JP3459523B2 - 生理活性物質の製造方法 - Google Patents
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Description
性物質の探索方法及び製造方法に関する。
液や組織中に存在する成分を分析し、新規な物質を同定
及び単離し、発見された新規な物質の生理活性を調べる
ことにより行なわれている。
は、何の予測もなくただ生体中の成分を分析し、新たな
物質を見つけ出してその生理活性を調べるだけである。
しかしながら、生体中には極めて多くの成分が存在する
し、生理活性物質はしばしば低濃度でしか存在しないか
ら新規な物質を見つけることは困難な仕事である。しか
も、生体は非常に多くの生理反応を行なっているので、
新たに見つかった物質がどのような生理活性を有してい
るかを見つけることも困難である。このように、従来の
方法では、新規な生理活性物質を見つけだすのは困難な
作業である。
もってより効率的に新規な生理活性物質を探索する方法
を提供することである。
Aが作用する細胞に対して拮抗作用を有する細胞若しく
は物質が生体中に存在する該物質Aのレセプターであっ
て、同一のレセプターにつき2種類以上のサイズのもの
が存在する場合があり、その欠失部分、つまりスプライ
スされた部分のアミノ酸配列が生理的意義を持つことを
見出した。例えば、カルシトニンは破骨細胞上のカルシ
トニンレセプターと結合して破骨細胞による骨吸収を抑
制し、一方、破骨細胞の作用と拮抗作用を有する骨芽細
胞が存在する。カルシトニンレセプターは既にアミノ酸
配列が報告されているが、サイズの異なる2種類以上の
ものが報告されている。本願発明者は、この2種類以上
のサイズのカルシトニンレセプターのうち、より長い方
のレセプターの1領域が切断されてより短い方のレセプ
ターになること、及びこの切断された領域が、カルシト
ニンが作用する破骨細胞の作用と拮抗する作用を有する
骨芽細胞に対して作用するであろうことを洞察した。そ
して、この切断領域を化学合成して調べたところ、この
新規なペプチドは骨芽細胞上のレセプターに結合して骨
形成を促進することが確認された。これにより、本願発
明者の上記の洞察が正しかったことが明らかになり、本
発明が完成された。
に対して拮抗作用を有する細胞若しくは物質が生体中に
存在する物質のレセプターであって、同一のレセプター
につき2種類以上のサイズのものが存在するレセプター
のアミノ酸配列を調べ、長いレセプターのどの領域が短
いレセプターにおいて欠失しているかを調べることを含
む生理活性物質の探索方法により判明した欠失領域又は
その誘導体を作製することから成る、生理活性ペプチド
の製造方法を提供する。
作用する細胞に対して拮抗作用を有する細胞若しくは物
質が生体中に存在する該物質Aのレセプターに着目す
る。拮抗作用は生体の恒常性を保つ上で基本的なもので
あり、生体内には互いに拮抗作用を有する物質又は細胞
が非常に多く存在する。ある物質Aが作用する細胞に対
して拮抗作用を有する細胞若しくは物質が生体中に存在
する該物質Aのレセプターの例としては、カルシトニン
(これが作用する破骨細胞が骨芽細胞と拮抗)レセプタ
ー、グルカゴン(インシュリンと拮抗)レセプター、ソ
マトスタチン(成長ホルモンと拮抗)レセプター、副甲
状腺ホルモン(カルシトニン等と拮抗)レセプター等多
数のレセプターがある。レセプターとしては、カルシト
ニンレセプターのような7回膜貫通型のレセプターが挙
げられるが、これに限定されるものではない。
アミノ酸配列又はサイズを調べ、同じレセプターであり
ながら、サイズが異なるものを見つけ出す。この作業
は、当該レセプターのアミノ酸配列又はサイズを複数回
決定することにより行なってもよいし、文献に報告され
ている場合にはその報告を利用してもよい。同一のレセ
プターでありながらサイズの異なる2種類以上のものが
存在するレセプターの例として、カルシトニンレセプタ
ー、グルカゴンレセプター、ソマトスタチンレセプター
等を挙げることができる。
2種類以上のレセプターが存在することを見つけ出した
