CN1250288C - 作为抑制素受体的β聚糖及其用途 - Google Patents

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Abstract

抑制素和活化素是可逆调控多种调节系统的蛋白质激素。竞争性结合实验揭示了β聚糖、III型TGF-β受体，还起到了抑制素受体的作用。β聚糖上调抑制素与ActRII活化素受体的结合。通过上调抑制素与ActRII的结合，β聚糖有效隔绝了ActRII与活化素结合，从而减弱了活化素信号传导。另外，ActRII-β聚糖复合物可产生与通过ActRII和ALK4的活化素信号传导不同的新信号。β聚糖在大鼠大脑的不连续核和成年大鼠的垂体、睾丸和卵巢内的特定类型细胞中产生。抑制素-反应性组织和细胞类型中β聚糖的存在，以及该蛋白聚糖能结合抑制素，并赋予抑制素敏感性的能力，与β糖苷作为抑制素特异性受体，调节各种组织中抑制素反应的作用一致。

Description

作为抑制素受体的β聚糖及其用途
发明背景
联邦基金说明
本发明部分使用联邦政府基金号HD-13527的基金。因此，联邦政府对本发明具有某些权利。
发明领域
本发明一般涉及内分泌学领域，生殖生物学和细胞生物学，尤其是关于激素/生长因子信号传导。更特别的是，本发明涉及抑制素受体的识别及其用途。
相关领域的描述
抑制素和活化素最初被认为是性腺起源的蛋白质激素，它们能可逆调节垂体前叶产生促卵泡成熟激素(FSH)(1)。这些蛋白质是相关多肽的二硫键连接的二聚体。活化素由两条β链构成，而抑制素具有一条β链，它与一条相关的但趋异的α链连接(2)。现在已知活化素在生殖和非生殖组织中起到了重要的内分泌、旁分泌和自分泌作用。这些作用调节发育和成年动物中包括激素分泌和细胞增殖和分化过程(1，3)。虽然有抑制素不能封闭活化素反应的系统(5，6)，抑制素通常拮抗活化素的作用(4)。
抑制素和活化素属于生长和分化因子的转化性生长因子-β(TGF-β)超家族(7)。与该家族的其它代表性成员一样，活化素显示通过两类跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体传递信号(8)。在1991年，克隆和确定了活化素II型受体，称为ActRII的特征(9)。ActRII是第一种被确定特征的脊椎动物受体丝氨酸激酶(RSK)，也是任何TGF-β超家族成员中第一种在分子水平详细描述的受体。现在超过12种受体丝氨酸激酶家族成员已被鉴定出来，包括第二种II型活化素受体(ActRIIB)(10，11)、II型TGF-β受体(12)和化合物(13，14)和TGF-β(15)的I型受体。
抑制素、活化素和相关因子的广泛的重要生物学作用，以及其与治疗生殖、发育、骨骼、肝脏、造血和中枢神经系统疾病的可能应用的关系，形成了探索其受体、信号传导机制和调控的强有力的理由。总的说，该工作涉及鉴定多种新的靶分子，并应提供针对治疗内分泌疾病和肿瘤病的治疗方法的新的基础。
活化素(β-β)和抑制素(α-β)结构上相关，具有同样的14kDa β亚基，但是抑制素二聚体还具有不同的18kDa α亚基。从滤泡液中分离了活化素和抑制素的同工型。这些包括活化素A(βA-βA)、活化素B(βB-βB)、活化素AB(βA-βB)、抑制素A(α-βA)和抑制素B(α-βB)。基于序列排列和保守半胱氨酸残基的定位，认为这些多肽与其它能得到晶体结构信息的TGF-β家族成员结构相似(16，17)。
迄今，已显示抑制素仅在活化素反应的情况下具有活性，它通常拮抗活化素信号(5，18-20)，虽然近来报道了骨骼中活化素依赖性抑制素作用的抽象的方式。已显示抑制素可与活化素竞争其靶细胞，抑制素能阻止活化素诱导的受体异源化(5，19)。未标记的抑制素直接与已标记的活化素竞争II型活化素受体，虽然其作为取代剂的能力大约比非标记的活化素低10倍(9，10)。
在活化素和抑制素中同时存在的β亚基将介导与II型活化素受体的结合。活化素与ActRII结合后，活化素-ActRII复合物随后促进I型活化素受体丝氨酸激酶ALK4的募集和磷酸化(5，8，14)。这导致同源I型受体的磷酸化和下游Smad蛋白质的激活(21，22)。抑制素还与II型活化素受体结合，但抑制素分子的α亚基不支持I型受体(即ALK4)的募集。这提示抑制素通过直接竞争受体结合位点来封闭信号传导(5，18，19)，因此防止活化素与II型活化素受体结合(23)。然而，抑制素在一些组织和细胞内不能拮抗活化素，这与抑制素作用需要其它成分的假设一致(5，24，25)。
先前的发现表明抑制素可能需要其它受体成分来与活化素成功竞争与II型活化素受体的接触，从而功能性拮抗活化素的反应。可能简单、直接的在活化素和抑制素之间竞争与活化素II型受体的接触单独对于揭示抑制素对活化素反应的作用是不够的。事实上，活化素抑制垂体ACTH分泌的作用不是由于大摩尔过量的抑制素的拮抗(6)。另外，在工程改造过度表达ActRII的K562红白血病细胞(KAR6细胞)中，提高的ActRII表达即使在存在基本分子过量的抑制素下，也封闭抑制素拮抗活化素信号传导的能力(5)。
在尝试鉴定推测的抑制素-特异性受体成分中，用[125I]-标记的活化素和抑制素进行交联实验，来标记野生型K562红白血病细胞和过度表达ActRII的KAR6细胞。结果显示活化素与两种细胞系中的I型和II型受体结合，标记的活化素与这两种受体的结合被过量的未标记的活化素或未标记的抑制素取代(5)。如预期的，标记的抑制素能结合两种细胞系中的II型受体，但不是I型受体。抑制素与II型受体的结合可被加入的未标记的活化素或抑制素取代。有趣的是，与标记的抑制素交联的高分子量的蛋白质在这两个实验中也是明显的可通过加入过量未标记的抑制素而不是活化素而能被竞争性的被取代。
总的说，这些结果提示除了与ActRII结合，抑制素还与另一种高分子量的推测共受体结合，它可稳定抑制素-ActRII相互作用，从而防止ActRII结合活化素和调节活化素反应。因此，在某些组织中缺乏抑制素对活化素反应的拮抗可通过缺少这类或类似的抑制素结合共受体成分解释。卵巢肿瘤细胞系KK-1中类似的高分子量抑制素-结合成分的存在已被确认。高亲和力抑制素与非鉴定的高分子量蛋白(24)。
β聚糖是III型TGF-β受体，最初被认为是三种显示以高亲和力结合TGF-β的细胞表面受体中最大的一种(26)。大鼠β聚糖eDNA编码853个氨基酸的蛋白质，含有一个大胞外结构域、一个单跨膜结构域和一个短C-末端胞质结构域，缺乏可清楚识别的信号传导基序(27，28)。β聚糖与三种TGF-β同工型以高亲和力结合，据信在促进TGF-β与其信号传导受体的结合中起到了辅助作用(22，29)。
成熟的β聚糖是蛋白聚糖，它含有硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素糖胺聚糖(GAG)链，得到在SDS-PAGE凝胶上在250-350kDA之间迁移的分子。不和糖胺聚糖结合的β聚糖核心多肽保留TGF-β活性，并作为100-110kDa的蛋白质迁移(27，30，31)。近来的工作显示β聚糖在介导对TGF-β的生理反应中的重要性，包括其自分泌调节人乳腺癌细胞增殖(32，33)及其触发心内膜细胞转化的能力(34)。
现有技术的缺陷在于，没有确定介导抑制素和活化素受体的相互作用的蛋白质的特征。本发明填补了本领域该长期存在的需要和需求。
发明简述
在本发明的一个实施例中，描述了一种方法，其中抑制素敏感细胞中活化素诱导的信号传导可以通过抑制抑制素/β聚糖复合物的形成上调。一种抗血清可以针对β聚糖的胞外表位，来防止抑制素与β聚糖结合。另外，形成抑制素/β聚糖复合物可由减少细胞中β聚糖的表达抑制，通过反义抑制或用同源重组等方法诱变一个或两个β聚糖等位基因。该方法的一种可能用途是增强垂体细胞中的活化素信号传导。这应导致促卵泡成熟激素(FSH)产生的增加，和生育力的增强。该方法还可用于治疗许多病理性状况，包括生殖、发育、皮肤、骨骼、肝脏、造血和中枢神经系统疾病，例如前列腺癌。
在本发明的另一个实施例中，提供了针对β聚糖胞外部分的抗血清。该抗血清抑制抑制素与β聚糖的结合，可掺入药物组合物。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种抑制活化素-诱导的信号传导的方法。这可通过增加抑制素/β聚糖复合物在靶细胞表面的形成实现。一种这样的方法利用提高β聚糖在靶细胞中的表达，来提供额外β聚糖用于形成这些复合物。该方法还可通过施用额外的抑制素来增强。β聚糖表达可通过用组成型或用诱导型启动子表达β聚糖的人工构建体转染靶细胞来提高。该方法还可用于对正常情况下对抑制素不反应的细胞引入抑制素敏感性。可用该方法治疗许多病理性状况，包括生殖、发育、皮肤、骨骼、肝脏、造血和中枢神经系统疾病。实施例包括性腺癌、肾上腺癌和肝脏发育不良。该方法还可用于促进肝脏再生。
本发明的另一个实施例是一种筛选抑制抑制素/β聚糖复合物形成，来增加活化素信号传导的方法。在可能的抑制素与β聚糖结合的抑制剂存在或不存在的条件下，培育表达β聚糖的细胞膜。进行竞争性结合试验等试验，比较结果。抑制抑制素/β聚糖复合物形成的化合物将导致更低水平的抑制素结合。可能的化合物可以是肽、蛋白质或小分子。另外，该方法可用于筛选增加抑制素/β聚糖复合物形成，从而抑制活化素信号传导的化合物。对此，化合物应提高抑制素与膜的结合。
