DE60031422T2

DE60031422T2 - Peptidanaloga als selektive Inhibitoren der Thrombinaktivierung des proteaseaktivierten Rezeptors 1

Info

Publication number: DE60031422T2
Application number: DE60031422T
Authority: DE
Inventors: H. Alvin Ann Arbor SCHMAIER; Ahmed A. K. Scio Township Dexter HASAN
Original assignee: Thromgen Inc Ann Arbor; University of Michigan; Thromgen Inc
Current assignee: Thromgen Inc Ann Arbor; University of Michigan; Thromgen Inc
Priority date: 1999-08-17
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2020-08-18
Also published as: WO2001012656A1; DE60031422D1; EP1212352A4; EP1212352B1; AU7882200A; IL148173A0; AU764707B2; ATE342914T1; EP1212352A1; US6544750B1; CA2382056A1; JP2003507389A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Inhibierung einer α- und γ-Thrombin-induzierten Zellaktivierung.
Hintergrund der Erfindung
Bradykinin (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg) (SEQ ID NO: 40) ist ein vasoaktives Peptid, das von den Vorläufer-Plasmakininogenen durch Plasma- und Gewebekallikreine und andere Enzyme freigesetzt wird (Silva et al., Amer. J. Physiol. 156, 261–274 (1949)). Es wurde erkannt, dass die Stammproteine von Bradykinin, Kininogene mit hohem (HK) und niedrigem (LK) Molekulargewicht, das Vermögen aufweisen, die α- und γ-Thrombin-induzierte Plättchenaktivierung zu inhibieren (Meloni et al., J. Biol. Chem. 266, 6786 (1991); Puri et al., Blood 77, 500 (1991)). Kininogene sowohl mit niedrigem als auch mit hohem Molekulargewicht weisen ausgehend von ihrem Aminoterminus über 12 Aminosäuren über den Carboxyterminus von Bradykinin hinaus identische Aminosäuresequenzen auf. LK und HK weisen eine gemeinsame schwere Kette (62 kDa), den Bradykininrest (BK-Rest) (0,9 kDa) und die ersten 12 Aminosäuren des aminoterminalen Abschnitts jeder ihrer „leichten Ketten" auf (Takagaki et al., J. Biol. Chem. 260, 8601–8609 (1985); Kitamura et al., J. Biol. Chem. 260, 8610–8617 (1985)). Diese Identität entspricht den Resten 1 bis etwa dem Rest 383, vgl. Salveson et al., Biochem J. 243, 429 (1986); Kellerman et al., Eur. J. Biochem. 154, 471 (1986). Die HK- und LK-Kininogene unterscheiden sich bezüglich der Größe ihrer leichten Ketten; die leichte Kette von LK ist 4 kDa groß und die leichte Kette von HK ist 56 kDa groß (Takagaki et al., vorstehend; Kitamura et al., vorstehend). Die Kininogene verhindern eine Thrombin-induzierte Plättchenaktivierung ohne das Vermögen von Thrombin, ein chromogenes Substrat zu hydrolysieren, zu inhibieren. Volllängenkininogene verhindern ein Binden von Thrombin an Plättchen. Sie stören nicht das Vermögen des Thrombins, zu proteolysieren, d.h. Fibrinogen zu spalten, was es einem freigesetzten Fibrinmonomer ermöglicht, einen Fibrinpfropfen zu bilden. Folglich zeigte der Stand der Technik, dass das Vermögen von Kininogenen, die Thrombinaktivierung von Plättchen zu inhibieren, nicht auf deren direkte Wechselwirkung mit dem Thrombinmolekül selbst zurückzuführen ist (Meloni et al., vorstehend; Puri et al., vorstehend).
Die Thrombin-inhibierende Aktivität der Kininogene schien sich an der isolierten Domäne 3 der schweren Kette der Kininogene zu befinden, da die Domäne 3 die gesamte Thrombin- inhibierende Aktivität des vollständigen Proteins bewahrt (Jiang et al., J. Biol. Chem. 267, 3712 (1992)). Später wurde gefunden, dass die Thrombin-inhibierende Aktivität der Kininogene mit der Domäne 4, der Bradykininsequenz, zusammenhängt, die an das carboxyterminale Ende der isolierten Domäne 3 gebunden ist, die durch proteolytische Spaltung von vollständigem LK hergestellt wurde (Hasan et al., Circulation 94, 517–528 (1996); Tayeh et al., J. Biol. Chem. 269, 16318–16325 (1994)). Die Thrombin-inhibierende Region der Domäne 4, die Bradykininsequenz, zeigte eine Anzahl von Merkmalen. Diese Sequenz verhinderte nicht das Binden von Thrombin an Plättchen und verhinderte nicht, dass das Thrombinrezeptoraktivierungspeptid (TRAP), SFLLRN (SEQ ID NO: 46) die Calciummobilisierung und die Plättchenaggregation in Plättchen stimuliert. Diese Sequenz von der Domäne 4 verhinderte, dass Thrombin-aktivierte Plättchen ein Epitop an den monoklonalen Antikörper SPAN12 verlieren. Der monoklonale Antikörper SPAN12 ist auf die Thrombinspaltungsstelle an dem Protease-aktivierten Rezeptor 1 (PAR1) gerichtet (Hasan et al., vorstehend; Vu et al., Cell 64, 1057–1068 (1991); Brass et al., J. Biol. Chem. 267, 13795–13798 (1992)). Der monoklonale Antikörper SPAN12 wurde zu dem Peptid NATLDPRSFLLR (Asn-Ala-Thr-Leu-Asp-Pro-Arg-Ser-Phe-Leu-Leu-Arg) (SEQ ID NO: 41) ausgebildet (Brass et al., vorstehend). Ferner verhinderten Bradykinin-analoge Peptide die Spaltung des Peptids NATLDPRSFLLR (Asn-Ala-Thr-Leu-Asp-Pro-Arg-Ser-Phe-Leu-Leu-Arg) (SEQ ID NO: 41) durch α-Thrombin zwischen Arginin und Serin, wobei es sich um die identische Stelle bei PAR1 handelt, die Thrombin spaltet, um diesen Rezeptor zu aktivieren. Obwohl es eine Anzahl von Peptidanaloga von Bradykinin gibt, die eine Thrombin-inhibierende Aktivität gegen die Plättchenaktivierung zeigen, sind die minimalen Sequenzen, welche diese Aktivität bewahren, die Peptide RPPGF (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe) (SEQ ID NO: 39), RPPG (Arg-Pro-Pro-Gly) (SEQ ID NO: 45) und RPP (Arg-Pro-Pro). Neuere Untersuchungen zeigten, das FITC-markiertes (Fluoresceinisothiocyanat) RPPGF (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe) (SEQ ID NO: 39) das Vermögen des direkten Bindens an Plättchen aufweist (Hasan et al., Thromb Haemost. 82, 1182–1187 (1999)). Diese Daten zeigten, dass das RPPGF (SEQ ID NO: 39) und entsprechende Bradykinin-analoge Peptide das Vermögen zum Binden an Plättchen aufweisen, so dass eine Thrombin-induzierte Plättchenaktivierung verhindert wird.