後、それら2種類以上のレセプターのアミノ酸配列を比
較し、長いレセプターのどの領域が欠失して短いレセプ
ターとなっているかを調べる。短いレセプターにおいて
欠失している領域が、当該拮抗作用に対して何らかの作
用を有する生理活性物質である。つまり、スプライスさ
れた構造のうちあるものが生理活性物質である。すなわ
ち、生理活性物質がレセプターに結合することにより、
そのレセプターの一部が切断され、この切断されたレセ
プター断片が当該拮抗作用に対して調節的な作用等の生
理活性を示すものと考えられる。例えば、下記実施例に
具体的に示されるように、カルシトニンレセプターにお
けるこの欠失領域が骨芽細胞上のレセプターに結合し、
骨形成を促進することが確かめられた。
活性を有するから、これを製造することにより生理活性
物質が得られる。多くの場合、欠失領域は比較的短いペ
プチドから成るので、このような場合には市販のペプチ
ド合成機を用いて、化学合成により容易に当該生理活性
物質を作製することができる。あるいは、常法により遺
伝子工学的手法を用いて作製することもできる。
拮抗作用に関与するものであるから、それぞれの拮抗作
用に応じた適宜の方法により容易に確認することができ
る。
おいて、その少数のアミノ酸が他のアミノ酸に置換し、
少数のアミノ酸が付加され、又は少数のアミノ酸が欠失
した場合でも、その生理活性が維持される場合があるこ
とは当業者に周知の事実である。従って、上記の欠失領
域を構成するアミノ酸のうち、少数のアミノ酸が他のア
ミノ酸に置換し、少数のアミノ酸が付加され、又は少数
のアミノ酸が欠失したものであって、上記欠失領域から
成る生理活性物質が持つ生理活性を有する物質(本願発
明においてこのような物質を上記欠失領域の「誘導体」
という)を製造することも本発明の範囲に含まれる。こ
のような誘導体は上記欠失領域に対し、70%以上、さ
らに好ましくは90%以上の相同性を有することが好ま
しい。
明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるも
のではない。
領域の決定 カルシトニンレセプターのアミノ酸配列はJournal of C
linical Investigation,第90巻、第5号(1992)に記載
されている。ここに記載されたカルシトニンレセプター
のアミノ酸配列を比較すると、短い方のアミノ酸配列で
は、長い方のアミノ酸配列の第175番目〜第190番
目のアミノ酸配列が欠失している。この欠失領域のアミ
ノ酸配列を配列番号1に示す。
ミノ酸配列を有するペプチドを合成した。
C)を10%牛胎児血清を含むF10培地(入手先:大
日本製薬)にて培養し、5%炭酸ガス加湿37℃恒温器
内にて育成した。トリプシン処理により24穴培養プレ
ートに1x105 個/穴(well)蒔種し、コンフルーエ
ントになったところで培地を1%牛胎児血清F10培地
に交換し、24時間培養した。その後、実施例2で製造
した本発明のペプチドを1%牛胎児血清F10培地に溶
解し、容量を変化させながらwellに加えてさらに2
4時間培養を継続した。培養後、本ペプチドによる細胞
の増殖促進効果をMTTアッセイにより測定し、非処理
群に対する増殖促進効果を求めた。なお、MTTアッセ
イ及び増殖促進率の算出は具体的には次のように行っ
た。フナコシ(株)より市販されているMTF−Cel
l−Growth Assay kitの手順に従い、
本物質を用量を変化させながらウェルに加え一昼夜放置
後、生細胞のミトコンドリア中に存在する酵素によりM
TT(3-4,5Dimethylthiazol-2YL)-2,5Diphenyl Tetraz
olium bromide が暗青色のホルマザンに開裂する現象を
利用し比色法にて生細胞を計数した。本物質を加えない
対照群を100%とし用量を変化させて加えた群の比色
度を求めると次のようになった。結果を下記表1に示
す。
より探索された上記ペプチドは、骨芽細胞に対し増殖促
進的に作用することが確認された。従って、本ペプチド
は骨量の増加に結びつくものと考えられ、骨粗鬆症等の
