KR20180096645A - 눈 질환의 치료 방법 - Google Patents

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KR20180096645A
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매튜 엘. 셔먼
케네스 엠. 애띠
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악셀레론 파마 인코포레이티드
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Abstract

필요로 하는 환자들의 시력을 증가시키기 위한 그리고 눈 혈관 질환들을 치료하기 위한 조성물 및 방법들이 본 출원에 개시되어 있다.

Description

눈 질환의 치료 방법
관련 출원들에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 11월 23일 출원된 미국 가특허출원 제 62/258,934에 대한 우선권의 이익을 주장한다. 전술한 출원의 명세서 전문은 본 출원에 참고로 포함된다.
발명의 배경
가장 대사적으로 활성인 조직들 중 하나인 눈의 구조적이고 기능적인 통합성은 혈액으로부터 규칙적인 산소 공급 및 영양소분들에 따라 달라진다 [Suk-Yee 외. (2012) Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2012:1-10]. 이러한 높은 대사 요구량을 충족시키기 위하여, 눈은 몇 가지 구조적으로 그리고 기능적으로 구별되는 혈관상(vascular bed)들을 내포하는데, 이러한 혈관상들은 시각 유지에 중요한 눈의 구성요소들에 산소 및 영양소를 제공한다 [Kiel J.W. (2010) The Ocular Circulation. San Rafael (CA) Morgan & Claypool Life Sciences, Chapter 2, Anatomy]. 혈관상들은 각각 망막의 내부 및 외부 부분들을 공급하는 망막 및 맥락막 혈관구조 및 각막의 주변부에 위치한 윤부 혈관을 포함한다. 눈의 정상적인 혈관 구조 및/또는 기능을 손상시키는 부상 및 질병들, 특히 허혈 및 혈관 합병증, 가령, 혈관신생, 혈관 누출, 및 혈관 폐색과 관련된 질병들은 시각 손상 및 실명을 초래하는 원인들 중 하나이다 [Kaur 외. (2008) Clinical Ophthalmology 2(4):879-999]. 이러한 부상 및 질병들은 종종 눈 내부에서 저산소증을 생성하고 및/또는 산화적 스트레스를 증가 (예컨대, 활성 산소종의 수준 증가)시키는 결과를 가져오며, 이는 망막 및 안구 신경에 특히 손상을 줄 수 있다. 따라서, 많은 허혈 및 미세혈관 기능부전 질환들에서, 시각 상실은 망막 손상, 시신경 손상, 및 유리체 출혈 (혈관외유출, 또는 눈의 유리체액 내부 및 주변 영역으로의 혈액 및 유체의 누출) 중 하나 이상으로 인한 것이다.
예를 들면, 당뇨 망막병증은 망막 혈관에 영향을 미치는 가장 통상적인 질병들 중 하나로, I형 당뇨병 또는 II형 당뇨병 환자들 모두에서 나타날 수 있다 [Shin 외. (2014) J Opthalmic Vis Res. 9(3):362-373]. 먼저, 당뇨 망막병증은 일반적으로 무증상 또는 경미한 시각 문제들만을 일으킨다. 그러나, 당뇨 망막병증을 치료하지 않은 채 두면 결국 실명을 가져올 수 있다. 비-증식 망막병증으로 분류되는 이 질병의 초기 단계에서, 망막의 혈관에서 미세동맥류가 발달한다. 질병이 진행됨에 따라, 점점 더 혈관이 손상되거나 차폐되어, 허혈을 초래하며, 산소 및 영양소 순환 감소를 보상하기 위해 새로운 혈관들 (혈관신생)의 성장을 촉진시킨다. 이러한 질병 단계를 증식 망막병증이라 칭한다. 새로운 혈관들이 망막 및 눈 내부를 채우는 맑은 유리체 겔의 표면을 따라 형성된다. 이러한 새로운 혈관들은 체액 누출 (전혈 및/또는 이의 일부 구성성분들) 및 파열되기 쉬운 얇고 약한 벽을 가진다. 이러한 누출은 망막 층들의 내부에 그리고 유리체액에서 혈액 및/또는 체액을 고이게 하여, 시각을 혼탁하게 한다. 또한, 혈액 및/또는 체액은 선명하고 똑바른 시각을 담당하는 눈의 부분인 망막의 황반 내부로 누출될 수 있다. 황반이 부어오름에 따라, 환자의 중심 시력은 왜곡되게 된다. 이러한 상태를 황반 부종이라 지칭하며, 치료하지 않은 채로 두면, 당뇨병 환자들에서 황반 변성을 초래할 수 있다.
허혈 및 미세혈관 병리학 또한, 예를 들면, 황반 변성 (예컨대, 연령-관련 황반 변성, 소아 황반 변성, 습성 황반 변성, 스타르가르트병, 및 베스트병), 망막 혈관 폐색 (예컨대, 중심 망막 혈관 폐색, 절반-망막 혈관 폐색, 망막 분지 혈관 폐색, 및 허혈성 망막 혈관 폐색), 망막 동맥 폐색 (예컨대, 중심 망막 동맥 폐색, 절반-망막 동맥 폐색, 망막 분지 동맥 폐색, 및 허혈성 망막 동맥 폐색), 허혈성 시신경병증 [예컨대, 전방 허혈성 시신경병증 (동맥염성 및 비-동맥염성) 및 후방 허혈성 시신경병증], 황반 모세혈관확장증 (I형 또는 II형), 망막 허혈 (예컨대, 급성 망막 허혈 또는 만성 망막 허혈), 안구 허혈 증후군, 망막 혈관염, 및 미숙아 망막병증을 비롯한 많은 기타 안구 질환들과 관련된다.
가장 유용한 눈 혈관 질환들의 치료는 혈관 및 신경 손상의 완화를 지향하는데, 예를 들면, 레이저 광응고 요법, 저선량 방사선요법, 및 수술 (예컨대, 신생혈관막의 제거 및 유리체절제)이 포함된다. 안타깝게도, 이러한 많은 치료요법들은 효과가 제한적이고 짧다. 예를 들면, 레이저 요법에 처음으로 반응하는 신생혈관막은 재발율이 높고 또한 레이저 치료 중의 손상으로 인해 시각을 상실할 위험이 있다. 유사하게, 저선량 방사선요법을 받은 환자들에서 공포신생(neovacuolization) 재발율이 높다. 신생혈관막의 수술에 의한 제거 및 유리체절제는 망막을 박리시킬 수 있으며 종종 치료 후 백내장 발병과 관련된다[Benson 외. (1988) Ophthalmic Surgery 19(20):826-824]. 최근, 다양한 VEGF 길항제는 연령-관련 황반 변성에서의 사용이 승인되었으며 그 외 안구 적응증들에 대해 임상 시험이 진행중이다. 그러나 VEGF 길항제 요법은 또한 다양한 유해 합병증과도 관련되어 왔다 [Falavarjani 외. (2013) Eye 27:787-794].
그러므로, 안구 질환들, 특히, 허혈 및/또는 미세혈관 기능부전과 관련된 질환들의 치료를 위한 효과적인 치료제에 대한 필요성이 높음에도 여전히 충족되지 않고 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 눈 혈관 질환들의 치료를 필요로 하는 환자들의 시각 개선 방법 및 이러한 질환들의 치료 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 명세서에 기재된 바와 같이, ActRII 길항제 (억제제)가 눈 (안구) 질환들을 치료함에 사용될 수 있음이 발견되었다. 특히, ActRII 폴리펩티드를 이용한 치료는 눈 혈관 손상 관련 질병에 걸린 환자의 시각을 개선시킴이 관찰되었다. 따라서, 특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게, 예를 들면, ActRII 폴리펩티드 (ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드, 뿐만 아니라 이의 변이체들, 가령, GDF 트랩)을 비롯한 하나 이상의 ActRII 길항제를 투여함에 의한, 눈 질환, 특히, 눈의 혈관 질환들의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 ActRII 폴리펩티드, 뿐만 아니라 이의 변이체들은 TGF-β 수퍼 패밀리 [예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, GDF3, BMP10, 및/또는 BMP9]의 다양한 리간드들에 결합한다. 따라서, ActRII 폴리펩티드, 특히 가용성 폴리펩티드는, ActRII-리간드 상호작용들 (예컨대, 세포막에서 발생하는 자연 발생 리간드-수용체 상호작용들)을 억제하기 위해 사용될 수 있으므로 ActRII-매개 Smad (예컨대, Smads 1, 2, 3, 5 및 8) 신호전달을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 그러므로, 특정 작용 메커니즘으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 명세서에 기재된 ActRII 폴리펩티드의 길항 성질들을 모방하는 기타 ActRII 억제제들, 또는 ActRII 억제제들의 조합은, 예를 들면, 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환에 걸린 환자의 시각을 개선시키는 능력을 비롯한, 생체내 유사 생물학적 효과들을 가질 것으로 예상된다. 이러한 길항성 모방체 (예컨대, 최소한 하나의 ActRII 리간드 및/또는 ActRII 수용체를 억제하는 하나 이상의 변이체 ActRII 폴리펩티드, 최소한 하나의 ActRII 리간드 및/또는 ActRII 수용체를 억제하는 하나 이상의 항체들, 최소한 하나의 ActRII 리간드 및/또는 ActRII 수용체를 억제하는 하나 이상의 핵산들, 최소한 하나의 ActRII 리간드 및/또는 ActRII 수용체를 억제하는 하나 이상의 소분자들, 뿐만 아니라 이의 조합)은 본 명세서에서 집합적으로 "ActRII 길항제" 또는 "ActRII 억제제"로 지칭된다.
그러므로, 특정 양상들에서, 본 출원은 유효량의 ActRII 길항제 (억제제), 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 필요로 하는 대상체 (환자)에게 투여하는 단계를 포함하는, 눈 질환 (예컨대, 눈 혈관 질환)의 치료 또는 예방, 특히, 이러한 질환의 하나 이상의 합병증들의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 출원은 유효량의 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 투여하는 단계를 포함하는, 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환에 걸린 환자의 시각 개선 방법을 제공한다. 일부 구체예들에서, 이러한 방법들은 환자의 시력을 증가시킨다. 다른 구체예들에서, 이러한 방법들은 환자의 시야를 증가시킨다. 또한 다른 구체예들에서, 이러한 방법들은 환자의 시력 및 시야를 증가시킨다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 허혈과 관련된 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 미세혈관 기능부전과 관련된 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 망막병증과 관련된 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 시신경병증과 관련된 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 그러므로, 특정 양상들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 다음으로 구성된 그룹에서 선택된, 하나 이상의 눈 질환, 특히, 눈 혈관 질환들의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다: 황반 변성 (예컨대, 연령-관련 황반 변성, 소아 황반 변성, 습성 황반 변성, 건성 황반 변성, 스타르가르트병, 및 베스트병), 망막 혈관 폐색 (예컨대, 중심 망막 혈관 폐색, 절반-망막 혈관 폐색, 망막 분지 혈관 폐색, 및 허혈성 망막 혈관 폐색), 망막 동맥 폐색 (예컨대, 중심 망막 동맥 폐색, 절반-망막 동맥 폐색, 망막 분지 동맥 폐색, 망막 혈관 폐색 후 황반 부종, 및 허혈성 망막 동맥 폐색), 당뇨 망막병증, 당뇨성 황반 부종, 허혈성 시신경병증 [예컨대, 전방 허혈성 시신경병증 (동맥염성 및 비-동맥염성) 및 후방 허혈성 시신경병증], 황반 모세혈관확장증 (I형 또는 II형), 망막 허혈 (예컨대, 급성 망막 허혈 또는 만성 망막 허혈), 안구 허혈 증후군, 망막 혈관염, 및 미숙아 망막병증. 일부 구체예들에서, 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자는 빈혈을 가진다. 예를 들면, 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자는 철적모구 빈혈을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자는 골수형성이상 증후군을 가진다. 일부 구체예들에서, 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자는, 헤모글로빈혈증을 가진다. 예를 들면 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자는, β-지중해빈혈 또는 중등도 지중해빈혈을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 지중해빈혈 질환을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자는 겸상 세포 질병을 가지지 않는다. 일부 구체예들에서, 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 주변 망막 허혈을 가지지 않는다. 일부 구체예들에서, 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 증식성 낫 적혈구 망막병증을 가지지 않는다. 일부 구체예들에서, 눈 질환, 특히 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 유리체 출혈을 가지지 않는다. 유사하게, 본 출원은 본 명세서에 기재된 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, ActRII 길항제 (억제제), 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 포함하는 조성물 및 약제를 제공한다.
특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 눈 질환 치료 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 눈 질환 예방 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 눈 질환의 중증도 감소 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 눈 질환은 눈 혈관 질환이다. 일부 구체예들에서, 눈 질환은 다음으로 구성된 그룹에서 선택된다: 황반 변성 (예컨대, 연령-관련 황반 변성, 소아 황반 변성, 습성 황반 변성, 건성 황반 변성, 스타르가르트병, 신생혈관 연령-관련 황반 변성, 및 베스트병), 망막 혈관 폐색 (예컨대, 중심 망막 혈관 폐색, 절반-망막 혈관 폐색, 망막 분지 혈관 폐색, 및 허혈성 망막 혈관 폐색), 망막 동맥 폐색 (예컨대, 중심 망막 동맥 폐색, 절반-망막 동맥 폐색, 망막 분지 동맥 폐색, 및 허혈성 망막 동맥 폐색), 황반 부종 (예컨대, 망막 혈관 폐색 후 황반 부종 및 당뇨성 황반 부종) 당뇨 망막병증 (예컨대, 당뇨성 황반 부종 환자들에서 당뇨 망막병증 및 당뇨 망막병증), 허혈성 시신경병증 [예컨대, 전방 허혈성 시신경병증 (동맥염성 및 비-동맥염성) 및 후방 허혈성 시신경병증], 황반 모세혈관확장증 (I형 또는 II형), 망막 허혈 (예컨대, 급성 망막 허혈 또는 만성 망막 허혈), 안구 허혈 증후군, 망막 혈관염, 및 미숙아 망막병증. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교시 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교시 최소한 30, 45, 60, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 또는 360일 또는 그 이상의 일수 동안 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 160 일 동안 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 360 일 동안 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 환자는 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 환자는 15 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 15 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 30, 45, 60, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 또는 360일 또는 그 이상의 일수 동안 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 160 일 동안 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 360 일 동안 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 최소한 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 최소한 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 최소한 15 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 최소한 15 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 망막 두께를 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 환자는 이전에 VEGF 억제제로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 VEGF 억제제 치료에 불응성이거나 불내성(intolerant)이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 아플리버셉트 (aflibercept)이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 라니비주맙이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 베바시주맙이다. 일부 구체예들에서, 환자는 이전에 페갑타닙으로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 페갑타닙 치료에 불응성 또는 불내성이다. 일부 구체예들에서, 환자는 이전에 플루오시놀론 아세토니드로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 플루오시놀론 아세토니드 치료에 불응성 또는 불내성이다. 일부 구체예들에서, 환자는 안구 또는 안구주위 감염이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 녹내장이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 활성 안구내 염증이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 주변 망막 허혈이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 증식성 낫 적혈구 망막병증이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 유리체 출혈이 없다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 눈 질환의 치료, 예방 또는 눈 질환의 중증도 감소를 위하여 하나 이상의 추가 활성 물질 또는 지지 요법과 병용하여 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 지지 요법들은 다음으로 구성된 그룹에서 선택된다: 수술, 레이저 요법 (예컨대, 광응고), 항-혈관신생 요법 [예컨대, VEGF 억제제, 가령, 베바시주맙 (Avastin®), 라니비주맙 (Lucentis®), 및 아플리버셉트 (Eylea®)], Ca2+ 억제제 (예컨대, 플루나르진 및 니페디핀), 냉동요법, 고압 산소공급, Na+ 채널 차단제 (예컨대, 토피라메이트), iGluR 길항제 (예컨대, MK-801, 덱스트로메토르판, 엘리프로딜, 및 플루피르틴), 항산화제 (예컨대, 다이메틸티오우레아, 비타민 E, 알파-리포산, 초과산화물 불균등화효소, 카탈라아제, 데스페리옥사민, 만니톨, 알로퓨리놀, 칼슘 도베실레이트, 플루피르틴, 트라이메타지딘, 및 EGB-761), 항염증 물질, 섬모체투열법, 섬모체냉동요법, 안구 필터링 과정, 배액 밸브 이식, 항혈소판제 요법 (예컨대, 아스피린, 티클로피딘, 및 클로피도그렐), 항응고제 요법 (예컨대, 와파린 및 헤파린), 스테로이드제, 전신 또는 국소 코르티코스테로이드제 (예컨대, 프레드니손 트라이암시놀론 (Triesence®) 및 플루오시놀론 아세토니드 (일루비엔), 및 덱사메타손 (Ozurdex®), 스테로이드-보존 면역억제제 (예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 마이코페놀레이트, 모페틸, 인플릭시맙 및 에타네르셉트), 식이 보충제 (예컨대, 비타민 C, 비타민 E, 루테인, 제악산틴, 아연, 염산, 비타민 B6, 비타민 B12, 및 제악산틴), 유리체절제, 공막돌륭술, 및 기체망막유착술. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 억제제이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 VEGF-A 억제제이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 태반 성장 인자 (PIGF) 억제제이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 VEGF 및 PIGF를 억제한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 아플리버셉트이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 라니비주맙이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 베바시주맙이다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 비경구 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 피하 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 안구 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 유리체강내 투여로 투여된다.
특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 황반 변성 치료 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 황반 변성 예방 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 황반 변성 중증도 감소 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 황반 변성은 연령-관련 황반 변성 (AMD)이다. 일부 구체예들에서, 환자는 연령-관련 눈 질병 연구 (AREDS) 기준으로 범주 2 AMD를 가진다. 일부 구체예들에서, 환자는 연령-관련 눈 질병 연구 (AREDS) 기준으로 범주 3 AMD를 가진다. 일부 구체예들에서, 환자는 연령-관련 눈 질병 연구 (AREDS) 기준으로 범주 4 AMD를 가진다. 일부 구체예들에서, AMD은 신생혈관 (습성) AMD이다. 일부 구체예들에서, AMD는 비-신생혈관 (건성) AMD이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 AREDS 기준으로 최소한 1 단계의 AMD 개선을 가져온다 (예컨대, AREDS 기준으로 범주 4에서 범주 3으로 AMD 개선, AREDS 기준으로 범주 3에서 범주 2로 AMD 개선, 또는 AREDS 기준으로 범주 2에서 범주 1로 AMD 개선). 일부 구체예들에서, 상기 방법은 AREDS 기준으로 최소한 2 단계의 AMD 개선을 가져온다 (예컨대, AREDS 기준으로 범주 4에서 범주 2로 AMD 개선, 또는 AREDS 기준으로 범주 3에서 범주 1로 AMD 개선). 일부 구체예들에서, 환자는 BIMRCC (Beckman Initiative for Macular Research Classification Committee) 분류 기준으로 최소한 초기 AMD를 가진다. 예컨대, Frederick L. Ferris III 외. (2013) American Academy of Ophthalmology. 120(4): 844-851을 참조하라. 일부 구체예들에서, 환자는 BIMRCC 분류 기준으로 중기 AMD를 가진다. 일부 구체예들에서, 환자는 BIMRCC 분류 기준으로 후기 AMD를 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 (BIMRCC) 분류 기준으로 최소한 1 단계의 AMD 개선을 가져온다 (예컨대, BIMRCC 기준으로 후기에서 중기 AMD로 개선 또는 BIMRCC 기준으로 중기에서 초기 AMD로 개선). 일부 구체예들에서, 상기 방법은 (BIMRCC) 분류 기준으로 최소한 2 단계의 AMD 개선을 가져온다 (예컨대, BIMRCC 기준으로 후기에서 초기 AMD로 개선). 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교시 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교시 최소한 30, 45, 60, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 또는 360일 또는 그 이상의 일수 동안 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 160 일 동안 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 360 일 동안 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 환자는 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 환자는 15 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 15 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 30, 45, 60, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 또는 360일 또는 그 이상의 일수 동안 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 160 일 동안 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 360 일 동안 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 최소한 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 최소한 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 최소한 15 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 최소한 15 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 망막 두께를 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 환자는 이전에 VEGF 억제제로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 VEGF 억제제 치료에 불응성이거나 불내성(intolerant)이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 아플리버셉트 (aflibercept)이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 라니비주맙이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 베바시주맙이다. 일부 구체예들에서, 환자는 이전에 페갑타닙으로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 페갑타닙 치료에 불응성 또는 불내성이다. 일부 구체예들에서, 환자는 이전에 플루오시놀론 아세토니드로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 플루오시놀론 아세토니드 치료에 불응성 또는 불내성이다. 일부 구체예들에서, 환자는 안구 또는 안구주위 감염이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 녹내장이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 활성 안구내 염증이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 주변 망막 허혈이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 증식성 낫 적혈구 망막병증이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 유리체 출혈이 없다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 눈 질환의 치료, 예방 또는 눈 질환의 중증도 감소를 위하여 하나 이상의 추가 활성 물질 또는 지지 요법과 병용하여 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 지지 요법들은 다음으로 구성된 그룹에서 선택된다: 수술, 레이저 요법 (예컨대, 광응고), 항-혈관신생 요법 [예컨대, VEGF 억제제, 가령, 베바시주맙 (Avastin®), 라니비주맙 (Lucentis®), 및 아플리버셉트 (Eylea®)], Ca2+ 억제제 (예컨대, 플루나르진 및 니페디핀), 냉동요법, 고압 산소공급, Na+ 채널 차단제 (예컨대, 토피라메이트), iGluR 길항제 (예컨대, MK-801, 덱스트로메토르판, 엘리프로딜, 및 플루피르틴), 항산화제 (예컨대, 다이메틸티오우레아, 비타민 E, 알파-리포산, 초과산화물 불균등화효소, 카탈라아제, 데스페리옥사민, 만니톨, 알로퓨리놀, 칼슘 도베실레이트, 플루피르틴, 트라이메타지딘, 및 EGB-761), 항염증 물질, 섬모체투열법, 섬모체냉동요법, 안구 필터링 과정, 배액 밸브 이식, 항혈소판제 요법 (예컨대, 아스피린, 티클로피딘, 및 클로피도그렐), 항응고제 요법 (예컨대, 와파린 및 헤파린), 스테로이드제, 전신 또는 국소 코르티코스테로이드제 (예컨대, 프레드니손 트라이암시놀론 (Triesence®) 및 플루오시놀론 아세토니드 (일루비엔), 및 덱사메타손 (Ozurdex®), 스테로이드-보존 면역억제제 (예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 마이코페놀레이트, 모페틸, 인플릭시맙 및 에타네르셉트), 식이 보충제 (예컨대, 비타민 C, 비타민 E, 루테인, 제악산틴, 아연, 염산, 비타민 B6, 비타민 B12, 및 제악산틴), 유리체절제, 공막돌륭술, 및 기체망막유착술. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 억제제이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 VEGF-A 억제제이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 태반 성장 인자 (PIGF) 억제제이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 VEGF 및 PIGF를 억제한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 아플리버셉트이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 라니비주맙이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 베바시주맙이다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 비경구 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 피하 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 안구 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 유리체강내 투여로 투여된다.
특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 황반 부종 치료 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 황반 부종 예방 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 황반 부종 중증도 감소 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 환자는 망막 혈관 폐색 (RVO) 후 황반 부종을 가진다. 일부 구체예들에서, RVO는 분지 RVO이다. 일부 구체예들에서, RVO는 중심 RVO이다. 일부 구체예들에서, 환자는 분지 및 중심 RVO 모두를 가진다. 일부 구체예들에서, RVO는 절반-중심 RVO이다. 일부 구체예들에서, 황반 부종은 당뇨성 황반 부종이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교시 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교시 최소한 30, 45, 60, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 또는 360일 또는 그 이상의 일수 동안 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 160 일 동안 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 360 일 동안 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 환자는 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 환자는 15 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 15 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 30, 45, 60, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 또는 360일 또는 그 이상의 일수 동안 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 160 일 동안 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 360 일 동안 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 최소한 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 최소한 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 최소한 15 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 최소한 15 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 망막 두께를 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 환자는 이전에 VEGF 억제제로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 VEGF 억제제 치료에 불응성이거나 불내성(intolerant)이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 아플리버셉트 (aflibercept)이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 라니비주맙이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 베바시주맙이다. 일부 구체예들에서, 환자는 이전에 페갑타닙으로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 페갑타닙 치료에 불응성 또는 불내성이다. 일부 구체예들에서, 환자는 이전에 플루오시놀론 아세토니드로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 플루오시놀론 아세토니드 치료에 불응성 또는 불내성이다. 일부 구체예들에서, 환자는 안구 또는 안구주위 감염이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 녹내장이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 활성 안구내 염증이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 주변 망막 허혈이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 증식성 낫 적혈구 망막병증이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 유리체 출혈이 없다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 눈 질환의 치료, 예방 또는 눈 질환의 중증도 감소를 위하여 하나 이상의 추가 활성 물질 또는 지지 요법과 병용하여 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 지지 요법들은 다음으로 구성된 그룹에서 선택된다: 수술, 레이저 요법 (예컨대, 광응고), 항-혈관신생 요법 [예컨대, VEGF 억제제, 가령, 베바시주맙 (Avastin®), 라니비주맙 (Lucentis®), 및 아플리버셉트 (Eylea®)], Ca2+ 억제제 (예컨대, 플루나르진 및 니페디핀), 냉동요법, 고압 산소공급, Na+ 채널 차단제 (예컨대, 토피라메이트), iGluR 길항제 (예컨대, MK-801, 덱스트로메토르판, 엘리프로딜, 및 플루피르틴), 항산화제 (예컨대, 다이메틸티오우레아, 비타민 E, 알파-리포산, 초과산화물 불균등화효소, 카탈라아제, 데스페리옥사민, 만니톨, 알로퓨리놀, 칼슘 도베실레이트, 플루피르틴, 트라이메타지딘, 및 EGB-761), 항염증 물질, 섬모체투열법, 섬모체냉동요법, 안구 필터링 과정, 배액 밸브 이식, 항혈소판제 요법 (예컨대, 아스피린, 티클로피딘, 및 클로피도그렐), 항응고제 요법 (예컨대, 와파린 및 헤파린), 스테로이드제, 전신 또는 국소 코르티코스테로이드제 (예컨대, 프레드니손 트라이암시놀론 (Triesence®) 및 플루오시놀론 아세토니드 (일루비엔), 및 덱사메타손 (Ozurdex®), 스테로이드-보존 면역억제제 (예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 마이코페놀레이트, 모페틸, 인플릭시맙 및 에타네르셉트), 식이 보충제 (예컨대, 비타민 C, 비타민 E, 루테인, 제악산틴, 아연, 염산, 비타민 B6, 비타민 B12, 및 제악산틴), 유리체절제, 공막돌륭술, 및 기체망막유착술. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 억제제이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 VEGF-A 억제제이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 태반 성장 인자 (PIGF) 억제제이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 VEGF 및 PIGF를 억제한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 아플리버셉트이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 라니비주맙이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 베바시주맙이다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 비경구 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 피하 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 안구 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 유리체강내 투여로 투여된다.
특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 RVO 치료 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 RVO 예방 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 RVO 중증도 감소 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, RVO는 분지 RVO이다. 일부 구체예들에서, RVO는 중심 RVO이다. 일부 구체예들에서, 환자는 분지 및 중심 RVO 모두를 가진다. 일부 구체예들에서, 환자는 절반-중심 RVO를 가진다. 일부 구체예들에서, 환자는 망막 혈관 폐색 (RVO) 후 황반 부종을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교시 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교시 최소한 30, 45, 60, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 또는 360일 또는 그 이상의 일수 동안 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 160 일 동안 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 360 일 동안 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 환자는 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 환자는 15 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 15 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 30, 45, 60, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 또는 360일 또는 그 이상의 일수 동안 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 160 일 동안 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 360 일 동안 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 최소한 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 최소한 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 최소한 15 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 최소한 15 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 망막 두께를 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 환자는 이전에 VEGF 억제제로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 VEGF 억제제 치료에 불응성이거나 불내성(intolerant)이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 아플리버셉트 (aflibercept)이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 라니비주맙이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 베바시주맙이다. 일부 구체예들에서, 환자는 이전에 페갑타닙으로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 페갑타닙 치료에 불응성 또는 불내성이다. 일부 구체예들에서, 환자는 이전에 플루오시놀론 아세토니드로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 플루오시놀론 아세토니드 치료에 불응성 또는 불내성이다. 일부 구체예들에서, 환자는 안구 또는 안구주위 감염이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 녹내장이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 활성 안구내 염증이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 주변 망막 허혈이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 증식성 낫 적혈구 망막병증이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 유리체 출혈이 없다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 눈 질환의 치료, 예방 또는 눈 질환의 중증도 감소를 위하여 하나 이상의 추가 활성 물질 또는 지지 요법과 병용하여 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 지지 요법들은 다음으로 구성된 그룹에서 선택된다: 수술, 레이저 요법 (예컨대, 광응고), 항-혈관신생 요법 [예컨대, VEGF 억제제, 가령, 베바시주맙 (Avastin®), 라니비주맙 (Lucentis®), 및 아플리버셉트 (Eylea®)], Ca2+ 억제제 (예컨대, 플루나르진 및 니페디핀), 냉동요법, 고압 산소공급, Na+ 채널 차단제 (예컨대, 토피라메이트), iGluR 길항제 (예컨대, MK-801, 덱스트로메토르판, 엘리프로딜, 및 플루피르틴), 항산화제 (예컨대, 다이메틸티오우레아, 비타민 E, 알파-리포산, 초과산화물 불균등화효소, 카탈라아제, 데스페리옥사민, 만니톨, 알로퓨리놀, 칼슘 도베실레이트, 플루피르틴, 트라이메타지딘, 및 EGB-761), 항염증 물질, 섬모체투열법, 섬모체냉동요법, 안구 필터링 과정, 배액 밸브 이식, 항혈소판제 요법 (예컨대, 아스피린, 티클로피딘, 및 클로피도그렐), 항응고제 요법 (예컨대, 와파린 및 헤파린), 스테로이드제, 전신 또는 국소 코르티코스테로이드제 (예컨대, 프레드니손 트라이암시놀론 (Triesence®) 및 플루오시놀론 아세토니드 (일루비엔), 및 덱사메타손 (Ozurdex®), 스테로이드-보존 면역억제제 (예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 마이코페놀레이트, 모페틸, 인플릭시맙 및 에타네르셉트), 식이 보충제 (예컨대, 비타민 C, 비타민 E, 루테인, 제악산틴, 아연, 염산, 비타민 B6, 비타민 B12, 및 제악산틴), 유리체절제, 공막돌륭술, 및 기체망막유착술. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 억제제이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 VEGF-A 억제제이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 태반 성장 인자 (PIGF) 억제제이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 VEGF 및 PIGF를 억제한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 아플리버셉트이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 라니비주맙이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 베바시주맙이다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 비경구 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 피하 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 안구 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 유리체강내 투여로 투여된다.
특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 망막병증 치료 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 망막병증 예방 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 망막병증 중증도 감소 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 망막병증은 당뇨성 망막병증이다. 일부 구체예들에서, 환자는 당뇨성 황반 부종을 가진다. 일부 구체예들에서, 환자는 초기 치료 당뇨 망막병증 연구 (ETDRS) 분류 기준으로 최소한 경미한 비-증식성 당뇨 망막병증 (NPDR)을 가진다. 일부 구체예들에서,환자는 ETDRS 분류 기준으로 중등도 NPDR을 가진다. 일부 구체예들에서,환자는 ETDRS 분류 기준으로 중증 NPDR을 가진다. 일부 구체예들에서,환자는 ETDRS 분류 기준으로 매우 중증인 NPDR을 가진다. 일부 구체예들에서, 환자는 ETDRS 분류 기준으로 초기 증식성 당뇨 망막병증 (PDR)을 가진다. 일부 구체예들에서, 환자는 ETDRS 분류 기준으로 고 위험 PDR을 가진다. 일부 구체예들에서, 환자는 ETDRS 분류 기준으로 고도의 (advanced) PDR을 가진다. 일부 구체예들에서, 환자는 ETDRS 분류 기준으로 임상적으로 유의한 황반 변성이 있는 고도의 PDR을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 ETDRS 분류 기준으로 최소한 1 단계의 당뇨 망막병증 개선을 가져온다 (예컨대, 임상적으로 유의한 황반 변성이 있는 고도의 PDR로부터 유의한 황반 변성이 없는 고도의 PDR로의 개선, 고도의 PDR로부터 고 위험 PDR로의 개선, 고 위험 PDR로부터 초기 PDR로의 개선, 초기 PDR로부터 매우 중증 NPDR로의 개선, 매우 중증 NPDR로부터 중증 NPDR로의 개선, 중증 NPDR로부터 중등도 NPDR로의 개선, 또는 중등도 NPDR로부터 경증 NPDR로의 개선). 일부 구체예들에서, 상기 방법은 ETDRS 분류 기준으로 최소한 2 단계의 당뇨 망막병증 개선을 가져온다 (예컨대, 임상적으로 유의한 황반 변성이 있는 고도의 PDR로부터 고 위험 PDR로의 개선, 고도의 PDR로부터 초기 PDR로의 개선, 고 위험 PDR로부터 매우 중증 NPDR로의 개선, 초기 PDR로부터 중증 NPDR로의 개선, 매우 중증 NPDR로부터 중등도 NPDR로의 개선, 중증 NPDR로부터 경증 NPDR로의 개선, 또는 중등도 NPDR로부터 분명하지 않은 망막병증으로의 개선). 일부 구체예들에서, 환자는 ETDRS 당뇨 망막병증 중증도 등급 (ETDRS-DRSS) 분류 기준으로 최소한 경증 NPDR을 가진다. 일부 구체예들에서,환자는 ETDRS-DRSS 분류 기준으로 중등도 NPDR을 가진다. 일부 구체예들에서,환자는 ETDRS-DRSS 분류 기준으로 중증 NPDR을 가진다. 일부 구체예들에서,환자는 ETDRS-DRSS 분류 기준으로 PDR을 가진다. 일부 구체예들에서, 환자는 ETDRS-DRSS 분류 기준으로 당뇨성 황반 부종이 없는 PDR을 가진다. 일부 구체예들에서, 환자는 ETDRS-DRSS 분류 기준으로 당뇨성 황반 부종이 있는 PDR을 가진다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 ETDRS-DRSS 분류 기준으로 최소한 1 단계의 당뇨 망막병증 개선을 가져온다 (예컨대, 당뇨성 황반 부종이 존재하는 PDR로부터 당뇨성 황반 부종이 없는 PDR로의 개선, 당뇨성 황반 부종이 없는 PDR로부터 PDR로의 개선, PDR로부터 중증 NPDR로의 개선, 중증 NPDR로부터 중등도 NPDR로의 개선, 중등도 NPDR로부터 경증 NPDR로의 개선, 또는 경증 NPDR로부터 분명하지 않은 망막병증으로의 개선). 일부 구체예들에서, 상기 방법은 ETDRS-DRSS 분류 기준으로 최소한 2 단계의 당뇨 망막병증의 개선을 가져온다 (예컨대, 당뇨성 황반 부종이 있는 PDR로부터 PDR로의 개선, 당뇨성 황반 부종이 없는 PDR로부터 중증 NPDR로의 개선, PDR로부터 중등도 NPDR로의 개선, 중증 NPDR로부터 경증 NPDR로의 개선, 중등도 NPDR로부터 분명하지 않은 정도로의 개선, 또는 경증 NPDR로부터 분명하지 않은 망막병증으로의 개선). 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교시 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교시 최소한 30, 45, 60, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 또는 360일 또는 그 이상의 일수 동안 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 160 일 동안 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 360 일 동안 시력을 유지시킨다. 일부 구체예들에서, 환자는 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 환자는 15 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 15 글자 미만으로 시력을 상실한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 30, 45, 60, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 또는 360일 또는 그 이상의 일수 동안 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 160 일 동안 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 기준선과 비교하여 최소한 360 일 동안 시력을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 최소한 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 최소한 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 최소한 15 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 시력을 개선시키는데, 여기서 환자는 기준선 (치료 시작 전 환자의 시력)과 비교하여 최소한 15 글자의 시력을 얻는다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 망막 두께를 감소시킨다. 일부 구체예들에서, 환자는 이전에 VEGF 억제제로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 VEGF 억제제 치료에 불응성이거나 불내성(intolerant)이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 아플리버셉트 (aflibercept)이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 라니비주맙이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 베바시주맙이다. 일부 구체예들에서, 환자는 이전에 페갑타닙으로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 페갑타닙 치료에 불응성 또는 불내성이다. 일부 구체예들에서, 환자는 이전에 플루오시놀론 아세토니드로 치료받은 적이 있다. 일부 구체예들에서, 환자는 플루오시놀론 아세토니드 치료에 불응성 또는 불내성이다. 일부 구체예들에서, 환자는 안구 또는 안구주위 감염이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 녹내장이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 활성 안구내 염증이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 주변 망막 허혈이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 증식성 낫 적혈구 망막병증이 없다. 일부 구체예들에서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 유리체 출혈이 없다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 눈 질환의 치료, 예방 또는 눈 질환의 중증도 감소를 위하여 하나 이상의 추가 활성 물질 또는 지지 요법과 병용하여 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 지지 요법들은 다음으로 구성된 그룹에서 선택된다: 수술, 레이저 요법 (예컨대, 광응고), 항-혈관신생 요법 [예컨대, VEGF 억제제, 가령, 베바시주맙 (Avastin®), 라니비주맙 (Lucentis®), 및 아플리버셉트 (Eylea®)], Ca2+ 억제제 (예컨대, 플루나르진 및 니페디핀), 냉동요법, 고압 산소공급, Na+ 채널 차단제 (예컨대, 토피라메이트), iGluR 길항제 (예컨대, MK-801, 덱스트로메토르판, 엘리프로딜, 및 플루피르틴), 항산화제 (예컨대, 다이메틸티오우레아, 비타민 E, 알파-리포산, 초과산화물 불균등화효소, 카탈라아제, 데스페리옥사민, 만니톨, 알로퓨리놀, 칼슘 도베실레이트, 플루피르틴, 트라이메타지딘, 및 EGB-761), 항염증 물질, 섬모체투열법, 섬모체냉동요법, 안구 필터링 과정, 배액 밸브 이식, 항혈소판제 요법 (예컨대, 아스피린, 티클로피딘, 및 클로피도그렐), 항응고제 요법 (예컨대, 와파린 및 헤파린), 스테로이드제, 전신 또는 국소 코르티코스테로이드제 (예컨대, 프레드니손 트라이암시놀론 (Triesence®) 및 플루오시놀론 아세토니드 (일루비엔), 및 덱사메타손 (Ozurdex®), 스테로이드-보존 면역억제제 (예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 마이코페놀레이트, 모페틸, 인플릭시맙 및 에타네르셉트), 식이 보충제 (예컨대, 비타민 C, 비타민 E, 루테인, 제악산틴, 아연, 염산, 비타민 B6, 비타민 B12, 및 제악산틴), 유리체절제, 공막돌륭술, 및 기체망막유착술. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 억제제이다. 일부 구체예들에서, VEGF 억제제는 VEGF-A 억제제이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 태반 성장 인자 (PIGF) 억제제이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 VEGF 및 PIGF를 억제한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 아플리버셉트이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 라니비주맙이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 베바시주맙이다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 비경구 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 피하 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 안구 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제는 유리체강내 투여로 투여된다.
본 출원의 ActRII 길항제는, 예를 들면, ActRII 수용체 (예컨대, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체) 신호 전달 경로(예컨대, 세포내 매개자, 가령, Smads 1, 2, 3, 5, 및/또는 8을 통한 신호 전달의 활성화)를 억제할 수 있는 물질; 하나 이상의 ActRII 리간드들 [예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, GDF3, BMP10, 및/또는 BMP9]을, ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 ActRII 수용체의 활성화로부터 억제할 수 있는 물질; ActRII 리간드 및/또는 ActRII 수용체의 발현 (예컨대, 전사, 번역, 세포 분비, 또는 이의 조합)을 억제하는 물질; 및 ActRII 신호전달 경로의 하나 이상의 세포내 매개자 (예컨대, Smads 1, 2, 3, 5, 및/또는 8)를 억제할 수 있는 물질을 포함한다. 이러한 물질들에는, 예를 들면, ActRII (ActRIIA 또는 ActRIIB) 폴리펩티드, 또는 ActRII 폴리펩티드들의 조합, 뿐만 아니라 이의 변이체들 (예컨대, GDF 트랩 폴리펩티드); 하나 이상의 ActRII 리간드 및/또는 ActRII 수용체에 결합하는 항체, 항체들의 조합; 하나 이상의 ActRII 리간드 및/또는 ActRII 수용체의 발현을 억제하는 RNA 또는 RNA들의 조합; 하나 이상의 ActRII 리간드 및/또는 ActRII 수용체의 발현을 억제하는 소분자 또는 소분자들의 조합, 뿐만 아니라 이의 조합이 포함된다.
특정 양상들에서, 본 명세서에 기재된 방법들 및 용도들에 따라 사용하기에 바람직한 ActRII 길항제, 또는 길항제들의 조합은 최소한 GDF11-매개 신호전달 (예컨대, Smad 2/3 신호전달)을 억제하는 물질이다. 리간드-매개 신호전달에 대한 효과는, 예를 들면, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 분석법들을 비롯한 세포-기반 분석법을 사용하여 결정될 수 있다. 그러므로, 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 최소한 GDF11에 결합할 수 있다. 리간드 결합 활성은, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 분석법들을 비롯한 결합 친화력 분석법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRII 억제제 또는 억제제들의 조합은 최소한 GDF11에 최소한 1 x 10-7 M의 KD로 (예컨대, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M) 결합한다.
다른 양상들에서, 본 명세서에 기재된 방법들 및 용도들에 따라 사용하기에 바람직한 ActRII 길항제, 또는 길항제들의 조합은 최소한 GDF8-매개 신호전달 (예컨대, Smad 2/3 신호전달)을 억제하는 물질이다. 그러므로, 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 최소한 GDF8에 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRII 억제제 또는 억제제들의 조합은 최소한 GDF8에 최소한 1 x 10-7 M의 KD로 (예컨대, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M) 결합한다.
또 다른 양상들에서, 본 명세서에 기재된 방법들 및 용도들에 따라 사용하기에 바람직한 ActRII 길항제, 또는 길항제들의 조합은 최소한 액티빈-매개 신호전달 (예컨대, Smad 2/3 신호전달)을 억제하는 물질이다. 그러므로, 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 최소한 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및/또는 액티빈 E)에 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRII 억제제 또는 억제제들의 조합은 최소한 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및/또는 액티빈 E에 최소한 1 x 10-7 M의 KD로 (예컨대, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M) 결합한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRII 억제제 또는 억제제들의 조합은 최소한 액티빈 B에 최소한 1 x 10-7 M의 KD로 (예컨대, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M) 결합한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 액티빈 A에 결합하지 않거나 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 액티빈 A에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐) 및/또는 액티빈 A 활성을 억제하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 최소한 액티빈 B에 결합하지만 (예컨대, 최소한 1 x 10-7 M, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M의 KD로 결합함), 실질적으로 액티빈 A에는 결합하지 않거나 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 액티빈 A에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐) 및/또는 액티빈 A 활성을 억제하지 않는다.
또 다른 양상들에서, 본 명세서에 기재된 방법들 및 용도들에 따라 사용하기에 바람직한 ActRII 길항제, 또는 길항제들의 조합은 최소한 BMP6-매개 신호전달 (예컨대, Smad 2/3 신호전달)을 억제하는 물질이다. 그러므로, 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 최소한 BMP6에 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRII 억제제 또는 억제제들의 조합은 최소한 BMP6에 최소한 1 x 10-7 M의 KD로 (예컨대, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M) 결합한다. 대안적으로, 다른 양상들에서, 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP6에 결합하지 않거나 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP6에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐) 및/또는 BMP6 활성을 억제하지 않는다.
또 다른 양상들에서, 본 명세서에 기재된 방법들 및 용도들에 따라 사용하기에 바람직한 ActRII 길항제, 또는 길항제들의 조합은 최소한 GDF3-매개 신호전달 (예컨대, Smad 2/3 신호전달)을 억제하는 물질이다. 그러므로, 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 최소한 GDF3에 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRII 억제제 또는 억제제들의 조합은 최소한 GDF3에 최소한 1 x 10-7 M의 KD로 (예컨대, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M) 결합한다. 대안적으로, 다른 양상들에서, 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 GDF3에 결합하지 않거나 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 GDF3에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐) 및/또는 GDF3 활성을 억제하지 않는다.
또한 또 다른 양상들에서, 본 명세서에 기재된 방법들 및 용도들에 따라 사용하기에 바람직한 ActRII 길항제, 또는 길항제들의 조합은 최소한 BMP9-매개 신호전달 (예컨대, Smad 2/3 신호전달)을 억제하는 물질이다. 그러므로, 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 최소한 BMP9에 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRII 억제제 또는 억제제들의 조합은 최소한 BMP9에 최소한 1 x 10-7 M의 KD로 (예컨대, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M) 결합한다. 대안적으로, 다른 양상들에서, 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP9에 결합하지 않거나 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP9에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐) 및/또는 BMP9 활성을 억제하지 않는다.
또 다른 양상들에서, 본 명세서에 기재된 방법들 및 용도들에 따라 사용하기에 바람직한 ActRII 길항제, 또는 길항제들의 조합은 최소한 BMP10-매개 신호전달 (예컨대, Smad 2/3 신호전달)을 억제하는 물질이다. 그러므로, 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 최소한 BMP10에 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRII 억제제 또는 억제제들의 조합은 최소한 BMP10에 최소한 1 x 10-7 M의 KD로 (예컨대, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M) 결합한다. 대안적으로, 다른 양상들에서, 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP10에 결합하지 않거나 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP10에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐) 및/또는 BMP10 활성을 억제하지 않는다.
추가 양상들에서, 본 명세서에 기재된 방법들 및 용도들에 따라 사용하기에 바람직한 ActRII 길항제, 또는 길항제들의 조합은 최소한 GDF11- 및 GDF8-매개 신호전달 (예컨대, Smad 2/3 신호전달)을 억제하는 물질이다. 그러므로, 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 최소한 GDF11 및 GDF8에 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRII 억제제들은 최소한 GDF11에 최소한 1 x 10-7 M의 KD로 (예컨대, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M) 그리고 GDF8에 최소한 1 x 10-7 M의 KD로 (예컨대, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M) 결합한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및 GDF8에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 액티빈 A에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 액티빈 A에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11 및 GDF8에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP9에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP9에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11 및 GDF8에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP10에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP10에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11 및 GDF8에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP9 또는 BMP10에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP9 또는 BMP10에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11 및 GDF8에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 액티빈 A, BMP9 또는 BMP10에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 액티빈 A, BMP9 또는 BMP10에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐).
또 다른 양상들에서, GDF11- 및/또는 GDF8-매개 신호전달 (예컨대, Smad 2/3 신호전달)에서 억제하는 길항제, 또는 길항제들의 조합은 액티빈-매개 신호전달을 추가로 억제할 수 있다. 그러므로, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 최소한 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및/또는 액티빈 E)에 추가로 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제 또는 억제제들의 조합은 최소한 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및/또는 액티빈 E)에 최소한 1 x 10-7 M의 KD로 (예컨대, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M) 결합한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제 또는 억제제들의 조합은 최소한 액티빈 B에 추가로 결합할 수 있다 (예컨대, 최소한 1 x 10-7 M, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M로 결합함). 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 액티빈 A에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 액티빈 A에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 최소한 액티빈 B에 추가로 결합할 수 있지만 (예컨대, 최소한 1 x 10-7 M, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M의 KD로 결합함), 실질적으로 액티빈 A에는 결합하지 않거나 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 액티빈 A에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐) 및/또는 액티빈 A 활성을 억제하지 않는다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP9에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP9에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP10에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP10에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP9 또는 BMP10에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP9 또는 BMP10에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 액티빈 A, BMP9 또는 BMP10에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 액티빈 A, BMP9 또는 BMP10에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐).
또 다른 양상들에서, GDF11-, GDF8-, 및/또는 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및/또는 액티빈 E) 매개 신호전달 (예컨대, Smad 2/3 신호전달)에서 억제하는 길항제, 또는 길항제들의 조합은 BMP6-매개 신호전달을 추가로 억제할 수 있다. 그러므로, GDF11, GDF8, 및/또는 액티빈에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 최소한 BMP6에 추가로 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 및/또는 액티빈에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제 또는 억제제들의 조합은 최소한 BMP6에 최소한 1 x 10-7 M의 KD로 (예컨대, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M) 추가로 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, 및/또는 BMP6에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 액티빈 A에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 액티빈 A에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, 및/또는 BMP6에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP9에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP9에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, 및/또는 BMP6에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP10에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP10에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, 및/또는 BMP6에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP9 또는 BMP10에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP9 또는 BMP10에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, 및/또는 BMP6에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 액티빈 A, BMP9 또는 BMP10에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 액티빈 A, BMP9 또는 BMP10에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐).
또한 추가 양상들에서, GDF11-, GDF8-, 및/또는 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및/또는 액티빈 E) 및/또는 BMP6-매개 신호전달 (예컨대, Smad 2/3 신호전달)에서 억제하는 길항제, 또는 길항제들의 조합은 GDF3-매개 신호전달을 추가로 억제할 수 있다. 그러므로, GDF11, GDF8, 액티빈 및/또는 BMP6에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 최소한 GDF3에 추가로 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, 및/또는 BMP6에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제 또는 억제제들의 조합은 최소한 GDF3에 최소한 1 x 10-7 M의 KD로 (예컨대, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M) 추가로 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, 및/또는 BMP6에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 액티빈 A에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 액티빈 A에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, 및/또는 BMP6에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP9에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP9에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, 및/또는 BMP6에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP10에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP10에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, 및/또는 BMP6에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP9 또는 BMP10에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP9 및 BMP10에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, 및/또는 BMP6에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 액티빈 A, BMP9 또는 BMP10에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 액티빈 A, BMP9 및 BMP10에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐).
또한 추가 양상들에서, GDF11-, GDF8-, 및/또는 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및/또는 액티빈 E), BMP6, 및/또는 GDF3-매개 신호전달 (예컨대, Smad 2/3 신호전달)에서 억제하는 길항제, 또는 길항제들의 조합은 BMP10-매개 신호전달을 추가로 억제할 수 있다. 그러므로, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, 및/또는 GDF3에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 최소한 BMP10에 추가로 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, 및/또는 GDF3에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제 또는 억제제들의 조합은 최소한 BMP10에 최소한 1 x 10-7 M의 KD로 (예컨대, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M) 추가로 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, BMP6, GDF3 및/또는 BMP10에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 액티빈 A에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 액티빈 A에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, BMP6, GDF3 및/또는 BMP10에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 BMP9에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 BMP10에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, BMP6, GDF3 및/또는 BMP10에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 액티빈 A 또는 BMP9에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 액티빈 A 및 BMP9에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐).
다른 양상들에서, GDF11-, GDF8-, 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및/또는 액티빈 E), BMP6, GDF3 및/또는 BMP10-매개 신호전달 (예컨대, Smad 2/3 신호전달)에서 억제하는 길항제, 또는 길항제들의 조합은 BMP9-매개 신호전달을 추가로 억제할 수 있다. 그러므로, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, GDF3 및/또는 BMP10에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 최소한 BMP9에 추가로 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, GDF3 및/또는 BMP10에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제 또는 억제제들의 조합은 최소한 BMP9에 최소한 1 x 10-7 M의 KD로 (예컨대, 최소한 1 x 10-8 M, 최소한 1 x 10-9 M, 최소한 1 x 10-10 M, 최소한 1 x 10-11 M, 또는 최소한 1 x 10-12 M) 추가로 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, GDF3, BMP10, 및/또는 BMP9에 결합하는 본 출원의 ActRII 억제제, 또는 억제제들의 조합은 실질적으로 액티빈 A에 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 높은 KD로 액티빈 A에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐).
특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 용어 "ActRII 폴리펩티드"는 자연 발생 ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드 뿐만 아니라, 가령, 본 출원에 기재된 이의 절두부들 및 변이체들 (예컨대, GDF 트랩 폴리펩티드)을 집합적으로 지칭한다. 바람직하게는 ActRII 폴리펩티드는 ActRII 폴리펩티드 또는 이의 변형된 (변이체) 형태의 리간드-결합 도메인을 포함하거나, 이러한 도메인으로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 ActRIIA 폴리펩티드의 ActRIIA 리간드-결합 도메인, 예를 들면, ActRIIA 세포외 도메인의 일부분을 포함하거나, 이러한 도메인으로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 유사하게, ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드의 ActRIIB 리간드-결합 도메인, 예를 들면, ActRIIB 세포외 도메인의 일부분을 포함하거나, 이러한 도메인으로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 기재된 방법들 및 용도에 따라 사용되는 ActRII 폴리펩티드는 가용성 폴리펩티드이다.
특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRIIA 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 아미노산 30-110의 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열들로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 다른 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 다른 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 10의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 11의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 32의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 36의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 39의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다.
다른 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRIIB 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 29-109의 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열들로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 29-109의 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산 [자연 발생 (E 또는 D) 또는 인공 산성 아미노산]을 포함한다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 25-131의 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 25-131의 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 2의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 3의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 3의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 4의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 4의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 4에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 5의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 5의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 4에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 6의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 6의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 4에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 44의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 44의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 45의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 45의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 46의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 46의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 48의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 48의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 49의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 49의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 50의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 50의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 79의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 79의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 61의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 61의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 64의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 64의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 65의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 65의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 40의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 40의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 41의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 41의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 또한 또 다른 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 78의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 78의 아미노산 서열과 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있으며, 여기서 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대한 위치 79에서 산성 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 기재된 방법들 및 용도에 따라 사용되는 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 L79에 해당하는 위치에 산성 아미노산을 포함하지 않는다.
다른 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 유효량의 GDF 트랩 폴리펩티드 (GDF 트랩)를 투여하는 단계를 포함하는 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, GDF 트랩은, 야생형 리간드-결합 도메인에 관한 비율에 비해 최소한 2-, 5-, 10-, 20, 50-, 100-, 또는 심지어 1000-배 더 큰, 액티빈 A 결합에 관한 Kd 대 GDF11 및/또는 GDF8 결합에 관한 Kd의 비율을 가지는 변형된 ActRII 리간드-결합 도메인을 포함하거나, 이러한 도메인으로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인을 포함하는 GDF 트랩은 야생형 ActRII 리간드-결합 도메인에 비해, 최소한 2-, 5-, 10-, 20-, 25- 50-, 100-, 또는 심지어 1000-배 더 큰, 액티빈 A의 억제에 관한 IC50 대 GDF11 및/또는 GDF8의 억제에 관한 IC50 의 비율을 가진다. 선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인을 포함하는 GDF 트랩은 액티빈 A의 억제에 관한 IC50 보다 최소한 2, 5, 10, 20, 50, 또는 심지어 100 배 더 작은 IC50으로 GDF11 및/또는 GDF8을 억제한다. 이러한 GDF 트랩들은 면역글로불린 Fc 도메인 (야생형 또는 돌연변이)를 포함하는 융합 단백질 일 수 있다. 특정 경우에서, 대상의 가용성 GDF 트랩들은 GDF8 및/또는 GDF11-매개 세포내 신호전달 (예컨대, Smad 2/3 신호전달)의 길항제 (억제제)이다.
일부 구체예들에서, 본 출원은 변형된 리간드-결합 (예컨대, GDF11-결합) 도메인을 포함하는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드인 GDF 트랩들을 제공한다. 변형된 리간드-결합 도메인을 보유한 GDF 트랩들은, 예를 들면, 인간 ActRIIB의 아미노산 잔기들에서의 돌연변이, 가령, E37, E39, R40, K55, R56, Y60, A64, K74, W78, L79, D80, F82 및 F101를 하나 이상 포함할 수 있다 (서열 번호: 1에 관하여 넘버링함). 선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인은 ActRIIB 수용체의 야생형 리간드-결합 도메인에 비해 일정 리간드, 가령, GDF8/GDF11에 대한 증가된 선택성을 가질 수 있다. 설명하기 위하여, 이들 돌연변이들은, 변형된 리간드-결합 도메인의 선택성을 액티빈에 대하여 보다 GDF11 (그리고, 그에 따라, 아마도, GDF8)에 대하여 증가시킴이 본 명세서에서 증명된다: K74Y, K74F, K74I, L79D, L79E, 및 D80I. 다음과 같은 돌연변이는 GDF11에 대하여 보다 액티빈 결합의 비율을 증가시키는 역효과를 가진다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 전체 (GDF11 및 액티빈) 결합 활성은 "꼬리" 영역 또는, 아마도, 구조화되지 않은 링커 영역을 포함시킴으로써, 그리고 또한 K74A 돌연변이를 사용함으로써 증가될 수 있다. 리간드 결합 친화력의 전체 감소를 유발하였던 다른 돌연변이에는 다음이 포함된다: R40A, E37A, R56A, W78A, D80K, D80R, D80A, D80G, D80F, D80M 및 D80N. 돌연변이는 원하는 효과를 구현하기 위해 조합될 수 있다. 예를 들면, GDF11:액티빈 결합의 비율에 영향을 주는 많은 돌연변이들은 리간드 결합에 전체적으로 부정적인 영향을 미치므로, 이들은 일반적으로 리간드 결합을 증가시켜 리간드 선택성을 가지는 개선된 결합 단백질을 생성하는 돌연변이들과 조합될 수 있다. 한 예시적인 구체예에서, GDF 트랩은 L79D 또는 L79E 돌연변이를, 선택적으로 추가 아미노산 치환, 부가, 또는 결실과 조합하여 포함하는 ActRIIB 폴리펩티드이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, ActRII 폴리펩티드 및 이의 변이체들 (GDF 트랩들)은 동종다량체, 예를 들면, 동종이량체, 동종삼량체, 동종사량체, 동종오량체, 및 그 이상의 동종다량체 복합체들일 수 있다. 특정 바람직한 구체예들에서, ActRII 폴리펩티드 및 이의 변이체들은 동종이량체이다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 기재된 ActRII 폴리펩티드 이량체들은 제 2 ActRII 폴리펩티드와 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합되는 제 1 ActRII 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 상기 제 1 폴리펩티드는 하나의 ActRII 도메인 및 상호작용 쌍의 제 1 구성원 (또는 제 2 구성원)의 하나의 아미노산 서열 (예컨대, 면역글로불린의 불변 도메인)을 포함하고 상기 제 2 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 제 2 구성원 (또는 제 1 구성원)의 하나의 아미노산 서열 및 하나의 ActRII 폴리펩티드를 포함한다.
특정 양상들에서, 이의 변이체들 (예컨대, GDF 트랩들)을 비롯한 ActRII 폴리펩티드는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에 있어서, ActRII 폴리펩티드는 ActRII 폴리펩티드 도메인과 하나 또는 그 이상의 이종 (비-ActRII) 폴리펩티드 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 폴리펩티드는, 하나의 도메인으로서, ActRII 폴리펩티드 유래의 아미노산 서열 (예컨대, ActRII 수용체 또는 이의 변이체의 리간드-결합 도메인) 및, 원하는 성질, 가령, 개선된 약물동력학, 보다 용이한 정제, 특정 조직들에 대한 표적, 등을 제공하는 하나 이상의 이종 도메인들을 가지는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질의 도메인은 생체내 안정성, 생체내 반감기, 흡수/투여, 조직 국소화 또는 분포, 단백질 복합체의 형성, 융합 단백질의 다량체화(multimerization), 및/또는 정제 중 하나 이상을 강화시킬 수 있다. 선택적으로, 융합 단백질의 ActRII 폴리펩티드 도메인은 하나 이상의 이종 폴리펩티드 도메인에 직접 연결(융합)되거나, 또는 ActRII 폴리펩티드의 아미노산 서열과 하나 이상의 이종 도메인의 아미노산 서열 사이에 링커와 같은 개입 서열이 위치할 수 있다. 특정 구체예에서, ActRII 융합 단백질은 이종 도메인과 ActRII 도메인 사이에 위치한 비교적 구조화되지 않은 링커를 포함한다. 이러한 구조화되지 않은 링커는 ActRIIA 또는 ActRIIB의 세포외 도메인의 C-말단 단부("꼬리")에 대략 15개의 아미노산으로 된 비구조화 영역에 해당할 수 있으며, 또는 링커는 상대적으로 2차 구조가 없는 3 내지 15, 20, 30, 50개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 인공 서열일 수 있다. 링커에는 글리신과 프롤린 잔기가 많을 수 있으며, 예를 들면, 트레오닌/세린 및 글리신의 반복 서열들을 내포할 수 있다. 링커의 예로는 서열 TGGG (서열 번호: 23), SGGG (서열 번호: 24), TGGGG (서열 번호: 21), SGGGG (서열 번호: 22), GGGGS (서열 번호: 25), GGGG (서열 번호: 20), 및 GGG (서열 번호: 19)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예들에서, ActRII 융합 단백질은, 예를 들면, 면역글로불린의 Fc 부위를 비롯한 면역글로불린의 불변 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열은 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgA (IgA1 또는 IgA2), IgE, 또는 IgM 면역글로불린의 Fc 도메인에서 유래한다. 예를 들면, 면역글로불린 도메인의 Fc 부위는 가령, 상호작용 쌍의 제 1 구성원은 서열 번호: 14-18 중 하나와 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 이러한 면역글로불린 도메인들은 변형된 Fc 활성, 예컨대, 하나 이상의 Fc 작동체(effector) 기능들의 감소를 부여하는 하나 이상의 아미노산 변형들 (예컨대, 결실, 부가, 및/또는 치환)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, ActRII 융합 단백질은 구성 A-B-C로 제시되는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, B 부분은 본 명세서에 기재된 N- 및 C-말단 절두된 ActRII 폴리펩티드이다. 상기 A 부분과 C 부분은 독립적으로 0, 1 또는 1개 이상의 아미노산일 수 있으며, A 부분과 C 부분은 모두 B에 대하여 이종이다. 상기 A 및/또는 C 부분은 링커 서열을 통하여 상기 B 부분에 부착될 수 있다. 특정 구체예에서, ActRII 융합 단백질은 리더 서열을 포함한다. 리더 서열은 고유 ActRII 리더 서열 (예컨대, 고유 ActRIIA 또는 ActRIIB 리더 서열) 또는 이종 리더 서열일 수 있다. 특정 구체예들에서, 상기 리더 서열은 조직 플라스미노겐 활성제 (TPA) 리더 서열이다.