WO 98/47522 beschreibt Bradykinin-Analoga als selektive Inhibitoren der Zellaktivierung. WO 99/40214 beschreibt Nukleinsäureabgabevehikel.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Inhibierung der Thrombin-induzierten Aktivierung in menschlichen Zellen. Die Inhibierung der Thrombinaktivierung von Plättchen kann entweder durch einen Inhibitor von Thrombin, der auf das Thrombinmolekül selbst gerichtet ist, oder durch einen Inhibitor, der auf Substrate von Thrombin gerichtet ist, stattfinden. Der Protease- aktivierte Rezeptor 1 (PAR1) ist ein spezifisches Substrat von Thrombin, auf das diese Inhibitorklasse gerichtet ist. Die vorliegende Erfindung betrifft die Inhibierung dieses Thrombinsubstrats bei jedweder Zelle, die PAR1 exprimiert. Diese Zellen umfassen Plättchen, Endothelzellen, glatte Muskelzellen, Fibroblasten, Nervenzellen oder jedwede andere Zelle, die diesen Rezeptor enthält. Die vorliegende Erfindung betrifft nicht die Inhibierung der ADP-induzierten Plättchenaktivierung, die mit der Thienopyridin-Klasse von Mitteln, Ticlopidin und Clopidogrel, zusammenhängt. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung nicht die Inhibierung der Plättchenaggregation durch Verhindern der Bildung des heterodimeren Komplexes von Plättchenglykoprotein IIb/IIIa (d.h. Integrin α_IIbβ₃). Diese Verbindungen umfassen den chimären monoklonalen Mensch-Maus-Antikörper 7E3c (ReoPro, abciximab), Eptifibatid (Integrilin) und Tirofibran (Aggrastat). Diese Erfindung betrifft nicht die Aspirininhibierung der Plättchenaktivierung durch die Inhibierung der Plättchencyclooxygenase.
Die folgenden Abkürzungen wurden verwendet:

BK:: Bradykinin (SEQ ID NO: 40);
D3:: Domäne 3 von Kininogenen;
D4:: Domäne 4 von Kininogen, bei der es sich um die Bradykinin-Region handelt;
FITC:: Fluoresceinisothiocyanat;
HK:: Kininogen mit hohem Molekulargewicht;
LK:: Kininogen mit niedrigem Molekulargewicht;
MAP4RPPGF:: Ein vierfach verzweigtes Peptid, das aus einem β-Alaninkern mit einem einzelnen Lysin, das an dessen aminoterminalem Ende gebunden ist, gefolgt von zwei zusätzlichen Lysinresten besteht. Jedes Lysin wird dann zwei RPPGF (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe) (SEQ ID NO: 39)-Peptide aufweisen, die durch das Phenylalanin an jeden der Lysinreste gebunden sind;
NAT12:: Peptidsequenz Asn-Ala-Thr-Leu-Asp-Pro-Arg-Ser-Phe-Leu-Leu-Arg (SEQ ID NO: 41), welche die α-Thrombin-Spaltungsstelle auf dem Thrombinrezeptor überbrückt;
PAR1:: Protease-aktivierter Rezeptor 1;
PTCA:: Perkutane, transluminale Koronarangioplastie;
RPPGF:: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe (SEQ ID NO: 39);
RPPG:: Arg-Pro-Pro-Gly (SEQ ID NO: 45);
RPP:: Arg-Pro-Pro;
SPAN12:: Ein monoklonaler Antikörper, der für die Sequenz (SEQ ID NO: 41) Asn-Ala-Thr-Leu-Asp-Pro-Ser-Phe-Leu-Leu-Arg spezifisch ist, welche die α-Thrombin-Spaltungsstelle auf dem Thrombinrezeptor überbrückt; und
Z:: Nomenklatur für jedwede natürlich vorkommende Aminosäure.

Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine Reihe von Verbindungen zur Inhibierung der Thrombin-induzierten Plättchenaktivierung oder der Thrombin-induzierten Aktivierung menschlicher Zellen bei der Verabreichung einer effektiven Menge eines Peptids, das die Thrombinaktivierung von Plättchen oder menschlichen Zellen inhibiert, wobei die Verbindung mindestens ein Segment mit der Aminosäuresequenz der Formel I oder der Formel II umfasst, wobei die Formel I
ist, wobei Z₄ jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, ausschließlich Cystein oder Asparagin, ist, und wobei die Formel II
ist, wobei Z₄ jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, ausschließlich Cystein, ist, wobei die Verbindung höchstens 10 aufeinander folgende Aminosäuren umfasst, und wobei die Verbindung nicht Arg-Gly-Asp-Phe-Cys (SEQ ID NO: 21) ist.
Die zwanzig Aminosäuren (gefolgt von ihren drei Buchstaben-Abkürzungen und ihrem Ein-Buchstaben-Symbol) sind in der nachstehenden Tabelle VII gezeigt.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein in vitro-Verfahren zur Inhibierung der Thrombinaktivierung in einer menschlichen Zelle, die PAR1 exprimiert, umfassend:

(a) Bereitstellen eines Gemischs, das Thrombin und eine menschliche Zelle, die PAR1 exprimiert, umfasst, wobei die Konzentration von Thrombin zur Induktion einer Reiz-Reaktions-Kopplung innerhalb der Zelle wirksam ist;
(b) In-Kontakt-Bringen des Gemischs mit einer Verbindung, die mindestens ein Segment mit der Aminosäuresequenz der Formel I oder der Formel II umfasst, wobei die Formel I
ist, wobei Z₄ jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, ausschließlich Cystein, ist, und wobei die Formel II
ist, wobei Z₄ jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, ausschließlich Cystein, ist, und wobei die Verbindung höchstens 10 aufeinander folgende Aminosäuren umfasst.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Inhibierung der Thrombinaktivierung in einer Probe, die Blutplättchen umfasst, umfassend:

(a) Bereitstellen einer Lösung, die Thrombin und Blutplättchen umfasst, wobei die Konzentration von Thrombin zum Verursachen einer Plättchenaggregation wirksam ist;
(b) In-Kontakt-Bringen der Blutprobe mit einer Verbindung, die mindestens ein Segment mit der Aminosäuresequenz der Formel I oder der Formel II umfasst, wobei die Formel I
ist, wobei Z₄ jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, ausschließlich Cystein, ist, und wobei die Formel II
ist, wobei Z₄ jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, ausschließlich Cystein, ist, und wobei die Verbindung höchstens 10 aufeinander folgende Aminosäuren umfasst.

Einige der bevorzugten Analoga umfassen RGKWC, RGKKC, RGKLC, RGKTC, RGKRC, RGDWC, RGDFC, RGDEC und RGDNC (SEQ ID NOS 5, 14, 1, 2, 3, 20, 21, 22 bzw. 32).
Ein Ziel der Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen an Zellen ist die Verhinderung einer Thrombose, d.h. eines Gefäßverschlusses aufgrund der Bildung eines Plättchen-reichen Thrombus, eines Fibrin-reichen Thrombus oder eines gemischten Plättchen-Fibrin-Thrombus. Demgemäß betrifft die Erfindung die vorstehend genannten Analoga und den Kontakt dieser Analoga mit Plättchen und menschlichen Zellen, die den Thrombinrezeptor exprimieren, um eine Thrombose zu verhindern.
Beschreibung der Figuren
1 veranschaulicht den Effekt des Peptids RGKWC (Arg-Gly-Lys-Trp-Cys) (SEQ ID NO: 5) auf die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation in Plättchen-reichem Plasma. Die Figur zeigt Aggregationsverfolgungen. Oben links induzierten 70 nM γ-Thrombin eine vollständige Aggregation. 1 mM RPPGF (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe) (SEQ ID NO: 39), wobei es sich um eine Kontrollaggregation handelte, beseitigte die Thrombin-induzierte Plättchenaggregation. Die Aggregation kehrte bei 0,25 mM RPPGF (SEQ ID NO: 39) wieder. Im Vergleich dazu beseitigte auch 1 mM RGKWC (Arg-Gly-Lys-Trp-Cys) (SEQ ID NO: 5) die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation. Bei 0,125 mM RGKWC (SEQ ID NO: 5) trat die Thrombin-induzierte Plättchenaggregation wieder auf.
Die 2 veranschaulicht den Effekt des Peptids RGKWC (Arg-Gly-Lys-Trp-Cys) (SEQ ID NO: 5) auf die α-Thrombin-induzierte Calciummobilisierung in Fibroblasten. Oben links indu zieren 2 nM α-Thrombin ein stabiles Niveau der Ca²⁺-Mobilisierung in diesen Fibroblasten. Unter Verwendung von RGKWC (SEQ ID NO: 5) bei 0,2 mM wird die α-Thrombin-induzierte Calciummobilisierung beseitigt. Bei abnehmender Konzentration von RGKWC (SEQ ID NO: 5) trat das Vermögen von Thrombin, die Ca²⁺-Mobilisierung zu induzieren, wieder auf. Bei 12,5 μM RGKWC (SEQ ID NO: 5) überwand α-Thrombin den inhibierenden Effekt des Peptids.
