KR102282638B1 - 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포 분화조절용 조성물, 분화 유도방법, 및 이를 포함한 체지방 감소 및 비만 예방용 약학 조성물 - Google Patents

베이지 지방세포 및 갈색 지방세포 분화조절용 조성물, 분화 유도방법, 및 이를 포함한 체지방 감소 및 비만 예방용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인삼에서 추출한 진세노사이드(ginsenoside) Re를 포함함으로써 백색 지방세포를 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포로 전환시키는 조성물을 제공하는 데 있다. 또한 본 발명은 상기 조성물을 백색 지방세포에 처리하여 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포로의 분화를 유도하는 방법을 제공하며, 상기 조성물을 포함한 체지방 감소 및 비만 예방용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

Description

베이지 지방세포 및 갈색 지방세포 분화조절용 조성물, 분화 유도방법, 및 이를 포함한 체지방 감소 및 비만 예방용 약학 조성물{Composition and Method for differentiation of beige and brown adipose tissue, and Pharmaceutical composition comprising the same for reducing body fats and treating obesity}
본 발명은 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포 분화조절용 조성물, 분화 유도방법, 및 이를 포함한 체지방 감소 및 비만 예방용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 진세노사이드(ginsenoside) Re가 포함된 조성물을 이용하여 체지방 감소 및 비만 예방이 가능한 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포 분화조절용 조성물, 분화 유도방법, 및 이를 포함한 체지방 감소 및 비만 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.
현대 사회의 발전에 따라 비만은 심각한 질병 중 하나로 등장하고 있으며 세계보건기구(WHO)는 비만을 치료해야 할 질병의 하나라고 하고 있다. 비만은 열량의 섭취와 소비의 불균형으로 발생되는 대사성 질환이며, 지방조직의 증가 상태로 정의된다. 비만은 서구사회에서는 가장 흔한 영양장애일 뿐 아니라, 최근 우리나라에서도 경제발전에 의한 식생활 향상 및 생활 방식의 서구화로 인하여 비만율이 급격하게 증가하는 추세에 있다.
비만은 여러 성인병의 발병 위험을 증가시키는 중요한 인자이다. 실제로 비만인 사람은 그렇지 않은 사람보다 고혈압, 혈중 콜레스테롤 상승, 당뇨병, 신장질환, 뇌졸증, 동맥경화, 지방간, 관절염 및 각종 암에 대해 발병률이 훨씬 높은 것으로 나타나있다. 이처럼 비만은 다양한 대사성 질환을 유발시키며 체중 감소를 통해 이러한 질환의 발병률을 현격히 감소시킬 수 있으므로 지방을 많이 함유하는 지방세포가 이러한 현상을 매개할 것이라고 유추할 수 있다.
비만 관련된 질환에 대한 관심이 고조되면서 비만 치료제로 개발될 수 있는 물질에 대한 연구도 성행하고 있다. 화학 합성 물질의 경우 부작용이 많아 안전도가 높은 생약들의 개발이 필요한 실정이다. 그 중 인삼은 전세계적으로 건강 식품과 의약품으로서 높은 인기를 차지하고 있는데, 인삼의 유효성분인 사포닌의 효능이 구 소련의 Brekhman에 의해 주장되었고, 이러한 사포닌 성분을 1964년 Shibata가 인삼에 함유된 glycoside란 뜻으로 진세노사이드(ginsenoside)라 명명하게 되었다.
이러한 진세노사이드 성분들이 다양한 약리 효능을 가지고 있음이 점차 밝혀지고 있는 가운데, 생체 내 지질대사와 당뇨병에도 특별한 효능이 있다는 연구결과들이 발표되었다. 콜레스테롤이 다량 함유된 사료를 토끼에게 투여한 뒤 홍삼이 고지혈증에 미치는 효과를 조사한 결과 지질대사와 관련된 각종 효소들의 활성이 촉진되어 혈중 콜레스테롤 함량이 저하되고 고지혈증으로 야기되는 죽종 형성이 예방되었다는 연구가 발표되었으며, 당뇨병 환자에게 홍삼 분말을 투여하면 환자에 따라 혈당량이 저하되고, 인슐린 치료환자는 투여량 감소조절이 가능하였다.