附图简述
因此，获得了上述引用的本发明的特征、优点和目的，以及其它会变得清楚的方面，并可详细理解，上面简单总结的本发明更具体的描述将参考一些实施例并用附图说明。这些附图是说明书的一部分。然而应注意附图说明了本发明的优选实施例，因此不应认为限制了本发明的范围。
图1A和1B显示β聚糖与抑制素高亲和性结合，加强了抑制素与ActRII的结合。
在图1A中，用磷酸钙沉淀(35)ActRII-myc、β糖苷(BG)或(ActRII+BG)一起转染标出的HEK293细胞。分离的细胞膜与约100pM[125I]抑制素A在存在或不存在各种浓度的未标记抑制素A竞争剂下培育。
图1B显示标准化的并表示成％特异性结合的图1A的数据。用Prism软件分析结合数据。
图2A和2B说明抑制素与β聚糖(转染和内源的)共价交联，提供了ActRII-β聚糖复合物的证据。
在图2A中，β聚糖增加了抑制素A与ActRII的共价交联。空载体(pcDNA3)、ActRII-myc、β聚糖(BG)或ActRII和β聚糖同时(BG+ActRII-myc)转染入HEK293细胞，然后与[125I]-抑制素A和DSS如前对于活化素所述(9)进行交联。[125I]-抑制素A与表达β聚糖的细胞的结合和交联在存在或不存在25nM未标记的抑制素A、25nM未标记的活化素A或5nM未标记的TGF-β1的条件下如指出的进行。用抗-β聚糖抗血清(R&D Systems，Inc.)或多克隆抗myc抗体(9E10)(Calbiochem，Inc.)免疫沉淀分离的交联复合物。在还原条件下通过SDS-PAGE分辨交联的蛋白质，并通过放射性自显影目测检验。标出了ActRII-myc、β聚糖核心多肽(核心)和含糖胺聚糖链的β聚糖(BG)的位置。分子量标记表示成Mr×10-3。
图2B显示了抑制素A和活化素A与内源β糖苷复合物的共价交联。[125I]-抑制素A和[125I]-活化素A的结合和交联在存在或不存在25nM未标记的抑制素A或25nM未标记的活化素A的条件下，如标出的在表达内源受体KK-1细胞上进行。用抗-β聚糖抗血清(R&D Systems，Inc.)、抗-ActRII抗血清或正常大鼠血清免疫沉淀分离交联复合物，在还原条件下用SDS-PAGE分辨，并用放射性自显影目测检验。标出了ActRII、β聚糖核心多肽(BG核心)、含糖胺聚糖链的β聚糖(BG)和ALK4的位置。分子量标记表示成Mr×10-3。
图3A-3F显示了在正常成年大鼠大脑、垂体、卵巢和睾丸中β聚糖的免疫细胞化学定位。高倍亮视野显微照相显示前脑(图3A)、垂体(图3B和3C)、附睾(图3D)、睾丸(3E)和卵巢(图3F)中的β聚糖免疫染色。用箭头标出了对β聚糖免疫阳性的细胞的典型例子(染成棕色)。条代表50微米。缩写包括：AL，垂体前叶；CT，结缔组织；GC，粒层细胞；IL，垂体中叶；LC，睾丸间质细胞；O，卵母细胞；PL，垂体后叶；ST，精小管；TT，Tenia Tecta；TC，卵泡膜细胞。
图4A-4D显示β聚糖可在促肾上腺皮质激素、卵巢和红白血病细胞中介导活化素信号传导的功能拮抗。
在图4A中，用3TPLux-报告质粒(7)、CMV-β-半乳糖苷酶(β-GAL)和空载体或β聚糖(BG)cDNA，用Superfect转染试剂(Qiagen)在优化的条件下转染AtT20细胞。用或不用2.5nM抑制素A(Inh A)和各种浓度的活化素A(Act A)处理细胞15小时，测量得到的荧光素酶活性。
在图4B中，如图4A中所述转染AtT20细胞，然后用或不用1nN活化素A和一定浓度范围的抑制素A处理。
在图4C中，如上所述转染KK-1卵巢肿瘤细胞，并用或不用0.3nM活化素A和一定范围浓度的抑制素A处理。
在图4D中，用β聚糖(BG)或空载体转染K562-衍生的KAR6细胞，用IPTG处理诱导活化素受体表达，并用0.3nM活化素A和一定范围浓度的抑制素A处理。荧光素酶活性用任意的荧光素酶单位(L.U.)代表，标化到β-GAL活性。
图5显示抑制素A抑制大鼠垂体前叶细胞FSH分泌在抗-β聚糖血清的存在下以剂量依赖性方式抑制。大鼠垂体前叶细胞如所述脱离并铺板(40)。铺板4天后，洗涤细胞并在0.2％FBS-bPJ(36)中培育24小时。然后用新鲜培养液洗涤细胞，用正常家兔血清(NRS)或来自注射了GST与大鼠β聚糖残基154-439(Ab-BG)的融合蛋白的家兔的抗血清处理。1小时后，用或不用25pM抑制素A处理细胞，并培育48小时。用放免法试剂盒(NIADDK的国家激素和垂体计划)测量FSH。报告值表示成三份孔的无抑制素处理的百分数±SEM。
图6示意性说明了假定的模型，其中β聚糖(BG)作为抑制素共受体。β聚糖或功能上相似的抑制素共受体的存在增加了与ActRII结合的抑制素，并从而防止活化素与ActRII的结合。除了封闭活化素信号传导途径外，抑制素/β聚糖/ActRII复合物的形成可指导新的下游信号。
发明详述
根据本发明，可使用本领域能力内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有完整的解释。见例如Maniatis，Fritsch & Sambrook，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(1982)；“DNA Cloning：A LaboratoryManual”卷I和II(D.N.Glover编，1985)；“Oligonucleitide Synthesis”(M.J.Gait编，1984)；“Nucleic Acid Hybridization”[B.D.Hames & S.J.Higgins编(1985)]；“Animal Cell Culture”[R.I.Freshney编(1986)]；“ImmobilizedCells And Enzymoes”[IRL Press(1986)]；B.Perbal，“A practical Guide ToMolecular Cloning”(1984)。
因此，如果本文出现，下面的术语将具有下列定义。
本文所用的术语“cDNA”应指基因mRNA转录物的DNA拷贝。
本文所用的术语“衍生的氨基酸序列”应意味着通过阅读cDNA中核苷酸碱基的三个一组的序列确定的氨基酸序列。
本文所用的术语“文库筛选”指用标记的探针检查是否在合适的条件下有序列与存在于特定DNA文库中的探针互补的过程。另外“文库筛选”可用PCR进行。
本文所用的术语“PCR”指聚合酶链式反应，它是Mullis的美国专利号4,683,195和4,683,202的主题，以及其它本领域现在已知的改进。
本文所描述的氨基酸优选是“L”异构形式的。然而“D”异构形式的残基可取代任何L-氨基酸，只要免疫球蛋白结合的所需的功能被多肽保留。NH2指存在于多肽氨基端的游离氨基。COOH指存在于多肽羧基端的游离羧基。与标准多肽命名法一致，J.Biol.Chem.243：3552-59(1969)，氨基酸残基的缩写是本领域已知的。
应注意所有氨基酸残基的序列在本文中是由化学式代表的，其左右朝向是从氨基端到羧基端的常规朝向。另外，应注意氨基酸残基序列开始和结束处的划线表示与一个或多个其它氨基酸残基序列的肽键。
“复制子”是任何作为体内的自主DNA复制单元；即能在其自身控制下复制的基因元件(例如质粒、染色体、病毒)。
“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，另一条DNA区段与其结合，因此使得结合的区段复制。
“DNA分子”指脱氧核糖核苷酸(腺苷酸、鸟苷酸、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的多聚形式，它可以是单链形式或双链螺旋。该术语仅指分子的一级或二级结构，不将其限于任何具体的三级形式。因此，该术语包括双链DNA，尤其是线性DNA分子(例如限制性片段)、病毒、质粒和染色体。在讨论中，本文的结构根据正常的常规仅是沿DNA非转录链的5’-3’方向的序列(即与mRNA序列相同的那条链)来给出。
“复制起始点”指参与DNA合成的DNA序列。
DNA“编码序列”是双链DNA序列，它在体内当置于合适的调控序列控制下时转录和翻译成多肽。编码序列的边界是由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子确定的。编码序列可包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA，来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，和甚至合成的DNA序列。聚腺苷酸信号和转录终止序列总在编码序列3’端。
转录和翻译控制序列是DNA调控序列，例如启动子、增强子、聚腺苷酸信号、终止子等，提供在宿主细胞中编码序列的表达。
