DE69233472T2 - Parathormonrezeptor und dafür codierende DNA - Google Patents

Parathormonrezeptor und dafür codierende DNA Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft endokrine Rezeptoren.
  • Ein entscheidender Schritt bei der Expression von hormonaler Wirkung ist die Wechselwirkung von Hormonen mit Rezeptoren auf der Plasmamembranoberfläche von Zielzellen. Die Ausbildung von Hormon-Rezeptor-Komplexen erlaubt die Übertragung von extrazellulären Signalen in die Zelle, um eine Vielzahl von biologischen Antworten hervorzurufen. Beispielsweise induziert die Bindung eines Hormons wie des follikelstimulierenden Hormons (FSH), des Luteinisierungshormons (LH), des Thyreotropins (TSH) und des Choriongonadotropins (CG) an seine Zelloberflächenrezeptoren eine Konformationsänderung des Rezeptors, was zur Assoziierung des Rezeptors mit einem Transduktormolekül führt, dem stimulierenden Guaninnukleotid (GTP)-bindenden Protein führt, von dem eine Komponente (GS) ist. Diese Assoziierung stimuliert die Adenylatzyklaseaktivität, die wiederum andere zelluläre Prozesse, wie beispielsweise Proteinphosphorylierung, Steroidsynthese und -sekretion und die Modulation des Ioneneinstroms auslöst. Das Binden von anderen Hormonen, einschließlich Arginin-Vasopressin (VP), Angiotensin II und Norepinephrin, an ihre Zelloberflächenrezeptoren führt zur Aktivierung von anderen Arten von GTP-bindenden Proteinkomponenten wie beispielsweise (GP), was wiederum die Aktivität des Enzyms Phospholipase C stimuliert. Die Produkte der Phospholipase C-Hydrolyse initiieren eine komplexe Kaskade aus zellulären Ereignissen, einschließlich der Mobilisierung von intrazellulärem Kalzium und Proteinphosphorylierung.
  • Parathormon (PTH) ist ein Hauptregulator der Kalziumhomöostase, deren hauptsächliche Zielzellen in Knochen und der Niere auftreten. Die Regulation der Kalziumkonzentration ist für das normale Funktionieren der gastrointestinalen, Skelett-, neurologischen, neuromuskulären und kardiovaskulären Systeme erforderlich. Die Synthese und Freisetzung von PTH werden hauptsächlich durch den Serumkalziumtiter gesteuert: Ein niedriger Titer stimuliert und ein hoher Titer unterdrückt sowohl die Hormonsynthese als auch die Hormonfreisetzung. PTH wiederum hält den Serumkalziumtiter durch direktes oder indirektes Fördern des Kalziumeinstroms in das Blut an drei Stellen des Kalziumaustausches: Darm, Knochen und Nieren. PTH trägt zur gastrointestinalen Nettoabsorption von Kalzium bei, indem die renale Synthese der aktiven Form von Vitamin D begünstigt wird. PTH fördert Kalziumresorption aus dem Knochen, indem Osteoblasten inhibiert werden und, indirekt, durch Stimulieren der Differenzierung der knochenresorbierenden Zellen, der Osteoclasten. Es vermittelt auch wenigstens drei Hauptwirkungen an den Nieren: Stimulierung der tubulären Kalziumresorption, Verstärkung der Phosphat-Clearance und Förderung einer Erhöhung des Enzyms, das die Synthese der aktiven Form von Vitamin D vervollständigt. PTH übt diese Wirkungen in erster Linie durch Rezeptor-vermittelte Aktivierung von Adenylatzyklase aus, obwohl auch die Rezeptor-vermittelte Aktivierung von Phospholipase C durch PTH berichtet worden ist (Hruska et al., J. Clin. Invest. 79: 230, 1987).
  • Eine Störung der Kalziumhomöostase kann viele klinische Störungen verursachen (z. B. schwere Knochenerkrankung, Anämie, Nierenstörung, Ulcera, Myopathie und Neuropathie) und ist üblicherweise das Ergebnis von Zuständen, die eine Änderung des Titers von Parathormon produzieren. Hyperkalziämie ist ein Zustand, der gekennzeichnet ist durch eine Erhöhung des Serumkalziumtiters. Sie ist oft mit primärem Hyperparathyreoidismus verbunden, bei dem eine übermäßige PTH-Produktion als Ergebnis einer Läsion (z. B. Adenom, Hyperplasie oder Karzinom) der Nebenschilddrüse erfolgt. Eine andere Art von Hyperkalziämie, maligne humorale Hyperkalziämie (HHM), ist das häufigste paraneoplastische Syndrom. Es scheint in den meisten Fällen aus der Produktion durch Tumoren (z. B. Plattenepithelzellen-, Nieren-, Ovarien- oder Blasenkarzinomen), einer neuen Klasse von Proteinhormon zu resultieren, das eine Aminosäurehomologie mit PTH teilt. Diese PTH-verwandten Proteine (PTHrP) scheinen bestimmte Nieren- und Skelettwirkungen von PTH nachzuahmen und man nimmt an, dass sie mit dem PTH-Rezeptor in diesen Geweben Wechselwirken. PTHrP wird normalerweise mit geringen Titern in vielen Geweben gefunden, einschließlich Keratinozyten, Gehirn, Hypophyse, Nebenschilddrüsen, adrenalem Cortex, Medulla, fötaler Leber, Osteoblasten-ähnlichen Zellen und laktierenden Mammageweben. Bei vielen HHM-Malignitäten wird PTHrP mit hohen Titern gefunden im Kreislaufsystem, wodurch die mit HHM assoziierten erhöhten Kalziumtiter produziert werden.
  • Die Erfindung betrifft isolierte DNA umfassend eine DNA-Sequenz, die für einen Zellrezeptor codiert, bevorzugterweise einen Parathormonrezeptor, eines Vertebraten, wobei der Rezeptor eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 30% (bevorzugterweise wenigstens 50%, oder bevorzugtererweise wenigstens 60% und am bevorzugtesten wenigstens 75%) Identität mit der in 3 (SEQ ID NO.: 3) gezeigten Aminosäuresequenz aufweist: d. h., wenn die beste Übereinstimmung zwischen den zwei Aminosäuresequenzen (unter Verwendung von Standardverfahren) erstellt wird, sind wenigstens 30% der Aminosäurereste der ersten Sequenz identisch mit den Aminosäureresten der letzteren Sequenz. Unter „isoliert" wird verstanden, dass die DNA frei von den codierenden Sequenzen von jenen Genen ist, die, im natürlicherweise auftretenden Genom des Organismus (wenn überhaupt), von dem die DNA der Erfindung abgeleitet ist, unmittelbar das Gen, das die DNA der Erfindung codiert, flankieren. Die isolierte DNA kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein und kann eine genomische DNA, cDNA, rekombinante Hyprid-DNA oder synthetische DNA sein. Sie kann identisch mit einer natürlicherweise auftretenden, Zellrezeptor (z. B. PTH-Rezeptor) -codierenden DNA-Sequenz sein, oder kann sich von einer derartigen Sequenz durch die Deletion, Addition oder Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden unterscheiden. Einzelsträngige DNAs der Erfindung sind wenigstens 18 Nukleotide lang (bevorzugterweise wenigstens 30 Nukleotide lang) und reichen bis zum Volllängengen oder zur Volllängen-cDNA; sie werden bevorzugterweise nachweisbar zur Verwendung als Hybridisierungssonden markiert und können antisense sein. Bevorzugterweise hybridisiert die isolierte DNA unter Bedingungen hoher Stringenz an eine Sequenz, die komplementär ist zu einem Teil oder der ganzen der in 1 (SEQ ID NO.: 1), 2 (SEQ ID NO.: 2), 3 (SEQ ID NO.: 3) oder 6 (SEQ ID NO.: 4) gezeigten DNA-Sequenz. Unter „hoher Stringenz" werden, beispielsweise, Bedingungen verstanden wie jene, die hierin im Folgenden für die Isolierung von menschlicher Nieren-PTH-Rezeptor-cDNA beschrieben sind (siehe auch Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989). Am bevorzugtesten ist das Tier ein Säugetier (wie beispielsweise ein Opossum, eine Ratte oder ein Mensch), und die DNA-Sequenz codiert im Wesentlichen die gesamte Aminosäuresequenz, die in 1 (SEQ ID NO.: 1), 2 (SEQ ID NO.: 2), 3 (SEQ ID NO.: 3) oder 6 (SEQ ID NO.: 4) gezeigt ist; oder durch die codierende Sequenz von einem der bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegten und mit den ATCC-Zugangsnummern 68570 oder 68571 bezeichneten Plasmide codiert ist. Die DNA der Erfindung kann in einen Vektor eingebaut sein [der als ein gereinigtes Präparat bereitgestellt sein kann (z. B: einen Vektor, der aus der Mischung von Vektoren abgetrennt ist, die eine Bibliothek ausbilden)], der eine DNA-Sequenz enthält, die einen Zellrezeptor der Erfindung codiert (z. B. Parathormonrezeptor) oder ein Fragment des Rezeptors, und eine Zelle oder eine im Wesentlichen homogene Population von Zellen (z. B. prokaryotische Zellen oder eukaryotische Zellen, wie beispielsweise Säugetierzellen), die den Vektor (oder die oben beschriebene isolierte DNA) enthalten. Unter „im Wesentlichen homogen" wird verstanden, dass wenigstens 99% der Zellen den Vektor der Erfindung enthalten (oder die isolierte DNA, wie es auch der Fall sein kann). Bevorzugterweise ist dieser Vektor (z. B. R15B) in der Lage, die Expression eines Parathormonrezeptors zu steuern (zum Beispiel in einer Zelle, die mit dem Vektor transfiziert oder transformiert ist).
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Zellrezeptor, bevorzugterweise einen Parathormonrezeptor (oder ein im Wesentlichen gereinigtes Präparat davon), das durch die Expression eines rekombinanten DNA-Moleküls hergestellt wird, das den Zellrezeptor, wie oben beschrieben, codiert. Ein „im Wesentlichen gereinigtes Präparat" ist ein solches, das im Wesentlichen frei von den Proteinen und Lipiden ist, mit dem es natürlicherweise verbunden ist.
  • In einem verwandten Aspekt betrifft die Erfindung ein Polypeptid umfassend wenigstens 6 Aminosäuren und weniger als die vollständige Aminosäuresequenz des Parathormonrezeptors, das durch die isolierte DNA, wie oben beschrieben, codiert ist. Das Polypeptid ist in der Lage, Parathormon oder Parathormon-verwandtes Protein zu binden. In bevorzugten Ausführungsformen weist dieses Polypeptid eine Sequenz auf, die aus der Gruppe ausgewählt ist umfassend:
    • (a) TNETREREVFDRLGMIYTVG; (SEQ ID NO.: 5)
    • (b) YLYSGFTLDEAERLTEEEL; (SEQ ID NO.: 6)
    • (c) VTFFLYFLATNYYWILVEG; (SEQ ID NO.: n
    • (d) Y-RATLANTGCWDLSSGHKKWIIQVP; (SEQ ID NO.: 8)
    • (e) PYTEYSGTLWQIQMHYEM; (SEQ ID NO.: 9)
    • (f) DDVFTKEEQIFLLHRAQA; (SEQ ID NO.: 10)
    • (g) FFRLHCTRNY; (SEQ ID NO.: 11)
    • (h) EKKYLWGFTL; (SEQ ID NO.: 12)
    • (i) VLATKLRETNAGRCDTRQQYRKLLK; oder (SEQ ID NO.: 13)
    • (j) ein Fragment (d. h. ein Teil mit wenigstens sechs Resten, aber weniger als alle) oder ein Analog zu (a)–(i), das in der Lage ist, Parathormon oder Parathormon-verwandtes Protein zu binden [wobei „Analog" ein Peptid mit einer Sequenz bezeichnet, die wenigstens 50% (und bevorzugterweise wenigstens 70%) identisch mit dem Peptid ist, von dem es ein Analog ist]. Bevorzugterweise wird das Polypeptid der Erfindung hergestellt durch Expression eines rekombinanten DNA-Moleküls oder es ist synthetisch (d. h. zusammengesetzt durch chemische anstelle von biologischen Mitteln). Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen eines derartigen Polypeptids bereit, wobei das Verfahren die Bereitstellung einer Zelle umfasst, die isolierte DNA enthält, die einen Zellrezeptor der Erfindung oder ein Rezeptorfragment enthält, und Kultivieren dieser Zelle unter Bedingungen, die die Expression eines Polypeptids von der isolierten DNA erlauben.
  • Die Erfindung betrifft auch einen Antikörper (monoklonal oder polyklonal) und ein gereinigtes Präparat aus einem Antikörper, der in der Lage ist, einen Immunkomplex mit einem Zellrezeptor der Erfindung auszubilden (bevorzugterweise einen Parathormonrezeptor wie beispielsweise einen menschlichen PTH-Rezeptor), wobei der Antikörper erzeugt wird, indem als Antigen entweder (1) ein Polypeptid, das ein Fragment des Zellrezeptors der Erfindung umfasst, oder (2) ein Zellrezeptor der Erfindung, der sich auf der Oberfläche einer Zelle befindet, verwendet wird. Dieser Antikörper ist bevorzugterweise in der Lage, eine biologische Aktivität des Zellrezeptors der Erfindung (d. h. eine Komponente von einer der Kaskaden, die natürlicherweise durch den Rezeptor ausgelöst werden, wenn der Ligand an ihn bindet), zu neutralisieren (d. h. teilweise oder vollständig zu inhibieren). In bevorzugten Ausführungsformen ist der Antikörper der Erfindung in der Lage, einen Immunkomplex mit Parathormonrezeptor auszubilden und in der Lage, eine biologische Aktivität des PTH-Rezeptors (d. h. Adenylatzyklase-Aktivierung oder Phospholipase C-Stimulierung) zu neutralisieren.
  • Weiterhin ist im Umfang der Erfindung eine therapeutische Zusammenfassung, die in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, (a) einen Zellrezeptor der Erfindung, (b) ein Polypeptid, das ein Fragment des Zellrezeptors der Erfindung enthält, oder (e) einen Antikörper gegen einen Zellrezeptor der Erfindung enthält. Diese therapeutischen Zusammensetzungen liefern ein Mittel zur Behandlung verschiedener Erkrankungen, die durch eine Überstimulierung der Zellrezeptoren der Erfindung durch ihren Liganden gekennzeichnet sind. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Polypeptide der Erfindung den PTH-Rezeptor, Fragmente des PTH-Rezeptors und Antikörper, die Immunkomplexe mit dem PTH-Rezeptor ausbilden. Diese Polypeptide und Antikörper sind nützlich als Diagnostika, zum Unterscheiden jener Fälle von Hyperkalziämie, die mit PTH oder PTHrP in Beziehung stehen oder nicht.
  • Die Nukleinsäuresonden der Erfindung versetzen den Fachmann auf dem Gebiet der Gentechnologie in die Lage, Zellrezeptorhomologe oder Zellrezeptoren einer anderen Spezies zu identifizieren und zu klonieren, die mit den Zellrezeptoren der Erfindung verwandt sind, wodurch die Nützlichkeit der Sequenzen der Erfindung erweitert wird.
  • Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen offensichtlich sein.
  • Zuerst werden die Zeichnungen kurz beschrieben werden.
  • 1 ist eine Darstellung der Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz, die den PTH/PTHrP-Rezeptorklon der Opossumniere, OK-H, codiert. (SEQ ID NO.: 1)
  • 2 ist eine Darstellung der Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz, die für den PTH/PTHrP-Rezeptorklon der Opossumniere, OK-O, codiert. (SEQ ID NO.: 2)
  • 3 ist eine Darstellung der Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz, die den PTH/PTHrP-Rezeptorklon des Rattenknochens, R15B, codiert. (SEQ ID NO.: 3)
  • 4 ist ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen, die durch cDNAs von den Klonen OK-O und R15B codiert sind.