변이체들 (예컨대, GDF 트랩들)을 비롯하여 ActRII 폴리펩티드는 정제 하위서열, 가령, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 서열, 및 GST 융합을 포함할 수 있다. 임의선택적으로, ActRII 폴리펩티드는 다음에서 선택된 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기를 포함한다: 당화된 아미노산, 페길화(PEGylated) 아미노산, 파르네실화 아미노산, 아세틸화 아미노산, 바이오티닐화 아미노산, 지질 모이어티에 접합된 아미노산, 그리고 유기 유도화 물질에 접합된 아미노산. ActRII 폴리펩티드는 최소한 하나의 N-연결된 당을 포함할 수 있고, 그리고 2, 3개 또는 그 이상의 N-연결된 당을 포함할 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 또한 O-연결된 당을 포함할 수 있다. 일반적으로, ActRII 길항제 폴리펩티드가 폴리펩티드의 자연 당화를 적절히 매개하는 포유동물 세포주에서 발현되어, 환자에서 바람직하지 않은 면역 반응 가능성을 감소시키는 것이 바람직하다. ActRII 폴리펩티드는 유전자조작된 곤충 또는 효모 세포, 그리고 포유동물 세포, 가령, COS 세포, CHO 세포, HEK 세포 및 NSO 세포를 비롯하여, 환자가 사용하기에 적합한 방식으로 단백질을 당화시키는 다양한 세포주에서 생성될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 폴리펩티드는 당화된 것이며, 중국 햄스터 난소 세포주로부터 수득가능한 당화 패턴을 갖는다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRII 폴리펩티드는 포유동물 (예컨대, 마우스 또는 인간)에서 최소한 4, 6, 12, 24, 36, 48, 또는 72 시간의 혈청 반감기를 나타낸다. 선택적으로, ActRII 폴리펩티드는 포유동물 (예컨대, 마우스 또는 인간)에서 최소한 6, 8, 10, 12, 14, 20, 25, 또는 30 일의 혈청 반감기를 나타낼 수 있다.
특정 양상들에서, 본 출원은 본 출원의 하나 이상의 ActRII 길항제 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약학적 약제를 제공한다. 제약학적 약제는 또한 하나 이상의 추가 활성 물질, 가령, 눈 혈관 질환, 가령, 본 명세서에 기재된 질환들을 치료하기 위하여 사용되는 화합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 출원의 제약학적 약제는 실질적으로 파라벤이 없다. 특정 구체예에서, 본 출원은 하나 이상의 눈 혈관 질환들 [예컨대, 연령-관련 황반 변성, 소아 황반 변성, 습성 황반 변성, 건성 황반 변성, 스타르가르트병, 및 베스트병), 망막 혈관 폐색 (예컨대, 중심 망막 혈관 폐색, 절반-망막 혈관 폐색, 망막 분지 혈관 폐색, 및 허혈성 망막 혈관 폐색), 망막 동맥 폐색 (예컨대, 중심 망막 동맥 폐색, 절반-망막 동맥 폐색, 망막 분지 동맥 폐색, 및 허혈성 망막 동맥 폐색), 당뇨 망막병증, 허혈성 시신경병증 [예컨대, 전방 허혈성 시신경병증 (동맥염성 및 비-동맥염성) 및 후방 허혈성 시신경병증], 황반 모세혈관확장증 (I형 또는 II형), 망막 허혈 (예컨대, 급성 망막 허혈 또는 만성 망막 허혈)]을 증가, 치료 또는 예방 중 하나 이상에서 사용하기 위해 라벨처리되고 본 명세서에 기재된 제약학적 약제를 포함하는 포장된 약제들을 제공한다.
특정 양상들에서, 본 출원은 필요로 하는 환자에게 최소한 하나의 ActRII 길항제 및 질환 치료를 위한 최소한 하나의 추가 요법들을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방에 관한 것이며, 상기 추가 요법들은, 예를 들면, 수술, 레이저 요법 (예컨대, 광응고), 항-혈관신생 요법 [예컨대, VEGF 억제제, 가령, 베바시주맙 (Avastin®), 라니비주맙 (Lucentis®), 및 아플리버셉트 (Eylea®)], Ca2+ 억제제 (예컨대, 플루나르진 및 니페디핀), 냉동요법, 고압 산소공급, Na+ 채널 차단제 (예컨대, 토피라메이트), iGluR 길항제 (예컨대, MK-801, 덱스트로메토르판, 엘리프로딜, 및 플루피르틴), 항산화제 (예컨대, 다이메틸티오우레아, 비타민 E, 알파-리포산, 초과산화물 불균등화효소, 카탈라아제, 데스페리옥사민, 만니톨, 알로퓨리놀, 칼슘 도베실레이트, 플루피르틴, 트라이메타지딘, 및 EGB-761), 항염증 물질, 섬모체투열법, 섬모체냉동요법, 안구 필터링 과정, 배액 밸브 이식, 항혈소판제 요법 (예컨대, 아스피린, 티클로피딘, 및 클로피도그렐), 항응고제 요법 (예컨대, 와파린 및 헤파린), 스테로이드제, 전신 또는 국소 코르티코스테로이드제 (예컨대, 프레드니손 트라이암시놀론 (Triesence®), 및 덱사메타손 (Ozurdex®), 스테로이드-보존 면역억제제 (예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 마이코페놀레이트, 모페틸, 인플릭시맙 및 에타네르셉트), 식이 보충제 (예컨대, 비타민 C, 비타민 E, 루테인, 제악산틴, 아연, 염산, 비타민 B6, 비타민 B12, 및 제악산틴), 유리체절제, 공막돌륭술, 및 기체망막유착술을 포함한다.
특정 양상들에서, 본 출원은 ActRII 활성을 길항시키는 (예컨대, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 신호전달, 예컨대, Smad 1, 2, 3, 5, 및 8 신호전달의 억제) 항체 또는 항체들의 조합에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 유효량의 항체 ActRII 길항제, 또는 항체 ActRII 길항제들 (예컨대, ActRII 리간드-결합 항체들, ActRII 항체들, 등)의 조합을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방 방법들을 제공한다. 예를 들면, 특정 구체예에서, 바람직한 본 출원의 ActRII 길항제는 최소한 GDF11에 결합하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 다른 구체예들에서, 바람직한 본 출원의 ActRII 길항제는 최소한 GDF8에 결합하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 다른 구체예들에서, 바람직한 본 출원의 ActRII 길항제는 최소한 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및/또는 액티빈 E)에 결합하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 추가 구체예들에서, 바람직한 본 출원의 ActRII 길항제는 최소한 액티빈 A 및 액티빈 B에 결합하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 추가 구체예들에서, 바람직한 본 출원의 ActRII 길항제는 최소한 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB에 결합하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 또 다른 구체예들에서, 바람직한 본 출원의 ActRII 길항제는, 특히 다중특이적 항체들, 가령, 이중특이적 항체와 관련하여, 최소한 GDF11 및 GDF8에 결합하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 선택적으로, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E), BMP6, 또는 BMP10 중 하나 이상에 추가로 결합한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 최소한 액티빈 B에 추가로 결합한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 실질적으로 액티빈 A에 결합하거나 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 큰 KD로 액티빈 A에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). 일부 구체예들에서, 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 실질적으로 BMP10에 결합하거나 결합하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 큰 KD로 BMP10에 결합하거나 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐).
특정 예들에서, 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방을 위해 본 출원의 ActRII 길항제, 또는 길항제들의 조합을 투여할 때, 적혈구들에 대한 바람직하지 않은 효과를 감소시키기 위하여 ActRII 길항제를 투여하는 동안 적혈구들에 대한 효과를 모니터하는 것, 또는 ActRII 길항제의 투여량을 결정 또는 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 적혈구 수준, 헤모글로빈 수준, 또는 적혈구용적률 수준의 증가는 바람직하지 않은 혈압 증가를 유발할 수 있다.
도면의 간단한 설명
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도 1은 다중 ActRIIB 및 ActRIIA 결정 구조의 복합 분석에 근거하여, humActRIIA의 세포외 도메인(서열 번호: 51)과 humActRIIB의 세포외 도메인 (서열 번호: 2)의 정렬을, 본 명세서에서 상자로 표시된 리간드와 직접 접촉하는 것으로 추측되는 잔기와 함께 보여준다.
도 2는 다양한 척추동물 ActRIIB 단백질의 다중 서열 정렬 및 인간 ActRIIA (서열 번호: 52-58) 뿐만 아니라 이러한 정렬로부터 유래한 공통 ActRII 서열 (서열 번호: 27)을 보여준다.
도 3은 CHO 세포에서 발현된 ActRIIA-hFc의 정제를 보여준다. 단백질은 크기 컬럼 (상부 패널) 및 쿠마씨(Coomassie) 염색 SDS-PAGE (하부 패널) (왼쪽 레인: 분자량 표준; 오른쪽 레인: ActRIIA-hFc)에서 보는 바와 같이 하나의, 잘-정의된 최고점으로 정제된다.
도 4는 BiacoreTM 분석법으로 측정한, 액티빈 (상부 패널) 및 GDF-11 (하부 패널)에 대한 ActRIIA-hFc의 결합을 보여준다.
도 5는 TPA 리더 서열 (두줄 밑줄), ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호: 1의 잔기들 20-134; 한줄 밑줄), 및 hFc 도메인을 포함하는 GDF 트랩 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc (서열 번호: 46)에 대한 전체 아미노산 서열을 보여준다. 고유 서열 내 위치 79에서 치환된 아스파르테이트는 두줄 밑줄 표시되어 강조되고, 시퀀싱에 의해 성숙 융합 단백질에서 N-말단 잔기가 되는 것으로 드러난 글리신에 대하여도 같다.
도 6A 및 6B는 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 서열 번호: 47은 센스 가닥에 해당하며, 서열 번호: 60은 안티센스 가닥에 해당한다. TPA 리더 (뉴클레오티드 1-66)에 두줄 밑줄 표시하고, ActRIIB 세포외 도메인 (뉴클레오티드 76-420)에 한줄 밑줄 표시한다.
도 7은 TPA 리더 (두줄 밑줄), 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호: 1의 잔기들 25-131; 한줄 밑줄), 및 hFc 도메인을 포함하는 절두된 GDF 트랩 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (서열 번호: 61)에 대한 전체 아미노산 서열을 보여준다. 고유 서열 내 위치 79에서 치환된 아스파르테이트에 두줄 밑줄 표시하여 강조하고, 시퀀싱에 의해 성숙 융합 단백질에서 N-말단 잔기가 되는 것으로 드러난 글루타메이트에 대하여도 같다.
도 8A 및 8B는 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 서열 번호: 62은 센스 가닥에 해당하며, 서열 번호: 63은 안티센스 가닥에 해당한다. TPA 리더 (뉴클레오티드 1-66)에 두줄 밑줄 표시하고, 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (뉴클레오티드 76-396)에 한줄 밑줄 표시한다. ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호: 1의 잔기들 25-131)에 대한 아미노산 서열 또한 도시한다.
도 9는 리더가 없는 절두된 GDF 트랩 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc에 대한 아미노산 서열을 보여준다 (서열 번호: 64). 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호: 1의 잔기들 25-131)에 밑줄 표시한다. 고유 서열 내 위치 79에서 치환된 아스파르테이트에 두줄 밑줄 표시하여 강조하고, 시퀀싱에 의해 성숙 융합 단백질에서 N-말단 잔기가 되는 것으로 드러난 글루타메이트에 대하여도 같다.
도 10은 리더, hFc 도메인, 및 링커가 없는 절두된 GDF 트랩 ActRIIB(L79D 25-131)에 대한 아미노산 서열을 보여준다 (서열 번호: 65). 고유 서열 내 위치 79에서 치환된 아스파르테이트에 밑줄 표시하여 강조하고, 시퀀싱에 의해 성숙 융합 단백질에서 N-말단 잔기가 되는 것으로 드러난 글루타메이트에 대하여도 같다.
도 11A 및 11B는 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc를 인코딩하는 대안적 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 서열 번호: 66은 센스 가닥에 해당하며, 서열 번호: 67은 안티센스 가닥에 해당한다. TPA 리더 (뉴클레오티드 1-66)에는 두줄 밑줄 표시하고, 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (뉴클레오티드 76-396)에는 밑줄 표시하고, 세포외 도메인의 야생형 뉴클레오티드 서열에서의 치환에 두줄 밑줄 표시하여 강조한다 (서열 번호: 62와 비교, 도 8). ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호: 1의 잔기들 25-131)에 대한 아미노산 서열 또한 도시한다.
도 12는 도 11에 도시된 대안적 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 66)의 뉴클레오티드 76-396 (서열 번호: 68)을 보여준다. 이 도면에서 도 11에 표시된 것과 동일한 뉴클레오티드 치환들에도 밑줄을 긋고 이 부분을 강조하였다. 서열 번호: 68은 L79D 치환된 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호: 1의 잔기들 25-131에 해당), 예컨대, ActRIIB(L79D 25-131) 만을 인코딩한다.
도 13은 GDF 트랩이 비효과적인 적혈구생성을 완화시키고 마우스 MDS 모델에서 다수의 질병 중증도 단계들에서의 빈혈을 개선함을 보여준다. (A) 주 2회 8주 동안 대략 6 개월령 (초기 단계)에서 종료한, 운반체 (트리스-완충 식염수, TBS, n = 5) 처리된 야생형 (Wt) 마우스, TBS 처리된 MDS 마우스 (n = 5), 및 ActRIIB(L79D 25-131)-mFc (10 mg/kg, n = 6) 처리된 MDS 마우스에서 RBC 수와 헤모글로빈 농도 (상부) 및 골수 내 조혈 전구체의 형태학적 측정 (하부). *P < 0.05, **P < 0.01, 대 TBS-처리된 MDS 마우스.; # # # P < 0.001 대 야생형 마우스. (B) ActRIIB(L79D 25-131)-mFc (10 mg/kg, 주 2회, n = 5) 또는 TBS (n = 4)로 7주 동안 처리하고 대략 12 개월령 (후기 단계)에서 종료한 MDS 마우스에서 패널 A에서와 동일한 결과 변수들. *P < 0.05 대 TBS-처리된 MDS 마우스. 데이터는 평균 ± SEM이다.
도 14는 다양한 척추동물 ActRIIA 단백질들 및 인간 ActRIIA의 다수의 서열 정렬을 보여준다 (서열 번호: 69-76).
도 15는 Clustal 2.1을 사용하여 인간 IgG 아이소형으로부터 얻은 Fc 도메인들의 다수 서열 정렬을 보여준다. 힌지 영역은 점선 밑줄로 표시된다.
도 16은 ActRIIB(25-131)-hFc (서열 번호: 79)에 대한 전체 비가공 아미노산 서열을 보여준다. TPA 리더 (잔기들 1-22) 및 이중-절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (잔기들 24-131, 서열 번호: 1의 고유 서열에 기초한 넘버링을 사용)들에 각각 밑줄 표시한다. 서열 번호: 1과 관련하여 위치 25에 있는, 시퀀싱에 의해 성숙 융합 단백질의 N-말단 아미노산인 것으로 드러난 글루타메이트를 강조표시하였다.
도 17A 및 17B는 ActRIIB(25-131)-hFc를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여준다 (코딩 가닥은 상부에 나타내고, 서열 번호: 80, 상보적인 가닥은 하부에 3'-5'로 나타낸다, 서열 번호: 81). TPA 리더 (뉴클레오티드 1-66) 및 ActRIIB 세포외 도메인 (뉴클레오티드 73-396)을 인코딩하는 서열들에 밑줄 표시한다. ActRIIB(25-131)에 해당하는 아미노산 서열 또한 보여준다.
도 18은 ActRIIB(25-131)-hFc를 인코딩하는 대안적 뉴클레오티드 서열을 보여준다 (코딩 가닥은 상부에 나타내고, 서열 번호: 82, 상보적인 가닥은 하부에 3'-5'로 나타낸다, 서열 번호: 83). 이러한 서열은 초기 형질전환에서 보다 큰 단백질 발현 수준을 제공하여, 더 신속한 과정으로 세포주를 발달시킨다. TPA 리더 (뉴클레오티드 1-66) 및 ActRIIB 세포외 도메인 (뉴클레오티드 73-396)을 인코딩하는 서열들에 밑줄을 그었으며, ECD의 야생형 뉴클레오티드 서열에서의 치환 (도 17 참고)을 강조하였다. ActRIIB(25-131)에 해당하는 아미노산 서열 또한 보여준다.
발명의 상세한 설명
1. 개요
형질변환 성장 인자-베타 (TGF-베타) 슈퍼패밀리는 공통의 서열 요소들과 구조적 모티프를 공유하는 다양한 성장 인자들을 함유한다. 이들 단백질은 척추동물과 비척추동물 모두의 광범위한 다양한 세포 유형에서 생물학적 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다. 슈퍼패밀리의 구성원들은 패턴 형성 및 조직 특화에 있어서 배발달 동안 중요한 기능을 수행하고, 지질생성, 근육 형성, 연골 형성, 심장 형성, 조혈, 신경 발생 및 상피 세포 분화를 비롯한 다양한 분화 과정에 영향을 줄 수 있다. TGF-베타 패밀리의 구성요소의 활성을 조절함으로써, 유기체에서 유의적인 생리학적 변화를 야기시키는 것이 대개 가능하다. 예를 들면, 피에몬테 및 벨기에 푸른 소 품종 (Piedmontese and Belgian Blue cattle breeds)은 GDF8 (미오스타틴으로도 불림) 유전자에서의 기능소실 돌연변이를 지니고 있는데, 이는 눈에 띄는 근육 덩어리의 증가를 유발한다 [예컨대, Grobet 외. (1997) Nat Genet. 17(1):71-4 참조]. 더욱이, 인간에서, GDF8의 비활성 대립유전자는 증가된 근육 질량, 그리고, 이례적으로 우수한 힘과 연관되는 것으로 보고된다 [예컨대, Schuelke 외. (2004) N Engl J Med, 350:2682-8 참조].
TGF-β 신호들은 리간드 자극 시 하류 SMAD 단백질 (가령, SMAD 단백질 1, 2, 3, 5, 및 8) 을 인산화시키고 활성화시키는 I형 및 II형 세린/트레오닌 키나제 수용체들의 이종 복합체에 의해 매개된다[Massaguㅹ (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178]. 이들 유형 I 및 유형 II 수용체는 시스테인-풍부 영역을 가지는 리간드-결합 세포외 도메인, 막경유 도메인, 그리고 예상되는 세린/트레오닌 특이성을 가지는 세포질 도메인으로 구성된 막경유 단백질이다. I형 수용체들은 신호전달에 필수적이다. II형 수용체들은 결합 리간드들의 결합 및 I형 수용체들의 활성화에 필요하다. I형 및 II형 액티빈 수용체들은 리간드 결합 후 안정적 복합체를 형성하고, II형 수용체에 의해 I형 수용체가 인산화된다.
두 개의 관련 II형 수용체들 (ActRII), ActRIIA 및 ActRIIB는 액티빈들에 대한 II형 수용체들로 확인되었다 [예컨대, Mathews and Vale (1991) Cell 65:973-982; 및 Attisano 외. (1992) Cell 68: 97-108 참조]. 액티빈 이외에도, ActRIIA 및 ActRIIB는, 예를 들면, BMP6, BMP7, 결절, GDF8, 및 GDF11를 비롯한 몇가지 다른 TGF-β 패밀리 단백질들과 생화학적으로 상호작용할 수 있다 [예컨대, Yamashita 외. (1995) J. Cell Biol. 130:217-226; Lee 및 McPherron (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9306-9311; Yeo 및 Whitman (2001) Mol. Cell 7: 949-957; 및 Oh 외. (2002) Genes Dev. 16:2749-54 참조]. ALK4는 액티빈, 특히, 액티빈 A에 대한 일차 I형 수용체이며, ALK-7은 다른 액티빈들, 특히, 액티빈 B에 대한 수용체로도 기능할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 출원은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 억제제, 특히, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP9, BMP10, BMP6, GDF3, GDF11 및/또는 GDF8 중 하나 이상을 길항할 수 있는 억제제로 ActRII 수용체의 리간드 (또한 ActRII 리간드로도 지칭됨)를 길항하는 것에 관한 것이다.
액티빈은 TGF-베타 수퍼패밀리에 속하는 이량체 폴리펩티드 성장 인자이다. 2개의 밀접하게 관련된 β 소단위 (βAβA, βBβB, 및 βAβB, 차례로)의 동종/이종이량체인 3가지 주요 액티빈 형태(A, B, 및 AB)가 있다. 인간 게놈은 또한 주로 간에서 발현되는 액티빈 C 및 액티빈 E 를 인코드하고, 그리고 βC 또는 βE를 함유하는 이종이량체 형태 또한 공지되어 있다.
TGF-베타 슈퍼패밀리에서, 액티빈은 난소 및 태반 세포에서 호르몬 생성을 자극하고, 신경 세포 생존을 지원하고, 세포 유형에 따라 세포주기 진행에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있고, 그리고 적어도 양서류 태아에서 중배엽 분화를 유도할 수 있는 독특하고 다기능적 요소다 [DePaolo 외. (1991) Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dyson 외. (1997) Curr Biol. 7:81-84; 그리고 Woodruff (1998) Biochem Pharmacol. 55:953-963]. 더욱이, 자극된 인간 단핵구 백혈병 세포들로부터 분리된 적혈구 분화 인자 (EDF)는 액티빈 A와 동일한 것으로 밝혀졌다 [Murata 외. (1988) PNAS, 85:2434]. 액티빈 A는 골수에서 적혈구생성을 촉진시킴이 제시된 바 있다. 몇몇 조직에서, 액티빈 신호전달은 이의 관련된 이종이량체, 인히빈에 의해 길항된다. 예를 들면, 뇌하수체로부터 난포-자극 호르몬 (FSH)을 방출하는 동안, 액티빈은 FSH 분비 및 합성을 촉진시키는 반면, 인히빈은 FSH 분비 및 합성을 억제한다. 액티빈 생활성을 조절하고 및/또는 액티빈에 결합하는 다른 단백질은 폴리스타틴 (FS), 폴리스타틴-관련된 단백질 (FSRP, 또한 FLRG 또는 FSTL3으로도 알려짐), 및 α2-마크로글로불린을 포함한다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 단리된 βA 소단위 또는 이량체 복합체 (가령, βAβA 동종이량체 또는 βAβB 이종이량체)에서 "액티빈 A"에 결합하는 물질은 βA 소단위에 특이적으로 결합하는 물질이다. 이종이량체 복합체 (가령, βAβB 이종이량체)의 경우, "액티빈 A"에 결합하는 물질은 βA 소단위 안에 존재하는 에피토프(epitopes)에 특이적이지만, 이 복합체의 비-βA 소단위 (가령, 복합체의 βB 소단위 ) 안에 존재하는 에피토프에는 결합하지 않는다. 유사하게, "액티빈 A"를 길항(억제)하는 것으로 본 명세서에서 공개된 물질은 단리된 βA 소단위 또는 이량체 복합체 (가령, βAβA 동종이량체 또는 βAβB 이종이량체)에서 βA 소단위에 의해 매개되는 하나 또는 그 이상의 활성을 억제하는 물질이다. βAβB 이종이량체의 경우에, "액티빈 A"를 억제하는 물질은 βA 소단위의 하나 또는 그 이상의 활성을 특이적으로 억제하지만, 복합체의 비-βA 소단위 (가령, 복합체의 βB 소단위)의 활성을 억제하지 않는 물질이다. 이러한 원리는 "액티빈 B", "액티빈 C" 및 "액티빈 E"에 결합하고 및/또는 이를 억제하는 물질에도 적용된다. "액티빈 AB"에 길항작용하는 본 출원에 개시된 물질은 βA 소단위에 의해 매개된 하나 또는 그 이상의 활성 및 βB 소단위에 의해 매개된 하나 또는 그 이상의 활성을 억제하는 물질이다.
성장 및 분화 인자-8 (GDF8)은 또한 미오스태틴으로 알려져 있다. GDF8은 골격 근육 질량의 음성 조절인자이다. GDF8은 성장중인 그리고 성인 골격 근육에서 많이 발현된다. 유전자삽입 마우스에서의 GDF8 무효화 돌연변이는 눈에 띄는 골격 근육 비대 및 과형성으로 특징지어진다 [McPherron 외., Nature, 1997, 387:83-90]. 소에서 GDF8의 자연 발생 돌연변이에서 골격근량의 비슷한 증가가 있고 [예컨대, Ashmore 외. (1974) 성장, 38:501-507; Swatland 및 Kieffer, J. Anim. Sci. (1994) 38:752-757; McPherron 및 Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461; Kambadur 외. Genome Res. (1997) 7:910-915 참조] 그리고 인간에서 현저하게 나타난다 [Schuelke 외. (2004) N Engl J Med, 350:2682-8 참조]. 연구에 따르면, 사람의 HIV 감염과 관련된 근육 소모는 GDF8 단백질 발현 증가를 수반하는 것으로 나타났다 [예컨대, Gonzalez-Cadavid 외., (1998) PNAS 95:14938-43 참조]. 또한, GDF8은 근육 특이적 효소 (예: 크레아틴 키나아제)의 생산을 조절하고, 근섬유 세포 증식을 조절할 수 있다.[예컨대, 국제 공개특허 출원 WO 00/43781 참조]. GDF8 프로펩티드(propeptide)는 성숙한 GDF8 도메인 이량체에 비공유 결합하여, 그 생물학적 활성을 불활성화시킬 수 있다 [예컨대, Miyazono 외. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield 외. (1988) J. Biol. Chem., 263: 7646-7654; 그리고 Brown 외. (1990) Growth Factors, 3: 35-43 참조]. GDF8 또는 구조적으로 관련된 단백질에 결합하고, 이들의 생물학적 활성을 억제시키는 다른 단백질은 폴리스타틴, 그리고 잠재적으로, 폴리스타틴-관련된 단백질을 포함한다.[예컨대, Gamer 외. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232 참조].
성장 및 분화 인자-11 (GDF11)은, BMP11로도 알려져있으며, 분비되는 단백질이다 [McPherron 외. (1999) Nat. Genet. 22: 260-264]. GDF11은 마우스 발생 동안 꼬리싹(tail bud), 팔다리싹(limb bud), 상악 및 하악 아치, 그리고 후근 신경절에서 발현된다 [예컨대, Nakashima 외. (1999) Mech. Dev., 80: 185-189 참조]. GDF11은 중배엽 및 신경 조직 모두에서 패턴화에 독특한 역할을 한다 [예컨대, Gamer 외. (1999) Dev Biol., 208:222-32 참조]. GDF11은 병아리 날개 발달에있어서 연골 형성 및 근형성의 음성 조절인자인 것으로 나타났다 [예컨대, Gamer 외. (2001) Dev Biol., 229:407-20 참조]. 근육에서 GDF11의 발현은 GDF8과 유사한 방식으로 근육 성장을 조절하는 역할을 암시한다. 또한, 뇌에서 GDF11의 발현은 GDF11이 또한 신경계의 기능과 관련된 활성을 가질 수 있음을 시사한다. 흥미롭게도, GDF11은 후각 상피의 신경 발생을 억제하는 것으로 밝혀졌다.[예컨대, Wu 외. (2003) Neuron., 37:197-207 참조].
ActRII 폴리펩티드 (예컨대, ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드, 뿐만 아니라 이의 변이체들, 가령, GDF 트랩)은 생체내 적혈구 수준을 증가시키기 위해 사용될 수 있음이 증명되었다 (예컨대, WO 2008/046437 및 WO 2010/019261 참조). 본 명세서에 기재된 특정 예들에서, GDF 트랩 폴리펩티드는 비변형된 ActRII 폴리펩티드에 해당하는 샘플과 비교하여 독특한 생물학적 성질로 특성화되는 것으로 나타난다. 이러한 GDF 트랩은, 부분적으로는, 액티빈 A에 대한 결합 친화력의 실질적 소실, 그리고 그에 따른 액티빈 A 활성의 길항 능력의 현저한 감소로 특징되나, GDF11의 결합 및 억제는 거의 야생형 수준으로 유지한다. GDF 트랩은 상응하는 비변형된 ActRIIB 폴리펩티드에 비해 적혈구 수준을 증가시킴에 보다 효과적이며 다양한 빈혈 모델에서 유익한 효과를 가진다. 그러므로 적혈구 수준과 관련하여 관찰된 ActRII 폴리펩티드의 생물학적 활성은 액티빈 A 억제에 의존하지 않음을 나타낸다. 그러나 액티빈 A 결합을 유지하는 비변형된 ActRII 폴리펩티드는, 생체내 적혈구들을 증가시키는 능력을 여전히 입증함을 유념하여야 한다. 더욱이, 액티빈 A 억제를 유지하는 ActRII 폴리펩티드는 액티빈 A에 대한 감소된 결합 친화력을 가지는 GDF 트랩과 비교하여, 보다 약간의 적혈구 수준 증가가 바람직하거나 및/또는 어느 정도 수준의 오프-타겟 활성이 허용가능한 (또는 심지어 바람직한) 일부 분야에서 더욱 바람직할 수 있다. 조혈작용은 에리트로포이에틴, G-CSF, 및 철 항상성을 비롯한 다양한 인자들에 의해 조절되는 복잡한 과정임을 유념하여야 한다. 용어 "적혈구 수준을 증가" 및 "적혈구 형성을 촉진"은 refer to 임상적으로 관찰가능한 측정치들, 가령, 적혈구용적률, 적혈구 수, 및 헤모글로빈 측정지표를 지칭하며, 이러한 변화를 발생시키는 메커니즘에 대해서는 중립적인 것으로 한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, ActRII 길항제 (억제제)는 MDS 환자들에 있어서 헤모글로빈 수준을 증가시키고 혈액 수혈 부하를 감소시키기 위하여 사용될 수 있는 것으로 결정되었다. 따라서, 이들 데이터는 ActRII 억제제들이, 선택적으로 하나 이상의 지지 요법들과 병용하여, 필요로 하는 대상체에서 골수형성이상 증후군을 치료하기 위해, 철적모구 빈혈을 치료하기 위해, 그리고 철적모구 빈혈 또는 골수형성이상 증후군의 하나 이상의 합병증들 (예컨대, 빈혈, 혈액, 수혈 필요성, 철 과부하, 중성구감소증, 비장비대, 및 급성 골수성 백혈병으로의 진행)을 치료 또는 예방하기 위하여, 그리고, 선택적으로, 골수 세포들의 SF3B1 유전자에서 고리 철적혈모구 및/또는 하나 이상의 돌연변이를 가지는 환자들의 하위 그룹에서 사용될 수 있음을 나타낸다.
놀랍게도, ActRII 길항제는 또한 MDS 환자의 시력을 개선시킴이 관찰되었다. 그러므로, 빈혈 치료에 대한 긍정적인 효과 이외에도, ActRII 억제제들은 MDS 환자들에서 시각의 증대 (예컨대, 시력 및/또는 시야의 증대)를 가져올 수 있다. 더욱이, MDS-관련 시각 소실에 관하여 보고된 메커니즘 [Han 외. (2015) J Glaucoma (인쇄 전 전자 간행물); Brouzas 외. (2009) Clinical Ophthalmology 3:133-137]을 보면, 데이터들은, 이러한 억제제가 또한 다른 유형의 안구 (눈) 질환들, 특히, 허혈 및 혈관 기능부전과 관련된 질환들의 치료에 대해 긍정적인 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다.
따라서, 본 출원의 방법들은, 부분적으로, 필요로 하는 대상체에서 눈 혈관 질환을 치료 또는 예방하거나, 눈 혈관 질환 환자에서 시각을 개선 (예컨대, 시력 및/또는 시야를 증대)하거나, 및/또는 눈 혈관 질환의 하나 이상의 합병증들을 치료 또는 예방하기 위하여 하나 이상의 ActRII 길항제 (억제제)를, 선택적으로 하나 이상의 지지 요법들과 병용하여 사용하는 것에 관련된다.
이 명세서에서 사용된 용어는 일반적으로 본 개시 내용 및 각 용어가 사용되는 특정 상황에서 당해 분야의 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 명세서의 구성 및 방법을 설명하고, 이를 작성하고 사용하는 방법에 대해 숙련된 기술자에게 추가 지침을 제공하기 위해 아래 또는 다른 곳에서 논의된다. 어떤 용어의 사용의 범위나 의미는 그것이 사용되는 특정 상황에서 명백해질 것이다.
모든 문법적 형태 및 단어 변이에서 "상동성(Homologous)"이란 동일한 유기체 종에서 슈퍼패밀리의 단백질을 포함하는 "공통적인 진화 기원"을 포함하는 두개 단백질간의 상관관계를 지칭하거나, 뿐만 아니라 상이한 유기체 종의 상동성 단백질을 지칭한다. 이러한 단백질 (및 이의 인코딩 핵산)은 서열 상동성을 갖고, 동일성 (%) 또는 특정 잔기 또는 모티프 및 보존된 위치의 존재 여부와 관계없이, 서열 유사성에 의해 반영되는 바와 같은 서열 상동성을 갖는다.용어 "서열 유사성(sequence similarity)"은 모든 문법적 형태에서 일반적인 진화론적 기원을 공유하거나 공유하지 않을 수 있는 핵산 또는 아미노산 서열 간의 동일성 또는 일치 정도를 의미한다. 그러나, 일반적인 용도 및 당해 출원에서, "상동성"이라는 용어는 "매우"와 같은 부사로 수식될 때 서열 유사성을 지칭할 수 있고, 일반적인 진화적 기원과 관련 될 수도 있고 또는 그렇지 않을 수 도 있다.
기준 폴리펩티드 (또는 뉴클레오티이드) 서열에 대한 "서열 동일성 백분율(%)"은 후보 서열의 아미노산 잔기(또는 핵산)이 기준 폴리펩티드(뉴클레오티드) 서열에의 아미노산 잔기(또는 핵산)과 동일한 아미노산 잔기 (또는 핵산)의 백분율로 정의되는데, 이때 서열을 정렬시킨 후 최대 서열 동일성 백분율을 얻기 위하여 필요하다면 갭을 도입하고, 보존적 치환은 상기 서열의 동일성의 일부분으로 간주되지 않는다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 해당 분야의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로 성취될 수 있다. 숙련된 기술자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 (핵산) 서열 동일성 %값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 작성되었으며, 소스 코드(source code)는 미국 저작권청 (Washington D.C., 20559)에 사용자 문서로 제출되어 미국 저작권 등록 번호 TXU510087에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코의 Genentech, Inc.에서 공개적으로 입수할 수 있으며, 소스 코드에서 컴파일 할 수도 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여 UNIX 운영 체제에서 사용하도록 컴파일해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 가변적이지 않다.
"항진하다(Agonize)"는 모든 문법적 형태로 (예컨대, 단백질의 유전자 발현을 활성화 또는 증폭하거나 비활성 단백질을 활성 상태로 유도함으로써) 단백질 및/또는 유전자를 활성화하거나 단백질 및 단백질을 증가시키는 과정을 의미한다.
"길항하다(Antagonize)"는 모든 문법적 형태로 (예컨대, 단백질의 유전자 발현을 억제 또는 감소시키거나 활성 단백질을 비활성화상태로 유도함으로써) 단백질 및/또는 유전자를 억제하거나 단백질 및 단백질을 감소시키는 과정을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 다른 언급이 없는 한, "X에 실질적으로 결합하지 않는다"는 한 물질이 "X"에 대하여 약 10-7, 10-6, 10-5, 10-4, 또는 그 이상의 KD를 가진다는 의미(가령, "X"에 대하여 KD 를 결정하는데 이용된 분석에 의해 탐지가능한 결합이 없음, 또는 "X"에 대하여 비교적 약한 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐)이다.
명세서 및 청구 범위에 걸쳐 수치와 관련하여 사용되는 용어 "약(about)" 및 "대략(대략ly)"이란 숙련된 기술자에게 친숙하고 수용가능한 정확도의 구간을 나타낸다. 일반적으로, 이러한 정확도 구간은 ± 10%이다. 대안으로, 그리고 특히 생물학적 계통에서, 용어 "약" 및 "대략"은 주어진 값의 크기의 차수, 바람직하게는 ≤5 배,보다 바람직하게는 ≤2 배 이내의 값을 의미 할 수 있다.
여기에 개시된 수치 범위는 범위를 정의하는 수치를 포함한다.
용어 "a"및 "an"은 용어가 사용된 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수형을 포함한다. 용어 "하나 또는 이상의" 및 "최소 하나의"은 물론 교환 할 수 있는 용어로 "하나"(또는 "하나")라는 용어를 사용할 수 있다. 더욱이, 본 명세서에서 사용 된 "및/또는"은 둘 또는 그 이상의 특정 특징 또는 구성 요소의 각각의 구체적인 설명으로서 취해질 것이다. 따라서, 구절에서 사용된 용어 "및/또는", 이를 테면 "A 및/또는 B"는 "A와 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)을 포함한다. 마찬가지로, "A, B, 및 / 또는 C"와 같은 문구에 사용된 "및/또는"이라는 용어는 다음 각 측면을 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본 명세서 전반에 걸쳐, "포함한다"라는 단어 또는 "포함하는"또는 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 정수 그룹을 포함하지만, 다른 정수 또는 정수 그룹을 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
2. ActRII 길항제
본 명세서에 제시되는 데이터들은 ActRII 길항제 (억제제) (예컨대, ActRII-매개 Smad 1, 2, 3, 5, 및 8 신호전달의 억제제)가 눈 혈관 질환 치료에 사용될 수 있음을 나타낸다. 특히, ActRII 길항제는 MDS 환자의 시각 증대에 효과적인 것으로 나타났다. MDS 환자들의 시각 소실은 허혈 및/또는 혈관 기능부전에 의해 매개되는 혈관 부전과 관련되었다 [Han 외. (2015) J Glaucoma (Epub ahead of print); Brouzas 외. (2009) Clinical Ophthalmology 3:133-137]. 따라서 본 출원은 부분적으로 필요로 하는 환자에서 눈 혈관 질환들 [예컨대, 황반 변성 (예컨대, 연령-관련 황반 변성, 소아 황반 변성, 습성 황반 변성, 건성 황반 변성, 스타르가르트병, 및 베스트병), 망막 혈관 폐색 (예컨대, 중심 망막 혈관 폐색, 절반-망막 혈관 폐색, 망막 분지 혈관 폐색, 망막 혈관 폐색 후 황반 부종, 및 허혈성 망막 혈관 폐색), 망막 동맥 폐색 (예컨대, 중심 망막 동맥 폐색, 절반-망막 동맥 폐색, 망막 분지 동맥 폐색, 및 허혈성 망막 동맥 폐색), 당뇨 망막병증, 당뇨성 황반 부종, 허혈성 시신경병증 [예컨대, 전방 허혈성 시신경병증 (동맥염성 및 비-동맥염성) 및 후방 허혈성 시신경병증], 황반 모세혈관확장증 (I형 또는 II형), 망막 허혈 (예컨대, 급성 망막 허혈 또는 만성 망막 허혈), 안구 허혈 증후군, 망막 혈관염, 및 미숙아 망막병증]을 치료 또는 예방; 눈 혈관 질환을 가진 필요로 하는 환자에서 시각 (예컨대, 시력 및/또는 시야)를 증대; 및/또는 눈 혈관 질환의 하나 이상의 합병증들을 치료 또는 예방하기 위하여 사용될 수 있는 다양한 ActRII 길항제를 단독으로 또는 하나 이상의 추가 지지 요법들과 조합하여 제공한다.
특정 양상들에서, 본 명세서에 개시된 방법들에 따라 사용되는 ActRII 길항제는 ActRII 폴리펩티드 (ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드)이며 이의 절두형 및 변이체들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에 개시된 방법들에 따라 사용되는 바람직한 ActRII 길항제는 GDF11 및/또는 GDF8에 대하여는 강한 내지 중간의 결합 친화력을 유지하지만, 상응하는 비-변이체 ActRII 폴리펩티드와 비교시 하나 이상의 ActRII 리간드들 (예컨대, 액티빈 A)에 대한 결합은 감소된 변이체 ActRII 폴리펩티드이다. 이러한 변이체 ActRII 폴리펩티드는 본 명세서에서 일반적으로 "GDF 트랩" 또는 "GDF 트랩 폴리펩티드"로 지칭된다.
가용성 ActRII 폴리펩티드 및 이의 변이체들 (예컨대, GDF 트랩)은 ActRII 리간드들의 억제가 아닌 다른 메커니즘을 통해 눈 혈관 질환들의 시각 또는 다른 합병증들에 영향을 줄 수 있지만 [예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, GDF3, BMP10, 및/또는 BMP9 중 하나 이상의 억제는, 아마도, TGF-베타 수퍼패밀리의 다른 구성원들을 비롯한 추가 물질들 범위의 활성을 억제하는 한 물질의 경향 지표가 될 수 있으며 이러한 집합적 억제는, 예를 들면, 시각에 대해 원하는 효과를 가져올 수 있다], 예를 들면, 항-GDF11 항체들; 항-GDF8 항체들; 항-ActRIIA 항체들; 항-ActRIIB 항체들; 항-ActRIIA/IIB 항체들; 항-액티빈 항체들; 항-BMP6 항체들; 항-GDF3 항체들; 항-BMP10 항체들; 항-BMP9 항체들; GDF11, GDF8, ActRIIA, ActRIIB, 액티빈, BMP6, GDF3, BMP10, 및 BMP9 중 하나 이상의 발현 (예컨대, 전사, 번역, 세포로부터의 분비, 또는 이의 조합)을 억제하는 핵산들; 뿐만 아니라 GDF11, GDF8, ActRIIA, ActRIIB, 액티빈, BMP6, GDF3, BMP10, 및 BMP9 중 하나 이상의 소분자 억제제를 비롯한 다른 유형들의 ActRII 리간드 및 수용체 억제제들, 또는 억제제들의 조합이 본 출원의 방법들에 따라 사용가능한 것으로 예상된다.
A. ActRII 폴리펩티드
특정 양상들에서, 본 출원은 ActRII 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 필요로 하는 환자에서 눈 질환, 특히, 눈 혈관 질환 [예컨대, 황반 변성 (예컨대, 연령-관련 황반 변성, 소아 황반 변성, 습성 황반 변성, 건성 황반 변성, 스타르가르트병, 및 베스트병), 망막 혈관 폐색 (예컨대, 중심 망막 혈관 폐색, 절반-망막 혈관 폐색, 망막 분지 혈관 폐색, 망막 혈관 폐색 후 황반 부종, 및 허혈성 망막 혈관 폐색), 망막 동맥 폐색 (예컨대, 중심 망막 동맥 폐색, 절반-망막 동맥 폐색, 망막 분지 동맥 폐색, 및 허혈성 망막 동맥 폐색), 당뇨 망막병증, 당뇨성 황반 부종, 허혈성 시신경병증 [예컨대, 전방 허혈성 시신경병증 (동맥염성 및 비-동맥염성) 및 후방 허혈성 시신경병증], 황반 모세혈관확장증 (I형 또는 II형), 망막 허혈 (예컨대, 급성 망막 허혈 또는 만성 망막 허혈), 안구 허혈 증후군, 망막 혈관염, 및 미숙아 망막병증]을 치료 또는 예방하거나, 눈 혈관 질환을 가진, 필요로 하는 환자에서 시각을 개선 (예컨대, 시력 증대 및/또는 시야 증대)하거나, 및/또는 눈 혈관 질환의 하나 이상의 합병증들을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 폴리펩티드를 단독으로 또는 하나 이상의 추가 활성 물질 또는 지지 요법들과 병용하여 사용하는 방법들을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "ActRII"는 II형 액티빈 수용체들의 패밀리를 지칭한다. 이러한 패밀리는 IIA형 액티빈 수용체 (ActRIIA) 및 IIB형 액티빈 수용체 (ActRIIB)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "ActRIIB"는 임의의 종으로부터 얻은 액티빈 수용체 IIB형 (ActRIIB) 단백질 그리고 이러한 ActRIIB 단백질로부터 돌연변이 유발 또는 다른 변형에 의해 유도된 변이체의 패밀리를 나타낸다. ActRIIB의 지칭은 현재 나타낸 형태들 중 하나에 대한 지칭으로 이해하면 된다. ActRIIB 패밀리의 구성원들은 시스테인-풍부 영역을 가지는 리간드-결합 세포외 도메인, 막경유 도메인, 및 예상 세린/트레오닌 키나아제 활성을 가지는 세포질 도메인으로 이루어진 막경유 단백질이다.
용어 "ActRIIB 폴리펩티드"는 ActRIIB 패밀리 구성원의 자연 발생적 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 뿐만 아니라, 유용한 활성을 보유하는 이의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편, 융합체 및 펩티드 모방체 형태들을 포함함)를 포함한다. 이러한 변이체 ActRIIA 폴리펩티드들의 예는 본 명세서 뿐만 아니라 국제 특허 출원 공개 번호. WO 2006/012627에서 제공되며, 이의 전문은 본 명세서에 참고자료로 포함된다. 본원에 기술된 모든 ActRIIB 관련 폴리펩티드에 대한 아미노산의 넘버링은 달리 명시하지 않는 한, 하기에 제공된 인간 ActRIIB 전구체 단백질 서열 (서열 번호: 1)의 번호에 기초한다.
인간 ActRIIB 전구체 단백질 서열은 다음과 같다:
Figure pct00001
501 TNVDLPPKES SI (서열 번호: 1)
신호 펩티드는 한줄 밑줄로 표시되어 있고; 세포외 영역은 굵게 표시되며; 잠재적인 내인성 N-연결된 당화 부위는 두줄 밑줄로 표시된다.
가공처리된 (processed) 세포외 ActRIIB 폴리펩티드 서열은 다음과 같다:
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (서열 번호: 2)
일부 구체예들에 있어서, N-말단에 "SGR…" 서열을 가지는 단백질이 만들어질 수 있다. 세포외 도메인의 C-말단 "꼬리(tail)"는 하나의 밑줄로 나타낸다. 결실된 "꼬리"를 가지는 서열(Δ15 서열)은 다음과 같다:
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA (서열 번호: 3)
서열 번호: 1의 위치 64에 알라닌 (A64)을 갖는 ActRIIB 형태 또한 문헌에 보고되었다 [Hilden 외. (1994) Blood, 83(8): 2163-2170 참고]. 출원인은 A64 치환을 갖는 ActRIIB의 세포외 도메인을 포함하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질이 액티빈과 GDF11에 대하여 상대적으로 낮은 친화력을 가짐을 확인하였다. 대조적으로, 위치 64에 아르기닌 (R64)을 갖는 동일한 ActRIIB-Fc 융합 단백질은 액티빈과 GDF11에 대하여 낮은 나노몰 내지 높은 피코몰 범위의 친화력을 가진다. 따라서, R64를 갖는 서열들은 본 명세서에서 인간 ActRIIB의 "야생형" 기준 서열로 사용된다.
위치 64에 알라닌을 갖는 ActRIIB 형태 는 다음과 같다:
Figure pct00002
501 TNVDLPPKES SI (서열 번호: 4)
신호 펩타이드는 하나의 밑줄로 표시되어 있고; 세포외 영역은 굵게 표시된다.
대안적 A64 형태의 가공처리된 세포외 ActRIIB 폴리펩티드 서열은 다음과 같다:
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (서열 번호: 5)
일부 구체예들에 있어서, N-말단에 "SGR…" 서열을 가지는 단백질이 만들어질 수 있다. 세포외 도메인의 C-말단 "꼬리"는 하나의 밑줄로 나타낸다. 결실된 "꼬리"를 가지는 서열(Δ15 서열)은 다음과 같다:
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA (서열 번호: 6)
인간 ActRIIB 전구체 단백질를 인코드하는 핵산 서열은 하기에 나타내며(서열 번호: 7), 이는 Genbank 기준 서열 NM_001106.3의 뉴클레오티드 25-1560으로 구성되며, ActRIIB 전구체의 아미노산 1-513을 인코딩한다. 나타낸 바와 같이, 서열은 위치 64에 아르기닌을 제공하며, 알라닌을 대신 제공하기 위하여 변형될 수 있다. 신호 서열은 밑줄로 표시된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
1501 ACCAATGTGG ACCTGCCCCC TAAAGAGTCA AGCATC (서열 번호: 7)
가공처리된 세포외 인간 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 다음과 같다 (서열 번호: 8):
Figure pct00005
(서열 번호: 8)
나타낸 바와 같이, 서열은 위치 64에 아르기닌을 제공하며, 대신 알라닌을 제공하기 위하여 변형될 수 있다.
인간 ActRIIB 세포외 도메인과 인간 ActRIIA 세포외 도메인의 아미노산 서열 정렬은 도 1에 도시된다. 이 정렬은 ActRII 리간드에 직접적으로 접촉하는 것으로 생각되는 두 수용체 내부의 아미노산 잔기들을 나타낸다. 예를 들면, 상기 복합 ActRII 구조에서 ActRIIB-리간드 결합 포켓은 부분적으로는 잔기 Y31, N33, N35, L38 내지 T41, E47, E50, Q53 내지 K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 내지 N83, Y85, R87, A92, 및 E94 내지 F101에 의해 정의됨을 나타낸다. 이들 위치에서, 보존적 돌연변이가 용인될 것으로 예상된다.
또한, ActRIIB는 일반적으로 척추동물간에 잘-보존되며, 세포외 도메인의 큰 스트레취(stretches)는 완벽하게 보존된다. 예를 들면, 도 2는 다양한 ActRIIB 이종상동성 유전자(또는thologs)와 비교하여 인간 ActRIIB 세포외 도메인의 다수-서열 정렬을 도시한다. ActRIIB에 결합하는 많은 리간드들이 상당히 보존되어 있다. 따라서, 이들 배열로부터, ActRIIB- 리간드 결합의 정상적 활성에 중요한 리간드 결합 도메인 안에 주요 아미노산 위치를 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 정상 ActRIIB- 리간드 결합 활성을 크게 변화시키지 않으면서 치환을 용인할 수 있는 아미노산 위치를 예측할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 따라 유용한 활성을 가진 인간 ActRIIB 변이체 폴리펩티드는 다른 척추 동물 ActRIIB의 서열의 상응하는 위치에 하나 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 인간 또는 다른 척추 동물 서열에서와 유사한 잔기를 포함 할 수 있다.
다음 예들은 활성 ActRIIB 변이체를 정의하는 방법을 설명하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 인간 세포외 도메인 (서열 번호: 2)의 L46은 제노푸스(xenopus) ActRIIB (서열 번호: 57)에서 발린이며, 따라서 이 위치는 변경될 수 있고, 임의선택적으로 또다른 소수성 잔기, 이를 테면 V, I 또는 F로 변경될 수 있거나, 또는 비-극성 잔기, 가령, A로 변경될 수 있다. 인간 세포외 도메인에서 E52는 제노푸스에서 K이며, 이것은 이 부위가 극성 잔기, 가령, E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y 그리고 아마도 A를 비롯한 다양한 광범위한 변화를 용인할 것임을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 T93은 제노푸스에서 K이며, 이것은 이 위치에서 다양한 구조적 변이를 용인하고, 극성 잔기, 가령, S, K, R, E, D, H, G, P, G 및 Y를 선호함을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 E111은 제노푸스에서 K이며, 이것은 이 위치에서 D, R, K 및 H, 뿐만 아니라 Q와 N을 포함하는 하전된 잔기가 용인될 수 있음을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 R112는 제노푸스에서 K이며, 이것은 이 위치에서 R 및 H를 포함하는 염기성 잔기가 용인됨을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 위치 119의 A는 상대적으로 덜 보존되며, 설치류에서는 P (서열 번호: 52 및 54) 이고, 제노푸스에서는 V이며, 따라서 이 위치는 기본적으로 임의의 아미노산이 용인되어야 함을 나타낸다.
더욱이, ActRII 단백질은 당해 분야에서 구조적/기능적 특징, 특히, 리간드 결합에 관해 특성화되었다 [Attisano 외. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald 외. (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allend또는ph 외. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson 외. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; 뿐만 아니라 미국 특허 제 7,709,605, 7,612,041, 및 7,842,663]. 본 출원에 개시된 내용 이외에도, 이들 참고 문헌은 하나 또는 그 이상의 원하는 활성 (예컨대, 리간드-결합 활성)을 보유하는 ActRII 변이체를 생성하는 방법에 대한 충분한 지침을 제공한다.
예를 들면, 3 개-핑거 톡신 폴드(three-finger toxin fold)로 알려진 구조적 모티프는 I형 및 II형 수용체에 의한 리간드 결합에 중요하며, 각각의 단량체 수용체의 세포외 도메인 안에 다양한 위치에 보존된 시스테인 잔기에 의해 형성된다. [Greenwald 외. (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; 및 Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. 따라서, 이렇게 보존된 시스테인들의 가장 바깥쪽에 의해 경계가 표시되는 인간 ActRIIB의 핵심 리간드-결합 도메인은 서열 번호 1 (ActRIIB 전구체)의 29-109 위치에 해당한다. 이러한 시스테인-경계된 코어 서열들에 연접하는, 구조적으로 덜 규칙적인 아미노산은 반드시 리간드 결합을 변화시키지 않으면서도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 또는 37개 잔기들이 절두될 수 있다. N-말단 및/또는 C-말단 절두에 대한 예시적인 ActRIIB 세포외 도메인들은 서열 번호: 2, 3, 5, 및 6을 포함한다.
Attisano 외.는 ActRIIB의 세포외 도메인의 C- 말단에서 프롤린 결절의 결실이 액티빈에 대한 수용체의 친화력을 감소시킴을 보여 주었다. 본 출원의 서열 번호: 1의 아미노산 20-119를 함유하는 ActRIIB-Fc 융합 단백질, "ActRIIB(20-119)-Fc"는 ActRIIB(20-134)-Fc와 비교하여 GDF11 및 액티빈에 대해 감소된 결합을 가지며, 이는 프롤린 결절 영역 및 완벽한 막근접 (juxta막) 도메인을 포함한다 (예컨대, 미국 특허 제 7,842,663 참고). 그러나, ActRIIB(20-129)-Fc 단백질은 프롤린 결절 영역이 파괴되었으나 야생형과 비교하여 유사한, 그러나 다소 감소된 활성을 유지한다. 따라서, (서열 번호: 1에 대하여) 아미노산 134, 133, 132, 131, 130 및 129에서 종료되는 ActRIIB 세포외 도메인들은 모두 활성일 것으로 예상되지만, 134 또는 133에서 종료되는 구조체는 대부분 활성일 것이다. 유사하게, (서열 번호: 1에 대하여) 잔기 129-134 중 임의의 위치에서 돌연변이는 큰 폭으로 리간드-결합 친화력을 변경시키지 않을 것으로 예상된다. 이를 뒷받침하는 것으로, P129 및 P130 (서열 번호: 1에 대하여)의 돌연변이는 실질적으로 리간드 결합을 감소시키지 않는 것으로 알려져있다. 따라서, 본 명세서의 ActRIIB 폴리펩티드는 아미노산 109 (최종 시스테인)와 같이 빨리 종료될 수 있지만, 그러나, 109와 119에서 또는 그 사이 (예컨대, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 또는 119)에서 종료되는 형태는 감소된 리간드 결합을 갖는 것으로 예상된다. (서열 번호: 1에 대하여) 아미노산 119는 잘 보존되지 않고, 따라서 용이하게 변경 또는 절두된다. (서열 번호: 1에 대하여) 128에서 또는 그 이후에 종료되는 ActRIIB 폴리펩티드들은 리간드-결합 활성을 유지해야만 한다. 서열 번호: 1에 대하여 119와 127에서 또는 그 사이 (가령, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 또는 127)에서 종료되는 ActRIIB 폴리펩티드들은 중간 결합 능력을 가질 것이다. 이들 중 임의의 것은 임상 또는 실험 환경에 따라 바람직하게 사용될 수 있다.
ActRIIB의 N-말단에서, (서열 번호: 1에 대하여) 아미노산 29 또는 그 전에 시작하는 단백질은 리간드-결합 활성을 보유하는 것으로 예상된다. 아미노산 29는 초기 시스테인을 나타낸다. (서열 번호: 1에 대하여) 위치 24에서 알라닌-에서-아스파라긴으로의 돌연변이는 리간드 결합에 실질적인 영향없이 N-연결된 당화 서열을 도입시킨다[미국 특허 번호. 7,842,663]. 이로써 신호 절단(cleavage) 펩티드와 아미노산 20-29에 상응하는 시스테인 가교 영역 사이의 돌연변이는 잘 용인된다는 것이 확인된다. 구체적으로, (서열 번호: 1에 대하여) 위치 20, 21, 22, 23, 및 24에서 시작하는 ActRIIB 폴리펩티드들은 전반적으로 리간드-결합 활성을 유지해야만 하고, 및 (서열 번호: 1에 대하여) 위치 25, 26, 27, 28, 및 29에서 시작하는 ActRIIB 폴리펩티드들 또한 리간드-결합 활성을 유지하는 것으로 예상된다. 놀랍게도, 22, 23, 24, 또는 25에서 시작되는 ActRIIB 구조체가 최고 활성을 가지게 될 것임을 예컨대, 미국 특허 제 7,842,663은 입증하였다.
종합하면, ActRIIB의 활성 부분 (예컨대, 리간드-결합 부분)에 관한 일반 형식(formula)은 서열 번호: 1의 아미노산 29-109를 포함한다. 따라서 ActRIIB 폴리펩티드들은 예를 들면, 서열 번호: 1의 아미노산 20-29중 임의의 하나에 대응하는 잔기 (가령, 서열 번호: 1의 아미노산 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29)에서 시작하고, 서열 번호: 1의 임의의 하나의 아미노산 109-134에 대응하는 잔기에서 종료되는 (가령, 아미노산 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134 중 임의의 하나에서 종료되는) ActRIIB의 부분에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 다른 예들에는 서열 번호: 1의 위치 20-29 (가령, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29중 임의의 하나) 또는 21-29 (가령, 위치 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29중 임의의 하나)에서 시작하고, 위치 119-134 (가령, 위치 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134중 임의의 하나), 119-133 (가령, 위치 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 또는 133중 임의의 하나), 129-134 (가령, 위치 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134), 또는 129-133 (가령, 위치 129, 130, 131, 132, 또는 133중 임의의 하나)에서 끝나는 폴리펩티드들을 포함한다. 다른 예들에는 서열 번호: 1의 위치 20-24 (가령, 위치 20, 21, 22, 23, 또는 24중 임의의 하나), 21-24 (가령, 위치 21, 22, 23, 또는 24 중 임의의 하나), 또는 22-25 (가령, 위치 22, 22, 23, 또는 25 중 임의의 하나)에서 시작하고, 위치 109-134 (가령, 위치 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134 중 임의의 하나), 119-134 (가령, 위치 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134 중 임의의 하나) 또는 129-134 (가령, 위치 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134 중 임의의 하나)에서 종료되는 구조체들을 포함한다. 이 범위 내의 변이체들, 특히, 서열 번호: 1의 해당부분에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 변이체들이 특히 고려된다.