“启动子序列”是一种能在细胞中与RNA聚合酶结合，引发下游(3’方向)编码序列转录的DNA调控区域。为了限定本发明，启动子序列在其3’末端与转录引发位点结合，向上游(5’方向)延伸，以包括引发在背景以上的可检测水平的转录所需的最少数目的碱基或元件。在启动子序列内将发现转录起始位点，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合域(共有序列)。真核启动子常常但不总是在-10和-35共有序列中含有Shine-Dalgarno序列。
“表达控制序列”是一种DNA序列，它控制和调节其它DNA序列的转录和翻译。当RNA聚合酶将编码序列转录入mRNA，编码序列在细胞中的转录和翻译控制序列的“控制下”，然后翻译成编码序列编码的蛋白质。
“信号序列”可包含在编码序列附近。该序列编码信号肽，在多肽的N-末端，它与宿主细胞通讯以将多肽定向到细胞表面或将多肽分泌入介质，宿主细胞在蛋白质离开细胞前切下该信号肽。可发现信号肽与各种原核生物和真核生物天然的蛋白质有关。
本文所用的术语“寡核苷酸”在指本发明的探针时，定义为含有两个或多个核糖核苷酸，优选三个以上的分子。其确切大小将由许多因素决定，它们又依赖于寡核苷酸的最终功能和用途。
本文所用的术语“引物”指寡核苷酸，不论它是以天然的纯化的限制性消化产物存在，还是合成产生的，当置于某些条件下能作为合成的起始点，这些条件是诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成，即在核苷酸和诱导剂，例如DNA聚合酶和合适的温度和pH条件下。引物可以是单链或双链的，必需足够长，在诱导剂的存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度将依赖于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。例如对于诊断用途，由靶序列的复杂性决定，寡核苷酸通常含有15-25个或更长的核苷酸，虽然它可以含有较少的核苷酸。
选择本文中的引物，使其“基本”与特定靶DNA序列的不同链互补。这意味着引物必需足够互补，与其相应的链杂交。因此，引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，不互补的核苷酸片段可与引物的5’末端结合，而剩余的引物序列与该链互补。另外，可在引物中插入不互补的碱基或更长的序列，条件是引物序列足够与序列互补或与其杂交，从而形成合成延伸产物的模板。
本文所用的术语“限制性内切核酸酶”和“限制性酶”指酶，它们各自在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA。
当DNA被引入细胞时，细胞被外源或异源DNA“转化”。转化的DNA可以或可以不整合(共价连接)到细胞基因组中。在例如原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化的DNA可以维持在游离状态，例如质粒中。对于真核细胞，稳定转化的细胞是其中转化的DNA整合到染色体中，从而它可以通过染色体复制被子代细胞继承。该稳定性由真核细胞建立含有一群含转化的DNA的子代细胞的细胞系或克隆来证明。“克隆”是一群通过有丝分裂衍生自单个细胞或祖先的细胞。“细胞系”是一个能在体外稳定生长许多代的祖细胞的克隆。
当至少约75％(优选至少约80％，最优选至少约90％或95％)核苷酸在限定长度的DNA序列中匹配时，两条DNA是“基本上同源的”。可通过用序列数据库中标准软件，或在例如如特定系统限定的严格条件下在Southern杂交实验中比较序列，来鉴定基本同源的序列。限定合适的杂交条件在本领域技术水平内。见例如Maniatis等，见上；DNA Cloning，卷I & II，见上；Nucleic Acid Hybridization，见上。
DNA构建物中的“异源”区是在更大的DNA分子中一个可鉴定的DNA区段，它与该更大的分子天然不结合。因此，当异源区编码哺乳动物基因时，该基因通常侧接有在来源生物体的基因组内不侧接哺乳动物基因组DNA的DNA。在另一个例子中，编码序列是一种构建体，其中编码序列本身在天然中不存在(如基因组编码序列含有内含子或合成性序列，具有与天然基因不同的密码子的cDNA)。等位变体或天然存在的突变事件不产生如本文定义的DNA异源区。
通常用于这些研究的标记是放射性元素、酶、当接触紫外光时发射荧光的化学物质等。许多荧光物质是已知的，并可用作标记。这些包括例如荧光素、罗丹明、金胺、Texas Red、AMCA蓝和Lucifer Yellow。特别的检测物质是在山羊中制备的抗兔抗体，并通过异硫氰酸与荧光素偶联。
蛋白质还可用放射性元件或酶标记。放射性标记可通过任何目前可得的计数法检测。优选的同位素可选自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
酶标记也是有用的，并可用任何现在利用显色、分光光度、荧光光度、电流测定或气体定量技术来检测。酶可以和所选的颗粒通过与桥联分子，例如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等偶联。优选的是过氧化物酶、β-葡糖苷酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶+过氧化物酶和碱性磷酸酶。其它标记物质和方法参考例如美国专利号3,654,090、3,850,752和4,016,043的公开内容。
本领域开发和利用的特定分析系统称作受体实验。在受体实验中，要分析的物质合适标记，然后用一定量的标记接种一些细胞测试集落，然后进行结合研究，测定标记物质与细胞受体结合的程度。用该方法可确定亲和力之间的差异。
本领域有用的实验称为“顺式/反式”实验。简单说，该实验使用两种基因构建物，其中一种是通常是当转染入合适细胞系时，连续表达感兴趣的特定受体的质粒，第二种是在受体/配体复合物控制下表达报告子，例如荧光素酶的质粒。因此例如，如果需要评估一种作为特定受体的配体的化合物，质粒之一可以是导致在所选细胞系中表达受体的构建体，而第二种质粒将具有与荧光素酶基因连接的启动子，其中插入了特定受体的反应元件。如果测试的化合物是受体的激动剂，配体将与受体复合，得到的复合物将与反应元件结合，引发荧光素酶基因的转录。然后进行光度测定得到的化学发光，获得剂量应答曲线，并于已知配体的曲线比较。上述方法在美国专利号4,981,784中详述。
一般说，含有促进插入的DNA片段有效转录的启动子序列的表达载体可与宿主连用。表达载体通常含有复制起始点、启动子、终止子以及能在转化的细胞中提供表型选择的特定基因。转化的宿主可根据本领域已知的方法发酵和培养，实现最佳细胞生长。
本领域技术人员熟知的方法可用于构建含有合适的转录和翻译控制信号的表达载体。见例如，Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版)Cold Spring Harbor Press，N.Y.中描述的技术。如果转录控制序列有效控制基因转录，基因及其转录控制序列被定义为“可操纵性连接”。本发明的载体包括但不限于质粒载体和病毒载体。
本发明针对一种通过抑制抑制素/β聚糖复合物的形成，加大活化素诱导的信号传导的方法。可用针对β聚糖胞外表位的抗血清抑制该复合物的形成。另外，可通过减少细胞中β聚糖的表达限制能形成复合物的β聚糖量。β聚糖的表达可通过抗-β聚糖反义转录物，或通过诱变细胞中一个或两个β聚糖等位基因减少。同源重组是一种可用于使β聚糖突变的方法。垂体细胞是该方法的可能目标，其中放大活化素信号传导提高了促卵泡成熟激素(FSH)的产生和增强生殖力。另外，该方法可用于治疗许多生殖、发育、皮肤、骨骼、肝脏和中枢神经系统疾病，例如前列腺癌。
本发明还针对抗β聚糖抗血清，它抑制抑制素与β聚糖的结合。抗血清可与药物学上可接受的载体复合，形成药物组合物。
还提供了通过增强抑制素/β聚糖复合物的形成抑制活化素-诱导的信号传导的方法。实现该目的的主要方法是通过提高所述细胞中β聚糖的表达。还可施用其它抑制素，来促进复合物的形成。表达可通过转染含有β聚糖基因的人工构建物来增强。β聚糖基因可以组成型表达或在诱导型启动子的控制下。该方法还可用于在正常情况下不和抑制素反应的细胞中引入对抑制素的敏感性。该方法可用于治疗许多病理情况，包括生殖、反应、皮肤、骨骼、肝脏、造血和中枢神经系统疾病。具体例子包括治疗性腺癌、肾上腺癌或肝发育不良。该方法还可用于促进受伤肝组织的再生。
本发明还针对筛选抑制抑制素/β聚糖复合物形成，从而放大活化素信号传导的化合物的方法。一种抑制素与β聚糖结合的测定法在表达β聚糖的细胞膜上进行。如果化合物在用化合物处理的细胞膜中，比未处理细胞的得到更低水平的抑制素结合，该化合物抑制抑制素/β聚糖复合物的形成，并放大活化素信号传导。该方法可用于测试许多可能的化合物，包括肽、蛋白质和小分子。另外，该方法可用于筛选化合物，它提高抑制素/β聚糖复合物的形成，从而抑制活化素信号传导。对此，化合物应提高抑制素与膜的结合。
给出下列例子是为了说明本发明的各种实施例，而不是要以任何形式限制本发明。
实施例1
竞争性结合研究
重组人活化素A和抑制素A是用J.Mather(Genetech Inc.)提供的稳定表达活化素的细胞系产生的，该细胞系由Wolfgang Fischer(PBL，Salk Institute)纯化。[125I]活化素A和[125I]-抑制素A是用氯亚明T法如前所述(7)制备的。
