DE60026592T2

DE60026592T2 - Betaglycan als ein inhibin rezeptor und dessen verwendung

Info

Publication number: DE60026592T2
Application number: DE60026592T
Authority: DE
Inventors: Wylie La Jolla VALE; C. Peter San Diego GRAY; L. Amy La Jolla BLOUNT; A. Kathy San Diego LEWIS; M. Louise San Diego BILEZIKJIAN
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 1999-12-15
Filing date: 2000-12-14
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2020-12-15
Also published as: US20040258689A1; DE60026592D1; ZA200204616B; CN1250288C; WO2001043763A1; EP1237565A1; US20010049360A1; KR100791797B1; CA2394576A1; JP2003516746A; CN1450907A; IL150198A0; EP1237565B1; NZ519546A; US7455839B2; EP1237565A4; AU2100501A; ATE319470T1; AU777166B2; US6692744B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Gebiete der Endokrinologie, der reproduktiven Biologie und der Zellbiologie, speziell bezüglich Hormon/Wachstumsfaktor-Signalisierung. Spezifischer betrifft die vorliegende Erfindung die Identifizierung eines Inhibinrezeptors und Verwendungen desselben.
Beschreibung des Standes der Technik
Inhibine und Aktivine wurden ursprünglich als Proteinhormone gonodalen Ursprungs erkannt, die reziprok die Produktion von follikelstimulierendem Hormon (FSH) durch den Hypophysenvorderlappen modulieren (1). Diese Proteine sind Disulfid-verknüpfte Dimere von verwandten Polypeptiden. Aktivine bestehen aus zwei β-Ketten, während Inhibine eine β-Kette verknüpft mit einer verwandten, aber unterschiedlichen α-Kette besitzen (2). Von Aktivinen ist nun bekannt, dass sie sowohl in reproduktiven als auch in nicht-reproduktiven Geweben wichtige endokrine, parakrine und autokrine Wirkungen ausüben. Diese Wirkungen regulieren Prozesse, einschließlich Hormonsekretion, wie auch Zellproliferation und -Differenzierung, beides während der Entwicklung und in erwachsenen Tieren (1, 3). Inhibin setzt sich im Allgemeinen den Wirkungen von Aktivin (4) entgegen, obgleich es Systeme gibt, in denen Inhibin unfähig ist, Aktivinreaktionen zu blockieren (5, 6).
Inhibine und Aktivine gehören zu der transformierenden Wachstumsfaktor-β(TGF-β)-Superfamilie von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren (7). Es wurde gezeigt, dass Aktivine wie andere charakterisierte Mitglieder dieser Familie durch zwei Klassen von Transmembran-Serin/Threonin-Kinaserezeptoren Signale übertragen (8). 1991 wurde der Typ II-Rezeptor für Aktivin, der ActRII genannt wird, kloniert und charakterisiert (9). ActRII war die erste Vertebratenrezeptorserinkinase (RSK), die charakterisiert wurde, wie auch der erste Rezeptor, der in molekularen Details als Mitglied der TGF-β-Superfamilie beschrieben wurde. Inzwischen wurden über zwölf Rezeptorserinkinase-Familienmitglieder identifiziert, einschließlich eines zweiten Typ II-Aktivinrezeptors (ActRIIB) (10, 11), des Typ II-TGF-β-Rezeptors (12) und den Typ I-Rezeptoren für Aktivin (13, 14) und TGF-β (15).
Das breite Spektrum von kritischen biologischen Wirkungen von Inhibin, Aktivin und verwandten Faktoren wie auch ihre Verbindung mit potentiellen Anwendungen für die Behandlung von Störungen des reproduktiven, Entwicklungs-, Knochen-, Leber-, hämatopoetischen und Zentralnervensystems bilden zusammen zwingende Gründe für die Untersuchung ihrer Rezeptoren, der Signalgebungsmechanismen und der Regulierung. Zusammengefasst involviert diese Arbeit die Identifizierung von mehreren neuen molekularen Targets und sollte daher die Basis für neue therapeutische Ansätze bereitstellen, die auf die Behandlung von endokrinen Störungen und neoplastischen Krankheiten abzielen.
Aktivine (β-β) und Inhibine (α-β) sind durch eine gemeinsame 14 kDa-β-Untereinheit strukturell verwandt, wobei das Inhibindimer auch eine unterschiedliche 18 kDa-α-Untereinheit hat. Isoformen von Aktivin und Inhibin wurden aus follikulärer Flüssigkeit isoliert. Diese umfassen Aktivin A (βA-βA), Aktivin B (βB-βB), Aktivin AB (βA-βB), Inhibin A (α-βA) und Inhibin B (α-βB). Basierend auf einer Sequenzanordnung und Orten konservierter Cysteinreste werden diese Polypeptide als strukturell ähnlich zu anderen TGF-β-Familienmitgliedern angenommen, für welche Kristallstrukturinformationen verfügbar sind (16, 17).
Bis heute wurde Inhibinaktivität nur im Kontext von Aktivinreaktionen beschrieben, wo es typischerweise das Aktivinsignal antagonisiert (5, 18–20), obgleich es neuere Berichte in Abstract-Form über Aktivin-unabhängige Inhibineffekte in Knochen gibt. Es wurde gezeigt, dass Inhibin mit Aktivin um Bindung an seine Targetzellen konkurrieren kann und dass Inhibin eine Aktivin-induzierte Rezeptorheteromerisierung verhindern kann (5, 19). Nicht markiertes Inhibin konkurriert direkt mit markiertem Aktivin um Bindung an Typ II-Aktivin-Rezeptoren, obgleich seine Wirksamkeit als Verdrängungsmittel etwa zehnmal niedriger als die von unmarkiertem Aktivin ist (9, 10).
Es wurde vorgeschlagen, dass die β-Untereinheiten, die sowohl in Aktivin als auch in Inhibin vorliegen, eine Bindung an Typ II-Aktivin-Rezeptoren vermitteln. Nach der Bindung von Aktivin an ActRII begünstigt der Aktivin-ActRII-Komplex nachfolgend die Rekrutierung und Phosphorylierung der Typ I-Aktivin-Rezeptorserinkinase ALK4 (5, 8, 14). Dies resultiert in der Phosphorylierung des verwandten Typ I-Rezeptors und der Aktivierung der stromabwärts gelegenen Smad-Proteine (21, 22). Inhibine binden auch an Typ II-Aktivinrezeptoren, allerdings unterstützt die α-Untereinheit des Inhibinmoleküls nicht die Rekrutierung von Typ I-Rezeptoren (d.h. ALK4). Dies legt nahe, dass Inhibine eine Signalisierung durch direkte Kompetition um den Rezeptorzugang blockieren (5, 18, 19), wodurch eine Aktivin-Bindung an Typ II-Aktivinrezeptoren verhindert wird (23). Allerdings antagonisieren Inhibine Aktivin in einigen Geweben und Zellen nicht, was mit der Hypothese übereinstimmt, dass zusätzliche Komponenten für die Inhibinwirkung erforderlich sind (5, 24, 25).
Frühere Feststellungen zeigen, dass eine zusätzliche Rezeptorkomponente erforderlich sein kann, damit Inhibin erfolgreich mit Aktivin um Zugang zum Typ II-Aktivinrezeptor konkurrieren kann und Aktivinreaktionen dadurch funktionell antagonisieren kann. Es ist wahrscheinlich, dass eine einfache, direkte Kompetition um einen Zugang zu dem Aktivin-Typ II-Rezeptor zwischen Aktivin und Inhibin nicht allein genügt, um die Effekte von Inhibin auf Aktivin-Antworten zu erklären. In der Tat wird die Fähigkeit von Aktivin, eine Hypophysen-ACTH-Sekretion zu unterdrücken selbst durch einen großen molaren Überschuss an Inhibin (6) nicht antagonisiert. In K562-erythroleukämischen Zellen, die zur Überexpression von ActRII entwickelt wurden (KAR6-Zellen), blockiert außerdem eine ActRII-Expression die Fähigkeit von Inhibin, eine Aktivinsignalisierung zu antagonisieren, selbst in Gegenwart eines wesentlichen molaren Inhibinüberschusses (5).
Bei der Anstrengung, vermeintliche Inhibin-spezifische Rezeptorkomponenten zu identifizieren, wurden Vernetzungsexperimente unter Verwendung von [¹²⁵I]-markiertem Aktivin und Inhibin durchgeführt, um sowohl Wildtyp-K562-erythroleukämische Zellen, als auch KAR6-Zellen, die ActRII überexprimieren, zu markieren. Die Resultate zeigten, dass Aktivin an Typ I- und Typ II-Rezeptoren in beiden Zelllinien bindet und dass eine Bindung von markiertem Aktivin an die zwei Rezeptoren durch einen Überschuss von nicht markiertem Aktivin oder nicht markiertem Inhibin verdrängt wurde (5). Wie erwartet ist das markierte Inhibin zur Bindung des Typ II-Rezeptors, nicht aber des Typ I-Rezeptors, in beiden Zelllinien fähig. Die Bindung von Inhibin an den Typ II-Rezeptor kann durch Zusatz von entweder unmarkiertem Aktivin oder Inhibin verdrängt werden. Interessanterweise wurde auch ein Protein mit hohem Molekulargewicht, das mit markiertem Inhibin vernetzt war, in diesen Experimenten nachgewiesen, wobei dieses durch Zusatz eines Überschusses an unmarkiertem Inhibin, nicht aber Aktivin, kompetitiv verdrängt werden konnte (5).
Zusammen legen diese Resultate nahe, dass Inhibin zusätzlich zur Bindung an ActRII auch an einen anderen vermeintlichen Co-Rezeptor mit höherem Molekulargewicht bindet, der dazu dienen könnte, die Inhibin-ActRII-Wechselwirkung zu stabilisieren und daher eine Bindung von ActRII an Aktivin und eine Vermittlung von Aktivin-Antworten zu verhindern. Das Fehlen eines Inhibinantagonismus von Aktivin-Antworten in bestimmten Geweben kann daher durch das Fehlen dieses oder einer ähnlichen Inhibin-bindenden Co-Rezeptorkomponente erklärt werden. Das Vorliegen einer ähnlichen hochmolekulargewichtigen Inhibin-bindenden Verbindung in der Eierstocktumorzelllinie KK-1 wurde anschließend bestätigt. Die Hochaffinitäts-Inhibin-Bindung an nicht identifizierte hochmolekulargewichtige Proteine wurde auch beschrieben (24).
