KR20120049214A - 발열성 지방세포를 증가시키는 방법 - Google Patents

Abstract

특정 측면들에서, 본 발명은 ActRIIB 신호발생 경로의 길항제를 투여함으로써 발열성 지방세포 (가령, 갈색 지방세포 또는 기타 UCP-1 발현시키는 지방세포)를 증가시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 이러한 길항제들의 예는 ActRIIB 폴리펩티드들, 항-ActRIIB 항체, 항-미오스타틴 항체, 항-GDF3 항체, 항-Nodal, 항-악티빈, 및 항-GDF11 항체를 포함한다. 대사 및 기타 다양한 질환은 발열성 지방세포를 증가시킴으로써 치료될 수 있다.

Description

발열성 지방세포를 증가시키는 방법{METHODS FOR INCREASING THERMOGENIC ADIPOCYTES}

관련 출원의 전후참조

본 출원은 2009년 6월 8일자로 제출된 미국 가특허 출원 61/268,128; 2009년 9월 10일자로 제출된 미국 가특허 출원 61/276,422; 및 2009년 11월 3일자로 제출된 미국 가특허 출원 61/280,545의 이점을 청구한다. 상기 언급된 출원의 모든 교시는 전문이 참고문헌에 통합된다.

포유류 지방 세포들은 전통적으로 에너지를 저장하는 백색 지방세포 또는 에너지를 소비하는 갈색 지방세포로 분류된다. 갈색 지방세포는 탈공역단백질-1(uncoupling protein-1:UCP1)을 발현시키는데, 이 단백질은 미토콘드리아 양성자 구배로부터 탈공역 ATP 생산에 의해 생화학 에너지를 열로 전환시킨다(Cannon et al ., 2004, Physiol Rev 84:277-359). 이러한 발열은 차가운 환경에서 체온을 유지시키거나 또는 과도한 열량 섭취에도 불구하고 에너지 균형을 촉진시키는 역할을 한다. 갈색 지방의 대사적 중요성을 강조하면서, 마우스에서 이 유전적 제거는 인슐린 저항, 과다혈당, 과지질혈증, 및 과콜레스테롤혈증을 수반한 심각한 비만을 초래한다 (Lowell et al ., 1993, Nature 366:740-742; Hamann et al ., 1995, 당뇨병 44:1266-1273; Hamann et al ., 1996, Endocrinology 137:21-29). UCP-1가 중요한 탈공역 단백질 역할을 한다면, UCP-1를 발현시키는 지방세포는 발열성 활성을 가질 것이다.

인간에서, 갈색 지방 조직은 출생 시기에 중요한 발열성 역할을 하지만, 출생후 축소되고, 조직학적으로 드문 것으로 해산되며, 성인에서는 임상적으로 중요하지 않게 된다. 그러나, 최근 발견은 이러한 생각을 뒤집고, 성인기에서 갈색 지방 조직의 역할에 상당한 흥미를 일으켰다. 특히, 종양 전이를 모니터하기 위하여 양전자 방출 단층촬영과 자동화된 X-선 단층 촬영(PET-CT)을 복합이용하여 성인에서 실질적인 비율의 매우 활성이 높은 갈색 지방 창고로 추정되는 것을 우연히 발견하였다(Nedergaard et al ., 2007, Am J Physiol Endocrinol Metab 293: E444 - E452). 후속 연구에서, 건강한 성인에서 이러한 창고는 사실상 UCP1를 발현시키는 기능을 하는 갈색 지방이라는 것이 확인되었으며(Virtanen et al ., 2009, N Engl J Med 360:1518-1525), 차가운 환경 그러나 열적으로 중성인 조건에 노출시킨 연구대상 젊은 남성의 90% 이상에서 갈색-지방-조직 활성이 관찰되었다 (van Marken Lichtenbelt et al ., 2009, N Engl J Med 360:1500-1508). 더욱이, 다양한 진단 이유로 진행된 거의 2천개의 PET-CT 스캔의 소급 분석에서 활성 갈색 지방의 양은 전체적인 지방과다의 광범위하게 이용되는 척도인 체질량 지수와 역관계에 있어, 성인 인간 대사에서 갈색 지방의 중요한 역할의 가능성이 증가된다.(Cypess et al ., 2009, N Engl J Med 360:1509-1517). 백색 지방 조직에 산재되어 있는 발열성 지방세포 (가령, 갈색 지방세포 또는 기타 UCP-1을 발현시키는 지방세포)의 역할에 대해서는 다소 덜 명확하다.

발열성 지방세포의 중요한 대사 활성이 있다면, 생체내 발열성 지방세포를 증가시키는(가령, 형성 및/또는 증가된 활성에 의해) 물질이 필요하다.

발명의 요약

특정 측면들에서, 본 내용은 환자에서 ActRIIB 신호생성 경로의 길항제들을 이용하여 발열성 지방세포를 증가시키는 방법을 제공한다. 이러한 길항제들은 예를 들면, 가용성 ActRIIB 단백질들 (가령, ActRIIB-Fc 융합 단백질들), ActRIIB에 결합하는 또는 ActRIIB 발현을 억제하는 길항제들, 그리고 ActRIIB를 통하여 신호를 발생시키고 발열성 지방세포의 조절에 참여하는 리간드에 결합하거나 또는 리간드의 발현을 억제하는 길항제들일 수 있다. 이러한 리간드들은 미오스타틴(가령, GDF8), GDF3, 악티빈 (가령, 악티빈 A, B, C, 또는 E), GDF11, 그리고 Nodal을 포함한다.

특정 측면들에서, 본 내용은 발열성 지방세포의 증가를 필요로 하는 환자에게 ActRIIB-관련 폴리펩티드의 유효량을 투여함으로써 발열성 지방세포를 증가시키는 방법들을 제공한다. ActRIIB-관련 폴리펩티드는 ActRIIB 리간드 가령, GDF3, GDF8, GDF11, 악티빈 또는 Nodal에 결합하는 ActRIIB 폴리펩티드 (가령, ActRIIB 세포외 도메인 또는 이의 일부)일 수 있다. 선택적으로, ActRIIB 폴리펩티드는 10 micromolar 미만 또는 또는 1 micromolar 미만, 100, 10 또는 1 nanomolar 미만의 Kd로 ActRIIB 리간드에 결합한다. 각종 적합한 ActRIIB 폴리펩티드들은 다음의 공개된 PCT 특허 출원들에서 설명되어 있으며, 이들 모두 전문이 참고문헌에 통합된다: WO 00/43781, WO 04/039948, WO 06/012627, WO 07/053775, WO 08/097541, 그리고 WO 08/109167. 선택적으로, 이 ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 리간드에 의해 촉발된 세포내 신호 변환 사건등과 같은 ActRIIB 신호생성을 억제한다. 이러한 제조에 이용되는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드는 여기에서 설명된 임의의 것일 수 있는데, 가령, 서열 번호: 1, 2, 5, 6, 12, 14 및 17로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는, 또는 서열 번호: 1, 2, 5, 6, 12, 14 및 17로부터 선택된 아미노산 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드다. 가용성 ActRIIB 폴리펩티드는 서열 번호: 1, 2, 5, 6, 12, 14 및 17로부터 선택된 서열의 최소한 10개, 20개 또는 30개 아미노산을 포함하는 단편 또는 C-말단 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 10 내지 15개 아미노산이 부족하고, N-말단에서 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 아미노산이 부족한 서열 번호:1의 서열과 같은, 천연 ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 단편을 포함할 수 있다. 선택적으로, 폴리펩티드들은 서열 번호:1에 대해 N-말단에서 2 내지 5개 아미노산 그리고 C-말단에서 단지 3개 아미노산 절두를 포함할 것이다. 또다른 폴리펩티드는 서열 번호:12로 제시된다. 가용성 ActRIIB 폴리펩티드는 자연적으로 생성되는 ActRIIB 폴리펩티드에 대해 아미노산 서열내(가령, 리간드-결합 도메인내) 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 변경(alterations)을 포함할 수 있다. 아미노산 서열내 변경은 예를 들면, 포유류, 곤충 또는 기타 진핵 세포에서 만들어질 때, 폴리펩티드의 당화(glycosylation)의 변경 또는 자연적으로 생성되는 ActRIIB 폴리펩티드에 대해 폴리펩티드의 단백질 분해 절단의 변경이다. 가용성 ActRIIB 폴리펩티드는 하나의 도메인으로 ActRIIB 폴리펩티드 (가령, ActRIIB의 리간드-결합 도메인 또는 이의 변이체)와 개선된 약물동력학, 용이한 정제, 특정 조직 등에 표적화와 같은 바람직한 성질을 제공하는 하나 이상의 추가 도메인을 가지는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질의 도메인은 하나 이상의 생체내 안정성, 생체내 반감기, 흡수/투여, 조직 국소화 또는 분포, 단백질 복합체의 형성, 융합 단백질의 다중화(multimerization), 및/또는 정제를 강화시킬 수 있다. 가용성 ActRⅡB 융합 단백질은 Fc 도메인(야생형(wildtype)과 같은 면역글로불린 불변 도메인 또는 변이형(mutant)), 혈청 알부민을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, ActRII-Fc 융합체는 Fc 도메인과 세포외 ActRII 도메인 사이에 배치된 상대적으로 체계화되지 않은(unstructured) 링커(linker)를 포함한다. 이러한 체계화되지 않은 링커는 ActRII의 세포외 도메인의 C-말단 단부(꼬리)에서 대략 15개의 아미노산 체계화되지 않은 영역에 상응하거나, 또는 이차 구조가 상대적으로 없는 5개 내지 15개, 20개, 30개, 50개 또는 그 이상의 길이의 아미노산으로된 인공 서열(artificial sequence)일 수 있다. 링커는 글리신(glycine)과 프롤린(proline) 잔기가 풍부하고, 예로써, 트레오닌/세린과 글리신의 반복 서열(repeating sequence)(가령, TG₄(서열번호:18) 또는 SG₄(서열 번호:19) 반복)을 보유한다. 융합 단백질은 정제 하위서열(purification subsequence), 예를 들면, 에피토프 태그(epitope tag), FLAG 태그, 폴리히스티딘 서열, 그리고 GST 융합을 포함할 수 있다. 선택적으로, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드에는 글리코실화된 아미노산, PEG화된 아미노산, 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 비오틴화된 아미노산, 지질 모이어티(lipid moiety)에 콘쥬게이트된 아미노산, 그리고 유기 유도체화제(organic derivatizing agent)에 콘쥬게이트된 아미노산에서 선택되는 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기가 포함된다. 일반적으로, ActRIIB 단백질은 환자에서 부정적인 면역 반응(unfavorable immune response)의 가능성을 낮추기 위하여, ActRIIB 단백질의 자연적인 글리코실화를 적절하게 매개하는 포유동물 세포주(mammalian cell line)에서 발현시키는 것이 바람직하다. 인간과 CHO 세포주(cell line)가 성공적으로 이용되고 있고, 다른 통상적인 포유동물 발현 벡터들이 유용할 것으로 기대된다.

특정 측면에서, 여기에서 설명된 화합물은 약제학적 조합제로 조제될 수 있다. 제약학적 조합제는 또한, 하나 이상의 추가 화합물, 예를 들면, ActRⅡB-연관 질환을 치료하는데 이용되는 화합물을 포함할 수 있다. 적절하게는, 제약학적 조합제는 실질적으로, 발열원(pyrogen)이 없다.

특정 측면에서, 본 발명에서는 완전한 ActRⅡB 폴리펩티드를 인코드하지 않는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제시한다. 분리된 폴리뉴클레오티드는 앞서 기술된 바와 같이, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 가령, 분리된 핵산은 ActRIIB의 세포외 도메인(가령, 리간드-결합 도메인)을 코딩하는 서열과 ActRIIB의 막통과 도메인 및/또는 세포질 도메인의 일부 또는 전부를 코딩하지만 막통과 도메인 또는 세포질 도메인 내에 배치된, 또는 세포외 도메인과 막통과 도메인 또는 세포질 도메인 사이에 배치된 종결 코돈(stop codon)을 코딩하지 않는 서열을 보유할 수 있다.

가령, 분리된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 4의 전장 ActRIIB 폴리뉴클레오티드 서열 또는 부분적으로 절두된 형태의 ActRIIB 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 3'-말단 앞에 또는 폴리뉴클레오티드의 해독에 의해 전장 ActRII의 절두된 일부분에 임의적으로 융합된 세포외 도메인을 발생시키도록 배치된 최소한 600개 뉴클레오티드의 전사 종료 코돈(transcription termination codon)을 더 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 핵산은 발현을 위한 프로모터(promoter)에 작동가능하게 연결될 수 있고, 본 발명에서는 이런 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포를 제시한다. 적절하게는, 상기 세포는 CHO 세포와 같은 포유동물 세포이다.

특정 측면들에서, 본 발명에서는 가용성, ActRⅡB 폴리펩티드를 만드는 방법을 제시한다. 이런 방법에는 적절한 세포, 예를 들면, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포에서 본 명세서에 개시된 임의의 핵산(가령, 서열 번호: 3)을 발현시키는 것이 포함될 수 있다. 이런 방법은 a) 가용성 ActRII 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고, 여기서 상기 세포는 가용성 ActRII 발현 구조체로 형질전환되고; b) 이렇게 발현된 가용성 ActRII 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다. 가용성 ActRII 폴리펩티드는 세포 배양물로부터 단백질을 수득하는 공지의 임의 기술을 이용하여 정제되지 않은, 부분적으로 정제된 또는 고도로 정제된 분취물(fraction)로서 회수될 수 있다.

특정 측면에서, 여기에서 설명된 화합물을 이용하여 발열성 지방세포를 증가시키는 것은 대사 활성 조절이 유익한 다양한 질환의 관리에 유용할 수 있다. 예로 비만 관리, 신체 지방 함량을 감소시키거나 또는 신체 지방 함량의 증가 비율을 감소, 비만, 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병(NIDDM), 유형 2 당뇨병, 심혈관 질환, 암, 고혈압, 골관절염, 발작, 호흡기 문제, 이상지질혈증, 지질이영양증, 코르티코스테로이드 투여 결과, 담낭질환과 같은 질환의 치료를 포함한다.

특정 측면들에서, 여기에서 설명된 가용성 ActRIIB 폴리펩티드는 근육 손실 또는 불충분한 근육 성장과 관련된 질환을 가진 개체의 치료 방법에 이용될 수 있는데, 이러한 질환은 비만, 지질이영양증, 당뇨병 (가령, 유형 II 당뇨병), 악액질과 같은 대사 질환 또는 상기 설명된 기타 질환과 또한 연관된다. 이러한 질환은 근위축증, 근감소증 및 HIV (근육 소모와 지질이영양증 모두에 관련될 수 있음)을 포함한다.

특정 측면들에서, 본 배양은 세포안에서 ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB 리간드 (가령, GDF8, GDF11, 악티빈, GDF3, 및 Nodal)의 활성을 길항하는 방법을 제공한다. 이 방법들은 세포를 가용성 ActRIIB 폴리펩티드에 접촉시키는 것을 포함한다. 선택적으로, ActRIIB 폴리펩티드 또는 ActRIIB 리간드의 활성은 ActRIIB/ActRIIB 리간드 복합체에 의해 중재되는 신호 변환으로, 예를 들면, 세포 증식 또는 UCP-1 발현의 수준으로 모니터한다. 이들 방법의 세포는 골아세포, 연골세포, 근세포, 지방세포 그리고 근육 세포를 포함한다.

특정 측면들에서, 본 내용은 여기에서 설명된 질환 또는 상태의 치료를 위한 약물 제조에 가용성 ActRIIB 폴리펩티드의 용도를 제공한다.

특정 측면들에서, 본 내용은 발열성 지방세포를 증가시킬 필요가 있는 환자에서 발열성 지방세포를 증가시키는 방법을 제공하는데, 이러한 방법은 서열 번호:2의 아미노산 29-109의 서열에 최소한 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 그리고 엄격한 혼성화 조건하에 서열 번호:3의 핵산에 혼성화되는 핵산에 의해 인코드된 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 폴리펩티드는 이종(heterologous) 부분을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 폴리펩티드는 이량체(dimer)일 수 있다. 폴리펩티드는 면역글로블린의 불변 도메인에 융합될 수 있다. 폴리펩티드는 면역글로블린, 가령, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 부분에 융합될 수 있다. 폴리펩티드는 서열 번호:2의 아미노산 29-109, 29-128, 29-131, 29-134, 25-109, 25-128, 25-131, 25-134 또는 20-134 서열에 최소한 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 서열 번호:5, 6, 12, 14 또는 17의 아미노산 서열에 최소한 80%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 화합물로 치료될 환자는 예를 들면, 대사 질환 (가령, 비만, 당뇨병, 대사 증후군, 이상지질혈증 또는 지질이영양증) 또는 대사 질환과 관련된 근육 질환 (가령, 일부 경우의 근감소증)을 포함하는 여기에서 설명된 질환을 가진 환자일 수 있다. 화합물의 투여로 치료된 환자의 지방 세포에서, 선택적으로 백색 지방 조직에서 UCP-1 발현이 촉진될 수 있다.

특정 측면들에서, 본 내용은 발열성 지방세포의 증가를 요하는 환자에서 발열성 지방세포를 증가시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 ActRIIB 또는 ActRIIB를 통하여 신호생성하는 리간드를 표적으로 하여 ActRIIB 신호생성 경로를 억제하는 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 화합물들의 예는 ActRIIB의 길항제들; 미오스타틴(가령, GDF-8)의 길항제들; 악티빈 (가령, 악티빈 A, 악티빈 B, 악티빈 C, 또는 악티빈 E)의 길항제들; GDF-11의 길항제들; Nodal의 길항제들; 그리고 GDF3의 길항제들을 포함한다. 상기 각 길항제들은 이러한 표적에 결합하여 표적을 억제하는 항체 또는 기타 단백질일 수 있다(가령, 단클론 항체 또는 미오스타틴 및 GDF3의 경우 프로펩티드). 전술한 길항제들은 또한 ActRIIB 또는 리간드의 발현을 억제하는 핵산 기반 화합물(가령, 안티센스 또는 RNAi 핵산)과 같은 화합물일 수 있다. 이러한 화합물로 치료될 환자는 예를 들면, 대사 질환 (가령, 비만, 당뇨병, 대사 증후군, 이상지질혈증 또는 지질이영양증) 또는 대사 질환과 관련된 근육 질환 (가령, 일부 경우의 근감소증)을 포함하는 여기에서 설명된 질환을 가진 환자일 수 있다. 화합물의 투여로 치료된 환자의 지방 세포에서, 선택적으로 백색 지방 조직에서 UCP-1 발현이 촉진될 수 있다.