본 명세서에 설명된 변형은 다양한 방식으로 조합 될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, ActRIIB 변이체는 리간드-결합 포켓내에 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15개의 보존 아미노산을 포함하고, 리간드-결합 포켓내에 위치 40, 53, 55, 74, 79 및/또는 82에 0, 1, 또는 그 이상의 비-보존 변경을 포함한다. 가변성이 특히 잘 용인될 수 있는 결합 포켓 외부의 부위들은 세포외 도메인의 아미노 및 카르복시 말단 (상기 언급한 바와 같음) 및 위치 42-46 및 65-73 (서열 번호: 1과 관련)을 포함한다. 위치 65에서 아스파라긴에서-알라닌으로의 변경(N65A)은 A64 배경에서 리간드 결합을 실질적으로 개선시키고, 따라서 R64 배경에서 리간드 결합에 유해한 효과를 가지지 않는 것으로 예상된다[미국 특허 제 7,842,663]. 이 변화는 아마도 A64 배경에서 N65의 당화를 제거하므로, 이 영역에서의 유의한 변화가 용인될 수 있음을 입증한다. R64A 변화는 잘 용인되지 않지만, R64K는 잘 용인되고, 따라서 H와 같은 또 다른 염기성 잔기는 64 번 위치에서 용인될 수 있다 [미국 특허 제 7,842,663]. 추가적으로, 해당 분야에 기재된 돌연변이 유발 프로그램의 결과는 ActRIIB에서 종종 보존에 유익한 아미노산 위치들이 있음을 나타낸다. 서열 번호: 1과 관련하여, 이들은 위치 80 (산성 또는 소수성 아미노산), 위치 78 (소수성, 특히 트립토판), 위치 37 (산성, 특히 아스파르트산 또는 글루탐산), 위치 56 (염기성 아미노산), 위치 60 (소수성 아미노산, 특히 페닐알라닌 또는 티로신)을 포함한다. 따라서, 본 명세서는 ActRIIB 폴리펩티드들에서 보존될 수 있는 아미노산의 틀을 제공한다. 보존되는 것이 바람직할 수 있는 다른 위치들은 다음과 같다: 모두 서열 번호:1에 대하여, 위치 52 (산성 아미노산), 위치 55 (염기성 아미노산), 위치 81 (산성), 98 (극성 또는 하전된, 특히 E, D, R 또는 K).
또 다른 N-연결된 당화 부위 (N-X-S/T)의 ActRIIB 세포외 도메인으로의 부가는 잘-용인됨이 이전에 입증된 바 있다 (예컨대, 미국 특허 제 7,842,663 참조). 그러므로, N-X-S/T 서열들은 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드에서 도 1에 정의된 리간드 결합 포켓 외부의 위치들에 일반적으로 도입될 수 있다. 특히 비-내인성 N-X-S/T 서열들의 도입에 적합한 부위들은 (서열 번호: 1에 대해) 아미노산 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 또는 129-134를 포함한다. N-X-S/T 서열들은 ActRIIB 서열과 Fc 도메인 또는 그 외 융합 구성성분 간의 링커기에 도입될 수 있다. 이러한 부위는 기존의 S 또는 T에 대하여 올바른 위치에 N을 도입함으로써, 또는 기존의 N에 상응하는 위치에 S 또는 T를 도입함으로써 최소한의 노력으로 도입될 수 있다. 그러므로, N-연결된 당화 부위들을 생성하게 되는 바람직한 변경들은 다음과 같다: (서열 번호: 1에 대해) A24N, R64N, S67N (N65A 변경과 조합 가능), E105N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S 및 R112T. 당화될 것으로 예상되는 임의의 S는 당화에 의해 제공되는 보호로 인해 면역원 부위를 생성하지 않고 T로 변형될 수 있다. 유사하게, 당화될 것으로 예상되는 임의의 T는 S로 변형될 수 있다. 그러므로 (서열 번호: 1에 대해) 변경 S67T 및 S44T가 고려된다. 유사하게, A24N 변이체에서, S26T 변경이 사용될 수 있다. 따라서, 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드는 상기와 같은 하나 이상의 추가적인, 비-내인성 N-연결된 당화 공통 서열들을 가지는 변이체일 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서는 최소한 하나의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 ActRII 억제제에 관계하며, 여기에는 이의 단편들, 기능성 변이체들 그리고 변형된 형태들이 포함된다. 바람직하게는 본 출원에 따라 사용되는 ActRIIB 폴리펩티드들은 가용성이다 (가령, ActRIIB의 세포외 도메인). 일부 구체예들에서, 본 출원에 따라 사용하기 위한 ActRIIB 폴리펩티드는 하나 이상의 TGF-베타 수퍼패밀리 리간드들 [예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, GDF3, BMP10, 및/또는 BMP9]의 활성 (예컨대, Smad 1, 2, 3, 5, 또는 8 신호전달 유도)을 억제 (길항)한다. 일부 구체예들에서, 본 출원에 따라 사용하기 위한 ActRIIB 폴리펩티드는 하나 이상의 TGF-베타 수퍼패밀리 리간드들 [예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, GDF3, BMP10, 및/또는 BMP9]에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 명세서의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 20-29에 대응하는 잔기 (가령, 서열 번호: 1의 아미노산 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29중 임의의 하나에서 시작)에서 시작하고, 서열 번호: 1의 아미노산 109-134에 대응하는 위치 (가령, 아미노산 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134중 임의의 하나에서 종료되는)에서 종료되는 ActRIIB의 부분에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 29-109에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 29-109에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되며, 여기서 서열 번호: 1의 L79에 해당하는 위치는 산성 아미노산 (자연 발생 산성 아미노산 D 및 E 또는 인공 산성 아미노산)이다. 특히 바람직한 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 25-131에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다. 특히 바람직한 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1의 아미노산 25-131에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되며, 여기서 서열 번호: 1의 L79에 대응하는 위치는 산성 아미노산이다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 40, 41, 44, 45, 46, 48, 49, 50, 61, 64, 65, 78, 및 79 중 어느 하나의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나, 본질적으로 구성된다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 40, 41, 44, 45, 46, 48, 49, 50, 61, 64, 65, 78, 및 79 중 어느 하나의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나, 본질적으로 구성되며, 여기서 서열 번호: 1의 L79에 대응하는 위치는 산성 아미노산이다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIB 폴리펩티드는 최소한 하나의 ActRIIB 폴리펩티드로 구성되거나 이러한 폴리펩티드로 본질적으로 구성되며, 여기서 서열 번호: 1의 L79에 대응하는 위치는 산성 아미노산이 아니다 (즉, 자연 발생 산성 아미노산 D 또는 E 또는 인공 산성 아미노산 잔기가 아님).
특정 구체예에서, 본 출원은 ActRIIA 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "ActRIIA"는 임의의 종으로부터 얻은 액티빈 수용체 IIA형 (ActRIIA) 단백질 그리고 이러한 ActRIIA 단백질로부터 돌연변이 유발 또는 다른 변형에 의해 유도된 변이체의 패밀리를 나타낸다. ActRIIA의 지칭은 현재 나타낸 형태들 중 하나에 대한 지칭으로 이해하면 된다. ActRIIA 패밀리의 구성원들은 시스테인-풍부 영역을 가지는 리간드-결합 세포외 도메인, 막경유 도메인, 및 예상 세린/트레오닌 키나아제 활성을 가지는 세포질 도메인으로 이루어진 막경유 단백질이다.
용어 "ActRIIA 폴리펩티드"는 ActRIIA 패밀리 구성원의 자연 발생적 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 뿐만 아니라, 유용한 활성을 보유하는 이의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편, 융합체 및 펩티드 모방체 형태들을 포함함)를 포함한다. 이러한 변이체 ActRIIA 폴리펩티드들의 예는 본 명세서 뿐만 아니라 국제 특허 출원 공개 번호. WO 2006/012627에서 제공되며, 이의 전문은 본 명세서에 참고자료로 포함된다. 본원에 기술된 모든 ActRIIA 관련 폴리펩티드에 대한 아미노산의 넘버링은 달리 명시하지 않는 한, 하기에 제공된 인간 ActRIIA 전구체 단백질 서열 (서열 번호: 9)의 넘버링에 기초한다.
표준 인간 ActRIIA 전구체 단백질 서열은 다음과 같다:
Figure pct00006
501 VTNVDFPPKE SSL (서열 번호: 9)
신호 펩티드는 하나의 밑줄로 표시되어 있고; 세포외 영역은 굵게 표시되며; 잠재적인 내인성 N-연결된 당화 부위는 두 개의 밑줄로 표시된다.
가공처리된 세포외 인간 ActRIIA 서열은 다음과 같다:
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP (서열 번호: 10)
세포외 도메인의 C-말단 "꼬리"는 하나의 밑줄로 나타낸다. 결실된 "꼬리"를 가지는 서열(Δ15 서열)은 다음과 같다:
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEM (서열 번호: 11)
인간 ActRIIA 전구체 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 하기에 나타내며 (서열 번호: 12), 이는Genbank 기준 서열 NM_001616.4의 뉴클레오티드 159-1700에 따른다. 신호 서열은 밑줄로 표시된다.
Figure pct00007
Figure pct00008
1501 gtgacaaatg ttgactttcc tcccaaagaa tctagtcta (서열 번호: 12)
가공처리된 가용성 (세포외) 인간 ActRIIA 폴리펩티드의 핵산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00009
301 gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccc(서열 번호:13)
ActRIIA는 척추동물간에 잘-보존되며, 세포외 도메인의 큰 스트레취(stretches)는 완벽하게 보존된다. 예를 들면, 도 14는 다양한 ActRIIA 이종상동성 유전자(또는thologs)와 비교하여 인간 ActRIIA 세포외 도메인의 다수의-서열 정렬을 도시한다. ActRIIA에 결합하는 많은 리간드들이 상당히 보존되어 있다. 따라서, 이들 배열로부터, ActRIIA- 리간드 결합의 정상적 활성에 중요한 리간드 결합 도메인 안에 주요 아미노산 위치를 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 정상 ActRIIA- 리간드 결합 활성을 크게 변화시키지 않으면서 치환을 용인할 수 있는 아미노산 위치를 예측할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법에 따라 유용한 활성을 가진 인간 ActRIIA 변이체 폴리펩티드는 다른 척추 동물 ActRIIA의 서열의 상응하는 위치에 하나 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 인간 또는 다른 척추 동물 서열에서와 유사한 잔기를 포함 할 수 있다.
다음 예들은 활성 ActRIIA 변이체를 정의하는 방법을 설명하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 인간 세포외 도메인에서의 F13은 오비스 아리에스 (서열 번호: 70), 갈루스 갈루스 (서열 번호: 73), 보스 타우루스 (서열 번호: 46), 타이토 알바 (서열 번호: 75), 및 마이오티스 다비디 (서열 번호: 76) ActRIIA에서 Y이며, 이것은 F, W, 및 Y를 비롯한 방향족 잔기들이 이 위치에서 용인됨을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 Q24는 보스 타우루스 ActRIIA에서 R이며, 이는 D, R, K, H, 및 E를 비롯한 하전된 잔기들이 이 위치에서 용인될 것임을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 S95는 갈루스 갈루스 및 타이토 알바 ActRIIA에서 F이며, 이는 극성 잔기들, 가령, E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y, 및 아마도 소수성 잔기, 가령, L, I, 또는 F를 비롯한 널리 다양한 변화가 이 부위에서 용인될 수 있음을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 E52는 오비스 아리에스 ActRIIA에서 D이며, 이는 D 및 E를 비롯한 산성 잔기들이 이 위치에서 용인됨을 나타낸다. 인간 세포외 도메인에서 P29는 상대적으로 잘 보존되지 않아, 오비스 아리에스 ActRIIA에서 S 그리고 마이오티스 다비디 ActRIIA에서 L로 나타나는 것이므로, 본질적으로 임의의 아미노산은 이 위치에서 용인되어야 한다.
더욱이, 상기 논의한 바와 같이, ActRII 단백질은 당해 분야에서 구조적/기능적 특징, 특히, 리간드 결합에 관해 특성화되었다 [Attisano 외. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald 외. (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allend또는ph 외. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson 외. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; 뿐만 아니라 미국 특허 제 7,709,605, 7,612,041, 및 7,842,663]. 본 출원에 개시된 내용 이외에도, 이들 참고 문헌은 하나 또는 그 이상의 원하는 활성 (예컨대, 리간드-결합 활성)을 보유하는 ActRII 변이체를 생성하는 방법에 대한 충분한 지침을 제공한다.
예를 들면, 3 개-핑거 톡신 폴드(three-finger toxin fold)로 알려진 구조적 모티프는 I형 및 II형 수용체에 의한 리간드 결합에 중요하며, 각각의 단량체 수용체의 세포외 도메인 안에 다양한 위치에 보존된 시스테인 잔기에 의해 형성된다. [Greenwald 외. (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; 및 Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870]. 따라서, 이렇게 보존된 시스테인들의 가장 바깥쪽에 의해 경계가 표시되는 인간 ActRIIA의 핵심 리간드-결합 도메인은 서열 번호 9 (ActRIIA 전구체)의 30-110 위치에 해당한다. 따라서, 이러한 시스테인으로 경계가 표시되는 코어 서열에 인접한 구조적으로 덜 규칙적인 아미노산은 반드시 리간드 결합을 바꾸지 않고도 N-말단에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 잔기 그리고 C-말단에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 잔기가 절두될 수 있다. 예시적인 ActRIIA 세포외 도메인들의 절두부들은 서열 번호: 10 및 11을 포함한다.
따라서, ActRIIA의 활성 부분 (예컨대, 리간드 결합)에 대한 일반적인 형식은 서열 번호: 9의 아미노산 30-110을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나 구성되는 폴리펩티드이다. 따라서 ActRIIA 폴리펩티드들은 예를 들면, 서열 번호: 1의 아미노산 21-30 중 임의의 하나에 대응하는 잔기 (가령, 서열 번호: 9의 아미노산 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30)에서 시작하고, 서열 번호: 9의 임의의 하나의 아미노산 110-135에 대응하는 잔기에서 종료되는 (가령, 아미노산 110, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 임의의 하나에서 종료되는) ActRIIA의 부분에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 또는 구성될 수 있다. 다른 예들은 서열 번호: 9의 21-30 (예컨대, 아미노산 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 임의의 하나에서 시작), 22-30 (예컨대, 아미노산 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 임의의 하나에서 시작), 23-30 (예컨대, 아미노산 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 임의의 하나에서 시작), 24-30 (예컨대, 아미노산 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 임의의 하나에서 시작)에서 선택된 위치에서 시작하여, 서열 번호: 9의 111-135 (예컨대, 아미노산 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 임의의 하나에서 종료), 112-135 (예컨대, 아미노산 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종료), 113-135 (예컨대, 아미노산 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종료), 120-135 (예컨대, 아미노산 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종료), 130-135 (예컨대, 아미노산 130, 131, 132, 133, 134 또는 135 중 어느 하나에서 종료), 111-134 (예컨대, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 또는 134 중 어느 하나에서 종료), 111-133 (예컨대, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 또는 133 중 어느 하나에서 종료), 111-132 (예컨대, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 또는 132 중 어느 하나에서 종료), 또는 111-131 (예컨대, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 또는 131 중 어느 하나에서 종료)에서 선택된 위치에서 종료하는 구조체를 포함한다. 그러므로, 본 출원의 ActRIIA는 서열 번호: 9의 아미노산 30-110에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 폴리펩티드를 포함하거나, 이러한 폴리펩티드로 본질적으로 구성되거나 또는 구성될 수 있다. 선택적으로, 본 출원의 ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 아미노산 30-110에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 리간드 결합 포켓에서 1, 2, 5, 10 또는 15개 이하의 보존적 아미노산 변화 그리고 서열 번호: 9에 대해 리간드-결합 포켓의 위치 40, 53, 55, 74, 79 및/또는 82에서 0, 1 또는 그 이상의 비-보존적 변경을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 본 출원은 최소한 하나의 ActRIIA 폴리펩티드를 포함하는 ActRII 억제제에 관한 것으로, ActRIIA 폴리펩티드에는 이의 단편들, 기능성 변이체들 그리고 변형된 형태들이 포함된다. 바람직하게는 본 출원에 따라 사용되는 ActRIIA 폴리펩티드들은 가용성이다 (예컨대, ActRIIA의 세포외 도메인). 일부 구체예들에서, 본 출원에 따라 사용하기 위한 ActRIIA 폴리펩티드는 하나 이상의 TGF-베타 수퍼패밀리 리간드들 [예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, GDF3, BMP10, 및/또는 BMP9]의 활성 (예컨대, Smad 1, 2, 3, 5, 또는 8 신호전달 유도)을 억제 (길항)한다. 일부 구체예들에서, 본 출원에 따라 사용하기 위한 ActRIIA 폴리펩티드는 하나 이상의 TGF-베타 수퍼패밀리 리간드들 [예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, GDF3, BMP10, 및/또는 BMP9]에 결합한다. 일부 구체예들에 있어서, 본 명세서의 ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 아미노산 21-30에 대응하는 잔기에서 시작하고 (가령, 서열 번호: 9의 아미노산 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 임의의 하나에서 시작), 서열 번호: 9의 아미노산 110-135에 대응하는 위치에서 종료되는 (가령, 아미노산 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 중 임의의 하나에서 종료되는) ActRIIA의 부분에 대하여 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성된다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 아미노산 30-110에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다. 특정 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9의 아미노산 21-135에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 ActRIIA 폴리펩티드는 서열 번호: 9, 10, 11, 32, 36, 및 39 중 어느 하나의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 서열로 구성되거나, 본질적으로 구성된다.
특정 양상들에서, 본 출원은 GDF 트랩 폴리펩티드 (또한 "GDF 트랩"으로도 지칭됨)에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 GDF 트랩은 ActRII 폴리펩티드 (예컨대, "야생형" 또는 비변형된 ActRII 폴리펩티드)의 세포외 도메인 (또한 리간드-결합 도메인으로도 지칭됨)에서 하나 이상의 돌연변이 (예컨대, 아미노산 부가, 결실, 치환, 및 이의 조합)를 포함하는 변이체 ActRII 폴리펩티드 (예컨대, ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드)이며, 이러한 변이체 ActRII 폴리펩티드는 대응하는 야생형 ActRII 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 변형된 리간드-결합 활성을 가진다. 바람직한 구체예들에서, 본 출원의 GDF 트랩 폴리펩티드는 대응하는 야생형 ActRII 폴리펩티드와 최소한 하나의 유사한 활성을 유지한다. 예를 들면, 바람직한 GDF 트랩은 GDF11 및/또는 GDF8에 결합하여 이의 기능을 억제 (예컨대 길항)한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 GDF 트랩은 TGF-베타 수퍼패밀리의 하나 이상의 리간드에 추가로 결합하여 이를 억제한다. 따라서, 본 출원은 하나 이상의 ActRII 리간드들에 대한 변형된 결합 특이성을 가지는 GDF 트랩 폴리펩티드를 제공한다.
이를 설명하기 위해, 하나 이상의 ActRII-결합 리간드들, 가령, 액티빈 (액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및/또는 액티빈 E), 특히 액티빈 A에 대하여보다 GDF11 및/또는 GDF8에 대해, 변형된 리간드-결합 도메인의 선택성을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이가 선택될 수 있다. 선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인은, 야생형 리간드-결합 도메인의 비율과 비교하여 최소한 2-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100- 또는 심지어 1000-배 더 큰, 액티빈 결합에 대한 Kd 대 GDF11 및/또는 GDF8 결합에 대한 Kd의 비율을 가진다. 선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인은 야생형 리간드-결합 도메인에 비해, 최소한 2-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100-, 또는 심지어 1000-배 더 큰, 액티빈 A의 억제에 관한 IC50 대 GDF11 및/또는 GDF8의 억제에 관한 IC50 의 비율을 가진다. 선택적으로, 변형된 리간드-결합 도메인은 액티빈의 억제에 관한 IC50 보다 최소한 2-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100- 또는 심지어 1000-배 더 작은 IC50으로 GDF11 및/또는 GDF8을 억제한다.
특정한 바람직한 구체예들에서, 본 출원의 GDF 트랩은 GDF11 및/또는 GDF8 (또한 미오스타틴으로도 공지됨)에 대해 선호적으로 결합하도록 설계된다. 선택적으로, GDF11 및/또는 GDF8-결합 트랩은 액티빈 B에 추가로 결합할 수 있다. 선택적으로, GDF11 및/또는 GDF8-결합 트랩은 BMP6에 추가로 결합할 수 있다. 선택적으로, GDF11 및/또는 GDF8-결합 트랩은 BMP10에 추가로 결합할 수 있다. 선택적으로, GDF11 및/또는 GDF8-결합 트랩은 액티빈 B 및 BMP6에 추가로 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 출원의 GDF 트랩은, 예컨대, 야생형 ActRII 폴리펩티드에 비해, 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 A/B, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E)에 대해 감소된 결합 친화력을 가진다. 특정한 바람직한 구체예들에서, 본 출원의 GDF 트랩 폴리펩티드는 액티빈 A에 대해 감소된 결합 친화력을 가진다.
ActRIIB 단백질들의 아미노산 잔기들 (예컨대, E39, K55, Y60, K74, W78, L79, D80, 및 F101)은 ActRIIB 리간드-결합 포켓에 존재하며, 예를 들면, 액티빈 A, GDF11, 및 GDF8을 비롯한 그 리간드들에 대한 매개 결합을 돕는다. 그러므로 본 출원은 이들 아미노산 잔기들에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, ActRIIB 수용체의 변형된-리간드 결합 도메인 (예컨대ㅈ GDF8/GDF11-결합 도메인)을 포함하는 GDF 트랩 폴리펩티드를 제공한다.
구체적인 예로서, ActRIIB의 리간드-결합 도메인의 양으로 하전된 아미노산 잔기 Asp (D80)를 상이한 아미노산 잔기로 돌연변이시켜 GDF8에 선호적으로 결합하나, 액티빈에는 결합하지 않는 GDF 트랩 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 바람직하게는, 서열 번호: 1에 대해 D80 잔기는 다음으로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 잔기로 변화된다: 하전되지 않은 아미노산 잔기, 음의 아미노산 잔기, 및 소수성 아미노산 잔기. 추가 구체예로서, 서열 번호: 1의 소수성 잔기 L79가 변형되어, 변형된 액티빈-GDF11/GDF8 결합 성질들을 제공할 수 있다. 예를 들면, L79P 치환은 액티빈 결합 보다 큰 정도로 GDF11 결합을 감소시킨다. 대조적으로, L79의 산성 아미노산으로의 치환 [아스파르트산 또는 글루탐산; L79D 또는 L79E 치환]은 액티빈 A 결합 친화력을 상당히 감소시키는 반면 GDF11 결합 친화력을 유지시킨다. 예시적인 구체예들에서, 본 명세서에 기재된 방법들은 선택적으로 하나 이상의 추가 아미노산 치환, 부가, 또는 결실과 함께 서열 번호: 1의 위치 79에 대응하는 위치에서 산성 아미노산 (예컨대, D 또는 E)을 포함하는 변이체 ActRIIB 폴리펩티드인 GDF 트랩 폴리펩티드를 이용한다.
일부 구체예들에 있어서, 본 명세서는 치료 효과 또는 안정성 (예컨대, 생체내 반감기 및 단백질분해에 대한 저항성)을 강화시킬 목적으로, ActRII 폴리펩티드의 구조를 변경시킴에 의한 기능적 변이체의 제조를 고려한다. 아미노산 치환, 결손, 추가, 또는 이의 조합들에 의해 변이체들이 만들어질 수 있다. 예를 들면, 류신을 이소류신 또는 발린으로 치환, 아스파르테이트를 글루탐산염으로 치환, 트레오닌을 세린으로 치환, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산 (가령, 보존 돌연변이)으로 단리된 치환은 생성 분자의 생물학적 활성에 주요한 영향을 주지 않을 것으로 합리적으로 예측할 수 있다. 보존적 치환은 아미노산 측쇄들이 관련되는, 아미노산 패밀리 안에서 일어나는 것이다. 본 명세서의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변화로 기능적 동소체가 생성되는 지의 여부는 생성된 변이체 폴리펩티드가 이의 야생형 폴리펩티드와 유사한 방식으로 세포 안에서 반응을 만드는 능력, 또는 예를 들면, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 결절, 신경아교세포-유래 신경영양성 인자 (GDNF), 뉴르투린, 아르테민, 페르세핀, MIS, 및 Lefty을 포함하는 하나 또는 그 이상의 TGF-베타 리간드들에 결합하는 능력을 평가함으로써 용이하게 결정될 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서는 ActRII 폴리펩티드의 당화를 변경하기 위해 상기 폴리펩티드의 특정한 돌연변이를 고려한다. 이러한 돌연변이는 하나 또는 그 이상의 당화 부위, 이를 테면 O-연결된 또는 N-연결된 당화 부위를 도입 또는 제거하도록 선택될 수 있다. 아스파라긴-연결된 당화 인지 부위는 일반적으로 적절한 세포의 당화 효소에 의해 특이적으로 인지되는 삼펩티드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌 또는 아스파라긴-X-세린 (여기서 "X"는 임의의 아미노산임)이다. 이러한 변형은 하나 또는 그 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 상기 폴리펩티드(O-연결된 당화 부위의 경우)에 추가 또는 치환시켜 만들 수도 있다. 당화 인지 부위의 제1 또는 제3 아미노산 위치중 하나 또는 둘 모두에서 다양한 아미노산 치환 또는 결손 (및/또는 제 2 위치에서 아미노산 결손)으로 변형된 삼펩티드 서열에서의 비-당화를 초래한다. 폴리펩티드의 탄소화물 모이어티의 수를 증가시키는 다른 수단은 상기 단백질에 화학 또는 효소적으로 글리코시드를 결합시키는 것이다. 이용되는 결합 방식에 따라, 이들 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 유리 카르복실 그룹; (c) 유리 술포하이드릴 그룹, 가령, 시스테인의 그룹; (d) 유리 하이드록실 그룹, 가령, 세린, 트레오닌, 또는 하이드록시프롤린; (e) 방향족 잔기, 가령, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 그룹; 또는 (f) 글루타민의 아미드 그룹에 부착될 수 있다. 폴리펩티드 상에 있는 하나 또는 그 이상의 탄수화물 모이어티는 화학적 및/또는 효소적으로 제거될 수 있다. 화학적 탈당화는 예를 들면, 트라이플루오로메탄설폰산 또는 이와 균등한 화합물에 대한 폴리펩티드의 노출을 수반할 수 있다. 이러한 처리는 아미노산 서열을 손상시키지 않으면서, 연결당 (N-아세틸 글루코사민 또는 N-아세틸 갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당을 절단하게 된다. 폴리펩티드상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 Thotakura et al. [Meth. Enzymol. (1987) 138:350]에서 설명된 바와 같이, 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 이루어질 수 있다. 포유류, 효모, 곤충 및 식물 세포는 모두 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받을 수 있는 상이한 당화 패턴을 도입시킬 수 있기 때문에 폴리펩티드의 서열은 이용되는 발현계 유형에 따라 적절하게 조정될 수 있다. 일반적으로, 인간에 사용하기 위한 본 명세서의 폴리펩티드는 적절한 당화를 제공하는 포유류 세포주, 이를 테면 HEK293 또는 CHO 세포주에서 발현될 수 있지만, 다른 포유류 발현 세포주 또한 마찬가지로 유용할 것으로 예상된다.
본 명세서는 돌연변이체, 특히 본 명세서의 ActRII 폴리펩티드 복합 돌연변이체, 뿐만 아니라 절두 돌연변이체를 만드는 방법을 추가로 고려한다. 복합 돌연변이체의 풀(pool)은 기능적으로 활성인 (가령, TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드 결합) ActRII 서열을 확인하는데 특히 유용하다. 이러한 복합 라이브러리들을 스크리닝하는 목적은 변경된 성질, 가령, 변경된 약동학적 또는 변경된 리간드 결합을 가지는 폴리펩티드들의 변이체를 만들기 위한 것일 수도 있다.. 다양한 스크리닝 분석이 하기에 제공되며, 이러한 분석을 이용하여 변이체들을 평가할 수 있다. 예를 들면, ActRII 변이체들은, TGF-베타 수퍼패밀리 수용체에 대한 TGF-베타 수퍼패밀리 리간드의 결합을 저해하기 위하여, 및/또는 TGF-베타 수퍼패밀리 리간드에 의해 유발되는 신호전달을 간섭하기 위하여, 하나 이상의 TGF-베타 수퍼패밀리 리간드들 (예컨대, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 결절, 신경아교세포-유래 신경영양성 인자 (GDNF), 뉴르투린, 아르테민, 페르세핀, MIS, 및 Lefty)에 결합하는 능력에 관해 스크리닝 될 수 있다.
The 활성 of an ActRII 폴리펩티드의 활성은 또한 세포 기반 또는 생체내 분석법에서 테스트될 수도 있다. 예를 들면, 시력에 관여하는 유전자들의 발현에 대한 ActRII 폴리펩티드의 효과를 평가할 수 있다. 이는 필요에 따라 하나 이상의 재조합 ActRII 리간드 단백질들 (예컨대, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 결절, 신경아교세포-유래 신경영양성 인자 (GDNF), 뉴르투린, 아르테민, 페르세핀, MIS, 및 Lefty)의 존재하에 실시될 수 있으며, 세포들은 ActRII 폴리펩티드, 및 선택적으로, ActRII 리간드를 제조하기 위하여 형질감염될 수 있다. 유사하게, ActRII 폴리펩티드는 마우스 또는 다른 동물에 투여될 수 있으며 시력을 해당 기술 분야에서 알려진 방법들을 사용하여 평가할 수 있다. 유사하게, ActRII 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 활성은 혈액 세포 전구체 세포들의 성장에 대한 임의의 효과에 관하여 이러한 세포들에서, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 분석법 및 해당 기술 분야에 통상적으로 공지된 분석법으로 테스트할 수 있다. SMAD-반응성 리포터 유전자를 이러한 세포계에서 이용하여 하류 신호생성에 대한 효과를 모니터할 수 있다.
기준 ActRII 폴리펩티드와 비교하여 선택성이 증가된 또는 전반적으로 효능이 증가된 복합-유도된 변이체가 만들어질 수 있다. 이러한 변이체들은 재조합 DNA 구조체로부터 발현될 때, 유전자 요법 프로토콜에 이용될 수 있다. 돌연변이유발은 대응하는 비변형된 ActRII 폴리펩티드와 상당히 상이한 세포내 반감기를 갖는 변이체를 만들 수 있다. 예를 들면, 변형된 단백질은 비변형된 폴리펩티드의 파괴 또는 그렇지 않으면 불활성화를 초래하는 단백질분해 또는 다른 세포 과정에 더 안정적이거나 덜 안정적이 될 수 있다. 이러한 변이체 및 이들을 코딩하는 유전자는 폴리펩티드의 반감기를 조절함으로써 폴리 펩타이드 복합체 수준을 변경 시키는데 이용 될 수 있다. 예를 들면, 짧은 반감기는 더욱 일시적인 생물학적 효과를 일으킬 수 있고, 유도성 발현 시스템의 일부는 세포 안에 재조합 폴리펩티드 복합체 수준을 더 엄밀하게 조절할 수 있다. Fc 융합 단백질에서, 돌연변이는 ActRII 폴리펩티드의 반감기를 변형시키기 위하여 링커 (존재하는 경우) 및/또는 Fc 부위에서 이루어질 수 있다.
잠재적 ActRII 서열의 최소한 일부분을 포함하는 각 폴리펩티드의 라이브러리를 인코드하는 유전자의 축중성(degenerate) 라이브러리에 의해 복합 라이브러리가 만들어질 수 있다. 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물은 유전자 서열에 효소적으로 결찰되어, 잠재적 ActRII를 인코드하는 뉴클레오티드 서열의 축중 세트는 개별 폴리펩티드로 발현되거나, 또는 대안으로, 더 큰 융합 단백질 (가령, 파아지 디스플레이의 경우)로 발현가능하다.
축중성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적 상동체(homologs)의 라이브러리를 만들 수 있는 많은 방법들이 있다. 자동 DNA 합성기에서 축중성 유전자 서열의 화학적 합성을 실행할 수 있고, 그 다음 합성 유전자를 적절한 발현 벡터 안에 결찰시킬 수 있다. 축중 올리고뉴클레오티드 합성은 해당 분야에 공지되어 있다 [Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd C수준and Sympos. Macro분자들, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; 그리고 Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477]. 이러한 기술은 다른 단백질의 유도된 진화에 이용되어 왔다. [Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; 뿐만 아니라 U.S. Patent Nos: 5,223,409, 5,198,346, 및 5,096,815].
대안으로, 다른 형태의 돌연변이유발을 이용하여 조합 라이브러리를 만들 수 있다. 예를 들면, 본 출원의 ActRII 폴리펩티드가 만들어지고, 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 이용한 스크리닝[가령, Ruf 외. (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang 외. (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint 외. (1993) Gene 137:109-118; Grodberg 외. (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima 외. (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; 낮은man 외. (1991) Biochemistry 30:10832-10838; 그리고 Cunningham 외. (1989) Science 244:1081-1085], 링커 스캐닝 돌연변이유발 [가령, Gustin 외. (1993) Virology 193:653-660; 그리고 Brown 외. (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight 외. (1982) Science 232:316], 포화 돌연변이유발 [가령, Meyers 외., (1986) Science 232:613]; PCR 돌연변이유발 [가령, Leung 외. (1989) 방법 Cell Mol Biol 1:11-19]; 또는 화학적 돌연변이유발을 포함하는 무작위 돌연변이유발[가령, Miller 외. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; and Greener et al. (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]에 의해 단리될 수 있다. 링커 스캐닝 돌연변이유발은 특히 복합적 환경에서 ActRII 폴리펩티드의 절두된 (생물 활성) 형태를 확인하는 매력적인 방법이다.
점 돌연변이 및 절두에 의해 만들어진 복합 라이브러리의 유전자 산물을 스크리닝하기 위한, 그리고 이와 같은 경우, 특정 성질을 갖는 유전자 산물의 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 광범위한 기술이 해당 분야에 공지되어 있다. 이러한 기술은 ActRII 폴리펩티드의 복합 돌연변이유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에 일반적으로 적합할 것이다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 가장 광범위하게 이용되는 기술은 전형적으로 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터에 클로닝하고, 적절한 세포를 벡터의 생성 라이브러리로 형질전환시키고, 원하는 활성의 탐지는 해당 유전자의 산물이 탐지되는 해당 유전자를 인코드하는 벡터를 상대적으로 용이하게 단리할 수 있는 조건하에 복합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다. 바람직한 분석에는 TGF-베타 리간드 (가령, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 결절, 신경아교세포-유도된 신경영양성 인자 (GDNF), 뉴르투린, 아르테민, 페르세핀, MIS, 및 Lefty) 결합 분석 및/또는 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드-매개된 세포 신호생성 분석이 포함된다.
해당 기술 분야의 숙련된 기술자들에게 알려진 바와 같이, 본 명세서에 기재된 대부분의 상기 돌연변이, 변이체들 또는 변형들은 핵산 수준에서 이루어지거나 또는, 일부 경우에서, 번역후 변형 또는 화학적 합성에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 기법들은 해당 분야에 널리 공지이며 그 중 일부는 본 명세서에 기재되어 있다. 일부에서, 본 출원은 본 명세서에 기재된 발명의 범위에 속하는 다른 변이체 ActRII 폴리펩티드의 생성 및 사용을 위한 지침으로서 사용될 수 있는 ActRII 폴리펩티드의 기능적 활성 부위들 (단편들) 및 변이체들을 식별한다.
특정 구체예에서, 본 출원의 ActRII 폴리펩티드의 기능적 활성 단편들은 ActRII 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 (예컨대, 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 37, 42, 47, 60, 62, 63, 66, 67, 68, 80, 81, 82, and 83)의 상응하는 단편으로부터 재조합적으로 제조된 폴리펩티드를 선별함으로써 얻을 수 있다. 또한, 단편들은 해당 기술 분야에 공지된 기법들, 가령, 종래의 메리필드 고상 (Merrifield solid phase) f-Moc 또는 t-Boc 화학을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 단편들은 (재조합으로 또는 화학적 합성으로) 제조되고 테스트되어, ActRII 수용체들 및/또는 하나 이상의 리간드들 (예컨대ㅈ BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 결절, 신경아교세포-유래 신경영양성 인자 (GDNF), 뉴르투린, 아르테민, 페르세핀, MIS, 및 Lefty)의 길항제 (억제제)로서 기능할 수 있는 펩티딜 단편들을 식별할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 출원의 ActRII 폴리펩티드는 ActRII (예컨대ㅈ ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드)에 자연적으로 존재하는 임의의 변형 이외에 번역후 변형을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 변형은 아세틸화, 카르복실화, 당화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 결과적으로, ActRII 폴리펩티드는 비-아미노산 성분들, 가령, 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 다당류 또는 단당류, 및 포스페이트를 내포할 수 있다. 리간드 트랩 폴리펩티드의 기능성에 대한 이러한 비-아미노산 성분들의 효과는 다른 ActRII 변이체들에 관하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 테스트될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드가 초기 형태의 폴리펩티드를 절단함으로써 세포에서 생산되는 경우, 번역 후 가공은 또한 단백질의 정확한 폴딩 및/또는 기능에 중요할 수 있다. 상이한 세포들 (예컨대, CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 또는 HEK293)이, 이러한 번역후 활성들에 대한 특이적인 세포 조직 (cellular machinery) 및 특징적 기전을 가지며 ActRII 폴리펩티드의 올바른 변형 및 가공을 확보하기 위해 선택될 수 있다.
특정 양상들에서, 본 출원의 ActRII 폴리펩티드는 ActRII 폴리펩티드 (예컨대, ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드)의 최소한 하나의 부위 (도메인) 및 하나 이상의 이종 부위들 (도메인들)을 가지는 융합 단백질을 포함한다. 이러한 융합 도메인의 잘 알려진 예로는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S-전달효소 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G,면역글로불린 중쇄 불변 영역 (Fc), 말토즈 결합 단백질 (MBP), 또는 인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 융합 도메인은 원하는 성질을 부여하도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 일부 융합 도메인들은 친화 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리에 특히 유용하다. 친화도 정제를 위하여, 친화 크로마토그래피를 위한 관련 기재들, 가령, 글루타티온-, 아밀라아제-, 및 니켈- 또는 코발트- 공액 수지들이 사용된다. 이러한 많은 기질들은 '키트' 형태, 가령, Pharmacia GST 정제 시스템 및 (HIS6) 융합 짝과 함께 유용한 QIAexpressTM 시스템(Qiagen)로 이용가능하다. 또 다른 예로서, 융합 도메인은 ActRII 폴리펩티드의 검출을 촉진시키도록 선택될 수 있다. 이러한 탐지 도메인의 예로는 다양한 형광 단백질 (가령, GFP) 뿐만 아니라 "에피토프 태그"를 포함하는데, 이는 특이적 항체가 이용가능한 짧은 펩티드 서열이 일반적이다. 특정 단클론 항체에 용이하게 이용되는 잘 공지된 에피토프 태그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA), 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에서 융합 도메인은 프로테아제 절단 부위, 이를 테면 인자(factor) Xa 또는 트롬빈에 대한 절단부위를 가지는데, 이에 의해 관련 프로테아제가 이 융합 단백질을 부분적으로 절단하고, 그에 따라 이로부터 재조합 단백질이 유리된다. 유리된 단백질은 후속 크로마토그래피 분리에 의해 융합 단백질로부터 단리될 수 있다. 선택될 수 있는 그 외 융합 도메인들의 유형들에는 다량체화 (예컨대, 이량체화, 사량체화) 도메인들 및 예를 들면, 면역글로불린들의 불변 도메인들 (예컨대, Fc 도메인들)을 비롯한 (추가 생물학적 기능을 부여하는) 기능적 도메인들이 포함된다.
특정 양상들에서, 본 출원의 ActRII 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드들을 "안정화"시킬 수 있는 하나 이상의 변형들을 내포한다. "안정화"는 파괴 감소, 신장에 의한 제거 감소, 또는 일정 물질의 약동학적 효과로 인한 것인지 여부에 관계없이 시험관내 반감기, 혈청 반감기를 증가시키는 어떤 것이든 의미한다. 예를 들면, 이러한 변형은 폴리펩티드의 보관 수명을 강화시키고, 폴리펩티드의 순환 반감기를 강화시키고 및/또는 폴리펩티드의 단백질분해를 감소시킨다. 이러한 안정화 변형에는 융합 단백질 (예를 들면, ActRII 폴리펩티드 도메인 및 안정화제 도메인을 포함하는 융합 단백질), 당화 부위의 변형 (예를 들면, 본 명세서의 폴리펩티드에 당화 부위 추가 포함), 및 탄수화물 모이어티의 변형 (예를 들면, 본 명세서의 폴리펩티드로부터 탄수화물 모이어티 제거 포함)이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "안정화제 도메인"은 융합 단백질인 경우 융합 도메인 (가령, 면역글로불린 Fc 도메인)을 지칭하고, 뿐만 아니라 비단백질성 변형, 가령, 탄수화물 모이어티, 또는 비단백질성 모이어티, 가령, 폴리에틸렌 글리콜을 또한 포함한다. 특정 바람직한 구체예들에서, ActRII 폴리펩티드는 폴리펩티드를 안정화시키는 이종 도메인 ("안정화제" 도메인), 바람직하게는 폴리펩티드의 생체내 안정성을 증가시키는 이종 도메인과 융합된다. 면역글로불린의 불변 도메인 (예컨대, Fc 도메인)과의 융합이 광범위한 단백질들에 바람직한 약동학적 성질들을 부여함은 공지이다. 유사하게, 인간 혈청 알부민에 대한 융합은 원하는 성질들을 부여할 수 있다.
인간 IgG1 (G1Fc)의 Fc 부분에 이용될 수 있는 고유한 아미노산 서열을 하기에 예시한다 (서열 번호: 14). 점선은 힌지 영역을 나타내며, 직선은 자연 발생적 변이체를 갖는 위치를 나타낸다. 부분적으로, 본 명세서는 서열 번호: 14에 대하여 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리펩티드를 제공한다. G1Fc에서 자연 발생적 변이체는 서열 번호: 14에서 이용된 넘버링 체계에 따라 E134D 및 M136L을 포함할 수 있다(Uniprot P01857 참고).
Figure pct00010
201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (서열 번호: 14)
선택적으로, IgG1 Fc 도메인은 잔기들, 가령, Asp-265, 리신 322, 및 Asn-434에서 하나 이상의 돌연변이를 가진다. 특정 경우에서, 이러한 돌연변이 (예컨대, Asp-265 돌연변이)를 하나 이상 가지는 돌연변이체 IgG1 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 Fcγ 수용체에 대한 결합 능력이 감소된다. 다른 경우들에서, 하나 또는 그 이상의 이들 돌연변이 (가령, Asn-434 돌연변이)를 갖는 돌연변이체 Fc 도메인은 야생형 IgG1 Fc 도메인와 비교하여 MHC 클래스 I-관련된 Fc-수용체 (FcRN)에 결합하는 능력이 증가된다.
인간 IgG2 (G2Fc)의 Fc 부분에 이용될 수 있는 고유한 아미노산 서열은 하기에 예시된다 (서열 번호: 15). 점선은 힌지 영역을 나타내며, 두줄 밑줄은 이 서열에서 데이터 베이스가 충돌하는 위치를 나타낸다 (UniProt P01859). 부분적으로, 본 명세서는 서열 번호: 15에 대하여 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리펩티드를 제공한다.
Figure pct00011
201 CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK (서열 번호: 15)
인간 IgG3 (G3Fc)의 Fc 부분에 이용될 수 있는 2가지 예시 아미노산 서열을 하기에 나타낸다. G3Fc의 힌지 영역은 다른 Fc 쇄의 길이의 최대 4배가 될 수 있고, 유사한 17개-잔기 분절을 선행시키는, 3개의 동일한 15개-잔기 분절들을 포함한다. 하기에 나타낸 제 1 G3Fc 서열(서열 번호: 16)은 단일 15개-잔기 분절로 구성된 짧은 힌지 영역을 포함하며, 반면 제 2 G3Fc 서열 (서열 번호: 17)은 전장 힌지 영역을 포함한다. 각 경우에서, 점선은 힌지 영역을 나타내며, 직선은 UniProt P01859에 따른 자연 발생적 변이체를 갖는 위치를 나타낸다. 부분적으로, 본 명세서는 서열 번호: 16 및 17에 대하여 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리펩티드를 제공한다.
Figure pct00012
201 RWQQGNIFSC SVMHEALHNR FTQKSLSLSP GK (서열 번호: 16)
Figure pct00013
251 QGNIFSCSVM HEALHNRFTQ KSLSLSPGK (서열 번호: 17)
G3Fc (예를 들면, Uniprot P01860)에서 자연 발생적 변이체들은 서열 번호: 16에 이용된 넘버링 체계로 전환될 때 E68Q, P76L, E79Q, Y81F, D97N, N100D, T124A, S169N, S169del, F221Y를 포함하며, 본 명세서는 이들 변이중 하나 또는 그 이상을 함유하는 G3Fc 도메인이 포함된 융합 단백질을 제공한다. 또한, 인간 면역글로불린 IgG3 유전자 (IGHG3)는 상이한 힌지 길이에 의해 특징화되는 구조적 다형태를 나타낸다[Uniprot P01859]. 특히, 변이체 WIS는 대부분의 V 영역과 모든 CH1 영역이 부족하다. 힌지 영역에 정상적으로 존재하는 11개에 추가하여 위치 7에 여분의 쇄간 이황화결합이 있다. 변이체 ZUC는 대부분의 V 영역, 모든 CH1 영역, 그리고 일부 힌지가 부족하다. 변이체 OMM은 대립형질 형태 또는 또다른 감마 쇄 하위부류를 나타낼 수 있다. 본 명세서는 하나 또는 그 이상의 이들 변이체를 함유하는 G3Fc 도메인이 포함된 추가적인 융합 단백질을 제공한다.
인간 IgG4 (G4Fc)의 Fc 부분에 이용될 수 있는 고유한 아미노산 서열은 하기에 예시된다 (서열 번호: 18). 점선은 힌지 영역을 나타낸다. 부분적으로, 본 명세서는 서열 번호: 18에 대하여 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성되는 폴리펩티드를 제공한다.
Figure pct00014
201 EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK (서열 번호: 18)
Fc 도메인 안에서 다양하게 조작된 돌연변이는 G1Fc 서열 (서열 번호: 14)에 대하여 나타내며, G2Fc, G3Fc, 및 G4Fc에서 유사 돌연변이는 도 15의 G1Fc와 배열함으로부터 유도될 수 있다. 같지 않은 힌지 길이로 인해, 아이소형 정렬 (도 15)을 기준으로 유사한 Fc 위치들은 서열 번호: 14, 15, 16, 17, 및 18에서 상이한 아미노산 번호를 소유한다. 힌지, CH2, 및 CH3 영역 (예컨대, 서열 번호: 14, 15, 16, 17, 및 18)으로 구성된 면역글로불린 서열에서 주어진 아미노산 위치는 Uniprot 데이타베이스에서와 같이, 넘버링이 IgG1 중쇄 불변 도메인 (CH1, 힌지, CH2, 및 CH3 영역으로 구성됨) 전체를 포괄하는 경우, 동일한 위치가 아닌 상이한 번호로 확인될 것이라는 것을 또한 인지할 수 있을 것이다. 예를 들면, 인간 G1Fc 서열 (서열 번호: 14), 인간 IgG1 중쇄 불변 도메인 (Uniprot P01857), 및 인간 IgG1 중쇄에서 선택된 CH3 위치 간의 대응성은 다음과 같다.
Figure pct00015
융합 단백질의 상이한 요소들(예컨대, 면역글로불린 Fc 융합 단백질)은 원하는 기능성과 일관된 방식으로 정렬될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, ActRII 폴리펩티드 도메인은 이종성 도메인의 C 말단에 배치될 수 있거나, 또는 대안으로, 이종성 도메인은 ActRII 폴리펩티드 도메인의 C 말단에 배치될 수 있다. ActRII 폴리펩티드 도메인과 이종성 도메인은 융합 단백질 내에서 인접할 필요가 없고, 그리고 추가 도메인 또는 아미노산 서열이 어느 한쪽 도메인의 C- 또는 N 말단에 또는 이들 도메인 사이에 포함될 수 있다.
예를 들면, ActRII 수용체 융합 단백질은 A-B-C 형태로 아미노산 서열을 포함할 수 있다. B 부분은 ActRII 폴리펩티드 도메인에 상응한다. A와 C 부분은 독립적으로 0, 1, 또는 하나 이상의 아미노산일 수 있고, A와 C 부분 모두 존재하는 경우 B에 대하여 이종성이다. A 및/또는 C 부분은 B 부분에 링커 서열을 경유하여 부착될 수 있다. 링커는 글리신 (가령, 2-10개, 2-5개, 2-4개, 2-3개 글리신 잔기)이 많거나, 또는 글리신과 프롤린 잔기가 많을 수 있고, 예를 들면, 트레오닌/세린 및 글리신의 단일 서열 또는 트레오닌/세린 및/또는 글리신의 반복 서열을 포함할 수 있고, 가령, GGG (서열 번호: 19), GGGG (서열 번호: 20), TGGGG (서열 번호: 21), SGGGG (서열 번호: 22), TGGG (서열 번호: 23), SGGG (서열 번호: 24), 또는 GGGGS (서열 번호: 25) 단일항, 또는 반복부를 포함할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, ActRII 융합 단백질은 A-B-C 형태로 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 이때 A는 리더(신호) 서열이며, B는 ActRII 폴리펩티드 도메인으로 구성되며, 그리고 C는 생체내 안정성, 생체내 반감기, 취입/투여, 조직 국소화 또는 분포, 단백질 복합체 형성, 및/또는 정제중 하나 또는 그 이상을 강화하는 폴리펩티드 부분이다. 특정 구체예들에 있어서, ActRII 융합 단백질은 A-B-C 형태로 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 이때 A는 TPA 리더 서열이며, B는 ActRII 수용체 폴리펩티드 도메인으로 구성되며, 그리고 C는 면역글로불린 Fc 도메인이다. 바람직한 융합 단백질은 다음의 서열 번호중 임의의 하나에서 제시된 아미노산 서열을 포함한다: 32, 36, 39, 40, 41, 44, 46, 50, 61, 64, 78, 및 79.
바람직한 구체예들에 있어서, 본 명세서의 방법에 따라 이용되는 ActRII 폴리펩티드는 단리된 폴리펩티드이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단리된 단백질 또는 폴리펩티드는 자연 환경의 성분으로부터 단리된 것이다. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원의 폴리펩티드는 예를 들면, 전기영동 (가령, SDS-PAGE, 등전초점조절 (IEF), 모세관전기이동) 또는 크로마토그래피 (가령, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 순도로 정제된다. 항체 순도의 측정 방법은 해당 분야에 공지되어 있다[예컨대, Flatman 외., (2007) J. Chromatogr. B 848:79-87 참조]. 일부 구체예들에 있어서, 본 출원의 방법에 따라 이용되는 ActRII 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이다.
본 출원의 ActRII 폴리펩티드는 해당 기술 분야에 공지된 다양한 기법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 본 출원의 폴리펩티드는 표준 단백질 화학 기술, 예를 들면, Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) 및 Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992)에서 설명된 것들을 이용하여 합성될 수 있다. 또한, 자동화된 펩티드 합성장치들을 상업적으로 구매가능하다 (예컨대, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). 대안으로, 본 출원의 폴리펩티드들과 이의 변이체들은 해당 분야에 공지된 다양한 발현 시스템 [예컨대, 대장균(E. coli)), 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, COS 세포, 베큘로바이러스]을 이용하여 재조합적으로 만들어질 수 있다. 추가 구체예에서, 본 출원의 변형된 또는 변형되지 않은 폴리펩티드는 예로서, 프로테아제, 예를 들면, 트립신, 서몰리신, 키모트립신, 펩신, 또는 대합된 염기성 아미노산 전환 효소 (PACE)를 이용함으로써 재조합적으로 생산된 전장 ActRII 폴리펩티드의 소화에 의해 생산될 수 있다. 단백질분해가능한 절단 부위는 컴퓨터 분석(시판되는 소프트웨어, 가령, MacVect또는, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.)을 이용하여 식별해낼 수 있다. 대안적으로, 이러한 폴리펩티드는 화학적 절단 (예컨대, 사이아노겐 브로마이드, 하이드록실아민, 등)을 사용하여 재조합적으로 생성된 전장 ActRII 폴리펩티드로부터 제조될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 ActRII 폴리펩티드 (예컨대, ActRIIA 또는 ActRIIB 폴리펩티드 뿐만 아니라 이의 변이체들 가령, GDF 트랩)는 원하는 효과 (예컨대, 필요로 하는 환자에서 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방, 눈 혈관 질환에 걸린, 필요로 하는 환자에서 시각을 증가, 및/또는 눈 혈관 질환의 하나 이상의 합병증들을 치료 또는 예방)를 구현하기 위해 하나 이상의 추가 ActRII 길항제와 조합될 수 있다. 예를 들면, ActRII 폴리펩티드는 다음과 조합하여 사용될 수 있다: i) 하나 이상의 추가 ActRII 폴리펩티드, ii) 하나 이상의 ActRII 길항제 항체들; iii) 하나 이상의 소분자 ActRII 길항제; iv) 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제; v) 하나 이상의 폴리스타틴 폴리펩티드; 및/또는 vi) 하나 이상의 FLRG 폴리펩티드.
B. ActRII 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서는 ActRII 폴리펩티드 (이의 단편, 기능적 변이체 (예컨대, GDF 트랩) 및 융합 단백질 포함)를 인코드하는 단리된 및/또는 재조합 핵산을 제공한다. 예를 들면, 서열 번호: 12는 자연 발생 인간 ActRIIA 전구체 폴리펩티드를 인코드하며, 서열 번호: 13은 ActRIIA의 가공처리된 세포외 도메인을 인코드한다. 또한, 서열 번호: 7은 자연 발생 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드 (상기 기재된 R64 변이체)를 인코드하며, 서열 번호: 8은 ActRIIB (상기 기재된 R64 변이체)의 가공처리된 세포외 도메인을 인코드한다. 대상 핵산은 단일-가닥이거나 또는 이중 가닥일 수 있다. 이러한 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이러한 핵산들은, 예를 들면, 본 출원에 기재된 ActRII-기반 리간드 트랩 폴리펩티드의 제조 방법에서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 단리된 핵산(들)은 자연 환경의 성분으로부터 단리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 포함하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체외부에 존재한다.
특정 구체예에서, 본 출원의 ActRII 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산들은 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 37, 42, 47, 60, 62, 63, 66, 67, 68, 80, 81, 82, 및 83 중 임의의 하나의 변이체들인 핵산들을 포함하는 것으로 이해된다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실에 의해 다른 서열, 예를 들면, 대립형질 변이체를 포함하고; 그리고, 이런 이유로, 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 37, 42, 47, 60, 62, 63, 66, 67, 68, 80, 81, 82, 및 83 중 하나에서 지정된 코딩 서열의 뉴클레오티드 서열과 상이한 코딩 서열을 포함할 것이다.
특정 구체예에서, 본 출원의 ActRII 폴리펩티드는 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 37, 42, 47, 60, 62, 63, 66, 67, 68, 80, 81, 82, 및 83 중 하나에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 단리된 및/또는 재조합 핵산 서열들에 의해 인코딩된다. 해당 기술 분야의 숙련된 기술자는 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 37, 42, 47, 60, 62, 63, 66, 67, 68, 80, 81, 82, 및 83에 상보적인 서열들에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산 서열들, 및 이의 변이체들 또한 본 출원의 범위에 속함을 이해할 것이다. 또다른 구체예들에서, 본 출원의 핵산 서열들은 이종 뉴클레오티드 서열과 함께, 또는 DNA 라이브러리에서 분리, 재조합 및/또는 융합될 수 있다.
다른 구체예들에서, 본 출원의 핵산들은 또한 매우 엄격한 조건들하에서 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 37, 42, 47, 60, 62, 63, 66, 67, 68, 80, 81, 82, 및 83에서 지정된 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는, 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 37, 42, 47, 60, 62, 63, 66, 67, 68, 80, 81, 82, 및 83의 상보적 서열들인 뉴클레오티드 서열들, 또는 이의 단편들을 포함한다. 상기 논의한 바와 같이, 해당 기술 분야의 숙련된 기술자는 DNA 혼성화를 촉진시키는 적절한 엄격한 조건들이 변화할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 숙련된 기술자는 DNA 혼성화를 촉진시키는 적절한 엄격 조건은 가변적일 수 있다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 예를 들면, 6.0 x 염화나트륨/구연산나트륨 (SSC)에서 약 45 ℃에서 혼성화, 이어서 50 ℃에서 2.0 x SSC의 세척으로 실행할 수 있다. 예를 들면, 세척 단계에서 염 농도는 50 ℃에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격성으로부터 50 ℃에서 0.2 x SSC의 높은 엄격성에서 선택될 수 있다. 또한, 세척 단계의 온도는 약 22 ℃의 낮은 엄격성 조건으로부터 약 65 ℃의 높은 엄격성 조건으로 증가될 수 있다. 온도 및 염이 변화될 수 있거나, 또는 다른 변수가 변화되는 동안 온도 또는 염 농도는 일정하게 유지될 수 있다. 한 구체예에서, 본 명세서는 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄격성 조건하에 혼성화되고, 이어서 실온에서 2 x SSC에서 세척된 핵산을 제공한다.
유전자 코드에서 축중성으로 인해 서열 번호: 7, 8, 12, 13, 37, 42, 47, 60, 62, 63, 66, 67, 68, 80, 81, 82, 및 83에서 제시된 바와 같은 핵산과 상이한 단리된 핵산들 역시 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들면, 다수의 아미노산이 하나 이상의 삼중항으로 지정된다. 동일한 아미노산을 특정하는 코돈, 또는 동의코돈 (예를 들면, CAU와 CAC는 히스티딘의 경우 동의코돈임)으로 이 단백질의 아미노산 서열에 영향을 주지 않은 "침묵(silent)" 돌연변이가 된다. 그러나, 포유류 세포 중에 본 단백질의 아미노산 서열의 변화를 유도하는 DNA 서열 다형성이 존재할 것으로 기대된다. 숙련된 기술자는 특정 단백질을 코딩하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드 (뉴클레오티드의 최대 약 3 내지 5 %)에서의 이러한 변이가 자연 대립 유전자 변이로 인해 주어진 종의 개체들 사이에 존재할 수 있음을 인식할 것이다. 임의의 모든 이런 뉴클레오티드 변이 및 결과의 아미노산 다형성은 본 발명의 범위 안에 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 재조합 핵산은 발현 구조체 내에서 하나 또는 그 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로, 발현에 이용된 숙주 세포에 적합할 것이다. 다수 유형의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 해당 기술 분야에 공지되어 있으며 다양한 숙주 세포에서 사용될 수 있다. 전형적으로, 하나 또는 그 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 종료 서열, 번역 개시 및 종료 서열, 및 인핸서 또는 활성자 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 해당 분야에 공지된 구성 또는 유도성 프로모터는 본 명세서에서 고려된다. 상기 프로모터는 자연 발생적 프로모터이거나, 또는 하나 이상의 프로모터 요소들이 복합된 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 구조체는 세포 안 에피좀 상에, 이를 테면 플라스미드로 존재하거나, 또는 발현 구조체는 염색체 안에 삽입될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 발현 벡터는 선택가능한 표지 유전자를 포함하여, 형질전환된 숙주 세포의 선별이 가능하다. 선택가능한 표지 유전자는 해당 분야에 공지되어 있으며, 이용되는 숙주 세포에 따라 가변적일 수 있다.
일정한 양상에서, 본 출원에 개시된 주제 핵산은 ActRII를 인코딩하고 최소한 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에서 제공된다. 조절 서열들은 기술분야에 공지이며 ActRII 폴리펩티드의 직접 발현을 위해 선택된다. 따라서, 용어 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 및 기타 발현 조절 요소들을 포함한다. 예시적인 조절 서열들은 Goeddel; Gene Expression 기술: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)에 기재되어 있다. 가령, 자신에게 작동가능하게 연결될 때 DNA 서열의 발현을 제어하는 임의의 매우 다양한 발현 제어 서열이 ActRII 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 발현하기 위해 이들 벡터에서 이용될 수 있다. 이러한 유용한 발현 조절 서열은, 예를 들면, SV40의 초기 및 후기 프로머터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 즉각 초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T7 RNA 중합효소에 의해 발현이 지시되는 T7 프로모터, 파아지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 피복 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소의 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 가령, Pho5, 효모 α-메이팅 인자들의 프로모터, 베큘로바이러스 시스템의 폴리헤드곤 프로모터, 또는 진핵 세포 또는 이의 바이러스의 발현을 제어하는 것으로 알려진 기타 서열, 및 다양한 이의 조합들을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택 및/또는 발현되기를 원하는 단백질의 유형과 같은 인자에 좌우될 수 있음을 알아야 한다. 더욱이, 벡터의 복사체 수, 복사체 수를 조절하는 능력, 그리고 이 벡터에 의해 인코드되는 임의의 다른 단백질, 가령, 항생제 표지 등의 발현이 또한 고려된다.
