合する。ある特定の実施形態では、アクチビンＢに結合する抗体は、任意選択で、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定して、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、アクチビンＢに結合する抗体は、アクチビンＢ－ＡｃｔＲＩＩＢ結合を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数に結合する多特異性抗体または多特異性抗体の組み合わせである。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＡＬＫ４に結合する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４に結合する抗体は、任意選択で、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定して、ＡＬＫ４シグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４に結合する抗体は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド、ＩＩ型受容体、または補助受容体がＡＬＫ４に結合するのを阻害する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４に結合する抗体は、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３からなる群から選択される１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンドがＡＬＫ４に結合するのを阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＡＬＫ５に結合する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ５に結合する抗体は、任意選択で、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定して、ＡＬＫ５シグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ５に結合する抗体は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド、ＩＩ型受容体、または補助受容体がＡＬＫ５に結合するのを阻害する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ５に結合する抗体は、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３からなる群から選択される１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンドがＡＬＫ５に結合するのを阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＡＬＫ７に結合する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ７に結合する抗体は、任意選択で、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて測定して、ＡＬＫ７シグナル伝達を阻害する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ７に結合する抗体は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド、ＩＩ型受容体、または補助受容体がＡＬＫ７に結合するのを阻害する。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ７に結合する抗体は、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ３からなる群から選択される１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンドがＡＬＫ７に結合するのを阻害する。一部の実施形態では、抗体は、少なくともＧＤＦ１１に結合する。ある特定の態様では、多特異性抗体または多特異性抗体の組み合わせは、細胞ベースのアッセイにおいて、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数のシグナル伝達を阻害する。一部の実施形態では、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。一部の実施形態では、抗体は、単鎖抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、タンデムな単鎖Ｆｖフラグメント、タンデムな単鎖ダイアボディ、または単鎖ダイアボディおよび免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも一部分を含む融合タンパク質である。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、小分子阻害剤または小分子阻害剤の組み合わせである。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＡｃｔＲＩＩＢの阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＡＬＫ４の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＡＬＫ５の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＡＬＫ７の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＧＤＦ１１の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＧＤＦ８の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＢＭＰ６の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＢＭＰ１０の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともＧＤＦ３の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）の阻害剤である。一部の実施形態では、小分子阻害剤は、少なくともアクチビンＢの阻害剤である。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、核酸阻害剤または核酸阻害剤の組み合わせである。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＡｃｔＲＩＩＢの阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＡＬＫ４の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＡＬＫ５の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＡＬＫ７の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＧＤＦ１１の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＧＤＦ８の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＢＭＰ６の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＢＭＰ１０の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともＧＤＦ３の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＥ、およびアクチビンＢＥ）の阻害剤である。一部の実施形態では、核酸阻害剤は、少なくともアクチビンＢの阻害剤である。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、フォリスタチンポリペプチドである。一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドは、配列番号６７のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、ＦＬＲＧポリペプチドである。一部の実施形態では、ＦＬＲＧポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
図１は、複数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡの結晶構造の合成解析に基づき、ボックスで指し示されるリガンドに直接接触することが本明細書で推定される残基を伴う、ヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメイン（配列番号３６）およびヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン（配列番号２）のアラインメントを示す。
図２は、種々の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質およびヒトＡｃｔＲＩＩＡ（配列番号３７～４３）の多重配列アライメントならびにアライメント由来のコンセンサスＡｃｔＲＩＩ配列（配列番号４４）を示す。
図３は、ＧＤＦトラップであるＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－ｈＦｃ（配列番号４５）の全長アミノ酸配列であって、ＴＰＡリーダー配列（二重下線を付す）、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２０～１３４；一重下線を付す）、およびｈＦｃドメインを含む全長アミノ酸配列を示す。シーケンシングにより、成熟融合タンパク質内のＮ末端残基であると明らかにされたグリシンと同様に、天然配列内の７９位において置換されたアスパラギン酸にも二重下線を付し、強調する。
図４Ａおよび４Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号４８は、センス鎖に対応し、配列番号４９は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）に二重下線を付し、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６～４２０）に一重下線を付す。 図４Ａおよび４Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号４８は、センス鎖に対応し、配列番号４９は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）に二重下線を付し、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６～４２０）に一重下線を付す。
図５は、短縮型ＧＤＦトラップであるＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃ（配列番号５０）の全長アミノ酸配列であって、ＴＰＡリーダー（二重下線を付す）、短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２５～１３１；一重下線を付す）、およびｈＦｃドメインを含む全長アミノ酸配列を示す。シーケンシングにより、成熟融合タンパク質内のＮ末端残基であると明らかにされたグルタミン酸と同様に、天然配列内の７９位において置換されたアスパラギン酸にも二重下線を付し、強調する。
図６Ａおよび６Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号５１は、センス鎖に対応し、配列番号５２は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）に二重下線を付し、短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６～３９６）に一重下線を付す。また、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２５～１３１）のアミノ酸配列も示す。 図６Ａおよび６Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号５１は、センス鎖に対応し、配列番号５２は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）に二重下線を付し、短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６～３９６）に一重下線を付す。また、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２５～１３１）のアミノ酸配列も示す。
図７は、リーダーを伴わない短縮型ＧＤＦトラップであるＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃのアミノ酸配列（配列番号５３）を示す。短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２５～１３１）に下線を付す。シーケンシングにより、成熟融合タンパク質内のＮ末端残基であると明らかにされたグルタミン酸と同様に、天然配列内の７９位において置換されたアスパラギン酸にも二重下線を付し、強調する。
図８は、リーダー、ｈＦｃドメイン、およびリンカーを伴わない短縮型ＧＤＦトラップであるＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）のアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。シーケンシングにより、成熟融合タンパク質内のＮ末端残基であると明らかにされたグルタミン酸と同様に、天然配列内の７９位において置換されたアスパラギン酸にも下線を付し、強調する。
図９Ａおよび９Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃをコードする代替的なヌクレオチド配列を示す。配列番号５５は、センス鎖に対応し、配列番号５６は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）に二重下線を付し、短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６～３９６）に下線を付し、細胞外ドメインの野生型ヌクレオチド配列内の置換に二重下線を付し、強調する（図６Ａおよび６Ｂの配列番号５１と比較する）。また、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２５～１３１）のアミノ酸配列も示す。 図９Ａおよび９Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃをコードする代替的なヌクレオチド配列を示す。配列番号５５は、センス鎖に対応し、配列番号５６は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）に二重下線を付し、短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６～３９６）に下線を付し、細胞外ドメインの野生型ヌクレオチド配列内の置換に二重下線を付し、強調する（図６Ａおよび６Ｂの配列番号５１と比較する）。また、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２５～１３１）のアミノ酸配列も示す。
図１０は、図９Ａおよび９Ｂに示される代替的なヌクレオチド配列（配列番号５５）のヌクレオチド７６～３９６（配列番号５７）を示す。図９Ａおよび９Ｂに表示した同じヌクレオチド置換に、本図でもまた下線を付し、強調する。配列番号５７は、Ｌ７９Ｄ置換を有する短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２５～１３１に対応する）、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）だけをコードする。
図１１は、Ｃｌｕｓｔａｌ ２．１を使用してヒトＩｇＧアイソタイプからのＦｃドメインの多重配列アライメントを示す。ヒンジ領域は点線下線で示されている。
図１２は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５－１３１）－ｈＦｃ（配列番号５８）についての全長の、プロセシングされていないアミノ酸配列を示す。ＴＰＡリーダー（残基１～２２）および二重短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（残基２４～１３１、配列番号１の天然配列に基づく番号付けを使用）それぞれに下線を付す。強調されているのは、配列番号１に対して２５位である、シーケンシングにより成熟融合タンパク質のＮ末端アミノ酸であると明らかにされたグルタミン酸である。
図１３Ａおよび１３Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５－１３１）－ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す（コード鎖は上に示され、配列番号５９、相補体は下に示されている、３’－５’、配列番号６０）。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３～３９６）をコードする配列に下線を付す。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５－１３１）についての対応するアミノ酸配列も示されている。 図１３Ａおよび１３Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５－１３１）－ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す（コード鎖は上に示され、配列番号５９、相補体は下に示されている、３’－５’、配列番号６０）。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３～３９６）をコードする配列に下線を付す。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５－１３１）についての対応するアミノ酸配列も示されている。
図１４Ａおよび１４Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５－１３１）－ｈＦｃをコードする代替ヌクレオチド配列を示す（コード鎖は上に示され、配列番号６１、相補体は下に示されている、３’－５’、配列番号６２）。この配列は、最初の形質転換体においてタンパク質のより多い発現レベルを付与し、細胞株発達をさらに急速なプロセスにする。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３～３９６）をコードする配列に下線を付し、ＥＣＤの野生型ヌクレオチド配列中の置換（図１３Ａおよび１３Ｂを参照されたい）を強調する。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５－１３１）に対応するアミノ酸配列も示す。 図１４Ａおよび１４Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２５－１３１）－ｈＦｃをコードする代替ヌクレオチド配列を示す（コード鎖は上に示され、配列番号６１、相補体は下に示されている、３’－５’、配列番号６２）。この配列は、最初の形質転換体においてタンパク質のより多い発現レベルを付与し、細胞株発達をさらに急速なプロセスにする。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１～６６）およびＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７３～３９６）をコードする配列に下線を付し、ＥＣＤの野生型ヌクレオチド配列中の置換（図１３Ａおよび１３Ｂを参照されたい）を強調する。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５－１３１）に対応するアミノ酸配列も示す。
（発明の詳細な説明）
（１．概要）
トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーは、共通の配列エレメントと構造モチーフを共有する、種々の増殖因子を含む。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物の両方における広範な種々の細胞型に対して生物学的作用を発揮することが公知である。このスーパーファミリーのメンバーは、胚発生の間に、パターン形成および組織の特異化において重要な機能を果たし、そして、脂質生成、筋発生、軟骨形成、心臓発生、造血、神経発生および上皮細胞分化を含む種々の分化プロセスに影響を及ぼし得る。ＴＧＦ－βファミリーのメンバーの活性を操作することによって、しばしば、生物において顕著な生理学的変化を引き起こすことが可能である。例えば、ウシのＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅおよびＢｅｌｇｉａｎ Ｂｌｕｅ品種は、ＧＤＦ８（ミオスタチンとも呼ばれる）遺伝子に機能喪失変異を有しており、筋肉量の顕著な増加を引き起こしている［例えば、Ｇｒｏｂｅｔら（１９９７年）、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．、１７巻（１号）：７１～４頁を参照されたい］。さらに、ヒトでは、ＧＤＦ８の不活性な対立遺伝子は、筋肉量の増加、および、報告によれば、例外的な強度と関連している［例えば、Ｓｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２～８頁を参照されたい］。
ＴＧＦ－βシグナルは、Ｉ型およびＩＩ型のセリン／スレオニンキナーゼ受容体の異種複合体（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ）によって媒介され、これらは、リガンド刺激の際に、下流のＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤタンパク質１、２、３、５、および８）をリン酸化および活性化する［例えば、Ｍａｓｓａｇｕｅ、２０００年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１巻：１６９～１７８頁を参照のこと］。これらのＩ型およびＩＩ型受容体は、システインリッチな領域を持つリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および、予測セリン／スレオニン特異性を持つ細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。Ｉ型受容体は、シグナル伝達に必須である。ＩＩ型受容体は、リガンド結合およびＩ型受容体の活性化に必要とされる。Ｉ型およびＩＩ型のアクチビン受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化をもたらす。
２つの関連するＩＩ型受容体（ＡｃｔＲＩＩ）である、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢがアクチビンについてのＩＩ型受容体として同定されている［例えば、ＭａｔｈｅｗｓおよびＶａｌｅ（１９９１年）、Ｃｅｌｌ、６５巻：９７３～９８２頁；ならびにＡｔｔｉｓａｎｏら（１９９２年）、Ｃｅｌｌ、６８巻：９７～１０８頁を参照されたい］。ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢは、アクチビンに加えて、例えば、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１を含む他のいくつかのＴＧＦ－βファミリータンパク質とも生化学的に相互作用し得る［例えば、Ｙａｍａｓｈｉｔａら（１９９５年）、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１３０巻：２１７～２２６頁；ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ（２００１年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻：９３０６～９３１１頁；ＹｅｏおよびＷｈｉｔｍａｎ（２００１年）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ、７巻：９４９～９５７頁；ならびにＯｈら（２００２年）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１６巻：２７４９～５４頁を参照されたい］。ＡＬＫ４は、アクチビン、特に、アクチビンＡに対する主たるＩ型受容体であり、ＡＬＫ７は、同様に他のアクチビン、特に、アクチビンＢに対する受容体として機能し得る。
アクチビンとは、ＴＧＦベータスーパーファミリーに属する、二量体ポリペプチドの増殖因子である。２つの近縁のβサブユニットのホモ／ヘテロ二量体（それぞれ、βＡβＡ、βＢβＢ、およびβＡβＢ）である、３つの主要なアクチビン形態（Ａ、Ｂ、およびＡＢ）が存在する。ヒトゲノムはまた、主に肝臓内で発現する、アクチビンＣおよびアクチビンＥもコードし、βＣまたはβＥを含有するヘテロ二量体形態もまた公知である。
ＴＧＦ－βスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、卵巣および胎盤の細胞におけるホルモン生成を刺激し得、神経細胞の生存を支援し得、細胞周期の進行に対して細胞型に依存して正もしくは負に影響を及ぼし得、そして、少なくとも両生類の胚において中胚葉分化を誘導し得る、独特かつ多機能の作用因子である［ＤｅＰａｏｌｏら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．１９８巻：５００～５１２頁；Ｄｙｓｏｎら（１９９７年）、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．７巻：８１～８４頁；およびＷｏｏｄｒｕｆｆ（１９９８年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５巻：９５３～９６３頁］。さらに、刺激されたヒト単球性白血病細胞から単離された赤血球分化作用因子（ＥＤＦ）は、アクチビンＡと同一であることが分かった［Ｍｕｒａｔａら（１９８８年）、ＰＮＡＳ、８５巻：２４３４頁］。アクチビンＡは、骨髄における赤血球生成を促進することが示唆されている。いくつかの組織では、アクチビンのシグナル伝達は、その関連するヘテロ二量体であるインヒビンによって拮抗される。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出の間に、アクチビンは、ＦＳＨの分泌および合成を促進するが、インヒビンは、ＦＳＨの分泌および合成を抑制する。アクチビンの生活性を調節し得、そして／または、アクチビンに結合し得る他のタンパク質としては、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ、ＦＬＲＧまたはＦＳＴＬ３としても公知）およびα２－マクログロブリンが挙げられる。
本明細書で記載される通り、「アクチビンＡ」に結合する作用因子は、単離βＡサブユニットの文脈であれ、二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてであれ、βＡサブユニットに特異的に結合する作用因子である。ヘテロ二量体の複合体（例えば、βＡβＢヘテロ二量体）の場合、「アクチビンＡ」に結合する作用因子は、βＡサブユニット内に存在するエピトープには特異的であるが、複合体のβＡ以外のサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）内に存在するエピトープには結合しない。同様に、「アクチビンＡ」に拮抗する（これを阻害する）本明細書で開示される作用因子は、単離βＡサブユニットの文脈であれ、二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてあれ、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性を阻害する作用因子である。βＡβＢヘテロ二量体の場合、「アクチビンＡ」を阻害する作用因子は、βＡサブユニットの１つまたは複数の活性を特異的に阻害するが、複合体のβＡ以外のサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）の活性は阻害しない作用因子である。この原則はまた、「アクチビンＢ」、「アクチビンＣ」、および「アクチビンＥ」に結合し、かつ／またはこれらを阻害する作用因子にも当てはまる。「アクチビンＡＢ」に拮抗する本明細書で開示される作用因子は、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性と、βＢサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性とを阻害する作用因子である。
増殖および分化因子８（ＧＤＦ８）は、ミオスタチンとしても公知である。ＧＤＦ８は、骨格筋量の負の調節因子である。ＧＤＦ８は、発生中および成体中の骨格筋において高度に発現する。遺伝子導入マウスにおけるＧＤＦ８欠失変異は、骨格筋の顕著な肥大および過形成を特徴とする［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７年）、３８７巻：８３～９０頁］。骨格筋量の同様の増加は、ウシ［例えば、Ａｓｈｍｏｒｅら（１９７４年）、Ｇｒｏｗｔｈ、３８巻：５０１～５０７頁；ＳｗａｔｌａｎｄおよびＫｉｅｆｆｅｒ（１９９４年）、Ｊ． Ａｎｉｍ． Ｓｃｉ．、３８巻：７５２～７５７頁；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ（１９９７年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９４巻：１２４５７～１２４６１頁；ならびにＫａｍｂａｄｕｒら（１９９７年）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、７巻：９１０～９１５頁を参照されたい］および、驚くべきことに、ヒト［例えば、Ｓｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２～８頁を参照されたい］におけるＧＤＦ８の天然に存在する変異において明らかである。研究は、ヒトにおけるＨＩＶ感染に関連する筋肉消耗には、ＧＤＦ８タンパク質の発現の増加が随伴することも示している［例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｃａｄａｖｉｄら（１９９８年）、ＰＮＡＳ、９５巻：１４９３８～４３頁を参照されたい］。加えて、ＧＤＦ８は、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の生成を調節することが可能であり、筋芽細胞の増殖を調節し得る［例えば、国際特許出願公開第ＷＯ００／４３７８１号を参照されたい］。ＧＤＦ８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ８ドメイン二量体に非共有結合的に結合し、その生物活性を不活性化することができる［例えば、Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６３巻：６４０７～６４１５頁；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６３巻：７６４６～７６５４頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９０年）、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３巻：３５～４３頁を参照されたい］。ＧＤＦ８または構造的に関連するタンパク質に結合し、それらの生物活性を阻害する他のタンパク質として、フォリスタチン、および、潜在的に、フォリスタチン関連タンパク質が挙げられる［例えば、Ｇａｍｅｒら（１９９９年）、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２～２３２頁を参照されたい］。
ＢＭＰ１１としても公知の増殖および分化因子１１（ＧＤＦ１１）は、分泌タンパク質である［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９９年）、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．、２２巻：２６０～２６４頁］。ＧＤＦ１１は、マウス発生時に尾芽、肢芽、上顎弓および下顎弓、ならびに後根神経節において発現する［例えば、Ｎａｋａｓｈｉｍａら（１９９９年）、Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ．、８０巻：１８５～１８９頁を参照されたい］。ＧＤＦ１１は、中胚葉組織および神経組織の両方のパターン形成において、固有の役割を果たす［例えば、Ｇａｍｅｒら（１９９９年）、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２～３２頁を参照されたい］。ＧＤＦ１１は、発生中のニワトリの肢における軟骨形成および筋発生の負の調節因子であることが示された［例えば、Ｇａｍｅｒら（２００１年）、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．、２２９巻：４０７～２０頁を参照されたい］。筋内のＧＤＦ１１の発現はまた、ＧＤＦ８と同様の方式での筋肉の増殖の調節におけるその役割も示唆する。加えて、脳内のＧＤＦ１１の発現は、ＧＤＦ１１はまた、神経系の機能に関連する活性を有し得ることを示唆する。興味深いことに、ＧＤＦ１１は、嗅上皮における神経発生を阻害することも見出された［例えば、Ｗｕら（２００３年）、Ｎｅｕｒｏｎ、３７巻：１９７～２０７頁を参照されたい］。
部分的に、本開示は、骨髄線維症患者を処置するため、特に、例えば、脾腫、髄外造血、および線維症を含めた当該疾患の種々の合併症を改善するためにＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（阻害剤）を使用することができるという発見に関する。具体的には、本明細書で提示されているデータは、ＧＤＦトラップポリペプチドが、骨髄線維症のＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆモデルにおける脾腫、髄外造血、および線維症を低下させることを示す。したがって、ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、任意選択で、骨髄線維症を処置するための１つまたは複数の他の支持療法または活性作用因子と組み合わせて投与することによって骨髄線維症を処置するため、特に、骨髄線維症の１つまたは複数の合併症（脾腫、髄外造血、貧血、および線維症）を処置または予防するための、組成物および方法に関する。
本明細書で使用される用語は、概して、本発明の文脈の範囲内で、かつ各用語が使用される特定の文脈において当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。実践者に本発明の組成物および方法ならびにそれらの作製および使用の仕方の記載に関して追加の指針を提供するためにある特定の用語は以下または本明細書の他の箇所で論じられる。用語の任意の使用の範囲または意味は、用語が使用される特定の文脈から明らかになるであろう。
「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて、同じ生物種のスーパーファミリーからのタンパク質、ならびに異なる生物種からの相同タンパク質を含めた、「共通の進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係を指す。このようなタンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、パーセント同一性の観点であれ、特定の残基またはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、それらの配列類似性によって反映される通り、配列相同性を有する。しかし、一般的な用法において、および本出願において、用語「相同」は、「高度に」などの副詞によって修飾されている場合、配列類似性を指す場合があり、共通の進化的起源に関連していてもしていなくてもよい。
用語「配列類似性」は、その文法形式の全てが、共通の進化的起源を共有していてもよく、共有していなくてもよい核酸またはアミノ酸配列の間の同一性または一致の程度を指す。
参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に照らした「配列同一性パーセント（％）」とは、配列を決定し、必要な場合、最大の配列同一性パーセントを達成するようにギャップを導入した後における、保存的置換は配列同一性の一部と考えない場合の、候補配列内のアミノ酸残基（または核酸）の百分率であって、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列内のアミノ酸残基（または核酸）と同一であるアミノ酸残基（または核酸）の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを目的とするアラインメントは、当該分野の技術の範囲内にある種々の方式で、例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェア、ＢＬＡＳＴ－２ソフトウェア、ＡＬＩＧＮソフトウェア、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど、一般に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、配列を決定するのに適切なパラメータであって、比較される配列の全長にわたり最大のアラインメントを達成するのに必要とされる、任意のアルゴリズムを含むパラメータを決定することができる。しかし、本明細書の目的では、アミノ酸（核酸）配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムである、ＡＬＩＧＮ－２を使用して生成する。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により作成され、ソースコードは、使用説明書と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、ここで、米国著作権登録第ＴＸＵ５１００８７号として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から一般に利用可能であるが、ソースコードからコンパイルすることもできる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標） Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上の使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムにより設定され、変化しない。
「アゴナイズする」は、全てのその文法上の形態において、タンパク質および／または遺伝子を活性化するプロセス（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を活性化または増幅することによって、または不活性なタンパク質が活性状態になるように誘導することによって）、またはタンパク質および／または遺伝子の活性を増加させるプロセスを指す。
「拮抗する」は、全てのその文法上の形態において、タンパク質および／または遺伝子を阻害するプロセス（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を阻害するかまたは低下させることによって、または活性タンパク質が不活性状態になるように誘導することによって）、またはタンパク質および／または遺伝子の活性を低下させるプロセスを指す。
用語「約」および「およそ」は、本明細書および特許請求の範囲にわたり数値と関連して使用される場合、当業者にとって一般的な許容できる正確さの隔たりを意味する。一般に、このような正確さの隔たりは±１０％である。代替的に、生物系において特に、用語「約」および「およそ」は、所与の値の１ケタ以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味し得る。
本明細書で開示された数値範囲は、範囲を定義する数を含む。
用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、その用語が使用される文脈が明らかにそうではないことを指示しない限り、複数形の指示対象を含む。用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、加えて用語「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」は、本明細書において同義的に使用することができる。さらに、「および／または」は、本明細書において使用される場合、２つまたはそれより多くの特定された特徴または構成要素のそれぞれが他方を含むまたは含まないことの具体的な開示として解釈されるものとする。したがって、用語「および／または」は、本明細書において例えば「Ａおよび／またはＢ」などの成句で使用される場合、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、用語「および／または」は、例えば「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの成句で使用される場合、以下の態様：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）のそれぞれを包含することが意図される。
本明細書にわたり、文言「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの派生語は、述べられている整数または整数の群を含むことを暗に意味するが、他のいずれの整数または整数の群も排除されないことが理解される。
２．ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト
部分的に、本開示は、骨髄線維症患者を処置するため、特に、例えば、脾腫、髄外造血、および線維症を含めた当該疾患の種々の合併症を改善するためにＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（阻害剤）を使用することができるという発見に関する。具体的には、本明細書で提示されているデータは、ＧＤＦトラップポリペプチドが骨髄線維症のＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆモデルにおける脾腫、髄外造血、および線維症を低下させることを示す。可溶性ＧＤＦトラップポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢ拮抗作用以外の機構を通じて骨髄線維症に影響を及ぼす可能性があるが［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＢ、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数の阻害は、おそらくＴＧＦ－ベータスーパーファミリーの他のメンバーを含む広範な追加の作用因子の活性を阻害する作用因子の傾向の指標になり得、このような集合的な阻害により、例えば骨髄線維症に対する所望の効果がもたらされる可能性がある］、本開示は、それにもかかわらず、ＡｃｔＲＩＩＢ拮抗作用に基づいて望ましい治療剤を選択することができることを実証する。したがって、特定の作用機序に束縛されることは望まないが、他のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト［例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体のアンタゴニスト、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンド（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０）のアンタゴニスト、１つまたは複数のＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）のアンタゴニスト、１つまたは複数の補助受容体のアンタゴニスト、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢ下流シグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ）のアンタゴニスト、またはこのようなアンタゴニストの組み合わせ］が、骨髄線維症の処置において、特に、種々の骨髄線維症に関連する合併症（例えば、脾腫、髄外造血、および線維症）の処置または予防において有用であることが予想される。このような作用因子は、本明細書では集合的に、「ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト」または「ＡｃｔＲＩＩＢ阻害剤」と称される。
Ａ．ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびそれらの改変体
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびそれらの改変体（例えば、ＧＤＦトラップ）に関する。具体的には、本開示は、骨髄線維症を処置するため、特に、骨髄線維症の１つまたは複数の合併症（例えば、脾腫、髄外造血、貧血、および線維症）、ならびに／またはヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者を処置または予防するために、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、単独で、または１つもしくは複数の追加の支持療法と組み合わせて使用する方法を提供する。本明細書で使用される場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＢ」は、任意の種に由来するアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質のファミリー、および変異誘発または他の改変によるこのようなＡｃｔＲＩＩＢタンパク質に由来する改変体を指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩＢに対する言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であるものと理解される。ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチ領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインで構成される膜貫通タンパク質である。
用語「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチド、ならびに、有用な活性を保持する任意のそれらの改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを包含する。このような改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例は、本開示を通して、ならびに、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０１２６２７号および同第ＷＯ２００８／０９７５４１号において提示される。本明細書に記載される全てのＡｃｔＲＩＩＢ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、他に特に指定がなければ、以下に提示するヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質配列（配列番号１）の番号付けに基づく。
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質配列は、以下の通りである。
Figure 0007264580000001
Figure 0007264580000002
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示し、潜在的な、内因性Ｎ－連結グリコシル化部位は、二重下線で指し示す。
プロセシング後の（成熟）細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである：
Figure 0007264580000003
一部の実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端における「ＳＧＲ・・・」配列により生成することができる。細胞外ドメインのＣ末端「テール」は、一重下線で指し示す。「テール」を欠失させた配列（Δ１５配列）は、以下の通りである。
Figure 0007264580000004
配列番号１の６４位においてアラニン（Ａ６４）を有するＡｃｔＲＩＩＢの形態についてはまた、文献［Ｈｉｌｄｅｎら（１９９４年）、Ｂｌｏｏｄ、８３巻（８号）：２１６３～２１７０頁］においても報告されている。本出願人らは、Ａ６４置換を有するＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対するアフィニティーが比較的低いことを確認した。これに対し、６４位においてアルギニン（Ｒ６４）を有する、同じＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対するアフィニティーが、低ｎＭ～高ｐＭの範囲である。したがって、Ｒ６４を有する配列を、本開示におけるヒトＡｃｔＲＩＩＢのための「野生型」参照配列として使用する。
６４位にアラニンを有するＡｃｔＲＩＩＢの形態は、以下の通りである。
Figure 0007264580000005
Figure 0007264580000006
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示す。
代替Ａ６４形態のプロセシング後の（成熟）細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである：
Figure 0007264580000007
一部の実施形態では、タンパク質は、Ｎ末端における「ＳＧＲ・・・」配列により生成することができる。細胞外ドメインのＣ末端「テール」は、一重下線で指し示す。「テール」を欠失させた配列（Δ１５配列）は、以下の通りである。
Figure 0007264580000008
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質をコードする核酸配列であって、ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のアミノ酸１～５１３をコードする、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１０６．３のヌクレオチド２５～１５６０からなる核酸配列を、下記（配列番号７）に示す。示される配列は、６４位においてアルギニンを提示するが、代わりに、アラニンを提示するように改変することができる。シグナル配列に下線を付す。
Figure 0007264580000009
Figure 0007264580000010
プロセシング後のヒト細胞外ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸配列は、以下（配列番号８）の通りである。
Figure 0007264580000011
示される配列は、６４位においてアルギニンを提示するが、代わりに、アラニンを提示するように改変することができる。
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインおよびヒトＡｃｔＲＩＩＡ細胞外ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを、図１に例示する。このアラインメントは、両方の受容体内のアミノ酸残基であって、ＡｃｔＲＩＩリガンドに直接接触すると考えられるアミノ酸残基を指し示す。例えば、複合的なＡｃｔＲＩＩ構造から、ＡｃｔＲＩＩＢ－リガンド結合ポケットは、残基Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８～Ｔ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５３～Ｋ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８～Ｎ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ａ９２、およびＥ９４～Ｆ１０１によって部分的に定義されることが指し示された。これらの位置において、保存的変異が許容されることが予想される。
加えて、ＡｃｔＲＩＩＢは、一般に、脊椎動物のなかでよく保存されており、完全に保存された細胞外ドメインの大きいストレッチを有する。例えば、図２は、種々のＡｃｔＲＩＩＢオーソログと比較したヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの多重配列アラインメントを描示する。ＡｃｔＲＩＩＢに結合するリガンドの多くも高度に保存されている。したがって、これらのアラインメントから、通常のＡｃｔＲＩＩＢ－リガンド結合活性に重要なリガンド結合ドメイン内の主要なアミノ酸位置を予想することが可能であるほか、通常のＡｃｔＲＩＩＢ－リガンド結合活性を顕著に変更させずに、置換に対して許容性を有する可能性が高いアミノ酸位置を予想することも可能である。したがって、ここで開示された方法に従って有用な活性ヒトＡｃｔＲＩＩＢ改変体ポリペプチドは、別の脊椎動物のＡｃｔＲＩＩＢの配列からの対応する位置における１つまたは複数のアミノ酸を含み得、または、ヒトまたは他の脊椎動物の配列中の残基に類似している残基を含み得る。