  • 5 ist ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen von OK-O, OK-H und R15B, angeordnet gemäß der Sequenzhomologie.
  • 6 ist eine Darstellung der Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz, die den menschlichen PTH/PTHrP-Rezeptor codiert. (SEQ ID NO.: 4)
  • 7 ist eine schematische Darstellung der Rattenknochen-PTH/PTHrP-Rezeptor-cDNA, des menschlichen genomischen DNA-Klons HPG1 und zweier cDNA-Klone, die den menschlichen PTH/PTHrP-Rezeptor codieren.
  • 8 ist eine Hydrophobizitätsplot der abgeleiteten Aminosäuresequenz des menschlichen Nieren-PTH/PTHrP-Rezeptors. Vorhergesagte Membran-überspannende Domänen I bis VII sind angegeben; A, B und C geben zusätzliche hydrophobe Regionen an.
  • 9 ist ein Diagramm, das die Bindung von PTHrP an COS-Zellen veranschaulicht, die mit OK-H transfiziert sind.
  • 10 ist ein Diagramm, das die Stimulierung von intrazellulärem freien Kalzium durch NlePTH in COS-Zellen veranschaulicht, die mit OK-H transfiziert sind.
  • 11 ist ein Diagramm, das die Bindung von PTHrP an COS-Zellen veranschaulicht, die mit OK-O transfiziert sind.
  • 12 ist ein Diagamm, das die Stimulierung von intrazellulärem freien Kalzium durch NlePTH in COS-Zellen veranschaulicht, die mit OK-O transfiziert sind.
  • 13 ist ein Diagramm, das die Bindung von PTHrP an COS-Zellen veranschaulicht, die mit R15B transfiziert sind.
  • 14 ist ein Diagramm, das die Stimulierung von intrazellulärem freien Kalzium durch NlePTH in COS-Zellen veranschaulicht, die mit R15B transfiziert sind.
  • 15 ist ein Diagramm, das die Stimulierung des Inositolphosphat-Metabolismus durch NlePTH in COS-Zellen veranschaulicht, die mit OK-H, OK-O oder R15B transfiziert sind.
  • 16 ist ein Diagramm, das die Ansammlung von zyklischem AMP in COS-Zellen durch NlePTH zeigt, die mit CDM-8, OK-H, R15B transfiziert sind.
  • 17 sind Diagramme, die das Binden von 125I-markiertem PTH(1–34) (A und B) und 125I-markiertem PTHrP (1–36) (C und D) an COS-7-Zellen veranschaulichen, die transient den menschlichen Nieren- (A und C) und den Rattenknochen- (B und D)-PTH/PTHrP-Rezeptor exprimieren; wobei kompetitierende Liganden PTH (1–34) (☐), PTHrP (1–36) (*), PTH (3–34) (
    Figure 00070001
    ), PTH (7–34) (+) umfassen. Daten werden als spezifische Bindung angegeben und stellen das Mittel ± Standardabweichung von wenigstens drei unabhängigen Experimenten dar.
  • 18 ist ein Balkendiagramm, das die stimulierte Akkumulation von intralzellulärem cAMP in COS-7-Zellen veranschaulicht, die den menschlichen Nierenrezeptor transient exprimieren. Die Daten zeigen das Mittel ± Standardabweichung und stellen wenigstens drei unabhängige Experimente dar.
  • 19 stellt eine Northern-Blot-Analyse von Gesamt-RNA (~10 μg/Spur) dar, die aus menschlicher Niere (A) und SaOS-2-Zellen (B) hergestellt ist. Der Blot wurde mit der Volllängen-cDNA hybridisiert, die den menschlichen Nieren-PTH/PTHrP-Rezeptor codiert; die Positionen von 28S und 18S ribosomalen RNA-Banden sind angegeben.
  • 20 stellt eine Southem-Blot-Analyse von menschlicher genomischer DNA dar, die mit SstI, HindIII und XhoI (~10 μg/Spur) verdaut ist. Der Blot wurde mit der Gesamtlängen-cDNA hybridisiert, die den menschlichen Nieren-PTH/PTHrP-Rezeptor codiert.
  • 21 ist ein schematisches Diagramm der vorgeschlagenen Anordnung, in einer zellulären Membran, des PTH/PTHrP-Rattenknochen-Rezeptors, der von R15B codiert wird.
  • MATERIAL UND METHODEN
  • ALLGEMEINES: [Nle8,18, Tyr34]bPTH(1–34)-Amid (PTH(1–34)), [Nle8,18, Tyr34]bPTH(3–34)-Amid (PTH(3–34)) und [Nle8,18, Tyr34]bPTH(7–34)-Amid (PTH(7–34)) wurden von Bachem Fine Chemicals, Torrance, CA, erhalten; [Tyr36]PTHrP(1–36)-Amid (PTHrP(1–36)) wurde wie beschrieben (Keutmann et al., Endocrinology 117: 1230, 1985) unter Verwendung eines Applied Biosystems Synthesizer 420A synthetisiert. Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM), EDTA/Trypsin und Gentamycin waren von GIBCO (Grand Island, NY; fötales Rinderserum (FBS) war von Hiclone Laboratory, Logan, UT. Gesamt-RNA aus menschlicher Niere wurde von Per Hellman, University Hospital, Uppsala, Schweden, bereitgestellt. Oligonukleotidprimer wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems 380B DNA-Synthesizers synthetisiert. Restriktionsenzyme, Klenow-Enzym, T4-Polynukleotid-Kinase und T4-DNA-Ligase waren von New England Biolabs, Beverly, MA. Alkalische Phosphatase vom Kalb war von Boehringer Mannheim, Deutschland. Alle anderen Reagenzien waren von der höchsten erhältlichen Reinheit.
  • ZELLEN
  • Die verwendeten Zelllinien umfassen COS-Zellen, OK-Zellen, SaOS-2-Zellen, CHO-Zellen, AtT20-Zellen, LLC-PK1-Zellen und UMR-106-Zellen, die von einer Vielzahl von Quellen erhältlich sind, einschließlich der American Type Culture Collection (Rockland, Maryland), Zugangsnummern CRL1650, CRL6551, HTB85, CCL61, CCL89, CL101 bzw. CRL1161. ROS 17/2 und ROS 17/2.8 sind von einer Vielzahl von Quellen erhältlich, einschließlich Dr. Gideon Rodan (Merck Laboratories, West Point, PA). MC-3T3-Zellen sind von Mausknochenzellen abgeleitet und sind auch aus einer Anzahl von Quellen erhältlich, einschließlich Dr. Chohei Shigeno (Dept. of Biochem. Medicine, Hyoto Univ., Kyoto, Japan).
  • Alle Zellen wurden in einer feuchten Atmosphäre aus 95% Luft, 5% CO2 angezogen und in einer Monolayer-Kultur mit Ham's F-12- oder DMEM-Medium (Grand Island Biological Co.), ergänzt mit 5% oder 10% fötalem Kälberserum (M. A. Bioproducts, Walkersville, MD), gehalten. Das Medium wurde alle 3 oder 4 Tage gewechselt und die Zellen wurden alle 2 oder 3 Wochen durch Trypsinieren unter Verwendung von Standardverfahren subkultiviert.
  • KLONIERUNG
  • Isolierung von cDNA-Klonen, die für Ratten- und Opossum-PTH/PTHrP-Rezeptoren codieren: Gesamt-RNA wurde anfänglich aus Ratten-Osteosarkoma (ROS)-Zellen (ROS 17/2.8) und Opossum-Nieren (OK)-Zellen durch Standardverfahren unter Verwendung von Guanidiumisothiocyanat (Ullrich et al., Science 196: 1313, 1977; Chirgwin et al., Biochemistry 24: 5294, 1979) und Zentrifugation durch Cäsiumchlorid (Gilsen et al., Biochemistry 13: 2633, 1974) isoliert. Poly A+-RNAs (mRNAs) wurden dann nach Passage der Gesamt-RNAs über Oligo-dT-Säulen (Pharmacia, Piscataway, NJ) durch das Verfahren von Aviv und Leder (Proc. Natl. Acad Sci. USA 69: 14087, 1972) wiedergewonnen. Die cDNA-Bibliothek aus der ROS 1712.8 mRNA wurde aus poly A+-RNA hergestellt unter Verwendung des Verfahrens von Gubler und Hoffman (Gene (Amst.) 25: 263, 1983). Oligo-dT-geprimte und zufallsmäßig-geprimte cDNAs wurden aus poly A+-ROS 17/2.8 bzw. OK-Zell-mRNA kloniert (Aviv und Leder, a.a.O.). Die cDNAs wurden an BstX1-Linker (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert und durch Zentrifugation (3 Std., 55.000 × g) in einem 5–20% Kaliumacetatgradienten nach Größe ausgewählt. Die Größen-ausgewählte cDNA wurde dann in den Plasmidvektor, pcDNA I (Invitrogen) unter Verwendung der nicht-selbstannelierenden BstX1-Restriktionsstellen eingeführt. Die sich ergebenden Plasmid-Bibliotheken wurden dann verwendet, um E. coli (MC1061/P3, Invitrogen) zu transformieren, die ein größeres Helferplasmid, p3, enthielten. Das p3-Plasmid besitzt Bernstein-Mutationen in zwei Genen, die für Ampicillin- und Tetrazyklin-Resistenz codieren. Unter Verwendung von Ampicillin- und Tetrazyklinselektion waren nur jene Zellen in der Lage zu wachsen, die sowohl das p3 als auch ein tRNA-Suppressorgen enthielten, das in pcDNA I enthalten ist. Die transformierten Bakterien wurden dann bis zur Konfluenz angezogen und die Plasmid-DNAs isoliert unter Verwendung von Standardtechniken (z. B. siehe Ausebel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley Sons, New York, 1989). Diese DNAs wurden dann in eine DEAE-Dextran-Lösung aufgenommen und verwendet, um afrikanische Green Monkey-Nierenzellen (COS) zu transfizieren, die zu 75% Konfluenz in „Seitenflaschen" (Nunc, Dänemark) angezogen worden waren.
  • Das Screenen auf COS-Zellen, die Plasmide enthalten, die in der Lage sind, funktional intakte ROS- oder OK-Zell-Parathormon/Parathormon-verwandtes Protein (PTH/PTHrP)-Rezeptorproteine zu exprimieren, wurde durchgeführt nach Gearing et al. (EMBO J. 8: 3676, 1989) mit einigen kleineren Modifikationen, einschließlich DEAE-Dextrantransfektion in Seitenflaschen. Achtundvierzig Stunden nach Transfektion wurden die Zellen auf Bindung von 125I-markiertem [Tyr36]PTHrp(1–36)-Amid unter Verwendung von zuvor beschriebenen Verfahren (Yamamoto et al., Endocrinology 122: 1208, 1988) mit den folgenden Ausnahmen getestet: die Zeit und Temperatur der Inkubation waren 2 Std. bzw. Raumtemperatur. Nach dem Abspülen wurden die Zellen mit 1,25% Glutaraldehyd fixiert und mit 1% Gelatine abgespült. Nach dem Wegschnappen des Deckels der Seitenflasche wurde der verbliebene Mikroskopobjektträger in NTB-2-Fotoemulsion getaucht (Eastman Kodak, Rochester, NY). Nach 3–4 Tagen Exposition bei 4°C wurden die Objektträger entwickelt, fixiert und mit 0,03% Toluolblau gefärbt. Das Screenen eines jeden Objektträgers wurde unter einem Lichtmikroskop (Olympus) durchgeführt. Ein Pool aus Plasmid-DNA aus ROS-Zellen und zwei Pools aus Plasmid-DNA aus OK-Zellen (10.000 unabhängige Klone) ergaben 3–4 transfizierte COS-Zellen, die den PTH/PTHrP-Rezeptor exprimierten. Diese Pools wurden nachfolgend aufgeteilt. Die Unterpools wurden verwendet, um COS-Zellen zu transfizieren und einzelne Klone wurden identifiziert, die das Rezeptorprotein exprimierten, das in der Lage ist, an den Radioliganden zu binden.
  • Isolierung von cDNA- und genomischen DNA-Klonen, die für den menschlichen PTH/PTHrP-Rezeptor codieren: Eine Oligo-dT-geprimte cDNA-Bibliothek aus menschlicher Niere (1,7 × 106 unabhängige Klone) in Lambda GT10 und eine genomische Bibliothek aus humaner Plazenta-DNA (2,5 × 106 unabhängige Klone) in EMBL3 (Sp6/T7) (Clontech, Palo Alto, CA) wurden durch die Plaque-Hybridisierungstechnik (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflg., S. 108–113, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989) mit dem 32P-markiertem (zufalls-geprimter Markierungskit Boehringer Mannheim, Deutschland) BamHI/NotI 1.8 kb-Restriktionsenzymfragment gescreent, das den Großteil der codierenden Sequenz des PTH/PTHrp-Rezeptors des Rattenknochens (3) codiert. Die Nitrozellulosefilter wurden bei 42°C für 4 Std. in einer Prähybridisierungslösung inkubiert, die 50% Formamid, 4 × Saline-Natriumcitrat (SSC; 1x SSC: 300 mM NaCl, 30 mM NaCitrat, pH 7,0), 2 × Denhardt's Lösung, 10% Dextransulfat, 100 μg/ml Lachsspermien-DNA (Endkonzentration) enthielt. Die Hybridisierungen wurde in der gleichen Lösung bei 42°C für 18–24 Std. durchgeführt. Die Filter wurden mit 2 × SSC/0,1% SDS für 30 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen und dann mit 1 × SSC/0,1% SDS für 30 Minuten bei 45°C. Die Filme wurden bei –80°C für 18–24 Std. unter Verwendung eines Verstärkungsschirmes exponiert.
  • Etwa 1.000.000 Klone wurden aus jeder Bibliothek gescreent. Positive Klone wurden Plaquegereinigt und Lambda-Phagen-DNA wurde isoliert (Sambrook et al., a.a.O.). Klonierte Inserts wurden aus Phagen-DNA durch Verdauung mit Restriktionsendonukleasen HindIII und EcoRI (Lambda GT10-Bibliothek) oder mit XhoI und SstI (EMBL3-Bibliothek) entfernt und dann in pcDNAI (Invitrogen, San Diego, CA) subkloniert unter Verwendung der geeigneten, dephosphorylierten Restriktionsstellen. Das Sequenzieren der CsCl2-gereinigten Subklone wurde gemäß Sauger et al. (Biochem 74: 5463, 1977) mittels des Didesoxy-Terminationsverfahrens durchgeführt (Sequenase Version 2 Sequencing Kit, United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH).
  • Reverse Transkription und Polymerase Kettenreaktion (PCR): 3 μg poly(A)+RNA aus menschlicher Niere (Clontech, Palo Alto, CA) in 73,5 μl Wasser wurde bei 100°C für 30 Sekunden inkubiert, auf Eis gelöscht und dann zu 20 μl 5 × RT-Puffer hinzugegeben (1 × RT- Puffer: 40 mM Tris-HCl, pH 8,2, 40 mM KCl, 6,6 mM MgCl2, 10 mM Dithiothreitol und dNTPs jeweils 0,5 mM), 2 μl (4 Einheiten) RNasin (Promega Biotec, Madison, WI), 1 μl (80 pmo/μl) des menschlichen cDNA-Primers H12 (5'-AGATGAGGCTGTGCAGGT-3'; SEQ ID NO.: 14) und 80 Einheiten der reversen Transkriptase des Vogelmyeloblastosevirus (Life Sciences, St. Petersburg, FL) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 40 Minuten bei 42°C inkubiert. Ein Zehntel der Erststrangsynthesereaktionsmischung wurde dann durch PCR in einem Endvolumen von 100 μl amplifiziert, das 3 mM MgSO4, 200 μM dNTPs, 2 Einheiten Vent-Polymerase (New England Biolab, Beverly, MA) und jeweils 2 μM sowohl des Vorwärts- als auch des Rückwärtsprimers (PCR-Bedingungen: Denaturierung für 1 Min. bei 94°C, Annelieren für 1 Min. bei 50°C und Verlängerung bei 72°C für 3 Minuten; 40 Zyklen) enthielt.