본 명세서의 재조합 핵산은 원핵 또는 진핵 세포 (효모, 조류, 곤충 또는 포유류), 또는 이둘 모두에서 발현하는데 적합한 벡터에 클론된 유전자 또는 이의 일부분을 결찰시킴으로써 만들어질 수 있다. 재조합 ActRII 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 운반체는 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 예를 들면, 적합한 벡터는 다음의 유형의 플라스미드를 포함한다: 원핵 세포, 이를 테면 대장균에서 발현을 위한 pBR322-유도된 플라스미드, pEMBL-유도된 플라스미드, pEX-유도된 플라스미드, pBTac-유도된 플라스미드 및 pUC-유도된 플라스미드.
일부 포유류 발현 벡터는 박테리아에서 벡터의 증식을 실행하는 원핵(prokaryotic) 서열과 진핵 세포에서 발현된 진핵(eukaryotic) 전사 단위를 모두 포함한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유도된 벡터는 진핵 세포의 형질감염에 적합한 포유류 발현 벡터의 예들이다. 이들 벡터중 일부는 박테리아 플라스미드, 이를 테면 pBR322의 서열로 변형되어, 진핵 세포와 원핵 세포 모두에서 복제 및 약물 저항성 선별이 가능하다. 대안으로, 바이러스, 이를 테면 소의 유두종 바이러스 (BPV-1), 또는 Epstein-Barr 바이러스 (pHEBo, pREP-유도된 그리고 p205)의 유도체들이 진핵 세포에서 단백질의 일시적 발현에 이용될 수 있다. 다른 바이러스 (레트로바이러스 포함) 발현 시스템의 예는 하기 유전자 요법 운반 시스템의 설명에서 찾아볼 수 있다. 플라스미드의 준비 및 숙주 유기체의 형질전환에 이용되는 다양한 방법들이 해당 분야에 공지되어 있다. 원핵 세포와 진핵 세포 모두에 적합한 다른 발현 시스템, 뿐만 아니라 전반적인 재조합 과정은, 예컨대, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)을 참고한다. 일부 경우들에 있어서, 베큘로바이러스 발현 시스템의 사용에 의해 재조합 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 베큘로바이러스 발현 시스템의 예로는 pVL-유도된 벡터 (이를 테면 pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유도된 벡터 (이를 테면 pAcUW1), 및 pBlueBac-유도된 벡터 (이를 테면 ㅯ-gal 함유 pBlueBac III)을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 벡터, 예를 들면, Pcmv-스크립트 벡터 (Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 및 pCI-neo 벡터 (Promega, Madison, Wisc.)는 CHO 세포에서 대상 ActRII 폴리펩티드를 생산하도록 설계될 것이다. 명백한 바와 같이, 주제 유전자 구조체는 예로서, 정제를 위한 융합 단백질 또는 변이체 단백질을 비롯한 단백질을 생산하기 위해, 배양액에서 증식된 세포에서 주제 ActRII 폴리펩티드의 발현을 유발하는데 이용될 수 있다.
본 명세서는 하나 또는 그 이상의 ActRII 폴리펩티드들에 대한 코딩 서열이 포함된 재조합 유전자로 형질감염된 숙주 세포에 또한 관계한다. 상기 숙주 세포는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 것이다. 예를 들면, 본 명세서의 ActRII 폴리펩티드는 박테리아 세포, 이를 테면 대장균, 곤충 세포 (가령, 베큘로바이러스 발현 시스템을 이용), 효모, 또는 포유류 세포 [가령, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포계]에서 발현될 수 있다. 숙련된 기술자들에게는 다른 적합한 숙주 세포들이 또한 알려져 있다.
따라서, 본 명세서는 주제 ActRII 폴리펩티드를 생산하는 방법과 더욱 관련된다. 가령, ActRII 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 ActRII 폴리펩티드의 발현이 발생하도록 허용하는 적절한 조건 하에 배양될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 분비되고, 이 폴리펩티드를 함유하는 세포와 배지 혼합물로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, ActRII 폴리펩티드는 세포질에 또는 막 분획물 및 수집되어 용해된 세포들, 및 분리된 단백질에 함유되어 있을 수 있다. 세포 배양물은 숙주 세포, 배지 및 다른 부산물을 포함한다. 세포 배양에 적합한 배지는 해당 분야에 공지되어 있다. 해당 폴리펩티드들은 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동, ActRII 폴리펩티드의 특정 에피토프에 특이적인 항체를 이용한 면역친화력 정제, 그리고 ActRII 폴리펩티드에 융합된 도메인에 결합하는 물질을 이용한 친화력 정제 (가령, 단백질 A 컬럼을 이용하여 ActRII-Fc 융합 단백질을 정제할 수 있다)를 포함하는 단백질을 정제하는데 공지된 기술을 이용하여 세포 배양 배지, 숙주 세포, 또는 이 둘 모두로부터 단리될 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, ActRII 폴리펩티드는 정제를 용이하게 하는 도메인을 함유하는 융합 단백질이다.
일부 구체예들에 있어서, 예를 들면, 다음중 3개 또는 그 이상이 임의의 순서로 포함된 일련의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 압출 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 상기 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완성될 수 있다. ActRII 폴리펩티드는 크기 압출 크로마토그래피에 의해 측정하였을 때, >90%, >95%, >96%, >98%, 또는 >99%의 순도이고, SDS PAGE에 의해 측정하였을 때 >90%, >95%, >96%, >98%, 또는 >99%의 순도를 가질 수 있다. 목표 수준의 순도는 포유류 시스템, 특히 비-인간 영장류, 설치류(마우스), 및 인간에 바람직한 결과를 얻는데 충분한 정도이어야 한다.
다른 구체예에서, 재조합 ActRII 폴리펩티드의 원하는 부분의 N 말단에서 정제 리더 서열, 예를 들면, 폴리-(His)/엔테로키나아제 개열 부위 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni2+ 금속 수지를 이용한 친화력 크로마토그래피에 의한 발현된 융합 단백질의 정제를 허용할 수 있다. 이후, 정제 리더 서열은 정제된 ActRII 폴리펩티드 및 이의 이종다량체를 제공하기 위해, 엔테로키나아제로 처리에 의해 차후 제거될 수 있다. 예컨대, Hochuli 외., (1987) J. Chromatography 411:177; 및 Janknecht 외. (1991) PNAS USA 88:8972 참조.
융합 유전자를 만드는 기술은 공지되어 있다. 기본적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 인코드하는 다양한 DNA 단편의 결합은 결찰을 위한 블런트-단부 또는 스태거(stagger)-단부를 이용, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한효소 절단, 바람직하지 못한 결합 및 효소적 결찰을 피하기 위하여 적절한 알칼리 포스포타제 처리와 같은 코헤시브 단부(cohesive ends)의 메우기를 이용하는 통상의 기술에 따라 실행된다. 또다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기가 포함된 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안으로, 유전자 단편들의 PCR 증폭은 2개의 연속 유전자 단편 간에 상보적 오버행(overhangs)을 만드는 엥커 프라이머를 이용하여 실행되고, 후속적으로 어닐링시켜 키메라 유전자 서열을 만들 수 있다. 예컨대, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel 외., John Wiley & Sons: 2009를 참조하라.
C. 항체 길항제
다른 양상들에서, 본 출원은 ActRII 활성을 길항시키는 (예컨대, Smads 1, 2, 3, 5, 및 8을 통한 ActRII 신호전달의 억제) 항체, 또는 항체들의 조합에 관한 것이다. 이러한 항체들은 하나 이상의 TGF-β 리간드들 (예컨대, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 액티빈 AB, 액티빈 AC, 결절, 신경아교세포-유래 신경영양성 인자 (GDNF), 뉴르투린, 아르테민, 페르세핀, MIS, 및 Lefty) 또는 하나 이상의 I형 및/또는 II형 수용체들 (예컨대, ActRIIA, ActRIIB, ALK4, ALK5)에 결합할 수 있다. 특히, 본 출원은 필요로 하는 환자에서 눈 혈관 질환 [예컨대, 황반 변성 (예컨대, 연령-관련 황반 변성, 소아 황반 변성, 습성 황반 변성, 건성 황반 변성, 스타르가르트병, 및 베스트병), 망막 혈관 폐색 (예컨대, 중심 망막 혈관 폐색, 절반-망막 혈관 폐색, 망막 분지 혈관 폐색, 망막 혈관 폐색 후 황반 부종, 및 허혈성 망막 혈관 폐색), 망막 동맥 폐색 (예컨대, 중심 망막 동맥 폐색, 절반-망막 동맥 폐색, 망막 분지 동맥 폐색, 및 허혈성 망막 동맥 폐색), 당뇨 망막병증, 당뇨성 황반 부종, 허혈성 시신경병증 [예컨대, 전방 허혈성 시신경병증 (동맥염성 및 비-동맥염성) 및 후방 허혈성 시신경병증], 황반 모세혈관확장증 (I형 또는 II형), 망막 허혈 (예컨대, 급성 망막 허혈 또는 만성 망막 허혈), 안구 허혈 증후군, 망막 혈관염, 및 미숙아 망막병증]을 치료 또는 예방; 필요로 하는 눈 혈관 질환 환자에서 시각을 증대 (시력 및/또는 시야 증대); 및/또는 눈 혈관 질환의 하나 이상의 합병증들의 치료 또는 예방하기 위하여 항체 ActRII 길항제, 또는 항체 ActRII 길항제들의 조합을 단독으로 또는 하나 이상의 추가 지지 요법들과 병용하여 사용하는 방법들을 제공한다.
특정 양상들에서, 본 출원의 바람직한 항체 ActRII 길항제는 최소한 GDF11에 결합하거나 및/또는 최소한 GDF11의 활성을 억제하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 다른 양상들에서, 본 출원의 바람직한 항체 ActRII 길항제는 최소한 GDF8에 결합하거나 및/또는 최소한 GDF8의 활성을 억제하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 다른 양상들에서, 본 출원의 바람직한 항체 ActRII 길항제는 최소한 GDF3에 결합하거나 및/또는 최소한 GDF3의 활성을 억제하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 또 다른 양상들에서, 본 출원의 바람직한 항체 ActRII 길항제는 최소한 BMP6에 결합하거나 및/또는 최소한 BMP6의 활성을 억제하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 또 다른 양상들에서, 특정 양상들에서, 본 출원의 바람직한 항체 ActRII 길항제는 최소한 BMP9에 결합하거나 및/또는 최소한 BMP9의 활성을 억제하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 대안적 양상들에서, 본 출원의 바람직한 항체 ActRII 길항제는 BMP9에 결합하지 않거나 및/또는 최소한 BMP9의 활성을 억제하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 또 다른 양상들에서, 본 출원의 바람직한 항체 ActRII 길항제는 최소한 BMP10에 결합하거나 및/또는 최소한 BMP10의 활성을 억제하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 대안적 양상들에서, 본 출원의 바람직한 항체 ActRII 길항제는 BMP10에 결합하지 않거나 및/또는 최소한 BMP10의 활성을 억제하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 추가 양상들에서, 본 출원의 바람직한 항체 ActRII 길항제는 최소한 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및 액티빈 D)에 결합하거나 및/또는 최소한 GDF8의 활성을 억제하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 항체 ActRII 길항제는 최소한 액티빈 B에 결합하거나 및/또는 액티빈 B의 활성을 억제하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 항체 ActRII 길항제는 최소한 액티빈 A 및 액티빈 B에 결합하거나 및/또는 액티빈 A 및 액티빈 B의 활성을 억제하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 대안적으로, 일부 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 항체 ActRII 길항제는 최소한 액티빈 B에 결합하거나 및/또는 액티빈 B의 활성을 억제하지만, 액티빈 A에 결합하거나 액티빈 A를 억제하지 않는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 또 다른 양상들에서, 본 출원의 바람직한 항체 ActRII 길항제는 BMP9, BMP10, 및 액티빈 A 중 하나 이상에 결합하지 않거나 및/또는 BMP9, BMP10, 및 액티빈 A 중 하나 이상의 활성을 억제하는 항체, 또는 항체들의 조합이다.
일부 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 항체 ActRII 길항제는, 특히, GDF11 및 GDF8 모두에 대한 결합 친화력을 가지는 다중특이적 항체의 경우 또는 하나 이상의 항-GDF11 항체들 및 하나 이상의 항-GDF8 항체들의 조합에 관한 내용에서, 최소한 GDF11 및 GDF8에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 추가로 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및/또는 액티빈 E)에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 추가로 액티빈 B에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8에 결합하거나 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 액티빈 A에 결합하지 않거나 및/또는 이의 활성을 억제하지 않는, 또는 액티빈 A에 실질적으로 결합하지 않거나 및/또는 이의 활성을 억제하지 않는다 (예컨대, 액티빈 A에 대해 1 x 10-7 보다 큰 KD를 가지는 항체). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 및/또는 액티빈에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 추가로 BMP6에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 및/또는 BMP6에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 GDF3에 추가로 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6 및/또는 GDF3에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 BMP10에 추가로 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, GDF3 및/또는 BMP10에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 BMP9에 추가로 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, 및/또는 GDF3에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 BMP9에 결합하지 않거나 및/또는 이를 억제하지 않는다 (예컨대, BMP9에 대해 1 x 10-7 보다 큰 KD를 가지는 항체). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, 및/또는 GDF3에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 BMP10에 결합하지 않거나 및/또는 이를 억제하지 않는다 (예컨대, BMP10에 대해 1 x 10-7 보다 큰 KD를 가지는 항체). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, 및/또는 GDF3에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 BMP9 또는BMP10에 결합하지 않거나 및/또는 이를 억제하지 않는다 (예컨대, BMP9 및BMP10에 대해 1 x 10-7 보다 큰 KD를 가지는 항체). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, BMP6, 및/또는 GDF3에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 BMP9에 결합하지 않거나 및/또는 이를 억제하지 않는다 (예컨대, BMP9에 대해 1 x 10-7 보다 큰 KD를 가지는 항체). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, BMP6, 및/또는 GDF3에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 BMP10에 결합하지 않거나 및/또는 이를 억제하지 않는다 (예컨대, BMP10에 대해 1 x 10-7 보다 큰 KD를 가지는 항체). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, BMP6, 및/또는 GDF3에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 BMP9 또는BMP10에 결합하지 않거나 및/또는 이를 억제하지 않는다 (예컨대, BMP9 및BMP10에 대해 1 x 10-7 보다 큰 KD를 가지는 항체). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, BMP6, 및/또는 GDF3에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 액티빈 A에 결합하지 않거나 및/또는 이를 억제하지 않는다 (예컨대, 액티빈 A에 대해 1 x 10-7 보다 큰 KD를 가지는 항체). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, BMP6, 및/또는 GDF3에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 액티빈 A 또는 BMP10에 결합하지 않거나 및/또는 이를 억제하지 않는다 (예컨대, 액티빈 A 및 BMP10에 대해 1 x 10-7 보다 큰 KD를 가지는 항체). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, BMP6, 및/또는 GDF3에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 액티빈 A 또는 BMP9에 결합하지 않거나 및/또는 이를 억제하지 않는다 (예컨대, 액티빈 A 및 BMP9에 대해 1 x 10-7 보다 큰 KD를 가지는 항체). 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, BMP6, 및/또는 GDF3에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 본 출원의 항체, 또는 항체들의 조합은 액티빈 A, BMP9 또는 BMP10에 결합하지 않거나 및/또는 이를 억제하지 않는다 (예컨대, 액티빈 A, BMP9 및 BMP10에 대해 1 x 10-7 보다 큰 KD를 가지는 항체).
또 다른 양상에서, 본 출원의 ActRII 길항제는 ActRII 수용체 (예컨대 ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체)에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제하는 항체, 또는 항체들의 조합이다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 수용체 항체, 또는 이러한 항체들의 조합은 ActRII 수용체에 결합하여 최소한 GDF11에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화를 저해한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 수용체 항체, 또는 이러한 항체들의 조합은 ActRII 수용체에 결합하여 최소한 GDF8에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화를 저해한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 수용체 항체, 또는 이러한 항체들의 조합은 ActRII 수용체에 결합하여 최소한 GDF3에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화를 저해한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 수용체 항체, 또는 이러한 항체들의 조합은 ActRII 수용체에 결합하여 최소한 GDF6에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화를 저해한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 수용체 항체, 또는 이러한 항체들의 조합은 ActRII 수용체에 결합하여 최소한 GDF10에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화를 저해한다. 대안적 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 수용체 항체, 또는 이러한 항체들의 조합은 BMP10에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화를 저해하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 수용체 항체, 또는 이러한 항체들의 조합은 ActRII 수용체에 결합하여 최소한 GDF9에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화를 저해한다. 대안적 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 수용체 항체, 또는 이러한 항체들의 조합은 BMP9에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화를 저해하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 수용체 항체, 또는 이러한 항체들의 조합은 ActRII 수용체에 결합하여 최소한 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및 액티빈 E)에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화를 저해한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 수용체 항체, 또는 이러한 항체들의 조합은 ActRII 수용체에 결합하여 최소한 액티빈 B에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화를 저해한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 수용체 항체, 또는 이러한 항체들의 조합은 액티빈 A에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화를 저해하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 수용체 항체, 또는 이러한 항체들의 조합은 ActRII 수용체에 결합하여 최소한 액티빈 B에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화를 저해하지만, 액티빈 A에 의한 ActRII 수용체의 결합 및/또는 활성화는 저해하지 않는다.
용어 항체는 본 명세서에서 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체 (가령, 이중특이적 항체), 그리고 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않은 다양한 항체 구조를 포괄하는 광범위한 의미로 이용된다. 항체 단편은 손상되지 않은(intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 손상되지 않은 항체의 부분을 포함하는 손상되지 않은 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편들의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디(diabodies); 선형 항체; 단쇄 항체 분자들 (예로써 scFv); 그리고 항체 분절들로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 가령, Hudson 외. (2003) Nat. Med. 9:129-134; Plㆌckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); WO 93/16185; 그리고 미국 특허 제 5,571,894; 5,587,458; 및 5,869,046 참조. 본 명세서에서 공개된 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 특정 실시 양태에서, 본 발명의 항체는 거기에 부착되어, 탐지가능하게 만드는 라벨을 포함할 수 있다 (예를 들어, 라벨은 방사성 동위 원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조 인자 일 수 있다). 바람직한 구체예들에서, 본 발명의 항체는 단리된 항체다.
다이아바디는 이가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 가진 항체 분절들이다. 예컨대, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 외. (2003) Nat. Med. 9:129-134 (2003); 그리고 Hollinger 외. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 참조. 트라이아바디(Triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies) 또한 Hudson 외. (2003) Nat. Med. 9:129-134에서 설명된다.
단일 도메인 항체는 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구체예들에 있어서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체다. 예컨대, 미국 특허 제 6,248,516 참조.
항체 단편은 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이에는 손상되지 않은 항체의 단백질분해 절단뿐만 아니라, 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 재조합 숙주 세포(가령, 대장균(E. coli) 또는 파아지)에 의한 생산된 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체는 임의의 부류일 수 있다. 항체의 부류는 그 중쇄가 갖는 불변 영역 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체에는 5 가지 주요 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들중 몇몇은 하위부류(아이소형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가 세분될 수 있다. 면역 글로불린의 상이한 부류에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라(mu)라고 불린다.
일반적으로, 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 항체는 바람직하게는 높은 결합 친화력으로 그 표적 항원에 결합한다. 친화력은 KD 값으로 표현될 수 있으며, 고유 결합 친화력을 반영한다 (예컨대, 최소화된 항체결합력(avidity) 효과). 전형적으로, 결합 친화력은 시험 관내에서 무(free)-세포 또는 세포와 관련된 환경에서 측정된다. 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명 (Biacore™ 분석법), 방사능라벨된 항원-결합 분석 (RIA), 및 ELISA를 포함하여, 본원에 개시된 분석법을 비롯한 해당 분야에 공지된 다수의 임의의 분석법을 사용하여 결합 친화력을 측정할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, 본 발명의 항체는 최소한 KD 값이 1x 10-7 또는 더 강하게, 1x10-8 또는 더 강하게, 1x10-9 또는 더 강하게, 1x10-10 또는 더 강하게, 1x10-11 또는 더 강하게, 1x10-12 또는 더 강하게, 1x10-13 또는 더 강하게, 또는 1x10-14 또는 더 강하게 이들의 표적 항원 (예컨대 GDF11, GDF8, ActRIIA, ActRIIB, 등)에 결합한다.
특정 구체예들에 있어서, KD는 하기 분석에 기재된 바와 같이, 관심있는 항체의 Fab 버전 및 그의 표적 항원으로 수행된 RIA에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화력은 라벨되지 않은 항원의 적정 시리즈의 존재하에 방사성 라벨된 항원 (예 : 125I-라벨된)의 최소 농도로 Fab를 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체 -코팅된 플레이트로 포획시킴으로써 측정된다 [가령, Chen 외. (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881]. 상기 분석의 조건을 확립하기 위하여, 다중-웰 플레이트 (예컨대, MICROTITER® , Thermo Scientific)는 포획용 항-Fab 항체 (예컨대, Cappel Labs)로 피복하고(예컨대, 하룻밤동안), 후속적으로 바람직하게는 실온 (예컨대, 대략 23℃)에서 소 혈청 알부민으로 차단한다. 비-흡착성 플레이트에서 방사능라벨된 항원은 일련의 관심 대상 Fab 희석물과 혼합된다 [가령, 항-VEGF 항체, Fab-12의 측정과 일관되게, Presta 외., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]. 관심 있는 Fab을 바람직하게는 밤새 배양하지만, 배양은 평형에 도달하도록 더 긴 기간 (예를 들어, 약 65 시간) 동안 계속 될 수 있다. 그 후, 혼합물을 바람직하게는 실온에서 약 1 시간 동안 배양을 위해 포획 플레이트로 이동시킨다. 상기 용액은 제거되고, 플레이트는 바람직하게는 폴리소르베이트 20 및 PBS 혼합물로 수차례 세척된다. 상기 플레이트가 건조되면, 섬광제(scintillant) (가령, MICROSCINT® , Packard)가 추가되고, 이 플레이트는 감마 카운터 (가령, TOPCOUNT® , Packard)상에서 카운트된다.
또다른 구체예에 따르면, KD는 예를 들면, Biacore® 2000 또는 Biacore® 3000 (Biacore, Inc., Piscataway, N.J.)을 이용하여, 고정된 항원 CM5 칩, 약 10 반응 단위 (RU)에서 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 측정된다. 간략하게 설명하자면, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, Biacore, Inc.)은 공급업자에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙시니미드 (NHS)로 활성화시킨다. 예를 들면, 항원은 결합된 단백질의 대략 10 반응 단위(RU)를 얻기 위하여 분당 5 μl의 유속으로 주사하기 전, 10 mM 아세테이트 나트륨, pH 4.8으로 5 μg/ml (약 0.2 μM)로 희석시킬 수 있다. 항원 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 비-반응 그룹을 차단한다. 역동학 측정을 위하여, 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®) 계면활성제 (PBST)와 함께 Fab의 2-배 일련의 희석물 (0.78 nM 에서 500 nM)은 PBS에서 분당 대략 25 μl의 유속으로 주사된다. 연합 속도(k온) 및 해리 속도(k오프)는 연합 및 해리 센소그램의 동시 핏팅(fitting)에 의해, 예를 들면, 단순한 일대일(one-to-one) Langmuir 결합 모델 (Biacore® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 산출된다. 평형 해리 상수 (KD)는 k오프/k온 비율로 산출된다[가령, Chen et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881]. 상기 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 연합 속도가 예를 들면, 106 M-1 s-1 를 초과한다면, 분광계, 이를 테면 스탑-플로우(stop-flow) 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐빗이 있는 8000-시리즈 SLM-AMINCO® 분광광도계(ThermoSpectronic)에서 측정될 때, 항원의 농도를 증가시키면서 PBS 안에 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 형광 방출 강도(가령, 여기=295 nm; 방출=340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 퀀칭 기술에 의해 연합 속도(on-rate)는 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항-GDF11 항체는 일반적으로 충분한 친화력으로 GDF11에 결합할 수 있는 항체로, 이 항체는 GDF11을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-GDF11 단백질에 항-GDF11 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA)에 의해 측정하였을 때, GDF11에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, 항-GDF11 항체는 상이한 종의 항-GDF11 중에서 보존된 항-GDF11의 에피토프에 결합한다. 특정한 바람직한 구체예들에서, 본 출원의 항-GDF11 항체는 GDF11 활성을 억제할 수 있는 길항제 항체이다. 예를 들면, 본 출원의 항-GDF11 항체는 GDF11의 동족 수용체 (예컨대, ActRIIA 또는 ActRIIB 수용체)에 대한 결합을 억제하고 및/또는 동족 수용체의 GDF11-매개 신호 전달 (활성화), 가령, ActRII 수용체에 의한 Smad 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-GDF11 항체들, 특히 다중특이적 항체들은, 액티빈 A에 실질적으로 결합하지 않거나 및/또는 이의 활성을 억제하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 큰 KD로 액티빈 A에 결합하거나 또는 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). GDF11은 GDF8에 대해 높은 서열 상동성을 가지므로 GDF11을 결합시키는 및/또는 이에 결합하는 항체들은, 일부 경우들에서, 또한 GDF8에 결합하거나 및/또는 이를 억제할 수 있음을 유념하여야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항-GDF8 항체는 일반적으로 충분한 친화력으로 GDF8에 결합할 수 있는 항체로, 이 항체는 GDF8을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-GDF8 단백질에 항-GDF8 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA)에 의해 측정하였을 때, GDF8에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, 항-GDF8 항체는 상이한 종의 항-GDF8 중에서 보존된 항-GDF8의 에피토프에 결합한다. 특정한 바람직한 구체예들에서, 본 출원의 항-GDF8 항체는 GDF8 활성을 억제할 수 있는 길항제 항체이다. 예를 들면, 본 출원의 항-GDF8 항체는 GDF8의 동족 수용체 (예컨대, ActRIIA 또는 ActRIIB 수용체)에 대한 결합을 억제하고 및/또는 동족 수용체의 GDF8-매개 신호 전달 (활성화), 가령, ActRII 수용체에 의한 Smad 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-GDF8 항체들, 특히 다중특이적 항체들은, 액티빈 A에 실질적으로 결합하지 않거나 및/또는 이의 활성을 억제하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 큰 KD로 액티빈 A에 결합하거나 또는 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐). GDF8은 GDF11과 높은 서열 상동성을 가지고, 따라서 일부 경우에 GDF8을 및/또는 GDF8에 결합하는 항체는 또한 GDF11에 결합하고 및/또는 이를 억제할 수 있음을 유념하여야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항-액티빈 항체는 일반적으로 충분한 친화력으로 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 AB, 및/또는 액티빈 E 중 하나 이상)에 결합할 수 있는 항체로, 이 항체는 액티빈을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-액티빈 단백질에 항-액티빈 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA)에 의해 측정하였을 때, 액티빈에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, 항-액티빈 항체는 상이한 종의 액티빈 중에서 보존된 액티빈의 에피토프에 결합한다. 특정한 바람직한 구체예들에서, 본 출원의 항-액티빈 항체는 액티빈 활성을 억제할 수 있는 길항제 항체이다. 예를 들면, 본 출원의 항-액티빈 항체는 액티빈의 동족 수용체 (예컨대, ActRIIA 또는 ActRIIB 수용체)에 대한 결합을 억제하고 및/또는 동족 수용체의 액티빈-매개 신호 전달 (활성화), 가령, ActRII 수용체에 의한 Smad 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-액티빈 항체들은 액티빈 B에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-액티빈 항체들은 액티빈 A 및 액티빈 B에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-액티빈 항체들, 특히 다중특이적 항체들은, 액티빈 A에 실질적으로 결합하지 않거나 및/또는 이의 활성을 억제하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 큰 KD로 액티빈 A에 결합하거나 또는 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항-BMP6 항체는 일반적으로 충분한 친화력으로 BMP6에 결합할 수 있는 항체로, 이 항체는 BMP6를 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-BMP6 단백질에 항-BMP6 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA)에 의해 측정하였을 때, BMP6에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, 항-BMP6 항체는 상이한 종의 항-BMP6 중에서 보존된 항-BMP6의 에피토프에 결합한다. 특정한 바람직한 구체예들에서, 본 출원의 항-BMP6 항체는 BMP6 활성을 억제할 수 있는 길항제 항체이다. 예를 들면, 본 출원의 항-BMP6 항체는 BMP6의 동족 수용체 (예컨대, ActRIIA 또는 ActRIIB 수용체)에 대한 결합을 억제하고 및/또는 동족 수용체의 BMP6-매개 신호 전달 (활성화), 가령, ActRII 수용체에 의한 Smad 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-BMP6 항체들, 특히 다중특이적 항체들은, 액티빈 A에 실질적으로 결합하지 않거나 및/또는 이의 활성을 억제하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 큰 KD로 액티빈 A에 결합하거나 또는 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항-GDF3 항체는 일반적으로 충분한 친화력으로 GDF3에 결합할 수 있는 항체로, 이 항체는 GDF3을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-GDF3 단백질에 항-GDF3 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA)에 의해 측정하였을 때, GDF3에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, 항-GDF3 항체는 상이한 종의 항-GDF3 중에서 보존된 항-GDF3의 에피토프에 결합한다. 특정한 바람직한 구체예들에서, 본 출원의 항-GDF3 항체는 GDF3 활성을 억제할 수 있는 길항제 항체이다. 예를 들면, 본 출원의 항-GDF3 항체는 GDF3의 동족 수용체 (예컨대, ActRIIA 또는 ActRIIB 수용체)에 대한 결합을 억제하고 및/또는 동족 수용체의 GDF3-매개 신호 전달 (활성화), 가령, ActRII 수용체에 의한 Smad 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-GDF3 항체들, 특히 다중특이적 항체들은, 액티빈 A에 실질적으로 결합하지 않거나 및/또는 이의 활성을 억제하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 큰 KD로 액티빈 A에 결합하거나 또는 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항-BMP10 항체는 일반적으로 충분한 친화력으로 BMP10에 결합할 수 있는 항체로, 이 항체는 BMP10을 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-BMP10 단백질에 항-BMP10 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA)에 의해 측정하였을 때, BMP10에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, 항-BMP10 항체는 상이한 종의 항-BMP10 중에서 보존된 항-BMP10의 에피토프에 결합한다. 특정한 바람직한 구체예들에서, 본 출원의 항-BMP10 항체는 BMP10 활성을 억제할 수 있는 길항제 항체이다. 예를 들면, 본 출원의 항-BMP10 항체는 BMP10의 동족 수용체 (예컨대, ActRIIA 또는 ActRIIB 수용체)에 대한 결합을 억제하고 및/또는 동족 수용체의 BMP10-매개 신호 전달 (활성화), 가령, ActRII 수용체에 의한 Smad 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-BMP10 항체들, 특히 다중특이적 항체들은, 액티빈 A에 실질적으로 결합하지 않거나 및/또는 이의 활성을 억제하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 큰 KD로 액티빈 A에 결합하거나 또는 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐).
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항-BMP9 항체는 일반적으로 충분한 친화력으로 BMP9에 결합할 수 있는 항체로, 이 항체는 BMP9를 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-BMP9 단백질에 항-BMP9 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA)에 의해 측정하였을 때, BMP9에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, 항-BMP9 항체는 상이한 종의 항-BMP9 중에서 보존된 항-BMP9의 에피토프에 결합한다. 특정한 바람직한 구체예들에서, 본 출원의 항-BMP9 항체는 BMP9 활성을 억제할 수 있는 길항제 항체이다. 예를 들면, 본 출원의 항-BMP9 항체는 BMP9의 동족 수용체 (예컨대, ActRIIA 또는 ActRIIB 수용체)에 대한 결합을 억제하고 및/또는 동족 수용체의 BMP9-매개 신호 전달 (활성화), 가령, ActRII 수용체에 의한 Smad 신호전달을 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-BMP9 항체들, 특히 다중특이적 항체들은, 액티빈 A에 실질적으로 결합하지 않거나 및/또는 이의 활성을 억제하지 않는다 (예컨대, 1 x 10-7 M 보다 큰 KD로 액티빈 A에 결합하거나 또는 비교적 보통의 결합, 예컨대, 약 1 x 10-8 M 또는 약 1 x 10-9 M을 가짐).
항-ActRII 항체는 일반적으로 충분한 친화력으로 ActRII (ActRIIA 및/또는 ActRIIB)에 결합할 수 있는 항체로, 이 항체는 ActRII를 표적화하는데 있어서 진단 및/또는 치료 물질로 유용하다. 특정 구체예들에 있어서, 무관한, 비-ActRII 단백질에 항-ActRII 항체의 결합 정도는 예를 들면, 방사능면역분석 (RIA)에 의해 측정하였을 때, ActRII에 이 항체가 결합하는 것의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만이다. 특정 구체예들에 있어서, 항-ActRII 항체는 상이한 종의 ActRII에서 보존된 ActRII의 에피토프에 결합한다. 바람직한 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 항체는 ActRII 활성을 억제할 수 있는 길항제 항체이다. 예를 들면, 본 출원의 항-ActRII 항체는 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, GDF11, GDF8, 액티빈 A, BMP6, 및 BMP7에서 선택된 하나 이상의 ActRII 리간드들을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 억제하거나 및/또는 이러한 리간드들 중 하나를 ActRII 신호전달 (예컨대, Smad 1, 2, 3, 5, 및 8 신호전달) 활성화로부터 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 항체들은 GDF11을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 억제하거나 및/또는 GDF11을 ActRII 신호전달 활성화로부터 억제한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 항체들은 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 억제하거나 및/또는 GDF8을 ActRII 신호전달 활성화로부터 억제한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRII 항체들은 GDF8 및 GDF11을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 억제하거나 및/또는 GDF8 및 GDF11을 ActRII 신호전달 활성화로부터 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 및/또는 이러한 수용체 활성화로부터 억제하는 본 출원의 항-ActRII 항체는 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E)을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 및/또는 이러한 수용체 활성화로부터 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 및/또는 이러한 수용체 활성화로부터 억제하는 본 출원의 항-ActRII 항체는, BMP6를 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 및/또는 이러한 수용체 활성화로부터 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 및/또는 이러한 수용체 활성화로부터 억제하는 본 출원의 항-ActRII 항체는, BMP10을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 및/또는 이러한 수용체 활성화로부터 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 및/또는 이러한 수용체 활성화로부터 억제하는 본 출원의 항-ActRII 항체는, BMP6 및 BMP10을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 및/또는 이러한 수용체 활성화로부터 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 및/또는 이러한 수용체 활성화로부터 억제하는 본 출원의 항-ActRII 항체는, 액티빈 (예컨대, 액티빈 B) 및 BMP6을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 및/또는 이러한 수용체 활성화로부터 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 및/또는 이러한 수용체 활성화로부터 억제하는 본 출원의 항-ActRII 항체는, 액티빈 (예컨대, 액티빈 B) 및 BMP10을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 및/또는 이러한 수용체 활성화로부터 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 및/또는 이러한 수용체 활성화로부터 억제하는 본 출원의 항-ActRII 항체는, 액티빈 (예컨대, 액티빈 B), BMP6 및 BMP10을 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 및/또는 이러한 수용체 활성화로부터 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 항-ActRIIA 항체들은 액티빈 A를 ActRII 수용체에 대한 결합으로부터 실질적으로 억제하지 않으며 및/또는 실질적으로 ActRII 신호전달의 액티빈 A-매개 활성화를 억제하지 않는다.
인간 ActRII 수용체들 및 리간드들 (예컨대, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP10, ActRIIB, 및 ActRIIA)의 핵산 및 아미노산 서열들은 해당 분야에 널리 공지이므로, 본 출원에 따라 사용하기 위한 항체 길항제는 본원에 제공된 기술 및 교시에 기초하여, 숙련된 기술자에 의해 통상적으로 제조될 수 있다.
특정 구체예들에서, 본원에서 제공되는 항체는 키메라 항체다. 키메라 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분은 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 특정 키메라 항체는 예를 들면, 미국 특허 제 4,816,567; 그리고 Morrison 외., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855에서 설명된다. 일부 구체예들에 있어서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (가령, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 이를 테면 원숭이로부터 유도된 가변 영역)과 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 부류 또는 하위부류에서 변경된 "부류 전환(class switched)"항체다. 일반적으로, 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 키메라 본 발명의 항체는 인간화된 항체다. 인간화된 항체는 비-인간 초가변 영역 (HVRs)의 아미노산 잔기와 인간 틀-구조 영역 (FRs)의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 말한다. 특정 구체예들에 있어서, 인간화된 항체는 실질적으로 최소한 하나의, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 이때 HVRs (가령, CDRs)의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비-인간 항체에 대응하며, FRs의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화된 항체는 임의선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 최소한 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화된 형태", 가령, 비-인간 항체는 인간화를 거친 항체를 말한다.
인간화된 항체 및 이를 만드는 방법은 예를 들면, Almagro and Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633에서 검토되며, 그리고 예를 들면 Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-329; Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; 미국 특허 제 5,821,337; 7,527,791; 6,982,321; and 7,087,409; Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34 [describing SDR (a-CDR) grafting]; Padlan, Mol. Immunol. (1991) 28:489-498 (describing "resurfacing"); Dall'Acqua et al. (2005) Methods 36:43-60 (describing "FR shuffling"); Osbourn et al. (2005) Methods 36:61-68; and Klimka 외. Br. J. Cancer (2000) 83:252-260 (describing the "guided selection" approach to FR shuffling)에서 설명되고 있다.
인간화에 이용되는 인간 틀-구조 영역은 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: "best-fit" 방법을 이용하여 선택된 틀-구조 영역 [가령, Sims 외. (1993) J. Immunol. 151:2296 ]; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위집단의 인간 항체의 공통 서열로부터 유도된 틀-구조 영역 [가령, Carter 외. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; 그리고 Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623]; 인간 성숙 (체세포적으로 성숙된) 틀-구조 영역 또는 인간 생식계 틀-구조 영역 [가령, Almagro and Fransson (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633]; 그리고 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유도된 틀-구조 영역 [가령, Baca 외., (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; 그리고 Rosok 외., (1996) J. Biol. Chem. 271:22611-22618].
특정 구체예들에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 인간 항체다. 인간 항체는 해당 분야에 공지된 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 van Dijk and van de Winkel (2001) Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg (2008), Curr. Opin. Immunol. 20:450-459에서 기술된다.
인간 항체는 항원 공격에 대하여 손상되지 않은 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 가진 손상되지 않은 항체를 만들도록 변형된 이식유전자를 가진 동물에게 면역원 (가령, GDF11 폴리펩티드, GDF8 폴리펩티드, ActRII폴리펩티드, 또는 ActRIIB 폴리펩티드)을 투여하여 만들 수 있다. 그러한 동물은 전형적으로 내인성 면역 글로불린 좌를 대체하거나, 또는 염색체 외적으로 존재하거나 무작위로 동물의 염색체에 통합된 인간 면역 글로불린 좌 전부 또는 일부를 포함한다. 이러한 이식유전자를 가진 동물에서 내인성 면역 글로불린 유전자 좌는 일반적으로 불활성화되었다. 이식유전자를 가진 동물로부터 인간 항체를 얻는 방법은 예를 들면, Lonberg (2005) Nat. Biotechnol. 23:1117-1125; 미국 특허 제 6,075,181 및 6,150,584 (XENOMOUSE™ 기술 설명); 미국 특허 제 5,770,429 (HuMab® 기술 설명); 미국 특허 제 7,041,870 (K-M MOUSE® 기술 설명); 그리고 미국 특허 출원 공개 No. 2007/0061900 (VelociMOUSE® 기술 설명)을 참고한다. 그러한 동물에 의해 생성된 손상되지 않은 항체로부터 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 결합시킴으로써 추가로 변형 될 수 있다.
인간 본 발명의 항체는 하이브리도마-기반 방법에 의해 또한 만들어질 수 있다. 인간 단클론 항체를 생산하기 위하여 인간 골수종 및 마우스-인간 이형골수종 세포 계통이 설명되었다 [가령, Kozbor J. Immunol., (1984) 133: 3001; Brodeur et al. (1987) Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York; 그리고 Boerner et al. (1991) J. Immunol., 147: 86 참조]. 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성되는 인간 상체들은 또한 Li 외., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562에 기재되어 있다. 또 다른 방법들에는, 예를 들면, 미국 특허 제 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체들의 제조를 기술) 및 Ni, Xiandai Mianyixue (2006) 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 기술)에 기재된 방법들이 포함된다. 인간 하이브리도마 기술(Trioma 기술)은 또한 Vollmers and Brandlein (2005) Histol. Histopathol., 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein (2005) Methods Find Exp. Clin. Pharmacol., 27(3):185-91에서 설명된다.
본 발명의 인간 항체는 인간-유래 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이러한 가변-도메인 서열은 그 다음 원하는 인간 불변 도메인에 복합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하기 위한 기술이 본 명세서에 설명된다.
예를 들면, 본 발명의 항체는 원하는 활성 또는 작용을 가진 항체에 대하여 복합 라이브러리 스크리닝에 의해 단리될 수 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 만들고, 원하는 결합 특성을 가진 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법들이 해당 분야에 공지되어 있다. 이러한 방법들은 예를 들면, Hoogenboom 외. (2001) in Methods in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien 외., ed., Human Press, Totowa, N.J. and further described, for example, in the McCafferty et al. (1991) Nature 348:552-554; Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628; Marks et al. (1992) J. Mol. Biol. 222:581-597; Marks and Bradbury (2003) in Methods in Molecular Biology 248:161-175, Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J.; Sidhu et al. (2004) J. Mol. Biol. 338(2):299-310; Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093; Fellouse (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472; 그리고 Lee et al. (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132에서 검토된다.
특정 파아지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레파토리는 중합효소 쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클론되고, 그 다음 파아지 라이브러리에 무작위로 재복합되고, 그 다음 Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455에서 설명된 바와 같이, 항원-결합 파아지에 대하여 스크리닝될 수 있다. 파아지는 전형적으로 단일-쇄 Fv (scFv) 단편들 또는 Fab 단편들로써 디스플레이 항체 단편들을 나타낸다. 면역화된 원천으로부터 라이브러리는 하이브리도마 구축 없이도 면역원(예컨대, GDF11, 액티빈 B, ActRIIA, 또는 ActRIIB)에 대한 고-친화력 항체를 제공한다. 대안으로, 나이브(naive) 레퍼토리가 클론되어 (가령, 인간으로부터) Griffiths et al. (1993) EMBO J, 12: 725-734에서 설명된 바와 같은 임의의 면역화없이 광범위한 비-자가 및 자가 항원에 대하여 지시된 항체의 단일 원천을 제공할 수 있다. 끝으로, Hoogenboom and Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381-388에 기재된 바와 같이, 고도로 가변적인 CDR3 영역을 인코딩하고, 시험 관내에서 재배열을 수행하기 위하여, 재배치되지 않은 V- 유전자 분절을 줄기 세포로부터 클로닝하고, 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 나이브 라이브러리를 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파아지 라이브러리를 설명하는 특허 공개문헌은 예를 들면: 미국 특허 제 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 본 발명의 항체는 다중특이적 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체다. 다중특이적 항체 (전형적으로 단클론 항체)는 하나 또는 그 이상의 (가령, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의) 항원에서 최소한 2개의 상이한 에피토프 (가령, 2, 3, 4, 5, 또는 6 또는 그 이상의)에 대한 결합 특이성을 갖는다.
특정 구체예에서, 본 출원의 다중특이적 항체는 둘 이상의 결합 특이성을 포함하며, 결합 특이성 중 최소한 하나는 GDF11 에피토프에 대한 것이고, 선택적으로 하나 이상의 추가 결합 특이성은 상이한 ActRII 리간드 (예컨대, GDF8, 액티빈, BMP6, 및/또는 BMP10) 및/또는 ActRII 수용체 (예컨대, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체)에 대한 에피토프에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 다중특이적 항체들은 GDF11의 둘 이상의 상이한 에피토프들에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 일부, GDF11 에피토프에 대한 결합 친화력을 가지는 본 출원의 다중특이적 항체는 GDF11 활성 (예컨대, ActRII 수용체에 결합하거나 및/또는 이를 활성화시키는 능력)을 억제하고, 선택적으로 하나 이상의 상이한 ActRII 리간드들 (예컨대, GDF8, 액티빈, BMP6, 및/또는 BMP10) 및/또는 ActRII 수용체 (예컨대, ActRIIA 또는 ActRIIB 수용체)의 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 특정한 바람직한 구체예들에서, GDF11에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 최소한 GDF8에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 선택적으로, GDF11에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 실질적으로 액티빈 A에 결합하지 않거나 및/또는 실질적으로 이를 억제하지 않는다.
특정 구체예에서, 본 출원의 다중특이적 항체는 둘 이상의 결합 특이성을 포함하며, 결합 특이성 중 최소한 하나는 GDF8 에피토프에 대한 것이고, 선택적으로 하나 이상의 추가 결합 특이성은 상이한 ActRII 리간드 (예컨대, GDF11, 액티빈, BMP6, BMP10, BMP9, 및/또는 GDF3) 및/또는 ActRII 수용체 (예컨대, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체)에 대한 에피토프에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 다중특이적 항체들은 GDF8의 둘 이상의 상이한 에피토프들에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 일부, GDF8 에피토프에 대한 결합 친화력을 가지는 본 출원의 다중특이적 항체는 GDF8 활성 (예컨대, ActRII 수용체에 결합하거나 및/또는 이를 활성화시키는 능력)을 억제하고, 선택적으로 하나 이상의 상이한 ActRII 리간드들 (예컨대, GDF11, 액티빈, BMP6, BMP10, BMP9, 및/또는 GDF3) 및/또는 ActRII 수용체 (예컨대, ActRIIA 또는 ActRIIB 수용체)의 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 특정한 바람직한 구체예들에서, GDF8에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 최소한 GDF11에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 선택적으로, GDF8에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 최소한 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및 액티빈 E)에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 일부 구체예들에서 GDF8에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 최소한 액티빈 B에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF8에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 실질적으로 액티빈 A에 결합하지 않거나 및/또는 실질적으로 이를 억제하지 않는다. 선택적으로, GDF8에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 BMP6에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 선택적으로, GDF8에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 BMP9에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF8에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 실질적으로 BMP9에 결합하지 않거나 및/또는 실질적으로 이를 억제하지 않는다. 선택적으로, GDF8에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 BMP10에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF8에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 실질적으로 BMP10에 결합하지 않거나 및/또는 실질적으로 이를 억제하지 않는다. 선택적으로, GDF8에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 GDF3에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다.
특정 구체예에서, 본 출원의 다중특이적 항체는 둘 이상의 결합 특이성을 포함하며, 결합 특이성 중 최소한 하나는 GDF11 에피토프에 대한 것이고, 선택적으로 하나 이상의 추가 결합 특이성은 상이한 ActRII 리간드 (예컨대, GDF8, 액티빈, BMP6, BMP10, BMP9, 및/또는 GDF3) 및/또는 ActRII 수용체 (예컨대, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체)에 대한 에피토프에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 다중특이적 항체들은 GDF11의 둘 이상의 상이한 에피토프들에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 일부, GDF11 에피토프에 대한 결합 친화력을 가지는 본 출원의 다중특이적 항체는 GDF11 활성 (예컨대, ActRII 수용체에 결합하거나 및/또는 이를 활성화시키는 능력)을 억제하고, 선택적으로 하나 이상의 상이한 ActRII 리간드들 (예컨대, GDF8, 액티빈, BMP6, BMP10, BMP9, 및/또는 GDF3) 및/또는 ActRII 수용체 (예컨대, ActRIIA 또는 ActRIIB 수용체)의 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 특정한 바람직한 구체예들에서, GDF11에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 최소한 GDF8에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 선택적으로, GDF11에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 최소한 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및 액티빈 E)에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 일부 구체예들에서 GDF11에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 최소한 액티빈 B에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 실질적으로 액티빈 A에 결합하지 않거나 및/또는 실질적으로 이를 억제하지 않는다. 선택적으로, GDF11에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 BMP6에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 선택적으로, GDF11에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 BMP9에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 실질적으로 BMP9에 결합하지 않거나 및/또는 실질적으로 이를 억제하지 않는다. 선택적으로, GDF11에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 BMP10에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 실질적으로 BMP10에 결합하지 않거나 및/또는 실질적으로 이를 억제하지 않는다. 선택적으로, GDF11에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 GDF3에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다.
특정 구체예에서, 본 출원의 다중특이적 항체는 둘 이상의 결합 특이성을 포함하며, 결합 특이성 중 최소한 하나는 액티빈에 대한 것이고, 선택적으로 하나 이상의 추가 결합 특이성은 상이한 ActRII 리간드 (예컨대, GDF11, GDF8, BMP6, BMP10, BMP9, 및/또는 GDF3) 및/또는 ActRII 수용체 (예컨대, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 수용체)에 대한 에피토프에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 다중특이적 항체들은 액티빈의 둘 이상의 상이한 에피토프들에 결합할 수 있거나 또는 상이한 액티빈 유형들 상의 둘 이상의 상이한 에피토프들에 결합할 수 있다 (예컨대, 액티빈 A 에피토프에 결합하거나 액티빈 B 에피토프에 결합한다). 바람직하게는, 일부, 액티빈 에피토프에 대한 결합 친화력을 가지는 본 출원의 다중특이적 항체는 액티빈 활성 (예컨대, ActRII 수용체에 결합하거나 및/또는 이를 활성화시키는 능력)을 억제하고, 선택적으로 하나 이상의 상이한 ActRII 리간드들 (예컨대, GDF11, GDF8, BMP6, BMP10, BMP9, 및/또는 GDF3) 및/또는 ActRII 수용체 (예컨대, ActRIIA 또는 ActRIIB 수용체)의 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 특정한 바람직한 구체예들에서, 액티빈에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 최소한 GDF11에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 선택적으로, 액티빈에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 GDF8에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 일부 구체예들에서 본 출원의 다중특이적 항체들은 액티빈 B에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 일부 구체예들에서, 액티빈 B에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 실질적으로 액티빈 A에 결합하지 않거나 및/또는 실질적으로 이를 억제하지 않는다. 선택적으로, 액티빈에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 BMP6에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 선택적으로, 액티빈에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 BMP9에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 일부 구체예들에서, 액티빈에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 실질적으로 BMP9에 결합하지 않거나 및/또는 실질적으로 이를 억제하지 않는다. 선택적으로, 액티빈에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 BMP10에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다. 일부 구체예들에서, 액티빈에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 실질적으로 BMP10에 결합하지 않거나 및/또는 실질적으로 이를 억제하지 않는다. 선택적으로, 액티빈에 결합하거나 및/또는 이를 억제하는 본 출원의 다중특이적 항체들은 추가로 GDF3에 결합하거나 및/또는 이를 억제한다.
"옥토푸스(Octopus) 항체"를 포함하는, 3개 또는 그 이상 기능성 항원 결합 부위들을 가진 조작제작된 항체가 또한 본 명세서에 포함된다 (예로써 US 2006/0025576A1 참고).
특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 항체들은 단클론 항체들이다. 단클론 항체는 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 획득된 항체를 말하는데, 가령, 개별 항체는 동일한 집단 및/또는 같은 에피토프에 결합하는 집단을 포함하는데, 다만, 변이체 항체, 가령, 자연 발생적 돌연변이 또는 단클론 항체 제재를 만드는 동안 발생되는 돌연변이를 가진 변이체 항체 가능성이 있으며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 에피토프로 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단일 클론 항체는 항원상의 단일 항원 결정기를 지향한다. 따라서, 수식어 "단클론(monoclonal)"은 상기 항체의 특징은 실질적으로 동질성 집단의 항체로부터 획득되나, 이 항체 생산에 임의의 특정 방법이 요구되지 않는 것으로 간주되는 것을 나타낸다. 예를 들면, 본 방법에 따라 사용될 단클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파아지-디스플레이 방법 그리고 인간 면역 글로불린 좌의 전부 또는 일부를 함유하는 이식유전자를 가진 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 제조 될 수 있고, 이들 방법 및 다른 예시적인 방법이 본원에 기술되어 있다.
예를 들면, GDF11로부터 유도된 면역원을 이용하여, 항-단백질/항-펩티드 항혈청 또는 단클론 항체를 표준 프로토콜에 의해 만들어질 수 있다 [가령, Antibodies: A Laboratory Manual (1998) ed. by Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Press]. 포유류, 이를 테면 마우스, 햄스터, 또는 토끼는 GDF11 폴리펩티드의 면역원 형태, 항체 반응을 유도할 수 있는 항원 단편, 또는 융합 단백질로 면역화될 수 있다. 단백질 또는 펩티드에 면역원성을 부여하는 기술은 운반체에 대한 접합을 포함하고, 또는 해당 분야에 널리 공지 된 다른 기술을 포함한다. GDF11 폴리펩티드의 면역원 부분은 어쥬번트 존재하에 투여될 수 있다. 면역화 과정은 혈장 또는 혈청에서 항체 역가 탐지에 의해 모니터될 수 있다. 표준 ELISA 또는 다른 면역분석은 항체 생산 수준 및/또는 결합 친화력 수준을 평가하기 위하여 항원으로 면역원을 이용한다.
GDF11 항원 제재로 동면을 면역화시킨 후, 항혈청이 수득되며, 원하는 경우, 혈청으로부터 다클론 항체가 단리될 수 있다. 단클론 항체를 생산하기 위하여, 항체 생성 세포 (림프구)를 면역화 동물로부터 수확하고, 골수종 세포와 같은 불멸화 세포와의 표준 체세포 융합 과정에 의해 융합시켜 하이브리 도마 세포를 수득 할 수 있다. 이러한 기술은 해당 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, 인간 단클론 항체를 생산하기 위한 하이브리도마 기술 [가령, Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-497], 인간 B 세포 하이브리도마 기술 [가령, Kozbar et al. (1983) Immunology Today, 4:72], 및 EBV-하이브리도마 기술[Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96]을 포함한다. 하이브리도마 세포는 GDF11 폴리펩티이드와 특이적으로 반응하는 항체 및 그러한 하이브리도마 세포를 포함하는 배양 물로부터 단리된 항체의 생산을 위해 면역화학적으로 스크리닝 될 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형이 본 발명의 항체의 Fc 영역 안으로 도입되고, 이로 인하여 Fc 영역 변이체가 만들어질 수 있다. 상기 Fc-영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (가령, 치환, 결손, 및/또는 추가)이 포함된 인간 Fc-영역 서열 (가령, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본원의 개시 내용은 전체 작동체 기능이 아닌 일부만을 보유하는 항체 변이체를 고려하는데, 이들 변이체는 항체의 반감기도 중요하지만, 특정 작동체 기능 [가령, 보체-의존적 세포독성 (CDC) 및 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)]은 불필요하거나 또는 유해한 용도에 바람직한 후보물질이 될 수 있다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 실행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석을 실행하여, 상기 항체는 FcγR 결합 (이로 인하여 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음)은 없지만, 여전히 FcRn 결합 능력은 유지하고 있다는 것을 확인할 수 있다. ADCC를 중개하는 일차 세포, NK 세포는 오직 FcγRIII만을 발현시키고, 반면 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈 세포에서 FcR 발현은 예를 들면, Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 분석하기 위한 시험관내 분석의 비-제한적인 예는 미국 특허 제 5,500,362; Hellstrom, I. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063]; Hellstrom, I et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1499-1502; 미국 특허 제 5,821,337; Bruggemann, M. et al. (1987) J. Exp. Med. 166:1351-1361에서 설명된다. 대안으로, 비-방사능활성 분석 방법이 이용될 수 있다(가령, ACTI™, 유동 세포측정용 비-방사능활성 세포독성 분석; CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.; 그리고 CytoTox 96® 비-방사능활성 세포독성 분석, Promega, Madison, Wis.). 이러한 분석을 위한 유용한 작동체 세포는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로, 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 예를 들면, 동물 모델에서 생체내 평가될 수 있는데, 이를 테면 Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656에서 설명된다. 이 항체가 C1q에 결합 할 수 없으므로, CDC 활성이 결핍된다는 것을 확인하기 위하여 C1q 결합 분석이 또한 시행될 수 있다 [가령, C1q 및 C3c 결합 ELISA, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402]. 보체 활성화 평가를 위하여, CDC 분석이 실행될 수 있다[가령, Gazzano-Santoro et al. (1996) J. Immunol. Methods 202:163; Cragg, M. S. et al. (2003) Blood 101:1045-1052; 그리고 Cragg, M. S, and M. J. Glennie (2004) Blood 103:2738-2743]. FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정은 해당 분야에 공지된 방법에 의해 또한 실행될 수 있다 [가령, Petkova, S. B. et al. (2006) Intl. Immunol. 18(12):1759-1769].
감소된 작동체 기능을 가진 본 발명의 항체는 하나 또는 그 이상의 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329에 치환을 갖는 것들을 포함한다 (미국 특허 제 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체가 포함된, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327중 2개 또는 그 이상이 치환된 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 제 7,332,581).
특정 구체예들에 있어서, 항체의 하나 또는 그 이상의 잔기가 시스테인 잔기으로 대체된, 시스테인 조작된 항체, 가령, "thioMAbs"를 만드는 것이 바람직할 수 있다. 구체적으로 구체예에서, 상기 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응활성 티올기는 이 상체의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 다른 모이어티, 이를 테면 하기에서 설명되는 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 이 항체가 접합되어 면역접합체가 생성될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 임의의 하나 또는 그 이상의 다음 잔기는 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 그리고 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는 예를 들면, 미국 특허 제 7,521,541에서 설명된 바와 같이 만들어질 수 있다.
또한, 원하는 항체를 식별하기 위하여 항체를 스크리닝하는데 이용되는 기술은 수득되는 항체의 성질에 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, 항체가 용액 내 항원을 결합시키는데 사용되는 경우, 용액 결합을 시험하는 것이 바람직할 수 있다. 특히 바람직한 항체를 확인하기 위해, 항체와 항원 사이의 상호 작용을 시험하기 위한 다양한 기술을 이용할 수 있다. 이러한 기술에는 ELISAs, 표면 플라스몬 공명 결합 분석 (가령, Biacore™ 결합 분석, Biacore AB, Uppsala, Sweden), 샌드위치 분석 (가령, 반자성 비드 시스템, IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), 웨스턴 블랏, 면역침전 분석, 및 면역조직 화학이 포함된다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체들도 고려된다. 예를 들면, 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 결합 친화력 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체들은 항체 및/또는 결합 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입시키거나, 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다. 이러한 변형은 예를 들면, 이 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 안에 잔기의 결손 및/또는 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 만일 최종 구조체가 바람직한 특징, 예를 들면, 표적-결합 (GDF11, GDF8, ActRIIA, 및/또는 ActRIIB 결합)을 보유한다면, 최종 구조체에 결손, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 있을 수 있다.
예를 들면, 항체 친화력을 개선시키기 위하여 변경 (가령, 치환)은 HVRs에서 만들어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟 (hotspots)"에서, 가령, 체세포 성숙 과정 동안 고빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코드되는 잔기에서 만들어질 수 있고[가령, Chowdhury (2008) Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)], 및/또는 SDRs (a-CDRs), 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화력에 대하여 테스트된다. 2 차 라이브러리로부터의 재구성 및 선택에 의한 친화력 성숙은 해당 분야에 기술되어 있다[가령, Hoogenboom 외., in Methods in Molecular Biology 178:1-37, O'Brien 외., ed., Human Press, Totowa, N.J., (2001) 참조]. 친화력 성숙의 일부 구체예들에 있어서, 다양성은 다양한 방법들 중 임의의 방법에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자들에 도입된다(가령, 오류-발생(error-prone) PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지향된 돌연변이생성). 그 후 제 2 라이브러리가 생성된다. 이어서, 이 라이브러리를 스크리닝하여, 원하는 친화력을 갖는 임의의 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하는 또다른 방법은 HVR-지향된 접근법을 포함하는데, 이때 몇개 HVR 잔기 (가령, 한번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는 가령, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 특이적으로 식별될 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 대개 표적이 된다.