限定することを意味しないが、以下の実施例は、活性なＡｃｔＲＩＩＢ改変体を定義するためのこのアプローチを例示する。ヒト細胞外ドメイン（配列番号２）におけるＬ４６は、アフリカツメガエルＡｃｔＲＩＩＢ（配列番号４２）におけるバリンであり、したがってこの位置は変更され得、任意選択で、Ｖ、ＩまたはＦなどの別の疎水性残基、またはＡなどの非極性残基に変更され得る。ヒト細胞外ドメインにおけるＥ５２は、アフリカツメガエルではＫであり、これは、この部位は、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、ＹおよびおそらくＡなどの極性残基を含めた多種多様の変化が許容され得ることを示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＴ９３は、アフリカツメガエルではＫであり、これは、この位置において幅広い構造的なバリエーションが許容されることを示しており、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなどの極性残基が好ましい。ヒト細胞外ドメインにおけるＦ１０８は、アフリカツメガエルではＹであり、したがって、Ｙまたは他の疎水性基、例えばＩ、ＶまたはＬが許容されるはずである。ヒト細胞外ドメインにおけるＥ１１１は、アフリカツメガエルではＫであり、これは、この位置において、Ｄ、Ｒ、ＫおよびＨ、ならびにＱおよびＮを含めた荷電残基が許容されるはずであることを示す。ヒト細胞外ドメインにおけるＲ１１２は、アフリカツメガエルではＫであり、これは、この位置において、ＲおよびＨを含めた塩基性残基が許容されることを示す。ヒト細胞外ドメインにおける１１９位のＡは比較的不完全に保存されており、げっ歯類ではＰ（配列番号３７および３９）およびアフリカツメガエルではＶとして出現し、したがってこの位置では本質的にいかなるアミノ酸も許容されるはずである。
さらに当該分野では、ＡｃｔＲＩＩタンパク質は、構造的／機能的な特徴に関して、特にリガンド結合に関して特徴付けられている［Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９２年）Ｃｅｌｌ ６８巻（１号）：９７～１０８頁；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６巻（１号）：１８～２２頁；Ａｌｌｅｎｄｏｒｐｈら（２００６年）ＰＮＡＳ １０３巻（２０号）：７６４３～７６４８頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２００３年）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２２巻（７号）：１５５５～１５６６頁；および米国特許第７，７０９，６０５号、同第７，６１２，０４１号、および同第７，８４２，６６３号］。本明細書に記載の教示に加えて、これらの参考文献は、１つまたは複数の所望の活性（例えば、リガンド結合活性）を保持するＡｃｔＲＩＩ改変体をどのように生成するかに関する詳細な指針を提供する。
例えば、スリーフィンガー毒素のフォールドとして公知の構造モチーフを定義することが、Ｉ型およびＩＩ型受容体によるリガンド結合に重要であり、各単量体受容体の細胞外ドメイン内の様々な位置に配置されている保存されたシステイン残基によって形成される［Greenwaldら（１９９９年）Nat Struct Biol、６巻：１８～２２頁；およびHinck（２０１２年）FEBS Lett、５８６巻：１８６０～１８７０頁］。したがって、ヒトＡｃｔＲＩＩＢのコアリガンド結合ドメインは、これらの保存されたシステインの最も外側を境界と定めた場合、配列番号１（ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体）の２９～１０９位に対応する。したがって、これらのシステインによって境界が定められたコア配列に隣接する構造的にあまり秩序立っていないアミノ酸は、Ｎ末端が約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、もしくは２８残基短縮されていてもよく、かつ／または、Ｃ末端が約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５残基短縮されていてもよく、それにより必ずしもリガンド結合は変更されない。Ｎ末端および／またはＣ末端における短縮の例示的なＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインとしては、配列番号２、３、５、および６が挙げられる。
Ａｔｔｉｓａｎｏらは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端におけるプロリンノットの欠失が、アクチビンに対する受容体のアフィニティーを低減したことを示した。本発明の配列番号１のアミノ酸２０～１１９を含有するＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１１９）－Ｆｃ」は、プロリンノット領域および完全な膜近傍ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１３４）－Ｆｃに比べて、ＧＤＦ１１およびアクチビンへの結合を低減した（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照されたい）。しかしながら、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１２９）－Ｆｃタンパク質は、プロリンノット領域が崩壊されていたとしても、野生型に類似した、ただし多少低減された活性を保持する。したがって、アミノ酸１３４、１３３、１３２、１３１、１３０および１２９（配列番号１に照らして）で終わるＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは全て、活性であると予想されるが、１３４または１３３で終わる構築物が最も高い活性を有し得る。同様に、残基１２９～１３４（配列番号１に照らして）のいずれかにおける変異は、リガンド結合アフィニティーが大幅に変更されるとは予想されない。この裏付けとして、Ｐ１２９およびＰ１３０の変異（配列番号１に照らして）によって、リガンド結合は実質的に低下しないことが当該分野において公知である。したがって、本発明の開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アミノ酸１０９（最後のシステイン）もの早期に終わる場合もあるが、１０９および１１９で終わるかまたはその間（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、または１１９）で終わる形態は、低減したリガンド結合を有すると予想される。アミノ酸１１９（本発明の配列番号１に照らして）は不完全に保存されているので、たやすく変更または短縮される。１２８またはそれ以降（配列番号１に照らして）で終わるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、リガンド結合活性を保持すると予想される。配列番号１に照らして、１１９および１２７で終わるかまたはその間（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、または１２７）で終わるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、中間の結合能力を有すると予想される。これらの形態のいずれも、臨床上または実験の設定に応じて使用するのに望ましい可能性がある。
ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端では、アミノ酸２９またはその手前（配列番号１に照らして）で始まるタンパク質が、リガンド結合活性を保持することが予想される。アミノ酸２９は、最初のシステインを表す。２４位におけるアラニンからアスパラギンへの変異（配列番号１に照らして）は、リガンド結合に実質的に影響を及ぼさずに、Ｎ－連結グリコシル化配列を導入する［米国特許第７，８４２，６６３号］。これにより、シグナル切断ペプチドとシステイン架橋領域との間の領域であって、アミノ酸２０～２９に対応する領域内の変異は、良好に許容されることが確認される。特に、２０、２１、２２、２３、および２４位（配列番号１に照らして）から始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、一般的なリガンド結合活性を保持し、２５、２６、２７、２８、および２９位（配列番号１に照らして）から始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドも、リガンド結合活性を保持すると予想される。例えば米国特許第７，８４２，６６３号において、驚くべきことに、２２、２３、２４、または２５位から始まるＡｃｔＲＩＩＢ構築物が最も高い活性を有すると予想されることが実証された。
総合すると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分（例えば、リガンド結合部分）の一般式は、配列番号１のアミノ酸２９～１０９を含む。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの一部分であって、配列番号１のアミノ酸２０～２９のいずれか１つに対応する残基で始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のいずれか１つで始まり）、配列番号１のいずれか１つのアミノ酸１０９～１３４に対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のいずれか１つで終わる）一部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよいし、これらから本質的になっていてもよいし、またはこれらからなっていてもよい。他の例としては、配列番号１の、２０～２９位（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９位のいずれか１つ）または２１～２９位（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９位のいずれか１つ）で始まり、１１９～１３４位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位のいずれか１つ）、１１９～１３３位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３位のいずれか１つ）、１２９～１３４位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位のいずれか１つ）、または１２９～１３３位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３位のいずれか１つ）で終わるポリペプチドが挙げられる。他の例としては、配列番号１の、２０～２４位（例えば、２０、２１、２２、２３、または２４位のいずれか１つ）、２１～２４位（例えば、２１、２２、２３、または２４位のいずれか１つ）、または２２～２５位（例えば、２２、２２、２３、または２５位のいずれか１つ）で始まり、１０９～１３４位（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位のいずれか１つ）、１１９～１３４位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位のいずれか１つ）または１２９～１３４位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位のいずれか１つ）で終わる構築物が挙げられる。これらの範囲内の改変体も企図され、特に、配列番号１の対応する部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する改変体も企図される。
本明細書に記載されるバリエーションは、種々の方法で組み合わせられ得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ改変体は、リガンド結合ポケット内に、１、２、５、６、７、８、９、１０または１５以下の保存的アミノ酸変化を含み、リガンド結合ポケット内の４０、５３、５５、７４、７９および／または８２位に、０、１つまたは複数の非保存的変更を含む。可変性が特に良好に許容され得る結合ポケットの外側の部位は、細胞外ドメインのアミノおよびカルボキシ末端（上述のように）、ならびに４２～４６位および６５～７３位（配列番号１に照らして）を包含する。６５位におけるアスパラギンからアラニンへの変更（Ｎ６５Ａ）は、Ａ６４バックグラウンドにおけるリガンド結合を実際に改善し、したがってＲ６４バックグラウンドにおいてリガンド結合に対する好ましくない影響を有さないと予想される［米国特許第７，８４２，６６３号］。この変化により、Ａ６４バックグラウンドにおけるＮ６５のグリコシル化が排除される可能性があり、したがって、この領域における著しい変化が許容される可能性があることが実証されている。Ｒ６４Ａ変化は許容性が乏しいが、Ｒ６４Ｋは良好に許容される、したがって、Ｈなどの別の塩基性残基は、６４位において許容され得る［米国特許第７，８４２，６６３号］。さらに、本技術に記載される変異誘発プログラムの結果は、保存が多くの場合有益であるアミノ酸位がＡｃｔＲＩＩＢにあることを示す。配列番号１に照らして、これらとしては、８０位（酸性または疎水性アミノ酸）、７８位（疎水性、そして特にトリプトファン）、３７位（酸性、そして特にアスパラギン酸またはグルタミン酸）、５６位（塩基性アミノ酸）、６０位（疎水性アミノ酸、特にフェニルアラニンまたはチロシン）が挙げられる。したがって、本開示はＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに保存され得るアミノ酸のフレームワークを提供する。保存が望ましいと考えられる他の位置は以下の通りである：５２位（酸性アミノ酸）、５５位（塩基性アミノ酸）、８１位（酸性）、９８位（極性または荷電、特にＥ、Ｄ、ＲまたはＫ）、全て配列番号１に照らして。
ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインへのさらなるＮ－連結グリコシル化部位（Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ）の付加は、良好に許容されることがこれまでに実証された（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照されたい）。したがって、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列は、一般に、本発明の開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおいて図１において定義されるリガンド結合ポケットの外側の位置に導入され得る。非内因性Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列の導入に特に好適な部位としては、アミノ酸２０～２９、２０～２４、２２～２５、１０９～１３４、１２０～１３４または１２９～１３４（配列番号１に照らして）が挙げられる。またＮ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列は、ＡｃｔＲＩＩＢ配列とＦｃドメインまたは他の融合成分との間のリンカーにも導入され得る。このような部位は、以前から存在しているＳまたはＴに対して正しい位置にＮを導入することによって、または以前から存在しているＮに対応する位置にＳまたはＴを導入することによって、最小の労力で導入され得る。したがって、Ｎ－連結グリコシル化部位を生じる望ましい変更は、Ａ２４Ｎ、Ｒ６４Ｎ、Ｓ６７Ｎ（可能であればＮ６５Ａの変更と組み合わせる）、Ｅ１０５Ｎ、Ｒ１１２Ｎ、Ｇ１２０Ｎ、Ｅ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｎ、Ａ１３２Ｎ、Ｒ１１２ＳおよびＲ１１２Ｔ（配列番号１に照らして）である。グリコシル化されることが予測されるＳはどれも、グリコシル化によってもたらされる保護のために、免疫原性部位を生じることなくＴに変更され得る。同様に、グリコシル化されることが予測されるＴはどれも、Ｓに変更され得る。したがって、Ｓ６７ＴおよびＳ４４Ｔ（配列番号１に照らして）の変更が企図される。同様に、Ａ２４Ｎ改変体では、Ｓ２６Ｔの変更が使用され得る。したがって、本発明の開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、上記の、１つまたは複数の追加の非内因性Ｎ－連結グリコシル化コンセンサス配列を有する改変体であり得る。
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、それらのフラグメント、機能的な改変体、および改変形態を含むＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストに関する。本開示に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、可溶性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン）であることが好ましい。一部の実施形態では、本開示に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、および／またはＢＭＰ１０の活性（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害する（それに拮抗する）。一部の実施形態では、本開示に従って使用するためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つまたは複数のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ９］に結合する。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢの一部分であって、配列番号１のアミノ酸２０～２９に対応する残基で始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のいずれか１つで始まり）、配列番号１のアミノ酸１０９～１３４に対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のいずれか１つで終わる）一部分と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９～１０９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９～１０９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になり、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸（天然に存在する酸性アミノ酸ＤおよびＥ、または人工酸性アミノ酸）である。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５～１３１と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５～１３１と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になり、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸である。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、２４、２５、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３５、４５、５０、５３、５４、および５８のいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、２４、２５、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３５、４５、５０、５３、５４、および５８のいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になり、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸である。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、少なくとも１つのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含み、配列番号１のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸ではない（すなわち、天然に存在する酸アミノ酸ＤもしくはＥ、または人工酸性アミノ酸残基ではない）。
ある特定の態様では、本開示は、ＧＤＦトラップポリペプチド（「ＧＤＦトラップ」とも称される）に関する。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが対応する野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと比べて１つまたは複数の変更されたリガンド結合活性を有するように、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、「野生型」または非改変ＡｃｔＲＩＩポリペプチド）の細胞外ドメイン（リガンド結合ドメインとも称される）中に１つまたは複数の変異（例えば、アミノ酸付加、欠失、置換、およびこれらの組み合わせ）を含む改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである。好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、対応する野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと類似した少なくとも１つの活性を保持する。例えば、好ましいＧＤＦトラップは、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に結合し、その機能を阻害する（例えば、それに拮抗する）。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのリガンドの１つまたは複数にさらに結合し、それを阻害する。したがって、本開示は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンドに対する変更された結合特異性を有するＧＤＦトラップポリペプチドを提供する。
例示すれば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンド、例えばアクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、および／またはアクチビンＥ）、特にアクチビンＡと比べて、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８への変更されたリガンド結合ドメインの選択性を増加させる１つまたは複数の変異を選択してもよい。任意選択で、変更されたリガンド結合ドメインは、アクチビン結合に関するＫｄとＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合に関するＫｄとの比率が、野生型リガンド結合ドメインの比率に対して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍であり、または１０００倍もの大きさである。任意選択で、変更されたリガンド結合ドメインは、アクチビン阻害に関するＩＣ５０とＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８阻害に関するＩＣ５０との比率が、野生型リガンド結合ドメインに対して、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍であり、または１０００倍もの大きさである。任意選択で、変更されたリガンド結合ドメインは、アクチビン（例えばアクチビンＡ）阻害に関するＩＣ５０の、少なくとも２分の１、５分の１、１０分の１、２０分の１、５０分の１、１００分の１またはさらには１０００分の１もの低さでＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８を阻害する。
ある特定の好ましい実施形態では、本発明の開示のＧＤＦトラップは、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８（ミオスタチンとしても公知である）に優先的に結合するように設計される。任意選択で、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、アクチビンＢにさらに結合することができる。任意選択で、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、ＢＭＰ６にさらに結合することができる。任意選択で、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、ＢＭＰ１０にさらに結合することができる。任意選択で、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合トラップは、アクチビンＢおよびＢＭＰ６にさらに結合することができる。ある特定の実施形態では、本発明の開示のＧＤＦトラップは、例えば、野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと比較して、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＡ／Ｂ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）への結合アフィニティーが低減されている。ある特定の好ましい実施形態では、本発明の開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、アクチビンＡへの結合アフィニティーが低減されている。
ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質のアミノ酸残基（例えば、Ｅ３９、Ｋ５５、Ｙ６０、Ｋ７４、Ｗ７８、Ｌ７９、Ｄ８０、およびＦ１０１）は、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合ポケット中であり、例えばアクチビンＡ、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８を含めたそのリガンドへの結合の媒介を助ける。したがって本発明の開示は、それらのアミノ酸残基において１つまたは複数の変異を含むＡｃｔＲＩＩＢ受容体の変更されたリガンド結合ドメイン（例えばＧＤＦ８／ＧＤＦ１１結合ドメイン）を含むＧＤＦトラップポリペプチドを提供する。
具体例として、ＡｃｔＲＩＩＢのリガンド結合ドメインの正に荷電したアミノ酸残基であるＡｓｐ（Ｄ８０）を、異なるアミノ酸残基に変異させて、アクチビンではなく、ＧＤＦ８に優先的に結合するＧＤＦトラップポリペプチドを生成することができる。好ましくは、Ｄ８０残基を、配列番号１に照らして、非荷電アミノ酸残基、負荷電アミノ酸残基、および疎水性アミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基に変化させる。さらなる具体例として、配列番号１の疎水性残基であるＬ７９を変更させて、アクチビン－ＧＤＦ１１／ＧＤＦ８結合特性の変更を付与することができる。例えば、Ｌ７９Ｐ置換は、ＧＤＦ１１への結合を、アクチビンへの結合より大幅に低減する。これに対し、Ｌ７９の、酸性アミノ酸による置き換え［アスパラギン酸またはグルタミン酸；Ｌ７９Ｄ置換またはＬ７９Ｅ置換］は、ＧＤＦ１１への結合アフィニティーを保持しながら、アクチビンＡへの結合アフィニティーを大幅に低減する。例示的な実施形態では、本明細書に記載される方法は、任意選択で、１つまたは複数の追加のアミノ酸の置換、付加、または欠失と組み合わせた、配列番号１の７９位に対応する位置に酸性アミノ酸（例えば、ＤまたはＥ）を含む改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである、ＧＤＦトラップポリペプチドを利用する。
一部の実施形態では、本開示は、治療有効性または安定性（例えば、貯蔵寿命およびインビボでのタンパク質分解に対する抵抗性）を増強することなどの目的のために、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの構造を改変することにより機能的改変体を作製することを企図する。改変体は、アミノ酸の置換、欠失、付加またはそれらの組み合わせによっても生成することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの単発的な置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での単発的な置換、スレオニンのセリンでの単発的な置換、または、あるアミノ酸の、構造的に関連したアミノ酸での同様の置換（例えば、保存的変異）は、結果として生じる分子の生物学的活性に対して大きな影響を及ぼさないと予想するのは理にかなっている。保存的置換は、その側鎖が関連しているアミノ酸のファミリー内で行われる置換である。本開示のポリペプチドのアミノ酸配列における変化が機能的な相同体をもたらすかどうかは、野生型ポリペプチドに類似した様式で細胞内の応答を生成するか、または例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙなど、１つまたは複数のＴＧＦ－ベータリガンドに結合する、改変体ポリペプチドの能力を評価することによってたやすく決定することができる。
ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変更させるような、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの特異的変異を企図する。このような変異は、１または複数のグリコシル化部位（例えば、Ｏ－連結もしくはＮ－連結のグリコシル化部位）を導入もしくは排除するように選択され得る。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、一般に、トリペプチド配列、アスパラギン－Ｘ－スレオニンまたはアスパラギン－Ｘ－セリン（ここで、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含み、この配列は、適切な細胞のグリコシル化酵素によって特異的に認識される。変化はまた、（Ｏ－連結グリコシル化部位については）ポリペプチドの配列への、１または複数のセリンもしくはスレオニン残基の付加、または、１または複数のセリンもしくはスレオニン残基による置換によってなされ得る。グリコシル化認識部位の第１位もしくは第３位のアミノ酸の一方もしくは両方における種々のアミノ酸置換もしくは欠失（および／または、第２位におけるアミノ酸の欠失）は、改変されたトリペプチド配列において非グリコシル化をもたらす。ポリペプチドにおける糖質部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的もしくは酵素的なカップリングによるものである。使用されるカップリング様式に依存して、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）遊離スルフヒドリル基（例えば、システインのもの）；（ｄ）遊離ヒドロキシル基（例えば、セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの）；（ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもの）；または（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。ポリペプチド上に存在する１または複数の糖質部分の除去は、化学的および／または酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのポリペプチドの曝露を含み得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトなままにしつつ、連結糖（Ｎ－アセチルグルコサミンまたはＮ－アセチルガラクトサミン）を除くほとんどもしくは全ての糖の切断を生じる。ポリペプチドにおける、炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら［Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７年）、１３８巻：３５０頁］により記載されているように、様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。ポリペプチドの配列は、適切なように、使用される発現系のタイプに応じて調節され得る。というのも、哺乳動物、酵母、昆虫および植物の細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得る。一般に、ヒトにおいて使用するための本開示のポリペプチドは、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞株またはＣＨＯ細胞株）において発現され得るが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であることと期待される。
本発明の開示はさらに、変異体、特にＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコンビナトリアル変異体のセットのほか、短縮型変異体を生成する方法も企図する。コンビナトリアル変異体のプールは、機能的に活性な（例えば、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのリガンドに結合する）ＡｃｔＲＩＩＢ配列を識別するために特に有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、薬物動態の変更またはリガンドへの結合の変更など、特性を変更させたポリペプチド改変体を生成することであり得る。種々のスクリーニングアッセイが以下に提供され、そして、このようなアッセイは、改変体を評価するために使用され得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ改変体は、１つまたは複数のＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）に結合する能力、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリー受容体へのＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのリガンドの結合を防止する能力、および／またはＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのリガンドによって引き起こされるシグナル伝達に干渉する能力についてスクリーニングされ得る。
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの活性はまた、細胞ベースのまたはインビボアッセイでも試験することができる。例えば、骨髄線維症の厳しさに関与する遺伝子の発現に対するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの作用を評価することができる。これは、必要に応じて、１つまたは複数の組換えＡｃｔＲＩＩリガンドタンパク質（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）の存在下で実施することができ、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび任意選択でＡｃｔＲＩＩＢリガンドが生成するように細胞をトランスフェクトすることができる。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをマウスまたは他の動物に投与し、骨髄線維症に対する効果を当技術分野で認められている方法を使用して評価することができる。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそれらの改変体の活性を、血液細胞の前駆細胞中で、これらの細胞の成長に対する何らかの効果に関して、例えば、本明細書に記載されるアッセイおよび当技術分野において常識的なアッセイによって試験することができる。このような細胞株では、下流のシグナル伝達に対する作用をモニタリングするためにＳＭＡＤ応答性レポーター遺伝子を使用することができる。
コンビナトリアル由来の改変体であって、参照ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと比べて選択的、または一般的に効力を増大させたリガンドトラップを生成することができる。このような改変体は、組換えＤＮＡ構築物から発現されたとき、遺伝子治療のプロトコルにおいて使用され得る。同様に、変異誘発は、対応する非改変ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有する改変体を生じ得る。例えば、変更されたタンパク質は、タンパク質分解、または、非改変ポリペプチドの崩壊もしくは他の方法で不活性化をもたらす他の細胞プロセスに対してより安定性であるかもしくは安定性が低いかのいずれかにされ得る。このような改変体およびこれをコードする遺伝子は、そのポリペプチドの半減期を調節することによってポリペプチド複合体レベルを変更するのに利用され得る。例えば、短い半減期は、より一過性の生物学的作用を生じ得、そして、誘導性の発現系の一部である場合、細胞内での組換えポリペプチド複合体レベルのより厳しい制御を可能にし得る。Ｆｃ融合タンパク質では、変異は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの半減期を変更するために、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分において作製され得る。
コンビナトリアルライブラリーは、各々が潜在的なＡｃｔＲＩＩＢ配列の少なくとも一部を含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって生成することができる。例えば、潜在的なＡｃｔＲＩＩＢをコードするヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、または代替的に、大型の融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイのための）として発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的にライゲーションすることができる。
潜在的な相同体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から生成し得る、多くの方式が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動式ＤＮＡ合成器で実行することができ、次いで、合成遺伝子は、発現に適切なベクターにライゲーションすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該分野で周知である。［Ｎａｒａｎｇ， ＳＡ（１９８３年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３９巻：３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１年）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ． ３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２７３～２８９頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５３巻：３２３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８巻：１０５６頁およびＩｋｅら（１９８３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１１巻：４７７頁］。このような技法は、他のタンパク質の指向進化で利用されている。［Ｓｃｏｔｔら、（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：３８６～３９０頁；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２年）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８９巻：２４２９～２４３３頁；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：４０４～４０６頁；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０年）、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８７巻：６３７８～６３８２頁のほか、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号、および同第５，０９６，８１５号］。
代替的に、変異誘発の他の形態も、コンビナトリアルライブラリーを生成するのに活用することができる。例えば、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、例えば、アラニン走査変異誘発［Ｒｕｆら（１９９４年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３巻：１５６５～１５７２頁；Ｗａｎｇら（１９９４年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６９巻：３０９５～３０９９頁；Ｂａｌｉｎｔら（１９９３年）、Ｇｅｎｅ、１３７巻：１０９～１１８頁；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら（１９９３年）、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１８巻：５９７～６０１頁；Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９３年）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６８巻：２８８８～２８９２頁；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：１０８３２～１０８３８頁；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１～１０８５頁］を使用して、リンカー走査変異誘発［Ｇｕｓｔｉｎら（１９９３年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９３巻：６５３～６６０頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９２年）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２巻：２６４４～２６５２頁；ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９８２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻：３１６頁］によって、飽和変異誘発［Ｍｅｙｅｒｓら、（１９８６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻：６１３頁］によって、ＰＣＲ変異誘発［Ｌｅｕｎｇら（１９８９年）、Ｍｅｔｈｏｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１巻：１１～１９頁］によって、または化学的変異誘発［Ｍｉｌｌｅｒら（１９９２年）、Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら（１９９４年）、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、７巻：３２～３４頁］を含むランダム変異誘発によって、スクリーニングすることにより、ライブラリーから生成および単離することができる。特に、コンビナトリアルの状況におけるリンカー走査変異誘発は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの短縮型（生体活性）形態を同定するための魅力的な方法である。
当該分野では、広範にわたる技法であって、点変異および短縮により作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための技法、および、このために、ある特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技法が公知である。このような技法は一般に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合可能である。大規模な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用される技法は典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングする工程と、適切な細胞を結果として得られるベクターのライブラリーで形質転換する工程と、所望の活性の検出により、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させる工程とを含む。好ましいアッセイは、ＴＧＦ－ベータリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）についての結合アッセイおよび／またはＴＧＦ－ベータリガンドに媒介される細胞シグナル伝達アッセイを含む。
当業者により認識される通り、本明細書で記載される変異、改変体または改変の大半は、核酸レベルで作製することもできる、または、場合によって、翻訳後修飾または化学合成により作製することもできる。このような技法は、当該分野で周知であり、それらの一部については、本明細書で記載される。本発明の開示は、部分的に、本明細書に記載される本発明の範囲内の他の改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを生成したり使用したりするための指標として使用することができる、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能的に活性な部分（フラグメント）および改変体を識別する。
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能的に活性なフラグメントは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号７、８、２６、３２、４８、４９、５１、５２、５５、５６、５７、５９、６０、６１、および６２）の対応するフラグメントから組換えにより生成されたポリペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。加えて、フラグメントは、従来のメリフィールド固相ｆ－Ｍｏｃまたはｔ－Ｂｏｃ化学などの当技術分野で公知の技法を使用して化学合成することができる。フラグメントを生成し（組換えにより、または化学合成により）、試験して、ＡｃｔＲＩＩ受容体および／または１つもしくは複数のリガンド（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ２／７、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ４／７、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ＧＤＦ５、ＧＤＦ６／ＢＭＰ１３、ＧＤＦ７、ＧＤＦ８、ＧＤＦ９ｂ／ＢＭＰ１５、ＧＤＦ１１／ＢＭＰ１１、ＧＤＦ１５／ＭＩＣ１、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、ｎｏｄａｌ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、ＭＩＳ、およびＬｅｆｔｙ）のアンタゴニスト（阻害剤）として機能することができるペプチジルフラグメントを同定することができる。
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、翻訳後修飾を、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドにおいて天然に存在するあらゆるものに加えてさらに含み得る。このような修飾としては、これらに限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられる。結果として、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、多糖または単糖、およびリン酸などの非アミノ酸要素を含有し得る。リガンドトラップポリペプチドの機能性に対するこのような非アミノ酸要素の影響を、他のＡｃｔＲＩＩＢ改変体について、本明細書に記載される通り試験することができる。本開示のポリペプチドを、細胞においてポリペプチドの発生期の形態を切断することにより生成する場合、翻訳後プロセシングもタンパク質の正しいフォールディングおよび／または機能のために重要であり得る。異なる細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ－３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）は、このような翻訳後の活性に関して特定の細胞機構および特徴的なメカニズムを有し、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの正しい修飾およびプロセシングが確実になるように選択することができる。
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの少なくとも一部分（ドメイン）と１つまたは複数の異種部分（ドメイン）とを有する融合タンパク質を含む。このような融合ドメインの周知の例としては、これらに限定されないが、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが挙げられる。融合ドメインは、所望の特性が付与されるように選択することができる。例えば、一部の融合ドメインは、融合タンパク質をアフィニティクロマトグラフィーによって単離するために特に有用である。アフィニティー精製のために、アフィニティクロマトグラフィーに関連するマトリックス、例えば、グルタチオンに結合体化させた樹脂、アミラーゼに結合体化させた樹脂、およびニッケルに結合体化させた樹脂またはコバルトに結合体化させた樹脂を使用する。このようなマトリックスの多くは、（ＨＩＳ６）融合パートナーと共に有用である、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システムおよびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）などの「キット」形態で入手可能である。別の例として、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの検出が容易になるように融合ドメインを選択することができる。このような検出ドメインの例としては、様々な蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ならびに、通常は特異的な抗体が入手可能な短いペプチド配列である「エピトープタグ」が挙げられる。特異的なモノクローナル抗体が容易に入手可能である周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、およびｃ－ｍｙｃタグが挙げられる。一部の場合では、融合ドメインは、関連するプロテアーゼにより融合タンパク質を部分的に消化し、それにより、そこから組換えタンパク質を遊離させることを可能にする、第Ｘａ因子またはトロンビンなどに対するプロテアーゼ切断部位を有する。次いで、その後のクロマトグラフィーによる分離により、遊離したタンパク質を融合ドメインから単離することができる。選択することができる融合ドメインの他のタイプとしては、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメイン、および、例えば免疫グロブリン由来の定常ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）を含めた、機能性ドメイン（追加の生物学的機能を付与するもの）が挙げられる。