비만환자에게 과도하게 축적된 중성지방은 지방조직뿐 아니라, 간이나 근육에 저장되어 인슐린 저항성을 유도한다. 따라서, 과도하게 저장된 중성지방의 소모가 근본적인 비만과 이에 따른 대사질환의 예방 및 치료가 될 수 있다. 지방세포는 크게 백색지방, 갈색 지방세포 및 베이지 지방세포로 분류된다. 백색 지방세포는 중성지방의 큰 지방구에 저장되어 주로 복부에서 많이 발견되며, 건강에 부정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 갈색 지방은 백색 지방세포에 비해 많은 미토콘드리아와 작은 크기의 지방구를 함유하고 있으며 열생성을 통한 체온 유지와 적절한 운동에 의해 유도 될 수 있다고 보고되고 있다. 갈색 지방세포가 많이 함유되도록 유도한 쥐는 고지방 식이에 의한 비만에 대해 상대적으로 몸무게 감소와 열량 소모의 증가를 유도하여 비만과 대사질환에 효과적이었다. 또한, 갈색 지방에서는 UCP-1(uncoupling protein-1) 단백질이 많이 발현되며, 이는 지방세포에서 열량의 저장이 아닌 열량 소모로 열생성에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 갈색 지방과 더불어 베이지 지방세포 또한 중요한 지방세포로 인식되고 있다. 베이지 지방세포는 건강에 유해한 백색 지방세포에서 운동이나 추위 등의 자극에 의해 유도되며 백색 지방세포의 형질은 감소되나 갈색 지방세포의 특징을 갖게 되어 UCP-1 발현을 증가시킨다. 베이지 지방세포 또한 쥐에게서 발견되는 갈색 지방세포와 유사하게 비만 및 대사 질환에 유익한 것으로 알려져 있다. 게다가, 인간에게서 발견되는 유익한 갈색 지방세포는 대부분 베이지 지방세포로 알려짐에 따라 건강에 해로운 백색 지방세포를 건강에 상대적으로 유익한 베이지 지방세포로의 전환 또는 분화 유도하는 기술에 대한 관심이 높아지고 있는 실정이다.
한편 본 발명과 관련된 선행기술로서 한국 공개특허공보 제10-2012-0049214호는 발열성 지방세포를 증가시키는 방법을 개시하고 있으나, 본 발명과 같이 천연 유래 성분을 사용하여 백색 지방세포를 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포로 전환시키는 방법을 제공하지는 못하고 있다.
대한민국 공개특허공보 제10-2012-0049214호(2012.05.16. 공개)
본 발명의 목적은 인삼에서 추출한 진세노사이드(ginsenoside) Re를 포함함으로써 백색 지방세포를 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포로 전환시킬 수 있는 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 백색 지방세포에 처리하여 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포로 분화 유도하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하여 지방 흡수 억제, 지방 산화 촉진 및 지방 합성 저해 기작을 통해 체지방 감소 및 비만 예방이 가능한 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 해결하기 위해, 진세노사이드(Ginsenoside) Re를 포함하는 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포 분화조절용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 베이지 지방세포 또는 갈색 지방세포의 활성을 증가시킬 수 있다.
상기 조성물은 UCP-1(uncoupling protein-1)의 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 조성물은 PRDM16(PR domain-containing protein 16)의 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 조성물은 CIDEA의 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 조성물은 PGC-1α(PPARγ coactivator-1α)의 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 진세노사이드 Re는 10 μM 내지 40 μM의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 진세노사이드 Re가 포함된 조성물을 백색 지방세포에 처리하여 베이지 지방세포로 분화시키는 분화 유도방법을 제공할 수 있다.
상기 유도방법은 갈색 지방세포의 활성을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함한 체지방 감소 및 비만 예방용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면 인삼에서 추출한 진세노사이드(ginsenoside) Re가 포함된 조성물을 사용하여 백색 지방세포를 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포로 분화시킬 수 있다.
