WO2006098520A1 - スクリーニング方法 - Google Patents

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receptor
ligand
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Hidetoshi Komatsu
Yasuaki Itoh
Masaaki Mori
Minoru Maruyama
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a medicine and a screening kit using the GPR52 receptor and a ligand having the ability to specifically bind to the GPR52 receptor, a screening method or a kit obtainable by the kit.
  • a screening method such as a preventive / therapeutic agent for psychiatric disorders and prolactin-related diseases, a screening kit and the like.
  • G protein-coupled receptor is a seven-transmembrane receptor that transmits signals from hormones, neurotransmitters, site force-in and other molecules into the cell membrane.
  • Reserpine (following formula) is an alkaloid contained in Rauwoliiaserpentina- and is known to have a central inhibitory effect and a hypotensive effect (Am. J. Chin. Med. 7 ⁇ , 197-236 P., 1979), used to improve schizophrenia, antipsychotic, antihypertensive, sedative.
  • MeO Methoctramine (formula) is known as an antagonist of muscarinic acetylcholine receptor M2 (Eur. J.
  • [1] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof; and (b) specific to the protein or a salt thereof.
  • a method for screening a compound or salt thereof that changes the binding property of the protein or salt thereof and the ligand, wherein a ligand having the ability to bind to the ligand is used.
  • ring and ring ⁇ are each a benzene ring optionally having a substituent
  • Ring C is an optionally substituted 6-membered ring
  • Ring D is an optionally substituted 5- to 7-membered nitrogen-containing heterocyclic ring
  • Ring E is an optionally substituted 5- to 7-membered ring].
  • ring Da is a 6-membered nitrogen-containing heterocyclic ring which may have a substituent
  • ring Ea is a 6-membered ring which may have a substituent
  • Ring A and Ring B are as defined above] or a salt thereof, the screening method according to the above [3],
  • Mecamine compounds have the formula
  • R 1 and R 2 are each a hydrocarbon group which may have a substituent, and X represents a spacer] or a salt thereof (hereinafter referred to as compound (II).
  • compound (II) A screening method according to [6] above, [8] the screening method according to [6] above, wherein the methtolamine compound is methotramine,
  • [1 0] (a) It has the ability to specifically bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a partial peptide or salt thereof.
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a partial peptide or salt thereof When the ligand is contacted with the protein or its partial peptide or its salt; and (b) when the ligand and test compound are contacted with the protein or its partial peptide or its salt.
  • [1 1] (a) It has the ability to specifically bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a partial peptide or salt thereof.
  • a ligand is brought into contact with a cell containing the protein or its partial peptide or a salt thereof or a membrane fraction of the cell; and (b) the ligand and a test compound are combined with the protein or its partial peptide. Or a cell containing the salt or of the cell.
  • SEQ ID NO: 1 A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof encodes the protein, a partial peptide, or a salt thereof.
  • [15] (a) Has the ability to specifically bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a partial peptide or salt thereof A ligand is brought into contact with a cell containing the protein or its partial peptide or a salt thereof, or a membrane fraction of the cell; and (b) the ligand and a test compound are combined with the protein or its partial peptide. Or measuring and comparing the cell stimulating activity via the protein or a partial peptide or a salt thereof when contacted with a cell containing the salt or a membrane fraction of the cell; Screening method
  • [17a] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof or a salt thereof; and (b) the protein or a salt thereof.
  • [17b] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof, and (b) the protein or a salt thereof A ligand that has the ability to specifically bind to a protein, or a compound or salt thereof that changes the binding property of the protein or salt thereof. Screening method,
  • [1 8] (a) Ability to specifically bind to a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide or salt thereof.
  • Cell stimulation activity via the protein or its partial peptide or salt thereof is measured and compared, or (ii) the test compound is added to the cell containing the protein or its partial peptide or its salt. It is characterized by measuring a cell stimulating activity via the protein or a partial peptide or a salt thereof when contacted.
  • SEQ ID NO: In the presence of a ligand having the ability to specifically bind to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof, When the test compound is brought into contact with a cell containing the protein or a partial peptide thereof or a salt thereof, the cell stimulating activity via the protein or the partial peptide or the salt thereof is measured.
  • [20] (a) a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a salt thereof, and (b) specifically binding to the protein, white protein or a salt thereof
  • [20a] A compound or a salt thereof obtainable by using the screening method described in [1] above or the screening kit described in [20] above, or [20b] the compound is represented by SEQ ID NO: 1.
  • [20a] above which is a compound or a salt thereof that inhibits the binding between a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as shown, a partial peptide thereof, or a salt thereof and a ligand. Or a salt thereof,
  • SEQ ID NO: 1 A compound containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof, which inhibits the binding of the ligand or a salt thereof
  • a medicine comprising
  • [2 0 f] A prophylactic / therapeutic agent for schizophrenia or cognitive impairment, comprising the compound of the above [2 0 c] or a salt thereof, [20 g] An agent for preventing and / or treating Parkinson's disease comprising the compound of the above [20] or a salt thereof,
  • SEQ ID NO: comprising a compound or a salt thereof that promotes the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof Preventive or therapeutic agent for schizophrenia or cognitive impairment,
  • [2 2] containing a compound or a salt thereof that promotes the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof, or a salt thereof.
  • Prolactin secretion failure prevention and treatment agent a compound or a salt thereof that promotes the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof, or a salt thereof.
  • [2 3] A compound or a salt thereof that inhibits the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof or a salt thereof Parkinson's disease prevention and treatment,
  • [2 4] comprising a compound or a salt thereof that inhibits the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof.
  • a ligand having the ability to specifically bind to a protein or salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • Schizophrenia characterized by promoting the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof Prevention and treatment of cognitive impairment,
  • Prolactin secretion deficiency characterized by promoting the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof.
  • Prevention / treatment [2 8] Prevention of Parkinson's disease characterized by inhibiting the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof ⁇ Treatment,
  • a hyperprolactin blood which inhibits the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a partial peptide thereof, or a salt thereof Prevention and treatment of illness,
  • a method of preventing or treating schizophrenia or cognitive impairment comprising administering to a mammal an effective amount of a compound that promotes the activity of the salt or a salt thereof,
  • Prolactin secretion deficiency prevention / treatment method characterized by administration to animals
  • SEQ ID NO: 1 An effective amount of a compound or salt thereof that inhibits the activity of a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof Hyperprolactinemia prevention and treatment, characterized by administration to animals
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, for the manufacture of a prophylactic / therapeutic agent for hyperprolactinemia The use of a compound or its salt that inhibits and harms the activity of the salt is provided.
  • a protein or a salt thereof comprising an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5;
  • a recombinant vector containing exogenous DNA encoding the protein described in (1) above or a mutant DNA thereof, which can be expressed in non-human animals (19) described in (1) above A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA encoding the protein is inactivated,
  • a protein containing the same amino acid sequence or a partial peptide or salt thereof may be abbreviated as “receptor of the present invention” or “protein of the present invention”.
  • the ligand having the ability to specifically bind to the receptor of the present invention is sometimes abbreviated as “the ligand of the present invention”.
  • the present invention provides:
  • test compound is brought into contact with the receptor cell membrane fraction of the present invention, and the activity of promoting GPRs binding to the receptor cell membrane fraction of the present invention is measured.
  • Agonis ⁇ scribing method
  • a test compound is contacted with a receptor-expressing cell of the present invention containing a labeled arachidonic acid, and the release activity of the arachidonic acid metabolite is measured. Screening method,
  • Intracellular calcium concentration when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention and when the ligand of the present invention and a test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention A method for screening a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention, characterized by measuring and comparing the ascending activity;
  • test compound is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, and the intracellular calcium A method for screening agonis for the receptor of the present invention, characterized by measuring a concentration-increasing activity,
  • the ligand of the present invention When the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence of labeled inositol, the ligand of the present invention and the test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention.
  • a method for screening a compound that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention, characterized in that inositol triphosphate production activity is measured and compared.
  • test compound is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence of labeled inositol, and the inositol triphosphate production activity is measured.
  • test compound is contacted with a receptor-expressing cell of the present invention into which a TRE-repo overnight gene vector has been introduced, and the enzyme activity of the reporter gene protein is measured.
  • Agonis ⁇ screening method for receptors Agonis ⁇ screening method for receptors,
  • a test compound is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence of ( ⁇ ′)-labeled rubidium, and the efflux activity of the labeled rubidium is measured.
  • (I) When the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, and the ligand of the present invention and the test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention.
  • a method for screening a compound that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention, wherein the pH change in the extracellular fluid is measured and compared
  • test compound is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, and the extracellular fluid p
  • a method for screening agonis for the receptor of the present invention characterized by measuring H change
  • a receptor-expressing yeast of the present invention into which a histidine synthesis gene has been introduced is cultured in a histidine-deficient medium, contacted with the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound, and the growth of the yeast is measured.
  • a screening method for a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is measured.
  • the receptor-expressing yeast of the present invention into which a histidine synthesis gene is introduced is cultured in a histidine-deficient medium, contacted with a test compound, and the growth of the yeast is measured.
  • the screening method of the agonist against the body is measured.
  • test compound is contacted with the acceptor gene RNA-introduced African frog oocyte of the present invention, and the change in cell membrane potential is measured, and the screen of Agonis ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ for the receptor of the present invention is used.
  • test compound is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, and the degree of internalization of the receptor is measured, and the script of an agonist for the receptor of the present invention is measured. It also provides a method of training.
  • a compound or salt thereof that promotes or inhibits the activity of the receptor of the present invention eg, GPR52
  • a compound or salt thereof that promotes or inhibits the expression of the gene of the receptor of the present invention screening of the present invention
  • Compounds or salts thereof eg, GPR52agonis®, GPR52 enzyme
  • mental disorders eg, schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, Panic disorder, phobic disorder, drug-induced psychotic disorder, delusional psychosis, neuroleptic drug-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinsonian symptom group, extrapyramidal symptoms, etc.
  • prolactin-related diseases eg, high prolactin (Eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy), pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormalities, prolactin content Insufficiency (eg, ovarian hypofunction, semi
  • a compound or a salt thereof that promotes the activity of the receptor of the present invention a compound or a salt thereof that promotes the expression of the gene of the receptor of the present invention, an agonist for the receptor of the present invention, a ligand for the receptor of the present invention, etc.
  • Increases the intracellular cAMP concentration of neurons expressing the receptor of the present invention eg, GPR52
  • GPR52 a receptor for the present invention
  • it can suppress overactivity of the dopamine pathway and improve the positive symptoms of schizophrenia.
  • it can improve cerebral cortex ⁇ DA-type receptor functional decline, which is one of the causes of schizophrenia negative symptoms and cognitive impairment, and can improve schizophrenia negative symptoms and cognitive impairment. Therefore, the above-mentioned compounds or salts thereof, agonists, ligands and the like are preferably useful as prophylactic / therapeutic agents for schizophrenia and cognitive impairment.
  • a compound or a salt thereof that promotes the activity of the receptor of the present invention a compound or a salt thereof that promotes the expression of the gene of the receptor of the present invention, an agonist for the receptor of the present invention, a ligand for the receptor of the present invention can promote the secretion of oral lactin, so it is useful as a preventive / therapeutic agent for prolactin secretion failure (eg hypoovulation, seminal vesicle development, climacteric disorder, hypothyroidism, etc.) is there.
  • prolactin secretion failure eg hypoovulation, seminal vesicle development, climacteric disorder, hypothyroidism, etc.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the receptor of the present invention secretes prolactin.
  • Prolactin hypersecretion eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy), pituitary gland tumor, diencephalon It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for tumors, abnormal menstruation, etc.
  • the receptor of the present invention eg, GPR52 etc.
  • its ligand eg, reserpine, methoctramine etc.
  • a compound having a prophylactic action such as mental illness or a salt thereof.
  • Figure 1 shows the results of examining changes in intracellular Ca 2+ concentration when human GPR52 expression plasmid was transiently expressed in CNGC-E583M / HEK293 cell line and reserpine was added.
  • the vertical axis is the fluorescence intensity indicating intracellular Ca 2+ concentration
  • the horizontal axis is the time elapsed (seconds) after the start of measurement
  • ⁇ is HBSS buffer (Base)
  • B is reserpi
  • 1.0 xM ⁇ is 3.0 M
  • X 10 M
  • ⁇ 30 ⁇
  • ⁇ is ⁇ ⁇ .
  • Fig. 2 shows the results of examining changes in intracellular Ca 2+ concentration when human GPR52 expression plasmid was transiently expressed in CNGC-E583M / HEK293 cell line and methoctamine was added.
  • the vertical axis shows the fluorescence intensity indicating intracellular Ca 2+ concentration
  • the horizontal axis shows the time elapsed (seconds) after the start of measurement
  • ⁇ is HBSS buffer (Base)
  • mouth methoctramine 15 M
  • ⁇ 45 M and ⁇ represent the case of 75 M, respectively.
  • Fig. 3 shows the results of examining the intracellular cAMP concentration increased by reserpine stimulation in CH0 cells stably expressing human GPR52.
  • the vertical axis represents the cAMP increase rate
  • the horizontal axis represents the amount of reserpine added
  • white represents
  • MockCHO cell line black represents GPR52-expressing CH0 cell line, and hatched lines represent TGR5-expressing CH0 cell line.
  • Figure 4 shows the measurement results for the increase in calcium concentration.
  • the vertical axis shows the fluorescence intensity indicating intracellular Ca 2+ concentration
  • the horizontal axis shows the time (minutes) after the start of measurement.
  • 10 M glutamic acid was added, and at the time indicated by the dashed arrow, 0.2 mM mectoamine was added.
  • Figure 5 shows the measurement results for the increase in calcium concentration.
  • the vertical axis shows the fluorescence intensity indicating intracellular Ca 2+ concentration
  • the horizontal axis shows the time (minutes) after the start of measurement.
  • a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used in human warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, hidges, tussins).
  • human warm-blooded animals eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, rabbits, pigs, hidges, tussins.
  • cells eg, retinal cells, hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, spleen 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts , Fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, cysts, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes Spheres, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or progenitors of these cells, stem cells or cancer Or any tissue in which those cells exist, such as the brain, brain regions (eg, retina, olfactory bulb, amygdala, basal ganglia, hippocampus, thalamus), etc.
  • brain regions
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 60% or more, preferably about 70% or more, preferably about 50% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequences having a homology of 80% or more, more preferably about 90% or more include amino acid sequences having a homology of 80% or more, more preferably about 90% or more.
  • the protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has, for example, the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, A protein having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by No. 1 is preferred.
  • Examples of the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • substantially the same activity examples include ligand binding activity and signal information transmission action. “Substantially homogeneous” means that their activities are qualitatively homogeneous. Therefore, activities such as ligand binding activity and signal signaling activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5). However, quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • the receptor of the present invention includes (i) one or more of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 (for example, 1 to 100). About 1, preferably about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10 and even more preferably several (1 to 5) amino acids.
  • SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 Preferably about 1 to 30 amino acids, more preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably several (1 to 5) amino acids
  • SEQ ID NO: No .: 1, SEQ ID NO: 3 or 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50, preferably 1 to An amino acid sequence in which about 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids are substituted with other amino acids
  • SEQ ID NO: 1, sequence 1 or 2 or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 for example, about 1 to 100, preferably about 1 to 50,
  • Specific examples of the receptor of the present invention include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the protein represented by SEQ ID NO: 5. And a protein containing an amino acid sequence.
  • any partial peptide can be used as long as it can be used in a screening method for pharmaceuticals described below.
  • the protein molecules of the present invention those that are exposed to the outside of the cell membrane and have substantially the same quality of ligand binding activity, etc. are used.
  • the extracellular region (hydrophilic site) in the hydrophobic plot analysis It is a peptide containing a portion analyzed to be.
  • a peptide partially containing a hydrophobic site can be used as well.
  • Peptides that contain individual domains can also be used, but peptides that contain multiple domains simultaneously may also be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably among the amino acid sequences constituting the protein of the present invention. Peptides having a sequence of 100 or more amino acids are preferred.
  • substantially the same quality of activity has the same meaning as described above. “Substantially the same quality of activity” can be measured in the same manner as described above.
  • a partial peptide containing the 2nd to 36 1st amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used.
  • the receptor of the present invention and the partial peptide of the present invention have an N-terminal (amino terminal) at the left end and a C-terminal (carboxyl terminal) at the right end according to the convention of peptide labeling.
  • the C-terminus may be carboxy (—C00H), carboxy (—C00 1), amide (—C0NH 2 ) or ester (—C00R).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, alkyl such as isopropyl or n- heptyl
  • C 3 _ 8 consequent opening alkyl such hexyl consequent opening, even if , Phenyl, ⁇ — naphthyl and other C 6 _ 12 aryls, for example, phenyl alkyl such as benzyl, phenethyl, or one naphthyl such as ⁇ — naphthylmethyl — C 7 — such as C ⁇ alkyl!
  • the receptor of the present invention and the partial peptide of the present invention have a carboxy (or strong oxyxylate) in addition to the C-terminus, and those in which strong rupoxy is amidated or esterified are also included in the present invention.
  • the partial peptides of the present invention As the ester in this case, for example, the above C-terminal ester or the like is used.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue is a protecting group (for example, acyl such as formyl, acetyl, etc.) Protected with, Pyroglutamine oxidized N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, Substituents on the side chain of amino acids in the molecule (e.g., -0H, -SH, amino Group, imidazolyl group, indole group, guanidino group, etc.) protected with an appropriate protecting group (eg, acyl, CH alkanoyl such as formyl, acetyl, etc.), or sugar chain is bound Complex proteins such as so-called glycoproteins are also included.
  • acyl such as formyl, acetyl, etc.
  • salts with acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metal salts
  • physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citrate, phosphonic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the ligand having the ability to specifically bind to the receptor of the present invention may be any substance as long as it specifically binds to the receptor of the present invention.
  • the dissociation constant of the binding to the receptor of the present invention is 10 M or less, preferably 2 i M or less, more preferably 1 or less, particularly preferably 2 0 0 ⁇ ⁇ or less, and most preferably 10 0 ⁇ ⁇ Examples include the following.
  • Examples of the ligand of the present invention include reserpine compounds (eg, compound (I) etc.), indole alkaloids, methoctramine compounds (eg, compound (I I) etc.) and the like.
  • reserpine compounds eg, compound (I) etc.
  • indole alkaloids e.g., indole alkaloids
  • methoctramine compounds e.g., compound (I I) etc.
  • Example 175) of 2003-321472 is also used.
  • “substituent” of “optionally substituted benzene ring” represented by ring A or ring B in compound (I) include halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.) , C Bok 3 alkylene O carboxymethyl (eg, main Chirenjiokishi, etc.
  • halogenated alkyl halogenated which may be C 2 _ 6 ⁇ alkenyl, carboxy C 2 _ 6 alkenyl (e.g., 2-carboxyanhydride shell butenyl, 2-force Rupokishi 2 Mechirueparu), optionally halogenated C 2 _ 6 alkynyl, it may be halogenated, but it may also be fused C 3 _ 8 consequent opening alkyl, C 6 _ 14 Ariru (e.g., phenyl, 1 one-naphthyl, 2 one-naphthyl, 2 - Bifue two Lil, 3 - Bifue two Lil, 4 Bifueniri, Le And 2-anthryl), optionally halogenated C Bok 8 an alkoxy, CH alkoxy Ichiriki Lupo two Lou alkoxy (eg, Etokishikaru Boni methyl O carb
  • Kishiruokishi hydroxy, C 6 - 14 7 Riruokishi (eg, Fueniruokishi, 1 one naphthyl old carboxymethyl, 2-Nafuchiruokishi), C 7 _ 16 Ararukiruokishi (eg, Ben Jiruokishi, Fuenechiruokishi etc.), mercapto, optionally halogenated alkylthio, C S - M Ariruchio (eg, phenylene thioether, 1 one naphthylthio, etc. 2 one naphthylthio), ⁇ 7 - 1 6 Ararukiruchio (e.g., benzylthio, etc.
  • C S - M Ariruchio eg, phenylene thioether, 1 one naphthylthio, etc. 2 one naphthylthio
  • ⁇ 7 - 1 6 Ararukiruchio e.g.,
  • Ji carbamoyl such as E Ji carbamoyl
  • c 6 _ 14 Ariru - Power Rubamoiru eg, phenylene carbamoyl, 1 one naphthylcarbamoyl, 2 one Nafuchirukarubamo I le Etc.
  • C 1 i alkoxy rubamoyl eg, methoxycarbamoyl, ethoxycarbamoyl, etc.
  • 5- or 6-membered heterocyclic rubamoyl eg, 2-pyridylcarbamoyl, 3-pyridylcarbamoyl, 4-1pyridylcarbamoyl, 2 - such Choi carbamoylmethyl, 3-Choi two Rukarupamo I le
  • sulfo CH alkylsulfonyl (e.g., methylsul
  • C 6 4 ⁇ Li one Rusuruhoniru eg, Fuenirusuru Honiru, 1-naphthylsulfonyl , 2-naphthylsulfonyl, etc.
  • formamino C ⁇ _ 6 Alkyl Force Lonylamino (eg, Acetylamino), (: 6 _ 14 Alley Lonylamino (eg, Benzylamino, Naphtoylamino, etc.), Alkoxy-Force Lonylamino (eg, Methoxy Carbonylamino, Ethoxy Carbonyla) Mino, propoxy force Lupo Niruamino, butoxy Cal Poni Rua amino etc.), alkyl sulfonyl Ruamino (e.g., methylsulfonyl ⁇ Mino, E chill sulfonyl ⁇ amino etc.), C 6 _ 14
  • C 6 _ 14 aryl rubamoyloxy eg, phenylcarbamoyloxy, naphthylcarbamoyloxy, etc.
  • 5- or 6-membered heterocyclic carbo nyloxy (eg, nicotinoyloxy, isonicotinoyloxy)
  • 5- to 7-membered saturated cyclic amino eg, pyrrolidine monoyl, piperidino, piperazine monoyl, morpholino, thiomorpholino, tetrahydroazepine monoyl, homopiperazine mono 1
  • 5- to 10-membered aromatic heterocyclic groups eg, 2-chenyl, 3-chenyl, 2-furyl, 3-furyl, 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4_pyridyl, 2-quinolyl, 3 —Quinolyl, 4-quinolyl, 5_quinolyl, 8_quinolyl, 1 monoisoquinolyl
  • CH alkyl examples include alkyl having 1 to 5, preferably 1 to 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.).
  • halogen atoms eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.
  • CH alkyl such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, etc.
  • Specific examples include methyl, chloromethyl, difluoromethyl, liquid methyl, trifluoromethyl, ethyl, 2-bromoethyl, 2, 2, 2-trifluoroethyl, pendefluoroethyl, propyl, 3, 3, 3 —Trifluoropropyl, isopropyl, butyl, 4, 4, 4 monotrifluorobutyl, isobutyl, s ec-butyl, tert-butyl, pen, chill, isopentyl, neopentyl, 5, 5, 5—trifluorofluoro And hexyl, 6, 6, 6-trifluoro hexyl and the like.
  • halogen atoms e.g., fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.
  • C 2 _ 6 alkenyl optionally eg, vinyl-, propenyl, isopropenyl, 2-butene one 1 one I le, 4-pentene one 1 one I le, the 5-hexene - such as one Iru) Etc.
  • C 2 _ 6 alkynyl be optionally has 1 to 5
  • halogen atoms e.g., fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.
  • C 2 _ 6 alkynyl be e.g, up port Parugiru, 2 - butyne - 1 - I le, 4 one pentyne - 1 - I le, etc. relaxin one 1 Iru to 5), and the like.
  • Examples include 28-hexyl, 2,2,3,3-tetrafluorocyclopentyl, and 4-cyclohexyl.
  • the "fused c 3 _ 8 cycloalkyl" may be halogenated.
  • the “optionally halogenated alkoxy” may have, for example, 1 to 5, preferably 1 to 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.).
  • Alkoxy eg, methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, pentyloxy, hexyloxy, etc.).
  • Specific examples include, for example, methoxy, difluoromethoxy, ⁇ fluoromethoxy, ethoxy, 2, 2, 2-trifluoroethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, 4, 4, 4 trifluorotrioxy, isobutoxy, sec -Butoxy, pentyloxy, hexyloxy and the like.
  • the “optionally halogenated alkylthio” may have, for example, 1 to 5, preferably 1 to 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.).
  • CH alkylthio eg, methylthio, ethylthio, propylthio, isopropylthio, butylthio, sec-ptylthio, tert-butylthio, etc.
  • Specific examples include methylthio, difluoromethylthio, trifluoromethylthio, ethylthio, propylthio, isopropylthio, butylthio, 4,4,4 trifluorobutylthio, pentylthio, hexylthio and the like.
  • benzene ring means, for example, that the above substituent is 1 at the substitutable position. 5 or preferably 1 to 3, and when the number of substituents is 2 or more, each substituent may be the same or different.
  • Examples of the “substituent” of the “optionally substituted 6-membered ring” represented by ring C include, for example, the “optionally substituted benzene ring represented by ring A above” "Substituent” and the like.
  • the “6-membered ring” may have, for example, one or two of the above substituents at substitutable positions. When the number of substituents is 2, each substituent may be the same or different.
  • Examples of the “5- to 7-membered nitrogen-containing heterocycle” of the “optionally substituted 5- to 7-membered nitrogen-containing heterocycle” represented by ring D include, for example, other than carbon atoms and nitrogen atoms 1 or 2 types selected from a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom, a 5- to 7-membered heterocycle containing 1 to 4 heteroatoms, preferably (i) a 5- to 7-membered nitrogen-containing aromatic heterocycle A ring, (ii) a 5- to 7-membered nitrogen-containing non-aromatic heterocycle, and the like.
  • Examples of the “5- to 7-membered nitrogen-containing aromatic heterocycle” include aromatic heterocycles such as pyrrole, imidazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, and pyridazine.
  • Examples of the “5- to 7-membered nitrogen-containing non-aromatic heterocyclic ring” include pyrrolidine, imidazoline, pyrazolidine, pyrazoline, piperidine, piperazine, morpholine, thiomorpholine and the like.
  • the above “5- to 7-membered nitrogen-containing heterocycle” may have, for example, the above-described substituents at 1-to-3, preferably 1-or 2-positions at substitutable positions. Each substituent may be the same or different.
  • Examples of the “5- to 7-membered ring” of the “optionally substituted 5- to 7-membered ring” represented by ring E include, for example, a 5- to 7-membered allocyclic ring and a 5- to 7-membered heterocyclic ring. Etc.
  • C 5 _ 7 cycloalkane e.g., cyclopentane, cyclohexane, cycloheptane, etc.
  • C 5 _ 7 consequent opening alkenes (e.g., cyclopentene, Shikuropen evening Zhen, Cyclohexene, 1,3-cyclohexagene, 1,4-cyclohexagen, cycl
  • Examples of the “5- to 7-membered heterocyclic ring” include, for example, one or two kinds selected from a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom in addition to a carbon atom, a 5- to 7-membered heterocyclic ring containing 1 to 4 heteroatoms, Preferred examples include (i) a 5- to 7-membered aromatic heterocycle, and (ii) a 5- to 7-membered non-aromatic heterocycle.
  • Examples of the “5- to 7-membered aromatic heterocycle” include aromatic heterocycles such as thiophene, furan, pyrrole, imidazole, pyrazol, pyridine, pyrazine, pyrimidine, and pyridazine.
  • Examples of the above “5- to 7-membered non-aromatic heterocycle” include, for example, tetrahydrofuran, dihydrofuran, pyran, dioxolan, dioxane, azetidine, pyrrolidine, imidazoline, pyrazolidine, pyrazoline, piperidine, piperazine, Examples include morpholine, thiomorpholine, thiazolidine, oxazolidine, oxadiazoline, thiadiazoline, triazoline, 1,4-diazepane, 1,4-oxazepane, 1,4-thiazepane, and the like.
  • the above “5- to 7-membered heterocycle” is preferably a 5- or 6-membered heterocycle (eg, thiophene, furan, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, etc.) .
  • the “5- to 7-membered ring” in the “optionally substituted 5- to 7-membered ring” represented by ring E is a group represented by the formula [Wherein, ring B has the same significance as described above], and may further have a substituent. Examples of such “substituent” include “substituent” of “optionally substituted benzene ring” represented by ring A above.
  • the above “5- to 7-membered ring” may have, for example, the above-mentioned substituents at 1-to-3, preferably 1-to-2 at the substitutable positions.
  • the groups may be the same or different.
  • Ring A is preferably a benzene ring optionally having alkoxy.
  • Ring B is preferably a benzene ring optionally having 1 to 3 alkoxy.
  • Ring C is preferably unsubstituted.
  • Ring D is preferably piperidine.
  • Ring E is preferably of the formula
  • ring B is as defined above] in addition to the group represented by,. More alkoxy and C Bok 8 alkoxy substituents selected from a force Ruponiru which may have 1 or 2 C 5 _ 7 is a cycloalkane.
  • Ring D a is an optionally substituted 6-membered nitrogen-containing heterocycle
  • Ring E a is an optionally substituted 6-membered ring
  • Ring A and Ring B have the same significance as described above].
  • Compound (I) is more preferably reserpine.
  • Indole alkaloids include, for example, Lauolfa Al Power Lloyd. Specific examples include reserpine, arsaroxylone, syrosingopine, and resinamine. Reserpine is preferably used.
  • hydrocarbon group of the “hydrocarbon group optionally having substituents” represented by R 1 or R 2 in the compound (II), for example, a chain or a ring
  • Hydrocarbon groups eg, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, cycloalkenyl, aryl, aralkyl, polycyclic hydrocarbon groups, etc.
  • alkyl examples include alkyl (eg, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, neopentyl, hexyl, etc.).
  • Alkyl examples include alkyl (eg, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, neopentyl, hexyl, etc.).
  • Alkyl examples include alkyl (eg, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, neopentyl, hexyl, etc.).
  • Alkeniru for example, C 2 _ 6 alkenyl
  • alkynyl for example, C 2 _ 6 alkynyl (e.g., Echini Le, propargyl, 1 - butynyl, 2-butynyl, 3 - heptynyl, etc. hexynyl to 1), and the like.
  • alkynyl for example, C 2 _ 6 alkynyl (e.g., Echini Le, propargyl, 1 - butynyl, 2-butynyl, 3 - heptynyl, etc. hexynyl to 1), and the like.
  • cycloalkyl for example, C 3 _ 6 cycloalkyl (e.g., cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexylene hexyl, etc.
  • cycloalkenyl for example C 5 _ 6 cycloalkenyl (e.g., 1 over cyclopentenyl, 3-cyclopentenyl, 4 Shikuropente Nyl, 1-cyclohexenyl, 3-cyclohexenyl, 4-cyclohexenyl, etc.).
  • Ariru e.g., phenyl, 1 one-naphthyl, 2 one-naphthyl, 2-Bifue two Lil, 3 Bifue two Lil, 4 Bifue two Lil, 2-anthryl, 3-indenyl Etc.
  • Ararukiru for example, C 7 - 1 9 Ararukiru (e.g., benzyl, phenethyl, Jifuenirumechiru, trityl, 1 one naphthylmethyl, 2 one naphthylmethyl, 2, 2 one Jifue two Ruechiru, 3-phenylpropyl, 4 Monophenylbutyl, 5-phenylpentyl, 9-fluorenyl, etc.).
  • Ararukiru e.g., benzyl, phenethyl, Jifuenirumechiru, trityl, 1 one naphthylmethyl, 2 one naphthylmethyl, 2, 2 one Jifue two Ruechiru, 3-phenylpropyl, 4 Monophenylbutyl, 5-phenylpentyl, 9-fluorenyl, etc.
  • polycyclic hydrocarbon group examples include, for example, a bicyclic to tetracyclic non-aromatic hydrocarbon group (eg, 1-adamantyl, 2-adamantyl, decalin-1 monoyl, tetralin 1 monoyl, indan 1), 1 and 3 for Androstan, 5 for Androsten 3).
  • substituted hydrocarbon group which may have a substituent examples include, for example, a halogen atom (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.), C!
  • alkylenedioxy eg, , Mechirenjiokishi, Echirenjiokishi etc.
  • nitro Shiano
  • optionally halogenated good CH alkyl halogenated which may be C 2 _ 6 alkenyl, Karupokishi C 2 - 6 alkenyl (e.g., 2 Ichiriki Rupokisheparu, 2- power Rupokishi 2 Mechiruearticulu etc.), optionally halogenated C 2 _ 6 alkynyl optionally may be halogenated, fused optionally C 3 _ 8 cycloalkyl, C 6 - 14 Ariru (e.g., Phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl, 2-biphenylyl, 3-biphenylyl, 4-biphenylyl, 2-anthryl, etc.), halogenated Unprotected C Bok 8 alkoxy, CH alkoxy Ichiriki Lupo two Lou CH
  • Fuenechiruokishi mercapto, optionally CH alkylthio which may be halogenated, c 6 - 14 Ariru Chio (eg , phenylene thioether, 1 one naphthylthio, etc. 2 one naphthylthio), (7 _ 16 Ararukiruchio (e.g., benzylthio, etc. Fuenechiruchio), amino, hydroxy ⁇ amino, mono- CH alkylamino (e.g., Mechiruamino, etc. Echiruamino) mono _ C 6 _ M ⁇ Li one Ruamino (eg, Fueniruamino, 1 - naphthylamino, etc.
  • C ⁇ 6 alkoxy-carbonyl eg, methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, propoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, etc.
  • C 6 — 14 aryl One-strength luponyl eg, benzo
  • 6 — 14 aryloxyls eg, phenoxycarbonyl
  • C. 7 — 16 aralkyloxycarbonyl eg, benzyloxycarbonyl, phenethyloxycarbonyl
  • 5- or 6-membered heterocyclic carbonyl eg, , Nicotinol, isonicotinoyl, tenoyl, furoyl, morpholino force pononyl, thiomorpholino force ruponyl, piperazine 1-1 ylcarbonyl, pyrrolidine 1-1 ylcarbonyl, etc., force rubamoyl, monoalkyl carbamoyl Tilcarbamoyl, etc.), dialkyl carbamoyl '(eg, dimethylcarbamoyl, jetylcarbamoyl, ethylmethylcarbamoyl, etc.), C 6 — 14 aryl-force rubamoyl (eg,
  • 5- or 6-membered polycyclic rubamoyl eg, 2-pyridylcarbamoyl, 3-pyridylcarbamoyl, 4-1pyridylcarbamoyl, 2 dichlorodicarbamoyl, 3-1 carbamoyl
  • sulfo alkylsulfonyl (e.g., methylsulfonyl, etc.
  • C 6 _ M ⁇ reel sulfonyl e.g., phenylalanine sulfonyl, 1 one naphthylsulfonyl, etc. 2 one Nafuchirusu Ruhoniru
  • Horumiruamino, alkyl - power Ruponiruamino examples, Asechiruamino etc.
  • C 6 _ 14 Ariru Ichiriki Ruponiruamino eg, base Nzoiruamino, etc.
  • Echirusuru Honiruamino c 6 _ 14 ⁇ Li one Le sulfonyl ⁇ amino (e.g., Fuenirusu Ruhoniruamino, 2-naphthylsulfonyl ⁇ Mino and 1 one Nafuchirusuruho Niruamino) alkyl - carbonyl O carboxymethyl (eg, Asetokishi propionyloxy, etc.
  • Ruo carboxymethyl c 6 _ 14 Ariru Ichiriki Ruponiruokishi (eg, base Nzoiruokishi, naphthylcarbonyl O carboxymethyl, etc.), alkoxy one Karuponiruokishi ( Examples, methoxycarbonyloxy, ethoxycarbonyloxy, propoxycarbonyloxy, butoxycarbonyloxy, etc., monono ( ⁇ _ 6 alkyl rubamoyloxy (eg, methylcarbamoyloxy, ethylca) Rubamoiruokishi etc.), di - alkyl Ichiriki Rubamoiruokishi (eg, dimethylcarbamoyl O carboxymethyl, etc.
  • halogenated CH alkyl examples include alkyl having 1 to 5, preferably 1 to 3, halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.).
  • alkyl such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, etc.
  • Specific examples include methyl, chloromethyl, difluoromethyl, trichloromethyl, trifluoromethyl, ethyl, 2-promoethyl, 2, 2, 2-trifluoroethyl, pendefluoroethyl, propyl, 3, 3, 3-trifluoro O-propyl, isopropyl, butyl, 4, 4, 4-trifluoroptyl, isobutyl, sec-ptyl, ter-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, 5, 5, 5-trifluoropentyl, hexyl 6, 6, 6-Trifluorohexyl.
  • halogenated optionally C 2 - 6 alkenyl as has 1 to 5
  • halogen atoms e.g., fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.
  • a which may be C 2 - 6 alkenyl e.g., bi Nyl, propenyl, isopropenyl, 2-butene-1-yl, 4-pentene-1-yl, 5-hexene-1-yl, etc.
  • halogen atoms e.g., fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.
  • C 2 even - 6 alkynyl e.g., up port Parugiru, 2 Buchin - 1 one I le, 4 one pentyne - 1 - I le, to 5 _ relaxin one 1-I le, etc.
  • the "may be halogenated, may be fused ⁇ 3 3 _ 8 cycloalkyl", “optionally halogenated and C 3 - 8 cycloalkyl” of as a, for example, 1 to 5, Preferably 1 to 3 halogen atoms (
  • fluorine, chlorine, bromine, optionally c 3 have a iodine) - 6 cycloalkyl (e.g., cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl consequent opening), and the like.
  • cycloalkyl e.g., cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl consequent opening
  • Specific examples include cyclopropyl, cycloptyl, cyclopentyl, cyclohexyl, 4,4-dichlorocyclohexyl, 2,2,3,3-tetrafluorocyclopentyl, 4-cyclohexyl and the like.
  • the “optionally halogenated CH alkoxy” may have, for example, 1 to 5, preferably 1 to 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.).
  • Alkoxy eg, methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isopoxy, sec-butoxy, pentyloxy, hexyloxy, etc.).
  • Specific examples include, for example, methoxy, difluoromethoxy, ⁇
  • Examples include rifluoromethoxy, ethoxy, 2,2,2-trifluoroethyl, propoxy, isopropoxy, butoxy, 4,4,4-trifluorobutoxy, isobutoxy, sec-butoxy, pentyloxy, hexyloxy and the like.
  • the “optionally halogenated C 6 _6 alkylthio” has, for example, 1 to 5, preferably 1 to 3 halogen atoms (eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine, etc.).
  • Alkylthio eg, methylthio, ethylthio, propylthio, isopropylthio, propylthio, sec-butylthio, tert-butylthio, etc.
  • Specific examples include methylthio, difluoromethylthio, trifluoromethi
  • the “hydrocarbon group” may have, for example, 1 or 5 of the above substituents at substitutable positions, and preferably 1 to 3 substituents. When the number of substituents is 2 or more, May be the same or different.
  • Examples of the spacer represented by X include a spacer having 1 to 24 atoms in the main chain.
  • a divalent chain hydrocarbon optionally having 1 to 4 groups selected from —NH—, _ 0—, 1 S —, — SO— and 1 S 0 2 — divalent ( ⁇ _ 24 chain hydrocarbon (e.g., alkylene down, alkenylene, alkynylene, etc.) or a divalent 3- to 8-membered cyclic group [eg, divalent 6-membered cyclic group (e.g., 1, 2-Hue Direne, 1,3-Fenylene, 1,4-Diylene, Cyclohexane-1,4-Diyl, Pyridin-2,5-Diyl, Pyridine-1,4-Diyl, Piperidine-1, 4-Gil, etc.) etc.].
  • divalent 6-membered cyclic group e.g., 1, 2-Hue Direne, 1,3-Fenylene
  • R 1 and R 2 are preferably alkyl. More preferred is alkyl.
  • X is preferably a divalent chain hydrocarbon which may be respectively passed through 1 to 4 groups selected from 1 NH— and 1 S _. More preferably,-(CH 2 ) 6- ⁇ -(CH 2 ) 8 -thigh- (CH 2 ) 6- ,
  • compound (II) examples include methoctramine [R 1 : methyl, R 2 : methyl, X:-(CH 2 ) 6 -dish- (CH 2 ) 8 -NH- (CH 2 ) 6- ] , Benextramine 1 : Methyl, R 2 : Methyl, X:-(CH 2 ) "Title _ (CH 2 ) 2 -S_S- (CH 2 ) 2 -NH- (CH 2 ) 6- ] I can get lost.
  • Examples of the salt of the compound represented by the formula (I) or (II) include a metal salt, an ammonium salt, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, and a basic or acidic amino acid.
  • Examples include salt.
  • Suitable examples of the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt;
  • Alkaline earth metal salts such as um, magnesium, barium, and aluminum salts.
  • the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6 lutidine, ethanolamine, ketanolamine, ⁇ ⁇ ⁇ , cyclohexylamine, dicyclohexylamine. , N, N′-dibenzylethylenediamine and the like.
  • Preferable examples of the salt with inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • Preferable examples of the salt with organic acid include formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, succinic acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, benzene And salts with p-toluenesulfonic acid.
  • Preferable examples of the salt with basic amino acid include salts with arginine, lysine, ornithine and the like, and preferable examples of the salt with acidic amino acid include salts with aspartic acid, glutamic acid and the like. Can be mentioned.
  • salts are preferred.
  • alkali metal salts eg, sodium salts, strong rhodium salts
  • alkaline earth metal salts eg, calcium salts, magnesium salts, barium salts, etc.
  • Inorganic salts ammonium salts, etc.
  • the compound has a basic functional group, for example, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, Salts with inorganic acids such as acid, or organic acids such as acetic acid, fuuric acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citrate, succinic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid Salt.
  • Labeled ligands are also included in the ligands of the present invention.
  • Labeling substances include radioisotopes (eg, [ m I], [ 131 1], [],
  • [M C], [32 p], [33 p],], etc.) fluorescent substances [e.g., Shianin fluorescent dyes (e.g., Cy2, Cy3, Cy5, Cy5 . 5, Cy7 ( Amersham by O Science), etc. ), Fluores force Min, Fluorecsen isothiocyanate, NBD (7-nit robenz-2-oxa-1, 3-diazol), etc.), Enzymes (eg,
  • Shianin fluorescent dyes e.g., Cy2, Cy3, Cy5, Cy5 . 5, Cy7 ( Amersham by O Science), etc.
  • Fluores force Min Fluorecsen isothiocyanate
  • Enzymes eg,
  • the receptor of the present invention and the partial peptide of the present invention can be produced from the aforementioned human warm-blooded animal cells or tissues by a known method for purifying a polypeptide, or can encode a polypeptide. It can also be produced by culturing a transformant transformed with DN ⁇ . It can also be produced according to the peptide synthesis method. For example, Genomi cs, 56, 12-21, 1999, Bioocim. Biophys. Ac ta ⁇ 1446, 57-70, 1999, etc. It can also be manufactured by a method.
  • resins for polypeptide synthesis can be used for the synthesis of the receptor or partial peptide of the present invention or a salt thereof.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, Benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamide methyl resin, polyacrylamide resin, 41 (2 ', 4'-dimethoxyphenyl dihydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl difluoro Fmoc aminoethyl) phenoxy resin, and the like.
  • an amino acid in which the ⁇ -amino group and the side chain functional group are appropriately protected is condensed on the resin according to various known condensation methods according to the sequence of the target polypeptide.
  • the polypeptide is cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • a disulfide bond-forming reaction is carried out in a highly diluted solution, and the desired polypeptide, receptor, and partial peptide are removed. Obtain peptides or their amides.
  • calpositimides include DCC, N, N'-diisopropyl carbopositimide, N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carbopositimide, and the like.
  • a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (eg, HOB t, HOOB t), or a symmetric anhydride or HO B 1: ester or HOO B t ester.
  • a racemization inhibitor eg, HOB t, HOOB t
  • a symmetric anhydride or HO B 1: ester or HOO B t ester e.g, HOB t, HOOB t
  • the protected amino acid can be activated in advance and then added to the resin.
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents that are known to be usable for the polypeptide condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and blackform, trifluoroethanol, etc.
  • Alcohols, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile, propionitrile, methyl acetate, ethyl acetate Any ester or appropriate mixture thereof may be used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for the polypeptide bond-forming reaction, and is usually appropriately selected from the range of about 120 ° C. to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times.
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isoponyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C 1 1 Z, B r—Z Adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, F moc, etc. are used.
  • Forced loxyl groups are, for example, alkyl esterified (e.g., methyl, ethyl, propyl, butyl, -butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • alkyl esterified e.g., methyl, ethyl, propyl, butyl, -butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • aralkyl esterification eg, benzyl ester, 4_nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification
  • phenacyl esterification benzyl It can be protected by oxycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower (O ⁇ 6 ) alkanoyl groups such as a acetyl group, aryl groups such as benzoyl group, carbon such as benzyloxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group and the like.
  • Groups derived from acids are used.
  • groups suitable for etherification include benzyl group, tetrahydropyranyl group, t-butyl group and the like.
  • Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include B z 1, C 1 2 —B zl, 2 —nitrobenzyl, B r—Z, and t-butyl.
  • protecting groups for histidine imidazoles include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, and Fmoc. It is possible.
  • Examples of the activated lpoxyl group of the raw material include the corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pen-and-mouth mouth phenol, 2, 4, 5-triclo-mouth phenol, 2 , 4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HON B, N-hydroxysuccinide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOB t)] and the like.
  • active esters eg, pen-and-mouth mouth phenol, 2, 4, 5-triclo-mouth phenol, 2 , 4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HON B, N-hydroxysuccinide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOB t)
  • a corresponding phosphoric acid amide is used as the activated amino group of the raw material.
  • Examples of methods for removing (eliminating) protecting groups include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, and anhydrous hydrogen fluoride and methanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon
  • anhydrous hydrogen fluoride and methanesulfonic acid include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, and anhydrous hydrogen fluoride and methanesulfonic acid.
  • Acid treatment with trifluoromethane sulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture of these, base treatment with diisopropylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, etc. are also used.
  • the elimination reaction by the acid treatment is generally performed at a temperature of about ⁇ 20 ° C. to 40 ° C.
  • the acid treatment for example, anisole, phenol, thioaesol, metacresol, paracresol, Addition of cation scavengers such as dimethylsulfide, 1,4 monobutanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc. is effective.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group for histidine is thiophene.
  • the formyl group which is removed by the glycol treatment and used as the indole protecting group for triftophan, is not limited to deprotection by acid treatment in the presence of 1,2-ethanedithiol, 1,4-butanedithiol, etc. It can also be removed by alkaline treatment with a solution of torium or dilute ammonia.
  • the protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material, the protecting group, the removal of the protecting group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
  • the ⁇ -stroxyl group of the carboxy terminal amino acid is amidated and protected and protected, and then a peptide (polypeptide) on the amino group side is protected.
  • the polypeptide excluding only the protecting group of the amino group at the terminus of the peptide chain and the polypeptide from which only the protecting group of the force loxyl group at the C-terminal is removed
  • the both polypeptides are condensed in a mixed solvent as described above.
  • the details of the condensation reaction are the same as described above.
  • This crude polypeptide can be purified using various known purification means, and the desired receptor or its partial peptide amide can be obtained by lyophilizing the main fraction.
  • the ⁇ -force lpoxyl group of a carboxy terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the receptor or its A desired receptor or an ester form of the partial peptide can be obtained in the same manner as the amide form of the partial peptide.
  • the receptor or partial peptide of the present invention can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or for a partial peptide of the receptor, by cleaving the receptor with an appropriate peptidase.
  • peptide synthesis methods include solid phase synthesis and liquid phase synthesis. Also good. That is, a partial peptide or amino acid that can constitute the receptor or partial peptide of the present invention is condensed with the remaining part, and when the product has a protective group, the target peptide is produced by eliminating the protective group. be able to.
  • Examples of known condensation methods and protecting group elimination include the methods described in the following (i) to (V).
  • the receptor or partial peptide of the present invention can be purified and isolated. If the receptor or partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method similar thereto, and conversely, if it is obtained as a salt, it is known. It can be converted to a free form or other salt by the method described in the above or a method according to it.
  • the polynucleotide encoding the receptor or partial peptide of the present invention may be any as long as it contains the base sequence encoding the receptor or partial peptide of the present invention described above.
  • DNA is preferable, and the DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • the total RNA or mRNA fraction prepared from the aforementioned cells / tissues can be used directly.
  • Amplification can also be achieved by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR).
  • Examples of the DNA encoding the receptor of the present invention include DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or sequence. It has a base sequence represented by No. 6 and a base sequence that is hybridized under highly stringent conditions, and contains an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5. Any DNA may be used as long as it encodes a receptor having substantially the same activity as the protein to be processed.
  • Examples of the DNA that can be hybridized under the conditions of high-ring linge with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, include, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: : About 60% or more, preferably about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more.
  • a DNA containing a base sequence having homology is used.
  • Hypodization can be performed according to a method known per se or a method according thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out according to highly stringent conditions. .
  • High stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19-40 mM, preferably about 19-20 mM, and a temperature of about 50-70 ° C, preferably about 60-65 ° C. C conditions are shown. In particular, it is most preferable when the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • the DNA encoding the receptor containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the like.
  • the DNA encoding the receptor containing the amino acid sequence represented by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 The DNA encoding the receptor containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 such as DN A containing the sequence includes DN A containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 6. Used.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains a base sequence encoding the partial peptide of the receptor of the present invention.
  • any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the cells / tissues described above, cDNA library derived from the cells / tissues described above, and synthetic DNA may be used.
  • DNA having a partial nucleotide sequence of DNA encoding a receptor having substantially the same activity as that of DNA is used.
  • a DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 has the same significance as described above.
  • the polynucleotide (eg, DNA) encoding the receptor or partial peptide of the present invention may be labeled by a method known per se.
  • labeling substances include radioisotopes, fluorescent substances (eg, fluorescein), phosphors, enzymes, piotin, and lanthanide elements.
  • a PCR known per se using a synthetic DNA primer having a partial base sequence of the receptor or partial peptide of the present invention is used.
  • High pre-dialysis with Can be sorted by The method of hyperpridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be converted using a known kit such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), ⁇ ⁇ ⁇ -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc. It can be carried out according to a method known per se such as duplex method, Kimkel method or the like, or a method analogous thereto.
  • a known kit such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), ⁇ ⁇ ⁇ -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc. It can be carried out according to a method known per se such as duplex method, Kimkel method or the like, or a method analogous thereto.
  • the cloned receptor-encoding DNA can be used as is, or, if desired, digested with a restriction enzyme or added with a linker depending on the purpose.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codons and translation termination codons can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the receptor or partial peptide expression vector of the present invention can be obtained by, for example, (a) cutting out the target DNA fragment from the DNA encoding the receptor or partial peptide of the present invention, and (b) appropriately expressing the DNA fragment. It can be manufactured by connecting to the downstream of the promotion in the vector.
  • vectors examples include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), and plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, PUB110, pTP5, pC1). 94), yeast-derived plasmids (eg, p SH 19, p SH 15), bacteriophages such as A phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc. pXT l, pR c / CMV, pRc / RS V, pc DNA I ZNeo, etc. are used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression.
  • SR promoter SV40 promoter
  • HIV ⁇ LTR promoter HIV ⁇ LTR promoter
  • CMV promoter CMV promoter
  • HS V_TK promoter etc.
  • the CMV (cytomegalovirus) promoter, SRa promoter and the like are preferably used.
  • the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, APL promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc.
  • the host is Bacillus
  • yeast such as S PO 1 promoter, S PO 2 promoter, pen P promoter, etc., PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, evening, ADH promoter and the like are preferable.
  • a polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector contains an enhancer, splicing signal, poly A addition signal, selection marker, SV 40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), etc.
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r ), Neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neor, G 418 resistance).
  • dhfr gene-deficient Chinese hamster cell is used and the dhfr gene is used as a selection marker, the target gene can be selected even in a medium containing no thymidine.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the receptor of the present invention. If the host is Escherichia, Pho A ⁇ signal sequence, OmpA ⁇ signal sequence, etc. If the host is an animal cell, such as MF Q: * signal sequence, S UC 2 signal sequence, etc. Phosphorus, signal sequence, single interferon signal sequence, antibody molecule • signal sequence can be used.
  • a transformant can be produced by using the thus constructed vector containing a DNA encoding the receptor or partial peptide of the present invention.
  • hosts examples include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, and animal cells.
  • Escherichia coli As specific examples of Escherichia coli, for example, Escherichia coli K 1 2 ⁇ D ⁇ 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume 60, 160 (1968)], JM 1 0 3 [ Nucleic Acids Research, 9 ⁇ , 309 (1981),], JA 2 2 1 [Journal oi Molecular Biology, 120, 517 (1978)], HB 1 0 1 [; Tournal of Molecular Biology, 41, 459 (1969) )], C 6 00 [Genetics, 39, 440 (1954)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH 2 2, AH 2 2 R NA 8 7-1 1 A, DKD— 5 D, 2 0 B— 1 2, Schizosaccharomyces poinbe NCYC 1 9 1 3, NCYC 2 0 3 6, Pichia pastoris KM 7 1 etc. are used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, larvae derived from larvae (Spodoptera frugiperda cell; S f cells), MG 1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, eggs of Trichoplusia ni High Five " 1 cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • S f cells include S f 9 cells (ATCC CRL 1711) and S f 21 cells (above, Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)). It is.
  • insects examples include silkworm larvae [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cells CO S-7 (CO S 7), V ero, Chinese hamster cells CH (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter referred to as CHO (dhfr- Abbreviated as cell), mouse L cell, mouse At T-20, mouse myeloma cell, rat GH 3, human FL cell, etc.
  • Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) or Gene, 17, 107 (1982) can be used to transform Escherichia bacteria. .