ある特定の態様では、本発明の開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ポリペプチドを「安定化すること」が可能な１つまたは複数の改変を含有する。「安定化すること」とは、それが、破壊の低減によるものであるか、腎臓によるクリアランスの減少によるものであるか、または作用因子の他の薬物動態作用によるものであるかとは無関係に、インビトロ半減期、血清中半減期を増加させる任意のものを意味する。例えば、このような修飾は、ポリペプチドの貯蔵寿命を増強させるか、ポリペプチドの循環半減期を増強させる、かつ／または、ポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。このような安定化修飾としては、融合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインと安定化ドメインとを含む融合タンパク質が挙げられる）、グリコシル化部位の修飾（例えば、本開示のポリペプチドへのグリコシル化部位の付加が挙げられる）、および糖質部分の修飾（例えば、本開示のポリペプチドからの炭水化物部分の除去が挙げられる）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「安定化ドメイン」は、融合タンパク質の場合のように融合ドメイン（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）を指すだけでなく、炭水化物部分のような非タンパク質性修飾、または、ポリエチレングリコールのような非タンパク質性部分も含む。ある特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ポリペプチドを安定化させる異種ドメイン（「安定剤」ドメイン）、好ましくはインビボにおけるポリペプチドの安定性を増加させる異種ドメインと融合されている。免疫グロブリンの定常ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）との融合は、多様なタンパク質に所望の薬物動態特性を付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、所望の特性を付与することができる。
以下に、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｇ１Ｆｃ）に使用できる天然アミノ酸配列の例を示す（配列番号９）。点線の下線は、ヒンジ領域を指し示し、実線の下線は、天然に存在する改変体を有する位置を指し示す。本開示は、部分的に、配列番号９と、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなるポリペプチドを提供する。Ｇ１Ｆｃ中の天然に存在する改変体は、配列番号９で使用される番号付けシステム（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７を参照）に従ってＥ１３４ＤおよびＭ１３６Ｌを含み得ると予想される。
Figure 0007264580000012
任意選択で、ＩｇＧ１Ｆｃドメインは、Ａｓｐ－２６５、リシン３２２、およびＡｓｎ－４３４のような残基における１つまたは複数の変異を有する。特定の場合には、これらの変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｐ－２６５変異）を有する変異型ＩｇＧ１Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインに対する、Ｆｃγ受容体への結合能の低下を有する。他の場合には、これらの変異のうち１つまたは複数（例えば、Ａｓｎ－４３４変異）を有する変異型Ｆｃドメインは、野生型ＩｇＧ１Ｆｃドメインに対する、ＭＨＣクラスＩ関連のＦｃ受容体（ＦｃＲＮ）への結合能の増加を有する。
以下に、ヒトＩｇＧ２（Ｇ２Ｆｃ）のＦｃ部分に使用できる天然アミノ酸配列の例を示す（配列番号１０）。点線の下線は、ヒンジ領域を指し示し、二重下線は、配列においてデータベースの矛盾がある位置（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１８５９に従う）を指し示す。本開示は、部分的に、配列番号１０と、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなるポリペプチドを提供する。
Figure 0007264580000013
以下に、ヒトＩｇＧ３（Ｇ３Ｆｃ）のＦｃ部分に使用できるアミノ酸配列の２つの例を示す。Ｇ３Ｆｃ中のヒンジ領域は、他のＦｃ鎖中のものの最大４倍であってもよく、類似の１７残基のセグメントに続き、３つの同一である１５残基のセグメントを含有する。以下に示す第１のＧ３Ｆｃ配列（配列番号１１）は、単一の１５残基のセグメントからなる短いヒンジ領域を含有し、それに対して第２のＧ３Ｆｃ配列（配列番号１２）は、全長ヒンジ領域を含有する。それぞれの場合において、点線の下線は、ヒンジ領域を指し示し、実線の下線は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１８５９に従って天然に存在する改変体を有する位置を指し示す。本開示は、部分的に、配列番号１１および１２と、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなるポリペプチドを提供する。
Figure 0007264580000014
Figure 0007264580000015
Ｇ３Ｆｃ中の天然に存在する改変体（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８６０を参照）は、配列番号１１で使用される番号付けシステムに変換した場合、Ｅ６８Ｑ、Ｐ７６Ｌ、Ｅ７９Ｑ、Ｙ８１Ｆ、Ｄ９７Ｎ、Ｎ１００Ｄ、Ｔ１２４Ａ、Ｓ１６９Ｎ、Ｓ１６９ｄｅｌ、Ｆ２２１Ｙを含み、本発明の開示は、これらのバリエーションのうち１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を提供する。加えて、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ３遺伝子（ＩＧＨＧ３）は、異なるヒンジ長さを特徴とする構造的多型を示す［Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５９を参照］。具体的には、改変体ＷＩＳは、Ｖ領域のほとんどおよびＣＨ１領域の全てが欠失している。これは、ヒンジ領域中に通常存在する１１個に加えて、７位に余分な鎖間のジスルフィド結合を有する。改変体ＺＵＣは、Ｖ領域のほとんど、ＣＨ１領域の全て、およびヒンジの一部を欠如している。改変体ＯＭＭは、対立遺伝子型または別のガンマ鎖サブクラスを表す場合がある。本発明の開示は、これらの改変体のうち１つまたは複数を含有するＧ３Ｆｃドメインを含む追加の融合タンパク質を提供する。
以下に、ヒトＩｇＧ４（Ｇ４Ｆｃ）のＦｃ部分に使用できる天然アミノ酸配列の例を示す（配列番号１３）。点線の下線は、ヒンジ領域を指し示す。本開示は、一部、配列番号１３と、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなるポリペプチドを提供する。
Figure 0007264580000016
Ｆｃドメインにおける種々の操作された変異が、本明細書ではＧ１Ｆｃ配列（配列番号９）に関して示されており、Ｇ２Ｆｃ、Ｇ３Ｆｃ、およびＧ４Ｆｃにおける類似の変異は、図１１におけるそれらのＧ１Ｆｃとのアラインメントから誘導することができる。不均一なヒンジ長のために、アイソタイプアラインメント（図１１）に基づく類似のＦｃ位置は、配列番号９、１０、１１、１２、および１３において異なるアミノ酸の数を有する。また、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域からなる免疫グロブリン配列中の所与のアミノ酸位置（例えば、配列番号９、１０、１１、１２、および１３）は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースに記載の通り、番号付けがＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域からなる）全体を包含する場合の同位置とは異なる番号で識別されることも認められ得る。例えば、ヒトＧ１Ｆｃ配列（配列番号９）、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７）、およびヒトＩｇＧ１重鎖中の選択されたＣＨ３位の位置間の対応は、以下の通りである。
Figure 0007264580000017
融合タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃ融合タンパク質）の異なるエレメントが、所望の機能性に符合する任意の形態で配列され得ることが理解される。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインを、異種ドメインに対してＣ末端に設置することもでき、または代替的に、異種ドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインに対してＣ末端に設置することもできる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインと異種ドメインとは、融合タンパク質内で隣接する必要はなく、追加のドメインまたはアミノ酸配列を、いずれかのドメインに対してＣ末端またはＮ末端に含めることもでき、またはドメイン間に含めることもできる。
例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体融合タンパク質は、式Ａ－Ｂ－Ｃに示されるアミノ酸配列を含み得る。Ｂ部分は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインに対応する。ＡおよびＣ部分は、独立に、０、１または１を超えるアミノ酸であってもよく、Ａ部分およびＣ部分はいずれも、存在する場合、Ｂに対して異種である。Ａおよび／またはＣ部分は、リンカー配列を介してＢ部分に付加され得る。リンカーは、グリシンリッチであってもよく（例えば、２～１０、２～５、２～４、２～３個のグリシン残基）、またはグリシンおよびプロリン残基がリッチであってもよく、例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの単一の配列、またはスレオニン／セリンおよび／もしくはグリシンの反復配列、例えば、ＧＧＧ（配列番号１４）、ＧＧＧＧ（配列番号１５）、ＴＧＧＧＧ（配列番号１６）、ＳＧＧＧＧ（配列番号１７）、ＴＧＧＧ（配列番号１８）、ＳＧＧＧ（配列番号１９）、またはＧＧＧＧＳ（配列番号２０）シングレット、またはリピートを含有し得る。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、式Ａ－Ｂ－Ｃに示されるアミノ酸配列を含み、式中、Ａは、リーダー（シグナル）配列であり、Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインからなり、Ｃは、インビボにおける安定性、インビボにおける半減期、取込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および／または精製の１つまたは複数を増強するポリペプチド部分である。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、式Ａ－Ｂ－Ｃに示されるアミノ酸配列を含み、式中、Ａは、ＴＰＡリーダー配列であり、Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体ポリペプチドドメインからなり、Ｃは、免疫グロブリンのＦｃドメインである。好ましい融合タンパク質は、配列番号２４、２５、２８、２９、３１、３３、３４、４５、５０、５３、および５８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態では、本明細書で記載される方法に従い使用されるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、単離ポリペプチドである。本明細書で使用する場合、単離タンパク質または単離ポリペプチドとは、その天然環境の成分から分離されたタンパク質またはポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドを、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）、またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換ＨＰＬＣまたは逆相ＨＰＬＣ）により決定した場合に、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より高い純度まで精製する。当該分野では、抗体純度を評価するための方法が周知である［例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、（２００７年）、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、Ｂ８４８巻：７９～８７頁を参照されたい］。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、組換えポリペプチドである。
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、当該分野で公知の様々な技法により生成することができる。例えば、本開示のポリペプチドは、Ｂｏｄａｎｓｋｙ， Ｍ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３年）；およびＧｒａｎｔ Ｇ． Ａ．（編）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２年）において記載されているものなどの標準的なタンパク質化学技術を使用して合成することができる。加えて、自動式ペプチド合成器も、市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ ３９６型；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ９６００）。代替的に、それらのフラグメントまたは改変体を含む、本開示のポリペプチドは、当該分野で周知の、種々の発現系［例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス］を使用して、組換えにより生成することもできる。さらなる実施形態では、本開示の改変ポリペプチドまたは非改変ポリペプチドは、例えば、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、またはＰＡＣＥ（ｐａｉｒｅｄ ｂａｓｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）の使用を介する、組換えにより生成された全長ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの消化により生成することができる。（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用する）コンピュータ解析を使用して、タンパク質分解性切断部位を同定することができる。代替的に、このようなポリペプチドは、化学的切断（例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミンなど）を使用して、組換えにより生成された全長ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドから生成することができる。
Ｂ．ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（それらのフラグメント、機能的な改変体（例えば、ＧＤＦトラップ）、および融合タンパク質を含めて）をコードする単離されたおよび／または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号７は、天然に存在するヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体ポリペプチド（上記のＲ６４改変体）をコードし、配列番号８は、プロセシングされたＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン（上記のＲ６４改変体）をコードする。主題の核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。このような核酸は、ＤＮＡ分子であってもよく、ＲＮＡ分子であってもよい。これらの核酸は、例えば、本明細書に記載されるＡｃｔＲＩＩに基づくリガンドトラップポリペプチドを作製するための方法において使用することができる。
本明細書で使用する場合、単離核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸は、その核酸分子を通常含有するが、その核酸分子が染色体外またはその天然の染色体位置と異なる染色体位置に存在する細胞内に含有される核酸分子を含む。
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸は、配列番号７、８、２６、３２、４８、４９、５１、５２、５５、５７、５９、６０、６１、および６２のいずれか１つの改変体である核酸を含むことが理解される。改変体ヌクレオチド配列は、対立遺伝子改変体を含めた、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失により異なる配列を含み、したがって、配列番号７、８、２６、３２、４８、４９、５１、５２、５５、５６、５７、５９、６０、６１、および６２のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列とは異なるコード配列を含むことになる。
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号７、８、２６、３２、４８、４９、５１、５２、５５、５６、５７、５９、６０、６１、および６２のいずれか１つと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ ９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である単離されたおよび／または組換え核酸配列によってコードされる。当業者は、配列番号７、８、２６、３２、４８、４９、５１、５２、５５、５６、５７、５９、６０、６１、および６２、ならびにそれらの改変体と相補的な配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％ ９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列も本開示の範囲内にあることを察知するであろう。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離され得る、組換えとなり得る、および／または異種ヌクレオチド配列と融合され得る、あるいはＤＮＡライブラリー中に存在し得る。
他の実施形態では、本開示の核酸は、配列番号７、８、２６、３２、４８、４９、５１、５２、５５、５６、５７、５９、６０、６１、および６２で示されるヌクレオチド配列、配列番号７、８、２６、３２、４８、４９、５１、５２、５５、５６、５７、５９、６０、６１、および６２の相補配列、またはそのフラグメントと、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。上記で考察した通り、当業者は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は変動し得ることを容易に理解する。当業者は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は変動し得ることを容易に理解する。例えば、ハイブリダイゼーションを６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、約４５℃で行い、その後、２．０×ＳＳＣ、５０℃で洗浄を行うことができる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、低ストリンジェンシーである約２．０×ＳＳＣ、５０℃から高ストリンジェンシーである約０．２×ＳＳＣ、５０℃まで選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温、約２２℃での低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増加し得る。温度と塩の両方が変動し得る、または温度もしくは塩濃度は、他方の変数が変化する一方で一定に保たれてよい。一実施形態では、本開示は、６×ＳＳＣ、室温の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、その後、２×ＳＳＣ、室温で洗浄される核酸を提供する。
配列番号７、８、２６、３２、４８、４９、５１、５２、５５、５６、５７、５９、６０、６１、および６２に示されている核酸とは遺伝暗号における縮重で異なる単離された核酸も本開示の範囲内である。例えば、いくつかのアミノ酸が１つより多くのトリプレットによって示される。同じアミノ酸、またはシノニム（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣは、ヒスチジンのシノニムである）を特定するコドンにより、タンパク質のアミノ酸配列には影響を及ぼさない「サイレント」変異が生じる可能性がある。しかし、主題のタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くＤＮＡ配列の多型が哺乳動物細胞の間で存在することが予想される。当業者は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（最大約３～５％のヌクレオチド）におけるこれらのバリエーションが所与の種の個体間で存在する可能性があることを理解する。ありとあらゆるこのようなヌクレオチドのバリエーションおよび結果生じるアミノ酸の多型は本開示の範囲内である。
特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物において１または複数の調節性ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節性のヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に対して適切なものである。多数のタイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節性配列が当該分野で公知であり、種々の宿主細胞において使用することができる。代表的には、上記１または複数の調節性ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー配列もしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに、エンハンサー配列もしくはアクチベーター配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。当該分野で公知の構成的もしくは誘導性のプロモーターが、本開示によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または、１つより多くのプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドのようにエピソーム上で細胞中に存在し得るか、または、発現構築物は、染色体中に挿入され得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、そして、使用される宿主細胞により変化し得る。
特定の態様では、本明細書に記載の本主題の核酸は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードし、そして、少なくとも１つの調節性配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて提供される。調節性配列は当該分野で認識され、そして、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって、用語、調節性配列は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節性配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）に記載される。例えば、作動可能に連結されたときにＤＮＡ配列の発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣもしくはＴＲＣシステム、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによってその発現が誘導されるＴ７プロモーター、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３－ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α－接合因子（ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならびに、原核生物もしくは真核生物の細胞、または、そのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、ならびにこれらの種々の組み合わせが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが所望されるタンパク質のタイプのような要因に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現もまた考慮されるべきである。
本開示の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部を、原核生物細胞、真核生物細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）のいずれか、または両方において発現させるために適切なベクター中に連結することによって生成され得る。組換えＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、適切なベクターとしては、以下のタイプのプラスミドが挙げられる：原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のための、ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミド。
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核生物細胞において発現される１または複数の真核生物の転写単位との両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ－ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にするために、細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）からの配列を用いて改変される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－１）またはエプスタイン－バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体が、真核生物細胞におけるタンパク質の一過的な発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる種々の方法は、当該分野で周知である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方についての他の適切な発現系、ならびに、一般的な組換え手順、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ Ｅｄ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年）。いくつかの場合において、バキュロウイルス発現系を用いて組換えポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷｌ）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えば、β－ｇａｌを含むｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩ）が挙げられる。
好ましい実施形態では、ベクターは、ＣＨＯ細胞における本主題のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの生成のために設計される（例えば、Ｐｃｍｖ－Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ－ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ））。明らかであるように、本主題の遺伝子構築物は、例えば、タンパク質（融合タンパク質または改変体タンパク質を含む）を生成するため、精製のために、培養物において増殖させた細胞において本主題のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。
本開示はまた、１または複数の本主題のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞［例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株］において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
したがって、本開示はさらに、本主題のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを生成する方法に関する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現を起こすことが可能な適切な条件下で培養され得る。ポリペプチドは、ポリペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、細胞質または膜画分に保持され得、そして、細胞が回収、溶解され、そして、タンパク質が単離される。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。本主題のポリペプチドは、タンパク質を精製するための当該分野で公知の技法であって、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫アフィニティー精製、およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに融合させたドメインに結合する作用因子によるアフィニティー精製（例えば、プロテインＡカラムを使用して、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質を精製することができる）を含む技法を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはこれらの両方から単離することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、その精製を容易とするドメインを含有する融合タンパク質である。
一部の実施形態では、精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多く、任意の順序で含む工程により達成する。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了し得る。ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、サイズ除外クロマトグラフィーにより決定した場合に、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％、または＞９９％の純度まで精製することができ、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより決定した場合に、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％、または＞９９％の純度まで精製することができる。純度の標的レベルは、哺乳動物系、特に、非ヒト霊長動物、齧歯動物（マウス）、およびヒトにおいて、望ましい結果を達成するのに十分なレベルであるべきである。
別の実施形態では、精製用リーダー配列（例えば、組換えＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの所望の部分のＮ末端に位置するポリ－（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位の配列）をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによる、発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。その後、精製用リーダー配列は、引き続いて、エンテロキナーゼでの処理によって除去され、精製ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを提供し得る。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１巻：１７７頁；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、（１９９１年）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８巻：８９７２頁を参照のこと）。
融合遺伝子を作製するための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの接合は、ライゲーションのための平滑末端もしくは突出（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた粘着末端のフィルイン（ｆｉｌｌｉｎｇ－ｉｎ）、所望されない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーション、を用いる従来の技術に従って行われる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じるアンカープライマーを用いて行われ得、これらのフラグメントは、その後、キメラ遺伝子配列を生じるようにアニーリングされ得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２年を参照のこと。
Ｃ．抗体アンタゴニスト
ある特定の態様では、本明細書で開示された方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、抗体（ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体）または抗体の組み合わせである。ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢ結合リガンド（例えば、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ６）、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、および／またはＡｃｔＲＩＩＢ補助受容体に結合することができる。本明細書に記載される通り、骨髄線維症を処置するため、特に、骨髄線維症の１つまたは複数の合併症（例えば、脾腫、髄外造血、貧血、および線維症）、ならびに／またはヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者を処置または予防するために、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体を、単独で、または１つもしくは複数の支持療法もしくは活性作用因子と組み合わせて使用することができる。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともアクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、および／またはアクチビンＢＥ）を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともアクチビンに結合する。本明細書で使用される場合、アクチビン抗体（または抗アクチビン抗体）とは、一般に、抗体が、アクチビンを標的化するときの診断剤および／または治療剤として有用であるように十分なアフィニティーでアクチビンに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、アクチビン以外の非関連タンパク質へのアクチビン抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用または結合アフィニティーアッセイにより測定される、抗体のアクチビンへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、アクチビン抗体は、異なる種に由来するアクチビンの間で保存的な、アクチビンのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗アクチビン抗体は、ヒトアクチビンに結合する。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンが、Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）に結合することを阻害することが可能であり、したがって、アクチビンに媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することが可能である。一部の実施形態では、アクチビン抗体は、アクチビンが、ＡｃｔＲＩＩＢ補助受容体に結合することを阻害することが可能であり、したがって、アクチビンに媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することが可能である。注目すべきことに、アクチビンＡは、アクチビンＢと類似した配列相同性を有し、したがって、アクチビンＡに結合する抗体は、場合によって、アクチビンＢに結合し、かつ／またはそれを阻害することも可能であり、これは、抗アクチビンＢ抗体にも当てはまる。一部の実施形態では、本開示は、アクチビンに結合し、例えば、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ６］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ならびに／または１つもしくは複数の補助受容体にさらに結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、およびその使用に関する。一部の実施形態では、アクチビンに結合する多特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しない、または実質的に結合しない（例えば、ＢＭＰ９に１×１０－７Ｍより大きいＫＤで結合するか、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）。一部の実施形態では、アクチビンに結合する多特異性抗体は、アクチビンＡに結合しない、または実質的に結合しない（例えば、アクチビンＡに１×１０－７Ｍより大きいＫＤで結合する、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関し、抗体の組み合わせは、アクチビン抗体と、例えば、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩＢスーパーファミリーリガンド［例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ６］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ならびに／または１つもしくは複数の補助受容体に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。一部の実施形態では、アクチビン抗体を含む抗体の組み合わせは、ＢＭＰ９抗体を含まない。一部の実施形態では、アクチビン抗体を含む抗体の組み合わせは、アクチビンＡ抗体を含まない。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともアクチビンＢを阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともアクチビンＢに結合する。本明細書で使用される場合、アクチビンＢ抗体（または抗アクチビンＢ抗体）とは、一般に、抗体が、アクチビンＢを標的化するときの診断剤および／または治療剤として有用であるように十分なアフィニティーでアクチビンＢに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、アクチビンＢ以外の非関連タンパク質へのアクチビンＢ抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用または結合アフィニティーアッセイにより測定される、抗体のアクチビンへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、アクチビンＢ抗体は、異なる種に由来するアクチビンＢの間で保存的な、アクチビンＢのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗アクチビンＢ抗体は、ヒトアクチビンＢに結合する。一部の実施形態では、アクチビンＢ抗体は、アクチビンＢが、Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）に結合することを阻害することが可能であり、したがって、アクチビンＢに媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することが可能である。一部の実施形態では、アクチビンＢ抗体は、アクチビンＢが、補助受容体に結合することを阻害することが可能であり、したがって、アクチビンＢに媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することが可能である。注目すべきことに、アクチビンＢは、アクチビンＡと類似した配列相同性を有し、したがって、アクチビンＢに結合する抗体は、場合によって、アクチビンＡに結合し、かつ／またはそれを阻害することも可能である。一部の実施形態では、本開示は、アクチビンＢに結合し、例えば、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ６］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ならびに／または１つもしくは複数の補助受容体にさらに結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、およびその使用に関する。一部の実施形態では、アクチビンＢに結合する多特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しない、または実質的に結合しない（例えば、ＢＭＰ９に１×１０－７Ｍより大きいＫＤで結合するか、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）。一部の実施形態では、アクチビンＢに結合する多特異性抗体は、アクチビンＡに結合しない、または実質的に結合しない（例えば、アクチビンＡに１×１０－７Ｍより大きいＫＤで結合するか、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関し、抗体の組み合わせは、アクチビンＢ抗体と、例えば、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ならびに／または１つもしくは複数の補助受容体に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。一部の実施形態では、アクチビンＢ抗体を含む抗体の組み合わせは、ＢＭＰ９抗体を含まない。一部の実施形態では、アクチビンＢ抗体を含む抗体の組み合わせは、アクチビンＡ抗体を含まない。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＧＤＦ８を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＧＤＦ８に結合する。本明細書で使用される場合、ＧＤＦ８抗体（または抗ＧＤＦ８抗体）とは、一般に、抗体が、ＧＤＦ８を標的化するときの診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＧＤＦ８に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ８以外の非関連タンパク質へのＧＤＦ８抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用または結合アフィニティーアッセイにより測定される、抗体のＧＤＦ８への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ８抗体は、異なる種に由来するＧＤＦ８の間で保存的な、ＧＤＦ８のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体は、ヒトＧＤＦ８に結合する。一部の実施形態では、ＧＤＦ８抗体は、ＧＤＦ８が、Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）に結合することを阻害することが可能であり、したがって、ＧＤＦ８に媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することが可能である。一部の実施形態では、ＧＤＦ８抗体は、ＧＤＦ８が、補助受容体に結合することを阻害することが可能であり、したがって、ＧＤＦ８に媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することが可能である。注目すべきことに、ＧＤＦ８は、ＧＤＦ１１との配列相同性が高く、したがって、ＧＤＦ８に結合する抗体は、場合によって、ＧＤＦ１１に結合し、かつ／またはそれを阻害することも可能である。一部の実施形態では、本開示は、ＧＤＦ８に結合し、例えば、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ６］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ならびに／または１つもしくは複数の補助受容体にさらに結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＧＤＦ８に結合する多特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しない、または実質的に結合しない（例えば、ＢＭＰ９に１×１０－７Ｍより大きいＫＤで結合するか、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）。一部の実施形態では、ＧＤＦ８に結合する多特異性抗体は、アクチビンＡに結合しない、または実質的に結合しない（例えば、アクチビンＡに１×１０－７Ｍより大きいＫＤで結合する、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関し、抗体の組み合わせは、ＧＤＦ８抗体と、例えば、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ１５］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ならびに／または１つもしくは複数の補助受容体に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ８抗体を含む抗体の組み合わせは、ＢＭＰ９抗体を含まない。一部の実施形態では、ＧＤＦ８抗体を含む抗体の組み合わせは、アクチビンＡ抗体を含まない。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＧＤＦ１１を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＧＤＦ１１に結合する。本明細書で使用される場合、ＧＤＦ１１抗体（または抗ＧＤＦ１１抗体）とは、一般に、抗体が、ＧＤＦ１１を標的化するときの診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＧＤＦ１１に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１１以外の非関連タンパク質へのＧＤＦ１１抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用または結合アフィニティーアッセイにより測定される、抗体のＧＤＦ１１への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体は、異なる種に由来するＧＤＦ１１の間で保存的な、ＧＤＦ１１のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体は、ヒトＧＤＦ１１に結合する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体は、ＧＤＦ１１が、Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）に結合することを阻害することが可能であり、したがって、ＧＤＦ１１に媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することが可能である。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体は、ＧＤＦ１１が、補助受容体に結合することを阻害することが可能であり、したがって、ＧＤＦ１１に媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することが可能である。注目すべきことに、ＧＤＦ１１は、ＧＤＦ８との配列相同性が高く、したがって、ＧＤＦ１１に結合する抗体は、場合によって、ＧＤＦ８に結合し、かつ／またはそれを阻害することも可能である。一部の実施形態では、本開示は、ＧＤＦ１１に結合し、例えば、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、およびＢＭＰ６］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ならびに／または１つもしくは複数の補助受容体にさらに結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１に結合する多特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しない、または実質的に結合しない（例えば、ＢＭＰ９に１×１０－７Ｍより大きいＫＤで結合するか、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１に結合する多特異性抗体は、アクチビンＡに結合しない、または実質的に結合しない（例えば、アクチビンＡに１×１０－７Ｍより大きいＫＤで結合するか、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関し、抗体の組み合わせは、ＧＤＦ１１抗体と、例えば、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ならびに／または１つもしくは複数の補助受容体に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体を含む抗体の組み合わせは、ＢＭＰ９抗体を含まない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１抗体を含む抗体の組み合わせは、アクチビンＡ抗体を含まない。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＢＭＰ６を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＢＭＰ６に結合する。本明細書で使用される場合、ＢＭＰ６抗体（または抗ＢＭＰ６抗体）とは、一般に、抗体が、ＢＭＰ６を標的化するときの診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＢＭＰ６に結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ６以外の非関連タンパク質へのＢＭＰ６抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用または結合アフィニティーアッセイにより測定される、抗体のＢＭＰ６への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ６抗体は、異なる種に由来するＢＭＰ６の間で保存的な、ＢＭＰ６のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ６抗体は、ヒトＢＭＰ６に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ６抗体は、ＢＭＰ６が、Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）に結合することを阻害することが可能であり、したがって、ＢＭＰ６に媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することが可能である。一部の実施形態では、ＢＭＰ６抗体は、ＢＭＰ６が、補助受容体に結合することを阻害することが可能であり、したがって、ＢＭＰ６に媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することが可能である。