Die 3 veranschaulicht den Effekt des Peptids RGDWC (Arg-Gly-Asp-Trp-Cys) (SEQ ID NO: 20) auf die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation. 70 nM γ-Thrombin induzierten ein vollständiges Niveau der Plättchenaggregation. 1 mM RPPGF (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe) (SEQ ID NO: 39) beseitigte die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation vollständig. RGDWC (Arg-Gly-Asp-Trp-Cys) (SEQ ID NO: 20) (0,2 mM) beseitigte die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation vollständig. Bei 6,25 μM RGDWC (SEQ ID NO: 20) trat die γ-Thrombin-induzierte Plättchen-aggregation wieder auf.
Die 4 veranschaulicht den Effekt von RGDWC (Arg-Gly-Asp-Trp-Cys) (SEQ ID NO: 20) auf die α-Thrombin-induzierte Ca²⁺-Mobilisierung. 4 nM α-Thrombin induzierten eine vollständige Ca²⁺-Mobilisierung. 0,2 mM RGDWC (SEQ ID NO: 20) wiesen nahezu keinen Effekt auf die Thrombin-induzierte Ca²⁺-Mobilisierung auf.
Die 5 veranschaulicht den Effekt verschiedener Peptide, die mit der Thrombin-induzierten Plättchenaggregation in Wechselwirkung treten, auf die ADP-induzierte Plättchenaggregation. 4,5 μM ADP induzierten eine vollständige Aggregationsreaktion. Die Peptide RPPGF (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe) (SEQ ID NO: 39), MAP4RPPGF und RGKWC (Arg-Gly-Lys-Trp-Cys) (SEQ ID NO: 5) inhibierten bei 1 mM die ADP-induzierte Plättchenaggregation nicht. Alternativ beseitigte RGDWC (Arg-Gly-Asp-Trp-Cys) (SEQ ID NO: 20) bei 0,5 mM eine ADP-induzierte Plättchenaggregation.
Die 6 untersucht das Vermögen des biotinylierten Peptids NATLDPRSFLLR (Biotin-NAT12) (SEQ ID NO: 41) zum Binden an die Peptide RPPGF (Arg-Pro-Pro-Gly-Pro) (SEQ ID NO: 39), MAP4RPPGF, RGDWC (Arg-Gly-Asp-Trp-Cys) (SEQ ID NO: 20) oder RGKWC (Arg-Gly-Lys-Trp-Cys) (SEQ ID NO: 5). Jedes dieser Peptide bei 10 μg/ml wurde durch Inkubieren der Peptide in 0,1 M Na₂CO₃-Puffer, pH 9,6, an eine Mikrotiterplatte gekoppelt. Biotin-NAT12 wurde mit der Platte inkubiert und die Konzentration von gebundenem biotinylierten Peptid wurde bestimmt.
Die Tabelle I ist eine Auflistung der RGKO₄C (SEQ ID NO: 43)-Teilbibliothek und des Einflusses jedes Peptids auf die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation in Plättchen-reichem Plasma. Die Zahlen in der Spalte unter „-fache Zunahme der Aggregationsinhibierung bezüglich RPPGF (SEQ ID NO: 39)" stellen die Zunahme des Inhibierungsgrads der Thrombin-induzierten Plättchenaggregation verglichen mit RPPGF (SEQ ID NO: 39) bei 0,2 mM dar.
Die Tabelle II ist eine Auflistung der RGKO₄C (SEQ ID NO: 43)-Teilbibliothek und des Einflusses jedes Peptids auf die γ-Thrombin-induzierte Calciummobilisierung in Fibroblasten. Die Zahlen in der Spalte unter „Ca²⁺ % Inhibierung" stellen den Inhibierungsgrad der γ-Thrombin-induzierten Calciummobilisierung durch das Peptid dar.
Die Tabelle III ist eine Auflistung der RGKO₄C (SEQ ID NO: 43)-Teilbibliothek und der Affinität von Biotin-NAT12 (SEQ ID NO: 41), an jedes der Peptide, die an die Mikrotiterplattenwells gekoppelt sind, zu binden. Die Zahlen in der Spalte unter „Niveau der Bindung an Biotin-NAT12" stellen den erhöhten Grad der Bindung von Biotin-NAT12 an das angegebene Peptid verglichen mit RPPGF (SEQ ID NO: 39) dar, wobei dessen Bindungsniveau willkürlich als 1 angegeben ist.
Die Tabelle IV ist eine Auflistung der RGDO₄C (SEQ ID NO: 44)-Teilbibliothek und des Einflusses jedes Peptids auf die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation. Die Zahlen in der Spalte unter „-fache Zunahme der Aggregationsinhibierung bezüglich RPPGF (SEQ ID NO: 39)" stellen die Zunahme des Inhibierungsgrads der Thrombin-induzierten Plättchenaggregation verglichen mit RPPGF (SEQ ID NO: 39) bei 0,2 mM dar.
Die Tabelle V ist eine Auflistung der RGDO₄C (SEQ ID NO: 44)-Teilbibliothek und des Einflusses jedes Peptids auf die γ-Thrombin-induzierte Calciummobilisierung in Fibroblasten. Die Zahlen in der Spalte unter „Ca²⁺ % Inhibierung" stellen den Inhibierungsgrad der γ-Thrombin-induzierten Calciummobilisierung durch das Peptid dar.
Die Tabelle VI ist eine Auflistung der RGDO₄C (SEQ ID NO: 44)-Teilbibliothek und der Affinität von Biotin-NAT12, an jedes der Peptide, die an die Mikrotiterplattenwells gekoppelt sind, zu binden. Die Zahlen in der Spalte unter „Niveau der Bindung an Biotin-NAT12" stellen den erhöhten Grad der Bindung von Biotin-NAT12 an das angegebene Peptid verglichen mit RPPGF (SEQ ID NO: 39) dar, wobei dessen Bindungsniveau willkürlich als 1 angegeben ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Peptidanaloga der vorstehenden und im Anspruch 12 angegebenen Formeln I und II. Peptide der Erfindung werden durch herkömmliche Festphasenpeptidsynthesetechniken unter Verwendung einer automatisierten Synthese hergestellt. Jede hier zitierte Literatur wird unter Bezugnahme so einbezogen, als ob sie einzeln unter Bezugnahme einbezogen worden wären. Die interessierenden Segmente können auch durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden. Demgemäß kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung mit Polypeptiden implementiert werden, die durch Peptidsyntheseverfahren oder durch rekombinante Techniken hergestellt werden.
Erfindungsgemäß werden natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäuren mit der allgemeinen Formel ^–CO₂(RCHCH(NH₃)⁺ durch die Addition der Gruppe entweder an den Carboxyl- oder Aminoterminus eines Peptids, das die Kernsequenz umfasst, um Kettenverlängerungsanaloga zu bilden, erzeugt. Die Peptide der Formel I und der Formel II umfassen höchstens zehn (10) aufeinander folgende Aminosäuren. Vorzugsweise umfassen die Peptidverbindung und das Segment fünf aufeinander folgende Aminosäuren. Gemäß der bevorzugten Synthese wurden die synthetischen kombinatorischen Peptidbibliotheken (SPCL) von H-R-O₂-X-X-C-NH₂, H-R-X-O₃-X-C-NH₂, H-R-X-X-O₄-C-NH₂, H-R-G-O₃-X-C-NH₂ und H-R-G-X-O₄-C-NH₂ im Positionsscanformat, und H-R-G-K-O₄-C-NH₂ und H-R-G-D-O₄-C-NH₂ (SEQ ID NOS 43 bzw. 44) im iterativen Format gemäß dem veröffentlichten Verfahren synthetisiert (Houghten et al., BioTechniques 13(3), 412–421 (1992)). O₂, O₃ und O₄ sind die definierten Positionen, an denen eine von jedweden natürlich vorkommenden Aminosäuren, mit Ausnahme von Cystein, angeordnet ist. Das Cystein wurde ausgeschlossen, um eine Dimer- oder Oligomerbildung auszuschließen. „X^„ stellt das äquimolare Gemisch (Houghten et al., BioTechniques 13(3), 412–421 (1992)) der natürlich vorkommenden Aminosäuren, mit Ausnahme von Cystein, dar. Auch hier wurde Cystein weggelassen, um eine Dimerisierung oder Oligomerisierung zu vermeiden.