특정 구체예들에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결손은 이러한 변경으로 이 항체가 항원에 결합하는 능력이 실질적으로 감소되지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 HVRs에 발생될 수 있다. 예를 들면, 결합 친화력을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (가령, 본 명세서에서 제공된 보존적 치환)이 HVRs에 만들어 질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDRs 밖에 있을 수 있다. 상기에서 제시된 변이체 VH 및 VL의 특정 구체예들에 있어서, 각 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이상의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발의 표적이 될 수 있는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 잔기 또는 영역을 식별하는데 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에서 설명된 바와 같이, "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 불린다. 이 방법애소, 표적 잔기 또는 표적 잔기들의 집단 (예컨대, 하전된 잔기, 가령, arg, asp, his, lys, 및 glu)이 확인되고, 그리고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예로써, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어, 항원과 항체 또는 결합 폴리펩티드와의 상호작용이 영향을 받았는지를 판단한다. 추가 치환이 상기 아미노산 위치에 도입되어, 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증할 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 이용하여 항체와 항원 간의 접촉점들을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 접촉 잔기와 이웃 잔기는 치환의 후보로 표적화되거나, 또는 제거될 수 있다. 변이체들이 원하는 성질을 보유하는지를 판단하기 위하여 이 변이체들이 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 한 개 잔기에서 수백 또는 그 이상의 잔기가 함유된 폴리펩티드 범위, 뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입이 포함된 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 이 항체 분자의 다른 삽입 변이체들은 이 항체의 N- 또는 C-말단을 효소 (가령, ADEPT를 위한) 또는 이 항체의 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 융합시킨 것을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 본원에서 제공된 항체 및/또는 결합 폴리펩티드는 해당 분야에 공지되어 있고, 쉽게 입수할 수 있는 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 유도체화에 적합한 부분은 수용성 중합체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 예로는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다:폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥소레인, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 그리고 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프로일프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (가령, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이의 혼합물. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인하여 제작에서 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 항체 및/또는 결합 폴리펩티드에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나 이상의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 항체 유도체 및/또는 결합 폴리펩티드 유도체가 규정된 상태하에 치료에 사용될 것인지 여부에 관계없이, 개선되는 항체 및/또는 결합 폴리펩티드의 특정 특성 또는 기능을 포함하는, 고려사항에 근거하여 결정될 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 ActRII 길항제 항체들 (예컨대, 항-액티빈 A 항체, 항-액티빈 B 항체, 항-액티빈 C 항체, 항-액티빈 E 항체, 항-GDF11 항체, 항-GDF8 항체, 항-BMP6 항체, 항-BMP10 항체, 항-ActRIIA 항체, 항-GDF3 항체, 및/또는 또는 항-ActRIIB 항체)은 원하는 효과를 구현하기 위해 [필요로 하는 환자에서 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방, 눈 혈관 질환에 걸린, 필요로 하는 환자에서 시각을 증가 (예컨대, 시력 및/또는 시야를 증가), 및/또는 눈 혈관 질환의 하나 이상의 합병증들을 치료 또는 예방] 하나 이상의 추가 ActRII 길항제 물질들과 조합될 수 있다. 예를 들면, ActRII 길항제 항체는 다음과 조합하여 사용될 수 있다: i) 하나 이상의 추가 ActRII 길항제 항체, ii) 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드; iii) 하나 이상의 소분자 ActRII 길항제; iv) 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제; v) 하나 이상의 폴리스타틴 폴리펩티드; 및/또는 vi) 하나 이상의 FLRG 폴리펩티드.
D. 소분자 길항제
또 다른 양상에서, 본 출원은 ActRII 활성을 길항 (예컨대, Smads 1, 2, 3, 5, 및 8을 통한 ActRII 신호전달의 억제)하는 소분자, 또는 소분자들의 조합에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 필요로 하는 환자에서 눈 혈관 질환 [예컨대, 황반 변성 (예컨대, 연령-관련 황반 변성, 소아 황반 변성, 습성 황반 변성, 건성 황반 변성, 스타르가르트병, 및 베스트병), 망막 혈관 폐색 (예컨대, 중심 망막 혈관 폐색, 절반-망막 혈관 폐색, 망막 분지 혈관 폐색, 망막 혈관 폐색 후 황반 부종, 및 허혈성 망막 혈관 폐색), 망막 동맥 폐색 (예컨대, 중심 망막 동맥 폐색, 절반-망막 동맥 폐색, 망막 분지 동맥 폐색, 및 허혈성 망막 동맥 폐색), 당뇨 망막병증, 당뇨성 황반 부종, 허혈성 시신경병증 [예컨대, 전방 허혈성 시신경병증 (동맥염성 및 비-동맥염성) 및 후방 허혈성 시신경병증], 황반 모세혈관확장증 (I형 또는 II형), 망막 허혈 (예컨대, 급성 망막 허혈 또는 만성 망막 허혈), 안구 허혈 증후군, 망막 혈관염, 및 미숙아 망막병증]을 치료 또는 예방; 필요로 하는 눈 혈관 질환 환자에서 시각을 증대 (예컨대, 시력의 증대 및/또는 시야 증대); 및/또는 눈 혈관 질환의 하나 이상의 합병증들의 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII의 소분자 길항제 (억제제), 또는 ActRII의 소분자 길항제들의 조합을 단독으로 또는 하나 이상의 추가 지지 요법들과 병용하여 사용하는 방법들을 제공한다.
일부 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 ActRII 길항제는 최소한 GDF11 활성을 억제하는 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합이다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 ActRII 길항제는 최소한 GDF8 활성을 억제하는 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합이다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 ActRII 길항제는 최소한 GDF3 활성을 억제하는 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합이다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 ActRII 길항제는 최소한 BMP6 활성을 억제하는 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합이다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 ActRII 길항제는 최소한 BMP9 활성을 억제하는 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합이다. 대안적으로, 다른 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 소분자 ActRII 길항제는 BMP9 활성을 억제하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 ActRII 길항제는 최소한 BMP10 활성을 억제하는 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합이다. 대안적으로, 다른 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 소분자 ActRII 길항제는 BMP10 활성을 억제하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 ActRII 길항제는 최소한 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및 액티빈 E) 활성을 억제하는 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합이다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 ActRII 길항제는 최소한 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및 액티빈 E) 활성을 억제하는 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합이다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 ActRII 길항제는 최소한 액티빈 B 활성을 억제하는 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합이다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 소분자 ActRII 길항제는 액티빈 B 활성을 억제하지 않는다.
일부 구체예들에서, 본 출원의 바람직한 ActRII 길항제는 최소한 GDF11 및 GDF8 활성을 억제하는 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합이다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8 활성을 억제하는 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E)을 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 및/또는 액티빈 활성을 억제하는 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 BMP6를 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, 및/또는 BMP6 활성을 억제하는 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 GDF3를 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, 및/또는 GDF3 활성을 억제하는 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 BMP10을 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, GDF3, 및/또는 BMP10 활성을 억제하는 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 BMP9를 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, GDF3, BMP9, 및/또는 BMP10 활성을 억제하는 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 액티빈 A를 억제하지 않는다.
일부 구체예들에서, 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 ActRII 수용체 (예컨대 ActRII-매개 Smad 1, 2, 3, 5, 및 8 신호전달)를 억제한다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 GDF11을 ActRII 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB)에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 억제한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 억제한다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 GDF11 및 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 억제하는 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및/또는 액티빈 E)을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 억제하는 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 BMP6를 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 억제하는 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 BMP10을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 억제하는 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 BMP6 및 BMP10을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 억제하는 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 액티빈 (예컨대, 액티빈 B) 및 BMP6을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 억제하는 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 액티빈 (예컨대, 액티빈 B) 및 BMP10을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 억제하는 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 액티빈 (예컨대, 액티빈 B), BMP6 및 BMP10을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8을 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 억제하는 본 출원의 소분자 길항제, 또는 소분자 길항제들의 조합은 액티빈 A를 ActRII 수용체에 대한 결합 및/또는 이의 활성화로부터 억제하지 않는다.
소분자 ActRII 길항제는 직접 또는 간접 억제제일 수 있다. 예를 들면, 간접 소분자 ActRII 길항제, 또는 소분자 ActRII 길항제들의 조합은, GDF11, GDF8, 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, GDF3, BMP10, ActRIIA 및/또는 ActRIIB의 최소한 하나 이상의 발현 (예컨대, 전사, 번역, 세포 분비, 또는 이의 조합)을 억제할 수 있다. 대안적으로, 직접 소분자 ActRII 길항제, 또는 소분자 ActRII 길항제들의 조합은, 예를 들면, 하나 이상의 리간드 [예컨대, GDF11, GDF8,GDF3, 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E) BMP6, 및/또는 BMP10], 수용체 (ActRIIA 및/또는 ActRIIB), 또는 ActRII-리간드 신호전달 경로의 신호전달 구성성분 (예컨대, Smad 1, 2, 3, 5, 및 8 중 하나 이상)에 직접 결합할 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법에 따라 하나 또는 그 이상의 간접적 그리고 하나 또는 그 이상의 직접 ActRII 소분자 길항제의 조합이 사용될 수 있다.
본 명세서의 유기 소분자 길항제의 결합은 공지의 방법을 이용하여 식별 및 화학적으로 합성될 수 있다 (가령, PCT 공개 특허 출원 제 WO 00/00823 및 WO 00/39585 참조). 일반적으로, 본 명세서의 소분자 길항제는 보통 약 2000 달톤 크기, 대안으로 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만의 크기이며, 이때 이러한 유기 소분자는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 폴리펩티드 (예컨대, GDF11, GDF8, ActRIIA, 및 ActRIIB)에 바람직하게 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 소분자 길항제는 잘 알려진 기술을 사용하여 과도한 실험없이 확인 될 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대한 유기 소분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 해당 분야에 잘 공지되어 있다(가령, 국제 특허 공개 번호. WO00/00823 및 WO00/39585).
본 명세서의 결합 유기 소분자는 예를 들면, 알데히드, 케톤, 옥심, 하이드라존, 세미카르바존, 카르바지드, 1 차 아민, 2 차 아민, 3 차 아민, N-치환된 하이드라진, 하이드라지드, 알코올, 에테르, 티올, 티오에테르, 디설파이드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카르바메이트, 카르보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할로겐화물, 아릴 술포네이트, 알킬 할로겐화물, 알킬 술포네이트, 방향족 화합물, 헤테로시클릭 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알코올, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 에나민, 술폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 이소시아네이트, 술포닐 클로라이드, 디아조 화합물 및 산 클로라이드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 임의의 소분자 ActRII 길항제들 (예컨대, GDF11, GDF8, GDF3, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP10, ActRIIA, 및/또는 ActRIIB중 하나 이상의 소분자 길항제)은 원하는 효과를 구현하기 위해 [예컨대, 필요로 하는 환자에서 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방, 눈 혈관 질환에 걸린, 필요로 하는 환자에서 시각을 증가 (예컨대, 시력을 증가 및/또는 시야를 증가), 및/또는 눈 혈관 질환의 하나 이상의 합병증들을 치료 또는 예방] 하나 이상의 추가 ActRII 길항제 물질들과 조합될 수 있다. 예를 들면, 소분자 ActRII 길항제는 다음과 조합하여 사용될 수 있다: i) 하나 이상의 추가 소분자 ActRII 길항제, ii) 본 명세서에 개시된 하나 이상의 ActRII 길항제 항체들; iii) 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드; iv) 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제; v) 하나 이상의 폴리스타틴 폴리펩티드; 및/또는 vi) 하나 이상의 FLRG 폴리펩티드.
E. 길항제 폴리뉴클레오티드
또 다른 양상에서, 본 출원은 ActRII 활성을 길항 (예컨대, Smads 1, 2, 3, 5, 및 8을 통한 ActRII 신호전달의 억제)하는 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리뉴클레오티드들의 조합에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 필요로 하는 환자에서 눈 혈관 질환 [예컨대, 황반 변성 (예컨대, 연령-관련 황반 변성, 소아 황반 변성, 습성 황반 변성, 건성 황반 변성, 스타르가르트병, 및 베스트병), 망막 혈관 폐색 (예컨대, 중심 망막 혈관 폐색, 절반-망막 혈관 폐색, 망막 분지 혈관 폐색, 망막 혈관 폐색 후 황반 부종, 및 허혈성 망막 혈관 폐색), 망막 동맥 폐색 (예컨대, 중심 망막 동맥 폐색, 절반-망막 동맥 폐색, 망막 분지 동맥 폐색, 및 허혈성 망막 동맥 폐색), 당뇨 망막병증, 당뇨성 황반 부종, 허혈성 시신경병증 [예컨대, 전방 허혈성 시신경병증 (동맥염성 및 비-동맥염성) 및 후방 허혈성 시신경병증], 황반 모세혈관확장증 (I형 또는 II형), 망막 허혈 (예컨대, 급성 망막 허혈 또는 만성 망막 허혈), 안구 허혈 증후군, 망막 혈관염, 및 미숙아 망막병증]을 치료 또는 예방; 필요로 하는 눈 혈관 질환 환자에서 시각을 증대 (예컨대, 시력 및/또는 시야 증대); 및/또는 눈 혈관 질환의 하나 이상의 합병증들의 치료 또는 예방하기 위하여 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합을 단독으로 또는 하나 이상의 추가 지지 요법들과 병용하여 사용하는 방법들을 제공한다.
일부 구체예들에서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 GDF11의 활성 및/또는 발현 (예컨대, 전사, 번역, 분비, 또는 이의 조합)을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 GDF8의 활성 및/또는 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 GDF3의 활성 및/또는 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 BMP6의 활성 및/또는 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 BMP9의 활성 및/또는 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 다른 구체예들에서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 BMP9의 활성 및/또는 발현을 억제하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 BMP10의 활성 및/또는 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 다른 구체예들에서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 BMP10의 활성 및/또는 발현을 억제하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및 액티빈 E)의 활성 및/또는 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 액티빈 B의 활성 및/또는 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 액티빈 A의 활성 및/또는 발현을 억제하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 액티빈 B의 활성 및/또는 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있으나, 액티빈 A의 활성 및/또는 발현을 억제하지 않는다.
일부 구체예들에서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 GDF11 및 GDF8의 활성 및/또는 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, GDF11 및/또는 GDF8의 활성 및/또는 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 액티빈 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 및/또는 액티빈 E)의 활성 및/또는 발현을 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 및/또는 액티빈의 활성 및/또는 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 BMP6의 활성 및/또는 발현을 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, 및/또는 BMP6의 활성 및/또는 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 GDF3의 활성 및/또는 발현을 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, 및/또는 GDF3의 활성 및/또는 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 BMP10의 활성 및/또는 발현을 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈, BMP6, GDF3, 및/또는 BMP10의 활성 및/또는 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 BMP9의 활성 및/또는 발현을 추가로 억제한다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, BMP6, GDF3, BMP9, 및/또는 BMP10의 활성 및/또는 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 액티빈 A의 활성 및/또는 발현을 억제하지 않는다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, BMP6, GDF3, 및/또는 BMP10의 활성 및/또는 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 액티빈 A 또는 BMP9의 활성 및/또는 발현을 억제하지 않는다. 일부 구체예들에서, GDF11, GDF8, 액티빈 B, BMP6, 및/또는 GDF3의 활성 및/또는 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들의 조합은 액티빈 A, BMP9, 또는 BMP10의 활성 및/또는 발현을 억제하지 않는다.
일부 구체예들에서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제들의 조합은 ActRII (ActRIIA 및/또는 ActRIIB)의 활성 및/또는 발현 (예컨대, 전사, 번역, 분비, 또는 이의 조합)을 억제한다. 일부 구체예들에서, ActRII의 활성 및/또는 발현을 억제하는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제들의 조합은 리간드들 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP9, GDF11, GDF8, 및 BMP10) 중 하나 이상의 활성 및/또는 발현을 추가로 억제할 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII의 활성 및/또는 발현을 억제하는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 길항제, 또는 폴리뉴클레오티드 길항제들의 조합은 액티빈 A의 활성 및/또는 발현을 억제하지 않는다.
본 명세서의 폴리뉴클레오티드 길항제는 안티센스 핵산, RNAi 분자 [가령, 작은 간섭 RNA (siRNA), 작은-헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA)], 압타머 및/또는 리보자임일 수 있다. 인간 GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP10, ActRIIA, 및 ActRIIB의 핵산 및 아미노산 서열들은 해당 분야에 공지이므로 본 출원의 방법들에 따라 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드 길항제는 해당 분야의 지식 및 본 명세서에 제공된 내용에 기초하여 숙련된 기술자에 의해 통상적으로 제조될 수 있다.
예를 들면, 안티센스 기술은 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 또는 삼중 나선 형성을 통해 유전자 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다. 안티센스 기술은 예를 들면, Okano (1991) J. Neurochem. 56:560; Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)에서 논의된다. 삼중-나선 형성은 예를 들면, Cooney et al. (1988) Science 241:456; 그리고 Dervan et al., (1991) Science 251:1300에서 논의된다. 상기 방법은 상보적 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합에 기초한다. 일부 구체예들에 있어서, 안티센스 핵산은 본원에 개시된 유전자의 RNA 전사체의 적어도 일부에 상보적인 단일 가닥 RNA 또는 DNA 서열을 포함한다. 그러나, 절대적인 상보성이 바람직하지만, 반드시 요구되지는 않는다
본원에서 언급된 "RNA의 적어도 일부에 상보적인" 서열은 RNA와 혼성화되어 안정한 이중나선을 형성할 수 있는 충분한 상보성을 갖는 서열을 의미하고; 본원에 개시된 유전자의 이중 가닥 센스 핵산의 경우, 상기 이중 가닥 DNA의 단일 가닥을 시험할 수 있거나, 삼중체 형성을 검정할 수 있다. 혼성화하는 능력은 상보성의 정도 및 안티센스 핵산의 길이 모두에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 혼성화되는 핵산이 많을수록 RNA와의 염기 미스 매치가 더 많이 포함될 수 있으며, 여전히 안정한 이중나선 (또는 경우에 따라 삼중나선)을 형성할 수 있다. 숙련된 기술자는 혼성화된 복합체의 융점을 결정하기 위하여 표준 절차에 따라 허용가능한 정도의 불일치를 확인할 수 있다.
메시지의 5 '말단, 예를 들어 AUG 개시 코돈까지의 5'-비-번역되는 서열과 상보적인 폴리뉴클레오티드는 번역을 억제하는데 가장 효율적으로 작용해야 한다. 그러나, mRNA의 3'-비-번역 서열에 상보적인 서열은 mRNA의 번역 억제에도 효과적임이 밝혀졌다 [가령, Wagner, R., (1994) Nature 372:333-335]. 따라서, 본 발명의 유전자의 5'- 또는 3'- 비-번역된 비-코딩 영역 중 어느 하나에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 내인성 mRNA의 번역을 억제하기 위한 안티센스 접근법에서 사용될 수 있다. mRNA의 5'-비-번역 영역에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 AUG 개시 코돈의 보완물을 포함해야 한다. mRNA 코딩 영역에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드는 번역에 다소 효과가 적은 억제제이지만, 본 명세서의 방법에 이용될 수 있다. 본 명세서의 mRNA의 5'-비번역, 3'-비번역 또는 코딩 영역들에 혼성화되도록 기획된다면, 안티센스 핵산은 길이가 최소한 6개 뉴클레오티드이어야 하고, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 약 50개 뉴클레오티드가 된다. 특이적 측면에서 상기 올리고뉴클레오티드는 최소한 10개 뉴클레오티드, 최소한 17개 뉴클레오티드, 최소한 25 개뉴클레오티드 또는 최소한 50개 뉴클레오티드이다.
한 구체예에서, 본 명세서의 안티센스 핵산은 외인성 서열로부터 선자에 의해 세포 안에서 생성된다. 예를 들면, 벡터 또는 이의 부분이 전사되어, 본 명세서의 유전자의 안티센스 핵산 (RNA)이 만들어진다. 이러한 벡터는 원하는 안티센스 핵산을 인코드하는 서열을 함유할 것이다. 이러한 벡터 는 목적하는 안티센스 RNA를 생산하도록 전사될 수 있는 한, 에피솜 (episomal)으로 남아있거나 또는 염색체에 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 해당 분야의 표준 재조합 DNA 기술 방법에 의해 작제될 수 있다 벡터는 플라스미드, 바이러스성, 또는 척추동물 세포에서 복제 및 발현에 이용되는 해당 분야에 공지된 다른 것들이 될 수 있다. 본 명세서의 바람직한 유전자를 인코딩하는 서열 또는 이의 단편은 척추동물, 바람직하게는 인간 세포에서 작용하는 것으로 해당 분야에 알려진 임의의 프로모터에 의해 발현될 수 있다. 이러한 프로모터는 유도성 또는 항시성 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 SV40 초기 프로모터 영역 [가령, Benoist and Chambon (1981) Nature 290:304-310], Rous 육종 바이러스의 3' 긴-말단 반복부에 포함된 프로모터 [가령, Yamamoto et al. (1980) Cell 22:787-797], 허피스 티미딘 프로모터 [가령, Wagner et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445], 그리고 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열[가령, Brinster, 외. (1982) Nature 296:39-42]을 포함한다.
일부 구체예들에서, 폴리뉴클레오티드 길항제는 하나 이상의 유전자들의 발현을 표적하는 간섭 RNA 또는 RNAi 분자들이다. RNAi는 표적화된 mRNA의 발현을 방해하는 RNA의 발현을 의미한다. 구체적으로, RNAi는 siRNA(작은 간섭 RNA)를 통해 특정 mRNA와 상호작용하여 표적 유전자를 침묵시킨다. 그런 다음 ds RNA 복합체는 이 세포에 의한 분해의 표적이 된다. siRNA 분자는 길이가 10 내지 50개 뉴클레오티드의 이중-가닥으로 된 RNA 듀플렉스로, 충분히 상보적인(가령, 이 유전자에 최소 80% 동일성) 표적 유전자의 발현을 간섭한다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 siRNA 분자는 이 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대하여 최소한 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가 RNAi 분자는 짧은-헤어핀 RNA (shRNA)을 포함하며; 또한 짧은-간섭 헤어핀 및 마이크로RNA (miRNA)을 포함한다. 상기 shRNA 분자는 루프에 의해 연결된 표적 유전자의 센스 및 안티센스 서열을 함유한다. 상기 shRNA는 핵으로부터 세포질로 운반되며, mRNA와 함께 분해된다. Pol III 또는 U6 프로모터는 RNAi를 위한 RNAs 발현에 이용될 수 있다. Paddison et al. [Genes & Dev. (2002) 16:948-958, 2002]는 RNAi에 영향을 주는 수단으로 헤어핀으로 접힌 작은 RNA 분자를 사용했다. 따라서, 이러한 짧은-헤어핀 RNA (shRNA) 분자는 본 명세서에서 기술된 방법에 또한 유익하게 이용된다. 기능적 shRNA의 줄기와 루프의 길이는 다양하며; 줄기 길이는 약 25 내지 약 30nt 범위일 수 있고, 루프 크기는 침묵 활성에 영향을 미치지 않고, 4 내지 약 25nt 범위일 수 있다. 특정 이론에 구속되기를 바라지는 않지만, 이들 shRNA는 DICER RNase의 이중 가닥으로 된 RNA (dsRNA)와 유사하며, 특정 유전자 발현 억제에 동일한 능력을 갖는다. 상기 shRNA는 렌티바이러스성 벡터로부터 발현될 수 있다. miRNA는 길이가 약 10 내지 70개 뉴클레오타이드의 단일 가닥으로된 RNA이며, "스템 루프 (stem-loop)" 구조를 특징으로 하는 pre-miRNA로 먼저 전사되고, 후속적으로 RISC를 통해 추가 처리후 성숙 miRNA로 처리된다.
siRNA를 포함하나, 이에 제한되지 않는 RNAi를 매개하는 분자는 화학적 합성 (Hohjoh, FEBS Lett 521:195-199, 2002), dsRNA의 가수분해 (Yang 외., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002), T7 RNA 중합효소와 시험관내 전사 (Donzeet 외., 핵산 Res 30:e46, 2002; Yu 외., Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052, 2002), 그리고 뉴클레아제, 이를 테면 대장균(e. coli) RNase III를 이용하여 이중-가닥으로 된 RNA의 가수분해 (Yang 외., Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947, 2002)에 의해 시험관 안에서 만들어질 수 있다.
또다른 측면에 따르면, 본 명세서는 decoy DNA, 이중-가닥으로 된 DNA, 단일-가닥으로 된 DNA, 복합체화된 DNA, 포집화된(encapsulated) DNA, 바이러스성 DNA, 플라스미드 DNA, 네이키드(naked) RNA, 포집화된 RNA, 바이러스성 RNA, 이중-가닥으로 된 RNA, RNA 간섭을 만들 수 있는 분자, 또는 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는 폴리뉴클레오티드 길항제를 제공한다.
일부 구체예들에 있어서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드 길항제는 압타머(aptamers)이다. 압타머는 이중-가닥으로 된 DNA와 단일-가닥으로 된 RNA 분자를 포함하는 핵산 분자로써, 표적 분자, 가령, GDF11, GDF8, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP7, 결절, ActRIIA, 및 ActRIIB 폴리펩티드에 특이적으로 결합하여, 4차 구조를 형성한다. 압타머의 일반적 그리고 치료 용도는 해당 분야에 잘 확립되어 있다. 예컨대, 미국 특허 제 5,475,096 참조. 압타머에 대한 추가 정보는 미국 특허 출원 공개 번호 20060148748에서 찾아볼 수 있다. 핵산 압타머는 해당 분야에 공지 된 방법, 예를 들어, 지수적 농축 (SELEX) 프로세스에 의한 리간드의 체계적 진화 (Systemigen Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 과정을 통해 선택된다. SELEX는 가령, 미국 특허 제 5,475,096; 5,580,737; 5,567,588; 5,707,796; 5,763,177; 6,011,577; 그리고 6,699,843에서 설명된 바와 같이, 표적 분자에 매우 특이적 결합을 하는 핵산 분자의 시험관내 진화를 위한 방법이다. 압타머를 식별하기 위한 또다른 스크리닝 방법은 미국 특허 제 5,270,163에 설명되어 있다. SELEX 과정은 다양한 2-차원 및 3-차원 구조를 형성하기 위한 핵산의 능력 뿐만 아니라, 실제 모든 화합물과 함께 리간드 (특정 결합 쌍을 형성)로 작용하는 뉴클레오티드 단량체 내에서 이용 가능한 화학적 다양성을 기반으로 하는데, 이들 단량체 또는 중합체는 다른 핵산 분자 및 폴리펩티드를 포함할 수도 있고, 포함하지 않을 수도 있다. 임의의 크기 또는 조성의 분자가 표적으로 작용할 수 있다. SELEX 방법은 후보 올리고 뉴클레오타이드의 혼합물로부터의 선택 및 원하는 결합 친화도 및 선택성을 달성하기 위해, 동일한 일반 선택 방안을 사용하여 결합, 분할 및 증폭의 단계적 반복을 포함한다. 무작위화된 서열의 분절을 포함할 수 있는 핵산 혼합물로부터 시작하여, 상기 SELEX 방법은 결합에 우호적인 조건하에 표적에 상기 혼합물을 접촉시키는 단계; 표적 분자에 특이적으로 결합된 핵산으로부터 결합안된 핵산을 분할시키는 단계; 핵산-표적 복합체를 해리시키는 단계; 핵산-표적 복합체로부터 해리된 핵산을 증폭시켜, 핵산의 리간드 농축된 혼합물을 생산하는 단계를 포함한다. 상기 결합, 분할, 해리 및 증폭 단계들은 표적 분자에 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 핵산 리간드를 만들기 위하여 필요한 수의 주기로 반복된다.
전형적으로, 이러한 결합 분자는 동물에 별도 투여되지만 [가령, O'Connor (1991) J. Neurochem. 56:560], 그러나 이러한 결합 분자는 숙주 세포가 취한 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있고, 생체내에서 발현될 수 있다 [가령, Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)].
본 명세서에 개시된 임의의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제들 (예컨대, GDF11, GDF8, GDF3, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, 액티빈 E, BMP6, BMP10, ActRIIA, 및/또는 ActRIIB의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 길항제)은 원하는 효과를 구현하기 위해 [예컨대, 필요로 하는 환자에서 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방, 눈 혈관 질환에 걸린, 필요로 하는 환자에서 시각을 증가 (예컨대, 시력 및/또는 시야를 증가), 및/또는 눈 혈관 질환의 하나 이상의 합병증들을 치료 또는 예방] 하나 이상의 추가 ActRII 길항제 물질들과 조합될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제는 i) 하나 이상의 추가 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제, ii) 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드; iii) 하나 이상의 ActRII 길항제 항체들; iv) 하나 이상의 소분자 ActRII 길항제; v) 하나 이상의 폴리스타틴 폴리펩티드; 및/또는 vi) 하나 이상의 FLRG 폴리펩티드와 조합되어 사용될 수 있다.
F. 폴리스타틴 및 FLRG 길항제
다른 양상들에서, 본 명세서에 개시된 방법들에 따라 사용하기 위한 ActRII 길항제 (억제제)는 폴리스타틴 또는 FLRG 폴리펩티드이며, 이는 필요로 하는 환자에서 눈 혈관 질환 (예컨대, 황반 변성 (예컨대, 연령-관련 황반 변성, 소아 황반 변성, 습성 황반 변성, 건성 황반 변성, 스타르가르트병, 및 베스트병), 망막 혈관 폐색 (예컨대, 중심 망막 혈관 폐색, 절반-망막 혈관 폐색, 망막 분지 혈관 폐색, 망막 혈관 폐색 후 황반 부종, 및 허혈성 망막 혈관 폐색), 망막 동맥 폐색 (예컨대, 중심 망막 동맥 폐색, 절반-망막 동맥 폐색, 망막 분지 동맥 폐색, 및 허혈성 망막 동맥 폐색), 당뇨 망막병증, 당뇨성 황반 부종, 허혈성 시신경병증 [예컨대, 전방 허혈성 시신경병증 (동맥염성 및 비-동맥염성) 및 후방 허혈성 시신경병증], 황반 모세혈관확장증 (I형 또는 II형), 망막 허혈 (예컨대, 급성 망막 허혈 또는 만성 망막 허혈), 안구 허혈 증후군, 망막 혈관염, 및 미숙아 망막병증)을 치료 또는 예방; 필요로 하는 눈 혈관 질환 환자에서 시각을 증대 (예컨대, 시력 및/또는 시야 증대); 및/또는 눈 혈관 질환의 하나 이상의 합병증들의 치료 또는 예방하기 위하여 단독으로 또는 하나 이상의 추가 지지 요법들과 병용하여 사용될 수 있다.
용어 "폴리스타틴 폴리펩티드"는 임의의 자연 발생적 폴리스타틴 폴리펩티드, 뿐만 아니라 유용한 활성을 유지하는 임의의 이의 변이체들 (돌연변이체, 단편, 융합 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드이며, 임의의 기능성 폴리스타틴 단량체 또는 다량체를 더 포함한다. 특히 바람직한 구체예들에서, 본 출원의 폴리스타틴 폴리펩티드는 액티빈, 특히 액티빈 A에 결합하거나 및/또는 이의 활성을 억제한다. 액티빈 결합 성질을 유지하는 폴리스타틴 폴리펩티드 변이체들은 폴리스타틴 및 액티빈 상호작용과 관련된 기존 연구에 근거하여 식별될 수 있다. 예를 들면, WO2008/030367은 액티빈 결합에 중요한 것으로 보이는 특이적 폴리스타틴 도메인 ("FSDs")을 공개한다. 하기 서열 번호: 28-30에 나타낸 바와 같이, 폴리스타틴 N-말단 도메인 ("FSND" 서열 번호:28), FSD2 (서열 번호: 30), 그리고 다소 약한 FSD1 (서열 번호: 29)은 액티빈 결합에 중요한 폴리스타틴 안에 있는 예시적인 도메인을 나타낸다. 또한, 폴리펩티드 라이브러리를 만들고 테스트하는 방법은 ActRII 폴리펩티드 관련 내용에서 설명되며, 이러한 방법들 또한 폴리스타틴의 변이체를 만들고, 테스트하는 방법에 속한다. 폴리스타틴 폴리펩티드는 폴리스타틴 폴리펩티드의 서열에 최소한 약 80% 동일한, 그리고 임의선택적으로 최소한 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 임의 공지의 폴리스타틴 서열로부터 유도된 폴리펩티드를 포함한다. 폴리스타틴 폴리펩티드의 예로는 예를 들면, WO2005/025601에서 설명된 인간 폴리스타틴 전구체 폴리펩티드 (서열 번호: 90)의 성숙 폴리스타틴 폴리펩티드 또는 더 짧은 아이소형 또는 다른 변이체들을 포함한다.
인간 폴리스타틴 전구체 폴리펩티드 아이소형 FST344는 다음과 같다:
Figure pct00016
(서열 번호: 26; NCBI 참조번호. NP_037541.1)
상기 신호 펩티드는 밑줄로 표시되며; 또한 상기 밑줄은 하기에 나타낸 더 짧은 폴리스타틴 아이소형과 이 폴리스타틴 아이소형을 구별시키는 C-말단 연장을 나타내는 마지막 27개 잔기다.
인간 폴리스타틴 전구체 폴리펩티드 아이소형 FST317은 다음과 같다:
1 MVRARHQPGG LCLLLLLLCQ FMEDRSAQAG NCWLRQAKNG RCQVLYKTEL
51 SKEECCSTGR LSTSWTEEDV NDNTLFKWMI FNGGAPNCIP CKETCENVDC
101 GPGKKCRMNK KNKPRCVCAP DCSNITWKGP VCGLDGKTYR NECALLKARC
151 KEQPELEVQY QGRCKKTCRD VFCPGSSTCV VDQTNNAYCV TCNRICPEPA
201 SSEQYLCGND GVTYSSACHL RKATCLLGRS IGLAYEGKCI KAKSCEDIQC
251 TGGKKCLWDF KVGRGRCSLC DELCPDSKSD EPVCASDNAT YASECAMKEA
301 ACSSGVLLEV KHSGSCN (서열 번호: 27; NCBI 참조번호. NP_006341.1)
상기 신호 펩티드는 밑줄로 표시된다.
폴리스타틴 N-말단 도메인 (FSND) 서열은 다음과 같다:
gncwlrqakngrcqvlyktelskeeccstgrlstswteedvndntlfkwmifnggapncipck (서열 번호: 28; FSND)
FSD1 및 FSD2 서열은 다음과 같다:
etcenvdcgpgkkcrmnkknkprcv (서열 번호: 29; FSD1)
ktcrdvfcpgsstcvvdqtnnaycvt (서열 번호: 30; FSD2)
다른 측면들에 있어서, 본 명세서에 개시된 방법들에 따라 사용하기 위한 물질은 폴리스타틴-유사 관련된 유전자(FLRG)이며, 이는 또한 폴리스타틴-관련된 단백질 3 (FSTL3)로도 알려져 있다. 용어 "FLRG 폴리펩티드"는 임의의 자연 발생적 FLRG 폴리펩티드, 뿐만 아니라 유용한 활성을 유지하는 임의의 이의 변이체들 (돌연변이체, 단편, 융합 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드이다. 특정 바람직한 구체예들에 있어서, 본 명세서의 FLRG 폴리펩티드는 액티빈 , 특히 액티빈 A에 결합하고 및/또는 이의 활성을 저해한다. 액티빈 결합 성질을 유지하는 FLRG 폴리펩티드 변이체들은 FLRG 및 액티빈 상호작용을 분석하는데 이용되는 통상적인 방법(가령, US 6,537,966)을 이용하여 식별될 수 있다. 또한, 폴리펩티드 라이브러리를 만들고 테스트하는 방법은 ActRII 폴리펩티드 관련 내용에서 설명되며, 이러한 방법들 또한 FLRG의 변이체를 만들고, 테스트하는 방법에 속한다. FLRG 폴리펩티드는 FLRG 폴리펩티드의 서열에 최소한 약 80% 동일한, 그리고 임의선택적으로 최소한 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 임의 공지의 FLRG 서열로부터 유도된 폴리펩티드를 포함한다.
인간 FLRG 전구체 (폴리스타틴-관련된 단백질 3 전구체) 폴리펩티드는 다음과 같다:
1 mrpgapgplw plpwgalawa vgfvssmgsg npapggvcwl qqgqeatcsl
51 vlqtdvtrae ccasgnidta wsnlthpgnk inllgflglv hclpckdscd
101 gvecgpgkac rmlggrprce capdcsglpa rlqvcgsdga tyrdecelra
151 arcrghpdls vmyrgrcrks cehvvcprpq scvvdqtgsa hcvvcraapc
201 pvpsspgqel cgnnnvtyis schmrqatcf lgrsigvrha gscagtpeep
251 pggesaeeee nfv (서열 번호: 31; NCBI 참조번호. NP_005851.1)
상기 신호 펩티드는 밑줄로 표시된다.
특정 구체예들에 있어서, 폴리스타틴 폴리펩티드와 FLRG 폴리펩티드의 기능성 변이체 또는 변형된 형태는 폴리스타틴 폴리펩티드의 최소한 일부분 또는 FLRG 폴리펩티드와 하나 또는 그 이상의 융합 도메인, 이를 테면, 예를 들면, 폴리펩티드의 단리, 탐지, 안정화 또는 다량체화를 용이하게 하는 도메인을 갖는 융합 단백질을 포함한다. 적합한 융합 도메인은 ActRII 폴리펩티드와 관련하여 상기에서 상세하게 논의된다. 일부 구체예에서, 본 명세서의 길항제 물질은 Fc 도메인에 융합된 폴리스타틴 폴리펩티드의 액티빈-결합 부분이 포함된 융합 단백질이다. 또다른 구체예에서, 본 명세서의 길항제 물질은 Fc 도메인에 융합된 FLRG 폴리펩티드의 액티빈-결합 부분이 포함된 융합 단백질이다.
본 명세서에 개시된 임의의 폴리스타틴 폴리펩티드는 원하는 효과 (예컨대, 필요로 하는 환자에서 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방, 눈 혈관 질환에 걸린, 필요로 하는 환자에서 시각을 증가, 및/또는 눈 혈관 질환의 하나 이상의 합병증들을 치료 또는 예방)를 구현하기 위해 본 출원의 하나 이상의 추가 ActRII 길항제 물질과 조합될 수 있다. 예를 들면, 폴리스타틴 폴리펩티드는 i) 하나 이상의 추가 폴리스타틴 폴리펩티드, ii) 본 명세서에 개시된 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드; iii) 하나 이상의 ActRII 길항제 항체들; iv) 하나 이상의 소분자 ActRII 길항제; v) 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제; 및/또는 vi) 하나 이상의 FLRG 폴리펩티드와 조합되어 사용될 수 있다.
유사하게, 본 명세서에 개시된 임의의 FLRG 폴리펩티드는 원하는 효과 (예컨대, 필요로 하는 환자에서 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방, 눈 혈관 질환에 걸린, 필요로 하는 환자에서 시각을 증가, 및/또는 눈 혈관 질환의 하나 이상의 합병증들을 치료 또는 예방)를 구현하기 위해 본 출원의 하나 이상의 추가 ActRII 길항제 물질과 조합될 수 있다. 예를 들면, FLRG 폴리펩티드는 i) 하나 이상의 추가 FLRG 폴리펩티드, ii) 본 명세서에 개시된 하나 이상의 ActRII 폴리펩티드; iii) 하나 이상의 ActRII 길항제 항체들; iv) 하나 이상의 소분자 ActRII 길항제; v) 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 ActRII 길항제; 및/또는 vi) 하나 이상의폴리스타틴 폴리펩티드와 조합되어 사용될 수 있다.
3. 스크리닝 분석
특정 양상들에서, 본 출원은 ActRII 폴리펩티드의 작용제 또는 길항제인 화합물들 (물질들)을 식별하기 위한 대상체 ActRII 폴리펩티드 (예컨대, ActRIIA 및 ActRIIB 폴리펩티드 및 이의 변이체들) 의 사용에 관한 것이다. 이러한 스크리닝을 통해 식별된 화합물들은, 예를 들면, 동물 모델에서, 시력 개선 능력을 평가하기 위해 테스트될 수 있다.
ActRII 신호전달 (예컨대, Smad 1, 2, 3, 5, 및 8을 통한 ActRII 신호전달)을 표적함으로써 시각을 개선 (예컨대, 시력 및/또는 시야 증가)시키기 위한 치료제를 스크리닝하기 위한 수많은 접근법들이 존재한다. 특정 구체예들에 있어서, 선택된 세포주에서 ActRII-매개된 효과를 교란시키는 물질을 식별하기 위해 화합물의 고효율 스크리닝이 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 이러한 분석법은 ActRII 폴리펩티드의 그 결합 파트너, 가령, ActRII 리간드 (예컨대, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, 액티빈 C, GDF8, GDF11 또는 BMP10)에 대한 결합을 특이적으로 억제 또는 감소시키는 화합물들을 선별 및 식별하기 위하여 수행된다. 대안으로, 상기 분석은 ActRII 폴리펩티드가 이의 결합 파트너, 가령, ActRII 리간드에 대한 결합을 향상시키는 화합물을 식별하는데 사용될 수 있다. 추가 구체예에서, 상기 화합물은 ActRII 폴리펩티드와 상호 작용하는 능력에 의해 식별될 수 있다.
다양한 분석 포맷이 충분할 것이며, 본원 명세서에 비추어, 본 명세서에 명백하게 기술되지 않은 것들은 그럼에도 불구하고 숙련된 기술자에 의해 이해될 것이다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 테스트 화합물 (물질)은 임의의 조합적 화학 방법에 의해 생성 될 수 있다. 대안으로, 본 화합물은 생체내 또는 시험관내에서 합성된 자연 발생 생체 분자일 수 있다. 조직 성장의 조절자로서 작용하는 능력에 대하여 테스트되는 화합물 (물질)은 예를 들어, 박테리아, 효모, 식물 또는 다른 유기체 (예 : 천연 생성물)에 의해 생성될 수 있고, 화학적으로 만들어질 수 있거나 (예 펩티도모방체를 포함하는 소분자), 또는 재조합 적으로 생산 될 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 테스트 화합물은 비-펩티딜 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티이드 모방체, 당, 호르몬 및 핵산 분자를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 테스트 물질은 분자량이 약 2,000 달톤 미만인 작은 유기 분자이다.
본 명세서의 테스트 화합물은 단일의 별개 엔터티로 제공되거나, 또는 조합 화학에 의해 만들어진, 더 큰 복합체 라이브러리로 제공될 수 있다. 이들 라이브러리는 예를 들어, 알코올, 알킬 할로겐화물, 아민, 아미드, 에스테르, 알데히드, 에테르 및 다른 부류의 유기 화합물을 포함 할 수 있다. 테스트 화합물을 테스트 시스템에 제시하는 것은 분리된 형태 또는 화합물의 혼합물로서, 특히 초기 스크리닝 단계에서 제시할 수 있다. 임의선택적으로, 상기 화합물은 임의로 다른 화합물로 유도체화 될 수 있고, 이 화합물의 단리를 용이하게 하는 유도체화 기를 가질 수 있다. 유도체화기의 비-제한적인 예는 바이오틴, 플루오레세인, 디옥시게닌, 녹색 형광 단백질, 동위 원소, 폴리히스티딘, 자성 비드, 글루타티온 S-전이효소(GST), 광활성 가교제 또는 이들의 임의 조합물을 포함한다.
화합물 및 천연 추출물의 라이브러리를 테스트하는 많은 약물-스크리닝 프로그램에서, 주어진 시간 동안 조사되는 화합물의 수를 최대화하기 위해서는 고-처리량 분석이 바람직하다. 정제되거나 반-정제된 단백질로 유도될 수 있는 것과 같이, 세포가 없는 시스템에서 수행되는 분석은 테스트 화합물에 의해 중재되는 분자 표적의 신속한 개발 및 변경의 상대적으로 용이한 탐지를 가능하게 하기 위해 생성 될 수 있다는 점에서 종종 "1 차" 스크린으로 선호된다. 더욱이, 테스트 화합물의 세포 독성 또는 생물이용성의 효과는 시험관 시스템에서 일반적으로 무시될 수 있지만, 대신 이 분석은 ActRII 폴리펩티드와 이의 결합 파트너 간의 결합 친화력을 변경시켜 구현될 수 있는, 분자 표적 상에서의 약물의 효과에 주로 집중한다.
단지 설명하기 위해, 본 발명의 예시적인 스크리닝 분석에서, 목적 화합물은 분석 의도에 적합하다면, ActRIIB 리간드에 통상적으로 결합 할 수 있는, 분리 및 정제된 ActRIIB 폴리펩티드에 접촉시킨다. 그 후 상기 화합물 및 ActRIIB 폴리펩티드의 혼합물을 ActRIIB 리간드 (예컨대, GDF11)를 함유하는 조성물에 추가한다. ActRIIB/ActRIIB-리간드 복합체의 탐지 및 정량화는 ActRIIB 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 사이에 복합체 형성을 억제(또는 강화)하는데 있어서 이 화합물의 효과를 측정하는 수단을 제공한다. 화합물의 효능은 다양한 농도의 테스트 화합물을 사용하여 얻은 데이터로부터 용량-반응 곡선을 생성함으로써 평가할 수 있다. 더욱이, 대조 분석을 수행하여 비교를 위한 기준을 제공할 수도 있다. 예를 들면, 대조군 분석에서, 단리 및 정제된 ActRIIB 리간드가 ActRIIB 폴리펩티드를 함유하는 조성물에 첨가되고, ActRIIB/ActRIIB 리간드 복합체의 형성은 테스트 화합물의 부재하에 정량화된다. 일반적으로, 반응물이 혼합되는 순서는 다양할 수 있고, 동시에 혼합될 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, 정제된 단백질 대신, 세포성 추출물과 용해물을 이용하여 적합한 무-세포 분석 시스템을 제공한다.
ActRII 폴리펩티드와 그 결합 단백질 간의 복합체 형성은 다양한 기술들에 의해 탐지될 수 있다. 예를 들면, 복합체 형성의 조절은 예를 들면, 탐지가능하도록 라벨된 단백질 이를 테면 방사능라벨된 (가령, 32P, 35S, 14C 또는 3H), 형광으로 라벨된 (가령, FITC), 또는 효소적으로 라벨된 ActRII 폴리펩티드 및/또는 이의 결합 단백질을 이용하거나, 면역분석에 의해, 또는 크로마토그래피 탐지에 의해 정량화될 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서는 ActRII 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 간에 상호작용을 직접적으로, 또는 간접적으로 측정함에 있어서, 형광 편광 분석 및 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 분석의 이용을 고려한다. 더욱이, 다른 방식의 탐지, 이를 테면 광학 도파관(waveguides) (PCT 공개출원 WO 96/26432 및 미국 특허 제 5,677,196 참조), 표면 플라스몬 공명 (SPR), 표면 전하 센서, 및 표면력 센서등은 본 명세서의 많은 구체예에서 상용가능하다.
더욱이, 본 명세서는 ActRII 폴리펩티드와 이의 결합 짝 사이의 상호작용을 파괴 또는 강화시키는 물질들을 식별하기 위한 "2-하이브리드 분석"으로 알려진 상호작용 트랩 분석의 사용을 고려한다. 예컨대, 미국 특허 제 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel 외. (1993) Biotechniques 14:920-924; 및 Iwabuchi 외. (1993) Oncogene 8:1693-1696) 참조. 특정 구체예에서, 본 명세서는 ActRII 폴리펩티드 또는 GDF 트랩과 이의 결합 단백질 간의 상호작용을 해리시키는 화합물 (가령, 소분자 또는 펩티드)를 식별하기 위한 역 2-하이브리드 시스템의 사용을 고려한다 [예컨대, Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; 및 미국 특허 5,525,490; 5,955,280; 그리고 5,965,368 참고].
특정 구체예들에 있어서, 상기 대상 화합물은 본 명세서의 ActRII 폴리펩티드와 상호작용하는 능력에 의해 식별된다. 상기 화합물과 ActRII 폴리펩티드 간의 상호작용은 공유 또는 비-공유적일 수 있다. 예를 들면, 광-가교, 방사능라벨된 리간드 결합, 및 친화력 크로마토그래피가 포함된 시험관내 생화학적 방법을 이용하여 단백질 수준에서 이러한 상호작용이 식별될 수 있다. [예컨대, Jakoby WB 외. (1974) Methods in Enzymology 46:1 참조]. 특정 경우에서, 상기 화합물은 기전-기반의 분석, 가령, ActRII 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 탐지하는 분석에서 스크리닝될 수 있다. 이 분석은 고형-상 또는 유체-상 결합의 경우를 포함할 수 있다. 대안으로, ActRII 폴리펩티드를 인코드하는 유전자는 리포터 시스템 (가령, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 또는 녹색 형광 단백질)과 함께 세포 안으로 형질감염되고, 라이브러리, 바람직하게는 고처리량 스크리닝 또는 이 라이브러리의 개별 구성요소들에 대하여 스크리닝될 수 있다. 다른 기전-기반의 결합 분석이 이용될 수 있는데, 예를 들면, 자유 에너지의 변화를 탐지하는 결합 분석이 이용될 수 있다. 결합 분석은 웰, 비드 또는 칩에 고정된 표적으로 또는 고정된 항체에 의해 포집된 표적 또는 모세관 전기영동에 의해 해리되는 표적으로 실행될 수 있다. 상기 결합된 화합물은 발색 종점 또는 형광 또는 표면 플라스몬 공명을 이용하여 탐지될 수 있다.
4. 예시적인 치료 용도
본 명세서에 기재된 바와 같이, 출원인은 ActRII 길항제 (억제제)가 MDS 환자의 시각을 개선시키는 놀라운 효과를 가짐을 발견하였다. 더욱이, MDS-관련 시각 소실에 관하여 보고된 메커니즘 [Han 외. (2015) J Glaucoma (인쇄 전 전자 간행물); Brouzas 외. (2009) Clinical Ophthalmology 3:133-137]을 보면, 본 출원의 데이터들은, ActRII 억제제가 또한 다른 유형의 눈 (안구) 질환들, 특히, 예를 들어, 허혈 및/또는 혈관 기능부전과 관련된 질환들을 비롯한 혈관 안구 질환들의 치료 또는 예방에서 긍정적인 효과를 나타낼 수 있음을 제시한다.
눈의 구조적 및 기능적 통합성은 규칙적인 산소 및 영양소 공급에 따라 달라진다. 가장 대사적으로 활성인 조직들 중 하나인, 망막은 신체의 다른 조직들보다 더 급속하게 산소를 소모한다 [Cohen 외. (1965) Biochemistry of the Retina. Orlando, Fla: Academic Press Inc; pp. 36―50; Anderson 외. (1964) Arch Ophthalmol 72:792―795; 및 Ames A. (1992) Can J Physiol Pharmacol. 70(Suppl):S158―64]. 이중 순환계의 존재는 망막 산소공급을 독특하게 한다 [Osborne 외. (2004) Prog Retin Eye Res. 23:91―147]. 보다 큰 외부 얼기층 부위 및 광수용체들은 맥락막모세혈관층으로부터 간접적으로 영양분을 제공받는 반면에 내부 망막층에는 망막의 중심 동맥의 가지에 의해 형성되는 표재 및 심부의 모세혈관 얼기들에 의해 공급된다. 망막 내부층은 저산소증에 대해 가장 높은 민감도를 보이는 반면 [Janㅱky 외. (2007) Doc Ophthalmol. 114:45―51], 외부 망막은 저산소증 스트레스에 대해 내성이 더 우수한 것으로 공지되어 있다[Tinjust 외. (2002) Aviat Space Environ Med. 73:1189―94].
수많은 전신 및 세포상의 반응들, 가령, 당분해작용, 혈관형성, 혈관확장, 및 적혈구생성은 유기체로 하여금 저산소증에 반응할 수 있게 한다 [Harris 외. (2002) Nat Rev Cancer. 2:38―47]. 많은 조직들은 저산소증-허혈성 병태하에서 보호 메커니즘들을 유도할 수 있으며, 이러한 메커니즘들은 전형적으로 발병 수분 이내에 유도되고 손상을 제한함에 매우 중요하다 [Kitagawa 외. (1990) Brain Res. 528:21―4]. 그러나, 장기화된 저산소증 병태 중에는, 이러한 보호 메커니즘들은 일반적으로 저산소증-허혈성 발작 수 시간 내에 감소되거나 소실되어, 세포 사멸 및 조직 손상을 초래한다 [Prass 외. (2003) Stroke. 34:1981―6]. 전사 활성화제 저산소증을-유도하는 인자-1α (HIF-1α)는 세포 O2 항상성의 주된 조절인자이다 [Iyer 외. (1998) Genes Dev. 12:149―62]. 저산소증이 많은 조직들에서 HIF-1α 및 이의 표적 유전자, 가령, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 산화 질소 합성효소 (NOS)를 유도함은 공지이다. 흥미롭게도, 가령, 장기화된 저산소증 동안 이러한 인자들의 과다생성은 저산소증-허혈성 병태에서 세포 사멸의 원인이 되었다. 또한, 장기화된 저산소증 동안 발생하는 글루타메이트 및 염증성 사이토카인들의 세포외 축적 증대는 세포 및 조직들을 손상시킬 수 있다. 저산소증 부상 후 망막에서 HIF-1α, VEGF, 및 다양한 아이소형의 NOS의 발현 증가가 보고되었다 [Kaur 외.(2006) Invest Ophthalmol Vis Sci. 47:1126―41; 및 Tezel 외. (2004) Curr Opin Ophthalmol. 15:80―4].
망막 신경절 세포들 (RGCs)은 급성이고, 일과성이며, 경미한 전신 저산소증 스트레스에 특히 민감성이다 [Kergoat 외. (2006) Invest Ophthalmol Vis Sci. 47:5423―7]. RGCs의 소실은 많은 안구 병태들, 가령, 녹내장 및 당뇨병 (Sucher 외. (1997) Vision Res. 37:3483―93; Abu-El-Asrar 외. (2004) Invest Ophthalmol Vis Sci. 45:2760―6], 이러한 소실의 원인이 되는 저산소증에서 발생한다 [Wax 외. (2002) Mol Neurobiol. 26:45―55; Tezel 외. (2001). Curr Opin Ophthalmol. 15:80―4; 및 Chen 외. (2007) Stem Cells. 25:2291―301]. 산소 및 기질 부족에 의해 유발된 망막 저산소증-허혈로부터 생성되는 신경세포 퇴행은 부분적으로는, 유리 산소 라디칼의 축적 [Block 외. (1997) Exp Eye Res. 64:559―64; Muller 외. (1997) Exp Eye Res. 64:637―43; 및 Szabo 외. (1997) Clin Neurosci. 4:240―5], 글루타메이트 흥분독성 [Kuroiwa T외. (1985) Acta Neuropathol (Berl) 68:122―9; Osborne 외. (2004) Prog Retin Eye Res. 23:91―147; 및 Kaur 외. (2006) Invest Ophthalmol Vis Sci. 47:1126―41], 염증, 및 혈액 망막 장벽의 파괴 [Kuroiwa 외. (1985) Acta Neuropathol (Berl) 68:122―9; 및 Kaur 외. (2007) J Pathol. 212:429―39]에 의해 매개된다.
저산소증-허혈은 또한 세포외 공간들 (혈관성 부종) 또는 세포내 공간들 (세포독성 부종)에서의 체액 축적과 연관되는 망막 혈관 손상을 가져온다 [Marmor 외. (1999) Doc Ophthalmol. 97:239―49]. 내부 망막의 세포외 공간들은 빽빽하게 채워진 세포 성분들 사이의 좁은 틈들을 구성한다. 내부 망막의 손상된 모세혈관들로부터 누출되는 체액은 세포외 공간들에 축적되어, 망막 세포 성분들을 대체하고 정상적인 신경세포 연결들의 해부학을 파괴하여, 황반 부종을 가져온다 [Hamann 외. (2005) Acta Ophthalmol Scand. 83:523―5]. 황반 부종은 또한 악화시키다 망막 허혈을 악화시키고 뿐만 아니라 산화적 스트레스 및 염증의 증가를 촉진시킬 수 있다 (Guex-Crosier Y. (1999) Doc Ophthalmol. 97:297―309; van Dam PS. (2002) Diabetes Metab Res Rev. 18:176―84; 및 Miyake 외. (2002) Surv Ophthalmol. 47:S203―8.). 체액 축적을 가져오는 혈액-망막 장벽 (BRB)의 투과성 증가는 압박에 의한 망막 신경세포 퇴행의 원인이 되는 것으로 보고되었다 [Antcliff 외. (1999) Semin Ophthalmol. 14:223―32; Marumo T 외. (1999) J Vasc Res. 36:510―15; 및 Reichenbach 외. (2007) Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245:627―36). 저산소증-허혈성 발작 중 초기에 보호적인 과다한 및/또는 만성 VEGF, 산화 질소 (NO), 및 아쿠아포린-4 생성은 내부 망막의 BRB 기능이상 및 혈관신생을 유발하여, 망막 조직 내부로의 혈청 누출 및 망막 부종을 가져올 수 있다. 혈관 투과성 증가 이외에도, 안구 저산소증은 또한 내피세포 사멸, 혈관들의 백혈구 막힘, 및 미세동맥류와도 상관관계가 있다 [Linsenmeier 외. (1998) Invest Ophthalmol Vis Sci. 39:1647―57].
저산소증-허혈은, 예를 들면, 망막 동맥/혈관 폐색 또는 혈전증, 안구 허혈 증후군, 허혈성 시신경병증, 및 망막 허혈을 비롯한 다양한 안구 병태들에서 발생한다. 저산소증-허혈은 또한 녹내장 발병과도 연관되어 왔으며 [Flammer J. (1994) 'Surv Ophthalmol. 38(Suppl):S3―6; Chung 외. (1999) Surv Ophthalmol. 43(Suppl 1):S43―50; 및 Tezel 외. (2004) Curr Opin Ophthalmol. 15:80―4], 망막 및 시신경 유두 혈관신생을 비롯하여 실명을 일으킬 수 있는 많은 당뇨성 눈 질병의 합병증들의 기저를 이루는 것으로 생각되며 [Linsenmeier 외. (1998) Invest Ophthalmol Vis Sci. 39:1647―57], 연령-관련 황반 변성에도 어느 정도 역할을 할 수 있다 [Tso 외. (1982) Ophthalmology. 89:902―15; Yanoff 외. (1984) Surv Ophthalmol. 28 (Suppl):505―11; 및 Bressler 외. (2001) In: Schachat AP, editor. Retina. St. Louis, MO: Mosby]. 안구 저산소증의 전신적 원인들에는 심장혈관 효과, 만성 폐쇄성 기도 질환, 동맥/정맥 폐쇄성 병태들 [Brown 외. (1988) Int Ophthalmol. 11:239―51] Takayasu's 동맥염 [Shelhamer 외. (1985) Ann Intern Med. 103:121―6], 과다점성 증후군 [Ashton 외. (1963) J Pathol Bacteriol. 86:453―61] 뿐만 아니라 외상 (예컨대, 수술 또는 사고 손상) [푸르쳐 망막병증; Buckley 외. (1996) Postgrad Med J. 72:409―12]이 포함된다. 상기 병태들과 연관된 저산소증은 시각 장애 및 실명의 공통 원인이다 [Osborne, 외. (2004) Prog Retin Eye Res. 23:91―147].
그러므로, 특정 양상들에서, 본 출원은 치료적 유효량의 ActRII 길항제 (억제제), 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 필요로 하는 환자에게 투여함으로써, 환자 (대상체) (특히, 포유동물, 가령, 설치류, 고양이, 개, 영장류 및 인간)의 눈 혈관 질환 (질병)을 치료 또는 예방하기위한 방법들 및 조성물을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 허혈과 관련된 눈의 혈관 질환들을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 허혈성 눈 질병을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 미세혈관 기능부전과 관련된 눈의 혈관 질환들을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 안구 미세혈관 기능부전 질병을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 망막병증과 관련된 눈의 혈관 질환들을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 시신경병증과 관련된 눈의 혈관 질환들을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 허혈성 망막병증을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 시신경병증을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 미세혈관 기능부전과 연관된 망막병증을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 미세혈관 기능부전과 연관된 시신경병증을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 특히, 본 출원은 다음에서 선택된 하나 이상의 질병들을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다: 황반 변성 (예컨대, 연령-관련 황반 변성, 소아 황반 변성, 습성 황반 변성, 건성 황반 변성, 스타르가르트병, 및 베스트병), 망막 혈관 폐색 (예컨대, 중심 망막 혈관 폐색, 절반-망막 혈관 폐색, 망막 분지 혈관 폐색, 및 허혈성 망막 혈관 폐색), 망막 동맥 폐색 (예컨대, 중심 망막 동맥 폐색, 절반-망막 동맥 폐색, 망막 분지 동맥 폐색, 및 허혈성 망막 동맥 폐색), 당뇨 망막병증, 허혈성 시신경병증 [예컨대, 전방 허혈성 시신경병증 (동맥염성 및 비-동맥염성) 및 후방 허혈성 시신경병증], 황반 모세혈관확장증 (I형 또는 II형), 망막 허혈 (예컨대, 급성 망막 허혈 또는 만성 망막 허혈), 안구 허혈 증후군, 망막 혈관염, 및 미숙아 망막병증. 일부 구체예들에서, 본 명세서에 개시된 안구 질병 치료를 위한 방법 및 조성물들은 환자 눈의 시각을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에 개시된 안구 질병 치료를 위한 방법 및 조성물들은 환자 눈의 시력을 증가시킨다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에 개시된 안구 질병 치료를 위한 방법 및 조성물들은 환자 눈의 시야를 증가시킨다. 선택적으로, 눈 혈관 질환을 치료 또는 예방하기 위한 본 출원의 방법들은 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물의 투여 이외에도 상기 질환의 치료 또는 예방을 위한 하나 이상의 지지 요법들 [예컨대, 수술, 레이저 요법 (예컨대, 광응고), 항-혈관신생 요법 [예컨대, VEGF 억제제들, 가령, 베바시주맙 (Avastin®), 라니비주맙 (Lucentis®), 및 아플리버셉트 (Eylea®)], Ca2+ 억제제s (예컨대, 플루나르진 및 니페디핀), 냉동요법, 고압 산소공급, Na+ 채널 차단제 (예컨대, 토피라메이트), iGluR 길항제 (예컨대, MK-801, 덱스트로메토르판, 엘리프로딜, 및 플루피르틴), 항산화제 (예컨대, 다이메틸티오우레아, 비타민 E, 알파-리포산, 초과산화물 불균등화효소, 카탈라아제, 데스페리옥사민, 만니톨, 알로퓨리놀, 칼슘 도베실레이트, 플루피르틴, 트라이메타지딘, 및 EGB-761), 항염증제, 섬모체투열법, 섬모체냉동요법, 안구 필터링 과정, 배액 밸브 이식, 항혈소판제 요법 (예컨대, 아스피린, 티클로피딘, 및 클로피도그렐), 항응고제 요법 (예컨대, 와파린 및 헤파린), 스테로이드제, 전신 또는 국소 코르티코스테로이드제 (예컨대, 프레드니손 트라이암시놀론 (Triesence®), 및 덱사메타손 (Ozurdex®), 스테로이드-보존 면역억제제 (예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 마이코페놀레이트, 모페틸, 인플릭시맙 및 에타네르셉트), 식이 보충제 (예컨대, 비타민 C, 비타민 E, 루테인, 제악산틴, 아연, 염산, 비타민 B6, 비타민 B12, 및 제악산틴), 유리체절제, 공막돌륭술, 및 기체망막유착술]의 투여를 추가로 포함할 수 있다.