一部の実施形態では、本開示は、ＢＭＰ６に結合し、例えば、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ１１］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ならびに／または１つもしくは複数の補助受容体にさらに結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＢＭＰ６に結合する多特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しない、または実質的に結合しない（例えば、ＢＭＰ９に１×１０－７Ｍより大きいＫＤで結合するか、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）。一部の実施形態では、ＢＭＰ６に結合する多特異性抗体は、アクチビンＡに結合しない、または実質的に結合しない（例えば、アクチビンＡに１×１０－７Ｍより大きいＫＤで結合するか、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関し、抗体の組み合わせは、ＢＭＰ６抗体と、例えば、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ならびに／または１つもしくは複数の補助受容体に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ６抗体を含む抗体の組み合わせは、ＢＭＰ９抗体を含まない。一部の実施形態では、ＢＭＰ６抗体を含む抗体の組み合わせは、アクチビンＡ抗体を含まない。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＧＤＦ３を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＧＤＦ３に結合する。本明細書で使用される場合、ＧＤＦ３抗体（または抗ＧＤＦ３抗体）とは、一般に、抗体が、ＧＤＦ３を標的化するときの診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＧＤＦ３に結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ３以外の非関連タンパク質へのＧＤＦ３抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用または結合アフィニティーアッセイにより測定される、抗体のＧＤＦ３への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＧＤＦ３抗体は、異なる種に由来するＧＤＦ３の間で保存的な、ＧＤＦ３のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＧＤＦ３抗体は、ヒトＧＤＦ３に結合する。一部の実施形態では、ＧＤＦ３抗体は、ＧＤＦ３が、Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）に結合することを阻害することが可能であり、したがって、ＧＤＦ３に媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することが可能である。一部の実施形態では、ＧＤＦ３抗体は、ＧＤＦ３が、補助受容体に結合することを阻害することが可能であり、したがって、ＧＤＦ３に媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することが可能である。一部の実施形態では、本開示は、ＧＤＦ３に結合し、例えば、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ１１］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ならびに／または１つもしくは複数の補助受容体にさらに結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＧＤＦ３に結合する多特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しない、または実質的に結合しない（例えば、ＢＭＰ９に１×１０－７Ｍより大きいＫＤで結合するか、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）。一部の実施形態では、ＧＤＦ３に結合する多特異性抗体は、アクチビンＡに結合しない、または実質的に結合しない（例えば、アクチビンＡに１×１０－７Ｍより大きいＫＤで結合するか、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関し、抗体の組み合わせは、ＧＤＦ３抗体と、例えば、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、アクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ならびに／または１つもしくは複数の補助受容体に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。一部の実施形態では、ＧＤＦ３抗体を含む抗体の組み合わせは、ＢＭＰ９抗体を含まない。一部の実施形態では、ＧＤＦ３抗体を含む抗体の組み合わせは、アクチビンＡ抗体を含まない。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＢＭＰ１０を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＢＭＰ１０に結合する。本明細書で使用される場合、ＢＭＰ１０抗体（または抗ＢＭＰ１０抗体）とは、一般に、抗体が、ＢＭＰ１０を標的化するときの診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＢＭＰ１０に結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０以外の非関連タンパク質へのＢＭＰ１０抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質相互作用または結合アフィニティーアッセイにより測定される、抗体のＢＭＰ１０への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体は、異なる種に由来するＢＭＰ１０の間で保存的な、ＢＭＰ１０のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＢＭＰ１０抗体は、ヒトＢＭＰ１０に結合する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体は、ＢＭＰ１０が、Ｉ型および／またはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）に結合することを阻害することが可能であり、したがって、ＢＭＰ１０に媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することが可能である。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体は、ＢＭＰ１０が、補助受容体に結合することを阻害することが可能であり、したがって、ＢＭＰ１０に媒介されるシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を阻害することが可能である。一部の実施形態では、本開示は、ＢＭＰ１０に結合し、例えば、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ６］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ならびに／または１つもしくは複数の補助受容体にさらに結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、およびその使用に関する。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０に結合する多特異性抗体は、ＢＭＰ９に結合しない、または実質的に結合しない（例えば、ＢＭＰ９に１×１０－７Ｍより大きいＫＤで結合するか、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０に結合する多特異性抗体は、アクチビンＡに結合しない、または実質的に結合しない（例えば、アクチビンＡに１×１０－７Ｍより大きいＫＤで結合するか、または比較的中度の結合、例えば、約１×１０－８Ｍまたは約１×１０－９Ｍを示す）。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関し、抗体の組み合わせは、ＢＭＰ１０抗体と、例えば、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、およびＧＤＦ１１］、１つもしくは複数のＩ型受容体および／もしくはＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ならびに／または１つもしくは複数の補助受容体に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体を含む抗体の組み合わせは、ＢＭＰ９抗体を含まない。一部の実施形態では、ＢＭＰ１０抗体を含む抗体の組み合わせは、アクチビンＡ抗体を含まない。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢに結合する。本明細書で使用される場合、ＡｃｔＲＩＩＢ抗体（抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）とは、一般に、抗体が、ＡｃｔＲＩＩＢを標的化するときの診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ以外の非関連タンパク質への抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質－タンパク質相互作用または結合アフィニティーアッセイにより測定される抗体のＡｃｔＲＩＩＢへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、異なる種に由来するＡｃｔＲＩＩＢの間で保存的なＡｃｔＲＩＩＢのエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、ヒトＡｃｔＲＩＩＢに結合する。一部の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０］がＡｃｔＲＩＩＢに結合することを阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢおよび１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０］、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、補助受容体、および／または追加のＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ）に結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関し、抗体の組み合わせは、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体と、例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０］、補助受容体、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ならびに／または追加のＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ）に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。注目すべきことに、ＡｃｔＲＩＩＢは、ＡｃｔＲＩＩＡとの配列類似性を有し、したがって、ＡｃｔＲＩＩＢに結合する抗体は、場合によって、ＡｃｔＲＩＩＡに結合し、かつ／またはそれを阻害することも可能である。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＡＬＫ４を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＡＬＫ４に結合する。本明細書で使用される場合、ＡＬＫ４抗体（抗ＡＬＫ４抗体）とは、一般に、抗体が、ＡＬＫ４を標的化するときの診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＡＬＫ４に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ４以外の非関連タンパク質への抗ＡＬＫ４抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質－タンパク質相互作用または結合アフィニティーアッセイにより測定される抗体のＡＬＫ４への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、異なる種に由来するＡＬＫ４の間で保存的なＡＬＫ４のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、ヒトＡＬＫ４に結合する。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０］がＡＬＫ４に結合することを阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ４抗体は、ＡＬＫ４および１つまたは複数のＧＤＦ／ＢＭＰリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０］、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、補助受容体、および／または追加のＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）に結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関し、抗体の組み合わせは、抗ＡＬＫ４抗体と、例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０］、補助受容体、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、および／または追加のＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＡＬＫ５を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＡＬＫ５に結合する。本明細書で使用される場合、ＡＬＫ５抗体（抗ＡＬＫ５抗体）とは、一般に、抗体が、ＡＬＫ５を標的化するときの診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＡＬＫ５に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ５以外の非関連タンパク質への抗ＡＬＫ５抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質－タンパク質相互作用または結合アフィニティーアッセイにより測定される抗体のＡＬＫ５への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体は、異なる種に由来するＡＬＫ５の間で保存的なＡＬＫ５のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体は、ヒトＡＬＫ５に結合する。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０］がＡＬＫ５に結合することを阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ５抗体は、ＡＬＫ５および１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０］、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、補助受容体、および／または追加のＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ４および／またはＡＬＫ７）に結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関し、抗体の組み合わせは、抗ＡＬＫ５抗体と、例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０］、補助受容体、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、および／または追加のＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ４および／またはＡＬＫ７）に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。
ある特定の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＡＬＫ７を阻害する抗体である。したがって、一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト抗体または抗体の組み合わせは、少なくともＡＬＫ７に結合する。本明細書で使用される場合、ＡＬＫ７抗体（抗ＡＬＫ７抗体）とは、一般に、抗体が、ＡＬＫ７を標的化するときの診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＡＬＫ７に結合する抗体を指す。ある特定の実施形態では、ＡＬＫ７以外の非関連タンパク質への抗ＡＬＫ７抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ、または他のタンパク質－タンパク質相互作用または結合アフィニティーアッセイにより測定される抗体のＡＬＫ７への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または約１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡＬＫ７抗体は、異なる種に由来するＡＬＫ７の間で保存的なＡＬＫ７のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、抗ＡＬＫ７抗体は、ヒトＡＬＫ７に結合する。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ７抗体は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、およびＢＭＰ１０］がＡＬＫ７に結合することを阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗ＡＬＫ７抗体は、ＡＬＫ７および１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ）ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０］、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、補助受容体、および／または追加のＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ４および／またはＡＬＫ５）に結合する多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）である。一部の実施形態では、本開示は、抗体の組み合わせ、およびその使用に関し、抗体の組み合わせは、抗ＡＬＫ７抗体と、例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよびアクチビンＢＥ）ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０］、補助受容体、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、および／または追加のＩ型受容体（例えば、ＡＬＫ４および／またはＡＬＫ５）に結合する１つまたは複数の追加の抗体とを含む。
抗体という用語は、本明細書では、最も広範な意味で使用され、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、および抗体断片を含めた種々の抗体構造を、それらが所望の抗原結合の活性を呈示する限りは、包含する。抗体断片とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、これらに限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる［例えば、Hudsonら（２００３年）Nat. Med.、９巻：１２９～１３４頁；Pluckthun、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、１１３巻、RosenburgおよびMoore編、（Springer-Verlag、New York）、２６９～３１５頁（１９９４年）；ＷＯ９３／１６１８５；および米国特許第５，５７１，８９４号；同第５，５８７，４５８号；および同第５，８６９，０４６号を参照されたい］。ダイアボディは、二価または二特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である［例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Hudsonら（２００３年）Nat. Med.、９巻：１２９～１３４頁（２００３年）；およびHollingerら（１９９３年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９０巻：６４４４～６４４８頁を参照されたい］。トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）およびテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）もHudsonら（２００３年）Nat. Med.、９巻：１２９～１３４頁に記載されている。単一ドメイン抗体は、重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または抗体の軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である［例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい］。本明細書で開示された抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、それに付着され、検出することができる標識を含む（例えば、標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素の補因子であり得る）。ある特定の好ましい実施形態では、本開示の抗体は、単離された抗体である。ある特定の好ましい実施形態では、本開示の抗体は、組換え抗体である。
本明細書の抗体は、任意のクラスの抗体であり得る。抗体のクラスとは、その重鎖により保有される定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。
一般に、本明細書で開示された方法において使用するための抗体は、その標的抗原に、好ましくは高い結合アフィニティーで特異的に結合する。アフィニティーは、ＫＤ値として表すことができ、内因性結合アフィニティーを反映する（例えば、結合活性への影響が最小化された）。典型的には、結合アフィニティーは、無細胞の状況であるか細胞が関連する状況であるかにかかわらず、インビトロで測定される。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）、およびＥＬＩＳＡを含めた、本明細書で開示されたものを含めた当技術分野で公知のいくつかのアッセイのいずれかを使用して、結合アフィニティー測定値を得ることができる。一部の実施形態では、本開示の抗体は、それらの標的抗原（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＧＤＦ３、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、および／またはＢＭＰ６）に少なくとも１×１０－７もしくはそれより強力な、１×１０－８もしくはそれより強力な、１×１０－９もしくはそれより強力な、１×１０－１０もしくはそれより強力な、１×１０－１１もしくはそれより強力な、１×１０－１２もしくはそれより強力な、１×１０－１３もしくはそれより強力な、または１×１０－１４もしくはそれより強力なＫＤで結合する。
ある特定の実施形態では、ＫＤは、以下のアッセイにより記載されるように、関心のある抗体のＦａｂバージョンおよびその標的抗原で実施されるＲＩＡにより測定される。Ｆａｂの抗原に対する溶液結合アフィニティーは、Ｆａｂを、滴定系列の非標識抗原の存在下において、最低濃度の放射性標識された抗原（例えば、１２５Ｉで標識された）と平衡化し、次いで、結合した抗原を、抗Ｆａｂ抗体でコーティングしたプレートで捕捉することにより測定する［例えば、Ｃｈｅｎら（１９９９年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９３巻：８６５～８８１頁を参照されたい］。アッセイ条件を確立するために、マルチウェルプレート（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標））を、捕捉用抗Ｆａｂ抗体（例えば、Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ製）でコーティングし（例えば、一晩にわたり）、その後、好ましくは、室温（およそ２３℃）において、ウシ血清アルブミンでブロッキングする。非吸着型プレートでは、放射性標識された抗原を、関心のあるＦａｂの系列希釈液と混合する［例えば、Ｐｒｅｓｔａら、（１９９７年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５７巻：４５９３～４５９９頁における抗ＶＥＧＦ抗体である、Ｆａｂ－１２の評価と符合する］。次いで、関心のあるＦａｂを、好ましくは、一晩にわたりインキュベートするが、平衡に到達することを確保するように、インキュベーションは、長時間（例えば、約６５時間）にわたり継続することもできる。その後、混合物を、好ましくは、室温で約１時間にわたるインキュベーションのために、捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、好ましくは、ポリソルベート２０とＰＢＳとの混合物で、複数回洗浄する。プレートを乾燥させたら、シンチレーション剤（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ製のＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ（登録商標））を添加し、ガンマカウンター（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ製のＴＯＰＣＯＵＮＴ（登録商標））上で、プレートをカウントする。
別の実施形態によれば、ＫＤは、例えば、抗原ＣＭ５チップを約１０応答単位（ＲＵ）で固定化させた、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定する。略述すると、供給元の指示書に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。例えば、抗原は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）まで希釈してから、５μｌ／分の流量で注入して、およそ１０応答単位（ＲＵ）のタンパク質のカップリングを達成することができる。抗原を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。反応速度の測定のため、Ｆａｂの２倍系列希釈液（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に、およそ２５μｌ／分の流量で注入する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、例えば、単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサーグラムおよび解離センサーグラムのフィッティングを同時に行うことにより計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算する［例えば、Ｃｈｅｎら、（１９９９年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９３巻：８６５～８８１頁を参照されたい］。オン速度が、例えば、上記の表面プラズモン共鳴アッセイで１０６Ｍ－１ｓ－１を超える場合、オン速度は、徐々に増大する濃度の抗原の存在下におけるＰＢＳ中、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光強度（例えば、励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）であって、攪拌型キュベットを有するストップフロー装備型分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または８０００シリーズのＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（登録商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計により測定した場合の、蛍光発光強度の増加または減少を測定する蛍光消光法を使用することにより決定することができる。
抗体断片は、これらに限定されないが、本明細書に記載されるインタクトな抗体のタンパク質消化ならびに組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含めた種々の技法によって作製することができる。ヒトＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、ＡｃｔＲＩＩＢ、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、およびアクチビンＥ）、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ１０、ＧＤＦ３、ならびにＢＭＰ６の核酸およびアミノ酸配列は、当技術分野で公知である。さらに、抗体を生成するための多数の方法が当技術分野で周知であり、その一部が本明細書に記載されている。したがって、本開示に従って使用するための抗体アンタゴニストは、当技術分野における知見および本明細書に提示される教示に基づいて当業者により常套的に作製され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体とは、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来する一方、重鎖および／または軽鎖の残余は異なる供給源または種に由来する抗体を指す。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１巻：６８５１～６８５５頁に記載されている。一部の実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長動物に由来する可変領域）と、ヒト定常領域とを含む。一部の実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスを、親抗体のクラスまたはサブクラスから変化させた「クラススイッチ」抗体である。一般に、キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるキメラ抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体とは、非ヒト超可変領域（ＨＶＲ）に由来するアミノ酸残基と、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）に由来するアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つの可変ドメインであり、典型的には２つの可変ドメインであって、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）に対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する、可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は任意選択で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を経た抗体を指す。ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８年）、Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ．、１３巻：１６１９～１６３３頁において総説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３～３２９頁；Ｑｕｅｅｎら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６巻：１００２９～１００３３頁；米国特許第５，８２１，３３７号；同第７，５２７，７９１号；同第６，９８２，３２１号；および同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：２５～３４頁［ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフティングについて記載する］；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９１年）、２８巻：４８９～４９８頁（「リサーフェシング」について記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：４３～６０頁（「ＦＲシャフリング」について記載する）；Ｏｓｂｏｕｒｎら（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：６１～６８頁；ならびにＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ（２０００年）、８３巻：２５２～２６０頁（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチについて記載する）においてさらに記載されている。ヒト化のために使用することができるヒトフレームワーク領域としては、これらに限定されないが、「最良適合」法を使用して選択されるフレームワーク領域［例えば、Simsら（１９９３年）J. Immunol.、１５１巻：２２９６頁を参照されたい］；特定のサブグループの軽鎖または重鎖可変領域のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域［例えば、Carterら（１９９２年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻：４２８５頁；およびPrestaら（１９９３年）J. Immunol.、１５１巻：２６２３頁を参照されたい］；ヒト成熟（体細胞変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域［例えば、AlmagroおよびFransson（２００８年）Front. Biosci.、１３巻：１６１９～１６３３頁を参照されたい］；およびスクリーニングＦＲライブラリーに由来するフレームワーク領域［例えば、Bacaら（１９９７年）J. Biol. Chem.、２７２巻：１０６７８～１０６８４頁；およびRosokら（１９９６年）J. Biol. Chem.、２７１巻：２２６１１～２２６１８頁を参照されたい］が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書に提示される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の種々の技法を使用して生成することができる。ヒト抗体は、一般に、van Dijkおよびvan de Winkel（２００８年）Curr. Opin. Pharmacol.、５巻：３６８～７４頁（２００１年）およびLonberg、Curr. Opin. Immunol.、２０巻：４５０～４５９頁に記載されている。例えば、ヒト抗体は、免疫原（例えば、ＧＤＦ１１ポリペプチド、アクチビンＢポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を、抗原による攻撃に応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に投与することによって調製することができる。このような動物は、典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有し、これは、内因性免疫グロブリン遺伝子座に置き換わるか、または、染色体外に存在するかもしくは動物の染色体内にランダムに組み込まれる。このようなトランスジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、例えば、Lonberg（２００５年）Nat. Biotech.、２３巻：１１１７～１１２５頁；米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術が記載されている）；米国特許第５，７７０，４２９号（ＨｕＭａｂ（登録商標）技術が記載されている）；米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術が記載されている）；および米国特許出願公開第２００７／００６１９００号（ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術が記載されている）を参照されたい。このような動物により生成されるインタクトな抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに改変することができる。
本明細書で提供されるヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法により作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は記載されている［例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９８４年）、１３３巻：３００１頁；Ｂｒｏｄｅｕｒら（１９８７年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１～６３頁、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＢｏｅｒｎｅｒら（１９９１年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：８６頁を参照されたい］。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Ｌｉら、（２００６年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０３巻：３５５７～３５６２頁において記載されている。追加の方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのヒトモノクローナルＩｇＭ抗体の生成について記載）およびＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ（２００６年）、２６巻（４号）：２６５～２６８頁（２００６年）（ヒト－ヒトハイブリドーマについて記載）において記載されている方法を含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ（２００５年）、Ｈｉｓｔｏｌ． Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、２０巻（３号）：９２７～９３７頁；ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｉｎｄ Ｅｘｐ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２７巻（３号）：１８５～９１頁において記載されている。本明細書に提示されるヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成することもできる。次いで、このような可変ドメイン配列を所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技法は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。
例えば、本開示の抗体は、１つまたは複数の所望の活性を有する抗体のためのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。当該分野では、ファージディスプレイライブラリーを生成し、このようなライブラリーを、所望の結合特徴を保有する抗体についてスクリーニングするための、様々な方法が公知である。このような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７８巻：１～３７頁、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．において総説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２～５５４頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４～６２８頁；Ｍａｒｋｓら（１９９２年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１～５９７頁；ＭａｒｋｓおよびＢｒａｄｂｕｒｙ（２００３年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻：１６１～１７５頁、Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．；Ｓｉｄｈｕら（２００４年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３３８巻（２号）：２９９～３１０頁；Ｌｅｅら（２００４年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３４０巻（５号）：１０７３～１０９３頁；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ（２００４年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０１巻（３４号）：１２４６７～１２４７２頁；ならびにＬｅｅら（２００４年）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８４巻（１～２号）：１１９～１３２頁においてさらに記載されている。
Winterら（１９９４年）Ann. Rev. Immunol.、１２巻：４３３～４５５頁に記載されている通り、ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、ファージライブラリー内でランダムに組み換え、次いでそれを抗原結合性ファージについてスクリーニングすることができる。ファージが、典型的には、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、またはＦａｂ断片としてのいずれかでディスプレイする。免疫された供給源に由来するライブラリーからは、ハイブリドーマの構築を必要とせずに、免疫原（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、ＡｃｔＲＩＩＢ、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、またはＢＭＰ６）に対するアフィニティーが高い抗体がもたらされる。あるいは、Griffithsら（１９９３年）EMBO J、１２巻：７２５～７３４頁により記載されている通り、ナイーブなレパートリーをクローニングして（例えば、ヒト由来）、いかなる免疫も伴わずに、広範囲の非自己抗原および加えて自己抗原に対する抗体の単一の供給源をもたらすことができる。最後に、ナイーブなライブラリーはまた、HoogenboomおよびWinter（１９９２年）J. Mol. Biol.、２２７巻：３８１～３８８頁により記載されている通り、幹細胞由来の再編成されていないＶ－遺伝子セグメントをクローニングすること、ならびに高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードするように、およびインビトロで再編成が達成されるようにランダムな配列を含有するＰＣＲプライマーを使用することによって合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーが記載されている特許公報としては、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、および米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、および同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書に提示される抗体は、多特異性抗体、例えば、二特異性抗体である。１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれより多くの）抗原上の少なくとも２つの異なるエピトープ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つまたはそれより多く）に対して結合特異性を有する多特異性抗体（典型的には、モノクローナル抗体）。
多特異性抗体を作製するための技法としては、これに限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の組換え同時発現が挙げられる［例えば、MilsteinおよびCuello（１９８３年）Nature、３０５巻：５３７頁；国際特許公開第ＷＯ９３／０８８２９号；ならびにTrauneckerら（１９９１年）EMBO J.、１０巻：３６５５頁、ならびに米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい（「ノブ・イン・ホール」操作）］。多特異性抗体はまた、抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体分子を作製するために静電気ステアリング効果を操作すること（例えば、ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１を参照されたい）；２つまたはそれより多くの抗体またはフラグメントを架橋結合させること［例えば、米国特許第４，６７６，９８０号；およびBrennanら（１９８５年）Science、２２９巻：８１頁を参照されたい］；ロイシンジッパーを使用して二特異性抗体を生成すること［例えば、Kostelnyら（１９９２年）J. Immunol.、１４８巻（５号）：１５４７～１５５３頁を参照されたい］；二特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること［例えば、Hollingerら（１９９３年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９０巻：６４４４～６４４８頁を参照されたい］；単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること［例えば、Gruberら（１９９４年）J. Immunol.、１５２巻：５３６８頁を参照されたい］；および三特異性抗体を調製すること（例えば、Tuttら（１９９１年）J. Immunol.、１４７巻：６０頁を参照されたい）によって作製することもできる。多特異性抗体は、全長抗体として調製することもでき、抗体断片として調製することもできる。「オクトパス抗体（Ｏｃｔｏｐｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」を含めた、３つまたはそれより多くの機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も本明細書に含まれる［例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい］。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、可能な改変体抗体、例えば、天然に存在する変異を含有する、またはモノクローナル抗体調製物の生成時に発生する改変体抗体（このような改変体は、一般に少量で存在する）を除き同一であり、かつ／または同じエピトープに結合する。典型的に、異なるエピトープを指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープを指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の性質を指し示し、任意の特定の方法により抗体の生成を必要とするとはみなさないものとする。例えば、本方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を活用する方法、本明細書で記載されるモノクローナル抗体を作製するためのこのような方法および他の例示的な方法を含むがこれらに限定されない様々な技法により作製することができる。
例えば、アクチビンに由来する免疫原を使用することにより、抗タンパク質／抗ペプチドの抗血清またはモノクローナル抗体を標準のプロトコルによって作製することができる［例えば、Antibodies: A Laboratory Manual、HarlowおよびLane編、（１９８８年）Cold Spring Harbor Press：１９８８年を参照されたい］。マウス、ハムスター、またはウサギなどの哺乳動物を、免疫原性形態のアクチビンポリペプチド、抗体応答を引き出すことができる抗原フラグメント、または融合タンパク質を用いて免疫することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技法としては、キャリアへの結合体化または当技術分野で周知の他の技法が挙げられる。アクチビンポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫の進行を、血漿中または血清中の抗体価を検出することによってモニタリングすることができる。免疫原を抗原として用いた標準のＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを使用して、抗体産生のレベルおよび／または結合アフィニティーのレベルを評価することができる。
アクチビンの抗原性調製物で動物を免疫化した後、抗血清を得ることができ、所望の場合、ポリクローナル抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を生成するために、抗体生成細胞（リンパ球）を、免疫化動物から採取し、標準的な体細胞融合手順により、骨髄腫細胞など、不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞をもたらすことができる。このような技法は、当該分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技法［例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５～４９７頁を参照されたい］、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法［例えば、Ｋｏｚｂａｒら（１９８３年）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁を参照されたい］、およびヒトモノクローナル抗体を生成するＥＢＶハイブリドーマ技法［Ｃｏｌｅら（１９８５年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、７７～９６頁］が挙げられる。ハイブリドーマ細胞は、アクチビンポリペプチドと特異的に反応性である抗体、およびこのようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離されたモノクローナル抗体の生成について、免疫化学的にスクリーニングすることができる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、これにより、Ｆｃ領域改変体を生成することができる。Ｆｃ領域改変体は、１つまたは複数のアミノ酸位置において、アミノ酸改変（例えば、置換、欠失、および／または付加）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、またはヒトＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