Betaglycan ist der Typ III-TGF-β-Rezeptor und wurde ursprünglich als der größte von drei Zelloberflächenrezeptoren, von denen gezeigt wurde, dass sie TGF-β mit hoher Affinität binden, identifiziert (26). Die Ratten-β-Glycan-cDNA kodiert für ein Protein mit 853 Aminosäuren, das eine große extrazelluläre Domäne, eine einzelne Transmembrandomäne und eine kurze C-terminale cytoplasmische Domäne, der eindeutig identifizierbare Signalgebungsmotive fehlen, enthält (27, 28). Betaglycan bildet alle drei TGF-β-Isoformen mit hoher Affinität und es wird angenommen, dass es eine akzessorische Rolle bei der Unterstützung des Zugangs von TGF-β zu seinen Signalisierungsrezeptoren spielt (22, 29).
Reifes Betaglycan ist ein Proteoglycan, das sowohl Heparansulfat- als auch Chondroitinsulfat-Glycosaminglycan (GAG)-Ketten enthält, was ein Molekül ergibt, das auf SDS-PAGE-Gelen zwischen 250 kDa und 350 kDa wandert. Das Betaglycankernpolypeptid ohne gebundene Glycosaminglycanketten behält die TGF-β-Bindungsaktivität bei und wandert als Protein mit 100 bis 110 kDa (27, 30, 31). Jüngere Arbeiten haben die Bedeutung von Betaglycan bei der Vermittlung physiologischer Antworten auf TGF-β, einschließlich seiner autokrinen Regulation der humanen Brustkrebszellproliferation (32, 33) und seiner Fähigkeit endokardiale Zelltransformation auszulösen (34), bewiesen.
Dem im Stand der Technik fehlt es an einer Charakterisierung des Proteins, das die Wechselwirkung von Inhibin mit dem Aktivinrezeptor vermittelt. Die vorliegende Erfindung befriedigt diesen seit langem bestehenden Bedarf und die Nachfrage auf dem Fachgebiet.
Zusammenfassung der Erfindung
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Verwendung einer Verbindung, welche die Bildung von Inhibin/Betaglycan-Komplexen an der Oberfläche einer Zelle inhibiert, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verstärkung von Aktivin-induziertem Signalisieren in der Zelle bereitgestellt. Ein Antiserum kann gegen ein extrazelluläres Epitop von Betaglycan gerichtet sein, um die Bindung von Inhibin an Betaglycan zu verhindern. Alternativ kann die Bildung von Inhibin/Betaglycan-Komplexen durch Reduzierung der Expression von Betaglycan in den Zellen entweder durch Antisense-Inhibierung oder durch Mutagenese von einem oder beiden Betaglycanallelen durch Verfahren wie homologe Rekombination inhibiert werden. Eine potentielle Anwendung der Erfindung besteht in der Verstärkung von Aktivin-Signalisieren in Hypophysenzellen. Dies sollte in einer Erhöhung der Produktion von Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) und damit einer Erhöhung der Fertilität resultieren. Die Erfindung kann auch auf die Behandlung einer Reihe pathophysiologischer Zustände angewendet werden; diese umfassen Störungen des reproduktiven, Entwicklungs-, Haut-, Knochen-, Leber-, hematopoetischen und Zentralnervensystems, z.B. Prostatakrebs.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Antiserum bereitgestellt, das gegen die Aminosäurereste 154 bis 439 von Betaglycan gerichtet ist. Dieses Antiserum inhibiert die Bindung von Inhibin an Betaglycan und kann in eine pharmazeutische Zusammensetzung eingearbeitet sein.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Screening auf eine Verbindung, welche die Bildung von Inhibin/Betaglycan-Komplexen zur Verstärkung der Aktivin-Signalisierung inhibiert. Membranen aus Betaglycan-exprimierenden Zellen werden sowohl in An- als auch Abwesenheit von potentiellen Inhibitoren der Inhibinbindung an Betaglycan inkubiert. Ein Assay, z.B. ein kompetitiver Bindungsassay, wird durchgeführt und die Resultate werden verglichen. Eine Verbindung, die die Bildung von Inhibin/Betaglycan-Komplexen inhibiert, wird in geringeren Leveln der Inhibinbindung resultieren. Potentielle Verbindungen können Peptide, Proteine oder kleine Moleküle sein. Alternativ kann das Verfahren angewendet werden, um auch Verbindungen durchzumustern, die die Bildung von Inhibin/Betaglycan-Komplexen verstärken und somit eine Aktivin-Signalisierung inhibieren. In diesem Fall sollte die Verbindung die Bindung von Inhibin an die Membranen verstärken.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Damit die Resultate, mit denen die oben angegebenen Merkmale, Vorzüge und Aufgaben der Erfindung, wie auch andere, die klar werden, erreicht werden und im Detail verstanden werden können, können besondere Beschreibungen der Erfindung, die oben kurz zusammengefasst sind, durch Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen, die in den beigefügten Zeichnungen dargestellt sind, gegeben werden. Diese Zeichnungen bilden einen Teil der Beschreibung. Es soll allerdings klar sein, dass die beigefügten Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen und daher nicht als beschränkend für ihren Rahmen anzusehen sind.
1A und 1B zeigen, dass Betaglycan Inhibin mit hoher Affinität bindet und die Inhibinbindung an ActRII verstärkt.
In 1A wurden HEK 293-Zellen unter Verwendung von Calciumphosphatpräzipitation (35) mit ActRII-myc, Betaglycan (BG) oder beidem (ActRII + BG), wie es gezeigt ist, transfiziert. Isolierte Zellmembranen wurden mit etwa 100 pM [¹²⁵I]-Inhibin A in Gegenwart oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen an unmarkiertem Inhibin A-Kompetitor inkubiert.
1B zeigt die Daten von 1A normalisiert und angegeben als Prozentwert der spezifischen Bindung. Die Bindungsdaten wurden unter Verwendung der Prism-Software analysiert.
2A und 2B veranschaulichen eine kovalente Vernetzung von Inhibin mit Betaglycan (transfiziert und endogen) und liefern einen Beweis für einen ActRII-Betaglycan-Komplex.
In 2A wird eine kovalente Vernetzung von Inhibin A mit ActRII durch Betaglycan verstärkt. Der leere Vektor (pcDNA3), ActRII-myc, Betaglycan (BG) oder beides, ActRII und Betaglycan (BG + ActRII-myc) wurden in HEK 293-Zellen transfiziert, die dann einer Vernetzung mit [¹²⁵I]-Inhibin A und DSS unterworfen wurden, wie es vorher für Aktivin beschrieben wurde (9). Bindung und Vernetzung von [¹²⁵I]-Inhibin A mit Betaglycan-exprimierenden Zellen wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von 25 nM unmarkiertem Inhibin A, 25 nM unmarkiertem Aktivin A oder 5 nM unmarkiertem TGF-β₁ wie angegeben durchgeführt. Vernetzte Komplexe wurden durch Immunpräzipitation isoliert, wobei Anti-Betaglycan-Antiserum (R&D Systems, Inc.) oder ein monoklonaler Anti-myc-Antikörper (9E10) (Calbiochem, Inc.) verwendet wurde. Die vernetzten Proteine wurde unter reduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE aufgelöst und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Positionen von ActRII-myc, dem Betagylcan-Kernpolypeptid (Kern) und Betaglycan enthaltenden Glycosamiglycan-Ketten (BG) sind angezeigt. Molekulargewichtsmarker sind als M_r × 10^–3 dargestellt.
2B zeigt eine kovalente Vernetzung von Inhibin A und Aktivin A mit endogenen Betaglycan-Komplexen. Bindung und Vernetzung von [¹²⁵I]-Inhibin A und [¹²⁵I]-Aktivin A wurden an KK-1-Zellen, die endogene Rezeptoren exprimieren, in Gegenwart oder Abwesenheit von 25 nM unmarkiertem Inhibin A oder 25 nM unmarkiertem Aktivin durchgeführt, wie es angegeben wurde. Vernetzte Komplexe, die durch Immunpräzipitation unter Verwendung von Anti-Betaglycan-Antiserum (R&D Systems, Inc.), Anti-ActRII-Antiserum oder normalem Kaninchenserum isoliert worden waren, wurden unter reduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE aufgetrennt und durch Autoradiographie visualisiert. Die Positionen von ActRII, dem Betaglycankernpolypeptid (BG-Kern), Betaglycan, das Glycosaminglycanketten enthält (BG), und Alk4 sind angezeigt. Molekulargewichtsmarker sind als M_r × 10^–3 dargestellt.
3A–3F zeigen eine immuncytochemische Lokalisierung von Betaglycan im normalen Erwachsenenrattengehirn, in der Hypophyse, den Eierstöcken und den Hoden. Hellfeld-Mikrofotografien mit hoher Vergrößerung zeigen eine Betaglycan-Immunfärbung im Vorderhirn (3A), der Hypophyse (3B und 3C), den Nebenhoden (3D), den Hoden (3E) und im Eierstock (3F). Typische Beispiele für Zellen, die auf Betaglycan (braune Färbung) immunpositiv sind, sind durch die Pfeile angezeigt. Die Balken zeigen 50 μm. Abkürzungen umfassen: AL, Hypophysenvorderlappen; CT, Bindegewebe; GC, Granulosazellen; IL, Hypophysenmittellappen; LC, Leydig-Zellen; O, Oozyte; PL, Hypophysenhinterlappen; ST, Samenkanälchen; TT, Teni Tecta; TC, Thekazellen.
4A–4D zeigen, dass Betaglycan funktionellen Antagonismus von Aktivin-Signalisierung in corticotropen, Eierstock- und erythroleukämischen Zellen vermitteln kann.