도 1은 고지방식이를 섭취한 수컷 마우스의 고환 지방 조직에서 탈공역단백질-1 (UCP1) mRNA 수준에 있어서 60일간의 ActRIIB(20-134)-hFc 치료 효과를 나타낸다. RT-PCR 데이터 (비교 단위, RU)는 평균 ± SEM; *, 비이클과 비교하였을 때 p < 0.05. ActRIIB(20-134)-hFc는 갈색 지방의 선택적 표식을 인코드하는 mRNA를거의 9배 증가시켰고, 따라서, 백색 지방 창고내 분산된 갈색 지방 세포에서 발열성 능력의 상향을 나타낸다.
도 2는 고지방식이를 섭취한 마우스에서 60일간의 ActRIIB(25-131)-hFc 치료에 의해 유도된 의 고환 백색 지방 조직내 유도된 발열성 조직 변화를 나타낸다. 모든 현미경 영상은 동일한 확대 비율로 나타낸다. 헤마토실린 및 에오신 (H&E) 착색은 지질 방울 크기를 감소시키고 그리고 갈색 지방의 다방성(multilocular) 지방세포(화살표)의 클러스터를 유도하는 ActRIIB(25-131)-hFc의 능력을 표시한다. 한다. 비-인접 부분의 면역착색(Immunostaining)은 다방성 및 일방성(unilocular) 지방 세포 모두에서 UCP1 (녹색 경황)의 광범위한 세포질 유도를 나타낸다.
도 3은 고지방식이가 제공된 마우스의 고환 백색 지방내 UCP1 mRNA 수준에 있어서 60일간 ActRIIB(25-131)-hFc 처리 효과를 보여준다. RT-PCR 데이터(비교 단위, RU)는 평균 ± SEM; n=그룹당 6-7 * p < 0.05. ActRIIB(25-131)-hFc는 갈색 지방의 선택적 표식을 인코드하는 mRNA를 60배 증가시켰고, 따라서, 백색 지방 창고내 분산된 갈색 지방 세포에서 발열성 능력의 상향을 나타낸다.
도 4는 마우스의 고환 백색 지방에서 60일간 ActRIIB(25-131)-hFc 치료와 식이에 대한 함수로써 시르투인 패밀리 구성부 SIRT-1 (silent information regulator two, homolog 1)를 인코드하는 mRNA의 수준을 보여준다. RT-PCR 데이터(비교 단위, RU)는 평균 ± SEM; n=그룹당 7 * p < 0.05; NS = 유의적이지 않음. 고지방식이가 공급된 마우스에서, ActRIIB(25-131)-hFc는 SIRT-1 mRNA 수준을 70% 이상 증가시켰고, 표준 식이가 공급된 마우스의 수준과 유의적으로 다르지 않는 수준까지 복원시켰다.
도 5는 마우스의 고환 백색 지방에서 60일간 ActRIIB(25-131)-hFc 치료와 식이에 대한 함수로써 PGC-1α (페록시좀 증식물질-활성화된 수용체 감마 공동활성물질-1α)를 인코드하는 mRNA의 수준을 보여준다. RT-PCR 데이터(비교 단위, RU)는 평균 ± SEM; n=그룹당 6-7; ***, p < 0.001. 고지방식이가 공급된 마우스에서, ActRIIB(25-131)-hFc는 PGC-1α mRNA 수준을 250% 이상 증가시켰고, 표준 식이가 공급된 마우스의 수준과 유의적으로 다르지 않는 수준까지 복원시켰다.
도 6은 마우스의 고환 백색 지방에서 60일간 ActRIIB(25-131)-hFc 치료와 식이에 대한 함수로써 Foxo-1 (포크머리 상자를 포함하는, 단백질 O 하위패밀리-1)를 인코드하는 mRNA의 수준을 보여준다. RT-PCR 데이터(비교 단위, RU)는 평균 ± SEM; n=그룹당 7; **, p < 0.01. 고지방식이가 공급된 마우스에서, ActRIIB(25-131)-hFc는 Foxo-1 mRNA 수준을 90% 이상 증가시켰고, 표준 식이가 공급된 마우스의 수준과 유의적으로 다르지 않는 수준까지 복원시켰다.
도 7은 마우스의 고환 백색 지방에서 60일간 ActRIIB(25-131)-hFc 치료와 식이에 대한 함수로써 아디포넥틴 mRNA의 수준을 보여준다. RT-PCR 데이터(비교 단위, RU)는 평균 ± SEM; n=그룹당 7; *, p < 0.05. 고지방식이가 공급된 마우스에서, ActRIIB(25-131)-hFc는 아디포넥틴 mRNA 수준을 60% 이상 증가시켰고, 이들 마우스에서 순환 아디포넥틴 농도를 상승시키는데 기여한다.
도 8은 마우스를 60일간 ActRIIB(25-131)-hFc 치료와 식이에 대한 함수로써 아디포넥틴의 혈청 수준을 보여준다. ELISA 측정은 모든 주요 올리고머형 이소폼(총 아디포넥틴)을 탐지하고, 그리고 데이터는 평균 ± SEM; n=그룹당 7-8 마리;**, p < 0.01; ***, p < 0.001. 고지방식이가 공급된 마우스에서, ActRIIB(25-131)-hFc는 순환 아디포넥틴 수준을 75% 이상 증가시켰고, 이는 표준-식이 대조군의 것을 상당히 초과하였다.
도 9는 마우스를 60일간 ActRIIB(25-131)-hFc 치료와 식이에 대한 함수로써 인슐린의 혈청 수준을 보여준다. 데이터는 평균 ± SEM; n=그룹당 7-8 마리;**, p < 0.01. 고지방식이가 공급된 마우스에서, ActRIIB(25-131)-hFc는 표준-식이 대조군에서 관찰되는 수준으로 인슐린 농도를 표준화시켰다.
도 10은 마우스를 60일간 ActRIIB(25-131)-hFc 치료와 식이에 대한 함수로써 견갑골사이 갈색 지방 주머니의 양측 쌍의 사진을 보여준다. 고지방식이는 이 주머니의 크기를 증가시키고 색깔을 밝게 하지만, ActRIIB(25-131)-mFc는 이러한 변화를 대게 역전시켰다.
도 11은 고지방식이가 공급된 마우스에서 견갑골사이 갈색 지방의 양에 있어서 60일간 ActRIIB(25-131)-hFc 치료 효과를 나타낸다. 복합된 좌측 및 우측 주머니에 대해 데이터는 평균± SEM이다; ***, p < 0.001. ActRIIB(25-131)-mFc는 이러한 갈색 지방 주머니의 양에 대해 고지방식이 영향을 역전시켰다.
도 12는 마이크로-CT로 측정하였을 때, 고지방식이가 공급된 마우스에서 견갑골사이 갈색 지방의 밀도에 있어서 60일간 ActRIIB(25-131)-hFc 치료 효과를 나타낸다. 데이터 (평균 ± SEM)는 골 미네랄 하이드록시아파타이트 (HA)에 대한 양성 값과 물에 대한 0(제로) 값에 근거하여 표준화된 단위로 나타낸다; 따라서, 지방 값은 음성이며, 백색 지방에 대한 값은 일반적으로 -120에 근접한다. **, p < 0.01. ActRIIB(25-131)-mFc는 이러한 갈색 지방 주머니의 밀도에 대해 고지방식이 영향을 완전하게 역전시켰다.
도 13은 ActRIIB(25-131)-hFc (서열 번호:14)의 전장 아미노산 서열을 나타낸다. TPA 리더 (잔기 1-22) 및 절두된 ActRIIB 세포외 도메인 (고유 잔기 25-131)는 각각 밑줄로 표시된다. 성숙 융합 단백질의 N-말단 아미노산으로 서열화함으로써 나타난 글루타메이트는 밝게 나타낸다.
도 14는 ActRIIB(25-131)-hFc (코딩 스트랜드, 서열 번호: 15는 상부에, 보체 스트랜드, 서열 번호: 16는 아래에 3’-5’방향으로 나타낸다)을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. TPA 리더 (뉴클레오티드 1-66) 및 ActRIIB 세포외 도메인 (뉴클레오티드 73-396)를 인코드하는 서열은 밑줄로 표시한다. ActRIIB(25-131)에 대한 대응하는 아미노산 서열도 또한 나타낸다.

1. 개요

포유류 지방 세포들은 에너지를 저장하는 백색 지방세포 또는 에너지를 소비하는 갈색 지방세포로 분류된다. 탈공역단백질-1(uncoupling protein-1:UCP1)은 미토콘드리아 양자(proton) 구배로부터 탈공역 ATP 생산을 통하여 생화학 에너지를 열로 전환시켜, 갈색 지방세포에 대한 한정적인 기능 표식으로 광범위하게 간주된다. 지방세포 발현시키는 UCP-1은 “발열성 지방세포”로 지칭된다. 마우스에서 갈색 지방 조직의 유전적 제거는 고도 비만을 유도하고(Lowell et al ., 1993, Nature 366:740-742), 그리고 UCP1의 선택적 제거는 마우스에서 β₃-아드레날린 자극에 대해 발열성 그리고 항-비만 반응을 막는다는 것은(Inokuma et al ., 2006, Am J Physiol Endocrinol Metab 290:E1014-E1021), UCP1가 에너지 소비 및 지방과다의 조절에 주요 분자라는 것을 확인시킨다(Kozak et al ., 2008, Int J Obes 32: S32 - S38).

설치류에서 인간에 이르는 범위의 포유동물에서, 갈색 지방세포는 갈색 지방 조직의 분리된 주머니에서 발생되는데, 이는 신생아에서 가장 두드러지며, 이 나이에 생존에 대한 열적 도전과 일치한다. 최근 발견에서 이러한 갈색 지방 주머니는 인간의 성인기 동안 발열성 능력을 지속한다는 것을 나타내고(Nedergaard et al ., 2007, Am J Physiol Endocrinol Metab 293: E444 - E452 ; van Marken Lichtenbelt et al ., 2009, N Engl J Med 360:1500-1508; Cypess et al ., 2009, N Engl J Med 360:1509-1517), 이러한 조직이 치료 유익함을 위하여 외생적으로 활성화될 수 있다는 가능성이 대두된다. 흥미로운 것은, 갈색 지방세포의 상당 수는 출생후 초기 발생동안 일부 “백색” 지방 주머니안에서 일시적으로 발생되기도 하고(Xue et al ., 2007, J Lipid Res 48:41-51) 그리고 성인기에서 특정 조건하에 백색 지방 주머니에서 다시 나타날 수 있다(Cousin et al ., 1992, J Cell Sci 103:931-942). 인간의 경우에서도, 제한된 증거들은 성인기동안 백색 지방 주머니안에서 갈색 지방세포는 유도성이라는 것을 제안한다(Lean et al ., 1986, Int J Obes 10:219-227). 따라서, ‘널리 퍼진(diffuse)’ 발열성 지방세포는 치료 목적으로 전통적인 백색 지방 주머니안에서 유도될 수 있다는 가능성도 또한 있다. 사실, 백색 지방 조직의 전통적인 주머니는 별도의 갈색 지방 주머니에서는 관찰되지 않는 세포 재건(cellular remodeling), 또는 표현형적인 가소성을 어느 정도 나타낸다(Prunet - Marcassus et al ., 2006, Exp Cell Res 312:727-736).

실시예에서 설명되는 것과 같이, ActRIIB-Fc 융합 단백질은 고지방식이가 공급된 마우스의 지방 주머니에 UCP-1 신호발생을 증가시키는데 이용할 수 있다. 따라서, ActRIIB-유도된 물질들과 ActRIIB 신호발생을 억제하는 기타 화합물들을 이용하여 발열성 지방세포의 수 및/또는 활성을 증가시킬 수 있다. 발열성 지방세포의 조절에 연루된 ActRIIB에 결합하는 리간드들은 악티빈 (가령, 악티빈 A, 악티빈 B, 악티빈 C, 및 악티빈 E), 미오스타틴(가령, GDF-8), GDF-3, GDF-11, 및 Nodal을 포함한다. 특정 측면들에서, 본 발명은 ActRIIB 폴리펩티드들에 관한 것이다. 여기에서 사용된 것과 같이, “ActRIIB”는 임의의 종으로부터 유도된 악티빈 수용체 유형 IIB (ActRIIB) 단백질들과 ActRIIB-관련 단백질들의 패밀리를 말한다. ActRIIB 패밀리의 구성부들은 일반적으로 시스테인이 풍부한 부분을 가진 리간드-결합 세포외 도메인, 막통과 도메인, 그리고 예상된 세린/트레오닌 키나제 특이성을 가진 세포질 도메인으로 구성된 모든 막통과 단백질들이다. 인간 ActRIIB 전구물질은 다음의 아미노산 서열을 가지는데, 밑줄은 신호 펩티드이며, 굵게 나타낸 부분은 세포외 도메인이며, 잠재적인 N-연결된 당화 부위는 박스로 표시되어 있다 (서열 번호: 2) (NM_001106, 512 aa).

고유 리더를 포함하는 상기 야생형 서열은 명세서를 통하여 임의의 다양한 절두, 성숙한 형태 및 ActRIIB의 변이체의 아미노산의 번호매김을 위한 기준 서열로 이용된다. 용어 "ActRIIB 폴리펩티드"는 ActRIIB 패밀리 구성원의 자연적으로 생성되는 폴리펩티드 뿐만 아니라 유용한 활성을 보유하는 이의 임의 변이체(돌연변이체, 단편, 융합체, 단백질모방체를 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, ActRⅡB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드 서열의 최소 80% 상동성인, 바람직하게는 최소 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상의 상동성을 가진 서열을 가지는 임의 공지의 ActRⅡB 서열에서 유도된 폴리펩티드를 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명은 가용성 ActRIIB 폴리펩티드에 관계한다. 여기에서 설명하는 것과 같이, 용어 "가용성 ActRIIB 폴리펩티드"는 일반적으로 ActRIIB 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 여기에서 사용된 바와 같은, "가용성 ActRIIB 폴리펩티드"에는 ActRIIB 단백질의 자연적으로 생성되는 세포외 도메인 뿐만 아니라 유용한 활성을 보유하는 이의 임의 변이체(돌연변이체, 단편, 융합체, 단백질모방체를 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 말한다.

예를 들면, ActRIIB 단백질의 세포외 도메인은 리간드에 결합하고, 일반적으로 가용성이다. 다음은 가용성 ActRIIB 폴리펩티드의 예가 된다(서열 번호: 1) (116 aa).

가용성 ActRIIB 폴리펩티드의 다른 예로는 ActRIIB 단백질의 세포외 도메인에 추가로 시그날 서열을 포함한다(실시예 1 참고). 시그날 서열은 ActRIIB의 고유 시그날이 되거나 또는 조직 플라스미노겐 활성물질(TPA) 시그날 서열 또는 꿀벌 멜라틴(HBM) 시그날 서열과 같은 또 다른 단백질로부터 유도된 시그날 서열이 될 수 있다.

2개의 관련된 II형 수용체(ActRII), ActRIIA와 ActRIIB는 액티빈에 대한 II형 수용체로서 확인되었고(Mathews and Vale , 1991, Cell 65:973-982; Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108), 뿐만 아니라 다양한 기타 BMPs 및 GDFs로 확인되었다. 게다가, 액티빈, ActRIIa와 ActRIIb는 BMP7, Nodal, GDF8과 GDF11을 비롯한 여러 다른 TGF-β 집단 단백질과 생화학적으로 상호작용할 수 있다(Yamashita et al ., 1995, J. Cell Biol . 130:217-226; Lee and McPherron , 2001, Proc . Natl . Acad. Sci . 98:9306-9311; Yeo and Whitman , 2001, Mol . Cell 7: 949-957; Oh et al ., 2002, Genes Dev. 16:2749-54). 특정 구체예들에서, 본 발명은 ActRⅡB 수용체(여기에서는 ActRⅡB 리간드라고 하기도 함)의 리간드가 대상 ActRⅡB 폴리펩티드(예를 들면, 가용성 ActRⅡB 리간드)를 길항하는 것에 관계한다. 따라서, 본 발명의 조성물과 방법은 ActRⅡB 수용체의 하나 또는 그 이상의 리간드의 비정상적 활성을 가진 질환 치료에 유용하다. ActRⅡB 수용체의 예시적인 리간드에는 악티빈 (가령, 악티빈 A, 악티빈 B, 악티빈 C, 및 악티빈 E), GDF3, Nodal, GDF8, 그리고 GDF11과 같은 일부 TGF-β 패밀리 구성원을 포함한다.

액티빈은 이량체 폴리펩티드 생장인자로써 TGF-베타 대과(superfamily)에 속한다. 두 가지 매우 근접하게 관련된 β소단위의 동종/이종 이량체(β_Aβ_A, β_Bβ_B, 및 β_Aβ_B)인 세 가지 액티빈(A, B, 및 AB)이 있다. TGF-베타 대과에서, 액티빈은 난소와 태반 세포에서 호르몬 생산을 촉진하고, 신경 세포 생존을 뒷받침하고, 세포 유형(cell type)에 따라 세포-주기 진행에 긍정적인 또는 부정적인 영향을 주고, 최소한 양서류 배(amphibian embryo)에서 중배엽(mesodermal) 분화를 유도할 수 있는 독특한 다중기능성 인자이다(DePaolo et al ., 1991, Proc SocEp Biol Med . 198:500-512; Dyson et al ., 1997, Curr Biol . 7:81-84; Woodruff , 1998, Biochem Pharmacol . 55:953-963). 게다가, 자극된 인간 단핵구 백혈병(monocytic leukemic) 세포로부터 분리된 적혈구 분화 인자(erythroid 분화 인자, EDF)가 액티빈 A와 동일한 것으로 밝혀졌다(Murata et al ., 1988, PNAS , 85:2434). 액티빈 A는 골수에서 적혈구생성을 촉진하는 것으로 제안되었다. 여러 조직에서, 액티빈 시그날전달은 관련된 이종이합체(heterodimer), 인히빈(inhibin)에 의해 길항된다. 가령, 뇌하수체(pituitary)로부터 여포-자극 호르몬(follicle-stimulating hormone, FSH)의 방출 동안, 액티빈은 FSH 분비와 합성을 촉진하는 반면, 인히빈은 FSH 분비와 합성을 막는다. 액티빈 생물활성(bioactivity)을 조절하고 및/또는 액티빈에 결합하는 다른 단백질에는 하기에서 설명될, 폴리스타틴(follistatin, FS), 폴리스타틴-관련된 단백질(follistatin-related protein, FSRP)과 α2-마크로글로불린(macroglobulin), Cerberus, 및 엔도글린이 포함되며, 하기에서 설명된다.

골형성 단백질-1(OP-1)으로도 알려진 뼈 형성 단백질 (BMP7)은 연골 및 뼈 형성을 유도하는 것으로 잘 알려져 있다. 또한, BMP7는 광범위한 생리학적 과정을 조절한다. 특히, BMP7은 갈색 지방세포 분화의 주요 프로모터로 최근에 확인되었다(Tseng et al ., 2008, Nature 454:1000-1004). 이 연구에서, BMP7의 유전적 제거는 뮤린 배에서 갈색 지방의 부족과 UCP1의 거의 완전한 부재를 유도하였다. 더욱이, 아데노바이러스 투여에 의한 마우스에서 BMP7 발현의 상향 조절은 갈색 지방량과 에너지 소비를 증가시켰다. 따라서, 이 문헌은 ActRIIB 폴리펩티드 또는 항-ActRIIB 항체와 같은 BMP7의 길항제는 UCP1 발현, 갈색 지방세포 형성, 및/또는 갈색 지방세포 활성을 촉진시킬 것으로 예측되지 않는다고 제안할 것이다. 악티빈과 유사하게, BMP7은 유형 II 수용체들, ActRIIA 및 ActRIIB에 결합한다. 그러나, BMP7 및 악티빈은 별개의 유형 I 수용체들을 이형이량 수용체 복합체로 모집한다. 관찰된 주요 BMP7 유형 I 수용체는 ALK2이었고, 악티빈은 독점적으로 ALK4 (ActRIIB)에 결합하였다. BMP7 및 악티빈은 별개의 생물학적 반응과 활성화된 상이한 Smad 경로를 유도하였다(Macias - Silva et al ., 1998, J Biol Chem . 273:25628-36).

Vg1-관련 2로도 알려진 성장-및-분화 인자-3 (GDF3)은 배 발생에 중요한 역할을 하고, 성인기 동안 지방세포분화에도 연루되었다. 간략하게 설명하면, 백색 지방 조직내 GDF3의 발현은 체질량 또는 비만에 관련되고(Weisberg et al ., 2003, J Clin Invest 112:1796-1808), 그리고 GDF3의 아데노바이러스-중개된 과다발현은 야생형 마우스에서 고지방식이 조건하에 관찰된 지방과다 증가를 지나치게 한다. (Wang et al ., 2004, Biochem Biophys Res Commun 321:1024-1031). 중요한 것은, 유전적으로 GDF3을 제거한 마우스는 건강하고, 표준 식이를 유지하면 기본적으로 정상이지만, 비만으로부터 보호되며, 그리고 고지방식이를 유지하였을 때 증가된 기초 대사율을 나타낸다(Shen et al ., 2009, Mol Endocrinol 23:113-123). 이를 함께 고려하면, 이러한 발견은 음식물에 의해 유도된 비만에 특별히 GDF3이 연루되며, 지방과다의 조절에 더 연루된다는 것을 나타낸다.

Nodal 단백질은 초기 배발생에서 심장 및 간과 같은 축 구조(axial structure)의 연속 조직화 뿐만 아니라 중배엽 및 내배엽 유도 및 형성에 기능을 가진다. 척추동물 배 발생에 복부 조직이 주로 척색 및 전척삭판(pre-chordal plate)의 축 구조에 기여하며, 주변 세포를 모집하여 비-축 배 구조(non-axial embryonic structures)를 형성하는 것으로 설명된 바 있다. Nodal은 타입 I 및 II 수용체를 통하여 그리고 Smad 단백질로 알려진 세포내 효과물질을 통하여 시그날을 전달하는 것으로 보인다. ActRHA 및 ActRIIB가 Nodal의 타입 II 수용체로 작용한다는 사상을 최근 연구가 뒷받침하였다(Sakuma et al ., Genes Cells . 2002, 7:401-12). Nodal 리간드들은 이들의 공인자(예를 들면, cripto)와 상호작용하여 액티빈 타입 I 및 타입 II 수용체를 활성화시켜, Smad2를 포스포릴화시키는 것으로 제안된다. Nodal 단백질은 초기 척추동물 배에서 중배엽 형성, 정면 패턴화(anterior patterning) 및 좌우 축 열거(left-right axis specification)을 포함하는 중요한 많은 사안들에 연루되어 있다. 실험적 증가가 Nodal 시그날링은 액티빈 및 TGF-beta에 특이적으로 반응하는 것으로 설명된 루시퍼라제 리포터인 pAR3-Lux를 활성화시킨다는 것을 설명한다. 그러나, Nodal은 골 형성 단백질에 특정하게 반응하는 리포터인 pTlx2-Lux를 유도하지는 못한다. 최근 결과에서는 Nodal 시그날링이 액티빈-TGF-베타 경로 Smad인, Smad2 및 Smad3 모두에 의해 중개된다는 직접적인 생화학적 증거를 제공한다. 추가 증거에서 Nodal 시그날링에는 세포외 cripto 단백질이 필요하다는 것을 보여주었고, 이것이 액티빈 또는 TGF-베타 시그날링과 구별된다.

생장 및 분화 인자-8 (GDF8)은 미오스타틴으로도 알려져있다. GDF8는 골근육량의 네가티브 조절물질이다. GDF8는 발생 및 성인 골근육에서 주로 발현된다. 유전자 전이 생쥐의 GDF8 null 돌연변이는 골근육의 두드러진 이상발달(hypertrophy) 및 과형성(hyperplasia)을 특징으로 한다(McPherron et al ., Nature , 1997, 387:83-90). 소(Ashmore et al ., 1974, Growth , 38:501-507; Swatland and Kieffer, J. Anim . ScL , 1994, 38:752-757; McPherron and Lee , Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 1997, 94:12457-12461; and Kambadur et al ., Genome Res ., 1997, 7:910-915)와 두드러지게는 사람에서(Schuelke et al ., N Engl J Med 2004;350:2682-8) 자연 발생 GDF8 돌연변이에서 골근육량의 유사한 증가가 분명히 나타난다. 사람에서 HIV-감염과 연관된 근 소모는 GDF8 단백질 발현 증가가 수반된다는 것을 연구에서 확인하였다(Gonzalez - Cadavid et al ., PNAS , 1998, 95:14938-43). 또한, GDF8는 근-특정 효소(예를 들면, 크레아틴 카이나제)의 생산을 조절할 수 있고, 근아세포 증식을 조절할 수도 있다(WO 00/43781). GDF8 폴리펩티드는 성숙한 GDF8 도메인 이량체에 비공유적으로 결합하여 이의 생물학적 활성을 비활성화시킨다(Miyazono et al . (1988) J. Biol . Chem ., 263: 6407-6415; Wakefield et al . (1988) J. Biol . Chem ., 263; 7646-7654; and Brown et al . (1990) Growth Factors , 3: 35-43). GDF8 또는 구조적으로 관련된 단백질에 결합하여 이들의 생물학적 활성을 저해하는 다른 단백질에는 폴리스태틴, 그리고 잠재적으로 폴리스태틴-관련 단백질들이 포함된다(Gamer et al . (1999) Dev . Biol ., 208: 222-232).