또한 상기 조성물을 백색 지방세포에 처리하여 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포로의 분화 유도하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 조성물을 포함한 체지방 감소 및 비만 치료가 가능한 약학 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 진세노사이드 Re 처리에 따른 3T3-L1 지방전구세포의 세포생존율 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 진세노사이드 Re 처리 농도에 따라 분화된 3T3-L1 지방전구세포의 Oil Red O 염색결과를 흡광도로 나타낸 이미지이다.
도 3은 도 2의 흡광도를 백분율 값으로 나타낸 그래프이다.
도 4는 진세노사이드 Re를 처리한 뒤 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포 분화 및 지방생성 조절인자들의 qPCR 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 진세노사이드 Re를 처리한 뒤 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포 분화 조절인자들의 qPCR 결과를 나타낸 그래프이다.
하기의 설명에서는 본 발명의 실시예를 이해하는데 필요한 부분만이 설명되며, 그 이외 부분의 설명은 본 발명의 요지를 흩트리지 않는 범위에서 생략될 것이라는 것을 유의하여야 한다.
이하에서 설명되는 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념으로 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 진세노사이드(Ginsenoside) Re를 포함하는 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포 분화조절용 조성물(이하, 조성물)을 제공한다.
진세노사이드는 인삼에서 추출되는 유효성분으로 많은 임상 실험과 동물 실험을 통하여 중추신경 억제 작용, DNA 촉진 작용, 프라스민 활성화 작용, 부신피질 자극호르몬 분비를 촉진하는 것으로 밝혀졌으며, 최근에는 비만과 그 합병증에도 효과를 나타낸다는 보고가 되어있지만 그 자세한 작용기작 및 표적 유전자에 대한 연구는 활발히 진행되지 않고 있다.
진세노사이드는 박층크로마토그래피(TLC)에서 분리된 이동거리 순으로 진세노사이드(Ginsenoside)-Ro와 진세노사이드(Ginsenoside)-Ra, -Rb1, -Rb2, -Rc, -Rd, -Re, -Rf, -Rg1, -Rg2, -Rg3 및 -Rh 등으로 정의된다.
본 발명은 상기의 다양한 진세노사이드 중 진세노사이드 Re를 포함한 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포 분화조절용 조성물을 제공한다.
상기 인삼의 종류는 제한되지 않으며 백삼, 수삼, 홍삼, 태극삼, 미삼, 흑삼, 호정화인삼, 배양삼 등을 사용할 수 있다.
상기 진세노사이드를 인삼에서 추출하기 위해서 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 예컨대 인삼에 다양한 추출용매를 처리하여 추출물을 얻을 수 있다.
상기 추출용매는 극성 용매 또는 비극성 용매일 수 있으며, 극성 용매로는 물，알코올(바람직하게는 메탄올, 에탄올，프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올，노말-부탄올，1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), 아세트산，DMFO(dimethyl-formamide), 및 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 사용할 수 있다. 비극성 용매로는 아세톤, 아세토나이트릴，에틸 아세테이트，메틸 아세테이트，플루오로알칸，펜탄，헥산，2,2,4-트리메틸펜탄，데칸, 사이클로헥산，사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐，1-클로로부탄，1-클로로펜탄，o-자일렌, 디이소프로필 에테르，2-클로로프로판，톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠，디에틸 에테르，디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민，에테르, 사염화탄소 및 THF를 사용할 수 있다.
상기 조성물은 베이지 지방세포 또는 갈색 지방세포의 활성을 증가시키거나, UCP-1, PRDM16, CIDEA, PGC-1α의 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 베이지 지방세포는 백색 지방조직에서 유래될 수 있으며, 미토콘드리아에 철분이 존재하여 베이지색을 띄는 세포이다. 백색 지방세포는 중성 지방으로 대량의 지방 에너지를 체내에 축적하는 기능을 갖는 세포로서 임신말기, 유아기, 사춘기에 집중하여 증식하며, 15 배까지 부풀어 올라 지방 비대화 현상의 원인이 되기도 한다. 일반적으로 지방세포라 함은 백색 지방세포를 의미한다. 베이지 지방세포는 백색 지방세포와 비교하여 에너지를 소비하여 열을 발생시킬 수 있는 지방세포이며, 지방을 에너지로 변환시켜 차가운 기온이나 특정 호르몬에 반응하여 UCP-1(uncoupling protein-1)을 생산한다.