  • Transformation of Bacillus can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979).
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a transformant transformed with an expression vector containing a DNA encoding a receptor or partial peptide can be obtained.
  • a liquid medium is suitable as a medium used for the culture, including a carbon source necessary for the growth of the transformant, Nitrogen source, inorganic substances, etc. are contained.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts and glass.
  • inorganic or organic substances and inorganic substances such as acid salts, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato extract include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • an M 9 medium containing glucose and casamino acids is preferable.
  • a drug such as 3] 3-indolylacrylic acid can be added.
  • the culture is usually carried out at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
  • the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration or agitation can be added.
  • examples of the medium include Burkholder's minimum medium [Bostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 77, 4505 (1980) And SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, .5330 (1984)].
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8. Incubate at about 20 ° C (about 35 ° C for about 24–72 hours), and add aeration or agitation as necessary.
  • the medium used is 10% gusci immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). Those added with additives such as serum as appropriate are used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Cultivation is usually carried out at about 27 ° 0 for about 3 to 5 days, with aeration and agitation as necessary.
  • the medium When cultivating a transformant whose host is an animal cell, the medium may be, for example, MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], R PM I 16 40 medium [ The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 1990 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)].
  • the pH is preferably about 6-8. Cultivation is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, with aeration and agitation as necessary.
  • the receptor or partial peptide of the present invention can be produced in the cell, the cell membrane, or extracellularly of the transformant.
  • the receptor or partial peptide of the present invention is extracted from cultured cells or cells, after culturing, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasound, lysozyme and A method of obtaining a crude polypeptide extract by centrifugation or filtration after disrupting cells or cells by freeze-thawing or the like is appropriately used.
  • a protein modifier such as urea or hydrochloric guanidine in the buffers may contain a surfactant such as Triton X- 1 0 0 TM.
  • the thus obtained culture supernatant or the receptor or partial peptide contained in the extract can be purified by appropriately combining known separation / purification methods.
  • known separation and purification methods include methods that utilize solubility such as salt precipitation and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • solubility such as salt precipitation and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the method using the difference in molecular weight the method using the difference in charge such as ion exchange chromatography, the method using the specific affinity such as affinity chromatography, the hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography, etc.
  • Using the difference of isoelectric point using isoelectric point difference such as isoelectric focusing The method to do is used.
  • the receptor or partial peptide thus obtained When the receptor or partial peptide thus obtained is obtained as a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when obtained as a salt, it is known per se. It can be converted into a free form or other salt by a method or a method similar thereto.
  • the receptor or partial peptide produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by allowing an appropriate protein modifying enzyme to act before or after purification.
  • protein-modifying enzyme examples include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycoside, and the like.
  • An antibody against a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as the antibody of the present invention) is: Any antibody that can recognize an antibody against the receptor of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Examples of antibodies to the receptor of the present invention include antibodies that inactivate receptor signal transduction, antibodies that activate receptor signal transduction, and the like.
  • the antibody against the receptor of the present invention can be produced according to a known antibody or antiserum production method using the receptor of the present invention as an antigen.
  • the receptor of the present invention is administered to a warm-blooded animal by itself, together with a carrier or a diluent, at a site where antibody production is possible by administration.
  • a carrier or a diluent In order to enhance antibody production at the time of administration, complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered. Administration is usually once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • warm-blooded animals used include sa Examples include mouse, rat, guinea pig, mouse, rat, hidge, goat, and chicken, with mouse and rat being preferred.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by fusing the antibody-producing cells to be fused with myeloma cells of the same or different species.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled polypeptide described below with the antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Köhler and Mills, IN (Nature, 256, 495 (1975)).
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus. PEG is preferably used.
  • myeloma cells include warm-blooded animal myeloma cells such as NS-1, P3U1, SP2Z0, and AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG 600) is 10 to Cell fusion can be carried out efficiently by adding at a concentration of about 80% and incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes.
  • a hybridoma culture supernatant is applied to a solid phase (eg, a microplate) on which a polypeptide (protein) antigen is adsorbed directly or together with a carrier.
  • a carrier e.g, a polypeptide (protein) antigen
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme if the cell used for cell fusion is a mouse, an anti-mouse immunoglobulin antibody is used
  • protein A protein A
  • the method of detecting the antibody, adding the hybridoma culture supernatant to a solid phase adsorbed with anti-immunoglobulin antibody or protein A examples include a method of detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding a polypeptide labeled with a radioactive substance or an enzyme.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a similar method. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with H A T (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • H A T hypoxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° (preferably about 37 ° C.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 to 2 weeks.
  • Hypridoma culture The antibody titer of the supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by known methods such as immunoglobulin separation and purification (eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchanger (eg, DEAE)).
  • Adsorption / desorption method by ultracentrifugation, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method to obtain antibody by dissociating the binding using active adsorbent such as protein A or protein G Can be done.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a known method or a method analogous thereto.
  • an immunizing antigen polypeptide antigen
  • a warm-blooded animal is immunized in the same manner as the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting an antibody-containing substance against the receptor of the antibody and performing separation and purification of the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are antibodies against hapten immunized by crosslinking with carrier.
  • any kind of material for example, urine serum albumin, assimiloglobulin, hemocyanin, and the like are about 0.1 by weight to hapten 1.
  • a method of force pulling at a rate of ⁇ 20, preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for the force pulling of the hapten and the carrier, but active esters containing dartalaldehyde, carpositimide, maleimide active ester, thiol group, or dithiobilidyl group.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at the site where antibody production is possible, or with a carrier and a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production at the time of administration.
  • the administration is usually about once every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
  • Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of warm-blooded animals immunized by the method described above.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the antibody titer in the antiserum. Separation and purification of the polyclonal antibody can be carried out according to the same immunoglopurin separation and purification method as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the polynucleotide (eg, DNA) containing a base sequence complementary to or a part thereof has a base sequence complementary to or substantially complementary to the polynucleotide, or a part thereof.
  • Any polynucleotide (amplifier) may be used as long as it has an action capable of suppressing the expression of the polynucleotide. Chisense nucleotide).
  • RNA encoding the receptor of the present invention
  • DNA a polynucleotide encoding the receptor of the present invention
  • antisense DNA having a base sequence or a part thereof (hereinafter, these DNAs may be abbreviated as antisense DNA), and complementary or substantially complementary to the DNA of the present invention.
  • Any antisense DNA may be used as long as it has an active nucleotide sequence or a part thereof and has an action capable of suppressing the expression of the DNA.
  • the base sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, about the entire base sequence or partial base sequence of the base sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention).
  • Examples include nucleotide sequences having homology of 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • about 70% of the entire base sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention and the complementary strand of the base sequence encoding the N-terminal site of the receptor of the present invention eg, the base sequence near the start codon.
  • Antisense DNA having a homology of at least%, preferably at least about 80%, more preferably at least about 90%, and most preferably at least about 95% is suitable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer.
  • a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, or a part thereof An antisense polynucleotide having SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, or a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 Or an antisense polynucleotide having a part thereof.
  • an antisense polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, or a part thereof examples thereof include a base sequence complementary to the base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, or an antisense polynucleotide having a part thereof.
  • the antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40 bases, preferably about 15 to 30 bases.
  • the phosphate residues (phosphites) of each nucleotide that constitutes the antisense DNA are chemically modified phosphates such as phosphorothioate, methylphosphonate, and phosphorodithione. It may be substituted with a residue.
  • These antisense polynucleotides can be produced and produced using a known DNA synthesizer.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the receptor gene of the present invention is cloned, or a DNA base that codes for a protein whose amino acid has been determined. Can be designed and synthesized based on sequence information.
  • a polynucleotide can be hybridized with the RNA of the receptor gene of the present invention, can inhibit the synthesis or function of the RNA, or interact with the receptor-related RNA of the present invention.
  • the expression of the receptor gene of the present invention can be regulated and controlled via A polynucleotide complementary to a selected sequence of the receptor-related RNA of the present invention, and a polynucleotide capable of specifically hybridizing with the receptor-related RNA of the present invention, can be obtained in vivo and in vitro. It is useful for regulating and controlling the expression of receptor genes, and is useful for the treatment or diagnosis of diseases.
  • the term “corresponding” means homologous to or complementary to a specific sequence of nucleotides, nucleotide sequences or nucleic acids including genes.
  • nucleotide, nucleotide sequence or nucleic acid and peptide usually refers to the amino acid of the peptide (protein) in the instruction derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement.
  • the translation region, protein translation stop codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3 'end untranslated region, 3' end palindrome region, and 3 'end hairpin loop can be selected as preferred target regions, but within the protein gene Any region can be selected as a target.
  • the target nucleic acid if the target nucleic acid can be hybridized with the target region, the target nucleic acid is not related to the polynucleotide of the target region. It can be said that it is “antisense”.
  • Antisense polynucleotides include 2-deoxy D-lipose-containing polynucleotides, D-ribose-containing polynucleotides, purines, or other types of polynucleotides that are pyrimidine base N-daricosides, or Other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers that contain special bonds (provided that such polymers are found in DNA and RNA) Base pairing contains nucleotides with a configuration allowing base attachment).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, or even DNA: RNA hybrids, and also unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), or even known Modifications, such as those with a label known in the art, capped, methylated, one or more natural nucleotides replaced with analogs, Intramolecular nucleotide modifications, such as those with uncharged bonds (eg, methylphosphonates, phosphoglycerides, phosphoramidates, strong rubamates, etc.), charged bonds or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothio) Such as protein (nuclease, nuclease, inhibitor, etc.) , Antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (for example, monosaccharides), etc., side-chain groups such as in-cariate compounds
  • nucleoside may contain not only purine and pyrimidine bases but also those having other modified polycyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also have modified sugar moieties such as one or more hydroxyl groups as halogens, aliphatic groups, etc.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, or modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acids include, but are not limited to, nucleic acid sulfur derivatives, thiophosphate derivatives, and polynucleoside amides that are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleotide of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, make the antisense nucleotide in the cell more stable, increase the cell permeability of the antisense nucleotide, increase the affinity for the target sense strand, and if it is toxic Reduce the toxicity of antisense nucleotides.
  • the antisense polynucleotides of the present invention can be altered, contain modified sugars, bases, bonds, and can be donated in specialized forms such as ribosomes, microspheres, or by gene therapy. Applied It can be given in an added form. In this way, it can be used in an additional form such as polycationic substances such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, increase the interaction with the cell membrane, and increase the uptake of nuclear acid Hydrophobic substances such as lipids (eg, phospholipids, cholesterol, etc.) can be mentioned.
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • These can be attached to the 3 'or 5' end of the nuclear acid and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • examples of other groups include cap groups that are specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of nucleic acids, and are used to prevent degradation by nucleases such as exonuclease and RNase.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleotide can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the receptor of the present invention. it can.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
  • the receptor of the present invention (i) the receptor of the present invention, (ii) a polynucleotide encoding the receptor of the present invention (polynucleotide of the present invention), (iii) an antibody against the receptor of the present invention (the antibody of the present invention) ), (Iv) Antisense polynucleotide of the receptor of the present invention (eg, DNA) (eg, antisense DNA of the present invention), (V) A ligand having the ability to specifically bind to the receptor of the present invention ( Applications of the ligand of the present invention will be described.
  • the binding of the receptor of the present invention and the ligand of the present invention can be improved Compound to change (eg, peptide, Proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.) or salts thereof can be efficiently screened.
  • Compound to change eg, peptide, Proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.
  • the compound or a salt thereof includes (i) cell stimulation activity via the receptor of the present invention (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation, cell CAMP production inhibition, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, GTPTS binding activity, cAMP dependence Protein kinase activation, c GMP-dependent protein kinase activation, phospholipid-dependent protein kinase activation, mitogen activity, protein kinase (MAP kinase) activation, serum response factor gene expression (Ii) a compound having an activity that promotes an increase, a receptor intracellular translocation activity, etc.) (ii) a compound having no cell stimulating activity (antagonist), (iii) the receptor of the present invention A compound that promotes the binding power to the ligand of the present invention, and
  • the comparison is performed, for example, by measuring the binding amount of the ligand of the present invention to the receptor of the present invention, cell stimulating activity, and the like.
  • Specific examples of the screening method of the present invention include, for example,
  • the receptor of the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor of the present invention and when the ligand of the present invention and a test compound are contacted with the receptor of the present invention A method for screening a compound or a salt thereof that alters the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention, which comprises measuring and comparing the binding amount to
  • a receptor binding assembly such as the screening method of (a) to (c) above, wherein the ligand of the present invention is a labeled ligand;
  • the ligand of the present invention When the ligand of the present invention is contacted with a cell containing the receptor of the present invention or a membrane fraction of the cell, the ligand of the present invention and the test compound are added to the cell containing the receptor of the present invention or the cell Binding of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention, characterized by measuring and comparing the cell stimulating activity via the receptor of the present invention when contacted with the membrane fraction of a cell A screening method for a compound or a salt thereof that alters sex, and
  • the receptor of the present invention a membrane fraction of an organ of a human warm-blooded animal is preferably used.
  • the receptor of the present invention expressed in a large amount using a recombinant is suitable for use in screening. 5900
  • the preparation method described later when the cell containing the receptor of the present invention or the cell membrane fraction is used, the preparation method described later may be followed.
  • the cells containing the receptor of the present invention when cells containing the receptor of the present invention are used, the cells may be fixed with dartaldehyde, formalin or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a publicly known method.
  • Examples of the cell containing the receptor of the present invention include a host cell expressing the receptor of the present invention.
  • Examples of the host cell include the aforementioned Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells and the like.
  • the manufacturing method is the same as described above.
  • the membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a method known per se after cell disruption.
  • Cell disruption methods include crushing cells with a Potter-E ivehj em homogenizer, crushing with a blender polytron (Kinemat i ca), crushing with ultrasonic waves, and applying pressure with a French press.
  • One example is rupture caused by ejecting cells from a thin nozzle.
  • a fractionation method using centrifugal force such as a differential centrifugation method or a density gradient centrifugation method is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (15000 ⁇ ! To 30000 rpm) for usually 30 minutes to 2 hours.
  • the resulting precipitate is used as the membrane fraction.
  • the membrane fraction contains a lot of membrane components such as the expressed receptor of the present invention and cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of the receptor of the present invention in the cell or membrane fraction containing the receptor of the present invention is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and 10 5 to 10 7 molecules. It is preferable that In addition, the higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, making it possible not only to construct a highly sensitive screening system but also to measure a large amount of samples at the same lot. become.
  • the receptor fraction of the present invention the ligand of the present invention (eg, the labeled ligand of the present invention) and the like are used.
  • the receptor fraction of the present invention is preferably a natural fraction of the receptor of the present invention, or a recombinant fraction of the present invention having an equivalent activity.
  • equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity and the like.
  • labeled ligands include radioisotopes (eg, [ 125 1], [ 131 1],
  • fluorescent material eg, cyanine fluorescent dye (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7) (Amersham Biosciences, etc.)), fluorescamine, fluorescene isothiocyanate, NBD (7-111 0 & 6112-2-0 & -1, 3- & 201) etc.), enzyme (eg, ⁇ — Labeled with galactosidase, / 3-Dalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc., luminescent substances (eg, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc.), piotin, lanthanide element, etc.
  • cyanine fluorescent dye eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Biosciences, etc.)
  • fluorescamine fluorescene isothiocyanate
  • NBD 7-111 0 & 6112-2-0 & -1
  • the membrane fraction of cells or cells containing the receptor of the present invention is screened.
  • the buffer may be any buffer that does not inhibit the binding between the ligand and the receptor, such as a phosphate buffer of ⁇ 4 to 10 (preferably ⁇ 6 to 8), tris-hydrochloride buffer, and the like.
  • a surfactant such as C HA PS, Twe ⁇ — 80 ( Kaoichi Atlas Co., Ltd.), digitonin, and dioxycholate can be added to the buffer.
  • protease inhibitors such as PMSF, leupeptin, E-6 4 (Peptide Laboratories) and pepsin can be added to suppress the degradation of the receptor of the present invention by protease.
  • a fixed amount (5 0 00 0 to 5 0 0 0 0 0 c pm) of a labeled ligand of the present invention was added to the receptor solution of 0. 0 1 to 10 m 1 and simultaneously 1 0— 1 to 1 0-7 coexistence of the test compound Micromax.
  • NBS non-specific binding
  • the reaction is carried out at 0 ° C to 50 ° (:, preferably 4 ° (: to 37 ° C for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours. After the reaction, it is filtered through a glass fiber filter paper, etc. , washed with an appropriate volume of the same buffer, non-specific binding from the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper is then measured by a liquid scintillation counter or ⁇ over the counter. count in the absence of substances that antagonize (B 0) (NSB ) Minus the count (B.-NSB) is 100%, the test compound whose specific binding amount (B-NSB) is, for example, 50% or less, is the ligand of the present invention and the receptor of the present invention.
  • the compound that binds to the receptor of the present invention can be selected by using surface plasmon sensor technology.
  • a test compound dissolved in a phosphate buffer solution (PBS) or the like was allowed to flow on the chip surface.
  • the test compound that binds to the receptor of the present invention is selected by measuring the change in surface plasmon. For example, a test compound that gives a measured value of change in surface plasmon of 5 resonance units or more is selected as a substance having binding properties to the receptor of the present invention.
  • cell stimulation activity for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2+ release, intracellular c AMP production via the receptor of the present invention
  • Inhibition of intracellular cAMP production Intracellular cGMP generation, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, c1;
  • Fos activation, pH reduction, GT PrS binding activity C activation of AMP-dependent protein kinase, c activation of GMP-dependent protein kinase, activation of phospholipid-dependent protein kinase, activation of mitogen-activated protein kinase (MAP kinase),
  • Activity that promotes or suppresses increase in serum response factor gene expression, receptor intracellular translocation activity, etc. is measured using a method known per se or a commercially available measurement kit.
  • cells containing the receptor of the present invention are cultured in a multiwell plate or the like. To do. Before performing screening, replace with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., and incubate for a certain period of time, then extract the cells or collect the supernatant. Then, the produced product is quantified according to each method. If the production of a substance (for example, arachidonic acid, etc.) used as an index of cell vitality is difficult to assay with a degrading enzyme contained in cells, an inhibitor for the degrading enzyme may be added to perform the assay. In addition, activities such as cAMP production inhibition can be detected as a production inhibition effect on cells whose basic production amount has been increased with forskolin or the like.
  • a substance for example, arachidonic acid, etc.
  • cells expressing an appropriate receptor of the present invention are required.
  • the cells expressing the receptor of the present invention the aforementioned receptor-expressing cell line of the present invention is desirable.
  • test compound examples include peptides, proteins, antibodies, non-base petit de compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, such as blood plasma and the like.
  • the compound of the present invention is screened for a compound that alters the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention against the receptor-expressing cell of the present invention. be able to.
  • This method is performed using a membrane fraction containing the receptor of the present invention.
  • the substance exhibiting the activity of promoting GTPrS binding to the receptor membrane fraction of the present invention is agonis.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor cell membrane fraction of the present invention in the presence of labeled GTPrS, the ligand of the present invention and the test compound are fractionated with the receptor cell membrane fraction of the present invention.
  • the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is changed. Screen the compound.
  • a test compound exhibiting an activity of suppressing the GTPrS binding promoting activity to the receptor cell membrane fraction of the present invention by the ligand of the present invention can be selected as an antago or varnish candy candidate compound.
  • screening of agonis can be performed by contacting only the test compound with the receptor cell membrane fraction of the present invention and measuring the GTPrS binding promoting activity to the receptor cell membrane fraction of the present invention. it can.
  • Dilute the cell membrane fraction containing the receptor of the present invention prepared according to a known method with membrane dilution buffer (50 mM Tris, 5 mM MgCl 2 , 150 mM NaCK l ⁇ M GDP, 0.1% BSA; H7.4) .
  • the dilution rate depends on the level of receptor expression. This is dispensed in 0.2 ml each into Falcon2053, the ligand of the present invention or the ligand and test compound of the present invention are added, and [ 35 S] GTPrS is further added to a final concentration of 200 pM.
  • a test compound having a GTPrS binding promoting activity of, for example, 50% or less can be selected as an candidate antagonist compound.
  • the compound of the present invention is screened for a compound that changes the binding properties of the ligand of the present invention and the receptor of the present invention by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention against the receptor-expressing cells of the present invention. be able to.
  • a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened by measuring and comparing the intracellular cAMP production promoting activity.
  • CAMP production amount of receptor expression in the cells of the invention are murine, rat, Usagi, catcher formic, ⁇ anti-cAMP antibody obtained and by immunized with [m I] -labeled cAMP (commercially available co )
  • the RIA system can be used, or the EIA system can be used in combination with anti-cAMP antibody and enzyme-labeled cAMP.
  • anti-cAMP antibodies can be prepared using beads containing scintillant immobilized using antibodies against IgG, etc.
  • a test compound showing an activity of inhibiting the cAMP production promoting activity of the receptor-expressing cell of the present invention by the ligand of the present invention can be selected as an antagonist candidate compound.
  • screening for a compound exhibiting agonist activity can be performed by contacting only the test compound with the receptor-expressing cell of the present invention and examining cAMP production promoting activity.
  • Receptor-expressing cells of the present invention e.g., animal cells such as CH0 cells
  • Receptor-expressing cells of the present invention were seeded in 24-well play Bok at 5xl0 4 ce ll / we ll, cultured for 48 hours.
  • Cells 0.2-2 Isobu Wash with Hanks buffer (pH 7.4) containing til-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter abbreviated as reaction buffer). Then add 0.5 ml of reaction buffer and incubate for 30 minutes in an incubator. After adding 0.25 ml of reaction buffer to the cells, except for the anti-application buffer, add 0.25 ml of reaction buffer containing IO M ligand of the present invention or 10 M ligand of the present invention and the test compound.
  • a test compound that inhibits the activity of the ligand of the present invention and has a cAMP production promoting activity of 50% or less, for example, can be selected as an candidate antagonist compound.
  • the cAMP production inhibitory activity was examined. It is possible to screen for compounds that exhibit inverse agonist activity.
  • a substance that increases the amount of intracellular cAMP in the above screening method for example, forskolin, the ligand of the present invention, etc.
  • the activity can be easily detected by increasing the internal cAMP concentration.
  • the binding activity between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is changed by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention against the receptor-expressing cell of the present invention.
  • Compounds can be screened.
  • CRE-Repo In the receptor-expressing cells of the present invention into which the gene vector has been introduced, stimulation accompanied by an increase in cAMP induces reporter gene expression via CRE and subsequent production of the gene product (protein) of the reporter gene. In other words, by measuring the enzyme activity of the repo overnight gene protein, it is possible to detect changes in the amount of cAMP in the CRE-reporter gene vector-introduced cells.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is brought into contact with the CRE-repo overnight gene vector-introduced receptor-expressing cell of the present invention, the ligand of the present invention and the test compound are mixed with the CRE-reporter gene.
  • the vector for example, Pitzka Gene Paysic Vector, Picker Gene Hansa Vector (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.) and the like are used.
  • the CRE-containing DNA is inserted into the multi-cloning site upstream of the vector repo gene, for example, upstream of the luciferase gene, to form a CRE-repo gene vector.
  • a test compound that suppresses the promotion of the enzyme activity of the repo overnight gene protein by the ligand of the present invention can be selected as an antagonist candidate compound.
  • screening of an agonist can be performed by contacting only the test compound with the receptor-expressing cell of the present invention and measuring the same promoting activity as the ligand of the present invention.
  • Receptor-expressing cells of the present invention into which a CRE-reporter gene (Luciferase) has been introduced are seeded on a 24-well plate at 5xl0 3 cell / well and cultured for 48 hours. Wash the cells with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.2 mM 3-isobutyl-methylxanthine, 0.05% BSA and 20 mM HEPES. Abbreviated as FFFA.) Then add 5 ml of reaction buffer and incubate for 30 minutes in an incubator.
  • the ligand of the present invention promotes an increase in the amount of luminescence by luciferase.
  • a compound that suppresses the promotion can be selected as an antagonist candidate compound.
  • a gene such as alkaline phosphatase, chloramphenicol acetyl transferase, chloroamphenicol acetyl transferase, or 8-galactosidase may be used as a reporter.
  • the enzyme activity of a single gene protein is measured according to a known method or using a commercially available measurement kit.
  • Alkaline Phosphatase activity is, for example, using Luini-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • ⁇ -karak ⁇ fernase activity is measured using, for example, Aurora Ga ⁇ XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries.
  • the binding activity between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is changed by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention against the receptor-expressing cell of the present invention.
  • the compound can be screened.
  • a DNA containing SRE (serum response element) is inserted upstream of the reporter gene of the vector to obtain an SRE-reporter gene vector.
  • SRE-Repo In the receptor-expressing cells of the present invention into which a gene vector has been introduced overnight, activation of growth signals such as MAP kinase activation by serum stimulation is the expression of reporter gene via SRE and subsequent reporter gene expression. Induces the production of gene products (proteins). In other words, by measuring the enzyme activity of the repo overnight gene protein, activation of the proliferation signal in the SRE-repo overnight gene vector introduced cell can be detected.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the SRE-reporter gene vector-introduced cell expressing the receptor of the present invention, the ligand of the present invention and the test compound are combined with the SRE-reporter gene vector.
  • the vector for example, Pitsuka Gene basic vector, Phi-Gen Gene Hansar vector (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.) and the like are used.
  • the SRE-containing DNA is inserted into the above-mentioned vector reporter gene, for example, the cloning site upstream of the luciferase gene, to form the SRE-repo overnight gene vector.
  • test compound that suppresses the enzyme activation of the repo overnight gene protein by the ligand of the present invention can be selected as an candidate antagonist compound.
  • screening of an agonist can be performed by contacting only the test compound with the receptor-expressing cell of the present invention and measuring the increase in the amount of luminescence similar to the ligand of the present invention.
  • SRE- repo one coater gene receptor-expressing cells of the present invention obtained by introducing a (Lucifera Ichize) were seeded at 5xl0 3 ce ll / we ll on a 24-well plate, cultured for 48 hours. Wash the cells with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 mM HEPES (hereinafter abbreviated as reaction buffer). Then 0.5ml anti Add application buffer and incubate for 30 minutes in an incubator. After removing the reaction buffer and adding 0.25 ml of reaction buffer to the cells, add 0.25 ml of reaction buffer containing 10 M of the ligand of the present invention or 10 M of the ligand of the present invention and a test compound.
  • Luminescence is measured by Luminome, liquid scintillation county or top county. The amount of luminescence by luciferase when the ligand of the present invention alone is added and when 10 M of the ligand of the present invention and a test compound are added are measured and compared.
  • the ligand of the present invention increases the amount of luminescence by luciferase.
  • a compound that suppresses the increase can be selected as an antagonist candidate compound.
  • a gene such as Al-force phosphatase, chloramphenicol acetyl transferase, 3-galactosidase, etc. may be used as a repo overnight gene.
  • the enzyme activity of the gene protein is measured according to a known method or using a commercially available measurement kit.
  • Alkaline phosphatase activity is, for example, by using Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • chloramphenicol acetylyl small transferase activity is, for example, by using FAST CAT chrolamphenicol Acetyl transferase Assay KiT, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the receptor-expressing cell of the present invention releases an arachidonic acid metabolite out of the cell upon stimulation of the ligand of the present invention.
  • the compound that changes the binding property of the ligand of the present invention to the receptor of the present invention is screened by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention to the receptor-expressing cell of the present invention. can do.
  • the arachidonic acid metabolite-releasing activity is increased extracellularly. It can be measured by measuring the labeled arachidonic acid metabolite released to the surface.
  • the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention containing a labeled arachidonic acid, the present invention containing the labeled arachidonic acid with the ligand of the present invention and a test compound.
  • a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened. .
  • a test compound that inhibits the arachidonic acid metabolite release activity by the ligand of the present invention can be selected as an antonigolist candidate compound.
  • test compound by contacting only the test compound with the receptor-expressing cell of the present invention and examining the arachidonic acid metabolite-releasing activity of the receptor-expressing cell of the present invention by a known method, screening of the compound exhibiting agonist activity is performed. It can also be carried out.
  • the receptor-expressing cells of the present invention were seeded at 5xl0 4 cell / well in 24-well play Bok, after 24 hours incubation, was added to a 0.25 XCI / well of [3 H] Arakidon acid, after 16 hours, the cells Wash with Hanks buffer (pH7.4) containing 0.05% BSA and 20 ⁇ HEPES (hereinafter abbreviated as reaction buffer).
  • reaction buffer Hanks buffer
  • a final buffer concentration of 10 M of the ligand of the present invention or 500 xl reaction buffer containing the final concentration of IOM ligand of the present invention and the test compound is added to each well.
  • the amount of free [] arachidonic acid metabolite in the case of adding only reaction buffer 500/21 (no addition of ligand of the present invention / no addition of test compound) is ⁇ %, ⁇
  • the amount of free [] arachidonic acid metabolite is taken as 100%.
  • the amount of free [] arachidonic acid metabolite when the product is added is calculated.
  • test compound having an arachidonic acid metabolite-releasing activity of, for example, 50% or less can be selected as an candidate antagonist compound.
  • the Ca concentration in the cell is increased by stimulation with the ligand of the present invention.
  • the compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor-expressing cell of the present invention. can do.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, the ligand of the present invention and the test compound are produced from the receptor of the present invention.
  • a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened by measuring and comparing the intracellular calcium concentration increasing activity when it is brought into contact with the present cell. The measurement is performed according to a known method.
  • a test compound that suppresses the increase in intracellular calcium concentration by the ligand of the present invention can be selected as an candidate antagonist compound.
  • the agonist can be screened by measuring the increase in fluorescence intensity due to the addition of only the test compound. .
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded on a sterilized microscope cover glass, and two days later, the culture solution is replaced with HBSS suspended in 4 Fura-2 AM (Dojindo Laboratories), and 2 at room temperature. Leave for 30 minutes. After washing with HBSS, place a cover glass in the cuvette, add the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound, and the ratio of the fluorescence intensity at 505 nm at excitation wavelengths of 340 nm and 380 nm. Measure the rise with a fluorometer and compare.
  • Fluo-3 AM manufactured by Dojindo Laboratories was added to the receptor-expressing cell suspension of the present invention and incorporated into cells, and the supernatant was washed several times by centrifugation, and then a 96-well plate. Seed cells.
  • the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound are added, and the increase in the ratio of the fluorescence intensity is measured with a fluorometer and compared.
  • a protein gene (eg, aeduor in) that emits light when the intracellular Ca ion is increased is co-expressed in the receptor-expressing cell of the present invention. It is also possible to screen for compounds that change the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention by utilizing the fact that a gene protein (eg, aeauo rin) becomes Ca-binding and emits light. .
  • the receptor-expressing cells of the present invention that co-occur and express a protein gene that emits light when the intracellular Ca ion rises are seeded in a 96-well plate, and in the same manner as described above, the ligand of the present invention or the ligand of the present invention. Add the test compound and measure the increase in the ratio of fluorescence intensities using a fluorometer.
  • a test compound that suppresses the increase in fluorescence intensity due to the ligand of the present invention can be selected as an candidate candidate for antagonist.
  • the intracellular inositol triphosphate concentration increases.
  • a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened. Can be binned.
  • the ligand of the present invention in the presence of labeled inositol.
  • the ligand of the present invention and the test compound are added to the receptor-expressing cell of the present invention.
  • a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened. The measurement is performed according to a known method.
  • a test compound that suppresses inositol monophosphate production activity can be selected as an candidate gonist candidate compound.
  • Agonists can be screened by measuring the increase in tall triphosphate production.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded in a 24-well plate and cultured for 1 day. After that, the cells are cultured in a medium supplemented with myo- [2-] inositol (2.5 Ci / we 1) for 1 day, and the cells are thoroughly washed with a medium not containing radioactive inositol. After adding the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and the test compound, 10% perchloric acid is added to stop the reaction. 1.
  • test compound having an inositol triphosphate production activity of, for example, 50% or less can be selected as an candidate antagonist compound.
  • Binding of the ligand of the present invention to the receptor of the present invention by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention against the receptor-expressing cell of the present invention using a TRE-reporter gene vector It is possible to screen for compounds that change sex.
  • DNA containing TRE is inserted upstream of the reporter gene of the vector to obtain a TRE-repo gene.
  • stimulation accompanied by an increase in intracellular calcium concentration is caused by TRE-mediated reporter gene expression followed by the gene product of the reporter gene. Induces the production of (protein). That is, by measuring the enzyme activity of the reporter gene protein, it is possible to detect changes in the amount of calcium in the cells into which the ⁇ -repo overnight gene vector has been introduced.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is brought into contact with the TRE-reporter gene vector-introduced receptor-expressing cell of the present invention, the ligand of the present invention and the test compound are transformed into the TRE-repo gene.
  • the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is changed.
  • the compound to be screened is screened.
  • TRE for example, Pitzka Gene Basic Vector, Picker Gene Enhancer Vector (Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.) and the like are used.
  • a DNA containing TRE is inserted into the above vector reporter gene, for example, a multicloning site upstream of a luciferase gene, to form a TRE-, reporter gene vector.
  • a test compound that suppresses the enzyme activity of the repo overnight gene protein by the ligand of the present invention can be selected as an antagonist candidate compound.
  • screening of agonis can be performed by contacting only the test compound with the TRE-reporter gene vector introduced into the receptor-expressing cell of the present invention and measuring the increase in the amount of luminescence similar to the ligand of the present invention. .
  • ⁇ - receptor expressing cells repo Isseki present invention obtained by introducing a monogenic (luciferase) were seeded at 5xl0 3 ce ll / we ll on a 24-well plate, cultured for 48 hours. After washing the cells with Hank's buffer (pH 7.4) containing 0.05% BSA and 20 HEPES, the IOM ligand of the present invention or the IOM ligand and test compound of the IOM were added, and the mixture was incubated at 37 ° C. Incubate for 60 minutes.
  • Hank's buffer pH 7.4
  • the IOM ligand of the present invention or the IOM ligand and test compound of the IOM were added, and the mixture was incubated at 37 ° C. Incubate for 60 minutes.
  • a cell lysing agent for picazine Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.
  • a luminescent substrate Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.
  • Luminescence by luciferase is measured with a luminometer, liquid scintillation counter or top counter.
  • Luciferase with the addition of the ligand of the invention and with 10 M of the ligand of the invention and the test compound Measure the amount of light emitted by and compare.
  • the increase in intracellular calcium by the ligand of the present invention increases the amount of luminescence by luciferase.
  • a compound that suppresses this increase can be selected as an candidate candidate compound.
  • alkaline phosphatase chloramphenicol acetyltransferase, or ⁇ -galactosidase may be used as a reporter gene.
  • the enzyme activity of the gene protein is measured according to a known method or using a commercially available measurement kit.
  • Lumi-Phos 530 manufactured by Wako Pure Chemical Industries is used for the alkaline phosphatase activity
  • FAST CAT clirolamphenicol Acetyl transferase Assay KiT manufactured by Wako Pure Chemical Industries is used for the activity of chloramphenicol and le acetyltransferase.
  • the ⁇ -sword lacquer fernase activity is measured using, for example, Aurora Gal-XE manufactured by Wako Pure Chemical Industries. (9)
  • MAP kinase is activated and proliferated by stimulation of the ligand of the present invention.
  • a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor-expressing cell of the present invention. It can be fixed.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, and when the ligand of the present invention and a test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, By measuring and comparing cell proliferation, a compound that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened.
  • the proliferation of the receptor-expressing cell of the present invention may be determined, for example, by measuring MAP kinase activity, thymidine uptake activity, ATP amount, cell number, and the like.
  • MAP kinase activity the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound are added to the receptor-expressing cell fc of the present invention, and then an anti-MAP kinase anti-body is used from the cell lysate.
  • MAP kinase fraction was obtained by immunoprecipitation, and a known method such as MAP Kinase manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Measure and compare MAP kinase activity using AssayKit and key [ 32 P] -ATP.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded in a 24-well plate, cultured, added with the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound, and then thymidine labeled with radioactivity (for example, [methy ⁇ 3 H] -thymidine) is added, and then the cells are lysed, and the thymidine incorporation activity is counted with a liquid scintillation counter to measure the thymidine incorporation activity. , Compare.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded in a 96-well plate, cultured, added with the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound, for example, CellTiter-Glo. Use (Promega) to measure and compare intracellular ATP levels.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded in a 24-well plate, cultured, added with the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound, and then MTT (
  • MTT formazan which has been taken up into cells and has changed MTT, is lysed with an aqueous solution of isopropanol made acidic with hydrochloric acid, and then measured by absorption of 57 Onm and compared.
  • test compound that suppresses the proliferation of the receptor-expressing cell of the present invention can be selected as an antagonist candidate compound.
  • screening of an agonist can be performed by contacting only the test compound with the receptor-expressing cell of the present invention and measuring the cell proliferation activity similar to that of the ligand of the present invention.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded on a 24-well plate at 5000 cells / well and cultured for 1 day. Next, incubate the cells in serum-free medium for 2 days to starve the cells.
  • a ligand of the present invention or a ligand of the present invention and a test compound After adding to the vesicles and culturing for 24 hours, add [me thyl ”H] -thymidine at 0.015 MBQ per well and incubate for 6 hours. Wash the cells with PBS, add methanol, and let stand for 10 minutes. Next, add 5% trichlorodiacetic acid and let stand for 15 minutes. Wash the fixed cells 4 times with distilled water. 0. Dissolve the cells with 3N sodium hydroxide solution, and measure the radioactivity in the lysate with a liquid scintillation counter.
  • a test compound that suppresses an increase in radioactivity when the ligand of the present invention is added can be selected as an antagonist candidate compound.
  • the potassium channel is activated by the stimulation of the ligand of the present invention, and K ions in the cell flow out of the cell.
  • the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor-expressing cell of the present invention is measured, and thereby the compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened. Can be used.
  • Rb ions rubberidium ions
  • the Rb [ 86 Rb]
  • the Rb is incorporated into the receptor-expressing cells of the present invention, and then the flow of 86 Rb that flows out by stimulation with the ligand of the present invention (efflux activity).
  • efflux activity By measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor-expressing cell of the present invention.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention in the presence of S6 Rb, the ligand of the present invention and the test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention.
  • 86 Rb efflux activity is measured and compared to screen for compounds that change the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention.
  • test compound is brought into contact with the receptor-expressing cell of the present invention.
  • An agonist can be screened by measuring the increase in 86 Rb efflux activity similar to that of the other ligands.
  • the receptor-expressing cells of the present invention are seeded in a 24-well plate and cultured for 2 days. Then, incubate in a medium containing lmC i / ffll 86 RbCl for 2 hours. Wash the cells thoroughly with medium and completely remove 86 RbCl in the external solution.
  • the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and the test compound are added to the cells. After 30 minutes, the external solution is collected, and the radioactivity is measured with a ⁇ counter and compared.
  • test compound that suppresses the increase in 86 Rb efflux activity by ligand stimulation of the present invention can be selected as an antagonist candidate compound.
  • the receptor-expressing cell of the present invention reacts with the ligand of the present invention, and the extracellular pH changes. Using this reaction, a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is measured by measuring the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor-expressing cells of the present invention. It can be done.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, and when the ligand of the present invention and a test compound are contacted with the receptor-expressing cell of the present invention, By measuring and comparing extracellular pH change, a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened.
  • the extracellular pH change is measured using, for example, a Cytosensor device (Molecular Device).
  • test compound that suppresses the extracellular pH change caused by the ligand of the present invention can be selected as an candidate antagonist compound.
  • screening of the agonist can be performed by contacting only the test compound with the receptor-expressing cell of the present invention and measuring the extracellular pH change similar to the ligand of the present invention.
  • a compound that suppresses the extracellular pH change by the ligand of the present invention can be selected as an antagonist candidate compound.
  • Sex pheromone receptor Ste2 of Saccharomyces cerevisiae haploid-mating type (MAT) is coupled to G protein Gpal and activates MAP kinase in response to sex pheromone-mating factor. Subsequently, Farl (cell-cycle arrest) and the transcriptional activator Stel2 are activated. Stel2 induces the expression of various proteins (eg, FUS1 involved in conjugation).
  • the control factor Sst 2 functions in a suppressive manner in the above process.
  • a yeast into which a receptor gene has been introduced is prepared, a signal transduction system in the yeast cell is activated by stimulation of the receptor agonist, and the resulting proliferation is used as an indicator.
  • a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention can be screened using the above receptor gene-introduced yeast system.
  • the gene encoding Ste2 and Gpal of MAT yeast is removed, and a gene encoding the receptor gene of the present invention and the Gpal-Gai2 fusion protein is introduced instead.
  • the gene encoding Farl is removed so that cell-cycle arrest does not occur, and the gene encoding Sst2 is removed to improve the sensitivity of the response to the ligand of the present invention.
  • the FUS1-HIS3 gene in which the histidine biosynthesis gene HIS3 is linked to FUS1, is introduced. This gene recombination operation is performed, for example, in the method described in Molecular and Cellular Biology, Vol. 15, pp. 6188-6195, 1995. This can be carried out by substituting the SSTR2 gene with the receptor of the present invention.
  • the transformed yeast constructed in this way reacts with high sensitivity to the ligand of the present invention.
  • activation of MAP kinase occurs, histidine biosynthetic enzyme is synthesized, and grows in a medium lacking histidine. It becomes possible.
  • the receptor-expressing yeast of the present invention (Ste2 gene and Gpal gene are removed, the receptor gene of the present invention and the GpaI-Gai2 fusion protein-encoding gene are introduced, and the Far gene and Ss gene are introduced.
  • the gene is removed and the FUS (HIS3 gene introduced ( ⁇ yeast) is cultured in a histidine-deficient medium, and the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound are contacted,
  • test compound that suppresses the growth of the yeast can be selected as an candidate candidate compound.
  • the receptor-expressing yeast of the present invention is cultured overnight in a completely synthetic liquid medium, and then added to a dissolved agar medium from which histidine has been removed to a concentration of 2xl04 4 cel / ml. Then, sow in a 9x9cm square petri dish. After the agar has solidified, sterilized filter paper impregnated with the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and a test compound is placed on the surface of the agar and cultured at 30 ° C. for 3 days. The effect of the test compound is compared to the growth of the yeast around the filter paper compared to the case of using sterile filter paper soaked with only the ligand of the present invention.
  • the ligand of the present invention is added in advance to an agar medium from which histidine has been removed, the test compound is soaked in a sterile filter paper, and the yeast is cultured.
  • the growth of the yeast on the entire surface of the petri dish affects the surroundings of the filter paper. You may observe receiving.
  • a compound that suppresses the growth of yeast can be selected as an candidate for an antagonist.
  • the ligand of the present invention when the ligand of the present invention is contacted with the receptor gene RNA-introduced Xenopus oocyte of the present invention, the ligand of the present invention and the test compound are introduced into the receptor gene RNA of the present invention.
  • a compound that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened. Two.
  • a test compound that suppresses changes in cell membrane potential can be selected as an candidate candidate compound.
  • an agonist can be screened by contacting only the test compound with the Xenopus oocyte into which the receptor gene RNA of the present invention is introduced and measuring the change in cell membrane potential similar to the ligand of the present invention.
  • a specific example of the screening method is described below.
  • the oocyte mass removed from the female Xenopus laevis that was unable to move due to ice-cooling was stored in the MBS solution (88 mM NaCl, lniMKCl, 0.41 mM CaCl 2 , 0.33 mM Ca (N0 3 ) 2 , 0.82 mM MgS0 4 , 2.4 mM NaHC0 3, lOmM HEPES; pH7.4) collagenase dissolved in (0.5mg / ml) 19 ° until the oocytes are loosened by C, 1 to 6 hours, to process at 150 rpm. Washed 3 times by substituting the MBS solution with the external solution. Micromanipure —In the evening, the receptor gene poly A added cRNA (50 ng / 50 nl) of the present invention was oocytes Microinject into.
  • the receptor gene mRNA of the present invention may be prepared from tissues or cells, or may be transcribed in vitro from brass.
  • the receptor gene mRNA of the present invention is cultured in MBS solution at 20 ° C for 3 days, and this is placed in a recess of a vo lt age cl amp apparatus in which Ringer solution is flowing, and a potential fixing glass microelectrode and potential Glass for measurement Insert a microelectrode into the cell, and place the (-) electrode outside the cell.
  • the Ringer solution containing the ligand of the present invention or the ligand of the present invention and the test compound is flowed to record the potential change.
  • the effect of the test compound was measured by comparing the change in cell membrane potential of the Xenopus laevis oocytes introduced with the receptor gene RNA of the present invention with a ring solution containing only the ligand of the present invention. can do.
  • a compound that suppresses changes in cell membrane potential can be selected as an candidate antagonist compound.
  • poly A-added RNA of various G protein genes may be introduced.
  • poly A-added RNA of a gene that produces luminescence in the presence of calcium eg, aequor in
  • the amount of luminescence can be measured instead of membrane potential change.
  • the receptor-expressing cell of the present invention reacts with the ligand of the present invention, and the receptor is taken into the cell from the cell surface '(internalization; internalization). By using this reaction, the stimulating activity of the ligand of the present invention on the receptor-expressing cell of the present invention is measured, and thereby a compound that changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention is screened. Can be done.
  • the receptor-GFP fusion protein of the present invention expressed in cells can be observed with an image analyzer (eg, fluorescence microscope, Aquacosmos (Hamamatsu Photonics), etc.). It can be detected by analyzing the location of the receptor of the present invention in a cell.
  • an image analyzer eg, fluorescence microscope, Aquacosmos (Hamamatsu Photonics), etc.
  • a test compound that suppresses receptor internalization by the ligand of the present invention can be selected as an antagonist candidate compound.
  • An expression plasmid for expressing a fusion protein linked to Green Fluorescent Protein (GFP) cDNA isolated from Ewan jellyfish is constructed by aligning the translation frame with the C-terminus of the receptor of the present invention. At that time, a fragment excised from the GFP expression vector PQB I 25 (Takara Shuzo) can be used as the GFP cDNA.
  • the constructed receptor-GFP fusion protein expression plasmid is transferred to CH0 cells according to a conventional method to obtain a receptor-GFP fusion protein-expressing CH0 cell line.
  • a compound that suppresses internalization by the ligand of the present invention can be selected as an candidate antagonist compound.
  • a screening kit for a compound that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention or a salt thereof is the receptor of the present invention or a cell membrane containing the receptor of the present invention. And a ligand of the present invention.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following. 1. Reagent for screening
  • Filter sterilize with a filter with a pore size of 0.45 mm and store at 4 ° C or prepare at use.
  • CH0 cells expressing the receptor of the present invention were subcultured at 5 ⁇ 10 5 cells / well in a 12-well plate and cultured at 37 ° (:, 5% C 0 2 , 95% air for 2 days.
  • the ligand of the present invention is dissolved in an appropriate solvent or buffer.
  • the ligand of the present invention is dissolved in ImM with PBS containing 0.1% ushi serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at -20 ° C.
  • the compound obtainable by using the screening method of the present invention or the screening kit or a salt thereof is a compound that changes the binding between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention or the activity of the receptor of the present invention. Specifically, (i) a compound having cell-stimulating activity via the receptor of the present invention or a salt thereof (receptor agonist of the present invention),
  • a compound that promotes the binding force between the receptor of the present invention and the ligand of the present invention examples include compounds selected from peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • salt of the compound the same salts as those of the receptor of the present invention described above can be used.
  • the method for evaluating whether the receptor antagonist of the present invention is an antagonist or an antagonist may be, for example, according to the following (i) or (ii).
  • (i) A compound that undergoes the binding assay shown in the screening methods of (a) to (c) above and changes the binding property between the ligand of the present invention and the receptor of the present invention (in particular, inhibits binding). Then, it is determined whether or not the compound has a cell stimulating activity via the receptor of the present invention described above.
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is the receptor agonist (agonist) of the present invention, and the compound having no such activity or a salt thereof is the receptor antagonist of the present invention. is there.
  • test compound is brought into contact with a cell containing the receptor of the present invention, and the cell stimulating activity via the receptor of the present invention is measured.
  • a compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is the receptor agonist of the present invention.
  • the ligand of the present invention has a nerve activity regulating activity, a motor function regulating activity, etc.
  • the receptor of the present invention In order to increase the intracellular cAMP concentration in neurons such as the striatum, nucleus accumbens, hippocampus, frontal lobe, etc. expressing the receptor of the present invention, one of the causes of the positive symptoms of schizophrenia, for example, It is possible to suppress the overactivity of the mesolimbic dopamine pathway, which is considered to be the best, and to improve the positive symptoms of schizophrenia.
  • the ligand of the present invention improves the negative function of DA-type receptors in the cerebral cortex, which is one of the causes of schizophrenia negative symptoms and cognitive impairment, and negative symptoms and cognitive impairment of schizophrenia. Can be improved.
  • the receptor agonist ⁇ of the present invention has the same action as the physiological activity (eg, nerve activity modulation activity, motor function modulation activity, etc.) possessed by the ligand of the present invention, and is safe and low toxic.
  • Medicine eg, mental illness (eg, schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug-induced psychotic disorder, delusional psychosis, etc.), prolactin secretion failure (eg, decreased ovarian function) Dysfunction, seminal vesicle development, climacteric disorder, hypothyroidism, etc.), hypertension, sleep disorders [eg, primary insomnia, circadian rhythm disorders (eg, physical condition changes due to three shifts, etc.) It is useful as a prophylactic / therapeutic agent such as schizophrenia, cognitive impairment, and prolactin secretion failure.
  • the receptor antagonist of the present invention can suppress the physiological activity (eg, nerve activity regulating activity, motor function regulating activity, etc.) possessed by the ligand of the present invention, and the striatum expressing the receptor of the present invention.
  • physiological activity eg, nerve activity regulating activity, motor function regulating activity, etc.
  • striatum expressing the receptor of the present invention.
  • Body, nucleus accumbens, hippocampus, frontal lobe In order to reduce the intracellular cAMP concentration of any neuron, for example, to improve the inhibition of intracellular cAMP production caused by dopamine deficiency in the nigrostriatal dopamine pathway, which is the cause of Parkinson's disease it can.
  • the receptor Antagonis ⁇ of the present invention is a safe and low-toxic drug such as a mental illness (eg, neuroleptic-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinson's symptoms group, extrapyramidal symptoms, etc.), prolactin Prophylactic / therapeutic agents such as hypersecretion (eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy), pituitary gland tumors, diencephalon tumors, menstrual abnormalities, etc.)
  • hyperprolactinemia eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy
  • it is useful as a preventive or therapeutic agent for Parkinson's disease, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy, etc.).
  • a compound that promotes the binding force between the receptor of the present invention and the ligand of the present invention is a safe and low-toxic drug, such as mental illness (eg, schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobia Disorders, drug-induced psychotic disorders, delusional psychosis, etc.), prolactin secretion failure (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle development failure, climacteric disorder, hypothyroidism, etc.), hypertension, sleep disorders (eg, primary) Insomnia, circadian rhythm disorders (eg, physical condition modulation due to three shifts, time zone change syndrome, etc.), etc., preferably schizophrenia, cognitive impairment, prolactin secretion failure It is useful as a preventive and therapeutic agent.
  • mental illness eg, schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobia Disorders, drug-induced psychotic disorders, delusional psychosis, etc.
  • prolactin secretion failure eg, ovarian hypofunction, seminal
  • a compound that inhibits the binding force between the receptor of the present invention and the ligand of the present invention is a safe and low-toxic drug such as a mental illness (eg, neuroleptic-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinson's symptoms, extrapyramidal symptoms, etc.), prolactin hypersecretion (eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy), pituitary gland tumors, between (Brain tumor, menstrual abnormalities, etc.), etc., preferably Parkinson's disease, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy), etc. It is useful as such.
  • a mental illness eg, neuroleptic-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinson's symptoms, extrapyramidal symptoms, etc.
  • the present invention also provides a polynucleotide of the present invention that encodes the receptor of the present invention.
  • the present invention also provides a screening method for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the gene of the receptor of the present invention, characterized by using a tide. Specifically, (i) when cells having the ability to produce the receptor of the present invention are cultured, and (ii) a mixture of cells having the ability to produce the receptor of the present invention and a test compound is cultured. Comparison with the case is carried out, and a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the gene of the receptor of the present invention is screened.
  • the expression level of the gene of the receptor of the present invention (specifically, the receptor amount of the present invention or the receptor of the present invention is encoded). Measure the amount of mRNA, etc.) to compare.
  • test compounds include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.
  • the compound may be a known compound or a known compound.
  • the buffer may be any buffer that does not inhibit the activity of the receptor of the present invention, such as a phosphate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably a pH of about 6 to 8) or a borate buffer. Also good.
  • a host transformed with a vector containing the above-described DNA encoding the receptor of the present invention is used.
  • animal cells such as C 3 H 2 O cells are preferably used.
  • a transformant in which the receptor of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
  • the protein amount of the receptor of the present invention can be measured by a known method, for example, the polypeptide or receptor present in a cell extract using the antibody of the present invention, Western analysis, ELISA method, etc. Or similar to It can be measured according to the method.
  • the gene expression level of the receptor of the present invention can be determined by a known method such as Northern blotting, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time PCR analysis system (ABI, TaQMan polymerase chain reaction), etc. Measurements can be made according to the method described above or a method similar thereto.
  • the expression of the gene of the receptor of the present invention in the case (ii) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50%, compared to the case (i).
  • the test compound that promotes the above can be selected as a compound that promotes the expression of the receptor gene of the present invention or a salt thereof.
  • the expression of the gene of the receptor of the present invention in the case (ii) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50%, compared to the case (i).
  • a test compound that inhibits at least% can be selected as a compound that inhibits the expression of the receptor gene of the present invention or a salt thereof.