BMP11으로도 알려진 생장 및 분화 인자-11 (GDFl1)는 분비된 단백질이다(McPherron et al ., 1999, Nat. Genet . 22: 260-264). 생쥐 발생에서 GDFl1는 꼬리 돌기(bud), 사지 돌기(limb bud), 턱뼈 및 하악궁, 그리고 후근 신경절에서 발현된다(Nakashima et al ., 1999, Mech . Dev . 80: 185-189). GDFl1은 중배엽 및 신경 조직 모두에서 패턴닝에 독특한 역할을 한다(Gamer et al ., 1999, Dev Biol., 208:222-32). GDFl1은 병아리 사지 발생시에 연골형성(chondrogenesis) 및 근형성의 네가티브 조절물질인 것으로 밝혀졌다(Gamer et al ., 2001, Dev Biol . 229:407-20). 근육에서 GDF11의 발현은 GDF8과 유사한 방식으로 근육 생장을 조절하는데 이의 역할이 있을 것이라고 제안된다. 게다가, 뇌에서 GDF11의 발현으로 신경계 기능에 관련된 활성을 보유할 것이라고도 제안된다. 흥미로운 것은 GDF11은 후각상피(olfactory epithelium)에서 신경생성을 저해하는 것으로 밝혀졌다 (Wu et al ., 2003, Neuron . 37:197-207). 따라서, GDF11은 근육 질환 및 신경퇴행성 질환(예를 들면, 근위축성측색경화증)을 치료하는데 시험관 및 생체내에서 용도를 가질 것이다.

특정 측면에서, 본 발명은 특정 ActRIIB 폴리펩티드 (예를 들면, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드)를 ActRⅡB 활성과 연관된 임의 공정에서 ActRⅡB 리간드의 시그날링을 길항하는데 이용되는 것에 관계한다. 선택적으로, 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드는 악티빈 (가령, 악티빈 A, 악티빈 B, 악티빈 C, 및 악티빈 E), GDF3, Nodal, GDF8, 및 GDF11와 같은 ActRⅡB 수용체의 하나 이상의 리간드를 길항할 수 있을 것이고, 따라서, 추가 질환 치료에 유용할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명은 발열성 지방세포의 활성과 관련된 질병 또는 이상을 치료하거나 예방하는데 ActRIIB 폴리펩티드들 그리고 ActRIIB 또는 ActRIIB 리간드들의 길항제의 이용하는 것을 고려한다. ActRIIB 또는 ActRIIB 리간드는 많은 중요한 생물학적 공정을 조정하는데 관련되어 있다. 이러한 대사 질환 또는 이상의 예는 대사증후군(예를 들면, 증후군X), 당뇨병, 손상된 내당장애, 손상된 공복혈당 장애, 상승된 혈장 인슐린 농도 및 인슐린 저항성, 이상지질혈증, 과지질혈증, 과식 및 폭식증, 결장, 전립선, 유방, 자궁내막 및 신장의 암, 골관절염, 폐쇄성 수면 무호흡, 담석증, 담석, 고혈압, 심장 질환, 비정상적인 심박 및 심부정맥, 심근경색, 웅혈성 심부전, 관상 심장 질환, 관상 동맥 질환, 협심증(angina pectoris), 급사, 다낭성 난소 질환, 두개내인종(craniopharyngioma), Prader-Willi 증후군, Frohlich 증후군, GH-결핍 개체, 저신장 정상적 변형(저신장 정상적 변이), Turner 증후군, 그리고 감소된 대사 활성 또는 총 제지방량(total fat-free mass)의 비율로 휴식 에너지 소비에서 감소를 보이는 임의의 병리적 상태, 가령, 급성 림프성모구성 백혈병 어린이를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가 예는 성욕 및 생산 기능이상(가령, 불임), 남성에서 생식샘기능저하증 그리고 여성에서 다모증, 위장 운동성 질환(가령, 비만-관련 위식도 역류), 호흡기 질환(가령, 비만-호흡저하증후군 또는 Pickwickian 증후군), 심혈관 질환, 뇌경색, 뇌혈전증, 일시적 허혈 쇼크, 염증(가령, 맥관 구조의 전신 염증), 아테롬성동맥경화증, 과콜레스테롤혈증, 고뇨산혈증, 지방 간, 통풍, 담낭 질환, 정형외과 질환, 그리고 허리 통증(lower back pain)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이와 같은 질환 및 이상은 예시적인 치료 용도에서 논의된다.

본 명세서에 이용되는 용어는 일반적으로, 본 발명의 배경 내에서 각 용어가 이용되는 특정 상황에서, 당분야의 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 본 발명의 조성물과 방법, 그리고 이들을 만들고 이용하는 방법을 기술함에 있어 실시자(practitioner)에게 부가적인 지침(guidance)을 제공하기 위하여 하기에, 또는 본 명세서의 다른 곳에서 논의된다. 이용되는 용어의 범위 또는 의미는 이러한 용어가 이용되는 특정 상황으로부터 명백할 것이다.

일반적으로, “약”및 대략은 측정의 특성 또는 정확도를 고려할 때, 측정된 양에 대한 허용 오차(acceptable degree of error)를 의미한다. 전형적으로, 예시적인 허용 오차는 일정한 수치 또는 수치 범위의 20 퍼센트(%) 이내, 특히, 10% 이내, 더욱 바람직하게는, 5% 이내로 존재한다.

대안으로, 특히, 생물학적 시스템에서, “약” 또는 대략은 일정한 수치의 10배 범위(order of magnitude) 이내, 바람직하게는, 5-배 이내, 더욱 바람직하게는, 2-배 이내의 수치를 의미한다. 본 명세서에 제공된 수치량(numerical quantity)은 달리 명시되지 않는 경우에 근사치(approximate)인데, 이는 “약” 또는 대략이 명시되지 않는 경우에, 추론될 수 있음을 의미한다.

본 발명의 방법은 서열을 서로 비교하는 단계, 예를 들면, 야생형 서열을 하나 이상의 돌연변이체(서열 변이체)와 비교하는 단계를 포함한다. 전형적으로, 이런 비교는 예로써, 당분야에 널리 공지된 서열 정렬 프로그램 및/또는 알고리즘(가령, BLAST, FASTA와 MEGALIGN)을 이용한 고분자 서열의 정렬을 포함한다. 당업자는 이런 정렬에서, 돌연변이가 잔기 삽입 또는 결실을 내포하는 경우에, 서열 정렬이 삽입되거나 결실된 잔기를 보유하지 않는 고분자 서열 내에 갭(gap)(전형적으로, 대시(dash), 또는 "A"로 표시됨)을 도입할 것임을 용이하게 인식할 수 있을 것이다.

여기에서 사용된 것과 같이,“당뇨병”은 비-인슐린-의존적 진성 당뇨병 (NIDDM, 유형 II 당뇨병이라고도 함). 유형 I 당뇨병, 또는 인슐린-의존적 진성 당뇨병(IDDM)은 포도당 이용을 조절하는 호르몬인 인슐린의 절대적 결핍의 결과다. 유형 II 당뇨병, 또는 인슐린-의존적 당뇨병 (가령, 비-인슐린-의존적 진성 당뇨병 )은 인슐린 수준이 정상인 경우 또는 상승된 경우에도 발생하며, 그리고 인슐린에 적절하게 반응하는 조직의 무능력의 결과로 보인다. 대부분의 유형 II 당뇨병은 또한 비만이다.

상동한(homologous)은 모든 문법적 형태와 다양한 철자로, 동일한 종의 생물체에서 대과로부터 단백질과 상이한 종의 생물체로부터 상동한 단백질을 비롯한, 공통의 진화적 기원(common evolutionary origin)을 공유하는 두 단백질 사이의 상관관계를 지칭한다. 이들 단백질(또는 이들의 인코딩 핵산)은 동일성 비율(percent identity)의 관점에서 또는 특정 잔기 또는 모티프와 보존된 위치의 존재에 의해, 그들의 서열 유사성(sequence similarity)에 의해 반영되는 서열 상동성(sequence homology)을 갖는다.

“비만”은 과도한 체지방이 있는 상태다. 비만의 사용가능한 정의는 평당 미터당 키에 대한 체중으로 계산된 체질량지수(BMI)(㎏/㎡)에 근거한다. “비만”은 의사가 이렇게 진단한 상태를 말한다. 한 가지 표준 등급화 체계는 일반적으로 유럽, 아프리카, 토착 미국인 또는 인디안 가계의 환자에 대해 다음과 같이 설명하며, 대안 체계는 아시아계 환자에서 흔히 이용된다. 이 체계에 따르면, 비만은 30(㎏/㎡)이거나 그 이상의 BMI를 가지는 경우로 정의되며, 그렇지 않는 경우는 건강한 개체이며, 또는 최소한 하나의 병적 상태를 가진 개체는 BMI가 27(㎏/㎡) 이상인 경우를 말한다.

서열 유사성은 모든 문법적 형태에서, 공통의 진화적 기원을 공유하거나 공유하지 않는 핵산 또는 아미노산 서열 사이에 동일성 또는 일치성의 정도를 지칭한다.

하지만, 통상적인 관례와 본 출원에서, 고도로와 같은 부사로 수식될 때 상동한은 서열 유사성을 지칭하고, 공통의 진화적 기원에 관련되거나 관련되지 않는다.

2. ActRIIB 폴리펩티드들

특정 측면들에서, 본 발명은 ActRIIB 변이체 폴리펩티드 (예를 들면, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드)에 관계한다. 선택적으로, 단편, 기능적 변이체, 및 변형된 형태는 이에 상응하는 야생형 ActRIIB 폴리펩티드와 동일한 또는 유사한 생물학적 활성을 가진다. 예를 들면, 본 발명의 ActRIIB 변이체는 ActRIIB 리간드 (가령, 악티빈 A, 악티빈 AB, 악티빈 B, 악티빈 C, 악티빈 E GDF3, Nodal, GDF8, 또는 GDF11)에 결합하고, 이의 기능을 방해할 수 있다. 선택적으로, ActRIIB 폴리펩티드는 지방, 근육, 뼈 또는 연골과 같은 조직의 생장을 조절한다. ActRIIB 폴리펩티드의 예로는 사람 ActRIIB 전구 폴리펩티드 (서열 번호: 2), 그리고 가용성 사람 ActRIIB 폴리펩티드 (예를 들면, 서열 번호: 1, 5, 6, 12, 14, 및 17)가 포함된다.

명세서에서는 ActRⅡB의 기능적 활성 부분과 변이체를 동정한다. 출원인은 Hilden et al. (Blood . 1994 Apr 15;83(8):2163-70)에서 개재한 서열을 가지고, 서열 번호: 2 (A64)의 아미노산 64에 상응하는 위치에 알라닌을 가지는 Fc 융합 단백질은 액티빈 및 GDF-11에 상대적으로 낮은 친화력을 가진다는 것을 확인하였다. 대조적으로, 아미노산 64(R64)에 아르기닌을 가진 동일한 Fc 융합 단백질은 액티빈 및 GDF-11에 대한 낮은 나노몰에서 높은 피크몰 범위의 친화력을 가진다. 따라서, R64를 가진 서열은 본 명세서에서 사람 ActRIIB에 대한 야생형 기준 서열로 이용된다.

Attisano et al. (Cell . 1992 Jan 10;68(l):97-108)는 ActRⅡB의 세포외 도메인의 C-말단에 프롤린 노트(knot)의 결손으로 액티빈에 대한 친화력이 감소되었음을 보여주었다. 서열 번호:2의 아미노산 20-119를 보유하는 ActRⅡB-Fc 융합 단백질인, "ActRHB(20-l19)-Fc"은 프롤린 노트 지역과 완벽한 영역주변(juxtamembrane) 도메인을 포함하는 ActRHB(20-134)-Fc에 비교하여, GDF11 및 액티빈에 대한 결합이 감소되었다는 것을 보여준다. 그러나, ActRIIB(20-129)-Fc 단백질은 비록 프롤린 노트 지역이 파괴되었지만 야생형과 어느 정도 유사하나 다소 감소된 활성을 보유한다. 따라서, 아미노산 134, 133, 132, 131, 130, 129에서 중단되는 ActRIIB 세포외 도메인들은 모두 활성이 있는 것으로 기대되나, 아미노산 134 또는 133에서 중단되는 도메인들은 대부분 활성이 있다. 유사하게, 잔기 129-134중 임의 것에서 돌연변이는 큰 여백(margin)으로 인하여 리간드 결합 친화력을 변경시키는 것으로 보이지는 않는다. 이를 뒷받침하는 것으로, P129 및 P130 돌연변이는 실질적으로 리간드 결합이 감소되지 않는다. 따라서, ActRⅡB-Fc 융합 단백질은 아미노산 109(최종 시스테인)과 같이 조기에 종료될 수 있지만, 아미노산 109와 119사이에 또는 109, 119에서 종료되는 형태는 리간드 결합이 감소될 것으로 기대된다. 아미노산 119는 보존성이 약하여 바로 변형되거나 절두된 것이다. 아미노산 128 또는 그 이후에 끝나는 형태는 리간드 결합 활성을 보유한다. 아미노산 119와 127사이에 또는 119, 127에서 종료되는 형태는 중간정도의 결합 능력을 가질 것이다. 이들형태중 어느 것이라도 임상적 또는 실험 세팅에 따라 바람직하게 이용될 수 있을 것이다.

ActRⅡB의 N-말단에서, 아미노산 29 또는 그 전에 시작하는 단백질은 리간드 결합 활성을 보유할 것으로 예상된다. 아미노산 29는 처음 시스테인을 나타낸다. 위치 24에서 알라닌이 아스파라긴으로의 돌연변이는 실질적인 리간드 결합에 영향을 주지 않고, N-연결된 글리코실화된 서열을 도입시킨다. 이는 아미노산 20-29에 상응하는 시그날 절단 펩티드와 시스테인 가교 부위사이에 돌연변이가 허용된다는 것으로 확인된다. 특히, 위치 20, 21, 22, 23, 24에서 시작하는 구조들은 활성을 보유할 것이며, 위치 25, 26, 27, 28, 29에서 시작하는 구조도 활성을 보유할 것으로 기대된다.

이와 함께, ActRⅡB의 활성 부분은 서열 번호:2의 아미노산 29-109를 포함하며, 예를 들면, 아미노산 20-29에 상응하는 잔기에서 시작되고, 아미노산 109-134에 상응하는 위치에서 종료되는 구조들이다. 다른 예로는 위치 20-29 또는 21-29에서 시작하고, 위치 119-134, 119-133 또는 129-134, 129-133에서 종료되는 구조들이 포함된다. 다른 예로는 위치 20-24 (또는 21-24, 또는 22-25)에서 시작되고, 위치 109-134 (또는 109-133), 119-134 (또는 119-133) 또는 129-134 (또는 129-133)에서 종료되는 구조들도 포함된다. 이 범주내에 변이체들, 특히, 서열 번호:4의 상응하는 부분에 최소 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 가지는 것들도 고려할 수 있다.

명세서에서는 복합 ActRIIB 구조의 분석 결과를 포함하는데, 리간드 결합 포켓은 잔기 Y31, N33, N35, L38~T41, E47, E50, Q53~ K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78~N83, Y85, R87, A92, 그리고 E94~FlOl에 의해 한정된다. 이들 위치에서, 보존성 돌연변이도 허용되는 것으로 예상되나 R40A, K55A, F82A 및 위치 L79에서 돌연변이와 같이, K74A 돌연변이가 잘 허용된다. 개구리(Xenopus)에서 R40은 K이고, 이는 이 위치에 염기성 아미노산이 허용된다는 것을 나타낸다. 소의 ActRⅡB에서 Q53은 R이고, 개구리 ActRⅡB에서는 K이며, 따라서, 이 위치에서 R, K, Q, N 및 H을 포함하는 아미노산이 허용될 것이다. 따라서, 활성 ActRIIB 변이체 단백질의 일반적인 형태는 아미노산 29-109을 포함하나, 선택적으로 위치 20-24 또는 22-25에서 시작하고, 위치 129-134에서 종료되며, 리간드 결합 포켓에는 1개, 2개, 5개, 10개 또는 15개의 보존성 아미노산 변화를 포함하고, 리간드 결합 포켓에서 위치 40, 53, 55, 74, 79 및/또는 82에서 0개 또는 하나 또는 그 이상의 비-보존성 변화도 포함한다. 이와 같은 단백질은 서열 번호:2의 아미노산 29-109의 서열에 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 서열 상동성을 보유할 것이다. 결합 포켓 바깥 부위, 특히 가변성이 잘 허용되는 부위에는 세포외 도메인 (상기 언급한 바와 같은)의 아미노 및 카르복시 말단과 위치 42-46 및 65-73가 포함된다. 위치 65에 아스파라진이 알라닌으로 변화(N65A)는 실질적으로 A64 배경에서 리간드 결합을 개선시키고, 따라서 R64 배경에서는 리간드 결합에 결정적인 영향을 주지는 않을 것으로 기대된다. 이와 같은 변화는 A64 배경에서 N65에서 글리코실화를 대개는 제거하여, 이 부위에 상당한 변화는 용인되는 것으로 설명된다. R64A 변화는 거의 용인되지 않으며, R64K는 용인되어, H와 같은 또 다른 염기성 잔기는 위치 64에서 용인될 것이다.

ActRIIB는 거의 모든 척추동물에서 완벽하게 보존된 세포외 도메인 스트레취와 함께 잘 보존되어 있다. ActRⅡB에 결합하는 리간드에 대부분이 상당히 보존되어 있다. 따라서, 다양한 척추동물 유기체로부터 ActRⅡB 서열을 비교하여 변형될 잔기에 대한 식견을 제공한다. 따라서, 활성, 사람 ActRIIB 변이체에는 또 다른 척추동물 ActRIIB의 서열에 상응하는 위치들에 하나 또는 그 이상의 아미노산을 포함하거나 사람 또는 다른 척추동물 서열에 것과 유사한 잔기가 포함될 수 있다. 다음의 예시들은 활성 ActRⅡB 변이체를 한정하는데 있어 이와 같은 방법을 설명한다. L46는 개구리 ActRⅡB에서 발린이고, 이 위치는 변형될 수 있으며, 선택적으로 또 다른 소수성 잔기 예를 들면, V, I 또는 F 잔기로 변형되거나 또는 A와 같은 비-극성 잔기로 변형될 수도 있다. 개구리에서 E52는 K인데, 이 위치는 다양한 변형을 용인할 수 있으며, 예를 들면, E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y와 같은 극성 잔기와 아마도 A를 포함한다. 개구리에서 T93는 K이며, 이 위치에서 다양한 구조적 변이가 용인되는데, S, K, R, E, D, H, G, P, G 및 Y와 같은 극성 잔기를 선호한다. 개구리에서 F108은 Y이며, 따라서, Y 또는 I, V 또는 L과 같은 다른 소수성 기가 용인되어야 한다. 개구리에서 E111은 K이며, D, R, K 및 H 뿐만 아니라 Q와 N을 포함하는 하전된 잔기가 이 위치에서 용인될 것이라는 것을 나타낸다. 개구리에서 Rl12는 K이며, R과 H를 포함하는 염기성 잔기가 용인된다는 것을 나타낸다. 위치 119에 A는 보존이 잘 안되는 것으로 설치류에서는 P, 개구리에서는 V로 나타나고, 따라서, 기본적으로 임의 아미노산이 이 위치에서 용인되어야 한다.

본 명세서에서는 추가 N-연결된 글리코실화부위(N-X-S/T)를 추가하면 ActRⅡB-Fc 융합 단백질의 혈청 반감기가 ActRIIB(R64)-Fc 형태에 비하여 증가된다는 것을 설명한다. 위치 24에 아스파라긴(A24N 구조)를 도입함으로써, NXT 서열이 만들어지고, 이것이 더 긴 반감기를 부여한다. 다른 NX(T/S) 서열들은 42-44 (NQS) 및65-67 (NSS)에서 볼 수 있지만, 후자의 경우는 위치 64에서 R로 효과적으로 글리코실화되지는 못할 것이다. N-X-S/T 서열은 리간드 결합 포켓의 바깥 위치에 일반적으로 도입될 수 있다. 특히 비-내생성 N-X-S/T 서열들의 도입을 위한 적절한 부위에는 아미노산 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 또는 129-134가 포함된다. N-X-S/T 서열들은 ActRIEB 서열과 Fc 또는 다른 융합 성분사이에 링커내로 도입될 수도 있다. 이와 같은 부위는 기존의 S 또는 T에 대해 정확한 위치에 N을 도입하여 또는 기존 N에 상응하는 위치에 S 또는 T를 도입함으로써 최소한의 노력으로 도입될 수 있을 것이다. 따라서, N-연결된 글리코실화 부위를 만들기 위한 바람직한 변화는 A24N, R64N, S67N (N65A 변형과 복합도 가능), E106N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S 및 R112T가 포함된다. 글리코실화될 것으로 예상되는 임의 S는 글리코실화에 의해 제공되는 보호 때문에 면역원성 부위를 만들지 않고 T로 변형될 수 있다. 유사하게, 글리코실화될 것으로 예상되는 임의 T는 S로 변형될 수 있다. 따라서, 변이 S67T 및 S44T도 고려한다. 유사하게, A24N 변이체에서, S26T 변이도 이용할 수 있다. 따라서, ActRIIB 변이체에는 하나 또는 그 이상의 추가적인, 비-내생성 N-연결된 글리코실화 컨센선스 서열을 포함할 수 있다.

위치 L79은 변형된 액티빈-미오스타틴 (GDF-11) 결합 성질을 부여하기 위해 변형될 수도 있다. L79A 또는 L79P는 액티빈 결합이상으로 더 크게 GDF11 결합을 감소시킨다. L79E 또는 L79D는 GDF-11 결합을 유지한다. 놀라운 것은, L79E 및 L79D 변이체는 상당히 감소된 액티빈 결합을 가진다. 생체내 실험에서, 이와 같은 비-액티빈 수용체들은 상당한 활성을 보유하여 근육량을 증가시키나 다른 조직에서는 효과가 감소된 것으로 나타났다. 이들 데이터에서 액티빈에 감소된 효과를 가지는 폴리펩티드를 수득하는 바람직함(desirability)과 실행가능성(feasibility)을 설명한다.