특정 양상들에서, 본 출원은 치료적 유효량의 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 환자에게 투여함으로써 다음 중 하나 이상을 가지는 환자의 눈 혈관 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법 뿐만 아니라 조성물들을 제공한다: 빈혈, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 헤모글로빈혈증, 지중해빈혈, 및 겸상 세포 질병. 일부 구체예들에서, 본 출원은 다음 중 하나 이상을 가지는 환자의 안구 허혈과 연관된 눈 혈관 질환들을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다: 빈혈, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 헤모글로빈혈증, 지중해빈혈, 및 겸상 세포 질병. 일부 구체예들에서, 본 출원은 다음 중 하나 이상을 가지는 환자의 허혈성 안구 질병을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다: 빈혈, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 헤모글로빈혈증, 지중해빈혈, 및 겸상 세포 질병. 일부 구체예들에서, 본 출원은 다음 중 하나 이상을 가지는 환자의 미세혈관 기능부전과 연관된 눈 혈관 질환들을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다: 빈혈, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 헤모글로빈혈증, 지중해빈혈, 및 겸상 세포 질병. 일부 구체예들에서, 본 출원은 다음 중 하나 이상을 가지는 환자의 안구 미세혈관 기능부전 질병을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다: 빈혈, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 헤모글로빈혈증, 지중해빈혈, 및 겸상 세포 질병. 일부 구체예들에서, 본 출원은 다음 중 하나 이상을 가지는 환자의 망막병증과 연관된 눈 혈관 질환들을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다: 빈혈, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 헤모글로빈혈증, 지중해빈혈, 및 겸상 세포 질병. 일부 구체예들에서, 본 출원은 다음 중 하나 이상을 가지는 환자의 시신경병증과 연관된 눈 혈관 질환들을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다: 빈혈, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 헤모글로빈혈증, 지중해빈혈, 및 겸상 세포 질병. 일부 구체예들에서, 본 출원은 다음 중 하나 이상을 가지는 환자의 허혈성 망막병증을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다: 빈혈, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 헤모글로빈혈증, 지중해빈혈, 및 겸상 세포 질병. 일부 구체예들에서, 본 출원은 다음 중 하나 이상을 가지는 환자의 허혈성 시신경병증을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다: 빈혈, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 헤모글로빈혈증, 지중해빈혈, 및 겸상 세포 질병. 일부 구체예들에서, 본 출원은 다음 중 하나 이상을 가지는 환자의 미세혈관 기능부전과 연관된 망막병증을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다: 빈혈, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 헤모글로빈혈증, 지중해빈혈, 및 겸상 세포 질병. 일부 구체예들에서, 본 출원은 다음 중 하나 이상을 가지는 환자의 미세혈관 기능부전과 연관된 시신경병증을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다: 빈혈, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 헤모글로빈혈증, 지중해빈혈, 및 겸상 세포 질병. 일부 구체예들에서, 다음 중 하나 이상을 가지는 환자의 안구 질병을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물들은 환자 눈의 시각을 개선시킨다: 빈혈, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 헤모글로빈혈증, 지중해빈혈, 및 겸상 세포 질병. 일부 구체예들에서, 다음 중 하나 이상을 가지는 환자의 눈 혈관 질환을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물들은 환자 눈의 시력을 증가시킨다: 빈혈, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 헤모글로빈혈증, 지중해빈혈, 및 겸상 세포 질병. 일부 구체예들에서, 다음 중 하나 이상을 가지는 환자의 눈 혈관 질환을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물들은 환자 눈의 시야를 증가시킨다: 빈혈, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 헤모글로빈혈증, 지중해빈혈, 및 겸상 세포 질병. 선택적으로, 다음 중 하나 이상을 가지는 환자의 안구 질병을 치료 또는 예방하기 위한 본 출원의 방법들은 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물의 투여 이외에도 눈 혈관 질환을 치료 또는 예방하기 위한 하나 이상의 지지 요법들의 투여를 추가로 포함할 수 있다: 빈혈, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 헤모글로빈혈증, 지중해빈혈, 및 겸상 세포 질병.
특정 양상들에서, 본 출원은 치료적 유효량의 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 환자에게 투여함으로써 골수형성이상 증후군을 가지는 환자 (대상체) (특히, 포유동물, 가령, 설치류, 고양이, 개, 영장류 및 인간)의 눈 혈관 질환을 치료 또는 예방하는 방법 및 조성물들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 골수형성이상 증후군을 가지는 환자의 안구 허혈과 관련된 눈 혈관 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 골수형성이상 증후군을 가지는 환자의 허혈성 안구 질병을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 골수형성이상 증후군을 가지는 환자의 미세혈관 기능부전과 관련된 눈 혈관 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 골수형성이상 증후군을 가지는 환자의 안구 미세혈관 기능부전 질병을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 골수형성이상 증후군을 가지는 환자의 망막병증과 관련된 눈 혈관 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 골수형성이상 증후군을 가지는 환자의 시신경병증과 관련된 눈 혈관 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 골수형성이상 증후군을 가지는 환자의 허혈성 망막병증을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 골수형성이상 증후군을 가지는 환자의 허혈성 시신경병증을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 골수형성이상 증후군을 가지는 환자의 미세혈관 기능부전과 연관된 망막병증을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 골수형성이상 증후군을 가지는 환자의 미세혈관 기능부전과 연관된 시신경병증을 치료 또는 예방하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 골수형성이상 증후군을 가지는 환자의 눈 혈관 질환을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물들은 환자 눈의 시각을 개선시킨다. 일부 구체예들에서, 골수형성이상 증후군을 가지는 환자의 눈 혈관 질환을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물들은 환자 눈의 시력을 증가시킨다. 일부 구체예들에서, 골수형성이상 증후군을 가지는 환자의 눈 혈관 질환을 치료하기 위한 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물들은 환자 눈의 시야를 증가시킨다. 선택적으로, 골수형성이상 증후군 환자의 눈 혈관 질환을 치료 또는 예방하는 본 출원의 방법들은 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물의 투여 이외에도 안구 질병을 치료 또는 예방하기 위한 하나 이상의 지지 요법들의 투여를 추가로 포함할 수 있다.
특정 양상들에서, 본 출원은 환자에게 치료적 유효량의 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 투여함으로써 필요로 하는 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키는 방법 및 조성물들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 눈 혈관 질환 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 허혈성 안구 질병과 연관된 눈 혈관 질환 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 미세혈관 기능부전과 연관된 눈 혈관 질환 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 안구 미세혈관 기능부전 질병 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 망막병증과 연관된 눈 혈관 질환 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 시신경병증과 연관된 눈 혈관 질환 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 허혈성 망막병증 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 허혈성 시신경병증 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 미세혈관 기능부전과 연관된 망막병증 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 미세혈관 기능부전과 연관된 시신경병증 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 특히, 본 출원은 다음에서 선택된 하나 이상의 질병들을 가진 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)하기 위해, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다: 황반 변성 (예컨대, 연령-관련 황반 변성, 소아 황반 변성, 습성 황반 변성, 건성 황반 변성, 스타르가르트병, 및 베스트병), 망막 혈관 폐색 (예컨대, 중심 망막 혈관 폐색, 절반-망막 혈관 폐색, 망막 분지 혈관 폐색, 및 허혈성 망막 혈관 폐색), 망막 동맥 폐색 (예컨대, 중심 망막 동맥 폐색, 절반-망막 동맥 폐색, 망막 분지 동맥 폐색, 및 허혈성 망막 동맥 폐색), 당뇨 망막병증, 허혈성 시신경병증 [예컨대, 전방 허혈성 시신경병증 (동맥염성 및 비-동맥염성) 및 후방 허혈성 시신경병증], 황반 모세혈관확장증 (I형 또는 II형), 망막 허혈 (예컨대, 급성 망막 허혈 또는 만성 망막 허혈), 안구 허혈 증후군, 망막 혈관염, 및 미숙아 망막병증. 일부 구체예들에서, 본 출원은 빈혈 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 골수형성이상 증후군 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 철적모구 빈혈 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 헤모글로빈혈증 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 지중해빈혈 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본 출원은 겸상 세포 질병 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)시키기 위해 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물을 사용하는 방법들을 제공한다. 선택적으로, 안구 질병 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및 또는 시야를 증대)하는 본 출원의 방법들은 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물의 투여 이외에도 안구 질병을 치료 또는 예방하기 위한 하나 이상의 지지 요법들의 투여를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 장애 또는 상태를 "방지하는" 치료는 통계적 시료에서 처리안된 대조 시료와 비교하여 처리된 시료에서 장애 또는 상태의 발생이 감소되거나, 또는 처리안된 대조 시료와 비교하여 장애 또는 상태의 하나 또는 그 이상의 증상의 개시를 지연시키거나 또는 그 중증도를 감소시키는 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료하는"은 특정 상태가 일단 확립되면 그 상태의 개선 또는 제거를 포함한다. 어느 경우에나, 예방 또는 치료는 의사 또는 다른 건강 관리 제공자에 의해 제공된 진단 및 치료제 투여의 의도된 결과로 식별 될 수 있다.
일반적으로, 본 출원에 기재된 질병 또는 병태의 치료 또는 예방은 하나 이상의 ActRII 길항제 (예컨대, ActRIIA 및/또는 ActRIIB 길항제)를 유효량으로 투여함으로써 구현된다. 물질의 유효량이란 필요한 치료 또는 예방 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 필요한 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 본 발명의 약제의 "치료적 유효량"은 질환 상태, 개체의 나이, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도하는 약제의 능력에 따라 달라질 수 있다. 물질의 "예방차원의 유효량(prophylactically effective amount)"이란 원하는 예방 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 필요한 시간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
안구 손상은 골수형성이상 증후군의 합병증/소견이다 [Han 외. (2015) J 녹내장 (인쇄 전 전자 간행물); [Brouzas 외. (2009) Clinical Ophthalmology 3:133-137]. 출원인들은 ActRII 억제제를 이용한 치료가 MDS 환자의 시각 개선에 놀라운 효과를 가져옴을 발견하였다. MDS 환자들의 시각 소실에 관한 메커니즘 통찰은 ActRII 억제제 요법이 또한 다른 눈 혈관 질환들, 특히, 허혈 및/또는 미세혈관 기능부전과 연관된 질환들의 치료에 유용할 수 있음을 암시한다. 예를 들면, MDS 이외에도, 예를 들면, 헤모글로빈혈증 질병들 (예컨대, 겸상 적혈구 질환 및 지중해빈혈)을 비롯한 다른 혈액학적 질환들이 안구 손상과 연관되어 왔다 [de Melo M.B. (2014) Rev Hematol Hemoter 36(5):319-321; 및 Aksoy 외. (2013) Seminars in Ophthalmology 28(1): 22-26].
그러므로, 특정 양상들에서, 본 출원은 하나 이상의 ActRII 길항제 (예컨대, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 등)을 투여함으로써 혈액학적 질환 환자의 시각 (예컨대, 시력 및/또는 시야)을 개선하는 방법 및 조성물들을 제공한다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은 빈혈 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및/또는 시야를 개선)하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은 MDS 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및/또는 시야를 개선)하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은 헤모글로빈혈증 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및/또는 시야를 개선)하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은 지중해빈혈 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및/또는 시야를 개선)하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은 겸상 적혈구 질환 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및/또는 시야를 개선)하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은 철적혈모구 빈혈 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및/또는 시야를 개선)하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 혈액학적 질환 (예컨대, 골수형성이상 증후군, 철적모구 빈혈, 지중해빈혈, 겸상 적혈구 질환, 빈혈, 헤모글로빈혈증, 또는 철적모구 빈혈)을 가지며 개선된 시각 (개선된 시력 및/또는 시야)이 필요한 환자들은 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물 이외에 혈액학적 질환을 치료하기 위한 하나 이상의 지지 요법들로 치료될 수 있다.
망막 허혈은 흔한 질병이며, 비교적 비효과적인 치료로 인해, 산업화된 세계에서 흔한 시각 장애 및 실명 원인으로 남아있다 [Osborne 외. (2004) Progress in Retinal and Eye Research 23:91-147]. 허혈은 조직으로의 부족한 (반드시 완전히 결여된 것은 아님) 혈류로 인하여 세포 에너지 요구량을 충족시키지 못하게 되는 병리학적 상황을 지칭한다. 일반적으로, 허혈은 조직에 다음과 같은 3가지 요건을 허용하지 않는다: 산소, 대사 기질, 및 폐 생성물의 제거. 이러한 요건들의 소실은 초기에 항상성 반응들을 저하시킬 것이며 시간이 지남에 따라 조직에 부상을 유도할 것이다. 이 요건들이 충분히 긴 시간 동안 유지되는 경우, 조직은 죽게 될 것이다 (경색). 세포 수준에서, 허혈성 망막 부상은 신경세포 탈분극, 칼슘 유입, 및 에너지 실패에 의해 개시되는 산화적 스트레스를 수반하는 자기-강화성 파괴 연쇄반응 및 글루타메이트에 의한 자극 증가로 구성된다. 궁극적으로 허혈성 손상은, 예를 들면, 광수용체들, 신경절 세포들 및 무축삭 세포들을 비롯한 망막 세포들의 소실을 초래할 수 있다.
망막 허혈은, 예를 들면, 뇌졸중, 안구 부상, 및 당뇨병을 비롯한 다양한 병태들에 의해 유발될 수 있다. 이는 또한 중심 망막 정맥이 폐색되거나 눈으로부터 떨어져나온 경우 흔히 유발된다. 망막이 그 산소 공급을 상실할 때, 신체는, 예를 들면, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 비롯한 다양한 혈관 변형 물질들을 생성함으로써 이를 보상하려고 한다. 유감스럽게도, 이는 망막 표면에 비정상적인 혈관이 성장하게 하여, 실명에 이르게 할 수 있다. 실제로, 허혈이 망막 혈관 폐색, 당뇨병, 겸상-세포 망막병증, 및 미숙아 망막병증의 환자들에서 망막 혈관신생의 원인이 되며, 이와 같은 병은 모두 궁극적으로 망막 혈관 출혈 및/또는 망막 박리를 가져올 수 있음이 제시되었다[Osborne 외. (2004) Progress in Retinal and Eye Research 23:91-147].
망막 허혈은 만성 또는 급성 질병으로 나타날 수 있다. 일반적으로, 망막 허혈은 먼저 한쪽 눈에 국소화되지만, 종종 시간이 지남에 따라 진행하여 양쪽 눈 모두에 영향을 준다. 대부분의 경우에, 망막 허혈 환자는 시신경유두 부종과 관련된 통증없는 시력 및 시야의 소실을 나타낸다. 이러한 병태를 보유한 환자들의 연령 범위는 광범위하며, 허혈 원인에 따라 달라진다. 그러나 일부 환자들은, 단순하게 갑작스런 시각 소실을 경험한다. 시각 소실 정도는 심각할 수 있고 또는 환자는 일정 부분의 시야에 걸쳐 종종 음영 또는 막(veil)으로도 설명되는 흐려진 시각의 희미한 감각만을 알려줄 수도 있다. 시각 소실은 시야 및 시력에 있어 심각한 장애를 유발할 수 있다. 일단 발생하면, 시각 소실은 적절한 치료시 초기 단계에서는 어느 정도 회복이 가능하기도 하지만 보통 영구적이다.
망막 허혈을 치료함에 이용가능한 다양한 안구 및 전신 치료가 존재하는데, 이들 다수는 한정된 효능 및/또는 잠재적 유해 부작용들을 가진다. 이러한 치료에는, 예를 들면 다음이 포함된다: 수술, 레이저 요법 (예컨대, 광응고), 항응고제 (예컨대, 아스피린 및 PAF 억제제), 항-혈관신생 요법 (예컨대, VEGF 억제제), Ca2+ 억제제 (예컨대, 플루나르진 및 니페디핀), 냉동요법, 고압 산소공급, Na+ 채널 차단제 (예컨대, 토피라메이트), iGluR 길항제 (예컨대, MK-801, 덱스트로메토르판, 엘리프로딜, 및 플루피르틴), 항산화제 (예컨대, 다이메틸티오우레아, 비타민 E, 알파-리포산, 초과산화물 불균등화효소, 카탈라아제, 데스페리옥사민, 만니톨, 알로퓨리놀, 칼슘 도베실레이트, 플루피르틴, 트라이메타지딘, 및 EGB-761), 및 항염증제.
특정 양상들에서, 본 출원은 하나 이상의 ActRII 길항제 [예컨대, ActRII 폴리펩티드 또는 이의 변이체 (예컨대, GDF 트랩)]를 투여함으로써 필요로 하는 환자들의 망막 허혈을 치료 또는 예방하는 방법, 뿐만 아니라 조성물들을 제공한다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 다음 중 하나 이상을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다: 급성 망막 허혈 및 만성 망막 허혈. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 다음에서 선택된 하나 이상의 망막 허혈 합병증을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다: 백내장, 각막 부종, 안구 저안압, 안구압 증가, 전방 염증, 신생혈관 녹내장, 및 홍채 혈관신생, 망막 동맥 협소화, 망막 정맥 확장, 망막 출혈, 면화 반점, 선홍색 반점, 시신경 혈관신생, 망막 혈관신생, 허혈성 안구 통증, 및 일과성 흑암시. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은 망막 허혈 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및/또는 시야를 개선)하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 망막 허혈로 괴로워하는 환자들은 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물 이외에 망막 허혈을 치료하기 위한 하나 이상의 지지 요법들 [예컨대, 수술, 레이저 요법 (예컨대, 광응고), 안구내 압력을 저하시키기 위한 국소 약물요법, 섬모체투열법, 섬모체냉동요법, 유리체강내 스테로이드제, 안구 필터링 과정, 신생혈관 녹내장을 치료하기 위한 녹내장 배액 밸브의 이식, 항혈소판제 요법 (예컨대, 아스피린, 티클로피딘, 및 클로피도그렐), 항응고제 요법 (예컨대, 와파린 및 헤파린), 및 전신 스테로이드 요법, 항-혈관신생 요법 (예컨대, VEGF 억제제), Ca2+ 억제제 (예컨대, 플루나르진 및 니페디핀), 냉동요법, 고압 산소공급, Na+ 채널 차단제 (예컨대, 토피라메이트), iGluR 길항제 (예컨대, MK-801, 덱스트로메토르판, 엘리프로딜, 및 플루피르틴), 항산화제 (예컨대, 다이메틸티오우레아, 비타민 E, 알파-리포산, 초과산화물 불균등화효소, 카탈라아제, 데스페리옥사민, 만니톨, 알로퓨리놀, 칼슘 도베실레이트, 플루피르틴, 트라이메타지딘, 및 EGB-761), 및 항염증제]로 치료될 수 있다.
안구 허혈 증후군 (OIS)은 만성 혈관 기능부전으로 인해 점진적 또는 갑작스런 시각 소실이 생기는 드문 질병이다 [Brown 외 (1994) Ocular ischemic syndrome. In: Retina. 2nd ed. Mosby. 1515-27; 및 Chen 외. (2007) Compr Ophthalmol Update. 8(1):17-28]. OIS의 가장 흔한 병인은 내경동맥의 절단 한쪽 또는 양쪽 죽상경화성 질병 또는 총경동맥 분기에서의 뚜렷한 협착이다. OIS는 또한 거대 세포 동맥염에 의해 유발될 수도 있다. 혈관 관류의 감소는 조직의 저산소증 및 안구 허혈성을 증가시키고, 이는 전형적으로 혈관신생을 일으키는 것으로 가정된다. 이 질병은 심장혈관 질병에 관한 다른 위험 인자들, 가령, 진성 당뇨병, 고지질혈증, 및 고혈압을 가진 환자들에서 가장 흔히 발견된다. 일반적인 전방 병리학에는 백내장, 각막 부종, 안구 저안압, 안구압 증가, 전방 염증, 신생혈관 녹내장, 및 홍채 혈관신생이 포함된다. 후방 구역 징후들에는 망막 동맥 협소화, 확장된 그러나 비사행상(nontortuour)인 망막 정맥, 망막 출혈, 면화 반점, 선홍색 반점, 및 시신경/망막 혈관신생이 포함된다.
OIS의 주요 증상들에는 시각 소실, 광-유도된 일과성 시각 소실, 일과성 흑암시, 및 허혈성 안구 통증이 포함된다 [Mizener 외. (1997) Ophthalmology. 104(5):859-64; 및 Chen 외. (2007) Compr Ophthalmol Update. 8(1):17-28]. 시력 소실은 가장 빈번히 경험하는 증상으로 환자들의 70-90%에서 나타난다. 시각 소실은 전형적으로 수 주 내지 수 개월의 기간에 걸쳐 점진적으로 발생하지만, 갑자기 발생할 수도 있다. OIS 환자들의 약 40%는 허혈성 통증 증상들을 나타낼 것이다. 일반적으로, 통증은 이마에 대한 둔한 통증으로 특징적으로 설명되며, 사전에 수 시간 내지 수 일에 걸쳐 점진적으로 시작된다. 일과성 흑암시는 약 10분 미만의 기간 동안 지속되는 일과성의 완전한 또는 부분적인 한눈 실명 상황이다. 일과성 흑암시 병력은 OIS 환자들의 약 9-15%에서 발견된다.
OIS를 치료함에 이용가능한 다양한 안구 및 전신 치료가 존재하는데, 이들 다수는 한정된 효능 및/또는 잠재적 유해 부작용들을 가진다. 안구 치료에는, 예를 들면, 다음이 포함된다: 홍채, 시신경, 또는 망막의 혈관신생을 치료하기 위한 수술 또는 레이저 요법 (예컨대, 범망막 광응고); 안구내 압력을 저하시키기 위한 국소 약물요법, 안구내 압력을 저하시키기 위한 섬모체투열법 및 섬모체냉동요법; 유리체강내 스테로이드제; 및 신생혈관 녹내장을 치료하기 위한 녹내장 배액 밸브의 이식 및 안구 필터링 과정. 전신 치료에는, 예를 들면, 다음이 포함된다: 항혈소판제 요법 (예컨대, 아스피린, 티클로피딘, 및 클로피도그렐), 항응고제 요법 (예컨대, 와파린 및 헤파린), 및 스테로이드제.
특정 양상들에서, 본 출원은 하나 이상의 ActRII 길항제 [예컨대, ActRII 폴리펩티드 또는 이의 변이체 (예컨대, GDF 트랩)]를 투여함으로써 필요로 하는 환자들의 안구 허혈 증후군을 치료 또는 예방하는 방법, 뿐만 아니라 조성물들을 제공한다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 다음에서 선택된 하나 이상의 안구 허혈 증후군 합병증을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다: 백내장, 각막 부종, 안구 저안압, 안구압 증가, 전방 염증, 신생혈관 녹내장, 및 홍채 혈관신생, 망막 동맥 협소화, 망막 정맥 확장, 망막 출혈, 면화 반점, 선홍색 반점, 시신경 혈관신생, 망막 혈관신생, 허혈성 안구 통증, 및 일과성 흑암시. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은 안구 허혈 증후군 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및/또는 시야를 개선)하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 안구 허혈 증후군으로 괴로워하는 환자들은 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물 이외에 안구 허혈 증후군을 치료하기 위해 하나 이상의 지지 요법들 [예컨대, 범망막 광응고, 안구내 압력을 저하시키기 위한 국소 약물요법, 섬모체투열법, 섬모체냉동요법, 유리체강내 스테로이드제, 안구 필터링 과정, 신생혈관 녹내장을 치료하기 위한 녹내장 배액 밸브의 이식, 항혈소판제 요법 (예컨대, 아스피린, 티클로피딘, 및 클로피도그렐), 항응고제 요법 (예컨대, 와파린 및 헤파린), 및 전신 스테로이드 요법]로 치료될 수 있다.
허혈성 시신경병증 (ION)은 눈의 시신경으로의 혈류 감소 또는 중단으로 인한 중심 시력, 측면 시각, 또는 두 가지 모두의 갑작스런 소실이다. 다음과 같은 ION의 두 가지 주요 범주가 존재한다: 후방 허혈성 시신경병증 (PION) 및 전방 허혈성 시신경병증 (AION). AION은 일반적으로 동맥염성 AION (AAION) 또는 비-동맥염성 AION (NAION)으로 분류된다.
PION은 일반적으로 시신경의 눈뒤 부위에 대한 허혈로 인한 손상으로 특징된다. 후방이라는 용어에도 불구하고, 이 병태생리학은 허혈성 손상이 전방에 존재하는 사례들에 적용될 수 있는데, 이 병태가 시신경에서의 손상 위치만큼 많이 시각이 소실되는 특정한 메커니즘을 설명하기 때문이다. AION은 취약한 조건들 및/또는 심장혈관 위험 인자들을 가진 환자들에서 자발적으로 그리고 한쪽에 발생한다는 사실에 의해 구별된다. PION은 전형적으로 다음 2가지 범주의 환자들에서 발생한다: i) 상당한 혈액 소실과 관련된 또는 혈액 소실이 지속되는 비-안구 수술을 경험한 환자들, 그리고 ii) 사고 또는 파열된 혈관으로 인해 상당한 출혈을 경험한 환자들. 고혈압, 당뇨병, 및 흡연 병력을 가진 환자들이 가장 PION에 걸리기 쉬운데, 이들은 일반적으로 혈관 자동조절이 손상을 입었기 때문이다.
AAION은 관자동맥염 (또한 거대 세포 동맥염으로도 지칭됨)으로 인해 생기며, 일반적으로 노인에서 발생하는 중간-크기 혈관의 염증성 질병이다. 대부분의 AAION 사례는 한쪽 눈의 거의 완전한 시각 소실이 일어난다. 치료하지 않고 남겨두면, 1-2 주 내에 두 번째 눈 또한 시각 소실을 겪게 되기 쉬울 것이다. 대조적으로, NAION은 약간 더 어린 그룹에서 더 빈번하게 관찰되며 "밀집성 유두" 또는 "위험한 시신경유두(disk at risk)"로도 종종 지칭되는 일정 유형의 시신경유두 모양을 가진 환자들에서 심장혈관 위험 인자들 (예컨대, 당뇨병, 고혈압, 및 고 콜레스테롤 수준)이 동시에 발생함으로 인해 생긴다.
한 때 ION 손상은 되돌릴 수 없다고 여겨졌다. 그러나, 최근의 연구들은 초기 ION 병기 중에 많은 용량의 코르티코스테로이드제 (예컨대, 프레드니손)로 치료받은 환자들에서 시력의 개선을 보여주었다 [Hayreh 외. (2008) Graefe's Archive for Clinical Experimental Opthalmology 246(7): 1029-1046].
특정 양상들에서, 본 출원은 하나 이상의 ActRII 길항제 [예컨대, ActRII 폴리펩티드 또는 이의 변이체 (예컨대, GDF 트랩)]를 투여함으로써 필요로 하는 환자들의 허혈성 시신경병증을 치료 또는 예방하는 방법 및 조성물들을 제공한다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 다음 중 하나 이상을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다: 후방 허혈성 시신경병증, 전방 허혈성 시신경병증, 동맥염성 전방 허혈성 시신경병증, 및 비-동맥염성 전방 허혈성 시신경병증. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 다음 중 하나 이상을 가진 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력 및/또는 시야를 증대)하기 위해 사용될 수 있다: 후방 허혈성 시신경병증, 전방 허혈성 시신경병증, 동맥염성 전방 허혈성 시신경병증, 및 비-동맥염성 전방 허혈성 시신경병증. 선택적으로, 허혈성 시신경병증을 앓는 환자들은 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물 이외에 허혈성 시신경병증을 치료하기 위해 하나 이상의 지지 요법들 [예컨대, 코르티코스테로이드 (프레드니손)]로 치료될 수 있다.
망막 혈관염은 망막 혈관들의 염증으로 특징지어지는 국소 또는 전신 질환들의 분리된 병태 또는 합병증일 수 있다 [Walton 외. (2003) Current opinion in ophthalmology. 14(6):413-419; 및 Ali 외. (2014) The British journal of ophthalmology. 98(6):785-789]. 망막 혈관염은 일반적으로 위치를 기준으로 다음과 같이 분류된다: 대혈관 혈관염, 중혈관 혈관염, 소혈관 혈관염, 가변 혈관 혈관염, 및 단일-기관 혈관염. 망막 혈관염의 전형적인 특징은 혈관 벽 주변의 집형성(sheathing) 존재이다. 혈관주위 집형성은 병에 걸린 혈관들 주위에 염증성 세포들로 이루어진 삼출액들이 모인 것이다. 이는 혈관 주위에 백색 띠가 나타나게 한다. 망막염 패치는 망막 혈관염을 수반할 수 있다. 이들은 아다만티아데스-베체트 병 및 감염성 포도막염에 걸린 개체들에서 나타난다. 망막염은 일과성일 수 있거나 또는 망막 괴사를 수반할 수 있다. 망막내 침윤물들은 실명을 일으킬 수 있으며 망막 위축증, 파열, 및 박리를 초래할 수 있다. 망막 혈관염은 표재성 망막 표면에서 미만성(diffuse)의 성긴 (fluffy) 면화형 반점들로 나타나는 망막 신경 섬유층의 미세-경색(micro-infarcts)을 가져올 수 있다. 망막 혈관염과 연관된 포도막염의 감염성 형태들은 망막층들의 괴사와 관련될 수 있다. 서리 가지 혈관염은 림프구형질세포 침윤물들에 의한 혈관주위 공간의 심각한 침윤으로 특징되는 망막 혈관염을 설명하는 용어이다. 이는 서리맞은 나무 가지들의 외형을 제공한다. 염증에 부차적인 망막 혈관의 폐색은 망막의 허혈 및 모세혈관 비-관류 영역들의 발달을 가져올 수 있다. 이러한 환자들은 망막 비-관류로 인해 발생하는 합병증들, 가령, 혈관신생 및 안구내 출혈을 발달시킬 가능성이 더 높을 수 있다. 이는 상당한 망막 비-관류 영역을 발달시킬 수 있다. 생길 수 있는 다양한 기타 합병증들에는 피부홍조, 견인 망막 박리, 신생혈관 녹내장, 및 재발성 유리체 출혈이 포함된다.
비-감염성 망막 혈관염은 전신 또는 국소 코르티코스테로이드제 (예컨대, 프레드니손 및 트라이암시놀론) 및 스테로이드-보존 면역억제제 (예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 마이코페놀레이트, 모페틸, 인플릭시맙 및 에타네르셉트)로 다루어진다. 치료제의 국소 전달은 유리체강내 주사 또는 안구주위 요법을 통해 이루어질 수 있으나, 안구주위 요법은 중증 망막 혈관염의 경우에는 충분히 적합하지 않을 수 있다. 면역억제제의 선택은 안구 소견, 병인 및 전신적 동반 질환(co-morbidities)을 기초로 잘 조절되어야 한다. 면역억제와 별도로, 망막 혈관염을 제어하기 위하여 다양한 치료 방법들, 가령, 수술, 냉동요법, 및 레이저 요법 (예컨대, 범망막 광응고)이 사용될 수 있다.
특정 양상들에서, 본 출원은 하나 이상의 ActRII 길항제 [예컨대, ActRII 폴리펩티드 또는 이의 변이체 (예컨대, GDF 트랩)]를 투여함으로써 필요로 하는 환자들의 망막 혈관염을 치료 또는 예방하는 방법 및 조성물들을 제공한다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 다음 중 하나 이상을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다: 대혈관 혈관염, 중혈관 혈관염, 소혈관 혈관염, 가변 혈관 혈관염, 및 단일-기관 혈관염. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 다음에서 선택된 하나 이상의 망막 혈관염 합병증들을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다: 혈관주위 집형성, 망막염, 망막 괴사, 망막내 침윤물들 서리 가지 모세혈관 비-관류, 혈관신생, 안구내 출혈, 피부홍조, 망막 박리, 신생혈관 녹내장, 및 재발성 유리체 출혈. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 망막 혈관염 (예컨대, 대혈관 혈관염, 중혈관 혈관염, 소혈관 혈관염, 가변 혈관 혈관염, 및 단일-기관 혈관염) 환자에서 시각을 개선 (예컨대, 시력을 증대 및/또는 시야를 증대)하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 망막 혈관염을 앓는 환자들은 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물 이외에 망막 혈관염을 치료하기 위하여 하나 이상의 지지 요법들 [예컨대, 코르티코스테로이드제 (예컨대, 프레드니손 및 트라이암시놀론) 및 스테로이드-보존 면역억제제 (예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 마이코페놀레이트, 모페틸, 인플릭시맙 및 에타네르셉트)]로 치료될 수 있다.
황반 변성은 시야 중심 (황반)의 시각 소실을 가져오며 일반적으로 망막 손상에 의해 유발된다 [de Jong PT (2006) N Engl J Med 255(14): 1474-1485]. 이는 실명 및 시각 장애의 주요 원인이며 통상적으로 노인에서 발생하고, 대략 세계적으로 2천-5천 만명이 걸린다. 노인에서 두드러지게 나타나기 때문에, 황반 변성은 종종 연령-관련 황반 변성으로도 지칭된다. 보다 어린 환자들에서, 황반 변성은 종종 소아 황반 변성으로도 지칭되며, 이는 일반적으로 기저 유전 질환 (예컨대, 스타르가르트병 또는 베스트병)의 결과이다 [Dryja et al. (1998) Science 279(5354): 1107]. 일반적으로, 황반 변성은 "건성" (비-삼출성) 또는 "습성" (삼출성) 질병으로 나타난다. 건성 황반 변성에서, 황색 침착물 (드루젠)들이 망막 색소 상피와 기저 맥락막 사이의 황반에 축적된다. 대형 및/또는 수많은 드루젠 침착물들은 황반 아래 색소침착 세포층을 파괴하고, 이는 손상된 광수용체들 (간상 및 원추)로 인해 시각 소실을 유발할 수 있다. 일반적으로, 습성 황반 변성은 맥락막모세혈관층으로부터 부르크 막을 통한 비정상적인 혈액 혈관 성장 (맥락막 혈관신생)으로 인한 것이다. 이러한 새로운 혈관들은 손상되기 쉬워서, 황반 아래 혈액 및 단백질 누출을 초래한다. 이러한 혈관들로부터의 출혈 및 흉터형성은 광수용체들을 손상시킬 수 있으므로 시각 소실을 촉진시킨다.
유감스럽게도, 건성 황반 변성에 대한 치료는 제한되어 있다. 그러나, 대규모의 과학적 연구 (연령-관련 눈 질병 연구 2)는 후기 황반 변성을 발병시킬 위험이 높은 사람들 중에서,비타민 C, 비타민 E, 루테인, 및 제악산틴의 식이 보충제를 아연과 함께 섭취하면 질병의 진행 병기들로의 진행을 최소한 25% 만큼 저하시켰음을 보여주었다[Chew 외. (2013) Ophthalmology 120(8): 1604-1611]. 또 다른 여성들에서의 대규모 연구는 염산 및 비타민 B6 및 B12의 섭취로 인한 이점을 보여주었다 [Christen 외. (2009) Arch Intern Med 169(4): 335-341]. 다른 연구들은 건성 황반 변성 발병 위험을 감소시킬 수 있음을 보여주었다 [Chew et al. (2013) Ophthalmology 131(7): 843-850].
습성 황반 변성에 대한 가장 통상적인 치료법은, 예를 들면, 베바시주맙, 라니비주맙, 및 아플리버셉트를 비롯한 하나 이상의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 길항제 (억제제)의 투여이다. 베바시주맙 (Avastin®)은 인간화된, 단클론 VEGF-A 항체이다. 유사하게, 라니비주맙 (Lucentis®)는 단클론 VEGF-A 항체 단편 (Fab)이다. 아플리버셉트 (Eylea®)는 인간 VEGF 수용체들 1과 2의 세포외 도메인들로부터 얻은 부분들을 포함하는 면역글로불린 Fc 융합 단백질이다. 대부분의 경우 투약으로 치료되지만, 수술 또는 레이저 요법 또한 습성 황반 변성을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 레이저 요법에서, 망막 내 비정상적인 혈관들을 파괴하여, 추가의 이상 혈관 성장 및 누출을 방지하기 위해 집중된 광선이 사용된다. 일부 사례들에서, 습성 황반 변성은 광역학 요법으로 치료될 수 있는데, 이는 광-활성화 약물 (감광제) 및 저 출력 레이저의 조합을 사용한다. 감광성 약물은 환자에게 주사되어 눈 뒤의 비정상적인 혈관들을 비롯한 신체 전반에 걸쳐 돌아다닌다. 저 출력 레이저는 비정상적인 혈관들에 직접 표적되어 약물을 활성화시키고 이로써 원치않는 혈관들을 특정적으로 손상시킨다.
특정 양상들에서, 본 출원은 하나 이상의 ActRII 길항제 [예컨대, ActRII 폴리펩티드 또는 이의 변이체 (예컨대, GDF 트랩)]를 투여함으로써 필요로 하는 환자들의 황반 변성을 치료 또는 예방하는 방법 및 조성물들을 제공한다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 다음 중 하나 이상을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다: 연령-관련 황반 변성, 소아 황반 변성, 스타르가르트병, 베스트병, 건성 황반 변성, 및 습성 황반 변성. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 예를 들면, 드루제 침착/축적, 황반 부종, 및 공포신생(neovacuolization)을 비롯한, 하나 이상의 황반 변성 합병증을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은 황반 변성 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력을 증대 및/또는 시야를 증대)하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 황반 변성을 앓는 환자들은 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물 이외에 황반 변성을 치료하기 위하여 하나 이상의 지지 요법들 [예컨대, VEGF 길항제 (예컨대, 베바시주맙, 라니비주맙, 및 아플리버셉트), 수술, 레이저 요법, 광역학 요법, 및/또는 식이 보충제 (예컨대, 비타민 C, 비타민 E, 루테인, 제악산틴, 아연, 염산, 비타민 B6, 비타민 B12, 및 제악산틴)]로 치료될 수 있다.
당뇨 망막병증은 당뇨병의 안과 소견이며 다음 두 가지 유형들로 분류된다: 비-증식성 당뇨 망막병증 (NPDR) 및 증식성 당뇨 망막병증 (PDR) [Semeraro et al. (2015) Journal of Diabetes Research 2015(582060) 1-16; Arden et al. (2011) Current Diabetes Reviews 7:291-304; 및 Eshaq et al. (2014) Redox Biology 2: 661-666]. NPDR은 일반적으로 경미한, 또는 존재하지 않는 증상들을 보유한 질병의 초기 단계이다. NPDR에서, 망막의 혈관들은 약해져서 미세동맥류를 유발한다. 이러한 망막미세꽈리들은 망막 내부로 체액을 누출시킬 수 있고, 황반 부종을 초래할 수 있다. 따라서, NPDR 합병증들은 종종 미세동맥류, 망막 출혈, 황반 부종, 및 황반 허혈로 나타난다. PDR은 보다 진행된 질병 형태이다. 이 단계에서, 순환 문제들로 인해 망막에서 산소가 없어지게 되고, 이는 망막 내 새롭고 약한 혈관들의 형성을 촉진시키는데, 이 혈관들은 유리체 내부로 확장될 수 있다. 이러한 혈관신생은 유리체 출혈을 가져올 수 있어서, 시각을 흐리게 할 수 있다. PDR의 다른 합병증들에는 흉터 조직 형성으로 인한 망막의 박리 및 녹내장 발병이 포함된다. 일부 사례들에서, 눈 내부의 체액 압력 증가는 시신경 손상을 초래한다. 치료하지 않은 채 두면, 당뇨 망막병증은 심각한 시각 소실 및 실명 조차도 유발할 수 있다.
당뇨 망막병증의 치료는 일반적으로 합병증들, 가령, 황반 부종 및 혈관신생에 관하여 환자를 모니터링 및 이러한 합병증들을 치료함으로써 시력을 유지시키는 방향으로 한다. 이러한 당뇨 망막병증의 합병증들은, 예를 들면, VEGF 길항제 (예컨대, 베바시주맙, 라니비주맙, 및 아플리버셉트) 및/또는 코르티코스테로이드제 (예컨대, 트라이암시놀론 및 덱사메타손)를 투여함으로써 치료될 수 있다. 일부 사례들에서, 당뇨 망막병증은 수술, 레이저 요법 (예컨대, 레이저 광응고, 변형된 격자 레이저 광응고, 범망막 광응고, 및 광역학 요법) 및/또는 유리체절제로 치료된다.
특정 양상들에서, 본 출원은 하나 이상의 ActRII 길항제 [예컨대, ActRII 폴리펩티드 또는 이의 변이체 (예컨대, GDF 트랩)]를 투여함으로써 필요로 하는 환자들의 당뇨 망막병증을 치료 또는 예방하는 방법 및 조성물들을 제공한다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 다음 중 하나 이상을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다: 비-증식성 당뇨 망막병증 및 증식성 당뇨 망막병증. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 예를 들면, 미세동맥류, 망막 출혈, 황반 부종, 황반 허혈, 혈관신생, 녹내장, 유리체 출혈, 시신경 손상, 및 망막 박리를 비롯한 하나 이상의 당뇨 망막병증 합병증들을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은 당뇨 망막병증 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력을 증대 및/또는 시야를 증대)하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 당뇨 망막병증을 앓는 환자들은 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물 이외에 당뇨 망막병증을 치료하기 위하여 하나 이상의 지지 요법들 [예컨대, VEGF 길항제 (예컨대, 베바시주맙, 라니비주맙, 및 아플리버셉트), 코르티코스테로이드 (트라이암시놀론 및 덱사메타손), 수술, 레이저 요법 (예컨대, 레이저 광응고, 변형된 격자 레이저 광응고, 범망막 광응고, 및 광역학 요법), 및/또는 유리체절제]로 치료될 수 있다.
망막 폐색은 흔한 망막 혈관 질환으로 전세계적으로 가장 흔한 시각 소실 원인들 중 하나이다 [Klein et al. (2000) Tran Am Opthalmol Soc. 98: 133-141]. 망막 폐색은 망막 동맥 폐색 (RAC) 또는 망막 혈관 폐색 (RVO)으로 나타날 수 있다. 망막 폐색은 폐색이 위치한 부분에 따라 분류된다. 시신경 수준에서 중심 혈관의 폐색은 중심 동맥/망막 혈관 폐색 (CRAO 및 CRVO)으로 지칭된다. 대략 망막의 절반에 이르는 일차 상부 가지 또는 일차 하부 가지에서의 폐색은 절반-망막 동맥/망막 폐색 (HRAO 및 HRVO)으로 지칭된다. 임의의 더 원위에 위치한 망막 가지들의 폐색은 망막 분지 동맥/망막 폐색 (BRAO 및 BRVO)으로 지칭된다. 폐색의 위치는 망막 폐색의 발병기전, 임상 표현, 및 관리에 영향을 미친다. 망막 폐색은 관찰된 망막 모세혈관 허혈의 양에 따라 비-허혈성 및 허혈성 유형들로 더욱 세분된다.
일반적으로, 망막 폐색은 혈액을 공급하거나 (RAC) 또는 망막으로부터 혈액을 배출시키는 (RVO) 순환 부위의 차단이다. 차단시, 모세혈관들 내 압력이 상승하여, 출혈 그리고 체액 및 혈액의 누출을 초래한다. 이는 황반의 부종을 유발할 수 있다. 황반 허혈 또한 산소를 망막에 공급하는 이러한 모세혈관들 내부에서 발달할 수 있다. 감소된 산소 및 영양소 가용성은 혈관신생을 촉진시켜, 신생혈관 녹내장, 유리체 출혈, 망막 박리를 초래할 수 있다. 시각 질환 (Visual morbidity) 및 실명은 일반적으로 이러한 인자들의 조합으로부터 생긴다.
망막 폐색의 치료는 일반적으로 합병증들, 가령, 황반 부종 및 혈관신생에 관하여 환자를 모니터링 및 이러한 합병증들을 치료함으로써 시력을 유지시키는 방향으로 한다. 이러한 합병증들은 VEGF 길항제 (예컨대, 베바시주맙, 라니비주맙, 및 아플리버셉트) 및/또는 예를 들면, 트라이암시놀론 (Triesence®) 및 덱사메타손 (Ozurdex®)을 비롯한 코르티코스테로이드제로 치료될 수 있다. 일부 사례들에서, 망막 폐색은 특정 유형들의 광역학 요법 기법들을 비롯한 수술 또는 레이저 요법으로 치료된다. 불응성 사례들에서, 유리체절제가 필요할 수 있으며, 이는 유리체 제거 및 식염수 용액으로의 대체를 포함한다.
특정 양상들에서, 본 출원은 하나 이상의 ActRII 길항제 [예컨대, ActRII 폴리펩티드 또는 이의 변이체 (예컨대, GDF 트랩)]를 투여함으로써 필요로 하는 환자들의 망막 폐색을 치료 또는 예방하는 방법 및 조성물들을 제공한다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 다음 중 하나 이상을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다: 중심 망막 혈관 폐색, 절반-망막 혈관 폐색, 망막 분지 혈관 폐색, 허혈성 망막 혈관 폐색, 비-허혈성 망막 혈관 폐색, 중심 망막 동맥 폐색, 절반-망막 동맥 폐색, 망막 분지 동맥 폐색, 허혈성 망막 동맥 폐색, 및 비-허혈성 망막 동맥 폐색. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 예를 들면, 황반 부종, 황반 허혈, 혈관신생, 녹내장, 및 망막 박리를 비롯한 하나 이상의 망막 폐색 합병증을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은 망막 폐색 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력을 증대 및/또는 시야를 증대)하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 망막 폐색을 앓는 환자들은 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물 이외에 망막 폐색을 치료하기 위하여 하나 이상의 지지 요법들 [예컨대, a VEGF 길항제 (예컨대, 베바시주맙, 라니비주맙, 및 아플리버셉트), 코르티코스테로이드 (트라이암시놀론 및 덱사메타손), 수술, 레이저 요법, 광역학 요법, 및 유리체절제]로 치료될 수 있다.
황반 모세혈관확장증은 황반의 중심에 존재하는 망막중심오목의 손상으로 특징되며, 두 가지 형태로 나타난다. 유형 2 황반 모세혈관확장증은 이 질병의 가장 흔한 형태로, 망막중심오목 주위의 혈관의 누출로 나타난다. 이러한 누출은 황반 부종 및 혈관신생을 초래하고, 부분적으로는, 유리체 출혈로 인해 중심 시력에 영향을 줄 수 있다. 또한, 흉터 조직은 황반 및 망막중심오목 위에 형성되어, 세부적인 시력의 소실을 유발할 수 있다. 유형 2 황반 모세혈관확장증은 양쪽 눈에 영향을 미치지만 반드시 동일한 중증도를 보이는 것은 아니다. 유형 1 황반 모세혈관확장증에서, 망막중심오목 주위의 혈관들은 확장되어 작은 꽈리들을 형성하며, 이는 황반 부종 및 혈관신생을 촉진시킬 수 있다. 유형 1 황반 모세혈관확장증은 거의 항상 한쪽 눈에서 발생하며, 이러한 점에서 이 질병의 유형 2 형태와 구별된다.
황반 모세혈관확장증의 치료는 일반적으로 합병증들, 가령, 황반 부종 및 혈관신생에 관하여 환자를 모니터링 및 이러한 합병증들을 치료함으로써 시력을 유지시키는 방향으로 한다. 황반 모세혈관확장증의 이러한 합병증들은 VEGF 길항제 (예컨대, 베바시주맙, 라니비주맙, 및 아플리버셉트)를 투여함으로써 치료될 수 있다. 일부 사례들에서, 황반 모세혈관확장증은 수술, 레이저 요법 (예컨대, 레이저 광응고, 변형된 격자 레이저 광응고, 범망막 광응고, 및 광역학 요법) 및/또는 유리체절제로 치료된다.
특정 양상들에서, 본 출원은 하나 이상의 ActRII 길항제 [예컨대, ActRII 폴리펩티드 또는 이의 변이체 (예컨대, GDF 트랩)]를 투여함으로써 필요로 하는 환자들의 황반 모세혈관확장증을 치료 또는 예방하는 방법 및 조성물들을 제공한다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 다음 중 하나 이상을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다: 유형 2 황반 모세혈관확장증 및 유형 1 황반 모세혈관확장증. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 예를 들면, 미세동맥류, 황반 부종, 혈관신생, 및 유리체 출혈을 비롯한, 하나 이상의 황반 모세혈관확장증의 합병증들을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은 황반 모세혈관확장증 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력을 증대 및/또는 시야를 증대)하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 황반 모세혈관확장증을 앓는 환자들은 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물 이외에 망막 황반 모세혈관확장증을 치료하기 위하여 하나 이상의 지지 요법들 [예컨대, VEGF 길항제 (예컨대, 베바시주맙, 라니비주맙, 및 아플리버셉트), 수술, 레이저 요법 (예컨대, 레이저 광응고, 변형된 격자 레이저 광응고, 범망막 광응고, 및 광역학 요법), 및/또는 유리체절제]로 치료될 수 있다.
테리 (Terry) 증후군 또는 수정체뒤 섬유증식증으로도 지칭되는 미숙아 망막병증 (ROP)은, 망막 주위에 비정상적으로 혈관이 성장되어 있는 미숙아에서 발생하는 안구 질병이다 [Phelps D.L. (2001) NeoReview 2(7):153-166]. 망막 주위의 혈관신생은 황반 부종 및 유리체 출혈을 초래하여 시각을 손상시킬 수 있다. 일부 사례들에서, 혈관신생은 망막 주위에 흉터 조직을 형성시켜, 망막 박리를 촉진시킬 수 있다. 특히, 중증 질병이 발병했던 ROP 환자들은 근시 (near-sightedness), 약시 (lazy eye), 사시 (misaligned eyes), 백내장, 및 노년기 녹내장 위험이 더 크다.
ROP의 치료는 일반적으로 합병증들, 가령, 황반 부종, 망막 출혈, 혈관신생, 유리체 출혈, 및 망막 박리에 관하여 환자를 모니터링 및 이러한 합병증들을 치료함으로써 시력을 유지시키는 방향으로 한다. ROP의 이러한 합병증들은 VEGF 길항제 (예컨대, 베바시주맙, 라니비주맙, 및 아플리버셉트)를 투여함으로써 치료될 수 있다. 일부 사례들에서, ROP는 수술, 레이저 요법 (예컨대, 레이저 광응고, 변형된 격자 레이저 광응고, 범망막 광응고, 및 광역학 요법) 및/또는 유리체절제로 치료된다. 공막돌륭술 및 기체망막유착술은 망막 박리를 복원시키기 위한 흔한 안과적 시술법이다. 최근, 베타-차단제 (예컨대, 프로프라놀롤)는, 특히, 망막 혈관형성을 억제하여 혈액-망막 장벽 기능이상을 개선시킴으로써, ROP의 진행 속도를 늦춤이 입증되었다 [Ristori C. (2001) Invest Ophthalmol Vis Sci 52(1): 155-170].
특정 양상들에서, 본 출원은 하나 이상의 ActRII 길항제 [예컨대, ActRII 폴리펩티드 또는 이의 변이체 (예컨대, GDF 트랩)]를 투여함으로써 필요로 하는 환자들의 미숙아 망막병증을 치료 또는 예방하는 방법 및 조성물들을 제공한다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은, 예를 들면, 망막 출혈s, 황반 부종, 혈관신생, 유리체 출혈, 및 망막 박리를 비롯한 하나 이상의 미숙아 망막병증의 합병증을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물은 미숙아 망막병증 환자의 시각을 개선 (예컨대, 시력을 증대 및/또는 시야를 증대)하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 미숙아 망막병증을 앓는 환자들은 ActRII 길항제, 또는 ActRII 길항제들의 조합물 이외에 미숙아 망막병증을 치료하기 위하여 하나 이상의 지지 요법들 [예컨대, VEGF 길항제 (예컨대, 베바시주맙, 라니비주맙, 및 아플리버셉트), 베타 차단제 (프로프라놀롤), 수술, 레이저 요법 (예컨대, 레이저 광응고, 변형된 격자 레이저 광응고, 범망막 광응고, 및 광역학 요법), 유리체절제, 공막돌륭술, 및/또는 기체망막유착술]로 치료될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "복합하여", 또는 "공동 투여"는 추가 요법(가령, 제2, 제3, 제 4 등)이 여전히 신체에서 효과적이도록 투여하는 임의의 형태를 의미한다 (예를 들어, 다수 화합물이 환자에서 동시에 효과적이며, 이들 화합물의 공조상승효과를 포함할 수 있음). 유효성은 혈액, 혈청 또는 혈장에서 측정가능한 약물 농도와 관련이 없을 수도 있다. 예를 들면, 상이한 치료 화합물은 동일한 제형 또는 별도 제형으로, 동시, 순차적 또는 상이한 일정에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 그러한 치료를 받는 개인은 다른 치료법의 결합된 효과로부터 이익을 얻을 수 있다. 본 출원의 하나 이상의 ActRII 길항제 (예컨대, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 항체 등)는 하나 또는 그 이상의 다른 추가적인 물질들 또는 보조 요법과 동시에, 이보다 앞서, 또는 후속적으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 각각의 치료제는 특정 약제에 대해 결정된 투여량 및/또는 일정으로 투여될 것이다. 요법에서 사용하는 특정 조합은 본 명세서의 길항제와 치료 및/또는 바람직한 치료 효과의 양립 가능성을 고려할 것이다.
시력 (VA)은, 부분적으로는, 눈 내부의 망막 초점의 선명도와 뇌 해석 능력의 민감도에 의존하는 시각의 예리함 또는 명확성이다. 시력은 시각 처리 시스템의 공간 분해능의 측정치이다. 일부 구체예들에서, VA는 시력을 테스트할 사람이 설정된 거리에 있는 차트에 있는 글자, 전형적으로 숫자 또는 문자를 식별하도록 요구함으로써 테스트된다. 일반적으로, 차트 글자는 백색의 바탕에 흑색의 기호로 표시된다. 사람의 눈과 테스트 차트 사이의 거리는 렌즈가 초점을 맞추는 방식에서 무한대에 가까워질 정도로 충분한 거리로 설정된다. 일부 구체예들에서, 광학적 관점에서 본질적으로 무한대인 20 피트 또는 6 미터이다.
VA를 측정하는 비-제한적 수단들 중 하나는 ESV-3000 ETDRS 테스트 장치 (US 5,078,486 참조), 자체 교정 테스트 조명을 사용하는 것이다. ESV-3000 장치는 LED 광원 기술을 통합시킨다. 자동-교정 회로는 계속 LED 광원을 모니터하고 테스트 밝기를 85 cd/m2 또는 3 cd/m2로 교정한다. 이 장치는 대형-포맷의 ETDRS 테스트 (최대 20/200)가 4 미터에서 수행되는 임상 시험용으로 설계되었지만, 안구 질환 모니터링이 수행되는 병원이나 클리닉과 같은 비-연구 환경에서 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 테스트는 표준 조명 조건들, 예를 들면, 85 cd/m2의 광순응 테스트 수준하에서 수행된다. 이러한 조명 수준은 ETDRS 및 대비감도 시각 테스트에 관한 미국 국가표준 협회 및 국립 과학원에 의해 권장되었다. 모니터링에 의해 선택된 임의의 방식으로 시력을 점수화 할 수 있다. 기준선 평가를 제공한 후, 테스트 대상체가 식별할 수 있는 문자들의 수의 증가 또는 감소는 치료하는 동안의 시력 증가 또는 감소에 관한 측정치를 제공한다. VA를 측정하는 다른 방법들에는, 예를 들면, 스넬렌 (Snellen) 테스트, E 차트 테스트, 및 근거리 (Near) 테스트가 포함된다.
한 양상에서, 본 출원은 본 명세서에 기재된 눈 혈관 질환을 가지는 대상체에서 시력을 증가시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 일반적으로, 이러한 방법들은 하나 이상의 ActRII 길항제 유효량을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 치료받은 눈에 의해 인식가능한 문자의 수를 약 1개 내지 약 30개 문자로 증가시키는 수단을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 인식가능한 문자의 수는 약 5개 내지 약 25개 문자로 증가된다. 한 추가 구체예에서, 인식가능한 문자의 수는 약 5개 내지 약 20개 문자로 증가된다. 또 다른 추가 구체예에서, 인식가능한 문자의 수는 약 5개 내지 약 15개 문자로 증가된다. 또한 추가 구체예에서, 인식가능한 문자의 수는 약 5개 내지 약 10개 문자로 증가된다. 또한 또 다른 구체예에서, 인식가능한 문자의 수는 약 10개 내지 약 25개 문자로 증가된다. 또한 또 다른 구체예에서, 인식가능한 문자의 수는 약 15개 내지 약 25개 문자로 증가된다. 또한 또 다른 구체예에서, 인식가능한 문자의 수는 약 20개 내지 약 25개 문자로 증가된다.
일반적으로, 시야는 환자가 주변적으로 볼 수 있는 것들에 관한 총 수평 및 수직 범위를 시야 테스트함으로써 결정될 수 있다. 이 유형의 테스트는 보통 자동 시야 테스트로 수행되며, 환자가 직진하는 광원을 쳐다 보며 서로 다른 밀도의 무작위 빛이 주변 시야에서 깜박인다. 환자는 버튼이나 다른 수단을 눌러 빛을 볼 수 있음을 나타낸다. 본 출원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있는 시야 테스트는 예를 들어 암슬러 (Amsler) 격자 테스트, 대면 테스트, 시야측정 테스트 및 탄젠트 스크린 테스트를 포함한다.
한 양상에서, 본 출원은 본 명세서에 기재된 눈 혈관 질환을 가지는 대상체에서 시야를 증가시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 일반적으로, 이러한 방법들은 하나 이상의 ActRII 길항제 유효량을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 환자의 시야를 최소한 10% (예컨대, 최소한 15%, 최소한 20%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 80%, 최소한 90%) 만큼 증가시키기 위한 수단을 제공한다.