对于结合研究，用DEAE Dextran和10微克ActRII和/或10微克β聚糖质粒DNA瞬时转染细胞。用DNA培养细胞4小时，用含10％DMSO的Hepes解离缓冲液(HDB)休克，在37℃和5％CO2下，含有10％胎牛血清和L-谷氨酰胺的DMEM中培养48小时。汇合的单层用Hepes解离缓冲液洗涤两次，重新悬浮在结合缓冲液(HepesDissociation Buffer，含0.1％BSA，5mM MgSO4和1.8mM CaCl2)中。通过在最终0.4毫升体积的结合缓冲液中存在或不存在各种浓度的未标记抑制素或活化素的条件下，将约2×105个细胞与2×105cpm[125I]-抑制素A(约100pM)一起在室温下保温90分钟，进行结合。结合后，离心沉淀细胞，用结合缓冲液洗涤两次。用γ计数器定量结合的[125I]-抑制素A，用Prism程序进行结合数据的分析。
实施例2
交联研究
在5％CO2下，完全DMEM(含有10％胎牛血清、青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺)中生长到约40-60％汇合的细胞中进行交联研究。细胞在10厘米培养皿中生长，然后用磷酸钙沉淀法，用Hepes缓冲的盐水(pH7.07)转染。转染后，细胞在5％CO2中培养48小时。用Hepes解离缓冲液漂洗各皿收集细胞，然后在含有1mm EDTA的Hepes解离缓冲液中培育10分钟，释放细胞。
将约106个重悬浮在Hepes解离缓冲液中的细胞与约2×106cpm[125I]-活化素A在总共500微升体积中室温孵育1小时，一边温和振摇，进行共价交联。该培养后，在各试管中加入1毫升冷Hepes解离缓冲液，然后离心沉淀细胞，重新悬浮在500微升HDB中，加到0.5mM二琥珀酰辛二酸(DSS)中，在冰上孵育30分钟。在各试管中加入1毫升TBS淬灭反应。然后离心沉淀细胞，吸取并将沉淀在冰上溶于1毫升裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.5，0.2mM EDTA，1％Triton X-100，1mMAEBSF，1mM EDTA，10微克/毫升亮抑肽酶、10微克/毫升胃酶抑素和1微克/毫升抑酶肽)30分钟。离心除去TX-100-不溶性物质，在各上清液中加入2微克抗-β聚糖或2微克抗-myc抗体。试管在4℃孵育16小时，在各试管中加入10微升50％蛋白质G琼脂糖(PGA)浆液沉淀免疫复合物，在4℃再保温1小时，并离心沉淀固定的免疫复合物。用1毫升裂解缓冲液洗涤各蛋白质G琼脂糖沉淀三次，然后煮沸10分钟，在25微升SDS样品缓冲液中洗脱，通过SDS-PAGE分辨。所有SDS-PAGE在还原条件下，在聚丙烯酰胺3-8％Tris乙酸酯NuPAGE凝胶(Novex)上进行SDS-PAGE。干燥凝胶，通过放射性自显影检测条带。
实施例3
AtT20和KK-1细胞中的荧光素酶测定
在瞬时转染实验中用良好确定特征的活化素/TGF-β-反应性荧光素酶报告质粒3TPLux评估β聚糖的功能。测试了两种小鼠细胞系；AtT20促皮质激素细胞(在DMEM、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和庆大霉素中生长)和KK-1卵细胞(在含有10％FBS、L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素的DMEM:F12中生长)。胰蛋白酶消化细胞，以1.5-2×105个细胞/孔的密度在转染24小时前铺在6孔平板中。细胞在完全培养基中用约1微克3TPLux、0.1-0.2微克巨细胞病毒(CMV)-β-半乳糖苷酶(β-GAL)和0.1-0.3微克载体或β聚糖质粒DNA转染。转染在优化的条件下，用市售的Superfect转染试剂(Qiagen，Hilden，Germany)进行。在培养2.5小时后，用含2％FBS的培养基洗涤细胞，使其恢复5小时。15小时后用抑制素A和/或活化素A处理细胞15小时，然后收集在裂解缓冲液(1％Triton X-100、25mM甘氨酰甘氨酸，pH7.8，15mM MgSO4，4mM EGTA和1mm DTT)中。荧光素酶报告子活性是通过对相对的β-GAL活性标定确定的。
实施例4
免疫细胞化学
正常的成年雄性和雌性Sprague-dawley大鼠(175-250克，Sprague Dawley)保持在标准箱、食物和光照条件(23℃，12小时光，12小时暗，早六点开灯)下。如前所述(MacConell等，1998)进行免疫细胞化学实验(ICC)。简单说，深度麻醉大鼠，经心脏灌注4％聚甲醛。取出组织(大脑、垂体、睾丸或卵巢)，预先在相同的固定剂中固定1小时。将大脑转移到10％蔗糖/0.02M磷酸钾缓冲的盐水(KPBS)中，4℃过夜储藏。在显微切片机上切下30μm冷冻的冠状切片，如下处理自由漂浮切片，用于ICC分析。垂体、睾丸和卵巢组织被包埋在石蜡中，切下10微米切片，加到Superfrost Plus载玻片(Fish Scientific)上，加工用于ICC分析。所有与使用动物有关的程序是根据联邦、州和地方法律和团体和NIH规则进行的。
为了减少背景染色，组织切片在1％H2O2中保温20分钟，用KPBS漂洗，然后在含有0.3％Triton X-100、10％正常兔血清和2％BSA的KPBS中室温保温1小时。切片与25微克/毫升的β聚糖原始抗血清(R&D)在加有0.3％Triton X-100、2％正常兔血清和2％BSA的KPBS中4℃过夜温育(作为对照，相邻的切片单独与正常山羊IgG或二抗温育)。然后用KPBS漂洗组织切片，然后与1∶1,000稀释的生物素化的家兔抗山羊二抗(Vector)在室温下温育1小时。KPBS洗涤过的组织与活化素-生物素-辣根过氧化物酶(Vector)的复合物室温保温1小时。然后过氧化物酶反应在0.03％DAB和0.015％H2O2的0.1M Tris-HCl，pH7.4保温3-5分钟得到可见的棕色的反应产物。将自由漂浮的脑切片放在Superfrost/Plus载玻片(FisherScientific)上，用光学显微镜观察免疫反应性。
实施例5
β聚糖高亲和力的结合抑制素，提高抑制素与ActRII的结合。
在一个筛选潜在的抑制素结合蛋白的过程中，在表达β聚糖的细胞中检测到抑制素结合。图1显示从转染β聚糖的HEK293细胞上分离的膜显示特异性的、高亲和力的抑制素结合[Ki＝0.6(0.5-0.9)nM]，而来自用空载体转染的细胞膜没有可检测的特异性抑制素结合。
为了进一步确定表达ActRII或共表达ActRII和β聚糖的细胞分离物的膜中抑制素的结合，将编码这些受体的cDNA转染入HEK 293细胞，并进行竞争性结合试验。当ActRII单独表达时，抑制素结合亲和力十分低[Ki＝6.3nM(2.9-13.4)nM]，与先前的结果(9)一致，但当ActRII与β聚糖共表达时，增加了30倍[Ki＝0.2(0.1-0.3)nM](图1B)另外，共表达ActRII和β聚糖使抑制素结合位点相对于单独表达ActRII或β聚糖的细胞中结合位点数目增加了约12倍或6倍(图1A)。用β聚糖和ActRIIB进行的实验有相似结果；然而β聚糖对抑制素亲和力和抑制素结合位点的数目的作用没有如此剧烈(数据未显示)。与β聚糖结合的活化素在HEK 293细胞中表达过程中检测不到。另外，β聚糖不增加活化素与ActRII的结合(数据未显示)，表明β聚糖不能通过增加ActRII表达的方法来增加抑制素结合。
实施例6
将抑制素与β聚糖共价交联，和抑制素与ActRII-β聚糖复合物的共价交联
为了确定抑制素是否能和ActRII一起表达或不表达的β聚糖结合并形成复合物的能力，两种受体在HEK 293细胞中表达。细胞用[125I]-抑制素，然后用共价交联剂二琥珀酰辛二酸酯(DSS)处理细胞。然后用针对β聚糖胞外结构域的ActRIImyc表位的抗体免疫沉淀交联的抑制素-受体复合物。交联的、免疫沉淀的复合物可通过SDS-PAGE分辨，并用放射性自显影用肉眼观察。
图2A显示了这样的交联实验的结果，其中单独用载体(泳道1)、单独用ActRII(泳道2)、β聚糖(泳道3)或β聚糖和ActRII一起(泳道7-10)转染细胞。用[125I]-抑制素交联在SDS-PAGE分析上，在被空载体转染的细胞中得不到任何可见复合物(图2A，泳道1)。在被ActRII单独(图2A，泳道2)转染的细胞中检测到约75-85kDa的共价复合物，与先前报道的抑制素/活化素-ActRII(8，9，18，19)的交联复合物大小一致。将[125I]-抑制素与单独用β聚糖转染的细胞交联得到约110kDa的复合物，和另一条175-250kDa的扩散条带(图2A、泳道3)。先前用[125I]-抑制素交联的β聚糖的实验已显示具有相似迁移率(27，28)的复合物，代表β聚糖核心蛋白(约110kDa)和具有糖胺聚糖链(200-300kDa)的β聚糖。因此，抑制素标记后所见的条带含有预测形式的β聚糖。