여기에서 설명하는 변이는 다양한 방식으로 복합될 수 있다. 추가로, 여기에서 설명하는 돌연변이생성 프로그램 결과에서 ActRⅡb에서 보존하는 것이 유익한 아미노산 위치가 있다는 것을 나타낸다. 이들 위치에는 위치 64 (염기성 아미노산), 위치 80 (산성 또는 소수성 아미노산), 위치 78 (소수성, 특히 트립토판), 위치 37 (산성, 특히 아스파르트산 또는 글루타민산), 위치 56 (염기성 아미노산), 위치 60 (소수성 아미노산, 특히 페닐알라닌 또는 티로신)이 포함된다. 따라서, 여기에서 설명하는 각 변이체에서, 명세서는 보존될 수도 있는 아미노산의 틀구조(framework)를 제공한다. 보존되는 것이 바람직할 수 있는 다른 위치에는 다음의 것들이 포함된다: 위치 52 (산성 아미노산), 위치 55 (염기성 아미노산), 위치 81 (산성), 98 (극성 또는 하전된, 특히 E, D, R 또는 K).

특정 구체예에서, ActRIIB 폴리펩티드의 분리된 단편들은 ActRIIB 폴리펩티드 (예를 들면, 서열 번호: 3 및 4)를 인코딩하는 핵산의 상응하는 단편으로부터 재조합적으로 만들어진 폴리펩티드를 스크리닝하여 수득할 수 있다. 이에 더하여, 단편은 전통적인 Merrifield 고형상(solid phase) f-Moc 또는 t-Boc 화학과 같은 당분야에 공지된 기술을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 이들 단편은 생산되고(재조합 방식으로 또는 화학적 합성에 의해), ActRII 단백질 또는 ActRⅡB 리간드의 길항물질(저해물질) 또는 항진물질(활성물질)로서 기능할 수 있는 펩티딜 단편을 확인하기 위하여 검사될 수 있다.

특정 구체예에서, ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 변이체는 서열 번호: 1, 2, 5, 6, 12, 14, 및 17으로 부터 선택되는 아미노산 서열에 최소한 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 사례에서, 이러한 기능적 변이체는 서열 번호: 1, 2, 5, 6, 12, 14, 및 17에서 선택되는 아미노산 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 보유한다.

특정 구체예에서, 기능적 변이체는 치료 효능(therapeutic efficacy), 또는 안정성(가령, 체외 반감기(ex vivo shelf life)와 생체내에서 단백분해(proteolytic degradation)에 대한 내성)을 강화시키는 것과 같은 목적을 위하여 ActRII 폴리펩티드의 구조를 변형함으로써 산출될 수도 있다. 변형된 ActRIIB 폴리펩티드는 예로써, 아미노산 치환, 결실, 또는 부가에 의해 생산될 수 있다. 가령, 이소루이신 또는 발린으로 루이신의 분리된 치환, 글루타민산염으로 아스파라진산염의 분리된 치환, 세린으로 트레오닌의 분리된 치환, 또는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산의 유사한 치환(가령, 보존성 돌연변이)은 결과의 분자의 생물학적 활성에 주요한 효과를 나타내지 않을 것으로 예상하는 것은 합당하다. 보존성 치환은 측쇄에 관련된 아미노산 집단 내에서 발생하는 치환이다. ActRIIB 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 변화가 기능적 동족체(functional homolog)를 결과하는 지의 여부는 야생형 ActRIIB 폴리펩티드에서와 유사한 방식으로 세포 내에서 반응을 유도하는지 또는 야생형과 유사한 방식으로 악티빈 (가령, 악티빈 A, 악티빈 B, 악티빈 C, 및 악티빈 E), Nodal, GDF3, GDF-11, 또는 미오스타틴과 같은 하나 또는 그 이상의 리간드에 결합하는지에 대해 변이 ActRII 폴리펩티드의 능력을 평가함으로써 용이하게 결정될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명은 펩티드의 글리코실화반응을 변경시키기 위하여 ActRⅡB 폴리펩티드의 특이적 돌연변이를 고려할 수 있다. ActRⅡB 폴리펩티드에서 예시적인 글리코실화 부위는 서열 번호: 2에서 설명하고 있다. O-연결된 또는 N-연결된 글리코실화부위와 같은 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 도입 또는 제거하기 위해 이와 같은 돌연변이가 선택될 수도 있다. 아스파라긴-연결된 글리코실화 인지 부위는 적정 세포 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인지되는 트리펩티드 서열, 아스파라진-X-트레오닌(이때 X"는 임의 아미노산임)을 일반적으로 포함한다. 이와 같은 변경은 야생형 ActRIIB 폴리펩티드 (O-연결된 글리코실화 부위를 위한)의 서열로 하나 또는 그 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 추가 또는 치환으로 만들어질 수도 있다. 글리코실화 인지 부위의 제1 또는 제3 아미노산 위치중 하나 또는 둘 모두에서 다양한 아미노산 치환 또는 결실로 인하여(및/또는 제2위치에서 아미노산 결실) 변형된 트리펩티드 서열에 비-글리코실화를 결과한다. ActRⅡB 폴리펩티드상에 탄수화물 모이어티 수를 증가시키는 또 다른 수단은 ActRⅡB 폴리펩티드에 화학적 또는 효소적 결합(coupling)을 시키는 것이다. 이용되는 결합 방식에 따라, 당(sugar)이 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 자유 카르복실 기; (c) 시스테인에서 볼 수 있는 것과 같은 자유 SH 기; (d) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프로린과 같은 것에서 볼 수 있는 자유 하이드록실 기; (e) 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판과 같은 방향족 잔기; 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 결합될 수 있다. 이들 방법은 WO 87/05330 (Sep. 11, 1987 공개) 및 Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev . Biochem ., pp . 259-306에서 설명되어 있으며, 이를 참고문헌으로 첨부한다. ActRIIB 폴리펩티드에 존재하는 하나 또는 그 이상의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 및/또는 효소적으로 실시할 수 있다. 화학적 글리코실화 반응은 예를 들면, 화합물 트리플로오르메탄술폰산(trifluoromethanesulfonic acid) 또는 이의 등가 화합물에 ActRⅡB 폴리펩티드를 노출시키는 것과 관련될 수 있다. 이와 같은 처리로 인하여 연결 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 슈가들이 절단되나 아미노산 서열은 고유하게 남아있다. 화학적 탈글리코실화(deglycosylation)는 Hakimuddin et al . (1987) Arch . Biochem . Biophys . 259:52 및 Edge et al . (1981) Anal . Biochem . 118:131에서 설명된다. ActRⅡB 폴리펩티드상에 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 Thotakura et al . (1987) Meth . Enzymol . 138:350에서 설명하는 것과 같이 다양한 엔도 및 엑소 글리코시다제를 이용하여 이루어진다. 포유류, 이스트, 곤충 및 식물 세포 모두 상이한 글리코실화 패턴을 도입하고 이는 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받기 때문에 이용되는 발현 시스템의 타입에 따라 ActRIIB 폴리펩티드의 서열을 적절하게 조정할 수 있다. 일반적으로 사람에 이용되는 ActRIEB 단백질은 적절한 글리코실화를 제공하는 HEK293 또는 CHO 세포주와 같은 포유류 세포주에서 발현될 수 있지만 다른 포유류 발현 세포주도 유용할 것으로 보인다.

본 명세서에서는 변이체를 만드는 방법을 추가로 고려하는데, 선택적으로 절두 변이체를 포함하는 복합 ActRⅡB 폴리펩티드 변이체 세트; 복합 변이체 풀(pools)은 기능적 변이체 서열을 확인하는데 특히 유용하다. 이와 같은 복합 라이브러리를 스크리닝하는 목적은 예를 들면, 변형된 약물동력학 또는 변형된 리간드 결합과 같은 변형된 성질을 가지는 ActRⅡB 폴리펩티드 변이체를 만드는 것이 될 수도 있다. 하기에는 다양한 스크리닝 방법을 제공하는데, 이와 같은 검사를 이용하여 변이체들을 평가할 수도 있다. 예를 들면, ActRIIB 폴리펩티드에 결합하는 능력, ActRIIB 폴리펩티드에 ActRⅡB 리간드가 결합하는 것을 방해하는 능력에 대해 ActRIIB 폴리펩티드 변이체를 스크리닝할 수도 있다.

ActRIIB 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 능력은 세포계 또는 생체내 분석으로 테스트될 수도 있다. 예를 들면, 지방세포 분과에 관련된 유전자(가령, UCP-1)의 발현 또는 기능에서 ActRIIB 폴리펩티드 변이체의 효과를 평가할 수도 있다. 필요한 경우, 하나 또는 그 이상의 재조합 ActRIIB 리간드 단백질 (예를 들면, GDF8) 존재하에 실행할 수도 있고, 세포는 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체들 그리고 선택적으로 ActRⅡB 리간드를 만들기 위해 형질감염시킬 수도 있다. 유사하게, ActRIIB 폴리펩티드를 생쥐 또는 다른 동물에 투여하여, 갈색 지방세포 열생성을 평가할 수도 있다. 유사하게, ActRIIB 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 활성을 지방세포들, 근육 세포, 골 세포 및 신경 세포에서 이들 세포의 성장에 임의 효과를 테스트할 수 있는데, 예를 들면 하기에서 설명하는 분석들을 통하여 테스트한다. 이와 같은 분석들은 당분야에 공지된 것들이다. SMAD-반응성 리포터 유전자를 이와 같은 세포주에 이용하여 하류 시그날링(downstream signaling)에 효과를 모니터할 수 있다.

자연적으로 생성되는 ActRⅡB 폴리펩티드에 대한 선택성을 가진 복합-유도된 변이체가 만들어질 수도 있다. 재조합 DNA 구조에서 발현될 경우 변이체 단백질들은 유전자 요법 프로토콜에 이용될 수도 있다. 유사하게, 돌연변이생성으로 상응하는 야생형 ActRIIB 폴리펩티드보다는 상당히 상이한 세포내 반감기를 가지는 변이체를 만들 수도 있다. 예를 들면, 변형된 단백질은 단백질 분해 또는 다른 공정에 더 안정적인 또는 덜 안정적이어서 고유 ActRⅡB 폴리펩티드를 파괴하거나 비활성화를 결과할 수도 있다. 이와 같은 변이체 및 이를 인코드하는 유전자는 ActRⅡB 폴리펩티드의 반감기를 조절하여 ActRⅡB 폴리펩티드 수준을 변화시키는데 이용될 수도 있다. 예를 들면, 반감기는 좀더 일과적인 생물학적 효과를 일으키고, 유도성 발현 시스템의 일부인 경우, 세포내에 재조합 ActRⅡB 폴리펩티드를 좀더 긴밀하게 제어할 수 있도록 한다.

특정 구체예들에서, 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드는 ActRⅡB 폴리펩티드에 자연상태로 존재하는 것에 추가로, 전사후 변형을 추가로 포함할 수도 있다. 이와 같은 변형에는 아세틸화(acetylation), 카르복실화(carboxylation), 글리코실화(glycosylation), 인산화(phosphorylation), 지질화(lipidation)와 아실화(acylation)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 그 결과로써, 이러한 변형된 ActRIIB 폴리펩티드는 비-아미노산 요소, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 지질(lipid), 폴리사카라이드(polysaccharide) 또는 모노사카라이드(monosaccharide), 그리고 인산염(phosphate)을 포함할 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드의 기능성(functionality)에 대한 이런 비-아미노산 요소의 효과는 다른 ActRII 폴리펩티드 변이체에 대하여, 본 명세서에 기술된 바와 같이 검사될 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드가 ActRII 폴리펩티드의 초기 형태(nascent form)를 절단함으로써 세포 내에서 생산될 때, 번역후 처리(post-translational processing) 역시 단백질의 정확한 접힘(folding) 및/또는 기능에 중요하다. ActRIIB 폴리펩티드의 정확한 변형과 처리를 담보하기 위하여, 이런 번역후 활성을 위한 특이적인 세포 기구와 특징적인 기전을 보유하는 상이한 세포(가령, CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 또는 HEK293)가 선택될 수 있다.

특정 측면들에서, ActRIIB 폴리펩티드의 기능적 변이체 또는 변형된 형태에는 ActRIIB 폴리펩티드의 최소한 일부분과 하나 이상의 융합 도메인을 보유하는 융합 단백질이 포함된다. 이런 융합 도메인의 널리 공지된 실례에는 폴리히스티딘(polyhistidine), Glu-Glu, 글루타티온 S 전이효소(glutathione S transferase, GST), 티오레독신(thioredoxin), 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 중쇄 불변 영역(Fc), 말토오스 결합 단백질(MBP), 또는 인간 혈청 알부민이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 융합 도메인은 원하는 특성을 공여하도록 선택된다. 가령, 일부 융합 도메인은 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의한 융합 단백질의 분리에 특히 유용하다. 친화성 정제를 위하여, 친화성 크로마토그래피에 관련매트릭스(matrix), 예를 들면, 글루타티온-, 아밀라아제-, 그리고 니켈- 또는 코발트-공동된 수지가 이용된다. 이들 매트릭스 중에서 대부분은 키트 형태, 예를 들면, Pharmacia GST 정제 시스템과 (HIS6) 융합 상대와 함께 이용되는 QIAexpress™ 시스템(Qiagen)으로 가용하다. 다른 실례로서, 융합 도메인은 ActRIIB 폴리펩티드의 검출을 용이하게 하도록 선택된다. 이런 검출 도메인의 실례에는 다양한 형광 단백질(가령, GFP)과 에피토프 태그(epitope tag)가 포함되는데, 이들 태그는 통상적으로, 특이적인 항체가 이용가능한 짧은 펩티드 서열이다. 특이적인 단클론 항체가 용이하게 가용한 널리 공지된 에피토프 태그에는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(influenza virus haemagglutinin, HA)과 c-myc 태그가 포함된다. 일부 사례에서, 융합 도메인은 프로테아제 절단 부위(protease cleavage site), 예를 들면, 인자 Xa 또는 트롬빈(thrombin)에 대한 프로테아제 절단 부위를 보유하는데, 상기 부위는 관련된 프로테아제가 융합 단백질을 부분적으로 절단하여, 이로부터 재조합 단백질이 유리될 수 있도록 한다. 유리된 단백질은 이후, 차후의 크로마토그래피 분리(chromatographic separation)에 의해 융합 도메인으로부터 분리될 수 있다. 특정의 바람직한 구체예에서, ActRIIB 폴리펩티드는 생체내에서 ActRII 폴리펩티드를 안정화시키는 도메인(안정화 도메인)과 융합된다. 안정화는 이러한 안정화가 감소된 파괴, 신장에 의한 감소된 소거, 또는 다른 약동학적 효과에 기인하는 지에 상관없이, 혈청 반감기를 증가시키는 무언가를 의미한다. 면역글로불린의 Fc 부분과의 융합은 광범위한 범위의 단백질에 바람직한 약동학적 특성을 공여하는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 인간 혈청 알부민에 융합은 바람직한 특성을 공여할 수 있다. 선택되는 다른 유형의 융합 도메인에는 다중화(multimerizing)(가령, 이합화(dimerizing), 사합화(tetramerizing)) 도메인과 기능성 도메인(추가적인 생물학적 기능, 예를 들면, 근육 성장의 추가적인 자극 공여)이 포함된다.

특정 실례로서, 본 발명에서는 Fc 도메인에 융합된 세포외(GDF8-결합) 도메인을 포함하는 GDF8 길항물질로써의 융합 단백질(가령, 서열 번호: 13)을 제시한다.

선택적으로, Fc 도메인은 Asp-265, 리신 322와 Asn-434와 같은 잔기에서 하나 이상의 돌연변이를 보유한다. 특정 사례에서, 이들 돌연변이 중에서 하나 이상(가령, Asp-265 돌연변이)을 보유하는 돌연변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합 능력을 갖는다. 다른 사례에서, 이들 돌연변이 중에서 하나 이상(가령, Asn-434 돌연변이)을 보유하는 돌연변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 MHC 클래스 I-관련된 Fc-수용체(FcRN)에 대한 증가된 결합 능력을 갖는다.

융합 단백질의 상이한 요소들은 원하는 기능성과 일치하는 임의의 방식으로 정렬될 수 있다. 가령, ActRIIB 폴리펩티드가 이질성 도메인의 C-말단에 배치되거나, 또는 대안으로, 이질성 도메인이 ActRIIB 폴리펩티드의 C-말단에 배치될 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드 도메인과 이질성 도메인은 융합 단백질 내에서 인접할 필요가 없고, 추가적인 도메인 또는 아미노산 서열이 한쪽 도메인의 C- 또는 N-말단에 또는 이들 도메인 사이에 포함될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드를 안정화시킬 수 있는 하나 이상의 변형을 보유한다. 가령, 이들 변형은 ActRIIB 폴리펩티드의 시험관내 반감기를 강화시키거나, ActRIIB 폴리펩티드의 순환 반감기(circulatory half life)를 강화시키거나, 또는 ActRIIB 폴리펩티드의 단백분해 변성을 감소시킨다. 이와 같은 안정화 변형에는 융합 단백질(예로써, ActRIIB 폴리펩티드와 안정화 도메인을 포함하는 융합 단백질 포함), 글리코실화 부위의 변형(예로써, ActRIIB 폴리펩티드에 글리코실화 부위의 추가 포함), 그리고 탄수화물 모이어티의 변형(예로써, ActRIIB 폴리펩티드로부터 탄수화물 모이어티의 제거 포함)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 융합 단백질들의 경우, ActRIIB 폴리펩티드는 IgG 분자(가령, Fc 도메인)과 같은 안정화 도메인에 융합된다. 여기에서 사용된 것과 같이, “안정화 도메인은 융합 단백질의 경우에서처럼 융합 도메인(가령, Fc)을 지칭할 뿐만 아니라 비-단백질성 변형(nonproteinaceous modification), 예를 들면, 탄수화물 모이어티, 또는 비-단백질성 모이어티, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 포괄한다.

특정 구체예에서, 본 발명에서는 ActRIIB 폴리펩티드의 분리된 및/또는 정제된 형태를 가능하게 하는데, 이들은 다른 단백질로부터 분리되거나, 또는 다른 단백질이 실질적으로 존재하지 않는다.

특정 구체예에서, 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드 (변형안된 또는 변형된)는 당분야에 공지된 다양한 기술을 통하여 생산될 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 ActRIIB 폴리펩티드는 Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) and Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992)에서 설명하는 표준 단백질 화학 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 또한, 자동화된 펩티드 합성기도 상업적으로 이용가능하다(예를 들면, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). 대안으로, ActRIIB 폴리펩티드, 이의 단편들 또는 변이체들은 당분야에 공지된 다양한 발현계(예를 들면, 대장균, CHO 세포, COS 세포, 베큘로바이러스)를 이용하여 재조합적으로 만들어질 수도 있다. 추가 구체예에서, 변형된 또는 변형안된 ActRⅡB 폴리펩티드는 자연 발생 또는 재조합에 의해 만들어진 전장 ActRⅡB 폴리펩티드를 트립신, 터모리신, 키모트립신, 펩신 또는 쌍을 이룬 염기성 아미노산 전환 효소(PACE)와 같은 프로테아제를 이용하여 절단시켜 만들 수 있을 것이다. 컴퓨터 분석(상업적으로 이용할 수 있는 소프트웨어, 가령, Mac Vector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.)을 이용하여 단백질가수분해 절단 부위를 확인할 수 있을 것이다. 대안으로, 이와 같은 ActRIIB 폴리펩티드는 당분야에 공지된 표준 기술 예를 들면, 화학적 절단(예를 들면, 시아노겐 브롬화물, 하이드록실아민)자연 생성 또는 재조합적으로 생산된 전장 ActRⅡB 폴리펩티드로부터 만들어질 수 있다.

3. ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산

특정 측면에서, 본 발명에서는 본 명세서에 개시된 단편, 기능적 변이체와 융합 단백질을 비롯한 임의의 ActRIIB 폴리펩티드(가령, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드)를 인코딩하는 분리된 및/또는 재조합 핵산을 제시한다. 가령, 서열 번호: 4는 자연적으로 생성되는 인간 ActRIIB 전구체 폴리펩티드를 인코딩하는 서열이다:

다음 서열은 인간 가용성(세포외) ActRIIB을 인코딩한다(서열 번호: 3)(348 bp).

본 발명의 핵산은 단일 가닥(single-strand) 또는 이중 가닥(double strand)일 수 있다. 이들 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이들 핵산은 예로써, ActRIIB 폴리펩티드를 제조하는 방법에, 또는 직접적인 치료제(가령, 유전자 치료법에서)로서 이용될 수 있다.

특정 측면에서, ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 본 발명의 핵산은 서열 번호: 3의 변이체 핵산을 포괄하는 것으로 간주된다. 변이체 뉴클레오티드 서열에는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실에 의해 구별되는 서열, 예를 들면, 대립형질 변이체(allelic variant)이 포함되고, 그리고 서열 번호: 4의 코딩 서열의 핵산 서열과는 상이한 코딩 서열을 포함할 것이다.

특정 구체예에서, 본 발명에서는 서열 번호: 3에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 분리된 또는 재조합 핵산 서열을 제시한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 서열 번호: 3에 상보적인 핵산 서열, 그리고 서열 번호: 3의 변이체 역시 본 발명의 범위 내에 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열은 분리되고, 재조합되고 및/또는 이질성 뉴클레오티드 서열과 융합되거나 DNA 라이브러리 내에 융합될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 서열 번호: 10 또는 15에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 분리된 또는 재조합 핵산 서열을 제공한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 핵산에는 서열 번호: 3에 열거된 뉴클레오티드 서열에 고도로 엄밀한 조건 하에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열, 서열 번호: 3의 보체 서열, 또는 이들의 단편 역시 포함된다. 앞서 언급된 바와 같이, 당업자는 DNA 혼성화(hybridization)를 촉진하는 적절한 엄밀도(stringency) 조건이 변화될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 당업자는 DNA 혼성화(hybridization)를 촉진하는 적절한 엄밀도(stringency) 조건이 변화될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 가령, 대략 45℃에서 6.0 x 염화나트륨(sodium chloride)/구연산나트륨(sodium citrate)(SSC)에서 혼성화, 이후 50℃에서 2.0 x SSC의 세척을 수행할 수 있다. 가령, 세척 단계에서 염 농도는 50℃에서 대략 2.0 x SSC의 낮은 엄밀도 내지 50℃에서 대략 0.2 x SSC의 높은 엄밀도에서 선택될 수 있다. 이에 더하여, 세척 단계에서 온도는 실온(대략 22℃)에서 낮은 엄밀도 조건에서 대략 65℃에서 높은 엄밀도 조건으로 증가될 수 있다. 온도와 염 모두 변화되거나, 또는 다른 변수가 변하는 반면에 온도 또는 염 농도는 일정하게 유지될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄밀도 조건하에 혼성화되고, 이후 실온에서 2 x SSC에서 세척되는 핵산을 제시한다.