상기 갈색 지방세포는 베이지 지방세포와 마찬가지로 지방을 에너지로 변환시키는 기능을 가지는 세포로서, 육안으로 보면 황갈색 내지 적갈색을 띈다. 갈색 지방세포가 많을수록 체지방이 감소하며 성인이 될수록 갈색 지방세포는 감소한다. 갈색 지방세포는 근육세포로 분화하는 줄기세포에 생성되는 반면, 베이지 지방세포는 백색 지방 세포층 안에서 생성된다는 점에 차이가 있다.
체내의 대부분의 대사회로들은 ATP를 소비하고 열을 발생하는데 기여한다. 전자 전달계가 미토콘드리아 밖으로 H+를 내보내면, 양성자 전위차가 형성되어 미토콘드리아 내막을 사이에 두고 electric potential과 chemical H+ gradient가 형성되고 이런 전자화학 전위차이가 ATP 합성을 유도한다. 이와 같은 미토콘드리아 연계(coupling)는 요구되는 에너지 양에 따라 산화율을 적응시킨다. 이와 반대되는 비연계(uncoupling) 과정은 양성자(H+) 전위차를 소모시킬 수 있는 여러 요소들에 의해 자극되어 열을 발산하는 열생성에 기여한다.
상기 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포는 이러한 열생성 관련 유전자를 발현함으로써 생체 내 클루코스 및 유리지방산을 제거하는 중요한 기능을 가진다. 갈색 지방세포는 미토콘드리아 내막의 UCP-1을 특이적으로 발현시킨다. UCP-1은 유리지방산에 의해 활성화되며 H+를 전달함으로써 에너지원 소모에 기여한다.
PRDM16은 C/EBPβ, PPARγ, PGC-1α/β, 및 C-terminal binding proteins 등의 전사 인자들과의 상호작용을 통해 백색 지방으로부터 갈색 지방세포로의 분화를 유도하고, 갈색 지방 조직 유전자 발현을 선택적으로 유도하여 백색 지방 세포의 유전자 발현을 억제한다.
PGC-1α(PPARγ coactivator-1α)는 미토콘드리아의 발생을 조절하는 중요 인자로, PPARγ 유전자와 물리적으로 결합하여 갈색 지방세포의 열생성에 직접적으로 관여한다.
CIDEA는 직접적으로 UCP-1과 상호작용하고 AMPK(AMP Kinase)의 발현을 조절함으로써 에너지 항상성에 중요한 역할을 한다.
하기의 실시예를 통해 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포의 조절인자인 UCP-1, PRDM16, CIDEA, PGC-1α의 발현 증가를 확인하였다.
실험 결과, 진세노사이드 Re는 세포 내 지방 축적을 감소시키고 지방세포 분화인자(PPARγ, SREBP1와 C/EBPα)의 발현을 증가시켰다. 또한 미토콘드리아의 열생성에 중요한 역할을 하는 UCP-1과 CIDEA의 발현을 현저하게 증가시키고, PRDM16과 PGC-1α의 발현을 증가시킴으로써 백색 지방세포를 베이지 지방세포 또는 갈색 지방세포로 전환시킬 수 있음을 확인하였다.
이러한 결과들을 종합적으로 보았을 때, 진세노사이드 Re는 지방에서 베이지 및 갈색 지방 선택적 유전자 발현을 증가시킴으로써 베이지 및 갈색 지방의 분화를 유도하고, 지방을 분해하여 에너지원으로 소모하는 과정을 촉진하게 되어 체지방 감소와 비만 예방 효과를 유도하는 것으로 볼 수 있다.
상기 진세노사이드 Re는 10 μM 내지 40 μM의 농도로 포함될 수 있으며, 20 μM의 농도로 포함되는 것이 바람직하다.