  • a compound or a salt thereof that promotes the expression of the gene of the receptor of the present invention (increases the expression level), for example, a psychiatric disorder (eg, schizophrenia, anxiety, recognition) Disorder, sonic disorder, phobic disorder, drug-induced psychotic disorder, delusional psychosis, etc.), prolactin secretion failure (eg, hypoovial function, seminal vesicle development failure, climacteric disorder, hypothyroidism), high Preventive / therapeutic agents such as blood pressure, sleep disorders [eg, primary insomnia, circadian rhythm disorders (eg, physical condition modulation due to three shifts, etc., time zone change syndrome, etc.)], preferably It is useful as a preventive and therapeutic agent for schizophrenia, cognitive impairment, and prolactin secretion failure.
  • a psychiatric disorder eg, schizophrenia, anxiety, recognition) Disorder, sonic disorder, phobic disorder, drug-induced psychotic disorder, delusional psychosis, etc.
  • the compound or its salt that inhibits the expression of the receptor gene of the present invention can suppress the physiological activity of the ligand of the present invention for the receptor of the present invention, for example, mental disorders (eg, nerve blockade) Drug-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinson's symptoms group, extrapyramidal symptoms, etc., prolactin hypersecretion [eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovary and uterus) Atrophy), pituitary gland tumor, diencephalon Tumors, menstrual abnormalities, etc.), etc., preferably Parkinson's disease, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy, etc.) is there.
  • mental disorders eg, nerve blockade
  • prolactin hypersecretion eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk
  • the compound or salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention is, for example, a peptide, a protein, an antibody, a non-peptide compound, a synthetic compound, a fermentation product, a cell extract, or a plant extract.
  • a compound selected from animal tissue extracts, plasma, and the like, a compound that changes the binding between the receptor of the present invention and the ligand of the present invention, and a compound that promotes or inhibits the activity or function of the receptor of the present invention A compound that promotes or inhibits expression (increases or decreases the expression level) of the gene of the receptor of the present invention.
  • salt of the compound the same salts as those of the receptor of the present invention described above can be used.
  • the compound obtained by using the screening method or screening kit of the present invention or a salt thereof is used as the above-mentioned pharmaceutical (such as a prophylactic / therapeutic agent), it can be carried out according to conventional means.
  • the compound or a salt thereof is, for example, as a tablet, a capsule, an elixir, a microcapsule or the like with sugar coating as required, or aseptically with water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of an injection such as an aqueous solution or suspension.
  • additives examples include gelatin, corn starch, tragacanth, binders such as gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • Leavening agent such as magnesium stearate Lubricants, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, squid mono oil or cherry are used.
  • a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection should be treated according to normal formulation practices such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. Can do.
  • aqueous solutions for injection examples include isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose, and other adjuvants.
  • isotonic solutions eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • physiological saline glucose, and other adjuvants.
  • J-recall for example, ethanol
  • polyalcohol for example, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.
  • nonionic surfactant for example, polysorbate 80 TM , HCO-50, etc.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • the compound or a salt thereof is added to a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, pro-hydrochloride-in, etc.), a stabilizer (eg, human) Serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc.
  • a buffer eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • a soothing agent eg, benzalkonium chloride, pro-hydrochloride-in, etc.
  • a stabilizer eg, human Serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic.
  • humans or warm-blooded animals eg mice, rats, rabbits, hidges, bushes, bushes, horses, birds, cats, dogs
  • Monkeys, chimpanzees, etc. e.g., Monkeys, chimpanzees, etc.
  • the dose of the compound or its salt varies depending on its action, target disease, administration subject, administration route and the like.
  • the compound (agonist) per day is about 0.1 to 100 nig, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferred. Or about 1.0 to 20 mg orally.
  • the compound is about 0.01-30 fflg per day, It is convenient to administer preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • patients with Parkinson's disease per 60 kg body weight orally about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound (antagonist) per day To do.
  • the compound when administered parenterally, for example, when the compound is administered in the form of an injection to a patient with Parkinson's disease (per body weight of 60 kg), the compound is about 0.01 to 30 mg, preferably about It is preferred to administer 0.1 to -20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • the receptor of the present invention has a binding activity to the ligand of the present invention having the activity described above. Therefore, if the receptor (eg, DNA) of the present invention is abnormal or deficient, for example, mental illness (eg, schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug Induced psychosis disorder, paranoid psychosis, neuroleptic-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinson's symptoms group, extrapyramidal symptoms, etc., prolactin-related diseases [eg, hyperprolactinemia (eg, infertility) , Milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy, etc.) pituitary gland tumors, diencephalon tumors, abnormal menstrual flow, impaired prolactin secretion (eg, ovarian dysfunction, seminal vesicle development failure, menopause, hypothyroidism, etc.) ), Etc., hypertension, sleep disorders [eg, primary insomnia
  • the receptor (eg, DNA) of the present invention can be used in, for example, mental illness (eg, schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug-induced psychotic disorder, delusional psychosis, nerve Blocker-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug induction Parkinsonian symptoms, extrapyramidal symptoms, etc.), prolactin-related diseases (eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy), pituitary gland tumors, diencephalon tumors, Abnormal menstruation, prolactin secretion failure (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle growth failure, climacteric disorder, hypothyroidism, etc.), hypertension, sleep disorders (eg, primary insomnia, circadian rhythm disorders (eg, , Modulation of physical condition due to three shifts, etc., time-zone change syndrome (time difference blur, etc.)]),
  • the receptor of the present invention is reduced in vivo.
  • the cell of the present invention After the polynucleotide is inserted and the receptor of the present invention is expressed, the cell is transplanted into the patient, or (c) the receptor of the present invention is administered to the patient, etc.
  • the role of the receptor of the present invention can be exhibited sufficiently or normally.
  • the polynucleotide of the present invention When the polynucleotide of the present invention is used as the above-mentioned preventive / therapeutic agent, the polynucleotide is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, etc. Thereafter, it can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional methods.
  • the polynucleotide of the present invention can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting ingestion, and can be administered by a force device such as a gene gun or a hydrogel catheter.
  • the receptor of the present invention When the receptor of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it is purified to at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more. It is preferable to use the same.
  • the receptor of the present invention is orally administered, for example, as a tablet, capsule, elixir, microcapsule, etc. It can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection such as a suspension.
  • the receptor of the present invention in a unit dosage form required for the practice of a generally accepted formulation along with physiologically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. It can be produced by mixing.
  • the amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose within the indicated range can be obtained.
  • Additives that can be mixed into tablets, capsules, etc. include, for example, gelatin, corn starch, tragacanth, binders such as gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin,
  • Swelling agents such as alginic acid, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cheri.
  • a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above-mentioned type material.
  • Sterile compositions for injection should be treated according to normal formulation practices such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. Can do.
  • aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agents such as alcohol (for example, ethanol), polyalcohol (for example, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (for example, polysorbate 80 TM , HC0150, etc.), etc. May be used in combination.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • Buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol) Etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • a vector into which the polynucleotide of the present invention (eg, DNA) is inserted is formulated in the same manner as described above and is usually used parenterally.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic.
  • humans or warm-blooded animals eg rats, mice, guinea pigs, rabbits, birds, birds, pigs, rabbits, horses, cats
  • Inu, monkeys, etc. e.g., cows, cows, etc.
  • the dose of the receptor of the present invention varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc.
  • the receptor of the present invention is orally administered for the purpose of treating Parkinson's disease
  • the receptor In adults (weight 60 kg), the receptor is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose of the receptor varies depending on the subject of administration, target disease, etc.
  • about 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the receptor is injected into the affected area per day. It is convenient to administer.
  • the converted dose can be administered per 60 kg body weight.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the receptor of the present invention, it can be used for quantification of the receptor of the present invention in a test solution, particularly quantification by a sandwich immunoassay method. it can.
  • the antibody of the present invention is reacted competitively with the test solution and the labeled receptor of the present invention, and the labeled ratio of the labeled receptor of the present invention bound to the antibody is measured.
  • a method for quantifying the receptor of the present invention in a test solution and (ii) After reacting the test solution with the antibody of the present invention insolubilized on the carrier and the labeled another antibody of the present invention simultaneously or successively, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured.
  • the method for quantifying the receptor of the present invention in a test solution is provided.
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal part of the receptor of the present invention, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal part of the receptor of the present invention. desirable.
  • the antibody molecule itself may be used, or the Fb ′) 2 , Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the receptor of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and an antibody, antigen or antibody-antigen corresponding to the amount of antigen (for example, amount of polypeptide) in the solution to be measured.
  • Any measurement method can be used as long as the amount of complex is detected by chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • nephrometry, competition method, immunometric method and sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
  • Examples of the labeling agent used in the measurement method using the labeling substance include radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, and luminescent substances.
  • radioisotope for example, [I], [131 1], [, and the like are used [14 c].
  • enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • j8-galactosidase, / 3-darcosidase, alkaline phosphatase, paroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • As the fluorescent material for example, fluorescamine, fluorescenzothiocyanate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a piotin-avidin system can be used for the binding of the antibody or antigen and the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, or glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further labeled with another monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction), followed by insolubilization.
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at different times.
  • the labeling agent and the method for insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used for the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site for the receptor of the present invention. Used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is used in the primary reaction, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal part of the receptor of the present invention.
  • the antibody is preferably an antibody that recognizes other than the C end, for example, the N end.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competitive method, an immunometric method or nephrometry.
  • the antigen in the test solution and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen bound to the antibody (F B) and (BZF separation), measure the amount of either B or F label, and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as the antibody.
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, and a solid phase antibody is used as the first antibody.
  • the antibody may be soluble and the second antibody may be a solid phase method using a solid phase antibody.
  • the solid phase and the liquid phase are separated after a competitive reaction between the antigen in the test solution and the immobilized antigen against a certain amount of labeled antibody, or the test solution After reacting an excess amount of labeled antibody with an excess amount of labeled antibody, and then adding solid-phased antigen to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, the solid phase and liquid phase are separated
  • nephrometry In nephrometry, the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in gel or solution is measured.
  • Laser-nephrometry which uses laser scattering, is also preferably used when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of precipitate can be obtained.
  • the receptor measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to the usual conditions and operation methods in each method. For details on these general technical means, refer to reviews and textbooks.
  • the receptor of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • Psychiatric disorders eg, schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug-induced psychotic disorder, delusional psychosis, neuroleptic-induced dyskinetic, Parkinson's disease, drug-induced Parkinson's symptoms Group, extrapyramidal symptoms, etc.
  • prolactin-related diseases eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy), pituitary gland tumor, mesencephalic tumor, menstrual abnormalities , Prolactin secretion deficiency (eg, ovarian dysfunction, seminal vesicle growth deficiency, climacteric disorder, thyroid function decline, etc.), hypertension, sleep disorder (eg, primary insomnia, circadian rhythm disorder (eg, three alternations) Modulation due to work, time zone change syndrome (time difference blur), etc.)] (especially schizophrenia, cognitive impairment, prolactin secretion failure, etc.) Can be diagnosed as
  • a decrease in the concentration of the receptor of the present invention is detected, for example, mental illness (eg, schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug-induced psychotic Disorders, delusional psychosis, neuroleptic-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinson's symptoms, extrapyramidal symptoms, etc., prolactin-related diseases (eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage) , Amenorrhea, ovarian and uterine atrophy, etc.), pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormality, prolactin secretion failure (eg hypoovia, seminal vesicle development, climacteric disorder, hypothyroidism, etc.) ), Hypertension, sleep disorders [eg, primary failure (Such as Parkinson's disease, hyperprolactinemia, etc.) or in the future, such as sleep, circadian rhythm disorders (eg, physical condition change due
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the receptor of the present invention present in a subject such as a body fluid or tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the receptor of the present invention, detection of the receptor of the present invention in each fraction during purification, analysis of the behavior of the receptor of the present invention in a test cell, etc. Can be used for. [4] Genetic diagnostic agents
  • the polynucleotide (DNA) of the present invention can be used, for example, as a probe to cause warm-blooded humans (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, birds, hidges, bushes, bushes, horses).
  • DNA or mRNA abnormalities (genetic abnormalities) encoding the receptor of the present invention in cats, cats, dogs, monkeys, etc.) can be detected, for example, damage or mutation of the DNA or mRNA.
  • it is useful as a genetic diagnostic agent such as decreased expression, increased DNA or mRNA, or excessive expression.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed by, for example, the known Northern hybridization method PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy. of Sciences of the United States of America, 86, 2766-2770 (1989)).
  • the gene of the receptor of the present invention when overexpression of the gene of the receptor of the present invention is detected, for example, mental illness (eg, schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug-induced psychotic disorder , Delusional psychosis, neuroleptic-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinson's symptoms group, extrapyramidal symptoms, etc., prolactin-related diseases (eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea) Ovaries and uterus atrophy), pituitary gland Glandular tumors, diencephalon tumors, menstrual abnormalities, prolactin secretion failure (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle growth failure, menopause, hypothyroidism, etc.)), hypertension, sleep disorders (eg, primary insomnia, Circadian rhythm disorders (eg, modulation of physical condition due to three shifts, etc., time zone change syndrome, etc.
  • a decrease in the gene expression of the receptor of the present invention is detected, for example, mental illness (e.g., schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug-induced psychosis) Disorders, paranoid psychosis, neuroleptic-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinson's symptoms group, extrapyramidal symptoms, etc., prolactin-related diseases [eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage) Amenorrhea, ovarian and uterine atrophy, etc.), pituitary gland tumor, diencephalon tumor, abnormal menstrual flow, prolactin secretion failure (eg, hypoovarian function, seminal vesicle development failure, climacteric disorder, hypothyroidism, etc.)) Hypertension, sleep disorders
  • mental illness e.g., schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug-induced psychosis
  • paranoid psychosis
  • a drug containing an antisense polynucleotide eg, DNA
  • it can bind to the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention in a complementary manner and suppress the occurrence of the polynucleotide (eg, DNA).
  • Antisense polynucleotides can be used, for example, for mental illness (eg, schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug-induced psychotic disorder, paranoid psychosis, nerve Blocker-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinson's symptoms, extrapyramidal symptoms, etc., prolactin-related diseases (eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovary and uterine) Atrophy), pituitary gland tumors, diencephalon tumors, menstrual abnormalities, prolactin secretion failure (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle growth failure, Menopause, hypothyroidism, etc.), hypertension, sleep disorders (eg, primary insomnia, circadian rhythm disorders (eg, physical condition changes due to three shifts, etc., time zone change syndrome, etc.) Prevention and treatment agents such as Parkinson'
  • the antisense DNA when used, the antisense DNA is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, etc.
  • an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, etc.
  • the antisense or DNA can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting ingestion, and can be administered through a catheter such as a gene gun or a hydrogel force taper.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression status of the DNA of the present invention in tissues and cells.
  • double-stranded RNA containing a part of RNA encoding the receptor of the present invention can also suppress the expression of the polynucleotide of the present invention.
  • the function of the receptor of the present invention or the polynucleotide of the present invention can be suppressed in vivo, for example, mental illness (eg, schizophrenia, anxiety, cognitive disorder, panic disorder, phobic disorder, Drug-induced psychiatric disorder, paranoid psychosis, neuroleptic-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinson's symptoms group, extrapyramidal symptoms, etc.)
  • Prolactin-related diseases eg, hyperprolactinemia (Eg, infertility, milk leak, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy), pituitary gland tumors, diencephalon tumors, menstrual abnormalities, prolactin secretion failure (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle growth failure, further Year Hypertension, sleep disorders (eg, primary insomnia, circadian rhythm disorders (eg, physical condition changes due to three shifts, time zone change syndrome, etc.) It is useful as a low-toxic
  • the double-stranded RNA can be produced by designing based on the sequence of the polynucleotide of the present invention in accordance with a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • the lipozyme can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, 221 pages, 2001). .
  • it can be produced by linking a known lipozyme to a part of RNA encoding the receptor of the present invention.
  • a part of the RNA encoding the receptor of the present invention of the present invention includes a portion (RNA fragment) adjacent to the cleavage site on the RNA of the present invention that can be cleaved by a known liposome.
  • RNA or lipozyme When the above double-stranded RNA or lipozyme is used as the prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
  • the receptor for the receptor of the present invention also includes, for example, mental disorders (eg, schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug inducement).
  • mental disorders eg, schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug inducement.
  • 3 ⁇ 4 psychotic disorder, paranoid psychosis neuroleptic-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinson's symptoms group, extrapyramidal symptoms, etc.
  • prolactin-related diseases eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, Milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy, etc.), pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormality, prolactin secretion failure (eg, hypoovarian function, seminal vesicle development failure, menopause, hypothyroidism, etc.) Etc.
  • Sleep disorders eg, primary insomnia, circadian rhythm disorders (eg, physical condition change due
  • the aptamer is obtained by a known method, for example, SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method (Annual Review of Medicine 56, 555-583, 2005).
  • SELEX systematic evolution of ligands by exponential enrichment
  • the structure of the abutama can be determined using a known method, and the abutama is produced according to a known method based on the structure.
  • Abutama When the above-mentioned Abutama is used as a medicine, it can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
  • the antibodies of the present invention can be used, for example, for psychiatric disorders (eg, schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug-induced psychotic disorder, delusional psychosis, neuroleptic drug-induced dyskinesia, Parkinson Disease, drug-induced Parkinsonian symptoms, extrapyramidal symptoms, etc., prolactin-related diseases (eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy), pituitary gland Tumors, diencephalic tumors, menstrual abnormalities, incomplete prolactin secretion (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle growth failure, menopause, hypothyroidism, etc.), hypertension, sleep disorders (eg, primary insomnia, circadian Preventive / therapeutic agents such as rhythm disorders (eg, physical condition modulation due to three shifts, time zone change syndrome, etc.) (preferably Parkinson's disease, high It is
  • the above-mentioned medicine containing the antibody of the present invention can be used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form, as a human warm-blooded animal (eg rat, rabbit, hidge, pig, pig, cat, y Or monkeys) orally or parenterally.
  • a human warm-blooded animal eg rat, rabbit, hidge, pig, pig, cat, y Or monkeys
  • the dose varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc.
  • the dose of the antibody of the present invention is usually 0.01 to About 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably It is convenient to administer about 0.1 to 5 mg / kg body weight by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent dose can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
  • the antibody of the present invention can be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration comprises the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration solid or liquid, body dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules) Syrups, emulsions, suspensions, etc.).
  • a composition is produced by a known method and contains a carrier, diluent or excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • parenteral administration for example, injections, suppositories, etc.
  • injections are agents such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous infusions, etc. Includes shape.
  • Such an injection is prepared by a known method, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above-mentioned antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injection.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants are used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (Eg, propylene dallicol, polyethylene glycol), nonionic surfactant [eg, polysorbate 80, HCO—50 (polyoxye thylene (50 ⁇ 1) adduc tof hydrogena ted cas t or oil)] You may use together.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol Eg, propylene dallicol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactant eg, polysorbate 80, HCO—50 (polyoxye thylene (50 ⁇ 1) adduc tof hydrogena ted cas t or oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubil
  • a suppository used for rectal administration is prepared by mixing the above-mentioned antibody or a salt thereof with an ordinary suppository base.
  • the above oral or parenteral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient. Examples of such dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., usually 5 to 500 mg per dosage unit form, especially for injections 5 to 100 mg, and other dosage forms preferably contain 10 to 25 mg of the above antibody.
  • compositions may contain other active ingredients as long as undesirable interactions are not caused by blending with the antibody.
  • [7a] a prophylactic / therapeutic agent for schizophrenia or cognitive impairment comprising the receptor of the present invention or the compound or its salt that promotes the activity of the ligand of the present invention, or the ligand of the present invention
  • the receptor of the present invention or the compound that promotes the activity of the ligand of the present invention or a salt thereof refers to a compound that promotes the activity of the receptor of the present invention or the ligand of the present invention (eg, peptide, protein, antibody) Non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.) or salts thereof.
  • the salt the same salts as those of the receptor of the present invention described above can be used.
  • the compound or a salt thereof, and a ligand, when used as a medicine are conventionally used in the same manner as the compound or the salt thereof obtained by using the screening method of the present invention or the screening kit. Therefore, it can be implemented.
  • [7b] Compound for promoting the activity of the receptor of the present invention or the ligand of the present invention or a salt thereof, or a prolactin secretory prophylactic / therapeutic agent comprising the ligand of the present invention
  • the receptor of the present invention or the compound that promotes the activity of the ligand of the present invention or a salt thereof refers to a compound that promotes the activity of the receptor of the present invention or the ligand of the present invention (eg, peptide, protein, antibody) , Non-peptideization Compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, plant extract, animal tissue extract, plasma, etc.) or a salt thereof.
  • the salt the same salts as those of the receptor of the present invention described above can be used.
  • the compound or a salt thereof, and a ligand, when used as a medicine are conventionally used in the same manner as the compound or the salt thereof obtained by using the screening method of the present invention or the screening kit. Therefore, it can be implemented.
  • Prophylactic / therapeutic agent for Parkinson's disease comprising a compound that inhibits the activity of the receptor of the present invention or the ligand of the present invention or a salt thereof
  • a compound that inhibits the activity of the receptor of the present invention or the ligand of the present invention or a salt thereof includes a compound that inhibits the activity of the receptor of the present invention or the ligand of the present invention (eg, peptide, protein, Antibody, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, plant extract, animal tissue extract, plasma, etc.) or a salt thereof.
  • a compound that inhibits the activity of the receptor of the present invention or the ligand of the present invention eg, peptide, protein, Antibody, non-peptide compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, plant extract, animal tissue extract, plasma, etc.
  • the salt the same salts as those of the receptor of the present invention described above can be used.
  • the compound or a salt thereof is carried out according to a conventional method when used as a medicine (a prophylactic / therapeutic agent, etc.) as in the case of the compound obtained by the screening method or screening kit of the present invention or the salt thereof. be able to.
  • a prophylactic / therapeutic agent for hyperprolactinemia comprising a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the receptor of the present invention or the ligand of the present invention
  • a compound that inhibits the activity of the receptor of the present invention or the ligand of the present invention or a salt thereof refers to a compound that inhibits the activity of the receptor of the present invention or the ligand of the present invention (eg, peptide, protein, antibody) Non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc.) or salts thereof.
  • the salt the same salts as those of the receptor of the present invention described above can be used.
  • the compound or salt thereof is the same as the compound or salt thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention. When used as a prophylactic / therapeutic agent, etc., it can be carried out according to conventional means.
  • DN A encoding the exogenous receptor of the present invention (hereinafter abbreviated as exogenous DN A of the present invention) or its mutant DN A (abbreviated as exogenous mutant DN A of the present invention)
  • exogenous DN A of the present invention or its mutant DN A (abbreviated as exogenous mutant DN A of the present invention)
  • exogenous mutant DN A of the present invention a non-human mammal having That is, the present invention
  • a recombinant vector or the like that contains the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and can be expressed in mammals.
  • the non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or its mutant DNA includes an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm and a germ cell including a primordial cell thereof.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method It can be produced by transferring the target DNA by the lipofussion method, agglutination method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc.
  • the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, living organs, tissue cells, etc., and used for cell culture, tissue culture, etc.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned embryo cells with the above-mentioned germ cells by a known cell fusion method.
  • non-human mammals examples include ushi, buyu, hidge, goat, usagi, inu, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat, etc. It is done.
  • rodents that have relatively short ontogeny and biological cycles in terms of the creation of disease animal model systems, and that are easy to reproduce, especially mice (for example, C 5 7 B LZ6 strain, D B 6 C 3 F, system, BD F, system, B 6 D 2 F, system, BA LB / c system, ICR system, etc.) or rat (eg W istar, SD Etc.) are preferred.
  • Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention is not the DNA of the present invention inherently possessed by a non-human mammal but the DNA and NA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
  • the mutant DNA of the present invention is a DNA in which a mutation (for example, mutation) has occurred in the original DNA sequence of the present invention, specifically, addition of a base, deletion, substitution to another base.
  • a mutation for example, mutation
  • Such as DNA is used, and abnormal DNA is also included.
  • the abnormal DN A means DN A that expresses an abnormal receptor of the present invention.
  • DN A that expresses a polypeptide that suppresses the function of a normal receptor of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from mammals of the same or different species as the target animal. In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use it as a DNA construct bound downstream of a promoter that can be expressed in animal cells.
  • various mammals having the DNA of the present invention having high homology with this for example, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, Hams evening, rats, mice, etc.
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be produced.
  • Examples of the expression vector for the receptor of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as ⁇ phage, retroviruses such as Moroni leukemia virus, ⁇ vaccinia Animal viruses such as viruses or baculoviruses are used. Of these, plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, or plasmids derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulate DNA expression include (i) promoters of DNA derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.) (Ii) Promotors derived from various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.) such as albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, Muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, dartathione S-transferase, platelet-derived growth factor / 3, keratin K l, 1 ⁇ 1 0 ⁇ 14, collagen types I and II, cyclic AMP-dependent protein Kinase 3 I subunit, dystrophin, Tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial sodium diuretic factor, endothelial receptor th
  • cytomegalovirus promo that can be expressed at high levels throughout the body.
  • the promoter of human polypeptide chain elongation factor 1 (EF-1), human and chicken] 3 lactin promoter, etc. are preferred.
  • the vector preferably has a sequence (generally called terminator) that terminates transcription of the target messenger RNA in a DNA-transferred mammal.
  • terminator a sequence that terminates transcription of the target messenger RNA in a DNA-transferred mammal.
  • each vector derived from viruses and various mammals Sequences can be used, preferably Simian virus SV 40 min.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, and a part of the intron of eukaryotic DNA are converted into the promoter region, upstream, and the promoter region. It is possible to connect between regions or 3 'downstream of the translation region depending on the purpose.
  • the normal translation region of the receptor of the present invention is a liver, kidney, thyroid cell, or fiber derived from a human or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.). Acquired as a raw material from blast cell-derived DNA and all genomic DNA from commercially available genomic DNA libraries, or from complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cell, or fibroblast-derived RNA You can do it.
  • exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating a normal polypeptide translation region obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a metastasized animal by a conventional DNA engineering technique in which it is linked downstream of the promoter and optionally upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the embryo cells of the produced animal after DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells.
  • Outpatient of the present invention Descendants of this type of animal that have inherited the sex DNA have the exogenous DNA of the present invention in all their germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has been confirmed to stably retain the exogenous DNA by mating, and the DNA-bearing animal can be subcultured in a normal breeding environment. I can do it.
  • the transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be excessively present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal.
  • Excessive exogenous DNA of the present invention is present in the embryo cells of the produced animal after the DNA transfer. All the offspring of the produced animal have the exogenous DNA of the present invention in all the germ cells and somatic cells. Means that. The offspring of this type of animal that has inherited the foreign DNA of the present invention has an excess of the foreign DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention has a high expression of the normal DNA of the present invention, and the function of the receptor of the present invention is finally promoted by promoting the function of the endogenous normal DNA.
  • diseases associated with the receptor of the present invention eg, mental illness (eg, Schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug-induced psychotic disorder, paranoid psychosis, nerve blocker drug-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinson's symptoms group, extrapyramidal symptoms, etc.
  • Prolactin-related diseases eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy), Pituitary gland tumors, diencephalon tumors, abnormal menstruation, prolactin secretion failure (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle growth failure, menopause, hypothyroidism, etc.), hypertension, sleep disorders (eg, primary insomnia, It can also be used in screening tests for prophylactic / therapeutic agents for circadian rhythm disorders (eg, physical condition modulation due to three shifts, time zone change syndrome, etc.).
  • circadian rhythm disorders eg, physical condition modulation due to three shifts, time zone change syndrome, etc.
  • the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention is subcultured in a normal breeding environment as the DNA-bearing animal after confirming that the exogenous DNA is stably retained by mating. I can do it.
  • the target foreign DNA can be incorporated into the aforementioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by conventional DNA engineering techniques. Metastasis of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the subject mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the embryo cell of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells.
  • the offspring of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention has a high expression of the abnormal DNA of the present invention, and the function of the receptor of the present invention is finally inhibited by inhibiting the function of endogenous normal DNA. It can become an inactive refractory disease and can be used as a model animal for the disease state. For example, by using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the functional inactive refractory of the receptor of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA high-expressing animal of the present invention is characterized by the abnormal poly- mer of the present invention in the functional inactive refractory of the receptor of the present invention.
  • This is a model for elucidating the function inhibition (dominant negat ive action) of normal polypeptides or receptors by the peptides or the abnormal receptors of the present invention.
  • the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released receptor of the present invention
  • screening of a therapeutic drug for the functional inactive type refractory of the receptor of the present invention It can also be used for testing.
  • a polypeptide or receptor that directly analyzes or expresses DNA or RNA in the tissue of a DNA transfer animal of the present invention (ii) A polypeptide or receptor that directly analyzes or expresses DNA or RNA in the tissue of a DNA transfer animal of the present invention
  • diseases associated with the receptor of the present invention including functional inactive refractories of the receptor of the present invention [eg, psychiatric diseases (eg, schizophrenia, Anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug-induced psychotic disorder, delusional psychosis, neuroleptic-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinsonian symptoms, extrapyramidal symptoms).
  • psychiatric diseases eg, schizophrenia, Anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug-induced psychotic disorder, delusional psychosis, neuroleptic-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinsonian symptoms, extrapyramidal symptoms.
  • Prolactin-related diseases eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy), pituitary gland tumors, mesencephalic tumors, menstrual abnormalities, prolactin secretion deficiency (eg, ovary Hypotension, seminal vesicle growth failure, climacteric disorder, hypothyroidism, etc.)), hypertension, sleep disorder (eg, primary insomnia, circadian rhythm disorder (eg, three-shift work) Of Modulation, time zone change syndrome (time difference blur, etc.))), etc.), and more detailed pathological findings in each organ of the disease model related to the receptor of the present invention. It is possible to contribute to the development of new treatment methods and the research and treatment of secondary diseases caused by the diseases.
  • hyperprolactinemia eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy
  • each organ can be removed from the DNA-transferred animal of the present invention, and after minced, free DNA-transferred cells can be obtained and cultured or the cultured cells can be organized by trypsin or other proteolytic enzymes. It is.
  • the receptor-producing cells of the present invention can be specified, apothesis, the relationship with differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism in them can be investigated, and their abnormalities can be investigated. It is an effective research material for elucidating the receptors and their actions.
  • the DNA-transferred animal of the present invention in order to develop a therapeutic agent for a disease related to the receptor of the present invention, including the functional inactive refractory of the receptor of the present invention, using the DNA-transferred animal of the present invention, In addition, it is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for diseases using a quantitative method and the like. Further, using the DNA-transferred animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a DNA therapy for a disease associated with the receptor of the present invention.
  • the present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and a non-human mammal having a dna expression deficiency of the present invention.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated (2) the DNA is inactivated by introducing a repo overnight gene (eg, a j3-galactosidase gene derived from E. coli).
  • a repo overnight gene eg, a j3-galactosidase gene derived from E. coli.
  • the DNA is inactivated by introducing a repo overnight gene (eg, a j3-galactosidase gene derived from E. coli), and the reporter gene is expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention.
  • a repo overnight gene eg, a j3-galactosidase gene derived from E. coli
  • a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated means that the DNA expression ability of the non-human mammal is suppressed by artificially adding mutations to the DNA of the present invention. Or by substantially losing the activity of the receptor of the present invention encoded by the DNA, DNA has substantially no ability to express the receptor of the present invention (hereinafter referred to as the present invention).
  • This is a non-human mammal embryonic stem cell (hereinafter abbreviated as ES cell).
  • non-human mammal those described above are used.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared by shifting the reading frame of codons or destroying the function of promoter or exon.
  • Non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and its exon part is a neomycin resistance gene, a drug resistance gene typified by a hygromycin resistance gene, or lac Z () 3-galactosidase. Gene), cat (chloramphenicol acetyl transferase gene) and other reporter genes, etc. are inserted to destroy the function of exons, or the transcription of genes is terminated at introns between exons.
  • a DNA strand (hereinafter abbreviated as “getting vector 1”) having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the resulting ES cell Southern hybridization analysis using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, or the DNA sequence and targeting vector on the targeting vector. It can be obtained by analyzing the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the invention by a PCR method using a primer and selecting the knockout ES cell of the present invention.
  • the original ES cell for inactivating the DNA of the present invention by homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufma method. It can be newly established.
  • mouse ES cells currently 1 29 ES cells are generally used, but since the immunological background is unclear, a purely alternative and immunologically inherited an object of the backgrounds Runado to get a clear ES cells for example, C 578 / / 6 Mausu Ya ⁇ 5 7 BD mice the egg collection number of lack of B LZ6 improved by crossing with DBA / 2 (C ' 5 7 Established by using Fj) of BL / 6 and D BAZ2 can be used well.
  • mice have a high number of eggs and are strong.
  • C 5 7 BL / 6 mice are used in the background, ES cells obtained using these mice can be cross-crossed with C 5 7 BL / 6 mice when creating pathological model mice.
  • the genetic background can be advantageously used in that it can be replaced with C 5 7 BLZ 6 mice.
  • blastocysts at the third day after fertilization are generally used, but in addition to this, a large number of 8 cell stage embryos are collected and cultured to blastocysts for efficient use. Early embryos can be obtained.
  • male ES cells are usually more convenient for producing germline chimeras.
  • Examples of ES cell sex determination methods include: An example of this is the method of amplifying and detecting the gene in the sex-determining region on the chromosome. Using this method, conventionally, for example G-banding method, it requires about 1 0 6 cells for the karyotyping, since suffices ES cell number of about 1 colony (about 5 0) The primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by distinguishing between males and females, and the selection of male cells at an early stage can greatly reduce labor in the early stage of culture.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • the embryonic stem cell line obtained in this way is usually very proliferative and tends to lose its ability to develop ontogeny, so it must be carefully subcultured.
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen
  • LIF 1-10000 ⁇ / ⁇ 1
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts , 5% carbon dioxide, 90% air
  • trypsin ZE DTA solution usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5 mM EDTA, preferably about 0.1% trypsin Zl mM EDTA).
  • Single cells by treatment and seeding on newly prepared feeder cells. Such passage is usually carried out every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and to discard the cultured cells if morphologically abnormal cells are found.
  • ES cells can be differentiated into various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, myocardium by monolayer culture to high density or suspension culture until a cell clump is formed under appropriate conditions.
  • MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin Pro Natl. Acad. Sci. USA 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal 'Ob' Embryo Mouth 'and' Experimental Morphology, Vol. 87, p. 27, 1985
  • the DNA expression-deficient cells of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention, It is useful in the cell biological study of the receptor of the present invention in the in vitro mouth.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and comparing the expression level indirectly. .
  • non-human mammal those similar to the above can be used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention introduces an evening getter vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or mouse egg cell, and then introduces the evening getter vector of the present invention into the DN of the present invention.
  • an evening getter vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or mouse egg cell
  • the evening getter vector of the present invention into the DN of the present invention.
  • a cell in which the DNA of the present invention is knocked out is Southern high pridification using a DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe. Analysis or PCR analysis using the DNA sequence on the getting vector and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used for the evening getting vector as a primer. it can.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell a cell line in which the DNA of the present invention is inactivated is cloned by gene homologous recombination, and the cell is cultured at an appropriate time, for example, a non-human at the 8-cell stage.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially obtained from the individual group obtained by mating such a chimeric individual and a normal individual. It is obtained by selecting an individual composed of cells having the DNA locus of the present invention to which mutations are added, for example, by determining the coat color.
  • the individual thus obtained is usually an individual who is deficient in the heterogeneous expression of the receptor of the present invention. It is possible to obtain an individual with a homozygous deficiency in the receptor.
  • a transgenic non-human mammal When using egg cells, for example, a transgenic non-human mammal can be obtained in which an evening-getting vector is introduced into the chromosome by injecting a DNA solution into the nucleus of the egg cell by microinjection. Compared with these transgenic non-human mammals, it can be obtained by selecting those having a mutation at the DNA locus of the present invention by genetic recombination.
  • an individual in which the DNA of the present invention is knocked out can be reared in a normal breeding environment by confirming that the individual animal obtained by mating has also been knocked out. .
  • germline acquisition and retention may be followed in accordance with conventional methods.
  • a homozygous animal having the inactivated DNA in both homologous chromosomes can be obtained.
  • the obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in a state where there are 1 normal individual and multiple homozygous animals.
  • breeding male and female heterozygous animals homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and passaged.
  • the non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated is very useful in producing the non-human mammal deficient in the expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the receptor of the present invention, it causes inactivation of the life and physical activity of the receptor of the present invention. Therefore, it is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatments.
  • the present invention relates to a compound that promotes or inhibits the activity of promoting DNA against the DNA of the present invention, comprising administering a test compound to a non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention and detecting the expression of a reporter gene. Or a method for screening the salt thereof.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention may be a gene that introduces a repo gene in the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention.
  • a reporter gene that is inactivated and can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
  • test compound examples are the same as described above.
  • reporter gene As the reporter gene, the same ones as described above are used, and a 3-galactosidase gene (1acZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene, or the like is preferable.
  • the repo overnight gene is present under the control of the promoter for the DNA of the present invention.
  • the activity of the promo is detected. be able to.
  • J8-galactosidase is expressed instead of the receptor of the present invention. Therefore, for example, by staining with a reagent that is a substrate for / 3-galactosidase, such as' 5-Promo 4 -Chromium 1-3-Indolyl 1 / 3-galactopyranoside (X-gal)
  • a reagent that is a substrate for / 3-galactosidase such as' 5-Promo 4 -Chromium 1-3-Indolyl 1 / 3-galactopyranoside (X-gal)
  • X-gal 5-Promo 4 -Chromium 1-3-Indolyl 1 / 3-galactopyranoside
  • the receptor-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof was fixed with glutaraldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga 1 at room temperature.
  • PBS phosphate buffered saline
  • m R N A encoding 1 a c Z may be detected.
  • the compound obtained by using the above screening method or a salt thereof is a compound selected from the test compounds described above, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids).
  • a physiologically acceptable acid addition salt is preferred.
  • such salts include salts with inorganic acids (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citrate, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.) are used.
  • the compound or its salt that promotes the promoter activity for the DNA of the present invention can promote the expression of the receptor of the present invention and promote the activity or function of the receptor of the present invention.
  • Eg schizophrenia, Anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug-induced psychotic disorder, delusional psychosis, neuroleptic-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinsonian symptoms, extrapyramidal symptoms), prolactin Related diseases [eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, oocyte and uterus atrophy), pituitary gland tumors, mesencephalic tumors, menstrual abnormalities, prolactin secretion failure (eg, ovary) Hypotension, seminal vesicle growth failure, climacteric disorder, hypothyroidism, etc.), hypertension, sleep disorder (eg, primary insomnia, circadian rhythm disorder (eg, physical condition modulation due to three shifts,
  • a compound or a salt thereof that inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention can inhibit the expression of the receptor of the present invention and inhibit the activity or function of the receptor of the present invention, for example, Psychiatric disorders (eg, schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, phobic disorder, drug-induced psychopathic disorder, delusional psychosis, neuroleptic drug-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinsonian symptoms, extrapyramidal symptoms, etc.), prolactin-related diseases (eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy), pituitary gland tumors, diencephalon tumors, Menstrual abnormalities, prolactin secretion failure (eg, ovarian hypofunction, seminal vesicle growth failure, menopause, hypothyroidism, etc.), hypertension, sleep disorders (eg, Preventive / therapeutic agents
  • a medicament containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof is a compound obtained by the screening method of the present invention described above or a compound thereof. It can be produced in the same manner as a medicine containing a salt.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic.
  • humans or mammals eg rabbits, mice, guinea pigs, rabbits, hidges, pigs, rabbits, horses, cats, dogs
  • Monkeys, etc. e.g., monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc.
  • a compound that promotes the promoter-activity of the DNA of the present invention is orally administered
  • the compound is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, subject disease, etc.
  • the compound that promotes the promoter activity against the DNA of the present invention is usually in the form of an injection.
  • the compound When administered to adults (with a body weight of 60 kg) schizophrenic patients, the compound is administered at about 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. Conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, the dose converted to the weight per 60 kg can be administered.
  • a compound that inhibits the promoter activity against DNA of the present invention when administered parenterally, generally, in an adult (with a body weight of 60 kg), Parkinson's disease patient, the compound is reduced to about 0.1 l per day. -100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, the target disease, etc.
  • a compound that inhibits the promoter activity against the DNA of the present invention is in the form of an injection.
  • the compound When administered to a normal adult (with a body weight of 60 kg) in a schizophrenic patient, the compound is about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 l per day. It is convenient to administer ⁇ 10 mg intravenously. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention has the D of the present invention. It is extremely useful for screening a compound or its salt that promotes or inhibits the activity of a promoter for NA, and investigates or prevents the development of various diseases caused by dna expression deficiency of the present invention. Can make a significant contribution.
  • a gene encoding various proteins is linked downstream thereof, and this is injected into an egg cell of an animal so-called transgenic. If an animal (transfected animal) is created, the polypeptide can be specifically synthesized and its action in the living body can be examined. Furthermore, if a suitable repo gene is bound to the above promoter part and a cell line that expresses it is established, the production ability of the receptor itself of the present invention itself is specifically promoted or inhibited (suppressed). It can be used as a search system for low molecular weight compounds that have
  • a 1 a Alanine
  • T C Thiazolidine— 4 (R) monocarboxamide group
  • T os p-toluenesulfonyl
  • HONB ⁇ Hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide
  • the amino acid sequence of human GPR52 is shown.
  • rat GPR52 The amino acid sequence of rat GPR52 is shown.
  • the base sequence of the probe 1 used in Example 6 is shown below: [5 ′ ′-end of ribonucleate —FAM (6-carboxy-fluorescein) as a dye, 3′-end as a quencher—TAMRA (6-carboxy-tetramethy ⁇ rhodamine) was labeled.
  • FAM ribonucleate
  • TAMRA quencher
  • the base sequence of the probe 2 used in Example 6 is shown. [Reporting at the 5 ′ 'end — FAM (6_carboxy-fluorescein) as the dye, and TAMRA (6-carboxy-tetraniethyl-rhodamine as the quenching at the 3 ′ end) )
  • Example 6 The base sequence of the probe 3 used in Example 6 is shown [FAM (6-carboxy-fluorescein) as a report dye at the 5 'end and Quentia at the 3' end as TAMRA (6-carboxy-tetramethyl). -rhodamine).
  • FAM 6-carboxy-fluorescein
  • a DNA fragment encoding human GPR52 was cloned from the MTC panel (Clontech) using PCR according to the sequence described in Molecular Brain Research Vol. 64, pp. 193-198, 1999.
  • the base sequence (SEQ ID NO: 2) of cDNA encoding human GPR52 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was obtained.
  • the obtained MA fragment was introduced into the Sall and Spel sites of pAKKO-111 vector CBiochem. Biopliys. Acta., 1219, 251 (1994)] to construct an expression plasmid. Then, in a method known per se
  • Expression plasmids were transfected into CH0 (dhfr-) cells, and the cells into which the expression plasmid was introduced were selected using a medium not containing thymidine to obtain stably expressing cells of human GPR52.
  • Rat '(SD) brain cDNA (BD Biosciences) was used as a saddle, and PCR' was performed using primer 1 (SEQ ID NO: 7) and primer 2 (SEQ ID NO: 8). Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) was used for PCR. (1) After 10 seconds at 98 ° C, (2) After 35 times at 98 ° C for 10 seconds and 68 ° C for 60 seconds, (3) 7 minutes at 68 The elongation reaction was performed.
  • PCR- Blunt2_T0P0 vector (Takara Shuzo) was used for PCR.
  • PCR was carried out using Primer-1 (SEQ ID NO: 7) and Primer 2 (SEQ ID NO: 8) using mouse (C57BL / 6) brain cDNA (BD Biosciences) as a saddle. Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) was used for PCR. (1) After 98 ° C for 10 seconds, (2) After 98 ° C for 10 seconds and 68 ° C for 60 seconds, (3) 68 ° C A 7-minute extension reaction was performed. PCR- Blunt2- T0P0 vector (SEQ ID NO: 7) and Primer 2 (SEQ ID NO: 8) using mouse (C57BL / 6) brain cDNA (BD Biosciences) as a saddle. Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) was used for PCR. (1) After 98 ° C for 10 seconds, (2) After 98 ° C for 10 seconds and 68 ° C for 60 seconds, (3) 68 ° C A 7-minute extension reaction was performed. PCR- Blunt2-
  • the stable expression cell line (CNGC-E583M / HEK293 cell line) of the rat olfactory cyclic nucleotide-dependent channel (CNGC-E583M) used as the host cell is the expression vector PCDNA3.1 (+) neo (Invitrogen) Put the rat olfactory cyclic nucleotide-dependent channel (CNGC-E583M) cDNA (pcDNA3, CNGC) into the HEK293 cell line (purchased from ATCC) and introduce pcDNA3.
  • calf serum (Invitrogen), using DMEM (Dulbecco 's modified Eagle medium ) medium containing 800mg / l geneticin (Invitrogen), 5% C0 2, was obtained by culturing at 37 ° C for [Fagan et al., FEBS, 500 rolls
  • 137 human GPR52 expression plasmids were transferred. The transfer was performed using Lipofectamine reagent (Invitrogen) according to the method attached to the reagent. First, two 15ffll centrifuge tubes were prepared, and Opti-MEM medium (Invitrogen) was dispensed into each for 600/1. Next, pAKKO-GPR52 expression vector (Reference Example 1) is 2.4 / g on one tube and on the other.
  • an accessory buffer was prepared to add the fluorescent dye Fluo-3AM (D0JIN) to the cells or to wash the cells immediately before the FLIPR assembly.
  • HBSS Invitrogen 1000 ml of 1M HEPES (pH 7.4) (D0JIN) 20 ml (probenecid (Sigma) 710 mg dissolved in IN NaOH 5 ml after adding HBSS / HEPES solution to HBSS / HEPES solution 5 ml was added and mixed 10 ml of the solution was added, and this solution was used as an assembly buffer.
  • the solution containing the test compound was diluted with 0.5 / IBMX and H / HBSS 220 1 containing 2.5 mM Probenecid, diluted, and transferred to a 96-well plate for FLIPR (V- ⁇ plate, Coster). Called). After dye loading of the cell plate, wash the cell plate with a wash buffer with 2.5 mM Probenecid added to H / HBSS using a plate washer (ELX405, Bio-Tek Instruments). Left. By setting this cell plate and sample plate to FLIPR (FLIPR will transfer 50 1 samples from the sample plate to the cell plate), and measuring the change in fluorescence intensity over time, The intracellular calcium ion concentration increasing activity was measured.
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • the CHO cells were introduced and transfected into CHO cells according to a conventional method to obtain a human GPR52-GFP expressing CH0 cell line.
  • GPR52-GFP fusion protein was observed in the cell membrane.
  • the cells reserpine was added to the medium so as to 10- 4 M, and after 30 minutes, rather than the fluorescence of the GFP is cell membrane was found to be moved to the cytoplasm. This indicates that GPR52 is a G protein-coupled receptor expressed on the cell membrane, and that GPR52 has translocated to the cytoplasm in response to reserpine, that is, it has been internalized.
  • Example 6 Examination of tissue distribution of human GPR52, mouse GPR52 and rat GPR52 mRNA
  • PolyA + RNA derived from various human tissues (Clontech) is used for the cDNA that is the saddle type used to examine the gene expression distribution in humans. Then, the one synthesized by the following method was used.
  • Random primer from RNA 1 / xg and SuperScriptll reverse transcriptase (Invitrogen) as reverse transcriptase were used and the reaction was performed at 42 ° C according to the attached manual.
  • RT-PCR is a Setiuence Detection System Prism 7700 (Applied to the following procedures:
  • primer 1 SEQ ID NO: 9
  • primer 1 SEQ ID NO: 10
  • probe 1 SEQ ID NO: 1 1
  • RT-PCR reaction solution was prepared in TadMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) 12.5 l, 100 M primer solution 0 ⁇ 05 ⁇ 1, 5 ⁇ probe 1 0.5 xl, and above 0.51 of cDNA solution was added, and the total reaction volume was adjusted to 25 1 with distilled water.
  • the PCR reaction was repeated 50 cycles at 50 ° C ⁇ 2 minutes and 95 ° C ⁇ 10 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C ⁇ 15 seconds and 60 ° C ⁇ 1 minute.
  • mice The rabbit cDNA used for examining the expression in mice was synthesized from total RNA derived from various mouse tissues by the following method. Random primer from RNA lg, as a reverse transcriptase-SuperScriptll reverse transcriptase (Invitrogen) was used, and the reaction was performed at 42 ° C according to the attached manual. After completion of the reaction, ethanol precipitation was performed to dissolve in 100 ⁇ 1 .
  • RT-PCR uses Sequence Detection System Prism 7700 (Applied Biosystems) and uses Primer 3 (SEQ ID NO: 1 2), Primer 4 (SEQ ID NO: 1 3) and Probe 2 (SEQ ID NO: 14) did.
  • RT-PCR reaction solution was TaaMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems) 12.5 / 1 with 100 M primer solution 0.05 1 and 5 ⁇ ⁇ probe 2 0.5 HK and the above prepared cDNA solution 0.5 1 In addition, the total reaction volume was adjusted to 25 1 with distilled water. The PCR reaction was repeated 50 cycles at 50 ° C ⁇ 2 minutes and 95 ° C ⁇ 10 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C ⁇ 15 seconds and 60 ° C ⁇ 1 minute. As a result, mouse GPR52 mRNA was highly expressed specifically in the striatum and female pituitary gland.
  • RT-PCR was performed using Sequence Detection System Prism 7700 (Applied Biosys tems), Primer 5 (SEQ ID NO: 1 5), Primer 6 (SEQ ID NO: 1 6) and Probe 3 (SEQ ID NO: 17) ) It was used.
  • RT-PCR reaction solution is TadMan Universal PCR Master Mix (PE Biosys tems) 12.5 1, 100 M primer solution 0.05 ⁇ 1, 5 ⁇ probe 3 0.5 1, and the above prepared cDNA solution 0.5 1
  • the total reaction volume was made 25 1 with distilled water.
  • the PCR reaction was repeated at 40 ° C for 2 minutes and 95 ° C for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute.
  • the expression level of GPR52 mRNA in various rat tissues was calculated as the number of copies per poly (A) + RNA lng.
  • rat GPR52 was highly expressed in the striatum, pituitary gland, and female pituitary gland. '
  • a digoxigenin-labeled GPR52 probe was prepared by the following method. First, rat GPR52 cDNA was inserted into the plasmid vector pCR_Blunt II-T0P0 (Invitrogen) by a known method. This meta-A was linearized by PCR using M13 Primer's (Invitrogen) ⁇ Advantage cDNA PCR-Kit (Clontech) and purified by ethanol precipitation.
  • Brain and pituitary tissues are sliced at a thickness of 16/2 m on MAS-coated slide (Matsunami) using Cryostat CM3050 (Leica) and 1 / 15M Phosphate Buffer pH7. Containing 4% paraformaldehyde. Fix with 4 (Wako Pure Chemical Industries) for 10 minutes at room temperature.
  • the slide was washed 3 times with PBS and then immersed in 0.1M triethanolamine containing 0.25% acetic anhydride for 10 minutes at room temperature. After washing the slide three times with PBS, the sections on the slide were mixed with high-precipitation buffer (503 ⁇ 4 Formamide, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, lXDenhardt Solution, 200 ng / ml tRNA, 10% Dextran Sulfate, 600 mM Add 60 l of digoxigenin-labeled rat GPR52cRNA probe diluted 200-fold with NaCl, 0.25% SDS, ImM EDTA pH 8.0 (covered with parafilm), and place in a moisture chamber with 50% formamide.
  • high-precipitation buffer 503 ⁇ 4 Formamide, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, lXDenhardt Solution, 200 ng / ml tRNA, 10% Dextran Sulfate, 600 mM Add 60 l of digoxigenin
  • the slide was washed with a washing buffer (lOOmM Tris-HC1 pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20), and then washed with 1.5% Blocking reagent (Roche).
  • a washing buffer lOOmM Tris-HC1 pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20
  • Blocking reagent (Roche).
  • Anti-DIG fab-fragment antibody diluted with 1000 times with non-specific reaction blocking by treatment with buffer (room temperature ⁇ 1 hour)
  • GPR52 mRNA was very strongly expressed in the striatum, nucleus accumbens, and olfactory nodule.
  • the cerebral cortex it was widely expressed mainly in the frontal and temporal lobes.
  • the amygdala it was expressed in the basal lateral nucleus, lateral nucleus, and medial nucleus.
  • the hippocampus it was expressed in the Ammon nucleus, dentate gyrus, and hippocampus.
  • the thalamus In the thalamus, it was expressed very strongly in the inner retina nucleus, and also in the thalamic reticular nucleus, parathalamic nucleus, and nigrostriatal bundle. In the hypothalamus, it was expressed more strongly in the medial papillary nucleus, and in the arcuate nucleus and the outer hypothalamic area. In the midbrain, it was expressed more strongly in the dorsal-ventral lateral knee nucleus, and in the ventral tegmental area, midbrain aqueduct, etc. In the pituitary gland, 'was expressed in the anterior lobe, and the expression in the middle and-lobes was below the detection limit. (table 1 )
  • GPR52 may be widely involved in various brain functions.
  • Interstitial nucleus Thalamic reticular nucleus + demarcation striatal nucleus ++ posterior commissural nucleus + cingulate cortex ++ inner pallidum
  • a digoxigenin-labeled GPR52cRNA probe was prepared in the same manner as in Example 7.