先前报道了在表达β聚糖的细胞中存在的大小范围相同的抑制素复合物具有相似的高分子量(5，24，38)。加入25nM未标记的抑制素或5nM未标记的TGF-β防止抑制素与β聚糖交联(图2A，泳道4和6)。相反，25nM未标记的活化素没有作用(图2A，泳道5)。这些结果说明了活化素缺乏该蛋白聚糖的亲和力，和β聚糖与抑制素的α亚基结合的可能性。TGF-β封闭抑制素交联的能力表明抑制素的结合位点与β聚糖上的至少一种TGF-β结合位点重叠。
当ActRII和β聚糖共表达时，抑制素-交联受体复合物的水平剧烈增加，[125I]-抑制素和ActRII和β聚糖之间的共价复合物是明显的(图2A，泳道7)。预计大小范围内的抑制素标记的复合物与针对ActRII的抗-myc抗体共同免疫沉淀(图2A，泳道7)，提供了抑制素、ActRII和β聚糖相互作用，形成寡聚抑制素受体复合物的证据。25nM未标记的抑制素的存在在表达两种受体的细胞中完全封闭了[125I]-抑制素对ActRII和β聚糖的标记(图2A，泳道8)。相反加入25nM活化素或5nM TGF-β对用[125I]-抑制素标记的条带强度几乎没有作用(图2A，泳道9和10)。未标记的TGF-β不能封闭抑制素与和ActRII共表达的β聚糖交联是和存在ActRII/β聚糖复合物，它与抑制素结合，而不是TGF-β结合一致的。
除了其与重组β聚糖和ActRII在转染细胞中形成交联的复合物的能力外，抑制素还与内源β聚糖和ActRII在小鼠卵巢细胞系KK-1中结合并形成交联的复合物(图2B)(38)。可在用抗β聚糖抗血清(泳道2)或抗ActRII抗血清(泳道4)免疫沉淀后目测这些复合物。通过与过量的未标记抑制素A温育，封闭标记的复合物的形成(图2B)。免疫沉淀的复合物包括β聚糖核心蛋白、具有糖胺聚糖链的β聚糖和ActRII，但是活化素I型受体Alk4不存在于复合物中(图2B)。用125I-活化素标记KK-1细胞，然后交联和用抗-β聚糖抗体免疫沉淀，显示内源β聚糖不与活化素形成共价复合物(泳道7和9)。当活化素-交联的细胞被抗-ActRII抗体免疫沉淀时，可见ActRII和Alk4，而不是β聚糖。
实施例7
抑制素应答性组织中β聚糖的表达
足够的证据提示抑制素是一种下丘脑-垂体-性腺轴的重要的旁分泌/自分泌调节剂(39)。因此，用免疫细胞化学来评估是否β聚糖蛋白的组织特异性分布与记录的有抑制素反应性的组织一致。令人惊奇的是，尽管相当长的时间以来已知β聚糖是一种TGF-β受体，β聚糖体内的组织分布仍然很大程度上未被探索。图3总结了正常成年大鼠大脑、垂体、卵巢和睾丸中β聚糖的免疫组织化学定位。
可能抑制素最广为人知的功能是其选择性抑制垂体前叶FSH分泌(1，40-42)。如图3B所示，与β聚糖介导抑制素应答的作用一致，在正常成年雄性大鼠垂体腺的整个前叶中的细胞亚类中观察到强β-聚糖-免疫应答，显示优势胞质定位。这些垂体前叶中的β聚糖-免疫阳性细胞类型可代表促性腺激素细胞和促乳激素细胞，因为这些垂体细胞类型主要分别是抑制素和TGF-β靶(43-45)。有趣的是，还在垂体中叶的一大类细胞中发现了强β聚糖-免疫应答(图3C)。虽然该叶中的细胞上抑制素作用未被记录，报道了TGF-β1与中叶的促黑激素细胞共同定位，表明它在调节该细胞类型中起到了作用(46)。β聚糖的阳性免疫染色在垂体的后叶中检测不到(图3C)。
在睾丸内，在大鼠睾丸间质细胞中观察到轻微的β聚糖染色，但在支持细胞或精细胞中在任何阶段没有可见的可辨别染色(图3D)。另外，附睾间质染成对β聚糖阳性(图3E)。β聚糖对睾丸间质细胞的免疫定位与由睾丸支持细胞分泌的抑制素局部作用，以调节睾丸胶质细胞中的类固醇生成作用的事实(47，48)，以及抑制素特异性结合位点被定位到该细胞类型的事实(49)一致。然而，精细胞上不能染色根据抑制素对配子声称的作用的报道，有些出乎意料(50，51)。
在粒层细胞、卵泡膜细胞和间隙细胞中观察到卵巢内阳性β聚糖免疫染色(图3F)。与睾丸中的发现类似，该定位与记载的抑制素对大鼠卵泡膜细胞的雄激素生产的作用相符(47)。
在成年雄性大鼠大脑中，在前脑的tenia tecta中β聚糖-免疫反应性(ir)纤维(图3A)。还在大鼠前脑的中隔海马回核中发现β聚糖-ir纤维(数据未显示)。值得注意的是，该β聚糖在tenia tecta中的中心定位对应于抑制素/活化素α-和βA-亚基mRNA在该相同区域中的存在(52)。因此可能大脑区域中分泌的成熟抑制素与类似定位的β聚糖相互作用。虽然α、βA和βB亚基蛋白和mRNA广泛分布在大鼠大脑的整个rostrocaudal extent中(虽然是低水平)，β聚糖-ir纤维的检测限于这两个大脑区域，在大鼠大脑的任何区域未观察到β聚糖的核周体染色。可能β聚糖在其它大脑区域中的表达由于低翻译、迅速蛋白质降解或蛋白质的快速运输在免疫组织化学的可检测水平之下，表明大鼠的秋水仙素处理可能是目测对β聚糖免疫阳性细胞体必需的。还可能在这些区域内表达与β聚糖不同的相关抑制素受体成分，进行与β聚糖类似的介导抑制素反应的功能。
实施例8
β聚糖介导促肾上腺皮质激素细胞和卵巢细胞系中活化素信号传导的拮抗。
虽然许多活化素反应被抑制素有效封闭，还有抑制素对活化素反应没有可测量作用的情况(5，6，53，54)。已显示例如在过度表达ActRII的K562红白血病细胞中，3TPLux报告质粒活化素介导的诱导不受加入高浓度抑制素的影响(5)。先前描述了活化素A抑制促肾上腺皮质激素细胞系AtT20中碱性ACTH的分泌的能力，其中抑制素类似的被发现对活化素反应没有作用(6)。
为了直接测试β聚糖是否能介导抑制素封闭活化素信号传导，将大鼠β聚糖cDNA和3TPLux报告子质粒转染入AcT20细胞，来确定是否β聚糖能对这些细胞赋予抑制素反应性。在转染后，测量抑制素封闭活化素诱导荧光素酶的活性。
图4A显示当AtT20被空3TPLux载体或表达β聚糖xDNA的3TPLux载体共转染后，提高的活化素A浓度导致3TPLux活性剂量依赖性的增加。然而当另外用2.5nM抑制素处理细胞时，β聚糖转染的细胞中活化素的反应大大下降，而被空载体转染的细胞中活化素反应不受抑制素的影响(图4A)。
为了测量该β聚糖介导的抑制素作用的剂量依赖性，再次用空载体或含有β聚糖的3TPLux质粒转染细胞。用一定范围浓度的抑制素A(图4B)在存在或不存在1nM活化素A的情况下处理转染的细胞。如图4B所示，抑制素封闭3TPLux的活化素诱导的活性是剂量依赖性的，并且需要β聚糖。抑制素在表达β聚糖的细胞中的该作用是浓度依赖性的，抑制素的估计IC50具有8-10pM(图4B)。
还测试了β聚糖对两种其它细胞系的抑制素反应性的作用。虽然发现卵巢细胞系KK-1具有弱抑制素反应性(数据未显示)，但是被β聚糖cDNA转染的KK-1细胞变得对抑制素高度敏感。在过度表达活化素受体的K562红白血病细胞(KAR6)中，3TPLux报告子质粒的活化素介导的诱导在很大程度上未受加入高浓度抑制素的影响(5)。图4D显示KAR6细胞还显示活化素诱导的荧光素酶报告活性在转染β聚糖cDNA后，而不是在转染空载体后抑制素依赖性的减少。
联合结合和交联结果，这些结果进一步支持了一种模型，其中β聚糖作为抑制素受体，初始抑制素与ActRII结合，从而限制活化素与ActRII的接触，并拮抗活化素信号传导。值得注意的是虽然β聚糖/ActRII的抑制素估计的亲和力是约200pM，抑制素对功能性实验中测试的这三种细胞类型的反应的IC50值范围低得多(5-50pM)。在一些实验中，在未加入抑制素时，β聚糖过度表达可变的抑制活化素诱导的报告子活性，提示β聚糖与ActRII在不存在抑制素的情况下相互作用，来干涉活化素信号传导。不能排除可能抑制素/ActRII/β聚糖复合物还可引发新的与活化素诱导的不同的信号来产生不依赖于活化素或其受体复合物的抑制素反应。
实施例9
抗-β聚糖抗血清实验
为了研究内源β聚糖在介导抑制素作用中的可能的生理学重要性，对β聚糖胞外功能域的一部分产生抗体，检测了这些抗体对抑制素的生物反应的作用。在家兔中产生抗-β聚糖抗血清(Ab-BG)，针对之前报道得到的序列，得到能封闭β聚糖-依赖性TGF-β信号传导的抗体(34)。图5显示抑制素将FSG分泌减少到对照或正常家兔血清(NRS)处理的细胞中测量的约30％。加入Ab-BG以剂量依赖形式逆转该抑制素作用，而以等剂量加入的正常加入血清(NRS)没有作用。这些数据表明β糖苷免疫中和抑制抑制素抑制原代垂体细胞分泌FSH的能力。这支持了β聚糖或免疫学上相关的蛋白质与抑制素对垂体的作用有关的猜想。
实施例10
抑制素与β聚糖和ActRII的相互作用的可能模型
几种生长因子和细胞因子需要细胞表面的蛋白聚糖来获得与其相关的信号传导受体的接触，并施加生物应答(55)。本文列出的数据与一种模型(图6)一致，其中抑制素/β聚糖复合物与活化素竞争与ActRII的接触。这因此可以防止活化素/ActRII复合物的形成，这种复合物是随后ALK4的补充和活化素信号传导级联必需的。该模型与对于TGF-β信号传导提出的机制类似但结果不同，在后者中β聚糖浓缩细胞表面的TGF-β，将其递呈给其协同II型受体来增强信号传导(56)。近来提出的有关红木(Mahogany)的蛋白聚糖促进拉美刺鼠的MSH拮抗剂与MSH受体(57，58)结合的作用最可能是与β聚糖对于本文报道的抑制素作用的影响。