  • Zwei unabhängige PCRs wurden durchgeführt unter Verwendung von zwei verschiedenen Vorwärtsprimern: i) degenerierter Primer RK-1
    Figure 00120001
    auf der Grundlage von dem 5'-codierenden Ende der zwei zuvor klonierten PTH/PTHrP-Rezeptoren (oben beschrieben), und ii) Primer RK-2 (5'-CGGGATCCCGCGGCCCTAGGCGGT-3'; SEQ ID NO.: 16) auf der Grundlage der 5' nicht-translatierten Region in dem Bereich des menschlichen genomischen Klons HPG1. Beide PCR-Reaktionen verwendeten den reversen Primer H26 (5'AGTATAGCGTCCTTGACGA-3'; SEQ ID NO.: 17), der die Nukleotide 713 bis 731 des codierenden Bereiches des menschlichen PTH/PTHrP-Rezeptors darstellt (4). Die PCR-Produkte wurden glattendig gemacht unter Verwendung des Klenow-Enzyms und in den dephosphorylierten pcDNAI cloniert, der mit EcoRV geschnitten war.
  • Northern-Blot-Analyse: Gesamt-RNA wurde aus SaOS-2-Zellen und aus menschlicher Niere durch das Guanidinthiocyanat-Verfahren extrahiert (Chirgwin et al., Biochem. 18: 5294, 1979). Für die Northern-Blot-Analyse wurden ~10 μg Gesamt-RNA einer Elektrophorese auf einem 1,5%/37% Formaldehydgel unterworfen und auf Nitrozellulose-Filter geblottet (Schleicher und Schuell, Keene, NH). Die Hybridisierungsbedingungen waren die gleichen wir jene für das Screenen der Phagen-Bibliotheken (siehe oben). Die Filter wurden mit einer Endstringenz von 0,5 × SSC/0,1% SDS für 30 Min. bei 60°C gewaschen und für Autoradiographie exponiert.
  • Southern-Blot-Analyse: Menschliche genomische DNA wurde hergestellt unter Verwendung des SDS/Proteinase K-Verfahrens (Gross-Bellard et al., Eur. J. Biochem. 36: 32, 1973). Für die Southern-Analyse wurden ~10 μg DNA mit SstI, PvuII und XhoI verdaut; einer Elektrophorese auf einem 0,8% Agarosegel unterzogen; und auf Nitrozellulosemembranen (Schleicher und Schuell, Keene, NH) geblottet. Die Hybridisierungsbedingungen waren die gleichen wie jene zum Screenen der Phagen-Bibliotheken (siehe oben). Die Filter wurden mit einer Endstringenz von 0,5 × SSC/0,1% SDS für 30 Min. bei 55°C gewaschen und für die Autoradiographie exponiert.
  • FUNKTIONELLE TESTS
  • Tests, um die funktionalen Eigenschaften der auf COS-Zellen exprimierten klonierten Rezeptoren zu charakterisieren, umfassten:
    • I) Binden von PTH- und PTHrP-Fragmenten und Analoga,
    • II) Stimulieren der Akkumulation von zyklischem AMP durch PTH- und PTHrP-Fragmente und -Analoga,
    • III) Erhöhen des intrazellulären freien Kalziums durch PTH- und PTHrP-Fragmente und -Analoga, und
    • IV) Aktivieren des Inositolphosphatmetabolismus durch PTH- und PTHrP-Fragmente und -Analoga davon. Die Verfahren sind wie folgt:
  • Radiorezeptor-Test
  • [Nle8,Nle18,Tyr34]bPTH-(1–34)-Amid (NlePTH), und [Tyr36]PTHrP(1–36)-Amid (PTHrP) wurden mit Na125I iodiert (trägerfrei, New England Nuclear, Boston, MA) wie zuvor berichtet (Segre et al., J. Biol. Chem. 254: 6980, 1979) und durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Kurz gesagt wurde das markierte Peptid in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) gelöst, auf eine C18-Sep-pak-Kartusche (Waten Associates, Inc., Milford, MA) aufgetragen und mit einer Lösung aus 60% Acetonitril in 0,1% TFA eluiert. Nach Lyophilisierung wurde der Radioligand dann auf eine C18-μBondapak-Säule (3,9 mm × 30 cm. Waters Associates) aufgetragen und über 30 Min. mit einem linearen Gradienten aus 30–50% Acetonitril-0,1% TFA bei einer Flussgeschwindigkeit von 2 ml/Min. eluiert. Der Radioligand eluierte in zwei Peaks; der erste Peak, der bei etwa 38% Acetonitril eluierte, wurde in diesen Studien verwendet, da er höhere Gesamt- und spezifische Bindungen ergab. Die spezifische Aktivität betrug 500 ± 75 mCi/mg, was einem durchschnittlichen Iod-Peptid-Verhältnis von 1 entspricht.
  • COS-7-Zellen wurden in 15 cm Platten in DMEM, 10% hitzeinaktiviertem FBS, 10 mg/l Gentamycin bis zu einer Konfluenz von 80–90% angezogen. Vierundzwanzig Stunden nach Transfektion mit dem DEAE/Dextran-Verfahren (Sambrook et al., a.a.O.) mit 1–2 μg Plasmid-DNA wurden die Zellen trypsiniert und erneut in Kunststoffschalen mit mehreren Näpfen (mit einem Durchmesser von 16 oder 35 mm, Costar, Cambridge, MA) erneut bei einer Zellkonzentration von 5 × 104 Zellen/cm2) ausplattiert. Die Zellzahl erhöhte sich nur geringfügig nach der Transfektion. Nach Fortsetzen der Kultur für weitere 48 Std. wurden Radiorezeptor-Tests durchgeführt. Das Kulturmedium wurde durch Puffer ersetzt, der 50 mM Tris-HCL (pH 7,7), 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 5 mM KCL, 0,5% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (GIBCO) und 5% hitzeinaktiviertes Pferdeserum (KC Biological Inc., Lenexa, KS) enthielt, unmittelbar bevor die Studien initiiert wurden. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Studien mit Zellen durchgeführt, die in diesem Puffer bei 15°C für 4 Std. mit 4 × 105 cpm/ml (9,6 × 10–11 M) 125I-markiertem NlePTH oder PTHrP inkubiert wurden.
  • Die Inkubationen wurden durch Absaugen des Puffers und wiederholtem (× 3) Waschen der Kulturschalen mit gekühlter 0,9% NaCl-Lösung über eine Zeitspanne von 15 Sek beendet, die die adhärenten Zellen enthielten. Zellgebundene Radioaktivität wurde durch sequenzielles Hinzufügen (× 3) von 1 N NaOH (200 μl) zu einem jeden Napf wiedergewonnen. Nach 30 Min. bei Raumtemperatur wurde das NaOH in ein Glasröhrchen überführt. Eine zweite und dritte Extraktion mit 1 N NaOH (200 μl) wurde mit der ersten kombiniert und die Gesamtaktivität wurde in einem γ-Spektrometer (Packard Instruments, Downers Grove, IL) gezählt. Das Anhaften des Tracers an das Kulturgefäß ohne Zellen war vernachlässigbar (< 0,2% der insgesamt hinzugegebenen Counts), sofern die Gefäße vorher mit Kulturmedium inkubiert wurden.
  • Bestimmungen von cAMP-Akkumulation
  • Intrazelluläre cAMP-Akkumulation wurde wie kürzlich beschrieben (Abou-Samra et al., J. Biol. Chem. 262: 1129, 1986) gemessen. Zellen in Platten mit 24 Näpfen wurden mit Kulturmedium abgespült, das 0,1% BSA und 2 mM IBMX enthielt. Die Zellen wurden dann mit PTH oder PTHrP für 15 Min. bei 37°C inkubiert. Der Überstand wurde entfernt und die Zellen unmittelbar durch Platzieren der gesamten Platte in Trockeneispulver eingefroren. Intrazelluläres cAMP wurde durch Auftauen der Zellen in 1 ml 50 mM HCl extrahiert und durch einen spezifischen Radioimmunotest unter Verwendung eines anti-cAMP-Antikörpers analysiert (z. B. Sigma, St. Louis, MO). Ein cAMP-Analog (zyklisches 2'-O-Monosuccinyl-Adenosin 3':5'-Monophosphattyrosylmethylester, erhalten von Sigma), der als Tracer für cAMP verwendet wurde, wurde durch das Chloramin-T-Verfahren iodiert. Freies Iod wurde durch Absorbieren des iodierten cAMP-Analogs auf einer C18 Sep-pak-Kartusche (Waters, Milford, MA) entfernt.
  • Nach dem Waschen mit dH2O wurde das iodierte cAMP-Analog von der Sep-pak-Kartusche mit 40% Acetonitril (ACN) und 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) eluiert. Das iodierte cAMP-Analog wurde lyophilisiert, rekonstituiert in 1 ml 0,1% TFA, und in eine C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule injiziert (Waters). Die Säule wurde mit 10% ACN in 0,1% TFA äquilibriert und mit einem Gradienten von 10–30% ACN in 0,1% TFA eluiert. Dies erlaubt die Abtrennung des mono-iodierten cAMP-Analogs von dem nicht-iodierten cAMP-Analog. Der Tracer ist für bis zu 4 Monate stabil, wenn er bei 20°C gelagert wird. Der für den Test verwendete Standard, nämlich zyklisches Adenosin-3':5'-Monophosphat, wurde von Sigma erworben. Die Proben (1–10 μl von HCl-Extrakten) oder Standards (0,04–100 fmol/Röhrchen) wurden in 50 mM Na-Acetat (pH 5,5) verdünnt und mit 10 μl einer Mischung aus Triethylamin und Essigsäureanhydrid (2:1 Vol:Vol) acetyliert. Nach der Acetylierung wurde cAMP-Antiserum (100 μl) aus einer in PBS (pH 7,4), 5 mM EDTA und 1% normalem Kaninchenserum hergestellten Stammlösung zugegeben. Der Tracer wurde in PBS (pH 7,4) mit 0,1% BSA verdünnt und hinzugegeben (20.000 Cpm/Röhrchen). Der Test wurde bei 4°C über Nacht inkubiert. Der gebundene Tracer wurde durch Hinzugeben von 100 μl Ziegen-anti-Kaninchen-Antiserum (1:20 in PBS) und 1 ml 7% Polyethylenglycol (MW 5000–6000) ausgefällt und bei 2000 rpm für 30 Min. bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die gebundene Radioaktivität in einem γ-Zähler (Micromedic) gezählt. Standardkurven wurden unter Verwendung des von Micromedic bereitgestellten Vier-Parameter-RIA-Programms berechnet. Typischerweise beträgt die Testempfindlichkeit 0,1 fmol/Röhrchen und die Standardkonzentration, die 50% des Tracers ersetzt, beträgt 5 fmol/Röhrchen.
  • In einem alternativen Verfahren zum Testen der cAMP-Akkumulation werden COS-Zellen, die mit PTH/PTHrP-Rezeptor-cDNA transfiziert sind, mit einem Kunststoff Gummiwischer in einer Lösung geerntet, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,2 mM MgCl, 0,5 mM Ethylenglycolbis(β-Aminoethylether)-N,N'-Tetraessigsäure (EGTA) (Sigma) und 1 mM Dithiothreitol (Sigma) enthält. Die Zellen werden durch 20 Schläge eines eng passenden Dounce-Homogenisators homogenisiert und mit 13.000 × g für 15 Min. bei 4°C zentrifugiert (Eppendorf, Typ 5412, Brinkmann Instruments, Inc., Westburg, NY. Das die Plasmamembranen enthaltende Pellet wird in dem gleichen Puffer durch mehrere Schläge mit einem Dounce-Homogenisator erneut suspendiert und weiter mit dem gleichen Puffer auf eine Proteinkonzentration von etwa 1,2 mg/ml verdünnt, wie durch das Verfahren von Lowry et al. (Lowry et al., J. Biol. Chem 193: 265, 1951) bestimmt. Etwa 30 μg (25 μl) Membran werden mit unterschiedlichen Konzentrationen an Hormon oder Vehikel alleine für 10 Min. bei 37°C (Endvolumen, 100 μl) in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,8 mM ATP, 4 × 106 cpm [α-32P]-ATP (New England Nuclear, Boston, MA), 9 mM Theophyllin, 4,2 mM MgCl2, 26 mM KCl, 0,12% BSA und einem ATP-regenerierenden System, das 5 mM Kreatinphosphat (Schwartz/Mann Division, Becton-Dickenson & Co., Orangeburg, NY) und 0,1 mg/ml Kreatinphosphokinase (Schwartz/Mann) enthält, inkubiert. Die Inkubationen werden durch Hinzugeben der Membransuspension initiiert und durch Hinzugeben von 100 μl einer Lösung beendet, die 20 mM cAMP, etwa 50.000 cpm [32H]cAMP und 80 mM ATP enthält. Die Reaktionsmischung wird gekocht und das erzeugte [32P]cAMP wird durch sequenzielle Chromatographie auf Ionenaustauschsäulen (Dowex 50 W-X4, Biorad Lab, Richmond, CA) und Aluminiumoxid (Sigma) gereinigt. Das [32P]cAMP kann in einem β-Szintillationszähler gezählt werden (Packard Instrument Co.) mit einer Korrektur für die Wiedergewinnung von [3H]cAMP.
  • Bestimmung von intrazellulärem freien Kalzium
  • Messungen von Titern an intrazellulärem Kalzium in Zellen, die mit PTH/PTHrP-Rezeptor-cDNAs transfiziert waren, wurden unter Verwendung von Fura-2 AM (Acetomethoxyester von Fura-2, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) -beladenen Zellen durchgeführt. Details des Verfahrens sind:
    Mit COS-Zellen plattierte Deckgläser wurden in Fura-2 AM-Beladungspuffer, der, in mM, enthielt: HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]), 20; CaCl2, 1; KCl 5; NaCl, 145; MgSO4, 0,5; NaHCO3, 25; K2HPO4, 1,4; Glukose, 10; und Fura-2 AM 91-(2-5'-Carboxyoxazol-2'-yl)-6-aminobenzofuran-Soxy-(2'-amino-5'-methylphenoxy)ethan-N,N,N',N'-Tetraessigsäure-Acetmethoxyester), 0,5; bei 37°C bei pH 7,4, belüftet mit 95% Luft und 5% CO2, für 45 Minuten inkubiert. Mit Fura-2 AM beladene Zellen wurden dann mit einem modifizierten Krebs-Heinseleit (KH)-Puffer gewaschen, der, in mM, enthielt: HEPES, 20; CaCl2, 1; KCl, 5; NaCl, 145; MgSO4, 0,5; Na2HPO4, 1; Glukose, 5; pH 7,4. Um zu überprüfen, dass die Spaltung des Esters erfolgt ist, wurden die Anregungsspektren zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Fura-2 AM-Inkubation gemessen. Bei 5 Min. nach dem Beginn der Inkubation wies das Anregungsspektrum ein Maximum bei etwa 360 nm auf, was eine vollständige Hydrolyse von Fura-2 AM wiedergab, wohingegen nach 30 Min. das Anregungsspektrum bei 345 nM eine Spitze aufwies, was für Fura-2 charakteristisch ist.