  • the fluorescein labeled dopamine D1 receptor cRNA probe and the fluorescein labeled dopamine D2 receptor cRNA probe were prepared by the following methods. First, dopamine D1 receptor, receptor and D2 receptor cDNAs were cloned from male Wistar rat striatum by a known method. These cMA were inserted into the plasmid vector pCRII-T0P0 (Invitrogen) by a known method.
  • cDNAs were linearized by PCR using M13 primer (Invitrogen) 'Advantage cDNA PCR-Kit (Clontech) and purified by ethanol precipitation. From the cDNA obtained, DIG RNA Labeling KIT
  • GPR52 mRNA was expressed in neurons different from dopamine D 1 receptors in rat striatum, nucleus accumbens, and olfactory nodule.
  • GPR52 mRNA was expressed in the same neurons as dopamine D2 receptor mRNA. This revealed that GPR52 coexists specifically with D2 receptors in rat striatum, nucleus accumbens, and olfactory nodule.
  • mPFC medial prefrontal cortex
  • GPR52 was also coexpressed with nerves expressing dopamine D1 or D2 receptors.
  • dopa and min D 1 receptor mRNA are expressed more widely than dopamine D2 receptor mRNA, and similarly GPR52 mRNA is also widely expressed in mPFC. More coexistence was observed.
  • GPR52 mRNA was co-expressed in nerves expressing dopamine D1 or D2 receptor mMA.
  • GPR52 mRNA and dopamine D 1 receptor mRNA were clearly expressed in the same cell, but dopamine in cells expressing GPR52 mRNA]) 2 receptor was not expressed Or the expression was weak.
  • GPR52 showed abnormalities in the dopamine mesencephalic striatum (eg, Pakinkinson's disease), mesencephalic marginal tract (eg, positive symptoms of schizophrenia), mesencephalic cortex It was suggested that it could be a target molecule for abnormalities (eg, negative symptoms of schizophrenia).
  • Rat fetal cerebral cortical neurons are cultured in 48-well poly-L-lysine (Sumitomo Bakelite) for 14-15 days according to the attached method. did. Unless otherwise specified, nerve cell culture medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was used as the medium. Changes in intracellular calcium concentration were measured using AQMCOSMOS (Hamamat photonics). In order to measure the fluctuation of intracellular calcium concentration, the following pretreatment was performed. First, the fluorescent dye f ura-2 / AM (Molecular Probes) was added to the cells. Therefore, an accessory buffer was prepared to wash the cells immediately before performing the assay.
  • AQMCOSMOS Hamat photonics
  • HBSS (Invitrogen) 1000 ml of 1M HEPES (pH7.4) (DOJIN) 20 ml is added to HBSS / HEPES after dissolving 710 mg of probenecid (Sigma) in 5 ml of IN NaOH. 10 ml of a solution mixed with 5 ml of solution was added, and this solution was used as an assembly buffer. Next, add an equal amount of 20% Pluronic acid (Molecular Device) to the fura-2 / AM stock solution, mix, dissolve in furnish-2 to a final concentration of 5 M, and add the fura_2 fluorescent dye solution. Prepared. This fura-2 fluorescent dye solution was loaded onto rat embryonic cerebral cortical neurons and incubated for 30 to 60 minutes. Thereafter, fluctuations in calcium concentration in individual neurons were measured using AQUAC0SM0S (Hamamamatsu photonics).
  • DA-type dartamic acid receptor is strongly related to schizophrenia, and it is clear that strengthening activation of this receptor improves negative symptoms and cognitive impairment in schizophrenia. It is expected that these symptoms will be improved by enhancing the activity of DA DA-Dalbuminic acid by GPR52 agonist (Science Vol. 296, 692, 2002, etc.).
  • Example 1 0
  • the CNGC-E583M / HEK293 cell line described in Example 3 was used to screen for an agonist as follows.
  • CNGC-E583M / HEK293 cells were cultured in a collagen-coated 75 cm 2 flask, and when the density reached about 70%, the human GPR52 expression plasmid prepared in Reference Example 1 was transfected. Transfection was performed using Lipof ectamine reagent (Invitrogen) according to the method attached to the reagent. First, two 15 ml centrifuge tubes were prepared, and Opti-MEM medium (Invitrogen) was poured into each one for 6001 minutes.
  • Opti-MEM medium Invitrogen
  • PAKKO-GPR52 expression vector 1 (Reference Example 1) was added to one tube, 2.4 / xg, and one Lipoiectamine reagent was added to the other, then both were mixed and allowed to stand at room temperature for 20 minutes.
  • the CNGC- E583M / HEK293 cells were incubated for 5 hours at C0 2 incubator (5% C0 2, 37 ° C). Thereafter, the mixture for transfection was removed and replaced with an EM medium containing 10% fetal calf serum. The next day, the cells are detached with 0.05% trypsin-EDTA solution (Invitrogen), collected by centrifugation, diluted to contain 4 x 10 5 cells / ml, and poly_D-lysine Black walled 96- well plate (Becton Dickenson) in 100 1 by dispensing after per well and cultured overnight in C0 2 incubator (hereinafter referred to as the cell plate).
  • GPR52 was expressed transiently by the above transfection procedure
  • test compounds were added to CNGC-E583M / HEK293 cells, and changes in intracellular calcium concentration were measured by the method described in Example 3 using FLIPR (Molecular Device).
  • GPR52 Agonist Screening (2) The GPR52 stably expressing cell prepared in Reference Example 1 was cultured overnight at 37 ° C, C0 2 incubator one 150 cm 2 flasks. After incubation, remove the cells at 0.5 mM EDTA / PBS, cells were washed with PBS, lxl0 7 cells / ml density in Buffer 1 (HBSS + 0.1% BSA , 25mM HEPES pH7.3, 0.5mM IBMX) to Suspended. This cell suspension 4401 and the alpha-screen cAMP assay kit (Parkin Elmer) anti-cAMP acceptor beads 22 K Bufierl 638 1 were mixed and dispensed 10 1 at a time into a white 96 well plate (Costar).
  • Buffer 1 HBSS + 0.1% BSA , 25mM HEPES pH7.3, 0.5mM IBMX
  • Example 11 Using the method described in 1 above, various compounds were initially screened at a final concentration of 30 M. As a result, compounds that increase intracellular cAMP concentration in cells stably expressing GPR52 (Agonio Multiple candidate compounds) were found. These compounds were used at various concentrations (100 M, 30 / M, IOM, 3 M, M, 0.1 iM), and secondary screening (examination) was performed using the method described in Example 11.
  • N- [3- (3-chlorophenoxy) phenyl] -2-methyl-8- [3- (1-piperazinyl) propyl] -5, 6, 7, 8 -tetrahydropyrido [2, 3 -d] pyrimidin-5-amamine tetrahydrochloride (Example 175 of JP-A-2003-321472) (hereinafter abbreviated as Compound A) showed relatively strong activity.
  • the EC 5Q of this compound for GPR52 was 2.1 M.
  • Example 1 Activation of DA-type glutamate receptor by cerebral cortex ⁇ ⁇ ⁇ by compound A
  • Compound A having ligand activity against GPR52 acts as a potentiator that has an enhancing action on activation of DA-type dull and tamate receptors. Since the cerebral cortex plays an important role in advanced information processing such as cognition, the GPR52 agonist improves the negative symptoms of schizophrenia and cognitive impairment by enhancing the activity of ⁇ DA-type dartamic acid receptor Is expected to do.
  • Rat (Wistar, Japan Chulis River) Dissecting the cerebral cortex from the fetal brain (E19), cells were prepared using a nerve cell dispersion set (Dainippon Pharmaceutical). Then, the cells were seeded on a 24 well po_L-lysine plate (3xl0 5 cells / wel 1) and cultured for 2 weeks in a culture solution of Neuro Basal (containing B27, 0.5 mM glutamine, GIBCO).
  • a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the receptor of the present invention eg, GPR52, etc.
  • a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the expression of the gene of the receptor of the present invention, or the screening method of the present invention Or a compound that can be obtained in a screening kit or a salt thereof (eg, GPR52 agonist, GPR52 antagonist), for example, mental illness (eg, schizophrenia, anxiety, cognitive impairment, panic disorder, Phobic disorder, drug-induced psychotic disorder, delusional psychosis, neuroleptic-induced dyskinesia, Parkinson's disease, drug-induced Parkinsonian symptom group, extrapyramidal symptoms, etc., prolactin-related diseases (eg, hyperprolactinemia (eg Eg infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy), pituitary gland tumors, diencephalon tumors, menstrual abnormalities, prolac Chin secretion failure (
  • a compound or its salt that promotes the activity of the receptor of the present invention a compound or its salt that promotes the expression of the gene of the receptor of the present invention, an agonist for the receptor of the present invention, a ligand for the receptor of the present invention, etc.
  • Is considered to be one of the causes of positive symptoms of schizophrenia because it increases the intracellular cAMP concentration of neurons expressing the receptors of the present invention (eg, GPR52). It can suppress overactivity of the mesolimbic dopamine pathway and improve the positive symptoms of schizophrenia.
  • it can improve cerebral cortex ⁇ DA-type receptor functional decline, which is one of the causes of schizophrenia negative symptoms and cognitive impairment, and can improve schizophrenia negative symptoms and cognitive impairment. Therefore, the above-mentioned compounds or salts thereof, agonists, ligands and the like are preferably useful as prophylactic / therapeutic agents for schizophrenia and cognitive impairment.
  • a compound or a salt thereof that promotes the activity of the receptor of the present invention a compound or a salt thereof that promotes the expression of the gene of the receptor of the present invention, an agonis for the receptor of the present invention, and the receptor of the present invention Since ligands can promote secretion of prolactin, they are useful as prophylactic / therapeutic agents for prolactin secretion failure (eg, egg, nest hypofunction, seminal vesicle development failure, climacteric disorder, hypothyroidism, etc.) It is.
  • prolactin secretion failure eg, egg, nest hypofunction, seminal vesicle development failure, climacteric disorder, hypothyroidism, etc.
  • the intracellular cAMP caused by dopamine deficiency in the nigrostriatal dopamine pathway which is the cause of Parkinson's disease Since it is possible to improve production inhibition, it is preferably useful as a preventive / therapeutic agent for Parkinson's disease.
  • a compound or salt thereof that inhibits the activity of the receptor of the present invention secretes prolactin.
  • Prolactin hypersecretion eg, hyperprolactinemia (eg, infertility, milk leakage, amenorrhea, ovarian and uterine atrophy), pituitary gland tumors, diencephalon tumors, menstrual abnormalities, etc. It is useful as a preventive / therapeutic agent.
  • the receptor of the present invention eg, GPR52
  • its ligand eg, reserpine, methoctramine, etc.
  • GPR52 GPR52
  • its ligand eg, reserpine, methoctramine, etc.

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Abstract

本発明は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性を促進または阻害する化合物またはその塩、該タンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩、該タンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、該タンパク質に対する抗体などを提供する。このような化合物またはその塩、アンチセンスヌクレオチド、抗体などは、精神疾患、プロラクチン関連疾患などの予防・治療剤などとして使用することができる。

Description

P T/JP2006/305900
明細書
スクリ一二ング方法 技術分野
本発明は、 GPR52受容体と特異的に結合する能力を有するリガンドと GPR52受容体とを用いる医薬のスクリ一二ング方法およびスクリーニン グ用キッ ト、 該スクリーニング方法またはキッ トによって得られうる化 合物などに関する。 詳細には、 本発明は、 精神疾患、 プロラクチン関連 疾患などの予防 ·治療剤などのスクリ一二ング方法およびスクリ一ニン グ用キッ トなどに関する。 背景技術
G protein-coupled receptor (GPCR) は、 7回膜貫通型受容体で、 ホル モン、 神経伝達物質、 サイ ト力インや他の分子のシグナルを細胞膜内へ 伝える働きを行っている。
ヒト GPR52 (Molecular Brain Research 64巻、 193- 198頁、 1999年） は GPCRの一つで、 そのリガンドは報告されておらず、 その役割や機能に関 する知見や有用性についての報告もない。
レセルピン (下式） は、 印度蛇木 （Rauwoliiaserpentina)-に含まれる アルカロイ ドで、 中枢抑制効果や降圧作用を有することが知られており (Am. J. Chin. Med. 7卷、 197- 236頁、 1979年） 、 統合失調症改善薬、 抗精神病薬、 降圧薬、 鎮静薬として使用されている。
Figure imgf000002_0001
MeO メ トク トラミン (methoctramine) (下式) は、 ムスカリン性ァセチル コリン受容体 M2のアン夕ゴニストとして知られている (Eur. J.
Pharmacol. 144巻、 117- 124頁、 1987年） 。
Figure imgf000003_0001
発明の開示
、 安全で優れた精神疾患、 プロラクチン関連疾患などの予防 ·治療剤が 求められている。
本発明者たちは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 レセルピンおよびメ トク トラミンが、 GPR52のリガンドであることを見出 した。 GPR52とこのリガンドとを用いて、 精神疾患に有効な医薬の探索が 可能となると考え、 これらの知見に基づき、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
〔 1〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩および（b) 該蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有 するリガンドを用いることを特徴とする、 該蛋白質またはその塩と該リ ガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ニング方 法、
〔2〕 リガンドが、 レセルピン化合物である上記 〔 1〕 記載のスクリー ニング方法、
〔3〕 レセルピン化合物が、 式 '
Figure imgf000004_0001
〔式中、 環 Αおよび環 Βは、 それぞれ置換基を有していてもよいべンゼ ン環、
環 Cは、 置換基を有していてもよい 6員環、
環 Dは、 置換基を有していてもよい 5ないし 7員含窒素複素環、 環 Eは、 置換基を有していてもよい 5ないし 7員環を示す〕 で表される 、 化合物またはその塩 〔以下、 化合物 （I ) と略記する〕 である上記 〔2〕 記載のスクリ一二ング方法、
〔3 a〕 化合物 （I ) が、 式
Figure imgf000004_0002
〔式中、 環 D aは、 置換基を有していてもよい 6員含窒素複素環、 環 E aは、 置換基を有していてもよい 6員環、.
環 Aおよび環 Bは、 上記と同意義を示す〕 で表される化合物またはその 塩である上記 〔3〕 記記載のスクリーニング方法、
〔4〕 レセルピン化合物が、 レセルピンである上記 〔2〕 記載のスクリ 一二ング方法、
〔5〕 リガンドが、 インド一ルアルカロイ ドである上記 〔 1〕 記載のス クリーニング方法、
〔5 a〕 インドールアルカロイ ドが、 ラウオルフィァ · アルカロイドで ある上記 〔2〕 記載のスクリーニング方法、 リガンドが、 メトク トラミン化合物である上記
ング方法、
メ 卜ク卜ラミン化合物が、 式
Figure imgf000005_0001
〔式中、 R 1および R 2は、 それぞれ置換基を有していてもよい炭化水素 基、 Xはスぺ一サーを示す〕 で表される化合物またはその塩 （以下、 化 合物 （I I) と略記する） である上記 〔6〕 記載のスクリーニング方法、 、 〔8〕 メ トク トラミン化合物が、 メ トクトラミンである上記 〔6〕 記載 のスクリ一二ング方法、
〔9〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸 配列が、 配列番号 ： 3または配列番号： 5で表されるアミノ酸配列であ る上記 〔 1〕 記載のスクリーニング方法、
[ 1 0 ] (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もし くはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、 （b) 該リガン ドおよび試験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその 塩に接触させた場合における、 該リガンドの該蛋白質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、 比較する、 上記 〔 1〕 記載のスクリーニング方法、
〔 1 1〕 ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もし くはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画 分に接触させた場合と、 （b) 該リガンドおよび試験化合物を、 該蛋白質 もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の 膜画分に接触させた場合における、 該リガンドの該細胞または該膜画分 に対する結合量を測定し、 比較する、 上記 〔 1〕 記載のスクリーニング 方法、
〔 1 2〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩が、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩をコードす る DN Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現 した蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記 〔 1 0〕 記載のスクリ一ニング方法、
〔 1 3〕 リガンドが、 標識したリガンドである上記 〔 1 0〕 〜 〔 1 2〕 、記載のスクリ一ニング方法、
〔 1 4〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もし くはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、 （b) 該リガン ドおよび試験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩に接触させた場合における、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩を介した細胞刺激活性を測定し、 比較する、 上記 〔 1〕 記載の スクリーニング方法、
[ 1 5] (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もし くはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画 分に接触させた場合と、 （b) 該リガンドおよび試験化合物を、 該蛋白質 もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の 膜画分に接触させた場合における、 該蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、 比較する、 上記 〔 1〕'記 載のスクリ一二ング方法、
〔 1 6〕 細胞刺激活性が、 G s活性である上記 〔 1 5〕 記載のスクリ一 ニング方法、
〔 1 7〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩が、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩をコードす る D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現 した蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記 〔 1 5〕 記載のスクリーニング方法、
〔 1 7 a〕 (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩および （b) 該蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力 、 を有するリガンドと、 該蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化 合物またはその塩を用いることを特徴とする、 該蛋白質またはその塩に 対するァゴニス卜またはアンタゴニストのスクリ一ニング方法、
〔 1 7 b〕 ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩および（b) 該蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力 を有するリガンドと、 該蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化 合物またはその塩を用いることを特徴とする、 該蛋白質またはその塩に 対するァゴニス卜またはアンタゴニス卜のスクリーニング方法、
[ 1 8 ] (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もし くはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞に接触させた場合と、 (b) 試験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を 含有する細胞に接触させた場合における、 該蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、 比較する、 または ( i i) 試験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそめ塩 を含有する細胞に接触させた場合における、 該蛋白質もしくはその部分 ぺプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定することを特徴とす る、 該蛋白質またはその塩に対するァゴニス卜のスクリ一二ング方法、
〔 1 9〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩と特異的に結合する能力を有するリガンドの存在下、 試験化合物 を、 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞に 接触させた場合における、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩を介した細胞刺激活性を測定することを特徴とする、 該蛋白質また はその塩に対するアン夕ゴニス卜のスクリ一二ング方法、
〔 2 0〕 ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および（b) 該蛋 、白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを含有する ことを特徴とする、 該蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キッ ト、
〔 2 0 a〕 上記 〔 1〕 記載のスクリーニング方法または上記 〔2 0〕 記 載のスクリーニング用キッ トを用いて得られうる化合物またはその塩、 〔 2 0 b〕 化合物が、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩とリガンドとの結合を阻害する化合物またはその塩 である上記 〔 2 0 a〕 記載の化合物またはその塩、
〔 2 0 c〕 ァゴニストである上記 〔2 0 b〕 記載の化合物またはその塩
〔 2 0 d〕 アン夕ゴニストである上記 〔2 0 b〕 記載の化合物またはそ の塩、
〔 2 0 e〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩とリガンドとの結合を阻害する化合物またはその塩を含有して なる医薬、
〔2 0 f 〕 上記 〔 2 0 c〕 記載の化合物またはその塩を含有してなる統 合失調症または認知障害の予防 ·治療剤、 〔 2 0 g〕 上記 〔 2 0 d〕 記載の化合物またはその塩を含有してなるパ —キンソン病の予防 ·治療剤、
〔2 1〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる統合失調症 または認知障害の予防 ·治療剤、
〔2 2〕 配列番号 ： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなるプロラクチ ン分泌不全の予防 ·治療剤、
〔2 3〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたは その塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなるパーキンソ ン病の予防 ·治療剤、
〔2 4〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる高プロラク チン血症の予防 ·治療剤、 ·
〔2 5〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしぐは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と特異的に結合する 能力を有するリガンド、
〔2 6〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を促進することを特徴とする統合失調症または認知障害の 予防 ·治療法、
〔2 7〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を促進することを特徴とするプロラクチン分泌不全の予 防 ·治療法、 〔2 8〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を阻害することを特徴とするパーキンソン病の予防 ·治療 法、
〔2 9〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を阻害することを特徴とする高プロラクチン血症の予防 · 治療法、
〔 3 0〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは
、その塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与 することを特徴とする統合失調症または認知障害の予防 ·治療法、
〔3 1〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与 することを特徴とするプロラクチン分泌不全の予防 ·治療法、
〔3 2〕 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与 することを特徴とするパーキンソン病の予防 ·治療法、
〔3 3〕 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたは その塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与 することを特徴とする高プロラクチン血症の予防 ·治療法、
〔3 4〕 統合失調症または認知障害の予防 ·治療剤の製造のための、 配 列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活 性を促進する化合物またはその塩の使用、
〔3 5〕 プロラクチン分泌不全の予防 ·治療剤の製造のための、 配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を 促進する化合物またはその塩の使用、
〔3 6〕 パーキンソン病の予防 ·治療剤の製造のための、 配列番号 ： 1 で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害す る化合物またはその塩の使用、
[3 7〕 高プロラクチン血症の予防 ·治療剤の製造のための、 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配 列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻 、害する化合物またはその塩の使用などを提供する。
さらに、
(1 ) 配列番号： 3または配列番号 ： 5で表わされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋 白質またはその塩、
(2) 上記 （ 1 ) 記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、
(3) 上記 （ 1 ) 記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有す るポリヌクレオチド、
(4) DNAである上記 （3) 記載のポリヌクレオチド、
(5 ) 配列番号： 4または配列番号： 6で表される塩基配列を含有する 上記 （4) 記載の DNA、
(6 ) 上記 （3) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべクタ一、
(7 ) 上記 （6) 記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
(8 ) 上記 （7) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （ 1 ) 記載の蛋白質 を生成せしめることを特徴とする上記 （1 ) 記載の蛋白質またはその塩 の製造法、
(9 ) 上記 （ 1 ) 記載の蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩に 対する抗体、
( 1 0) 上記 （ 1 ) 記載の蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩 を用いることを特徴とする上記 （ 1 ) 記載の蛋白質またはその塩に対す るリガンドの決定方法、
( 1 1 ) 上記 （ 3 ) 記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェン卜な 条件下でハイプリダイズするポリヌクレオチド、
( 1 2) 上記 （ 3) 記載のポリヌクレオチドと相補的または実質的に相 補的な塩基配列またはその一部を含有してなるアンチセンスポリヌクレ ォチド、
( 1 3) 上記 （ 3) 記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いるこ とを特徴とする上記 （ 1 ) 記載の蛋白質の mRNAの定量方法、 ( 1 4) 上記 （ 9 ) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 （ 1 ) 記 載の蛋白質の定量方法、
( 1 5) 外来性の、 上記 （ 1 ) 記載の蛋白質をコードする DNAまたは その変異 DN Aを有する非ヒトトランスジエニック動物、
( 1 6) 非ヒト動物がゲッ歯動物である上記 （ 1 5) 記載の動物、 ( 1 7) ゲッ歯動物がマウスまたはラッ トである上記 （ 1 6) 記載の動 物、
( 1 8) 外来性の、 上記 （ 1 ) 記載の蛋白質をコードする DNAまたは その変異 DN Aを含有し、 非ヒ卜動物において発現しうる組換えべクタ ( 1 9) 上記 （ 1 ) 記載の蛋白質をコ一ドする DNAが不活性化された 非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2 0) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （ 1 9) 記載の胚幹細 胞、
(2 1 ) ゲッ歯動物がマウスである上記 （ 2 0) 記載の胚幹細胞、 ( 2 2 ) 上記 （ 1 ) 記載の蛋白質をコードする DNAが不活性化された 該 DN A発現不全非ヒト哺乳動物、
(2 3) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （2 2) 記載の非ヒト 哺乳動物なども提供する。
以下、 「配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ぺプチドもしく はその塩」 を 「本発明の受容体」 または 「本発明の蛋白質」 と略記する 場合がある。 さらに、 「本発明の受容体と特異的に結合する能力を有す るリガンド」 を 「本発明のリガンド」 と略記する場合がある。
さらに、 本発明は、
(i) 標識した GTP r sの存在下、 本発明のリガンドを本発明の受容体 細胞膜画分に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を 本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合における、 本発明の受容体 細胞膜画分への GTP r S結合促進活性を測定し、 比較することを特徴 とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化 、合物のスクリ一二ング方法、
(Γ) 試験化合物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させ、 本発明の受 容体細胞膜画分への GT P r s結合促進活性を測定することを特徴とす る、 本発明の受容体に対するァゴニス卜のスクリ一二ング方法、
(ii)本発明のリガンドを本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触さ せた場合における、 該細胞の細胞内 c AMPの濃度を測定し、 比較する ことを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変 化させる化合物のスクリーエング方法、
(ii') 試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させ、 該細胞の細胞 内 c AM Pの濃度 （好ましくは、 細胞内 c AMP産生促進活性） を測定 することを特徴とする、 本発明の受容体に対するァゴニストのスクリ一 ニング方法、
(iii) 本発明のリガンドを、 CRE—レポーター遺伝子ベクターを導入 した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドぉ よび試験化合物を、 C RE—レポーター遺伝子ベクターを導入した本発 明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 レポーター遺伝子蛋白 質の酵素活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンド と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、 ( i i i ' ) 試験化合物を、 C R E—レポ一夕一遺伝子ベクターを導入した 本発明の受容体発現細胞に接触させ、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活 性を測定することを特徴とする、 本発明の受容体に対するァゴニス卜の スクリ一二ング方法、
( iv) 本発明のリガンドを、 S R E—レポ一ター遺伝子ベクターを導入 した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドぉ よび試験化合物を、 S R E—レポ一夕一遺伝子ベクターを導入した本発 明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 レポーター遺伝子蛋白 質の酵素活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンド と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一ニング方法、 、 （iv' ) 試験化合物を、 S R E—レポーター遺伝子ベクターを導入した本 発明の受容体発現細胞に接触させ、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性 を測定することを特徴とする、 本発明の受容体に対するァゴニストのス クリーニング方法、
( V) 本発明のリガンドを、 標識したァラキドン酸を含有する本発明の受 容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物 を、 標識したァラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触さ せた場合における、 ァラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、 比較する ことを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変 化させる化合物のスクリーニング方法、'
(ν' ) 試験化合物を、 標識したァラキドン酸を含有する本発明の受容体 発現細胞に接触させ、 ァラキドン酸代謝物の放出活性を測定することを 特徴とする、本発明の受容体に対するァゴニストのスクリ一ニング方法、
(v i) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合 と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に 接触させた場合における、 細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、 比 較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合 性を変化させる化合物のスクリ一二ング方法、
(v i ' ) 試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させ、 細胞内カルシ ゥム濃度上昇活性を測定することを特徴とする、 本発明の受容体に対す るァゴニス卜のスクリ一二ング方法、
(vii) 標識したイノシトールの存在下、 本発明のリガンドを、 本発明の 受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合 物を、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 イノシトー ル三リン酸産生活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリ ガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニン グ方法、
(vii') 標識したイノシトールの存在下、 試験化合物を本発明の受容体 発現細胞に接触させ、 イノシトール三リン酸産生活性を測定することを
、特徴とする、本発明の受容体に対するァゴニス卜のスクリーニング方法、
(viii) 本発明のリガンドを、 T R E—レポーター遺伝子ベクターを導 入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンド および試験化合物を、 TRE—レポーター遺伝子べクタ一を導入した本 発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 レポ一夕一遺伝子蛋 白質の酵素活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガン ドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一二ング方 法、
(viii')試験化合物を、 TR E—レポ一夕一遺伝子ベクターを導入した 本発明の受容体発現細胞に接触させ、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活 性を測定することを特徴とする、 本発明の受容体に対するァゴニス卜の スクリ一ニング方法、
(ix) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合 と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に 接触させた場合における、 細胞増殖を測定し、 比較することを特徴とす る、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物 のスクリーニング方法、
(ix') 試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させ、 細胞増殖を測 定することを特徴とする、 本発明の受容体に対するァゴニストのスクリ 一二ング方法、
(x) 標識したルビジウムの存在下、 本発明のリガンドを、 本発明の受容 体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 標識したルビジゥ ムの流出活性を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンド と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
(χ' ) 標識したルビジウムの存在下、 試験化合物を、 本発明の受容体発 現細胞に接触させ、 標識したルビジウムの流出活性を測定することを特 徴とする、 本発明の受容体に対するァゴニス卜のスクリ一ニング方法、 (xi) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合 、と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に 接触させた場合における、 細胞外液の p H変化を測定し、 比較すること を特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化さ せる化合物のスクリ一二ング方法、
(xi ' ) 試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させ、 細胞外液の p
H変化を測定することを特徴とする、 本発明の受容体に対するァゴニス 卜のスクリ一二ング方法、
(xi i ) ヒスチジン合成遺伝子を導入した本発明の受容体発現酵母を、 ヒ スチジン欠乏培地で培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンド および試験化合物を接触させ、 該酵母の生育を測定し、 比較することを 特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させ る化合物のスクリーニング方法、
(xi i ' ) ヒスチジン合成遺伝子を導入した本発明の受容体発現酵母を、 ヒスチジン欠乏培地で培養し、 試験化合物を接触させ、 該酵母の生育を 測定することを特徴とする、 本発明の受容体に対するァゴニストのスク リ一二ング方法、
(xi i i) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体遺伝子 R N A導入ァクリ カツメガエル卵母細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試 験化合物を、 本発明の受容体遺伝子 R N A導入アフリカッメガエル卵母 細胞に接触させた場合における、 細胞膜電位の変化を測定し、 比較する ことを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変 化させる化合物のスクリーニング方法、
(x i i i' ) 試験化合物を、 本発明の受容体遺伝子 R N A導入アフリカッメ ガエル卵母細胞に接触させ、 細胞膜電位の変化を測定することを特徴と する、 本発明の受容体に対するァゴニス卜のスクリ一二ング方法、
(x iv)本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合 と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に 接触させた場合における、 受容体のインターナリゼーシヨン （内部移行 ) の程度を測定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本
、発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一二ング方法、
(xiv' ) 試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させ、 受容体のィ ンターナリゼーション（内部移行）の程度を測定することを特徴とする、 本発明の受容体に対するァゴニストのスクリ一ニング方法なども提供す る。
本発明の受容体 （例、 GPR52など） の活性を促進または阻害する化合物 またはその塩、 本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害する化 合物またはその塩、 本発明のスクリ一ニング方法またはスクリ一二ング 用キッ 卜で得られうる化合物またはその塩（例、 GPR52ァゴニス卜、 GPR52 アン夕ゴニス ト） などは、 例えば、 精神疾患 （例、 統合失調症、 不安症、 認知障害、 パニック障害、 恐怖性障害、 薬物誘発性精神病性障害、 妄想 性精神病、 神経遮断薬誘発性ジスキネジァ、 パーキンソン病、 薬物誘発 性パーキンソン症状群、 錐体外路症状など） 、 プロラクチン関連疾患 〔 例、高プロラクチン血症（例、不妊症、乳汁漏出、無月経、卵巣および子宮の 萎縮など）、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 プロラクチン分泌不全 (例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害、 甲状腺機能低下な ど） など〕 、 高血圧症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （ 例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 などの予防 ·治療剤などとして有用である。 また、 本発明の受容体の活性を促進する化合物またはその塩、 本発明 の受容体の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、 本発明の受容 体に対するァゴニスト、 本発明の受容体に対するリガンドなどは、 本発 明の受容体 （例、 GPR52など） を発現している神経細胞の細胞内 cAMP濃度 を上昇させるため、 統合失調症の陽性症状の原因の一つとされている中 脳辺縁系ドーパミン経路の過活動を抑制し、 統合失調症の陽性症状を改 善させることができる。 また、 統合失調症の陰性症状や認知障害の原因 の一つとされている大脳皮質の丽 DA型受容体の機能低下を改善し、 統合 失調症の陰性症状や認知障害を改善させることができる。 よって、 上記 化合物またはその塩、 ァゴニストおよびリガンドなどは、 好ましくは、 、統合失調症、 認知障害などの予防 ·治療剤などとして有用である。
さらに、 本発明の受容体の活性を促進する化合物またはその塩、 本発 明の受容体の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、 本発明の受 容体に対するァゴニスト、 本発明の受容体に対するリガンドなどは、 プ 口ラクチンの分泌を促進し得るので、 プロラクチンの分泌不全 (例、 卵 巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害、 甲状腺機能低下など） など の予防 ·治療剤などとして有用である。
本発明の受容体の活性を阻害する化合物またはその塩、 本発明の受容 体の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 本発明の受容体に対 するアン夕ゴニストなどは、 本発明の受容体 （例、 GPR52など） を発現し ている神経細胞の細胞内 cAMP濃度を低下させるため、 パーキンソン病の 原因とされている黒質線条体ド一パミン経路でのドーパミン欠損に起因 する細胞内 cAMPの産生の抑制不全を改善させることができるため、 好ま しくは、 パーキンソン病などの予防 ·治療剤などとして有用である。 また、 本発明の受容体の活性を阻害する化合物またはその塩、 本発明 の受容体の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 本発明の受容 体に対するアン夕ゴニストなどは、 プロラクチンの分泌を抑制し得るの で、 プロラクチン分泌過多症 〔例、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣および子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳 腫瘍、 月経異常など〕 などの予防 ·治療剤などとして有用である。
さらに、 本発明の受容体 （例、 GPR52など） または （および） そのリガ ンド （例、 レセルピン、 メ トクトラミンなど） は、 精神疾患などの予防 '治療作用を有する化合物またはその塩のスクリ一エングに有用である。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト GPR52発現プラスミ ドを、 CNGC- E583M/HEK293細胞株に一 過性に発現させてレセルピンを添加した時の細胞内 Ca2+濃度の変化を調 ベた結果を表す。 図中、 縦軸は細胞内 Ca2+濃度を示す蛍光強度を、 横軸は 測定開始後の時間経過 （秒） を、 ◊は HBSS buffer (Base)、 ロはレセルピ 、ン 1. 0 xM、 △は 3. 0 M、 Xは 10 M、 ♦は 30 Μ、 ▲は ΙΟΟ Μの場合をそ れぞれ表す。
図 2は、 ヒト GPR52発現プラスミ ドを、 CNGC-E583M/HEK293細胞株に一 過性に発現させてメトク トラミンを添加した時の細胞内 Ca2+濃度の変化 を調べた結果を表す。 図中、 縦軸は細胞内 Ca2+濃度を示す蛍光強度を、 横 軸は測定開始後の時間経過 （秒） を、 ◊は HBSS buffer (Base)、 口はメト クトラミン 15 M、 △は 45 M、 ▲は 75 Mの場合をそれぞれ表す。
図 3は、 ヒト GPR52を安定発現させた CH0細胞における、 レセルピン刺 激によって増加した細胞内 cAMP濃度を調べた結果を表す。 図中、 縦軸は cAMP増加率を、 横軸はレセルピンの各添加量をそれぞれ表し、 白は
MockCHO細胞株を、 黒は GPR52発現 CH0細胞株を、. 斜線は TGR5発現 CH0細胞 株の結果を表す。
図 4は、 カルシウム濃度上昇の測定結果を表す。 図中、 縦軸は細胞内 Ca2+濃度を示す蛍光強度を、 横軸は測定開始後の時間経過 （分） を示す。 黒矢印で示した時点で 10 M グルタミン酸添加を、 破線矢印で示した時 点で 0.2mM メ卜ク トラミンを添加した。
図 5は、 カルシウム濃度上昇の測定結果を表す。 図中、 縦軸は細胞内 Ca2+濃度を示す蛍光強度を、 横軸は測定開 台後の時間経過 （分） を示す。 破線矢印で示した時点で 0.2mM メトクトラミンを、 黒矢印で示した時点 T JP2006/305900
19 で 5 x M グルタミン酸添加を添加した。 発明を実施するための最良の形態
配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を有する蛋白質は、 ヒトゃ温血動物 (例えば、モルモッ ト、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 網膜細胞、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 滕臓 3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮 細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 線維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラ一細 、胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間 質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは癌細胞など） も しくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 (例、 網膜、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳 皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小 腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 または血球系の細胞もしくはその 培養細胞 （例、 MEL, Ml , CTLL-2, HT- 2, WEHI- 3， HL-60, JOSK- 1 , K562 , ML - 1， MOLT - 3， MOLT - 4， MOLT- 10， CCRF-CEM, TALL- 1 , Jurka t , CCRT-HSB-2 ， KE-37, SKW-3 , HUT- 78 , HUT- 102, H9, U937, THP- 1 , HEL, JK - 1， CMK, KO-812, MEG-01など） に由来する蛋白質であってもよく、 合成蛋白質で あってもよい。
配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 としては、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と約 6 0 %以上、 好ま しくは約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST ( National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、 以下の条件 （期待値 = 10； ギャップを許す； マト リクス =BLOSUM62； フィルタリング = OFF) にて計算することができる。 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表されるァ ミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。 配列 番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 例えば、 配列番号 ： 3で表されるアミノ酸配列、 配列番号 ： 5で表 されるアミノ酸配列などが挙げられる。
、 実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル 情報伝達作用などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性 質的に同質であることを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナ ル情報伝達作用などの活性が同等 （例、 約 0. 0 1〜 1 0 0倍、 好まし くは約 0. 5〜 2 0倍、 より好ましくは約 0. 5〜 2倍） であることが 好ましいが、 これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異 なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 自体 公知の方法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後に記載するリガ ンドの決定方法ゃスクリ一二ング方法に従って測定することができる。 また、 本発明の受容体としては、 （i) 配列番号： 1、 配列番号： 3ま たは配列番号： 5で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例え ば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0 個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （ 1〜 5個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （ii) 配列番号： 1、 配 列番号： 3または配列番号 ： 5で表されるアミノ酸配列に 1または 2個 以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 5 0個程度、 好ましく は 1〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは 数個 （ 1〜 5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （iii) 配列番 号： 1、 配列番号 ： 3または配列番号： 5で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個程度、 好ましくは 1〜 5 0個程 度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さら に好ましくは数個 （ 1〜 5個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され たアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 1、 配列番号： 3または配列番号： 5で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 1 0 0個 程度、 好ましくは 1〜 5 0個程度、 好ましくは 1〜 3 0個程度、 より好 ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （ 1〜 5個） ） のアミ ノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組み合わせたアミ ノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
、 本発明の受容体の具体例としては、 配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列を含有する蛋白質、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有す る蛋白質、 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質など が挙げられる。
本発明の受容体の部分ペプチド （以下、 本発明の部分ペプチドと称す る場合がある） としては、 後述の医薬等のスクリーニング方法に用いる ことのできる部分ペプチドであれば、 いかなるものであってもよく、 例 えば、 本発明の蛋白質分子のうち、 細胞膜の外に露出している部位であ つて、 実質的に同質のリガンド結合活性などを有するものな.どが用いら れる。
配列番号： 1、 配列番号： 3または配列番号： 5で表されるアミノ酸 配列を含有する蛋白質の部分ペプチドとしては、 疎水性プロッ ト解析に おいて細胞外領域 （親水性 （Hydrophi l ic) 部位） であると分析された部 分を含むペプチドである。 また、 疎水性 （Hydrophobic) 部位を一部に含 むペプチドも同様に用いることができる。 個々のドメインを個別に含む ぺプチドも用い得るが、 複数のドメインを同時に含む部分のぺプチドで もよい。
本発明の部分べプチドのアミノ酸の数は、 本発明の蛋白質の構成アミ ノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好 ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を有するぺプチドなどが好ましレ ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 上記と同意義を示す。 「実質 的に同質の活性」 の測定は上記と同様に行なうことができる。
また、 本発明の部分ペプチドは、 （i ) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （ 1〜 5個） ） のアミノ酸が欠失し、 （i i ) 上記アミノ酸配列に 1または 2個 以上 （好ましくは、 1〜 2 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （ 1〜 5個） ） のアミノ酸が付加し、 または （i i i ) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜 1 0個程 度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜 5個程度） のアミノ酸 、が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
具体例としては、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の第 2 1〜 3 6 1番目のアミノ酸配列を含む部分べプチドなどが用いられる。
本発明の受容体および本発明の部分べプチドは、 ぺプチド標記の慣例 に従って左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 (カルボキシル末 端） である。 C末端はカルポキシ （- C00H) 、 カルポキシレート （- C00一 ) 、 アミ ド （- C0NH2) またはエステル （- C00R) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n— プロピル、 イソプロピルもしくは n—プチルなどの アルキル、 例え ば、 シク口ペンチル、 シク口へキシルなどの C 3_8シク口アルキル、 例え ば、 フエニル、 α —ナフチルなどの C 6_12ァリール、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー アルキルもしくは α —ナフチルメチル などのひ 一ナフチル— C Ηアルキルなどの C 7—！ 4ァラルキルのほか、 経口 用エステルとして汎用されるピバロィルォキシメチルなどが用いられる。 本発明の受容体および本発明の部分べプチドが C末端以外にカルポキ シ （または力ルポキシレ一ト） を有している塲合、 力ルポキシがアミ ド 化またはエステル化されているものも本発明の受容体および本発明の部 分ペプチドに含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。 さらに、 本発明の受容体および本発明の部分ペプチドには、 N末端の アミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホ ルミル、 ァセチルなどの アルカノィルなどの ァシルなど） で保 護されているもの、 生体内で切断されて生成する N末端のグルタミン残 基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 (例えば、 - 0H、 - SH、 アミノ基、 イミダゾ一ル基、 インドール基、 グァ ニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル、 ァセチルなどの C Hアルカノィルなどの ァシルなど） で保護されているもの、 あるい は糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。 本発明の受容体または本発明の部分ペプチドの塩としては、 生理学的
、に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ま しい。 このような塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プ ロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リ ンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） と の塩などが用いられる。
本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンド （本発明の リガンド）としては、本発明の受容体と特異的に結合するもめであれば、 何れの物であってもよい。 例えば、 本発明の受容体との結合の解離定数 が 1 0 M以下、好ましくは 2 i M以下、さらに好ましくは 1 以下、 特に好ましくは 2 0 0 η Μ以下、 最も好ましくは 1 0 0 η Μ以下である 物などが挙げられる。
本発明のリガンドとしては、 例えば、 レセルピン化合物 （例、 化合物 ( I ) など） 、 インドールアルカロイ ド、 メトクトラミン化合物 （例、 化 合物 （I I) など） などが用いられる。 さらに、 Ν- [3- (3-クロロフエノキ シ）フエニル] -2 -メチル- 8- [3 -（1-ピペラジニル）プロピル] - 5， 6, 7, 8 -テ トラヒドロピリ ド [2， 3-d]ピリミジン- 5-ァミン 4塩酸塩 （特開
2003 - 321472号の実施例 175) なども用いられる。 化合物 （I ) における環 Aまたは環 Bで示される 「置換基を有していて もよいベンゼン環」 の 「置換基」 としては、 例えば、 ハロゲン原子 （例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） 、 C卜 3アルキレンジォキシ (例、 メ チレンジォキシ、 エチレンジォキシなど) 、 ニトロ、 シァノ、 ハロゲン 化されていてもよい アルキル、 ハロゲン化されていてもよい C 2_6ァ ルケニル、 カルボキシ C 2_6アルケニル （例、 2—カルボキシェテニル、 2—力ルポキシー 2—メチルェテニルなど） 、 ハロゲン化されていても よい C 2_6アルキニル、 ハロゲン化されていてもよく、 縮合していてもよ い C 3_8シク口アルキル、 C 6_14ァリール （例、 フエニル、 1 一ナフチル、 2 一ナフチル、 2 —ビフエ二リル、 3 —ビフエ二リル、 4ービフエニリ 、ル、 2—アンスリルなど) 、 ハロゲン化されていてもよい C卜8アルコキ シ、 C Hアルコキシ一力ルポ二ルー アルコキシ （例、 エトキシカル ボニルメチルォキシなど) 、 C 3_ 8シクロアルキル一ォキシ (例、 シクロ プロピルォキシ、 シク口ペンチルォキシ、 シク口へキシルォキシなど）、 ヒドロキシ、 C 6-147リールォキシ （例、 フエニルォキシ、 1 一ナフチル 才キシ、 2—ナフチルォキシなど) 、 C 7_16ァラルキルォキシ (例、 ベン ジルォキシ、 フエネチルォキシなど） 、 メルカプト、 ハロゲン化されて いてもよい アルキルチオ、 C S-Mァリールチオ （例、 フエ二ルチオ、 1 一ナフチルチオ、 2 一ナフチルチオなど) 、 < 7-1 6ァラルキルチオ (例 、 ベンジルチオ、 フエネチルチオなど) 、 ァミノ、 ヒドロキシァミノ、 モノー アルキルアミノ （例、 メチルァミノ、 ェチルァミノなど） 、 モノー C 6_14ァリールァミノ （例、 フエニルァミノ、 1 一ナフチルァミノ 、 2—ナフチルァミノなど） 、 ジー アルキルアミノ （例、 ジメチル ァミノ、 ジェチルァミノ、 ェチルメチルァミノなど） 、 ジー C 6_14ァリー ルァミノ （例、 ジフエニルァミノなど） 、 ニトロ、 二トリル、 ホルミル、 力ルポキシ、 アルキル一力ルポニル （例、 ァセチル、 プロピオニル など） 、 （ 3_ 8シクロアルキル一力ルポニル （例、 シクロプロピルカリレポ ニル、 シクロペンチルカルポニル、 シクロへキシルカルポニルなど） 、 アルコキシ一力ルポニル （例、 メトキシカルボニル、 エトキシカル ポニル、 プロポキシカルボニル、 t e r t -ブトキシカルボニルなど） 、 C 6.H ァリール一カルボニル （例、 ベンゾィル、 1 _ナフトイル、 2—ナフト ィルなど） 、 C 7— 16ァラルキル—カルボニル （例、 フエ二ルァセチル、 3 一フエニルプロピオニルなど） 、 （ 6_14ァリールォキシ一力ルポニル （例 、 フェノキシ力ルポニルなど) 、 < 7_16ァラルキルォキシ—カルポニル ( 例、 ベンジルォキシカルボニル、 フエネチルォキシカルボニルなど) 、 5または 6員複素環カルポニル（例、 ニコチノィル、イソニコチノィル、 テノィル、 フロイル、 モルホリノカルボニル、 チオモルホリノカルボ二 ル、 ピペラジン一 1 ーィルカルボニル、 ピロリジン— 1 ーィルカルポ二 ルなど） 、 力ルバモイル、 モノ— アルキル—力ルバモイル （例、 メ
、チルカルバモイル、 ェチルカルバモイルなど） 、 ジ— c Hアルキル—力 ルメチルカルバモイルなど） 、 c 6_14ァリール—力ルバモイル (例、 フエ 二ルカルバモイル、 1 一ナフチルカルバモイル、 2 一ナフチルカルバモ ィルなど） 、 C 1 iアルコキシ一力ルバモイル (例、 メ トキシカルバモイ ル、 エトキシカルバモイルなど） 、 5または 6員複素環力ルバモイル （ 例、 2—ピリジルカルバモイル、 3—ピリジルカルバモイル、 4一ピリ ジルカルバモイル、 2—チェ二ルカルバモイル、 3—チェ二ルカルパモ ィルなど） 、 スルホ、 C Hアルキルスルホニル (例、 メチルスルホニル、 ェチルスルホニルなど) 、 C 6 4ァリ一ルスルホニル (例、 フエニルスル ホニル、 1—ナフチルスルホニル、 2—ナフチルスルホニルなど） 、 ホ ルミルァミノ、 C】_6アルキル一力ルポニルァミノ （例、 ァセチルァミノ など） 、 （：6_14ァリール一力ルポニルァミノ （例、 ベンゾィルァミノ、 ナ フトイルァミノなど） 、 アルコキシ—力ルポニルァミノ （例、 メ ト キシカルポニルァミノ、 エトキシカルポニルァミノ、 プロポキシ力ルポ ニルァミノ、 ブトキシカルポニルァミノなど） 、 アルキルスルホ二 ルァミノ （例、 メチルスルホニルァミノ、 ェチルスルホニルァミノなど ) 、 C 6_14ァリ一ルスルホニルァミノ （例、 フエニルスルホニルァミノ、 2—ナフチルスルホニルァミノ、 1 —ナフチルスルホニルアミノなど）、 アルキル一カルボニルォキシ (例、 ァセトキシ、 プロピオ二ルォキ シなど） 、 C 6— 14ァリール—カルポニルォキシ （例、 ベンゾィルォキシ、 ナフチルカルボニルォキシなど) 、 C 1 -6アルコキシ一カルボニルォキシ (例、 メ 卜キシカルボニルォキシ、 Xトキシカルポニルォキシ、 プロボ キシカルポニルォキシ、 ブトキシカルボニルォキシなど) 、 モノー C 1ー6 アルキル一力ルバモイルォキシ (例、 メチルカルバモイルォキシ、 ェチ ルカルバモイルォキシなど） 、 ジー c Hアルキル一力ルバモイルォキシ
) 、 c 6_14ァリール一力ルバモイルォキシ （例、 フエ二ルカルバモイルォ キシ、 ナフチルカルバモイルォキシなど） 、 5または 6員複素環カルボ 、ニル才キシ (例、 ニコチノィルォキシ、 イソニコチノィルォキシなど） 、 5ないし 7員飽和環状アミノ （例、 ピロリジン一 1 一ィル、 ピペリジノ、 ピぺラジン一 1 一ィル、 モルホリノ、 チオモルホリ ノ、 テトラヒドロア ゼピン一 1 一ィル、 ホモピぺラジン一 1ーィルなど） 、 5ないし 1 0員 芳香族複素環基 （例、 2—チェニル、 3 -チェニル、 2—フリル、 3— フリル、 2 —ピリジル、 3 —ピリジル、 4 _ピリジル、 2 —キノリル、 3—キノリル、 4—キノリル、 5 _キノリル、 8 _キノリル、 1 一イソ キノリル、 3—イソキノリル、 4 _イソキノリル、 5—イソキノリル、 1 一インドリル、 2—インドリル、 3—インドリル、 2—べ.ンゾチアゾ リル、 2—べンゾ 〔b〕 チェニル、 3—べンゾ 〔b〕 チェニル、 2—べ ンゾ 〔b〕 フラニル、 3 _ベンゾ 〔b〕 フラニルなど） 、 3ないし 1 0 員非芳香族複素環基 （例、 1ーァゼチジニル、 2—ァゼチジニル、 3— ァゼチジニル、 1 一ピロリジニル、 2 —ピロリジニル、 3 —ピロリジニ ル、 2—イミダゾリニル、 4 一イミダゾリニル、 2—ピラゾリジニル、 3 —ビラゾリジニル、 4—ピラゾリジニル、 2 一ピぺリジル、 3 —ピぺ リジル、 4ーピペリジル、 1—ピペラジニル、 2—ピペラジニル、 モル ホリノ、 チオモルホリノ、 2一才キシラニル、 2—才キセタニル、 3 一 ォキセ夕ニル、 2—テトラヒドロフラニル、 4—テトラヒドロピラニル など） 、 ォキソなどが挙げられる。 前記 「ハロゲン化されていてもよい C Hアルキル」 としては、 例えば 1ないし 5個、 好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子 （例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよいアルキル （例、 メチル、 ェチル、 プ口ピル、 イソプロピル、 プチル、 イソブチル、 s ec-ブチル、 t e r t -ブチル、 ペンチル、 へキシルなどの C Hアルキルなど） などが挙げ られる。 具体例としては、 メチル、 クロロメチル、 ジフルォロメチル、 卜リク口ロメチル、 トリフルォロメチル、 ェチル、 2 -ブロモェチル、 2 , 2， 2—トリフルォロェチル、 ペン夕フルォロェチル、 プロピル、 3， 3 , 3—トリフルォロプロピル、 イソプロピル、 ブチル、 4， 4 , 4 一トリフルォロブチル、 イソブチル、 s ec-ブチル、 t e r t -プチル、 ペン 、 チル、 ィソペンチル、 ネオペンチル、 5， 5 , 5—トリフルォロペンチ ル、 へキシル、 6， 6 , 6—トリフルォ口へキシルなどが挙げられる。 前記 「ハロゲン化されていてもよい C 2—6アルケニル」 としては、 例え ば 1ないし 5個、好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子（例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよい C 2_6アルケニル （例、 ビ ニル、 プロぺニル、 イソプロぺニル、 2—ブテン一 1 一ィル、 4—ペン テン一 1 一ィル、 5—へキセン— 1ーィルなど） などが挙げられる。 前記 「ハロゲン化されていてもよい C 2_6アルキニル」 としては、 例え ば 1ないし 5個、好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子（例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよい C 2_6アルキニル （例、 プ 口パルギル、 2 —ブチン— 1 —ィル、 4 一ペンチン— 1 —ィル、 5—へ キシン一 1ーィルなど） などが挙げられる。