本文引用了下列参考文献：
1.Vale等，1988，蛋白质激素的抑制素家族的化学和生物学鉴定。于：Laurentian激素会议，1988 Clark，JH.(编)Resent Progresss in HormoneResearch，Inc.，San Diego卷44，1034。
2.Vale等，1998，活化素、抑制素和受体丝氨酸超家族以及Smad蛋白质。于关于卵巢功能性Sapporo的第四届Sapporo国际专题讨论会，1998年一月到1998八月7-8。
3.Kessler Dam，DA(1994)脊椎动物胚胎诱导：中胚层和神经图式。Science266：596-604。
4.Vale W，Rivier C 1995活化素和抑制素。于：Munson P(编)，药物学原理：基础概念和临床应用。Chapman & Hall，New York，883-886。
5.Lebrun，J-J，Vale WW 1997活化素和抑制素对I型和II型活化素受体的配体依赖性异二聚化作用和人红细胞样细胞分化的拮抗作用。
6.Bileziljian等，1991，活化素-A抑制AtT20细胞中鸦黑皮素原信使RNA聚集和促肾上腺皮质激素的分泌，Mol Endocriniol 5：1389-1395。
7.Massague J 1990转化生长因子β家族，Annu.Rev.Cell Biol 6：597-641。
8.Attisano等，1996，活化素受体复合物的信号传导的激活Mol.Cell.Biol.16：1066-1073。
9.Mathews LS，Vale WW 1991活化素受体，以后预测多种跨膜丝氨酸激酶的表达克隆，Cell 65：973-982。
10.Mathews等，1992第二类活化素受体的克隆和在非洲爪蟾胚胎中的特征确定，Science 255：1702-1705。
11.Attisano等，1992，新活化素受体：不同的基因和另外的mRNA剪切产生了丝氨酸/苏氨酸激酶受体的文库，Cell 68：97-108。
12.Lin等，1992，表达克隆TGF-βII型受体，一种功能上跨膜丝氨酸/苏氨酸，Cell 68：775-785。
13.Ten Dijke等，1993，活化素受体样激酶：一类具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的新的细胞表面受体亚类，Oncogene，8：2879-2887。
14.Carcamo等，1994，I型受体指定生长抑制和对转化生长因子β和活化素的转录反应。Mol.Cell.Biol 14：3810-3821。
15.Yamashita等(1994)，用于转化生长因子β的i型和II型受体的异源寡聚复合物的形成。J.Biol.Chem.269：20172-20178。
16.Daopin S等，1992，转化生长因子2的晶体结构：该超家族不寻常的折叠。Science 257：373。
17.Griffith DL等，1996，重组人成骨蛋白1的三维结构：转化生长因子β超家族的结构范例，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：878-883。
18.Martens等，1997，抑制素在中国仓鼠卵巢细胞内的活化素受体复合物水平上干涉活化素信号传导，Endocrinology 138：2928-36。
19.Xu等，1995，抑制素通过显性-隐性机制拮抗活化素对肝细胞生长的抑制，J.Biol.Chem.270：6308-6313。
20.Yu等，1987，FSH释放蛋白质和抑制素在红细胞分化中的作用，Nature330：765-767。
21.Derynck R，Zhang Y，Feng XH 1998 Smads：TGF-β反应的转录激活物，Cell 95：737-740。
22.Massague J 1998 TGF-β信号转导，Annu.Rev Biochem 67：753-91。
23.Xu等，1995，显阴性的骨形态发生蛋白4受体导致非洲爪蟾外胚层中的神经化Biochem Biophys Res Commun 212：212-9。
24.Woodruff T，1998，抑制素a-亚基敲除的小鼠的性腺肿瘤中抑制素受体的鉴定，Journal of Biological Chemistry 273：398-403。
25.Hertan，R.等，1999，对培养物中羊垂体细胞鉴定抑制素的高亲和力结合位点，Endocrinology 140，6-12。
26.Massague J，与B 1985类似，β型转化生长因子的细胞受体，J.Biol.Chem.260：2636-2645。
27.Lopez-Casillas等，1991，膜蛋白聚糖β聚糖，TGF-β受体系统的一个成员的结构和表达，Cell 67：785-95。
28.Wang等，1991，TGF-βIII型受体的表达克隆和特征确定67：797-805。
29.Derynck R，Feng XH，1997，TGF-β受体信号传导，Biochem Biophys Acta1333：F105-50。
30.Wang等，1991，TGF-βIII型受体的表达克隆和特征确定，Cell 67：797-805。
31.Lopez-Casillas等，β聚糖可作为TGF-β接触信号传导受体的双重调节剂：配体结合与GAG接触位点的作图，J Cell Biol 124：557-68。
32.Sun L，Chen C 1997，转化生长因子βIII型受体的表达抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的肿瘤原性，J.Biol.Chem.272：25367-72。
33.Chen C，Wang XF，Sun L 1997，转化生长因子β(TGF-β)III型受体的表达恢复人乳腺癌MCF-7细胞中的TGF β1活性，J.Biol.Chem.272：12862-7。
34.Brown等，1999，心脏中心内膜细胞转化对于III型TGF-β受体的要求，Science 283：2080-2。
35.Chen C，Okayama H.1987，质粒DNA对哺乳动物细胞的高效率转化，Mol.Cell.Biol.7：2745-2752。
36.Vale W等，1983于：酶学方法：神经内分泌肽Conn P M(编)Academic Press，New York，pp.565-577。
37.Kananen K等，1995，携带小鼠抑制素α-亚基启动子/猿病毒t-抗原融合基因的转基因小鼠中的性腺肿瘤原性：卵巢肿瘤的确定特征和促性腺素反应性粒层细胞系的建立，Molecular Endocrinology，9：616-627。
38.Mason等，1985，卵巢卵泡液抑制素的互补DNA序列显示前体结构和与转化生长因子β的同源性，Nature 318：659-663。
39.Vale等，1990，生长因子的抑制素/活化素家族，于：Sporn等(编)，肽生长因子及其受体，实验药物学手册，Springer-Verlag，Heidelberg，卷95/II，211-248。
40.Mason等，1985，卵巢卵泡液抑制素的互补DNA序列显示前体结构和与转化生长因子β的同源性，Nature 318：659-663。
41.Mason等，1986，两种人卵巢抑制素的结构，Biochem Biophys Res Commun135：957-64。
42.Mayo等，1986，来自猪卵巢和人胎盘的抑制素α-亚基cDNA，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5849-5853。
43.Carroll等，1989，抑制素、活化素和滤泡素抑制素：滤泡刺激性激素信使核糖核酸水平的调节，Mol.Endocrinol 3：1969-1976。
44.Sarkar DK，Kim KH，Minami S 1992，垂体腺中转化生长因子β1信使RNA和蛋白质表达-其对促乳激素分泌和促乳激素细胞生长的作用，Mol Endocrinol6：1825-1833
45.Sarkar等，1998，转化生长因子(TGF)-βI型和TGF-βII型受体在垂体促乳激素细胞中对分泌性TGF-β1调节的基因表达中的作用，Endicrinology139：3620-8。
46.Burns G，Sarkar DK 1993，大鼠垂体腺中转化生长因子β1-样免疫反应性：雌激素的作用，Endocrinology 133：1444-9。
47.Hsueh等，1987，抑制素亚基的杂二聚体和同二聚体具在调节黄体素化激素刺激的雄激素生物合成中有不同的旁分泌作用，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5082-5086。
48.Morris等，1988，富含原代睾丸足细胞的培养物产生的抑制素：滤泡刺激性激素、雄激素和表皮生长因子的调控，Endocrinology 122：717-725。
49.Krummen等，1994通过原位配体结合对睾丸中发育过程中抑制素和活化素结合位点定位，Biol.Reprod 50：734-44。