Die erste Positionsscanbibliothek war aus drei Teilbibliotheken (H-R-O₂-X-X-C-NH₂, H-R-X-O₃-X-C-NH₂ und H-R-X-X-O₄-C-NH₂) zusammengesetzt, die jeweils aus 19 separaten Peptidgemischen zusammengesetzt waren, die insgesamt 19³ oder 6859 individuelle Peptide darstellen. Jede Teilbibliothek enthielt die gleiche individuelle Sequenz, jedoch auf andere Weise angeordnet. Das Screening der ersten Bibliothek, d.h. aller drei ersten Teilbibliotheken, stellte die Informationen bezüglich der effektivsten Aminosäure an jeder Position und der relativen Spezifität jeder Position bereit. Aus den Screeningdaten unter Verwendung der drei Tests (des Plättchenaggregationstests, des Calciummobilisierungstests und des Biotin-NAT12-Bindungstests), die nachstehend detaillierter beschrieben werden, schien sich zu ergeben, dass Glycin (G) an der zweiten Position die inhibierende Aktivität mit der größten Spezifität bereitstellte (d.h. keine anderen Aminosäuren erwiesen sich an dieser Position als so aktiv wie Glycin). Es gab keinen klaren spezifischen Aminosäurekandidaten für die dritte oder vierte Position.
Mit diesen Informationen wurde eine zweite Bibliothek im Positionsscanformat synthetisiert, wobei die erste und die zweite Position als Arginin (R) bzw. Glycin (G) definiert wurden. Die zweite Bibliothek wurde mit dem gleichen Verfahren wie bei der vorstehend angegebenen SPCL-Synthese synthetisiert. Diese zweite Bibliothek war aus zwei Teilbibliotheken (H-R-G-O₃-X-C-NH₂ und H-R-G-X-O₄-C-NH₂) zusammengesetzt, die jeweils aus 19 separaten Peptidgemischen zusammengesetzt waren, die insgesamt 19² oder 361 individuelle Peptide darstellten. Auch hier werden O₃, O₄ und X so verwendet, wie es vorstehend für die erste Bibliothek beschrieben worden ist. Das Screening dieser zwei Teilbibliotheken zeigte, dass zwei Aminosäuren, nämlich Lysin (K) und Asparaginsäure (D), die aktivsten und relativ spezifischen Reste für die dritte Position nach Arginin und Glycin waren. Es gab keinen klaren Kandidatenrest für die vierte Position. Zur Bestimmung des Rests der vierten Position wurde eine dritte Bibliothek im iterativen Format gemäß den veröffentlichten Verfahren synthetisiert (Houghten et al., BioTechniques 13(3), 412–421 (1992)). Diese Bibliothek war aus zwei Teilbibliotheken zusammengesetzt: H-R-G-K-O₄-C-NH₂ und H-R-G-D-O₄-C-NH₂ (SEQ ID NOS 43 bzw. 44). Jede Bibliothek bestand aus 19 individuellen Peptiden mit insgesamt 38 individuellen Peptiden. Das O₄ wurde durch jede natürliche Aminosäure mit Ausnahme von Cystein ersetzt.
Peptidanaloga, die als selektive Antithrombine wirken, können in einem Verfahren zur Verhinderung einer Thrombose verwendet werden. Diese Peptidanaloga sind selektive Antithrombine, da sie die Aktivierung von Plättchen oder anderen Zellen durch menschliches α-Thrombin und γ-Thrombin durch die Spaltung von PAR1 an oder nahe an dessen Thrombinspaltungsstelle inhibieren können, so dass eine Thrombin-induzierte Reiz-Reaktions-Kopplung und eine Aktivierung von Plättchen und anderen Zellen verhindert wird. Die relativen Konzentrationen von Thrombin zu Plättchen, die zur Induzierung einer Plättchenaktivierung oder -aggregation verwendet werden, lagen im Bereich von etwa 0,05 bis etwa 3 nM α-Thrombin oder etwa 15 bis etwa 70 nM γ-Thrombin. Verbindungen der Formel I und der Formel II sind eine erste Generation von Verbindungen, die eine Selektivität bei der Inhibierung der Thrombinaktivierung dadurch erreichen, dass sie auf ein Substrat von Thrombin anstatt auf das Enzym selbst gerichtet sind. Die meisten bekannten Thrombininhibitoren, nämlich Hirudin, Hirulog, Hirugin, Argatroban, usw., treten mit der α-Thrombin-Wirkung durch Blockieren von dessen gesamter proteolytischer Aktivität in Wechselwirkung. Die Verwendung dieser bekannten proteolytischen Inhibitoren zur Blockierung der α-Thrombin-Aktivierung von Plättchen und anderen Zellen, die PAR1 exprimieren, kann zu einer übermäßigen Antikoagulation, einer Hämorrhagie und einer Störung anderer wichtiger biologischer Aktivitäten wie z.B. der Mitogenese und der Zellproliferation führen. Die Peptidanaloga, die in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden, erlauben eine Inhibierung einer Thrombin-induzierten Plättchen- oder anderen Zell-Reiz-Reaktions-Kopplung und Aktivierung, die durch ein Substrat von Thrombin, PAR1, vermittelt wird, ohne andere α-Thrombin-Aktivitäten, wie z.B. die Aktivierung der Faktoren V und XIII, zu stören.
Wir haben gefunden, dass die hier beschriebenen Peptide die Thrombinspaltung des Thrombinrezeptors (PAR1), der auf Plättchen, Fibroblasten und anderen menschlichen Zellen exprimiert wird, inhibieren. Folglich haben wir gefunden, dass die hier beschriebenen Peptide das Vermögen zur Inhibierung der Thrombin-induzierten Plättchenaktivierung durch Blockieren der Spaltung von PAR1 und einer anschließenden Aktivierung von Plättchen durch die Bereitstellung des neuen Aminoterminus des gespaltenen Rezeptors aufweisen. Die Verabreichung eines hier beschriebenen Peptidanalogons umfasst ein Verfahren zur Inhibierung der Thrombin-induzierten Aktivierung von Plättchen, Endothelzellen, Gehirnzellen, Fibroblasten, glatten Muskelzellen oder anderen Zellen, die den PAR1-Rezeptor für Thrombin enthalten. Diese Funktion inhibiert die Plättchenthrombusbildung und andere Aktivitäten, die durch den Thrombinrezeptor vermittelt werden.
Die hier beschriebenen Peptidanaloga inhibieren die Plättchenaktivierung nicht durch den gleichen Mechanismus wie intakte Kininogene oder die isolierte Domäne 3. 1 mM Peptidanaloga blockieren die Bindung von ¹²⁵I-α-Thrombin genauso wenig wie ein molarer Überschuss an gereinigtem HK, LK oder isolierter Domäne 3. Wir haben gefunden, dass diese Peptidanaloga:

1) die α-Thrombin-induzierte Calciummobilisierung in Fibroblasten blockieren,
2) die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation blockieren, und
3) Biotin-NAT12 direkt binden.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung stellen die Peptidanaloga, die in einem Verfahren der Erfindung verwendet werden, eine Aminosäuresubstitution in der vierten Position des Stammpeptids dar, das die Sequenz RGKZ₄C (Arg-Gly-Lys-Z₄-Cys) (SEQ ID NO: 43) aufweist, und umfassen höchstens 10 aufeinander folgende Aminosäuren. Die vierte Position kann jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, mit der Ausnahme von Cystein, sein. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung stellen die Peptidanaloga, die in einem Verfahren der Erfindung verwendet werden, eine Aminosäuresubstitution in der vierten Position des Stammpeptids dar, das die Sequenz RGDZ₄C (Arg-Gly-Asp-Z₄-Cys) (SEQ ID NO: 44) aufweist, und umfassen höchstens 10 aufeinander folgende Aminosäuren. Die vierte Position kann jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, mit der Ausnahme von Cystein, sein.