  • Um die Fluoreszenz einzelner Zellen zu messen, wurden die Deckgläser in eine Mikroskop-Gewebekammer (Biophysica Technologies, Inc., MD) gegeben. Die Kammer bestand aus einer flachen, ansteigenden, aus Teflon hergestellten Kammer mit einer Silikongummidichtung. Die Deckgläser dienten als der Boden der Kammer. Ein Heiz-/Kühl-Ring wurde in dem Silikongummi eingehüllt, der das Deckglas vor Ort abdichtete. Die Temperaturen wurden zwischen 22°C und 37°C variiert durch Anlegen von 0–7,4 V an dem Heizgerät. Wenn die Temperatur nicht genau angegeben ist, wurde das Experiment bei 37°C durchgeführt. Die Kammer wurde auf dem Tisch eines Umkehrmilkoskopes angebracht (Zeiss IM-35, Thornwood, NY. Fura-2-Fluoreszenz wurde mit einer 75 Watt Xenon-Bogenlampe angeregt, die an dem Brennpunkt eines Kondensors (Photon Technologies International (PTL) Inc., NJ) platziert war. Gitter-Monochromatoren, abgewechselt durch einen Drehzerhacker, in dem Spiegelflügel mit Durchlassektoren abwechseln, wurden zur Auswahl von Wellenlängen verwendet. Die Monochromator-Ausgaben wurden kombiniert, um einen gemeinsamen optischen Weg auszubilden, der das Quellengehäuse durch eine einstellbare Iris anregte. Das Licht ging dann durch Quarzlinsen und einen dichroitischen Spiegel durch ein 100 × Nikon-Fluor-Objektiv. Ein Photonen-Zähl-PMT-Vorrichtungsnachweis wurde verwendet, um die Lichtabgabe zu messen. Die Datenanalyse wurde unter Verwendung einer PTI-Software durchgeführt, die auf einem IBM-kompatiblen AT/286-Computer unter Verwendung des MS-DOS-Betriebssystems durchgeführt wurde. Die Daten wurden in einem gepackten binären Format zurückgehalten und gehandhabt.
  • Intrazelluläre Kalziumkonzentrationen wurden gemäß der folgenden Formel berechnet: [Ca2+] i = Kd (R – Rmin)/(Rmax – R)B, wobei R das Verhältnis aus Fluoreszenz der Zelle bei 340 und 380 nm ist; Rmax und Rmin die Verhältnisse der Fura-2-Fluoreszenzintensität bei 340 und 380 nm Anregungswellenlängen in Gegenwart einer sättigenden Menge Kalzium bzw. effektiv null Kalzium ist; B das Verhältnis aus Fluoreszenz von Fura-2 bei 380 nm bei null Kalzium zu der bei sättigenden Mengen von Kalzium ist; und Kd die Dissoziationskonstante von Fura-2 für Kalzium ist. Um Rmax zu bestimmen, wurde am Ende eines Experimentes Ionomycin zu den Fura-2 AM-beladenen Zellen gegeben, um Ca2+ zwischen den extrazellulären (1 mM) und intrazellulären Umgebung auszugleichen. Um Rmin zu berechnen, wurde dann 1 mM EGTA zu der Badlösung hinzugegeben. Unterschiedliche Dissoziationskonstanten wurden bei verschiedenen Temperaturen verwendet: 224 nM bei 34–37°C und 135 nM bei 24–27°C.
  • Bestimmung von Inositolphosphat
  • Das Ausmaß an Inositolphosphatmetabolismus wurde in COS-Zellen, die mit PTH/PTHrP-Rezeptoren transfiziert waren, unter Verwendung kürzlich beschriebener Verfahren bestimmt (Bonventre, et al., J. Biol. Chem. 265: 4934, 1990).
  • ERGEBNISSE
  • Molekulare Charakterisierung
  • Zwei unabhängige Klone (OK-H und OK-O), beide isoliert aus der OK-Zell-cDNA-Bibliothek, wiesen Längen von etwa 2 Kilobasen auf. Die bestimmte Nukleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz dieser Klone sind in 1 (SEQ ID NO.: 1) bzw. 2 (SEQ ID NO.: 2) gezeigt. Der R15B-Klon, der aus der ROS-Zell-cDNA-Bibliothek isoliert war, wies eine Länge von etwa 4 Kilobasen auf. Die bestimmte Nukleotidsequenz und die bestimmte Aminosäuresequenz des Rattenknochen-PTH/PTHrP-Rezeptors ist in 3 (SEQ ID NO.: 3) dargestellt.
  • Die drei cDNA-Klone scheinen Volllängenklone zu sein gemäß dem Kriterium, dass sie Codons aufweisen, die Methioninreste codieren, von denen vorhergesagt wird, dass sie die wahrscheinlichen Initiator-Methionin-Kandidaten sind. Diesen Methionin-Codons folgen Aminosäuresequenzen (abgeleitet aus der DNA) mit Eigenschaften, die nahelegen, dass sie „Signalpeptid"-Sequenzen sind. Alle drei Rezeptor-cDNAs weisen Stop-Codons an Stellen auf, die erlauben, dass diese Rezeptoren in ein Modell mit mutmaßlich sieben überspannenden Membranen „passen", das ein Modell ist, das für mit G-Protein verbundene Rezeptoren typisch ist. Am wichtigsten ist, dass alle drei klonierten Rezeptoren Liganden binden und, wenn sie aktiviert werden, in der Lage sind, intrazelluläre Effektoren zu aktivieren. Diese Eigenschaften legen nahe, dass alle drei isolierten Klone für Volllängen-cDNAs codieren.
  • 4 zeigt das hohe Ausmaß an Homologie zwischen den Aminosäuresequenzen, die von den cDNAs von OK-O und ROS 15B codiert werden. Es besteht eine Gesamthomologie von 87% und eine Aminosäureidentität zwischen diesen zwei Rezeptoren von 77,8%. Das hohe Ausmaß an Identität über lange Bereiche von Aminosäuren zeigt, dass die Aminosäuresequenz des PTH-Rezeptors in einem hohen Maße evolutionär konserviert ist. Dies erlaubt, dass Daten sowohl von OK-O als auch R15B auf andere Arten, einschließlich dem Menschen, übertragen werden können.
  • 5 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz von allen drei klonierten cDNAs, die gemäß der Sequenzhomologie angeordnet sind. Die OK-H-Sequenz ist identisch mit der von OK-O mit der Ausnahme des C-terminalen Schwanzes, wobei die OK-O-Sequenz insgesamt 585 Aminosäuren aufweist, wohingegen die OK-H-Sequenz bei 515 Aminosäuren aufhört. Dieser Unterschied wird einem einzelnen Nukleotid (G) zugeschrieben, das in der OK-H-Sequenz verglichen mit der OK-O-Sequenz deletiert ist, was eine Rahmenverschiebung und ein frühes Stopcodon in dem letzteren verursacht. Es ist nicht bekannt, ob OK-O und OK-H die Ergebnisse von zwei unterschiedlichen Genen oder ein Laborartefakt sind.
  • Einige G-Protein-gekoppelte Rezeptoren werden von Intron-freien Genen codiert (Kobilka et al., Nature 329: 75, 1987); Kobilka et al., J. Biol. Chem. 262: 7321, 1987; Heckert et al., Mol. Endocrinol. 6: 70, 1992; Kobilka et al., Science 238: 650, 1987; Bonner et al., Science 237: 527, 1987; Sunahara et al., Nature 347: 80, 1990). Um eine menschliche PTH/PTHrP- Rezeptor-cDNA zu isolieren, wurden sowohl eine menschliche cDNA-Bibliothek als auch eine menschliche genomische Bibliothek mit einer Sonde (BamHI/NotI) gescreent, die den Großteil der codierenden Region des Rattenknochen-PTH/PTHrP-Rezeptors darstellt (3). Das Screenen von einer menschlichen Nieren-cDNA-Bibliothek führte zur Isolierung des Klons HK-1 (6) [SEQ ID NO.: 4]. Da gezeigt wurde, dass eine der zwei EcoRI-Klonierungsstellen von Lambda-GT10 als Ergebnis der Bibliothekskonstruktion eliminiert worden war, wurde das HindIII/EcoRI-Phagen-Fragment, das das cDNA-Insert enthielt und 250 Basenpaare des 37 kb (linken) Lambda-Arms enthielt, in die entsprechenden Restriktionsstellen in pcDNAI einkloniert. Die DNA-Sequenzierung ergab, dass die klonierte cDNA ~1000 Basenpaare der 3' codierenden Region und ~200 Basenpaare der 3' nicht codierenden Region enthielt, einschließlich eines A-reichen 3'-Endes. Die codierende Region 5' zu der XhoI-Stelle wurde nachfolgend verwendet, um die Bibliothek erneut zu screenen und führte zur Isolierung des Klons HK-2, von dem nach Subklonierung in pcDNAI gezeigt wurde, dass er ~1400 Basenpaare der codierenden Region enthält. Für das dritte Screenen der Bibliothek wurde das PvuII/PstI-Fragment von HK-2 verwendet; es wurde gezeigt, dass der isolierte Klon HK-3 identisch zu HK-2 ist.
  • Das Screenen der genomischen Bibliothek (~106 pfu) führte zur Isolierung von vier unabhängigen Klonen. Ein Vergleich von Southern-Blot-Analysen von Restriktionsenzymverdauungen dieser Klone mit der von normaler genomischer DNA zeigte, dass ein 15 kb großer genomischer Klon, HPG1 (auch als HG4A bezeichnet), ein SstI/SstI-Fragment enthielt, das die gleiche Größe aufwies wie eine hybridisierende DNA-Spezies aus normaler menschlicher genomischer DNA, die mit SstI verdaut war (siehe unten). Das hybridisierende 2,3 kb große SstI/SstI-DNA-Fragment und ein ~8 kb XhoI-Fragment, das das SstI/SstI-Fragment enthielt, wurden beide in pcDNAI subkloniert. Eine weitergehende Southern-Blot-Analyse des SstI/SstI-DNA-Fragmentes ergab, dass ein ~1000 bp BamHI/SstI-Fragment einen Teil des menschlichen PTH/PTHrP-Rezeptors codierte, von dem später gezeigt wurde, dass er das Exon, das das mutmaßliche Signalpeptid codiert, und die 5' nicht-translatierte Region darstellt, die durch ein ~1000 bp-Intron unterbrochen wird (7).
  • Um die verbliebenen ~450 Nukleotide der codierenden Region zu isolieren, wurde eine poly(A)+-RNA aus menschlicher Niere nach Primen mit H12 (7) revers transkribiert. Nach einer Einzelstrangsynthese wurden zwei unabhängige PCRs durchgeführt unter Verwendung verschiedener Vorwärtsprimer: i) ein degenerierter Primer RK-1 auf der Grundlage des 5'-codierenden Endes der zwei zuvor klonierten PTH/PTHrP-Rezeptoren, OK-O und R15B; und ii) Primer RK-2 basierend auf der 5'-nicht-codierenden Region von HPG1. H-26 wurde als der Umkehrprimer für beide Reaktionen verwendet. Southern-Blot- und Restriktionskartierungsanalysen bestätigten die erwartete Größe der amplifizierten DNA, die den menschlichen PTH/PTHrP-Rezeptor codierte. Die glattendigen PCR-Produkte, die das 5'-Ende des menschlichen PTH/PTHrP codierten, wurden in pcDNAI kloniert unter Verwendung der dephosphorylierten EcoRV-Stellen. Die Sequenzanalyse eines jeden PCR-Klons bestätigte ihren 5'-Nukleotidunterschied infolge des Unterschiedes in der Vorwärts-Primer-Sequenz, offenbarte aber ansonsten identische Sequenzen. Nukleotidsequenzierung von beiden Strängen der menschlichen PTH/PTHrP-Rezeptor-cDNA ergab einen offenen Leserahmen, der für ein 593-Aminosäureprotein codierte (6, SEQ ID NO.: 4).
  • Die Volllängen-cDNA von PTH/PTHrP-Rezeptor-cDNA, HKrk, aus menschlicher Niere wurde konstruiert unter Verwendung des BamHI/PvuII-Fragmentes von PCR-Klon #2 und HK-2. Unter Verwendung der Volllängen-cDNA, die den menschlichen PTH/PTHrP-Rezeptor codiert, ergab die Northern-Blot-Analyse von Gesamt-RNA (~10 μg/Spur) aus menschlichen Nieren- und SaOS-2-Zellen eine hybridisierende Haupt-DNA-Spezies von ~2,5 kb (19). Der XhoI-Verdau von normaler menschlicher genomischer DNA, wenn mit der gleichen Volllängen-cDNA beprobt (20), ergab eine hybridisierende Hauptspezies mit etwa 5,5 kb und zwei DNA-Spezies mit 4 und 8 kb, die schwach hybridisierten. Diese Daten schlagen vor, dass der menschliche PTH/PTHrP-Rezeptor das Produkt eines einzelnen Gens ist. Dieser Volllängenklon wurde dann transient in COS-7-Zellen zur funktionalen und biologischen Charakterisierung durch die oben angegebenen Verfahren exprimiert.
  • Ein Vergleich des menschlichen Rezeptors mit dem PTH/PTHrP-Rezeptor der Opossumniere und dem PTH/PTHrP-Rezeptor des Rattenknochens ergab eine Aminosäuresequenzidentität von 81% bzw. 91% und entsprechend einen sehr ähnlichen Hydrophobizitätsplot (8). Alle extrazellulären Cysteine, einschließlich der zwei Cysteinreste in dem mutinaßlichen Signalpeptid, sind konserviert, ebenso wie alle potentiellen extrazellulären N-Glycosylierungsstellen. Man fand, dass eine Anzahl der Aminosäuren, die zwischen den PTH/PTHrP-Rezeptoren der menschlichen Niere und des Rattenknochens nicht identisch waren, zwischen dem menschlichen und dem Opossum-Rezeptor konserviert waren. Diese konservierten Aminosäuren umfassen ein Arg zu Leu bei 51, ein Arg zu Trp bei 58, ein Arg zu His bei 262, ein Asp zu His bei 358, ein Ile zu Thr bei 422 und ein Thr zu Leu bei 427.
  • Biologische Charakterisierung
  • Die funktionale Charakterisierung der biologischen Eigenschaften der PTH/PTHrP-Rezeptoren des Opossums und der Ratte wurde in transient transfizierten COS-Zellen durchgeführt durch die Radiorezeptor-Test-Technik, die sowohl 125I-PTHrP als auch 125I-NlePTH als Radioliganden verwendet, und durch Biotests, die Ligaaden-stimulierte cAMP-Akkumulation, Erhöhen des intrazellulären freien Kalziums und Stimulierung des Inositolphosphatmetabolismus durch die oben angegebenen Verfahren messen.
  • 9 zeigt, dass die COS-Zellen, die OK-H exprimieren, 125I-PTHrP binden. Diese Daten demonstrieren auch, dass das Binden von PTHrP inhibiert wird, wenn intaktes PTH (1–34) oder PTH-Analoge, die an ihrem Aminoterminus verkürzt sind (d. h. die 3–34 und 7–34-Analoge, die Nle-Substitutionen für Methionin an den Positionen 8 und 18 und eine Tyrosin-Substitution für Phenylalanin an Position 34 enthalten) als Kompetitoren für das Binden verwendet werden. In ähnlicher Weise wurde das Binden von 125I-NlePTH an COS-Zellen, die OK-H exprimieren, inhibiert, wenn PTHrP oder PTHrP-Fragmente als Kompetitoren verwendet wurden. Diese Daten zeigen an, dass sowohl PTH als auch PTHrP an den von OK-H codierten Rezeptor binden.
  • 10 zeigt, dass die COS-Zellen, die OK-H exprimieren, ihre Konzentration an intrazellulärem freien Kalzium erhöhen, wenn sie gegenüber NlePTH exponiert werden, aber in einem geringeren Umfang (Mittel = 39 nm), oder überhaupt nicht, verglichen mit COS-Zellen, die OK-O- oder R15B-Rezeptoren exprimieren (12 und 14) und durch NlePTH stimuliert werden. Im Unterschied zu COS-Zellen, die OK-O oder R15B exprimieren, zeigen COS-Zellen, die OK-H exprimieren, keine nachweisbare Erhöhung des Inositolphosphatmetabolismus, wenn sie mit NlePTH stimuliert werden (15).