例えば、本開示は、エフェクター機能を全てではないが一部有し、それにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能［例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）］は不必要であるかまたは有害である適用のための望ましい候補になる抗体改変体を企図する。インビトロおよび／またはインビボにおける細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低下／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能は保持することを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、例えば、RavetchおよびKinet（１９９１年）Annu. Rev. Immunol.、９巻：４５７～４９２頁に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号；Hellstrom, I.ら（１９８６年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８３巻：７０５９～７０６３頁］；Hellstrom, Iら（１９８５年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８２巻：１４９９～１５０２頁；米国特許第５，８２１，３３７号；Bruggemann, M.ら（１９８７年）J. Exp. Med.、１６６巻：１３５１～１３６１頁に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を使用することができる（例えば、ＡＣＴＩ（商標）、フローサイトメトリー用非放射性細胞傷害性アッセイ；ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．；およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。その代わりにまたはそれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性をインビボにおいて、例えば、Clynesら（１９９８年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９５巻：６５２～６５６頁に開示されているものなどの動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる［例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい］。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる［例えば、Gazzano-Santoroら（１９９６年）J. Immunol. Methods、２０２巻：１６３頁；Cragg, M. S.ら（２００３年）Blood、１０１巻：１０４５～１０５２頁；ならびにCragg, M. S、およびM. J. Glennie（２００４年）Blood、１０３巻：２７３８～２７４３頁を参照されたい］。ＦｃＲｎ結合およびインビボにおけるクリアランス／半減期の決定も、当技術分野で公知の方法を使用して実施することができる［例えば、Petkova, S. B.ら（２００６年）Intl. Immunol. １８巻（１２号）：１７５９～１７６９頁を参照されたい］。エフェクター機能を低減した本開示の抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９のうちの１つまたは複数を置換した抗体を含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体は、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、および３２７位のうちの２つまたはこれより多くにおいて置換を有するＦｃ変異体であって、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含むＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ある特定の実施形態では、システイン操作抗体、例えば、抗体の１つまたは複数の残基をシステイン残基で置換した「チオＭＡｂ」を創出することが望ましいと考えられる。特定の実施形態では、残基の置換を、抗体の接近可能な部位に施す。システインでこれらの残基を置換することにより、反応性のチオール基が抗体の接近可能な部位に配置され、抗体を、薬物部分またはリンカー－薬物部分など、他の部分に結合体化させて、本明細書でさらに記載されるような、免疫結合体を創出するのに使用することができる。ある特定の実施形態では、以下の残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のうちの任意の１つまたは複数を、システインで置換することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号において記載されているように生成することができる。
加えて、望ましい抗体を同定するための抗体をスクリーニングするのに使用される技法は、得られる抗体の特性に影響を及ぼし得る。例えば、抗体を、溶液中の抗原の結合に使用する場合、溶液中での結合について試験することが望ましいと考えられる。抗体と抗原との相互作用を試験して、特に望ましい抗体を同定するために、様々な異なる技法が利用可能である。このような技法として、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズシステム）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、および免疫組織化学が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書に提示される抗体および／または結合性ポリペプチドのアミノ酸配列改変体が企図される。例えば、抗体および／または結合性ポリペプチドの結合アフィニティーおよび／または他の生物学的性質を改善することが望ましい場合がある。抗体および／または結合性ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、抗体および／または結合性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。このような改変としては、例えば、抗体および／または結合性ポリペプチドのアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそれらへの挿入および／またはそれらの置換が挙げられる。最終的な構築物が所望の特徴、例えば、標的への結合（例えば、アクチビンＥおよび／またはアクチビンＣなどのアクチビンへの結合）を有するのであれば、最終的な構築物に達するまでに欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行うことができる。
変更（例えば、置換）をＨＶＲ内に施して、例えば、抗体のアフィニティーを改善することができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスにおいて高頻度で変異を経るコドンによりコードされる残基［例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ（２００８年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２０７巻：１７９～１９６頁（２００８年）を参照されたい］、および／またはＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）に施すことができ、結果として得られる改変体ＶＨまたは改変体ＶＬを結合アフィニティーについて調べる。当該分野では、二次ライブラリーを構築し、ここから再選択することによるアフィニティー成熟が記載されている［例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７８巻：１～３７頁、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．（２００１年）を参照されたい）。アフィニティー成熟の一部の実施形態では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指向変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性を導入する。次いで、二次ライブラリーを創出する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望のアフィニティーを有する任意の抗体改変体を同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４～６残基）をランダム化する、ＨＶＲ指向アプローチを伴う。抗原の結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニン走査変異誘発またはモデル化を使用して、特異的に同定することができる。特にＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３は、しばしば標的化される。
ある特定の実施形態では、このような変更が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減しない限りにおいて、１つまたは複数のＨＶＲ内に置換、挿入、または欠失を施すことができる。例えば、結合アフィニティーを実質的に低減しない保存的変更（例えば、本明細書で提供される保存的置換）を、ＨＶＲ内に施すことができる。このような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外部であり得る。上記で提供した改変体ＶＨ配列およびＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは、不変であるか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
変異誘発の標的にすることができる抗体および／または結合性ポリペプチドの残基または領域を同定するための有用な方法は、CunninghamおよびWells（１９８９年）Science、２４４巻：１０８１～１０８５頁により記載されている通り「アラニンスキャニング変異誘発」と称される。この方法では、残基または標的残基の群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）により置き換えて、抗体－抗原の相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。最初の置換に対して機能的感受性が示されるアミノ酸位置にさらなる置換を導入することができる。その代わりにまたはそれに加えて、抗原抗体複合体の結晶構造を決定して、抗体と抗原の接触点を同定する。このような接触残基および近隣残基を、置換の候補として標的化するまたは排除することができる。改変体をスクリーニングして、それらが所望の性質を含有するかどうかを決定することができる。
アミノ酸配列の挿入は、１残基～１００またはこれより多くの残基を含有するポリペプチドの範囲の長さのアミノ末端融合物および／またはカルボキシル末端融合物のほか、単一または複数のアミノ酸残基の内部配列挿入も含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入改変体として、抗体のＮ末端もしくはＣ末端の、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）、または抗体の血清中半減期を延長するポリペプチドへの融合物が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および／または結合性ポリペプチドを、当該分野で公知であり、たやすく利用可能である、追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾することができる。抗体および／または結合性ポリペプチドの誘導体化に適する部分は、水溶性ポリマーを含むがこれらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、およびデキストラン、またはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、ポリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中のその安定性のために、製造において有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であることが可能であり、分枝状でもよく、非分枝状でもよい。抗体および／または結合ポリペプチドに付加させるポリマーの数は、変化させることができ、１つより多くのポリマーを付加させる場合、それらは、同じ分子でもよく、異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、抗体の誘導体および／または結合ポリペプチドの誘導体が規定の条件下での治療に使用されようと、改善する抗体および／または結合ポリペプチドの特定の特性または機能を含むがこれらに限定されない検討事項に基づき決定することができる。
Ｄ．小分子アンタゴニスト
他の態様では、本明細書に記載される方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、小分子（ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子）または小分子アンタゴニストの組み合わせである。ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子または小分子アンタゴニストの組み合わせは、例えば、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、および／またはＢＭＰ１０）、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、および／または補助受容体を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子または小分子アンタゴニストの組み合わせは、例えば、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて決定して、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンドによって媒介されるシグナル伝達を阻害する。本明細書に記載される通り、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子は、骨髄線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するため、特に、１つもしくは複数の骨髄線維症に関連する合併症（例えば、脾腫、髄外造血、貧血および線維症）の進行速度および／もしくは重症度を処置、予防、もしくは低減するため、および／またはヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者を処置するために、単独で、または１つもしくは複数の支持療法もしくは活性作用因子と組み合わせて使用することができる。
一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子または小分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ１１を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子または小分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ８を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ１１、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７うちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子または小分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともアクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子または小分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともアクチビンＢを阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子または小分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＢＭＰ６を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子または小分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ３を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子または小分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＢＭＰ１０を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子または小分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子または小分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ４を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰ１０、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子または小分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ５を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＢＭＰ１０、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子または小分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ７を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ１５、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、本明細書で開示されたＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子または小分子アンタゴニストの組み合わせは、ＢＭＰ９を阻害しないまたは実質的に阻害しない。一部の実施形態では、本明細書で開示されたＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子または小分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡを阻害しないまたは実質的に阻害しない。
ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子は、直接的または間接的な阻害剤であり得る。例えば、間接的な小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくとも１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、ＧＤＦ３、および／またはＧＤＦ８］、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、補助受容体、および／または１つもしくは複数の下流のＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ）の発現（例えば、転写、翻訳、細胞分泌、またはこれらの組み合わせ）を阻害し得る。あるいは、直接的な小分子アンタゴニスト、または小分子アンタゴニストの組み合わせは、例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド［例えば、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥ、またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ９、ＢＭＰ６、ＢＭＰ５、ＧＤＦ３、および／またはＧＤＦ８］、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５および／またはＡＬＫ７）、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、補助受容体、および／または１つもしくは複数の下流のＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ）に直接的に結合し、それを阻害し得る。１つまたは複数の間接的なＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子、および１つまたは複数の直接的なＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト小分子の組み合わせは、本明細書で開示された方法に従って使用することができる。
本開示の小分子アンタゴニストの結合は、公知の方法体系を使用して同定および化学合成することができる（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３号および同第ＷＯ００／３９５８５号を参照されたい）。一般に、本開示の小分子アンタゴニストは、通常、約２０００ダルトン未満のサイズである、あるいは、約１５００、７５０、５００、２５０または２００ダルトン未満のサイズであり、このような有機小分子は本明細書に記載される通り、ポリペプチドに、好ましくは特異的に結合することが可能である。これらの小分子アンタゴニストは、過度な実験を伴わずに、周知の技法を使用して同定することができる。この点について、有機小分子ライブラリーをポリペプチド標的に結合することが可能である分子についてスクリーニングするための技法は当技術分野で周知であることに留意する（例えば、国際特許公開第ＷＯ００／００８２３号および同第ＷＯ００／３９５８５号を参照されたい）。
本開示の結合有機低分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハロゲン化物、アリールスルホネート、アルキルハロゲン化物、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニル塩化物、ジアゾ化合物、および酸塩化物であり得る。
Ｅ．ポリヌクレオチドアンタゴニスト
他の態様では、本明細書で開示された方法および使用に従って使用されるＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、ポリヌクレオチド（ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチド）またはポリヌクレオチドの組み合わせである。ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、および／またはＢＭＰ１０）、Ｉ型受容体（例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、および／またはＡＬＫ７）、ＩＩ型受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、補助受容体、および／または下流のシグナル伝達成分（例えば、Ｓｍａｄ）を阻害し得る。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、例えば、本明細書に記載されるものなどの細胞ベースのアッセイにおいて決定して１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンドによって媒介されるシグナル伝達を阻害する。本明細書に記載される通り、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドは、骨髄線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するため、特に、１つもしくは複数の骨髄線維症に関連する合併症（例えば、脾腫、髄外造血、貧血、および線維症）の進行速度および／もしくは重症度を処置、予防もしくは低減するため、ならびに／またはヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者を処置するために、単独で、または１つもしくは複数の支持療法もしくは活性作用因子と組み合わせて使用することができる。
一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ１１を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ８を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ１１、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともアクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともアクチビンＢを阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＢＭＰ６を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ３を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ１０、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＢＭＰ１０を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢを阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＢＭＰ１０、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＧＤＦ／ＢＭＰポリヌクレオチドアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ４を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰ１０、ＡＬＫ５、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ５を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＢＭＰ１０、およびＡＬＫ７のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡＬＫ７を阻害し、任意選択で、ＧＤＦ８、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡＢ、アクチビンＡＣ、アクチビンＢＣ、アクチビンＡＥおよび／またはアクチビンＢＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数をさらに阻害する。一部の実施形態では、本明細書で開示されたＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、ＢＭＰ９を阻害しないまたは実質的に阻害しない。一部の実施形態では、本明細書で開示されたＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡを阻害しないまたは実質的に阻害しない。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ分子［例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ－ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）］、アプタマーおよび／またはリボザイムであり得る。ヒトＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、およびアクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＧＤＦ３、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、およびＢＭＰ１０の核酸およびアミノ酸配列は、当技術分野で公知である。さらに、ポリヌクレオチドアンタゴニストを生成する多くの異なる方法が当技術分野で周知である。したがって、本開示に従って使用するためのポリヌクレオチドアンタゴニストは、当技術分野における知見および本明細書に提示される教示に基づいて当業者により常套的に作製され得る。
アンチセンス技術を使用して、遺伝子発現を、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通じて、または三重らせん形成を通じて制御することができる。アンチセンス技法は、例えば、Okano（１９９１年）J. Neurochem.、５６巻：５６０頁；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression、CRC Press、Boca Raton、Fla.（１９８８年）において論じられている。三重らせん形成は、例えば、Cooneyら（１９８８年）Science、２４１巻：４５６頁；およびDervanら（１９９１年）Science、２５１巻：１３００頁において論じられている。方法は、ポリヌクレオチドの相補ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。一部の実施形態では、アンチセンス核酸は、本明細書で開示された遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部分と相補的である一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。しかし、絶対的な相補性は、好ましいが、必要ではない。
本明細書で言及される「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズし、安定的な二重鎖を形成することが可能であるのに十分な相補性を有する配列を意味し、したがって、本明細書で開示される遺伝子の二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験してもよく、三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダイズさせる核酸が大型であるほど、それが含有し得るＲＮＡとの塩基のミスマッチも多くなるが、なおも安定的な二重鎖（または、場合に応じて、三重鎖）を形成する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準的な手順の使用により、ミスマッチの許容可能な程度を確認することができる。
メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンを含めてＡＵＧ開始コドンまでの５’－非翻訳配列と相補的なポリヌクレオチドが翻訳の阻害において最も効率的に機能するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’－非翻訳配列と相補的な配列も同様にｍＲＮＡの翻訳の阻害において有効であることが示されている［例えば、Wagner, R.（１９９４年）Nature、３７２巻：３３３～３３５頁を参照されたい］。したがって、本開示の遺伝子の５’－または３’－非翻訳、非コード領域のいずれかと相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンスアプローチにおいて使用して、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。ｍＲＮＡの５’－非翻訳領域と相補的なポリヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補物を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域と相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳のより効率の低い阻害剤であるが、本開示の方法に従って使用することができる。本開示のｍＲＮＡの５’－領域、３’－領域またはコード領域のいずれにハイブリダイズするように設計されるかにかかわらず、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドの長さであるべきであり、６から約５０ヌクレオチドにわたる長さのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
一実施形態では、本開示のアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写により、細胞内で生成される。例えば、ベクターまたはその一部は、転写され、本開示の遺伝子のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生成する。このようなベクターは、所望のアンチセンス核酸をコードする配列を含有する。このようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを生成するように転写され得る限りにおいて、エピソームにとどまってもよく、染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ法により構築することができる。ベクターは、プラスミドベクターでもよく、ウイルスベクターでもよく、または当該分野で公知の他のベクターであって、脊椎動物細胞内の複製および発現のために使用されるベクターでもよい。本開示の所望の遺伝子またはこれらのフラグメントをコードする配列の発現は、脊椎動物細胞内、好ましくは、ヒト細胞内で作用することが当該分野で公知の任意のプロモーターによるものであり得る。このようなプロモーターは、誘導性であっても、恒常的であってもよい。このようなプロモーターとして、ＳＶ４０初期プロモーター領域［例えば、ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ（１９８１年）、Ｎａｔｕｒｅ、２９０巻：３０４～３１０頁を参照されたい］、ラウス肉腫ウイルスの３’側長末端リピート内に含有されるプロモーター［例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８０年）、Ｃｅｌｌ、２２巻：７８７～７９７頁を参照されたい］、ヘルペスチミジンプロモーター［例えば、Ｗａｇｎｅｒら（１９８１年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８巻：１４４１～１４４５頁を参照されたい］、およびメタロチオネイン遺伝子の調節配列［例えば、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２年）、Ｎａｔｕｒｅ、２９６巻：３９～４２頁を参照されたい］が挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドアンタゴニストは、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、およびアクチビンＥ）、ＢＭＰ６、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＧＤＦ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、およびＢＭＰ１０のうちの１つまたは複数の発現を標的化する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。ＲＮＡｉは、標的化されたｍＲＮＡの発現に干渉するＲＮＡの発現を指す。具体的には、ＲＮＡｉは、標的化された遺伝子を、特定のｍＲＮＡとｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）を通じて相互作用することによってサイレンシングする。次いで、ｄｓＲＮＡ複合体を、細胞による分解について標的化する。ｓｉＲＮＡ分子は、１０～５０ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ二重鎖であり、十分に相補的である標的遺伝子（例えば、遺伝子に対して少なくとも８０％同一性）の発現に干渉する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
追加のＲＮＡｉ分子は、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ－ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）（ｓｈＲＮＡ）を含み、短鎖干渉ヘアピンおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）も含む。ｓｈＲＮＡ分子は、ループによって接続された標的遺伝子由来のセンスおよびアンチセンス配列を含有する。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質中に輸送され、ｍＲＮＡと一緒に分解される。ＲＮＡｉのためのＲＮＡを発現させるために、Ｐｏｌ ＩＩＩまたはＵ６プロモーターを使用することができる。Paddisonら［Genes & Dev.（２００２年）１６巻：９４８～９５８頁、２００２年］は、ＲＮＡｉに影響を及ぼすための手段として、ヘアピンにフォールディングした低分子ＲＮＡ分子を使用した。したがって、このような短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子は、本明細書に記載される方法においても有利に使用される。機能性ｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは変動する；サイレンシング活性に影響を及ぼすことなく、ステムの長さは、概ね約２５から約３０ｎｔまでの範囲にわたり得、ループのサイズは、４から約２５ｎｔの間にわたり得る。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、これらのｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ ＲＮａｓｅの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物と似ていると考えられ、いずれにしても、特定の遺伝子の発現を阻害するための同じ能力を有する。ｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクターから発現させることができる。ｍｉＲＮＡは、「ステムループ」構造を特徴とするｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとして最初に転写され、その後、ＲＩＳＣによるさらなるプロセシング後にプロセシングされて成熟ｍｉＲＮＡになる、約１０～７０ヌクレオチドの長さの一本鎖ＲＮＡである。
ｓｉＲＮＡを含むがこれに限定せず、ＲＮＡｉを媒介する分子は、インビトロで、化学合成（Ｈｏｈｊｏｈ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、５２１巻：１９５～１９９頁、２００２年）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９巻：９９４２～９９４７頁、２００２年）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写（Ｄｏｎｚｅｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３０巻：ｅ４６頁、２００２年；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９巻：６０４７～６０５２頁、２００２年）、およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＮアーゼＩＩＩなどのヌクレアーゼを使用する二本鎖ＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９巻：９９４２～９９４７頁、２００２年）によって生成することができる。
別の態様に従うと、本開示は、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合体化ＤＮＡ、封入型ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、封入型ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉をもたらすことが可能な分子、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないポリヌクレオチドアンタゴニストを提供する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アプタマーである。アプタマーは、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ分子を含めた核酸分子であり、結合し、標的分子に特異的に結合する三次構造を形成する。アプタマーの生成および治療への使用が当技術分野において十分に確立されている（例えば、米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい）。アプタマーに関する追加の情報は、米国特許出願公開第２００６０１４８７４８号に見出すことができる。核酸アプタマーは、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）プロセスによって選択される。ＳＥＬＥＸは、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号；同第５，５８０，７３７号；同第５，５６７，５８８号；同第５，７０７，７９６号；同第５，７６３，１７７号；同第６，０１１，５７７号；および同第６，６９９，８４３号に記載されている通り、標的分子に対して高度に特異的な結合を有する核酸分子のインビトロにおける進化のための方法である。アプタマーを同定するための別のスクリーニング方法は、米国特許第５，２７０，１６３号に記載されている。ＳＥＬＥＸプロセスは、種々の二次元構造および三次元構造を形成する核酸の能力、ならびに、他の核酸分子およびポリペプチドを含め、単量体であるかポリマーであるかにかかわらず、事実上あらゆる化学化合物とのリガンドとしての機能を果たす（特異的な結合対を形成する）ヌクレオチド単量体内で利用可能な化学的多用途性に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が標的としての機能を果たし得る。ＳＥＬＥＸ法は、所望の結合アフィニティーおよび選択性を達成するために、同じ一般的な選択スキームを使用した、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択、ならびに結合、分割および増幅の段階的反復を伴う。ランダム化された配列のセグメントを含み得る核酸の混合物から出発して、ＳＥＬＥＸ法は、混合物を標的と結合に好都合な条件下で接触させる工程；結合していない核酸を標的分子に特異的に結合した核酸から分割する工程；核酸－標的複合体を解離させる工程；核酸－標的複合体から解離した核酸を増幅して、リガンドが濃縮された核酸の混合物を得る工程を含む。結合、分割、解離および増幅の工程を所望の通り多くのサイクルを通じて繰り返して、標的分子に高いアフィニティーおよび特異性で結合する核酸リガンドを得る。
典型的に、このような結合分子は、動物に別個に投与される［例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ（１９９１年）、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６巻：５６０頁を参照されたい］が、このような結合分子はまた、宿主細胞により取り込まれたポリヌクレオチドからインビボで発現させることもでき、インビボで発現させることができる［例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８８年）を参照されたい］。
Ｆ．フォリスタチンおよびＦＬＲＧアンタゴニスト
他の態様では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、フォリスタチンまたはＦＬＲＧポリペプチドである。本明細書に記載される通り、フォリスタチンおよび／またはＦＬＲＧポリペプチドは、骨髄線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するため、特に、１つもしくは複数の骨髄線維症に関連する合併症（例えば、脾腫、髄外造血、貧血、および線維症）の進行速度および／もしくは重症度を処置、予防もしくは低減するため、ならびに／またはヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者を処置するために、単独で、または１つもしくは複数の支持療法もしくは活性作用因子と組み合わせて使用することができる。
用語「フォリスタチンポリペプチド」は、フォリスタチンの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）も含むポリペプチドを含み、フォリスタチンの任意の機能的な単量体または多量体もさらに含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のフォリスタチンポリペプチドは、アクチビン、特に、アクチビンＡに結合し、かつ／またはこれらの活性を阻害する。アクチビンへの結合特性を保持する、フォリスタチンポリペプチドの改変体は、フォリスタチンとアクチビンとの相互作用に関するかつての研究に基づき同定することができる。例えば、ＷＯ２００８／０３０３６７は、アクチビンへの結合に重要であることが示されている、特異的なフォリスタチンドメイン（「ＦＳＤ」）について開示している。下記の配列番号６５～６７に示される通り、フォリスタチンのＮ末端ドメイン（「ＦＳＮＤ」；配列番号６５）、ＦＳＤ２（配列番号６７）は、フォリスタチン内の例示的なドメインであって、アクチビンへの結合に重要なドメインを表し、程度は劣るが、ＦＳＤ１（配列番号６６）も、フォリスタチン内の例示的なドメインであって、アクチビンへの結合に重要なドメインを表す。加えて、上記では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの文脈において、ポリペプチドのライブラリーを作製し、これについて調べるための方法についても記載したが、このような方法はまた、フォリスタチンの改変体を作製し、これらについて調べることにも関する。フォリスタチンポリペプチドは、任意の公知のフォリスタチン配列に由来するポリペプチドであって、フォリスタチンポリペプチドの配列に少なくとも約８０％同一である配列を有し、任意選択で、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはこれを超える同一性を有するポリペプチドを含む。フォリスタチンポリペプチドの例は、成熟フォリスタチンポリペプチド、または、例えば、ＷＯ２００５／０２５６０１において記載されている、ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチド（配列番号６３）の短いアイソフォームもしくは他の改変体を含む。
ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドのアイソフォームであるＦＳＴ３４４は、以下の通りである。
Figure 0007264580000018
Figure 0007264580000019
シグナルペプチドに下線を付す；上記ではまた、このフォリスタチンアイソフォームを、下記に示される短いフォリスタチンアイソフォームであるＦＳＴ３１７から弁別する、Ｃ末端伸長部分を表す最後の２７残基にも下線を付している。
ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドのアイソフォームであるＦＳＴ３１７は、以下の通りである。
Figure 0007264580000020
シグナルペプチドに下線を付す。
フォリスタチンＮ末端ドメイン（ＦＳＮＤ）配列は、以下の通りである。
Figure 0007264580000021
ＦＳＤ１およびＦＳＤ２配列は、以下の通りである。
Figure 0007264580000022
他の態様では、本明細書で開示される方法に従う使用のための作用因子は、フォリスタチン関連タンパク質３（ＦＳＴＬ３）としてもまた公知の、フォリスタチン様関連遺伝子（ＦＬＲＧ）である。用語「ＦＬＲＧポリペプチド」は、ＦＬＲＧの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）も含むポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＦＬＲＧポリペプチドは、アクチビン、特に、アクチビンＡに結合し、かつ／またはこれらの活性を阻害する。アクチビンへの結合特性を保持するＦＬＲＧポリペプチドの改変体は、ＦＬＲＧとアクチビンとの相互作用についてアッセイする日常的方法を使用して同定することができる（例えば、ＵＳ６，５３７，９６６を参照されたい）。加えて、上記では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの文脈において、ポリペプチドのライブラリーを作製し、これについて調べるための方法についても記載したが、このような方法はまた、ＦＬＲＧの改変体を作製し、これらについて調べることにも関する。ＦＬＲＧポリペプチドは、任意の公知のＦＬＲＧ配列に由来するポリペプチドであって、ＦＬＲＧポリペプチドの配列に少なくとも約８０％同一である配列を有し、任意選択で、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはこれを超える同一性を有するポリペプチドを含む。
ヒトＦＬＲＧ前駆体（フォリスタチン関連タンパク質３前駆体）ポリペプチドは、以下の通りである。
Figure 0007264580000023
シグナルペプチドに下線を付す。
ある特定の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドおよびＦＬＲＧポリペプチドの機能的な改変体または改変形態は、フォリスタチンポリペプチドまたはＦＬＲＧポリペプチドの少なくとも一部を有する融合タンパク質と、例えば、ポリペプチドの単離、検出、安定化、または多量体化を容易とするドメインなど、１つまたは複数の融合ドメインとを含む。適切な融合ドメインについては、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関して、上記で詳細に論じられている。一部の実施形態では、本開示のアンタゴニスト作用因子は、Ｆｃドメインに融合させたフォリスタチンポリペプチドのアクチビン結合性部分を含む融合タンパク質である。別の実施形態では、本開示のアンタゴニスト作用因子は、Ｆｃドメインに融合させたＦＬＲＧポリペプチドのアクチビン結合性部分を含む融合タンパク質である。
３．スクリーニングアッセイ
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである化合物（作用因子）を同定するための対象ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびそれらの改変体（例えば、ＧＤＦ８トラップ）の使用に関する。このスクリーニングによって同定された化合物を、例えば、動物モデルにおいて、骨髄線維症を処置するそれらの能力を評価するために試験することができる。
ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達（例えば、Ｓｍａｄシグナル伝達）を標的化することによって骨髄線維症を処置するための治療剤についてスクリーニングする多数のアプローチがある。ある特定の実施形態では、化合物のハイスループットなスクリーニングを行って、選択された細胞株に対するＡｃｔＲＩＩＢに媒介される効果を乱す作用因子を同定することができる。ある特定の実施形態では、アッセイを行って、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのその結合パートナー、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＧＤＦ１１またはＢＭＰ１０）などへの結合を特異的に阻害するまたは低減する化合物をスクリーニングし、同定する。あるいは、アッセイを使用して、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのその結合パートナー、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドなどへの結合を増強する化合物を同定することができる。さらなる実施形態では、化合物は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと相互作用するそれらの能力によって同定することができる。
種々のアッセイ形式が十分であり、そして、本開示を考慮すれば、本明細書中に明示的に記載されない形式は、本明細書中に記載されていないにもかかわらず、当業者によって理解される。本明細書中に記載されるように、本発明の試験化合物（作用因子）は、任意の組み合わせ化学の方法によって作製され得る。あるいは、本主題の化合物は、インビボまたはインビトロで合成された天然に存在する生体分子であり得る。組織増殖の調節因子として作用するその能力について試験される化合物（作用因子）は、例えば、細菌、酵母、植物または他の生物によって生成されても（例えば、天然の生成物）、化学的に生成されても（例えば、ペプチド模倣物を含む低分子）、組換えにより生成されてもよい。本発明によって企図される試験化合物としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖、ホルモンおよび核酸分子が挙げられる。ある特定の実施形態では、試験作用因子は、約２０００ダルトン未満の分子量を持つ小さな有機分子である。