In 4A wurden AtT20-Zellen mit dem 3TPLux-Reporterplasmid (7), CMV-β-Galactosidase (β-GAL)- und entweder leerer Vektor- oder Betaglycan (BG)-cDNA unter Verwendung von Superfect Transfection Reagenz (Qiagen) unter optimierten Bedingungen transfiziert. Zellen wurden mit oder ohne 2,5 nM Inhibin A (Inh A) und verschiedenen Konzentrationen an Aktivin A (Act A) für 15 h behandelt und die resultierenden Luciferaseaktivitäten wurden gemessen.
In 4B wurden AtT20-Zellen, wie für 4A ausgeführt, transfiziert und dann mit oder ohne 1 nM Aktivin A und einem Bereich an Inhibin A-Konzentrationen behandelt.
In 4C wurden KK-1-Eierstocktumorzellen wie oben beschrieben transfiziert und mit oder ohne 0,3 nM Aktivin A und einem Bereich an Inhibin A-Konzentrationen behandelt.
In 4D wurden von K562 abgeleitete KAR6-Zellen mit Betaglycan (BG) oder leerem Vektor transfiziert, mit IPTG behandelt, um eine Aktivinrezeptorexpression zu induzieren, und mit 0,3 nM Aktivin A und einem Bereich an Inhibin A-Konzentrationen behandelt. Luciferaseaktivität wird in willkürlichen Luciferaseeinheiten (L.U.) und normalisiert bezüglich β-GAL-Aktivität dargestellt.
5 zeigt, dass eine Inhibierung der FSH-Sekretion aus Rattenhypophysevorderlappenzellen durch Inhibin A in dosisabhängiger Art in Gegenwart von Anti-Betaglycanserum blockiert wird. Rattenhypophysevorderlappenzellen wurden dissoziiert und plattiert, wie es in der Literatur beschrieben ist (40). Vier Tage nach dem Plattieren wurden die Zellen gewaschen und 24 Stunden in 0,2% FBS-bPJ inkubiert (36). Die Zellen wurden dann mit frischem Medium gewaschen und entweder mit normalem Kaninchenserum (NRS) oder mit Antiserum aus einem Kaninchen, dem GST-Fusionsprotein injiziert worden war, gegen Ratten-Betaglycanreste 154–439 (Ab-BG) behandelt. Nach 1 Stunde wurden die Zellen mit oder ohne 25 pM Inhibin A behandelt und 48 h inkubiert. FSH wurde unter Verwendung eines Radioimmunoassaykits (National Hormone and Pituitary Program of NIADDK) gemessen. Die berichteten Werte sind als Prozentwert derjenigen ohne Inhibierungsbehandlung +/– SEM für drei Wells angegeben.
6 ist eine schematische Darstellung des vorgeschlagenen Modells, in dem Betaglycan (BG) als Inhibincorezeptor fungiert. Das Vorliegen von Betaglycan oder einem funktionell ähnlichen Inhibincorezeptor erhöht die Inhibinbindung an ActRII und kann dadurch einen Zugang von Aktivin zu ActRII verhindern. Zusätzlich zu einer Blockierung des Aktivinsignalisierungswegs kann die Bildung des Inhibin/Betaglycan/ActRII-Komplexes neue „Downstream"-Signale steuern.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung können herkömmliche Molekularbiologie-, Mikrobiologie- und DNA-Rekombinationstechniken im Rahmen des Fachwissens des Standes der Technik verwendet werden. Solche Techniken werden in der Literatur umfangreich erläutert. Siehe z.B. Maniatis, Fritsch & Sambrook, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); „DNA Cloning: A Practical Approach", Band I und II (D. N. Glover, Herausg., 1985); „Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait Herausg. 1984); „Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J. Higgins Herausg. (1985); „Transcription and Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins Herausg. (1984)]; „Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, Herausg. (1986)]; „Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, „A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
Daher sollen die folgenden Ausdrücke, wenn sie hier auftreten, die unten angegebenen Definitionen haben.
Der Ausdruck „cDNA", wie er hier verwendet wird, soll sich auf die DNA-Kopie des mRNA-Transkripts eines Gens beziehen.
Der Ausdruck „abgeleitete Aminosäuresequenz", wie er hier verwendet wird, soll die Aminosäuresequenz meinen, die durch Lesen der Triplettsequenz der Nucleotidbasen in der cDNA bestimmt wird.
Der Ausdruck „Screening einer Bibliothek", wie er hierin verwendet wird, soll sich auf das Verfahren einer Verwendung einer markierten Sonde beziehen, um zu untersuchen, ob unter den geeigneten Bedingungen eine Sequenz, die in einer bestimmten DNA-Bibliothek vorliegt, komplementär zu der Sonde ist. Außerdem könnte „Screening einer Bibliothek" durch PCR durchgeführt werden.
Der Ausdruck „PCR", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Polymerasekettenreaktion, die Gegenstand der US-Patente Nr. 4 683 195 und 4 683 202 von Mullis ist, wie auch auf andere Verbesserungen, die derzeit auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Es ist bevorzugt, dass die hierin beschriebenen Aminosäuren in der „L"-isomeren Form vorliegen. Allerdings können Reste in der „D"-isomeren Form für einen beliebigen L-Aminosäurerest eingesetzt werden, solange die gewünschte funktionelle Eigenschaft der Immunglobulin-Bindung durch das Polypeptid beibehalten wird. NH2 bezieht sich auf die freie Aminogruppe, die am Aminoterminus eines Polypeptids vorliegt. COOH bezieht sich auf die freie Carboxygruppe, die am Carboxyterminus eines Polypeptids vorliegt. Da die Standardpolypeptidnomenklatur beibehalten wird, J Biol. Chem, 243: 3552–59 (1969), sind Abkürzungen für Aminosäurereste auf dem Fachgebiet bekannt.
Es sollte betont werden, dass alle Aminosäurereste-Sequenzen hierin durch Formeln dargestellt werden, deren linke und rechte Orientierung in der herkömmlichen Richtung von Amino-Terminus zu Carboxy-Terminus erfolgt. Darüber hinaus sollte betont werden, dass ein Bindestrich am Anfang oder Ende eine Aminosäurereste-Sequenz angibt, dass ein Peptid an eine weitere Sequenz eines oder mehrerer Aminosäurereste gebunden ist.
Ein „Replikon" ist ein beliebiges genetisches Element (z.B. Plasmid, Chromosom, Virus), das als autonome Einheit der DNA-Replikation in vivo funktioniert, d.h. zur Replikation unter seiner eigenen Kontrolle fähig ist.
Ein „Vektor" ist ein Replikon, z.B. Plasmid, Phage oder Kosmid, an das ein anderes DNA-Segment so gebunden sein kann, dass es die Replikation des gebundenen Segments bewirkt.
Ein „DNA-Molekül" bezieht sich auf die polymere Form von Desoxyribonucleotiden (Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin) entweder in ihrer Einzelstrangform oder als Doppelstranghelix. Dieser Ausdruck bezieht sich nur auf die Primär- und Sekundärstruktur des Moleküls und begrenzt es auf keine besonderen tertiären Formen. Somit umfasst dieser Ausdruck doppelsträngige DNA, die inter alia in linearen DNA-Molekülen (z.B. Restriktionsfragmente), Viren, Plasmiden und Chromosomen gefunden wird. Bei der Diskussion der Struktur hierin wird gemäß der normalen Konvention nur die Sequenz in der 5'-zu-3'-Richtung entlang des nicht transkribierten DNA-Strangs (d.h. der Strang, der eine Sequenz homolog zu der mRNA hat) angegeben.
Ein „Replikationsursprung" bezieht sich auf solche DNA-Sequenzen, die an der DNA-Synthese teilnehmen.
Eine „kodierende DNA-Sequenz" ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz, die in vivo in ein Polypeptid transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Startcodon am 5' (Amino)-Terminus und ein Translationsstopcodon am 3' (Carboxyl)-Terminus bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann prokaryotische Sequenzen, cDNA aus eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus eukaryotischer (z.B. Säuger-)DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. 3' zu der kodierenden Sequenz werden üblicherweise ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationsequenz lokalisiert sein.
Transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen sind regulatorische DNA-Sequenzen, z.B. Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale, Terminatoren und dergleichen, die für die Expression einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle sorgen.
Eine „Promotorsequenz" ist eine regulatorische DNA-Region, die fähig ist, RNA-Polymerase in einer Zelle zu binden und eine Transskription einer stromabwärts liegenden (3'-Richtung) kodierenden Sequenz zu initiieren. Zu Definitionszwecken in der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus durch die Transskriptionsinitiationsstelle gebunden und erstreckt sich stromaufwärts (5'-Richtung), um die Mindestanzahl von Basen oder Elementen zu enthalten, die notwendig sind, um eine Transkription bei detektierbaren Leveln über dem Hintergrund zu initiieren. Innerhalb der Promotorsequenz werden eine Transkriptionsinitationsstelle wie auch Protein-bindende Domänen (Consensus-Sequenzen) gefunden, die für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryotische Promotoren enthalten oft, aber nicht immer, „TATA"-Boxen und „CAT"-Boxen. Prokaryotische Promotoren enthalten Shine-Dalgarno-Sequenzen zusätzlich zu den -10 und -35-Consensus-Sequenzen.
Eine „Expressionskontrollsequenz" ist eine DNA-Sequenz, die die Transkription und Translation einer anderen DNA-Sequenz kontrolliert und reguliert. Eine codierende Sequenz ist „unter der Kontrolle" von transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen in einer Zelle, wenn RNA-Polymerase die kodierende Sequenz in mRNA transkribiert, die dann in das durch die kodierende Sequenz kodierte Protein translatiert wird.
Eine „Signalsequenz" kann nahe der kodierenden Sequenz enthalten sein. Diese Sequenz kodiert für ein Signalpeptid, N-terminal zum Polypeptid, das mit der Wirtszelle kommuniziert, um das Polypeptid an die Zelloberfläche zu lenken oder das Polypeptid in das Medium zu sezernieren; dieses Signalpeptid wird durch die Wirtszelle abgespalten, bevor das Protein die Zelle verlässt. Signalsequenzen können assoziiert mit einer Vielzahl von Proteinen, die für Prokaryoten und Eukaryoten aktiv sind, gefunden werden.