  • 11 zeigt, dass die COS-Zellen, die OK-O exprimieren, 125I-PTHrP exprimieren. Diese Daten zeigen auch, dass das Binden von PTHrP inhibiert wird, wenn intaktes PTH (1–34) oder PTH-Analoga, die an ihrem Aminoterminus verkürzt sind (d. h. die 3–34- und 7–34-Analoga, die Nle-Substitutionen für Methionin an den Positionen 8 und 18 und eine Tyrosinsubstitution für Phenylalanin an Position 34 enthalten) als Kompetitoren für die Bindung verwendet werden. In ähnlicher Weise wurde das Binden von 125I-NlePTH an COS-Zellen, die OK-H exprimieren, inhibiert, wenn PTHrP oder PTHrP-Fragmente als Kompetitoren verwendet wurden. Diese Daten zeigen an, dass sowohl PTH als auch PTHrP an den von OK-O codierten Rezeptor binden.
  • 12 zeigt, dass COS-Zellen, die OK-O exprimieren, ihre Konzentration an intrazellulärem freien Kalzium und die Geschwindigkeit des Inositolphosphatmetabolismus nach Stimulieren mit NlePTH und PTHrP erhöhen (15).
  • 13 zeigt, dass die COS-Zellen, die R15B exprimieren, 125I-PTHrP binden. Diese Daten zeigen auch, dass das Binden von PTHrP inhibiert wird, wenn intaktes PTH (1–34) oder PTH-Analoga, die an ihrem Aminoterminus verkürzt sind (d. h. die 3–34- und 7–34-Analoga, die Nle-Substitutionen für Methionin an den Positionen 8 und 18 und eine Tyrosin-Substitution für Phenylalanin an Position 34 enthalten) als Kompetitoren für das Binden verwendet werden. In ähnlicher Weise wurde das Binden von 125I-NlePTH an COS-Zellen, die OK-H exprimieren, inhibiert, wenn PTHrP oder PTHrP-Fragmente als Kompetitoren verwendet wurden. Diese Daten zeigen an, dass sowohl PTH als auch PTHrP beide an den durch R15B codierten Rezeptor binden.
  • 14 zeigt, dass die COS-Zellen, die R15B exprimieren, ihre Konzentration an intrazellulärem Kalzium in einem Umfang erhöhen, der ähnlich dem von stimulierten COS-Zellen ist, die OK-O exprimieren.
  • 15 zeigt, dass die COS-Zellen, die R15B oder OK-O exprimieren, ihre Geschwindigkeit der Phosphatidylinositolhydrolyse erhöhen, wie durch die schnelle Erhöhung der Inositoltriphosphat (IP3)- und Inositolbisphosphat (IP2)-Akkumulation nach Stimulation der Zellen mit NlePTH oder PTHrP belegt. Im Gegensatz dazu zeigen COS-Zellen, die OK-H exprimierten, keine nachweisbare Erhöhung der Inositoltriphosphat- und Inositolbisphosphat-Akkumulierung nach Stimulierung mit NlePTH oder PTHrP. Diese Daten legen nahe, dass der durch R15B und OK-O codierte PTH-Rezeptor an Phospholipase C gekoppelt ist, mutmaßlich durch GP. Da der einzige Unterschied zwischen OK-O und OK-H in dem cytoplasmatischen C-terminalen Schwanz besteht, legen diese Daten stark nahe, dass der C-Terminus des PTH-Rezeptors, der von OK-O und R15B codiert wird, an der Aktivierung von Phospholipase C beteiligt ist.
  • 16 zeigt, dass die COS-Zellen, die R15B und OK-H exprimieren, die cAMP-Akkumulation nach Stimulation mit NlePTH erhöhen. Ähnliche Ergebnisse wurden in COS-Zellen erhalten, die OK-O exprimieren. Es wurde keine cAMP-Stimulierung in COS-Zellen nachgewiesen, die mit dem cDM8-Vektor alleine transfiziert waren. Diese Daten legen nahe, dass der PTH-Rezeptor, der an die Adenylatzyklase gekoppelt ist, den C-terminalen cytoplasmatischen Volllängen-Schwanz des Rezeptors nicht benötigt.
  • Diese Daten demonstrieren, dass alle drei PTH/PTHrP-Rezeptoren, die von sowohl OK- als auch ROS-Zell-cDNA-Bibliotheken kloniert waren, die Amino-terminalen Liganden von beiden Peptiden in äquivalenter Weise binden. Die Aktivierung all dieser Rezeptoren durch Ligand stimuliert die Adenylatzyklase (wie durch das erhöhte intrazelluläre cAMP gemessen), mutmaßlich durch die Aktivierung einer Klasse von Guaninnukleotid-bindenden Proteinen (G-Proteine). G-Proteine weisen eine trimere Peptidstruktur auf, bei der eine der Untereinheiten, alpha, unterschiedlich ist, und die beiden anderen, beta und gamma, identisch oder hoch homolog sind. Eines dieser G-Proteine (GS) enthält G-alpha-„stimulatorisch" (G-alpha-s), das an der Aktivierung von Adenylatzyklase beteiligt ist.
  • Das Binden von Ligand an OK-O und R15B, aber nicht an OK-H, erhöht auch das intrazelluläre freie Kalzium und stimuliert den Inositolphosphatmetabolismus. Diese Eigenschaften legen stark nahe, dass die Aktivierung von sowohl OK-O- als auch R15B-Rezeptoren durch Liganden zu einer Stimulierung eines zweiten intrazellulären Effektors, nämlich Phospholipase C, führt. Der Kopplungsmechanismus zwischen diesen aktivierten Rezeptoren und Phospholipase C ist wahrscheinlich ein G-Protein, das von GS verschieden ist. Im Gegensatz dazu schlagen die Eigenschaften des aktivierten OK-H-Rezeptors, der an dem Carboxy-Terminus verkürzt ist, vor, dass er die Phospholipase C nicht aktivieren kann, oder dass er Phospholipase C nicht wirksam aktiviert.
  • Die biochemische Rolle des Carboxy-terminalen Schwanzes des PTH/PTHrP-Rezeptors wurde weiter studiert durch die Konstruktion eines Carboxy-terminal-verkürzten Rattenrezeptors, R480, durch Standard-PCR-Technologie unter Verwendung von R15B als eine Matrize und einem Upstream-Primer, der ein Stop-Codon an Position 481 eingeführt enthielt. Kurz gesagt war der Upstream-Primer ein synthetisches Oligonukleotid auf der Grundlage der Nukleotide 1494–1513 der cDNA-Sequenz der Ratte (siehe 3; SEQ ID NO.: 3), an dem ein Stop-Codon und eine XbaI-Klonierungsstelle hinzugefügt wurden.
  • Dreißig PCR-Zyklen wurden durchgeführt, wobei ein jeder Zyklus aus 1 Min. bei 92°C zum Denaturieren, 1 Min. bei 60°C für Annelieren und 1 Min. bei 72°C für Verlängerung bestand. Das Produkt wurde mit NsiI und XbaI geschnitten und durch Gelelektrophorese gereinigt. R15B wurde sequenziell mit XbaI und NsiI verdaut und das gereinigte PCR-Produkt wurde dann in den XbaI-NsiI-geschnittenen R15B-Vektor ligiert. Das sich ergebende Plasmid, R480, wurde in Bakterien amplifiziert und sequenziert.
  • R480 codiert 480 Aminosäuren, die identisch zu jenen in dem 591 Aminosäure-Rezeptor sind. Diese verkürzte cDNA wurde in COS-7-Zellen (transiente Expression) und in CHO-Zellen (stabile Expression) exprimiert. Sowohl COS-7- als auch CHO-Zellen, die den frankierten Rezeptor, R480, und den Wildtyp-Rezeptor, RB, exprimierten, binden PTH (1–34) mit äquivalenten Affinitäten. Wenn aktiviert, stimuliert R480 die cAMP-Akkumulation in COS7- und CHO-Zellen genauso wirksam wie der Wildtyp-Rezeptor. Im Gegensatz zu dem Wildtyp-Rezeptor vermittelt R480 keine Erhöhung der [Ca2+]i, wenn er durch PTH in entweder den COS-7-Zellen oder den CHO-Zellen stimuliert wurde. Diese Daten zeigen an, dass die molekularen Erfordernisse für eine Aktivierung von Phospholipase C und Adenylatzyklase durch PTH/PTHrP-Rezeptor voneinander verschieden sind und weisen auf eine wesentliche Rolle des Carboxy-terminalen Schwanzes des PTH/PTHrP-Rezeptors bei der Kopplung an Phospholipase C, aber nicht an die Adenylatzyklase hin. Natürlich ist es auch möglich, dass die aktivierten PTH/PTHrP-Rezeptoren zusätzliche G-Proteine und/oder intrazelluläre Effektormoleküle aktivieren können.
  • Die Analyse von COS-7-Zellen, die mit dem klonierten menschlichen PTH/PTHrP-Rezeptor transfiziert waren, zeigte, dass radiomarkiertes PTH (1–4) und PTHrP (1–36) (200.000 Cpm) an die exprimierten Rezeptoren mit einer Wirksamkeit (spezifische Bindung: 10,1 ± 3,7% bzw. 7,6 ± 6,0%) ähnlich derjenigen banden, die für COS-Zellen beobachtet wurde, die R15B exprimierten (spezifische Bindung: 8,1 + 3,5% bzw. 7,1 + 4,1%). Die exprimierten menschlichen PTH/PTHrP-Rezeptoren banden PTH (1–34) mit einer 2-fach höheren apparenten Kd als der PTH/PTHrP-Rezeptor des Rattenknochens: ~5 nM gegenüber ~10 nM (17). Trotz ihres hohen Ausmaßes an Aminosäurehomologie zeigten die zwei Rezeptoren jedoch erhebliche Unterschiede hinsichtlich der Affinität für PTH (3–34) und PTH (7–34). PTHrP (1–36) zeigte eine 2- bis 4-fach geringere Affinität für den menschlichen PTH/PTHrP-Rezeptor als. für den Rattenrezeptor (~35 nM für HKrk gegenüber ~10 nM für R15B), was stärker ausgeprägt schien, wenn PTHrP (1–36) als Radioligand verwendet wurde. Die Affinitäten für PTHrP (3–34) und PTH (7–34) waren 7- und 35-fach höher mit dem exprimierten HKrK als mit R15B (~7 nM gegenüber ~45 nM für PTH (3–34); ~60 nM gegenüber ~2000 nM für PTH (7–34)). In COS-7-Zellen, die einen jeden Rezeptor exprimierten, stimulierte sowohl PTH (1–34) als auch PTHrP (1–36) die Erhöhung des intrazellulären freien Kalziums und der cAMP-Akkumulation in gleichem Umfang (18).
  • Beziehung von PTH/PTHrP-Rezeptoren
  • Die Aminosäuresequenz des menschlichen PTH/PTHrP-Rezeptors zeigte ein sehr hohes Ausmaß an Konservierung verglichen mit dem Knochen-PTH/PTHrP-Rezeptor von der Ratte, einem Eutheria-Säugetier, während seine Sequenzidentität mit dem PTH/PTHrP-Rezeptor mit dem Opossum, einem Marsupialia, weniger ausgeprägt ist. Ähnlich wie der Opossum-Nieren- und der Ratten-Knochen-Rezeptor induziert der menschliche Nierenrezeptor eine Erhöhung sowohl des intrazellulären cAMP als auch des intrazellulären freien Kalziums, wenn er mit entweder PTH oder PTHrP gereizt wird. Trotz des hohen Ausmaßes an Homologie zwischen dem menschlichen PTH/PTHrP-Rezeptor und dem Opossum- und Rattenhomologen weist der transient exprimierte menschliche Rezeptor einige funktionale Merkmale auf, die von jenen des Rattenknochenrezeptors verschieden sind. Diese umfassen eine geringfügig höhere Affinität für PTH (1–34) und eine erheblich verringerte Affinität für PTHrP (1–36). Höhere Affinitäten wurden für PTH (3–34) und insbesondere für PTH (7–34) beobachtet, deren Affinität für den menschlichen Rezeptor etwa 35-fach höher war verglichen mit dem Rattenknochenrezeptor. Diese Ergebnisse können erhebliche Implikationen für die weitere Entwicklung von PTH/PTHrP-Analoga aufweisen, da sie vorhersagen, dass Spezies-spezifische Gewebe die geeigneten Gewebe zum Testen des Potentials von Antagonisten (und Agonisten) in vitro wären.
  • Beziehung zwischen den PTH/PTHrP-Rezeptoren und anderen Rezeptoren
  • Die biochemischen Eigenschaften von PTH- und PTHrP-Rezeptoren legen nahe, dass sie Mitglieder der Klasse der Membran-Rezeptormoleküle sind, die als G-Protein-gekoppelte Membranrezeptoren bekannt sind. Die Strukturmerkmale von gut charakterisierten G-Proteinrezeptoren zeigen an, dass sie alle wenigstens sieben Regionen aus mehreren aufeinanderfolgenden hydrophoben Aminosäuren aufweisen, wobei eine jede Region ausreichend lang ist, um die Plasmamembran zu durchspannen.
  • Eine Unterfamilie der G-Protein-gekoppelten Membranrezeptoren, bezeichnet als die Glycopeptid-Rezeptor-Unterfamilie, umfasst Rezeptoren, die Glycopeptidhormone (Schilddrüsen-stimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon, Follikel-stimulierendes Hormon und Choriongonadotropin) binden und durch diese aktiviert werden. All diese Rezeptoren sind gekennzeichnet durch (1) extensive mutmaßliche Amio-terminale extrazelluläre Domänen (größer als 300 Aminosäuren), von denen angenommen wird, dass sie einige oder alle der Liganden-bindenden Domänen enthalten, und (2) eine erhebliche Aminosäurehomologie, insbesondere in den sieben mutmaßlichen Transmembrandomänen. Eine zweite Unterfamilie, die als die adrenerge/muskarine Unterfamilie bezeichnet wird, umfasst Rezeptoren, die durch kleine Liganden aktiviert werden, wie beispielsweise Katecholamine, neuromuskuläre Transmitter und Retinol. Diese Rezeptoren sind alle durch vergleichsweise kurze (25–75 Aminosäuren) mutmaßliche Amino-terminale extrazelluläre Domänen ebenso wie durch erhebliche Aminosäurehomologie gekennzeichnet, insbesondere in den sieben mutmaßlichen Transmembrandomänen. Die Aktivierung dieser Rezeptoren durch ihre Liganden scheint wenigstens einige der mehreren Transmembrandomänen zu involvieren und scheint nicht den Amino-terminalen Teil der Rezeptoren zu involvieren.
  • Mehrere Strukturmerkmale, die von der vorhergesagten Aminosäuresequenz des Ratten-PTH/PTHrP-Rezeptors (3) abgeleitet werden können, zeigen an, dass das PTH/PTHrP ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor ist. Der Aminoterminus zeigt charakteristische Merkmale eines Signalpeptids, einschließlich einer hydrophoben Domäne, und die Anwesenheit von drei aufeinanderfolgenden Leucinresten. Dieser Aminosäurebereich aus 20–28 Aminosäuren kann als eine Leader-Sequenz dienen, ähnlich dem Aminoterminus, der der extrazellulären Domäne von anderen Glycoproteinrezeptoren vorangeht. Es gibt auch einen Cluster aus sieben hydrophoben Segmenten, die mutmaßliche Membran-durchspannende Domänen darstellen (19).
  • Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen des PTH/PTHrP-Rezeptors der Opossumniere, des Rattenknochens und der menschlichen Niere zeigen an, dass sie nicht ohne weiteres in diese G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Unterfamilien passen. Die Gesamthomologie der PTH/PTHrP-Rezeptoren von der Ratte und vom Menschen mit dem Glycopeptidrezeptor und adrenergen/muskarinen Unterfamilien beträgt etwa 10 bis 20% mit einem etwas höheren Ausmaß an Homologie innerhalb der Transmembrandomänen. Letzteres kann erwartet werden infolge der beschränkten Auswahl an hydrophoben Aminosäuren, die in diesen Regionen auftreten können. Eine Homologie von zwanzig Prozent ist bei weitem geringer als jene, die unter den Rezeptoren gefunden wird, von denen allgemein akzeptiert wird, dass sie Mitglieder von einer jeden dieser Unterfamilien sind. Zusätzlich gibt es keine Teile dieser Sequenzen, selbst über beschränkte Bereiche hinweg, die etwas aufweisen, das als intensive Homologie gekennzeichnet werden könnte (d. h. genau passende Aminosäuresequenzen).