50.Hakovirta等，1993，大鼠精小管上皮循环中活化素-A、抑制素-A和转化生长因子-1对阶段特异性脱氧核酸合成的作用，Endocrinology 133：1664-1668。
51.van Dissel-Emiliani等，1989，抑制素减少成年小鼠和中国仓鼠睾丸中精原细胞数量，Endocrinology 125：1899-1903。
52.Roberts VJ，Barth SL，Meunier H，Vale W 1996大鼠大脑中抑制素/活化素亚基和信使核糖核酸的杂交组织化学和免疫组织化学定位，J CompNeurology 364：473-493。
53.Schubert D等，1990，活化素是一种神经细胞存活分子，Nature344：868-870。
54.Darland DC等，1995，睫状神经节神经元的发育目标中滤泡素抑制素表达显示了调控神经递质表型的作用，Neutron，15：857-866。
55.Schlessinger J等，1995，蛋白聚糖对生长因子活化的调节：低亲和力受体的作用是什么？Cell 83：357-360。
56.Lopez-Casillas等，1993，β聚糖代表了TGF-β信号传导受体的配体，Cell73：1435-44。
57.Gunn TM等，1999，小鼠mahogany基因座编码人吸引素(attractin)的跨膜形式，Nature 398：152-156。
58.Nagle D等，1999 Nature，398：148-152。
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本领域技术人员将不难理解本发明适合实施目的并获得提到的结果和优点，以及那些本文中提到的目的、结果和优点。本文的实施例以及方法、程序、疗法、分子和本文所述的具体化合物是优选例的代表，是示范性的，不意味着限制本发明的范围。对于本领域技术人员可进行改变和其他用途，这些在权利要求限定的本发明的精神内。

Claims (23)

1.针对β聚糖的胞外表位的抗血清的用途，其特征在于：用于制备一种药物，该药物增加细胞中活化素诱导的信号传导，其中所述抗血清抑制所述细胞表面抑制素/β聚糖复合物的形成。
2.β聚糖的反义转录物的用途，其特征在于，用于制备药物，该药物增加细胞中活化素诱导的信号传导，其中所述转录物抑制β聚糖的表达。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述细胞是垂体细胞。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，活化素信号传导的增强提高了所述细胞中促卵泡成熟激素的产生。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述活化素信号传递的增加提高了生育力。
6.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述活化素信号传导的增加减轻了所述细胞中的病理状况。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述病理状况选自生殖、发育、皮肤、骨骼、肝脏、造血和中枢神经系统疾病。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述病理状况是前列腺癌。
9.含有β聚糖基因的人工构建物的用途，其特征在于，用于制备药物，所述药物抑制细胞中活化素诱导的信号传导，其中所述构建物的表达导致所述细胞中β聚糖的表达增加，并提高所述细胞表面形成的抑制素/β聚糖复合物的形成。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，该方法还包括步骤：对所述细胞施用其它抑制素。
11.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述β聚糖基因组成型表达。
12.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述β聚糖基因是由诱导型启动子表达的。
13.如权利要求9所述的用途，其特征在于，在活化素信号传导不受抑制素正常影响的细胞中引起对抑制素的敏感性提高。
14.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述活化素信号传导的抑制减轻了所述细胞中的病理状况。
15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述病理状况选自生殖、发育、皮肤、骨骼、肝脏、造血和中枢神经系统疾病。
16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述病理状况选自性腺癌、肾上腺癌和肝脏发育不良。
17.如权利要求15所述的用途，其特征在于，促进了受伤肝脏中的肝脏再生。
18.一种筛选抑制抑制素/β聚糖复合物形成，从而提高活化素信号传导的化合物的方法，其特征在于，该方法包括步骤：
a)在所述化合物存在或不存在下培育来自表达β聚糖的细胞的膜；
b)进行试验，测量抑制素对β聚糖的结合；
c)比较与所述化合物一起培养的细胞对未处理细胞的试验结果，其中降低抑制素结合水平的化合物是抑制抑制素/β聚糖复合物形成的化合物。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述化合物选自肽、蛋白质和小分子。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述试验是标记和未标记抑制素之间的竞争性结合试验。
21.一种筛选化合物的方法，该化合物提高抑制素/β聚糖复合物的形成，来抑制活化素信号传导，其特征在于，该方法包括步骤：
a)在所述化合物存在或不存在下培育来自表达β聚糖的细胞的膜；
b)进行试验，测量抑制素与β聚糖的结合；
c)比较与所述化合物一起培养的细胞对未处理细胞的试验结果，其中导致抑制素结合水平提高的化合物是提高抑制素/β聚糖复合物形成的化合物。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述化合物选自肽、蛋白质和小分子。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述试验是标记和未标记抑制素之间的竞争性结合试验。
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1237565B1 (en) * 1999-12-15 2006-03-08 Research Development Foundation Betaglycan as an inhibin receptor and uses thereof
WO2004041197A2 (en) * 2002-11-01 2004-05-21 Case Western Reserve University Methods of inhibiting glial scar formation
WO2005028517A2 (en) * 2003-05-09 2005-03-31 The General Hospital Corporation SOLUBLE TGF-β TYPE III RECEPTOR FUSION PROTEINS
MXPA03004172A (es) * 2003-05-13 2004-11-18 Univ Mexico Nacional Autonoma Kit de tratamiento para coadyuvar con la antibioticoterapia en enfermedades infecciosas intracelulares.
EP3489257A1 (en) 2004-07-23 2019-05-29 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
DOP2006000195A (es) * 2005-09-07 2017-08-15 Amgen Fremont Inc Anticuerpos monoclonales humanos para la quinasa-1 tipo receptor de activina
EP1973559B1 (en) 2005-11-23 2013-01-09 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
PL2468290T3 (pl) * 2006-12-18 2015-08-31 Acceleron Pharma Inc Antagoniści aktywiny-ActRII do stosowania w leczeniu niedokrwistości