Der Ausdruck „Oligonucleotid", wie er hierin unter Bezugnahme auf die Sonde der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist als ein Molekül definiert, das aus zwei oder mehr Ribonucleotiden, vorzugsweise mehr als drei, besteht. Seine genaue Größe wird von vielen Faktoren abhängen, die wiederum von der letztlichen Funktion und Verwendung des Oligonucleotids abhängen.
Der hierin verwendete Ausdruck „Primer" bezieht sich auf ein Oligonucleotid, entweder natürlich auftretend wie in einem gereinigten Restriktionsverdau oder synthetisch produziert, das fähig ist, als Initiationspunkt der Synthese zu wirken, wenn es unter Bedingungen gestellt wird, bei denen eine Synthese eines Primerverlängerungsproduktes, das komplementär zu einem Nucleinsäurestrang ist, induziert wird, d.h. in Gegenwart von Nucleotiden und eines induzierenden Mittels, z.B. einer DNA-Polymerase und bei einer geeigneten Temperatur und einem geeigneten pH. Der Primer kann entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein und muss ausreichend lang sein, um die Synthese des gewünschten Verlängerungsproduktes in Gegenwart eines induzierenden Mittels auszulösen. Die genaue Länge des Primers wird von vielen Faktoren, einschließlich Temperatur, Primerquelle und verwendetes Verfahren, abhängen. Beispielsweise enthält der Oligonucleotidprimer für diagnostische Anwendungen in Abhängigkeit von der Komplexität der Zielsequenz 15–25 oder mehr Nucleotide, obgleich er auch weniger Nucleotide haben kann.
Die Primer hierin werden so gewählt, dass sie „im Wesentlichen" komplementär zu verschiedenen Strängen einer bestimmten Target-DNA-Sequenz sind. Dies bedeutet, dass die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren jeweiligen Strängen zu hybridisieren. Daher braucht die Primersequenz nicht die exakte Sequenz der Matritze wiederzugeben. Beispielsweise kann ein nicht-komplementäres Nucleotidfragment an das 5'-Ende des Primers gebunden sein, wobei der Rest der Primersequenz komplementär zu dem Strang ist. Alternativ können nicht-komplementäre Basen oder längere Sequenzen im Primer verstreut sein, vorausgesetzt die Primersequenz hat ausreichende Komplementarität mit der Sequenz oder hybridisiert damit und bildet dadurch die Matritze für die Synthese des Verlängerungsproduktes bzw. Extentionsproduktes.
Die Ausdrücke „Restriktionsendonucleasen" und „Restriktionsenzyme", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf Enzyme, die doppelsträngige DNA an oder in der Nähe einer spezifischen Nucleotidsequenz schneiden.
Eine Zelle wurde durch exogene oder heterologe DNA „transformiert", wenn eine solche DNA ins Innere der Zelle eingeführt wurde. Die transformierende DNA kann in das Genom der Zelle integriert (kovalent gebunden) werden oder nicht. In Prokaryoten-, Hefe- und Säugerzellen beispielsweise kann die transformierende DNA an einem episomalen Element, z.B. einem Plasmid, gehalten werden. Für eukaryotische Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine, in der die transformierende DNA in ein Chromosom integriert wurde, so dass es durch Tochterzellen über Chromosomenreplikation vererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der eukaryotischen Zelle bewiesen, Zelllinien oder Klone zu entwickeln, die aus einer Population von Tochterzellen bestehen, die die transformierte DNA enthalten. Ein „Klon" ist eine Population von Zellen, die durch Mitose von einer einzelnen Zelle oder einem Ancestor stammt. Eine „Zelllinie" ist ein Klon einer primären Zelle, die zum stabilen Wachstum in vitro über viele Generationen fähig ist.
Zwei DNA-Sequenzen sind „im Wesentlichen homolog", wenn wenigstens etwa 75% (vorzugsweise wenigstens 80% und am bevorzugtesten mindestens etwa 90% oder 95%) der Nucleotide über die definierte Länge der DNA-Sequenzen übereinstimmen. Sequenzen, die im Wesentlichen homolog sind, können identifiziert werden, indem die Sequenzen unter Verwendung von Standardsoftware, die in Sequenzdatenbanken verfügbar ist, oder in einem Southern-Hybridisierungsexperiment unter zum Beispiel stringenten Bedingungen, wie sie für das bestimmte System definiert sind, verglichen werden. Die Definition geeigneter Hybridisierungsbedingungen liegt im Rahmen des Fachwissens eines Fachmanns. Siehe z.B. Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Bd. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
Eine „heterologe" Region des DNA-Konstrukts ist ein identifizierbares DNA-Segment in einem größeren DNA-Molekül, das in der Natur nicht in Verbindung mit dem größeren Molekül gefunden wird. Wenn die heterologe Region demnach für ein Säugergen kodiert, wird das Gen üblicherweise von DNA flankiert, die nicht die genomische Säuger-DNA im Genom des Quellenorganismus flankiert. In einem anderen Beispiel ist die kodierende Sequenz ein Konstrukt, in dem die kodierende Sequenz selbst in der Natur nicht gefunden wird (z.B. eine cDNA, in dem die genomische kodierende Sequenz Introns enthält, oder synthetische Sequenzen, die andere Codons als das native Gen haben).
Allelvariationen oder natürlich auftretende Mutationsereignisse führen nicht zu einer heterologen Region von DNA, wie sie hierin definiert ist.
Die Markierungen, die für diese Studien am gängigsten verwendet werden, sind radioaktive Elemente, Enzyme, Chemikalien, die fluoreszieren, wenn sie ultraviolettem Licht ausgesetzt sind, und andere. Eine Reihe von fluoreszierenden Materialien ist bekannt und kann als Markierungen verwendet werden. Diese umfassen z.B. Fluorescein, Rhodamin, Auramin, Texas-Rot, AMCA-Blau und Lucifer-Gelb. Ein besonderes detektierendes Material ist Anti-Kaninchen-Antikörper, hergestellt in Ziegen und konjugiert mit Fluorescein durch ein Isothiocyanat.
Proteine können auch mit einem radioaktiven Element oder mit einem Enzym markiert werden. Die radioaktive Markierung kann durch ein beliebiges der gängigerweise verfügbaren Zählverfahren detektiert werden. Das bevorzugte Isotop kann aus ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, und ¹⁸⁶Re ausgewählt werden.
Enzymmarkierungen sind entsprechend verwendbar und können durch eine beliebige der derzeit verwendeten kolorimetrischen, spektralfotometrischen, fluorospectralfotometrischen, amperometrischen oder gasometrischen Techniken detektiert werden. Das Enzym wird durch Reaktion mit Brückenmolekülen, z.B. Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyd und dergleichen, an das ausgewählte Partikel konjugiert. Es sind viele derartige Enzyme bekannt und können verwendet werden. Die bevorzugten sind Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase plus Peroxidase und alkalische Phosphatase. Die US-Patente Nr. 3 654 090, 3 850 752 und 4 016 043 werden als Beispiele für die Offenbarung alternativer Markierungsmaterialien und -verfahren genannt.
Ein besonderes Assaysystem, das entwickelt wurde und auf dem Fachgebiet verwendet wird, ist als Rezeptorassay bekannt. In einem Rezeptorassay wird das zu analysierende Material geeigneterweise markiert und dann werden bestimmte zelluläre Testkolonien mit einer Menge der Markierung inokuliert, wonach Bindungsstudien durchgeführt werden, um den Grad zu bestimmen, in dem das markierte Material an die Zellrezeptoren bindet. Auf diese Weise können Unterschiede in der Affinität zwischen Materialien ermittelt werden.
Ein Assay, der auf dem Fachgebiet einsetzbar ist, ist als „cis/trans"-Assay bekannt. Kurz ausgedrückt, dieser Assay verwendet zwei genetische Konstrukte, von denen eines typischerweise ein Plasmid ist, das kontinuierlich einen bestimmten Rezeptor von Interesse exprimiert, wenn es in eine geeignete Zelllinie transfiziert ist, und das zweite ein Plasmid ist, das einen Reporter, z.B. Luciferase, unter der Kontrolle eines Rezeptors/Liganden-Komplexes exprimiert. Wenn es z.B. gewünscht ist, eine Verbindung als Ligand für einen bestimmten Rezeptor zu beurteilen, wäre eines der Plasmide ein Konstrukt, das in der Expression des Rezeptors in der gewählten Zelllinie resultiert, während das zweite Plasmid einen Promotor besitzen würde, der an das Luciferasegen gebunden ist, in das das Antwortelement auf einem bestimmten Rezeptor insertiert ist. Wenn eine zu untersuchende Verbindung ein Agonist für den Rezeptor ist, wird der Ligand mit dem Rezeptor einen Komplex bilden und der resultierende Komplex wird das Antwortelement binden und eine Transkription des Luciferasegens initiieren. Die resultierende Chemieluminiszenz wird dann fotometrisch gemessen und es werden Dosis-Antwort-Kurven erhalten und mit denen bekannter Liganden verglichen. Das vorstehende Protokoll ist detailliert im US-Patent Nr. 4 981 784 beschrieben.
Im Allgemeinen werden Expressionsvektoren, die Promotorsequenzen enthalten, die die effiziente Transkription des insertierten DNA-Fragments erleichtern, in Verbindung mit dem Wirt eingesetzt. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsursprung, Promotor(en), Terminator(en), wie auch spezifische Gene, die fähig sind, eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen bereitzustellen. Die transformierten Wirte können mit Mitteln, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, um ein optimales Zellwachstum zu erreichen, fermentiert und kultiviert werden.
Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die geeignete transkriptionale und translationale Kontrollsignale enthalten. Siehe zum Beispiel die Techniken, die bei Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg.), Cold Spring Harbor Press, N. Y. beschrieben sind. Ein Gen und seine Transkriptionskontrollsequenzen sind als „funktionell verknüpft" definiert, wenn die Transkriptionskontrollsequenzen die Transkription des Gens wirksam kontrollieren. Vektoren der Erfindung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Plasmidvektoren und virale Vektoren.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung einer Verbindung, welche die Bildung von Inhibin/Betaglycan-Komplexen auf der Oberfläche einer Zelle inhibiert, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verstärkung von Aktivin-induziertem Signalisieren in genannter Zelle gerichtet. Es kann ein Antiserum gegen ein extrazelluläres Epitop von Betaglycan verwendet werden, um die Bildung von solchen Komplexen zu inhibieren.
Alternativ kann die Menge an Betaglycan, die zur Bildung der Komplexe verfügbar ist, limitiert werden, indem die Expression von Betaglycan in den Zellen reduziert wird. Die Expression von Betaglycan kann durch Anti-Betaglycan-Antisense-Transkripte oder durch Mutagenese eines oder beider Betaglycanallele in den Zellen reduziert werden. Eine homologe Rekombination ist ein Verfahren, das verwendet werden kann, um Betaglycan zu mutieren. Hypophysenzellen sind ein potentielles Ziel dieser Erfindung, wobei eine Verstärkung der Aktivin-Signalisierung die Produktion von Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) verstärkt und die Fertilität erhöht. Alternativ kann die Erfindung auf die Behandlung einer Reihe von Erkrankungen des Reproduktions-, Entwicklungs-, Haut-, Knochen-, Leber-, hämatopoetischen und Zentralnervensystems, z.B. Prostatakrebs, angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Antiserum gerichtet, das gegen die Aminosäurereste 154–439 von Betaglycan gerichtet ist, wobei das genannte Antiserum die Bindung von Inhibin an Betaglycan inhibiert. Das Antiserum kann mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger unter Bildung einer pharmazeutischen Zusammensetzung kombiniert werden.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf Verfahren zum Screening auf Verbindungen, welche die Bildung von Inhibin/Betaglycan-Komplexen inhibieren und somit die Aktivin-Signalisierung verstärken, gerichtet. Ein Assay auf Inhibinbindung an Betaglycan wird an Membranen aus Zellen, die Betaglycan exprimieren, durchgeführt. Wenn die Verbindung zu einem niedrigen Level an Inhibinbindung in Membranen aus einer Zelle, die mit der Verbindung behandelt wurde, als derjenige bei unbehandelten Zellen führt, inhibiert die Verbindung die Bildung von Inhibin/Betaglycan-Komplexen und wird die Aktivin-Signalisierung verstärken.
Das Verfahren kann eingesetzt werden, um eine Reihe möglicher Verbindungen, einschließlich Peptide, Proteine und kleine Moleküle, zu testen. Alternativ kann das Verfahren zum Screening auf Verbindungen eingesetzt werden, welche die Bildung von Inhibin/Betaglycan-Komplexen verstärken und somit eine Aktivin-Signalisierung inhibieren. In diesem Fall sollte die Verbindung die Bindung von Inhibin an die Membranen erhöhen.
Die folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Veranschaulichung verschiedener Ausführungsformen der Erfindung angeführt und sollen die vorliegende Erfindung in keiner Weise beschränken.
Beispiel 1
Kompetitionsbindungsstudien
Rekombinantes humanes Aktivin A und Inhibin A wurden unter Verwendung einer stabilen Aktivin-exprimierenden Zelllinie, die von Dr. J. Mather (Genentech, Inc.) zur Verfügung gestellt worden war, erzeugt und von Wolfgang Fischer (PBL, Salk Institute) gereinigt. [¹²⁵I]-Aktivin A und [¹²⁵I]-Inhibin A wurden unter Verwendung des Chloramin T-Verfahrens, wie es früher beschrieben wurde (37), hergestellt.
Für Bindungsstudien wurden Zellen transient unter Verwendung von DEAE-Dextran mit 10 μg ActRII und/oder 10 μg Betaglycan-Plasmid-DNA transfiziert. Die Zellen wurden für 4 Stunden mit der DNA inkubiert, mit 10% DMSO in Hepes-Dissoziationspuffer (HDB) geschockt und für 48 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ in DMEM, das 10% fötales Kälberserum und L-Glutamin enthielt, inkubiert. Konfluente Monolayer wurden zweimal mit Hepes-Dissoziationspuffer gewaschen und in Bindungspuffer (Hepes-Dissoziationspuffer mit 0,1% BSA, 5 mM MgSO₄ und 1,8 mM CaCl₂ resuspendiert. Die Bindung wurde durch Inkubieren von ~2 × 10⁵ Zellen mit 2 × 10⁵ cpm [¹²⁵I]-Inhibin A (etwa 100 pM) für 90 min bei Raumtemperatur in Gegenwart oder Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen an unmarkiertem Inhibin oder Aktivin in einem Endvolumen von 0,4 ml Bindungspuffer inkubiert. Nach dem Binden wurden die Zellen durch Zentrifugation pelletisiert und zweimal in Bindungspuffer gewaschen. Gebundenes [¹²⁵I]-Inhibin A wurde unter Verwendung eines Gammazählers quantitativ bestimmt und Bindungsanalysendaten wurden unter Verwendung des Prism-Programms durchgeführt.
Beispiel 2
Vernetzungsstudien
Vernetzungsstudien wurden an Zellen durchgeführt, die zu ~40–60% Konfluenz in 5% CO₂ in vollständigem DMEM (mit 10% Rinderkälberserum, Penicillin, Streptomycin und L-Glutamin) gewachsen waren, durchgeführt. Die Zellen wurden in 10 cm-Kulturschalen wachsen gelassen und dann unter Verwendung des Calciumphosphat-Präzipitationsverfahrens unter Verwendung von Hepes-gepufferter Salzlösung (pH 7,07) transfiziert. Nach Transfektion wurden die Zellen bei 5% CO₂ für 48 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden geerntet, indem jede Platte einmal mit Hepes-Dissoziationspuffer gespült wurde und dann jede Platte in Hepes-Dissoziationspuffer, der 1 mM EDTA enthielt, für 10 min inkubiert wurde, um die Zellen freizusetzen.
Eine kovalente Vernetzung wurde durchgeführt, indem ungefähr 10⁶ Zellen, die in Hepes-Dissoziationspuffer resuspendiert waren, mit ungefähr 2 × 10⁶ cpm [¹²⁵I]-Aktivin A in insgesamt 500 μL für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln inkubiert wurden. Nach dieser Inkubation wurde 1 ml kalter Hepes-Dissoziationspuffer in jedes Röhrchen gegeben und die Zellen wurden dann durch Zentrifugation pelletisiert, in 500 μl HDB resuspendiert, auf 0,5 mM Disuccinylsuberat (DSS) gebracht und 30 min auf Eis inkubiert. Jede Reaktion wurde durch Zusatz von 1 ml TBS in jedes Röhrchen abgeschreckt. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation pelletisiert, angesaugt und die Pellets wurden in 1 ml Lysepuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM AEBSF, 1 mM EDTA, 10 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Pepstatin und 1 μg/ml Aprotinin) für 30 min auf Eis solubilisiert. TX-100-unlösliches Material wurde durch Zentrifugation entfernt und 2 μg Anti-Betaglycan- oder 2 μg Anti-myc-Antikörper wurden zu jedem Überstand gegeben. Die Röhrchen wurden für 16 Stunden bei 4°C inkubiert und Immunkomplexe wurden durch Zusatz von 10 μL 50% Protein G-Agarose (PGA)-Aufschlämmung zu jedem Röhrchen, Inkubieren für 1 weitere Stunde bei 4°C und Pelletisieren von immobilisierten Immunkomplexen durch Zentrifugation präzipitiert. Jedes Protein G-Agarose-Pellet wurde dreimal mit 1 ml Lysepuffer gewaschen und dann 10 min gekocht, in 25 μl SDS-Probenpuffer eluiert und über SDS-PAGE wieder getrennt. Die gesamte SDS-PAGE wurde unter reduzierenden Bedingungen auf Polyacrylamid 3–8% Tris-Acetat-NuPAGE-Gelen (Novex) durchgeführt. Die Gele wurden getrocknet und Banden wurden über Autoradiografie detektiert.
Beispiel 3
Luciferase-Assays in AtT20- und KK-1-Zellen
Die Funktion von Betaglycan wurde in transienten Transfektionsexperimenten unter Verwendung eines gut bekannten auf Aktivin/TGF-β-ansprechenden Luciferase-Reporterplasmids 3TPLux beurteilt (14). Zwei Mauszelllinien wurden getestet: AtT20-corticotrope Zellen (gewachsen in DMEM, 10% FBS, 2 mM L-Glutamin und Gentamycin) und KK-1-Eierstockzellen (gewachsen in DMEM:F12 mit 10% FBS, L-Glutamin, Penicillin und Streptomycin). Die Zellen wurden trypsiniert und in einer Dichte von 1,5–2 × 10⁵ Zellen/Well in Platten mit 6-Wells 24 Stunden vor Transfektion plattiert. Die Zellen wurden in komplettem Medium mit etwa 1 μg 3TPLux, 0,1–0,2 μg Cytomegalovirus (CMV)-β-Galactosidase (β-GAL) und 0,1–0,3 μg entweder Vektor- oder Betaglycanplasmid-DNA transfiziert. Transfektionen wurden unter optimierten Bedingungen unter Verwendung des im Handel erhältlichen Superfect Transfection Reagent (Qiagen; Hilden, Deutschland) durchgeführt. Nach einem Inkubationszeitraum von 2,5 h wurden die Zellen mit Medium, das 2% FBS enthielt, gewaschen und sich für 5 Stunden erholen gelassen. Die Zellen wurden mit Inhibin A und/oder Aktivin A für 15 Stunden behandelt und dann in Lysepuffer (1% Triton X-100, 25 mM Glycylglycin (pH 7,8), 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA und 1 mM DTT) geerntet. Die Luciferase-Reporteraktivität wurde bestimmt, indem auf relative β-GAS-Aktivitäten normalisiert wurde.