  • Ein jüngerer Vergleich mit den neu charakterisierten Sekretin- und Calcitonin-Rezeptoren (Ishihara et al., EMBO J 10: 1635, 1991; Lin et al., Science 254: 1022, 1991) haben eine Identität von 30% und 40% zwischen diesen Rezeptoren und dem PTH/PTHrP-Rezeptor gezeigt. Obwohl der PTH/PTHrP-Rezeptor mehr als 100 Aminosäuren länger ist als der Calcitonin-Rezeptor, besteht eine ~32% Identität zwischen den Aminosäuresequenzen des PTH/PTHrP-Rezeptors der Opossumniere (SEQ ID NO.: 2) und dem Calcitonin-Rezeptor der Schweineniere (GenBank-Zugangsnummer M74420). Ein Bereich von 17 der 18 Aminosäuren in der mutmaßlichen Transmembrandomäne VII sind identisch. Auch sind zwei der vier N-verbundenen Glycosylierungsstellen und die Position von sieben der acht potentiellen extrazellulären Cysteinen konserviert. Hauptunterschiede zwischen den zwei Rezeptoren scheinen in ihren NH2-terminalen und COOH-terminalen Domänen zu liegen. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen des Ratten-Sekretin-Rezeptors (GenBank-Zugangsnummer X59132) mit dem menschlichen PTH/PTHrP-Rezeptor zeigt an, dass eine Identität von 43% zwischen diesen beiden Rezeptoren besteht, wobei ein Bereich von 21 der 25 Aminosäuren der mutmaßlichen Transmembrandomäne VII identisch sind. Die Ähnlichkeit zwischen den PTH/PTHrP-, Calcitonin- und Sekretin-Rezeptoren legt nahe, dass sie eine neue Familie aus G-Protein-gekoppelten Rezeptoren mit sieben Transmembrandurchgängen darstellen, die Adenylatzyklase aktivieren. Mit Blick auf die Aminosäuresequenzen dieser Rezeptoren würden die Fachleute auf dem Gebiet in der Lage sein, diese Sequenzen auf identische Regionen hin zu vergleichen, was bei der Konstruktion von Nukleinsäuresonden nützlich wäre, die dann für die Identifizierung und Isolierung von anderen Rezeptoren verwendet werden könnten, die zu dieser Familie gehören könnten.
  • Hinterlegung der Klone
  • Unter den Bedingungen des Budapester Vertrages zur internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zu Zwecken von Patentverfahren sind die cDNA-Expressionsplasmide R15B, OK-O und OK-H; der Phage HPG1; und ein Plasmid (als 8A6 bezeichnet), das einen Teil des menschlichen Klons enthält, bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt worden, wo sie die entsprechenden Zugangsnummern ATCC Nr. 68571, 68572, 68573, 40998 und 68570 tragen. Die Rechtsnachfolgerin der Anmelder, The General Hospital Corporation, versichert, dass die ATCC eine Hinterlegungsstelle ist, die eine andauernde Hinterlegung und leichte Zugänglichkeit dazu für die Öffentlichkeit sicherstellt, wenn ein Patent erteilt wird. Alle Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit des solchermaßen hinterlegten Materials für die Öffentlichkeit werden unwiderruflich nach der Erteilung eines Patentes zurückgenommen werden. Das Material wird während der Anhängigkeit der Patentanmeldung für eine von dem Commissioner gemäß 37 CFR 1.14 und 35 U.S.C. 122 bestimmte berechtigte Person verfügbar sein. Das hinterlegte Material wird mit aller erforderlicher Sorgfalt behandelt werden, um es für eine Zeitspanne von wenigstens fünf Jahren nach der letzten Anforderung zur Bereitstellung einer Probe des hinterlegten Plasmides und in einem jeden Falle für eine Zeitspanne von wenigstens dreißig (30) Jahren nach dem Hinterlegungsdatum oder für die durchsetzbare Laufzeit des Patentes am Leben und unkontaminiert zu halten, je nachdem welche Zeitspanne länger ist. Die Rechtsnachfolgerin der Anmelder erkennt ihre Verpflichtung an, die Hinterlegungen zu ersetzen, sollte die Hinterlegungsstelle infolge des Zustandes der Hinterlegung nicht in der Lage sein, auf Anforderung eine Probe bereitzustellen.
  • POLYPEPTIDE
  • Hierin offenbarte Polypeptide umfassen die Opossum- und Ratten- und menschliche Parathormonrezeptoren, wie in den 1–3 bzw. 6 gezeigt, und einen jeglichen anderen natürlicherweise vorkommende Rezeptor, der durch Verfahren hergestellt werden kann, die analog zu jenen sind, die verwendet wurden, um diese Rezeptoren zu klonieren und zu exprimieren, oder durch Verfahren, die als eine Sonde alle oder einen Teil einer der hierin beschriebenen Sequenzen verwenden. Zusätzlich werden Analoga oder Fragmente eines PTH-Rezeptors offenbart, die in der Lage sind, an Parathormon oder ein Parathormon-verwandtes Protein zu binden.
  • Spezifische interessierende Rezeptoranaloga umfassen Volllängen-Rezeptorproteine oder Teilrezeptorproteine mit einer Aminosäuresequenz, die sich nur durch konservative Aminosäureaustausche unterscheiden: zum Beispiel die Substitution von einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure der gleichen Klasse (z. B. Valin für Glycin; Arginin für Lysin etc.), oder durch eine oder mehrere nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen, Deletionen oder Insertionen unterscheiden, die an Positionen angeordnet sind, die die Fähigkeit des Rezeptors, an Parathormon oder an Parathormon-verwandtes Protein zu binden, nicht zerstören.
  • Spezifische Rezeptorfragmente von besonderem Interesse umfassen, sind allerdings nicht darauf beschränkt, Abschnitte des Rezeptors, von denen aus der primären Aminosäuresequenz abgeleitet wurde, dass sie extrazellulär sind, unter Verwendung einer Hydrophobie/Hydrophilie-Berechnung, wie beispielsweise dem Chou-Fasman-Verfahren (siehe, z. B. Chou und Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47: 251, 1978). Hydrophile Domänen, insbesondere jene, die von hydrophoben Abschnitten (z. B. Transmembrandomänen) aus wenigstens 10 Aminosäuren umgeben sind, präsentieren sich als starke Kandidaten für extrazelluläre Domänen. 21 veranschaulicht eine vorhergesagte Anordnung aus extrazellulären, intrazellulären und Transmembrandomänen von einem PTH-Rezeptor.
  • Beispiele für spezifische PTH-Rezeptorfragmente umfassen jene mit den folgenden Aminosäuresequenzen (gezeigt in standardmäßigen Einbuchstabensymbolen), die von der abgeleiteten Aminosäuresequenz des R15B-Klons abgeleitet sind:
  • Extrazelluläre Domänen:
    Figure 00300001
  • Intrazelluläre Domänen:
    Figure 00310001
  • Diese Fragmente wurden synthetisiert und durch HPLC gemäß dem Verfahren von Keutmann et al., (Endocrinology 117: 1230, 1984) gereinigt.
  • EXPRESSION VON POLYPEPTIDEN
  • Polypeptide gemäß der Erfindung können hergestellt werden durch Expression von einer rekombinanten Nukleinsäure mit einer Sequenz, die einen Teil oder den gesamten Zellrezeptor der Erfindung codiert, unter Verwendung eines geeigneten Expressionssystems: z. B. Transformation einer geeigneten Wirtszelle (entweder prokaryotisch oder eukaryotisch) mit der rekombinanten Nukleinsäure in einem geeigneten Expressionsvehikel (z. B. pcDNAI). Die genaue Wirtszelle, die verwendet wird, ist für die Erfindung nicht kritisch; im Falle jedoch, wo die Polypeptide der Erfindung den ganzen oder einen Teil des PTH/PTHrP-Rezeptors umfassen, sind die folgenden Wirtszellen bevorzugt: COS-Zellen, LLC-PK1-Zellen, OK-Zellen, AtT20-Zellen und CHO-Zellen. Das Transfektionsverfahren und die Auswahl des Expressionsvehikels wird abhängig sein von dem ausgewählten Wirtssystem. Verfahren zur Transfektion von Säugerzellen sind, beispielsweise, beschrieben in Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989); Expressionvehikel können ausgewählt werden von jenen, die, beispielsweise, diskutiert sind in Cloning Vectors: A Laboratory Manual (P.H. Pouwels et al., 1985, Ergänzungsband 1987). Stabil transfizierte Zellen werden vermittels Integration von Rezeptor-DNA in die Wirtszellchromosomen bereitgestellt. Geeignete DNAs werden in pcDNA, pcDNAI-Neo oder andere geeignete Plasmide eingeführt, und dann werden Zellen mit diesem Plasmid mit oder ohne Cotransfektion mit psV-2-Neo oder psV-2-DHFR durch Standard-Elektroporation, Kalziumphosphat und/oder DEAE/Dextran-Techniken transfiziert. Die Auswahl von transfizierten Zellen wird durchgeführt unter Verwendung von sich progressiv erhöhenden Titern an G418 (Geneticin, GIBCO), und sofern erforderlich, Methotrexat.
  • DNA-Sequenzen, die die Polypeptide der Erfindung codieren, können auch in einer prokaryotischen Wirtszelle exprimiert werden. DNA, die einen Zellrezeptor oder ein Rezeptorfragment codiert, wird in einem Vektor getragen, der funktionsfähig mit Steuersignalen verbunden ist, die in der Lage sind, die Expression in dem prokaryotischen Wirt zu bewirken. Sofern erwünscht, kann die codierende Sequenz an ihrem 5'-Ende eine Sequenz enthalten, die irgendeine der bekannten Signalsequenzen codiert, die in der Lage sind, die Sekretion des exprimierten Proteins in den periplasmatischen Raum der Wirtszelle zu bewirken, wodurch die Wiedergewinnung des Proteins und die nachfolgende Reinigung erleichtert wird. Prokaryonten, die am häufigsten verwendet werden, sind verschiedene Stämme von E. coli; andere mikrobielle Stämme können jedoch auch verwendet werden. Plasmidvektoren werden verwendet, die Replikationsursprünge, selektierbare Marker und Steuersequenzen enthalten, die von einer Spezies stammen, die mit dem mikrobiellen Wirt kompatibel ist. Beispielsweise kann E. coli transformiert werden unter Verwendung von Derivaten von pBR322, einem Plasmid, das von Bolivar et al. konstruiert wurde (Gene 2: 95, 1977) unter Verwendung von Fragmenten, die abgeleitet sind von drei natürlich vorkommenden Plasmiden, zwei isoliert aus Arten von Salmonella und eines isoliert aus E. coli. pBR322 enthält Gene von Ampicillin- und Tetrazyklin-Resistenz und liefert somit mehrere selektierbare Marker, die bei der Konstruktion des erwünschten Expressionsvektors entweder beibehalten oder zerstört werden können. Üblicherweise verwendete prokaryorische Steuersequenzen (auch als „regulatorische Elemente" bezeichnet) sind hierin so definiert, dass sie Promotoren für die Initiierung der Transkription umfassen, optional mit einem Operator, zusammen mit Ribosomenbindungsstellensequenzen. Üblicherweise verwendete Promotoren, um die Proteinexpression zu steuern, umfassen die beta-Lactamase- (Penicillinase), die Lactose- (lac) (Chang et al., Nature 198: 1056, 1977) und die Tryptophan (Trp)-Promotorsysteme (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980) ebenso wie den von lambda abgeleiteten PL-Promotor und die N-Gen-Ribosomenbindungsstelle (Simatake et al., Nature 292: 128, 1981).
  • Die Art des Zellrezeptorproteins der Erfindung ist so, dass es, nach Expression innerhalb einer Zelle, zu der Zellmembran und teilweise durch die Zellmembran bewegt wird, so dass ein Teil davon in der Membran eingebettet verbleibt, ein Teil sich außerhalb der Zelle erstreckt und ein Teil innerhalb der Zelle verbleibt. Transformierte Zellen, die derartige eingebettete Zellrezeptoren tragen, können in den Verfahren der Erfindung selbst verwendet werden, oder es kann das Rezeptorprotein aus diesen Membranen extrahiert und gereinigt werden.
  • Die Expression von Peptidfragmenten, denen die hydrophoben Abschnitte des Proteins fehlen, die für das Verankern des intakten Proteins in der Zellmembran verantwortlich sind, würde man nicht in die Membran eingebettet erwarten; ob sie innerhalb der Zelle verbleiben oder in das extrazelluläre Medium sekretiert werden, hängt davon ab, ob ein Mechanismus, der die Sekretion fördert (z. B. ein Signalpeptid), enthalten ist oder nicht. Wenn es sekretiert wird, kann das Polypeptid der Erfindung aus dem Medium geerntet werden; wenn nicht, müssen die Zellen aufgeschlossen werden und das erwünschte Polypeptid aus den gesamten Inhalten der Zellen isoliert werden. Spezifische Beispiele für Polypeptide, die exprimiert werden können, umfassen ohne Beschränkung:
    • 1) Den aminoterminalen Teil umfassend Aminosäuren 1–192, einschließlich der mutmaßlichen Leader-Sequenz, des Rattenknochen-PTH/PTHrP-Rezeptors, wie in 3 gezeigt.
    • 2) Den aminoterminalen Teil umfassend Aminosäuren 27–192, ausschließlich der mutmaßlichen Leader-Sequenz, des Rattenknochen-PTH/PTHrP-Rezeptors, wie in 3 gezeigt.
    • 3) Den Volllängen-PTH/PTHrP-Rezeptor aus Rattenknochen, wie in 3 gezeigt.
    • 4) RP-1 (wie oben beschrieben).
    • 5) RP-2 (wie oben beschrieben).
  • Die Polypeptide der Erfindung können leicht unter Verwendung von Affinitätschromatographie gereinigt werden. Antikörper gegen diese Polypeptide, oder die Rezeptor-spezifischen Liganden (z. B. die Hormone PTH und PTHrP für den PTH/PTHrP-Rezeptor) können kovalent an einen Festphasenträger gekoppelt sein, wie beispielsweise Sepharose 4 CNBr-aktivierte Sepharose (Pharmacia), und verwendet werden, um die Polypeptide der Erfindung von irgendwelchen kontaminierenden Substanzen abzutrennen. Typischerweise wird 1 mg Ligand oder Antikörper mit CNBr-aktivierter Sepharose bei 4°C für 17–20 Std. (unter Schütteln) inkubiert werden. Die Sepharose wird mit 1 M Tris HCL (pH 8) abgespült, um überschüssige Bindungsstellen zu blockieren. Das Sepharose-PTH, das Sepharose-PTHrP oder der Sepharose-Antikörper wird dann mit dem rohen Polypeptid in Phosphat-gepufferter Saline (pH 7,4) bei 4°C für 2 Std. (unter Schütteln) inkubiert. Die Sepharose wird dann typischerweise in eine Säule gepackt, gründlich mit PBS (typischerweise dem 10-fachen Säulenvolumen) gewaschen und mit verdünner HCl in H2O (pH 1,85) eluiert. Das Eluat kann dann durch Lyophilisierung konzentriert und seine Reinheit durch, beispielsweise, Umkehrphasen-HPLC geprüft werden.