本開示の試験化合物は、単一の別個の実体として提供され得るか、または、組み合わせ化学によって作製されたような、より複雑度の高いライブラリーにおいて提供され得る。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび有機化合物の他の分類を含み得る。試験システムに対する試験化合物の提示は、特に、最初のスクリーニング段階において、単離された形態または化合物の混合物としてのいずれかであり得る。任意選択で、化合物は、任意選択で他の化合物で誘導体化され得、そして、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有し得る。誘導体化基の非限定的な例としては、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化クロスリンカー、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所与の期間に調査される化合物の数を最大にするためには、ハイスループットアッセイが望ましい。精製もしくは半精製（ｓｅｍｉ－ｐｕｒｉｆｉｅｄ）されたタンパク質で誘導され得るような、無細胞のシステムにおいて行われるアッセイは、試験化合物によって媒介される分子標的における変更の迅速な発生と比較的容易な検出とを可能にするように作られ得るという点で、しばしば、「一次」スクリーニングとして好ましい。さらに、試験化合物の細胞毒性またはバイオアベイラビリティの作用は、一般に、インビトロのシステムでは無視され得るが、その代わりに、このアッセイは主として、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合パートナー（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド）との間の結合親和性の変更において明らかになり得るような、分子標的に対する薬物の作用に焦点を当てている。
単なる例示として、本開示の例示的なスクリーニングアッセイでは、関心のある化合物は、アッセイの意図に応じて適宜、通常ＡｃｔＲＩＩＢリガンドに結合し得る単離および精製されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと接触させられる。その後、化合物とＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとの混合物は、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ１１）を含む組成物に加えられる。ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体の検出および定量は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合タンパク質との間の複合体の形成の阻害（または助長）における化合物の効力を決定するための手段を提供する。化合物の効力は、種々の濃度の試験化合物を用いて得られたデータから用量応答曲線を生成することによって評価され得る。さらに、比較のためのベースラインを提供するためのコントロールアッセイもまた行われ得る。例えば、コントロールアッセイでは、単離および精製されたＡｃｔＲＩＩＢリガンドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む組成物に加えられ、そして、ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体の形成は、試験化合物の非存在下で定量される。一般に、反応物が混合され得る順序は変化し得、そして、同時に混合され得ることが理解される。さらに、適切な無細胞アッセイ系を与えるように、精製したタンパク質の代わりに、細胞の抽出物および溶解物が使用され得る。
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合タンパク質との間の複合体の形成は、種々の技術によって検出され得る。例えば、複合体の形成の調節は、例えば、検出可能に標識されたタンパク質、例えば、放射標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ）、または、酵素標識されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／またはその結合タンパク質を用いて、イムノアッセイによって、あるいは、クロマトグラフィーによる検出によって定量され得る。
特定の実施形態では、本開示は、直接的または間接的のいずれかで、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用の程度を測定する、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー遷移（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図する。さらに、光導波管（ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号を参照のこと）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサ、および表面力センサに基づくもののような、他の検出様式が、本開示の多くの実施形態と適合性がある。
さらに、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を妨害または助長する作用因子を同定するための、「ツーハイブリッドアッセイ」としても公知である相互作用トラップアッセイの使用を企図する。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３年）Ｃｅｌｌ ７２巻：２２３～２３２頁；Ｍａｄｕｒａら（１９９３年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８巻：１２０４６～１２０５４頁；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４巻：９２０～９２４頁；およびＩｗａｂｕｃｈｉら（１９９３年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８巻：１６９３～１６９６頁を参照のこと。特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップとその結合タンパク質との間の相互作用を解離させる化合物（例えば、低分子またはペプチド）を同定するための、逆ツーハイブリッドシステムの使用を企図する［例えば、ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７巻：９１９～２９頁；ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７巻：３７４～８１頁；ならびに米国特許第５，５２５，４９０号；同第５，９５５，２８０号；および同第５，９６５，３６８号を参照のこと］。
特定の実施形態では、本主題の化合物は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと相互作用するその能力によって同定される。化合物と、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとの間の相互作用は、共有結合性であっても非共有結合性であってもよい。例えば、このような相互作用は、光架橋、放射性標識リガンド結合、およびアフィニティクロマトグラフィーを含むインビトロの生化学的な方法を用いて、タンパク質レベルで同定され得る［例えば、Ｊａｋｏｂｙ
ＷＢら（１９７４年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４６巻：１頁を参照のこと］。特定の場合には、化合物は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合する化合物を検出するためのアッセイのような、機構ベースのアッセイにおいてスクリーニングされ得る。これは、固相もしくは流体相の結合事象を含み得る。あるいは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする遺伝子は、レポーターシステム（例えば、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）と共に細胞中にトランスフェクトされ、そして、好ましくは、ハイスループットスクリーニングによって、ライブラリーに対して、または、ライブラリーの個々のメンバーを用いてスクリーニングされ得る。他の機構ベースの結合アッセイ（例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイ）が使用され得る。結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップに固定されているか、または、固定された抗体によって捕捉されている標的を用いて行われ得るか、あるいは、キャピラリー電気泳動によって分離され得る。結合した化合物は通常、比色エンドポイントあるいは蛍光または表面プラズモン共鳴を用いて検出され得る。
４．例示的な治療的使用
本開示の実施例に記載の通り、骨髄線維症患者を処置するため、特に、例えば、脾腫、髄外造血、および線維症を含めた当該疾患の種々の合併症を改善するために、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト（阻害剤）を使用することができることが発見されている。具体的には、本明細書で提示されているデータは、ＧＤＦトラップポリペプチドが、骨髄線維症のＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆモデルにおける脾腫、髄外造血、および線維症を低下させることを示す。したがって、ある特定の態様では、本開示は、それを必要とする患者に、有効量の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、任意選択で骨髄線維症を処置するための１つまたは複数の他の支持療法または活性作用因子と組み合わせて投与することにより、骨髄線維症を処置するため、特に、骨髄線維症の１つまたは複数の合併症（脾腫、髄外造血、貧血、および線維症）を処置または予防するための組成物および方法に関する。
本明細書中で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計的試料において、無処置の対照試料に対して、処置試料における障害もしくは状態の出現を低下させるか、あるいは、無処置の対照試料に対して、障害もしくは状態の１または複数の症状の発症を遅延させるか、または、重篤度を低下させるような化合物を指す。用語「処置する」は、本明細書中で使用される場合、一度確立された状態の改善もしくは除去を含む。いずれの場合にも、予防または処置は、医師または他の医療提供者によって提供される診断、および、治療剤の投与の意図される結果において認識され得る。
一般に、本開示に記載されている疾患または状態の処置または予防は、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを有効量で投与することによって達成される。作用因子の有効量とは、所望の治療上または予防上の結果を達成するために必要な投与量および期間での有効な量を指す。本開示の作用因子の治療有効量は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに個体における所望の応答を引き出す作用因子の能力などの因子に応じて変動し得る。予防有効量とは、所望の予防上の結果を達成するために必要な投与量および期間での有効な量を指す。
用語「対象」、「個体」または「患者」は、本明細書全体を通して互換的であり、一般に、哺乳動物を指す。哺乳動物としては、これらに限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびにげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。
骨髄線維症は、造血のクローン性新生物障害であり、一般に、進行する無効造血、髄外造血、種々の炎症性合併症、および生存の短縮をもたらす進行性骨髄線維症（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を特徴とする［Mascarenhasら（２０１２年）Curr Med Chem、１９巻：４３９９～４４１３頁；およびVannucchiら（２０１１年）Hematol Am Soc Hematol Educ Prog、２０１１年：２２２～２３０頁］。これは、過剰な細胞が産生される、骨髄の骨髄増殖性障害の１つである。異常な造血細胞クローンによる線維芽細胞増殖因子などのサイトカインの産生は、コラーゲン線維化を介した骨髄の造血組織の結合組織による置き換えにつながる。造血組織の減少により、患者の新しい血液細胞を生成する能力が損なわれ、その結果、進行性の汎血球減少、全ての血液型の不足が生じる。しかし、増殖および線維芽細胞およびコラーゲンの沈着は二次的な現象であり、線維芽細胞自体は異常な細胞クローンの一部ではない。骨髄の進行性の瘢痕化または線維症の結果として、患者は、造血細胞の他の領域、特に肝臓および脾臓への強制的移動に伴って髄外造血を発症する。これにより、これらの臓器の腫大が引き起こされる。肝臓では、この状態は肝腫大と称される。脾臓の腫大は脾腫と称され、これは、汎血球減少、特に、血小板減少症および貧血にも寄与する。肺およびリンパ節において生じる髄外造血の報告もある。髄外造血の別の合併症は、異常な形状の赤血球が存在する、変形赤血球症である。骨髄線維症の一般的な臨床徴候としては、進行性肝脾腫、血球数異常、ならびに、疲労、体重減少、寝汗、発熱、そう痒、骨痛、早期満腹、腹痛または不快感、関節痛、筋痛、異常知覚、悪液質、脾梗塞および出血などの消耗性症状が挙げられる。最近まで、疾患の進行に対する影響が明白に実証された処置は、同種造血幹細胞移植ａｌｌｏＨＳＣＴだけであるが、処置に関連する死亡率が高く、この集中的な治療に適するのは少数の患者だけである［Guptaら（２０１２年）Blood、１２０巻：１３６７～１３７９頁］。
ある特定の態様では、骨髄線維症（例えば、原発性骨髄線維症、真性赤血球増加症後骨髄線維症、および本態性血小板血症後骨髄線維症）の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するために、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、単独で、または１つもしくは複数の支持療法もしくは活性作用因子と組み合わせて使用することができる。具体的には、例えば、無効造血、貧血、炎症、線維症（例えば、骨髄線維症（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、脾線維症、および肝線維症）、汎血球減少、血小板減少症、髄外造血（例えば、脾髄外造血、肝髄外造血、肺髄外造血、およびリンパ性髄外造血）、肝腫大、脾腫、骨硬化症、骨骨髄線維症、変形赤血球症、疲労、体重減少、寝汗、発熱、そう痒、骨痛、早期満腹、腹痛または不快感、関節痛、筋痛、異常知覚、悪液質、脾梗塞、および出血を含めた骨髄線維症の１つまたは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するために、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、単独で、または１つもしくは複数の支持療法もしくは活性作用因子と組み合わせて使用することができる。
原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）の現行の診断は、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ）－基準に基づき、臨床的特徴および検査による特徴の複合評価を伴う［Tefferi Aら（２００７年）Blood.、１１０巻：１０９２～１０９７頁］。３つのＷＨＯ診断主要基準がある：１）レチクリンおよび／もしくはコラーゲン線維化のいずれかを伴った巨核球の増殖および異型（異常な核／細胞質比を有する小さな～大きな巨核球および過色素性であり不規則に折り重なった核および高密度の密集）、または、レチクリン線維化がない場合は、巨核球の変化に、骨髄細胞充実性の増大、顆粒球増殖、および、しばしば赤血球生成の低下（すなわち、前線維化期原発性骨髄線維症）が伴わなければならない、２）慢性骨髄性白血病、真性赤血球増加症、骨髄異形成症候群、または他の骨髄性新生物のＷＨＯ基準を満たさないこと、ならびに３）ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆもしくは他のクローンマーカーが実証されていること、または、反応性の骨髄線維症（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の証拠がないこと。さらに、４つのＷＨＯ診断副次的基準がある：１）白赤芽球症、２）血清ＬＤＨレベルの増加、３）貧血、および４）触知可能な脾腫。末梢血白赤芽球症（すなわち、有核赤血球、未成熟顆粒球、および涙滴赤血球の存在）が典型的であるが、ＰＭＦの不変の特徴ではない；前線維化期ＰＭＦは顕性の白赤芽球症を示さない可能性がある［Kvasnickaら（２０１０年）Am J Hematol.、８５巻：６２～６９頁］。ＰＭＦとしての骨髄線維症は、通常、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆまたは変異体ＣＡＬＲ、またはＭＰＬ、トリソミー９、またはｄｅｌ（１３ｑ）に関連する［Husseinら（２００９年）Eur J Haematol.、８２巻：３２９～３３８頁］。したがって、これらの遺伝子マーカーの存在により、骨髄線維症（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）に関連する骨髄性新生物が存在する場合のＰＭＦの診断が強力に支持される。ある特定の態様では、本開示は、原発性骨髄線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するため、特に、原発性骨髄線維症の１つまたは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するための方法およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの使用に関する。
真性赤血球増加症後骨髄線維症（ＰＶ後ＭＦ）および本態性血小板血症後骨髄線維症（ＥＴ後ＭＦ）の現行の診断は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｆｏｒ ＭＰＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（ＩＷＧ－ＭＲＴ）により公開された基準に基づく［Barosi Gら（２００８年）Leukemia.、２２巻：４３７～４３８頁］。ＰＶ後ＭＦの２つのＩＷＧ－ＭＲＴ主要基準がある：１）ＷＨＯ基準によって定義される真性赤血球増加症の以前の診断の証拠書類、および２）骨髄線維症（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）グレード２～３（０～３尺度で）またはグレード３～４（０～４尺度で）。ヨーロッパ分類によるグレード２～３：広汎性、しばしば膠原化の証拠を伴わない（陰性トリクローム染色）粗い線維ネットワーク、または、広汎性、膠原化の領域を伴う（陽性トリクローム染色）粗い線維ネットワーク［Thieleら（２００５年）Haematologica.、９０巻：１１２８～１１３２頁］。標準の分類によるグレード３～４：広範囲にわたる交差を伴い、時々限局性のコラーゲンの束および／もしくは限局性の骨硬化症のみを伴う、広汎性かつ高密度のレチクリンの増加、または、広範囲にわたる交差を伴い、コラーゲンの粗い束を伴い、しばしば有意な骨硬化症が付随する、広汎性かつ高密度のレチクリンの増加［Manoharanら（１９７９年）Br J Haematol、４３巻：１８５～１９０頁］。さらに、４つのＩＷＧ－ＭＲＴ診断副次的基準があり、ＰＶ後ＭＦ診断のためには、そのうち２つがＩＷＧ－ＭＲＴ主要基準と一緒に患者において検出されなければならない：１）貧血、または細胞減少療法の不在下で静脈切開の必要性の持続的消失、２）白赤芽球性の末梢血像、３）５ｃｍ以上の触知可能な脾腫の増加または新しく触知可能になった脾腫の出現として定義される脾腫の増大、４）３つの全身症状：６カ月で１０％超の体重減少、寝汗、原因不明の発熱のうち１つ以上の発生。ＥＴ後ＭＦの２つのＩＷＧ－ＭＲＴ主要基準がある：１）ＷＨＯ基準によって定義される真性赤血球増加症の以前の診断の証拠書類、２）骨髄線維症（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）グレード２～３（０～３尺度で）またはグレード３～４（０～４尺度で）。さらに、５つのＩＷＧ－ＭＲＴ診断副次的基準があり、ＥＴ後ＭＦ診断のためにはそのうち２つがＩＷＧ－ＭＲＴ主要基準と一緒に患者において検出されなければならない：１）貧血およびベースラインヘモグロビンレベルから２ｇ／ｄＬ以上の低下、２）白赤芽球性の末梢血像、３）５ｃｍ以上の触知可能な脾腫の増加または新しく触知可能になった脾腫の出現として定義される脾腫の増大、４）乳酸デヒドロゲナーゼの増加、および５）３つの全身症状：６カ月で１０％超の体重減少、寝汗、原因不明の発熱のうち１つ以上の発生。ある特定の態様では、本開示は、真性赤血球増加症後骨髄線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するため、特に、真性赤血球増加症後骨髄線維症の１つまたは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するための方法およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの使用に関する。ある特定の態様では、本開示は、本態性血小板血症後骨髄線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するため、特に、本態性血小板血症後骨髄線維症の１つまたは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するための方法およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの使用に関する。
骨髄線維症におけるロバストな予後モデル化が、２００９年に国際予後スコア化システム（ＩＰＳＳ）の開発と共に開始された［Cervantes Fら（２００９年）Blood、１１３巻：２８９５～２９０１頁］。骨髄線維症に対するＩＰＳＳは、最初の診断時に評価された患者に適用可能であり、生存不良の５つの独立した予測因子を使用する：年齢＞６５歳、ヘモグロビン＜１０ｇ／ｄＬ、白血球数＞２５×１０９／Ｌ、循環芽細胞≧１％、および全身症状の存在。有害な因子が０、１、２、および３つ以上存在することを、それぞれ低、中間１、中間２、および高リスクの疾患と定義する。対応する生存期間中央値は、それぞれ１１．３、７．９、４、および２．３年であった。ある特定の態様では、本開示は、ＩＰＳＳによる低、中間１、中間２、または高リスクの骨髄線維症を有する患者において骨髄線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するための方法およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、本開示は、ＩＰＳＳによる骨髄線維症リスクの進行を予防または遅延する（例えば、ＩＰＳＳによる、低リスクから中間１リスク、中間１リスクから中間２リスク、および中間２リスクから高リスクへのリスクの進行を予防または遅延する）ための方法およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、本開示は、ＩＰＳＳによる骨髄線維症リスクの後退を促進または増大する（例えば、ＩＰＳＳによる、高リスクから中間２リスク、中間２リスクから中間１リスク、および中間１リスクから低リスクへの後退を促進または増大する）ための方法およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの使用に関する。
その後、ＩＷＧ－ＭＲＴにより、ＩＰＳＳで使用されるものと同じ予後変数を使用するが、疾患経過中のあらゆる時点で適用することができる動的な予後モデル（動的国際予後スコア化システム［ＤＩＰＳＳ］）が開発された［Passamonti Fら（２０１０年）Blood.、１１５巻：１７０３～１７０８頁］。ＤＩＰＳＳでは、ヘモグロビン＜１０ｇ／ｄＬについて逆得点１ではなく２を割り当て、したがって、リスクカテゴリー化が改変される：低（０逆得点）、中間１（１または２点）、中間２（３または４点）、および高（５または６点）。対応する生存期間中央値は、到達せず、１４．２、４、および１．５年であった。ある特定の態様では、本開示は、ＤＩＰＳＳによる低、中間１、中間２、または高リスクの骨髄線維症を有する患者において骨髄線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するための方法およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、本開示は、ＤＩＰＳＳによる骨髄線維症リスクの進行を予防または遅延する（例えば、ＤＩＰＳＳによる低リスクから中間１リスク、中間１リスクから中間２リスク、および中間２リスクから高リスクへのリスクの進行を予防または遅延する）ための方法およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、本開示は、ＤＩＰＳＳによる骨髄線維症リスクの後退を促進または増大する（例えば、ＤＩＰＳＳによる高リスクから中間２リスク、中間２リスクから中間１リスク、および中間１リスクから低リスクへの後退を促進または増大する）ための方法およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの使用に関する。
骨髄線維症における生存についてのＩＰＳＳおよびＤＩＰＳＳとは独立した危険因子がその後同定され、好ましくない核型（すなわち、＋８、－７／７ｑ－、ｉ（１７ｑ）、ｉｎｖ（３）、－５／５ｑ－、１２ｐ－、または１１ｑ２３再編成を含む複雑核型または単一もしくは２つの異常）［Husseinら（２０１０年）Blood.、１１５巻：４９６～４９９頁］、赤血球輸血の必要［Tefferiら（２００９年）Am J Hematol.、８５巻：１４～１７頁］、および血小板数＜１００×１０９／Ｌ［Patnaikら（２０１０年）Eur J Haematol.、８４巻：１０５～１０８頁］が含まれた。したがって、これら３つの追加のＤＩＰＳＳとは独立した危険因子：血小板数＜１００×１０９／Ｌ、赤血球輸血の必要、および好ましくない核型を組み入れることによってＤＩＰＳＳをＤＩＰＳＳ－ｐｌｕｓに改変した。上述の８つの危険因子に基づく４つのＤＩＰＳＳ－ｐｌｕｓリスクカテゴリーは、低（危険因子なし）、中間１（危険因子が１つ）、中間２（危険因子が２つまたは３つ）、および高（危険因子が４つまたはそれより多い）であり、それぞれの生存期間中央値は、１５．４、６．５、２．９、および１．３年である。ある特定の態様では、本開示は、ＤＩＰＳＳ－ｐｌｕｓによる低、中間１、中間２、または高リスクの骨髄線維症を有する患者において骨髄線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するための方法およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、本開示は、ＤＩＰＳＳ－ｐｌｕｓによる骨髄線維症リスクの進行を予防または遅延する（例えば、ＤＩＰＳＳ－ｐｌｕｓによる低リスクから中間１リスク、中間１リスクから中間２リスク、および中間２リスクから高リスクへのリスクの進行を予防または遅延する）ための方法およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、本開示は、ＤＩＰＳＳ－ｐｌｕｓによる骨髄線維症リスクの後退を促進または増大する（例えば、ＤＩＰＳＳ－ｐｌｕｓによる高リスクから中間２リスク、中間２リスクから中間１リスク、および中間１リスクから低リスクへの後退を促進または増大する）ための方法およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの使用に関する。
ＤＩＰＳＳ－ｐｌｕｓの公開以来、追加の予後情報を示唆するいくつかの研究が公開されている。例えば、モノソーム核型、ｉｎｖ（３）／ｉ（１７ｑ）異常、または、循環芽細胞＞９％、白血球≧４０×１０９／Ｌまたは他の好ましくない核型のうちのいずれか２つによって骨髄線維症における＞８０％の２年死亡率が予測された［Tefferiら（２０１１年）Blood.、１１８巻：４５９５～４５９８頁］。同様に、骨髄線維症における生存不良が、ＪＡＫ２ ４６／１ハプロタイプのヌル欠損、低ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ対立遺伝子負荷、またはＩＤＨ、ＥＺＨ２、ＳＲＳＦ２、もしくはＡＳＸＬ１変異の存在に関連付けられた［Tefferi, Ayalew（２０１４年）Am. J. Hematol.、８９巻：９１６～９２５頁］。対照的に、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ、ＭＰＬ、またはＴＥＴ２変異の有無は生存に影響しないと思われた。骨髄線維症における生存はまた、血清ＩＬ－８およびＩＬ－２Ｒレベルの増加ならびに血清遊離軽鎖レベルの増加による影響も受け、これらはどちらもＤＩＰＳＳ－ｐｌｕｓとは独立したものである。ごく最近、Tefferiらは、２５４名の骨髄線維症の患者を試験し、変異の頻度について、ＪＡＫ２が５８％、ＣＡＬＲが２５％、ＭＰＬが８％、および３つ全ての変異について野生型（すなわち、トリプルネガティブ）が９％であることを報告した［Tefferiら（２０１４年）Leukemia、DOI 10.1038/leu.2014.3として事前出版］。ＪＡＫ２／ＭＰＬ無変異の場合のＣＡＬＲ変異の頻度は７４％であった。ＣＡＬＲ変異は、より若い年齢、より高い血小板数、およびより低いＤＩＰＳＳ－ｐｌｕｓスコアに関連付けられた。ＣＡＬＲが変異した患者はまた、貧血である、輸血を必要とする、または白血球増加症を示す可能性が低かった。ＣＡＬＲが変異した患者ではスプライソソーム変異が低頻度であった。その後の５７０名の患者に関する国際的な研究において、著者らは、生存がＣＡＬＲ＋ＡＳＸＬ１－患者で最も長く（中央値１０．４年）、ＣＡＬＲ－ＡＳＸＬ１＋患者で最も短い（中央値２．３年）ことを報告した［Tefferiら（２０１４年）Leukemia、DOI 10.1038/leu.2014.57として事前出版］。ＣＡＬＲ＋ＡＳＸＬ１＋およびＣＡＬＲ－ＡＳＸＬ１－患者は同様の生存を有し、中間リスクカテゴリーに一緒に群分けされた（生存期間中央値５．８年）。全生存に関して明らかになりつつあるように、ＩＤＨおよびＳＲＳＦ２を含めたある特定の変異を有する患者では無白血病生存も有意に損なわれる［Tefferiら（２０１２年）Leukemia.、２６巻：４７５～４８０頁；Lashoら（２０１２年）Blood.、１２０巻：４１６８～４１７１頁］。さらに、ＬＮＫおよびＴＨＰＯの変異が骨髄線維症に関連付けられた。
ヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）機能獲得型変異であるＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆの発見により、骨髄線維症の基礎をなす生物学の理解の有意な改善、ならびに、骨髄線維症の処置に関してＦＤＡにより承認された最初の薬物であるＪＡＫ２阻害剤ルクソリチニブの開発がもたらされた［Baxterら（２００５年）Lancet、３６５巻：１０５４～１０６１頁；James C.ら（２００５年）Nature、４３４巻：１１４４～１１４８頁；Kralovicsら（２００５年）N Engl J Med.、３５２巻：１７７９～１７９０頁；およびLevineら（２００５年）Cancer Cell、７巻：３８７～３９７頁］。受容体チロシンキナーゼのヤヌスキナーゼファミリーは、４つの異なるタンパク質（ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３およびＴＹＫ２）を含み、このファミリーのタンパク質は、骨髄系およびリンパ系細胞の成長および発達において極めて重要な役割を果たすことが分かっている。具体的には、このファミリーのタンパク質は、サイトカイン受容体からの細胞内相互作用を媒介し、その結果、転写のシグナル伝達因子活性化因子（ＳＴＡＴ）因子の活性化ならびに細胞増殖および分化を調節する遺伝子の下流促進をもたらす［Quintas-Cardamaら（２０１１年）Nat Rev Drug Discov、１０巻：１２７～１４０頁］。ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異により、ＪＡＫ２の構成的な活性化がもたらされ、したがって、骨髄系細胞の増殖および分化が促進される。臨床試験中の他のヤヌスキナーゼ阻害剤として、例えば、フェドラチニブ（ＳＡＲ３０２５０３）、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、パクリチニブ、レスタウルチニブ、ＡＺＤ－１４８０、ＢＭＳ－９１１５４３、ＮＳ－０１８、ＬＹ２７８４５４４、ＳＥＰ－７０１、ＸＬ０１９、およびＡＴ－９２８３が挙げられる。
ある特定の態様では、本開示は、モノソーム核型、ｉｎｖ（３）／ｉ（１７ｑ）異常、循環芽細胞＞９％および／または白血球≧４０×１０９／Ｌ、ＪＡＫ２ ４６／１ハプロタイプのヌル欠損、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異、ＩＤＨ１変異、ＩＤＨ２変異、ＥＺＨ２変異、ＳＲＳＦ２変異、ＡＳＸＬ１変異、血清ＩＬ－８レベルの増加、血清ＩＬ－２Ｒレベルの増加、遊離軽鎖レベルの増加、ＪＡＫ１変異、ＪＡＫ２変異、ＪＡＫ３変異、ＴＹＫ２変異、ＭＰＬ変異、ＣＡＬＲ変異、ＣＡＬＲ＋ＡＳＸＬ１－、ＣＡＬＲ－ＡＳＫＬ１＋、ＣＡＬＲ＋ＡＳＫＬ１＋、ＣＡＬＲ－ＡＳＫＬ１－、ＴＥＴ２変異、ＴＨＰＯ変異、およびＬＮＫ変異のうちの１つまたは複数を有する患者において骨髄線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するための方法およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの使用に関する。
貧血の管理は、骨髄線維症の患者の処置の最も困難な側面の１つであり得る［Tefferi A.（２０１１年）Blood １１７巻（１３号）：３９４９～３５０４頁；Barosiら（２０１１年）Expert Opin Pharmacother １２巻（１０号）：１５９７～１６１１頁］。輸血（全血または赤血球輸血）は、貧血の症状がある骨髄線維症患者に対する標準治療である。輸血に加えて、種々の従来の作用因子がこれらの患者における貧血を処置するために使用される。例えば、赤血球生成刺激剤［例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびその誘導体などのＥＳＡ］、アンドロゲン（例えば、エナント酸テストステロンおよびフルオキシメステロン）、プレドニゾン、ダナゾール、サリドマイド、プレドニゾン、およびレナリドミドが骨髄線維症患者における貧血を処置するために一般に使用される。一般に、ＥＳＡは、中等度の非輸血依存性貧血および低血清エリスロポエチンレベルを有する患者において使用される。奏効率は２０～６０％で変動し、従来の組換えエリスロポエチンと比較してダルベポエチン－アルファは明白に支持されない。ＥＳＡ応答は、通常、一時的なものである（約１年）。ＥＳＡが機能しないまたは効力が不十分である場合、典型的には、ダナゾールまたはアンドロゲン調製物が貧血患者を処置するために使用され、奏効率は約２０％である。漸減的なプレドニゾンを伴う低用量サリドマイドにより、患者のおよそ２０～４０％で貧血における応答が生じている［Thapaliyaら（２０１１年）Am J Hematol ８６巻（１号）：８６～９８頁］。しかし、サリドマイドによる処置は、多くの場合、耐容性が乏しく、末梢神経障害、便秘、および傾眠が伴い、大多数の患者で当該薬物の中止に至る。ｄｅｌ（５ｑ３１）に関連する貧血を有する骨髄線維症患者では、レナリドミドが推奨される第一選択治療であり、これは、貧血の消散および時々証明される分子寛解を伴う有意な改善が報告されているからである［Tefferiら（２００７年）Leukemia ２１巻（８号）：１８２７～１８２８頁］。ある特定の態様では、本開示は、貧血を有する患者において骨髄線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するための方法およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、本開示は、骨髄線維症患者における貧血の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するための方法およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの使用に関する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者において骨髄線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、赤血球生成刺激剤［例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびその誘導体などのＥＳＡ］、アンドロゲン（例えば、エナント酸テストステロンおよびフルオキシメステロン）、プレドニゾン、ダナゾール、サリドマイド、プレドニゾン、およびレナリドミドからなる群から選択される１つまたは複数の追加の活性作用因子と併せて投与することを含む方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする骨髄線維症患者における貧血の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、赤血球生成刺激剤［例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびその誘導体などのＥＳＡ］、アンドロゲン（例えば、エナント酸テストステロンおよびフルオキシメステロン）、プレドニゾン、ダナゾール、サリドマイド、プレドニゾン、およびレナリドミドからなる群から選択される１つまたは複数の追加の活性作用因子と併せて投与することを含む方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする骨髄線維症患者における貧血の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減する方法であって、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを輸血（全血または赤血球輸血）と併せて投与することを含む方法に関する。
ヒトにおけるヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットレベルをモニタリングする場合、レベルが適切な年齢および性別カテゴリーについての正常よりも低いことにより貧血が示され得るが、個々の変動を考慮に入れる。例えば、ヘモグロビンレベルは、１０～１２．５ｇ／ｄｌ、および典型的には約１１．０ｇ／ｄｌが健康な成人の正常範囲内であると考えられるが、治療の観点から、標的レベルをより低くすることにより、より少ない心血管副作用が引き起こされ得る。例えば、Jacobsら（２０００年）Nephrol Dial Transplant、１５巻、１５～１９頁を参照されたい。あるいは、ヘマトクリットレベル（細胞が占める血液試料の体積の百分率）を貧血の測定基準として使用することができる。健康な個体のヘマトクリットレベルは、成人男性では約４１～５１％にわたり、成人女性では３５～４５％にわたる。ある特定の実施形態では、患者を赤血球、ヘモグロビン、および／もしくはヘマトクリットの標的レベルまで回復させること、または、赤血球、ヘモグロビンおよび／もしくはヘマトクリットの許容されるレベルを維持しながら赤血球輸血を低減もしくは排除する（輸血負荷を低減する）ことを意図した投薬レジメンを用いて患者を処置することができる。ヘモグロビンおよびヘマトクリットレベルは人によって変動するので、最適には、標的ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットレベルを各患者に対して個別化することができる。
全血または赤血球の頻繁な輸血を受けている患者では、鉄恒常性の正常な機構が圧倒され、最終的に、心臓、肝臓、および内分泌腺などの生命維持に必要な組織における毒性かつ潜在的に致死的な鉄の蓄積に至ることがある。定期的な赤血球輸血には種々のドナー単位の血液への曝露が必要であり、したがって、同種免疫のリスクが高い。血管アクセスの難しさ、鉄キレート化の利用可能性およびコンプライアンス、ならびに費用が高いことが、赤血球輸血の数を制限することが有益であり得ることの理由の一部である。
ある特定の態様では、任意選択でＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせた１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、尿および／または便中への鉄排出を促進し、それにより、骨髄線維症患者における組織鉄過剰負荷を予防するまたは反転させるための１つまたは複数の鉄キレート化分子と組み合わせて使用することができる。有効な鉄キレート化剤は、ヒドロキシルラジカルおよび酸化生成物の触媒による生成を通じて鉄毒性の大部分の原因となっている可能性が高い非トランスフェリン結合鉄の酸化形態である三価鉄に選択的に結合し、それを中和することができるはずである［例えば、Espositoら（２００３年）Blood、１０２巻：２６７０～２６７７頁を参照されたい］。これらの作用因子は、構造的に多様であるが、全てが、個々の鉄原子の化学量論が１：１（六座作用因子）、２：１（三座）、または３：１（二座）である中和性八面体配位錯体を形成することができる酸素または窒素ドナー原子を有する［Kalinowskiら（２００５年）Pharmacol Rev、５７巻：５４７～５８３頁］。一般に、有効な鉄キレート化剤はまた、比較的低分子量（例えば、７００ダルトン未満）であり、患部組織に接近できるように水および脂質の両方に対して溶解性である。鉄キレート化分子の具体例としては、デフェロキサミン、毎日の非経口投与が必要な細菌起源の六座作用因子、ならびに経口的に活性な合成作用因子デフェリプロン（二座）およびデフェラシロクス（三座）が挙げられる。２つの鉄キレート化剤の同日投与からなる併用療法は、キレート化単独療法に対して不応答性の患者において有望であり、デフェロキサミン（dereroxamine）単独で用いる場合の患者のコンプライアンスが不十分であるという問題を克服することにおいても有望であることを示している［Caoら（２０１１年）Pediatr Rep、３巻（２号）：ｅ１７頁；およびGalanelloら（２０１０年）Ann NY Acad Sci、１２０２巻：７９～８６頁］。
本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、特に低用量範囲のＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用して、赤血球の増加を達成することができる。このことは、高用量のＥＰＯ受容体活性化因子に伴う既知のオフターゲットの効果およびリスクを低減することにおいて有益であり得る。ＥＳＡの主要な有害作用としては、例えば、ヘマトクリットまたはヘモグロビンレベルの過剰な増加および赤血球増加症が挙げられる。ヘマトクリットレベルの上昇により、高血圧（より詳細には高血圧の増悪）が生じる可能性がある。そのうちの一部が高血圧に関する、報告されているＥＳＡの他の有害作用は、血栓症、高血圧性脳障害、および赤血球形成不全に起因する頭痛、インフルエンザ様症候群、シャントの閉塞、心筋梗塞および脳痙攣である。例えば、Singibarti（１９９４年）J. Clin Investig、７２巻（補遺６）、Ｓ３６～Ｓ４３頁；Horlら（２０００年）Nephrol Dial Transplant、１５巻（補遺４）、５１～５６頁；Delantyら（１９９７年）Neurology、４９巻、６８６～６８９頁；およびBunn（２００２年）N Engl J Med、３４６巻（７号）、５２２～５２３頁）を参照されたい。ある特定の実施形態では、本開示は、患者に治療有効量の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストおよびＥＰＯ受容体活性化因子を投与することによって、骨髄線維症患者における貧血を処置または予防する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストをＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用して、ＥＳＡの有害作用を受けやすい患者におけるこれらの活性化因子の必要な用量を低減することができる。これらの方法は、患者の治療的および予防的処置のために使用することができる。
本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストはＥＳＡとは異なる機構によって作用するとすれば、これらのアンタゴニストは、ＥＳＡまたは他のＥＰＯ受容体活性化因子に十分に応答しない患者における赤血球およびヘモグロビンレベルを増加させるために有用であり得る。例えば、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、通常～増加させた（＞３００ＩＵ／ｋｇ／週）用量のＥＳＡを投与することではヘモグロビンレベルが標的レベルまで増加しない患者に有益であり得る。ＥＳＡに対する不十分な応答は、構成的なもの（ＥＳＡを用いた最初の処置時に観察される）または獲得されたもの（ＥＳＡを用いて繰り返し処置すると観察される）のいずれかであり得る。
細胞減少剤は、症候性の脾腫を有する大多数の患者に選択される処置であった。ヒドロキシカルバミド（ヒドロキシウレア、ＨＣ）が最も一般的に使用される細胞減少剤であり、通常、高用量で中程度の応答が生じる。しかし、ＨＣは、多くの場合、血球減少症を増悪させる可能性があり、したがって、多くの場合、耐容性が良好でない。ＨＣで処置された患者の３５％までで脾臓サイズの２５％～５０％の縮小が報告されている［Martinez-Trillosら（２０１０年）Ann Hematol. ８９巻（１２号）：１２３３～１２３７頁］。ＨＣに応答しない患者では、ブスルファンまたはメルファランを、これらの作用因子により白血病転換の頻度が増大し得る証拠があるので、特に高齢の患者において使用することができる。低用量サリドマイドを用いた脾臓応答は低い（＜２０％）。しかし、レナリドミドでは、以前のサリドマイド療法が失敗した何名かの患者が含まれた試験において、３３％奏効率がもたらされることが示されている。広範囲の不応性脾腫の場合には、毎月の静脈内クラドリビン過程により、５０％までの応答がもたらされ、主要な毒性として重症であるが可逆的な血球減少症が伴った［Faoroら（２００５年）Eur J Haematol、７４巻（２号）：１１７～１２０頁］。ルクソリチニブは、最近の研究においてＨＣよりも優れていることが証明され、したがって、症候性または進行性脾腫を制御するための第一選択の作用因子になりつつある。残念ながら、ルクソリチニブの一般的な副作用は、骨髄線維症患者における貧血の発生または悪化である。したがって、ＪＡＫ阻害剤は脾腫を処置するために有用であり得るが、ＪＡＫ阻害剤により、骨髄線維症の他の合併症、特に、貧血および貧血に関連する障害が実際に悪化する可能性がある。
ＪＡＫ２阻害に加えて、免疫調節薬（例えば、ポマリドミド）、ｍＴＯＲ経路の哺乳動物標的の阻害剤（例えば、ラパマイシン、シロリムス、デフォロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＰＫ１－５８７、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、およびＡＺＤ２０１４）、ならびにエピジェネティック因子モジュレーター（例えば、ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）およびプラシノスタットなどのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤）を含めたいくつかの他の処置戦略が、骨髄増殖性障害の処置に関して調査中である［Mascarenhasら（２０１３年）Haematologica ９８巻（１０号）：１４９９～１５０９頁］。
本開示は、本明細書に記載される患者の処置における、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの、１つまたは複数の他の治療モダリティと組み合わせた使用をさらに企図する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、細胞毒、免疫抑制剤、放射性毒性薬剤、および／または治療用抗体と組み合わせて投与することができる。本発明により企図される特定の共治療薬としては、これらに限定されないが、ステロイド（例えば、プレドニゾンなどのコルチコステロイド）、免疫抑制剤および／または抗炎症剤（例えば、ガンマ－インターフェロン、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキサート、ペニシラミン、シクロスポリン、コルヒチン、抗胸腺細胞グロブリン、ミコフェノール酸モフェチル、およびヒドロキシクロロキン）、細胞傷害性薬物、カルシウムチャネル遮断薬（例えば、ニフェジピン）、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ）阻害剤、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ジメチルスルホキシド、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）阻害剤、インターロイキン－５（ＩＬ－５）阻害剤、および汎カスパーゼ阻害剤が挙げられる。ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストと組み合わせて使用することができる追加の作用因子としては、これらに限定されないが、レクチン（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０２６，２８３号に記載されている）、ならびにWynnら（２００７年、J Clin Invest、１１７巻：５２４～５２９頁）に記載されている抗線維化剤が挙げられる。例えば、追加の抗線維化剤および療法としては、これらに限定されないが、種々の抗炎症／免疫抑制／細胞傷害性薬（コルヒチン、アザチオプリン、シクロホスファミド、プレドニゾン、サリドマイド、ペントキシフィリンおよびテオフィリンを含む）、ＴＧＦβシグナル伝達修飾因子（レラキシン、ＳＭＡＤ７、ＨＧＦ、およびＢＭＰ７、ならびにＴＧＦβ１、ＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ、ＥＧＲ－Ｉ、およびＣＴＧＦ阻害剤を含む）、サイトカインおよびサイトカイン受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１β、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＩＬ－２１、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－１３Ｒα１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、オンコスタチンＭ、ＷＩＳＰ－Ｉ、およびＰＤＧＦの阻害剤）、サイトカインおよびケモカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α／β、ＩＬ－１２、ＩＬ－１０、ＨＧＦ、ＣＸＣＬ１０、およびＣＸＣＬ１１）、ケモカインアンタゴニスト（ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ６、ＣＣＬ１７、およびＣＣＬ１８の阻害剤）、ケモカイン受容体アンタゴニスト（ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ２、およびＣＸＣＲ４の阻害剤）、ＴＬＲアンタゴニスト（ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ９の阻害剤）、血管新生アンタゴニスト（ＶＥＧＦ特異的抗体およびアデノシンデアミナーゼ補充療法）、降圧薬（ベータ遮断薬ならびにＡＮＧ１１、ＡＣＥ、およびアルドステロンの阻害剤）、血管作動性物質（ＥＴ－１受容体アンタゴニストおよびボセンタン（bosetan））、コラーゲンを合成および加工する酵素の阻害剤（プロリルヒドロキシラーゼの阻害剤）、Ｂ細胞アンタゴニスト（リツキシマブ）、インテグリン／接着分子アンタゴニスト（α１β１およびαｖβ６インテグリンを遮断する分子、ならびにインテグリン連結キナーゼの阻害剤、ならびにＩＣＡＭ－ＩおよびＶＣＡＭ－Ｉに特異的な抗体）、筋線維芽細胞を標的とするアポトーシス促進薬、ＭＭＰ阻害剤（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、およびＭＭＰ１２の阻害剤）、ならびにＴＩＭＰ阻害剤（ＴＩＭＰ－１に特異的な抗体）が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、それを必要とする患者を処置するために単独で使用することができる。あるいは、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、例えば、外科手術（例えば、脾摘出術）、細胞傷害性薬剤、放射性物質の照射または投与を伴う放射線学的処置、化学療法剤、抗ホルモン剤、成長阻害剤、抗新生物組成物、および本明細書において列挙されており、当技術分野で公知の抗がん剤を用いた処置、またはこれらの組み合わせを含めた、本明細書に記載される増殖性障害の処置または予防を対象とする従来の治療的アプローチと組み合わせて使用することができる。