Beispiel 4
Immuncytochemie
Normale erwachsene männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten (175–250 g; Harlan Sprague-Dawley) wurden unter Standardbedingungen des Haltens, des Fütterns und der Beleuchtung (23°C, 12 Stunden Licht, 12 Stunden Dunkelheit mit Beleuchtung um 0600 Uhr an) gehalten. Die Immuncytochemie (ICC) wurde durchgeführt, wie es früher beschrieben wurde (MacConell et al., 1998). Kurz ausgedrückt, Ratten wurden tief anästhesiert und transkardial mit 4% Paraformaldehyd perfundiert. Gewebe (Gehirn, Hypophyse, Hoden oder Eierstöcke) wurden entfernt und für 1 Stunde in demselben Fixativum nachfixiert. Gehirne wurden in 10% Saccharose/0,02 M Kaliumphosphat-gepufferter Salzlösung (KPBS) übertragen und über Nacht bei 4°C gelagert. Gefrorene Herzschnitte mit 30 μm wurden an einem Mikrotom in Scheiben geschnitten und freischwimmende Schnitte wurden zur ICC-Analyse wie unten beschrieben bearbeitet. Hypophysen-, Hoden- und Eierstockgewebe wurden in Paraffin eingebettet und 10 μm-Paraffin-Schnitte wurden geschnitten, auf Superfrost Plus Slides (Fisher Scientific) montiert und zur ICC-Analyse bearbeitet. Alle Verfahren, die die Verwendung von Tieren involvieren, wurden entsprechend den Bestimmungen föderaler, staatlicher und örtlicher Gesetze und Institutionen und gemäß NIH-Regulierungen durchgeführt.
Um eine Hintergrundfärbung zu reduzieren, wurden Gewebeschnitte für 20 min in 1% H₂O₂ inkubiert und mit KPBS gespült, worauf eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur in KPBS mit 0,3% Triton X-100, 10% normalem Kaninchenserum und 2% BSA folgte. Schnitte wurden mit primären Betaglycan-Antiseren (R&D) bei einer Konzentration von 25 μg/ml in KPBS plus 0,3% Triton-X, 2% normales Kaninchenserum und 2% BSA über Nacht bei 4°C inkubiert (als Kontrolle wurden benachbarte Schnitte nur mit normalem Ziege-IgG oder sekundärem Antikörper inkubiert). Gewebeschnitte wurden dann in KPBS gespült, worauf eine einstündige Inkubation mit einer 1:1.000-Verdünnung von biotinyliertem Kaninchen-anti-Ziege-sekundärem Antikörper (Vektor) bei Raumtemperatur folgte. Mit KPBS gewaschenes Gewebe wurde in einem Avidin-Biotin-Meerrettich-Peroxidasekomplex (Vektor) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Peroxidasereaktion wurde dann als braunes Reaktionsprodukt mit einer 3–5-minütigen Inkubation in einem Gemisch aus 0,03% DAB und 0,015% H₂O₂ in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, sichtbar gemacht. Die freischwimmenden Gehirnsektionen wurden an Superfrost/Plus-Objektträgern (Fisher Scientific) montiert und zur Visualisierung von Immunreaktivität wurde Lichtmikroskopie verwendet.
Beispiel 5
Betaglycan bindet Inhibin mit hoher Affinität und erhöht die Inhibinbindung an ActRII
In dem Verfahren zum Screening auf potentielle Inhibin-bindende Proteine wurde eine Inhibinbindung in Zellen, die Betaglycan exprimieren, detektiert.
1 zeigt, dass isolierte Membranen aus HEK 293-Zellen, die mit Betaglycan transfiziert waren, spezifische Inhibinbindung hoher Affinität [Ki = 0,6 (0,5–0,9) nM] zeigten, wohingegen Membranen aus Zellen, die mit leerem Vektor transfiziert waren, eine nicht detektierbare spezifische Inhibinbindung hatten.
Um die Inhibinbindung in isolierten Membranen aus Zellen, die ActRII exprimieren oder ActRII und Betaglycan coexprimieren, weiter zu charakterisieren, wurden cDNAs, die für diese Rezeptoren codieren, in HEK 293-Zellen transfiziert und es wurden Kompetitionsbindungsassays durchgeführt. Die Inhibinbindungsaffinität war ziemlich niedrig, wenn ActRII allein exprimiert wurde [Ki = 6,3 nM (2,9–13,4) nM], was mit früheren Resultaten konsistent ist (9), aber etwa 30-fach erhöht, wenn ActRII und Betaglycan coexprimiert wurden [Ki = 0,2 (0,1–0,3) nM] (1B). Darüber hinaus erhöhte eine Coexpression von ActRII und Betaglycan die Zahl der Inhibinbindungsstellen im Vergleich zur Anzahl an Bindungsstellen in Zellen, die ActRII oder Betaglycan allein exprimieren, zwölffach oder sechsfach (siehe 1A). Experimente, die mit Betaglycan und ActRIIB durchgeführt wurden, hatten ähnliche Resultate; allerdings waren die Wirkungen von Betaglycan auf die Erhöhung der Inhibinaffinität und die Zahl der Inhibinbindungsstellen weniger dramatisch (Daten nicht gezeigt). Eine Aktivinbindung an Betaglycan wurde während einer Expression in HEK 293-Zellen nicht detektiert. Betaglycan erhöhte auch die Bindung von Aktivin an ActRII nicht (Daten nicht gezeigt), was anzeigt, dass Betaglycan die Inhibinbindung nicht mittels Erhöhung der AktRII-Expression verstärkt.
Beispiel 6
Kovalente Vernetzung von Inhibin mit Betaglycan und kovalente Vernetzung von Inhibin mit dem ActRII-Betaglycan-Komplex
Um zu bestimmen, ob Inhibin zur Bindung und Bildung eines Komplexese mit Betaglycan, das entweder mit oder ohne ActRII exprimiert wird, fähig ist, wurden beide Rezeptoren in HEK 293-Zellen exprimiert. Die Zellen wurden mit [¹²⁵I]-Inhibin, gefolgt von dem kovalenten Vernetzungsreagenz Disuccinylsuberat (DSS), behandelt. Vernetzte Inhibin-Rezeptorkomplexe wurden dann mit einem Antikörper immunpräzipitiert, der gegen das ActRII myc-Epitop der extrazellulären Domäne von Betaglycan gerichtet ist. Die vernetzten immunpräzipitierten Komplexe wurden durch SDS-PAGE getrennt und durch Autoradiografie sichtbar gemacht.
2A zeigt die Resultate eines solchen Vernetzungsexperiments, in dem die Zellen entweder mit Vektor allein (Bahn 1), ActRII allein (Bahn 2), Betaglycan allein (Bahnen 3–6) oder Betaglycan und ActRII zusammen (Bahn 7–10) transfiziert wurden. Eine Vernetzung mit [¹²⁵I]-Inhibin lieferte keine sichtbaren Komplexe bei SDS-PAGE-Analyse in Zellen, die mit leerem Vektor transfiziert waren (2A, Bahn 1). Ein kovalenter Komplex mit etwa 75–85 kDa wurde in Zellen detektiert, die mit ActRII allein transfiziert waren (2A, Bahn 2), eine Größe, die mit früher beschriebenen vernetzten Komplexen von Inhibin/Aktivin-ActRII konsistent ist (8, 9, 18, 19). Eine Vernetzung von [¹²⁵I]-Inhibin mit Zellen, die mit Betaglycan allein transfiziert waren, lieferte einen Komplex mit etwa 110 kDA und eine weitere diffuse Bande bei 175–250 kDa (2A, Bahn 3). Frühere Experimente mit [¹²⁵I]-TGF-β, vernetzt mit Betaglycan, zeigten Komplexe mit ähnlicher Mobilität (27, 28), die das Betaglycan-Kernprotein (~110 kDa) und Betaglycan mit Glycosaminglycan-Ketten (200–300 kDa) repräsentieren. Daher enthalten die Banden, die nach Inhibinmarkierung gesehen werden, die vorhergesagten Formen von Betaglycan.
Bereits früher wurden ähnliche hochmolekulargewichtige Inhibinkomplexe desselben Größenbereichs wie die, die in Zellen vorliegen, die Betaglycan exprimieren, beschrieben (5, 24, 38). Der Zusatz von 25 nM unmarkiertem Inhibin oder 5 nM unmarkiertem TGF-β verhinderte eine Vernetzung von Inhibin mit Betaglycan (2A, Bahnen 4 und 6). Dagegen hatte 25 nM unmarkiertes Aktivin keine Wirkung (2A, Bahn 5). Diese Resultate stimmen mit dem Fehlen von Affinität für dieses Proteoglycan bei Aktivin und der Möglichkeit, dass Betaglycan die α-Untereinheit von Inhibin bindet, überein. Die Fähigkeit von TGF-β, eine Inhibin-Vernetzung zu blockieren, zeigt, dass die Bindungsstelle für Inhibin mit wenigstens einer der TGF-β-Bindungsstellen an Betaglycan überlappt.
Wenn ActRII und Betaglycan coexprimiert werden, waren die Level an Inhibin-vernetzten Rezeptorkomplexen drastisch erhöht und es traten kovalente Komplexe zwischen [¹²⁵I]-Inhibin und ActRII und Betaglycan auf (2A, Bahn 7). Inhibin-markierte Komplexe im erwarteten Größenbereich für Betaglycan wurden co-immunpräzipitiert mit einem Anti-myc-Antikörper, der gegen ActRII gerichtet war (2A, Bahn 7), was einen Beweis dafür liefert, dass Inhibin, ActRII und Betaglycan unter Bildung eines oligomeren Inhibinrezeptorkomplexes wechselwirken. Das Vorliegen von 25 nM unmarkiertem Inhibin blockierte [¹²⁵I]-Inhibinmarkierung sowohl von ActRII als auch von Betaglycan in Zellen, die beide Rezeptoren exprimieren, vollständig (2A, Bahn 8). Dagegen hatte der Zusatz von 25 nM Aktivin oder 5 nM TGF-β geringe Wirkung auf die Intensität der Banden, die mit [¹²⁵I]-Inhibin markiert waren (2A, Bahnen 9 und 10). Die Unfähigkeit von unmarkiertem TGF-β, eine Inhibinvernetzung mit Betaglycan, das mit ActRII coexprimiert wird, zu blockieren, steht in Übereinstimmung mit dem Vorliegen eines ActRII/Betaglycan-Komplexes, der Inhibin, nicht aber TGF-β bindet.