유전자 코드(genetic code)에서 축퇴(degeneracy)로 인하여 서열 번호: 3에 열거된 핵산과 차별되는 분리된 핵산 역시 본 발명의 범위 내에 있다. 가령, 다수의 아미노산이 하나 이상의 삼중항(triplet)에 의해 지정된다. 동일한 아미노산을 명기하는 코돈, 또는 동종이명(synonym)(가령, CAU와 CAC는 히스티딘에 대한 동종이명(synonym)이다)은 단백질의 아미노산 서열에 영향을 주지 않는 침묵 돌연변이를 유도한다. 하지만, 본 발명의 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 유발하는 DNA 서열 다형성(polymorphism)이 포유동물 세포 사이에 존재할 것으로 예상된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 특정 단백질을 인코딩하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드에서 이들 변이(뉴클레오티드의 최대 3-5%)가 자연적인 대립형질 변이(allelic variation)로 인하여 특정한 종의 개체 사이에 존재할 수 있다. 이와 같은 모든 뉴클레오티드 변이 및 결과의 아미노산 다형성은 본 발명의 범위 내에 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 재조합 핵산은 발현 구조체(expression construct) 내에서 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다.조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로, 발현에 이용되는 숙주 세포에 적합할 것이다. 다양한 숙주 세포에 대한 다양한 유형의 적합한 발현 벡터와 조절 서열이 공지되어 있다. 전형적으로, 상기 하나 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에는 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 시작과 종결 서열, 번역 시작과 종결 서열, 인핸서 또는 활성인자 서열 등이 포함된다. 당분야에 공지된 구조성 또는 유도성 프로모터가 본 발명에 의해 고려된다. 이들 프로모터는 자연 발생 프로모터, 또는 하나 이상의 프로모터의 요소를 통합하는 하이브리드 프로모터이다.발현 구조체는 세포 내에서 에피솜(episome), 예를 들면, 플라스미드(plasmid) 상에 존재하거나, 또는 발현 구조체는 염색체 내로 삽입된다. 바람직한 구체예에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 선택가능 마커 유전자를 포함한다. 선택가능 마커 유전자는 당분야에 널리 공지되어 있고, 이용된 숙주 세포에 따라 변한다.

본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 핵산은 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 최소한 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 발현 벡터(expression vector)에 담겨 제공된다. 조절 서열은 당분야에서 인지되고, ActRIIB 폴리펩티드의 발현을 관리하도록 선택된다. 따라서 조절 서열에는 프로모터, 인핸서와 다른 발현 제어 요소가 포함된다. 예시적인 조절 서열은 Goeddel ; Gene Expression Technology : Methods in Enzymology , Academic Press , San Diego , CA (1990)에서 기술된다. 가령, 작동가능하게 연결되면 DNA 서열의 발현을 제어하는 다양한 발현 제어 서열은 ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 발현하기 위하여 이들 벡터에 이용될 수 있다. 이런 유용한 발현 제어 서열에는 예로써, SV40의 초기와 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 극초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T7 프로모터(이의 발현은 T7 RNA 중합효소에 의해 관리된다), 파지 람다(phage lambda)의 주요 오퍼레이터와 프로모터 영역, fd 외피 단백질에 대한 제어 영역, 3-글리세르산인산 키나아제(phosphoglycerate kinase) 또는 다른 당분해(glycolytic) 효소에 대한 프로모터, 산성 인산가수분해효소(acid phosphatase)의 프로모터(가령, Pho5), 효모 α-교미 인자(mating factor)의 프로모터, 배큘로바이러스(baculovirus) 시스템의 다면체(polyhedron) 프로모터, 원핵이나 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 알려져 있는 다른 서열, 이들의 다양한 조합 등이 포함된다. 발현 벡터의 설계는 형질전환되는 숙주 세포의 선택 및/또는 발현되는 원하는 단백질의 타입과 같은 인자에 좌우된다. 게다가, 벡터의 사본수(copy number), 사본수를 제어하는 능력과 상기 벡터에 의해 인코딩되는 임의의 다른 단백질, 예를 들면, 항생제 마커(antibiotic marker)의 발현 역시 숙고되어야 한다.

본 발명의 재조합 핵산은 원핵 세포, 진핵 세포(효모, 조류, 곤충 또는 포유류), 또는 둘 모두에서 발현에 적합한 벡터 내로, 클론된 유전자 또는 이의 일부분을 결찰함으로써 산출될 수 있다. 재조합 ActRIIB 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 벡터에는 플라스미드 및 다른 벡터가 포함된다. 가령, 원핵 세포, 예를 들면, 대장균(E. coli)에서 발현에 적합한 벡터에는 아래 유형의 플라스미드가 포함된다: pBR322-유래된 플라스미드, pEMBL-유래된 플라스미드, pEX-유래된 플라스미드, pBTac-유래된 플라스미드와 pUC-유래된 플라스미드.

일부 포유동물 발현 벡터는 세균 내에서 벡터의 증식을 용이하게 하는 원핵 서열, 그리고 진핵 세포에서 발현되는 하나 이상의 진핵 전사 단위(transcription unit)를 모두 포함한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo와 pHyg 유래된 벡터는 진핵 세포의 형질감염(transfection)에 적합한 포유동물 발현 벡터의 실례이다. 이들 벡터 중에서 일부는 원핵과 진핵 세포 모두에서 복제와 내약성(drug 저항성) 선택을 용이하게 하는 세균 플라스미드, 예를 들면, pBR322로부터 서열로 변형된다. 대안으로, 소 파필로마 바이러스(bovine papilloma virus)(BPV-I), 또는 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)(pHEBo, pREP-유래된, p205)와 같은 바이러스의 유도체가 진핵 세포에서 단백질의 일시적인 발현에 이용될 수 있다. 다른 바이러스(레트로바이러스 포함) 발현 시스템의 실례는 하기, 유전자 치료 전달 시스템의 설명에서 확인할 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 생물체의 형질전환에 이용되는 다양한 방법이 당분야에 널리 공지되어 있다. 원핵과 진핵 세포 둘 모두에 적합한 다른 발현 시스템 및 전반적인 재조합 절차는 Molecular Cloning A Laboratory Manual , 2 nd Ed ., ed . by Sambrook , Fritsch and Maniatis ( Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1989) Chapters 16 및 17을 참조한다. 일부 사례에서, 배큘로바이러스 발현 시스템의 이용으로 재조합 폴리펩티드를 발현하는 것이 바람직하다. 이런 배큘로바이러스 발현 시스템의 실례에는 pVL-유래된 벡터(가령, pVL1392, pVL1393과 pVL941), pAcUW-유래된 벡터(가령, pAcUWl), 그리고 pBlueBac-유래된 벡터(가령, β-gal 보유 pBlueBac III)가 포함된다.

바람직한 구체예에서, CHO 세포에서 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드의 생산을 위한 벡터, 예를 들면, Pcmv-Script 벡터(Stratagene , La Jolla , Calif .), pcDNA4 벡터(Invitrogen , Carlsbad , Calif.)와 pCI-neo 벡터(Promega , Madison , Wise)가 설계된다. 확인되는 바와 같이, 본 발명의 유전자 구조체는 예로써, 정제를 위한, 융합 단백질 또는 변이체 단백질을 비롯한 단백질을 생산하기 위하여 배양으로 증식된 세포에서 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드의 발현을 유도하는데 이용될 수 있다.

본 발명은 또한, 하나 이상의 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드에 대한 코딩 서열(가령, 서열 번호: 3, 4, 10, 또는 15)을 비롯한 재조합 유전자로 형질감염된 숙주 세포에 관계한다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 가령, 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드는 세균 세포(가령, 대장균(E. coli)), 곤충 세포(가령, 배큘로바이러스 발현 시스템 이용), 효모, 또는 포유동물 세포에서 발현된다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관계한다. 가령, ActRIIB 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 ActRIIB 폴리펩티드의 발현이 진행되도록 하는 적절한 조건 하에 배양될 수 있다. ActRIIB 폴리펩티드는 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하는 세포와 배지의 혼합물로부터 분비되고 분리될 수 있다. 대안으로, ActRIIB 폴리펩티드는 세포질에 또는 막 분획(membrane fraction) 내에 유지되고, 세포는 수거되고 용해되며, 상기 단백질은 분리된다. 세포 배양액은 숙주 세포, 배지와 다른 부산물을 함유한다. 세포 배양에 적합한 배지는 당분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드는 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과(ultrafiltration), 전기영동(electrophoresis) 및 ActRIIB 폴리펩티드의 특정 에피토프에 특이적인 항체를 이용한 면역친화성(immunoaffinity) 정제를 비롯한, 단백질을 정제하기 위한 당분야에 공지된 기술을 이용하여, 세포 배양 배지, 숙주 세포, 또는 둘 모두로부터 분리될 수 있다. 바람직한 구체예에서, ActRIIB 폴리펩티드는 정제를 용이하게 하는 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.

다른 구체예에서, 재조합 ActRIIB 폴리펩티드의 원하는 부분의 N-말단에서 정제 리더 서열, 예를 들면, 폴리-(His)/엔테로키나아제(enterokinase) 절단 부위 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni^{2 +} 금속 수지(metal resin)를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의한, 발현된 융합 단백질의 정제를 가능하게 할 수 있다. 정제 리더 서열은 이후, 정제된 ActRIIB 폴리펩티드를 제공하기 위하여 엔테로키나아제 처리에 의해 차후에 제거될 수 있다(참조: Hochuli et al ., (1987) J Chromatography 411:177; Janknecht et al ., PNAS USA 88:8972).

융합 유전자를 만드는 기술은 널리 공지되어 있다. 본질적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 다양한 DNA 단편의 결합은 통상적인 기술에 따라, 결찰을 위한 평활-말단(blunt-ended termini) 또는 갈지자-말단(stagger-ended termini), 적절한 말단을 제공하는 제한 효소 절단(restriction enzyme digestion), 점착 말단(cohesive end)의 채움(filling-in), 원치 않는 결합을 차단하는 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase) 처리, 그리고 효소 결찰(enzymatic ligation)을 이용하여 수행된다. 다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성장치를 비롯한 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 2개의 연속하는 유전자 단편 사이에 상보성 오버행(overhang)을 산출하는 앵커 프라이머(anchor primer)를 이용하여 수행될 수 있는데, 이들 유전자 단편은 차후에 어닐링되어 키메라 유전자 서열을 산출할 수 있다(참조: Current Protocols in Molecular Biology , eds . Ausubel et al ., John Wiley & Sons : 1992).

4. 항체 및 기타 길항제

본 발명의 또 다른 측면에는 항체 및 여기에서 설명된 표적에 결합하는 단백질들, 여기에서 설명된 표적의 발현을 억제하는 핵산을 비롯한 기타 길항제가 포함된다. ActRIIB 폴리펩티드(가령, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드)와 특이적으로 반응하고, ActRIIB 폴리펩티드에 경쟁적으로 결합하는 항체는 ActRIIB 폴리펩티드 활성의 길항물질로서 이용될 수 있다. 예를 들면, ActRIIB 폴리펩티드로부터 유래된 면역원(immunogen)을 이용함으로써, 항-단백질/항-펩티드 항혈청(antisera) 또는 단클론 항체가 표준 프로토콜(standard protocol)에 의해 제조될 수 있다(예를 들면, Antibodies : A Laboratory Manual ed . by Harlow and Lane ( Cold Spring Harbor Press : 1988)참고). 포유동물, 예를 들면, 생쥐, 햄스터 또는 토끼는 ActRIIB 폴리펩티드 또는 리간드의 면역원성 형태(immunogenic form), 항체 반응(antibody response)을 유도할 수 있는 항원 단편, 또는 융합 단백질로 면역될 수 있다. 단백질 또는 펩티드에 면역원성(immunogenicity)을 부여하는 기술에는 담체(carrier)에 결합(conjugation) 또는 당분야에 널리 공지된 다른 기술이 포함된다. ActRIIB 폴리펩티드의 면역원성 부분이 어쥬번트(adjuvant)의 존재 하에 투여될 수 있다. 면역화의 진행은 혈장 또는 혈청에서 항체 역가(antibody titer)의 검출에 의해 모니터될 수 있다. 표준 ELISA 또는 다른 면역분석은 상기 면역원을 항원으로 하여 항체 수준을 평가하는데 이용될 수 있다.

ActRIIB 폴리펩티드의 항원성 조합제로 동물의 면역이후, 항혈청이 수득될 수 있고, 원하는 경우에, 다클론 항체가 혈청으로부터 분리될 수 있다. 단클론 항체를 생산하기 위하여, 항체-생산 세포(림프구)를 면역된 동물로부터 수거하고 표준 체세포 융합 절차에 의해 영속 세포(immortalizing cell), 예를 들면, 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마(hybridoma) 세포를 산출할 수 있다. 이런 기술은 당분야에 널리 공지되어 있는데, 여기에는 예로써, 하이브리도마 기술(Kohler와 Milstein에 의해 최초로 개발됨((1975) Nature , 256: 495-497)), 인간 B 세포 하이브리도마 기술(Kozbar et al., (1983) Immunology Today , 4: 72), 인간 단클론 항체를 생산하는 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al ., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy , Alan R. Liss , Inc . pp . 77-96) 등이 포함된다. 하이브리도마 세포는 ActRIIB 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 항체 및 이런 하이브리도마 세포를 포함하는 배양액으로부터 분리된 단클론 항체의 생산을 위하여 면역화학적으로 선별될 수 있다.

여기에서 사용된 것과 같이, 항체는 본 ActRⅡB 폴리펩티드 또는 리간드와 특이적으로 반응하는 이의 단편을 또한 포함한다. 항체는 통상적인 기술을 이용하여 단편화될 수 있고, 단편은 상기 완전 항체(whole antibody)와 동일한 방법으로 유용성에 대해 선별될 수 있다. 예를 들면, F(ab)₂ 단편은 펩신을 항체로 처리하면 만들 수 있다. 생성된 F(ab)₂ 단편을 이황화결합을 환원시키기 위해 추가 처리하며 Fab 단편을 만들 수도 있다. 본 발명의 항체는 이중특이성, 단일-쇄 및 항체의 최소 한 개 CDR 부분에 의해 부여되는 ActRⅡB 폴리펩티드에 대한 친화성을 가지는 키메라 및 인화 항체를 더 포함한다. 적절한 구체예에서, 항체는 추가로 이에 부착된 라벨을 포함하여, 감지가능할 수 있다(예를 들면, 라벨은 방사능동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소-공인자가 될 수 있다).

특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 단클론 항체이고, 특정 구체예에서, 본 발명은 신규한 항체를 생산하는 방법을 제시한다. 가령, ActRIIB 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 산출하는 방법은 검출가능한 면역 반응을 자극하는데 효과적인 항원 폴리펩티드를 함유하는 면역 조성물(immunogenic composition)의 일정량을 생쥐에 투여하는 단계, 생쥐로부터 항체-생산 세포(가령, 비장으로부터 유래된 세포)를 수득하는 단계, 항체-생산 세포를 골수종 세포와 융합하여 항체-생산 하이브리도마를 수득하는 단계, 그리고 항체-생산 하이브리도마를 검사하여 ActRⅡB 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 확인하는 단계를 포함한다. 일단 수득된 하이브리도마는 임의적으로, 하이브리도마-유래된 세포가 ActRⅡB 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 생산하는 배양 조건 하에 세포 배양액에서 증식될 수 있다. 단클론 항체는 세포 배양액으로부터 정제될 수 있다.

항체와 관련하여 이용된 형용사 특이적으로 반응하는은 당분야에서 일반적으로 이해되는 바와 같이, 상기 항체가 목적 항원(가령, ActRIIB 폴리펩티드)과 목적하지 않는 다른 항원 사이에 충분히 선택적이고, 상기 항체가 최소한, 특정 타입의 생물학적 시료의 내에서 목적 항원의 존재를 검출하는데 유용하다는 것을 의미한다. 치료 용도와 같은 상기 항체를 이용하는 특정 방법에서, 더욱 높은 수준의 결합 특이성이 바람직하다. 단클론 항체는 일반적으로, 원하는 항원과 교차-반응성(cross-reacting) 폴리펩티드를 효과적으로 구별하는데 더욱 높은 추세(다클론 항체와 비교하여)를 갖는다. 항체:항원 상호작용의 특이성에 영향을 주는 한 가지 특징은 항원에 대한 항체의 친화성이다. 원하는 특이성이 일정한 범위의 상이한 친화성으로 달성될 수도 있지만, 일반적으로 선호되는 항체는 대략 10^-6, 10^-7, 10^-8, 10^-9 또는 그 이하의 친화성(해리 상수)을 갖는다.

이에 더하여, 바람직한 항체를 확인하기 위하여 항체를 선별하는데 이용되는 기술은 수득된 항체의 특성에 영향을 줄 수 있다. 가령, 항체가 용해 상태에서 항원에 결합하는데 이용된다면, 용액 결합(solution binding)을 검사하는 것이 바람직하다. 항체와 항원 사이에 상호작용을 검사하여 특히 바람직한 항체를 확인하기 위하여 여러 다양한 기술이 가용하다. 이런 기술에는 ELISA, 표면 플라즈몬 공명 결합 검사(가령, Biacore™ 결합 검사, Biacore AB, Uppsala, Sweden), 샌드위치 검사(sandwich assay)(가령, 상자성 비드(paramagnetic bead) 시스템, IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), 웨스턴 블랏(western blot), 면역침전 검사(immunoprecipitation assay), 면역조직화학법(immunohistochemistry) 등이 포함된다.

특정 측면에서, 명세서에서는 가용성 ActRIIB 폴리펩티드에 결합하는 항체를 제공한다. 이와 같은 항체는 상기에서 설명하는 것과 같이 항원으로 가용성 ActRIIB 폴리펩티드 또는 이의 단편을 사용하여 생산할 수 있을 것이다. 이와 같은 타입의 항체들은 생물학적 샘플에서 ActRⅡB 폴리펩티드를 감지하거나, 개체에서 가용성 ActRⅡB 폴리펩티드 수준을 모니터하는데 이용할 수 있다. 특정 경우에, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 ActRIIB 폴리펩티드 및/또는 ActRIIB 리간드의 활성을 조절하여, 발열성 지방세포를 증가시킬 수 있다.

미오스타틴 및 GDF3과 같은 특정 리간드들은 각 프로펩티드(propeptide), 또는 이의 변이체의 결합 부분을 포함하는 폴리펩티드를 이용하여 억제될 수 있다. 이러한 프로펩티드들은 Fc 융합 단백질들을 포함하는 융합 단백질로 제조될 수 있다. 적합한 프로펩티드의 예는 공개된 특허 출원들 WO 02/085306 및 WO 06/002387에 설명되어 있다.

추가적으로, 소위 “트랩(traps)”으로 불리는 기타 결합 단백질들(가령, 폴리스타틴, FLRG, FSTL, Cerberus 및 Coco), 가용성 유형 I 수용체들, 가령, ALK-7를 이용할 수 있다. 이러한 폴리펩티드들의 예는 공개된 특허 출원들 WO 05/115439, WO 08/109779, WO 08/067480, WO 07/109686, WO 05/100563, 및 WO 05/025601에서 찾아볼 수 있다.

안티센스 또는 RNAi 프로브(자연적으로 생성되는 그리고 자연적으로 생성되지 않는 뉴클레오티드 모두를 포함)와 같은 핵산을 이용하여 여기에서 논의되는 ActRIIB or 리간드들의 발현을 억제할 수 있다.

5. 선별 검사

특정 측면에서, 본 발명은 액티빈-ActRIIB 폴리펩티드의 항진물질 또는 길항물질인 화합물(작용제)을 확인하기 위한 ActRIIB 폴리펩티드(가령, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드)의 용도에 관계한다. 이러한 선별을 통하여 확인된 화합물은 시험관내에서 조직 생장을 조절하는 능력을 평가하기 위해, 지방, 근육, 뼈, 연골, 및/또는 뉴런과 같은 조직에서 테스트할 수 있다. 선택적으로, 이들 화합물들은 조직 성장 생체내에서 조직 성장을 조절하는 능력을 평가하기 위하여 동물 모델에서 추가 테스트될 수 있다.

ActRIIB 폴리펩티드를 표적함으로써 조직 생장을 조절하는 치료제의 선별을 위한 다수의 접근법이 존재한다. 특정 구체예에서, 화합물의 고속 선별(high-throughput screening)은 지방, 근육, 뼈, 연골, 및/또는 뉴런과 같은 조직에서 ActRIIB-매개된 효과를 교란시키는 작용제를 확인하기 위하여 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 이러한 검사는 ActRⅡB 리간드(가령, 악티빈, GDF3, Nodal, GDF8, 또는 GDF11)와 같은 결합 짝에 ActRⅡB 폴리펩티드의 결합을 특이적으로 저해하거나 감소시키는 화합물을 선별하고 확인하기 위하여 수행된다. 대안으로, 상기 검사는 ActRⅡB 리간드와 같은 이의 결합 단백질에 폴리펩티드의 결합을 강화시키는 화합물을 확인하는데 이용될 수 있다. 추가 구체예에서, 화합물은 ActRIIB 폴리펩티드와 상호작용하는 능력으로 확인될 수 있다.