하기 실시예에서는 진세노사이드 Re의 농도에 따른 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포 조절인자들의 qPCR을 측정하여, 진세노사이드 Re의 농도가 증가함에 따라 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포 조절인자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 진세노사이드 Re의 농도가 20 μM인 경우 UCP-1과 CIDEA는 대조군에 비해 발현율이 4배 가량 증가하였으며, PRDM16과 PGC-1α는 2배 가량 발현율이 증가하였다. 이에 따라 본 발명의 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포 분화조절용 조성물은 체지방 감소 및 비만 예방의 약학적 조성물로서 이용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 상기 조성물을 백색 지방세포에 처리하여 베이지 지방세포로 분화시키는 유도방법을 제공하며, 상기 유도방법은 갈색 지방세포의 활성을 증가시킬 수 있다.
상기 유도방법은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 본 발명에서 개체란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비인간인 영장류, 생쥐, 쥐, 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 체지방 감소 및 비만 예방용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인 비만은 대사 장애로 인하여 체내에 지방세포가 증식 분화하고, 이로 인하여 지방이 과잉으로 축적된 상태를 의미하며, 에너지 흡수량이 소비량에 비해 상대적으로 증가하는 경우 지방세포의 수와 부피가 증가되는 과정을 거쳐 결과적으로 지방조직의 질량이 증가하는 것을 의미한다. 세포 수준에서의 비만은 지방세포의 증식 및 분화의 촉진으로 인한 지방세포의 수와 부피의 증가를 의미한다.
상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 약학 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충용액 등을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은, 소디움 카르복시메틸셀룰로오스, 솔비톨 또는 데스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실험 재료
1. 재료
인삼 사포닌 중 진세노사이드 Re는 도경 F&S(경기도) 인삼에서 분리 후 분말형태로 제공하였으며 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 시료로 사용하였다.
2. 세포배양
본 실험에 사용된 3T3-L1 지방전구세포는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 구입하였으며, 10 % bovine calf serum(BCS) 및 1 % antibiotic-antimycotic(Gibco BRL, USA)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, Gibco BRL)을 이용하여 37 ℃, 5 % CO2 조건에서 배양하였다.
실험 방법
1. 세포 생존율 측정
3T3-L1 지방전구세포를 well 당 1 Х 104 개씩 96 well plate에 분주하여 24시간 배양한 뒤, 진세노사이드 Re를 농도별로 처리하였다. 처리 후 24, 48, 72 시간 뒤에 Cell Counting Kit-8(CCK-8, Dojindo Molecular Technologies, USA)을 이용하여 세포생존율을 측정하였다.
2. 3T3-L1 지방전구세포의 분화 유도
3T3-L1 지방전구세포를 세포 배양용 6 well plate에서 confluent한 상태가 될 때까지 배양하였다. 이후 10 μg/ml insulin, 0.1 mM dexamethasone 및 0.5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)가 포함된 분화 배지로 교환하여 3일간 배양하였으며, 매 2일마다 10 μg/ml insulin이 포함된 배지로 교환하였다. 지방분화 유도 진행과정에서 진세노사이드 Re의 영향을 확인하기 위해 배지를 교환할 때마다 진세노사이드 Re를 농도별로 함께 처리하였다. 지방분화 유도 과정은 총 7일간 진행하였다.
3. Oil Red O 염색 및 정량적 분석
분화가 완료된 3T3-L1 세포를 PBS로 세척한 후 3.7 % formalin으로 1 시간 이상 고정한 뒤 Oil Red O solution을 처리하여 실온에서 30 분 동안 염색해주었다. 염색 후 Oil Red O solution을 제거하고 증류수로 3 회 세척한 뒤 염색된 세포를 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다.
또한 정량적 분석을 위하여 100% isopropanol을 이용하여 지방을 추출한 후 96 well plate에 200 μl씩 옮겨서 ELISA reader로 500 nm에서의 흡광도를 측정하였으며 대조군의 흡광도에 대한 백분율 값으로 나타내었다.