骨疾患の治療に対し有用である。
の受容体の存在 本ペプチドが骨芽細胞に対し増殖促進作用があることが
判明したことにより、骨芽細胞が本ペプチドに対する受
容体を持っていることが推察される。もし受容体が存在
するならば本ペプチドは生命にとり根源的な物質である
ことが考えられ、次に骨芽細胞に受容体が存在するか否
かを調査した。
標識し、実施例3と同様に培養したROS細胞に一定量
に標識した本ペプチドを加え、さらに競合反応をさせる
ために非標識の本ペプチドを10%牛胎児血清F10培
地に溶解し、容量を変化させながら加えて競合反応を見
た。この実験操作は具体的には次のように行った。SU
MILON社製の蛋白ビオチン化標識キットの手順に従
い本ペプチドをビオチン化し、ウェルに播種された一定
数の細胞に対し一定量のビオチン化ペプチドを加え非標
識ペプチド0〜0.512μg/wellを各々加え競合反
応を6時間行い、その後、細胞をPBSにて洗浄しスト
レプトアビジンで標識したペルオキシダーゼで細胞表面
にある受容体に結合したビオチン化ペプチドに反応して
発色反応を見る。細胞表面に本ペプチドの受容体が存在
すれば非標識のペプチドと競合反応が起こり発色強度は
低下する。結果を下記表2に示す。
に依存して加えた標識体に対する割合が変化しているの
で、骨芽細胞が本ペプチドに対する受容体を持っている
ことは明らかであり、本物質が根源的な役割を担ってい
ることが推察される。
ス(体重40〜45g)を用い、その急性毒性を試験し
た。本ペプチドを生理食塩水(pH6.0)に溶解し、
これをマウスの尾静脈より投与し、14日間観察した。
投与量は1、10、100μg/kgとした。この結果
を下記表3に示す。
域の決定 実施例1と同じ方法により、FEBS Letters 351 (1994)
271-275 に記載されたグルカゴンレセプターのアミノ酸
配列を比較することにより、長い方のレセプターに存在
するが短い方のレセプターにおいて欠失している領域の
アミノ酸配列を決定した。決定された欠失領域のアミノ
酸配列を配列番号2に示す。
失領域の決定 実施例1と同じ方法により、Molecular Pharmacology 4
4:1008-1015(1993) に記載されたソマトスタチンレセプ
ターのアミノ酸配列を比較することにより、長い方のレ
セプターに存在するが短い方のレセプターにおいて欠失
している領域のアミノ酸配列を決定した。決定された欠
失領域のアミノ酸配列を配列番号3に示す。
率的に新規な生理活性物質を探索する方法が初めて提供
された。本発明の方法では、拮抗作用に関与する物質の
レセプターを調べることにより新規な生理活性物質を見
つけることができるので、従来のように極めて多様な成
分を含む生体試料中に微量含まれる生理活性物質を単離
する必要がない。また、探索された生理活性物質の生理
活性は、上記拮抗作用に関与するものであるから、その
生理活性を探索することも従来に比べてはるかに容易で
ある。よって、本発明の方法によれば、従来よりもはる
かに高効率に新規な生理活性物質を探索することができ
る。
Claims (4)
- 【請求項1】 物質が作用する細胞に対して拮抗作用を
有する細胞若しくは物質が生体中に存在する物質のレセ
プターであって、同一のレセプターにつき2種類以上の
サイズのものが存在するレセプターのアミノ酸配列を調
べ、長いレセプターのどの領域が短いレセプターにおい
て欠失しているかを調べることを含む生理活性物質の探
索方法により判明した欠失領域又はその誘導体を又はそ
の誘導体を作製することから成る、生理活性ペプチドの
製造方法。 - 【請求項2】 前記レセプターは7回膜貫通型のレセプ
ターである請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 上記欠失領域を作製することから成る、
請求項1又は2記載の方法。 - 【請求項4】 前記欠失領域を化学合成により合成する
請求項3記載の方法。
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