다양한 검사 양식(assay format)이 만족스럽지만, 그럼에도 불구하고, 본 발명의 개시에 비추어, 본 명세서에서 명시되지 않은 것들 역시 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명의 검사 화합물(작용제)은 임의의 조합 화학 방법(combinatorial chemical method)으로 산출될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 화합물은 생체내에서 또는 시험관내에서 합성된 자연 발생 생물분자이다. 조직 성장의 조절인자(modulator)로서 기능하는 능력에 대하여 검사되는 화합물(작용제)은 예로써, 세균, 효모, 식물 또는 다른 생물체에 의해 생산되거나(가령, 자연 산물), 화학적으로 생산되거나(가령, 펩티드모방체(peptidomimetic)를 비롯한 소형 분자), 또는 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 본 발명에서 고려되는 검사 화합물에는 비-펩티딜 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 당, 호르몬, 핵산 분자 등이 포함된다. 특정 구체예에서, 검사 작용제는 대략 2,000 달톤(dalton) 이하의 분자량(molecular weight)을 보유하는 소형 유기 분자다.

본 발명의 검사 화합물들은 단일의 구별된 존재로서 제공되거나, 또는 예로써, 복합 화학(combinatorial chemistry)으로 만들어진 더욱 복잡한 라이브러리에 담겨 제공될 수 있다. 이들 라이브러리는 예로써, 알코올, 알킬 할로겐화물, 아민, 아마이드, 에스테르, 알데히드, 에테르 및 다른 종류의 유기 화합물을 포함할 수 있다. 검사 시스템에 검사 화합물의 제공은 특히, 최초 선별 단계에서 분리된 형태로 또는 화합물의 혼합물로서 달성될 수 있다. 선택적으로, 화합물은 다른 화합물로 임의적으로 유도체화되고, 화합물의 분리를 용이하게 하는 유도체화 기(derivatizing group)를 보유한다. 유도체화 기의 무제한적 실례에는 비오틴(biotin), 플루오레세인(fluorescein), 디곡시제닌(digoxygenin), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein), 동위원소(isotope), 폴리히스티딘(polyhistidine), 자성 비드(magnetic beads), 글루타티온 S 전달효소(glutathione S transferase, GST), 광활성화가능 가교제(photoactivatable crosslinker) 또는 이들의 조합이 포함된다.

화합물과 천연 추출물의 라이브러리를 검사하는 많은 약물 선별 프로그램에서, 정해진 기간 내에 조사되는 화합물의 수를 극대화사키기 위하여 고속 분석법이 바람직하다. 정제된 또는 반-정제된 단백질로 유도된 것과 같은 세포-없는 시스템에서 수행되는 분석법은 종종, 일차 스크린으로서 선호되는데, 그 이유는 이들이 검사 화합물에 의해 매개되는 분자 표적(molecular target) 내에서 변형의 신속한 발생과 상대적으로 용이한 검출을 가능하도록 산출될 수 있기 때문이다. 게다가, 검사 화합물의 세포 독성 또는 생체이용효율(bioavailability)의 효과는 시험관내 시스템에서 일반적으로 무시될 수 있는데, 이러한 분석법은 그 대신에, ActRIIB와 이의 결합 단백질(가령, ActRⅡB 리간드) 사이에 결합 친화성의 변형으로 확인되는, 분자 표적에 대한 약제의 효과에 일차적으로 집중한다.

설명을 목적으로, 본 발명의 전형적인 선별 검사에서, 목적 화합물은 ActRⅡB 리간드에 통상적으로 결합할 수 있는 분리되고 정제된 ActRIIB 폴리펩티드와 접촉한다. 상기 화합물과 ActRIIB 폴리펩티드의 혼합물에 ActRIIB 리간드를 함유하는 조성물이 추가된다. ActRIIB/ActRⅡB 리간드 복합체의 검출과 정량은 ActRIIB 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 사이에 복합체 형성을 저해하는(또는 강화하는) 화합물의 효능을 결정하는 수단을 제공한다. 화합물의 효능은 다양한 농도의 검사 화합물을 이용하여 획득된 데이터로부터 용량 반응 곡선(dose response curve)을 산출함으로써 평가할 수 있다. 게다가, 비교를 위한 기준선(baseline)을 제공하기 위하여 대조 분석(control assay) 역시 수행될 수 있다. 가령, 대조 분석에서, 분리되고 정제된 ActRⅡB 리간드를 ActRIIB 폴리펩티드를 함유하는 조성물에 추가되고, ActRIIB/ActRⅡB 리간드 복합체의 형성이 검사 화합물의 부재 하에 정량된다. 일반적으로, 반응물이 혼합되는 순서는 변경될 수 있고, 동시에 혼합될 수 있다. 게다가, 적절한 세포-없는 분석 시스템을 제공하기 위하여 정제된 단백질 대신에, 세포 추출물과 용해물(lysate)이 이용될 수도 있다.

ActRIIB 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 사이에 복합체 형성은 다양한 기술로 검출될 수 있다. 가령, 복합체 형성의 조절은 예로써, 검출가능하게 표지된 단백질, 예를 들면, 방사성표지된(가령, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C 또는 ³H), 형광 표지된(가령, FITC), 또는 효소 표지된 ActRIIB 폴리펩티드 또는 이의 결합 단백질을 이용하여, 면역분석(immunoassay)에 의해, 또는 크로마토그래피 검출(chromatographic detection)에 의해 정량될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명에서는 ActRIIB 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 사이에 상호작용 정도를 직접적으로 또는 간접적으로 측정하는데 있어 형광 편광(fluorescence polarization) 분석 및 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 분석의 이용을 고려한다. 더 나아가, 광도파(optical waveguide)(PCT 공개 WO 96/26432; 미국 특허 제5,677,196호), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR), 표면 전하 센서(surface charge sensor), 그리고 표면력 센서(surface force sensor)에 기초한 것들과 같은 다른 검출 양식이 본 발명의 다수 구체예에 적합하다.

게다가, 본 발명에서는 ActRIIB 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 사이의 상호작용을 파괴하거나 강화시키는 작용제를 확인하기 위한, 이중 하이브리드 분석(two hybrid assay)으로 알려져 있는 상호작용 트랩 분석(interaction trap assay)의 이용을 고려한다. 예를 들면, 미국 특허 제5,283,317호; Zervos et al ., 1993, Cell 72:223-232; Madura et al ., 1993, J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al ., 1993, Biotechniques 14:920-924; and Iwabuchi et al ., 1993, Oncogene 8:1693-1696) 참고. 특정 구체예에서, 본 발명에서는 ActRIIB 폴리펩티드와 이의 결합 단백질 사이에 상호작용을 분리시키는 화합물(가령, 소형 분자 또는 펩티드)을 확인하는 역 이중 하이브리드 시스템(reverse two hybrid system)의 이용을 고려한다. 예를 들면, Vidal and Legrain, 1999, Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, 1999, Trends Biotechnol 17:374-81; 그리고 미국 특허 제5,525,490호; 제5,955,280호; 그리고 제5,965,368호 참고.

특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 본 발명의 ActRIIB 폴리펩티드와 상호작용하는 능력으로 확인된다. 상기 화합물과 ActRIIB 폴리펩티드 사이에 상호작용은 공유 또는 비-공유이다. 가령, 이런 상호작용은 광-가교연결(photo-crosslinking), 방사성표지된 리간드 결합, 그리고 친화성 크로마토그래피를 비롯한 시험관내 생화학적 방법을 이용하여 단백질 수준에서 확인될 수 있다(Jakoby WB et al ., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). 특정 사례에서, 이들 화합물은 기전 기초된 분석(mechanism based assay), 예를 들면, 액티빈 또는 ActRII 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 검출하는 분석에서 선별된다. 이는 고체상(solid phase) 또는 액체상(fluid phase) 결합 현상을 포함할 수 있다. 대안으로, 액티빈 또는 ActRIIa 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자는 리포터 시스템(가령, β-갈락토시다아제, 루시페라제, 또는 녹색 형광 단백질)으로 세포 내로 형질감염되고, 임의적으로 고속 선별에 의해 라이브러리에 대하여 또는 상기 라이브러리의 개별 구성원으로 선별된다. 다른 기전 기초된 결합 분석, 예를 들면, 자유 에너지(free energy)에서 변화를 검출하는 결합 분석이 이용될 수도 있다. 결합 분석은 웰, 비드 또는 칩에 고정되거나, 고정된 항체에 의해 포획되거나, 또는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)에 의해 분해된 표적으로 수행될 수 있다. 결합된 화합물은 통상적으로, 비색(colorimetric) 또는 형광 또는 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 검출된다.

특정 측면에서, 본 발명은 체중 증가 및 비만 조절용 물질 및 방법을 제공한다. 세포 수준에서, 지방세포 증식 및 분화는 추가 지방 세포들 (지방세포)의 생성을 유도하는 비만 발달에 중요하다. 따라서, 확인된 임의 화합물을 시험관내 또는 생체내에서 전체 세포 또는 조직에서 테스트하여 지방 세포 증식 또는 분화의 조절에 의해 지방세포 분화를 조절하는 능력을 확인할 수 있다. 이 목적을 위해 당분야에 공지된 다양한 방법들이 이용될 수 있다. 예를 들면, ActRⅡB 폴리펩티드(예를 들면, 가용성 ActRⅡB 폴리펩티드) 또는 테스트 화합물의 지방세포분화에 효과는 세포계 검사에서 3T3-L1 전지방세포(preadipocyte)가 성숙한 지방세포로의 분화를 측정함으로써 결정될 수 있는데, 검사로는 예를 들면, Oil Red O 착색 소포에서 트리아실글리세롤의 축적을 관찰하거나 FABP (aP2/422) 및 PPARγ2와 같은 특정 지방세포 마커의 출현을 관찰함하는 것등이 포함된다. 예를 들면, Reusch et al ., 2000, Mol Cell Biol . 20:1008-20; Deng et al ., 2000, Endocrinology . 141:2370-6; Bell et al ., 2000, Obes Res . 8:249-54 참고. 세포계 검사의 또 다른 예로는 브로모데옥시우리딘(BrdU)-포지티브 세포의 모니터링을 하는 것과 같이 지방세포 또는 지방세포 전구세포(가령 3T3-L1)의 증식에 ActRⅡB 폴리펩티드 및 테스트 화합물의 역할을 분석하는 것도 포함된다. 예를 들면, Pico et al ., 1998, Mol Cell Biochem . 189:1-7; Masuno et al ., 2003, Toxicol Sci. 75:314-20 참고. 본 발명의 스크리닝 검사는 ActRⅡB 폴리펩티드 및 이의 변이체 뿐만 아니라 ActRⅡB 폴리펩티드의 항진물질 및 길항물질을 포함하는 임의 테스트 화합물에도 적용될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 이와 같은 스크리닝 검사는 약물 표적 확인 및 품질 조절 공정에도 유용하다.

본 발명의 스크리닝 검사는 ActRⅡB 폴리펩티드 및 이의 분이체 뿐만 아니라 ActRⅡB 폴리펩티드의 항진물질 및 길항물질을 포함하는 임의 테스트 화합물에도 적용될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 이와 같은 스크리닝 검사는 약물 표적 확인 및 품질 조절 공정에도 유용하다.

6. 예시적인 치료 용도

특정 구체예에서, 본 발명의 조성물(가령, ActRⅡB 폴리펩티드)는 ActRⅡB 폴리펩티드 또는 ActRⅡB 리간드(예를 들면, 악티빈 또는 GDF8)의 비정상적 활성과 연관된 질병 또는 이상을 치료 또는 예방하는데 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명에서는 상기에서 설명한 ActRIIB 폴리펩티드의 치료 효과량을 필요 개체에 투여하는 방법을 제시한다. 이들 방법은 포유동물, 특히, 인간의 치료적 처치와 예방적 처치에 이용될 수 있다.

여기에서 사용된 것과 같이, 질환이나 이상을 예방(prevent)하는 치료제는 통계학적 표본(statistical sample)에서, 처리되지 않은 대조 표본과 비교하여 처리된 표본에서 질환이나 이상의 발생률(occurrence)을 감소시키거나, 또는 처리되지 않은 대조 표본과 비교하여 이러한 질환이나 이상의 발병을 지연시키거나 상기 질환이나 이상의 한가지이상의 증상의 심각도(severity)를 감소시키는 화합물을 지칭한다. 여기에서 사용된 것과 같이, 치료(“treating”)는 지명된 이상의 예방, 또는 확립된 이상의 완화 또는 제거를 포괄한다.

여기에서 설명된 것과 같이, ActRIIB-Fc는 미토콘드리아에서 탈공역을 중재하는 단백질인 UCP1의 발현을 촉진시켜, 대사적으로 활성을 가진 또는 발열성 지방 조직을 유도한다. 따라서, 여기에서 설명된 조성물들은 갈색 지방 조직 또는 갈색 지방세포의 결핍, 대사 증후군 (증후군 X로 공지됨), 당뇨병, 과지질혈증, 과콜레스테롤혈증, 과식 및 폭식증, 고혈압, 동맥경화증(관상 동맥 질환 또는 관상 심장 질환), 심근 경색, 충혈성 심부전, 뇌경색, 뇌혈전증, 호흡기 질환 (가령, Pickwickian 증후군), 결장 암, 전립선 암, 유방암, 내막암 및 신장암, 성장 호르몬-결핍 개체들, 저신장 정상적 변이, Turner 증후군, 및 가령, 급성 림프구성 백혈병에 걸린 어린이와 같이, 전체 제지방량(fat-free mass)의 비율로 감소된 대사 활성 또는 휴식 에너지 소비의 감소를 보이는 기타 병인 상태와 같은 다양한 질환을 치료하는데 이용할 수 있다.

특정 구체예들에서, 본 발명의 조성물들(가령, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드들)은 발열성 지방세포의 형성 및/또는 활성을 촉진시키는데 이용된다. 상기에서 논의된 바와 같이, 백색 지방 조직내 발열성 분리된 갈색-지방 조직 및 갈색 지방세포들은 탈공역단백질-1 (UCP)을 발현시키는 다수의 미토콘드리아를 보유한다. 고열량 섭취 및 갈색 지방세포가 부족한 개체들은 과도한 칼로리 섭취를 심장으로 전환시킬 수 없고, 따라서 확장된 백색 지방 조직의 형태로 사용안된 생화학 에너지를 저장하도록 한다. 생체내 하나 이상의 ActRIIB 리간드들 (가령, GDF8)의 차단 또는 길항 기능은 별개의 데포우안에 갈색 지방세포 또는 백색 지방 조직안에 분포된 갈색 지방세포의 발열성 활성을 효과적으로 증가시킬 수 있다. 이러한 방법은 여기에서 제공된 데이터에 의해 확인되고 뒷받침되며, 이로 인하여 ActRIIB-Fc 단백질은 백색 지방에서 UCP1 발현을 유도하고, 전체적인 신체 조성물을 높이고, 고지방 식이를 한 마우스에서 대사 상태를 개선시키는 것을 보여주었다.

특정 구체예들에서, 본 발명의 조성물 (가령, 가용성 ActRIIB 폴리펩티드들)은 심혈관 질환 및 진성 당뇨병 유형 II를 발달시키는 위험을 증가시키는 위험 인자들과 질환의 조합인 대사 증후군 (증후군 X 및 인슐린 저항성 증후군으로도 알려짐)의 치료 일부로 이용된다. 대부분 환자들은 노령의, 비만의 그리고 앉아 있는 사람들이며, 어느 정도의 인슐린 저항성을 가진다. 중앙(복부 또는 내장) 비만은 이 증후군의 주요 특징이다.

관련 구체예들에서, 본 발명의 가용성 ActRIIB 폴리펩티드들과 기타 조성물들은 진성 당뇨병 유형 II (비-인슐린-의존적 진성 당뇨병 또는 성인-개시 당뇨병으로도 알려짐)의 치료 일부로 이용할 수 있는데, 이는 인슐린 저항성과 관련 인슐린 결핍에서 혈당 수준이 상승된 것을 특징으로 한다. 당뇨병에서 복합적인 그리고 다중요인성 대사 변화는 많은 장기, 가장 중요하게는 심혈관계에 손상 및 기능성 손상을 유도한다. 진성 당뇨병 유형 II는 비만 (복부 또는 내장 비만), 고혈압, 상승된 콜레스테롤, 그리고 대사 증후군과 흔히 연관된다. 진성 당뇨병 유형 II의 중요한 위험 인자는 노화, 고지방식이, 그리고 좌식 생활이 포함된다.

기타 관련 구체예들에서, 본 발명의 가용성 ActRIIB 폴리펩티드들과 기타 조성물들은 지방 축적으로 인하여 흔히 플락이라고 하는 동맥 벽이 두꺼워 지는 아테롬동맥경화증, 만성 염증 상태의 치료 일부로 이용할 수 있다. 아테롬동맥경화증의 위험 인자로는 노화, 진성 당뇨병, 이상지단백질 혈증, 비만(복부 또는 내장 비만) 및 좌식 생활이 포함된다.

가용성 ActRIIB 폴리펩티드들은 지방이영양증(lipodystrophic disorders)에 또한 이용될 수 있는데, 이는 대사 증후군과 연관되는 경향이 있다. 심각한 인슐린 저항성은 유전적 그리고 후천적 지질이영양증으로부터 발생될 수 있는데, 후자의 경우 항레트로바이러스 지쵸를 받은 환자들에서 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)-관련 지질이영양증을 포함한다.

본 ActRIIB 폴리펩티드들은 비만 발달을 지연 또는 예방하는 치료제로 더 이용될 수 있다. 이러한 방법은 여기에서 제공되는 데이터에 의해 확인 및 뒷받침되는데, 이에 의해 ActRIIB-Fc 단백질은 고지방식이를 한 마우스에서 대사 상태를 개선시키는 것을 보여주었다.

기타 구체예들에서, 본 발명은 동물에서 체지방 함량을 조절하는 조성물 및 방법 그리고 이에 관련된 질환, 특히 건강을 해치는 질환을 치료 또는 예방용 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 체중 조절(제어)은 체중 감소 또는 증가, 체중 증가율의 감소 또는 증가, 또는 체중 감소율의 증가 또는 감소를 말하며, 그리고 체중을 적극적으로 유지 또는 심각하게 변화되지 않도록 하는 것을 포함한다(가령, 체중의 증가 또는 감소에 영향을 주는 외부적 또는 내부적 영향에 대항하여). 본 발명의 한 구체예는 ActRIIB 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 동물(가령, 인간)에 투여함으로써 체중 조절에 관한 것이다.

한 특정 구체예에서, 본 발명은 동물에서 체중 감소 및/또는 체중 증가의 감소를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이며, 더 구체적으로 비만인 환자 또는 비만 위험에 처한 환자에서 비만을 치료 또는 개선시키는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또다른 특정 구체예에서, 본 발명은 체중 증가 또는 유지가 불가능한 동물(가령, 소모 증후군 동물)을 치료하는 방법 및 조성물에 관계한다. 이러한 방법들은 체중 증가 및/또는 체량의 증가에 유효하거나 또는 체중 및/또는 체량 감소에 유효하거나 또는 바람직하지 못할 수준의 낮은 체중 및/또는 체량으로 인한 또는 관련된 상태를 개선시키는데 유효하다.

WO 2006/012627 및 WO 2008/097541에서 설명된 것과 같이, 여기에서 설명된 화합물들은 근육 성장을 자극한다. 따라서, 이들 화합물들은 근육 및 대사 기능이상이 중복된 질환 또는 상태에 특히 유용할 것이다.

특정 구체예에서, 본 발명의 조성물(예를 들면, 가용성 ActRIEB 폴리펩티드)는 근이영양증의 치료의 일부분으로 이용될 수 있다. 근이영양증("muscular dystrophy")은 골근육, 때때로 심장 및 호흡기 근육의 약화 및 퇴화를 특징으로 하는 퇴행성 근육 질환을 말한다. 근이영양증은 근육에서 미세한 변화로 시작되는 진행성 근육 약화 및 소모를 특징으로 하는 유전적 질환이다. 근육은 시간이 경과함에 따라 퇴화되어, 사람의 근육의 강도가 약화된다. 더욱이, 근량의 감소 및 신체 활성의 감소는 칼로리 섭취와 에너지 소비간에 불균형을 초래하고, 이는 백색 지방 조직으로 과도한 에너지의 해로운 저장을 유도한다. 본 발명의 ActRⅡB 폴리펩티드를 포함하는 섭생으로 치료될 수 있는 예시적인 근이영양증에는 다음을 포함한다: Duchenne 근이영양증 (DMD), Becker 근이영양증 (BMD), Emery-Dreifuss 근이영양증 (EDMD), Limb-Girdle 근이영양증 (LGMD), 안면견갑상완근 근이영양증 (FSH 또는 FSHD) (Landouzy-Dejerine으로도 알려짐), 근육질 이영양증 (MMD) (Steinert's 질환으로도 알려짐), 안구 및 인두 근이영양증 (OPMD), 말단 근이영양증 (DD), 선천적 근이영양증 (CMD)이 포함된다.

Duchenne 근이영양증 (DMD)은 1860년대에 프랑스 신경학자 Guillaume Benjamin Amand Duchenne에 의해 처음 보고되었다. Becker 근이영양증 (BMD)은 1950년대 DMD 변이체를 처음 설명한 독일 의사 Peter Emil Becker의 이름을 따다 붙인 것이다. DMD는 남성에서 가장 빈번하게 유전되는 질병중에 하나로 3,500명의 소년중 한명 꼴이다. DMD는 X 염색체의 짧은 암(arm)에 위치한 디스트로핀(dystrophin) 유전자가 파괴된 것이다. 남성은 X 염색체중 하나만을 가지기 때문에 디스트로핀 유전자의 한 개 복사체만 가진다. 디스트로핀 단백질이 없으면, 근육은 수축과 이완동안 쉽게 손상된다. 근육 질환의 초기에는 재생에 의해 보상되나 나중에 근육 전구세포는 진행중인 손상(ongoing damage)를 잘 모르기 때문에 건강한 근육이 비-기능성 섬유-지방 조직으로 대체된다.

디스트로핀 유전자에 상이한 돌연변이로 생성되는 것이 BMD 이다. BMD 환자는 일부 디스트로핀을 가지고 있지만 양에서 부족하거나 질에서 떨어진다. 일부 디스트로핀을 가지고 있음으로 DMD 환자처럼 나쁘게 또는 신속하게 근육이 퇴행되는 것으로부터 BMD 환자를 보호하게 된다.