前記 「ハロゲン化されていてもよく、 縮合していてもよい C 3_8シクロ アルキル」 の 「ハロゲン化されていてもよい C 3_8シクロアルキル」 とし ては、 例えば 1ないし 5個、 好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子 （ 例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよい C 3— 6シクロ アルキル （例、 シクロプロピル、 シクロブチル、 シクロペンチル、 シク 口へキシルなど）などが挙げられる。具体例としては、 シクロプロピル、 シクロブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 4， 4ージクロロシ 2006/305900
28 ク口へキシル、 2， 2 , 3， 3—テトラフルォロシクロペンチル、 4一 クロ口シクロへキシルなどが挙げられる。
前記 「ハロゲン化されていてもよく、 縮合していてもよい C 3_8シクロ アルキル」 の 「縮合した C 3_8シクロアルキル」 としては、 例えば、 8な いし 1 4員の二環または三環性 C 3—8シクロアルキル （例、 1—ァダマン チル、 2ーァダマンチル、デカリン一 1—ィル、テトラリン一 1 一ィル、 9 一フルォレニル、 1 一インダニル、 1， 2 , 3， 4 —テトラヒドロー
1 _ナフチルなど） などが挙げられる。 また、 該 「縮合した c 3_8シクロ アルキル」 は、 ハロゲン化されていてもよい。
前記 「ハロゲン化されていてもよい アルコキシ」 としては、 例え 、 ば 1ないし 5個、好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子（例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよい アルコキシ （例、 メ トキシ、 エトキシ、 プロボキシ、 イソプロポキシ、 ブトキシ、 イソブト キシ、 s ec-ブトキシ、 ペンチルォキシ、 へキシルォキシなど） などが挙 げられる。 具体例としては、 例えばメ 卜キシ、 ジフルォロメ トキシ、 卜 リフルォロメ 卜キシ、 エトキシ、 2， 2 , 2—トリフルォロエトキシ、 プロポキシ、 イソプロポキシ、 ブトキシ、 4， 4 , 4一トリフルォロブ トキシ、 イソブトキシ、 sec-ブトキシ、 ペンチルォキシ、 へキシルォキ シなどが挙げられる。
前記 「ハロゲン化されていてもよい アルキルチオ」 としては、 例 えば 1ないし 5個、 好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子 （例、 フッ 素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよい C Hアルキルチオ （ 例、 メチルチオ、 ェチルチオ、 プロピルチオ、 イソプロピルチオ、 プチ ルチオ、 s ec -プチルチオ、 t e r t-プチルチオなど） などが挙げられる。 具 体例としては、 メチルチオ、 ジフルォロメチルチオ、 トリフルォロメチ ルチオ、 ェチルチオ、 プロピルチオ、 イソプロピルチオ、 プチルチオ、 4， 4 , 4一トリフルォロブチルチオ、 ペンチルチオ、 へキシルチオな どが挙げられる。
上記 「ベンゼン環」 は、 例えば上記置換基を、 置換可能な位置に 1な いし 5個、 好ましくは 1ないし 3個有していてもよく、 置換基数が 2個 以上の場合、 各置換基は同一または異なっていてもよい。
環 Cで示される 「置換基を有していてもよい 6員環」 の 「置換基」 と しては、 例えば、 上記環 Aで示される 「置換基を有していてもよいベン ゼン環」 の 「置換基」 などが挙げられる。
上記 「 6員環」 は、 例えば上記置換基を、 置換可能な位置に 1または 2個有していてもよく、 置換基数が 2個の場合、 各置換基は同一または 異なっていてもよい。
環 Dで示される 「置換基を有していてもよい 5ないし 7員含窒素複素 環」 の 「 5ないし 7員含窒素複素環」 としては、 例えば、 炭素原子およ 、び窒素原子以外に窒素原子、 硫黄原子および酸素原子から選ばれる 1ま たは 2種、 1ないし 4個のへテロ原子を含む 5ないし 7員複素環、 好ま しくは （i ) 5ないし 7員含窒素芳香族複素環、 （i i ) 5ないし 7員含窒 素非芳香族複素環などが挙げられる。
上記 「 5ないし 7員含窒素芳香族複素環」 としては、 例えば、 ピロ一 ル、 イミダゾール、 ピリジン、 ピラジン、 ピリミジン、 ピリダジンなど の芳香族複素環などが挙げられる。
上記 「 5ないし 7員含窒素非芳香族複素環」 としては、 例えば、 ピロ リジン、 イミダゾリン、 ピラゾリジン、 ピラゾリン、 ピぺリジン、 ピぺ ラジン、 モルホリン、 チオモルホリンなどが挙げられる。
環 Dで示される 「置換基を有していてもよい 5ないし 7員含窒素複素 環」 の 「置換基」 としては、 例えば、 上記環 Aで示される 「置換基を有 していてもよいベンゼン環」 の 「置換基」 などが挙げられる。
上記 「 5ないし 7員含窒素複素環」 は、 例えば上記置換基を、 置換可 能な位置に 1ないし 3個、 好ましくは 1または 2個有していてもよく、 置換基数が 2個の場合、 各置換基は同一または異なっていてもよい。 環 Eで示される 「置換基を有していてもよい 5.ないし 7員環」 の '「 5 ないし 7員環」 としては、 例えば、 5ないし 7員同素環、 5ないし 7員 複素環などが挙げられる。 「 5ないし 7員同素環」 としては、 例えば C 5_7シクロアルカン （例、 シクロペンタン、 シクロへキサン、 シクロヘプタンなど） 、 C 5_7シク口 アルケン （例、 シクロペンテン、 シクロペン夕ジェン、 シクロへキセン、 1， 3—シクロへキサジェン、 1， 4 -シク口へキサジェン、 シクロへ プテン、 1， 3—シクロへブタジエンなど) 、 ベンゼンなどが挙げられ る。
「 5ないし 7員複素環」 としては、 例えば、 炭素原子以外に窒素原子、 硫黄原子および酸素原子から選ばれる 1または 2種、 1ないし 4個のへ テロ原子を含む 5ないし 7員複素環、 好ましくは （i ) 5ないし 7員芳香 族複素環、 （i i ) 5ないし 7員非芳香族複素環などが挙げられる。
、 上記 「 5ないし 7員芳香族複素環」 としては、 例えば、 チォフェン、 フラン、 ピロ一ル、 イミダゾール、 ピラゾ一ル、 ピリジン、 ピラジン、 ピリミジン、 ピリダジンなどの芳香族複素環などが挙げられる。
上記 「 5ないし 7員非芳香族複素環」 としては、 例えば、 テトラヒド 口フラン、 ジヒドロフラン、 ピラン、 ジォキソラン、 ジォキサン、 ァゼ チジン、 ピロリジン、 イミダゾリン、 ピラゾリジン、 ピラゾリン、 ピぺ リジン、 ピぺラジン、 モルホリン、 チオモルホリン、 チアゾリジン、 ォ キサゾリジン、 ォキサジァゾリン、 チアジアゾリン、 トリァゾリン、 1， 4一ジァゼパン、 1 , 4—ォキサゼパン、 1 , 4—チアゼパンなどが挙 げられる。
上記 「 5ないし 7員複素環」 として好ましくは、 5または 6員複素環 (例、 チォフェン、 フラン、 ピロ一ル、 イミダゾ一ル、 ピラゾール、 ピ リジン、 ピラジン、 ピリミジン、 ピリダジンなど） などが挙げられる。 環 Eで示される 「置換基を有していてもよい 5ないし 7員環」 の 「 5 ないし 7員環」 は、 式
Figure imgf000031_0001
〔式中、 環 Bは上記と同意義を示す〕 で表される基以外に、 さらに、 置 換基を有していてもよい。 このような 「置換基」 としては、 例えば、 上 記環 Aで示される 「置換基を有していてもよいベンゼン環」 の 「置換基 」 などが挙げられる。
上記 「 5ないし 7員環」 は、 例えば上記置換基を、 置換可能な位置に 1ないし 3個、 好ましくは 1ないし 2個有していてもよく、 置換基数が 2個以上の場合、 各置換基は同一または異なっていてもよい。
環 Aとして好ましくは、 アルコキシを有していてもよいベンゼン 環である。
環 Bとして好ましくは、 アルコキシを 1〜 3個有していてもよい ベンゼン環である。
環 Cとして好ましくは、 無置換である。
環 Dとして好ましくは、 ピぺリジンである。
環 Eとして好ましくは、 式
Figure imgf000032_0001
〔式中、 環 Bは上記と同意義を示す〕 で表される基以外に、 .さらに アルコキシおよび C卜8アルコキシ一力ルポニルから選ばれる置換基を 1 または 2個有していてもよい C 5_7シクロアルカンである。
化合物 （I) として、 好ましくは、 式
Figure imgf000032_0002
〔式中、 環 D aは、 置換基を有していてもよい 6員含窒素複素環、 環 E aは、 置換基を有していてもよい 6員環、
環 Aおよび環 Bは、 上記と同意義を示す〕 で表される化合物などが挙げ られる。
化合物 （I ) として、 さらに好ましくは、 レセルピンである。
インドールアルカロイ ドとしては、 例えば、 ラウオルフィァ · アル力 ロイ ドなどが挙げられる。 具体的には、 レセルピン、 アルサーォキシロ ン、 シロシンゴピン、 レシナミンなどが挙げられる。 好ましくはレセル ピンが用いられる。
化合物 （I I ) における R 1または R 2で示される 「置換基を有していて もよい炭化水素基」 の 「炭化水素基」 としては、 例えば、 鎖状または環
、状炭化水素基 （例、 アルキル、 アルケニル、 アルキニル、 シクロアルキ ル、 シクロアルケニル、 ァリール、 ァラルキル、 多環式炭化水素基など
) などが挙げられる。 このうち、 炭素数 1ないし 1 9個の鎖状または環 状炭化水素基などが好ましい。
上記 「アルキル」 としては、 例えば アルキル (例、 メチル、 ェチ ル、 プロピル、 イソプロピル、 プチル、 イソブチル、 sec-プチル、 t e r t - プチル、 ペンチル、 ネオペンチル、 へキシルなど) などが挙げられる。 上記 「ァルケニル」 としては、 例えば C 2_6アルケニル （例、 ビニル、 ァリル、 イソプロべニル、 1ーブテニル、 2—ブテニル、 3 —.ブテニル、 2—メチル— 2—プロぺニル、 1ーメチルー 2—プロぺニル、 2—メチ ルー 1 一プロぺニルなど） などが挙げられる。
上記 「アルキニル」 としては、 例えば C 2_6アルキニル （例、 ェチニ ル、 プロパルギル、 1 —ブチニル、 2—ブチニル、 3 —プチニル、 1— へキシニルなど） などが挙げられる。
上記 「シクロアルキル」 としては、 例えば C 3_6シクロアルキル （例、 シクロプロピル、 シクロブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシルなど
) などが挙げられる。
上記 「シクロアルケニル」 としては、 例えば C 5_6シクロアルケニル （ 例、 1ーシクロペンテニル、 3—シクロペンテニル、 4ーシクロペンテ ニル、 1ーシクロへキセニル、 3—シクロへキセニル、 4—シクロへキ セニルなど） などが挙げられる。
上記 「ァリール」 としては、 例えば C 6_14ァリール （例、 フエニル、 1 一ナフチル、 2 一ナフチル、 2—ビフエ二リル、 3—ビフエ二リル、 4 ービフエ二リル、 2—アンスリル、 3—インデニルなど） などが挙げら れる。
上記 「ァラルキル」 としては、 例えば C 7— 1 9ァラルキル （例、 ベンジル 、 フエネチル、 ジフエニルメチル、 トリチル、 1 一ナフチルメチル、 2 一ナフチルメチル、 2 , 2 一ジフエ二ルェチル、 3—フエニルプロピル、 4一フエニルブチル、 5 -フエ二ルペンチル、 9 —フルォレニルなど） 、などが挙げられる。
上記 「多環式炭化水素基」 としては、 例えば 2ないし 4環性非芳香族 炭化水素基 （例、 1ーァダマンチル、 2—ァダマンチル、 デカリン— 1 一ィル、 テトラリン一 1 一ィル、 インダン一 1 一ィル、 アンドロスタン 一 3 —ィル、 5 _アンドロステン一 3—ィルなど） などが挙げられる。 上記「置換基を有していてもよい炭化水素基」 の 「置換基」 としては、 例えば、 ハロゲン原子 （例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） 、 C !_3 アルキレンジォキシ （例、 メチレンジォキシ、 エチレンジォキシなど） 、 ニトロ、 シァノ、 ハロゲン化されていてもよい C Hアルキル、 ハロゲン 化されていてもよい C 2_6アルケニル、 カルポキシ C 2— 6アルケニル （例、 2一力ルポキシェテニル、 2—力ルポキシー 2—メチルェテニルなど）、 ハロゲン化されていてもよい C 2_6アルキニル、 ハロゲン化されていても よく、 縮合していてもよい C 3_8シクロアルキル、 C 6— 14ァリール （例、 フ ェニル、 1 一ナフチル、 2 —ナフチル、 2—ビフエ二リル、 3 —ビフエ 二リル、 4ービフエ二リル、 2—アンスリルなど） 、 ハロゲン化されて いてもよい C卜8アルコキシ、 C Hアルコキシ一力ルポ二ルー C Hアルコ キシ （例、 エトキシカルポニルメチルォキシなど） 、 C 3_ 8シクロアルキ ル一ォキシ （例、 シクロプロピルォキシ、 シクロペンチルォキシ、 シク 口へキシルォキシなど） 、 ヒドロキシ、 C 6— 14ァリールォキシ （例、 フエ ニルォキシ、 1 一ナフチルォキシ、 2 一ナフチルォキシなど) 、 C 7—16ァ ラルキル才キシ (例、 ベンジルォキシ、 フエネチルォキシなど) 、 メル カプト、 ハロゲン化されていてもよい C Hアルキルチオ、 c 6— 14ァリール チォ （例、 フエ二ルチオ、 1 一ナフチルチオ、 2 一ナフチルチオなど） 、 (：7_16ァラルキルチオ (例、 ベンジルチオ、 フエネチルチオなど) 、 アミ ノ、 ヒドロキシァミノ、 モノー C Hアルキルアミノ (例、 メチルァミノ、 ェチルァミノなど） 、 モノ _ C 6_Mァリ一ルァミノ (例、 フエニルァミノ 、 1 —ナフチルアミノ、 2 一ナフチルアミノなど) 、 ジー C w)アルキル ァミノ (例、 ジメチルァミノ、 ジェチルァミノ、 ェチルメチルァミノな ど） 、 ジー c s— 14ァリールァミノ (例、 ジフエニルァミノなど） 、 ニトロ 、、 二トリル、 ホルミル、 カルボキシ、 C Hアルキル一カルボニル (例、 ァセチル、 プロピオニルなど) 、 C 3- 8シクロアルキル一カルボニル (例
、 シクロプロピル力ルポニル、 シクロペンチルカルポニル、 シクロへキ シルカルボニルなど) 、 C卜6アルコキシ—カルボニル (例、 メ トキシカ ルポニル、 ェトキシカルポニル、 プロポキシカルボニル、 t e r t-ブトキシ カルポニルなど） 、 C 6— 14ァリール一力ルポニル （例、 ベンゾィル、 1 一 ナフ 卜ィル、 2—ナフトイルなど） 、 C w6ァラルキル—カルポニル （例 、 フエ二ルァセチル、 3 一フエニルプロピオニルなど) 、 。6—14ァリール ォキシ一力ルポニル (例、 フエノキシカルポニルなど) 、 C.7— 16ァラルキ ルォキシーカルボニル (例、 ベンジルォキシカルポニル、 フエネチルォ キシカルポニルなど） 、 5または 6員複素環カルポニル （例、 ニコチノ ィル、 イソニコチノィル、 テノィル、 フロイル、 モルホリノ力ルポニル、 チオモルホリノ力ルポニル、 ピぺラジン一 1 ーィルカルポニル、 ピロリ ジン一 1ーィルカルポニルなど） 、 力ルバモイル、 モノー アルキル —力ルバモイル （例、 メチルカルバモイル、 ェチルカルバモイルなど） 、 ジー アルキル一力ルバモイル' （例、 ジメチルカルバモイル、 ジェチ ルカルバモイル、 ェチルメチルカルバモイルなど） 、 C 6— 14ァリール—力 ルバモイル （例、 フエ二ルカルバモイル、 1 一ナフチルカルバモイル、 2—ナフチルカルバモイルなど） 、 C j_6アルコキシ一力ルバモイル（例、 5900
35 メ トキシカルバモイル、 エトキシカルバモイルなど） 、 5または 6員複 素環力ルバモイル （例、 2—ピリジルカルバモイル、 3—ピリジルカル バモイル、 4一ピリジルカルバモイル、 2 一チェ二ルカルバモイル、 3 一チェ二ルカルバモイルなど) 、 スルホ、 アルキルスルホニル （例、 メチルスルホニル、 ェチルスルホニルなど） 、 C 6_Mァリールスルホニル (例、 フエニルスルホニル、 1 一ナフチルスルホニル、 2 一ナフチルス ルホニルなど） 、 ホルミルァミノ、 アルキル—力ルポニルァミノ （ 例、 ァセチルァミノなど） 、 C 6_14ァリール一力ルポニルァミノ （例、 ベ ンゾィルァミノ、 ナフ トイルァミノなど） 、 アルコキシ—力ルポ二 ルァミノ （例、 メ トキシカルボニルァミノ、 ェトキシカルポニルアミノ、 、プロポキシ力ルポニルァミノ、 ブトキシカルポニルァミノなど） 、 アルキルスルホニルァミノ （例、 メチルスルホニルァミノ、 ェチルスル ホニルァミノなど） 、 c 6_14ァリ一ルスルホニルァミノ (例、 フエニルス ルホニルァミノ、 2—ナフチルスルホニルァミノ、 1 一ナフチルスルホ ニルァミノなど） 、 アルキル—カルボニルォキシ （例、 ァセトキシ、 プロピオニルォキシなど） 、 c 6_14ァリール一力ルポニルォキシ （例、 ベ ンゾィルォキシ、 ナフチルカルボニルォキシなど) 、 アルコキシ一 カルポニルォキシ （例、 メ トキシカルポニルォキシ、 エトキシカルボ二 ルォキシ、 プロボキシカルボニルォキシ、 ブトキシカルポニルォキシな ど） 、 モノー（^_6アルキル一力ルバモイルォキシ (例、 メチルカルバモ ィルォキシ、 ェチルカルバモイルォキシなど） 、 ジ— アルキル一力 ルバモイルォキシ （例、 ジメチルカルバモイルォキシ、 ジェチルカルバ モイルォキシなど） 、 c 6_14ァリール一力ルパモイルォキシ （例、 フエ二 6員複素環カルポニルォキシ （例、 ニコチノィルォキシ、 イソニコチノ ィルォキシなど） 、 5ないし 7員飽和環状アミノ （例、 ピロリジン一 1 一ィル、 ピペリジノ、 ピぺラジン一 1 一ィル、 モルホリノ、 チオモルホ リノ、 テトラヒドロアゼピン— 1 一ィル、 ホモピぺラジン一 1 一ィルな ど） 、 5ないし 1 0員芳香族複素環基 （例、 2—チェニル、 3 _チェ二 ル、 2 —フリル、 3 —フリル、 2—ピリジル、 3 —ピリジル、 4一ピリ ジル、 2 —キノリル、 3 —キノリル、 4 一キノリル、 5 —キノリル、 8 一キノリル、 1 一イソキノリル、 3 —イソキノリル、 4 —イソキノリル、 5 _イソキノリル、 1 一インドリル、 2—インドリル、 3 —インドリル、 2—ベンゾチアゾリル、 2—べンゾ 〔b〕 チェニル、 3—ベンゾ 〔b〕 チェニル、 2—ベンゾ 〔b〕 フラニル、 3—べンゾ 〔b〕 フラニルなど ) 、 3ないし 1 0員非芳香族複素環基 （例、 1ーァゼチジニル、 2—ァ ゼチジニル、 3ーァゼチジニル、 1 一ピロリジニル、 2—ピロリジニル、 3 —ピロリジニル、 2—イミダゾリニル、 4 一イミダゾリニル、 2—ピ ラゾリジニル、 3 —ピラゾリジニル、 4 一ビラゾリジニル、 2—ピペリ 、ジル、 3—ピペリジル、 4ーピペリジル、 1 一ピペラジニル、 2 -ピぺ ラジニル、 モルホリノ、 チオモルホリノ、 2—才キシラニル、 2ーォキ セ夕ニル、 3—ォキセ夕ニル、 2—テトラヒドロフラニル、 4—テトラ ヒドロピラニルなど） 、 ォキソなどが挙げられる。
前記 「ハロゲン化されていてもよい C Hアルキル」 としては、 例えば 1ないし 5個、 好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子 （例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよいアルキル （例、 メチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル、 ブチル、 イソブチル、 s ec -プチル、 t e r t-ブチル、 ペンチル、 へキシルなどの アルキルなど）.などが挙げ られる。 具体例としては、 メチル、 クロロメチル、 ジフルォロメチル、 トリクロロメチル、 トリフルォロメチル、 ェチル、 2—プロモェチル、 2 , 2 , 2—トリフルォロェチル、 ペン夕フルォロェチル、 プロピル、 3 , 3， 3—トリフルォロプロピル、 イソプロピル、 ブチル、 4， 4， 4—トリフルォロプチル、 イソブチル、 sec -プチル、 t e r卜プチル、 ペン チル、 イソペンチル、 ネオペンチル、 5， 5 , 5 —トリフルォロペンチ ル、 へキシル、 6， 6， 6—トリフルォ口へキシルなどが挙げられる。 前記 「ハロゲン化されていてもよい C 2—6アルケニル」 としては、 例え ば 1ないし 5個、好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子（例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよい C 2—6アルケニル （例、 ビ ニル、 プロぺニル、 イソプロぺニル、 2 —ブテン— 1一ィル、 4一ペン テン一 1 _ィル、 5—へキセン— 1ーィルなど） などが挙げられる。 前記 「ハロゲン化されていてもよい C 2—6アルキニル」 としては、 例え ば 1ないし 5個、好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子（例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよい C 2-6アルキニル （例、 プ 口パルギル、 2ーブチン— 1 一ィル、 4一ペンチン— 1 —ィル、 5 _へ キシン一 1—ィルなど） などが挙げられる。
前記 「ハロゲン化されていてもよく、 縮合していてもよい <3 3_8シクロ アルキル」 の 「ハロゲン化されていてもよい C 3— 8シクロアルキル」 とし ては、 例えば 1ないし 5個、 好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子 （
、例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよい c 3—6シクロ アルキル (例、 シクロプロピル、 シクロブチル、 シクロペンチル、 シク 口へキシルなど）などが挙げられる。具体例としては、 シクロプロピル、 シクロプチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 4 , 4ージクロロシ クロへキシル、 2 , 2， 3， 3—テトラフルォロシクロペンチル、 4一 クロ口シク口へキシルなどが挙げられる。
前記 「ハロゲン化されていてもよく、 縮合していてもよい C 3_8シクロ アルキル」 の 「縮合した C 3_8シクロアルキル」 としては、 例えば、 8な いし 1 4員の二環または三環性 C 3_8シクロアルキル （例、 1ーァダマン チル、 2—ァダマンチル、デカリン— 1—ィル、テトラリン一 1 一ィル、 9 —フルォレニル、 1 一インダニル、 1， 2， 3， 4ーテトラヒドロ— 1一ナフチルなど） などが挙げられる。 また、 該 「縮合した C 3_8シクロ アルキル」 は、 ハロゲン化されていてもよい。
前記 「ハロゲン化されていてもよい C Hアルコキシ」 としては、 例え ば 1ないし 5個、好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子（例、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよい アルコキシ （例、 メ 卜キシ、 エトキシ、 プロボキシ、 イソプロボキシ、 ブトキシ、 イソプ卜 キシ、 sec-ブトキシ、 ペンチルォキシ、 へキシルォキシなど） などが挙 げられる。 具体例としては、 例えばメトキシ、 ジフルォロメ トキシ、 卜 リフルォロメトキシ、 エトキシ、 2， 2 , 2—トリフルォロエトキシ、 プロボキシ、 イソプロボキシ、 ブトキシ、 4 , 4 , 4—トリフルォロブ トキシ、 イソブトキシ、 sec-ブトキシ、 ペンチルォキシ、 へキシルォキ シなどが挙げられる。
前記 「ハロゲン化されていてもよい C ,_6アルキルチオ」 としては、 例 えば 1ないし 5個、 好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子 （例、 フッ 素、 塩素、 臭素、 ヨウ素など） を有していてもよい アルキルチオ （ 例、 メチルチオ、 ェチルチオ、 プロピルチオ、 イソプロピルチオ、 プチ ルチオ、 s ec-プチルチオ、 t e r t -プチルチオなど） などが挙げられる。 具 体例としては、 メチルチオ、 ジフルォロメチルチオ、 トリフルォロメチ
、ルチオ、 ェチルチオ、 プロピルチオ、 ィソプロピルチオ、 プチルチオ、
4 , 4， 4 一トリフルォロブチルチオ、 ペンチルチオ、 へキシルチオな どが挙げられる。
上記 「炭化水素基」 は、 例えば上記置換基を、 置換可能な位置に 1な いし 5個、 好ましくは 1ないし 3個有していてもよく、 置換基数が 2個 以上の場合、 各置換基は同一または異なっていてもよい。
Xで示されるスぺーサ一としては、 主鎖の原子数が 1ないし 2 4のス ぺーサ一が挙げられる。例えば、 — N H—、 _ 0—、 一 S —、 — S O— お よび 一 S 0 2—から選ばれる 1ないし 4個の基をそれぞれ介していても よい二価の鎖状炭化水素 〔例、 二価の（^_24鎖状炭化水素 （例、 アルキレ ン、 アルケニレン、 アルキニレンなど） または二価の 3ないし 8員環状 基 〔例、 二価の 6員環状基 （例、 1 , 2—フエ二レン、 1， 3 —フエ二 レン、 1， 4—フエ二レン、 シクロへキサン一 1 , 4ージィル、 ピリジ ンー 2 , 5—ジィル、 ピリジン一 2， 4—ジィル、 ピぺリジン一 1 , 4 —ジィルなど） など〕 などが挙げられる。
R 1および R 2として好ましくは、 アルキルである。 さらに好ましくは アルキルである。 . Xとして好ましくは、 一 N H— および .一 S _から選ばれる 1ないし 4個の基をそれぞれ介していてもよい二価の 鎖状炭化水素である。 さらに好ましくは、 - (CH2) 6-丽- (CH2) 8-腿- (CH2) 6-、
― (CH2) 6- NH- (CH2) 2-S-S- (CH2) 2-匪- (CH2) 6- などである。
化合物 ( I I ) の具体例としては、 メトク トラミン [R1： メチル、 R2： メ チル、 X： - (CH2) 6 -皿-（CH2) 8- NH- (CH2) 6 -〕 、 ベネクストラミン 1 : メチ ル、 R2 : メチル、 X： - (CH2)「題 _ (CH2) 2- S_S- (CH2) 2- NH- (CH2) 6-〕 などが挙 げられる。
式 （I ) または （I I) で表される化合物の塩としては、 例えば金属塩、 アンモニゥム塩、 有機塩基との塩、 無機酸との塩、 有機酸との塩、 塩基 性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。 金属塩の好適な例とし ては、 例えばナトリウム塩、 カリウム塩などのアルカリ金属塩； カルシ
、ゥム塩、 マグネシウム塩、 バリウム塩などのアルカリ土類金属塩； アル ミニゥム塩などが挙げられる。 有機塩基との塩の好適な例としては、 例 えばトリメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 2 , 6ールチジン、 エタノールァミン、 ジェタノ一ルァミン、 卜リエ夕ノー ルァミン、 シクロへキシルァミン、 ジシクロへキシルァミン、 N , N ' ージベンジルエチレンジァミンなどとの塩が挙げられる。 無機酸との塩 の好適な例としては、 例えば塩酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸な どとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、 酢酸、 トリフルォロ酢酸、 フタル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 .酒石酸、 マ レイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼ ンスルホン酸、 p —トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。 塩基 性アミノ酸との塩の好適な例としては、 例えばアルギニン、 リジン、 ォ ルニチンなどとの塩が挙げられ、 酸性アミノ酸との塩の好適な例として は、 例えばァスパラギン酸、 グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
このうち、 薬学的に許容し得る塩が好ましい。 例えば、 化合物内に酸 性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩 （例、 ナトリウム塩， 力リウ ム塩など） 、 アルカリ土類金属塩 （例、 カルシウム塩， マグネシウム塩， バリウム塩など） などの無機塩、 アンモニゥム塩など、 また、 化合物内 に塩基性官能基を有する場合には、 例えば臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リ ン酸など無機酸との塩、 または酢酸、 フ夕ル酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 メタンスルホン酸、 p—ト ルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。
標識されたリガンドも、 本発明のリガンドに含まれる。
標識物質としては、 放射性同位元素 （例、 〔mI〕 、 〔1311〕 、 〔 〕 、
〔MC〕 、 〔32p〕 、 〔33p〕 、 〕 など） 、 蛍光物質 〔例、 シァニン蛍光 色素 （例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバイォサイエンス社 製） など） 、 フルォレス力ミン、 フルォレツセンイソチオシァネート、 NBD (7- n i t robenz- 2-oxa- 1， 3- d i azo l )など〕 、 酵素 （例、 |3 —ガラクト シダーゼ、 β -ダルコシダーゼ、 アル力リフォスファ夕一ゼ、 パーォキ
、シダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素など） 、 発光物質 （例、 ルミノール、 ル ミノール誘導体、 リレシフェリン、 ルシゲニンなど） 、 ピオチン、 ランタ ニド元素などがあげられる。 中でも、 放射性同位元素 〔 〕 が好ましい。 本発明の受容体および本発明の部分べプチドは、 前述したヒトゃ温血 動物の細胞または組織から自体公知のポリべプチドの精製方法によって 製造することもできるし、 ポリペプチドをコ一ドする D N Αで形質転換 された形質転換体を培養することによつても製造することができる。 ま た、ぺプチド合成法に準じて製造することもできる。例えば、 Genomi c s , 56巻、 12 - 2 1頁、 1999年、 B i oc im. B i ophys. Ac t aゝ 1446巻、 · 57- 70頁、 1999年などに記載の方法またはこれに準じた方法により、 製造すること もできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物 の組織または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽 出液を逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマ卜グラフィーなどの クロマトグラフィ一を組み合わせることにより精製単離することができ る。
本発明の受容体または部分べプチドもしくはそれらの塩の合成にほ、 通常、 市販のポリペプチド合成用樹脂を用.いることができる。 そのよう な樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一ベンジルォキシべ ンジルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM 樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエ二ルァセトアミ ドメチル樹脂、 ポリアクリルアミ ド樹脂、 4一 ( 2 ' , 4 ' —ジメ トキシフエ二ルーヒ ドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4— ( 2 ' , 4 ' ージメ トキシフエ 二ルー Fmo cアミノエチル） フエノキシ樹脂などをあげることができ る。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護し たアミノ酸を、 目的とするポリペプチドの配列通りに、 自体公知の各種 縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からポリぺプ チドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分 、 子内ジスルフィ ド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチド、受容体、 部分べプチドまたはそれらのアミ ド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 ポリべプチド合成に使用で きる各種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミ ド類 がよい。 カルポジイミ ド類としては、 D C C、 N， N ' ージイソプロピ ルカルポジィミ ド、 N—ェチル— N' — ( 3ージメチルアミノプロリル ) カルポジイミ ドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化 抑制添加剤 （例えば、 HOB t , HOOB t ) とともに保護アミノ酸を 直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または HO B 1:·エステルあ るいは HOO B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行 なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ポ リぺプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択 されうる。 例えば、 N， N—ジメチルホルムアミ ド， N, N—ジメチル ァセトアミ ド， N—メチルピロリ ドンなどの酸アミ ド類、塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールな どのアルコール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、 ピリ ジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエーテル類、 ァセトニト リル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸ェチルな どのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度はポリべプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範 囲から適宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択され る。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護 基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を 行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないとき には、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸を ァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないようにするこ とができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t—ペンチ ルォキシカルポニル、 イソポルニルォキシカルボニル、 4ーメ トキシべ ンジルォキシカルボニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカ ルポニル、 トリフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロ フエニルスルフエニル、 ジフエニルホスフイノチオイル、 F m o cなど が用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 -ブチル、 シク口ペンチル、 シクロへキ シル、 シクロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖 状、 分枝状もしくは環状アルキルエステル化) 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステル、 4 _ニトロべンジルエステル、 4—メト キシベンジルエステル、 4一クロ口べンジルエステル、 ベンズヒドリル エステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキシカルポ二ルヒド ラジド化、 t —ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒドラジド 化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保 護することができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、' ァ セチル基などの低級 （〇卜6) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロ ィル基、 ベンジルォキシカルボニル基、 エトキシカルポニル基などの炭 酸から誘導される基などが用いられる。 また、 エーテル化に適する基と しては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル基、 t—ブチル基 などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1 、 C l 2_B z l、 2 _ニトロベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用い られる。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 例えば、 T o s、 4 - メ トキシ— 2， 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベン ジルォキシメチル、 B um、 B o c、 T r t、 Fmo cなどが用いられ る。
、 原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応す る酸無水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペン夕クロ 口フエノール、 2， 4， 5—トリクロ口フエノール、 2， 4—ジニトロ フエノール、 シァノメチルアルコール、 パラニトロフエノール、 HON B、 N—ヒドロキシスクシミ ド、 N—ヒドロキシフタルイミ ド、 HOB t ) とのエステル〕 などが用いられる。 原料のァミノ基の活性化された ものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミ ドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d 一炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水 フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリ フルォロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、 ジィソプロ ピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどに よる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用い られる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約— 2 0°C〜40°Cの温 度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノー ル、 チオアエソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスル フイ ド、 1 , 4一ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオールなどの ようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダ ゾール保護基として用いられる 2， 4ージニトロフエニル基はチォフエ ノール処理により除去され、 トリブトファンのィンドール保護基として 用いられるホルミル基は上記の 1 , 2—エタンジチオール、 1， 4ーブ 夕ンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナ トリゥム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去さ れる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 および その保護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基また は公知の手段から適宜選択しうる。
本発明の受容体または部分ぺプチドを得る別の方法としては、例えば、 まず、 カルポキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミ ド化して保 、護した後、 アミノ基側にペプチド （ポリペプチド） 鎖を所望の鎖長まで 延ばした後、 該ぺプチド鎖の Ν末端のひ一アミノ基の保護基のみを除い たポリぺプチドと C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除去したポリ ペプチドとを製造し、 この両ポリべプチドを上記したような混合溶媒中 で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合によ り得られた保護ポリべプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保 護基を除去し、 所望の粗ポリペプチドを得ることができる。 この粗ポリ ぺプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥 することで所望の受容体またはその部分べプチドのアミ ド体を得ること ができる。
本発明の受容体または部分べプチドもしくはそれらの塩のエステル体 を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基を 所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 受容体または その部分ペプチドのアミ ド体と同様にして、 所望の受容体またはその部 分ペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明の受容体または部分べプチドは、 自体公知のぺプチドの合成法 に従って、 あるいは受容体の部分ペプチドについては、 受容体を適当な ぺプチダーゼで切断することによって製造することができる。 ぺプチド の合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによって も良い。 すなわち、 本発明受容体または部分ペプチドを構成し得る部分 ぺプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を 有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造するこ とができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の (i) 〜 （V) に記載された方法があげられる。
( i) M. Bodanszky およひ M. A. Ondet t i, Peptide Synthesis,
Interscience Publishers, New York (1966年）
( i i) Schroederおよび Luebke、 The Peptide, Academic Press, New York (1965年）
(iii) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善（株） （ 1975年） (iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化 学 IV、 205、 （1977年）
(v) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロ マトグラフィー、 液体クロマトグラフィー、 再結晶などを組み合わせて 本発明の受容体または部分べプチドを精製単離することができる。 上記 方法で得られる受容体または部分べプチドが遊離体である場合は、 公知 の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することがで きるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれ.に準じる方 法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明の受容体または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドと しては、 前述した本発明の受容体または部分べプチドをコードする塩基 配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 このうち D NAが好ましく、 該 DNAは、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ 一、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリ一、 合成 DN Aのいずれでもよい。
ライブラリ一に使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミ ド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記し た細胞 ·組織より total RNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain React ion (以下、 RT - PCR法と 略称する） によって増幅することもできる。
本発明の受容体をコードする DNAとしては、 例えば配列番号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 6で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2、 配列番号 ： 4または配列番号 ： 6で表される塩基 配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を 有し、 配列番号： 1、 配列番号 ： 3または配列番号： 5で表されるアミ ノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する受容体をコー ドする D N Aなどであれば何れのものでもよい。
配列番号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 6で表される塩基配列 、とハイス卜リンジェン卜な条件下でハイブリダィズできる D N Aとして は、 例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 6で表され る塩基配列と約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 5 %以 上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
ハイプリダイゼーションは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方 法、 例えば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができ る。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記 載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリン ジェントな条件に従って行なうことができる。 .
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9 〜40mM、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜 7 0 °C , 好ましくは約 6 0〜6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有する受 容体をコードする DNAとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を 含有する DNAなどが、 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列を含有す る受容体をコードする DNAとしては、 配列番号： 4で表される塩基配 列を含有する DN Aなどが、 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を含 有する受容体をコードする DNAとしては、 配列番号： 6で表される塩 基配列を含有する DN Aなどがが用いられる。
本発明の部分べプチドをコードする DNAとしては、 本発明の受容体 の部分べプチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなる ものであってもよい。 また、ゲノム DNA、ゲノム DNAライブラリ一、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 前記した細胞 ·組織由来の c D N Aライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 具体的には、 配列番号 ： 2、 配列番号： 4または配列番号： 6で表される塩基配列を有する D NAの部分塩基配列を有する DNA、 または配列番号： 2、 配列番号： 、 4または配列番号： 6で表される塩基配列とハイストリンジェントな条 件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 配列番号： 1、 配列番号 ： 3または配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質 的に同質の活性を有する受容体をコードする DN Aの部分塩基配列を有 する DN Aなどが用いられる。
配列番号： 2、 配列番号： 4または配列番号 ： 6で表される塩基配列 とハイブリダィズできる DNAは、 前記と同意義を示す。
ハイプリダイゼーションの方法およびハイストリンジェン卜な条件は 前記と同様のものが用いられる。
本発明の受容体または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （ 例、 DNA) は、 自体公知の方法で標識化されていてもよい。 標識物質 としては、 放射性同位元素、 蛍光物質 （例、 フルォレセインなど） 、 発 光物質、 酵素、 ピオチン、 ランタニド元素などがあげられる。
本発明の受容体または部分ペプチドを完全にコードする DN Aのクロ —ニングの手段としては、 本発明の受容体または部分ペプチドの部分塩 基配列を有する合成 DN Aプライマーを用いて自体公知の P C R法によ つて増幅するか、 または適当なベクターに組み込んだ DN Aを本発明の 受容体または部分べプチドの一部あるいは全領域をコードする DN A断 片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものとのハイプリダイゼーショ ンによって選別することができる。 ハイプリダイゼーションの方法は、 例えば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 ま た、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方 法に従って行なうことができる。
D N Aの塩基配列の変換は、 公知のキッ ト、 例えば、 MutanTM- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Μιι ηΤΜ- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0DA- LAPCR法、 Gapped duplex法、 Kimkel法等の自体公知の方法あるいは それらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された受容体をコードする DNAは目的によりそのまま、 、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使 用することができる。 該 DNAはその 5 ' 末端側に翻訳開始コドンとし ての ATGを有し、また 3 '末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンゃ翻 訳終止コドンは、 適当な合成 DNAアダプターを用いて付加することも できる。
本発明の受容体または部分ペプチドの発現ベクターは、 例えば、 （a ) 本発明の受容体または部分ペプチドをコードする DNAから目的とす る DNA断片を切り出し、 （b) 該 DNA断片を適当な発現べクタ一中の プロモー夕一の下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 p BR 322, p B R 325 , p U C 1 2 , pUC 1 3) 、 枯草菌由来のプラスミ ド （例、 PUB 1 1 0, p T P 5 , p C 1 94 ) 、 酵母由来プラスミ ド （例、 p SH 19, p SH 1 5) 、 Aファージなどのバクテリオファージ、 レト ロウィルス， ワクシニアウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィル スなどの他、 pA l— 1 1、 pXT l、 pR c/CMV、 pRc/RS V、 p c DNA I ZN e oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモー夕一としては、 遺伝子の発現に用いる宿 主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例え ば、 動物細胞を宿主として用いる場合は、 SRひプロモーター、 SV4 0プロモー夕一、 H I V · L T Rプロモー夕一、 CMVプロモーター、 H S V_T Kプロモータ一などがあげられる。
これらのうち、 CMV (サイ トメガロウィルス） プロモーター、 S R aプロモーターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌で ある場合は、 t r pプロモータ一、 l a cプロモーター、 r e cAプロ モーター、 A PLプロモータ一、 l p pプロモ一夕一、 T 7プロモータ 一などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 S PO lプロモーター、 S PO 2プロモーター、 p e n Pプロモーターなど、 宿主が酵母である 場合は、 PH05プロモーター、 PGKプロモー夕一、 GAPプロモー 、夕一、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合 は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 1 0プロモー夕一などが好ましい。 発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライ シングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 S V 40複製ォ リジン （以下、 SV40 o r iと略称する場合がある） などを含有して いるものを用いることができる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メ ソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 A mprと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺伝子 （以下、 N e o rと略称する場合がある、 G 41 8耐性） 等があげられる。 特に、 d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて d h f r遺伝子を選 択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地 によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明の受容体 の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 P h o A · シグナル配列、 OmpA · シグナル配列などが、 宿主がバチルス属 菌である場合は、 a—アミラーゼ · シグナル配列、 サプチリシン · シグ ナル配列などが、 宿主が酵母である場合は、 MF Q: * シグナル配列、 S UC 2 · シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 インシュ リン， シグナル配列、 ひ一インタ一フエロン · シグナル配列、 抗体分子 • シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明の受容体または部分べプチドをコ一 ドする DN Aを含有するベクターを用いて、 形質転換体を製造すること ができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆 虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア厲菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア · コリ ( Escherichia coli) K 1 2 · D Η 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 巻， 160 (1968)〕 ， J M 1 0 3 [Nucleic Acids Research, 9卷， 309 (1981) 、〕 ， J A 2 2 1 [Journal oi Molecular Biology, 120巻， 517 (1978)〕 ， HB 1 0 1 〔； Tournal of Molecular Biology, 41巻， 459 (1969)〕 ， C 6 0 0 [Genetics, 39巻， 440(1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス （Bacillus subtilis) M I 1 1 4 CGene, 24巻， 255 (1983)〕 ， 2 0 7 - 2 1 [Journal of Biochemistry, 95巻， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae) AH 2 2 , AH 2 2 R NA 8 7 - 1 1 A, DKD— 5 D ， 2 0 B— 1 2、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces poinbe) NCYC 1 9 1 3 , NCYC 2 0 3 6、 ピキア パストリス （ Pic ia pastoris) KM 7 1などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが A c N P Vの場合は、 ョ トウ ガの幼虫由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell ； S f 細胞） 、 Trichoplusia niの中腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five"1細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea 由来の細胞などが用いられる。 ウィルスが BmN P Vの場合は、 蚕由来 株化細胞 （Bombyx mori N 細胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f 細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 2 1細胞 (以上、 Vaughn, J. L. ら、 In Vivo, 13, 213-217, (1977)) などが用いら れる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 Nature, 315巻, 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 CO S— 7 (CO S 7 ) ， V e r o , チャイニーズハムスター細胞 CH〇 （以下、 CHO細胞と略記） ， d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO ( d h f r -) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T— 2 0， マウ スミエローマ細胞， ラッ 卜 GH 3， ヒト F L細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69巻， 2110 (1972)や Gene, 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って 、行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General Genetics, 168巻， 111 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができ る。
酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194巻 ， 182-187 (1991)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75巻， 1929 (1978)などに 記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、 Bio/Technology, 6， 47-55 (1988) などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学 実験プロ トコール. 263-267 (1995) (秀潤社発行） 、 Virology, 52巻
, 456 (1973)に記載の方法に従つて行なうことができる。
このようにして、 受容体または部分べプチドをコードする DN Aを含 有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。 宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する 際、 培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には 該形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せし められる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶 性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝 酸塩類、 コーンスチープ · リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大 豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウム などがあげられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子など を添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、 カザミノ酸を含む M 9培地 〔Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972) が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせる ために、 例えば、 3 ]3—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えるこ 、とができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 43 °Cで約 3〜 24時間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜40°Cで約 6〜 2 4 時間行ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホールダ一（Burkholder)最小培地〔Bostian， K. L. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77巻， 4505 (1980)〕 や 0. 5 %カザミノ酸を含有する S D 培地 [Bitter, G. A. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81巻，.5330 (1984) 〕 があげられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養 は通常約 2 0 ° (：〜 3 5 °Cで約 24〜 7 2時間行ない、 必要に応じて通気 や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地とし ては、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. C. C. , Nature, 195, 788 (1962) ) に非動化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用い られる。 培地の pHは約 6. 2〜 6. 4に調整するのが好ましい。 培養 は通常約 2 7°0で約3〜 5 日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加え る。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例え ば、 約 5〜 2 0 %の胎児牛血清を含む MEM培地 [Science, 122巻 , 501 (1952) ] , DMEM培地 [Virology, 8巻， 396 (1959)〕 ， R PM I 1 6 40培地 [The Journal of the American Medical Association, 199 巻， 519 (1967)〕 , 1 9 9培地 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 pHは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0 °C〜 40 °Cで約 1 5〜 6 0時 間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外などに 本発明の受容体または部分べプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明の受容体または部分べプチドを分離精製するに
、は、 例えば、 下記の方法により行なうことができる。
本発明の受容体または部分べプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出 するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これ を適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解 などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、 遠心分離やろ過により ポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。 緩衝液の中 に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリ トン X— 1 0 0TM などの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にポリペプチドが分 泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体.あるいは細 胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる受容 体または部分べプチドの精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適宜組み合 わせて行なうことができる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩 析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲ ルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法などの主 として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグラフィーなど の荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなどの 特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなどの 疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用 する方法などが用いられる。
かくして得られる受容体または部分べプチドが遊離体で得られた場合 には、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換する ことができ、 逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに 準じる方法により、 遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生する受容体または部分ペプチドを、 精製前また は精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を 加えたり、 ポリペプチドを部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵 素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンド ぺプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダ一ゼなどが用いられる。 、 本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンドは、 市販さ れている場合には市販品をそのまま用いることもでき、 自体公知の方法 またはこれらに準じた方法に従って抽出または製造することもできる。 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩 に対する抗体 （以下、 単に本発明の抗体と称する場合がある） は、 本発 明の受容体に対する抗体を認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗 体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。 本発明の受容体に対す る抗体としては、 受容体のシグナル伝達を不活性化する抗体.、 受容体の シグナル伝達を活性化する抗体などが挙げられる。
本発明の受容体に対する抗体は、 本発明の受容体を抗原として用い、 公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の受容体は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部 位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して 抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバン卜や不完全フロイ ントアジュバントを投与してもよい。投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜 1 0回程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サ ル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモッ ト、 マウス、 ラッ ト、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮ トリがあげられるが、 マウスおよびラッ 卜が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温 血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生 細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノ クロ一ナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製することができる。 抗血清中 の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化ポリペプチドと抗血清とを反 応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行な うことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーとミルス夕 、インの方法 〔ネィチヤ一 （Nature), 256、 495 (1975)) に従い実施する ことができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール (P E G) やセンダイウィルスなどがあげられるが、 好ましくは P E G が用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2Z0、 A P— 1などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、 P 3 U 1が好まし く用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数 との好ましい比率は 1 ： 1〜 2 0 ： 1程度であり、 P E G (好ましくは P E G 1 000〜P E G 6 0 0 0) が 1 0〜 8 0 %程度の濃度で添加さ れ、 2 0〜 40 °C、 好ましくは 3 0〜 3 7 °Cで 1〜 1 0分間インキュべ 一卜することにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマのスクリーニングには種々の 方法が使用できるが、 例えば、 ポリペプチド （蛋白質） 抗原を直接ある いは担体とともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫 グロブリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス 免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを加え、 固相に 結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロプリン抗体ま たはプロティン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したポリぺプチドを加え、 固相に結合した モノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従つ て行なうことができる。通常 H A T (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別およ び育種用培地としては、 ハイブリ ドーマが生育できるものならばどのよ うな培地を用いても良い。 例えば、 1〜 2 0 %、 好ましくは 1 0〜 2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清 を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） あるいはハイブリ ド一マ培養 用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） などを用いることが 、 できる。 培養温度は、 通常 2 0〜 4 0 ° ( 、 好ましくは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培 養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリ ドーマ培養 上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定でき る。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 公知の方法、 例えば、 免疫グロブ リンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電 気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相またはプロテイン Aまたはプロテイン Gなど の活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特 異的精製法〕 に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法に従 つて製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （ポリペプチド抗原） 自 体、 あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつく り、 上記のモノ クローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、 該免疫動物か ら本発明の受容体に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行 なうことにより製造することができる。 温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキヤリア一蛋白質と の複合体に関し、 キヤリァー蛋白質の種類およびキヤリァ一とハプテン との混合比は、 キヤリァ一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体 が効率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよい が、 例えば、 ゥシ血清アルブミンゃゥシサイログロブリン、 へモシァニ ン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合で力プルさせる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用い ることができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミ ド、 マレイミ ド 活性エステル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル
、試薬等が用いられる。
縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体 あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を 高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバ ントを投与してもよい。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3 〜 1 0回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹 水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクロ一ナル抗体価の測定は、 上記の抗血清.中の抗体価 の測定と同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上 記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製 法に従って行なうことができる。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列 ¾含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩 をコードするポリヌクレオチド （例、 D N A ) に相補的な、 または実質 的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド（例、 D N A) としては、 該ポリヌクレオチドに相補的な、 または実質的に相 補的な塩基配列またはその一部を有し、 該ポリヌクレオチドの発現を抑 制し得る作用を有するものであれば、 いずれのポリヌクレオチド （アン チセンスボリヌクレオチド) であってもよい。
具体的には、 本発明の受容体をコードするポリヌクレオチド （例、 D N A) (以下、 これらの DNAを本発明の DNAと略記する場合がある ) に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有す るアンチセンス DN A (以下、 これらの DNAをアンチセンス DNAと 略記する場合がある） が挙げられ、 本発明の DNAに相補的な、 または 実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、 該 DN Aの発現を抑 制し得る作用を有するものであれば、 いずれのアンチセンス DN Aであ つてもよい。
本発明の DNAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の 、DNAに相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の DNAの相補鎖） の全 塩基配列あるいは部分塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以 上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同 性を有する塩基配列などがあげられる。 特に、 本発明の DNAの相補鎖 の全塩基配列うち、 本発明の受容体の N末端部位をコードする部分の塩 基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） の相補鎖と約 7 0 % 以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好 ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンス DN Aが好適であ る。 これらのアンチセンス DNAは、 公知の DNA合成装置などを用い て製造することができる。
具体的には、 配列番号： 2、 配列番号 ： 4または配列番号： 6で表さ れる塩基配列を有する DN Aの塩基配列に相補的な、 もしくは実質的に 相補的な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレ ォチド、 配列番号： 2、 配列番号： 4または配列番号： 6で表される塩 基配列を有する DN Aの塩基配列に相補的な、 もしくは実質的に相補的 な塩基配列、 またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド などが挙げられる。 好ましくは例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 4ま たは配列番号： 6で表される塩基配列を有する DNAの塩基配列に相補 な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、 配列番号 ： 2、 配列番号： 4または配列番号： 6で表される塩基配列を 有する D N Aの塩基配列に相補な塩基配列、 またはその一部分を有する アンチセンスポリヌクレ才チドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 1 0〜4 0個程度、 好ましく は 1 5〜 3 0個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 アンチセ ンス D N Aを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフエ一ト）は、 例えば、 ホスホロチォェ一ト、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネ 一卜などの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。 これらのアン チセンスポリヌクレオチドは、 公知の D N A合成装置などを用いて製造 、することができる。