RU2473362C2 (ru) 2007-02-01 2013-01-27 Акселерон Фарма Инк. АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa-Fc И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
TW201940502A (zh) 2007-02-02 2019-10-16 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
EP2120999B1 (en) 2007-02-09 2012-08-29 Acceleron Pharma, Inc. Pharmaceutical compositions comprising Activin-ActRIIA antagonists and use thereof in preventing or treating multiple myeloma
WO2009038745A1 (en) 2007-09-18 2009-03-26 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion
DK3494986T3 (da) 2008-08-14 2020-08-03 Acceleron Pharma Inc GDF fanger
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
MX2011013172A (es) 2009-06-08 2012-04-02 Acceleron Pharma Inc Metodos para aumentar adipocitos termogenicos.
EP3805259A1 (en) 2009-06-12 2021-04-14 Acceleron Pharma Inc. Truncated actriib-fc fusion proteins
CA2781152A1 (en) 2009-11-17 2011-05-26 Acceleron Pharma Inc. Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
WO2012064771A1 (en) 2010-11-08 2012-05-18 Acceleron Pharma, Inc. Actriia binding agents and uses thereof
FR2993558B1 (fr) 2012-07-18 2014-08-29 Rhodia Operations Synthese d'anhydride (meth)acrylique par transanhydrification
NZ707477A (en) 2012-11-02 2019-09-27 Celgene Corp Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
WO2015108972A1 (en) * 2014-01-14 2015-07-23 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Activin inhibitor response prediction and uses for treatment
MA40008A (fr) 2014-06-13 2021-05-05 Acceleron Pharma Inc Antagoniste actrii pour le traitement et la prevention d'un ulcere cutane chez un sujet ayant l'anemie
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
TWI730949B (zh) 2014-12-03 2021-06-21 美商西建公司 活化素-ａｃｔｒｉｉ拮抗劑及治療貧血之用途
US11246883B2 (en) * 2016-09-30 2022-02-15 Academia Sinica Microrna let-7 and transforming growth factor beta receptor III axis as target for cardiac injuries
PE20211279A1 (es) 2018-10-23 2021-07-19 Dragonfly Therapeutics Inc Proteinas heterodimericas fusionadas con fc
CN116096353A (zh) 2020-04-22 2023-05-09 蜻蜓疗法股份有限公司 异二聚体fc融合蛋白的配制品、剂量方案和制造工艺

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4864019A (en) * 1985-11-08 1989-09-05 The Salk Institute For Biological Studies Antibodies to inhibin and conjugates produced therefrom
US4973577A (en) * 1986-04-04 1990-11-27 The Salk Institute For Biological Studies FSH-releasing peptides
US5102868A (en) * 1990-01-08 1992-04-07 Genentech, Inc. Method for inhibiting follicular maturation
US5428011A (en) * 1992-06-16 1995-06-27 Procyon Biopharma, Inc. Pharmaceutical preparations for inhibiting tumours associated with prostate adenocarcinoma
AU8016894A (en) * 1993-10-15 1995-05-04 La Jolla Cancer Research Foundation Betaglycan polypeptides having tgf-beta binding activity
US5786179A (en) * 1994-02-28 1998-07-28 Agritech Technologies Ltd. Heterologous protein comprising avian alpha-subunit inhibin protein and methods of producing same
DE69523750T2 (de) * 1994-05-04 2002-08-01 Mount Sinai Hospital Corp., Toronto Modulatoren der cytokine der tgf-beta überfamilie und verfahren zu ihrer bestimmung
DE69518760T2 (de) * 1994-07-13 2001-05-23 The Johns Hopkins University School Of Medicine, Baltimore Wachstumsdifferenzierungsfaktor-12
GB2304045A (en) * 1995-08-04 1997-03-12 Univ Manchester Betaglycan compositions for promoting the healing of wounds and fibrotic diseases
GB2306481A (en) * 1995-10-21 1997-05-07 Univ Manchester Pharmaceutical comprising a stimulator of activin and/or inhibin
EP1237565B1 (en) * 1999-12-15 2006-03-08 Research Development Foundation Betaglycan as an inhibin receptor and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
IL150198A0 (en) 2002-12-01
US6692744B2 (en) 2004-02-17
KR20020073141A (ko) 2002-09-19
ATE319470T1 (de) 2006-03-15
EP1237565B1 (en) 2006-03-08
US20010049360A1 (en) 2001-12-06
CA2394576A1 (en) 2001-06-21
AU777166B2 (en) 2004-10-07
EP1237565A1 (en) 2002-09-11
KR100791797B1 (ko) 2008-01-04
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