Zusätzlich zu seiner Fähigkeit, einen vernetzten Komplex mit rekombinantem Betaglycan und ActRII in transfizierten Zellen zu bilden, bindet Inhibin und bildet vernetzte Komplexe mit endogenem Betaglycan und ActRII in der Eierstockmauszelllinie KK-1 (2B) (38). Diese Komplexe können nach Immunpräzipitation entweder mit anti-Betaglycan-Antiserum (Bahn 2) oder anti-ActRII-Antiserum (Bahn 4) sichtbar gemacht werden. Die Bildung von markierten Komplexen wird durch Inkubierung mit einem Überschuss an unmarkiertem Inhibin A blockiert (2B). Immunpräzipitierte Komplexe umfassen das Betaglycan-Kernprotein, Betaglycan mit Glycosaminglucanketten und ActRII, während der Aktivin-Typ I-Rezeptor Alk4 in dem Komplex nicht vorliegt (2B). Eine Markierung von KK-1-Zellen mit ¹²⁵I-Aktivin, gefolgt von einer Vernetzung und Immunpräzipitation mit anti-Betaglycan-Antikörpern, beweist, dass endogenes Betaglycan keinen kovalenten Komplex mit Aktivin bildet (Bahnen 7 und 9).
Wenn Aktivin-vernetzte Zellen mit anti-ActRII-Antikörper immunpräzipitiert werden, werden ActRII und Alk4, nicht aber Betaglycan, sichtbar (Bahn 9).
Beispiel 7
Expression von Betaglycan in auf Inhibin ansprechenden Geweben
Wesentliche Anhaltspunkte implizieren Inhibin als einen bedeutenden parakrinen/autokrinen Regulator, der hypothalmischen-Hypophysen-gonadalen Achse (39). Daher wurde eine Immuncytochemie verwendet, um zu bestimmen, ob die gewebespezifische Verteilung von Betaglycanprotein mit der von Geweben übereinstimmt, die als auf Inhibin ansprechend dokumentiert sind. Trotz der Tatsache, dass Betaglycan als TGF-β-Rezeptor seit einiger Zeit bekannt ist, bleibt die Gewebeverteilung von Betaglycan in vivo überraschenderweise weitgehend ungeklärt. Die immuncytochemische Lokalisierung von Betaglycan im normalen Erwachsenen-Rattengehirn, der Hypophyse, den Eierstöcken und den Hoden, ist in 3 zusammengefasst.
Vielleicht ist die am besten bekannte Funktion von Inhibin seine selektive Inhibierung der Hypophysenvorderlappen-FSH-Sekretion (1, 40–42). Wie in 3B gezeigt ist, wurde entsprechend der Rolle von Betaglycan bei der Vermittlung der Inhibin-Antwort starke Betaglycan-ir in einem Untersatz von Zellen in Hypophysenhinterlappen der normalen erwachsenen männlichen Ratte beobachtet, das eine vornehmlich cytoplasmische Lokalisierung aufweist. Diese Betaglycan-immunpositiven Zelltypen im Hypophysenvorderlappen können Gonadotrope und Laktotrope darstellen, da diese Hypophysenzelltypen Haupt-Inhibin- und TGF-β-Targets sind (43–45). Interessanterweise wurde auch eine intensive Betaglycan-ir in der Mehrheit von Zellen im Zwischenlappen der Hypophyse gefunden (3C). Obgleich ein Inhibineffekt auf Zellen in diesem Lappen nicht dokumentiert wurde, wurde berichtet, dass TGF-β₁ zusammen mit den Melanotropen des Zwischenlappens lokalisiert ist, was anzeigt, dass es eine Rolle bei der Regulierung dieses Zelltyps spielt (46). Eine positive Immunfärbung für Betaglycan wurde im Hypophysenhinterlappen nicht detektiert (3C).
In den Hoden wird eine moderate Betaglycanimmunfärbung in den Ratten-Leydig-Zellen beobachtet, wobei es keine erkennbare Färbung für Betaglycan in den Sertoli- oder Keimzellen gibt, die in einem beliebigen Stadium sichtbar sind (3D). Außerdem färbte sich das Interstitium der Epididymis Betaglycan-positiv (3E). Die Immunlokalisierung von Betaglycan in Leydig-Zellen ist mit der Tatsache, dass Inhibin, das durch testikuläre Sertoli-Zellen sezerniert wird, lokal zur Modulierung der Steroidogenese in Leydig-Zellen wirkt (47, 48), und mit der Tatsache, dass Inhibin-spezifische Bindungsstellen für diesen Zelltyp lokalisiert wurden (49), konsistent. Allerdings war das Fehlen von Färbung an Keimzellen hinsichtlich der berichteten Effekte von Inhibin auf die Gametogenese etwas unerwartet (50, 51).
Eine positive Immunfärbung auf Betaglycan im Eierstock wurde in Granulosa-, thekalen und interstitialen Zellen beobachtet (3F). Wie bei den Befunden im Hoden stimmt diese Lokalisierung mit dokumentierten Inhibinwirkungen auf Androgenproduktion durch thekale Rattenzellen überein (47).
Im Gehirn der erwachsenen männlichen Ratte wurden Betaglycan-immunreaktive (ir) Fasern in der Tenia Tecta des Vorderhirns beobachtet (3A). Betaglycan-ir-Fasern wurden auch im septalen hippocampalen Nucleus des Rattenvorderhirns detektiert (Daten nicht gezeigt). Bemerkenswerterweise stimmt diese zentrale Lokalisierung von Betaglycan in der Tenia Tecta mit dem Vorliegen von Inhibin/Aktivin-α- und -βA-Untereinheit-mRNA in derselben Region überein (52). Daher ist es möglich, dass reifes Inhibin, das in dieser Gehirnregion sezerniert wird, mit ähnlich lokalisiertem Betaglycan wechselwirkt. Während die α-, βA- und βB-Untereinheitproteine und mRNAs im rostrocaudalen Bereich des Rattenhirns (wenn auch bei niedrigen Konzentrationen) weit verteilt sind, war die Detektion von Betaglycan-ir-Fasern auf diese zwei Gehirnregionen beschränkt und in keinem Bereich des Rattengehirns wurde eine perikaryale Färbung auf Betaglycan beobachtet. Es ist möglich, dass eine Expression von Betaglycan in anderen Gehirnregionen unter den Detektionsleveln der Immuncytochemie sein kann, und zwar infolge der geringen Translation, des schnellen Proteinabbaus oder des schnellen Transports des Proteins, was anzeigt, dass eine Colchicinbehandlung von Ratten notwendig sein kann, um auf Betaglycan immunpositive Zellkörper sichtbar zu machen. Es ist auch möglich, dass verwandte Inhibin-Rezeptorkomponenten, die sich von Betaglycan unterscheiden, in diesen Regionen exprimiert werden, wobei sie eine ähnliche Funktion wie die von Betaglycan zur Vermittlung von Inhibinantworten durchführen.
Beispiel 8
Betaglycan vermittelt einen funktionellen Antagonismus der Aktivin-Signalisierung in corticotropen und Eierstockzelllinien
Obgleich viele Aktivinantworten durch Inhibin stark blockiert werden, gibt es auch Fälle, in denen Inhibin keine messbare Wirkung auf die Aktivinantwort hat (5, 6, 53, 54). Bei K562-Erythroleukämiezellen, die ActRII übererprimieren, wurde zum Beispiel gezeigt, dass eine Aktivin-vermittelte Induktion des 3TPLux-Reporterplasmids durch den Zusatz hoher Konzentrationen an Inhibin nicht beeinflusst wird (5). Die Fähigkeit von Aktivin A, eine Basal-ACTH-Sekretion in der corticotropen Zelllinie AtT20 zu unterdrücken, wurde früher beschrieben, wobei in ähnlicher Weise gefunden wurde, dass Inhibin keine Wirkung auf die Aktivinantwort hat (6).
Um direkt zu testen, ob Betaglycan die Fähigkeit von Inhibin, eine Aktivin-Signalisierung zu blockieren, vermitteln kann, wurden Ratten-Betaglycan-cDNA und das 3TPLux-Reporterplasmid in AtT20-Zellen transfiziert, um zu bestimmen, ob Betaglycan diesen Zellen Ansprechbarkeit für Inhibin verleihen kann. Nach Transfektion wurde die resultierende Fähigkeit von Inhibin, eine Aktivin-Induktion von Luciferase zu blockieren, gemessen.
4A zeigt, dass, wenn AtT20-Zellen entweder mit leerem 3TPLux-Vektor oder 3TPLux-Vektor, der die Betaglycan-cDNA exprimiert, cotransfiziert werden, steigende Konzentrationen an Aktivin A in einer dosisabhängigen Erhöhung der 3TPLux-Aktivität resultieren. Wenn die Zellen allerdings zusätzlich mit 2,5 nM Inhibin behandelt werden, ist die Aktivin-Antwort in Betaglycan-transfizierten Zellen wesentlich verringert, während die Aktivin-Anwort in Zellen, die mit leerem Vektor transfiziert sind, durch Inhibin unbeeinflusst ist (4A).
Um die Dosisabhängigkeit dieses Betaglycan-vermittelten Inhibineffekts zu messen, wurden Zellen erneut mit leerem Vektor oder 3TPLux-Plasmid, das Betaglycan enthält, transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden mit einem Konzentrationsbereich an Inhibin A (4B) sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von 1 nM Aktivin A behandelt. Wie in 4B gezeigt ist, ist die Fähigkeit von Inhibin, eine Aktivin-Induktion von 3TPLux zu inhibieren, dosisabhängig und erfordert Betaglycan. Der Effekt von Inhibin in Zellen, die Betaglycan exprimieren, war konzentrationsabhängig, und zwar bei einem geschätzten IC50-Wert von 8–10 pM Inhibin (4B).