I. Herstellung von Peptidanaloga, die mit der Thrombin-induzierten Plättchenaggregation in Wechselwirkung treten
A. Tests zum Screenen kombinatorischer Bibliotheken
Es wurden drei Tests entwickelt, um Peptide zu screenen, die durch kombinatorische Bibliotheken erzeugt worden sind:
1. Plättchenaggregation
Frisches Vollblut wurde gesammelt und mit 0,013 M Natriumcitrat gemischt und Plättchen-reiches Plasma wurde gemäß dem Verfahren von Meloni et al., J. Biol. Chem. 266, 6786 (1991) hergestellt. Plättchen-reiches Plasma mit einer normalisierten Plättchenzählung zwischen 2 bis 2,5 × 10⁸ Plättchen/ml wurde einer Küvette eines Aggregometers (Chronlog Corp., Havertown, PA), standardisiert unter Verwendung des Protokolls von Meloni et al., vorstehend, zugesetzt. Zu untersuchende Peptide wurden der Küvette zugesetzt und das Gemisch wurde für kurze Zeit stabilisiert. Sobald die Grundlinie stabilisiert war, wurde γ-Thrombin (10 bis 70 nM) (Haematologic Technologies, Essex Junction, VT) zugesetzt, um die minimale Konzentration des Agonisten zu bestimmen, die erforderlich ist, um eine vollständige Plättchenaggregation zu erreichen. Alle Untersuchungen mit Peptiden wurden unter Verwendung der Schwellenkonzentrationen von γ-Thrombin durchgeführt. Die Aggregation wurde vor dem Stoppen 5 min ablaufen gelassen. Wenn ADP-induzierte Plättchenaggregationsuntersuchungen durchgeführt wurden, wurden der Küvette, die Plättchen-reiches Plasma enthielt, 1 bis 5 μM ADP (Sigma) zugesetzt.
Wie es in der 1 gezeigt ist, induzierten 70 nM γ-Thrombin eine vollständige Plättchenaggregationsreaktion. Die Aggregationsreaktion wurde durch 0,1 bis 1 mM RPPGF (SEQ ID NO: 39) beseitigt. Bei 0,25 mM RPPGF (SEQ ID NO: 39) trat die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation wieder auf. Diese Inhibierungsreaktion wurde mit derjenigen verglichen, die mit RGKWC (SEQ ID NO: 5) auftrat. Bei 0,25 bis 1 mM RGKWC (SEQ ID NO: 5) wurde die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation vollständig inhibiert. Bei 0,125 mM RGKWC (SEQ ID NO: 5) kehrte die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation zu einem Niveau zurück, das ohne jedweden Inhibitor vorlag. Die Tabelle I zeigt eine Liste von RGKO₄C (SEQ ID NO: 43)-Peptiden, welche die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation inhibieren. Die stärksten bis schwächsten Inhibitoren der γ-Thrombin-induzierten Plättchenaggregation sind RGKLC, RGKTC, RGKRC, RGKIC, RGKWC, RGKYC und RGKMC (SEQ ID NOS 1 bis 7) in abnehmender Reihenfolge.
Die 3 zeigt Ergebnisse mit dem RGDWC (SEQ ID NO: 20)-Peptid bezüglich der γ-Thrombin-induzierten Plätchenaggregation. 70 nM γ-Thrombin induzierten eine Schwellen-Plättchenaggregation. 1 mM RPPGF (SEQ ID NO: 39) beseitigte die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation. Das Peptid RGDWC (SEQ ID NO: 20) inhibierte die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation bis hinab zu einer Konzentration von 25 μM. Bei 6,25 μM RGDWC (SEQ ID NO: 20) kehrte die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation zu einem normalen Wert zurück. Die Tabelle IV gibt alle RGDO₄C (SEQ ID NO: 44)-Peptide von dem stärksten bis zum schwächsten an, welche die γ-Thrombin-induzierte Plättchenaggregation inhibieren.
Die 5 vergleicht das Vermögen von RGKWC (SEQ ID NO: 5)- und RGDWC (SEQ ID NO: 20)-Peptiden im Hinblick auf die ADP-induzierte Plättchenaggregation. Unbehandelte Plättchen wiesen eine vollständige Plättchenaggregation mit 4,5 μM ADP auf. 1 mM RPPGF (SEQ ID NO: 39), MAP4RPPGF (MaP₄) und RGKWC (SEQ ID NO: 5) inhibierte die ADP-induzierte Plättchenaggregation nicht. Alternativ inhibierten ≥ 0,5 mM RGDWC (SEQ ID NO: 20) die ADP-induzierte Plättchenaggregation vollständig. Diese Daten zeigten, dass die RGKO₄C (SEQ ID NO: 43)-Gruppe von Verbindungen spezifischer auf die Thrombin-induzierte Plättchenaggregation gerichtet war als die RGDO₄C (SEQ ID NO: 44)-Gruppe von Verbindungen, welche die Thrombin-induzierte Plättchenaggregation beeinflussen konnte, jedoch auch die ADP-induzierte Plättchenaggregation beeinflusste. Es wird angenommen, dass die Verbindungen auf RGD-Basis die Thrombin-induzierte Plättchenaggregation durch Blockieren des letzten gemeinsamen Stoffwechselwegs der Plättchenaggregation, d.h. des Bindens von Fibrinogen an den heterodimeren Komplex von Glykoprotein IIb/IIIa, d.h. α_IIbβ₃-Integrin, partiell inhibiert.