  • Anti-Zell-Rezeptor-Antikörper
  • Zellrezeptoren oder Rezeptorfragmente der Erfindung können verwendet werden, um Antikörper durch ein jegliches herkömmliches Verfahren zu erzeugen, das den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt ist, einschließlich jener, die polyklonale Antikörper erzeugen, und jener, die monoklonale Antikörper erzeugen. Zum Beispiel offenbart die abgeleitete Aminosäuresequenz des PTH-Rezeptors eine Proteinstruktur, die mehrere Transmembran- (d. h. hydrophobe) Domänen aufzuweisen scheint, die hier und da zwischen mutmaßlichen extrazellulären und intrazellulären Regionen (siehe 21) eingefügt sind, analog zu jenen in anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gefundenen. Diese Information kann verwendet werden, um die Auswahl von Regionen des Rezeptorproteins zu steuern, von denen es wahrscheinlich ist, dass sie auf der Zelloberfläche exponiert und somit gegenüber Antikörper in vivo präsentiert werden würden. Ein kurzes Peptid, das eine oder mehrere derartige Regionen darstellt, kann synthetisiert (z. B. chemisch oder durch rekombinante DNA-Techniken) und verwendet werden, um ein Tier (z. B. ein Kaninchen oder eine Maus) zu immunisieren, um polyklonale oder monoklonale Antikörper zu erzeugen. Zum Beispiel sind bestimmte der oben angegebenen Peptide des PTH/PTHrP-Rezeptors (RP-1, RP-5 und RP-6) chemisch unter Verwendung von Standardtechniken synthetisiert und verwendet worden, um polyklonale Antikörper in Kaninchen durch das folgende Verfahren zu erzeugen:
    Ein Präparat eines gegebenen Peptids, das mit komplettem Freund'schem Adjuvans emulgiert ist, wird intradermal in Kaninchen injiziert. Auffrischungsinjektionen werden in oder vollständigem Adjuvans emulgiert und in monatlichen Intervallen injiziert.
  • Der Antikörpertiter wird unter Verwendung eines von zwei Verfahren bestimmt. Zuerst werden Reihenverdünnungen des Antiserums in 1% normalem Kaninchenserum mit 125I- markiertem PTH/PTHrP-Rezeptorfragment mittels Standardverfahren (z. B. siehe Segre et al., a.a.O.) für 24 Std. bei 4°C inkubiert. Die gebundenen 125I-PTH/PTHrP-Rezeptorfragmente werden von ungebundenen durch Hinzufügen von 100 μl eines zweiten Antikörpers (Anti-Kaninchen-IgG, Sigma) abgetrennt, der 1:20 verdünnt ist, und 1 ml 5% Polyethylenglykol, gefolgt von Zentrifugation bei 2000 Upm für 30 Min. bei 4°C. Der Überstand wird entfernt und das Pellet auf Radioaktivität in einem γ-Zähler analysiert. Bei dem zweiten Verfahren werden Zelllinien, die entweder native (z. B. ROS 17/2.8, OK, SaOS-02-Zellen) oder rekombinante (COS-Zellen oder CHO-Zellen, die mit R15B, OK-O oder OK-H transfiziert sind) PTH/PTHrP-Rezeptoren exprimieren, mit seriell verdünntem Antikörper bei 4°C, 20°C oder 37°C für 1–4 Std. inkubiert. Die Zellen werden mit PBS (× 3) abgespült und für 2 Std. bei 4°C mit 125I-markiertem (NEN, Dupont) oder FITC-markiertem (Sigma) zweiten Antikörpern inkubiert. Nach Abspülen (× 3 mit PBS) werden die Zellen entweder mit 0,1 M NaOH lysiert und in einem γ-Zähler gezählt (sofern ein 125I-markierter zweiter Antikörper verwendet wurde) oder mit 1% Paraformaldehyd fixiert und durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert (wenn ein FITC-markierter zweiter Antikörper verwendet wurde).
  • Ein weiteres Verfahren zum Herstellen von Antikörpern verwendet als Antigen das intakte Zellrezeptorprotein der Erfindung, das auf der Oberfläche von Zellen (z. B. Säugerzellen, wie beispielsweise COS-Zellen, die mit DNA codierend den Rezeptor transfiziert sind) exprimiert werden. Derartige Zellen werden durch Standardverfahren hergestellt, z. B. durch das DEAE-Dextran-Transfektionsverfahren, unter Verwendung eines Vektors, der den Zellrezeptor codiert und in der Lage ist, eine starke Expression desselben zu steuern. Derartige Zellen können verwendet werden, um polyklonale oder monoklonale Antikörper zu erzeugen. Zum Beispiel können monoklonale Antikörper, die für den PTH/PTHrP-Rezeptor spezifisch sind, durch das folgende Verfahren hergestellt werden:
    Intakte COS-Zellen, die große Mengen an rekombinanten Ratten-PTH-Rezeptoren auf der Zelloberfläche exprimieren, werden intraperitoneal (IP) in Balb-c-Mäuse (Charles River Laboratories, Willmington, MA) injiziert. Die Mäuse werden alle 4 Wochen durch IP-Injektion aufgefrischt und durch eine intravenöse (IV) Auffrischung 3 Tage vor der Fusion hyperimmunisiert. Milzzellen von den Mäusen werden isoliert und durch Standardverfahren mit Myelomzellen fusioniert. Hybridome werden in standardmäßigem Hypoxanthin/Aminopterin/Thymin-(HAT)-Medium gemäß Standardverfahren selektiert. Hybridome, die Antikörper sekretieren, die den PTH-Rezeptor erkennen, werden anfangs durch Screenen mit Zelllinien, die natürlicherweise reichlich Kopien des PTH-Rezeptors pro Zelle (wie beispielsweise ROS 17/2.8 oder OK-Zellen) exprimieren, unter Verwendung von immunologischen Standardtechniken identifiziert. Jene Hybridome, die Antikörper produzieren, die in der Lage sind, an den PTH-Rezeptor zu binden, werden kultiviert und subkloniert. Ein zweites Screenen mit Radiorezeptor- und cAMP-Stimulierungstests kann dann durchgeführt werden, um die monoklonalen Antikörper weiter zu charakterisieren (siehe unten).
  • SCREENEN AUF PTH-REZEPTOR-ANTAGONISTEN UND -AGONISTEN
  • Die Polypeptide und Antikörper der Erfindung und andere Verbindungen können auf PTH-Kompetition und auf antagonistische und agonistische Eigenschaften unter Verwendung der hierin beschriebenen Tests gescreent werden.
  • In einem Beispiel werden jene Antikörper, die den PTH-Rezeptor auf den intakten Zellen erkennen, auf ihre Fähigkeit hin gescreent, mit PTH oder PTHrP um das Binden an einen PTH/PTHrP-Rezeptor zu kompetieren. Zellen, die den PTH-Rezeptor auf der Zelloberfläche exprimieren, werden mit 125I-PTH-Analog, 125I-NlePTH oder 125I-PTHrP in Gegenwart oder in Abwesenheit des zu testenden polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers für 4 Std. bei 15°C inkubiert. Der verwendete Antikörper kann aus einem rohen Antiserum, Zellmedium oder Aszites stammen oder in gereinigter Form vorliegen. Nach Inkubation werden die Zellen mit Bindungspuffer (z. B. physiologische Saline) abgespült, lysiert und quantitativ auf Radioaktivität hin unter Verwendung eines Gamma-Zählers analysiert. Antikörper, die die Bindung des PTH-Analogs an den PTH-Rezeptor verringern, werden als kompetitiv klassifiziert; jene, die nicht, als nicht-kompetitiv.
  • Verbindungen, einschließlich Antikörper und Polypeptide, können auf ihre agonistischen oder antagonistischen Eigenschaften unter Verwendung der cAMP-Akkumulation, des intrazellulären Kalziums und/oder des Inositolphosphattests gescreent werden, die oben beschrieben sind. Zellen, die den PTH-Rezeptor auf der Zelloberfläche exprimieren, werden mit PTH, PTH-Rezeptor-Antikörper oder einer Kombination aus beidem für 5–60 Minuten bei 37°C in Gegenwart von 2 mM IBMX (3-Isobutyl-1-methyl-xanthin, Sigma, St. Louis, MO) inkubiert. Akkumulation von zyklischem AMP wird durch einen spezifischen Radio-Immunotest gemessen, wie oben beschrieben. Eine Verbindung, die mit PTH um das Binden an den PTH-Rezeptor kompetitiert und die die Wirkung von PTH auf cAMP-Akkumulation inhibiert, wird als kompetitiver PTH-Antagonist erachtet. Umgekehrt wird eine Verbindung, die nicht um die PTH-Bindung an den PTH-Rezeptor kompetitiert, aber noch eine PTH-Aktivierung von cAMP-Akkumulation verhindert (mutmaßlich durch Blockieren der Rezeptoraktivierungsstelle) als ein nicht-kompetitiver Antagonist betrachtet. Eine Verbindung, die mit PTH um die Bindung an den PTH-Rezeptor kompetitiert und die die cAMP-Akkumulation in Gegenwart oder Abwesenheit von PTH stimuliert, ist ein kompetitiver Agonist. Eine Verbindung, die nicht mit PTH um die Bindung an den PTH-Rezeptor kompetitiert, aber die noch in der Lage ist, die cAMP-Akkumulation in Gegenwart oder Abwesenheit von PTH zu stimulieren, oder die eine höhere Akkumulation als jene stimuliert, die durch PTH alleine beobachtet wird, würde als ein nicht-kompetitiver Agonist betrachtet werden.
  • ANWENDUNG
  • Die Polypeptide, Antikörper und andere Verbindungen der Erfindung sind für die Diagnose, Klassifikation, Prognose und/oder Behandlung von Erkrankungen nützlich, die als mit der Wechselwirkung eines Zellrezeptors der Erfindung und eines spezifischen Ligands in Beziehung stehend charakterisiert werden können. Beispielsweise stehen einige Formen von Hyperkalziämie und Hypokalziämie in Beziehung mit der Wechselwirkung zwischen PTH und PTHrP und dem/den PTH/PTHrP-Rezeptor(en). Hyperkalziämie ist ein Zustand, bei dem eine anormale Erhöhung des Serumkalziumspiegels vorhanden ist; sie ist oft mit anderen Erkrankungen verbunden, einschließlich Hyperparathyreoidismus, Osteoporose, Karzinomen der Brust, Lunge und Prostata, Plattenepithelkarzinomen des Kopfs und Halses des Ösophagus, multiplem Myelom und Hypernephrom. Hypokalziämie, ein Zustand, bei dem der Serumkalziumtiter anormal niedrig ist, kann sich aus einem Mangel an wirksamem PTH ergeben, d. h. nach einer Schilddrüsenoperation.
  • In einem ersten Beispiel werden die Verbindungen der Erfindung verwendet, um diagnostische Mittel herzustellen, die als diagnostische Werkzeuge für die Diagnose von Hyperkalziämie verwendet werden, und um zwischen hyperkalziämischen Zuständen zu unterscheiden, d. h. Hyperkalziämie, die durch PTH oder PTHrP vermittelt wird (z. B. Hyperparathyreoidismus und humorale maligne Hyperkalziämie) und Hyperkalziämie zu differenzieren, die mit Erkrankungen verbunden ist, die diese Faktoren nicht involvieren (z. B. lokale osteolytische Hyperkalziämie, die durch die Anwesenheit von metastatischen Tumorzellen in direktem Kontakt mit Knochen vermittelt sind, und bestimmte seltene Arten mit Malignität in Beziehung stehenden Hyperkalziämien, die durch eine Erhöhung humoraler Faktoren vermittelt werden, wie beispielsweise Osteoklasten-aktivierender Faktor (Interleukin), Lymphotoxin, Calcitriol, Typ-E-Prostaglandine und Vitamin D-ähnliche Sterole).
  • In einem Diagnoseverfahren werden Serum-Gesamttiter und/oder Titer an ionisiertem Kalzium durch Standardverfahren vor und nach der Verabreichung der PTH oder PTHrP-Antagonisten der Erfindung gemessen. Mit PTH oder PTHrP in Beziehung stehende Hyperkalziämien wären als eine Verringerung der Serumkalziumtiter nach Verabreichung des Antagonisten der Erfindung nachweisbar. Im Gegensatz dazu würden für hyperkalziämische Zustände, die durch Faktoren vermittelt werden, die von PTH oder PTHrP verschieden sind, die Serumkalziumtiter sogar nach Verabreichung des Antagonisten unverändert bleiben.
  • Eine weitere diagnostische Anwendung der Erfindung erlaubt die Messung der Titer von PTH oder PTHrP in einer biologischen Probe, um mit PTH oder PTHrP in Beziehung stehende Tumoren zu diagnostizieren, z. B. Tumoren, die mit humoraler maligner Hyperkalziämie verbunden sind, und um den Titer von PTH oder PTHrP während Krebstherapie zu überwachen. Dieses Verfahren umfasst das Testen der Bindung des rekombinanten Parathormonrezeptors der Erfindung an PTH oder PTHrP, das in einer Gewebeprobe vorhanden ist, unter Verwendung des hierin beschriebenen Bindungstests. Der Umfang an Bindung kann direkt bestimmt werden (z. B. durch Verwendungen von radioaktiv markiertem PTH-Rezeptar und Testen der an endogenem PTH gebundenen Radioaktivität). Alternativ kann die Bindung von PTH-Rezeptor an die Probe (z. B. ein Gewebeschnitt) durch Färben der Gewebeschnitte mit einem Antikörper verfolgt werden, der für den PTH-Rezeptor spezifisch ist, unter Verwendung von immunologischen Standardtechniken (Chin et al., Hybridoma 5: 339, 1986).
  • In einem dritten diagnostischen Ansatz könnte man Zelllinien stabil (durch die in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Publishers, New York, 1987 beschriebenen Verfahren) mit einem PTH-Rezeptorgen transfizieren, das an einen geeigneten Promotor gebunden ist (z. B. dem Metallothionin-Promotor). Alternativ könnte der PTH-PTHrP-Rezeptor von einem eukaryontischen Vektor exprimiert werden, beispielsweise pcDNAI, und mit einem mutierten DHFR-Gen kotransfiziert werden, das eine weitere Genamplifikation vermittels Methotrexat-Selektion erlauben wird (Simonsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2495–2499, 1983). Eine derartige Expression des Gens auf hohem Niveau liefert eine immortale Zelllinie, die gegenüber PTH oder PTHrP überempfindlich ist. Derartige Zellen sind ein besonders nützliches Werkzeug zum Nachweisen von Serumbluttitern an PTH oder PTHrP. Eine derartige Zelllinie kann für die Diagnose von Zuständen verwendet werden, die erhöhte PTH- oder PTHrP-Titer involvieren (z. B. jene, die oben beschrieben sind), oder für Bedingungen, die ungewöhnlich niedrige Titer an PTH oder PTHrP involvieren (z. B. jene, die oben beschriebenen sind). Eine derartige Zelllinie ist auch zum Überwachen der Regression oder Erhöhung von PTH- oder PTHrP-Titern während der Therapie für Hyperkalziämien bzw. Hypokalziämien nützlich.
  • Obgleich nicht Teil der vorliegenden Erfindung, wird auch offenbart, dass ein Patient, von dem man vermutet, dass er hyperkalziämisch ist, unter Verwendung von Verbindungen behandelt werden kann, die durch die Verfahren der Erfindung identifiziert sind. Eine schnelle Intervention ist wichtig, da Symptome abrupt auftreten und, sofern nicht umgekehrt, fatal sein können. In einer Anwendung werden die Serumkalziumtiter durch einen unmittelbaren Behandlungsverlauf stabilisiert, der Antagonisten von PTH oder PTHrP umfasst. Derartige Antagonisten umfassen Verbindungen, von denen man (durch die hierin beschriebenen Tests) bestimmt hat, dass sie die PTH-Rezeptor-vermittelte Zellaktivierung stören. Um den Antagonisten zu verabreichen, wird der geeignete Antikörper oder das geeignete Peptid bei der Herstellung eines Medikamentes verwendet, im Allgemeinen indem es in einem geeigneten Träger, wie beispielsweise physiologischer Saline, formuliert wird, und intravenös mit einer Dosis verabreicht wird, die eine ausreichende Kompetition für PTH- oder PTHrP-Bindung an dem PTH-Rezeptor bereitstellt (z. B. eine Dosierung, die ausreichend ist, um den Serumkalziumtiter unter 10 mg/dl zu verringern). Typische Dosierungen würden 1 ng bis 10 mg des Antikörpers oder Peptids pro kg Körpergewicht pro Tag sein. Die Behandlung kann sofern erforderlich für eine Langzeitaufrechterhaltung akzeptabler Kalziumtiter wiederholt werden (d. h. Titer < 10,1 mg/dl). Dies kann für eine akute Behandlung eines zugrundeliegenden Erkrankungszustandes erforderlich sein, der Hyperkalziämie auslöst; oder sie kann beispielsweise für die chronische Behandlung von Zuständen wie Osteoporose verwendet werden.