Die Effekte von Betaglycan auf das Inhibin-Ansprechen von zwei zusätzlichen Zelllinien wurden getestet. Während festgestellt wurde, dass die Eierstockzelllinie KK-1 schwach Inhibin-ansprechend ist (Daten nicht gezeigt), wurden KK-1-Zellen, die mit Betaglycan cDNA transfiziert waren, gegenüber Inhibin hochempfindlich. Aktivin-induzierte 3TPLux-Aktivität wurde durch Cobehandlung mit Inhibin blockiert (4C). In K562-Erythroleukämiezellen, die Aktivinrezeptoren überexprimieren (KAR6), ist eine Aktivin-vermittelte Induktion des 3TPLux-Reporterplasmids durch den Zusatz von hohen Konzentrationen an Inhibin in großem Umfang unbeeinflusst (5). 4D zeigt, dass KAR6-Zellen auch eine Inhibin-abhängige Reduktion der Aktivin-induzierten Luciferase-Reporteraktivität nach Transfektion mit Betaglycan-cDNA zeigten, nicht aber nach Transfektion mit leerem Vektor.
Zusammen mit den Bindungs- und Vernetzungsresultaten stützen diese Resultate ein Modell, in dem Betaglycan als Inhibinrezeptor wirkt, um eine Inhibinbindung an ActRII zu erleichtern, wodurch der Zugang von Aktivin zu ActRII beschränkt wird und eine Aktivin-Signalisierung antagonisiert wird. Es ist erwähnenswert, dass, obgleich die geschätzte Affinität von Inhibin für Betaglycan/ActRII ungefähr 200 pM war, der Bereich der IC50-Werte (5–50 pM) für Inhibin-Antworten der drei getesteten Zelltypen in funktionellen Experimenten viel niedriger war. In einigen Experimenten unterdrückte eine Überexpression von Betaglycan eine Aktivin-induzierte Reporteraktivität in Abwesenheit von zugesetztem Inhibin variabel, was nahelegt, dass Betaglycan mit ActRII in Abwesenheit von Inhibin wechselwirken könnte, um eine Aktivin-Signalisierung zu stören. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass es möglich ist, dass der Inhibin/ActRII/Betaglycan-Komplex auch neue Signale initiieren könnte, die sich von denen unterscheiden, die durch Aktivin induziert werden, um Inhibin-Antworten zu erzeugen, die von Aktivin oder seinem Rezeptorkomplex unabhängig sind.
Beispiel 9
Anti-Betaglycan-Antiserum-Experimente
Um die mögliche physiologische Bedeutung von endogenem Betaglycan bei der Vermittlung einer Inhibin-Wirkung zu untersuchen, wurden Antikörper gegen einen Teil der extrazellulären Domäne von Betaglycan erzeugt und der Effekt dieser Antikörper auf die biologische Antwort auf Inhibin wurde untersucht. Anti-Betagylcan-Antiserum (Ab-BG) wurde in Kaninchen gegen eine Sequenz erzeugt, von der vorher beschrieben worden war, dass sie Antikörper liefert, die fähig sind, eine Betaglycan-abhängige TGF-β-Signalisierung zu blockieren (34). 5 zeigt, dass Inhibin die FSH-Sekretion auf etwa 30% derjenigen, die für eine Kontrolle oder für mit normalem Kaninchenserum (NRS) behandelte Zellen gemessen wird, reduziert. Der Zusatz von Ab-BG kehrt diesen Inhibineffekt in dosisabhängiger Weise um, während normales Kaninchenserum (NRS), das in äquivalenten Dosen zugesetzt wurde, keine Wirkung hatte. Diese Daten zeigen, dass eine Betaglycan-Immunneutralisation die Fähigkeit von Inhibin, eine FSH-Sekretion aus primären Hypophysenzellen zu unterdrücken, inhibiert. Dies stützt die Hypothese, dass Betaglycan oder ein immunologisch verwandtes Protein bei der Wirkung von Inhibin auf die Hypophyse involviert ist.
Beispiel 10
Ein mögliches Model für Inhibin-Wechselwirkungen mit Betaglycan und ActRII
Verschiedene Wachstumsfaktoren und Zytokine erfordern Zelloberflächenproteoglycane, um Zugang zu ihren entsprechenden Signalisierungsrezeptoren zu erhalten und biologische Antworten auszuüben (55). Die hier präsentierten Daten stimmen mit einem Modell überein (6), in dem der Inhibin/Betaglycan-Komplex mit Aktivin um Zugang zu ActRII konkurriert. Dies kann die Bildung des Aktivin/ActRII-Komplexes verhindern, der für die nachfolgende Rekrutierung von ALK4 und die Initiierung der Aktivin-Signalisierungskaskade erforderlich ist. Dieses Modell ist dem für die TGF-β-Signalisierung in Bezug auf den Mechanismus, nicht aber in Bezug auf die Folge, ähnlich, wobei bei letztgenanntem angenommen wird, dass Betaglycan TGF-β an der Zelloberfläche konzentriert und es seinem verwandten Typ II-Rezeptoren präsentiert, um eine Signalisierung zu verstärken (56). Die kürzlich vorgeschlagene Rolle für das Proteoglycan Mahogany für die Erleichterung der Bindung des MSH-Antagonisten, Agouti für den MSH-Rezeptor (57, 58) könnte den Effekten von Betaglycan auf die Inhibinwirkung, die hier beschrieben werden, am stärksten analog sein.
Die folgenden Literaturstellen wurden hier zitiert:

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Patente oder Publikationen, die in dieser Beschreibung erwähnt wurden, sind ein Hinweis für den Level des Fachwissens eines Fachmanns auf dem Gebiet, das die Erfindung betrifft.
Ein Fachmann wird leicht erkennen, dass die vorliegende Erfindung zur Lösung der Aufgaben und zur Erreichung der genannten Ziele und Vorzüge wie auch dem darin Inhärenten angepasst ist. Die vorliegenden Beispiele sind zusammen mit den Methoden, Verfahren, Behandlungen, Molekülen und spezifischen Verbindungen, die hierin beschrieben wurden, derzeit repräsentativ für bevorzugte Ausführungsformen, sind beispielhaft und sollen den Rahmen der Erfindung nicht beschränken.

Claims

Verwendung einer Verbindung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antiserum oder für Betaglykan spezifische Antisense-Nukleinsäure, welche die Bildung von Inhibin/Betaglykan-Komplexen auf der Oberfläche einer Zelle inhibiert, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verstärkung von Aktivin-induziertem Signalisieren in genannter Zelle.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die genannte Verbindung ein Anti-Betaglykan-Antiserum darstellt, das gegen ein extrazelluläres Epitop von Betaglykan gerichtet ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die genannte Verbindung ein Antisense-Transkript von Betaglykan darstellt.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die genannte Zelle eine Hypophysenzelle darstellt.
Verwendung nach Anspruch 4, worin die genannte Verstärkung der Aktivin-Signalisierung die Bildung von follikelstimulierendem Hormon (FSH) durch die genannte Zelle steigert.
Verwendung nach Anspruch 5, worin die genannte Verstärkung der Aktivin-Signalisierung die Fertilität fördert.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die genannte Verstärkung der Aktivin-Signalisierung einen pathophysiologischen Zustand in genannter Zelle lindert.
Verwendung nach Anspruch 7, worin der genannte pathophysiologische Zustand aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Reproduktions- und Entwicklungsstörungen, dermatologischen, ossären, hepatischen, hämatopoetischen und zentralnervösen Erkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 8, worin der genannte pathophysiologische Zustand ein Prostatakarzinom darstellt.
Antiserum, das gegen die Aminosäurereste 154–439 von Betaglykan gerichtet ist, worin das genannte Antiserum die Bindung von Inhibin an Betaglykan inhibiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Antiserum nach Anspruch 10 und einen pharmazeutischen Träger.
Verfahren zum Screening auf eine Verbindung, welche die Bildung von Inhibin/Betaglykan-Komplexen zur Verstärkung der Aktivin-Signalisierung inhibiert, umfassend die Schritte von: a) Inkubation von Membranen aus Betaglykan-exprimierenden Zellen sowohl in Anals auch Abwesenheit der genannten Verbindung; b) Durchführung eines Assays, der die Bindung von Inhibin an Betaglykan misst; c) Vergleich der Ergebnisse von genanntem Assay an mit genannter Verbindung inkubierten Zellen mit unbehandelten Zellen, worin eine Verbindung, welche die Bildung von Inhibin/Betaglykan-Komplexen inhibiert, zu niedrigeren Niveaus der Inhibinbindung führt.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die genannte Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Peptiden, Proteinen und kleinen Molekülen.
Verfahren nach Anspruch 12, worin der genannte Assay ein kompetitiver Bindungsassay zwischen markiertem und nicht markiertem Inhibin darstellt.
Verfahren zum Screening auf eine Verbindung, welche die Bildung von Inhibin/Betaglycan-Komplexen zur Inhibition der Aktivin-Signalisierung verstärkt, umfassend die Schritte von: a) Inkubation von Membranen aus Betaglykan-exprimierenden Zellen sowohl in Anals auch Abwesenheit der genannten Verbindung; b) Durchführung eines Assays, der die Bindung von Inhibin an Betaglykan misst; c) Vergleich der Ergebnisse von genanntem Assay an mit genannter Verbindung inkubierten Zellen mit unbehandelten Zellen, worin eine Verbindung, welche die Bildung von Inhibin/Betaglykan-Komplexen verstärkt, zu höheren Niveaus der Inhibinbindung führt.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die genannte Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Peptiden, Proteinen und kleinen Molekülen.
Verfahren nach Anspruch 15, worin der genannte Assay ein kompetitiver Bindungsassay zwischen markiertem und nicht markiertem Inhibin darstellt.