4. RNA 분리와 quantitative real-time PCR
준비된 3T3-L1 세포에 TRIzol reagent(Invitrogen Co.,USA) 1 ml을 첨가하여 상온에서 10 분 동안 반응시킨 후 200 μl의 chloroform을 첨가하여 4 ℃에서 30분 동안 반응시켰다. 14,000 rpm, 4 ℃에서 15 분간 원심분리 후 상층액을 400 μl 분리한 뒤 동량의 isopropanol을 첨가하여 4 ℃에서 30 분 동안 반응시킨 후 14,000 rpm, 4 ℃에서 30 분간 원심분리한 뒤 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 DEPC water를 이용하여 녹이고 정량한 뒤 SuperScriptⓡ III kit(Invitrogen Co.)를 사용하여 1차 cDNA를 합성하였으며, 100 ng의 cDNA를 SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa Co.)을 이용하여 ABI QuantStudio 3(Applied Biosystems, Foster City, USA)으로 분석하였다. 본 발명에서 사용된 primer sequence들은 아래 표 1에 제시한 바와 같다.
유전자 primer sequences
PPARγ TTTTCAAGGGTGCCAGTTTC
AATCCTTGGCCCTCTGAGAT
SREBP1 ATCGCAAACAAGCTGACCTG
AGATCCAGGTTTGAGGTGGG
C/EBPα TTACAACAGGCCAGGTTTCC
GGCTGGCGACATACAGTACA
UCP-1 CCTGCCTCTCTCGGAAACAA
GTAGCGGGGTTTGATCCCAT
PRDM16 CAGCACGGTGAAGCCATTC
GCGTGCATCCGCTTGTG
CIDEA ATCACAACTGGCCTGGTTACG
TACTACCCGGTGTCCATTTCT
PGC-1α GCAACATGCTCAAGCCAAAC
TGCAGTTCCAGAGAGTTCCA
상기 표 1의 유전자는 다음과 같다. Peroxisome proliferator-activated receptor(PPARγ), sterol regulatory element-binding protein 1(SREBP1), CCAAT/enhancer binding protein alpha(C/EBPα)는 지방세포 분화 및 지방생성 조절인자이다.
Uncoupling protein-1(UCP-1), PR domain containing 16(PRDM16), Cell death activator CIDE-A(CIDEA)와 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator - 1 alpha(PGC-1α)는 베이지 및 갈색지방세포의 분화 조절인자이다.
5. 통계 분석
통계분석은 SPSS 12.0K for Windows 통계 프로그램 패키지를 사용하였다. (+)con(positive control)을 기준으로 분석되었으며, 모든 실험은 3회 반복 또는 그 이상으로 실시되었고, 데이터들은 ±SD로 표시되었으며 유의수준은 P<0.05로 하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 One way-ANOVA와 Tukey test 사후검정으로 실시되었다.
실험 결과 분석
1. 3T3-L1 세포의 세포생존율
도 1은 진세노사이드 Re 처리에 따른 3T3-L1 지방전구세포의 세포생존율 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 1을 참조하면, 진세노사이드 Re를 0.1, 1, 10 과 100 μM처리하였을 때, 24 시간이 지난 후 모든 농도에서 대조군(control)에 비해 세포생존율이 증가하였다. 또한 48 시간과 72 시간이 지난 후 고농도(100 μM)를 제외한 모든 농도에서 대조군에 비해 세포생존율이 증가하였다. 이에 따라 100 μM의 높은 농도에서도 진세노사이드 Re가 세포독성을 일으키지 않고 세포생존율에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.
2. Oil Red O 염색결과
도 2는 진세노사이드 Re 처리 농도에 따라 분화된 3T3-L1 지방전구세포의 Oil Red O 염색결과를 흡광도로 나타낸 이미지이며, 도 3은 도 2의 흡광도를 백분율 값으로 나타낸 그래프이다.
도 2를 참조하면, Oil Red O 염색결과 대조군과 비교하여 진세노사이드 Re의 농도가 증가할수록 분화된 지방구의 크기가 작아지고 연해지는 것을 관찰 할 수 있었다.