예를 들면, 최근 연구에서는 생체내에서 GDF8(ActRⅡB 리간드)의 기능을 차단 또는 제거하는 것으로 DMD 및 BDM 환자에서 최소한 특정 징후를 효과적으로 치료할 수 있을 것이다. 따라서, 본 ActRIIB 폴리펩티드는 GDF8 저해물질(길항물질)로 작용할 수 있을 것이며, DMD 및 BDM 환자에서 GDF8 및/또는 ActRIIB의 기능을 차단시키는 대안 수단을 구성할 수도 있을 것이다. 이와 같은 방식은 여기에서 보여주는 데이터에 의해 확인되고 지지되는데, ActRIIB -Fc 단백질은 근이영양증 모델 생쥐에서 근육량의 증가된 것이다.

유사하게, 당해 ActRIIB 폴리펩티드는 근육 생장을 요하는 다른 질환에서 근육량을 증가시키는 효과적인 수단을 제공한다. 예를 들면, ALS(루게릭 질환이라고도 함)(운동 신경 질환)은 골근육에 뇌를 연결시키는 CNS의 성분인 운동 뉴우런을 공격하는 만성적이며, 치료불가능한 그리고 중단되지 않는 CNS 질환이다. ALS에서, 운동 뉴우런이 퇴화되고 종국에는 죽게 되는데, 환자의 뇌는 정상적으로 기능을 하지만 움직이라는 명령은 근육으로 전달되지 않는다. ALS를 앓는 대부분의 사람은 40대 내지 70대이다. 처음 약화되는 운동 뉴우런은 팔 또는 다리를 이끄는 뉴우런이다. ALS를 가진 환자는 걷는데 문제가 있으며, 물건을 떨어뜨리거나 넘어지거나 말이 분명하지 않거나 웃음이나 울음을 조절할 수가 없다. 사지의 근육은 사용하지 않으면 위축이 시작된다. 이와 같은 약해짐으로 쇠약하게 되고, 그 사람은 휠체어의 도움을 받거나 침대밖에서는 아무런 일을 할 수 없게 될 수도 있다. 대부분의 ALS 환자들은 질병 개시 3-5년내에 호흡 불능 또는 폐렴과 같은 인공호흡기 합병증(complications of ventilator assistance)으로 사망한다. 이와 같은 방식은 여기에서 보여주는 데이터에 의해 확인되고 지지되는데, 이때 데이터에서는 ActRIIB-Fc 단백질이 ALS 생쥐 모델의 외양, 근육량 및 수명을 개선시키는 것으로 나타났다.

ActRIBB 폴리펩티드-유도된 근육량 증가는 근소모성 질환을 앓고 있는 환자에 유익함을 제공할 것이다. Gonzalez-Cadavid et al. (supra)은 GDF8의 발현은 사람에서 제지방량(fat-free mass)과 역관계에 있으며, GDF8 유전자의 발현 증가는 AIDS 소모성 증후군 남성에서 체중 감소와 연관이 있다고 보고하였다. AIDS 환자에서 GDF8 기능을 저해함으로써 최소한 ADIS 의 특정 증후는 완전하게 제거되지는 못하더라도 완화될 수 있고, AIDS 환자의 삶의 질이 상당히 개선될 것이다.

노화와 함께 근육을 상실하는 근감소증은 대사 증후군, 당뇨병, 동맥경화증, 이상지질혈증, 및 기타 노화-관련 대사 상태와 또한 흔히 관련된다. ActRIIB 폴리펩티드-유도된 근육량은 근감소증을 앓는 환자들에게 또한 유익할 것이다.

7. 제약학적 조성물

특정 구체예에서, 본 발명의 화합물(가령, ActRIIB 폴리펩티드)은 제약학적으로 허용되는 담체로 제제화된다. 가령, ActRIIB 폴리펩티드는 단독으로, 또는 제약학적 제형(치료 조성물)의 한 성분으로서 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 의학 또는 수의학에 이용하기 편의한 방식으로 투여를 위하여 제제화된다.

특정 구체예에서, 본 발명의 치료 방법은 이식물(implant) 또는 장치로서 전신적으로 또는 국소적으로 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 투여될 때, 본 발명에 이용되는 치료 조성물은 당연히, 발열원-없는, 생리학적으로 허용되는 형태를 취한다. 추가로, 본 발명의 조성물은 조직 손상을 가진 부위와 같은 표적 조직 부위(가령, 뼈, 연골, 근육, 지방 또는 뉴우런)으로 운반하기 위해 캡슐화 또는 점성형으로 주사될 수도 있다. 국소 투여는 상처 치료 및 조직 재생에 적절하다. 앞서 기술된 바와 같은 조성물에 임의적으로 포함되는, ActRIIB 폴리펩티드 이외의 치료제는 대안으로 또는 추가로 본 발명의 방법에서, 본 발명의 화합물(가령, ActRIIB 폴리펩티드)과 동시에 또는 순차적으로 투여된다.

특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 표적 조직 부위(가령, 골수)로의 하나 또는 그 이상의 치료 조성물(예를 들면 ActRⅡB 폴리펩티드)를 운반할 수 있는 매트릭스(matrix)을 포함하며, 이는 발달중인 조직에 대한 구조물을 제공하고 최적으로, 체내 재흡수될 수 있다. 가령, 매트릭스는 ActRIIB 폴리펩티드의 느린 방출(slow release)을 제공한다. 이런 매트릭스는 다른 이식된 의학 용도에 현재 이용되고 있는 물질로 형성될 수 있다.

매트릭스 물질의 선택은 생체적합성(bibcompatibility), 생물분해성(biodegradability), 기계적 특성, 미용적 외관(cosmetic appearance) 및 접촉면 특성(interface property)에 기초한다. 본 발명의 조성물의 특정 적용은 적절한 제형을 정의할 것이다. 이들 조성물에 적합한 잠재적인 기반은 생물분해가능하고 화학적으로 정의된 황산칼슘(calcium sulfate), 트리칼슘포스페이트(tricalciumphosphate), 수산화인회석(hydroxyapatite), 폴리락트산(polylactic acid)과 폴리안하이드라이드(polyanhydride)이다. 다른 잠재적인 물질은 생물분해가능하고 생물학적으로 충분히 정의된 물질, 예를 들면, 골 또는 피부 콜라겐이다. 추가의 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 기반 성분으로 구성된다. 다른 잠재적인 매트릭스는 생물분해불가능하고 화학적으로 정의된 물질, 예를 들면, 소결된 수산화인회석(sintered hydroxyapatite), 생체유리(bioglass), 알루민산염(aluminate), 또는 다른 세라믹이다. 매트릭스는 앞서 언급된 유형의 물질의 조합, 예를 들면, 폴리락트산과 수산화인회석, 또는 콜라겐과 트리칼슘포스페이트로 구성될 수도 있다. 생체세라믹(bioceramic)은 칼슘-알루민산염-인산염(calcium-aluminate-phosphate)에서처럼 조성(composition), 그리고 구멍 크기, 입자 크기, 입자 형태와 생물분해성(biodegradability)을 변경하는 가공(processing)에서 변경될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 예로써, 캡슐, 교갑(cachet), 알약(pill), 정제(tablet), 마름모꼴 정제(lozenge)(방향성 기부(flavored basis), 통상적으로, 수크로오스(sucrose)와 아카시아(acacia) 또는 트랜거캔스(tragacanth) 이용), 분말, 과립, 또는 수용성이나 비-수용성 액체에 녹인 용액이나 현탁액, 또는 수중유(oil-in-water) 또는 유중수(water-in-oil) 액체 에멀젼, 또는 엘릭시르 또는 시럽, 또는 향정(pastille)(불활성 기부(inert base), 예를 들면, 젤라틴(gelatin)과 글리세린(glycerin), 또는 수크로오스와 아카시아 이용) 및/또는 구강세정제(mouth wash) 등의 형태로 경구 투여될 수 있는데, 이들 각각은 미리 결정된 양의 작용제를 활성 성분으로 함유한다. 작용제는 거환약(bolus), 연질약(electuary) 또는 페이스트(paste)로 투여될 수도 있다.

경구 투여용 고형 약형(캡슐, 정제, 알약, 당의정, 분말, 과립 등)에서, 본 발명의 하나 이상의 치료 화합물은 한가지이상의 제약학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 구연산나트륨 또는 이인산칼슘 및/또는 (1) 충전제 또는 증량제, 예를 들면, 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨, 또는 규산; (2) 접착제, 예를 들면, 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로오스, 또는 아카시아; (3) 습윤제, 예를 들면, 글리세롤; (4) 붕해제, 예를 들면, 아가-아가, 탄산칼슘, 감자나 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염, 또는 탄산나트륨; (5) 용해 지연제, 예를 들면, 파라핀; (6) 흡수 가속화제, 예를 들면, 4급 암모늄 화합물; (7) 보습제, 예를 들면, 세틸 알코올과 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예를 들면, 고령토와 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예를 들면, 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고형 폴리에틸렌 글리콜, 소디움 라우릴 설페이트, 또는 이들의 혼합물; (10) 착색제와 혼합된다. 캡슐, 정제와 알약의 경우에, 제약학적 조성물은 완충제를 함유할 수도 있다. 유사한 유형의 고형 조성물은 또한, 락토오스 또는 유당과 같은 부형제 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 이용한 연성과 경성-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로 사용될 수 있다.

경구 투여용 액체 제형에는 제약학적으로 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽과 엘릭시르가 포함된다. 활성 성분 이외에, 액체 제형은 당분야에 통상적으로 이용되는 불활성 희석제, 예를 들면, 물 또는 다른 용매, 용해제(solubilizing agent)와 유화제(emulsifier), 예를 들면, 에틸 알코올(ethyl alcohol), 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol), 에틸 카보네이트(ethyl carbonate), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 벤질 알코올(benzyl alcohol), 벤질 벤조에이트(benzyl benzoate), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 1,3-부틸렌 글리콜, 오일(특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 점(germ), 올리브, 피마자와 참깨 기름), 글리세롤(glycerol), 테트라하이드로푸릴 알코올(tetrahydrofuryl alcohol), 소르비탄의 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 지불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 습윤제, 유화제와 현탁제, 감미료, 조미료, 착색제, 방향제, 보존제 등과 같은 어쥬번트를 함유할 수 있다.

현탁액은 활성 화합물 이외에, 에톡실화된 이소스테아릴 알코올(ethoxylated isostearyl alcohol), 폴리옥시에틸렌 소르비톨(polyoxyethylene sorbitol)과 소르비탄 에스테르(sorbitan ester), 미세결정성 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 알루미늄 메타하이드록시드(aluminum metahydroxide), 벤토나이트(bentonite), 아가-아가(agar-agar)와 트랜거캔스(tragacanth), 이들의 혼합물 등과 같은 현탁제를 함유할 수 있다.

여기에서 설명되는 특정 조성물은 국소적으로 피부 또는 점막으로 투여될 수 있다. 국조 제제물에는 피부 또는 각질층 침투 강화제로 효과가 있는 것으로 알려진 다양한 물질 하나 또는 그 이상이 추가 포함될 수 있다. 이들 예로는 2-피롤리돈, N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸아세타미드, 디메틸포름아미드, 프로필렌 글리콜, 메틸 또는 이소프로필 알코올, 디메틸 설폭시드 및 아존등이 포함된다. 미용적으로 수용가능하도록 조제물을 만들기 위해 추가 물질이 포함될 수도 있다. 이의 예로는 지방, 왁스, 오일, 염료, 향료, 보존제, 안정화제 및 표면 활성제가 있다. 당분야에 공지된 케라틴 용해물질도 포함될 수 있다. 예로 살리실산 및 황이다.

국소 또는 경피 투여를 위한 약형에는 분말, 분무, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 패취, 용액 및 흡입제가 포함된다. 활성 화합물은 약학적으로 수용가능한 캐리어와 함께 멸균 상태에서 혼합될 수 있고, 필요한 경우, 임의 보존제, 완충제 또는 추진제와 함께 혼합될 수도 있다. 연고, 페이스트, 크림 및 겔에는 본 발명의 당해 화합물(예를 들면, ActRⅡB 폴리펩티드)이외에 부형제, 예를 들면, 동물 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트랜거캔스, 셀룰로오즈 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석, 산화아연 또는 이의 혼합물이 추가 포함될 수 있다.

분말 및 분무에는 당해 화합물에 추가로 락토즈, 활석, 유산 수산화 알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분말 또는 이의 혼합물과 같은 부형제가 포함될 수 있다. 분무에는 추가로 클로로플로오르탄화수소와 같은 통상의 추진제, 휘발성 비치환된 탄화수소 예를 들면 부탄 및 프로판이 포함될 수 있다.

특정 구체예에서, 비경구(parental) 투여에 적합한 제약학적 조성물은 하나 이상의 제약으로 허용되는 무균 등장성 수용액이나 비-수용액, 분산액(dispersion), 현탁액(suspension)이나 에멀젼(emulsion), 또는 사용 직전에 무균 주사가능 용액이나 분산액으로 재구성되는 무균 분말(sterile powder)과의 조합으로 하나 이상의 ActRIIB 폴리펩티드를 포함하고, 항산화제(antioxidant), 완충제(buffer), 정균제(bacteriostat), 의도된 수용자의 혈액과 제형이 등장성이 되도록 하는 용질, 현탁제, 또는 농후제(thickening agent)를 포함할 수 있다.

본 발명의 제약학적 조성물에 이용될 수 있는 적절한 수성과 비-수성 담체의 실례에는 물, 에탄올, 폴리올(가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등)과 이들의 적절한 혼합물, 식물성 오일(vegetable oil)(가령, 올리브 오일(olive oil)), 그리고 주사가능 유기 에스테르(injectable organic ester)(가령, 올레인산에틸(ethyl oleate))가 포함된다. 적절한 유동성(fluidity)은 예로써, 레시틴(lecithin)과 같은 코팅 물질의 이용에 의하여, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의하여, 그리고 계면활성제의 이용에 의하여 유지될 수 있다.

본 발명의 조성물에는 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 어쥬번트를 포함할 수 있다. 미생물의 작용을 방지하기 위해 다양한 항균 및 항곰팡이제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르빈산 및 이와 유사한 것을 포함시킬 수 있다. 또한 설탕, 염화나트륨 및 이와 유사한 등장성 물질을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 주사용 약학 형태의 연장된 흡수를 위해 지연 흡수제 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 물질을 포함시킬 수도 있다.

투약 섭생은 본 발명의 당해 화합물(가령, ActRⅡB 폴리펩티드)의 작용을 수정시킬 수 있는 다양한 인자를 고려하여 결정될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 다양한 인자들은 치료될 질환에 따라 달라질 수 있을 것이다.

특정 구체예에서, 본 발명에서는 여기에서 설명된 ActRIIB 폴리펩티드 또는 다른 화합물들의 생체내 생산을 위한 유전자 요법을 제시한다. 이런 요법은 앞서 열거된 바와 같은 질환을 나타내는 세포 또는 조직 내로 ActRIIB 폴리뉴클레오티드 서열의 도입에 의해 치료 효과를 달성하게 된다. ActRIIB 폴리뉴클레오티드 서열의 전달은 키메라 바이러스 또는 콜로이드성 분산 시스템과 같은 재조합 발현 벡터를 이용하여 달성될 수 있다. ActRII 폴리뉴클레오티드 서열의 치료적 전달(therapeutic delivery)에는 표적된 리포좀(liposome)의 이용이 바람직하다.

본 명세서에 교시된 바와 같이 유전자 요법에 이용될 수 있는 다양한 바이러스 벡터에는 아데노바이러스(adenovirus), 포진 바이러스(herpes virus), 우두(vaccinia), 또는 레트로바이러스(retrovirus)와 같은 RNA 바이러스가 포함된다. 바람직하게는, 레트로바이러스 벡터는 뮤린 또는 조류 레트로바이러스의 유도체다. 단일 외래 유전자가 삽입될 수 있는 레트로바이러스 벡터의 실례에는 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스(MoMuLV), Harvey 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV), 뮤린 유방 종양 바이러스(MuMTV), 그리고 Rous 육종 바이러스(RSV)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다수의 추가적인 레트로바이러스 벡터는 복수 유전자를 통합할 수 있다. 이들 모든 벡터는 형질도입된 세포가 확인되고 생성될 수 있도록 선택가능 마커에 대한 유전자를 전달하거나 통합할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 예로써, 당, 당지질(glycolipid), 또는 단백질을 부착함으로써 표적-특이적으로 만들어질 수 있다. 바람직한 표적화는 항체를 이용함으로써 달성된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 특이적인 폴리뉴클레오티드 서열은 레트로바이러스 게놈 내로 삽입되거나, 또는 ActRIIB 폴리뉴클레오티드를 포함하는 레트로바이러스 벡터의 표적 특이적인 전달을 가능하게 하는 바이러스 외피(viral envelope)에 부착될 수 있다. 한 적절한 구체예에서, 벡터는 뼈, 연골, 근육 또는 뉴우런 세포/조직으로 표적화된다.

대안으로, 조직 배양 세포는 통상적인 인산칼슘(calcium phosphate) 형질감염(transfection)에 의해, 레트로바이러스 구조 유전자 gag , pol과 env를 인코딩하는 플라스미드로 직접적으로 형질감염될 수 있다. 이들 세포는 이후, 목적 유전자를 포함하는 벡터 플라스미드로 형질감염된다. 생성된 세포는 배양 배지 내로 레트로바이러스 벡터를 방출한다.

ActRIIB 폴리뉴클레오티드에 대한 다른 표적된 전달 시스템은 콜로이드성 분산 시스템이다. 콜로이드성 분산 시스템에는 거대분자 복합체, 나노캡슐(nanocapsule), 마이크로캡슐(microsphere), 비드(bead), 그리고 지질-기초된 시스템(가령, 수중유 에멀젼, 미셀(micell), 혼합된 미셀, 리포좀 등)이 포함된다. 본 발명에서 바람직한 콜로이드성 시스템은 리포좀이다. 리포좀은 시험관내와 생체내에서 전달 운반체(delivery veheicle)로서 유용한 인공 막 소포(membrane vesicle)이다. RNA, DNA와 원형 비리온(virion)은 수성 내부에 내포될 수 있고, 생물학적 활성 형태로 세포에 전달될 수 있다(참조: Fraley , et al ., Trends Biochem . Sci ., 6:77, 1981). 리포좀 소포를 이용한 효율적인 유전자 전달 방법은 당분야에 공지되어 있다(참조: Mannino , et al ., Biotechniques , 6:682, 1988). 리포좀의 조성은 통상적으로, 스테로이드, 특히, 콜레스테롤과 조합된 인지질의 조합이다. 다른 인지질 또는 다른 지질 역시 이용될 수 있다. 리포좀의 물리적 특징은 pH, 이온 강도와 이가 양이온의 존재에 좌우된다.

리포좀 생산에 유용한 지질의 실례에는 포스파티딜 화합물, 예를 들면, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로시드 및 강글리오시드가 포함된다. 예시적인 인지질에는 난 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 그리고 디스테아로일포스파디틸콜린이 포함된다. 또한, 리포좀의 표적화는 예로써, 장기-특이성(organ-specificity), 세포-특이성(cell-specificity), 그리고 세포소기관-특이성(organelle-specificity)에 기초하고, 당분야에 공지되어 있다.

실례

본 발명은 앞서 전반적으로 기술되었고, 아래의 실시예를 참조하면 더욱 용이하게 이해될 수 있는데, 이들 실시예는 본 발명의 특정 구체예를 예시하는 목적으로 포함되고 본 발명을 한정하지 않는다.

실시예 1.

ActRIIB - Fc 융합 단백질의 생성.

본 발명자들은 사이에 위치하는 인간 또는 생쥐 Fc 도메인에 최소 링커(중간에 세 개 글리신 아미노산)와 함께 융합된 인간 ActRIIb의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 ActRIIa 융합 단백질을 작제하였다. 이들 구조체는 각각, ActRIIB(20-134)-hFc 및 ActRIIB(20-134)-mFc로 지칭된다.

CHO 세포주로부터 정제된 ActRIIB-hFc는 하기에 도시된다(서열 번호: 5):

ActRIIB(20-134)-hFc 및 ActRIIB(20-134)-mFc 단백질은 CHO 세포주에서 발현되었다. 3가지 상이한 리더(leader) 서열이 고려되었다:

(i) 꿀벌 멜리틴(mellitin)(HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (서열 번호: 7)

(ii) 조직 플라스미노겐 활성인자(TPA):

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (서열 번호: 8)

(iii) 고유: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (서열 번호: 9)

선택된 형태는 TPA 리더를 이용하고, 아래의 가공되지 않은 아미노산 서열을 보유한다:

상기 폴리펩티드는 아래의 핵산 서열에 의해 인코딩된다:(서열 번호: 10).

CHO-세포 생산된 물질의 N-말단 염기서열분석에서, -GRGEAE의 주요 서열(서열 번호: 11)이 밝혀졌다. 문헌에서는 보고된 다른 구조체는 -SGR...서열로 시작된다.

정제는 예로써, 단백질 A 크로마토그래피, Q 세파로오스 크로마토그래피, 페닐세파로오스 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 그리고 양이온 교환 크로마토그래피 중에서 임의의 순서로, 3가지 또는 그 이상을 비롯한 일련의 칼럼 크로마토그래피 단계에 의해 달성될 수 있다. 정제는 바이러스 여과(viral filtration)와 완충액 교환(buffer exchange)으로 완결될 수 있다.

ActRIIb-Fc 융합 단백질은 HEK293 세포 및 COS 세포에서도 발현된다. 모든 세포주로부터 얻은 재료 및 적당한 배양 조건으로 생체내에서 근육-생성 활성을 가진 단백질을 제공할 수 있자만, 세포주 선택 및/또는 배양 조건과 연관하여 다양한 가능성이 관측되었다.