  • Obgleich nicht Teil der vorliegenden Erfindung, wird hierin auch offenbart, dass in einer weiteren Anwendung Verbindungen, die gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung als Agonisten charakterisiert worden sind, therapeutisch verwendet werden können, um Hypokalziämie zu behandeln: z. B. jene, die aus der teilweisen oder vollständigen chirurgischen Entfernung der Nebenschilddrüsen resultiert. Agonisten können in einem geeigneten Träger (z. B. physiologische Saline) formuliert sein und werden bevorzugterweise intravenös in einer Dosierung verabreicht, die eine Erhöhung des Serumkalziums auf einen akzeptablen Titer verursacht (d. h. etwa 8 mg/dl). Ein nützlicher Dosierungsbereich wäre 1 mg bis 10 mg des Agonisten pro kg Körpergewicht pro Tag. Die Behandlung kann wiederholt werden, wie erforderlich ist, um geeignete Serumkalziumtiter aufrechtzuerhalten; eine Langzeitbehandlung kann für Patienten erforderlich sein, denen die Nebenschilddrüse entfernt worden ist.
  • Die Nukleinsäuren der Erfindung können auch therapeutisch verwendet werden. Oligonukleotide, die antisense zu der PTH-Rezeptor-mRNA sind (oder Nukleinsäurekonstrukte, die RNA exprimieren, die antisense zu der PTH-Rezeptor-mRNA sind), können in der Krebstherapie verwendet werden. Dieser Ansatz ist, beispielsweise, für Hyperkalziämien nützlich, die aus einer genomischen Rearrangierung oder Amplifikation resultieren, die die Menge oder Aktivität an PTH-Rezeptor, PTH oder PTHrP erhöhen. Das Verfahren würde die Einführung des Antisense-Oligonukleotids in die Tumorzelle an vivo involvieren. Der Antisense-Strang hybridisiert mit endogener PTH-Rezeptor-mRNA, stört die Translation des Proteins, wodurch die Produktion des PTH-Rezeptors in einer derartigen Zelle verringert wird, und verringert PTH/PTHrP-assoziiertes neoplastisches Wachstum. Verfahren für die Antisense-Konstruktion und Einführung in Wirtszellen sind, beispielsweise, in Weinberg et al., U.S. Patent Nr. 4,740,463 beschrieben. Die biochemische Charakterisierung der OK-H-, OK-O- und R15B PTH/PTHrP-Rezeptoren der Erfindung zeigt, dass die zwei Transduktionswege, von denen nun bekannt ist, dass sie durch die Wechselwirkung von PTH mit seinem Rezeptor ausgelöst werden, verschieden sind und getrennt werden können. Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen dieser Rezeptoren zeigen an, dass OK-H, welches den Inositolphosphatmetabolismus nicht in einem nachweisbaren Umfang zu aktivieren scheint, an dem Carboxyterminus 70 Aminosäuren kürzer ist als OK-O oder R15B. Durch Verwenden der Sequenzen der Erfindung und der hierin offenbarten Information könnte man PTH/PTHrP-Rezeptorgene von irgendeiner anderen Spezies klonieren und dann ändern (z. B. durch ortsgerichtete Mutagenese), um PTH/PTHrP-Rezeptoren zu erzeugen, die Phospholipase C nicht aktivieren. Dies könnte potentiell die Auftrennung von verschiedenen PTH-vermittelten Wirkungen erlauben, einschließlich Knochenresorption und Knochenbildung, und könnte für die Behandlung verschiedener Knochenerkrankungen wie beispielsweise Osteoporose von großer Bedeutung sein.
  • Nukleinsäuren der Erfindung, die einen PTH-Rezeptor codieren, können auch mit einem ausgewählten gewebespezifischen Promotor und/oder Enhancer verbunden sein, und das sich ergebende Hybridgen kann, durch Standardverfahren (z. B. wie von Leder et al., U.S. Patent Nr. 4,736,866 beschrieben), in einen tierischen Embryo in einem frühen Entwicklungsstadium (z. B. dem Stadium des befruchteten Oozyten) eingeführt werden, um ein transgenes Tier herzustellen, das einen erhöhten Titer an PTH-Rezeptor in ausgewählten Geweben exprimiert (z. B. den Osteo-Calcin-Promoter für Knochen). Derartige Promotoren werden verwendet, um gewebespezifische Expression des PTH-Rezeptors in dem transgenen Tier zu steuern. Die Form des verwendeten PTH-Rezeptor kann eine solche sein, die einen PTH-Rezeptor codiert, der ähnlich zu jenem der verwendeten Tierart ist, oder sie kann das PTH-Rezeptorhomolog von einer anderen Spezies codieren. In einem speziellen Beispiel werden transgene Küken konstruiert, um den PTH-Rezeptor von einem Promotor zu exprimieren, der eine Expression auf hohem Niveau in Küken-Eileitern steuert. Man erwartet, dass ein derartiges Tier Eier mit einem höheren Kalziumgehalt und somit härteren Schalen produziert.
  • Andere Ausführungsformen
  • Andere Ausführungsformen sind im Umfang der folgenden Ansprüche enthalten. Beispielsweise umfasst die Nukleinsäure der Erfindung Gene oder cDNAs oder RNAs, die ursprünglich aus irgendeiner Vertebratenart isoliert worden sind, einschließlich Vögeln oder Säugetieren, wie beispielsweise Marsupialia, Nagetieren oder Menschen. Das hohe Ausmaß an Homologie, die für die PTH-Rezeptoren von derartig verschiedenen Arten wie Opossum, Ratte und Mensch gezeigt worden ist, zeigt an, dass die Verfahren zum Isolieren von PTH-Rezeptoren, die hierin offenbart worden sind, breit auf die Isolierung von verwandten Zellrezeptoren von einer großen Vielzahl von Arten anwendbar sein werden.
  • Sequenzprotokoll
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Claims (33)

  1. Isolierte DNA-Sequenz, die einen Zellrezeptor eines Vetrebraten codiert, wobei der Rezeptor Parathormon oder Parathormon-verwandtes Protein unter physiologischen Bedingungen bindet und der Rezeptor eine Aminosäuresequenz aufweist mit einer Identität von wenigstens 30% mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 3 gezeigt ist.
  2. Isolierte DNA nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert.
  3. Isolierte DNA nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz unter Bedingungen hoher Stringenz mit einer Sequenz hybridisiert, die zu der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 gezeigten DNA-Sequenz komplementär ist.
  4. Gereinigtes Präparat eines Vektors, wobei der Vektor eine DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.
  5. Isolierte Zelle, die die isolierte DNA gemäß Anspruch 1 enthält, wobei die Zelle keine menschliche Keimzelle, kein menschliches befruchtetes Ei oder keine menschliche Embryonenstammzelle ist.
  6. Zelle nach Anspruch 5, wobei die Zelle in der Lage ist, den Zellrezeptor von der isolierten DNA zu exprimieren.
  7. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen einer Zelle, die isolierte DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder ein Fragment des Rezeptors umfasst; und Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die die Expression eines Polypeptids von der DNA erlauben.
  8. Einzelsträngige DNA mit einem Abschnitt eines Parathormon-Rezeptor-Gens oder einer Parathormon-Rezeptor-cDNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Abschnitt wenigstens 18 Nukleotide lang ist.
  9. Einzelsträngige DNA nach Anspruch 8, wobei der Abschnitt weniger als das vollständige Parathormon-Rezeptor-Gen ist.
  10. Einzelsträngige DNA nach Anspruch 8 oder 9, wobei die DNA nachweisbar markiert ist.
  11. Einzelsträngige DNA nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die DNA antisense ist.
  12. Im wesentlichen gereinigtes Präparat des durch die Expression der DNA gemäß Anspruch 2 produzierten Parathormon-Rezeptors.
  13. Polypeptid umfassend wenigstens sechs Aminosäuren und weniger als die vollständige Aminosäuresequenz des durch die isolierte DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 codierten Parathormon-Rezeptors, wobei das Polypeptid in der Lage ist, Parathormon oder Parathormon-verwandtes Protein zu binden.
  14. Polypeptid nach Anspruch 13, umfassend (a) TNETREREVFDRLGMIYTVG, (b) YLYSGFTLDEAERLTEEEL, (c) VTFFLYFLATNYYWILVEG, (d) Y-RATLANTGCWDLSSGHKKWIIQVP, (e) PYTEYSGTLWQIQMHYEM, (f) DDVFTKEEQIFLLHRAQA, (g) FFRLHCTRNY, (h) EKKYLWGFTL, (i) VLATKLRETNAGRCDTRQQYRKLLK, oder (j) ein Fragment von (a)–(i), das in der Lage ist, Parathormon oder Parathormon-verwandtes Protein zu binden.
  15. Polypeptid nach Anspruch 13 oder 14, wobei der Parathormon-Rezeptor ein menschlicher Parathormon-Rezeptor ist.
  16. Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 15 zur Anwendung in der Therapie oder Diagnostik.
  17. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 15 zum Herstellen eines Medikaments zur Verwendung in der Therapie für die Iihibierung der Aktivierung eines Parathormon-Rezeptors eines Säugetiers durch Parathormon oder Parathormon-verwandtes Protein, oder für die Verringerung des Kalzium-Titers im Blut eines Säugetiers.
  18. Im wesentlichen gereinigtes Präparat des Polypeptids nach einem der Ansprüche 13 bis 15.
  19. Therapeutische Zusammensetzung umfassend, in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, (a) einen Parathormon-Rezeptor, der durch die isolierte DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert ist, oder (b) ein Polypeptid umfassend ein Fragment des Rezeptors.
  20. Gereinigter Antikörper, der in der Lage ist, einen Immunkomplex mit einem Parathormon-Rezeptor auszubilden, der durch die isolierte DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert ist.
  21. Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die in der Lage ist, mit einem Parathormon oder Parathormon-verwandten Protein um das Binden an einen Parathormon-Rezeptor zu konkurrieren, wobei das Verfahren umfasst: (a) Kontaktieren des Polypeptids von Anspruch 13 mit einem Parathormon oder Parathvrmon-verwandten Protein, (i) in Gegenwart oder (ii) in Abwesenheit einer Kandidatenverbindung; (b) Vergleichen (i) des Umfanges der Bindung des Polypeptids an das Parathormon oder das Parathormon-verwandte Protein in Gegenwart der Kandidatenverbindung, mit (ii) dem Umfang der Bindung des Polypeptids an das Parathormon oder das Parathormon-verwandte Protein bei Abwesenheit der Kandidatenverbindung; wobei ein geringerer Umfang an Bindung in Gegenwart der Kandidatenverbindung als in seiner Abwesenheit anzeigt, dass die Kandidatenverbindung in der Lage ist, mit dem Parathormon oder dem Parathormon-verwandten Protein um die Bindung an den Rezeptor zu konkurrieren.
  22. Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die in der Lage ist, mit einem Parathormon um die Bindung an einen Parathormon-Rezeptor zu konkurrieren, wobei das Verfahren umfasst: (a) Kombinieren eines Parathormons mit der Zelle nach Anspruch 6 (i) in Gegenwart oder (ii) in Abwesenheit einer Kandidatenverbindung und; (b) Vergleichen (i) des Umfanges der Bindung von dem Rezeptor an das Parathormon in Gegenwart der Kandidatenverbindung mit (ii) dem Umfang der Bindung des Rezeptors an das Parathormon bei Abwesenheit der Kandidatenverbindung; wobei ein geringerer Umfang an Bindung in Gegenwart der Kandidatenverbindung als in seiner Abwesenheit anzeigt, dass die Kandidatenverbindung in der Lage ist, mit dem Parathormon um die Bindung an den Rezeptor zu konkurrieren.
  23. Transgenes nicht menschliches Wirbeltier, das ein Transgen trägt, das eine DNA-Sequenz umfasst, die den Parathormon-Rezeptor codiert, der von der isolierten DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert ist, oder ein Fragment des Rezeptors.
  24. Verfahren zum Identifizieren eines hyperkalziämischen Zustandes in einem Patienten, der durch Parathormon oder Parathormon-verwandtes Protein vermittelt ist, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bestimmen des Kalziumtiters einer ersten Blutprobe von dem Patienten, (b) Bestimmen des Kalziumtiters einer zweiten Blutprobe von dem Patienten, die zu einer Zeit nach der Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzung von Anspruch 19 genommen ist, und (c) Vergleichen der Kalziumtiter der zwei Blutproben, wobei ein niedrigerer Kalziumtiter in der zweiten Blutprobe ein Zeichen für einen Zustand ist, der in dem Patienten mit dem Parathormon oder Parathormon-verwandten Protein in Beziehung steht.
  25. Verfahren zum Identifizieren eines hyperkalziämischen Zustandes in einem Patienten, der durch Parathormon oder Parathormon-verwandtes Protein vermittelt ist, wobei das Verfahren umfasst (a) Bestimmen des Kalziumtiters einer ersten Blutprobe von dem Patienten, (b) Bestimmen des Kalziumtiters einer zweiten Blutprobe von dem Patienten, die zu einer Zeit nach der Verabreichung einer Zusammensetzung genommen ist, die den Antikörper von Anspruch 20 umfasst, und (c) Vergleichen der Kalziumtiter der zwei Blutproben, wobei ein niedrigerer Kalziumtiter in der zweiten Blutprobe ein Zeichen für einen Zustand ist, der in dem Patienten mit einem Parathormon oder Parathormon-verwandten Protein in Beziehung steht.
  26. Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung gemäß Anspruch 21 oder 22, welches weiter den Schritt umfasst, zu bestimmen, ob die Verbindung ein Agonist oder ein Antagonist des Parathormon-Rezeptors ist.
  27. Therapeutische Zusammensetzung umfassend den Antikörper von Anspruch 20 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
  28. Antikörper nach Anspruch 20 zur Verwendung in der Therapie oder Diagnostik.
  29. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 27 oder Antikörper nach Anspruch 20 zur Verwendung in der Therapie für das Inhibieren der Aktivierung eines Parathormon- Rezeptor eines Säugetiers durch Parathormon oder Parathormon-verwandtes Protein oder für die Verringerung des Kalziumtiters im Blut eines Säugetiers.
  30. Oligonukleotid zur Anwendung als eine Antikrebstherapie, wobei das Oligonukleotid antisense zu der Parathormon-Rezeptor-mRNA ist, die durch die DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert ist, oder RNA codiert, die antisense zu der mRNA ist.
  31. Verwendung des Oligonukleotids gemäß Anspruch 30 für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Hyperkalziämie.
  32. Verwendung des Oligonukleotids nach Anspruch 30 für die Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung in der Antikrebstherapie, wobei das Antisense-Oligonukleotid in Tumorzellen in vivo eingeführt wird.
  33. Verfahren zum Erzeugen von Rezeptoren für Parathormon oder Parathormon-verwandtem Protein, die Phospholipase C nicht aktivieren, umfassend die Schritte: Bereitstellen einer isolierten DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1; und Ändern der Sequenz, die den 70 Aminosäuren langen Carboxyterminus des Rezeptors codieren, so dass der Rezeptor Phospholipase C nicht aktiviert.
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