또한 도 3을 참조하면, 진세노사이드 Re를 농도별로 처리한 후 대조군의 Oil Red O의 값을 100으로 하여 농도별 500 nm에서의 흡광도를 백분율 값으로 비교한 결과, 진세노사이드 Re 농도가 증가할수록 세포내 지방 축적이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
3. 3T3-L1 지방세포 분화 및 지방생성 조절인자의 quantitative real-time PCR 결과
도 4는 진세노사이드 Re를 처리한 뒤 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포 분화 및 지방생성 조절인자들의 qPCR 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4를 참조하면, 진세노사이드 Re 농도가 증가함에 따라 지방세포 분화가 증가하는 것으로 나타났다.
지방전구세포에서 성숙한 지방세포로 분화되는 과정은 호르몬, 사이토카인 그리고 다양한 전사인자들의 상호작용을 통해 이루어진다. C/EBPα와 PPARγ의 전사인자들이 분화과정을 협동적으로 촉진하여 지방조직 특이 유전자들의 발현을 유도하고 성숙한 지방조직 형질을 나타나게 한다. 또한, SREBP1은 C/EBPα와 PPARγ의 발현을 조절하여 지방세포 분화에 관여한다.
지방세포 분화가 진행되는 동안 진세노사이드 Re를 처리하지 않은 (+)con (positive control)보다 10 μM 처리한 그룹에서 PPARγ와 SREBP1의 발현은 2배가량 증가한 것으로 나타났고, 반면 20 μM 처리한 그룹에서는 PPARγ, SREBP1와 C/EBPα 의 발현이 10 μM 처리 그룹에 비해 약간 감소한 것으로 나타났다.
이에 따라, 진세노사이드 Re를 처리한 경우 지방세포 분화인자의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
4. 3T3-L1 지방세포의 베이지 및 갈색지방 분화 조절 인자의 quantitative real-time PCR 결과
도 5는 진세노사이드 Re를 처리한 뒤 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포 분화 조절인자들의 qPCR 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5를 참조하면, 진세노사이드 Re의 농도에 따라 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포 조절인자의 발현이 증가하였다. 진세노사이드 Re의 농도가 20 μM인 경우, UCP-1과 CIDEA는 진세노사이드 Re를 첨가하지 않은 대조군에 비해 4배 가량 발현율이 증가하였으며, PRDM16과 PGC-1α는 2배 가량 증가하였다.
이에 따라, 미토콘드리아의 열생성에 중요한 역할을 담당하는 UCP-1과 CIDEA의 발현을 현저하게 증가시키고, PRDM16과 PGC-1α을 증가시킴으로써 베이지 지방세포 또는 갈색 지방세포로의 분화를 유도하고, 특이적 유전자 발현을 조절하는 것을 확인할 수 있었다.
지금까지 본 발명의 일 실시예에 따른 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포 분화조절용 조성물, 분화 유도방법, 및 이를 포함한 체지방 감소 및 비만 예방용 약학 조성물에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

  1. 진세노사이드(Ginsenoside) Re를 포함하는 조성물로서,
    PRDM16(PR domain-containing protein 16)과 PGC-1α(PPARγ coactivator-1α)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는,
    지방전구세포로부터 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포로의 분화유도용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 베이지 지방세포 또는 갈색 지방세포의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는,
    지방전구세포로부터 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포로의 분화유도용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 UCP-1(uncoupling protein-1)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는,
    지방전구세포로부터 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포로의 분화유도용 조성물.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 CIDEA의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는,
    지방전구세포로부터 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포로의 분화유도용 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 진세노사이드 Re는 10 μM 내지 40 μM의 농도로 포함된 것을 특징으로 하는,
    지방전구세포로부터 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포로의 분화유도용 조성물.
  8. 제1항, 제2항, 제3항, 제5항 및 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물로서,
    PRDM16(PR domain-containing protein 16)과 PGC-1α(PPARγ coactivator-1α)의 발현을 증가시키고,
    지방전구세포로부터 베이지 지방세포 및 갈색 지방세포로의 분화를 유도하는 것을 특징으로 하는,
    체지방 감소 및 비만 예방용 약학 조성물.
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