비효율적인 적혈구 생성의 가장 흔한 원인은 지중해빈혈 증후군으로, 이는 손상되지 않은 알파- 및 베타- 헤모글로빈 쇄의 생성 불균형이 적혈모구 성숙 과정동안 증가된 세포사멸을 초래하는 유전적 헤모글로빈 병증이다 (Schrier, 2002, Curr Opin Hematol 9:123-126). 지중해빈혈은 집합적으로 전세계적으로 가장 빈번한 유전 질환들 중 하나이며, 이의 역학적 패턴들의 변화에 의해 미국 및 전 세계 모두에서 증가하고 있는 공중 보건 문제에 기여할 것으로 예측되고 있다 (Vichinsky, 2005, Ann NY Acad Sci 1054:18-24). 지중해빈혈 증후군은 그 중증도에 따라 명명된다. 그러므로 α-지중해빈혈은 α-지중해빈혈 경증 (α-지중해빈혈 소인으로도 공지됨; 2개 α-글로빈 유전자 영향받음), 헤모글로빈 H 질병 (3개 α-글로빈 유전자 영향받음), 및 α-지중해빈혈 중증 (태아 수종으로도 공지됨; 4개의 α-글로빈 유전자 영향받음)을 포함한다. β-지중해빈혈은 β-지중해빈혈 경증 (β-지중해빈혈 소인으로도 공지됨; 1개의 β-글로빈 유전자 영향받음), β-지중해빈혈 중등도 (2개의 β-글로빈 유전자 영향받음), 헤모글로빈 E 지중해빈혈 (2개의 β-글로빈 유전자 영향받음), 그리고 β-지중해빈혈 중증 (쿨레이 (Cooley) 빈혈로도 공지됨; 2개의 β-글로빈 유전자 영향받음, β-글로빈 단백질이 완전히 없어짐)을 포함한다. β-지중해빈혈은 다수의 기관들에 영향을 미치며, 상당한 질환 및 사망률과 연관되어 있고, 현재 일생에 걸친 진료를 필요로 한다. 최근 몇 년 사이에 철분 킬레이트화와 함께 정기적인 수혈로 인하여 β -지중해빈혈 환자의 기대 수명이 증가했지만, 수혈 및 철분의 과도한 위장 흡수 모두로 인한 철 과다는 심각한 합병증들, 가령, 심장병, 혈전증, 생식선 기능저하증, 갑상선 기능 저하증, 당뇨병, 골다공증 및 골감소증을 일으킬 수 있다 (Rund 외, 2005, N Engl J Med 353:1135-1146). ActRII 길항제는, 선택적으로 하나 이상의 추가 지지 요법들과 병용하여, 지중해빈혈 증후군을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
ActRII 길항제는, 선택적으로 하나 이상의 추가 지지 요법들과 병용하여, 지중해빈혈 증후군 이외에도 비효율적인 적혈구생성 질환들을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 질환들에는 철적모구 빈혈 (선천성 또는 후천성); 적혈구형성이상 빈혈 (유형 I 및 II); 겸상 세포 빈혈; 유전성 공모양적혈구증; 피루베이트 키나아제 결핍증; 일정한 상태들, 가령, (선천성 질병들, 섭취 감소 또는 요구량 증가로 인한) 엽산염 결핍, (선천성 질병들, 악성 빈혈, 흡수 손상, 이자 기능부전, 또는 섭취 감소로 인한) 코발라민 결핍, 특정 약물들, 또는 설명할 수 없는 원인들 (선천성 적혈구형성이상 빈혈, 불응성 거대적혈모구 빈혈, 또는 적백혈병)에 의해 유발될 수 있는 거대적혈모구 빈혈; 골수섬유증 (골수 화생) 및 골수황폐증을 비롯한 골수로성 빈혈; 선천성 적혈구조혈 포르피린증; 및 납 중독이 포함된다.
골수형성이상 증후군 (MDS)은 골수 혈액 세포의 비효율적인 생성과 급성 골수성 백혈병으로의 변형 위험으로 특징되는 다양한 혈액 질환들의 집합체이다. MDS 환자들에서, 조혈 줄기 세포들은 건강한 적혈구들, 백혈구 세포들, 또는 혈소판으로 성숙하지 않는다. MDS 질환들에는, 예를 들면, 불응성 빈혈, 단선 형성이상증이 있는 불응성 혈구감소증 (RCUD), 고리 철적혈모구가 있는 불응성 빈혈 (RARS), 두드러진 혈소판증가증 관련된 고리 철적혈모구가 있는 불응성 빈혈 (RARS-T), 과다 모세포가 있는 불응성 빈혈 (RAEB-1), 과다 형질전환 모세포가 있는 불응성 빈혈 (RAEB-2), 다선 형성이상증이 있는 불응성 혈구감소증 (RCMD), 비분류 MDS (MDS-U), 및 단리된 5q 염색체 이상 관련 골수형성이상 증후군 [del(5q)가 있는 MDS]이 포함된다.
MDS 환자들은 적혈구 수준을 증가시키기 위하여 궁극적으로 혈액 수혈 및/또는 적혈구조혈 성장 인자들 (예컨대, ESA, 가령, EPO) 단독으로 또는 집락-자극 인자 [예컨대, 과립구 집락-자극 인자 (G-CSF)의 유사체, 가령, 필그라스팀 또는 과립구 대식세포 집락-자극 인자 (GM-GSF)의 유사체, 가령, 사그라모스팀]와의 조합을 이용한 치료를 필요로 한다. 수혈 빈도는 질병 정도 및 동반질환의 존재에 따라 달라진다. 만성 수혈은 헤모글로빈 수준을 증가시키고, 결과적으로 뇌와 주변 조직 산소공급을 개선시킴으로써, 신체 활성 및 정신적 각성도를 개선시키는 것으로 공지되어 있다. 그러나 많은 MDS 환자들은 이러한 치료법들을 사용하면 부작용이 발달한다. 예를 들면, 빈번하게 적혈구 수혈을 받은 환자들은 철 축적 및 독성의 활성 산소종 생성으로 인한 조직 및 기관 손상을 발달시킬 수 있다. 따라서, 본 출원의 하나 이상의 ActRII 길항제 물질들 (예컨대, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)은, 선택적으로 EPO 수용체 활성화제와 조합하여, MDS 또는 철적모구 빈혈 환자들을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, MDS 또는 철적모구 빈혈을 앓는 환자들은 본 출원의 하나 이상의 ActRII 길항제 물질 (예컨대, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등)을, 선택적으로 EPO 수용체 활성화제와 조합하여 사용하여 치료될 수 있다. 다른 구체예들에서, MDS 또는 철적모구 빈혈을 앓는 환자들은 본 출원의 하나 이상의 ActRII 길항제 물질 (예컨대, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩 등) 및 MDS를 치료하기 위한 하나 이상의 추가 치료제를 병용 사용하여 치료될 수 있으며, 이러한 추가 치료제에는, 예를 들면, ESA; 필그라스팀을 비롯한 G-CSF 유사체; 사그라모스팀을 비롯한 GM-CSF 유사체; 레날리도마이드; 탈리도마이드; 포말리도마이드; 아자시티딘 및 데시타빈을 비롯한 저메틸화제; 데페록사민 및 데페라시록스를 비롯한 철분-킬레이트화제; 로미플로스팀 및 엘트롬보팍을 비롯한 트롬보포이에틴 모방체; 시타라빈 (ara-C) 단독 또는 이다루비신, 포토테칸, 또는 플루다라빈과의 조합을 비롯한 화학치료제; 항가슴샘세포 글로불린, 알렘투주마브, 및 사이클로스포린을 비롯한 면역억제제; 보리노스타트, 발프로산, 페닐부티레이트, 엔티노스타트, MGCD0103, 및 기타 클래스 I 핵 HDAC 억제제, 클래스 II 비-핵 HDAC 억제제, 팬(pan) HDAC 억제제 및 아이소형-특이적 HDAC 억제제를 비롯한 히스톤 탈아세틸화효소 억제제 (HDAC 억제제); 티피파르니브 및 로나파르니브를 비롯한 파르네실전달효소 억제제; 에타네르셉트 또는 인플릭시맙을 비롯한 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 억제제; 에자티오스타트를 비롯한 글루타티온-S-전달효소 (GST) P1-1의 억제제; 및 젬투주맙 오조가마이신을 비롯한 CD33의 억제제가 포함된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 고리 철적혈모구를 나타내는 환자들은 ActRII 길항제를 이용한 치료에 특히 적합할 수 있다. 철적모구 빈혈은 광범위하게는 선천성 (inherited) 및 후천성 형태들로 분류될 수 있으며, 이는 표 1에 나타낸 바와 같이 더욱 세분화 될 수 있다.
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* Bottomley 외., 2014, Hematol Oncol Clin N Am 28:653-670 참조.
** 세계 보건 기구에 따른 MDS 하위분류에 관한 하기 표 참조.
최근 몇 년간 MDS에서 반복적으로 돌연변이가 발생하는 수십 개의 유전자를 밝혀내는 새로운 시퀀싱 기술이 등장했다. 유형별로 분류된 이러한 유전자들의 2013년 목록을 표 3에 나타낸다. MDS가 있는 거의 모든 환자에서 이러한 돌연변이가 하나 이상 발견될 수 있으며, 치료에 영향을 미치지는 않았지만 MDS가 어떻게 발전하고 진화하는지를 더 잘 이해하게 되었다. MDS 환자 샘플에 전체 게놈 시퀀싱을 적용하여 mRNA 스플라이싱 (스플라이소좀) 인자들을 인코딩하는 완전히 새로운 분류의 암-관련 유전자들을 확인하였다. MDS에서 확인된 첫번째 이러한 유전자는 SF3B1이었는데, 이는 특히 RARS 환자들에서 빈번하게 돌연변이된다 [Papaemmanuil 외. (2011) N Engl J Med 365:1384-1395]. 돌연변이된 유전자들의 다른 주요 범주들은 후성 (DNA 메틸화) 조절인자, 전사 인자들, 및 신호전달 분자들이다 [Cazzola 외. (2013) Blood 122:4021-4034; Bejar 외. (2014) Blood 124:2793-2803]. 이러한 돌연변이가 MDS 환자들에서 함께 발생되는 정도는 유전자 유형에 따라 달라지는 것으로 보인다. 예를 들면, 대략 50%의 MDS 환자들은 지금까지 돌연변이 스플라이싱 인자들을 인코딩하는 것으로 확인된 10개의 유전자들 중 하나를 보유하지만, 이러한 돌연변이 유전자들은 동일한 환자에서 동시 발생하는 일이 드물다 [Bejar 외. (2014) Blood 124:2793-2803]. 그러므로 이러한 돌연변이 유전자들은 동일한 개체들에서의 중복 표지가 거의 없다. 돌연변이 후성 조절인자들을 인코딩하는 유전자들은 동일한 환자에서 서로 간에 그리고 돌연변이 스플라이싱 인자 유전자들과 함께 더욱 빈번하게 동시 발생한다. 본 명세서에 논의된 바와 같이, 돌연변이 유전자들, 가령, 표 3에 열거된 유전자들의 서로 다른 발생은 MDS 또는 철적모구 빈혈 환자들이 ActRII 길항제에 대해 치료적으로 반응성이거나 비반응성일 가능성이 있는지를 예측함에 도움이 될 수 잇는 유전적 특성을 제공한다.
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Figure pct00019
* Tothova 외. (2013) Clin Cancer Res 19:1637-1643 참조.
표 3에 열거된 유전자들 중에서, 스플라이싱 인자 3B1 (SF3B1)을 인코딩하는 유전자는 최근 MDS, 특히, RARS, RARS-T, 및RCMD-RS 하위유형들에서 중요하게 연관되는 것으로 밝혀졌다 [Malcovati 외. (2011) Blood 118:6239-6246; Dolatshad 외. (2014) Leukemia doi: 10.1038/leu.2014.331 인쇄 전 전자 간행물]. SF3B1에서의 체세포 돌연변이는 또한 만성 림프구 백혈병 (CLL), 및 급성 골수성 백혈병 (AML)을 비롯한 혈액암, 뿐만 아니라 유방암, 이자 암, 위암, 전립선 암, 및 포도막 흑색종에서 발생한다 [Malcovati 외. (2011) Blood 118:6239-6246; Wang 외. (2011) N Engl J Med 365:2497-2506; The Cancer Genome Atlas Network (2012) Nature 490:61-70; Biankin 외. (2012) Nature 491:399-405; Chesnais 외. (2012) Oncotarget 3:1284-1293; Furney 외. (2013) Cancer Discov 3:1122-1129; Je 외. (2013) Int J Cancer 133:260-266]. 많은 수가 단백질 내 몇몇 위치들에서 무더기를 형성하는 SF3B1 돌연변이의 스펙트럼이 고농도의 플라디에놀라이드에 노출된 임상 샘플 또는 세포주에서 확인되었다 [Webb 외. (2013) Drug Discov Today 18:43-49]. MDS에서 확인된 SF3B1 돌연변이에는, 예를 들면, K182E, E491G, R590K, E592K, R625C, R625G, N626D, N626S, H662Y, T663A, K666M, K666Q, K666R, Q670E, G676D, V701I, I704N, I704V, G740R, A744P, D781G, 및 A1188V가 포함된다. 암에서 확인된 SF3B1 돌연변이에는, 예를 들면, N619K, N626H, N626Y, R630S, I704T, G740E, K741N, G742D, D894G, Q903R, R1041H, 및 I1241T가 포함된다. 마지막으로, MDS와 암 모두에서 발견된 SF3B1 돌연변이에는, 예를 들면, G347V, E622D, Y623C, R625H, R625L, H662D, H662Q, T663I, K666E, K666N, K666T, K700E, 및 V701F가 포함된다.
본 출원의 한 구체예에서, ActRII 길항제는 예컨대, 고리 철적혈모구가 있는 불응성 빈혈 (RARS), 두드러진 혈소판증가증 관련 RARS (RARS-T), 또는 다선 형성이상증이 있는 불응성 혈구감소증 (RCMD, 고리 철적혈모구가 현저한 환자들에서 RCMD-RS로도 공지됨)에서 적혈구 전구체들의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상이 고리 철적혈모구인 철적모구 빈혈 환자 또는 MDS 환자들을 비롯한 환자들의 눈 혈관 질환을 치료함에 유용하다.
수많은 유전자들이 고전적인 겸상 세포 질병 (SCD; 겸상적혈구증)의 원인이 된다. 주로, 겸상 세포 질병은 β-글로빈 유전자에서의 돌연변이 (코돈 6에서 글루타메이트의 발린으로의 돌연변이)에 의해 유발되는 선천성 질환이다. 예컨대, Kassim et al. (2013) Annu Rev Med, 64: 451-466 참조. 겸상-세포 빈혈은 겸상 세포 질병 중 가장 흔한 형태를 지칭하며, β S 대립유전자 (HbSS)에서 동형접합 돌연변이를 가지며, 겸상 세포 질병을 보유한 사람들의 60 내지 70%에 영향을 준다. β-글로빈 유전자에서의 돌연변이로 인하여, 산소제거된 상태로 존재할 때 노출되는 소수성 모티프를 가진 비정상적인 헤모글로빈 분자들이 생성된다 [예컨대, Eaton 외. (1990) Adv Protein Chem, 40: 63-279; Steinberg, MH (1999) N Engl J Med 340(13): 1021-1030; 및 Ballas 외. (1992) Blood, 79(8): 2154-63 참조]. 일단 노출되면, 별도의 헤모글로빈 분자들의 사슬들이 중합하고, 이는 적혈구 막에 대한 손상 및 세포 탈수를 가져온다. 막 손상은, 부분적으로는, 막 지질의 재분포에 의해 나타나는데, 이는 적혈구 막의 외층 (outer leaflet)에서 포르파티딜세린을 발현시킨다 [예컨대, (2002) Blood 99(5): 1564-1571 참조]. 외부화된 포스파티딜세린은 대식세포 및 활성화된 내피세포들 모두에 대한 부착을 촉진시키고, 이는 혈관 (vaso) 폐색의 원인이 된다. 그러므로 저 산소 상태에서, 적혈구의 헤모글로빈은 긴 결정들로 침전되어, 연장된 형태가 유발되고, 이는 형태학적으로 "겸상" 적혈구로 전환된다. 유전자형 및 탈산소화 정도와 등급 모두 헤모글로빈 중합의 중증도의 원인이 된다. 태아 헤모글로빈의 존재는 병리학적 헤모글로빈 폴리머의 양을 비례적으로 감소시키며 혈관-폐색 위험으로부터 보호함이 입증되었다.
겸상 세포 질병 환자들 대다수를 위한 치료의 주축은 지지요법이다. 겸상 세포 질병 환자들의 현재 치료 방법들에는 항생제, 통증 관리 [예컨대, 하나 이상의 마약, 비-스테로이드 항-염증성 약물, 및/또는 코르티코스테로이드제를 이용한 치료), 정맥내 체액, 혈액 수혈, 수술, 철 킬레이트화 요법 (예컨대, 데페록사민) 및 하이드록시우레아 (예컨대 Droxia®)]가 포함된다. 일부 구체예들에서, 본 출원의 하나 이상의 ActRII 길항제 물질들 (예컨대, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 등)은 , 겸상 세포 질병을 치료하기 위한 하나 이상의 추가 제제들 및 지지 요법들 (예컨대, 하나 이상의 마약, 비-스테로이드 항-염증성 약물, 및/또는 코르티코스테로이드제를 이용한 치료), 정맥내 체액, 혈액 수혈, 수술, 철 킬레이트화 요법 (예컨대, 데페록사민 및 하이드록시우레아)과 조합하여 필요로 하는 환자들에서 겸상 세포 질병을 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 출원은 본 출원의 하나 이상의 하나 이상의 ActRII 길항제 [예컨대, ActRIIA 폴리펩티드 뿐만 아니라 이의 변이체들 (예컨대 GDF 트랩)]로 치료받았던, 또는 치료될 후보인 환자를, 환자의 하나 이상의 혈액학적 매개변수들을 측정함으로써 관리하는 방법들을 제공한다. 이러한 혈액학적 매개변수들은 본 출원의 상기 길항제로 치료될 후보인 환자에 대한 적절한 투여량을 평가하기 위해, 치료하는 동안 상기 혈액학적 매개변수들을 모니터링하기 위해, 본 출원의 상기 하나 이상의 길항제들로 치료하는 동안 투여량을 조절해야하는지 여부를 평가하기 위해, 및/또는 본 출원의 상기 하나 이상의 길항제들의 적절한 유지 용량을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 하나 이상의 혈액학적 매개변수들이 정상 수준에서 벗어난 경우, 하나 이상의 ActRII 길항제 투약은 감소되거나, 지연되거나, 또는 종료될 수 있다.
본 명세서에 제공되는 방법들에 따라 측정될 수 있는 혈액학적 매개변수들에는, 예를 들면, 적혈구 수준, 혈압, 철 저장량, 및 해당 기술 분야에 공지된 방법들을 사용하여, 증가된 적혈구 수준과 관계 있는 체액들에서 발견되는 다른 제제들이 포함된다. 이러한 매개변수들은 환자의 혈액 샘플을 사용하여 결정될 수 있다. 적혈구 수준, 헤모글로빈 수준, 및/또는 적혈구용적률 수준의 증가는 혈압의 증가를 유발할 수 있다.
한 구체예에서, 하나 이상의 ActRII 길항제로 치료될 후보인 환자에서 하나 이상의 혈액학적 매개변수들이 정상 범위에서 벗어나거나 정상의 높은 쪽에 존재하는 경우, 상기 하나 이상의 길항제의 투여 시작은 혈액학적 매개변수들이 정상 또는, 자연적으로 또는 치료적 개입을 통해 허용가능한 수준으로 다시 돌아갈 때까지 지연될 수 있다. 예를 들면, 후보 환자가 고혈압 또는 고혈압 전단계인 경우, 이 환자는 환자의 혈압을 감소시키기 위하여 혈압 저하제로 치료될 수 있다. 예를 들면, 이뇨제, (알파 차단제 및 베타 차단제를 비롯한) 아드레날린 억제제, 혈관확장제, 칼슘 채널 차단제, 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제, 또는 안지오텐신 II 수용체 차단제를 비롯하여, 개개인 환자들의 조건에 적합한 임의의 혈압 저하제가 사용될 수 있다. 혈압은 대안적으로 식이 및 운동요법을 사용하여 치료될 수 있다. 유사하게, 후보 환자가 정상 보다 낮은, 또는 정상에서 낮은 쪽의 철 저장량을 가지는 경우, 이 환자는 환자의 철 저장량이 정상 또는 허용가능한 수준으로 다시 돌아갈 때까지 적절한 식이 요법 및/또는 철 보충제로 치료될 수 있다. 정상보다 높은 적혈구 수준 및/또는 헤모글로빈 수준을 가지는 환자들의 경우, 본 출원의 상기 하나 이상의 길항제 투여는 이러한 수준이 정상 또는 허용가능한 수준으로 다시 돌아갈 때까지 지연될 수 있다.
특정 구체예에서, 하나 이상의 ActRII 길항제로 치료될 후보인 환자에서 하나 이상의 혈액학적 매개변수들이 정상 범위에서 벗어나거나 정상의 높은 쪽에 존재하는 경우, 투여 시작은 지연되지 않을 수 있다. 그러나, 하나 이상의 길항제의 투여량 또는 투여 빈도는 본 출원의 상기 하나 이상의 길항제의 투여시 상승하는 혈액학적 매개변수들의 허용될 수 없는 증가 위험을 감소시키는 양으로 설정될 수 있다. 대안적으로, 해당 환자를 위해 하나 이상의 ActRII 길항제 물질들 (예컨대, GDF-ActRII 길항제, ActRIIA 폴리펩티드, ActRIIB 폴리펩티드, GDF 트랩, 등)을 바람직하지 않은 혈액학적 매개변수 수준을 해결하는 치료제와 조합하는 치료 요법 (therapeutic regimen)을 개발할 수 있다. 예를 들면, 환자가 상승된 혈압을 가지는 경우, 하나 이상의 ActRII 길항제와 혈압 저하제의 투여를 포함하는 치료 요법을 설계할 수 있다. 바람직한 철 저장량 보다 낮은 양을 가지는 환자의 경우, 하나 이상의 ActRII 길항제 및 철 보충을 포함하는 치료 요법을 개발할 수 있다.
한 구체예에서, 하나 이상의 ActRII 길항제 물질로 치료될 후보인 환자에 대하여 하나 이상의 혈액학적 매개변수들에 관한 기준선 매개변수(들)을 결정할 수 있으며 상기 기준선 값(들)을 기준으로 해당 환자에 대해 적절한 투약 요법을 결정할 수 있다. 대안적으로, 환자의 의학 병력에 기초하여 결정된 기준선 매개변수들은 해당 환자에 대한 적절한 길항제 투약 요법에 관한 정보를 알아내기 위해 사용될 수 있을 것이다. 예를 들면, 건강한 환자가 정의된 정상 범위 이상인, 결정된 기준선 혈압 판독값을 가지는 경우, 환자의 혈압을 본 출원의 하나 이상의 길항제로 치료전 일반 모집단에서 정상으로 고려되는 범위로 되게 할 필요는 없다. 하나 이상의 ActRII 길항제로 치료하기 전 하나 이상의 혈액학적 매개변수들에 관한 환자들의 기준선 값들은 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 길항제로 치료하는 동안 상기 혈액학적 매개변수들에 대한 임의의 변화를 모니터링하기 위한 관련 비교값으로 사용될 수도 있다.
특정 구체예에서, 하나 이상의 혈액학적 매개변수들은 하나 이상의 ActRII 길항제로 치료될 환자들에서 측정된다. 이러한 혈액학적 매개변수들은 치료하는 동안 환자를 모니터링하기 위해 사용되어, 본 출원의 하나 이상의 길항제의 투약 또는 또 다른 치료제를 이용한 추가 투약의 조절 또는 종료를 가능하게 할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 ActRII 길항제의 투여가 혈압, 적혈구 수준, 또는 헤모글로빈 수준의 증가, 또는 철 저장량의 감소를 가져오는 경우, 본 출원의 하나 이상의 길항제의 투약은 상기 하나 이상의 혈액학적 매개변수들에 대한 본 출원의 하나 이상의 길항제의 효과를 감소시키기 위하여 그 양 또는 빈도가 감소될 수 있다. 하나 이상의 ActRII 길항제의 투여가 환자에게 불리한 하나 이상의 혈액학적 매개변수들의 변화를 가져오는 경우, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 길항제의 투약은 상기 혈액학적 매개변수(들)가 허용가능한 수준으로 다시 돌아갈 때까지 일시적으로, 또는 영구적으로 종료될 수 있다. 유사하게, 하나 이상의 혈액학적 매개변수들이 본 명세서에 기재된 하나 이상의 길항제의 투여량 또는 투여 빈도를 감소시킨 후 허용가능한 범위에 속하게 되지 않는 경우, 투약은 종료될 수 있다. 본 출원에 기재된 하나 이상의 길항제를 이용한 투약을 감소 또는 종료하는 것에 대한 대안으로 또는 이에 더하여, 환자는 바람직하지 않은 혈액학적 매개변수(들) 수준을 해결하는 추가 치료제, 가령, 예를 들면, 혈압 저하제 또는 철 보충제가 투약될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 ActRII 길항제로 치료되는 환자의 혈압이 상승되는 경우, 본 출원의 하나 이상의 길항제 투약은 동일한 수준으로 지속시키고 혈압-저하제가 하나 이상의 길항제를 이용한 투약 (예컨대, 양 및/또는 빈도) 또는 상기 치료 요법에 추가되고 그리고 혈압-저하제가 이러한 치료 요법에 추가되거나, 또는 하나 이상의 길항제를 이용한 투약이 종료될 수 있고 이 환자는 혈압-저하제로 치료될 수 있다.
6. 약학 조성물
특정 양상들에서, 본 출원의 하나 이상의 ActRII 길항제는 약학적 배합물 (치료 조성물 또는 약학적 조성물로서도 지칭됨)의 구성성분으로서 또는 단독으로 투여될 수 있다. 약학적 배합물은 이 안에 포함된 활성 성분 (가령, 본 명세서의 물질)의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하고, 그리고 이 배합물이 투여될 예정인 대상에 대하여 허용불가능한 독성이 있는 추가 성분들을 내포하지 않는 형태의 제제를 지칭한다. 대상 화합물은 인간 또는 동물용 의약에 사용하기 위한 임의의 편리한 방법으로 투여하기 위해 제형화 될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 물질들은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 활성 성분이외에 약학적 배합물 안에 있는 성분을 말하며, 일반적으로 대상에게 비독성이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 및/또는 보존제다. 일반적으로, 본 명세서에 이용되는 약학적 배합물은 대상에게 투여될 때, 발열원이 없고, 생리학적으로-수용가능한 형태이다. 본 명세서에서 설명된 것들 이외의 치료에 유용한 물질은 상기에서 설명된 바와 같이, 본 명세서의 방법에서 해당 물질과 복합 투여될 수 있다.
전형적으로, 화합물들은, 예컨대, 국소 투여, 안구내 (예컨대, 유리체강내) 주사에 의해, 또는 이식물 또는 장치에 의한 방법으로 눈에 투여될 것이다. 유리체강내 주사는, 예를 들면, 유리체를 통해, 가장자리에서 3 mm 내지 4 mm 후방에 주사될 수 있다. 눈에 투여하기 위한 약학적 조성물은, 예를 들면, 점안약, 안과용 용액, 안과용 현탁액, 안과용 유탁액, 유리체강내 주사, 테논낭하 (sub-Tenon) 주사, 안과용 생분해성 이식물, 및 비-생분해성 안과용 삽입물 또는 데포를 비롯한 다양한 방식으로 제형화될 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 화합물들은 비경구 [예컨대, 정맥 (I.V.) 주사, 동맥내 주사, 골내 주입, 근육 주사, 척수강 내 주사, 피하 주사 또는 피내 주사]로 투여될 것이다.
안구 또는 비경구 투여에 적합한 약학 조성물들은 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 물질들과 하나 이상의 약학적으로 허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비수용액, 분산액, 현탁액 또는 유화액, 또는 사용 직전에 멸균 용액 또는 분산액으로 재구성 될 수 있는 멸균 분말을 포함할 수 있다. 용액 또는 분산액은 항산화제, 완충액, 세균발육억제제, 현탁제, 증점제 또는 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있다. 본 발명의 약학적 배합물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일 (예: 올리브 오일), 주사가능한 유기 에스테르 (예, 에틸 올리에이트) 및 이들의 적합한 혼합물을 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅 물질 (예컨대, 레시틴)의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 그리고 계면 활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
일부 구체예들에 있어서, 본 명세서의 치료 방법은 상기 약학 조성물을 전신 투여하거나, 또는 이식물 또는 장치로부터 국소적으로 투여하는 것을 포함한다. 또한, 상기 약학 조성물은 표적 조직 부위 (가령, 골수 또는 근육)에 운반하기 위한 형태에 포집되거나 또는 주입될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서의 조성물은 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 물질을 표적 조직 부위 (가령, 골수 또는 근육)로 운반할 수 있는 기질을 포함할 수 있는데, 이 기질은 발생 조직에 대한 구조를 제공하고, 선택적으로 체내로 최적으로 흡수될 수 있다. 예를 들면, 상기 기질은 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 물질의 지연 방출을 제공할 수 있다. 이러한 기질은 다른 이식된 의학 용도에 현재 사용되는 재질로 형성될 수 있다.
기질 재질은 생체적합성, 생분해성, 기계적 성질, 미용적 외관 및 경계면 성질중 하나 또는 그 이상에 의해 선택될 수 있다. 해당 조성물의 특정 용도가 적절한 제형을 결정할 것이다. 상기 조성물에 대한 가능한 기질은 생분해가능하며, 화학적으로 황산칼슘, 인산삼칼슘, 하이드록시아파타이트, 폴리락트산 및 폴리안하이드리드로 규정될 수 있다. 다른 가능한 물질은, 예를 들면, 뼈 또는 피부 콜라겐을 비롯한, 생분해가능하며, 생물학적으로 잘 규정된 물질이다. 또한 기질은 순수 단백질 또는 세포외 기질 성분들로 구성된다. 다른 가능한 기질은 비-생분해성이며, 화학적으로 예를 들면, 소결된 하이드록시아파타이트, 바이오글라스, 알루미네이트 또는 기타 세라믹을 비롯한 것으로 화학적으로 규정된다. 기질은 예를 들면, 폴리락트산 및 하이드록시아파타이트 또는 콜라겐 및 인산삼칼슘을 포함하는 전술한 유형의 물질의 조합을 포함할 수도 있다. 바이오 세라믹은 공극 크기, 입자 크기, 입자 형태 및 생분해성중 하나 또는 그 이상을 변경시키기 위하여 조성물(예, 칼슘-알루미네이트-포스페이트) 및 공정이 변경될 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서의 약학 조성물들은 예를 들면, 캡슐, 카시에(cachets), 알약, 테블릿, 로젠지(착향 베이스, 이를 테면 슈크로스 및 아카시아 또는 트라가탄 이용), 분말, 과립, 또는 수성 또는 비-수성 액체에 용액 또는 현탁액, 수중유(oil-in-water) 또는 유중수(water-in-oil) 유탁액, 또는 엘릭시르(elixir) 또는 시럽, 또는 캔디 (비활성 베이스, 이를 테면 젤라틴 및 글리세린, 또는 슈크로스 및 아카시아 이용), 및/또는 구강 세척제로 경구 투여될 수 있는데, 이들 각각은 본 명세서의 사전 결정된 양의 화합물 및 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 활성 성분을 함유한다. 본 명세서의 화합물 및 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 다른 활성 성분은 또한 볼루스(bolus), 연질약(electuary), 또는 페이스트로 또한 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 투약형 (가령, 캡슐, 테블릿, 알약, 당의정, 분말 및 과립)에서, 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 화합물은 예를 들면, 구연산나트륨, 인산이칼슘, 충전제 또는 증량제(extender) (가령, 전분, 락토스, 슈크로스, 포도당, 만니톨, 및 실리카산), 결합제 (가령, 카르복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 슈크로스, 및 아카시아), 습윤제 (가령, 글리세롤), 붕해 물질 (가령, 한천-한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 실리케이트, 및 탄산 나트륨), 용액 완염제 (가령, 파라핀), 흡수 가속화제 (가령, 4차 암모니움 화합물), 습윤제 (가령, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트), 흡습제 (가령, 카올린 및 벤토나이트 진흙), 윤활제 (가령, 활석, 스테아레이트 칼슘, 스테아레이트 마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 라우릴 술페이트 나트륨), 발색제, 및 이의 혼합물을 포함하는 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합될 수 있다. 캡슐, 테블릿 및 알약의 경우, 상기 약학적 배합물 (조성물)은 완충제를 또한 포함할 수 있다. 유사한 형태의 고체 조성물은 가령, 락토스 또는 유당을 포함하는 하나 또는 그 이상의 부형제 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 연질 및 경질 충전된 젤라틴 캡슐 안에 충전물로 이용될 수 있다.
상기 약학 조성물의 경구 투여를 위한 액체 투약형은 약학적으로 허용가능한 유탁액, 마이크로유탁액, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함할 수 있다. 활성 성분(들)에 추가하여, 액체 투약형은 해당 분야에서 통상적으로 이용하는 비활성 희석액, 예를 들면, 물 또는 기타 용매, 가용화 물질 및/또는 유화제 [가령, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 또는 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (가령, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 검, 올리브, 피마자, 및 참깨유), 글리세롤, 테트라히드로퓨릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 및 이의 혼합물]을 포함할 수 있다. 비활성 희석제 이외에, 경구 제형은 예를 들면, 가습 물질, 유화 및 현탁 물질, 감미 물질, 풍미 물질, 발색제, 향료 물질, 보존 물질, 및 이의 조합들을 포함하는 어쥬번트를 또한 포함할 수 있다.
현탁액은 활성 화합물 이외에, 예를 들어 에톡시화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로즈, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 한천-한천, 트라가탄 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
미생물의 작용 및/또는 성장의 예방은 파라벤, 클로로부탄올 및 페놀 소르브산을 비롯한 다양한 항박테리아 및 항진균제를 포함시킴으로써 확보될 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 조성물에 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 등장화제를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 예를 들어, 모노스테아르산 알루미늄 및 젤라틴을 포함하는 흡수를 지연시키는 물질을 포함시킴으로써 주사가능한 약형의 장기 흡수가 이루어질 수 있다.
투여 섭생은 본 발명의 하나 이상의 물질의 작용을 변형시키는 다양한 인자를 고려하는 주치의에 의해 결정될 것이다. 환자의 적혈구 수, 헤모글로빈 수치, 원하는 목표 적혈구 수, 환자의 나이, 환자의 식단, 억제된 적혈구 세포 수준에 원인이 될 수 있는 질병의 중증도, 기여할 수 있는 질병의 중증도, 투여 시간 및 다른 임상 인자들을 비롯한 다양한 인자들을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 최종 조성물에 기타 공지의 활성 물질을 추가하면 이 약형에 또한 영향을 줄 수 있다. 적혈구 수준, 헤모글로빈 수준, 망상세포 수준, 및 조혈 과정의 다른 지표 중 하나 또는 그 이상을 주기적 측정하여 진행을 모니터할 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서는 본 명세서에 따른 하나 또는 그 이상의 물질의 생체내 생산을 위한 유전자 요법을 또한 제공한다. 그러한 치료는 상기 나열된 바와 같은 하나 이상의 장애를 갖는 세포 또는 조직 내로 약물 서열을 도입함으로써 그의 치료 효과를 얻을 수 있다. 상기 물질 서열의 전달은 예를 들어, 키메라 바이러스 또는 콜로이드성 분산 시스템과 같은 재조합 발현 벡터를 사용하여 달성 될 수 있다. 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 물질 서열의 바람직한 치료 전달은 표적화된 리포좀을 사용하는 것이다.
본 명세서에서 교시된 바와 같이, 유전자 요법에 이용될 수 있는 다양한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 유두종, 또는 RNA 바이러스 (가령, 레트로바이러스)를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 뮤린 또는 조류 레트로바이러스의 유도체일 수 있다. 단일 외부 유전자가 삽입될 수 있는 레트로바이러스 벡터의 예로는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMuLV), 하베이 뮤린 육종 바이러스 (HaMuSV), 뮤린 유방 종양 바이러스 (MuMTV), 및 라우스 육종 바이러스 (RSV). 다수의 추가 레트로바이러스 벡터가 다중 유전자를 혼입할 수 있다. 이들 모든 벡터는 선택가능한 표지의 유전자를 전달 또는 혼입하여, 형질유도된 세포를 식별 및 생성할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 예를 들면, 당, 당지질, 또는 단백질을 부착시킴으로써, 표적-특이적으로 만들어질 수 있다. 항체를 이용한 바람직한 표적화가 이루어진다. 숙련된 기술자는 특이적 폴리뉴클레오티드 서열을 레트로바이러스 게놈 안에 삽입시키거나 또는 바이러스 외피에 부착시켜, 본 명세서의 하나 또는 그 이상의 물질을 함유하는 레트로바이러스 벡터의 표적 특이적 운반이 가능하다는 것을 인지할 것이다.
대안으로, 조직 배양 세포는 통상적인 인산칼슘 형질감염에 의해 레트로바이러스 구조 유전자 (gag, pol, 및 env)를 인코드하는 플라스미드로 직접적으로 형질감염될 수 있다. 이들 세포는 관심 대상의 유전자를 함유하는 벡터 플라스미드로 형질감염된다. 생성 세포는 레트로바이러스 벡터를 배양 배지로 방출한다.
본 발명의 하나 또는 그 이상의 물질에 대한 또다른 표적화된 전달 시스템은 콜로이드성 분산 시스템이다. 콜로이드성 분산 시스템은 예를 들면, 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 그리고 수중유 유탁액, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서의 바람직한 콜로이드 시스템은 리포좀이다. 리포좀은 인공 막 소포로, 시험관 및 생체내 운반 운반체로 유용하다. RNA, DNA, 및 고유 비리온은 수성 내부에 포집되고, 생물학적 활성 형태로 세포로 운반된다 [Fraley, 외. (1981) Trends Biochem. Sci., 6:77 참조]. 리포좀 운반체를 사용하는 효율적인 유전자 절단 방법들은, 해당 기술분야에 공지이다 [예컨대, Mannino, 외.(1988) Biotechniques, 6:682, 1988 참조].
리포좀의 조성물은 통상 인지질의 조합으로, 스테로이드 (가령, 콜레스테롤)를 포함할 수 있다. 리포좀의 물리적 성질은 pH, 이온 강도 그리고 이가양이온 존재에 따라 달라진다. 다른 인지질 또는 다른 지질이 또한 이용될 수 있는데, 예를 들면 포스파티딜 화합물 (가령, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고리피드, 세레브로시드, 또는 강글리오시드), 난 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 및 디스테아로일포스파티딜콜린이 포함된다. 리포좀의 표적화는 예를 들면, 기관-특이성, 세포-특이성, 및 소기관-특이성에 기반을 두고, 해당 분야에 공지되어 있다.
실시예
지금부터 본 발명이 일반적으로 기술되며, 단지 본 발명의 특정 구체예 및 실시 양태는 예시하기 위한 목적으로 포함되는 것으로, 이에 본 발명을 제한하려는 의도는 아니며, 하기 실시 예를 참조함으로써 보다 용이하게 이해될 것이다.
실시예 1: ActRIIa-Fc 융합 단백질
출원인은 인간 또는 마우스 Fc 도메인에, 이들 사이에 최소 링커로 융합된 인간 ActRIIa의 세포외 도메인을 가지는 가용성 ActRIIA 융합 단백질을 작제하였다. 이 작제물들은 각각 ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc로서 지칭된다.
ActRIIA-hFc는 CHO 세포주로부터 정제된 것으로 하기와 같이 나타낸다 (서열 번호: 32):
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc 단백질들은 CHO 세포주에서 발현되었다. 3개의 상이한 리더 서열들이 고려되었다:
(i) 꿀벌 멜리틴 (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (서열 번호: 33)
(ii) 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (서열 번호: 34).
(iii) 고유: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (서열 번호: 35).
선택된 형태는 TPA 리더를 사용하며 다음과 같은 프로세스되지 않은 아미노산 서열을 가진다:
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열 번호: 36)
이 폴리펩티드는 다음 핵산 서열에 의해 인코딩된다:
ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCGGCGCCGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTCTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCGGAGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCCACCGGTGGTGGAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGTCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGAATTC (서열 번호: 37)
ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc 모두는 확실히 재조합 발현이 가능했다. 도 3에 도시된 바와 같이, 단백질은 하나의 잘 정의된 단백질 최고점으로 정제되었다. N-말단 시퀀싱은 ―ILGRSETQE (서열 번호: 22)의 하나의 서열을 나타내었다. 정제는 다음중 3개 또는 그 이상이 임의의 순서로 포함된 일련의 컬럼 크로마토그래피에 의해 실행될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 상기 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완성될 수 있다. ActRIIA-hFc 단백질은 크기 배제 크로마토그래피로 측정시 >98%, 그리고 SDS PAGE로 측정시 >95% 순도로 정제되었다.
ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc는 리간드들에 대한 높은 친화력을 보였다. GDF-11 또는 액티빈 A를 표준 아민-커플링 절차를 사용하는 Biacore™ CM5 칩 상에 고정시켰다. ActRIIA-hFc 및 ActRIIA-mFc 단백질들을 시스템에 적재하고 결합을 측정하였다. ActRIIA-hFc는 액티빈에 5 x 10-12의 해리 상수 (KD)로 결합되었으며, GDF11에 9.96 x 10-9의 KD로 결합되었다. 도 4를 참조하라. ActRIIA-mFc는 유사하게 거동하였다.
ActRIIA-hFc는 약동학 연구에서 매우 안정하였다. 래트들에게 1 mg/kg, 3 mg/kg, 또는 10 mg/kg의 ActRIIA-hFc 단백질을 투여하고, 단백질의 혈장 수준을 24, 48, 72, 144 및 168 시간에 측정하였다. 별도의 연구에서, 래트들에게 1 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 30 mg/kg를 투여하였다. 래트에서, ActRIIA-hFc는 11-14일의 혈청 반감기를 가졌으며, 약물의 순환 수준은 2주 후 상당히 높았다 (1 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 30 mg/kg의 초기 투여에 관하여 각각 11 μg/ml, 110 (μg/ml), 또는 304 (μg/ml)). 시노몰구스 원숭이들에서, 혈장 반감기는 실질적으로 14 일 보다 컸으며, 약물의 순환 수준은 1 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 30 mg/kg의 초기 투여에 관하여 각각 25 μg/ml, 304 (μg/ml), 또는 1440 (μg/ml)였다.
실시예 2: ActRIIA-hFc 단백질의 특성화
ActRIIA-hFc 융합 단백질은 서열 번호: 34의 조직 플라스미노겐 리더 서열을 사용하여 pAID4 벡터 (SV40 원점/인핸서, CMV 프로모터)로부터 안정하게 형질감염된 CHO-DUKX B11 세포들에서 발현되었다. 상기 실시예 1에서 기재한 바와 같이 정제된 단백질은 서열 번호: 32의 서열을 가졌다. Fc 부위는 서열 번호: 32에 나타낸 인간 IgG1 Fc 서열이다. 단백질 분석은 ActRIIA-hFc 융합 단백질이 이황화 결합을 보유한 동종이량체로 형성됨을 나타낸다.
CHO-세포-발현된 물질은 인간 293 세포들에서 발현된 ActRIIa-hFc 융합 단백질에 대해 보고되었던 친화력보다 액티빈 B 리간드에 대해 더 높은 친화력을 가진다 [del Re 외. (2004) J Biol Chem. 279(51):53126-53135 참조]. 또한, TPA 리더 서열을 사용하여 다른 리더 서열들 보다 더 많이 제조하였으며 고유 리더를 사용하여 발현된 ActRIIA-Fc와 달리, 매우 순도 높은 N-말단 서열을 제공하였다. 고유 리더 서열을 사용하여 각각 상이한 N-말단 서열을 가지는 ActRIIA-Fc의 2가지 주요 종들을 생성하였다.
실시예 3: 대체 ActRIIA-Fc 단백질들
본 명세서에 기재된 방법들에 따라 사용될 수 있는 다양한 ActRIIA 변이체들은 WO2006/012627로 공개된 국제 특허 출원에 기재되어 있으며 (예컨대, pp. 55-58 참조), 이 문헌의 전문은 본 명세서에 참고로 포함된다. 대안적 작제물은 C-말단 꼬리 (ActRIIA의 세포외 도메인의 마지막 15개 아미노산)의 결실을 가질 수 있다. 이러한 작제물에 관한 서열을 하기에 나타낸다 (Fc 부위 밑줄) (서열 번호: 39):
Figure pct00020
실시예 4: ActRIIB-Fc 융합 단백의 생성
출원인은 인간 또는 마우스 Fc 도메인에, 이들 사이에 최소 링커(3개의 글리신 아미노산)로 융합된 인간 ActRIIB의 세포외 도메인을 가지는 가용성 ActRIIB 융합 단백질을 작제하였다. 이 작제물들은 각각 ActRIIB-hFc 및 ActRIIB-mFc로서 지칭된다.
ActRIIB-hFc는 CHO 세포주로부터 정제된 것으로 하기와 같이 나타낸다 (서열 번호: 40):
Figure pct00021
ActRIIB-hFc 및 ActRIIB-mFc 단백질들은 CHO 세포주에서 발현되었다. 3개의 상이한 리더 서열들이 고려되었다: (i) 꿀벌 멜리틴 (HBML), ii) 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA), 및 (iii) 고유: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (서열 번호: 77).
선택된 형태는 TPA 리더를 사용하며 다음과 같은 프로세스되지 않은 아미노산 서열을 가진다 (서열 번호: 41):
Figure pct00022
이 폴리펩티드는 다음 핵산 서열 (서열 번호: 42)에 의해 인코딩된다:
Figure pct00023
Figure pct00024
CHO-세포-제조된 물질의 N-말단 시퀀싱은 ―GRGEAE (서열 번호: 43)의 주요 서열을 나타내었다. 명백하게, 문헌에 기재된 다른 작제물들은 ―SGR… 서열로 시작한다.
정제는 다음중 3개 또는 그 이상이 임의의 순서로 포함된 일련의 컬럼 크로마토그래피에 의해 실행될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 상기 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완성될 수 있다.
ActRIIB-Fc 융합 단백질은 또한 HEK293 세포들 및 COS 세포들에서 발현되었다. 모든 세포주 및 합당한 배양 조건들로부터 얻은 물질은 생체내 근육형성 활성을 가진 단백질을 제공하였으나, 아마도 세포주 선택 및/또는 배양 조건들과 관련하여 효능의 변동성이 관찰되었다.
출원인들은 ActRIIB의 세포외 도메인에서 일련의 돌연변이를 제조하였으며 세포외 ActRIIB와 Fc 도메인 사이에 가용성 융합 단백질로서 이들 돌연변이 단백질들을 제조하였다. 기준 ActRIIB-Fc 융합은 서열 번호: 40의 서열을 가진다.
N- 및 C-말단 절두들을 비롯한 다양한 돌연변이가 기준 ActRIIB-Fc 단백질에 도입되었다. 본 명세서에 제시된 데이터에 기초하여, TPA 리더를 사용하여 발현되는 경우 이들 작제물들은, N-말단 세린이 없을 것으로 예상된다. PCR 돌연변이유발에 의해 ActRIIB 세포외 도메인에 돌연변이들을 생성하였다. PCR 후, 단편들을 Qiagen 컬럼을 통해 정제하고, SfoI 및 AgeI로 분해하고 겔 정제하였다. 이들 단편들을 발현 벡터 pAID4 (see WO2006/012627)에 결찰시켜, 결찰시 인간 IgG1을 가지는 융합 키메라를 생성하였다. 대장균 (E. coli) M50 알파로 형질전환시, 집락들을 채취하여 DNA를 단리하였다. 쥐과 작제물 (mFc)을 위해, 인간 IgG1을 쥐과 IgG2a로 치환하였다. 모든 돌연변이들의 서열들을 확인하였다.
모든 돌연변이들이 일과성 형질감염에 의해 HEK293T 세포들에서 제조되었다. 요약하면, 500ml 스피너에서, HEK293T 세포들을 250ml 부피의 프리스타일 (Invitrogen) 배지에 6x105 세포들/ml로 셋업하고 하룻밤 성장시켰다. 다음날, 이들 세포들을 0.5 ug/ml의 최종 DNA 농도의 DNA:PEI (1:1) 복합체로 처리하였다. 4시간 후, 250 ml 배지를 추가하고 세포들을 7일 동안 성장시켰다. 세포들을 회전시켜 조정 배지를 수집하고 농축시켰다.
돌연변이들을, 예를 들면, 단백질 A 컬럼을 비롯한 다양한 기법들로 정제하고, 저 pH (3.0)의 글리신 완충액으로 용리시켰다. 중성화처리 후, 이들을 PBS에 대해 투석시켰다.
돌연변이들을 또한 유사한 방법으로 CHO 세포들에서 제조하였다. 돌연변이들을 WO 2008/097541 및 WO 2006/012627에 기재된 결합 분석 및/또는 생물분석법으로 테스트하였으며, 이 문헌들은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 일부 예들에서, 분석은 정제된 단백질들 보다는 조정 배지로 수행되었다. 또 다른 ActRIIB의 변이체들이 미국 특허 7,842,663호에 기재되어 있다.
출원인은 ActRIIB(25-131)-hFc 융합 단백질을 생성하였는데, 이는 고유 ActRIIB 리더에 대해 치환된 TPA 리더 서열이 N-말단에 그리고 최소 링커 (3개의 글리신 잔기들)를 통해 인간 Fc 도메인이 C-말단에 융합된, 말단 및 C-말단 절두 (고유 단백질 서열 번호: 1의 잔기들 25-131)된 인간 ActRIIB 세포외 도메인을 포함한다 (도 16). 이러한 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 도 17A 및 17B에 나타낸다. 출원인들은 코돈들을 변형시켰으며 초기 형질전환 발현 수준의 실질적 개선을 제공하였던 ActRIIB(25-131)-hFc 단백질을 인코딩하는 변이체 핵산을 발견하였다 (도 18).
성숙 단백질은 다음과 같은 아미노산 서열을 가진다 (N-말단은 N-말단 시퀀싱에 의해 확인됨)(서열 번호: 78):
Figure pct00025
Figure pct00026
아미노산 1-107은 ActRIIB에서 유래한 것이다.
발현된 분자를, 예를 들면, 다음 중 3 또는 그 이상을 임의의 순서로 포함하는, 일련의 컬럼 크로마토그래피 단계를 사용하여 정제하였다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 상기 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완성될 수 있다.
ActRIIB(25-131)-hFc 및 이의 전장 대응 (counterpart) ActRIIB(20-134)-hFc에 대한 몇 가지 리간드들의 친화력들을 Biacore™ 장치로 시험관내 평가하였으며, 그 결과를 아래 표에 요약한다. Kd값들은, k온 및 k오프를 정확하게 결정하지 못하게 하는 복합체의 매우 신속한 결합 및 해리로 인해 정상-상태 친화력 적합에 의해 수득되었다. ActRIIB(25-131)-hFc는 액티빈 A, 액티빈 B, 및 GDF11을 높은 친화력으로 결합시켰다.
ActRIIB-hFc 형태들의 리간드 친화력:
Figure pct00027
실시예 5: GDF 트랩의 생성
출원인들은 다음과 같이 GDF 트랩을 작제하였다. (서열 번호:1의 위치 79에서 류신이 아스파르테이트로 치환된 결과로서) GDF11 및/또는 미오스타틴에 비해 상당히 감소된 액티빈 A 결합을 가지는 ActRIIB의 변형된 세포외 도메인을 가지는 폴리펩티드 (L79D 치환을 가지는 서열 번호: 1의 아미노산 20-134)는 사이에 최소 링커 (3개의 글리신 아미노산)로 인간 또는 마우스 Fc 도메인에 융합되었다. 이 작제물들은 각각 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc 및 ActRIIB(L79D 20-134)-mFc로 지칭된다. 위치 79에 아스파르테이트가 아닌 글루타메이트를 이용한 대안적 형태들을 유사하게 실시하였다 (L79E). 서열 번호: 44에 있어서 위치 226에 발린이 아닌 알라닌을 이용한 하기 대안적 형태들을 또한 생성하였으며 모든 면에서 동등하게 테스트를 수행하였다. (서열 번호: 1에 관하여, 또는 서열 번호: 44에 대하여 위치 60) 아스파르테이트가 아래 두줄 밑줄로 표시된다. 서열 번호: 44에 대하여 위치 226의 발린 또한 아래 두줄 밑줄로 표시된다.
CHO 세포주 (서열 번호: 44)로부터 정제된 GDF 트랩 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc를 아래 나타낸다.
Figure pct00028
GDF 트랩의 ActRIIB-유래 부위는 아래 제시된 아미노산 서열을 가지며 (서열 번호: 45), 이 부위는 단량체로서 또는 단량체, 이량체, 또는 그 이상 차수의 복합체와 같은 비-Fc 융합 단백질로서 사용될 수 있을 것이다.
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT (서열 번호: 45)
GDF 트랩 단백질은 CHO 세포주에서 발현되었다. 3개의 상이한 리더 서열들이 고려되었다:
(i) 꿀벌 멜리틴 (HBML), (ii) 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA), 및 (iii) 고유.
선택된 형태는 TPA 리더를 사용하며 다음과 같은 프로세스되지 않은 아미노산 서열을 가진다:
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
(서열 번호: 46)
이 폴리펩티드는 다음 핵산 서열 (서열 번호: 47)에 의해 인코딩된다:
Figure pct00032
정제는 다음중 3개 또는 그 이상이 임의의 순서로 포함된 일련의 컬럼 크로마토그래피에 의해 실행될 수 있다: 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로즈 크로마토그래피, 페닐세파로즈 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 양이온 교환 크로마토그래피. 상기 정제는 바이러스 여과 및 완충액 교환으로 완성될 수 있다. 정제 도식의 한 예에서, 세포 배지를 단백질 A 컬럼을 통해 통과시키고, 150 mM Tris/NaCl (pH 8.0)로 세정한 후, 50 mM Tris/NaCl (pH 8.0)로 세정하고; pH 3.0의 0.1 M 글리신으로 용리시킨다. 바이러스 제거 단계로서 낮은 pH의 용리액을 실온에서 30분 동안 유지시킨다. 그 후 용리액을 중화시키고 Q-세파로즈 이온-교환 컬럼을 통과시키고 50 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCl으로 세척하고 150 mM 내지 300 mM 농도의 NaCl과 함께 50 mM Tris pH 8.0로 용리시킨다. 그 후 용리액을 50 mM Tris pH 8.0, 1.1 M 암모늄 설페이트로 교환하고 페닐 세파로즈 컬럼을 통과시키고, 세척하고, 150 내지 300 mM의 암모늄 설페이트와 함께 50 mM Tris pH 8.0에서 용리시킨다. 사용하기 위해 이 용리액을 투석하고 여과시킨다.
또 다른 GDF 트랩 (미오스타틴 또는 GDF11 결합에 비해 액티빈 A 결합의 비율을 감소시키기 위해 변형된 ActRIIB-Fc 융합 단백질)은 WO 2008/097541 및 WO 2006/012627에 기재되어 있으며, 이 문헌들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
실시예 6: GDF-11- 및 액티빈-매개 신호전달에 관한 생물학적분석법
A-204 리포터 유전자 분석법을 사용하여 GDF-11 및 액티빈 A에 의한 신호전달에 대한 ActRIIB-Fc 단백질들 및 GDF 트랩의 효과를 평가하였다. 세포주: 인간 횡문근육종 (근육에서 유래함). 리포터 벡터: pGL3(CAGA)12 (Dennler 외, 1998, EMBO 17: 3091-3100에 기재). CAGA12 모티프는 TGFβ-반응성 유전자 (예컨대, PAI-1 유전자)에 존재하며, 이 벡터는 SMAD2 및 SMAD3을 통한 신호생성 인자에 일반적으로 사용된다.
1일차: 48-웰 플레이트에 A-204 세포를 분열시킨다.
2일차: A-204 세포는 10 ug pGL3(CAGA)12 또는 pGL3(CAGA)12(10 ug)+pRLCMV (1 ug) 및 Fugene로 형질감염시킨다.
3일차: 인자들을 추가한다 (배지+0.1% BSA로 희석됨). 억제제는 세포에 추가하기 전, 1 시간 동안 인자들로 사전 배양될 필요가 있다. 6시간 후, 세포들을 PBS로 헹구고 용해시켰다.
루시퍼라제 분석이 후속된다. 어떠한 억제제들도 없이, 액티빈 A는 리포터 유전자 발현의 10-배 자극 및 ED50 ~ 2 ng/mL을 보였다. GDF-11: 16배 자극, ED50: ~ 1.5 ng/mL.
ActRIIB(20-134)는 이 분석법에서 액티빈 A, GDF-8, 및 GDF-11 활성의 효능있는 억제제이다. 하기 설명하는 바와 같이, ActRIIB 변이체들을 또한 이 분석법으로 테스트하였다.
실시예 7: ActRIIB-Fc 변이체들, 세포-기반 활성
ActRIIB-Fc 단백질들 및 GDF 트랩의 활성을 상기 기재한 바와 같은 세포-기반 분석법으로 테스트하였다. 연구 결과를 하기 표에 요약한다. 일부 변이체들을 상이한 C-말단 절두 작제물들에서 테스트하였다. 상기 논의한 바와 같이, 5개 또는 15개 아미노산의 절두는 활성 감소를 유발하였다. GDF 트랩 (L79D 및 L79E 변이체들)은 GDF-11의 야생형 억제를 거의 유지하면서 액티빈 A 억제를 실질적으로 소실함을 보여주었다.
GDF11 및 액티빈 A에 대한 가용성 ActRIIB-Fc 결합:
Figure pct00033
Figure pct00034
+ 열등한 활성 (대략 1x10-6 KI)
++ 중등도 활성 (대략 1x10-7 KI)
+++ 우수한 (야생형) 활성 (대략 1x10-8 KI)
++++ 야생형 활성 보다 큼
몇 가지 변이체들을 래트에서의 혈청 반감기에 관하여 평가하였다. ActRIIB(20-134)-Fc는 대략 70 시간의 혈청 반감기를 가진다. ActRIIB(A24N 20-134)-Fc는 대략 100-150 시간의 혈청 반감기를 가진다. A24N 변이체는 세포-기반 분석법에서 활성을 가지며 (상부) 이는 야생형 분자와 동일한 것이다. 더 긴 반감기와 함께, 이는 시간이 경과함에 따라 A24N 변이체는 야생형 분자 보다 단백질 단위 당 보다 큰 효과를 제공하게 될 것임을 의미한다. A24N 변이체, 그리고 상기 테스트한 임의의 다른 변이체들은, GDF 트랩 분자들, 가령, L79D 또는 L79E 변이체들과 조합될 수 있다.
실시예 8: GDF-11 및 액티빈 A 결합.
특정 ActRIIB-Fc 단백질들 및 GDF 트랩의 리간드들에 대한 결합을 BiacoreTM 분석법에서 테스트하였다.
ActRIIB-Fc 변이체들 또는 야생형 단백질을 항-hFc 항체를 사용하여 상기 시스템 상에서 포획하였다. 리간드들을 주입하고 포집된 수용체 단백질들 위로 흐르게 하였다. 결과를 하기 표에 요약한다.
리간드-결합 특이성 IIB 변이체들.
Figure pct00035
Figure pct00036
세포-유리 분석법에서 얻은 이러한 데이터들은, A24N 변이체가 ActRIIB(20-134)-hFc 분자와 유사한 리간드-결합 활성을 유지하며 L79D 또는 L79E 분자는 미오스타틴 및 GDF11 결합을 유지하지만 액티빈 A에 대하여 현저히 감소된 (정량불가) 결합을 보여줌을 입증하는 세포-기반 분석법 데이터를 확인시켜준다.
WO2006/012627에 기재된 바와 같이, 다른 변이체들을 생성하고 테스트하였다 (이 문헌의 전문은 본 명세서에 참고로 포함됨). 예컨대, pp. 59-60, 상기 장치에 커플링된 리간드들을 사용하고 커플링된 리간드들 위에 수용체를 흐르게 하는 것을 참조하라. 특히, K74Y, K74F, K74I (그리고 아마도 K74에서 다른 소수성 치환, 가령, K74L), 및 D80I는, 야생형 K74 분자에 비해, GDF11 결합에 대한 액티빈 A (ActA) 결합 비율의 감소를 유발하였다. 이들 변이체들에 관한 데이터의 표를 하기에 다시 만든다:
GDF11 및 액티빈 A에 대한 가용성 ActRIIB-Fc 변이체들 결합 (Biacore™ 분석법)
Figure pct00037
Figure pct00038
* 결합 관찰되지 않음
-- < 1/5 WT 결합
- ~ 1/2 WT 결합
+ WT
++ < 2x 증가된 결합
+++ ~5x 증가된 결합
++++ ~10x 증가된 결합
+++++ ~ 40x 증가된 결합
실시예 9: 절두된 ActRIIB 세포외 도메인을 보유한 GDF 트랩의 생성
류신의 아스파르테이트로의 치환 (서열 번호:1의 잔기 79에서)을 내포하는 ActRIIB 세포외 도메인 (서열 번호:1의 잔기들 20-134)에 TPA 리더를 N-말단 융합시키고 최소 링커 (3개의 글리신 잔기들)로 인간 Fc 도메인을 C-말단 융합시켜 ActRIIB(L79D 20-134)-hFc로 지칭되는 GDF 트랩을 생성하였다 (도 5). 이러한 융합 단백질에 대응하는 뉴클레오티드 서열을 도 6A 및 6B에 도시한다.
류신의 아스파르테이트로의 치환 (서열 번호:1의 잔기 79에서)을 내포하는 절두된 세포외 도메인 (서열 번호:1의 잔기들 25-131)에 TPA 리더를 N-말단 융합시키고 최소 링커 (3개의 글리신 잔기들)로 인간 Fc 도메인을 C-말단 융합시켜 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc로 지칭되는 절두된 ActRIIB 세포외 도메인의 GDF 트랩을 생성하였다 (도 7, 서열 번호: 61). ActRIIB(L79D 25-131)-hFc (서열 번호: 64)의 가공처리된 형태를 도 9에 도시한다. 이러한 융합 단백질을 인코딩하는 하나의 뉴클레오티드 서열을 도 8A 및 8B (서열 번호: 62)에 도시하고 정확히 동일한 융합 단백질을 인코딩하는 대체 뉴클레오티드 서열을 도 11A 및 11B (서열 번호: 66)에 도시한다.