一般に、細胞傷害性薬剤とは、細胞の機能を阻害するもしくは妨げるおよび／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤、例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン（adriamicin）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤、酵素およびそのフラグメント、例えば、核酸分解酵素など、抗生物質、ならびに毒素、例えば、それらのフラグメントおよび／または改変体を含めた、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素など、ならびに、以下に開示される種々の抗腫瘍剤または抗がん剤を含むことが意図される。他の細胞傷害性薬剤を下に記載する。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
一般に、化学療法剤は、がんの処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミドなどのアルキル化剤； ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチルオロメラミンを含めたエチレンイミンおよびメチルアメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ－ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体であるトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ－１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）を含む）、アセチルカンプトテシン、スコポレチン（scopolectin）、および９－アミノカンプトテシン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体であるＫＷ－２１８９およびＣＢＩ－ＴＭＩを含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ranimnustine）などのニトロソ尿素；エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマ１ｌおよびカリチアマイシンオメガ１ｌ（例えば、Agnew、Chem Intl. Ed. Engl.、３３巻：１８３～１８６頁、（１９９４年）を参照されたい）などの抗生物質；ジネミシンＡを含めたジネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カルビシン（carabicin）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌ）；フォリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デメコルチン；ジアジクオン；エフロルニチン（elfornithine）；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；マイタンシンおよびアンサマイトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（mopidanmol）；ニトラクリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）クレモホールを含まない、アルブミン操作されたパクリタキセルのナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（doxetaxel）（Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボリン（leucovovin）；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＹＥＬＯＦＩＢＲＯＳＩＳ Ｏ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびに上記のうちの２つまたはそれより多くの組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略語）、ならびにＦＯＬＦＯＸ（オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））と５－ＦＵおよびロイコボリンを組み合わせた処置レジメンの略語）などが挙げられる。
がんの成長を促進し得るホルモンの影響が調節、低減、遮断、または阻害されるように作用し、多くの場合、全身的、または全身の処置の形態である抗ホルモン剤もまた、がんの処置において有用な化学化合物である。抗ホルモン剤は、ホルモン自体であり得る。例としては、例えばタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１ １７０１８、オナプリストン、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェンを含めた抗エストロゲン剤および選択的なエストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）；抗プロゲステロン剤；エストロゲン受容体下方調節因子（ＥＲＤ）；卵巣が抑制されるまたは機能停止するように機能する作用因子、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト、例えば、ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）酢酸リュープロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリンおよびトリプトレリン（tripterelin）；他の抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミドなど；ならびに、副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）－イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳ ＯＲ（登録商標）ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）レトロゾール、およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）アナストロゾールが挙げられる。さらに、化学療法剤のこのような定義は、ビスホスホネート、例えば、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、ＤＩＤＲＯＣ ＡＬ（登録商標）エチドロネート、ＮＥ－５８０９５、ＺＯＭＥＴ Ａ（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）アレンドロネート、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）パミドロネート、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標）チルドロネート、またはＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標）リセドロネートなど；ならびにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、迷走性細胞増殖に関係付けられるシグナル伝達経路内の遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ－アルファ、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）など；ワクチン、例えば、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子療法ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチンなど；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；トシル酸ラパチニブ（ＥｒｂＢ－２およびＧＷ５７２０１６としても公知のＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体を含む。
成長阻害剤とは、一般に、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞の成長を阻害する化合物または組成物を指す。したがって、成長阻害剤は、Ｓ期の細胞の百分率を有意に低下させるものであり得る。成長阻害剤の例としては、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の場所で）遮断する作用因子、例えば、Ｇ１での静止およびＭ期での静止を誘導する作用因子などが挙げられる。古典的なＭ期遮断薬として、ビンカ（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびに、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどのトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が挙げられる。Ｇ１を静止する作用因子はＳ期静止にも広がり、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、およびａｒａ－ＣなどのＤＮＡアルキル化剤である。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer、MendelsohnおよびIsrael編、第１章、表題「Cell cycle regulation, oncogenes,and antineoplastic drugs」、Murakamiら（WB Saunders：Philadelphia、１９９５年）、特に、１３頁に見出すことができる。タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、どちらもイチイに由来する抗がん薬である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似体である。パクリタキセルおよびドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管の集合を促進し、また、解重合を防止することによって微小管を安定化し、その結果、細胞における有糸分裂が阻害される。
ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストおよび追加の活性作用因子（例えば、共治療剤）は、同じ製剤として投与することもでき、別々に投与することもできる。別々の投与の場合では、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを追加の活性作用因子の前に、これらの後に、またはこれらと共時的に投与することができる。１つの作用因子が他の作用因子の投与に数分から数週間までにわたる間隔で先行するまたはその後に続くことができる。２つまたはそれより多くの異なる種類の治療剤を別々に対象に適用する実施形態では、一般に、これらの異なる種類の作用因子がなお標的組織または細胞に対する組み合わせ効果を有利に発揮することができるように、各送達時間の間に著しい期間が過ぎないことを確実にする。
ある特定の実施形態では、本開示は、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト作用因子を用いて処置されているか、または処置される候補の患者を、その患者における１つまたは複数の血液学的パラメータを測定することによって管理するための方法を提供する。血液学的パラメータは、本開示のアンタゴニストを用いて処置される候補である患者への適切な投薬を評価するため、処置中の血液学的パラメータをモニタリングするため、本開示の１つもしくは複数のアンタゴニストを用いた処置中に投与量を調整するかどうかを評価するため、および／または、本開示の１つもしくは複数のアンタゴニストの適切な維持用量を評価するために使用することができる。血液学的パラメータのうちの１つまたは複数が正常なレベルから外れた場合、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの投薬を低減する、遅らせる、または終結させることができる。
本明細書に提示される方法に従って測定することができる血液学的パラメータとしては、例えば、赤血球レベル、血圧、鉄貯蔵、および、当技術分野において認められている方法を使用して赤血球レベルの増加と相関する体液中に見出される他の作用因子が挙げられる。このようなパラメータは、患者由来の血液試料を使用して決定することができる。赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および／またはヘマトクリットレベルの増加により、血圧の増加が引き起こされる可能性がある。
一実施形態では、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを用いて処置される候補である患者において１つまたは複数の血液学的パラメータが正常範囲を外れているかまたは正常の高値側である場合には、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投与の開始を、血液学的パラメータが自然にまたは治療介入によって正常または許容されるレベルに戻るまで遅らせることができる。例えば、候補患者が高血圧または前高血圧である場合には、患者の血圧を低下させるために、患者を、血圧降下剤を用いて処置することができる。例えば、利尿薬、アドレナリン作用阻害剤（アルファ遮断薬およびベータ遮断薬を含む）、血管拡張薬、カルシウムチャネル遮断薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬を含め、個々の患者の状態に適した任意の血圧降下剤を使用することができる。あるいは、食事および運動レジメンを使用して血圧を処置することができる。同様に、候補患者の鉄貯蔵が正常よりも低いか、または正常の低値側にある場合には、患者の鉄貯蔵が正常または許容されるレベルに戻るまで、患者を、食事および／または鉄補給剤の適切なレジメンを用いて処置することができる。赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルが正常よりも高い患者に関しては、レベルが正常または許容されるレベルに戻るまで、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投与を遅らせることができる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを用いて処置される候補である患者において１つまたは複数の血液学的パラメータが正常範囲を外れているかまたは正常の高値側にある場合、投与の開始を遅らせなくてもよい。しかし、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投与量または投薬の頻度を、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを投与すると生じる血液学的パラメータの許容されない増加のリスクが低減される量に設定することができる。あるいは、患者に対して、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストと望ましくないレベルの血液学的パラメータに対処する治療剤とを組み合わせた治療レジメンを開発することができる。例えば、患者の血圧が上昇している場合には、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト作用因子および血圧降下剤の投与を伴う治療レジメンを設計することができる。鉄貯蔵が望ましいものよりも低い患者に関しては、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストおよび鉄補給を伴う治療レジメンを開発することができる。
一実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメータのベースラインパラメータ（複数可）を、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを用いて処置される候補である患者に対して確立することができ、ベースライン値（複数可）に基づいて、その患者に対する適切な投薬レジメンを確立することができる。あるいは、患者の病歴に基づいて確立されたベースラインパラメータを使用して、患者に対する適切なアンタゴニスト投薬レジメンを通知することができる。例えば、健康な患者が、定義された正常範囲を超えている確立されたベースライン血圧読み取りを有する場合、患者の血圧を、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた処置前に、一般集団に関して正常であると考えられる範囲内にする必要がない場合がある。本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを用いた処置前の患者の１つまたは複数の血液学的パラメータのベースライン値も、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた処置中の血液学的パラメータのあらゆる変化をモニタリングするための関連する比較値として使用することができる。
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを用いて処置されている患者において１つまたは複数の血液学的パラメータを測定する。血液学的パラメータを使用して、患者を処置中モニタリングし、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬または別の治療剤を用いた追加の投薬の調整または終結を可能にすることができる。例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの投与により、血圧、赤血球レベル、もしくはヘモグロビンレベルの増加、または鉄貯蔵の低減が生じる場合には、１つまたは複数の血液学的パラメータに対する本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの影響を低下させるために、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの用量は、その量または頻度を減少させることができる。１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストの投与により、患者に対して有害な１つまたは複数の血液学的パラメータの変化が生じる場合には、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投薬を、血液学的パラメータ（複数可）が許容されるレベルに戻るまで一時的に終結させるか、または恒久的に終結させることができる。同様に、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投与の用量または頻度を減少させた後に１つまたは複数の血液学的パラメータが許容される範囲内に入らない場合には、投薬を終結させることができる。本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬を減少または終結させる代わりに、またはそれに加えて、患者に、例えば血圧降下剤または鉄補給剤などの、望ましくないレベルの血液学的パラメータ（複数可）に対処する追加の治療剤を投薬することができる。例えば、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを用いて処置されている患者の血圧が上昇した場合には、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬を同じレベルで継続することができ、かつ処置レジメンに血圧降下剤を追加するか、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬（例えば、量および／または頻度）を減少させることができ、かつ処置レジメンに血圧降下剤を添加するか、または本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬を終結させ、患者を、血圧降下剤を用いて処置することができる。
本明細書で使用される場合、「～と組み合わせて」、「～の組み合わせ」、または「併用」投与とは、追加的治療（例えば、第２、第３、第４など）が、体内でなおも効果的である（例えば、複数の化合物は、患者において同時に効果的であり、これは、これらの化合物の相乗効果を含み得る）ような、任意の投与形態を指す。有効性は、血中、血清中、または血漿中の作用因子の測定可能な濃度と相関しない場合がある。例えば、異なる治療用化合物を、同じ製剤として投与することもでき、別々の製剤として、共時的または逐次的に投与することもでき、異なるスケジュールで投与することもできる。したがって、このような処置を施される個体は、異なる治療の組み合わせ効果による利益を得ることができる。本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト、またはこのようなポリペプチドの組み合わせは、１つまたは複数の他の追加の作用因子または支持療法と共時的に、これらの前に、またはこれらの後に投与され得る。一般に、各治療剤は、その特定の作用因子について決定された用量および／または時間スケジュールで投与される。レジメンにおいて使用する特定の組み合わせは、本開示のアンタゴニストの、治療および／または所望のその適合性を考慮に入れる。
５．医薬組成物
本明細書に記載される治療剤（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト）は、医薬組成物に製剤化することができる。本開示に従って使用するための医薬組成物は、１つまたは複数の生理的に許容されるキャリアまたは賦形剤を使用し、従来の様式で製剤化することができる。このような製剤は、一般に、大多数の規制要件に従って、実質的に発熱物質非含有である。
ある特定の実施形態では、本開示の治療方法は、組成物を全身的にまたは局所的に移植片またはデバイスとして投与することを含む。投与される際、本開示において使用するための治療用組成物は、発熱物質非含有、生理的に許容される形態である。任意選択で上記の組成物に同様に含めることができるＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達アンタゴニスト以外の治療的に有用な作用因子は、本明細書で開示された方法において、対象の化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）と同時にまたは逐次的に投与することができる。
典型的には、本明細書で開示されたタンパク質治療剤は、非経口的に、具体的には、静脈内にまたは皮下に投与される。非経口投与に適した医薬組成物は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、製剤に意図されたレシピエントの血液との等張性を与える溶質または懸濁化もしくは増粘剤を含有し得る１つまたは複数の薬学的に許容される滅菌の等張性の水溶液または非水性溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルション、または使用する直前に滅菌の注射可能な溶液もしくは分散に再構成することができる滅菌粉末と組み合わせて含み得る。本開示の医薬組成物に使用することができる適切な水性および非水性キャリアの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料を使用することによって、分散の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性物質を使用することによって維持することができる。
組成物および製剤は、所望であれば、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得る包装またはディスペンサーデバイスとして提示することができる。包装は、例えば、金属またはブリスター包装などのプラスチック箔を含み得る。包装またはディスペンサーデバイスに投与の指示を付随させることができる。
さらに、組成物は、標的組織部位に送達するための形態で封入または注射することができる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、１つまたは複数の治療用化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を標的組織部位に送達し得、成長中の組織のための構造を提供し得、最適には体内に再吸収され得るマトリックスを含み得る。例えば、マトリックスは、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストのゆっくりとした放出をもたらすことができる。このようなマトリックスは、他の埋め込み型医学的適用に現在使用されている材料で形成することができる。
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容的外観および界面特性に基づく。対象の組成物の特定の適用により、適切な製剤が規定される。組成物のための潜在的なマトリックスは、生分解性であり、かつ既知組成の硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ酸無水物であり得る。他の潜在的な材料は、例えば、骨または皮膚のコラーゲンなどの、生分解性であり、かつ生物学的に明確に定義されているものである。別のマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリックス構成成分で構成される。他の潜在的なマトリックスは、例えば、焼結したヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックスなどの、非生分解性であり、化学的に定義されるものである。マトリックスは、例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムなど、上記のタイプの材料のいずれかの組み合わせで構成され得る。バイオセラミックスの組成を、例えば、カルシウム－アルミン酸塩－リン酸塩などに変更し、孔径、粒子サイズ、粒子の形状、および生分解性が変更されるように加工することができる。
ある特定の実施形態では、本発明の方法を、経口的に、例えば、それぞれが所定量の作用因子を活性成分として含有する、カプセル剤、カシェ剤、ピル、錠剤、ロゼンジ（風味を付けた基剤、通常はショ糖およびアラビアゴムまたはトラガントを使用する）、粉末、顆粒剤の形態で、または水性もしくは非水性液中溶液もしくは懸濁液として、または水中油もしくは油中水エマルション液として、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはパステル剤（不活性な基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアラビアゴムなどを使用する）ならびに／または口内洗浄剤などとして投与することができる。作用因子は、ボーラス、舐剤またはペースト剤として投与することもできる。
経口投与用の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖剤、粉末、顆粒剤など）では、本発明の１つまたは複数の治療用化合物を、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの１つもしくは複数の薬学的に許容されるキャリア、および／または以下のいずれかと混合することができる：（１）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸など；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／またはアラビアゴムなど；（３）湿潤剤、例えば、グリセロールなど；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなど；（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィンなど；（６）吸収促進剤、例えば、四級アンモニウム化合物など；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなど；（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイト粘土など；（９）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物など；ならびに（１０）着色料。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合では、医薬組成物は、緩衝剤も含み得る。同種の固体組成物を、例えばラクトースまたは乳糖などの賦形剤、ならびに高分子量のポリエチレングリコールなどを使用する軟充填ゼラチンカプセルおよび硬充填ゼラチンカプセル中の増量剤として使用することもできる。
経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられる。液体剤形は、活性成分に加えて、当技術分野で一般に使用される不活性な希釈剤、例えば、水または他の溶媒など、可溶化剤および乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などを含有し得る。経口用組成物は、不活性な希釈剤に加えて、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色料、香料、ならびに防腐剤などのアジュバントも含み得る。
懸濁液は、活性化合物に加えて、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステル、結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガント、ならびにそれらの混合物などの懸濁化剤も含有し得る。
本発明の組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）および分散剤などのアジュバントも含有し得る。微生物による作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることによって確実にすることができる。例えば、糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤も組成物に含めることが望ましい場合がある。さらに、吸収を遅延させる作用因子、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどを含めることにより、注射可能な医薬形態の持続的な吸収をもたらすことができる。
投与量レジメンは、主治医により、本発明の対象の化合物（例えば、ＴβＲＩＩポリペプチド）の作用を改変する様々な因子を考慮して決定されることが理解される。様々な因子としては、これらに限定されないが、患者の年齢、性別、および食事、疾患の重症度、投与時間、および他の臨床的因子が挙げられる。任意選択で、再構成に使用するマトリックスのタイプおよび組成物中の化合物のタイプに応じて投与量を変動させることができる。他の公知の増殖因子を最終的な組成物に添加することも、投与量に影響を及ぼし得る。進行は、骨の成長および／または修復の周期的な評価、例えば、Ｘ線（ＤＥＸＡを含む）、組織形態計測的決定、およびテトラサイクリン標識によってモニタリングすることができる。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストをインビボで産生させるための遺伝子療法も提供する。このような療法は、ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列を上で列挙した障害を有する細胞または組織内に導入することによってその治療効果を達成する。ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列の送達は、キメラウイルスまたはコロイド分散系などの組換え発現ベクターを使用して達成することができる。ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列の治療的送達には、標的化リポソームの使用が好ましい。
本明細書で教示した遺伝子療法に利用することができる様々なウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、好ましくはレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターはマウスまたはトリレトロウイルスの誘導体であることが好ましい。単一の外来遺伝子を挿入することができるレトロウイルスベクターの例としては、これらに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられる。いくつかの追加のレトロウイルスベクターに多数の遺伝子を組み入れることができる。これらのベクターは全て、遺伝子を選択マーカーとして移行するまたは組み入れることができ、したがって、形質導入された細胞を同定し、生成することができる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質を付着させることによって標的特異的にすることができる。好ましい標的化は、抗体を使用することによって達成される。ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするために、特異的なポリヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノムに挿入することまたはウイルス外被に付着させることができることを当業者は認識する。好ましい実施形態では、ベクターは、骨または軟骨を標的化する。
あるいは、組織培養細胞にレトロウイルスの構造遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドを従来のリン酸カルシウムトランスフェクションによって直接トランスフェクトすることができる。次いで、これらの細胞に目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドをトランスフェクトする。得られる細胞は、レトロウイルスベクターを培養培地中に放出する。
ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストポリヌクレオチドの別の標的化送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、巨大分子の複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含めた脂質に基づく系が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボにおいて送達ビヒクルとして有用な人工的な膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンを水性の内部に被包することができ、生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる（例えば、Fraleyら、Trends Biochem. Sci.、６巻：７７頁、１９８１年を参照されたい）。リポソームビヒクルを使用して効率的に遺伝子移入するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Manninoら、Biotechniques、６巻：６８２頁、１９８８年を参照されたい。リポソームの組成物は、通常、リン脂質の組み合わせ、通常、ステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質も使用することができる。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。
リポソームの作製において有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドなどのホスファチジル化合物が挙げられる。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが挙げられる。リポソームの標的化は、例えば、臓器特異性、細胞特異性、および細胞小器官特異性に基づくことも可能であり、当技術分野で公知である。
本開示は、ｐＨ調整するために酸および塩基；ならびにｐＨを狭い範囲内に維持するために緩衝剤を含むように変動させることができる製剤を提供する。
本発明は、ここに概して記載されているが、ただ単に本発明のある特定の実施形態を例示するため含まれ、本発明を限定するものではない以下の実施例を参照することによってより容易に理解されよう。
（実施例１）
ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質の生成
出願人らは、最小限のリンカー（３つのグリシンアミノ酸）を間に有する、ヒトまたはマウスのＦｃドメインに融合されたヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質を構築した。構築物は、それぞれＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃと称される。
ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃをＣＨＯ細胞株からの精製物として下記に示す（配列番号２４）：
Figure 0007264580000024
ＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃタンパク質をＣＨＯ細胞株で発現させた。３つの異なるリーダー配列：（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号２１）、ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号２２）、および（ｉｉｉ）天然：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号２３）について検討した。
選択された形態は、ＴＰＡリーダーを使用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列（配列番号２５）を有する。
Figure 0007264580000025
このポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号２６）によってコードされる。
Figure 0007264580000026
Figure 0007264580000027
ＣＨＯ細胞により生成された材料の、Ｎ末端のシーケンシングにより、－ＧＲＧＥＡＥ（配列番号２７）の主要な配列を明らかにした。とりわけ、文献において報告されている他の構築物は、－ＳＧＲ・・・配列で始まる。
精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーの３つまたはこれ超を、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了させることができた。
ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質はまた、ＨＥＫ２９３細胞内およびＣＯＳ細胞内でも発現された。全ての細胞株および妥当な培養条件に由来する材料は、インビボにおいて筋構築活性を有するタンパク質をもたらしたが、おそらく細胞株の選択および／または培養条件に関連する、効力の変動性も観察された。
本出願人らは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン内に一連の変異を生成し、これらの変異体タンパク質を、細胞外ＡｃｔＲＩＩＢとＦｃドメインとの間の可溶性融合タンパク質として生成した。バックグラウンドのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合物は、配列番号２４の配列を有する。
Ｎ末端およびＣ末端の切断を含む種々の変異を、バックグラウンドのＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃタンパク質に導入した。本明細書に提示したデータに基づくと、これらの構築物は、ＴＰＡリーダーとともに発現させる場合、Ｎ末端のセリンを欠くことが予想される。変異は、ＰＣＲ変異誘発により、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン内に生成した。ＰＣＲの後、フラグメントを、Ｑｉａｇｅｎカラムを介して精製し、ＳｆｏＩおよびＡｇｅＩで消化し、ゲル精製した。ライゲーションすると、ヒトＩｇＧ１との融合物キメラを創出するように、これらのフラグメントを、発現ベクターであるｐＡＩＤ４（ＷＯ２００６／０１２６２７を参照されたい）にライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５アルファへと形質転換させたら、コロニーを採取し、ＤＮＡを単離した。マウス構築物（ｍＦｃ）のために、マウスＩｇＧ２ａで、ヒトＩｇＧ１を置換した。全ての変異体の配列を検証した。
変異体の全ては、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で、一過性のトランスフェクションにより生成した。まとめると、５００ｍｌのスピナー内で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、容量２５０ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中に１ｍｌ当たりの細胞６×１０５個で設定し、一晩にわたり増殖させた。翌日、これらの細胞を、最終ＤＮＡ濃度を０．５ｕｇ／ｍｌとするＤＮＡ：ＰＥＩ（１：１）複合体で処理した。４時間後、２５０ｍｌの培地を添加し、細胞を、７日間にわたり増殖させた。細胞をスピンダウンすることにより馴化培地を採取し、濃縮した。
変異体を、例えば、プロテインＡカラムを含む、様々な技法を使用して精製し、低ｐＨ（３．０）のグリシン緩衝液で溶出させた。中和の後、これらを、ＰＢＳに対して透析した。
変異体はまた、同様な方法により、ＣＨＯ細胞内でも生成した。変異体を、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００８／０９７５４１およびＷＯ２００６／０１２６２７において記載されている、結合アッセイおよび／またはバイオアッセイにおいて調べた。一部の場合には、アッセイを、精製タンパク質ではなく、馴化培地について実施した。ＡｃｔＲＩＩＢの追加のバリエーションについては、米国特許第７，８４２，６６３号において記載されている。
本出願人らは、Ｎ末端およびＣ末端短縮（天然タンパク質配列番号１の残基２５～１３１）を有し、Ｎ末端で天然ＡｃｔＲＩＩＢリーダーを置換するＴＰＡリーダー配列に、およびＣ末端で最小限のリンカー（３つのグリシン残基）を介してヒトＦｃドメインに融合された、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２５－１３１）－ｈＦｃ融合タンパク質を生成した（図１２）。この融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を図１３に示す。本出願人らは、コドンを改変し、最初の形質転換体の発現レベルに実質的な改善を提供したＡｃｔＲＩＩＢ（２５－１３１）－ｈＦｃタンパク質をコードする改変体核酸を見出した（図１４）。
成熟タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する（Ｎ末端はＮ末端シーケンシングによって確認した）（配列番号２８）。
Figure 0007264580000028
アミノ酸１～１０７はＡｃｔＲＩＩＢに由来する。
発現分子は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多くを、任意の順序で含む工程を使用して精製された。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了し得る。
ＡｃｔＲＩＩＢ（２５－１３１）－ｈＦｃおよびその全長対応物ＡｃｔＲＩＩＢ（２０－１３４）－ｈＦｃに対するいくつかのリガンドに対するアフィニティーを、インビトロにおいて、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）装置により評価し、結果を、下記の表にまとめる。Ｋｄ値は、複合体の会合および解離が極めて急速であり、ｋｏｎおよびｋｏｆｆの正確な決定が妨げられるために、定常状態アフィニティーの当てはめにより得た。ＡｃｔＲＩＩＢ（２５－１３１）－ｈＦｃは、アクチビンＡ、アクチビンＢおよびＧＤＦ１１に高アフィニティーで結合した。
Figure 0007264580000029
（実施例２）
ＧＤＦトラップの生成
本出願人らは、以下のようにＧＤＦトラップを構築した。アクチビンＡへの結合を、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンと比べて大幅に低減した（配列番号１内の７９位における、ロイシンからアスパラギン酸への置換の帰結として）、改変ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン（Ｌ７９Ｄ置換を有する配列番号１のアミノ酸２０～１３４）を有するポリペプチドを、間に最小限のリンカー（３つのグリシンアミノ酸）を有する、ヒトＦｃドメインまたはマウスＦｃドメインに融合させた。構築物を、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－Ｆｃと呼ぶ。７９位にアスパラギン酸ではなく、グルタミン酸を有する代替的形態についても、同様に実施した（Ｌ７９Ｅ）。下記の配列番号４４に照らした２２６位において、バリンではなく、アラニンを有する代替的形態もまた、生成し、調べる全ての点において、同等に実施した。７９位におけるアスパラギン酸（配列番号１に照らした；または配列番号２９に照らした６０位）は、下記で二重下線により指し示す。配列番号２９に照らした２２６位におけるバリンもまた、下記で二重下線により指し示す。
ＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０－１３４）－ｈＦｃをＣＨＯ細胞株からの精製物として下記に示す（配列番号２９）。
Figure 0007264580000030
ＧＤＦトラップのＡｃｔＲＩＩＢに由来する部分は、下記（配列番号３０）に示されるアミノ酸配列を有し、この部分は、単量体として使用することもでき、単量体、二量体またはより高次の複合体としての非Ｆｃ融合タンパク質として使用することもできるであろう。
Figure 0007264580000031
ＧＤＦトラップタンパク質をＣＨＯ細胞株で発現させた。３つの異なるリーダー配列：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）、（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、および（ｉｉｉ）天然について検討した。
選択された形態は、ＴＰＡリーダーを使用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列を有する。
Figure 0007264580000032
このポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号３２）によってコードされる。
Figure 0007264580000033
Figure 0007264580000034
精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーの３つまたはこれ超を、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了させることができた。精製スキームの例では、細胞培養培地を、プロテインＡカラムに通し、１５０ｍＭのトリス／ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中で洗浄し、次いで、５０ｍＭのトリス／ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中で洗浄し、０．１Ｍのグリシン、ｐＨ３．０で溶出させる。低ｐＨの溶出物は、ウイルス除去工程として、室温で３０分間にわたり保持する。次いで、溶出物を中和させ、Ｑセファロースイオン交換カラムに通し、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ中で洗浄し、１５０ｍＭ～３００ｍＭの間の濃度のＮａＣｌを伴う、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０中で溶出させる。次いで、溶出物を、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１．１Ｍの硫酸アンモニウムへと交換し、フェニルセファロースカラムに通し、洗浄し、１５０～３００ｍＭの間で硫酸アンモニウムを伴う、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０で溶出させる。使用のために、溶出物を透析し、濾過する。
追加のＧＤＦトラップ（アクチビンＡへの結合の、ミオスタチンまたはＧＤＦ１１への結合と比べた比を低減するように改変されたＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質）は、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００８／０９７５４１およびＷＯ２００６／０１２６２７において記載されている。
（実施例３）
ＧＤＦ－１１およびアクチビンに媒介されるシグナル伝達についてのバイオアッセイ
Ａ－２０４レポーター遺伝子アッセイを使用して、ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃタンパク質およびＧＤＦトラップの、ＧＤＦ－１１およびアクチビンＡによるシグナル伝達に対する効果を評価した。細胞株：ヒト横紋筋肉腫（筋肉に由来する）。レポーターベクター：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８年、ＥＭＢＯ、１７巻：３０９１～３１００頁において記載されている）。ＣＡＧＡ１２モチーフは、ＴＧＦベータ応答性遺伝子（例えば、ＰＡＩ－１遺伝子）内に存在するので、このベクターは、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３を介してシグナル伝達する因子のために一般的に使用される。
１日目：Ａ－２０４細胞を、４８ウェルプレートに分ける。
２日目：Ａ－２０４細胞に、１０ｕｇのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２またはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０ｕｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１μｇ）およびＦｕｇｅｎｅをトランスフェクトする。
３日目：因子（培地＋０．１％のＢＳＡ中に希釈された）を添加する。細胞に添加する前に、１時間にわたり、阻害剤を、因子と共に、あらかじめインキュベートする必要がある。６時間後、細胞を、ＰＢＳですすぎ、溶解させた。
これに続いて、ルシフェラーゼアッセイを行う。いかなる阻害剤も存在しない下で、アクチビンＡは、レポーター遺伝子発現に対する１０倍の刺激およびＥＤ５０約２ｎｇ／ｍｌを示した。ＧＤＦ－１１：１６倍の刺激、ＥＤ５０：約１．５ｎｇ／ｍｌを示した。
このアッセイでは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１３４）は、アクチビンＡ、ＧＤＦ－８、およびＧＤＦ－１１の活性の強力な阻害剤である。下記で記載される、ＡｃｔＲＩＩＢ改変体もまた、このアッセイで調べた。
（実施例４）
ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ改変体の細胞ベースの活性
ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃタンパク質およびＧＤＦトラップの活性を、上記で記載した細胞ベースのアッセイで調べた。結果を、下記の表にまとめる。一部の改変体を、異なるＣ末端切断構築物で調べた。上記で論じた通り、５または１５アミノ酸の切断は、活性の低減を引き起こした。ＧＤＦトラップ（Ｌ７９Ｄ改変体およびＬ７９Ｅ改変体）は、ＧＤＦ－１１の野生型阻害をほとんど保持しながら、アクチビンＡ阻害の実質的な喪失を示した。
Figure 0007264580000035
いくつかの改変体を、ラットにおける血清中半減期について評価した。ＡｃｔＲＩＩＢ（２０－１３４）－Ｆｃは、およそ７０時間の血清中半減期を有する。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ａ２４Ｎ ２０－１３４）－Ｆｃは、およそ１００～１５０時間の血清中半減期を有する。上記で試験した改変体はいずれもＧＤＦトラップ分子と組み合わせることができる。
（実施例５）
ＧＤＦ－１１およびアクチビンＡへの結合
ある特定のＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃタンパク質およびＧＤＦトラップの、リガンドへの結合について、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイで調べた。
ＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ改変体または野生型タンパク質を、抗ｈＦｃ抗体を使用するシステム上に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流した。結果を、下記の表にまとめる。
Figure 0007264580000036