本発明に従えば、 本発明の受容体遺伝子の複製または発現を阻害する ことのできるアンチセンスポリヌクレオチド (核酸) を、 クローン化し た、 あるいはアミノ酸が決定された蛋白質をコ一ドする D N Aの塩基配 列情報に基づき設計し、 合成しうる。 かかるポリヌクレオチド （核酸） は、 本発明の受容体遺伝子の R N Aとハイプリダイズすることができ、 該 R N Aの合成または機能を阻害することができるか、 あるいは本発明 の受容体関連 R N Aとの相互作用を介して本発明の受容体遺伝子の発現 を調節 ·制御することができる。 本発明の受容体関連 R N Aの選択され た配列に相補的なポリヌクレオチド、 および本発明の受容体関連 R N A と特異的にハイプリダイズすることができるポリヌクレオチドは、 生体 内および生体外で本発明の受容体遺伝子の発現を調節 ·制御するのに有 用であり、 また病気などの治療または診断に有用である。 用語 「対応す る」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核酸の特定の 配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオ チド、 塩基配列または核酸とペプチド （蛋白質） との間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列またはその相補体から誘導される指 令にあるペプチド （蛋白質） のアミノ酸を通常指している。 蛋白質遺伝 子の 5 '端ヘアピンループ、 5， 端 6—ベースペア ' リピート、 5， 端非 翻訳領域、 蛋白質翻訳終止コドン、 蛋白質コード領域、 O R F翻訳終止 コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 および 3 ' 端 ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、 蛋白質遺伝子 内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド との関係については、 目的核酸が対象領域とハイプリダイズすることが できる場合は、 その目的核酸は、 当該対象領域のポリヌクレオチドに対 して 「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンスポリヌ クレオチドは、 2ーデォキシー D—リポースを含有しているポリヌクレ ォチド、 D—リボースを含有しているボリヌクレオチド、 プリンまたは 、ピリミジン塩基の N—ダリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオ チド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、 市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマ一） または特殊な 結合を含有するその他のポリマー （但し、 該ポリマーは D N Aや R N A 中に見出されるような塩基のペアリングゃ塩基の付着を許容する配置を もつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 それらは、 二本鎖 D N A、 一本鎖 D N A、 二本鎖 R N A、 一本鎖 R N A、 さらに D N A : R N Aハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （ または非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の.付加された もの、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたも の、 メチル化されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置 換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 (例えば、 メチルホスホネート、 ホスホ卜リエステル、 ホスホルアミデ —ト、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含 有結合 （例えば、 ホスホロチォエート、 ホスホロジチォエートなど） を 持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレアーゼ、 ヌクレア一ゼ ·インヒビ夕一、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L一リジンなど） や糖 '（例 えば、 モノサッカライ ドなど） などの側鎖基を有しているもの、 イン夕 —カレ一ト化合物 （例えば、 ァクリジン、 ソラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性 の金属など） を含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾され た結合を持つもの（例えば、 aァノマー型の核酸など）であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリ ンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他の複 素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メ チル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンおよびピ リミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾され たヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾され ていてよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基など
、で置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミンなどの官能基に変換さ れていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） は、 RNA、 DNA、 あるいは修飾された核酸 （RNA、 DNA) である。 修飾された核酸の 具体例としては核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポ リヌクレオシドアミ ドゃオリゴヌクレオシドアミ ドの分解に抵抗性のも のが挙げられるが、 それに限定されるものではない。 本発明のアンチセ ンスヌクレオチドは次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、 細胞内でのアンチセンスヌクレオチドをより安定なものにする、 アンチ センスヌクレオチドの細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に 対する親和性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアン チセンスヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al. , P arm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed. , Ant isense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、 変化せしめられたり、' 修 飾された糖、 塩基、 結合を含有していて皋く、 リボゾーム、 ミクロスフ エアのような特殊な形態で供与されたり、 遺伝子治療により適用された り、 付加された形態で与えられることができうる。 こうして付加形態で 用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポ リリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用を高めたり、 核 酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コレス テロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加するに好まし い脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリル クロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核 酸の 3 '端あるいは 5 '端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌ クレオシド結合を介して付着させることができうる。 その他の基として は、核酸の 3 '端あるいは 5 '端に特異的に配置されたキャップ用の基で、 、ェキソヌクレア一ゼ、 R N a s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止 するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリ エチレングリコール、 テトラエチレングリコールなどのグリコールをは じめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それに 限定されるものではない。
アンチセンスヌクレオチドの阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発 明の生体内や生体外の遺伝子発現系、 あるいは本発明の受容体の生体内 や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。 該核酸は公知の各種の 方法で細胞に適用できる。
以下に、 （i ) 本発明の受容体、 （i i ) 本発明の受容体をコードするポ リヌクレオチド （本発明のポリヌクレオチド）.、 ( i i i) 本発明の受容体 に対する抗体 （本発明の抗体） 、 （iv) 本発明の受容体のアンチセンス ポリヌクレオチド （例、 D N A ) (例、 本発明のアンチセンス D N A ) 、 ( V) 本発明の受容体に特異的に結合する能力を有するリガンド （本発明 のリガンド） などの用途を説明する。
〔1〕 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明の受容体を用い、 または組換え型本発明の受容体の発現系を用 いたリガンドレセプ夕一アツセィ系を用いることにより、 本発明の受容 体と、本発明のリガンドとの結合性を変化させる化合物（例、ぺプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細 胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など） またはその塩を効 率よくスクリーニングすることができる。
該化合物またはその塩には、 （i) 本発明の受容体を介して細胞刺激活 性 （例、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a2+遊離、 細 胞内 c AM P生成、 細胞内 c AM P産生抑制、 細胞内 c GMP生成、 ィ ノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c 一 f o sの活性化、 p Hの低下、 G T P T S結合活性、 c AM P依存性 プロティンキナーゼの活性化、 c GMP依存性プロティンキナーゼの活 性化、 リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、 マイ トジェン活性 、化蛋白質リン酸化酵素 （MAPキナーゼ） の活性化、 血清応答因子遺伝 子発現上昇などを促進する活性、 受容体細胞内移行活性など） を有する 化合物 （ァゴ二スト） 、 （ii) 上記細胞刺激活性を有しない化合物 （ァ ンタゴニスト） 、 （iii) 本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力 を促進する化合物、 （iv) 本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合 力を阻害する化合物などが含まれる。
具体的には、 （i) 本発明の受容体に、 本発明のリガンドを接触させた 場合と （ii) 本発明の受容体に、 本発明のリガンドおよび試験化合物を 接触させた場合との比較を行なう。 比較は、 例えば、 本発明の受容体に 対する本発明のリガンドの結合量、 細胞刺激活性などを測定して行う。 本発明のスクリーニング方法としての具体例としては、 例えば、
(a) 本発明のリガンドを本発明の受容体に接触させた場合と、 本発明の リガンドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、 本発明のリガンドの本発明の受容体に対する結合量を測定し、 比較する ことを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリ一ニング方法、
(b) 本発明のリガンドを、 本発明の受容体を含有する細胞または該細胞 の膜画分に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本 発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合に おける、 本発明のリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測 定し、 比較することを特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体 との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一二ング方法、 お よび
(c) 本発明の受容体が、 本発明の受容体をコードする D N Aを含有する 形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体 である上記 （b) 記載のスクリーニング方法、
(d) 本発明のリガンドが、 標識したリガンドである上記 （a) 〜 （c) の スクリ一ニング方法などのレセプター結合アツセィ系、
( e) 本発明のリガンドを本発明の受容体に接触させた場合と、 本発明の 、リガンドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、 本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを特徴と する、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合 物またはその塩のスクリ一二ング方法、
( 0本発明のリガンドを本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の 膜画分に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本発 明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合にお ける、 本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを 特徴とする、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させ る化合物またはその塩のスクリーニング方法、 および
(g) 本発明の受容体が、 本発明の受容体をコードする D N Aを含有する 形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体 である上記 （ί) のスクリーニング方法などの細胞刺激アツセィ系などが 挙げられる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
本発明の受容体としては、 ヒトゃ温血動物の臓器の膜画分などが好適 に用いられる。 しかし、 特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なとと から、 スクリーニングに用いられるものとしては、 組換え体を用いて大 量発現させた本発明の受容体などが適している。 5900
65 本発明の受容体を製造するには、 前述の本発明の受容体の製造方法な どが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明の受容体を含有する細 胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。 本発明の受容体を含有する細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアル デヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法はそれ自体公 知の方法に従って行うことができる。
本発明の受容体を含有する細胞としては、 本発明の受容体を発現した 宿主細胞をいう力 該宿主細胞としては、 前述の大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが挙げられる。 製造方法は前述と同様である。 、 膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる 細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Po t t e r— E ivehj em型ホモジナイザ一で細胞を押し潰す方法、 ヮーリング プレンダーゃポリ トロン （Kinemat i ca社製） による破砕、 超音波による 破砕、 フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出さ せることによる破碎などがあげられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分 離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いら れる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （500rpm〜3000 rpm) で短時間 （通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （ 15000ΓΡΠ！〜 30000rpm) で 通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中 には、 発現した本発明の受容体と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの 膜成分が多く含まれる。
該本発明の受容体を含有する細胞や膜画分中の本発明の受容体の量は、 1細胞当たり 1 0 3〜 1 0 8分子であるのが好ましく、 1 0 5〜 1 0 7分子で あるのが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド 結合活性 （比活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可 能になるばかりでなく、 同一ロッ卜で大量の試料を測定できるようにな る。
前記のレセプター結合アツセィ系や細胞刺激アツセィ系などのスクリ 一二ング方法を実施するためには、 例えば、 本発明の受容体画分、 本発 明のリガンド （例、 標識した本発明のリガンド） などが用いられる。 本 発明の受容体画分としては、 天然型の本発明の受容体画分か、 またはそ れと同等の活性を有する組換え型本発明の受容体画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性などを示す。 標識し たリガンドとしては、 例えば、 放射性同位元素 （例、 〔1251〕 、 〔1311〕 、
〔3H〕 、 〔14C〕 、 〔32P〕 、 〔33P〕 、 〔35S〕 など） 、 蛍光物質 〔例、 シァ ニン蛍光色素 （例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバイオサイ エンス社製） など） 、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァ ネート、 NBD (7-111 0&6112-2-0 &-1, 3- &201)など〕 、 酵素 （例、 β— 、ガラクトシダーゼ、 /3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素など） 、 発光物質 （例、 ルミノ ール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなど） 、 ピオチン、 ランタニド元素などで標識されたリガンドなどを用いることができる。 具体的には、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化さ せる化合物のスクリーニングを行うには、 本発明の受容体を含有する細 胞または細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファ一に懸濁す ることによりレセプ夕一標品を調製する。 バッファーには、 ρ Η4〜 1 0 (望ましくは ρ Η 6〜 8) のリン酸バッファ一、 トリス—塩酸バッフ ァ一などのリガンドと受容体との結合を阻害しないバッファーであれば いずれでもよい。 また、非特異的結合を低減させる目的で、 C HA P S、 Twe e η _ 8 0ΤΜ (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレ一 トなどの界面活性剤をバッファ一に加えることもできる。 さらに、 プロ テアーゼによる本発明の受容体の分解を抑える目的で P M S F、 ロイべ プチン、 E— 6 4 (ペプチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテア —ゼ阻害剤を添加することもできる。 0. 0 1〜 1 0 m 1の該レセプター 溶液に、 一定量 （5 0 0 0〜 5 0 0 0 0 0 c pm) の標識した本発明の リガンドを添加し、 同時に 1 0— 1ϋ〜 1 0—7Μの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （N S B) を知るために大過剰の未標識の本発明のリガ ンドを加えた反応チューブも用意する。 反応は 0°C〜 5 0° (：、 望ましく は 4 ° (：〜 3 7 °Cで 2 0分〜 24時間、 望ましくは 3 0分〜 3時間行う。 反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンター またはァーカウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（ B0) から非特異的結合量 （N S B) を引いたカウント （B。― N S B) を 1 0 0 %とした時、 特異的結合量 （B— N S B) が例えば 5 0 %以下に なる試験化合物を、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を低 下させる化合物として選択することができる。 さらに、 表面プラズモン センサー技術を利用することによって、 本発明の受容体に結合する化合
、物をスクリーニングすることもできる。
具体的には、 ビアコア 3 0 0 0 (ビアコア社） のセンサ一チップ表面 に、 本発明の受容体を固定化後、 チップ表面にリン酸緩衝液 （P B S) などに溶解した試験化合物を流したときの表面プラズモンの変化を測定 することにより、 本発明の受容体に結合する試験化合物を選択する。 例 えば、 表面プラズモンの変化の測定値が 5レゾナンスユニッ ト以上与え る試験化合物を本発明の受容体に結合性を有する物質として選択する。 前記の細胞刺激アツセィ系のスクリーニング方法を実施するためには、 本発明の受容体を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァ セチルコリン遊離、 細胞内 C a2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c A MP産生抑制、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜 電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 ； f o sの活性化、 p Hの低下、 GT P r S結合活性、 c AMP依存性プロテインキナーゼの活性化、 c GMP依存性プロティンキナーゼの活性化、 リン脂質依存性プロティン キナーゼの活性化、 マイ トジェン活性化蛋白質リン酸化酵素 （MAPキ ナ一ゼ） の活性化、 血清応答因子遺伝子発現上昇などを促進する活性ま たは抑制する活性、 受容体細胞内移行活性など） を、 自体公知の方法ま たは市販の測定用キッ トを用いて測定する.ことができる。 具体的には、 まず、 本発明の受容体を含有する細胞をマルチウエルプレ一ト等に培養 する。 スクリ一二ングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは 細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物などを添 加して一定時間ィンキュペートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回 収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞剌激活 性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含 有する分解酵素によって検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤 を添加してアツセィを行なってもよい。 また、 c A M P産生抑制などの 活性については、 フオルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させ ておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当な本発明 、の受容体を発現した細胞が必要である。 本発明の受容体を発現した細胞 としては、 前述の本発明の受容体発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 抗体、 非べプチ ド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物 組織抽出液、 血漿などがあげられる。
上記細胞刺激アツセィ系のスクリ一ニング方法について、 さらに具体 的に以下 （ 1 ) 〜 （ 1 4 ) に記載する。
( 1 ) 受容体発現細胞が受容体ァゴニス卜によって刺激されると細胞内 の G蛋白質が活性化されて GTPが結合する。 この現象は受容体発現細胞の 膜画分においても観察される。 通常、 GTPは加水分解されて GDPへと変化 するが、 このとき反応液中に GTP r Sを添加しておくと、 GTP r Sは GTPと同 様に G蛋白質に結合するが、 加水分解されずに G蛋白質を含む細胞膜に結 合した状態が維持される。 標識した GTP T Sを用いると細胞膜に残存した 標識された GTP T Sを測定することにより、 受容体ァゴニストの受容体発 現細胞剌激活性を測定することができる。
この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に 対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本発明の受 容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
この方法は、 本発明の受容体を含む膜画分を用いて行う。 本測定法に おいて本発明の受容体膜画分への GTPrS結合促進活性を示す物質はァゴ ニス卜である。
具体的には、 標識した GTPrSの存在下、 本発明のリガンドを本発明の 受容体細胞膜画分に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化 合物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合における、 本発明の 受容体細胞膜画分への GTP T S結合促進活性を測定し、 比較することによ り、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物 をスクリ一ニングする。
本方法において、 本発明のリガンドによる本発明の受容体細胞膜画分 への GTPrS結合促進活性を抑制する活性を示す試験化合物を、 アンタゴ 、ニス卜候補化合物として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体細胞膜画分に接触させ、 本発 明の受容体細胞膜画分への GTPrS結合促進活性を測定することにより、 ァゴニス卜のスクリ一二ングを行なうこともできる。
スクリ一ニング法の一具体例を以下に述べる。
公知の方法に従って調製した本発明の受容体を含む細胞膜画分を、 膜 希釈緩衝液 （50mM Tris、 5mM MgCl2、 150mM NaCK l^M GDP, 0. 1% BSA ； H7.4) で希釈する。 希釈率は、 受容体の発現量により異なる。 これを Falcon2053に 0.2mlずつ分注し、本発明のリガンドまたは本発明のリガン ドおよび試験化合物を加え、さらに終濃度 200pMとなるように [35S]GTPrS を加える。 25°Cで 1時間保温した後、 氷冷した洗浄用緩衝液（50mMTris, 5mM MgCl2, 150mM NaCl, 0.1% BSA, 0.05% CHAPS； pH7.4) 1.5mlを加 えて、 ガラス繊維ろ紙 GF/Fでろ過する。 65° (：、 30分保温して乾燥後、 液 体シンチレーションカウンターでろ紙上に残った膜画分に結合した
[35S] GTPrSの放射活性を測定する。 本発明のリガンドのみを加えた実験 区の放射活性を 100%、本発明のリガンドを加えなかった実験区の放射活 性を 0 %とし、本発明のリガンドによる G T Pァ S結合促進活性に対する試験 化合物の影響を算出する。 GTPrS結合促進活性が例えば 50%以下になる 試験化合物をアン夕ゴニスト候補化合物として選択することができる。 ( 2 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 細 胞内 CAMPの産生が促進される。 この反応を利用して、 本発明のリガンド の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本 発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスク リーニングすることができる。
具体的には、 本発明のリガンドを本発明の受容体発現細胞に接触させ た場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体発現細 胞に接触させた場合における、 該細胞の細胞内 cAMPの産生促進活性を測 定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結 合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
、 本発明の受容体発現細胞内の cAMP産生量は、マウス、 ラッ ト、 ゥサギ、 ャギ、 ゥシなどを免疫して得られた抗 cAMP抗体と 〔mI〕 標識 cAMP (とも に市販品） を使用することによる RIA系、 または抗 cAMP抗体と酵素標識 cAMPとを組み合わせた EIA系で測定することができる。 また、 抗 cAMP抗体 を、 pro t e in Aまたは抗 cAMP抗体産生に用いた動物の IgGなどに対する抗 体などを使用して固定したシンチラントを含むビーズと 〔 I〕 標識 cAMP とを使用する SPA ( Sc int i l l at ion Proximi ty As say) 法による定量、 ィ匕 学増幅型ルミネッセンスプロキシミティ一ホモジニアスアッセィ系であ る AlphaScreen (PerkinElmer社） を応用した競合法 cAMP検出キッ ト （ PerkinElmer社） による定量も可能である。
本方法において、 本発明のリガンドによる本発明の受容体発現細胞の cAMP産生促進活性を阻害する活性を示す試験化合物を、 アンタゴニスト 候補化合物として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、 cAMP 産生促進活性を調べることによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリ —ニングを行なうことができる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞 （例、 CH0細胞などの動物細胞） を 24穴プレー 卜に 5xl04ce l l/we l lで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 2 3-イソブ チル-メチルキサンチン、 0.05% BSAおよび 20mMHEPESを含むハンクスバ ッファー （pH7.4) で洗浄する （以下、 反応用バッファーと略記する） 。 その後、 0.5mlの反応用バッファーを加えて 30分間培養器で保温する。 反 応用バッファ一を除き、 新たに 0.25mlの反応用バッファーを細胞に加え た後、 IO Mの本発明のリガンドまたは 10 Mの本発明のリガンドおよび 試験化合物を含む 0.25mlの反応用バッファーを、 細胞に加え、 37°Cで 24 分間反応させる。 100 1の 20%過塩素酸を加えて反応を停止させ、 その 後氷上で 1時間置くことにより細胞内 cAMPを抽出する。 抽出液中の cAMP 量を、 cAMP EIAキッ ト (アマシャムフアルマシアバイオテク） を用いて 測定する。 反応用バッファ一のみを加えた時の cAMP量と比較し、 10 xM 、の本発明のリガンドの添加によって促進された cAMP量を 100%として、本 発明のリガンドによる cAMP産生促進活性に対する試験化合物の影響を算 出する。 本発明のリガンドの活性を阻害して、 cAMP産生促進活性が例え ば 50%以下になる試験化合物を、 アン夕ゴニスト候補化合物として選択 することができる。
一方、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体発現細胞 に接触させた場合、 または試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に 接触させた場合における c AMP産生抑制活性を調べることによりインバー スァゴニス ト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。 なお、 cAMP産生抑制活性を測定する場合は、 上記のスクリーニング法に おいて細胞内 cAMP量を増加させる物質 （例え【ま、 フォルスコリン、 本発 明のリガンドなど） を添加し、 ベースとなる細胞内 cAMP濃度を上昇させ ることによって活性の検出が容易になる。
( 3 ) CRE-レポーター遺伝子ベクターを用いて、 本発明のリガンドの本 発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明 のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一 ニングすることができる。
CRE (cAMP response element) を含む DNAを、 ベクタ一のレポ一夕一遺 伝子上流に挿入し、 CRE-レポ一夕一遺伝子ベクターを得る。 CRE-レポ一 夕一遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、 cAMP の上昇を伴う刺激は、 CREを介したレポーター遺伝子発現と、 それに引き 続くレポーター遺伝子の遺伝子産物 （蛋白質） の産生を誘導する。 つま り、 レポ一夕一遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、 CRE -レ ポーター遺伝子ベクター導入細胞内の cAMP量の変動を検出することがで きる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 CRE-レポ一夕一遺伝子ベクター導 入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよ び試験化合物を、 CRE-レポーター遺伝子べクタ一導入本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合における、 レポ一夕一遺伝子蛋白質の酵素活性
、を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体と の結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングする。
ベクタ一としては、 例えば、 ピツカジーン ペイシックベクター、 ピ ッカジーン ェンハンサ一ベクター （東洋インキ製造 （株） ） などが用 いられる。 CREを含む DNAを、 上記べクタ一のレポ一夕一遺伝子、 例えば ルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクロ一ニングサイトに挿入し、 CRE - レポ一夕一遺伝子ベクターとする。
本方法において、 本発明のリガンドによるレポ一夕一遺伝子蛋白質の 酵素活性の促進を抑制させる試験化合物を、 アンタゴニスト候補化合物 として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、 本発 明のリガンドと同様な促進活性を測定することによりァゴニストのスク リーニングを行なうこともできる。
レポ一ター遺伝子として、 ルシフェラ一ゼを利用する例を用いて、 こ のスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
CRE -レポーター遺伝子 （ルシフェラ一ゼ） を導入した本発明の受容体 発現細胞を、 24穴プレートに 5xl03ce l l/we l lで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 2mM 3-イソブチル -メチルキサンチン、 0. 05 % BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファー （pH7. 4) で洗浄する （以下、 反応用バ ッファ一と略記する） 。 その後 5mlの反応用バッファーを加えて 30分間 培養器で保温する。 反応用バッファ一を除き、 新たに 0.25mlの反応用バ ッファーを細胞に加えた後、 IO Mの本発明のリガンドまたは IO Mの本 発明のリガンドおよび試験化合物を添加した 0.25mlの反応用パッファー を、 細胞に加え、 37DCで 24分間反応させる。 細胞をピツカジーン用細胞 溶解剤 （東洋インキ製造 （株） ） で溶かし、 溶解液に発光基質 （東洋ィ ンキ製造 （株） ） を添加する。 ルシフェラーゼによる発光は、 ルミノメ —ター、 液体シンチレーションカウンタ一またはトップカウン夕一によ り測定する。 本発明のリガンド単独を添加した場合と、 10 Mの本発明の リガンドおよび試験化合物を添加した場合のルシフェラ一ゼによる発光
、量を測定して、 比較する。
本発明のリガンドは、ルシフェラ一ゼによる発光量の増加を促進する。 該促進を抑制させる化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択する ことができる。
レポ一夕ー遗伝子として、 例えば、 アルカリフォスファタ一ゼ、 クロ ラムフエ二コール ·ァセチルトランスフェラーゼ (chloramphenicol acetyl transferase) 、 ；8—ガラク トシダーゼなどの遺伝子を用いてもよ レ これらのレポ一夕一遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、 または市販の測定キットを用いて測定する。 アルカリフォス.ファタ一ゼ 活性は、 例えば和光純薬製 Luini- Phos 530を用いて、 クロラムフエニコー ル * ァセチルトランスフェラ一ゼ活性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT chrolamp enicol Acetyltransferase Assay KiTを用レ て、 β—カラク 卜 シダ一ゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Ga卜 XEを用いて測定する。 (4) SRE -レポーター遺伝子ベクターを用いて、 本発明のリガンドの本 発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明 のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリー ニングすることができる。
SRE (serum response element) を含む DNAを、 ベクタ一のレポ一ター 遺伝子上流に挿入し、 SRE -レポーター遺伝子べクタ一を得る。 SRE-レポ 一夕一遺伝子べクタ一を導入した本発明の受容体発現細胞において、 血 清刺激による MAPキナーゼ活性化などの増殖シグナルの活性化は、 SREを 介したレポーター遺伝子発現と、 それに引き続くレポーター遺伝子の遺 伝子産物 （蛋白質） の産生を誘導する。 つまり、 レポ一夕一遺伝子蛋白 質の酵素活性を測定することにより、 SRE-レポ一夕一遺伝子べクタ一導 入細胞内の増殖シグナルの活性化を検出することができる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 SRE -レポーター遺伝子ベクター導 入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよ び試験化合物を、 SRE-レポーター遺伝子べクタ一導入本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合における、 レポ一ター遺伝子蛋白質の酵素活性
、を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体と の結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングする。
ベクターとしては、 例えば、 ピツカジーン べィシックベクター、 ピッ 力ジーン ェンハンサーベクター （東洋インキ製造 （株） ） などが用いら れる。 SREを含む DNAを、 上記べクタ一のレポーター遺伝子、 例えばルシ フェラ一ゼ遺伝子上流のマルチクロ一ニングサイ トに挿入し、 SRE-レポ 一夕一遺伝子べクタ一とする。
本方法において、 本発明のリガンドによるレポ一夕一遺伝子蛋白質の 酵素活性化を抑制させる試験化合物を、 アン夕ゴニスト候補化合物とし て選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、 本発 明のリガンドと同様な発光量の上昇を測定することによりァゴニストの スクリ一二ングを行なうこともできる。
レポ一夕一遺伝子として、 ルシフェラ一ゼを利用する例を用いて、 こ のスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
SRE-レポ一ター遺伝子 （ルシフェラ一ゼ） を導入した本発明の受容体 発現細胞を、 24穴プレートに 5xl03ce l l/we l lで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 05 % BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファ一 （pH7. 4 ) で洗浄する （以下、 反応用バッファーと略記する） 。 その後 0. 5mlの反 応用バッファーを加えて 30分間培養器で保温する。 反応用バッファーを 除き、 新たに 0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、 10 Mの本 発明のリガンドまたは 10 Mの本発明のリガンドおよび試験化合物を添 加した 0.25mlの反応用バッファーを、 細胞に加え、 37°Cで 24分間反応さ せる。 細胞をピツカジーン用細胞溶解剤 （東洋インキ製造 （株） ） で溶 かし、 溶解液に発光基質 （東洋インキ製造 （株） ） を添加する。 ルシフ エラーゼによる発光は、 ルミノメ一夕一、 液体シンチレーションカウン 夕一またはトツプカウン夕一により測定する。 本発明のリガンド単独を 添加した場合と、 10 Mの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し た場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、 比較する。
- 本発明のリガンドは、 ルシフェラ一ゼによる発光量を増加させる。 該 増加を抑制させる化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択するこ とができる。
レポ一夕一遺伝子として、 例えば、 アル力リフォスファタ一ゼ、 クロ ラムフエ二コール · ァセチルトランスフェラーゼ （chloramphenicol acetyl transferase) 、 3—ガラク トシダ一ゼなどの遺伝子を用いてもよ レ これらのレポ一夕一遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、 または市販の測定キットを用いて測定する。 アルカリフォスファターゼ 活性は、 例えば和光純薬製 Lumi- Phos 530を用いて、 クロラムフエニコー ル · ァセチル小ランスフェラ一ゼ活性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol Acetyl transferase Assay KiTを用レ て、 /9—刀ラク 卜 シダ一ゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Ga卜 XEを用いて測定する。 ( 5) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 ァ ラキドン酸代謝物を細胞外に放出する。 この反応を利用して、 本発明の リガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することに より、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合 物をスクリーニングすることができる。
あらかじめ、 標識したァラキドン酸を、 本発明の受容体発現細胞に取 り込ませておくことによって、 ァラキドン酸代謝物放出活性を、 細胞外 に放出された標識されたァラキドン酸代謝物を測定することによって測 定することができる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 標識したァラキドン酸を含有する 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび 試験化合物を、 標識したァラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細 胞に接触させた場合における、ァラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を 変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、 本発明のリガンドによるァラキドン酸代謝物放出活 性を阻害する試験化合物を、 アン夕ゴニスト候補化合物として選択する 、 ことができる。
また、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 本発明 の受容体発現細胞のァラキドン酸代謝物放出活性を公知の方法で調べる ことによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリ一二ングを行なうこと もできる。
スクリ一二ング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレー卜に 5xl04cell/wellで播種し、 24時間培養後、 [3H]ァラキドン酸を 0.25 xCi/wellとなるよう添加し、 16 時間後、 細胞を 0.05% BSAおよび 20謹 HEPESを含むハンクスバッファー (pH7.4) (以下、 反応用バッファーと略記する） で洗浄する。 終濃度 10 Mの本発明のリガンドまたは終濃度 IO Mの本発明のリガンドおよび試 験化合物を含む反応用バッファ一 500 x lを、 各 wellに添加する。 37°Cで 60分間ィンキュペートした後、 反応液 400 X 1をシンチレ一ターに加え、 反応液中に遊離した [3H]ァラキドン酸代謝物の量をシンチレ一ションカ ゥン夕一により測定する。
反応用バッファー 500/21のみを添加した場合（本発明のリガンド非添 加 ·試験化合物非添加） の遊離 [ ]ァラキドン酸代謝物の量を ο%、 Ίθ
Μの本発明のリガンドを含む反応用バッファーを添加した場合（試験化合 物非添加） の遊離 [ ]ァラキドン酸代謝物の量を 100%として、 試験化合 物を添加した場合の遊離 [ ]ァラキドン酸代謝物の量を算出する。
ァラキドン酸代謝物放出活性が、 例えば 50 %以下になる試験化合物を アン夕ゴニスト候補化合物として選択することができる。
( 6 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 細 胞内の Ca濃度が上昇する。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本 発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明 のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一 ニングすることができる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触さ せた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発
、現細胞に接触させた場合における、 細胞内カルシウム濃度上昇活性を測 定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結 合性を変化させる化合物をスクリーニングする。 測定は公知の方法に従 つて行う。
本方法において、 本発明のリガンドによる細胞内カルシウム濃度の上 昇を抑制する試験化合物を、 アン夕ゴニスト候補化合物として選択する ことができる。
一方、 試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇を測定することに よってァゴニストのスクリ一二ングを行なうこともできる。 .
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を、滅菌した顕微鏡用カバ一グラス上に播き、 2日後、 培養液を、 4 Fura- 2 AM (同仁化学研究所） を縣濁した HBSSに 置換し、 室温で 2時間 30分おく。 HBSSで洗浄した後、 キュべッ トにカバー グラスをセッ トし、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試 験化合物を添加し、 励起波長 340nmおよび 380nmでの、 505nmの蛍光強度の 比の上昇を蛍光測定器で測定し、 比較する。
また、 FLIPR (モレキュラーデバイス社製） を使って行ってもよい'。 本 発明の受容体発現細胞縣濁液に Fluo- 3 AM . (同仁化学研究所製） を添加し 、 細胞に取り込ませた後、 上清を遠心により数度洗浄後、 96穴プレート に細胞を播く。 FLIPR装置にセッ トし、 Fura-2の場合と同様に、 本発明の リガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し、 蛍光強度 の比の上昇を蛍光測定器で測定し、 比較する。
さらに、 本発明の受容体発現細胞に、 細胞内 Caイオンの上昇によって 発光するような蛋白質の遺伝子 （例、 aeduor inなど） を共発現させてお き、 細胞内 Caイオン濃度の上昇によって、 該遺伝子蛋白質（例、 aeauo r in など） が Ca結合型となり発光することを利用して、 本発明のリガンドと 本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングするこ ともできる。
細胞内 Caイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子を共発 、現させた本発明の受容体発現細胞を、 96穴プレートに播き、 上記と同様 に、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加 し、 蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、 比較する。
本発明のリガンドによる蛍光強度の上昇を、 抑制する試験化合物をァ ンタゴニス卜候補化合物として選択することができる。
( 7 ) 本発明の受容体を発現する細胞に、 受容体ァゴニストを添加する と、細胞内ィノシトール三リン酸濃度は上昇する。本発明のリガンドの、 本発明の受容体発現細胞における細胞内ィノシトール三リン酸産生活性 を利用することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性 を変化させる化合物をスクリ一二ングすることができる。
具体的には、 標識したイノシトールの存在下.、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび 試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 ィ ノシトール三リン酸産生活性を測定し、 比較することにより、 本発明の リガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリー二 ングする。 測定は公知の方法に従って行う。
本方法において、 ィノシト一ル三リン酸産生活性を抑制する試験化合 物を、 アン夕ゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 イノシ トール三リン酸産生上昇を測定することによってァゴニストのスクリー ニングを行なうこともできる。
スクリ一二ング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに播き、 1日間培養する。 その 後、 myo- [2- ] inos i t o l ( 2. 5 C i/we l 1 ) を添加した培地で 1 日間培養 し、 細胞を放射活性を有するィノシトールを無添加の培地でよく洗浄す る。 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加 後、 10 %過塩素酸を加え、反応を止める。 1. 5M 水酸化力リゥムおよび 60mM HEPES溶液で中和し、 0. 5mlの AGlx8樹脂 （B io- Rad) を詰めたカラムに通 し、 5mM 四ホウ酸ナトリウム （Na2B407) および 60mM ギ酸アンモニゥムで 、洗浄した後、 1M ギ酸アンモニゥムおよび 0. 1M ギ酸で溶出した放射活性 を、 液体シンチレ一シヨンカウン夕一で測定する。 本発明のリガンドを 添加しない場合の放射活性を 0 %、本発明のリガンドを添加した場合の放 射活性を 100 %とし、 試験化合物の、 本発明のリガンドと本発明の受容体 の結合に対する影響を算出する。
ィノシトール三リン酸産生活性が、 例えば 50 %以下になる試験化合物 をアン夕ゴニスト候補化合物として選択することができる。
( 8 ) TRE-レポ一ター遺伝子べクタ一を用いて、 本発明のリガンドの本 発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明 のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一 ニングすることができる。
TRE (TPA response e l ement) を含む DNAを、 ベクタ一のレポーター遺 伝子上流に挿入し、 TRE-レポ一夕一遺伝子べクタ一を得る。 TRE-レポ一 ター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、 細胞 内カルシウム濃度の上昇を伴う刺激は、 TREを介したレポ一夕一遺伝子発 現と、 それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物 （蛋白質） の産生 を誘導する。 つまり、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定するこ とにより、 ΠΕ-レポ一夕一遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の 変動を検出することができる。 具体的には、 本発明のリガンドを、 TRE -レポーター遺伝子ベクター導 入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよ び試験化合物を、 TRE-レポ一夕一遺伝子べクタ一導入本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合における、 レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性 を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体と の結合性を変化させる化合物をスクリ一ニングする。
ベクタ一としては、 例えば、 ピツカジーン べィシックべクタ一、 ピ ッカジーン ェンハンサーベクター （東洋インキ製造 （株） ） などが用 いられる。 TREを含む DNAを、 上記べクタ一のレポーター遺伝子、 例えば ルシフェラーゼ遗伝子上流のマルチクローニングサイ 卜に挿入し、 TRE- 、レポーター遺伝子ベクターとする。
本方法において、 本発明のリガンドによるレポ一夕一遺伝子蛋白質の 酵素活性を抑制する試験化合物を、 アンタゴニスト候補化合物として選 択することができる。
一方、 試験化合物のみを TRE-レポ一ター遺伝子ベクター導入本発明の 受容体発現細胞に接触させ、 本発明のリガンドと同様な発光量の増加を 測定することによりァゴニス卜のスクリーニングを行なうこともできる。
レポーター遺伝子として、 ルシフェラーゼを利用する例を用いて、 こ のスクリ一二ング方法の具体例を以下に述べる。
ΠΕ-レポ一夕一遺伝子 （ルシフェラーゼ） を導入した本発明の受容体 発現細胞を、 24穴プレートに 5xl03ce l l/we l lで播種し、 48時間培養する。 細胞を 0. 05 % BSAおよび 20 HEPESを含むハンクスバッファ一 （pH7. 4 ) で洗浄した後、 I O Mの本発明のリガンドまたは I O Mの本発明のリガ ンドおよび試験化合物を添加し、 37°Cで 60分間反応させる。 細胞をピッ カジ一ン用細胞溶解剤 （東洋インキ製造 （株） ） で溶かし、 溶解液に発 光基質 （東洋インキ製造 （株） ） を添加する。 ルシフェラーゼによる発 光は、 ルミノメータ一、 液体シンチレーシヨンカウンターまたはトップ カウン夕一により測定する。 本発明のリガンドを添加した場合と、 10 M の本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した場合のルシフェラ一ゼ による発光量を測定して、 比較する。
本発明のリガンドによる細胞内カルシウムの上昇によって、 ルシフエ ラーゼによる発光量が増加する。 この増加を抑制する化合物をアン夕ゴ ニスト候補化合物として選択することができる。
レポ一ター遺伝子として、 例えば、 アルカリフォスファタ一ゼ、 クロ ラムフエニコーリレ · ァセチリレトランスフェラーゼ (chloramphenicol acetyltransferase) 、 β—ガラク トシダ一ゼなどの遺伝子を用いてもよ レ これらのレポ一夕一遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、 または市販の測定キッ トを用いて測定する。 アルカリフォスファタ一ゼ 活性は、 例えば和光純薬製 Lumi- Phos 530を用いて、 クロラムフエニコ一 、ル · ァセチルトランスフェラ一ゼ活性は、 例えば和光純薬製 FAST CAT clirolamphenicol Acetyl transferase Assay KiTを用レ て、 β—刀ラク 卜 シダ一ゼ活性は、 例えば和光純薬製 Aurora Gal- XEを用いて測定する。 ( 9) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 MAP キナーゼが活性化され、 増殖する。 この反応を利用して、 本発明のリガ ンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をス クリ一二ングすることができる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触さ せた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合における、 細胞増殖を測定し、 比較することに より、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合 物をスクリ一ニングする。
本発明の受容体発現細胞の増殖は、 例えば、 MAPキナーゼ活性、 チミジ ン取り込み活性、 ATP量、 細胞数などを測定すればよい。
具体例としては、 MAPキナーゼ活性については、 本発明のリガンドまた は本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発現細胞 fc添 加した後、 細胞溶解液から抗 MAPキナーゼ坑体を用いた免疫沈降により MAPキナーゼ分画を得た後、 公知の方法、 例えば和光純薬製 MAP Kinase AssayKitおよびァ- [32P]-ATPを使用して MAPキナーゼ活性を測定し、 比較 する。
チミジン取り込み活性については、 本発明の受容体発現細胞を 24穴プ レートに播種し、 培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドぉ よび試験化合物を添加した後、 放射活性により標識したチミジン （例、 [methy卜3 H]-チミジンなど） を加え、 その後、 細胞を溶解し、 細胞内に 取り込まれたチミジンの放射活性を、 液体シンチレーションカウンタ一 で計数することにより、 チミジン取り込み活性を測定し、 比較する。
ATP量の測定については、本発明の受容体発現細胞を 96穴プレートに播 種し、 培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化 、合物を添加した後、 例えば CellTiter- Glo (Promega) を用いて細胞内の ATP量を測定し、 比較する。
細胞数の測定については、 本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに 播種し、 培養し、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験 化合物を添加した後、 MTT (
3- (4, 5 - dimethyト 2 - thiazolyl) - 2, 5-dip enyl-2H-tetrazol ium bromide ) を添加する。 細胞内に取り込まれて MTTが変化した MTTホルマザンを、 塩酸にて酸性としたィソプロパノール水溶液で細胞を溶解した後、 57 Onm の吸収によって測定し、 比較する。
本方法において、 本発明の受容体発現細胞の増殖を抑制する試験化合 物を、 アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 本発明 のリガンドと同様な細胞増殖活性を測定することによりァゴニストのス クリ一二ングを行なうこともできる。
チミジン取り込み活性を利用するスクリーニング法の一具体例を以下 に述べる。
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに 5000個/ゥエル播き、 1日間 培養する。 次に血清を含まない培地で 2日間培養し、 細胞を飢餓状態にす る。 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を、 細 胞に添加して 24時間培養した後、 [me thyl」H] -チミジンをゥエル当たり 0. 015MBQ添加し、 6時間培養する。 細胞を PBSで洗った後、 メタノールを 添加して 10分間放置する。次に 5 %トリクロ口酢酸を添加して 15分間放置 後、 固定された細胞を蒸留水で 4回洗う。 0. 3N水酸化ナトリウム溶液で細 胞を溶解し、 溶解液中の放射活性を液体シンチレ一シヨンカウンターで 測定する。
本発明のリガンドを添加した場合の放射活性の増加を抑制する試験化 合物を、 アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
( 1 0 ) 本発明の受容体発現細胞は、 本発明のリガンドの刺激により、 カリウムチャネルが活性化し、 細胞内にある Kイオンが、 細胞外に流出す
、る。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞 に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本発明の 受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングすることができ る。
Kイオンと同族元素である Rbイオン (ルビジウムイオン) は、 Kイオン と区別無く、 カリウムチャネルを通って細胞外に流出する。 よって、 本 発明の受容体発現細胞に、 放射活性同位体である Rb ( [86Rb] ) を取り込ま せておいた後、本発明のリガンドの刺激によって流出する86 Rbの流れ（流 出活性） を測定することにより、 本発明のリガンドの本発明の受容体発 現細胞に対する刺激活性を測定する。
具体的には、 S6Rbの存在下、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現 細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発 明の受容体発現細胞に接触させた場合における、86 Rbの流出活性を測定し 、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性 を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、本発明のリガンド刺激による8 bの流出活性の上昇を 抑制する試験化合物を、 アン夕ゴニスト候補化合物として選択すること ができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 本発明 のリガンドと同様な86 Rbの流出活性の上昇を測定することによりァゴニ ストのスクリーニングを行なうこともできる。
スクリ一二ング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を 24穴プレー卜に播き、 2日間培養する。 その 後、 lmC i/ffllの86 RbC lを含む培地中で 2時間保温する。細胞を培地でよく洗 浄し、外液中の86 RbC lを完全に除く。本発明のリガンドまたは本発明のリ ガンドおよび試験化合物を細胞に添加し、 30分後外液を回収し、 τカウ ンターで放射活性を測定し、 比較する。
本発明のリガンド刺激による 86Rbの流出活性の上昇を抑制する試験化 合物を、 アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
、 （ 1 1 ) 本発明の受容体発現細胞が本発明のリガンドに反応し、 細胞外 の pHが変化する。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の受 .容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガン ドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングす ることができる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触さ せた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合における、 細胞外の p H変化を測定し、 比較す ることにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合牲を変化さ せる化合物をスクリーニングする。
細胞外 pH変化は、 例えば、 Cyt osensor装置 （モレキュラーデバイス社 ) を使用して測定する。
本方法において、 本発明のリガンドによる細胞外 pH変化を抑制する試 験化合物を、 アン夕ゴニスト候補化合物として選択することができる。 一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 本発明 のリガンドと同様な細胞外 pH変化を測定することによりァゴニストのス クリーニングを行なうこともできる。
スクリ一ニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を Cyt osensor装置用のカプセル内で終夜培養 し、装置のチャンバ一にセッ トして細胞外 pHが安定するまで約 2時間、 0.1 % BSAを含む RPMI 1640培地（モレキュラーデバイス社製）を灌流させる。 pHが安定した後、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験 化合物を含む培地を細胞上に灌流させる。 灌流によって生じた培地の pH 変化を測定し、 比較する。
本発明のリガンドによる細胞外 pH変化を抑制する化合物をアンタゴニ スト候補化合物として選択することができる。
( 1 2 ) 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) の haploid ひ - mating type (MAT ) の性フェロモン受容体 Ste2は、 G蛋白質 Gpalと共役しており、 性 フェロモンひ- mating factorに応答して MAPキナーゼを活性化し、 これに 、引き続き、 Farl (cell-cycle arrest) および転写活性化因子 Stel2が活 性化される。 Stel2は、 種々の蛋白質 （例えば、 接合に関与する FUS1) の 発現を誘導する。一方、制御因子 Sst 2は上記の過程に抑制的に機能する。 この系において、 受容体遺伝子を導入した酵母を作製し、 受容体ァゴニ ストの刺激により酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、 その結果生 じる増殖などを指標として用いる、 受容体ァゴニス卜と受容体との反応 の測定系の試みが行なわれている （Trends in Biotechnology, 15巻， 487-494頁， 1997年） 。 上記の受容体遺伝子導入酵母の系を利用して、 本 発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスク リ一ニングすることができる。
具体例を以下に示す。
MATひ酵母の Ste2および Gpalをコ一ドする遺伝子を除去し、 代わりに、 本発明の受容体遺伝子および Gpal- Gai2融合蛋白質をコードする遺伝子 を導入する。 Farlをコ一ドする遺伝子を除去して cell- cycle arrestが生 じないようにし、 また、 Sst2をコードする遺伝子を除去して本発明のリ ガンドに対する応答の感度を向上させておく。 さらに、 FUS1にヒスチジ ン生合成遺伝子 HIS3を結合した FUS1-HIS3遺伝子を導入する。この遺伝子 組換え操作は、 例えば、 Molecular and Cellular Biology, 15巻， 6188- 6195頁， 1995年に記載の方法において、 ソマトス夕チン受容体タイ プ 2 ( SSTR2) 遺伝子を、 本発明の受容体に置き換えて実施することがで きる。
このように構築された形質変換酵母は、 本発明のリガンドに高感度で 反応し、 その結果、 MAPキナーゼの活性化が起き、 ヒスチジン生合成酵素 が合成されるようになり、 ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。
従って、 上記の本発明の受容体発現酵母 （S t e2遺伝子および Gpa l遺伝 子が除去され、本発明の受容体遺伝子および Gpa l- Ga i 2融合蛋白質コード 遺伝子が導入され、 Far遺伝子および Ss 遺伝子が除去され、 FUS卜 HI S3 遺伝子が導入された ΜΑΤ α酵母） を、 ヒスチジン欠乏培地で培養し、 本発 明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を接触させ、 該
、酵母の生育を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明 の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一ニングすることがで きる。
本方法において、 該酵母の生育を抑制する試験化合物を、 アン夕ゴニ スト候補化合物として選択することができる。
一方、 試験化合物のみを上記の本発明の受容体発現酵母に接触させ、 本発明のリガンドと同様な酵母の生育を測定することによりァゴニスト のスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
上記の本発明の受容体発現酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養 し、 その後、 ヒスチジンを除去した溶解寒天培地に、 2xl04ce l l/mlの濃 度になるように加える。 ついで、 9x9cmの角形シャーレに播く。 寒天が固 化した後、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物 をしみこませた滅菌濾紙を寒天表面におき、 30°Cで 3日間培養する。 試験 化合物の影響は、 濾紙の周囲の酵母の生育を、 本発明のリガンドのみを しみこませた滅菌濾紙を用いた場合と比較する。 また、 あらかじめ、 ヒ スチジンを除去した寒天培地に本発明のリガンドを添加しておき、 滅菌 濾紙に試験化合物のみをしみこませて酵母を培養し、 シャーレ全面での 酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察してもよい。 酵母の生育を抑制する化合物をアン夕ゴニスト候補化合物として選択 することができる。
( 1 3 )本発明の受容体遺伝子 RNAをアフリカッメガエル卵母細胞に注入 し、 本発明のリガンドによって刺激すると細胞カルシウム濃度が上昇し て、 calcium- activated chloride currentが生じる。 これは、 膜電位の 変化としてとらえることができる（Kイオン濃度勾配に変化がある場合も 同様） 。 本発明のリガンドによって生じる本発明の受容体導入アフリカ ッメガエル卵母細胞における上記反応を利用して、 本発明のリガンドの 本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発 明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ
、一二ングすることができる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体遺伝子 RNA導入ァフ リカツメガエル卵母細胞に接触させた場合と、 本発明のリガンドおよび 試験化合物を、本発明の受容体遺伝子 RNA導入アフリカッメガエル卵母細 胞に接触させた場合における、 細胞膜電位の変化を測定し、 比較するこ とにより、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる 化合物をスクリ一二ングする。
本方法において、 細胞膜電位変化を抑制する試験化合物を、 アン夕ゴ ニスト候補化合物として選択することができる。
—方、試験化合物のみを本発明の受容体遺伝子 RNA導入アフリカッメガ エル卵母細胞に接触させ、 本発明のリガンドと同様な細胞膜電位変化を 測定することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。 スクリ一ニング法の一具体例を以下に述べる。
氷冷して動けなくなった雌のアフリカッメガエルから取り出した、 卵 母細胞塊を、 MBS液 （88mMNaCl， lniMKCl, 0.41mMCaCl2, 0.33mM Ca (N03) 2, 0.82mM MgS04, 2.4mM NaHC03, lOmM HEPES； pH7.4) に溶かしたコラーゲ ナーゼ （0.5mg/ml) で卵塊がほぐれるまで 19°C、 1〜6時間、 150rpmで処 理する。 外液を MBS液に置換することで 3度洗浄し、 マイクロマニピユレ —夕一で本発明の受容体遺伝子 poly A付加 cRNA (50ng/50nl) を卵母細胞 にマイクロインジェクションする。
本発明の受容体遺伝子 mRNAは、 組織や細胞から調製してもよく、 ブラ スミ ドから in v i t roで転写してもよい。 本発明の受容体遺伝子 mRNAを MBS 液中で 20°Cで 3日培養し、 これを Ringe r液を流している vo l t age c l amp装 置のくぼみに置き、 電位固定用ガラス微小電極および電位測定用ガラス 微小電極を細胞内に刺入し、 （―） 極は細胞外に置く。 電位が安定した ら、 本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を含む Ringer液を流して電位変化を記録する。 試験化合物の影響は、 本発明の 受容体遺伝子 RNA導入アフリカッメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化を、 本発明のリガンドのみ含む Ringe r液を流した場合と比較することによつ 、て測定することができる。
細胞膜電位変化を抑制する化合物をアン夕ゴニスト候補化合物として 選択することができる。
上記の系において、 電位の変化量を増大させると、 測定しやすくなる ため、 各種の G蛋白質遺伝子の po ly A付加 RNAを導入してもよい。 また、 カルシウム存在下で発光を生じるような蛋白質 （例、 aequor inなど） の 遺伝子の po ly A付加 RNAを共ィンジェクシヨンすることにより、 膜電位変 化ではなく発光量を測定することもできる。
( 1 4 ) 本発明の受容体発現細胞が本発明のリガンドに反応し、 受容体 が細胞表面から細胞内に取り込まれる '（インターナリゼーシヨン； 内部 移行） 。 この反応を利用して、 本発明のリガンドの本発明の受容体発現 細胞に対する刺激活性を測定することにより、 本発明のリガンドと本発 明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一ニングすることが できる。
具体的には、 本発明のリガンドを、 本発明の受容体発現細胞に接触さ せた場合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を、 本発明の受容体発 現細胞に接触させた場合における、 受容体のィンターナリゼーションの 程度を測定し、 比較することにより、 本発明のリガンドと本発明の受容 体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。 受容体のインターナリゼーシヨンは、 例えば、 細胞に発現させた本発 明の受容体- GFP融合夕ンパク質を、ィメージ解析装置〔例、蛍光顕微鏡、 アクアコスモス （浜松ホトニクス） など〕 で観察し、 細胞内の本発明の 受容体の存在場所を解析することで検出することができる。
本方法において、 本発明のリガンドによる受容体のインターナリゼ一 ションを抑制する試験化合物を、 アンタゴニスト候補化合物として選択 することができる。
一方、 試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、 本発明 のリガンドと同様なィンターナリゼ一ションを測定することによりァゴ 二ストのスクリーニングを行なうこともできる。
、 スクリ一二ング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体の C末端に翻訳フレームを合わせて、ォワンクラゲより 単離された Green F luorescent Pro t e in (GFP) cDNAをつないだ融合タン パク質を発現させるための発現プラスミ ドを構築する。その際、 GFP cDNA には GFPの発現ベクター PQB I 25 (宝酒造） から切り出される断片を用いる ことができる。 構築した受容体- GFP融合タンパク質発現プラスミ ドを、 常法に従って CH0細胞に卜ランスフエクションし、受容体- GFP融合タンパ ク質発現 CH0細胞株を取得する。本細胞株を Lab— Tekl lカバーグラスチェ ンバ一 （Na l gen Nunc社） にまき、 37° ( 、 5%C02条件下で一晩培養し、 試 験化合物を添加後、 共焦点顕微鏡 （ライカ社） で GFPの蛍光像を励起波長 488Mで観察する。
本発明のリガンドによるィンターナリゼ一ションを抑制する化合物を アン夕ゴニスト候補化合物として選択することができる。
本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物ま たはその塩のスクリーニング用キッ トは、 本発明の受容体または本発明 の受容体を含有する細胞もしくは細胞の膜画分、 および本発明のリガン ドを含有する。 ' 本発明のスクリーニング用キッ トの例としては、 次のものが挙げられ る。 1. スクリーニング用試薬
(i) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (インビトロジェン社製） に、 0.05 %のゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 ΠΙのフィルタ一で濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 または用 時調製しても良い。
(ii) 本発明の受容体標品
本発明の受容体を発現させた CH0細胞を、 12穴プレートに 5X105個/穴 で継代し、 37° (：、 5%C02、 95%airで 2日間培養したもの。
(iii) 標識リガンド
、 〔 〕 、 〔1251〕 、 〔14C〕 、 C32P] 、 〔33P〕 、 C35S] などの放射性同 位元素で標識した本発明のリガンドを適当な溶媒または緩衝液に溶解し たものを、 4°Cまたは -20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液にて Ι/iMに 希釈する。
(iv) リガンド標準液
本発明のリガンドを 0.1%ゥシ血清アルブミン（シグマ社製）を含む PBS で ImMとなるように溶解し、 - 20°Cで保存する。
2. 測定法
(i) 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の受容体を発現させた 細胞を、 測定用緩衝液 lmlで 2回洗浄した後、 の測定用緩衝液を各 穴に加える。
(ii) 1(T3〜10— 1QMの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識した本発明の リガンドを 5 / 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知る ためには試験化合物の代わりに 10—¾の本発明のリガンドを 5 1加えてお <。
(iii) 反応液を除去し、 lmlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合 した標識された本発明のリガンドを 0.2NNa0H- 1%SDSで溶解し、 4ml'の液 体シンチレ一夕一 A (和光純薬製） と混合する。
(iv) 液体シンチレーシヨンカウン夕一 （ベックマン社製） を用いて放 射活性を測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次式で求める。
PMB= [ (B— NS B) / (BQ - NS B) ] X I 00
PMB : Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NS B ： Non-specific Binding (非特異的結合量）
h Q ：取大糸口口里
本発明のスクリ一ニング方法またはスクリーニング用キッ卜を用いて 得られうる化合物またはその塩は、 本発明のリガンドと本発明の受容体 との結合を変化させる化合物あるいは本発明の受容体の活性を促進また は阻害する化合物であり、 具体的には、 （i) 本発明の受容体を介して細 、胞刺激活性を有する化合物またはその塩（本発明の受容体ァゴニスト）、
(ii)該刺激活性を有しない化合物（本発明の受容体アンタゴニスト）、
(iii)本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物 、 (iv) 本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合 物などである。 該化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 抗体、 非べプチ ド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物 組織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物などが挙げられ、 これら化合 物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、 前記した本発明の受容体の塩と同様のものが 用いられる。
上記本発明の受容体ァゴニス卜であるか、 またはアン夕ゴニストであ るかの評価方法は、 例えば、 以下の （i) または （ii) に従えばよい。 (i) 前記 （a) 〜 （c) のスクリーニング方法で示されるバインディング •アツセィを行い、 本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変 化させる （特に、 結合を阻害する） 化合物を得た後、 該化合物が上記し た本発明の受容体を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。 細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体ァゴニスト (ァゴ二スト） であり、 該活性を有しない化合物またはその塩は本発明 の受容体アン夕ゴニス卜 （アン夕ゴニスト） である。 ( i i ) (a)試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させ、 本発 明の受容体を介した細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有する化 合物またはその塩は本発明の受容体ァゴニストである。
(b)本発明のリガンドを本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場 合と、 本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する 細胞に接触させた場合における、 本発明の受容体を介した細胞刺激活性 を測定し、 比較する。 本発明の受容体を活性化する化合物による細胞刺 激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の受容体アン夕ゴニ ストである。