2. Calciummobilisierungstest
Bei dem zweiten Test, der zur Bewertung von Peptiden von den kombinatorischen Bibliotheken entwickelt worden ist, wird die Inhibierung der α-Thrombin-induzierten Calciummobilisierung in Fibroblasten genutzt. Normale menschliche Lungenfibroblasten (NHLF) wurden von Clonetics, San Diego, CA, einem Tochterunternehmen von Bio-Wittaker, Walkersville, MD, erworben. Die freie Ca²⁺-Konzentration im Cytoplasma ([Ca²⁺]_i) wurde unter Verwendung des fluoreszierenden Ca²⁺-Indikators Fura-2 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) gemessen. Eine Suspension von Fibroblasten in Hepes-Tyrode's-Puffer wurde durch Inkubieren mit 2 μm Fura-2/Acetoxymethylester für 45 min gemäß dem Verfahren von Rasmussen et al., J. Biol. Chem. 268, 14322 (1993), mit Fura-2 beladen. Die markierten Fibroplasten wurden von überschüssiger Sonde durch Waschen mittels Zentrifugation bei 1000 U/min (180 × g) getrennt. Aliquots der markierten Fibroblasten wurden in eine Quarzküvette mit einem Magnetrührstab überführt, die dann in einer thermostatengesteuerten, auf 37°C eingestellten Kammer in einem Fluoreszenzspektrophotometer (Perkin-Elmer LS50B Spektrofluorometer, Chicago, IL) angeordnet wurde. Reagenzien, Testpeptid (von 0,2 mM zu einer effektiven niedrigeren Konzentration) und α-Thrombin (2 bis 4 nM) wurden der Küvette nacheinander direkt zugesetzt. Die Anregungswellenlängen variierten zwischen 340 und 380 nm. Die Fluoreszenz wurde durch Aufzeichnen des emittierten Lichts bei 510 nm gemäß den Angaben von Fisher et al., Mol Pharm. 35, 195 (1989) gemessen. Die minimale Emission wurde bei einer solubilisierten Fibroblastenprobe in der Gegenwart von 10 mM EDTA bestimmt; die maximale Emission wurde bei der gleichen Probe, wobei 10 mM Ca²⁺ zugesetzt worden sind, bestimmt. Die freie Ca²⁺-Konzentration in Fibroblasten wurde durch das Verfahren von Grykiewicz et al., J. Biol. Chem. 260, 3440 (1985) berechnet. Das Verhältnis der Fluoreszenzmesswerte wurde als R = 340/380 nm berechnet und gemäß der Gleichung [Ca²⁺]_i = K_D((R – R_min)/R_max – R)(S_f2/S_b2) verarbeitet, um die freie Ca²⁺-Konzentration in Fibroblasten zu bestimmen. Der K_D-Wert für Fura-2 wurde als 224 nM angenommen. R_max und R_min sind das maximale und das minimale Fluoreszenzverhältnis, die jeweils am Ende des Experiments gemessen worden sind; S_f2 und S_b2 sind die Fluoreszenzwerte bei 380 nm in der Abwesenheit bzw. der Gegenwart einer [Ca²⁺]-Sättigung. Die Reaktion wurde 3 bis 5 min verfolgt. Wie es in der 2 gezeigt ist, blockierte das Peptid RGKWC (SEQ ID NO: 5) eine 2 nM-α-Thrombin-induzierte Calciummobilisierung in Fibroblasten bei Konzentrationen von ≥ 50 μM. Die Tabelle II gibt alle RGKO₄C (SEQ ID NO: 43)-Peptide vom stärksten bis zum schwächsten Inhibitor der Thrombin-induzierten Ca²⁺-Mobilisierung an. Die Tabelle zeigt, mit abnehmender Stärke, die prozentuale Inhibierung der Thrombin-induzierten Calciummobilisierung unter Verwendung von 0,2 mM jedes der Peptide. Die acht stärksten Inhibitoren in abnehmender Reihenfolge waren: RGKWC, RGKKC, RGKRC, RGKHC, RGKPC, RGKQC, RGKTC und RGKDC (SEQ ID NOS 5, 14, 3, 13, 16, 17, 2 bzw. 9). In der 4 inhibierte das Peptid RGDWC (SEQ ID NO: 20) bei 0,2 mM 31% einer 4 nM α-Thrombin-induzierten Ca²⁺-Mobilisierung in Fibroblasten. Die Tabelle V zeigt die Liste von RGDO₄C (SEQ ID NO: 44)-Peptiden vom stärksten bis zum schwächsten Inhibitor der Thrombin-induzierten Ca²⁺-Mobilisierung. Die Tabelle zeigt, mit abnehmender Stärke, die prozentuale Inhibierung der Thrombin-induzierten Calciummobilisierung unter Verwendung von 0,2 mM jedes der Peptide. Die sieben stärksten Peptide in abnehmender Reihenfolge der Stärke waren: RGDNC, RGDWC, RGDFC, RGDKC, RGDMC, RGDYC und RGDAC (SEQ ID NOS 32, 20, 21, 29, 24, 35 bzw. 37).
3. Test der Bindung von Biotin-NAT12 an Peptidanaloga
Es wurde ein dritter Test entwickelt, um das Vermögen von Biotin-NAT12 (NATLDPRSFLLR) (SEQ ID NO: 41) zum direkten Binden an Peptide, die mit Mikrotiterplatten verknüpft sind, zu bewerten. In diesem Test wurden Peptidanaloga durch Inkubation des Peptids in 0,1 M Na₂CO₃-Puffer, pH 9,6, über Nacht bei 4°C mit Mikrotiterplattenküvettenwells verknüpft. Nach dem Koppeln des Peptids an den Küvettenwell wurde der Inhalt der Wells verworfen und jeder Well wurde mit 1% Rinderserumalbumin in 0,01 M Na₃PO₄, 0,15 M NaCl bei pH 7,4 blockiert. Nach 1 Stunde Inkubieren wurde der Inhalt der Wells verworfen und die Wells wurden dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Die Wells wurden dann mit Biotin-NAT12 inkubiert. Die Menge an gebundenem Biotin-NAT12 wurde durch Zugeben von Streptavidin-Peroxidase gefolgt von der Zugabe von turbo-TMB (Pierce) bestimmt.
Die 5 zeigt, dass das Peptid RGKWC (SEQ ID NO: 5) in einem größeren Ausmaß bindet als das Peptid RGDWC (SEQ ID NO: 20). Das Ausmaß des Bindens von RGKWC (SEQ ID NO: 5) war größer als dasjenige von RPPGF (SEQ ID NO: 39). Dessen Bindungsniveau war jedoch geringer als dasjenige, das bei dem mehrfach verzweigten Peptid MAP4RPPGF festgestellt wurde. Die Tabelle III zeigt die RGKO₄C (SEQ ID NO: 43)-Peptide, die Biotin-NAT12 binden. In abnehmender Reihenfolge des Bindungsniveaus umfassen diese Peptide: RGKSC, RGKMC, RGKHC, RGKKC, RGKFC, RGKLC, RGKWC und RGKVC (SEQ ID NOS 18, 7, 13, 14, 11, 1, 5 bzw. 19). Die Tabelle VI zeigt die RGDO₄C (SEQ ID NO: 44)-Peptide, die Biotin-NAT12 binden. Das beste RGDO₄C (SEQ ID NO: 44)-peptid (RGDSC) (SEQ ID NO: 34) zum Binden von Biotin-NAT12 wies ein zu RGKWC (SEQ ID NO: 5) äquivalentes Vermögen zum Binden von Biotin-NAT12 auf. Das beste bis zum schlechtesten der RGDO₄C (SEQ ID NO: 44)-Peptide zum Binden von Biotin-NAT12, die in der Tabelle VI angegeben sind, sind: RGDSC, RGDGC, RGDQC, RGDEC, RGDIC, RGDPC, RGDDC und RGDYC (SEQ ID NOS 34, 28, 23, 22, 36, 38, 27 bzw. 35). Ein Festphasen-Peptid-Peptid-Bindungstest wurde zur Bestimmung der Biotin-NAT12-Bindung an Bibliothekpeptide verwendet. Testpeptide in 0,1 M Na₂CO₃-Puffer, pH 9,6, wurden bei 10 μg/Well in einem 50 μl-Volumen durch eine Inkubation über Nacht an Mikrotiterplattenwells gekoppelt. Nach der Inkubation wurde der Inhalt der Wells verworfen und die Wells wurden mit einem pH 7,4-Puffer gewaschen, der 0,01 M Na₃PO₄, 0,15 M NaCl und 0,01% Tween 20 enthielt. Nach dem Blockieren jedes Wells mit 1% Rinderserumalbumin in Radioimmunoassayqualität wurden die verknüpften Peptide mit 100 μl von 100 μM Biotin-NAT12 für 1 Stunde bei 37°C inku biert. Nach der Inkubation wurde der Inhalt der Wells verworfen und die Wells wurden dreimal (jedes Mal 100 μl/Well) mit dem vorstehend angegebenen Puffer gewaschen. Jeder Well wurde dann mit 100 μl einer 2 μg/ml-Lösung eines Immuno-Pure Streptoavidin-Meerettichperoxidase-Konjugats (Pierce Chemical Co., Rockville, IL) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der Inhalt der Wells wurde verworfen und die Wells wurden dreimal in der vorstehend beschriebenen Weise gewaschen. Die Wells wurden dann mit 100 μl eines Peroxidasespezifischen, schnell reagierenden Substrats, nämlich turbo-3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (turbo-TMB, Pierce) für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und die sieh entwickelnde Farbreaktion wurde durch die Zugabe von 100 μl 1 M Phosphorsäure gestoppt. Die Extinktion wurde bei 450 nm unter Verwendung eines Microplate Auto Reader EL311 (Bio-Tek, Winooski, VT) gemessen. Das Ausmaß des Biotin-NAT12-Bindens an Testpeptide von den Bibliotheken wurde durch den Grad der angezeigten Extinktion bewertet.