실시예 10. 이중-절두된 ActRIIB 세포외 도메인을 보유하는 GDF 트랩에 의한 선택적 리간드 결합
몇 가지 리간드들에 대한 GDF 트랩 및 다른 ActRIIB-hFc 단백질들의 친화력을 Biacore™ 장치로 시험관내에서 평가하였다. 연구 결과를 하기 표에 요약한다. Kd값들은, k온 및 k오프를 정확하게 결정하지 못하게 하는 복합체의 매우 신속한 결합 및 해리로 인해 정상-상태 친화력 적합에 의해 수득되었다.
ActRIIB-hFc 변이체들의 리간드 선택성:
Figure pct00039
절두된 세포외 도메인, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc을 보유하는 GDF 트랩은, 보다 긴 변이체인, ActRIIB(L79D 20-134)-hFc에 의해 나타났던 리간드 선택성과 동일하거나 이를 능가하며, L79D 치환이 없는 ActRIIB-hFc 대응물에 비해 액티빈 A 결합이 두드러지게 소실되고, 액티빈 B 결합이 부분적으로 소실되고, GDF11 결합이 거의 완전히 유지된다. 절두 단독 (L79D 치환 없음)은 본 명세서에서 나타났던 리간드에서 선택성을 변화시키지 않았음을 유념하라 [ActRIIB(L79 25-131)-hFc를 ActRIIB(L79 20-134)-hFc와 비교]. ActRIIB(L79D 25-131)-hFc는 또한 Smad 2/3 신호전달 리간드 GDF8 및 Smad 1/5/8 리간드들 BMP6 및 BMP10에 대하여 강한 내지 중간의 결합을 유지시킨다.
실시예 11. ActRIIB5로부터 유도된 GDF 트랩
ActRIIB 막경유 도메인을 포함하여 엑손 4가 상이한 C-말단 서열로 대체되어 있는 ActRIIB의 대안적 가용성 형태 (ActRIIB5로 표시)가 보고된 바 있다 (예컨대, WO 2007/053775 참조).
리더가 없는 고유 인간 ActRIIB5의 서열은 다음과 같다:
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVK
KGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEGPWAST
TIPSGGPEATAAAGDQGSGALWLCLEGPAHE (서열 번호: 48)
다음 서열을 가지는 변이체 ActRIIB5(L79D)를 작제하기 위해 기재된 바와 같이 류신의 아스파르테이트로의 치환, 또는 다른 산성 치환이 고유 위치 79에서 이루어질 수 있다:
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVK
KGCWDDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEGPWAST
TIPSGGPEATAAAGDQGSGALWLCLEGPAHE (서열 번호: 49)
이러한 변이체는 TGGG 링커 (한줄 밑줄)로 인간 Fc (두줄 밑줄)에 연결되어 다음 서열을 가지는 인간 ActRIIB5(L79D)-hFc 융합 단백질을 생성할 수 있다:
Figure pct00040
Figure pct00041
(서열 번호: 50).
이러한 작제물은 CHO 세포들에서 발현될 수 있다.
실시예 12. MDS 마우스 모델에서 비효과적인 적혈구생성 및 빈혈에 대한 GDF 트랩의 효과
출원인들은 불완전한 전구체 성숙 및 비효과적인 조혈작용으로 특징지어지는 MDS의 NUP98-HOXD13 마우스 모델에서 GDF 트랩 ActRIIB(L79D 25-131)-mFc의 효과를 조사하였다. 이 모델에서, 질병 중증도는 연령에 따라 증가하며, 궁극적으로 마우스의 대다수에서 급성 골수성 백혈병으로 진행하며, 이들은 대략 14개월의 평균 수명을 가진다. 대략 4 개월령에서 시작하여, 이들 마우스는 빈혈, 백혈구감소증, 비효과적 적혈구생성, 및 정상세포성 내지 세포과다성인 골수를 나타낸다 [Lin 외. (2005) 혈액 106:287-295]. 만성 투여 효과를 모니터링하기 위하여, MDS 마우스들을 ActRIIB(L79D 25-131)-mFc (10 mg/kg, s.c.) 또는 운반체로 매주 2회 4 개월령에서 시작하여 7개월 동안 지속하여 처리하였으며, 온혈구 계산 분석을 위해 기준선 및 그 후 매달 혈액 샘플 (50 μl)을 수집하였다. 예상한 바와 같이, 6-개월령의 MDS 마우스는 야생형 마우스에 비해 중증 빈혈을 발병하였으며 (도 13A), 골수 분석 결과 연령-매칭된 FVB 야생형 마우스에 비해 MDS 마우스에서 적혈구 전구체들의 수 증가 (도 13A) 및 보다 낮은 골수/적혈구 (M/E) 비율이 나타났으며 이는 비효과적 적혈구생성을 나타내는 것이다 [Suragani 외. (2014) Nat Med 20:408-414]. 6-개월령의 MDS 마우스에서, ActRIIB(L79D 25-131)-mFc 처리는 유의하게 RBC 수 (16.9% 만큼) 및 헤모글로빈 농도 (12.5% 만큼)를 증가시켰으며 (도 13A), 골수내 적혈구 전구체 세포수를 감소시켰고 (도 13A), 야생형 마우스에 대한 M/E 비율을 정규화시켰다 [Suragani 외. (2014) Nat Med 20:408-414].
12개월령의 MDS 마우스에서, ActRIIB(L79D 25-131)-mFc 처리는 유의하게 RBC 수 (18.3% 만큼) 및 헤모글로빈 수준 (13.0% 만큼)을 증가시켰으며 (도 13B), 적혈구 전구체 세포수를 감소시켰고 (도 13B), 그리고 운반체에 비해 M:E 비율을 개선시켰다 [Suragani 외. (2014) Nat Med 20:408-414]. ActRIIB(L79D 25-131)-mFc 처리는 골수 전구체들의 절대수에 영향을 미치지 않았다. 유세포측정법은 ActRIIB(L79D 25-131)-mFc 처리가 두 가지 연령 모두의 MDS 마우스에서 적혈구 과형성을 감소시켰음을 확인시켜 주었다. 7개월 동안 ActRIIB(L79D 25-131)-mFc로 처리된 MDS 마우스의 시간-경과 분석은 연구 기간 동안 RBC 수의 지속적인 상승을 보여주었다 [Suragani 외. (2014) Nat Med 20:408-414]. 종합하면, 이러한 결과들은 GDF 트랩을 이용한 처리가 질병 중증도에 관계없이 MDS 마우스에서 빈혈, 적혈구 과형성 및 비효과적 적혈구생성을 개선시킴을 나타내는 것이다.
실시예 13: GDF 트랩에 대해 치료적으로 반응성인 MDS 환자들에서의 세포학적 및 유전학적 특성
비효과적 적혈구생성, 가령, 골수형성이상 증후군 (MDS)으로 인한 빈혈의 치료를 위해, 변형된 액티빈 수용체 IIB형 및 IgG Fc [ActRIIB(L79D 25-131)-hFc, 루스파터셉트 또는 ACE-536로도 공지됨]를 내포하는 재조합 융합 단백질을 개발중이다. MDS 환자들은 종종 상승된 EPO 수준을 가지며 적혈구생성-자극 물질들 (ESAs)에 대해 비-반응성 또는 불응성일 수 있다. MDS 환자들은 또한 증가된 GDF11 혈청 수준 [Suragani 외. (2014) Nat Med 20:408-414] 및 골수 내 증가된 Smad 2/3 신호전달을 가지는 것으로 나타났다 [Zhou 외. (2008) 혈액 112:3434-3443]. ActRIIB(L79D 25-131)-hFc는 GDF11을 비롯한 TGFβ 수퍼패밀리 리간드들에 결합하고, Smad2/3 신호전달을 억제하고, ESAs와 구별되는 메커니즘을 통해 후기 적혈구 분화를 촉진시킨다. 쥐과의 경우, MDS의 마우스 모델에서 ActRIIB(L79D 25-131)-mFc는, Smad2 신호전달을 감소시켰으며, 헤모글로빈 (Hb) 수준을 증가시켰고, 골수 적혈구 과형성을 감소시켰다 [Suragani 외. (2014) Nat Med 20:408-414]. 건강한 지원자 연구에서, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc는 내약성이 우수하였으며 Hb 수준을 증가시켰다 [Attie 외. (2014) Am J Hematol 89:766-770].
출원인들은 높은 수혈 부담 (HTB, 기준선 이전 8주 당 ≥ 4 단위 RBC로 정의됨) 또는 낮은 수혈 부담 (LTB, 기준선 이전 8주 당 < 4 단위 RBC로 정의됨)을 가지는 낮은 또는 Int-1 위험의 MDS 환자들에서 빈혈에 대한 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc의 효과를 평가하기 위하여 진행중, 2상, 다기관, 공개-라벨, 용량-찾기 연구를 실시중이다. 연구 결과들에는 적혈구 반응 (LTB 환자들에서 Hb 증가 또는 HTB 환자들에서 수혈 부담 감소), 안전성, 내약성, 약물동력학, 및 약물역학적 생물표지자가 포함된다.포함 기준은 다음과 같다: 저 또는 Int-1 위험 MDS, 연령 ≥ 18 세, 빈혈 (HTB 환자이거나 기준선 Hb < 10.0 g/dL를 가지는 LTB 환자로 정의됨), EPO > 500 U/L 또는 ESAs에 대한 비반응성/불응성, 아자시티딘 또는 데시타빈 투약 경험 없음, 및 현재 ESA, 과립구 집락-자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 집락-자극 인자 (GM-CSF), 또는 레날리도마이드, 탈리도마이드 또는 포말리도마이드 투약 없음. 용량-증가 단계(phase)에서, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc를 피하 주사로 매 3주에 1회 7개의 순차적 코호트에서 (n = 3-6) 0.125, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.33 및 1.75 mg/kg의 용량 수준으로 최대 5회 투약 동안 투여하였으며 3개월 추적검사를 하였다.
데이터는 26명의 환자들에 대해 이용가능하였다 (7명은 LTB/19 HTB). 중앙 연령은 71세 (범위: 27-88 세)이었으며, 50%가 여성이고, 54%는 EPO 요법 경험이 있었으며, 15%는 레날리도마이드 경험이 있었다. WHO 하위유형에 의한 환자 분류는 다음과 같았다: 15% RARS, 46% RCMD-RS, 15% RCMD, 15% RAEB-1 (≥15% 고리 철적혈모구를 가지는 2명의 환자 포함) 및 8% del (5q). LTB 환자들 (n = 7)에 대한 평균 (SD) 기준선 Hgb는 9.1 (0.4) g/dL였다. 처리 8주 전에 수혈받은 평균 (SD) 단위 RBC는 LTB 환자들에 대하여 0.9 (1.1) 단위 그리고 HTB 환자들에 대하여 6.3 (2.4) 단위였다. 7명 중 2명의 LTB 환자들은 기준선과 비교하여 8주에 걸쳐 평균 Hb ≥ 1.5 g/dL의 증가를 보였다. LTB 환자들에서 평균 최대 Hb 증가는 0.125 (n=1), 0.25 (n = 1), 0.75 (n = 3), 및 1.75 (n = 2) mg/kg 투여량 그룹 각각에서 0.8, 1.0, 2.2, 및 3.5 g/dL 이었다. 7명 중 6명의 LTB 환자들은 연구하는 ≥ 8주 동안 RBC 수혈 독립 (RBC-TI)에 도달하였다. 0.75 mg/kg 내지 1.75 mg/kg 범위의 투여량 수준이 활성 투여량으로 간주되었다. 활성 투여량 그룹의 5명의 환자들 중에서, 4명 (80%)은 ≥ 2 주 동안 ≥ 1.5 g/dl의 사전-예정된 Hgb 증가 종점에 도달하였다. 2명의 환자들 (40%)은 HI-E 반응에 도달하였으며 [International Working group; Cheson 외. (2000) Blood 96:3671-3674; Cheson 외. (2006) Blood 108:419-425], 이는 LTB 환자들에서 ≥ 8주 동안 ≥ 1.5 g/dl의 Hgb 증가로 정의된다. HTB 환자들에서, HI-E 반응은 연구 시작 8주 전과 비교시 8주의 기간에 걸쳐 수혈된 적혈구들의 최소한 4 단위의 수혈 부담 감소로 정의된다. 활성 투여량 그룹에서, 12명 중 5명 (42%)의 HTB 환자들은 치료 8주 전과 비교시 치료 기간 동안 8주 간격에 걸쳐 수혈되는 RBC 단위의 ≥ 4 감소 또는 RBC 단위의 ≥ 50% 감소의 예정된 종점을 충족시켰으며, 동일한 환자들 (12명 중 5명, 42%)은 HI-E 반응을 달성하였고; 활성 투여량 그룹의 HTB 환자들의 12명 중 3명 (25%)은 연구기간 동안 RBC-TI ≥ 8 주를 달성하였다. 연구 약물 투여 후 호중수 수의 증가가 일부 환자들에서 관찰되었다. 마지막으로, ActRIIB(L79D 25-131)-hFc는 일반적으로 내약성이 우수하였다. 지금까지 심각한 관련 유해 사례들은 보고된 바 없었다. 인과성과 관계없이 가장 빈번한 유해 사례들은 다음과 같았다: 설사 (n = 4, 등급 1/2), 뻐 통증, 피로, 근육 연축, 근육통, 및 코인두염 (각각 n = 3, 등급 1/2).
골수 흡인물 평가는 활성 투여량 그룹 (0.75 ― 1.75 mg/kg)에서 고리 철적혈모구의 존재 (적혈구 전구체들의 ≥ 15%가 고리 철적혈모구 형태를 나타내었던 경우 양성으로 간주함)와 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc에 대한 반응성 사이의 관계를 입증하였다. LTB 및 HTB 환자들 모두에 걸친 전체 반응율 (상기 HI-E 기준 사용)은 17명 중 7명 이었다 (41%). 기준선에서 고리 철적혈모구에 양성인 환자들 중, 13명 중 7명 (54%)의 환자들은 HI-E 반응을 구현하였으나, 특히 기준선에서 고리 철적혈모구에 음성인 4명의 환자들 중 어느 환자도 HI-E 반응을 구현하지 않았다.
환자들로부터 얻은 골수 흡인물들을 또한 MDS와 관련된 돌연변이 (주로 체세포 돌연변이)를 정착시키는 것으로 공지된 21개의 상이한 유전자들에서 돌연변이의 존재에 관하여 또한 평가하였다. 게놈 DNA를 골수 흡인물로부터 단리하고, 21개 유전자들의 선택된 코딩 영역들을 중합효소 연쇄 반응으로 증폭시키고, 이들 영역들의 DNA 서열들을 차세대 시퀀싱 (골수 분자 프로파일 21-유전자 패널, Genoptix, Inc., Carlsbad, CA)을 사용하여 결정하였다. 이러한 분석은 활성화된 신호전달 유전자들 (KIT, JAK2, NRAS, CBL, 및 MPL), 전사 인자들 (RUNX1, ETV6), 후성 유전자들 (IDH1, IDH2, TET2, DNMT3A, EZH2, ASXL1, 및 SETBP1), RNA 스플라이싱 유전자들 (SF3B1, U2AF1, ZRSF2, 및 SRSF2), 그리고 종양 억제인자들/기타 (TP53, NPM1, PHF6)를 검사하였다. SF3B1의 분석은 엑손 13-16을 특이적으로 표적하였다. 평가된 이들 21개 MDS-관련 유전자들 중에서, SF3B1에서의 돌연변이는 비반응성 환자들에서 보다 반응성 환자들의 골수 세포들에서 더 빈번하게 탐지되었다. 이들 환자들에서 탐지된 개개의 SF3B1 돌연변이들을 하기 표에 나타낸다. 동일한 돌연변이는 때때로 여러 환자들에서 나타났다.
Figure pct00042
활성 투여량 그룹의 SF3B1 돌연변이를 가진 환자들에서, 8주 이상 동안 수혈 독립을 달성하였던 3명의 환자들 모두를 포함하여, 9명 중 6명 (67%)이 HI-E 반응을 달성하였다. SF3B1 돌연변이를 가지지 않은 환자들에서, 8명 중 1명만 (13%) HI-E 반응을 달성하였다. SF3B1에서의 돌연변이는 고리 철적혈모구를 가지는 MDS 환자들에서 종종 관찰되며 비효과적 적혈구생성과 관련된다.
이러한 결과들은 ≥ 15%의 고리 철적혈모구 (그리고 다른 형태의 철적모구 빈혈을 가진 환자들), 및/또는 SF3B1에서 최소한 하나의 돌연변이를 나타내는 MDS 환자들이 < 15% 고리 철적혈모구를 가지며 및/또는 SF3B1에서 돌연변이가 없는 MDS 환자들보다 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc에 대해 치료적으로 더 반응하기 쉬움을 나타낸다. 이러한 데이터에 근거하여, 이러한 환자 하위그룹 중 어느 한 그룹의 선택적 치료는 ActRII 억제제들을 이용한 치료의 이익성/위험성 비율을 크게 증가시킬 것으로 예상된다.
실시예 14: GDF 트랩에 치료적으로 반응성인 MDS 환자의 시력 개선
ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 치료는 또한 시각에 대한 놀라운 효과를 가지는 것으로 관찰되었다. 상기 2상 MDS 연구에서, 열등한 시각 (예컨대, 특정 활동을 하기 위해 보정 렌즈를 필요로 하는)을 가진 남성 환자는 ActRIIB(L79D 25-131)-hFc 요법에 대해 반응성인 것으로 나타났다. 치료전 환자는 정기적인 수혈을 요하는 만성 빈혈이 있었다. ActRIIB(L79D 25-131)-hFc는 환자의 헤모글로빈 수준을 유의하게 그리고 지속적으로 증가시켰다. 실제로, 환자는 연구하는 동안 ≥ 8 개월 동안 수혈 독립을 달성하였다. 또한, 이 환자에서 유의한 시각 개선이 관찰되었다. 사실상, 이 환자는 특정 활동을 하기 위해 보정 렌즈를 필요로하지 않았다. 그러므로 이러한 데이터는 빈혈 치료에 대한 긍정적인 효과 이외에도, ActRII 억제제들이 MDS 환자들의 시각을 개선시키기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다. 더욱이, 하기 논의되는 바와 같은 MDS-관련 시각 소실에 관하여 보고된 메커니즘의 관점에서, 이들 데이터는 ActRII 억제제가 또한 다른 유형의 안구 질환들의 치료에도 긍정적인 효과를 가질 수 있음을 암시한다.
망막 신경 섬유층 두께는 다양한 혈액학적 질환들을 가진 환자들, 특히, 빈혈 관련 질환들을 가진 환자들에서 감소되는 것으로 보고되었다 [Han 외. (2015) J Glaucoma (인쇄 전 전자 간행물)]. 망막 신경 섬유의 이러한 변화들은 감소된 시력 및 눈의 다른 병리학적 변화들과 관련된다. 연구들은 이러한 환자들의 망막 손상이 허혈성 시신경병증으로 인한 것일 수 있음을 나타낸다. 예를 들면, MDS 환자들의 시각 소실은 NAION 소견과 관련되어 있었다 [Brouzas 외. (2009) Clinical Ophthalmology 3:133-137]. 이러한 MDS 환자들에서, NAION의 개시는 허혈 및/또는 미세혈관 기능부전의 메커니즘에 의한 것으로 생각된다. 실제로, 허혈-저산소증의 치료 요법은 MDS 환자들의 시력을 개선시킴이 입증되었다. 따라서, 본 출원의 데이터는 ActRII 길항제가 관련된 다른 안구 질환들, 특히, 허혈 및 미세혈관 기능부전과 관련된 질환들을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 암시한다.
실시예 15: 레이저-유도된 맥락막 혈관신생 후 병소 크기 및 누출에 대한 ActRII 폴리펩티드의 효과
레이저-유도된 맥락막 혈관신생의 래트 모델에서 병소 크기 및 누출에 대한 ActRIIA-Fc (실시예 1 참조), ActRIIB-Fc (실시예 4 참조), 및 ActRIIB(L79D 25-131)-Fc (실시예 9 참조)의 효과들을 평가하고자 하는 것이다.
1 연구일에, 20마리의 브라운 노르웨이 (Brown Norway) 래트 (6-8주령)에게 양쪽 레이저 처리하고 눈 한쪽 당 3개의 병소들이 생성된다. 동물들은 1% 시클로길 용액으로 확장되어 빛으로부터 보호된다. 관찰가능한 확장 후, 동물들을 진정시킨다. 진정시킨 동물의 안저를 Micron IV 소 동물 안저검사기 (small animal funduscope) (Phoenix Research)를 사용하여 관찰하고 기록하였다. Micron IV 맞춤형 레이저를 부착하여 연결된 열 레이저를 사용하여 레이저 처리를 실시한다. 한 눈 당 총 3개의 병소들이 532 nm 파장을 사용하여 오른쪽 눈에 위치된다. 생성된 안저 이미지들을 기록하고 평가하여, 레이저가 부르크 막을 통하여 기포를 성공적으로 생성하였는지를 확인한다.
레이저 처리 후, 래트들을 다음 4개의 처리 그룹들 중 하나로 나눈다: a) 1, 8, 및 15일차에 운반체 (PBS)의 s.c. 투여; b) 1, 8, 및 15일차에 ActRIIA-Fc (10 mg/kg)의 s.c. 투여; c) 1, 8, 및 15일차에 ActRIIB-Fc (10 mg/kg)의 s.c. 투여; 및 d) 1, 8, 및 15일차에 ActRIIB(L79D 25-131)-Fc (10 mg/kg)의 s.c. 투여.
22일차에, 래트들을 생체내 형광안저 혈관조영술로 병소 크기 및 누출의 감소에 관하여 평가하였다. 동물들을 안락사시킨 다음 1 μl/그램 (체중)으로 10% 플루오레세인 나트륨을 IP 주사한다. 이후 안저 이미지들을 Micron III 및 목표한 488 nm 파장에 대한 여기광선/차단 필터들을 사용하여 8-비트 TIFF 파일로 캡쳐하였다. 또한 각 눈에 대한 표준 컬러 안저 사진들도 캡쳐하였다. 모든 TIFF 이미지들을 컴퓨터 이미지-분석 소프트웨어 (예컨대, ImageJ, NIH, USA)를 사용하여 정량한다. 이후 병소들의 경계는 개별적으로 손으로 자유로이 추적하고, 생성된 이미지에 다중-오츠 임계값(multi-Otsu thresholding)을 적용하여 배경 신호를 제거하고 면적을 픽셀로 정량한다. 2개의 병소들이 중첩되는 영역들 또는 출혈 영역들은 분석에서 제외시킨다.
실시예 16: 스트렙토조토신-유도된 당뇨병 모델의 래트 모델에서 병소 크기 및 누출에 대한 ActRII 폴리펩티드의 효과
스트렙토조토신 (STZ) 유도된 당뇨병의 래트 모델에서 병소 크기 및 누출에 대한 ActRIIA-Fc (실시예 1 참조), ActRIIB-Fc (실시예 4 참조), 및 ActRIIB(L79D 25-131)-Fc (실시예 9 참조)의 효과들을 평가하고자 하는 것이다.
STZ는 전신 투여 후 이자 섬 세포들의 고갈을 유발하는 소분자이다. 이자 섬 세포 사멸은 인슐린 생성의 소실 그리고 후속하여 혈액 글루코오스 수준의 조절장애를 유발하여 수일내 고혈당증을 초래한다. 이 모델은 당뇨 망막병증 및 당뇨성 황반 부종의 발병기전에서 염증, 혈관 병리, 및 신호전달 경로들을 연구하기 위해 사용되었다. STZ로 당뇨병을 유도 후 8주에, 시력 및 대비 감도의 유의한 그리고 진행성 소실이 존재한다. 인간 임상 시험을 위해 규제 당국이 허용한 주요 평가변수들은 시력과 대비 감도의 정량적 측정에 초점을 두고 있기 때문에, 이는 당뇨성 시각 소실을 예방하기 위한 치료제의 활성을 테스트하는 우수한 모델이다.
1 연구일에, 20 브라운 노르웨이 래트 (8-12주령)에게 STZ를 1회 복강내 주사한다 (pH 4.5의 시트레이트 완충액 10 mmol/L 중 50 mg/체중(kg)). 혈청 글루코오스 수준은 STZ 주사 후 이틀간 그리고 그 후 매주 조사될 것이다. 350 mg/dl 보다 높은 혈액 글루코오스 수준을 가진 동물들만 당뇨병 래트로 사용될 것이다.
STZ 처리하고 6 내지 8주 후에, 래트들을 다음 4개의 처리 그룹들 중 하나로 나눈다: a) 1, 8, 및 15일차에 운반체 (PBS)의 s.c. 투여; b) 1, 8, 및 15일차에 ActRIIA-Fc (10 mg/kg)의 s.c. 투여; c) 1, 8, 및 15일차에 ActRIIB-Fc (10 mg/kg)의 s.c. 투여; 및 d) 1, 8, 및 15일차에 ActRIIB(L79D 25-131)-Fc (10 mg/kg)의 s.c. 투여.
치료요법 시작 후 22일차에, 실시예 15에 기재한 바와 같이 래트들을 생체내 형광안저 혈관조영술로 병소 크기 및 누출의 감소에 관하여 평가하였다.
참고자료에 포함
여기에 언급 된 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 개별적으로 참조로 포함되도록 지시 된 것처럼 본원에 참고로 인용된다.
주제의 특정 실시 예들이 논의되었지만, 상기 명세서는 예시적이고, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서 및 청구 범위를 검토시 숙련된 기술자들에게 많은 변형예들이 명백해질 것이다. 본 발명의 전체 범위는 균등물의 전체 범위 및 명세서 그리고 이러한 변형예들과 함께 청구항을 참조하여 결정되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ACCELERON PHARMA INC. <120> METHODS FOR TREATING EYE DISORDERS <130> 1848179-0002-092-101 <140> 15/360,588 <141> 2016-11-23 <150> 62/258,934 <151> 2015-11-23 <160> 86 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 512 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 25 30 Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45 Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80 Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn 85 90 95 Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 100 105 110 Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140 Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr 145 150 155 160 Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro 165 170 175 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu 180 185 190 Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln 195 200 205 Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys 210 215 220 Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys 225 230 235 240 His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn 245 250 255 Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser 260 265 270 Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys 275 280 285 His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp 290 295 300 Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg 305 310 315 320 Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val 325 330 335 Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro 340 345 350 Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu 355 360 365 Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile 370 375 380 Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys 385 390 395 400 Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu 405 410 415 Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val 420 425 430 His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro 435 440 445 Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp 450 455 460 Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu 465 470 475 480 Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu 485 490 495 Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile 500 505 510 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser 35 40 45 Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His 85 90 95 Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr 100 105 110 Ala Pro Thr 115 <210> 3 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser 35 40 45 Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His 85 90 95 Leu Pro Glu Ala 100 <210> 4 <211> 512 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr 20 25 30 Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg 35 40 45 Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp 65 70 75 80 Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn 85 90 95 Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 100 105 110 Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu 130 135 140 Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr 145 150 155 160 Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro 165 170 175 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu 180 185 190 Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln 195 200 205 Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys 210 215 220 Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys 225 230 235 240 His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn 245 250 255 Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser 260 265 270 Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys 275 280 285 His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp 290 295 300 Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg 305 310 315 320 Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val 325 330 335 Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro 340 345 350 Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu 355 360 365 Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile 370 375 380 Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys 385 390 395 400 Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu 405 410 415 Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val 420 425 430 His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro 435 440 445 Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp 450 455 460 Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu 465 470 475 480 Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu 485 490 495 Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile 500 505 510 <210> 5 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Ser Ser 35 40 45 Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His 85 90 95 Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr 100 105 110 Ala Pro Thr 115 <210> 6 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Ser Ser 35 40 45 Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His 85 90 95 Leu Pro Glu Ala 100 <210> 7 <211> 1536 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgacggcgc cctgggtggc cctcgccctc ctctggggat cgctgtgcgc cggctctggg 60 cgtggggagg ctgagacacg ggagtgcatc tactacaacg ccaactggga gctggagcgc 120 accaaccaga gcggcctgga gcgctgcgaa ggcgagcagg acaagcggct gcactgctac 180 gcctcctggc gcaacagctc tggcaccatc gagctcgtga agaagggctg ctggctagat 240 gacttcaact gctacgatag gcaggagtgt gtggccactg aggagaaccc ccaggtgtac 300 ttctgctgct gtgaaggcaa cttctgcaac gaacgcttca ctcatttgcc agaggctggg 360 ggcccggaag tcacgtacga gccacccccg acagccccca ccctgctcac ggtgctggcc 420 tactcactgc tgcccatcgg gggcctttcc ctcatcgtcc tgctggcctt ttggatgtac 480 cggcatcgca agccccccta cggtcatgtg gacatccatg aggaccctgg gcctccacca 540 ccatcccctc tggtgggcct gaagccactg cagctgctgg agatcaaggc tcgggggcgc 600 tttggctgtg tctggaaggc ccagctcatg aatgactttg tagctgtcaa gatcttccca 660 ctccaggaca agcagtcgtg gcagagtgaa cgggagatct tcagcacacc tggcatgaag 720 cacgagaacc tgctacagtt cattgctgcc gagaagcgag gctccaacct cgaagtagag 780 ctgtggctca tcacggcctt ccatgacaag ggctccctca cggattacct caaggggaac 840 atcatcacat ggaacgaact gtgtcatgta gcagagacga tgtcacgagg cctctcatac 900 ctgcatgagg atgtgccctg gtgccgtggc gagggccaca agccgtctat tgcccacagg 960 gactttaaaa gtaagaatgt attgctgaag agcgacctca cagccgtgct ggctgacttt 1020 ggcttggctg ttcgatttga gccagggaaa cctccagggg acacccacgg acaggtaggc 1080 acgagacggt acatggctcc tgaggtgctc gagggagcca tcaacttcca gagagatgcc 1140 ttcctgcgca ttgacatgta tgccatgggg ttggtgctgt gggagcttgt gtctcgctgc 1200 aaggctgcag acggacccgt ggatgagtac atgctgccct ttgaggaaga gattggccag 1260 cacccttcgt tggaggagct gcaggaggtg gtggtgcaca agaagatgag gcccaccatt 1320 aaagatcact ggttgaaaca cccgggcctg gcccagcttt gtgtgaccat cgaggagtgc 1380 tgggaccatg atgcagaggc tcgcttgtcc gcgggctgtg tggaggagcg ggtgtccctg 1440 attcggaggt cggtcaacgg cactacctcg gactgtctcg tttccctggt gacctctgtc 1500 accaatgtgg acctgccccc taaagagtca agcatc 1536 <210> 8 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gggcgtgggg aggctgagac acgggagtgc atctactaca acgccaactg ggagctggag 60 cgcaccaacc agagcggcct ggagcgctgc gaaggcgagc aggacaagcg gctgcactgc 120 tacgcctcct ggcgcaacag ctctggcacc atcgagctcg tgaagaaggg ctgctggcta 180 gatgacttca actgctacga taggcaggag tgtgtggcca ctgaggagaa cccccaggtg 240 tacttctgct gctgtgaagg caacttctgc aacgaacgct tcactcattt gccagaggct 300 gggggcccgg aagtcacgta cgagccaccc ccgacagccc ccacc 345 <210> 9 <211> 513 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe 20 25 30 Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu 35 40 45 Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp 50 55 60 Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu 65 70 75 80 Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp 85 90 95 Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu 100 105 110 Lys Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn 115 120 125 Pro Val Thr Pro Lys Pro Pro Tyr Tyr Asn Ile Leu Leu Tyr Ser Leu 130 135 140 Val Pro Leu Met Leu Ile Ala Gly Ile Val Ile Cys Ala Phe Trp Val 145 150 155 160 Tyr Arg His His Lys Met Ala Tyr Pro Pro Val Leu Val Pro Thr Gln 165 170 175 Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Leu Gly Leu Lys Pro Leu 180 185 190 Gln Leu Leu Glu Val Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys 195 200 205 Ala Gln Leu Leu Asn Glu Tyr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Ile Gln 210 215 220 Asp Lys Gln Ser Trp Gln Asn Glu Tyr Glu Val Tyr Ser Leu Pro Gly 225 230 235 240 Met Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Ile Gly Ala Glu Lys Arg Gly 245 250 255 Thr Ser Val Asp Val Asp Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Glu Lys 260 265 270 Gly Ser Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ala Asn Val Val Ser Trp Asn Glu 275 280 285 Leu Cys His Ile Ala Glu Thr Met Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His 290 295 300 Glu Asp Ile Pro Gly Leu Lys Asp Gly His Lys Pro Ala Ile Ser His 305 310 315 320 Arg Asp Ile Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Asn Asn Leu Thr Ala 325 330 335 Cys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Leu Lys Phe Glu Ala Gly Lys Ser 340 345 350 Ala Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro 355 360 365 Glu Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg 370 375 380 Ile Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Ala Ser Arg 385 390 395 400 Cys Thr Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu 405 410 415 Glu Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Asp Met Gln Glu Val Val 420 425 430 Val His Lys Lys Lys Arg Pro Val Leu Arg Asp Tyr Trp Gln Lys His 435 440 445 Ala Gly Met Ala Met Leu Cys Glu Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His 450 455 460 Asp Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Gly Glu Arg Ile Thr 465 470 475 480 Gln Met Gln Arg Leu Thr Asn Ile Ile Thr Thr Glu Asp Ile Val Thr 485 490 495 Val Val Thr Met Val Thr Asn Val Asp Phe Pro Pro Lys Glu Ser Ser 500 505 510 Leu <210> 10 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser 35 40 45 Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr 85 90 95 Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro 100 105 110 Lys Pro Pro 115 <210> 11 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser 35 40 45 Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr 85 90 95 Phe Pro Glu Met 100 <210> 12 <211> 1539 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 atgggagctg ctgcaaagtt ggcgtttgcc gtctttctta tctcctgttc ttcaggtgct 60 atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg ggaaaaagac 120 agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt 180 tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg 240 gatgatatca actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta 300 tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccggagatg 360 gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccctatta caacatcctg 420 ctctattcct tggtgccact tatgttaatt gcggggattg tcatttgtgc attttgggtg 480 tacaggcatc acaagatggc ctaccctcct gtacttgttc caactcaaga cccaggacca 540 cccccacctt ctccattact aggtttgaaa ccactgcagt tattagaagt gaaagcaagg 600 ggaagatttg gttgtgtctg gaaagcccag ttgcttaacg aatatgtggc tgtcaaaata 660 tttccaatac aggacaaaca gtcatggcaa aatgaatacg aagtctacag tttgcctgga 720 atgaagcatg agaacatatt acagttcatt ggtgcagaaa aacgaggcac cagtgttgat 780 gtggatcttt ggctgatcac agcatttcat gaaaagggtt cactatcaga ctttcttaag 840 gctaatgtgg tctcttggaa tgaactgtgt catattgcag aaaccatggc tagaggattg 900 gcatatttac atgaggatat acctggccta aaagatggcc acaaacctgc catatctcac 960 agggacatca aaagtaaaaa tgtgctgttg aaaaacaacc tgacagcttg cattgctgac 1020 tttgggttgg ccttaaaatt tgaggctggc aagtctgcag gcgataccca tggacaggtt 1080 ggtacccgga ggtacatggc tccagaggta ttagagggtg ctataaactt ccaaagggat 1140 gcatttttga ggatagatat gtatgccatg ggattagtcc tatgggaact ggcttctcgc 1200 tgtactgctg cagatggacc tgtagatgaa tacatgttgc catttgagga ggaaattggc 1260 cagcatccat ctcttgaaga catgcaggaa gttgttgtgc ataaaaaaaa gaggcctgtt 1320 ttaagagatt attggcagaa acatgctgga atggcaatgc tctgtgaaac cattgaagaa 1380 tgttgggatc acgacgcaga agccaggtta tcagctggat gtgtaggtga aagaattacc 1440 cagatgcaga gactaacaaa tattattacc acagaggaca ttgtaacagt ggtcacaatg 1500 gtgacaaatg ttgactttcc tcccaaagaa tctagtcta 1539 <210> 13 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg ggaaaaagac 60 agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt 120 tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg 180 gatgatatca actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta 240 tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccggagatg 300 gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccc 345 <210> 14 <211> 225 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 15 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 20 25 30 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 35 40 45 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 50 55 60 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 65 70 75 80 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 85 90 95 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 100 105 110 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 115 120 125 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 130 135 140 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 145 150 155 160 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 165 170 175 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 180 185 190 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 195 200 205 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 Lys 225 <210> 15 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 20 25 30 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 100 105 110 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 180 185 190 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 16 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 47 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120 aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180 aagcggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240 aagggctgct gggacgatga cttcaactgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300 gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360 catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420 ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gtccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780 aaagggcagc cccgagaacc 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<400> 50 Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly 20 25 30 Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser 35 40 45 Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His 85 90 95 Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Gly Pro Trp Ala Ser Thr Thr Ile 100 105 110 Pro Ser Gly Gly Pro Glu Ala Thr Ala Ala Ala Gly Asp Gln Gly Ser 115 120 125 Gly Ala Leu Trp Leu Cys Leu Glu Gly Pro Ala His Glu Thr Gly Gly 130 135 140 Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 145 150 155 160 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 165 170 175 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 180 185 190 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 195 200 205 Asn Ala Lys 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (76)..(396) <400> 62 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccggcg ccgct gag aca cgg gag tgc atc tac tac aac gcc aac tgg 111 Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp 1 5 10 gag ctg gag cgc acc aac cag agc ggc ctg gag cgc tgc gaa ggc gag 159 Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu 15 20 25 cag gac aag cgg ctg cac tgc tac gcc tcc tgg cgc aac agc tct ggc 207 Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly 30 35 40 acc atc gag ctc gtg aag aag ggc tgc tgg gac gat gac ttc aac tgc 255 Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn Cys 45 50 55 60 tac gat agg cag gag tgt gtg gcc act gag gag aac ccc cag gtg tac 303 Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr 65 70 75 ttc tgc tgc tgt gaa ggc aac ttc tgc aac gag cgc ttc act cat ttg 351 Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 63 tcatttaccc ggggacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60 catcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120 gctatagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180 ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240 caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300 cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360 gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420 gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480 cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540 gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600 cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660 cggtgggcat gtgtgagttc caccacctgt cgggggtggc tcgtacgtga cttccgggcc 720 cccagcctct ggcaaatgag tgaagcgctc gttgcagaag 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Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 260 265 270 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 275 280 285 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 290 295 300 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 305 310 315 320 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 335 <210> 79 <211> 360 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 79 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr 20 25 30 Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu 35 40 45 Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu 65 70 75 80 Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu 85 90 95 Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu 100 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gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600 cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660 cggtgggcat gtgtgagttc caccacctgt cgggggtggc tcgtacgtga cttccgggcc 720 cccagcctct ggcaaatgag tgaagcgctc gttgcagaag ttgccttcac agcagcagaa 780 gtacacctgg gggttctcct cagtggccac acactcctgc ctatcgtagc agttgaagtc 840 atctagccag cagcccttct tcacgagctc gatggtgcca gagctgttgc gccaggaggc 900 gtagcagtgc agccgcttgt cctgctcgcc ttcgcagcgc tccaggccgc tctggttggt 960 gcgctccagc tcccagttgg cgttgtagta gatgcactcc cgtgtctcag cggcgccggg 1020 cgaaacgaag actgctccac acagcagcag cacacagcag agccctctct tcattgcatc 1080 cat 1083 <210> 82 <211> 1083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (73)..(396) <400> 82 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccggcg cc gcc gaa acc cgc gaa tgt att tat tac aat gct aat tgg 111 Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn 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acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 576 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 636 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 696 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 756 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 816 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 876 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 936 tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 996 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1056 agcctctccc tgtccccggg taaatga 1083 <210> 83 <211> 1083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 83 tcatttaccc ggggacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60 catcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120 gctatagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180 ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240 caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300 cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360 gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420 gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480 cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540 gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600 cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660 cggtgggcat gtgtgagttc caccaccggt gggcgggggt tcataggtca cctcgggccc 720 gccggcttcg gggaggtggg taaaccgttc attacagaaa ttcccctcgc aacaacagaa 780 atagacctgc ggattctctt cggtcgcgac acattcctgg cggtcataac aattgaaatc 840 gtccagccag caccctttct tgaccagttc aatcgtcccg gaggagttcc tccacgacgc 900 atagcaatgg aggcgtttat cctgttcccc ctcacaccgt tcgagcccgg attggttcgt 960 ccgttcgagt tcccaattag cattgtaata aatacattcg cgggtttcgg cggcgccggg 1020 cgaaacgaag actgctccac acagcagcag cacacagcag agccctctct tcattgcatc 1080 cat 1083 <210> 84 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 84 His His His His His His 1 5 <210> 85 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 85 Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu 1 5 10 15 Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys 20 25 30 Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu 35 40 45 Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg 50 55 60 Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys 65 70 75 80 Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala 85 90 95 Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr 100 105 <210> 86 <211> 1107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 86 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120 aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180 aagcggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240 aagggctgct gggatgatga cttcaactgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300 gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360 catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420 ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 840 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 960 tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080 agcctctccc tgtccccggg taaatga 1107

Claims (125)

  1. 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 눈 혈관 질환의 치료 또는 예방 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 환자 눈의 시각을 개선시킴을 특징으로 하는 방법.
  3. 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 눈 혈관 질환 환자의 시각 개선 방법.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서, 상기 방법은 시력을 증가시킴을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 2-4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 시야를 증가시킴을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 1-5 중 임의의 한 항에 있어서, 눈 혈관 질환은 허혈과 관련됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 청구항 1-6 중 어느 한 항에 있어서, 눈 혈관 질환은 미세혈관 기능부전과 관련됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 청구항 1-7 중 어느 한 항에 있어서, 눈 혈관 질환은 망막병증과 관련됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 청구항 1-8 중 어느 한 항에 있어서, 눈 혈관 질환은 시신경병증과 관련됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 청구항 1-9 중 어느 한 항에 있어서,눈 혈관 질환은 다음 중 하나 이상에서 선택됨을 특징으로 하는 방법: 황반 변성 (예컨대, 연령-관련 황반 변성, 소아 황반 변성, 습성 황반 변성, 건성 황반 변성, 스타르가르트병, 및 베스트병), 망막 혈관 폐색 (예컨대, 중심 망막 혈관 폐색, 절반-망막 혈관 폐색, 망막 분지 혈관 폐색, 및 허혈성 망막 혈관 폐색), 망막 동맥 폐색 (예컨대, 중심 망막 동맥 폐색, 절반-망막 동맥 폐색, 망막 분지 동맥 폐색, 및 허혈성 망막 동맥 폐색), 당뇨 망막병증, 허혈성 시신경병증 [예컨대, 전방 허혈성 시신경병증 (동맥염성 및 비-동맥염성) 및 후방 허혈성 시신경병증], 황반 모세혈관확장증 (I형 또는 II형), 망막 허혈 (예컨대, 급성 망막 허혈 또는 만성 망막 허혈), 안구 허혈 증후군, 망막 혈관염, 및 미숙아 망막병증.
  11. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 빈혈을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 골수형성이상 증후군을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 11 또는 12에 있어서, 환자는 철적모구 빈혈을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 환자는 지중해빈혈을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 환자는 β-지중해빈혈을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 환자는 중등도 지중해빈혈을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  17. 필요로 하는 환자에게 유효량의 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 눈 질환의 중증도를 치료, 예방 또는 감소시키는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 환자는 혈관 눈 질환을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  19. 청구항 17 또는 18에 있어서, 눈 질환은 다음으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 방법: 황반 변성 (예컨대, 연령-관련 황반 변성, 소아 황반 변성, 습성 황반 변성, 건성 황반 변성, 스타르가르트병, 신생혈관 연령-관련 황반 변성, 및 베스트병), 망막 혈관 폐색 (예컨대, 중심 망막 혈관 폐색, 절반-망막 혈관 폐색, 망막 분지 혈관 폐색, 및 허혈성 망막 혈관 폐색), 망막 동맥 폐색 (예컨대, 중심 망막 동맥 폐색, 절반-망막 동맥 폐색, 망막 분지 동맥 폐색, 및 허혈성 망막 동맥 폐색), 황반 부종 (예컨대, 망막 혈관 폐색 후 황반 부종 및 당뇨성 황반 부종) 당뇨 망막병증 (예컨대, 당뇨성 황반 부종 환자들에서 당뇨 망막병증 및 당뇨 망막병증), 허혈성 시신경병증 [예컨대, 전방 허혈성 시신경병증 (동맥염성 및 비-동맥염성) 및 후방 허혈성 시신경병증], 황반 모세혈관확장증 (I형 또는 II형), 망막 허혈 (예컨대, 급성 망막 허혈 또는 만성 망막 허혈), 안구 허혈 증후군, 망막 혈관염, 및 미숙아 망막병증.
  20. 청구항 17-19 중 어느 한 항에 있어서, 눈 질환은 황반 변성임을 특징으로 하는 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 눈 질환은 연령-관련 황반 변성 (AMD)임을 특징으로 하는 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 환자는 연령-관련 눈 질병 연구 (AREDS) 기준으로 최소한 범주 2 AMD를 가짐을 특징으로 하는 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 환자는 AREDS 기준으로 범주 4 AMD를 가짐을 특징으로 하는 방법.
  24. 청구항 21 또는 23에 있어서, AMD는 신생혈관 (습성) AMD임을 특징으로 하는 방법.
  25. 청구항 21 또는 23에 있어서, AMD는 비-신생혈관 (건성) AMD임을 특징으로 하는 방법.
  26. 청구항 22-25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 AREDS 기준으로 최소한 1 단계의 AMD 개선을 가져옴을 특징으로 하는 방법.
  27. 청구항 21 및 23-25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 AREDS 기준으로 최소한 2 단계의 AMD 개선을 가져옴을 특징으로 하는 방법.
  28. 청구항 21에 있어서, 환자는 BIMRCC (Beckman Initiative for Macular Research Classification Committee) 분류 기준으로 최소한 초기 AMD를 가짐을 특징으로 하는 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 환자는 (BIMRCC) 분류 기준으로 후기 AMD를 가짐을 특징으로 하는 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, AMD는 신생혈관 (습성) AMD임을 특징으로 하는 방법.
  31. 청구항 29에 있어서, AMD는 비-신생혈관 (건성) AMD임을 특징으로 하는 방법.
  32. 청구항 21 및 28-31 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 (BIMRCC) 분류 기준으로 최소한 1 단계의 AMD 개선을 가져옴을 특징으로 하는 방법.
  33. 청구항 21 및 29-32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 (BIMRCC) 분류 기준으로 최소한 2 단계의 AMD 개선을 가져옴을 특징으로 하는 방법.
  34. 청구항 17-19 중 어느 한 항에 있어서, 눈 질환은 황반 부종임을 특징으로 하는 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 환자는 망막 혈관 폐색 (RVO) 후 황반 부종을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  36. 청구항 35에 있어서, RVO는 분지(branched) RVO임을 특징으로 하는 방법.
  37. 청구항 35에 있어서, RVO는 중심 RVO임을 특징으로 하는 방법.
  38. 청구항 35에 있어서, 환자는 분지 및 중심 RVO를 모두 가짐을 특징으로 하는 방법.
  39. 청구항 35에 있어서, RVO는 절반-중심(hemi-central) RVO임을 특징으로 하는 방법.
  40. 청구항 35에 있어서, 황반 부종은 당뇨성 황반 부종임을 특징으로 하는 방법.
  41. 청구항 17-19 중 어느 한 항에 있어서, 눈 질환은 망막병증임을 특징으로 하는 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, 망막병증은 당뇨 망막병증임을 특징으로 하는 방법.
  43. 청구항 41 또는 42에 있어서, 환자는 당뇨성 황반 부종을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  44. 청구항 42 또는 43에 있어서, 환자는 초기 치료 당뇨 망막병증 연구 (ETDRS) 분류 기준으로 최소한 경미한 비-증식성 당뇨 망막병증 (NPDR)을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  45. 청구항 42-44 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 ETDRS 분류 기준으로 경증, 중등도, 중증, 또는 매우 중증의 NPDR을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  46. 청구항 42-45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 ETDRS 분류 기준으로 최소한 1 단계의 당뇨 망막병증 개선을 가져옴을 특징으로 하는 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 방법은 ETDRS 분류 기준으로 최소한 2 단계의 당뇨 망막병증 개선을 가져옴을 특징으로 하는 방법.
  48. 청구항 42 또는 43에 있어서, 환자는 ETDRS 당뇨 망막병증 중증도 등급 (ETDRS-DRSS) 분류 기준으로 최소한 경증 비-증식성 당뇨 망막병증 (NPDR)을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  49. 청구항 48에 있어서, 환자는 ETDRS-DRSS 분류 기준으로 중등도-내지-중증 NPDR을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  50. 청구항 48 또는 49에 있어서, 상기 방법은 ETDRS-DRSS 분류 기준으로 최소한 1 단계의 당뇨 망막병증 개선을 가져옴을 특징으로 하는 방법.
  51. 청구항 49 또는 50에 있어서, 상기 방법은 ETDRS-DRSS 분류 기준으로 최소한 2 단계의 당뇨 망막병증 개선을 가져옴을 특징으로 하는 방법.
  52. 청구항 17-19 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 RVO를 가짐을 특징으로 하는 방법.
  53. 청구항 52에 있어서, RVO는 분지 RVO임을 특징으로 하는 방법.
  54. 청구항 52에 있어서, RVO는 중심 RVO임을 특징으로 하는 방법.
  55. 청구항 52에 있어서, 환자는 분지 및 중심 RVO를 모두 가짐을 특징으로 하는 방법.
  56. 청구항 52에 있어서, 환자는 절반-중심 RVO를 가짐을 특징으로 하는 방법.
  57. 청구항 52-56 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 망막 혈관 폐색 (RVO) 후 황반 부종을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  58. 청구항 1-57 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 시력을 유지시킴을 특징으로 하는 방법.
  59. 청구항 58에 있어서, 상기 방법은 기준선 (치료 시작 전 시력)과 비교시 시력을 유지시킴을 특징으로 하는 방법.
  60. 청구항 58 또는 59에 있어서, 상기 방법은 최소한 30 일 동안 기준선과 비교하여 시력을 유지시킴을 특징으로 하는 방법.
  61. 청구항 58-60 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 15개 문자 미만의 시력을 소실함을 특징으로 하는 방법.
  62. 청구항 61에 있어서, 환자는 기준선 (치료 시작 전 시력)과 비교하여 15개 문자 미만의 시력을 소실함을 특징으로 하는 방법.
  63. 청구항 1-57 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 시력을 개선시킴을 특징으로 하는 방법.
  64. 청구항 63에 있어서, 상기 방법은 기준선 (치료 시작 전 시력)과 비교시 시력을 개선시킴을 특징으로 하는 방법.
  65. 청구항 63 또는 64에 있어서, 상기 방법은 최소한 30 일 동안 기준선과 비교하여 시력을 개선시킴을 특징으로 하는 방법.
  66. 청구항 63-65 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 최소한 15개 문자의 시력을 얻음을 특징으로 하는 방법.
  67. 청구항 66에 있어서, 환자는 기준선 (치료 시작 전 시력)과 비교하여 최소한 15개 문자의 시력을 얻음을 특징으로 하는 방법.
  68. 청구항 1-67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 망막 두께를 감소시킴을 특징으로 하는 방법.
  69. 청구항 1-68 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 이전에 VEGF 억제제로 치료받은 적이 있음을 특징으로 하는 방법.
  70. 청구항 1-69 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 VEGF 억제제를 이용한 치료에 불응성이거나 불내성임을 특징으로 하는 방법.
  71. 청구항 69 또는 70에 있어서, VEGF 억제제는 아플리버셉트임을 특징으로 하는 방법.
  72. 청구항 69 또는 70에 있어서, VEGF 억제제는 라니비주맙임을 특징으로 하는 방법.
  73. 청구항 69 또는 70에 있어서, VEGF 억제제는 베바시주맙임을 특징으로 하는 방법.
  74. 청구항 69 또는 70에 있어서, 환자는 이전에 페갑타닙으로 치료받은 적이 있음을 특징으로 하는 방법.
  75. 청구항 74에 있어서, 환자는 페갑타닙을 이용한 치료에 불응성이거나 불내성임을 특징으로 하는 방법.
  76. 청구항 1-75 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 이전에 플루오시놀론 아세토니드로 치료받은 적이 있음을 특징으로 하는 방법.
  77. 청구항 76에 있어서, 환자는 플루오시놀론 아세토니드를 이용한 치료에 불응성 또는 불내성임을 특징으로 하는 방법.
  78. 청구항 1-77 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 안구 또는 안구주위 감염이 없음을 특징으로 하는 방법.
  79. 청구항 1-77 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 녹내장이 없음을 특징으로 하는 방법.
  80. 청구항 1-79 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 활성 안구내 염증이 없음을 특징으로 하는 방법.
  81. 청구항 1-80 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 겸상 세포 질병이 없음을 특징으로 하는 방법.
  82. 청구항 81에 있어서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 주변 망막 허혈이 없음을 특징으로 하는 방법.
  83. 청구항 81에 있어서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 증식성 낫 적혈구 망막병증이 없음을 특징으로 하는 방법.
  84. 청구항 81에 있어서, 환자는 겸상 세포 질병의 합병증으로 유리체 출혈이 없음을 특징으로 하는 방법.
  85. 청구항 1-84 중 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 ActRII 폴리펩티드임을 특징으로 하는 방법.
  86. 청구항 85에 있어서, ActRII 폴리펩티드는 다음으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 방법:
    a) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 10의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    b) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 11의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    c) 서열 번호:9의 아미노산 30-110과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 9의 아미노산 30-110의 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    d) 서열 번호:1의 아미노산 29-109와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 1의 아미노산 29-109의 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    e) 서열 번호:1의 아미노산 25-131과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 1의 아미노산 25-131의 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    f) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 2의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    g) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 3의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    h) 서열 번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 5의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    i) 서열 번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 6의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    j) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 45의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    k) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 48의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    l) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 49의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
    m) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 65의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  87. 청구항 86에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대해 위치 79에서 산성 아미노산을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  88. 청구항 87에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대해 위치 79에서 D 또는 E를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  89. 청구항 86-88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 ActRII 폴리펩티드 도메인 이외에, 면역글로불린 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질임을 특징으로 하는 방법.
  90. 청구항 89에 있어서, 면역글로불린 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인임을 특징으로 하는 방법.
  91. 청구항 89에 있어서, 면역글로불린 Fc 도메인은 서열 번호: 14-18 중 어느 하나에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  92. 청구항 89-91 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질은 ActRII 도메인과 면역글로불린 Fc 도메인 사이에 위치한 링커 도메인을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  93. 청구항 92에 있어서, 링커 도메인은 다음으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 방법: GGG (서열 번호: 19), GGGG (서열 번호: 20), TGGGG (서열 번호: 21), SGGGG (서열 번호: 22), TGGG (서열 번호: 23), SGGG (서열 번호: 24), 및 GGGGS (서열 번호: 25).
  94. 청구항 89에 있어서, 상기 폴리펩티드는 다음으로 구성된 그룹에서 선택된 폴리펩티드를 포함하는 ActRII-Fc 융합 단백질임을 특징으로 하는 방법:
    a) 서열 번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 32의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    b) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 36의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    c) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 39의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    d) 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 40의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    e) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 41의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    f) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 44의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    g) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 46의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    h) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 50의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    i) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 61의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    j) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 64의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    k) 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 78의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
    l) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 또는 서열 번호: 79의 아미노산 서열에 최소한 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  95. 청구항 94에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대해 위치 79에서 산성 아미노산을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  96. 청구항 95에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 1에 대해 위치 79에서 D 또는 E를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  97. 청구항 85-96 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 다음에서 선택된 하나 이상의 아미노산 변형들을 포함함을 특징으로 하는 방법: 당화된 아미노산, 페길화된 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 바이오티닐화된 아미노산, 및 지질 모이어티에 접합된 아미노산.
  98. 청구항 97에 있어서, 상기 폴리펩티드는 당화된 것이며 포유동물 당화 패턴을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  99. 청구항 98에 있어서, 상기 폴리펩티드는 당화된 것이며 중국 햄스터 난소 세포주로부터 수득가능한 당화 패턴을 가짐을 특징으로 하는 방법.
  100. 청구항 85-99 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 GDF11에 결합함을 특징으로 하는 방법.
  101. 청구항 85-100 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 GDF8에 결합함을 특징으로 하는 방법.
  102. 청구항 85-101 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 액티빈에 결합함을 특징으로 하는 방법.
  103. 청구항 102에 있어서, 상기 폴리펩티드는 액티빈 A에 결합함을 특징으로 하는 방법.
  104. 청구항 102 또는 103에 있어서, 상기 폴리펩티드는 액티빈 B에 결합함을 특징으로 하는 방법.
  105. 청구항 1-84 중 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 항-GDF11 또는 항-GDF8 항체임을 특징으로 하는 방법.
  106. 청구항 1-84 중 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 항-액티빈 항체임을 특징으로 하는 방법.
  107. 청구항 1-84 중 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 최소한 GDF11에 결합하는 다중특이적 항체임을 특징으로 하는 방법.
  108. 청구항 107에 있어서, 상기 다중특이적 항체는 GDF8 및/또는 액티빈에 추가로 결합함을 특징으로 하는 방법.
  109. 청구항 107 또는 108에 있어서, 상기 다중특이적 항체는 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, 또는 BMP6 중 하나 이상에 추가로 결합함을 특징으로 하는 방법.
  110. 청구항 105-109 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 이중특이적 항체임을 특징으로 하는 방법.
  111. 청구항 110에 있어서, 상기 이중특이적 항체는 GDF11 및 GDF8에 결합함을 특징으로 하는 방법.
  112. 청구항 105-111 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 키메라 항체, 인간화된 항체, 또는 인간 항체임을 특징으로 하는 방법.
  113. 청구항 1-112 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 눈 질환의 치료, 예방 또는 눈 질환의 중증도를 감소시키기 위한 하나 이상의 추가 활성 물질 또는 지지 요법과 병용하여 ActRII 길항제를 투여하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  114. 청구항 113에 있어서, 상기 하나 이상의 지지 요법들은 다음으로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 방법: 수술, 레이저 요법 (예컨대, 광응고), 항-혈관신생 요법 [예컨대, VEGF 억제제, 가령, 베바시주맙 (Avastin®), 라니비주맙 (Lucentis®), 및 아플리버셉트 (Eylea®)], Ca2+ 억제제 (예컨대, 플루나르진 및 니페디핀), 냉동요법, 고압 산소공급, Na+ 채널 차단제 (예컨대, 토피라메이트), iGluR 길항제 (예컨대, MK-801, 덱스트로메토르판, 엘리프로딜, 및 플루피르틴), 항산화제 (예컨대, 다이메틸티오우레아, 비타민 E, 알파-리포산, 초과산화물 불균등화효소, 카탈라아제, 데스페리옥사민, 만니톨, 알로퓨리놀, 칼슘 도베실레이트, 플루피르틴, 트라이메타지딘, 및 EGB-761), 항염증 물질, 섬모체투열법, 섬모체냉동요법, 안구 필터링 과정, 배액 밸브 이식, 항혈소판제 요법 (예컨대, 아스피린, 티클로피딘, 및 클로피도그렐), 항응고제 요법 (예컨대, 와파린 및 헤파린), 스테로이드제, 전신 또는 국소 코르티코스테로이드제 (예컨대, 프레드니손 트라이암시놀론 (Triesence®) 및 플루오시놀론 아세토니드 (일루비엔), 및 덱사메타손 (Ozurdex®), 스테로이드-보존 면역억제제 (예컨대, 사이클로스포린, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 마이코페놀레이트, 모페틸, 인플릭시맙 및 에타네르셉트), 식이 보충제 (예컨대, 비타민 C, 비타민 E, 루테인, 제악산틴, 아연, 염산, 비타민 B6, 비타민 B12, 및 제악산틴), 유리체절제, 공막돌륭술, 및 기체망막유착술.
  115. 청구항 113에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 활성 물질은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 억제제임을 특징으로 하는 방법.
  116. 청구항 115에 있어서, VEGF 억제제는 VEGF-A 억제제임을 특징으로 하는 방법.
  117. 청구항 113에 있어서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 태반 성장 인자 (PIGF) 억제제임을 특징으로 하는 방법.
  118. 청구항 113에 있어서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 VEGF 및 PIGF를 억제함을 특징으로 하는 방법.
  119. 청구항 115-118 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 아플리버셉트임을 특징으로 하는 방법.
  120. 청구항 115에 있어서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 라니비주맙임을 특징으로 하는 방법.
  121. 청구항 115에 있어서, 하나 이상의 추가 활성 물질은 베바시주맙임을 특징으로 하는 방법.
  122. 청구항 1-121 중 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 비경구 투여로 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  123. 청구항 1-121 중 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 피하 투여로 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  124. 청구항 1-121 중 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 안구 투여로 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  125. 청구항 1-121 중 어느 한 항에 있어서, ActRII 길항제는 유리체강내 투여로 투여됨을 특징으로 하는 방법.
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