本発明のリガンドは、 神経活動調節活性、 運動機能調節活性などを有
、し、 本発明の受容体を発現している線条体、 側坐核、 海馬、 前頭葉など の神経細胞の細胞内 cAMP濃度を上昇させるため、 例えば統合失調症の陽 性症状の原因の一つとされている中脳辺縁系ド一パミン経路の過活動を 抑制し、 統合失調症の陽性症状を改善させることができる。 また、 本発 明のリガンドは、 統合失調症の陰性症状や認知障害の原因の一つとされ ている大脳皮質の丽 DA型受容体の機能低下を改善し、 統合失調症の陰性 症状や認知障害を改善させることができる。 従って、 本発明の受容体ァ ゴニス卜は、 本発明のリガンドが有する生理活性 （例、 神経活動調節活 性、 運動機能調節活性など） と同様の作用を有しており、 安全で低毒性 な医薬、 例えば、 精神疾患 （例、 統合失調症、 不安症、 認知障害、 パニ ック障害、 恐怖性障害、 薬物誘発性精神病性障害、 妄想性精神病など） 、 プロラクチン分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障 害、 甲状腺機能低下など） 、 高血圧症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概 日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域変化症候 群 （時差ボケ） など） 〕 などの予防 ·治療剤、 好ましくは、 統合失調症、 認知障害、プロラクチン分泌不全などの予防 ·治療剤として有用である。 本発明の受容体アンタゴニストは、 本発明のリガンドが有する生理活 性 （例、 神経活動調節活性、 運動機能調節活性など） を抑制することが でき、 本発明の受容体を発現している線条体、 側坐核、 海馬、 前頭葉な どの神経細胞の細胞内 cAMP濃度を低下させるため、 例えばパーキンソン 病の原因とされている黒質線条体ド一パミン経路でのドーパミン欠損に 起因する細胞内 cAMP産生の抑制不全を改善させることができる。従って、 本発明の受容体アンタゴニス卜は、 安全で低毒性な医薬、 例えば、 精神 疾患 （例、 神経遮断薬誘発性ジスキネジァ、 パーキンソン病、 薬物誘発 性パーキンソン症状群、 錐体外路症状など） 、 プロラクチン分泌過多症 〔例、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣およ び子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常など〕 などの 予防 ·治療剤、 好ましくはパーキンソン病、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣および子宮の萎縮など） などの予防 - 、治療剤などとして有用である。
本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物は、 安全で低毒性な医薬、 例えば、 精神疾患 （例、 統合失調症、 不安症、 認 知障害、 パニック障害、 恐怖性障害、 薬物誘発性精神病性障害、 妄想性 精神病など） 、 プロラクチン分泌不全 (例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育 不全、 更年期障害、 甲状腺機能低下など） 、 高血圧症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時 間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 などの予防 ·治療剤、 好ましく は、 統合失調症、 認知障害、 プロラクチン分泌不全などの予防，治療剤 として有用である。
本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物は、 安全で低毒性な医薬、 例えば、 精神疾患 （例、 神経遮断薬誘発性ジスキ ネジァ、 パ一キンソン病、 薬物誘発性パーキンソン症状群、 錐体外路症 状など） 、 プロラクチン分泌過多症 〔例、 高プロラクチン血症 （例、 不 妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣および子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常など〕 などの予防 ·治療剤、 好ましくはパーキンソ ン病、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣およ び子宮の萎縮など） などの予防 ·治療剤などとして有用である。
また、 本発明は、 本発明の受容体をコードする本発明のポリヌクレオ チドを用いることを特徴とする本発明の受容体の遺伝子の発現を促進ま たは阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法なども提供する。 具体的には、 （i ) 本発明の受容体を産生する能力を有する細胞を培養 した場合と （i i ) 本発明の受容体を産生する能力を有する細胞と試験化 合物の混合物を培養した場合との比較を行い、 本発明の受容体の遺伝子 の発現を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする。 上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （i ) と （i i ) の場合に おける、 本発明の受容体の遺伝子の発現量 （具体的には、 本発明の受容 体量または本発明の受容体をコードする m R N A量など） を測定して、 比較する。
、 試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 抗体、 非ペプチド 性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組 織抽出液、 血漿などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であって もよいし、 公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、 本発明ポリペプチドまた は本発明の受容体を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適し たバッファーに浮遊して調製する。 ノ ッファーには、 p H約 4〜 1 0 ( 望ましくは、 p H約 6〜 8 ) のリン酸バッファー、 ほう酸バッファ一な どの、 本発明の受容体の活性を阻害しないパッファーであればいずれで もよい。
本発明の受容体を産生する能力を有する細胞.としては、 例えば、 前述 した本発明の受容体をコードする D N Aを含有するベクターで形質転換 された宿主 （形質転換体） などが用いられる。 宿主としては、 例えば、 C H O細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。 該スクリーニングに は、 例えば、 前述の方法で培養することによって、 本発明の受容体を細 胞膜上に発現させた形質転換体などが好ましく用いられる。
本発明の受容体の蛋白質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明の 抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在す.る前記ポリペプチドまたは受 容体を、 ウエスタン解析、 E L I S A法などの方法またはそれに準じる 方法に従い測定することができる。
本発明の受容体の遺伝子の発現量は、 公知の方法、 例えば、 ノーザン ブロッティンクゃ Reverse transcription- polymerase chain react ion (RT-PCR)、 リアルタイム PCR解析システム （ABI社製、 TaQMan polymerase chain reaction) などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測 定することができる。
例えば、上記（ii)の場合における本発明の受容体の遺伝子の発現を、 上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より 好ましくは約 5 0 %以上促進する試験化合物を本発明の受容体の遺伝子 の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
、 例えば、上記（ii)の場合における本発明の受容体の遺伝子の発現を、 上記 （i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より 好ましくは約 5 0 %以上阻害する試験化合物を本発明の受容体の遺伝子 の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。 本発明の受容体の遺伝子の発現を促進 （発現量を増加） する化合物ま たはその塩は、 本発明のリガンドと同様に、 例えば、 精神疾患 （例、 統 合失調症、 不安症、 認知障害、ソ°ニック障害、 恐怖性障害、 薬物誘発性 精神病性障害、 妄想性精神病など） 、 プロラクチン分泌不全 （例、 卵巣 機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害、 甲状腺機能低下など） 、 高血 圧症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等 による体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 などの予 防 ·治療剤、 好ましくは、 統合失調症、 認知障害、 プロラクチン分泌不 全などの予防 ·治療剤として有用である。
本発明の受容体の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、 本 発明の受容体に対する本発明のリガンドが有する生理活性を抑制するこ とができるので、 例えば、 精神疾患 （例、 神経遮断薬誘発性ジスキネジ ァ、 パーキンソン病、 薬物誘発性パーキンソン症状群、 錐体外路症状な ど） 、 プロラクチン分泌過多症 〔例、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣および子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳 腫瘍、 月経異常など〕 などの予防 ·治療剤、 好ましくはパーキンソン病、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣および子宮 の萎縮など） の予防 ·治療剤などとして有用である。
本発明のスクリ一ニング方法またはスクリーニング用キットを用いて 得られる化合物またはその塩は、 例えば、 ぺプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出 液、 動物組織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物であり、 本発明の受 容体と本発明のリガンドとの結合性を変化させる化合物、 本発明の受容 体の活性または機能を促進または阻害する化合物、 本発明の受容体の遺 伝子の発現を促進または阻害 （発現量を増加または減少） する化合物な 、 どである。
該化合物の塩としては、 前記した本発明の受容体の塩と同様のものが 用いられる。
本発明のスクリ一ニング方法またはスクリーニング用キットを用いて 得られる化合物またはその塩を上記の医薬 （予防 ·治療剤など） として 使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。
該化合物またはその塩は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該 化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 ベ ヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤実 施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することがで きる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が 得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例え ば、 ゼラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結 合剤、 結晶性セルロースのような賦形剤、.コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤 滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。 調剤単位 形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料にさらに油脂のよう な液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用 水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処 方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の 補助薬を含む等張液 （例えば、 D —ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 ァ Jレコール (例えば、 エタノールなど） 、 ポリアルコール (例えば、 プロ ピレンダリコール、 ポリエチレングリコールなど） 、 非イオン性界面活 性剤 （例えば、 ポリソルベート 8 0 TM、 H C O - 5 0など） などと併用し てもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などがあげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用し てもよい。 また、 該化合物またはその塩を、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩 緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザ ルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブ ミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアル コール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製さ れた注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填さ.れる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トまたは温血動物 （例えば、 マウス、 ラッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投 与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどにより差異はある。
例えば、 統合失調症の患者 （体重 60kg当たり） に、 一日につき該化合 物 （ァゴニスト） を約 0. l〜100nig、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好まし くは約 1. 0〜20mg経口投与する。 非経口的に投与する場合、 例えば、 該化 合物を注射剤の形で統合失調症の患者 （体重 60kg当たり） に投与する場 合、 一日につき該化合物を約 0. 0 1〜30fflg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より 好ましくは約 0. l〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他 の動物の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。 例えば、 パーキンソン病の患者 （体重 60kg当たり） に、 一日につき該 化合物 （アンタゴニスト） を約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 よ り好ましくは約 1. 0〜20mg経口投与する。 非経口的に投与する場合、 例え ば、 該化合物を注射剤の形でパーキンソン病の患者 （体重 60kg当たり） に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 0 1〜30mg、 好ましくは約 0. 1 、〜20mg、より好ましくは約 0. l〜10mgを静脈注射により投与するのが好都 合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投与する ことができる。
〔 2〕 本発明の受容体が関与する各種疾病の予防 ·治療剤
本発明の受容体は、 前述したような活性を有する本発明のリガンドへ の結合活性などを有する。 従って本発明の受容体 （例、 D N A ) に異常 があったり、 欠損している場合には、 例えば、 精神疾患 （例、 統合失調 症、 不安症、 認知障害、 パニック障害、 恐怖性障害、 薬物誘発性精神病 性障害、 妄想性精神病、 神経遮断薬誘発性ジスキネジァ、 パーキンソン 病、 薬物誘発性パーキンソン症状群、 錐体外路症状など） 、 プロラクチ ン関連疾患 〔例、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣および子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 プ ロラクチン分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害、 甲状腺機能低下など） など〕 、 高血圧症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域変化症 候群 （時差ボケ） など） 〕 などとなる可能性が高い。 従って、 本発明の 受容体 （例、 D N A ) は、 例えば、 精神疾患 （例、 統合失調症、 不安症、 認知障害、 パニック障害、 恐怖性障害、 薬物誘発性精神病性障害、 妄想 性精神病、 神経遮断薬誘発性ジスキネジァ、 パーキンソン病、 薬物誘発 性パーキンソン症状群、 錐体外路症状など） 、 プロラクチン関連疾患 〔 例、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣および 子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 プロラクチン 分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害、 甲状腺機 能低下など） など〕 、 高血圧症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズ ム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時 差ボケ） など） 〕 などの予防 ·治療剤、 好ましくは、 統合失調症、 認知 障害などの予防 ·治療剤などの低毒性で安全は医薬として使用すること ができる。
本発明の受容体は、 例えば、 生体内において本発明の受容体が減少あ
、るいは欠損している患者がいる場合に、 （i ) 本発明のポリヌクレオチド を該患者に投与し、生体内で本発明の受容体を発現させることによって、 ( i i ) 細胞に本発明のポリヌクレオチドを挿入し、 本発明の受容体を発 現させた後に、 該細胞を患者に移植することによって、 または （ハ） 本 発明の受容体を該患者に投与することなどによって、 該患者における本 発明の受容体の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。 本発明のポリヌクレオチドを上記め予防 ·治療剤として使用する場合 は、 該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、 アデ ノウィルスベクタ一、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクタ 一などの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って、 ヒトまたは 温血動物に投与することができる。 本発明のポリヌクレオチドは、 その ままで、 あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる 担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイ ドロゲルカテーテルのような力 テ一テルによって投与できる。
本発明の受容体を上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 少なく とも 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さら に好ましくは 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。' 本発明の受容体は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセ ル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 または 水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸 濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明の受 容体を生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単 位用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤 における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにす るものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例え ば、 ゼラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結 合剤、 結晶性セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、
、アルギン酸などのような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤 滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような香味剤などが用いられる。 調剤単位 形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料にさらに油脂のよう な液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用 水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処 方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の 補助薬を含む等張液 （例えば、 D —ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などがあげられ、 適当な.溶解補助剤、 例えば、 ァ ルコール （例えば、 エタノールなど） 、 ポリアルコール （例えば、 プロ ピレングリコール、 ポリエチレングリコールなど） 、 非イオン性界面活 性剤 （例えば、 ポリソルベート 8 0 TM、 H C〇一 5 0など） などと併用し てもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などがあげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用し てもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩 衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコ ールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当な アンプルに充填される。
本発明のポリヌクレオチド （例、 D N A ) が挿入されたベクターも上 記と同様に製剤化され、 通常、 非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは温血動物 （例えば、 ラッ ト、 マウス、 モルモッ ト、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） に対して 投与することができる。
本発明の受容体の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ 、 り差異はあるが、 例えば、 パーキンソン病の治療目的で本発明の受容体 を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一 日につき該受容体を約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好まし くは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該受容体の 1回 投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 パーキ ンソン病の治療目的で本発明の受容体を注射剤の形で成人 （体重 60kgと して） に投与する場合、 一日につき該受容体を約 0. 0 1〜30mg、 好ましく は約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0. l〜10mgを患部に注射することによ り投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換 算した量を投与することができる。
〔3〕 本発明の受容体の定量
本発明の抗体は、 本発明の受容体を特異的に認識することができるの で、 被検液中の本発明の受容体の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法に よる定量などに使用することができる。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明の受容体とを 競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明の受容体め割 合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の受容体の定量法、 お よび ( i i ) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本 発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体 上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明の受容 体の定量法を提供する。
上記 （i i ) の定量法においては、 一方の抗体が本発明の受容体の N端 部を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明の受容体の C端部に反応する 抗体であることが望ましい。
また、 本発明の受容体に対するモノクローナル抗体を用いて本発明の 受容体の定量を行うことができるほか、 組織染色等による検出を行なう こともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 、また、 抗体分子の F b ' ) 2、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いても よい。
本発明の抗体を用いる本発明の受容体の定量法は、 特に制限されるべ きものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 ポリペプチド量） に対 応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的 手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した 標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもょレ 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメ トリック法およびサンドィ ツチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述す.るサンドィ ツチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射 性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位 元素としては、 例えば、 〔 I〕 、 〔1311〕 、 〔 、 〔14c〕 などが用い られる。 上記酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例 えば、 j8—ガラクトシダ一ゼ、 /3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスフ ァ夕ーゼ、 パ一ォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンィゾチ オシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノー ル、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を 用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 ま た通常ポリべプチドあるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられ る化学結合を用いる方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキス トラン、 セルロースなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリル アミ ド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいはガラス等があげられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に 被検液を反応させ （ 1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノク 口一ナル抗体を反応させ （ 2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の 、活性を測定することにより被検液中の受容体量を定量することができる。
1次反応と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよ いし時間をずらして行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前 記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測 定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず しも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種類 以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法による本発明の受容体の測定法においては、 1次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発 明の受容体の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すな わち、 1次反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応 で用いられる抗体が、 本発明の受容体の C端部を認識する場合、 1次反 応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識す る抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリ一などに用 いることができる。
競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反 応させたのち、 未反応の標識抗原 （F ) と、 抗体と結合した標識抗原 （ B ) とを分離し （B Z F分離） 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被 検液中の抗原量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用 レ B Z F分離をポリエチレングリコール、 前記抗体に対する第 2抗体 などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体として固相化抗体を 用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の 標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるい は、 被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗 原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分
、離する。 次に、 いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量 する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の 結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かで あり、 少量の沈降物しか得られない場合にもレーザ一の散乱を利用する レーザ—ネフロメ トリ一などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたつ ては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法に おける通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加.えて本発明 の受容体の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細 については、 総説、 成書などを参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年 発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年 発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行 ) 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7 年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭 和 6 2年発行） 、 rMe thods in ENZYMOLOGYj Vol. 70 (I腿 unochemicial Techni Ques (Par t A) )、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Tec ni aues (Part B) )、 同書 Vol. 74 (I匪 imochemical Techni aues (Part C) )、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D ： Selected Immunoassays) ) , 同 書 Vol. 92 (Immunochemical Techniaues (Part E ： Monoclonal Antibodies and General Im匪 oassay Methods) )、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniaues (Part I ： Hybr idoma Technology and Monoclonal
Antibodies) ) (以上、 アカデミックプレス社発行）などを参照することが できる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明の受 容体を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明の受容体の濃度を定量するこ とによって、 本発明の受容体の濃度の増加が検出された場合、 例えば、
、精神疾患 （例、 統合失調症、 不安症、 認知障害、 パニック障害、 恐怖性 障害、 薬物誘発性精神病性障害、 妄想性精神病、 神経遮断薬誘発性ジス キネジァ、 パーキンソン病、 薬物誘発性パーキンソン症状群、 錐体外路 症状など） 、 プロラクチン関連疾患 〔例、 高プロラクチン血症 （例、 不 妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣および子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 プロラクチン分泌不全 (例、 卵巣機能低下症、 精 嚢発育不全、 更年期障害、 甲状腺機能低下など） など〕 、 高血圧症、 睡 眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体 調の変調、 時間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 などの疾病 （特に、 統合失調症、 認知障害、 プロラクチン分泌不全など） である、 または将 来罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 本発明の受容 体の濃度の減少が検出された場合には、 例えば、 精神疾患 （例、 統合失 調症、 不安症、 認知障害、 パニック障害、 恐怖性障害、 薬物誘発性精神 病性障害、 妄想性精神病、 神経遮断薬誘発性ジスキネジァ、 パーキンソ ン病、 薬物誘発性パーキンソン症状群、 錐体外路症状など） 、 プロラク チン関連疾患 〔例、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月 経、 卵巣および子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 プロラクチン分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障 害、 甲状腺機能低下など） など〕 、 高血圧症、 睡眠障害 〔例、 原発性不 眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域変 化症候群 （時差ボケ） など） 〕 などの疾病 （特に、 パーキンソン病、 高 プロラクチン血症など） である、 または将来罹患する可能性が高いと診 断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明 の受容体を検出するために使用することができる。 また、 本発明の受容 体を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本 発明の受容体の検出、 被検細胞内における本発明の受容体の挙動の分析 などのために使用することができる。 〔4〕 遺伝子診断薬
本発明のポリヌクレオチド （DNA) は、 例えば、 プローブとして使 用することにより、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモ ット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） における本発明の受容体をコードする D NAまたは mRNAの異 常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 DNAまた は mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mR N Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。 本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 公知のノーザ ンハイブリダィゼーションゃ P CR— S S C P法 （Genomics, 第 5巻， 874 〜879頁 (1989年)、 Proceedings of the Nat ional Academy of Sciences of the United States of America，第 86巻， 2766〜2770頁（1989年）） などに より実施することができる。
例えば、 本発明の受容体の遺伝子の発現過多が検出された場合は、 例 えば、 精神疾患 （例、 統合失調症、 不安症、 認知障害、 パニック障害、 恐怖性障害、 薬物誘発性精神病性障害、 妄想性精神病、 神経遮断薬誘発 性ジスキネジァ、 パーキンソン病、 薬物誘発性パーキンソン症状群、 錐 体外路症状など） 、 プロラクチン関連疾患 〔例、 高プロラクチン血症 （ 例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣および子宮の萎縮など） 、 下垂体 腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 プロラクチン分泌不全 (例、 卵巣機能低 下症、 精嚢発育不全、 更年期障害、 甲状腺機能低下など） など〕 、 高血 圧症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等 による体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 などの疾 病 （特に、 統合失調症、 認知障害、 プロラクチン分泌不全など） である、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 本発 明の受容体の遺伝子の発現減少が検出された場合は、 例えば、 精神疾患 (例、 統合失調症、 不安症、 認知障害、 パニック障害、 恐怖性障害、 薬 物誘発性精神病性障害、妄想性精神病、神経遮断薬誘発性ジスキネジァ、 パーキンソン病、薬物誘発性パーキンソン症状群、錐体外路症状など）、 、プロラクチン関連疾患 〔例、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏 出、 無月経、 卵巣および子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 プロラクチン分泌不全（例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害、 甲状腺機能低下など） など〕 、 高血圧症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時 間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 などの疾病 （特に、 パーキンソ ン病、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣およ び子宮の萎縮など） など） である、 または将来罹患する可能性が高いと 診断することができる。
〔5〕 アンチセンスポリヌクレオチド (例、 D N A ) を含有する医薬 本発明のポリヌクレオチド （例、 D N A ) に相補的に結合し、 該ポリ ヌクレオチド （例、 D N A ) の発 ¾を抑制することができるアンチセン スポリヌクレオチド （例、 アンチセンス D N A ) は、 例えば、 精神疾患 (例、 統合失調症、 不安症、 認知障害、 パニック障害、 恐怖性障害、 薬 物誘発性精神病性障害、妄想性精神病、神経遮断薬誘発性ジスキネジァ、 パーキンソン病、薬物誘発性パーキンソン症状群、錐体外路症状など）、 プロラクチン関連疾患 〔例、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏 出、 無月経、 卵巣および子宮の萎縮など） .、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 プロラクチン分泌不全（例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害、 甲状腺機能低下など） など〕 、 高血圧症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時 間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 などの予防 ·治療剤、 特に、 パ 一キンソン病、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣および子宮の萎縮など） などの予防 ·治療剤などの低毒性で安全な 医薬として有用である。
例えば、 上記アンチセンス D N Aを用いる場合、 該アンチセンス D N Aを単独あるいはレトロウィルスベクタ一、 アデノウィルスベクタ一、 アデノウイルスァソシェ一テッ ドウィルスベクタ一などの適当なベクタ 一に挿入した後、 常套手段に従って実施することができる。 該アンチセ 、ンス D N Aは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤などの生 理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイ ドロゲル力 テーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、 該アンチセンス D N Aは、 組織や細胞における本発明の D N Aの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプロ —ブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明の受容体をコ一 ドする R N Aの一部を含有する二重鎖 R N A (本発明の受容体に対する s i R N A (sma l l (shor t) interfer ing RNA)、 s h R N A (smal l (short) ha i rp in RNA)など） 、 本発明の受容体をコードする R N Aの一部を含有 するリポザィムなども、 本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制するこ とができ、 生体内における本発明の受容体または本発明のポリヌクレオ チドの機能を抑制することができるので、 例えば、 精神疾患 （例、 統合 失調症、 不安症、 認知障害、 パニック障害、 恐怖性障害、 薬物誘発性精 神病性障害、 妄想性精神病、 神経遮断薬誘発性ジスキネジァ、 パーキン ソン病、 薬物誘発性パーキンソン症状群、 錐体外路症状など） 、 プロラ クチン関連疾患 〔例、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、—無 月経、 卵巣および子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異 常、 プロラクチン分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年 期障害、 甲状腺機能低下など） など〕 、 高血圧症、 睡眠障害 〔例、 原発 性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯 域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 などの予防 ·治療剤、 好ましくはパ 一キンソン病、 高プロラクチン血症などの予防 ·治療剤などの低毒性で 安全な医薬として有用である。
二重鎖 R N Aは、 公知の方法 （例、 Na t ure, 41 1巻， 494頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造するこ とができる。
リポザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Mol ecul ar Med i c ine, 7 巻， 221頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に 、設計して製造することができる。 例えば、 本発明の受容体をコードする R N Aの一部に公知のリポザィムを連結することによって製造すること ができる。本発明の本発明の受容体をコ一ドする R N Aの一部としては、 公知のリポザィムによって切断され得る本発明の R N A上の切断部位に 近接した部分 （R N A断片） が挙げられる。
上記の二重鎖 R N Aまたはリポザィムを上記予防 ·治療剤として使用 する場合、 アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与 することができる。
上記アンチセンスボリヌクレオチドと同様に、 本発明の受容体に対す るアブ夕マーなども、 例えば、 精神疾患 （例、 統合失調症、 不安症、 認 知障害、 パニック障害、 恐怖性障害、 薬物誘 ¾性精神病性障害、 妄想性 精神病、 神経遮断薬誘発性ジスキネジァ、 パーキンソン病、 薬物誘発性 パーキンソン症状群、 錐体外路症状など） 、 プロラクチン関連疾患〔例、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣および子宮 の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 プロラクチン分泌 不全 （例、 卵巣機能低下症、 ·精嚢発育不全、 更年期障害、 甲状腺機能低 下など） など〕 、 高血圧症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障 害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時差ポ ケ） など） 〕 などの予防 ·治療剤、 好ましくはパーキンソン病、 高プロ ラクチン血症などの予防 ·治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用 である。
ァプタマ一は、 公知の方法、 例えば SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) 法 (Annual Review of Medicine56 巻， 555- 583頁， 2005年） を用いて取得する。 アブタマ一の構造は、 公知 の方法を用いて決定することができ、 その構造を基に、 公知の方法に従 いアブタマ一を製造する。
上記のアブタマ一を医薬として使用する場合、 アンチセンスポリヌク レオチドと同様にして製剤化し、 投与することができる。
〔6〕 本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体は、 例えば精神疾患 （例、 統合失調症、 不安症、 認知障 害、 パニック障害、 恐怖性障害、 薬物誘発性精神病性障害、 妄想性精神 病、 神経遮断薬誘発性ジスキネジァ、 パーキンソン病、 薬物誘発性パー キンソン症状群、 錐体外路症状など） 、 プロラクチン関連疾患 〔例、 高 プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣および子宮の 萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 プロラクチン分泌不 全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害、 甲状腺機能低下 など） など〕 、 高血圧症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 (例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域変化症候群.（時差ボケ ) など） 〕 などの予防 ·治療剤、 好ましくはパーキンソン病、 高プロラ クチン血症などの予防 ·治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用で ある。
本発明の抗体を含有する上記医薬は、 そのまま液剤として、 または適 当な剤型の医薬組成物として、 ヒトゃ温血動物 （例、 ラッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非 経口的に投与することができる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 パーキンソン病の患者の 治療のために使用する場合には、本発明の抗体を 1回量として、通常 0.01 〜20mg/kg体重程度、 好ましくは 0. l〜10mg/kg体重程度、 さらに好ましく は 0. l〜5mg/kg体重程度を、 1 日 1〜 5回程度、 好ましくは 1 日 1〜 3回 程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与およ び経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特 に重い場合には、 その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与するこ とができる。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記またはその塩と 薬理学的に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであ る。 かかる組成物は、 経口または非経口投与に適する剤形として提供さ れる。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液 、体の剤形、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロッ プ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあげられる。 かかる組成物は公知の方法によ つて製造され、 製剤分野において通常用いられる担体、 希釈剤もしくは 賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。 非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用 いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤などの剤形を包含する。 かかる注射剤は、 公知の方法に従つ て、 例えば、 上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水 性もしくは油性液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補 助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコ ール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレンダリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルべ一ト 8 0、 H C O— 5 0 (po lyoxye thyl ene (50ΜΟ 1) adduc t o f hydrogena t ed cas t or o i l ) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ 油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベン ジルアルコールなどを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適 当なアンプルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体ま たはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。 上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合 するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投 薬単位の剤形としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示され、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜 5 0 0 m g、 とりわけ注射剤では 5〜 1 0 0 m g、 その他の剤形では 1 0〜 2 5 0 m gの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互 作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
、 〔 7 a〕本発明の受容体または本発明のリガンドの活性を促進する化合物 またはその塩、 または本発明のリガンドを含有してなる統合失調症また は認知障害の予防 ·治療剤
「本発明の受容体または本発明のリガンドの活性を促進する化合物ま たはその塩」 としては、 本発明の受容体または本発明のリガンドの活性 を促進する化合物 （例、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化 合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽 出液、 血漿など） またはその塩であればよい。 該塩としては、 前記した 本発明の受容体の塩と同様のものが用いられる。
該化合物またはその塩、 およびリガンドは、 医薬 （予防 ·治療剤など ) として使用する場合、 本発明のスクリーニング方法またはスクリー二 ング用キッ トを用いて得られる化合物またはその塩と同様、 常套手段に 従って実施することができる。
〔 7 b〕本発明の受容体または本発明のリガンドの活性を促進する化合物 またはその塩、 または本発明のリガンドを含有してなるプロラクチンの 分泌不全の予防 ·治療剤
「本発明の受容体または本発明のリガンドの活性を促進する化合物ま たはその塩」 としては、 本発明の受容体または本発明のリガンドの活性 を促進する化合物 （例、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化 合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽 出液、 血漿など） またはその塩であればよい。 該塩としては、 前記した 本発明の受容体の塩と同様のものが用いられる。
該化合物またはその塩、 およびリガンドは、 医薬 （予防 ·治療剤など ) として使用する場合、 本発明のスクリーニング方法またはスクリー二 ング用キッ トを用いて得られる化合物またはその塩と同様、 常套手段に 従って実施することができる。
〔 8 a〕本発明の受容体または本発明のリガンドの活性を阻害する化合物 またはその塩を含有してなるパーキンソン病の予防 ·治療剤
「本発明の受容体または本発明のリガンドの活性を阻害する化合物ま 、たはその塩」 としては、 本発明の受容体または本発明のリガンドの活性 を阻害する化合物 （例、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化 合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽 出液、 血漿など） またはその塩であればよい。 該塩としては、 前記した 本発明の受容体の塩と同様のものが用いられる。
該化合物またはその塩は、 本発明のスクリーニング方法またはスクリ 一二ング用キッ トを用いて得られる化合物またはその塩と同様、 医薬 （ 予防 ·治療剤など） として使用する場合、 常套手段に従って実施するこ とができる。
〔 8 b〕本発明の受容体または本発明のリガンドの活性を阻害する化合物 またはその塩を含有してなる高プロラクチン血症の予防 ·治療剤
「本発明の受容体または本発明のリガンドの活性を阻害する化合物ま たはその塩」 としては、 本発明の受容体または本発明のリガンドの活性 を阻害する化合物 （例、 ペプチド、 タンパク質、 抗体、 非ペプチド性化 合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽 出液、 血漿など） またはその塩であればよい。 該塩としては、 前記した 本発明の受容体の塩と同様のものが用いられる。 ' 該化合物またはその塩は、 本発明のスクリ一ニング方法またはスクリ 一二ング用キットを用いて得られる化合物またはその塩と同様、 医薬 （ 予防 ·治療剤など） として使用する場合、 常套手段に従って実施するこ とができる。
〔9〕 DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明の受容体をコードする DN A (以下、 本発 明の外来性 DN Aと略記する） またはその変異 DN A (本発明の外来性 変異 DN Aと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。 すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒ卜哺乳 動物、
(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （ 1 ) 記載の動物、 (3) ゲッ歯動物がマウスまたはラッ トである上記 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物 において発現しうる組換えベクターなどを提供する。
本発明の外来性 DN Aまたはその変異 D N Aを有する非ヒ卜哺乳動物 (以下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非 ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞 または受精卵細胞の段階でかつ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシ ゥム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジ ェクシヨン法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキストラン法などに より目的とする DN Aを転移することによって作出することができる。 また、 該 DN A転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに 目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培養などに 利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細 胞融合法により融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出す ることもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサ ギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用い られる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生 物サイクルが比較的短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマ ウス （例えば、 純系として、 C 5 7 B LZ6系統， D BA 2系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 F,系統， BD F,系統， B 6 D 2 F,系統， BA L B / c系統， I C R系統など） またはラッ ト （例えば、 W i s t a r , S Dなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 と しては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 D N Aとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明 の DNAではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の D 、 N Aをいう。
本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 (例えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠 損、 他の塩基への置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。
該異常 DN Aとしては、 異常な本発明の受容体を発現させる DN Aを 意味し、 例えば、 正常な本発明の受容体の機能を抑制するポリペプチド を発現させる DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 D N Aは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどち らの哺乳動物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に 転移させるにあたっては、 該 DNAを動物細嗨で発現させうるプロモー ターの下流に結合した DN Aコンストラク トとして用いるのが一般に有 利である。 例えば、 本発明のヒト DNAを転移させる場合、 これと相同 性が高い本発明の DN Aを有する各種哺乳動物（例えば、 ゥサギ、ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムス夕一、 ラッ ト、 マウスなど） 由来の DNAを 発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒ卜 DN Aを結合し た DNAコンストラク ト （例、ベクターなど） を対象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本 発明の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出することができる。 本発明の受容体の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド、 枯草菌由来のプラスミ ド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバ クテリオファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ヮ クシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用 いられる。 なかでも、 大腸菌由来のプラスミ ド、 枯草菌由来のプラスミ ドまたは酵母由来のプラスミ ドなどが好ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 （i ) ゥィルス (例、 シミアンウィルス、 サイ トメガロウィルス、 モロニ一 白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど) に由来する D N Aのプロモーター、 （ii) 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 、ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター、 ラッ ト、 マウスなど） 由来のプ 口モーター、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋クレアチンキナー ゼ、 グリア線維性酸性蛋白質、 ダルタチオン S—トランスフェラーゼ、 血小板由来成長因子 /3、 ケラチン K l， 1^ 1 0ぉょび 1 4、 コラーゲ ン I型および I I型、 サイクリック AMP依存蛋白質キナーゼ 3 Iサブ ユニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファタ一ゼ、 心房ナ卜リゥム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナトリゥムカリゥムアデノシン 3リ.ン酸化酵素 (N a , K— AT P a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタロチォ ネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティナ一ゼ 1組織インヒビ夕一、 M HCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ド一パミン β - 水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （ΤΡΟ) 、 ポリペプチド鎖延長 因子 1 a (E F— 1 ひ） 、 βァクチン、 ひおよび jSミオシン重鎖、 ミオ シン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎蛋白質、 チログロブリン、 Th y— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイ ド Pコンポ —ネント、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑筋 ァクチン、 プレブ口 エンケファリン八、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発現することが可能なサイトメガロウィルスプロモ —ター、 ヒトポリペプチド鎖延長因子 1 ひ ( E F - 1 ) のプロモータ ―、 ヒトおよびニヮトリ ]3ァクチンプロモー夕一などが好適である。 上記ベクターは、 D N A転移哺乳動物において目的とするメッセンジ ヤー R N Aの転写を終結する配列 （一般にターミネタ一と呼ばれる） を 有していることが好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物 由来の各 D N Aの配列を用いることができ、 好ましくは、 シミアンウイ ルスの S V 4 0夕一ミネ夕一などが用いられる。
その他、 目的とする外来性 D N Aをさらに高発現させる目的で各 D N Aのスプライシングシグナル、 ェンハンサ一領域、 真核 D N Aのイント ロンの一部などをプロモーター領域の 5， 上流、 プロモータ一領域と翻 、訳領域間あるいは翻訳領域の 3 '下流 に連結することも目的により可能 である。
正常な本発明の受容体の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺乳動物 （例え ば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモッ ト、 ハムスター、 ラッ ト、 マウスな ど） 由来の肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 D N Aおよび市販 の各種ゲノム D N Aライブラリーよりゲノム D N Aの全てあるいは一部 として、 または肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 R N Aより公 知の方法により調製された相補 D N Aを原料として取得することが出来 る。 また、 外来性の異常 D N Aは、 上記の細胞または組織より得られた 正常なポリべプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳 領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる D N Aコンストラクトとし て、 前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に 連結させる通常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動 物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D N Aが存在 することは、 作出動物の後代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のす ベてに本発明の外来性 D N Aを保持することを意味する。 本発明の外来 性 D N Aを受け継'いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞 のすべてに本発明の外来性 D N Aを有する。
本発明の外来性正常 D N Aを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配によ り外来性 D N Aを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物と して通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動 物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過 剰に存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有することを意味する。 本発明 、の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および 体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有する。
導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に 有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常 D N Aを有する非ヒ卜哺乳動物は、 本発明の正常 D N A が高発現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することに より最終的に本発明の受容体の機能亢進症を発症することがあり、 その 病態モデル動物として利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D N A転移動物を用いて、 本発明の受容体の機能亢進症や、 本発明の受容 体が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検 討を行なうことが可能である。
また、 本発明の外来性正常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した 本発明の受容体の増加症状を有することから、 本発明の受容体に関連す る疾患 〔例、 精神疾患 （例、 統合失調症、 不安症、 認知障害、 パニック 障害、 恐怖性障害、 薬物誘発性精神病性障害、 妄想性精神病、 神経遮断 薬誘発性ジスキネジァ、 パーキンソン病、 薬物誘発性パーキンソン症状 群、 錐体外路症状など） 、 プロラクチン関連疾患 〔例、 高プロラクチン 血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣および子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 プロラクチン分泌不全 (例、 卵巣 機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害、 甲状腺機能低下など） など〕 、 高血圧症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤 務等による体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 など 〕 に対する予防 ·治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配に より外来性 D NAを安定に保持することを確認して該 DNA保有動物と して通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする 外来 D N Aを前述のプラスミ ドに組み込んで原科として用いることがで きる。 プロモータ一との D N Aコンストラク トは、 通常の DNA工学的 、手法によって作製することができる。 受精卵細胞段階における本発明の 異常 DN Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存 在するように確保される。 DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において 本発明の異常 DN Aが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞および体細胞の全てに本発明の異常 DNAを有することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細 胞および体細胞の全てに本発明の異常 DN Aを有する。 導入 DNAを相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を 交配することによりすベての子孫が該 DN Aを有するように繁殖継代す ることができる。
本発明の異常 DNAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 DNA が高発現させられており、 内在性の正常 DN Aの機能を阻害することに より最終的に本発明の受容体の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物として利用することができる。 例えば、 本発明の異 常 DNA転移動物を用いて、 本発明の受容体の機能不活性型不応症の病 態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能であ る。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 DNA高発現動物 は、 本発明の受容体の機能不活性型不応症における本発明の異常ポリべ プチドまたは本発明の異常受容体による正常ポリべプチドまたは受容体 の機能阻害 （dominant negat ive作用） を解明するモデルとなる。
また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本 発明の受容体の増加症状を有することから、 本発明の受容体の機能不活 性型不応症に対する治療薬スクリ一ニング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性と して、 例えば、
( i) 組織培養のための細胞源としての使用、
( i i) 本発明の D N A転移動物の組織中の D N Aもしくは R N Aを直接 分析するか、 または D N Aにより発現されたポリペプチドまたは受容体
、組織を分析することによる、 本発明の受容体により特異的に発現あるい は活性化するポリペプチドまたは受容体との関連性についての解析、
( i i i) D N Aを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 こ れらを使用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
( iv) 上記 （i i i) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるよ うな薬剤のスクリーニング、 および
(v)本発明の変異ポリべプチドまたは受容体を単離精製およびその抗体 作製
などが考えられる。
さらに、 本発明の D N A転移動物を用いて、 本発明の受容体の機能不 活性型不応症などを含む、 本発明の受容体に関連する疾患 〔例、 精神疾 患 （例、 統合失調症、 不安症、 認知障害、 パニック障害、 恐怖性障害、 薬物誘発性精神病性障害、 妄想性精神病、 神経遮断薬誘発性ジスキネジ ァ、 パーキンソン病、 薬物誘発性パーキンソン症状群、 錐体外路症状な ど）. 、 プロラクチン関連疾患 〔例、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣および子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳 腫瘍、 月経異常、 プロラクチン分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発 育不全、 更年期障害、 甲状腺機能低下など） など〕 、 高血圧症、 睡眠障 害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の 変調、 時間帯域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 など〕 の臨床症状を調 ベることができ、 また、 本発明の受容体に関連する疾患モデルの各臓器 におけるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さ らには、 該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することがで きる。
また、 本発明の DNA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリ プシンなどの蛋白質分解酵素により、 遊離した DN A転移細胞の取得、 その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さら に、 本発明の受容体産生細胞の特定化、 アポ卜一シス、 分化あるいは増 殖との関連性、 またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それら 、の異常を調べることなどができ、 本発明の受容体およびその作用解明の ための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明の受容体の機能不 活性型不応症を含む、 本発明の受容体に関連する疾患の治療薬の開発を 行なうために、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な 該疾患治療薬のスクリ一ニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DNA転移動物または本発明の外来性 DNA発現ベクターを用 いて、 本発明の受容体が関連する疾患の DNA治療法を検討、 開発する ことが可能である。
〔 1 0〕 ノックァゥト動物
本発明は、 本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 および本発明の DN A発現不全非ヒ卜哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、 (2 ) 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の j3—ガラクトシ ダーゼ遺伝子） を導入することにより不活性化された上記 （ 1 ) 記載の 胚幹細胞、
(3 ) ネオマイシン耐性である上記 （ 1 ) .記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （ 1 ) 記載の胚幹細胞、 ( 5 ) ゲッ歯動物がマウスである上記 ( 4 ) 記載の胚幹細胞、
( 6 ) 本発明の DN Aが不活性化された該 DN A発現不全非ヒト哺乳動 物、
( 7 ) 該 DN Aがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の j3—ガラクトシ ダーゼ遺伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝 子が本発明の DNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記 （ 6 ) 記載の非ヒト哺乳動物、
( 8 ) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記 （6 ) 記載の非ヒト哺乳 動物、
( 9 ) ゲッ歯動物がマウスである上記 （ 8 ) 記載の非ヒト哺乳動物、 お 、よび
( 1 0) 上記 （ 7 ) 記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポ一夕一遺 伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモ 一ター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ一二ング 方法を提供する。