B. Herstellung von kombinatorischen Peptidbibliotheken
Drei aufeinander folgende kombinatorische Bibliotheken wurden hergestellt, um die hier enthaltenen Peptidanaloga zu erhalten. Die erste Bibliothek begann mit dem Peptid RPPGF (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe) (SEQ ID NO: 39). Untersuchungen zeigten, dass eine Alaninsubstitution in dem Peptid an der Position 1 am aminoterminalen Ende zu einem beträchtlichen Verlust an Thrombin-inhibierender Aktivität führte. Alternativ führte eine Substitution eines Phenylalanins durch ein Cystein an der fünften Position an dem carboxyterminalen Ende zu keinerlei Aktivitätsverlust. Da Cystein in dieser fünften Position das Binden der Peptide an Kunststoffplatten förderte, war bei allen folgenden Peptiden Cystein an dieser Position angeordnet.
Die anfängliche kombinatorische Positionspeptidbibliothek bestand aus H-RO₂XXC-NH₂, H-RXO₃XC-NH₂ und H-RXXO₄C-NH₂, wobei O₂, O₃ oder O₄ alle L-Aminosäuren von A bis Y, mit Ausnahme von Cystein, darstellen, und X ein äquimolares Gemisch von L-Aminosäuren von A bis Y, mit Ausnahme von Cystein, ist (Houghten et al., BioTechniques 13(3), 412–421 (1992)). Untersuchungen zeigten, dass ein Glycin in der zweiten Position (ein) Peptid(e) mit dem besten Vermögen zur Inhibierung der Thrombin-induzierten Plättchenaggregation, zur Inhibierung der Thrombin-induzierten Calciummobilisierung und zum Binden von Biotin-NAT12 erzeugte. Es wurde eine zweite kombinatorische Peptidbibliothek gestaltet, um die dritte und die vierte Position dieser Sequenz zu untersuchen. Die Peptide H-RGO₃XC-NH₂ und H-RGXO₄C-NH₂ wurden hergestellt, wobei O₃ und O₄ alle L-Aminosäuren von A bis Y, mit Ausnahme von Cystein, waren, und X ein äquimolares Gemisch von L-Aminosäuren von A bis Y, mit Ausnahme von Cystein, war. Untersuchungen zeigten, dass Lysin oder Aspara ginsäure in der dritten Position Peptide mit dem besten Vermögen zur Inhibierung der Thrombin-induzierten Plättchenaggregation, zur Inhibierung der Thrombin-induzierten Calciummobilisierung und zum Binden von Biotin-NAT12 erzeugte. Es wurde eine dritte Bibliothek hergestellt, bei der die dritten Positionen als Lysin oder Asparaginsäure fixiert waren, H-RGKO₄C-NH₂ bzw. H-RGDO₄C-NH₂ (SEQ ID NOS 43 bzw. 44), wobei O₄ alle L-Aminosäuren, mit Ausnahme von Cystein, umfasst. Die Peptide von dieser dritten kombinatorischen Bibliothek sind die hier beschriebenen Peptidanaloga.
Zur Herstellung der Peptidbibliotheken wurde eine automatisierte Standard-Festphasenpeptidsynthese verwendet. Die synthetischen Peptidbibliotheken wurden unter Verwendung von Methylbenzhydrylamin (MBHA)-Polystyrolharz und Standard-t-Boc-Chemie in Kombination mit einer gleichzeitigen Mehrfachpeptidsynthese SMPS hergestellt (Houghten et al., Nature 354, 84–86 (1991); Houghten et al., BioTechniques 13, 412–421 (1992); Dooley et al., Science 266, 2019–2022 (1994)). Es wurde ein Peptidsyntheseharz hergestellt, das die Äquimolarität der Peptide auf dem Harz sicherstellt (Houghten et al., BioTechniques 13, 412–421 (1992)). 19 poröse Polypropylenpakete, die jeweils 4,65 mmol des MBHA-Harzes enthielten, wurden an jede der interessierenden geschützten N-α-t-Boc-Aminosäuren gekoppelt (Houghten et al., BioTechniques 13, 412–421 (1992)). Cystein wurde aus dem Kopplungsgemisch ausgeschlossen. In allen Fällen waren die Kopplungsreaktionen zu > 99,9% vollständig, was mittels Pikrinsäure- oder Ninhydrintests bewertet wurde (Gisin Analytica chim. Acta 58, 248–249 (1972), Kaiser et al., Analyt. Biochem. 34, 595–598 (1970)). Die resultierenden Harze von jedem Paket wurden vereinigt und sorgfältig gemischt. Es lagen etwa 4000 Kügelchen pro mg des Harzes vor. Das Harzgemisch wurde dann in 19 Portionen mit gleichem Gewicht aufgeteilt, die dann als poröse Polypropylenpakete angeordnet wurden, worauf eine N-α-t-Boc-Schutzgruppenentfernung und eine Neutralisation der resultierenden Amin-TFA-Salze stattfand. Die Harzpakete wurden dann mit Lösungen der einzelnen aktivierten Aminosäuren umgesetzt, um die verschiedenen Peptidkombinationen zu erzeugen. Die Peptidgemische wurden von ihren Schutzgruppen befreit und dann von ihren jeweiligen Harzen unter Verwendung von „low-high"-Fluorwasserstoff (HF) (Cuervo et al., Peptide Res. 1, 81–86 (1991); J. P. Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 105, 6442–645 (1983), Houghten et al., Int. J. Peptide Protein Res. 27, 673–678 (1986)) in einer Mehrfach-HF-Spaltungsvorrichtung (Multiple Peptide Systems, San Diego, CA) abgespalten. Die Extraktion der einzelnen Peptidgemische wurde mit H₂O oder verdünnter Essigsäure durchgeführt und die Lösungen wurden lyophilisiert.
Tabelle I Effekt der RGKO₄C (SEQ ID NO: 21)-Peptidteilbibliothek auf die Thrombin-induzierte Plättchenaggregation
Tabelle II Inhibierung der Thrombin-induzierten Calciummobilisierung durch Peptide der RGKO₄C (SEQ ID NO: 43)-Peptidteilbibliothek
Tabelle III Bindung von Biotin-NAT12-Peptid von PAR1 an die RGKO₄C (SEQ ID NO: 43)-Peptidteilbibliothek
Tabelle IV Effekt der RGDO₄C (SEQ ID NO: 44)-Peptidteilbibliothek auf die Thrombin-induzierte Plättchenaggregation
Tabelle V Inhibierung der Thrombin-induzierten Calciummobilisierung durch Peptide der RGDO₄C (SEQ ID NO: 44)-Peptidteilbibliothek
Tabelle VI Bindung von Biotin-NAT12-Peptid von PAR1 an die RGDO₄C (SEQ ID NO: 44)-Peptidteilbibliothek
Tabelle VII
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind zur Verwendung in Individuen mit akuten Koronarsyndromen (Crescendo-Angina, Myokardinfarkt) und in Individuen vorgesehen, die akute Koronarsyndrome aufweisen und eine perkutane transluminale Koronarangioplastie (PTCA) mit der Platzierung eines künstlichen Stents erhalten. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können als ein einzelnes Mittel allein oder in Kombinationen mit anderen Mitteln verwendet werden. Diese anderen Mittel können jedweden oder jedwede Anzahl der folgenden Arzneistoffe (einschließlich alle davon) umfassen: Standardheparin, Heparin mit niedrigem Molekulargewicht, Aspirin, Ticlopidin, Clopidogrel, Abciximab, Tirofiban oder Eptifibatid. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können mit dem (den) anderen Mittel(n) zur Behandlung von Individuen im Hinblick auf akute Koronarsyndrome und während einer entsprechenden Behandlung intravenös verabreicht werden. Diese Verbindungen der Erfindung könnten auch bei der Behandlung von Individuen mit Dacron-Transplantaten von einer peripheren Bypass-Chirurgie und von Individuen mit Stents für eine Karotid- oder Nierenarterienstenose geeignet sein. Mittel, wie z.B. die hier angegebenen Mittel, können bei der Behandlung von Patienten mit vorübergehenden ischämischen Attacken, fortschreitendem Schlaganfall und vollständigem Gehirnschlag geeignet sein.
