DE60014919T2

DE60014919T2 - Peptidantagonisten des faktors viia

Info

Publication number: DE60014919T2
Application number: DE60014919T
Authority: DE
Inventors: S. Mark DENNIS
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-08-06
Filing date: 2000-08-04
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2020-08-05
Also published as: US20040077547A1; CA2380633A1; AU6518300A; EP1203014A2; DE60014919D1; JP2003512303A; WO2001010892A3; WO2001010892A2; ATE279437T1; EP1203014B1; AU783087B2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neue Verbindungen, die einen) durch FVIIa vermittelten/-s oder mit FVIIa zusammenhängenden/-s Vorgang oder Ereignis, wie beispielsweise die katalytische Überführung von FX in FXa, FVII in FVIIa oder FIX in FIXa, verhindern oder blockieren. In speziellen Aspekten binden die Verbindungen der Erfindung Faktor VIIa (FVIIa), sein Zymogen Faktor VII (FVII) und/oder blockieren die Bindung von FVII oder FVIIa mit einer Peptidverbindung der vorliegenden Erfindung. Ferner betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die neuen Verbindungen umfassen, sowie ihre Verwendung in der Forschungs-, Diagnose-, Therapie- und prophylaktischen Verfahren.
Beschreibung verwandter Offenbarungen
Faktor VIIa (FVIIa) ist eine Trypsin-ähnliche Serinprotease im Plasma, die durch den extrinsischen Weg der Koagulationskaskade an der Hämostase mitwirkt (Davie et al., Biochem. 30(43), 10363–10370 (1991)). FVIIa wird durch Proteolyse einer einzelnen internen Peptidbindung aus seinem Zymogen Faktor VII (FVII) umgewandelt. FVII im Kreislauf ist ein globuläres Protein mit einer N-terminalen γ-Carboxyglutaminsäure- (Gla-) Domäne, zwei Epidermis-Wachstumsfaktor- (EGF-) Domänen und einer C-terminalen Proteasedomäne. Vor der Überführung in FVIIa bindet sich FVII an einen Gewebefaktor (TF), der konstitutiv auf Zellen exprimiert wird, die durch das Gefäßendothel vom Plasma getrennt sind (Carson, S.D., und Brozna, J.P., Blood Coag. Fibrinol. 4, 281–292 (1993)). TF und FVII bilden in Gegenwart von Calciumionen einen Eins-zu-eins-Proteinkomplex (TF-FVIIa) (Wildgoose et al., Biochem. 32, 114–119 (1993)). Diese Bindung erleichtert die Proteolyse von FVII zu FVIIa an einer Stelle (Arg152–Ile153 bei menschlichem FVII (hFVII)), die sich zwischen der C-terminalen EGF-Domäne (EGF2) und der Proteasedomäne befindet (Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2412–2416 (1986)). Während eine Reihe von Serinproteasen FVII in vitro aktivieren, ist die Protease, die für In-vivo-Aktivierung von FVII verantwortlich ist, nicht bekannt (Wildgoose et al., w.o.).
TF dient als Cofaktor für FVIIa, wobei die FVIIa-Gla-Domäne mit dem C-terminalen Ende von TF nahe der Membran wechselwirkt und die FVIIa-Proteasedomäne über der N-terminalen Domäne liegt (Higashi et al., J. Biol. Chem. 269, 18891–18898 (1994)). Die Struktur der extrazellulären Domäne von menschlichem TF (hTF) und seines Komplexes mit FVIIa mit gehemmtem aktivem Zentrum wurden vor kurzem durch Röntgenkristallographie bestimmt (Harlos et al., Nature 370, 662–666 (1994); Muller et al., Biochemistry 33, 10864 (1994); Banner et al., Nature 380, 41–46 (1996)).
Der TF-FVIIa-Komplex stellt den Hauptinitiator des extrinsischen Wegs der Blutgerinnung dar (Carson, S.D., und Brozna, J.P., Blood Coag., Fibrinol. 4, 281–292 (1993); Davie, E.W., et al., Biochemistry 30, 10363–10370 (1991); Rapaport, S.I., und Rao, L.V.M., Arterioscler. Thromb. 12, 1111–1121 (1992)). Der Komplex initiiert den extrinsischen Weg durch Aktivierung von FX zu Faktor Xa (FXa), FIX zu Faktor IXa (FIXa) und außerdem FVII zu FVIIa. Die Wirkung von TF-FVIIa führt schließlich zur Überführung von Prothrombin in Thrombin, das viele biologische Funktionen aufweist (Badimon, L., et al., Trends Cardiovasc. Med. 1, 261–267 (1991)). Zu den wichtigsten Funktionen von Thrombin gehört die Überführung von Fibrinogen in Fibrin, das polymerisiert und ein Gerinnsel bildet. Der TF-FVIIa-Komplex wirkt auch als Sekundärfaktor bei der Ausweitung der physiologischen Wirkungen der Kontaktaktivierungssystems mit.