本発明の DNAが不活性化された非ヒ卜哺乳動物胚幹細胞とは、 該非 ヒ卜哺乳動物が有する本発明の DN Aに人為的に変異を加えることによ り、 DNAの発現能を抑制するか、 あるいは該 DNAがコードしている 本発明の受容体の活性を実質的に喪失させることにより、 DN Aが実質 的に本発明の受容体の発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある） 非ヒト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 E S細 胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝 子工学的手法により該 DNA配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを揷 入または置換させることによって行なうことができる。 これらの変異に より、 例えば、 コドンの読み取り枠をずらしたり、 プロモータ一あるい はェキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウト DNAを 作製すればよい。 · 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本 発明の DNA不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と 略記する） の具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有 する本発明の DN Aを単離し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺 伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、 ある いは l a c Z ( )3—ガラクトシダ一ゼ遺伝子） 、 c a t (クロラムフエ ニコールァセチルトランスフェラ一ゼ遺伝子） を代表とするレポーター 遺伝子等を揷入することによりェキソンの機能を破壊するか、 あるいは ェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DN A配列 （ 例えば、 p o 1 y A付加シグナルなど) を挿入し、 完全なメッセンジャ 、一 RN Aを合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊する ように構築した DNA配列を有する DNA鎖 （以下、 夕一ゲッティング ベクタ一と略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に 導入し、 得られた E S細胞について本発明の DN A上あるいはその近傍 の DN A配列をプロ一ブとしたサザンハイブリダィゼーション解析ある いはターゲッティングベクター上の DN A配列と夕一ゲッティングべク 夕一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列をブラ イマ一とした P C R法により解析し、 本発明のノックアウト E S細胞を 選別することにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の E S 細胞としては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよ く、 また公知 Evansと Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよ レ 。 例えば、 マウスの E S細胞の場合、 現在、 一般的には 1 2 9系の E S細胞が使用されているが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかな E S細胞を取得す るなどの目的で例えば、 C 578 //6マゥスゃ〇 5 7 B LZ6の採卵 数の少なさを D B A / 2との交雑により改善した B D マウス （C'5 7 B L/6と D BAZ2との Fj) を用いて樹立したものなども良好に用い うる。 BD F,マウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという利 点に加えて、 C 5 7 B L / 6マウスを背景に持つので、 これを用いて得 られた E S細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 5 7 B L / 6マ ウスとバッククロスすることでその遺伝的背景を C 5 7 B L Z 6マウス に代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、 E S細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3 . 5 日目の胚盤胞を 使用するが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いる ことにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの E S細胞を用いてもよいが、 通常雄の E S細胞の 方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手 間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望まし
、い。
E S細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 ？じ 法にょり丫染色 体上の性決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあ げることができる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに 約 1 0 6個の細胞数を要していたのに対して、 1コロニー程度の E S細胞 数 （約 5 0個） で済むので、 培養初期における E S細胞の第一次セレク ションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、 早期に雄細胞の選定を 可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法に よる染色体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染 色体数は正常数の 1 0 0 %が望ましいが、 樹 ¾の際の物理的操作等の関 係上困難な場合は、 E S細胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 (例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 4 0である細胞） に再びクロー ニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良い力 個体発生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養するごとが必 要である。 例えば、 S T O繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上 で L I F ( 1〜 10000 ϋ/πι1) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5 %炭酸ガス、 9 5 %空気または 5 %酸素、 5 %炭酸ガス、 9 0 %空気） で約 3 7 °Cで培養するなどの方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリ プシン ZE D T A溶液（通常 0.001〜0.5%トリプシン/ 0.1〜5 mM EDTA、 好ましくは約 0.1%トリプシン Zl mM EDTA) 処理により単細胞化し、 新 たに用意したフィーダ一細胞上に播種する方法などがとられる。 このよ うな継代は、 通常 1〜 3 日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄すること が望まれる。
E S細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓 筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. 、Evans及び M. H. Kaufman, Nature 第 292巻、 154頁、 1981年； G. R. Martin Pro Natl. Acad. Sci. U. S.A. 第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナル ' ォブ ' ェンブリオ口ジ一 ' アンド 'ェクスペリメン夕 ル - モルフォロジ一、 第 87巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分 化させて得られる本発明の DNA発現不全細胞は、 インビト口における 本発明の受容体の細胞生物学的検討において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公 知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正 常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにし て作製した夕一ゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵 細胞に導入し、 導入により夕一ゲッティングベクターの本発明の DN A が不活性化された DNA配列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細 胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明の DN Aと入れ換わる相同組 換えをさせることにより、 本発明の DN Aをノックアウトさせることが できる。
本発明の DNAがノックァゥ卜された細胞は、 本発明の DNA上また はその近傍の DNA配列をプローブとしたサザンハイプリダイゼーショ ン解析または夕ーゲッティングベクター上の D N A配列と、 夕一ゲッテ ィングベクターに使用したマウス由来の本発明の D N A以外の近傍領域 の D N A配列とをプライマーとした P C R法による解析で判定すること ができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、 遺伝子相同組換え により、 本発明の D N Aが不活性化された細胞株をクローニングし、 そ の細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤 胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D N A座をもつ細胞と人 為的に変異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成されるキ メラ動物である。
、 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D N A座をもつ場 合、 このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個 体群より、 全ての組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ 細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別す ることにより得られる。 このようにして得られた個体は、 通常、 本発明 の受容体のへテロ発現不全個体であり、 本発明の受容体のへテロ発現不 全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発明の受容体のホモ発現不全 個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェク ション法で D N A溶液を注入することにより夕ーゲッティングベクター を染色体内に導入したトランスジエニック非ヒ.ト哺乳動物を得ることが でき、 これらのトランスジエニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相 同組換えにより本発明の D N A座に変異のあるものを選択することによ り得られる。
このようにして本発明の D N Aがノックアウトされている個体は、 交 配により得られた動物個体も該 D N Aがノックァゥトされていることを 確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。 ― さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 す なわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し うる。得られたホモザィゴート動物は、母親動物に対して、正常個体 1 , ホモザィゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得 ることができる。 ヘテロザィゴ一ト動物の雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴ一トおよびへテロザィゴ一ト動物を 繁殖継代する。
本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明 の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。 また、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の受容体に より誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明の受容体の生 、物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの 疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
本発明は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を 投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の D N Aに対するプロモー夕一の活性を促進または阻害する化合物または その塩のスクリ一ニング方法を提供する。
上記スクリ一二ング方法において、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺 乳動物としては、 前記した本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物の中 でも、 本発明の D N Aがレポ一夕一遺伝子を導入することにより不活性 化され、 該レポーター遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモーターの 制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 3—ガラ クトシダ一ゼ遺伝子 （ 1 a c Z ) 、 可溶性アル力リフォスファターゼ遺 伝子またはルシフエラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の D N Aをレポーター遺伝子で置換された本発明の D N A発現 不全非ヒト哺乳動物では、 レポ一夕一遺伝子が本発明の D N Aに対する プロモーターの支配下に存在するので、 レポ一夕一遺伝子がコードする 物質の発現をトレースすることにより、 プロモ一夕一の活性を検出する ことができる。
例えば、 本発明の受容体をコードする D N A領域の一部を大腸菌由来 の ]3—ガラク トシダーゼ遺伝子（ 1 a c Z )で置換している場合、本来、 本発明の受容体の発現する組織で、 本発明の受容体の代わりに j8—ガラ ク トシダ一ゼが発現する。 従って、 例えば、 '5—プロモー 4一クロ口— 3—インドリル一 /3—ガラクトピラノシド （X— g a l ) のような /3— ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、 簡便 に本発明の受容体の動物生体内における発現状態を観察することができ る。 具体的には、 本発明の受容体欠損マウスまたはその組織切片をグル タルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理食塩液 （P B S ) で洗浄 、後、 X— g a 1 を含む染色液で、 室温または 3 7 °C付近で、 約 3 0分な いし 1時間反応させた後、組織標本を 1 m M E D T A Z P B S溶液で洗 浄することによって、 j8—ガラクトシダ一ゼ反応を停止させ、 呈色を観 察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする m R N Aを検 出してもよい。
上記スクリ一二ング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上 記した試験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対する プロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や 塩基 （例、 有機酸など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許 容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （ 例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機 酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハ ク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン 酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。
本発明の D N Aに対するプロモーター活性を促進する化合物またはそ の塩は、 本発明の受容体の発現を促進し、 本発明の受容体の活性または 機能を促進することができるので、 例えば、 精神疾患（例、 統合失調症、 不安症、 認知障害、 パニック障害、 恐怖性障害、 薬物誘発性精神病性障 害、 妄想性精神病、 神経遮断薬誘発性ジスキネジァ、 パーキンソン病、 薬物誘発性パーキンソン症状群、 錐体外路症状など） 、 プロラクチン関 連疾患 〔例、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵 巣および子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 プロ ラクチン分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害、 甲状腺機能低下など） など〕 、 高血圧症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域変化症 候群 （時差ボケ） など） 〕 などの予防 ·治療剤、 特に、 統合失調症、 認 知障害、 プロラクチン分泌不全などの低毒性で安全な医薬として有用で 、ある。
また、 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を阻害する化合物ま たはその塩は、 本発明の受容体の発現を阻害し、 本発明の受容体の活性 または機能を阻害することができるので、 例えば、 精神疾患 （例、 統合 失調症、 不安症、 認知障害、 パニック障害、 恐怖性障害、 薬物誘発性精 神病性障害、 妄想性精神病、 神経遮断薬誘発性ジスキネジァ、 パーキン ソン病、 薬物誘発性パーキンソン症状群、 錐体外路症状など） 、 プロラ クチン関連疾患 〔例、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無 月経、 卵巣および子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異 常、 プロラクチン分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年 期障害、 甲状腺機能低下など） など〕 、 高血圧症、 睡眠障害 〔例、 原発 性不眠、 概日リズム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯 域変化症候群 （時差ボケ） など） 〕 などの予防 ·治療剤、 特にパーキン ソン病、 高プロラクチン血症などの低毒性で安全な医薬として有用であ る。
さらに、 上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物 も同様に用いることができる。
該スクリ一二ング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬 は、 前記した本発明のスクリ一二ング方法で得られる化合物またはその 塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは哺乳動物 （例えば、 ラッ 卜、 マウス、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与する ことができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルー卜 などにより差異はあるが、 例えば、 本発明の D N Aに対するプロモータ —活性を促進する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kg として） の統合失調症の患者においては、 一日につき該化合物を約 0. 1 〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する 、。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象 疾患などによっても異なるが、 例えば、 本発明の D N Aに対するプロモ —ター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人 （体重 60kgとして ) の統合失調症の患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 0 1〜 30mg、 好ましくは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0. 1〜 10mgを静脈注射 により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たり に換算した量を投与することができる。
一方、 例えば、 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を阻害する 化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） のパーキ ンソン病の患者においては、 一日につき該化合物を約 0. l〜100mg、 好ま しくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に 投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによ つても異なるが、 例えば、 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を 阻害する化合物を注射剤の形で通常成人 （体重 60kgとして） の統合失調 症の患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 0 1〜30mg、 好まし くは約 0. l〜20mg、 より好ましくは約 0. l〜10mgを静脈注射により投与す るのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 0 k g当たりに換算し た量を投与することができる。
このように、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D N Aに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはそ の塩をスクリ一二ングする上で極めて有用であり、 本発明の DN A発現 不全に起因する各種疾患の原因究明または予防 ·治療薬の開発に大きく 貢献することができる。
また、本発明の受容体のプロモータ一領域を含有する DN Aを使って、 その下流に種々の蛋白質をコ一ドする遺伝子を連結し、 これを動物の卵 細胞に注入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を 作成すれば、 特異的にそのポリペプチドを合成させ、 その生体での作用 を検討することも可能となる。 さらに上記プロモーター部分に適当なレ ポ一夕一遺伝子を結合させ、 これが発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明の受容体そのものの体内での産生能力を特異的に促進または阻害 (抑制） する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
本明細書および配列表において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示す る場合、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略 号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下 記する。 またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示し なければ L体を示すものとする。
DN A デォキシリポ核酸
c D N A 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C シ卜シン
RN A リポ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸
d AT P デォキシアデノシン三リン酸
d T T P デォキシチミジン三リン酸
d GT P デォキシグアノシンミリン酸
d C T P デォキシシチジン三リン酸 AT P ： アデノシン三リン酸
E D T A ： エチレンジアミン四酢酸
S D S ： ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y ： グリシン
A 1 a ： ァラニン
V a 1 ： バ Uン
L e u ： ロイシン
I 1 e ： イソロイシン
S e r ： セリン
T h r ： スレオニン
C y s ： システィン
M e t ： メチォニン
G 1 u ： グル夕ミン酸
A s P ： ァスパラギン酸
L y s ： リジン
A r g ： アルギニン
H i s ： ヒスチジン
P h e ： フエ二ルァラニン
T y r ： チロシン
T r P ： 卜リブ卜ファン
P r o ： プロリン
A s n ： ァスパラギン
G 1 n ： ダルタミン
p G 1 u ： ピログルタミン酸
S e c ： セレノシスティン (selenocysteine) また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記 号で表記する。
M e ： メチル基 E t ： ェチル基
B u ： ブチル基
P h ： フエニル基
T C ： チアゾリジン— 4 (R) 一カルボキサミ ド基 T o s ： p -トルエンスルフォニル
CHO ： ホルミル
B z 1 ： ベンジル
Cl2-Bzl ： 2 , 6—ジクロロべンジル
B om ： ベンジルォキシメチル
Z ： ベンジルォキシカルボニル
、 C 1 - Z ： 2—クロ口べンジルォキシカルボニル
B r— Z ： 2—ブロモベンジルォキシカルボニル
B o c ： t—ブトキシカルボニル
D N P ： ジニ卜口フエニル
T r t ： トリチル
B um ： t—ブトキシメチル
Fmo c ： N— 9—フルォレニルメ 卜キシカルボニル
HOB t ： 1—ヒドロキシベンズトリアゾ一ル
HOOB t : 3, 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシー 4 _ォキソ一
1 , 2 , 3 _ベンゾトリアジン
HONB ： 卜ヒドロキシ- 5-ノルポルネン- 2, 3-ジカルポキシ イミ ド
D C C N， N'—ジシクロへキシルカルポジイミ ド 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号 1〕
ヒト GPR52のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号 2〕
ヒト GPR52をコードする cDNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 3〕
ラッ ト GPR52のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 4〕
ラッ ト GPR52をコードする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
マウス GPR52のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 6〕
マウス GPR52をコ一ドする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
実施例 1および実施例 2で用いられたプライマ一 1の塩基配列を示す。 、 〔配列番号： 8〕
実施例 1および実施例 2で用いられたプライマ一 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
実施例 6で用いられたプライマ一 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 0〕
実施例 6で用いられたプライマー 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕
実施例 6で用いられたプローブ 1の塩基配列を示す 〔5' ' 末端にリボー夕 —色素として FAM (6- carboxy- fluorescein) を、 3'末端にはクェンチヤ —として TAMRA (6- carboxy- tetramethy卜 rhodamine) を標識した〕 。
〔配列番号： 1 2〕
実施例 6で用いられたプライマー 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 3〕
実施例 6で用いられたプライマー 4の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 4〕
実施例 6で用いられたプローブ 2の塩基配列を示す 〔5' ' 末端にリポー夕 —色素として FAM (6_carboxy- fluorescein) を、 3'末端にはクェンチヤ 一として TAMRA (6-carboxy-tetraniethyl-rhodamine) を標識した〕 。
〔配列番号： 1 5〕 実施例 6で用いられたプライマー 5の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 6〕
実施例 6で用いられたプライマ一 6の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 7〕
実施例 6で用いられたプローブ 3の塩基配列を示す 〔5' ' 末端にリポー夕 一色素として FAM (6- carboxy- fluorescein) を、 3'末端にはクェンチヤ —として TAMRA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) を標識した〕 。 実施例
以下において、 参考例および実施例により本発明をより具体的にする
、が、 この発明はこれらに限定されるものではない。
参考例 1
ヒト GPR52発現 CH0細胞株の取得
ヒト GPR52をコードする DNA断片は、 Molecular Brain Research 64巻、 193- 198頁、 1999年に記載の配列に従って、 PCRを用いて MTCパネル （クロ ンテック） からクローニングした。 その塩基配列を解析した結果、 配列 番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するヒト GPR52をコードする cDNA の塩基配列 （配列番号： 2) を得た。 得られた MA断片を pAKKO-111べク 夕一 CBiochem. Biopliys. Acta. , 1219巻， 251 (1994)〕 の Sall、. Spel部位 に導入し発現プラスミ ドを構築した。 続いて自体公知の方法で
CH0(dhfr— )細胞に発現プラスミ ドをトランスフエクシヨンし、 発現ブラ スミ ドが導入された細胞をチミジンを含まない培地によって選択し、 ヒ ト GPR52の安定発現細胞を取得した。
実施例 1
ラッ ト GPR52のクロ一ニング
ラッ ト （SD) 脳 cDNA (BD Biosciences) を銬型として、 プライマ一 1 (配列番号： 7) およびプライマー 2 (配列番号： 8) を用いて PCR'を 行なった。 PCR には Pyrobest DNA polymerase (宝酒造） を用い、 （1) 98 °C 10 秒の後、 （2) 98°C 10 秒、 68°C 60 秒を 35回の後、 （3) 68で 7 分 の伸長反応を行なった。 増幅産物を pCR- Blunt2_T0P0 vector (
Invitrogen) に挿入し、 これを大腸菌 JM109 (宝酒造） に導入してクロ 一二ングした。 その塩基配列を解析した結果、 配列番号 ： 3で表される アミノ酸配列を有するラッ ト GPR52をコードする cDNAの塩基配列（配列番 号 ： 4) を得た。
実施例 2
マウス GPR52のクローニング
マウス （C57BL/6) 脳 cDNA (BD Biosciences) を錶型として、 プライマ ― 1 (配列番号： 7 ) およびプライマー 2 (配列番号： 8 ) を用いて PCR を行なった。 PCR には Pyrobest DNA polymerase (宝酒造） を用い、 （1) 、98°C 10 秒の後、 （2) 98°C 10 秒、 68°C 60 秒を 35回の後、 （3) 68°C 7 分 の伸長反応を行なった。 増幅産物を pCR- Blunt2- T0P0 vector (
Invitrogen) に挿入し、 これを大腸菌 JM109 (宝酒造） に導入してクロ 一二ングした。 その塩基配列を解析した結果、 配列番号： 5で表される アミノ酸配列を有するマウス GPR52をコードする cDNAの塩基配列（配列番 号 ： 6) を得た。
実施例 3
GPR52に対するリガンド採索
宿主細胞として使用したラッ ト嗅覚型環状ヌクレオチド依存性チヤネ ル （CNGC- E583M) の安定発現細胞株 （CNGC- E583M/HEK293細胞株） は、 発現べクタ一 PCDNA3.1 (+) neo (Invitrogen) にラッ ト嗅覚型環状ヌクレ ォチド依存性チャネル（CNGC- E583M) cDNAを入れて （pcDNA3,卜 CNGC) 、 HEK293細胞株 （ATCCより購入） に常法に従って pcDNA3.卜 CNGCを導入し、 10% 牛胎児血清 (Invitrogen) 、 800mg/l geneticin (Invitrogen) を 含む DMEM (Dulbecco' s modified Eagle medium) 培地を用いて、 5% C02 、 37°Cで培養することにより得た 〔Fagan et al. , FEBS, 500巻
, 85 (2001)； Reinescheid et al. , European Journal of Pharmacology,' 478 巻， 27(2003)3 。 CNGC- E583M/HEK293細胞をコラーゲンコートされた 75cm2 フラスコを用いて培養し、 約 70%程の密度になった時に、 参考例 1で作製 5900
137 したヒト GPR52発現プラスミ ドのトランスフエクシヨンを行った。 トラン スフエクシヨンは Lipofectamine試薬 （Invitrogen) を用い、 試薬添付の 方法に準じて操作を行った。 まず、 15ffll容遠沈管を 2本用意し、 それぞれ に Opti- MEM培地 （Invitrogen) を 600 / 1分注した。 次に、 片方のチュー ブに pAKKO- GPR52発現ベクター （参考例 1 ) を 2.4 /g、 もう片方に
Lipoiectamine試薬を 1添加後、 両者を混合し、 20分間室温に静置し た。この溶液に Opti- MEM培地を 6id加えた卜ランスフエクション用混合液 を、あらかじめ Opti- MEM培地を用いて洗浄した CNGC-E583M/HEK293細胞に 添加後、 C02培養器 （5% C02、 37°C) にて 5時間培養した。 その後、 トラ ンスフエクシヨン用混合液を取り除き、 10% 牛胎児血清を含む DMEM培地 、に置換した。 その翌日に PBS (Invitrogen) を用いてリンスした後、 0.05 % トリプシン · EDTA溶液 （Invitrogen) を用いて剥がし、 遠心操作にて 回収した後、 4x 104個ノ 100 1の細胞が含まれるように希釈し、 poly-D-lys ine Black walled 96- well plate (Becton Dickenson) に 1 穴あたり 100 x lずつ分注後、 C02培養器にて一晩培養した （以後、 細胞プ レートと称する） 。 上記トランスフエクシヨン操作にて一過性に受容体 を発現した CNGC- E583M/HEK293細胞に各種の試験化合物を添加し、この際 の細胞内カルシウム濃度の変動を FLIPR (Molecular Device) を用いて測 定した。
FLIPRにて細胞内カルシウム濃度の変動を測定するために、以下の前処 置を施した。 まず、 細胞に蛍光色素 Fluo-3AM (D0JIN) を添加するため、 または F L I P Rアツセィを行う直前に細胞を洗浄するためのアツセィパッ ファーを作成した。 HBSS (Invitrogen) 1000mlに 1M HEPES (pH7.4) (D0JIN ) 20mlを加えた溶液 （以下、 HBSS/HEPES溶液） に、 プロべネシド （Sigma ) 710mgを IN NaOH 5mlに溶解後さらに HBSS/HEPES溶液 5mlを加え混合した 溶液 10mlを添加し、この溶液をアツセィバッファーとした。次に Fluo- 3AM 50 gを 21 1 DMS0 (D0JIN) に溶解し、 さらに等量の 20% プルロン酸 （ Molecular Device) を加え混合後、 105 ^ 1の牛胎児血清を添加した 10.6ml のアツセィバッファーに加え、 さらに 500mM IBMX/DMS020 1を混合させ て蛍光色素溶液を調製した。 8連ピぺッ トを用いて培養液を除いた細胞プ レートに蛍光色素溶液を各ゥエル 10021ずつ分注し、 5% C02インキュ ベー夕一中にて 37°Cで 1時間インキュベートした （色素ローデイング） 。 試験化合物を含有する溶液を 0.5禮 IBMX、 2.5 mM Probenecidを含む H/HBSS 220 1に加えて希釈し、 FLIPR用 96穴プレート （V- ΒοΠοιηプレー ト、 Coster社） へ移した （以後、 サンプルプレートと称する） 。 細胞プ レー卜の色素ローディング終了後、 H/HBSSに 2.5 mM Probenecidを加えた 洗浄バッファーでプレートウォッシャー （ELX405, Bio-Tek Instruments 社） を用いて細胞プレートを洗浄し、 洗浄後 100 1の洗浄バッファーを 残した。この細胞プレ一卜とサンプルプレートを FLIPRにセッ トし（FLIPR 、により、サンプルプレー卜から 50 1のサンプルが細胞プレー卜へと移さ れる） 、 蛍光強度変化を継時的に測定することにより、 細胞内カルシゥ ムイオン濃度上昇活性を測定した。
その結果、 レセルピン （図 1 ) およびメトク トラミン （Methoctramine ) (図 2 ) を添加することにより、 用量依存的に細胞内カルシウム濃度 が上昇することがわかった。
他の受容体発現ベクターを導入した対照の CNGC- E583M/HEK293細胞で は、 このような応答は見られなかった。
実施例 4
ヒト GPR52発現 CH0細胞株の細胞内 cAMP濃度上昇
参考例 1で得られたヒト GPR52発現 CH0細胞を、 アツセィ用培地 （HBSS (GibcoBRL) に 0.2mM isobutylmethylxanthineを添加したもの） にて洗 浄した後、 37°C、 5%C02条件下で 30分培養した。 その後、 アツセィ用培 地にて希釈した各濃度のレセルピンを添加した。 また、 アツセィ用培地 のみのものを Baseとした。 添加した後、 37°C、 5% C02条件下で 30分培養 した。 培養上清を捨てて、 cAMP screen kit (アプライ ドバイオシステム ズ社） のプロトコ一ルに従い、 細胞内の cAMP量をプレートリーダ一 '（ EnVision. PerkinElmer社） を用いて測定した。 またネガティブコント口 ールとして、外来からの受容体を発現していない CH0細胞株（Mock)と他の Gs共役受容体である TGR5を安定に発現している CHO細胞株（TGR5)を同時 にアツセィした。
その結果、 ヒト GPR52発現 CH0細胞株にのみ、 レセルピン添加による細 胞内 cAMP濃度上昇が用量依存的に検出された （図 3 ) 。
実施例 5
CH0細胞に発現させた GPR52- GFP融合夕ンパク質のレセルピン添加によ る細胞内移行
GPR52の C末端に翻訳のフレーム合わせてォワンクラゲより単離された Green Fluorescent Protein (GFP) cDNAをつないだ融合タンパク質を発現 させるための発現プラスミ ドを構築した。 その際、 GFP cDNAには GFPの発 、現ベクター PQBI25 (宝酒造） から切り出した断片を用いた。 GPR52は PCR 法によりその終止コドンを制限酵素 Nhelの認識配列に修正し、 ここに GFP 断片を連結して、 pAKKO - 111ベクタ一 〔Biochem. Biophys. Acta. , 1219 巻， 251 (1994)〕 に導入し、 常法に従って CHO細胞にトランスフエクシヨン し、 ヒト GPR52-GFP発現 CH0細胞株を得た。 ヒト GPR52- GFP発現 CH0細胞株 は、 増殖培地 〔αΜΕΜ培地 （核酸含有： Invitrogen) に 10%ゥシ胎児血清 (GIBCO BRL社） を添加したもの〕 に懸濁し、 0.6Xl05cells/チャンバ一 の濃度にてチェンバー数 4つの Lab— Tekllカバーグラスチェンバ一 （ Nalgen Nunc社） にまき、 37° ( 、 5%C02条件下で一晩培養した。 培地を共 焦点顕微鏡観察用培地 〔Hanks' Balanced Salt Solution (GIBCO BRL社） 〕 に置き換え、 共焦点顕微鏡 （ライカ社） で GFPの蛍光像を観察した。 そ の際、 GFPの励起は 488nmで行った。
その結果、 GPR52- GFP融合蛋白は細胞膜に観察された。 この細胞にレセ ルピンを 10—4Mとなるように培地に添加し、 30分後には、 GFPの蛍光が細 胞膜ではなく、 細胞質に移動していることがわかった。 これは、 GPR52 が細胞膜に発現する Gタンパク質共役型の受容体であるとともに、 GPR52 がレセルピンに反応して細胞質へ移行、 すなわちィンターナリゼーショ ンしたことを示している。
実施例 6 ヒト GPR52、 マウス GPR52およびラッ ト GPR52 mRNAの組織分布の検討 ( 1 ) ヒトでの遺伝子発現分布を調べるために使用した錶型となる cDNA には、 ヒト各種組織由来の polyA+RNA (クロンテック社） から以下の方法 で合成したものを使用した。
RNA 1/xgからランダムプライマ—、 逆転写酵素として SuperScriptll 逆転写酵素 （Invitrogen社） を用い、 添付のマニュアルに従って 42°Cで 反応を行い、 反応終了後にエタノール沈殿して 1 に溶解した。
RT - PCRは Setiuence Detection System Prism 7700 (Applied
Biosystems社） を用い、 プライマー 1 (配列番号： 9) 、 プライマ一 2 ( 配列番号： 1 0 )およびプローブ 1 (配列番号： 1 1 ) を使用した。 RT- PCR 、反応液は TadMan Universal PCR Master Mix (Appl ied Biosystems社） 12.5 lに、 それぞれ 100 Mのプライマー溶液を 0· 05μ 1、 5 Μのプロ一ブ 1 を 0.5 x l、 および上記で調製した cDNA溶液を 0.5 1加え、 蒸留水で総反 応液量を 25 1とした。 PCR反応は 50°C · 2分、 95°C · 10分の後、 95°C · 15 秒、 60°C · 1分のサイクルを 40回繰り返した。
その結果、 ヒト GPR52は、 被殻、 尾状核で高発現していた。
( 2 ) マウスでの発現を調べるために使用した铸型となる cDNAには、 マ ウス各種組織由来のトータル RNAから以下の方法で合成したものを使用 した。 RNA l gからランダムプライマ—、 逆転写酵素として - SuperScriptll逆転写酵素 （Invitrogen社） を用い、 添付のマニュアルに 従って 42°Cで反応を行い、反応終了後にエタノール沈殿して 100^ 1 に溶 解した。 RT-PCRは Sequence Detection System Prism 7700 (Applied Biosystems社） を用い、 プライマ一 3 (配列番号 ： 1 2) 、 プライマ一 4 (配列番号： 1 3)およびプローブ 2(配列番号： 1 4)を使用した。 RT- PCR 反応液は TaaMan Universal PCR Master Mix (PE Biosystems社） 12.5 / 1 に、それぞれ 100 Mのプライマー溶液を 0.05 1、 5^Μのプローブ 2を 0.5 H K および上記で調製した cDNA溶液を 0.5 1加え、 蒸留水で総反応液量 を 25 1とした。 PCR反応は 50°C · 2分、 95°C · 10分の後、 95°C · 15秒、 60 °C · 1分のサイクルを 40回繰り返した。 その結果、 マウス GPR52 mRNAは、 線条体及び雌下垂体で特異的に高発 現していた。
( 3 ) Wis tarラッ トより各種臓器を摘出し、 total RNAを Isogen (二ッポ ンジーン社） を用いて調製し、 得られた total RNAから mRNA purification kit (フアルマシア社) により poly(A) +RNAを調製した。 いずれもそれぞ れのマニュアルにしたがって調製をおこなった。 得られた poly (A) +RNA 1 gを Dnase I (Amplificatin Grade, GIBCO BRL社）処理後、 160ng分を RNA PCR Kit (Takara社）を用いて、 マニュアルに従い 42°Cで cDNAを合成した。 合成された cDNAは poly (A) +RNA換算で 4ng/ 1の溶液とし、 以後の RT- PCR の铸型として用いた。 RT-PCRは Sequence Detection System Prism 7700 、 (Applied Biosys tems社） を用いて、 プライマ一 5 (配列番号 ： 1 5) 、 プライマー 6 (配列番号： 1 6) およびプローブ 3 (配列番号 ·· 1 7 ) を 使用した。 RT - PCR反応液は TadMan Universal PCR Master Mix (PE Biosys tems社） 12.5 1に、それぞれ 100 Mのプライマー溶液を 0.05 μ 1、 5 Μのプローブ 3を 0.5 1、および上記で調製した cDNA溶液を 0.5 1加え 、 蒸留水で総反応液量を 25 1とした。 PCR反応は 50°C · 2分、 95°C · 10 分の後、 95°C · 15秒、 60°C · 1分のサイクルを 40回繰り返した。 得られた ラッ ト各種組織における GPR52の mRNA発現量は poly(A)+RNA lngあたりの コピー数として算出した。
その結果、 ラッ ト GPR52は、 線条体、 下垂体、 雌下垂体で高発現してい た。 '
実施例 7
In situハイプリダイゼーション法を用いた脳および下垂体における GPR52 mRNAの発現分布の検討
ジゴキシゲニン標識 GPR52プローブを以下の方法で調製した。 まず、 プ ラスミ ドベクタ一 pCR_Blunt II- T0P0 (インビトロジェン） に、 公知の方 法によりラット GPR52 cDNAを挿入した。 この c而 Aを、 M13プライマ一' （ィ ンビトロジェン） · Advantage cDNA PCR- Kit (クロンテック） を用いた PCRにて増幅'直鎖化し、エタノール沈殿法により精製した。得られた cDNA から、 DIG RNA Labeling KIT (SP6/T7) (ロシュ） にて SP6または T7によ る in vitro anscri.ptionを行い （40 lスケール） 、 エタノール沈殿後 、 40mM NaHC03、 60mM Na2C03, H 10.2、 60°Cの条件下で 400bpに加水分解 した。 さらにエタノール沈殿後、 100/21の蒸留水に溶解することにより ジゴキシゲニン標識ラッ ト GPR52cRNAプローブ（アンチセンスプローブお よびセンスプローブ） を得た。
雄性成熟 SDラッ ト （日本チヤ一ルスリバ一） を屠殺し、 脳を取り出し PBSで洗浄した後、 OCTコンパウンド中で液体窒素により凍結し、 -80でで 保存した。 また、 雌性成熟 SDラッ トを屠殺し、 下垂体を取り出し PBSで洗 浄した後、 OCTコンパウンド中で液体窒素により凍結し、 -80°Cで保存し 、た。 脳および下垂体組織をクライオスタツ ト CM3050 (ライカ） を用いて MASコートスライ ド （松浪） 上に 16/2 mの厚さで薄切し、 4%パラホルムァ ルデヒドを含む 1/15M Phosphate Buffer pH7.4 (和光純薬） で室温 10分 間固定した。スライ ドを PBSで 3回洗浄した後、 0.25% acetic anhydride を 含む 0.1M triethanolamineに室温 10分間浸漬した。 スライ ドを PBSで 3回 洗浄した後、 スライ ド上の切片にハイプリダイゼィーションバッファー (50¾ Formamide, 10mM Tris-HCl pH7.5 , lXDenhardt Solution, 200 n g/ml tRNA, 10% Dextran Sulfate, 600mM NaCl, 0.25% SDS, ImM EDTA pH8.0)で 200倍に希釈したジゴキシゲニン標識ラット GPR52cRNAプローブ を 60 l滴下し （パラフィルムでカバー） 、 50%ホルムアミ ドを敷いたモ イスチヤ一チヤンバー内にて 60°C、 ー晚ハイズリダ一ゼーション反応を 行った。 引き続き、 スライド上の切片から非特異的にハイブリダーゼー シヨンしたプローブを洗浄するため以下の操作を行った。 1) XSSC (SSC; 1XSSC = 150niM NaCl, 15mMクェン酸ナトリウム， pH7.0)/50%ホル ムアミ ド処理 （60°C · 30分 1回） 、 2) 2XSSC処理 （60°C · 20分 1回） 、 3) 0.1XSSC処理 （60 · 20分 2回） 。 これらの操作を行った後、 ジゴ キシゲニン標識フ;1ローブを検出するための免疫組織化学を行った。まず、 スライ ドを洗浄バッファー （lOOmM Tris- HC1 pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Tween20) で洗浄した後、 1.5% Blocking reagent (ロシュ）を含む洗浄バ ッファーによる処理 （室温 · 1時間） にて非特異反応のブロッキングを行 い、 同液で 1000倍に希釈した anti - DIG fab-fragment antibody
conjugated with alkal ine phosphatase (ロシュ)を室 で 1時間反 J心さ せた。 スライ ドを洗浄バッファーで室温 15分間 X 3回洗浄した後、 発色バ ッファー （lOOmM Tri s-HCl pH 9. 5, lOOmM NaCl, 50mM MgCl2)でリ ンス し、 発色液 （50mg/ml BCIP (ロシュ）， 100mg/ml NBT (ロシュ）， 3% Polybinylalcholを含む発色バッファー） によって、 室温にてー晚発色反 応を行った。. 適時に発色を PBS洗浄により止めた後、 Pristine Mount ( フアルマ） にて永久封入し、 観察 ·写真撮影を行った。
その結果、 ラッ ト脳内の広い部位で GPR52 mRNAの発現を示すアンチセ 、 ンスプローブ特異的なシグナルが確認された。大脳基底核では、線条体、 側坐核、嗅結節に GPR52 mRNAは非常に強く発現していた。大脳皮質では、 前頭葉 ·側頭葉を中心として広く発現していた。 扁桃体では、 基底外側 核、 外側核、 内側核などで発現していた。 海馬では、 アンモン核、 歯状 回、 海馬台において発現していた。 視床では、 内側手綱核で非常に強く 発現し、 また視床網様核、 視床室傍核、 黒質線条体束などで発現してい た。 視床下部では、 内側乳頭体核でやや強く発現し、 その他、 弓状核、 視床下部外側野などで発現していた。 中脳では、 背 ·腹外側膝状体核で やや強く発現し、 その他、 腹側被蓋野、 中脳水道灰白質など'で発現して いた。 下垂体において'は、 前葉で発現しており、 中葉および— 葉におけ る発現は検出限界以下だった。 （表 1 )
これより、GPR52は各種脳機能に広く関与している可能性が示唆された。 組 織 GPR52 mRNA 扁桃体梨状皮質移行野
ラッ卜 扁桃体皮質核 + 前頭連合野 ++ 扁桃体海馬領域
辺縁前皮質 ++ 歯状回顆粒細胞層
辺縁下皮質 ++ 海馬 CA1-CA3錐体細胞屠
背側脚皮質 ++ 海馬合 + 内側眼窩皮質 ++ ヒモ傍核 ++ 眼 S皮質 ++ 外側手網核 ++ 梨状皮質 ++ 内側手網核 +++ 嗅前核 ++ 視床室傍核
中隔海馬核 ++ 視床中間内背側核 + 腹側淡蒼 + 視床中心内側核
線条体 +++ 視床菱形核
側坐核 +++ 視床結合核 ++ 嗅結節 +++ 視床下部後野
間質核 ++ 視床網様核 + 分界条床核 ++ 後交連核 + 帯状皮質 ++ 内側淡蒼球
運動皮質 + 視床下部前野
感覚皮質 + 視床下部外側野
顆粒島皮質 + 視床下部弓状核 ·内側後部 + 鼻周囲皮質 + 乳頭核 + 嗅外皮質 ++ 内側乳頭核 ++ 嗅内皮質 ++ 黒質緻密部 + 視党皮質 + 黒質網様部 + 聴党皮質 + 被蓋核 + 扁桃体外側核 + 中脳水道周囲灰白質 + 扁桃体基底外側核 + 脚間核 + 扁桃体内側核 + 内側前庭核、小細胞部
扁桃体基底内側核 + 舌下神経前核 + 実施例 8
二重 in situバイブリダイゼーション法.を用いた脳における GPR52 mRNA およびドーパミン D1受容体 mRNAまたはドーパミン D2受容体 mRNAの局在比 較
GPR52 mRNAおよびドーパミン D1受容体 mRNAまたはドーパミン D2受容体 niRNAを同時に検出するため、ジゴキシゲニン標識 GP R 52 c RNAプローブおよ びフルォレツセィン標識ドーパミン D1受容体 cRNAプローブまたはフルォ レツセイン標識ドーパミン D2受容体 cRNAプローブを用いた二重 in situ ハイブリダィゼーションを行った。
ジゴキシゲニン標識 GPR52cRNAプローブは実施例 7と同様に調製した。 フルォレツセィン標識ドーパミン D1受容体 cRNAプローブ、 およびフル ォレツセィン標識ド一パミン D2受容体 cRNAプローブは以下の方法で調製 した。 まず、 雄性 Wistarラッ ト線条体から公知の方法でド一パミン D1受 、容体および D2受容体 cDNAをクローニングした。 これらの cMAをプラスミ ドベクタ一 pCRII- T0P0 (インビトロジェン） に公知の方法により挿入し た。これらの cDNAを、 M13プライマー（ィンビトロジェン） 'Advantage cDNA PCR-Kit (クロンテック） を用いた PCRにて増幅 '直鎖化し、 エタノール 沈殿法により精製した。 得られた cDNAから、 DIG RNA Labeling KIT
(SP6/T7) (ロシュ） にて SP6または T7による in vitro transcriptionを行 つた (40 1スケール) 。 標識には Fluorescein RNA Labeling Mix (ロシ ュ）を使用した。 エタノール沈殿後、 100/X 1の蒸留水に溶解することによ りフルォレツセィン標識ド一パミン D1受容体 cRNAプローブ （アンチセン スプローブおよびセンスプローブ） 、 およびフルォレツセイン標識ド一 パミン D2受容体 cRNAプローブ （アンチセンスプローブおよびセンスプロ ーブ） を得た。
雄性成熟 SDラット （日本チヤ一ルスリバ一） を屠殺し、 脳を取り出し PBSで洗浄した後、 OCTコンパウンド中で液体窒素により凍結し、 - 80°Cで 保存した。 脳をクライオス夕ッ ト CM3050 (ライカ） を用いて MASコートス ライ ド （松浪） 上に 16 ΠΙの厚さで薄切し、 4%パラホルムアルデヒドを 含む l/15MPhosphateBufierpH7.4 (和光純薬) で室温 10分間固定した。 スライ ドを PBSで 3回洗浄した後、 0.25% acetic anhydride を含む 0.1M triet anolamine (TEA)に室温 10分間浸漬した。 スライ ドを PBSで 3回洗浄 した後、 ハイプリダーゼーションバッファーでそれぞれ 200倍、 500倍に 希釈したジゴキシゲニン標識 GPR52CRNAプローブおよびフルォレツセィ ン標識ド一パミン D1受容体 cRNAプローブ、 またはハイプリダーゼ一ショ ンバッファーでそれぞれ 200倍、 500倍希釈したジゴキシゲニン標識 GPR52CRNAプローブおよびフルォレツセィン標識ドーパミン D2受容体 cRNAプローブを、 スライ ド上の切片に全量 60 1滴下し （パラフィルムで カバ一） 、 50%ホルムアミ ドを敷いたモイスチャーチャンバ一内にて 60 °Cで一晩ハイブリダ一ゼーシヨン反応を行った。 引き続き、 非特異的に ハイブリダーゼーションしたプローブを洗浄するため以下の操作を行つ た。 1) 2XSSC (SSC; 1XSSC = 150mM NaCl, 15mMクェン酸ナトリウム， ,pH7.0)/50% ホルムアミ ド処理 （60°C · 30分 1回） 、 2) 2XSSC処理 （ 60°C · 20分 1回） 、 3) 0.1XSSC処理 （60°C · 20分 2回） 。 この操作を 行った後、 フルォレツセィン標識プローブを検出するために
GenPoint™Fluorescein (DAK0)を用いたチラミ ド増幅法を行った。
GenPoint™ Fluorescein (DAK0)のマニュアル通りにフルォレツセイン標 識プローブの HRP標識を行った後、 DAB Substrate-Chromogen Solution により発色 （茶色） を行った。 適時に DWに 1分間浸漬することにより発色 を停止した後、 引き続き、 ジゴキシゲニン標識 GPR52CRNAプローブを検出 するための免疫組織化学を行った。 まず、 スライ ドを洗浄パ.ッファー （ 100mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1¾ Tween20) で洗浄した後、 1.5% Blocking reagent (ロシュ）を含む洗浄バッファ一による処理 （室温 · 1 時間） にて非特異反応のブロッキングを行い、 同液で 1000倍に希釈した ant i -DIG fab-fragment antibody conjugated with alkal ine phosphatase (ロシュ）を室温で 1時間反応させた。スライ ドを洗浄バッファーで室温 15 分間 X3回洗浄した後、 発色バッファー （100mM Tris-HCl pH 9.5， lOOmM NaCl, 50mMMgCl2)でリンスし、 発色液（50mg/ml BCIP (ロシュ）， lOOmg/ml NBT (ロシュ）， 3% Polybinylalcholを含む発色バッファー）. によって、 室温にて一晩発色反応 （青色） を行った。 適時に発色を PBS洗浄により止 めた後、 Pristine Mount (フアルマ） にて永久封入し、 観察 ·写真撮影 を行った。
その結果、 ラッ ト線条体、 側坐核、 嗅結節において、 GPR52 mRNAはド ーパミン D 1受容体とは異なるニューロンに発現していた。 一方、 GPR52 mRNAはド一パミン D2受容体 mRNAと同じニューロンで発現していた。 この ことから、 ラッ ト線条体、 側坐核、 嗅結節において、 GPR52が D2受容体と 特異的に共存することが明らかになった。 ラッ ト大脳皮質において、 前 頭葉では、 GPR52 mRNAはドーパミン D 1受容体 mRNAおよび D2受容体 mRNAと 同様に、 内側前頭前皮質 （以下、 mPFCと呼称する） に発現していた。 mPFC において、 GPR52は、 ドーパミン D 1受容体または D2受容体を発現する神経 とも共発現していた。 mPFCでは、 ドーパミン D2受容体 mRNAよりもドーパ 、ミン D 1受容体 mRNAの方がより広く発現しており、 同様に GPR52 mRNAも mPFCに広く発現していたため、 ドーパミン D 1受容体 mRNA発現神経との共 存がより数多く観察された。 帯状皮質においても、 GPR52 mRNAはドーパ ミン D1もしくは D2受容体 mMAを発現する神経に共発現していた。 梨状皮 質や嗅核では、 GPR52 mRNAとド一パミン D 1受容体 mRNAは明確に同じ細胞 に発現していたが、 GPR52 mRNA を発現する細胞においてドーパミン]) 2 受容体は発現していないか、 発現が弱かつた。
以上の結果より、 GPR52がドーパミン中脳線条体路の異常 （例、 パ一キ ンソン病） 、 中脳辺縁路の異常 （例、 統合失調症の陽性症状） 、 中脳皮 質路の異常 （例、 統合失調症の陰性症状） 等のターゲット分子になり得 る可能性が示唆された。
実施例 9
メトク トラミンによる大脳皮質丽 DA型グルタミン酸受容体の活性化 ラッ ト胎児大脳皮質神経細胞 （CAMBREX) を添付の方法に準じて 48穴ポ リ- L-リジン （住友ベークライ ト） で 14- 15日間培養した。 特に記載が無 い限り培地は神経細胞培養液 （大日本製薬） を用いた。 細胞内カルシゥ ム濃度の変動は、 AQMCOSMOS (Hamamat su pho t on ics) を用いて測定した 。 細胞内カルシウム濃度の変動を測定するために、 以下の前処置を施し た。 まず、 細胞に蛍光色素 f ura- 2/AM (Mo l ecu l ar Probe s) を添加するた め、 アツセィを行う直前に細胞を洗浄するためのアツセィバッファーを 作成した。 HBSS (Invitrogen) 1000mlに 1M HEPES (pH7.4) (DOJIN) 20ml を加えた溶液 （以下、 HBSS/HEPES溶液） に、 プロべネシド （Sigma) 710mg を IN NaOH 5mlに溶解後、 さらに HBSS/HEPES溶液 5mlを加え混合した溶液 10mlを添加し、 この溶液をアツセィバッファ一とした。 次に fura- 2/AM ストック溶液と等量の 20% プルロン酸 （Molecular Device) を加え混合 し、 fura-2が最終濃度 5 Mになるようにアツセィバッファーで溶解し、 fura_2蛍光色素溶液を調製した。 この fura- 2蛍光色素溶液を、 ラット胎 児大脳皮質神経細胞にロードし、 30〜60分間ィンキュベーションした。 その後、 AQUAC0SM0S (Hamamatsu photonics) を用いて個々の神経細胞内 、のカルシウム濃度変動を測定した。
その結果、 ダル夕ミン酸による匪 DA型グルタミン酸受容体の活性化を 示す細胞内カルシウム濃度上昇が観察された後、 カルシウム濃度上昇の 減退が生じている間に、 メ 卜クトラミンを添加することによって再び 丽 DA型グルタミン酸受容体が活性化され、 カルシウム濃度上昇が引き起 こされることが分かった （図 4) 。 個々の神経細胞 （n=ll) に関して力 ルシゥム濃度上昇を Fura- 2蛍光比率 （340nm/380M) として示した （図 4 ) 。 これに対し、 グルタミン酸を加えずメ トクトラミン単独添加の時は カルシウム濃度上昇が起きないことが分かった （図 5) 。 個々の神経細 胞 （n=27) に関してカルシウム濃度上昇を Fura- 2蛍光比率 （340nm/380nni ) として示した（図 5)。
これより、 GPR52に対してリガンド活性を持つメトク トラミンは、 丽 DA 型グルタミン酸受容体の活性化に対して増強作用があるポテンシエー夕 —として働く事が明らかとなつた。 匪 DA型ダルタミン酸受容体は統合失 調症に強く関係しており、 この受容体の活性化を強めることにより統合 失調症の陰性症状、認知障害を改善することは明らかとなっているため、 GPR52ァゴニストによる匪 DA型ダル夕ミン酸の活性増強によりこれらの 症状が改善されることが期待される （Science 第 296巻、 692頁、 2002年 など） 。 実施例 1 0
GPR52ァゴニストのスクリーニング （ 1 )
実施例 3に記載の CNGC-E583M/HEK293細胞株を用いて、以下のようにァ ゴニストのスクリーニングを行った。 CNGC-E583M/HEK293細胞をコラーゲ ンコートされた 75cm2フラスコを用いて培養し、 約 70%程の密度になった 時、参考例 1で作製したヒト GPR52発現プラスミドのトランスフエクショ ンを行った。 トランスフエクシヨンは Lipof ectamine試薬 (Invitrogen ) を用い、 試薬添付の方法に準じて操作を行った。 まず、 15ml容遠沈管 を 2本用意し、 それぞれに Opti- MEM培地 （Invitrogen) を 600 1分注した 。 次に、 一方のチューブに PAKKO-GPR52発現べクタ一 （参考例 1 ) を 2.4 、/xg、 片方に Lipoiectamine試薬を 1添加後、 両者を混合し、 20分間室 温に静置した。 この溶液に Opt i-MEM培地を 6ml加えたトランスフエクショ ン用混合液を、 あらかじめ Opti_MEM培地を用いて 1回リンスした
CNGC- E583M/HEK293細胞に添加後、 C02培養器 （5% C02、 37°C) にて 5時間 培養した。 その後、 トランスフエクシヨン用混合液を取り除き、 10% 牛 胎児血清を含む丽 EM培地に置換した。 翌日、 細胞を 0.05% トリプシン - EDTA溶液 （Invitrogen) を用いて剥がし、 遠心操作にて回収した後、 4 X 105個/ mlの細胞が含まれるように希釈し、 poly_D- lysine Black walled 96 - well plate (Becton Dickenson) に 1穴あたり 100 1ずつ分注 後、 C02培養器にて一晩培養した （以後、 細胞プレートと称する） 。 上記 トランスフエクション操作にて一過性に GPR52を発現させた
CNGC- E583M/HEK293細胞に各種の試験化合物を添加し、細胞内カルシウム 濃度の変動を FLIPR (Molecular Device) を用いて、 実施例 3に記載した 方法で測定した。
その結果、 GPR52を発現させた CNGC- E583M/HEK293細胞に対して特異的 に細胞内カルシウム濃度を上昇させる化合物 （ァゴニスト候補化合物） が複数ヒッ トした。
実施例 1 1
GPR52ァゴニストのスクリーニング （2 ) 参考例 1で作製した GPR52の安定発現細胞を 150cm2フラスコで一晩 37 °C、 C02インキュベータ一で培養した。 培養後、 0.5mM EDTA/PBSにて細 胞をはがし、 PBSで細胞を洗浄後、 lxl07cells/mlの密度で Buffer 1 (HBSS + 0.1%BSA、 25mM HEPES pH7.3、 0.5mM IBMX)に懸濁した。 この細胞懸濁 液 440 1とアルフアスクリーン cAMP assay kit (Parkin Elmer)の anti-cAMP acceptor beads 22 K Buf ierl 638 1を混合し、 白色 96well プレート （Costar)に 10 1ずつ分注した。 次に各ゥエルに Buffer 1で希釈 した試験化合物を 10/ 1ずつ加え、 室温で 30分間振とう後、 アルファスク リーン cAMP assay kitの Biotinyl camp 20 および Streptavin donor beads 82 /x 1を Bui f er2 (HBSS + 0.1%BSA、 25mM HEPES pH7.3, 1.5¾
、Tween20) 40mlに加えた液をプレートの全ゥエルに 30 1ずつ加えた。 プ レートを室温で 3時間分間振とうした後、 Fusions (Parkin Elmer)にて蛍 光強度を測定した。
その結果、 GPR52の安定発現細胞に対して細胞内 cAMP濃度を上昇させる 化合物 （ァゴ二スト候補化合物） が複数ヒットした。
実施例 1 2
GPR52ァゴニストのスクリーニング （3)
実施例 1 1で記載した方法を用いて、 各種化合物を最初、 終濃度 30 M で一次スクリ一二ングした結果、 GPR52の安定発現細胞に対して細胞内 cAMP濃度を上昇させる化合物 （ァゴ二スト候補化合物） が複数見出され た。 これら化合物を各種濃度 （100 M， 30/ M,. IO M, 3 M, M, 0.1 iM) で使用し、 実施例 1 1で記載した方法を用いて二次スクリーニング (精査） を行った。
その結果、 N- [3- (3 -クロロフエノキシ）フェニル] -2-メチル- 8- [3- (1- ピペラジニル）プロピル] -5, 6, 7, 8 -テトラヒドロピリ ド [2， 3-d]ピリミジ ン- 5-ァミン 4塩酸塩 （特開 2003- 321472号の実施例 175) (以下、 化合物 A と略記） が比較的強い活性を示した。本化合物の GPR52に対する EC5Qは 2.1 Mであった。
実施例 1 3 化合物 Aによる大脳皮質丽 DA型グルタミン酸受容体の活性化
実施例 9で記載の方法を用いて大脳皮質丽 DA型ダル夕ミン酸受容体の 活性化の検討を行った。
その結果、 IO Mダルタミン酸による丽 DA型ダルタミン酸受容体の活性 化を示す細胞内カルシウム濃度上昇が観察された後、 カルシウム濃度上 昇の減退が生じている間に、 化合物 Aを 10 χΜ添加することによって再び 丽 DA型グルタミン酸受容体が活性化され、 カルシウム濃度上昇が引き起 こされることが分かった。 これに対し、 グルタミン酸を加えず 15 Μ の 化合物 Α単独添加の時はカルシウム濃度上昇が起きないことが分かった。
これより、 GPR52に対してリガンド活性を持つ化合物 Aは、 匪 DA型ダル 、タミン酸受容体の活性化に対して増強作用があるポテンシエー夕一とし て働くことが明らかとなった。 大脳皮質は認知などの高度情報処理に重 要な働きをしていることから、 GPR52ァゴニストは丽 DA型ダルタミン酸受 容体の活性を増強させることにより、 統合失調症の陰性症状、 認知障害 を改善することが期待される。
実施例 1 4
化合物 Aによるラット大脳皮質初代培養細胞の NMDA型グルタミン酸受 容体のリン酸化
ラッ ト海馬初代培養神経細胞を用いて GPR52ァゴニストによる丽 DA型 グルタミン酸受容体のリン酸化の検討を行った。 ラッ ト （Wistar、 日本 チヤ一ルスリバ一） 胎児脳（E19)から大脳皮質を解剖して取り出し、 神経 細胞分散液セッ ト （大日本製薬） を用いて細胞を調製した。 そして、 そ の細胞を 2 4穴 po _L- lysine プレートに播種 （3xl05cel ls/wel 1) し、 Neuro Basal (B27, 0.5mM glutamine含有、 GIBCO) 培養液で 2週間培養し た。 最終濃度 50 Mの化合物 Aを上記の細胞に添加し、 1、 2、 5、 15および 30分後の細胞を回収して、 Invitrogen社 NuPAGE Sample Buffer (DTT含有 )を用いて細胞を溶解した後、抗体 Anti- phospho-NRl (Ser897) (Upstate) を用いてウェスタンブロッ ト解析を行った。
その結果、 化合物 Aは、 NMDA型グルタミン酸受容体のリン酸化 （Ser897 ) を引き起こすことが分かった。 匪 DA型グルタミン酸受容体活性増強作 用の分子機構として、 細胞内 cAMP濃度上昇を介した匪 DA型グルタミン酸 受容体のリン酸化 （Se r897) が重要であることが明らかになつている。 したがって、実施例 1 3に示した化合物 Aによる丽 DA型ダル夕ミン酸受容 体活性増強作用は、 GPR52を介した細胞内 cAMP濃度上昇による匪 DA型ダル 夕ミン酸受容体のリン酸化 （Se r897) を起因として引き起こされたと考 えられた。 GPR52ァゴニストは丽 DA型ダルタミン酸受容体のポテンシエー 夕一として働くことが生化学的にも支持された。 産業上の利用可能性
、 本発明の受容体 （例、 GPR52など） の活性を促進または阻害する化合物 またはその塩、 本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害する化 合物またはその塩、 本発明のスクリーニング方法またはスクリ一二ング 用キッ トで得られうる化合物またはその塩（例、 GPR52ァゴニスト、 GPR52 アン夕ゴニスト） などは、 例えば、 精神疾患 （例、 統合失調症、 不安症、 認知障害、 パニック障害、 恐怖性障害、 薬物誘発性精神病性障害、 妄想 性精神病、 神経遮断薬誘発性ジスキネジァ、 パーキンソン病、 薬物誘発 性パーキンソン症状群、 錐体外路症状など） 、 プロラクチン関連疾患 〔 例、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳汁漏出、 無月経、 卵巣および 子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 プロラクチン 分泌不全 （例、 卵巣機能低下症、 精嚢発育不全.、 更年期障害、 甲状腺機 能低下など） など〕 、 高血圧症、 睡眠障害 〔例、 原発性不眠、 概日リズ ム障害 （例、 三交替勤務等による体調の変調、 時間帯域変化症候群 （時 差ボケ） など） 〕 などの予防 ·治療剤などとして有用である。
また、 本発明の受容体の活性を促進する化合物またはその塩、 本発明 の受容体の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、 本発明の受容 体に対するァゴニスト、 本発明の受容体に対するリガンドなどは、 本発 明の受容体 （例、 GPR52など） を発現している神経細胞の細胞内 cAMP濃度 を上昇させるため、 統合失調症の陽性症状の原因の一つとされている中 脳辺縁系ドーパミン経路の過活動を抑制し、 統合失調症の陽性症状を改 善させることができる。 また、 統合失調症の陰性症状や認知障害の原因 の一つとされている大脳皮質の丽 DA型受容体の機能低下を改善し、 統合 失調症の陰性症状や認知障害を改善させることができる。 よって、 上記 化合物またはその塩、 ァゴニストおよびリガンドなどは、 好ましくは、 統合失調症、 認知障害などの予防 ·治療剤などとして有用である。
さらに、 本発明の受容体の活性を促進する化合物またはその塩、 本発 明の受容体の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、 本発明の受 容体に対するァゴニス卜、 本発明の受容体に対するリガンドなどは、 プ ロラクチンの分泌を促進し得るので、 プロラクチンの分泌不全 (例、 卵 、巣機能低下症、 精嚢発育不全、 更年期障害、 甲状腺機能低下など） など の予防 ·治療剤などとして有用である。
本発明の受容体の活性を阻害する化合物またはその塩、 本発明の受容 体の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 本発明の受容体に対 するアンタゴニストなどは、 本発明の受容体 （例、 GPR52など） を発現し ている神経細胞の細胞内 cAMP濃度を低下させるため、 パーキンソン病の 原因とされている黒質線条体ド一パミン経路でのドーパミン欠損に起因 する細胞内 cAMPの産生の抑制不全を改善させることができるため、 好ま しくは、 パーキンソン病などの予防 ·治療剤などとして有用である。 また、 本発明の受容体の活性を阻害する化合物またはその塩、 本発明 の受容体の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、 本発明の受容 体に対するアン夕ゴニストなどは、 プロラクチンの分泌を抑制し得るの でプロラクチン分泌過多症 〔例、 高プロラクチン血症 （例、 不妊症、 乳 汁漏出、 無月経、 卵巣および子宮の萎縮など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫 瘍、 月経異常など〕 などの予防 ·治療剤などとして有用である。
さらに、 本発明の受容体 （例、 GPR52など） または （および） そのリガ ンド （例、 レセルピン、 メトクトラミンなど） は、 精神疾患などの乎防 •治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニングに有用である。

Claims

請求の範囲
1 . ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩および （b) 該蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有 するリガンドを用いることを特徴とする、 該蛋白質またはその塩と該リ ガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一二ング方 法。
2 . リガンドが、 レセルピン化合物である請求項 1記載のスクリー二 ング方法。
3 · レセルピン化合物が、 式
Figure imgf000155_0001
〔式中、 環 Aおよび環 Bは、 それぞれ置換基を有していてもよいべンゼ ン環、
環 Cは、 置換基を有していてもよい 6員環、
環 Dは、 置換基を有していてもよい 5ないし 7.員含窒素複素環、 環 Eは、 置換基を有していてもよい 5ないし 7員環を示す〕 で表される 化合物またはその塩である請求項 2記載のスクリ一ニング方法。
4 . レセルピン化合物が、 レセルピンである請求項 2記載のスクリー ニング方法。
5 . リガンドが、 インドールアルカロイ ドである請求項 1記載のスク リーニング方法。
6 . リガンドが、 メ 卜ク トラミン化合物である請求項 1記載のスクリ 一二ング方法。
7 . メトク トラミン化合物が、 式
Figure imgf000156_0001
〔式中、 R 1および R 2は、 それぞれ置換基を有していてもよい炭化水素 基、 Xはスぺーサーを示す〕 で表される化合物またはその塩である請求 項 6記載のスクリーニング方法。
8 . メ トク トラミン化合物が、 メ トク トラミンである請求項 6記載の スクリ一二ング方法。
、 9 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸 配列が、 配列番号： 3または配列番号 ： 5で表されるアミノ酸配列であ る請求項 1記載のスクリ一二ング方法。
1 0 . ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もし くはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、 （b) 該リガン ドおよび試験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその 塩に接触させた場合における、 該リガンドの該蛋白質もしくはその部分 ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、 比較する、 請求項 1記 載のスクリーニング方法。
1 1 . ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もし くはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画 分に接触させた場合と、 （b) 該リガンドおよび試験化合物を、 該蛋白質 もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の 膜画分に接触させた場合における、 該リガンドの該細胞または該膜画分 に対する結合量を測定し、 比較する、 請求項 1記載のスクリーニング方 法。
1 2 . 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩が、 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコ一ドす る D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現 した蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩である請求項 1 0記 載のスクリ一二ング方法。
1 3 . リガンドが、 標識したリガンドである請求項 1 0〜請求項 1 2 記載のスクリ一ニング方法。
1 4 . ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 、的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もし くはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、 （b) 該リガン ドおよび試験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその 塩に接触させた場合における、 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまた はその塩を介した細胞刺激活性を測定し、 比較する、 請求項 1記載のス クリ一二ング方法。
1 5 . ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドま たはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質もし くはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画 分に接触させた場合と、 （b) 該リガンドおよび試験化合物を、 該蛋白質 もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の 膜画分に接触させた場合における、 該蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、 比較する、 請求項 1記載 のスクリ一二ング方法。
1 6 . 細胞刺激活性が、 G s活性である請求項 1 5記載のスクリー二 ング方法。
1 7 . 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩が、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩をコードす る D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現 した蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩である請求項 1 5記 載のスクリーニング方法。
1 8 . ( i ) ( a) 配列番号 ： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、 該蛋白質 もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞に接触させた場 合と、 （b) 試験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそ 、の塩を含有する細胞に接触させた場合における、 該蛋白質もしくはその 部分べプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、 比較する、 または （i i) 試験化合物を、 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたは その塩を含有する細胞に接触させた場合における、 該蛋白質もしくはそ の部分べプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定することを特 徴とする、 該蛋白質またはその塩に対するァゴニス卜のスクリーニング 方法。
1 9 . 配列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩と特異的に結合する能力を有するリガンドの存在下、 試験化合物 を、 該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞に 接触させた場合における、 該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそ の塩を介した細胞刺激活性を測定することを特徴とする、 該蛋白質また はその塩に対するアン夕ゴニストのスクリ一二ング方法。
2 0 . ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および（b) 該蛋 白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを含有する ことを特徴とする、 該蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変 化させる化合物またはその塩のスクリ一二ング用キッ ト。
2 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる統合失調症ま たは認知障害の予防 ·治療剤。
2 2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなるプロラクチ ン分泌不全の予防 ·治療剤。
2 3 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは
、その塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなるパーキンソ ン病の予防 ·治療剤。
2 4 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる高プロラク チン血症の予防 ·治療剤。
2 5 . 配列番号 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と特異的に結合する 能力を有するリガンド。
2 6 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩の活性を促進することを特徴とする統合失調症または認知障害の予 防 ·治療法。
2 7 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を促進することを特徴とするプロラクチン分泌不全の予 防 ·治療法。
2 8 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を阻害することを特徴とするパーキンソン病の予防 · 治療 法。
2 9 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を阻害することを特徴とする高プロラクチン血症の予防 · 治療法。
3 0 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与 することを特徴とする統合失調症または認知障害の予防 ·治療法。
、 3 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与 することを特徴とするプロラクチン分泌不全の予防 ·治療法。
3 2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与 することを特徴とするパーキンソン病の予防 ·治療法。
3 3 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしぐは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与 することを特徴とする高プロラクチン血症の予防 ·治療法。
3 4 . 統合失調症または認知障害の予防 ·治療剤の製造のための、 配 列番号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活 性を促進する化合物またはその塩の使用。
3 5 . プロラクチン分泌不全の予防 ·治療剤の製造のための、 配列番 号 ： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を 促進する化合物またはその塩の使用。
3 6 . パーキンソン病の予防 ·治療剤の製造のための、 配列番号 ： 1 で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害す る化合物またはその塩の使用。
3 7 . 高プロラクチン血症の予防 ·治療剤の製造のための、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害 する化合物またはその塩の使用。
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