無細胞アッセイにおいて得られたこれらのデータにより、細胞ベースのアッセイによるデータが確認され、Ａ２４Ｎ改変体は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０～１３４）－ｈＦｃ分子のリガンド結合活性と同様なリガンド結合活性を保持し、Ｌ７９Ｄ分子またはＬ７９Ｅ分子は、ミオスタチンおよびＧＤＦ１１への結合を保持するが、アクチビンＡへの結合の顕著な減殺（定量化不可能な結合）を示すことが実証される。
他の改変体も、ＷＯ２００６／０１２６２７（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）で報告される通りに生成され、調べられている。例えば、デバイスにカップリングさせたリガンドを使用し、カップリングさせたリガンド上に受容体を流す、５９～６０頁を参照されたい。とりわけ、Ｋ７４Ｙ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ（および、おそらく、Ｋ７４Ｌなど、Ｋ７４における他の疎水性置換）およびＤ８０Ｉは、アクチビンＡ（ＡｃｔＡ）への結合の、ＧＤＦ１１への結合に対する比の、野生型Ｋ７４分子と比べた減少を引き起こす。これらの改変体に関するデータの表を、下記に再掲載する。
Figure 0007264580000037
Figure 0007264580000038
（実施例６）
短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップの生成
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０－１３４）－ｈＦｃと称されるＧＤＦトラップを、Ｎ末端における、ＴＰＡリーダーの、ロイシンからアスパラギン酸への置換（配列番号１の残基７９における）を含有するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１の残基２０～１３４）への融合と、Ｃ末端における、ヒトＦｃドメインの、最小限のリンカー（３つのグリシン残基）による融合とにより生成した（図３）。この融合タンパク質に対応するヌクレオチド配列を図４に示す。
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃと称される短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップを、Ｎ末端における、ＴＰＡリーダーの、ロイシンからアスパラギン酸への置換（配列番号１の残基７９における）を含有する短縮型細胞外ドメイン（配列番号１の残基２５～１３１）への融合と、Ｃ末端における、ヒトＦｃドメインの、最小限のリンカー（３つのグリシン残基）による融合とにより生成した（図５、配列番号５０）。この融合タンパク質をコードする１つのヌクレオチド配列を図６（配列番号５１）に示し、正確に同じ融合タンパク質をコードする代替ヌクレオチド配列を図９（配列番号５５）に示す。
（実施例７）
二重短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップによる選択的なリガンド結合
ＧＤＦトラップおよび他のＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃタンパク質のいくつかのリガンドに対するアフィニティーを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）装置を用いてインビトロで評価した。結果を下記の表に要約する。Ｋｄ値は、複合体の会合および解離が極めて急速であり、それにより、ｋｏｎおよびｋｏｆｆの正確な決定が妨げられたので、定常状態アフィニティーの当てはめにより得た。
Figure 0007264580000039
短縮型細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップである、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５～１３１）－ｈＦｃは、より長い改変体である、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０～１３４）－ｈＦｃにより示されるリガンドへの選択性に匹敵するかまたはこれを凌駕し、アクチビンＡへの結合の顕著な喪失、アクチビンＢへの結合の部分的喪失、およびＬ７９Ｄ置換を欠くＡｃｔＲＩＩＢ－ｈＦｃ対応物と比較してほぼ完全なＧＤＦ１１への結合の保持を伴った。短縮単独（Ｌ７９Ｄ置換を有さない）では、本実施例で示されるリガンド間の選択性を変更しなかった［ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９ ２５～１３１）－ｈＦｃを、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９ ２０～１３４）－ｈＦｃと比較する］ことに注目されたい。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５－１３１）－ｈＦｃもＳｍａｄ２／３シグナル伝達リガンドＧＤＦ８ならびにＳｍａｄ１／５／８リガンドＢＭＰ６およびＢＭＰ１０への強いから中程度の結合を保持している。
（実施例８）
ＡｃｔＲＩＩＢ５由来ＧＤＦトラップ
他の研究者らも、ＡｃｔＲＩＩＢの膜貫通ドメインを含むエクソン４が、異なるＣ末端配列により置きかえられた、ＡｃｔＲＩＩＢの代替的な可溶性形態（ＡｃｔＲＩＩＢ５と表記される）について報告している（例えば、ＷＯ２００７／０５３７７５を参照されたい）。
リーダーを含まない天然ヒトＡｃｔＲＩＩＢ５の配列は以下の通りである。
Figure 0007264580000040
記載される通りに、ロイシンからアスパラギン酸への置換、または他の酸性置換を、天然の７９位（下線を付す）に施して、以下の配列を有する、改変体ＡｃｔＲＩＩＢ５（Ｌ７９Ｄ）を構築することができる。
Figure 0007264580000041
この改変体を、ＴＧＧＧリンカー（一重下線）により、ヒトＦｃ（二重下線）に接続して、以下の配列を有するヒトＡｃｔＲＩＩＢ５（Ｌ７９Ｄ）－ｈＦｃ融合タンパク質を生成することができる。
Figure 0007264580000042
この構築物はＣＨＯ細胞において発現され得る。
（実施例９）
ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ動物モデルにおけるＧＤＦトラップの効果
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５－１３１）－Ｆｃの骨髄線維症に対する効果を理解するために、トランスジェニックＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ変異体マウス［Xingら（２００８年）Blood、１１１巻：５１０９～５１１７頁に記載されているＡ株］を使用した。
骨髄線維症疾患の発症および進行を理解するために、種々の年齢のＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆマウスにおける全血球計算値および線維症の程度を、対照動物（年齢適合野生型マウス）から得られたデータと比較した。全ての年齢のＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆマウスにおいて野生型と比較して赤血球（ＲＢＣ）および血小板レベルが上昇し、２～５カ月齢の変異動物においてレベルが増加し、その後、８～１２カ月齢で進行性に低下する傾向があった。約５カ月齢からＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆマウスの骨髄において線維症が検出可能であり、これは、年齢と共に悪化した。ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆマウスはまた、約３～４カ月齢で脾腫も示し、これも年齢と共に悪化した。
ＧＤＦトラップ試験のために、後期骨髄線維症に対応する１２カ月齢時に処置を開始した。マウスを２つの群：ｉ）ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆマウスを、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５－１３１）－Ｆｃを用い、１０ｍｇ／ｋｇ、週２回の投薬スケジュールで処置する；およびｉｉ）ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆマウスをビヒクル（ＴＢＳ）で週２回処置する（すなわち、対照動物）のうちの１つに入れた。１０週間後、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５－１３１）－Ｆｃで処置した動物は、対照動物と比較して脾臓サイズの縮小（－１２．５％）を示した。この知見と一致して、病理組織検査により、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５－１３１）－Ｆｃで処置したマウスの脾臓での髄外造血が対照動物と比較して低下したことが明らかになった。病理組織検査により、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５－１３１）－Ｆｃで処置したマウスにおける骨髄線維症（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）が対照動物と比較して低下したことも示された。
したがって、ＧＤＦトラップを用いた処置は、このＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆモデルにおける骨髄線維症の種々の合併症を改善することに関して、特に、脾腫、髄外造血、および線維症を低下することに関して、有効である。したがって、これらのデータは、骨髄線維症を処置するためにＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを使用することができることを示す。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、例えば、脾腫の低下、髄外造血の低下、赤血球レベルの増加、および／または線維症（例えば、骨髄線維症（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｉｂｒｏｓｉｓ））の低下を含め、骨髄線維症の種々の合併症の処置において特に有用であり得る。
（実施例１０）
ルクソリチニブで処置した動物におけるＧＤＦトラップの効果
ルクソリチニブは、中間または高リスクの骨髄線維症の処置に関して承認されたヤヌスキナーゼ阻害剤である。具体的には、ルクソリチニブは、骨髄線維症患者における脾臓サイズの縮小および脾腫に伴う症状の改善において有意な効果を示す。しかし、ルクソリチニブを用いて処置された患者において、例えば、貧血を含めた種々の血液学的副作用が観察されている。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５－１３１）－Ｆｃによる処置の、ルクソリチニブで処置したマウスにおける種々の血液学的パラメータに対する効果を理解するために、９カ月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。
この試験のために、６～７カ月齢で処置を開始した。マウスを４つの群：ｉ）ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５－１３１）－Ｆｃを１０ｍｇ／ｋｇ、週２回の投薬スケジュールで用いた処置；ｉｉ）ルクソリチニブを６０ｍｇ／ｋｇ、１日２回の投薬スケジュールで用いた処置；ｉｉｉ）ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５－１３１）－Ｆｃを１０ｍｇ／ｋｇ、週２回の投薬スケジュールで用い、ルクソリチニブを６０ｍｇ／ｋｇ、１日２回の投薬スケジュールで用いた処置；およびｉｖ）ビヒクル（ＴＢＳ）を週２回用いた処置（すなわち、対照動物）のうちの１つに入れた。４週間の処置後、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５－１３１）－Ｆｃマウスでは、対照（ＴＢＳで処置した）マウスと比較して、赤血球レベルの増加（約１５％）およびヘモグロビンレベルの増加（約１３％）が観察され、これにより、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５－１３１）－ＦｃによりＣ５７ＢＬ／６マウスにおける赤血球生成の活性が増大することが実証される。対照的に、ルクソリチニブによる処置により、対照動物と比較して、赤血球レベルの低下（約４％）およびヘモグロビンレベルの低下（約４％）がもたらされた。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５－１３１）－Ｆｃとルクソリチニブの共同で処置したマウスは、対照動物と比較して、赤血球レベルの増加（約８％）およびヘモグロビンレベルの増加（約５％）を示した。
これらのデータは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２５－１３１）－Ｆｃが、正常な健康なマウスにおいて、ルクソリチニブにより誘導される貧血を反転できることを実証する。したがって、データは、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、例えば、１つまたは複数のヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置されていたまたは処置を受けている骨髄線維症患者を含めた種々の患者集団において、ヤヌスキナーゼ阻害剤により誘導される貧血の緩和において有用であり得ることを示唆する。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストは、例えば、１つまたは複数のヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置されていたまたは処置を受けている骨髄線維症患者、特に、貧血を示す患者を含めた種々の患者集団を処置するために、ヤヌスキナーゼ阻害剤との併用療法の一部分として有用であり得る。
（参考としての援用）
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が、具体的かつ個別に参考として援用されると示されるかのように、その全体が本明細書に参考として援用される。
本主題の特定の実施形態が考察されてきたが、上記明細書は、例示的であり、限定的なものではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を精査すれば、多くの変更が当業者に明らかとなる。本発明の完全な範囲は、その等価物の完全な範囲と共に特許請求の範囲を、そして、このような変更と共に明細書を参照することによって決定されるべきである。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
骨髄線維症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するための方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することを含む、方法。
（項目２）
骨髄線維症の１つまたは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するための方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することを含む、方法。
（項目３）
骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するための方法であって、それを必要とする患者に、ａ）ヤヌスキナーゼ阻害剤；およびｂ）ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することを含み、前記ヤヌスキナーゼ阻害剤およびＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが有効量で投与される、方法。
（項目４）
前記骨髄線維症の１つまたは複数の合併症が、無効造血、貧血、炎症、線維症（例えば、骨髄線維症（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、脾線維症、および肝線維症）、汎血球減少、血小板減少症、髄外造血（例えば、脾髄外造血、肝髄外造血、肺髄外造血、およびリンパ性髄外造血）、肝腫大、脾腫、変形赤血球症、疲労、体重減少、寝汗、発熱、そう痒、骨痛、早期満腹、腹痛または不快感、関節痛、筋痛、異常知覚、悪液質、脾梗塞、骨硬化症、骨骨髄線維症、および出血からなる群から選択される、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
骨髄線維症（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、脾線維症、肝線維症、肺線維症、およびリンパ節線維症の１つまたは複数を低下させる、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
脾腫を低下させる、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
肝腫大を低下させる、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
脾臓、肝臓、肺、リンパ節、および骨髄からなる群から選択される臓器／組織における炎症を低下させる、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
脾臓、肝臓、肺、およびリンパ節からなる群から選択される臓器／組織のサイズおよび／または重量を低下させる、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
髄外造血を低下させる、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
脾臓（脾髄外造血）、肝臓（肝髄外造血）、肺（肺髄外造血）、およびリンパ液（リンパ性髄外造血）からなる群から選択される臓器または組織における髄外造血を低下させる、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記患者における赤血球レベルを増加させる、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記患者におけるヘモグロビンレベルを増加させる、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記患者が、貧血を有する、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記貧血を処置する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記患者に、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストによる処置の開始前に１回または複数回の血液細胞輸血が施されている、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記患者が、血液細胞輸血依存性である、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
血液細胞輸血負荷を低下させる、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
血液細胞輸血を、４～８週間にわたって、前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストによる処置の開始前の同等の時間と比べて約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％より大きく低下させる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
血液細胞輸血を、４～８週間にわたって、前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストによる処置の開始前の同等の時間と比べて、約５０％より大きく低下させる、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
鉄過剰負荷を低下させる、項目１から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
肝臓、脾臓、および心臓からなる群から選択される１つまたは複数の臓器／組織中の鉄含有量を低下させる、項目１６に記載の方法。
（項目２３）
前記患者が、原発性骨髄線維症を有する、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記患者が、真性赤血球増加症後骨髄線維症を有する、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記患者が、本態性血小板血症後骨髄線維症を有する、項目１から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記患者が、国際予後スコア化システム（ＩＰＳＳ）による低リスク、中間１リスク、中間２リスク、または高リスクの骨髄線維症を有する、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記患者が、動的ＩＰＳＳ（ＤＩＰＳＳ）による低リスク、中間１リスク、中間２リスク、または高リスクの骨髄線維症を有する、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記患者が、ＤＩＰＳＳ－ｐｌｕｓによる低リスク、中間１リスク、中間２リスク、または高リスクの骨髄線維症を有する、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
低リスクから中間１リスク、中間１リスクから中間２リスク、または中間２リスクから高リスクの骨髄線維症への骨髄線維症リスクの進行を予防または遅延する、項目２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
高リスクから中間２リスク、中間２リスクから中間１リスク、または中間１リスクから低リスクの骨髄線維症への骨髄線維症リスクの後退を促進または増大する、項目２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記骨髄線維症が、ＪＡＫ２ ４６／１ハプロタイプのヌル欠損、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＥＺＨ２、ＳＲＳＦ２、ＡＳＸＬ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＴＹＫ２、ＭＰＬ、ＣＡＬＲ、ＣＡＬＲ＋ＡＳＸＬ１－、ＣＡＬＲ－ＡＳＫＬ１＋、ＣＡＬＲ＋ＡＳＫＬ１＋、ＣＡＬＲ－ＡＳＫＬ１－、ＴＥＴ２、ＴＨＰＯ、およびＬＮＫからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の１つまたは複数の変異に関連する、項目１から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記骨髄線維症が、ＪＡＫ２の１つまたは複数の変異に関連する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記ＪＡＫ２変異が、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記骨髄線維症が、血清ＩＬ－８レベルの増加、血清ＩＬ－２Ｒレベルの増加、および遊離軽鎖レベルの増加からなる群から選択される１つまたは複数の血清マーカーの上昇に関連する、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記患者が、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置されている、項目１から３および５から３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記患者が、ヤヌスキナーゼ阻害剤に不寛容である、項目１から３および５から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記患者が、ヤヌスキナーゼ阻害剤に対して不十分な応答を有する、項目１から３および５から３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、前記ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いた処置の前に投与される、項目４または３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、前記ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いた処置の後に投与される、項目４または３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、前記ヤヌスキナーゼ阻害剤と同時に投与される、項目４または３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記ヤヌスキナーゼ阻害剤が、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、およびＪＡＫ３からなる群から選択されるヤヌスキナーゼのうちの１つまたは複数を阻害する、項目４および３５から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記ヤヌスキナーゼ阻害剤が、細胞ベースのアッセイにおいてＪＡＫ１、ＪＡＫ２、およびＪＡＫ３の１つまたは複数のシグナル伝達を阻害する、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ヤヌスキナーゼ阻害剤が、ルクソリチニブ、フェドラチニブ（ＳＡＲ３０２５０３）、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、パクリチニブ、レスタウルチニブ、ＡＺＤ－１４８０、ＢＭＳ－９１１５４３、ＮＳ－０１８、ＬＹ２７８４５４４、ＳＥＰ－７０１、ＸＬ０１９、およびＡＴ－９２８３からなる群から選択される、項目３５から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記ヤヌスキナーゼ阻害剤が、ルクソリチニブである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記患者が、１つまたは複数の支持療法または活性作用因子をさらに投与される、項目１から４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記１つまたは複数の支持療法または活性作用因子が、輸血（全血または赤血球輸血）、鉄キレーター（例えば、デフェロキサミン、デフェリプロンおよびデフェラシロクス）、コルチコステロイド、プレドニゾン、ＥＳＡ（例えば、エリスロポエチン、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、ダルベポエチンアルファ、およびメトキシポリエチレングリコール－エポエチンベータ）、アンドロゲン、ダナゾール、サリドマイド、レナリドミド、細胞減少剤、ヒドロキシウレア、ブスルファン、メルファラン、クラドリビン、脾摘出術、照射療法、アスピリン、ポマリドミド、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン、シロリムス、デフォロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＰＫ１－５８７、ＩＮＫ１２８、ＡＺＤ８０５５、およびＡＺＤ２０１４）、およびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（例えば、ギビノスタット、パノビノスタット、およびプラシノスタット）からなる群から選択される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記患者が、ヒドロキシウレアをさらに投与される、または以前にヒドロキシウレアを用いて処置されている、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記患者が、ヒドロキシウレアに不寛容であるかまたはヒドロキシウレアに対して不十分な応答を有する、項目１から４５および４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者における赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルを増加させるための方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することを含む、方法。
（項目５０）
前記患者が、貧血を有する、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
貧血を処置する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置された患者における貧血を処置するための方法であって、それを必要とする患者に有効量のＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストを投与することを含む、方法。
（項目５３）
前記患者における赤血球および／またはヘモグロビンレベルを増加させる、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記患者に、ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストによる処置の開始前に１回または複数回の血液細胞輸血が施されている、項目４９から５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記患者が、血液細胞輸血依存性である、項目４９から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
血液細胞輸血負荷を低下させる、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
血液細胞輸血を、４～８週間にわたって、前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストによる処置の開始前の同等の時間と比べて約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％より大きく低下させる、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
血液細胞輸血を、４～８週間にわたって、前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストによる処置の開始前の同等の時間と比べて約５０％より大きく低下させる、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
鉄過剰負荷を低下させる、項目４９から５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
肝臓、脾臓、および心臓からなる群から選択される１つまたは複数の臓器／組織中の鉄含有量を低下させる、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、前記ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いた処置の前に投与される、項目４９から６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、前記ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いた処置の後に投与される、項目４９から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、前記ヤヌスキナーゼ阻害剤と同時に投与される、項目４９から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記ヤヌスキナーゼ阻害剤が、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、およびＪＡＫ３からなる群から選択されるヤヌスキナーゼのうちの１つまたは複数を阻害する、項目４９から６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記ヤヌスキナーゼ阻害剤が、細胞ベースのアッセイにおいてＪＡＫ１、ＪＡＫ２、およびＪＡＫ３の１つまたは複数のシグナル伝達を阻害する、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記ヤヌスキナーゼ阻害剤が、ルクソリチニブ、フェドラチニブ（ＳＡＲ３０２５０３）、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、パクリチニブ、レスタウルチニブ、ＡＺＤ－１４８０、ＢＭＳ－９１１５４３、ＮＳ－０１８、ＬＹ２７８４５４４、ＳＥＰ－７０１、ＸＬ０１９、およびＡＴ－９２８３からなる群から選択される、項目４９から６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記ヤヌスキナーゼ阻害剤が、ルクソリチニブである、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである、項目１から６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、
ａ）配列番号１のアミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９のいずれか１つに対応する残基で始まり、配列番号１のアミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４のいずれか１つに対応する残基で終わる配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号１のアミノ酸２９～１０９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ）配列番号１のアミノ酸２５～１３１と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ）配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ）配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｆ）配列番号４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｇ）配列番号５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｈ）配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉ）配列番号３０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｊ）配列番号５４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記ポリペプチドが、配列番号１の７９位に対応するアミノ酸位置に酸性アミノ酸を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記ポリペプチドが、配列番号１の７９位に対応するアミノ酸位置にＤを含む、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記ポリペプチドが、配列番号１の７９位に対応するアミノ酸位置にＥを含む、項目７０に記載の方法。
（項目７３）
前記ポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃドメインを含む融合タンパク質である、項目６８から７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、ＩｇＧ１のＦｃドメインに由来する、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、配列番号９～１３のいずれか１つと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢドメインと前記免疫グロブリンＦｃドメインの間に位置するリンカードメインをさらに含む、項目７３から７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記リンカードメインが、配列番号１４～２０のいずれか１つに対応するアミノ酸配列である、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記ポリペプチドが、
ａ）配列番号２４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ）配列番号２８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ）配列番号２９のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ）配列番号３１のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｆ）配列番号４５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｇ）配列番号５０のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｈ）配列番号５３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｉ）配列番号５８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩＢ－Ｆｃ融合タンパク質である、項目７３に記載の方法。
（項目７９）
前記ポリペプチドが、配列番号１の７９位に対応するアミノ酸位置に酸性アミノ酸を含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記ポリペプチドが、配列番号１の７９位に対応するアミノ酸位置にＤを含む、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記ポリペプチドが、配列番号１の７９位に対応するアミノ酸位置にＥを含む、項目７９に記載の方法。
（項目８２）
前記ポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、および脂質部分に結合体化したアミノ酸から選択される、１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む、項目６８から８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記ポリペプチドが、グリコシル化されており、かつ哺乳動物グリコシル化パターンを有する、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記ポリペプチドが、グリコシル化されており、かつチャイニーズハムスター卵巣細胞株から得ることができるグリコシル化パターンを有する、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記ポリペプチドが、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドに結合する、項目６８から８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
前記ポリペプチドが、アクチビンＡに結合する、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記ポリペプチドが、アクチビンＢに結合する、項目８５または８６に記載の方法。
（項目８８）
前記ポリペプチドが、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０からなる群から選択される１つまたは複数のリガンドのシグナル伝達を阻害する、項目６８から６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
前記ポリペプチドが、アクチビンＡのシグナル伝達を阻害する、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記ポリペプチドが、アクチビンＢのシグナル伝達を阻害する、項目８８または８９に記載の方法。
（項目９１）
前記ポリペプチドが、細胞ベースのアッセイにおいて前記１つまたは複数のリガンドのシグナル伝達を阻害する、項目８８から９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、抗体または抗体の組み合わせである、項目１から６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数に結合する抗体または抗体の組み合わせである、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記抗体または抗体の組み合わせが、少なくともアクチビンＡに結合する、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記抗体または抗体の組み合わせが、少なくともアクチビンＢに結合する、項目９３または９４に記載の方法。
（項目９６）
前記抗体が、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数のシグナル伝達を阻害する、項目９２から９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記抗体または抗体の組み合わせが、細胞ベースのアッセイにおいて前記１つまたは複数のシグナル伝達を阻害する、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数に結合する多特異性抗体または多特異性抗体の組み合わせである、項目９２に記載の方法。
（項目９９）
前記多特異性抗体または多特異性抗体の組み合わせが、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数のシグナル伝達を阻害する、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
多特異性抗体または多特異性抗体の組み合わせが、細胞ベースのアッセイにおいて前記１つまたは複数のシグナル伝達を阻害する、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記抗体が、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、項目９２から１００のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記抗体が、単鎖抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖ダイアボディ、タンデムな単鎖Ｆｖフラグメント、タンデムな単鎖ダイアボディ、または単鎖ダイアボディおよび免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも一部分を含む融合タンパク質である、項目９２から１０１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数の小分子阻害剤である、項目１から６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記小分子阻害剤が、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数のシグナル伝達を阻害する、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数の核酸阻害剤である、項目１から６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
前記核酸阻害剤が、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７、アクチビン、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＧＤＦ３、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ１０の１つまたは複数のシグナル伝達を阻害する、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、フォリスタチンポリペプチドである、項目１から６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０８）
前記フォリスタチンポリペプチドが、配列番号６３のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
前記フォリスタチンポリペプチドが、配列番号６４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１０７に記載の方法。
（項目１１０）
前記フォリスタチンポリペプチドが、配列番号６５のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１０７に記載の方法。
（項目１１１）
前記フォリスタチンポリペプチドが、配列番号６６のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１０７に記載の方法。
（項目１１２）
前記フォリスタチンポリペプチドが、配列番号６７のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１０７に記載の方法。
（項目１１３）
前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストが、ＦＬＲＧポリペプチドである、項目１から６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
前記ＦＬＲＧポリペプチドが、配列番号６８のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１１３に記載の方法。

Claims (17)

  1. ルクソリチニブ、フェドラチニブ（ＳＡＲ３０２５０３）、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、パクリチニブ、レスタウルチニブ、ＡＺＤ－１４８０、ＢＭＳ－９１１５４３、ＮＳ－０１８、ＬＹ２７８４５４４、ＳＥＰ－７０１、ＸＬ０１９、およびＡＴ－９２８３からなる群から選択されるヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置されている患者において、赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルを増加させるための、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃドメインを含む有効量の可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド融合タンパク質を含む組成物であって、前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸２５～１３１の配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号１の７９位に対応するアミノ酸位置に酸性アミノ酸Ｄを含み（ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ）２５～１３１）、前記ポリペプチドが、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８からなる群から選択される１つ以上のリガンドに結合する、組成物。
  2. 患者において、骨髄線維症または骨髄線維症の１つもしくは複数の合併症の進行速度および／または重症度を処置、予防、または低減するための組合せ物であって、前記組合せ物が、ａ）ルクソリチニブ、フェドラチニブ（ＳＡＲ３０２５０３）、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、パクリチニブ、レスタウルチニブ、ＡＺＤ－１４８０、ＢＭＳ－９１１５４３、ＮＳ－０１８、ＬＹ２７８４５４４、ＳＥＰ－７０１、ＸＬ０１９、およびＡＴ－９２８３からなる群から選択されるヤヌスキナーゼ阻害剤；およびｂ）ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド融合タンパク質を含み、前記ヤヌスキナーゼ阻害剤およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド融合タンパク質が有効量で投与されるものであり、前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸２５～１３１の配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号１の７９位に対応するアミノ酸位置に酸性アミノ酸Ｄを含み（ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ）２５～１３１）、前記ポリペプチドが、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８からなる群から選択される１つ以上のリガンドに結合する、組合せ物。
  3. 前記組成物または前記組合せ物が、骨髄線維症（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、脾線維症、肝線維症、肺線維症、およびリンパ節線維症の１つまたは複数を低下させる、請求項１に記載の組成物または請求項２に記載の組合せ物。
  4. 前記組合せ物が、前記患者における赤血球レベルを増加させる、かつ／または前記患者におけるヘモグロビンレベルを増加させる、請求項２に記載の組合せ物。
  5. 前記患者が、貧血を有し、前記組成物または前記組合せ物が前記貧血を処置する、請求項１または３に記載の組成物または請求項２または４のいずれか一項に記載の組合せ物。
  6. 前記患者に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドによる処置の開始前に１回または複数回の血液細胞輸血が施されている、かつ／または前記患者が、血液細胞輸血依存性であり；前記使用のための組成物が、血液細胞輸血負荷を、４～８週間にわたって、前記ＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニストによる処置の開始前の同等の時間と比べて約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％より大きく低下させる、請求項１、３および５のいずれか一項に記載の組成物または請求項２から５のいずれか一項に記載の組合せ物。
  7. 前記患者が、原発性骨髄線維症、真性赤血球増加症後骨髄線維症、および／または本態性血小板血症後骨髄線維症を有する、請求項１、３および５から６のいずれか一項に記載の組成物または請求項２から６のいずれか一項に記載の組合せ物。
  8. 前記骨髄線維症が、ＪＡＫ２の１つまたは複数の変異に関連する、請求項２に記載の組合せ物。
  9. 前記ＪＡＫ２変異が、ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆである、請求項８に記載の組合せ物。
  10. 前記患者が、ヤヌスキナーゼ阻害剤を用いて処置されている、ヤヌスキナーゼ阻害剤に不寛容である、かつ／またはヤヌスキナーゼ阻害剤に対して不十分な応答を有する、請求項１、３および５から７のいずれか一項に記載の組成物または請求項２から９のいずれか一項に記載の組合せ物。
  11. 前記ヤヌスキナーゼ阻害剤が、フェドラチニブである、請求項１、３、５から７および１０のいずれか一項に記載の組成物または請求項２から１０のいずれか一項に記載の組合せ物。
  12. 前記ヤヌスキナーゼ阻害剤が、ルクソリチニブである、請求項１、３、５から７および１０のいずれか一項に記載の組成物または請求項２から１０のいずれか一項に記載の組合せ物。
  13. 前記患者が、ヒドロキシウレアをさらに投与される、以前にヒドロキシウレアを用いて処置されている、ヒドロキシウレアに不寛容である、かつ／またはヒドロキシウレアに対して不十分な応答を有する、請求項１、３、５から７および１０から１２のいずれか一項に記載の組成物または請求項２から１２のいずれか一項に記載の組合せ物。
  14. 前記免疫グロブリンＦｃドメインが、ＩｇＧ１のＦｃドメインに由来し、前記融合タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと前記免疫グロブリンＦｃドメインの間に位置するリンカードメインをさらに含む、請求項１、３、５から７および１０から１３のいずれか一項に記載の組成物または請求項２から１３のいずれか一項に記載の組合せ物。
  15. 前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、配列番号５３のアミノ酸配列を含む、請求項１、３、５から７および１０から１４のいずれか一項に記載の組成物または請求項２から１４のいずれか一項に記載の組合せ物。
  16. 前記ヤヌスキナーゼ阻害剤がフェドラチニブである、請求項１、３、５から７および１０から１５のいずれか一項に記載の組成物または請求項２から１５のいずれか一項に記載の組合せ物。
  17. 前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド融合タンパク質およびヤヌスキナーゼ阻害剤が、別々の組成物中にある、請求項１、３、５から７および１０から１６のいずれか一項に記載の組成物。
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