Gereinigte Peptide der Erfindung können unter Umständen verabreicht werden, bei denen eine Inhibierung der Thrombin-induzierten Plättchenaktivierung oder Plättchenaggregation erwünscht ist. Die Analoga dienen zur Verwendung für und Verabreichung an Lebewesen, die eine Plättchenthrombose mit jedweder Ursache aufweisen und sie können prophylaktisch bei der Chirurgie oder der Katheterisierung zum Einsetzen von künstlichen Dacron- Transplantaten und Stents verwendet werden, um Reokklusionsereignisse aufgrund von Plättchenthromben zu verhindern. Folglich können die Analoga Individuen infundiert werden, um Schlaganfälle und ein Zerebralödem zu verhindern.
Die Analoga können mit jedwedem zweckmäßigen Mittel verabreicht werden, das zu einer wesentlichen Abgabe in den Blutstrom führt. Vorzugsweise ist die Verabreichung parenteral. Die Verabreichung von Analoga kann jedoch mit jedwedem Mittel durchgeführt werden, das die Analoga in den Blutstrom einbringt, einschließlich einer intravenösen, intranasalen und oralen Verabreichung, sowie einer Verabreichung über ein Dermalpflaster oder Rektalzäpfchen. Eine intravenöse Verabreichung ist gegenwärtig als der bevorzugte Verabreichungsweg vorgesehen, obwohl auch eine intranasale Verabreichung eingesetzt werden kann.
Die Peptidanaloga können mit jedwedem pharmazeutischen Träger kombiniert werden, der für den Empfänger physiologisch verträglich ist. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann gemäß herkömmlicher pharmazeutischer Techniken gemischt werden. Der Träger kann abhängig von der Form des zur Verabreichung gewünschten Präparats in verschiedenen Formen bereitgestellt werden. Für eine parenterale Verabreichung kann der Träger steriles Wasser und gegebenenfalls andere Bestandteile zur Unterstützung der Löslichkeit oder für Konservierungszwecke umfassen. Bei der intravenösen Verabreichung, wobei es sich um den bevorzugten parenteralen Weg handelt, können die Analoga in geeigneten intravenösen Abgabevehikeln gelöst werden, die physiologisch verträgliche Substanzen, wie z.B. steriles Natriumchlorid mit einem gepufferten pH-Wert, der mit physiologischen Bedingungen verträglich ist, wie z.B. Kochsalzlösung, enthalten. Eine injizierbare Suspension kann ebenfalls hergestellt werden, wobei in diesem Fall geeignete flüssige Träger, Suspendiermittel und dergleichen eingesetzt werden können.
Die Dosierung der Verabreichung wird von der Größe und dem Gewicht des Patienten abhängen. Der Fachmann der Infusionstherapie auf einer Intensivstation oder bei der intervenierenden Kardiologie kann geeignete Dosierungen und Verabreichungsschemata ableiten, die zu den speziellen Umständen und Bedürfnissen des Patienten passen. Die physiologisch verträglichen Dosierungen liegen im Bereich von etwa 10 bis 30 mg pro Tag pro kg Körpergewicht. Bei der bevorzugten intravenösen Verabreichung beträgt die Dosierung 10 mg/kg Körpergewicht in 5 ml normaler Kochsalzlösung oder in jedwedem geeigneten Vehikel, gegeben mit einer Rate von 1 ml/min. Die therapeutisch optimalen Mengen der Dosierung können durch Überwachen der Prä- und Postinfusionsplättchenfunktion durch Bestimmen der ex vivo-γ-Thrombin-induzierten Plättchenaggregation und -sekretion, und auch durch Messen hämostatischer Parameter, wie z.B. der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT), der Prothrombinzeit (PT), der Thrombinzeit (TT) und der Template-Blutungszeit (BT) bestimmt werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

In vitro-Verfahren zur Inhibierung der Thrombinaktivierung in einer menschlichen Zelle, die PAR1 exprimiert, umfassend: (a) Bereitstellen eines Gemischs, das Thrombin und eine menschliche Zelle, die PAR1 exprimiert, umfasst, wobei die Konzentration von Thrombin zur Induktion einer Reiz-Reaktions-Kopplung innerhalb der Zelle wirksam ist; (b) In-Kontakt-Bringen des Gemischs mit einer Verbindung, die mindestens ein Segment mit der Aminosäuresequenz der Formel I oder der Formel II umfasst, wobei die Formel I
ist, wobei Z₄ jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, ausschließlich Cystein, ist, und wobei die Formel II
ist, wobei Z₄ jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, ausschließlich Cystein, ist, und wobei die Verbindung höchstens 10 aufeinander folgende Aminosäuren umfasst.
Verfahren zur Inhibierung der Thrombinaktivierung in einer Probe, die Blutplättchen umfasst, umfassend: (a) Bereitstellen einer Lösung, die Thrombin und Blutplättchen umfasst, wobei die Konzentration von Thrombin zum Verursachen einer Plättchenaggregation wirksam ist; (b) In-Kontakt-Bringen der Blutprobe mit einer Verbindung, die mindestens ein Segment mit der Aminosäuresequenz der Formel I oder der Formel II umfasst, wobei die Formel I
ist, wobei Z₄ jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, ausschließlich Cystein, ist, und wobei die Formel II
ist, wobei Z₄ jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, ausschließlich Cystein, ist, und wobei die Verbindung höchstens 10 aufeinander folgende Aminosäuren umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Thrombin alpha-Thrombin, gamma-Thrombin oder ein Gemisch davon ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, welches das Inhibieren einer Thrombin-induzierten Plättchenaggregation umfasst, wobei das Thrombin alpha-Thrombin oder gamma-Thrombin ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Segment ist:
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, welches das Inhibieren einer Thrombin-induzierten Calciummobilisierung in Fibroblasten umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Segment ist:
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Verbindung höchstens 5 aufeinander folgende Aminosäuren umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Zelle, die PAR1 exprimiert, ein Plättchen, eine Endothelzelle, eine Gehirnzelle, ein Fibroblast oder eine glatte Muskelzelle ist.
Verfahren zum Binden einer Verbindung an das biotinylierte Peptid NATLDPRSFLLR (SEQ ID NO: 41) (Biotin-NAT12), umfassend: (a) Bereitstellen einer Verbindung, die mindestens ein Segment mit der Aminosäuresequenz der Formel I oder der Formel II umfasst, wobei die Formel I
ist, wobei Z₄ jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, ausschließlich Cystein, ist, und wobei die Formel II
ist, wobei Z₄ jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, ausschließlich Cystein, ist, und wobei die Verbindung höchstens 10 aufeinander folgende Aminosäuren umfasst; und (b) Inkubieren des biotinylierten Peptids NATLDPRSFLLR (SEQ ID NO: 41) (Biotin-NAT12) mit der Verbindung.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Segment ist:
Verbindung, die mindestens ein Segment mit der Aminosäuresequenz der Formel I oder der Formel II umfasst, wobei die Formel I
ist, wobei Z₄ jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, ausschließlich Cystein oder Asparagin, ist, und wobei die Formel II
ist, wobei Z₄ jedwede natürlich vorkommende Aminosäure, ausschließlich Cystein, ist, und wobei die Verbindung höchstens 10 aufeinander folgende Aminosäuren umfasst, und wobei die Verbindung nicht Arg-Gly-Asp-Phe-Cys (SEQ ID NO: 21) ist.
Verbindung nach Anspruch 12, bei der das Segment der Formel I ist:

und bei der das Segment der Formel II ist:
Verbindung nach Anspruch 13, die höchstens 5 aufeinander folgende Aminosäuren umfasst.
Verbindung nach einem der Ansprüche 12 bis 14 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch eine Therapie oder Diagnose.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 12 bis 14 zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung einer Thrombose, wobei Thrombose als Verschluss eines Gefäßes aufgrund der Bildung eines Plättchen-reichen Thrombus, Fibrin-reichen Thrombus oder eines gemischten Plättchen-Fibrin-Thrombus definiert ist.