실시예 2:

ActRIIB - Fc 돌연변이체 생성

출원인은 ActRIIB의 세포외 도메인에 일련의 돌연변이을 생성하여, 세포외 ActRIIB 와 Fc 도메인 사이에 가용성 융합 단백질로써 이들 돌연변이 단백질들을 생산하였다. 배경 ActRIIB-Fc 융합은 다음 서열을 가진다(밑줄은 Fc 부분)(서열 번호: 12):

배경 ActRIIB-Fc 단백질로 N- 및 C-말단 절두를 포함하는 다양한 돌연변이를 도입시켰다. 실시예 1에서 제시하는 데이터에 근거하여, TPA 리더와 발현되는 경우, 이들 구조체는 N-말단 세린이 부족할 것으로 기대된다. 돌연변이는 PCR 돌연변이생성에 의해 ActRⅡB 세포외 도메인에서 생성된다. PCR 후에, Qiagen 컬럼을 통하여 단편들이 정제되고, SfoI 및 AgeI으로 절단하고, 겔 정제하였다. 이들 단편들은 발현벡터 pAID4 (WO2006/012627 참조)에 결찰시켜, 사람 IgGI와 융합 키메라가 만들어지도록 한다. 대장균(E. coli) DH5 알파로 형질도입시에 콜로니를 찍어내고 DNA를 분리하였다. 뮤린 구조체(mFc)의 경우, 뮤린 IgG2a을 사람 IgGI에 대체한다. 모든 돌연변이는 서열로 확인되었다.

일과성 형질감염을 통하여 HEK293T 세포에서 모든 돌연변이를 만들었다. 요약하면, 500ml 스피너(spinner)에서, HEK293T 세포는 250㎖ 용적의 Freestyle(Invitrogen)에 6x105 세포/㎖가 되도록 하여, 하룻밤동안 생장시켰다. 그 다음날, 세포를 DNA:PEI (1:1) 복합체로 최종 농도가 0.5㎍/㎖이 되도록 처리하였다. 4시간 후에, 250㎖ 배지를 추가하고, 세포를 7일간 생장시켰다. 조건화 배지는 세포를 스핀 다운시켜 수거한 후 농축시켰다.

돌연변이체는 다양한 기술을 이용하여 정제하는데, 예를 들면, 단백질 A 컬럼과 낮은 pH(3.0) 글리신 완충액으로 용출시켜 정제할 수 있다. 중화후에, PBS에 대해 투석하였다.

유사한 방법을 이용하여 CHO 세포에서도 돌연변이체를 만들 수 있다.

하기에서 설명하는 결합 검사 및/또는 생검에서 돌연변이체를 테스트하였다. 일부 경우에, 정제된 단백질보다는 조건화 배지로 검사를 실행하였다. 예를 들면, 공개된 특허 출원들 WO 06/012627 및 WO 08/097541에서 변이체들이 설명된다. 이러한 변이체들은 여기에서 설명되는 방법들에 이용될 수 있다.

실시예 3: 고지방식이가 공급된 마우스에서 백색 지방 조직의 발열성 성질에 ActRIIB (20-134)- hFc 의 효과

출원인은 고지방식이가 공급된 수컷 마우스에서 갈색 지방세포 및 기타 대사 종점(endpoint)상에 ActRIIB-Fc 효과를 조사하였다. 10주령의 C57BL/6 마우스의 체중을 대등하게 하였고, ActRIIB(20-134)-hFc (n = 10) 또는 트리스-완충된 염(TBS) 비이클(n = 7)로 60일간 10 ㎎/㎏으로 매주 2차례 처리하였다. 이 기간 동안, 마우스들은 4.5% 지방을 함유하는 표준 음식 대신 지방 58%를 함유하는 규정식에 무제한으로 접근하였다. 연구 종료시에, 고환 지방 패드를 수거하였고, 정량적 RT-PCR (역 전사 중합효소 쇄 반응)을 이용하여 백색 지방 주머니안에 고르게 분포된 갈색 지방세포에서 발열성 능력에 대한 잘 알려진 표식인 탈공역단백질-1(UCP-1)을 인코드하는 mRNA의 수준을 측정하였다(Cousin et al ., 1992, J Cell Sci 103:931-942).

ActRIIB(20-134)-hFc 처리는 주목할만한 대사 효과를 야기하였다. 고지방식이를 한 마우스에서, ActRIIB(20-134)-hFc는 비이클과 비교하였을 때 고환 지방에서 UCP1 mRNA 수준을 거의 9배 증가시켰고(도 1; P < 0.05), C57BL/6 마우스는 다른 마우스 계통과 비교하였을 때, 주요 백색 지방 데포우내 UCP1과 갈색 지방세포의 심각하게 무딘 유도를 나타내었다(Guerra et al ., 1998, J Clin Invest 102:412-420; Xue et al ., 2007, J Lipid Res 48:41-51). ActRIIB(20-134)-hFc는 또한 유익하게 지방산이 없는 혈청 농축물을 30%(P < 0.001) 감소시켰다. 중요한 것은, 기준일 및 48일 시점에서 핵 자기공명(NMR)로 측정하였을 때, 신체 조성물에서 ActRIIB(20-134)-hFc의 유익한 효과는 UCP1의 상향조절을 수반하였다. 고지방식이 조건하에 비이클로 처리된 대조군에서 총 지방량은 48일 기간 동안 3배가 되었고, ActRIIB(20-134)-hFc 처리는 이러한 증가를 40% 감소시켰다. 48일 시점에서 총 지방량은 ActRIIB(20-134)-hFc-처리된 마우스에서 체중의 28%이며, 대조군 마우스에서는 체중의 39% 이었고, 체지방량(lean tissue mass)은 ActRIIB-Fc-처리된 마우스에서 체중의 64%였고, 대조군 마우스는 55% 였다. 따라서, 최종 결과는 고지방식이 조건하에서 더 건강한 체조성물이라는 것이다.

실시예 4: 고지방식이를 섭취한 마우스에서 백색 지방 조직의 발열성 성질에 절두된 변이체 ActRIIB(25-131)-hFc의 효과

상기에서 설명된 연구에서(실시예 3), 출원인들은 또한 고지방식이 조건하에 백색 지방 조직과 기타 대사 종점의 발열성 성질에서 절두된 변이체 ActRIIB(25-131)-hFc의 효과를 조사하였다.

출원인은 ActRIIB(20-134)-hFc에 대해 상기에서 설명된 동일한 리더와 방법으로 방법을 이용하여 절두된 융합 단백질 ActRIIB(25-131)-hFc (도 13-14)를 만들었다. CHO 세포에서 발현후 정제된 성숙 단백질은 하기 서열을 가진다(서열 번호: 6):

10주령 C57BL/6 마우스는 ActRIIB(25-131)-hFc 또는 트리스-완충된 염(TBS) 비이클로 60일간 10 ㎎/㎏으로 매주 2차례 처리하였다. 이 기간 동안, 마우스들은 4.5% 지방을 함유하는 표준 음식 대신 지방 58%를 함유하는 규정식에 무제한으로 접근하였다. 표준 음식 섭취를 유지한 추가 마우스 군 또한 TBS 비이클로 처리하였고, 그 다음 식이 조절군과 같이 처리하였다.

고지방식이 조건하에, ActRIIB(25-131)-hFc 처리는 백색 지방 조직에서 조직학적 변화와 유전자 발현 프로파일을 촉발시켰고, 이는 발열성 능력과 일관되었다. 도 2에 나타낸 것과 같이, 고환 백색 지방의 조직학적 검사에서 ActRIIB(25-131)-hFc는 지방 방울 크기를 감소시켰고, 갈색 지방의 인증이 되는 다방성 지방세포 덩어리 형성을 야기하였다는 것이 나타났다. 더욱이, 이러한 조직의 면역조직 분석에서 ActRIIB(25-131)-hFc 처리 결과로(도 2) 다방성(multilocular) 및 일방성(unilocular) 지방세포 모두에서 광범위한 UCP1의 세포질 유도가 나타났다.

이러한 조직학적 변화의 수반은 정량적 RT-PCR에 의해 결정하였을 때, 고환 백색 지방에서 주요 발열성 및 대사 조절 유전자의 발현에 주요 변화였다. 고지방식이를 한 마우스에서, ActRIIB(25-131)-hFc 처리는 비이클과 비교하였을 때 UCP1 mRNA 수준을 60배 이상 증가시켰고(도 3), 상기에서 지적한 것과 같이 이러한 계통의 마우스는 다른 마우스 계통과 비교하였을 때, 주요 백색 지방 주머니안에 UCP1 및 갈색 지방세포의 심각하게 둔한 유도를 나타내었기 때문에 특히 강한 인상을 주는 변화다. 또한, ActRIIB(25-131)-hFc 처리는 고지방식이에 의해 유도된 대사 손상에 대항하여 보호하는 에너지-민감성 마스터 조절물질(데아세틸라제)인 시르투인 SIRT-1 (silent information regulator two, homolog 1) (도 4)를 인코드하는 mRNA 수준을 증가시켰고(Pfluger et al ., 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105:9793-9798) 그리고 지방산 대사의 주요 조절에 연루된다(Rodgers et al., 2008, FEBS Lett 582:46-53). 의미심장하게, ActRIIB(25-131)-hFc 처리는 또한 갈색 지방 조직에서 미토콘드리아 생물발생 및 발열성 능력에 필요한 많은 유전자의 발현을 조절하는 SIRT-1의 잘 확인된 표적인 PGC-1α (페록시좀 증식물질-활성화된 수용체 감마공동활성물질-1α) (도 5)을 인코드하는 mRNA 수준을 증가시켰다(Uldry et al ., 2006, Cell Metab , 3:333-341). 특히, 백색 지방세포내에서 PGC-1α의 강요된 발현은 갈색 지방세포안에 것과 매우 닮은 UCP1을 포함한 유전자 발현의 발열성 프로그램을 유도하는 것으로 보였다(Hansen et al ., 2006, Biochem J 398:153-168). 본 연구에서, ActRIIB(25-131)-hFc는 고지방식이 조건하에 백색 지방 조직내 PGC-1α 유전자 발현을 표준 식이를 섭취한 쥐의 것과 구별안되는 수준으로 복원시켰다(도 5).

처리와 연관된 추가 변화는 백색 지방 조직내 변경된 발현 프로파일과 유익한 호르몬 및 대사 효과 사이에 현저한 연계를 구성한다. 따라서, 고환 백색 지방안에, ActRIIB(25-131)-hFc는 SIRT-1의 표적과 아디포넥틴 발현의 주요 유도물질인 전사 인자, Foxo-1 (포크머리 상자를 포함하는, 단백질 O 하위패밀리-1) (도 6)를 인코드하는 mRNA 수준을 증가시켰다(Qiao et al ., 2006, J Biol Chem 281:39915-39924). 지방-유도된 호르몬인 아디포넥틴은 지방량/비만과 역 관계로 농도가 변화되어, 표적 조직에서 중요한 인슐린-감응성 작용을 발휘한다(Yamauchi et al ., 2001, Nat Med 7:941-946; Maeda et al ., 2002, Nat Med 8:731-737; Kadowaki et al ., 2005, Endocr Rev 26:439-451). Foxo-1 mRNA 유도와 일관되게, ActRIIB(25-131)-hFc 처리는 고환 백색 지방(도 7)내 아디포넥틴 mRNA의 수준을 상승시켰고, 뿐만 아니라 순환 아디포넥틴 농도도 상승시켰다(도 8). 중요한 것은, 이러한 변화는 ActRIIB(25-131)-hFc-처리된 마우스의 순환 인슐린 (도 9), 트리글리세리드, 자유 지방산, 고밀도 지단백질 (HDL), 그리고 저 밀도 지단백질 (LDL)의 강력한 감소와 수반되어, 이들 모든 변수들이 거의 정상화되었다. 끝으로, 전술한 효과는 기준일과 48일 시점에서 핵 자기 공명(NMR)로 측정하였을 때, 신체 조성물의 유익한 변화와 함께 동반되었다. 특히, 고지방식이 조건하에 비이클-처리된 대조군의 총 지방향은 48일 기간 동안 3배가 되었고, 그리고 ActRIIB(25-131)-hFc 처리는 이러한 증가를 거의 40% 감소시켰다. 요약하면, 고지방식이 조건하에서 ActRIIB(25-131)-hFc 처리는 1) 발열성 능력과 일치하는 백색 지방 조직내 조직학적 변화와 유전자 발현 프로파일, 2) 호르몬 및 대사 변수들의 광범위한 범위의 유익한 변화, 그리고 3) 개선된 신체 조성물을 결과하였다.

실시예 5:

고지방식이를 섭취한 마우스에서 갈색 지방 주머니에 있어서 ActRIIB (25-131)- mFc 의 효과

또다른 연구에서, 출원인은 고지방식이가 공급된 수컷 마우스에서 내견갑부(intrascapular) 갈색 지방 주머니상에 절두된 변이체 ActRIIB(25-131)-mFc 효과를 조사하였다. 9주령의 C57BL/6 마우스는 ActRIIB(25-131)-mFc (n = 20) 또는 트리스-완충된 염(TBS) 비이클(n = 10)로 60일간 10 ㎎/㎏으로 매주 2차례 처리하였다. 투약 시작 7일전에 시작하여, 마우스들은 4.5% 지방을 함유하는 표준 음식 대신 지방 58%를 함유하는 규정식에 무제한으로 접근하였다. 표준 음식 섭취를 유지한 추가 마우스 군(n=10) 또한 TBS 비이클로 처리하였고, 그 다음 식이 조절군과 같이 처리하였다.

표준 식이와 비교하였을 때, 고지방식이는 갈색 지방 조직의 견갑골사이 주머니에서 몇 가지 눈에 띄는 변화를 만들었고, ActRIIB(25-131)-mFc 처리는 이러한 각 변화를 완전하게 또는 대부분 역전시켰다. 특히, 고지방식이는 견갑골사이 주머니의 명백한 확장의 원인이 되었고, 뿐만 아니라 이 주머니의 색을 붉은 색에서 핑크색으로 밝게하였다(도 10). 이러한 음식물에 의해 유도된 확대는 지방량의 배가(도 11)및 갈색 지방 주머니안의 밀도 감소(도 12)를 반영하였다. 주머니 밀도는 마우스 하위집단(군당 n=4)에서 microCT로 측정하였는데, 핵 자기 공명(NMR)에 의해 측정하였을 때, 총 신체 지방의 비율은 군 평균에 근접하였다(모든 마우스를 NMR로 스캔하였다). 임의의 경우에서, ActRIIB(25-131)-mFc 처리는 갈색 지방량에서 음식물에 의해 유도된 변화(도 11) 및 밀도(도 12)를 완전하게 역전시켰고(도 11), 주머니의 크기 및 색깔에서 음식물에 의해 유도된 변화를 대부분 역전시켰다(도 10). 이러한 결과는 고지방식이 조건하에서 ActRIIB(25-131)-mFc는 건강한 갈색 지방 기능과 관련된 성질을 대부분 또는 완전하게 복원시키고, 따라서 갈색 지방 주머니의 전반적인 크기를 감소시켜 갈색 지방의 질을 개선시킨다.

이와 함께, 이들 데이터는 가용성 ActRIIB-Fc 융합 단백질들은 발열성 갈색 지방세포의 형성 및/또는 활성을 증가시켜, 고열량 섭취 및 잠재적인 다른 질환들에 의해 악화되는 대사 이상을 치료하기 위하여 TGF-패밀리 리간드들에 의한 신호발생의 길항제로 이용할 수 있다는 것을 나타낸다.

참고 자료에 통합

여기에서 언급된 모든 공개 및 특허는 각 개별 공개 또는 특허가 참고자료에 특별히 그리고 개별적으로 지적된 것처럼 전문이 참고문헌에 통합된다.

요부(subject matter)의 특정 구체예가 논의되긴 했지만, 상기 명세서는 설명을 목적으로 하고, 본 발명을 한정하지 않는다. 상기 명세서와 하기 특허청구범위를 검토한 이후에, 다수의 변이는 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 전체 범위는 특허청구범위와 이의 균등한 범위, 그리고 명세서와 이의 변이에 기준하여 결정되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Acceleron Pharma Inc. <120> METHODS FOR INCREASING THERMOGENIC ADIPOCYTES <130> PHPH-050-WO1 <140> PCT/US10/37779 <141> 2010-06-08 <150> 61/280,545 <151> 2009-11-03 <150> 61/276,422 <151> 2009-09-10 <150> 61/268,128 <151> 2009-06-08 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala 1 5 10 15 Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu 20 25 30 Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser 35 40 45 Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe 50 55 60 Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln 65 70 75 80 Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr 85 90 95 His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro 100 105 110 Thr Ala Pro Thr 115 <210> 2 <211> 512 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu 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ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 876 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 936 tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 996 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1056 agcctctccc tgtccccggg taaatga 1083 <210> 16 <211> 1083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 16 tcatttaccc ggggacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60 catcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120 gctatagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180 ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240 caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300 cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360 gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420 gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480 cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540 gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600 cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660 cggtgggcat gtgtgagttc caccacctgt cgggggtggc tcgtacgtga cttccgggcc 720 cccagcctct ggcaaatgag tgaagcgctc gttgcagaag ttgccttcac agcagcagaa 780 gtacacctgg gggttctcct cagtggccac acactcctgc ctatcgtagc agttgaagtc 840 atctagccag cagcccttct tcacgagctc gatggtgcca gagctgttgc gccaggaggc 900 gtagcagtgc agccgcttgt cctgctcgcc ttcgcagcgc tccaggccgc tctggttggt 960 gcgctccagc tcccagttgg cgttgtagta gatgcactcc cgtgtctcag cggcgccggg 1020 cgaaacgaag actgctccac acagcagcag cacacagcag agccctctct tcattgcatc 1080 cat 1083 <210> 17 <211> 368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 17 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr 20 25 30 Arg Glu 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Claims (32)

1. 발열성 지방세포를 증가시킬 필요가 있는 환자에게서 발열성 지방세포를 증가시키는 방법에 있어서, 이 방법은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법:
   a) 서열 번호: 2의 아미노산 29-109의 서열에 최소 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
   b) 엄격한 혼성화 조건(stringent hybridization conditions)하에 서열 번호: 3의 핵산에 혼성화되는 핵산에 의해 인코드된 폴리펩티드.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 이량체(dimer)인, 방법.
3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 폴리펩티드는 ActRIIB에 이종 부분을 포함하는 융합 단백질인, 방법.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 폴리펩티드는 면역글로블린의 불변 도메인에 융합된, 방법.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 폴리펩티드는 면역글로블린의 Fc 도메인에 융합된, 방법.
6. 청구항 5에 있어서, 면역글로블린은 인간 IgG1인, 방법.
7. 청구항 1-6중 임의의 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:5 또는 6의 서열을 포함하는, 방법.
8. 청구항 중 임의의 한 항에 있어서, 환자는 대사 질환을 가진, 방법.
9. 청구항 1-7중 임의의 한 항에 있어서, 환자는 근질환 및 대사 질환을 가진, 방법.
10. 청구항 중 임의의 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:2의 아미노산 29-109의 서열에 최소 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:2의 아미노산 29-109의 서열에 최소 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:2의 아미노산 29-109의 서열에 최소 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
13. 청구항 1-9중 임의의 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:2의 아미노산 25-131의 서열에 최소 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
14. 청구항 13에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:2의 아미노산 25-131의 서열에 최소 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
15. 청구항 14에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:2의 아미노산 25-131의 서열에 최소 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
16. 청구항 15에 있어서, 폴리펩티드는 서열 번호:2의 아미노산 25-131의 서열에 최소 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
17. 청구항 1-16중 임의의 한 항에 있어서, 화합물의 투여로 치료받은 환자의 지방세포에서 UCP-1 발현이 촉진되는, 방법.
18. 청구항 17에 있어서, UCP-1 발현은 백색 지방 조직내에서 증가된, 방법.
19. 발열성 지방세포를 증가시킬 필요가 있는 환자에게서 발열성 지방세포를 증가시키는 방법에 있어서, 이 방법은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법:
    a. ActRIIB의 길항제;
    b. 미오스타틴의 길항제;
    c. 악티빈의 길항제;
    d. GDF11의 길항제;
    e. Nodal의 길항제; 그리고
    f. GDF3의 길항제.
20. 청구항 19에 있어서, 상기 화합물은 ActRIIB의 길항제인, 방법.
21. 청구항 20에 있어서, ActRIIB의 길항제는 ActRIIB에 결합하는 항체 그리고 ActRIIB를 인코드하는 핵산에 혼성화되어, ActRIIB 생산을 억제하는 핵산으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
22. 청구항 19에 있어서, 화합물은 미오스타틴의 길항제인, 방법.
23. 청구항 22에 있어서, 미오스타틴의 길항제는 미오스타틴에 결합하는 항체, 미오스타틴를 인코드하는 핵산에 혼성화되어, 미오스타틴 생산을 억제하는 핵산 그리고 미오스타틴 프로펩티드 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
24. 청구항 19에 있어서, 화합물은 악티빈의 길항제인, 방법.
25. 청구항 24에 있어서, 화합물은 악티빈 A, 악티빈 B, 악티빈 C, 및 악티빈 E으로부터 선택된 악티빈 단백질의 길항제인 방법.
26. 청구항 24 또는 25에 있어서, 악티빈의 길항제는 악티빈에 결합하는 항체 그리고 악티빈을 인코드하는 핵산에 혼성화되어, 악티빈 생산을 억제하는 핵산으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
27. 청구항 19에 있어서, 화합물은 GDF3의 길항제인, 방법.
28. 청구항 27에 있어서, GDF3의 길항제는 GDF3에 결합하는 항체, GDF3을 인코드하는 핵산에 혼성화되어, GDF3 생산을 억제하는 핵산 그리고 GDF3 프로펩티드 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
29. 청구항 19에 있어서, 화합물은 GDF11의 길항제인, 방법.
30. 청구항 29에 있어서, GDF11의 길항제는 GDF11에 결합하는 항체, GDF11을 인코드하는 핵산에 혼성화되어, GDF11 생산을 억제하는 핵산 그리고 GDF11 프로펩티드 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
31. 청구항 30에 있어서, 화합물은 Nodal의 길항제인, 방법.
32. 청구항 31에 있어서, Nodal의 길항제는 Nodal에 결합하는 항체, Nodal을 인코드하는 핵산에 혼성화되어, Nodal생산을 억제하는 핵산 그리고 Nodal 프로펩티드 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
    

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