Es wurde angenommen, dass die Beteiligung dieser Plasma-Proteasesysteme an verschiedenen klinischen Manifestationen, einschließlich Arterien- und Venenthrombose, septischem Schock, Atemnotsyndrom bei Erwachsenen (ARDS), akuter Verbrauchskoagulopathie (DIC) und verschiedenen anderen Erkrankungen, eine wichtige Rolle spielt (Haskel, E.J., et al., Circulation 84, 821–827 (1991)); Holst, J., et al., Haemostasis 23 (Suppl. 1), 112–117 (1993); Creasey, A.A., et al., J. Clin. Invest. 91, 2850–2860 (1993); siehe auch Colman, R.W., N. Engl. J. Med. 320, 1207–1209 (1989); Bone, R.C., Arch. Intern. Med. 152, 1381–1389 (1992)).
Es wurde nachgewiesen, dass Antikörper, die mit der Proteasedomäne von FVII reaktiv sind, die proteolytische Funktion von TF-FVIIa hemmen (Dickinson et al., J. Mol., Biol. 277, 959–971 (1998)). Peptide, die der EGF2-Domäne von Faktor VII entsprechen, sind starke Inhibitoren der TF-FVIIa-vermittelten Aktivierung von FX (Husbyn et al., J. Peptide Res. 50, 475–482 (1997)). Verschiedene Peptide, die verschiedenen Regionen von FVII entsprechen (z.B. die Aminosäuresequenzreste 372–337 und 103–112 von hFVII), wurden aufgrund ihrer Fähigkeit, TF-FVIIa-vermittelte Koagulation zu hemmen, als therapeutische Antikoagulanzien vorgeschlagen (internationale Veröffentlichung Nr. WO 90/03390; internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/00541). Am aktiven Zentrum modifizierte FVII-Varianten, die zur Bindung von TF fähig sind, wurden als pharmazeutische Zusammensetzungen zur Prävention von TF/FVIIa-vermittelter Koagulation vorgeschlagen (internationale Veröffentlichung Nr. WO 91/11514). Die internationale Veröffentlichung Nr. WO 96/40779 beschreibt Peptidfragmente von TF, die FX-Aktivierung hemmen. Die US-Patente 5.759.954, 5.863.893, 5.880.256 und 5.834.244 beschreiben Varianten von Serinprotease-Inhibitoren vom Kunitz-Typ, die TF-FVIIa-Aktivität hemmen und erwiesenerweise die durch den Gewebefaktor initiierte Prothrombinzeit (PT) verlängern. Das stimmt mit der Fähigkeit dieser Inhibitoren von aktiven TF-FVIIa-Stellen überein, FX-Aktivierung durch Hemmung des TF-FVIIa-Komplexes zu verhindern.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verbindungen und Zusammensetzungen bereit, die einen durch FVII/FVIIa vermittelten oder damit zusammenhängenden Vorgang, wie beispielsweise die katalytische Überführung von FVII in FVIIa, FIX in FIXa oder FX in FXa, hemmen und so anfängliche Vorgänge des extrinsischen Wegs der Blutgerinnung blockieren. Außerdem sind die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung fähig, die thrombotischen Wirkungen von engogenem TF durch Bindung an FVII oder FVIIa zu neutralisieren und TF-FVIIa-vermittelte Aktivierung von FX zu verhindern. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind somit für therapeutische und prophylaktische Verfahren zur Hemmung von durch TF-FVIIa vermit telten oder damit zusammenhängenden Vorgängen nützlich. Vorteilhafterweise ermöglichen die Zusammensetzungen eine starke Hemmung von FVIIa und des TF-FVIIa-Komplexes, wodurch in bevorzugten Ausführungsformen niedrig dosierte pharmazeutische Formulierungen bereitgestellt werden.
Demgemäß stellt die Erfindung Verbindungen bereit, die durch Bindung von FVII oder FVIIa einen durch FVII oder FVIIa vermittelten Koagulationsvorgang hemmen. Solche Verbindungen binden vorzugsweise FVII oder FVIIa mit einer Kd von weniger als etwa 100 μM, vorzugsweise weniger als etwa 100 nM, und hemmen vorzugsweise die Aktivität anderer Proteasen der Koagulationskaskade im Wesentlichen nicht. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können beispielsweise Peptide oder Peptidderivate, wie z.B. Peptidmimetika, sein. Spezifische Beispiele für solche Verbindungen zur Hemmung der durch FVIIa vermittelten Aktivierung von FX umfassen lineare oder zyklische Peptide und Kombinationen davon, vorzugsweise mit einer Länge zwischen etwa 10 und 100 Aminosäureresten und gegebenenfalls am N-Terminus oder C-Terminus oder an beiden modifiziert, sowie ihre Salze und Derivate, funktionelle Analoge davon und verlängerte Peptidketten, die Aminosäuren oder Polypeptide an den Termini der Sequenzen aufweisen.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung bereit, die durch FVII/FVIIa vermittelte Aktivierung von FX blockiert, das folgende Schritte umfasst:

(1) Kontaktieren von FVII/FVIIa mit einer Verbindung der Erfindung in Gegenwart und Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls unter Bedingungen, welche die spezifische Bindung der Peptidverbindung der Erfindung an FVII/FVIIa ermöglichen;
(2) Detektieren des Ausmaßes an spezifischer Bindung der Peptidverbindung der Erfindung an FVII/FVIIa, die in Gegenwart und Abwesenheit der Kandidatenverbindung stattfindet, worin ein Rückgang des Ausmaßes der Bindung der Peptidverbindung in Gegenwart der Kandidatenverbindung in Bezug auf das Ausmaß der Bin dung in Abwesenheit der Kandidatenverbindung ein Indikator für die Fähigkeit der Kandidatenverbindung ist, die durch FVII/FVIIa vermittelte Aktivierung von FX zu blockieren.

Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Hemmung der Aktivierung von FX zu FXa bereit, welches das Kontaktieren von FVII mit TF unter Bedingungen, welche die Bildung eines TF-FVIIa-Komplexes in Gegenwart einer Peptidverbindung der Erfindung (oder, nach bestimmten Aspekten, einer Verbindung, welche die Wechselwirkung von FVII/FVIIa mit einer Peptidverbindung der Erfindung verhindern) ermöglichen, sowie das Kontaktieren des TF-FVIIa-Komplexes mit FX umfasst. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden die Kontaktierungsschritte in vitro durchgeführt.
In bestimmten Aspekten betrifft die Erfindung Kombinationen aus Peptidverbindungen mit anderen Peptidverbindungen oder mit anderen Proteinen, insbesondere Serumproteinen oder -peptiden. Die Kombinationen werden im Hinblick auf unterschiedliche Ziele hergestellt, einschließlich der Erhöhung der Affinität oder Avidität der Peptidverbindung zu FVII/FVIIa, wie beispielsweise durch die Verwendung verschiedener Multimerisationsdomänen, wie hierin beschrieben ist; der Erhöhung der Stabilität der Peptidverbindung oder der Vereinfachung ihrer Gewinnung und Reinigung, wie beispielsweise durch Expression der Peptidverbindung als Z-Proteinfusion; und der Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit der Peptidverbindung gemäß Aspekten der Erfindung, welche eine In-vivo-Verwendung der Peptidverbindung umfassen, beispielsweise durch Verlängerung oder Verkürzung der Serum-Halbwertszeit, indem die Peptidverbindung etwa an ein Plasmaprotein, wie z.B. Serumalbumin, ein Immunglobulin, Apolipoproteine oder Transferring fusioniert wird (wobei die Fusion am besten in rekombinanten Wirtszellen oder durch Verwendung von bifunktionellen Vernetzern durchgeführt wird).
Die Erfindung umfasst Zusammensetzungen, einschließlich pharmazeutischer Zusammensetzungen, die Verbindungen, wie z.B. Peptide, zur Behandlung einer durch FVII/FVIIa vermittelten Störung enthalten, sowie Sets und Produkte. Sets und Produkte umfassen vorzugsweise:

(a) einen Behälter;
(b) ein Etikett auf dem Behälter oder an diesem befestigt; und
(c) eine Zusammensetzung, die eine Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfasst, in diesem Behälter; worin die Zusammensetzung zur Behandlung einer durch FVII/FVIIa vermittelten Störung wirksam ist. Vorzugsweise weist das Etikett auf dem Behälter darauf hin, dass die Zusammensetzung zur Behandlung einer durch FVII/FVIIa vermittelten Störung verwendet werden kann und dass die Verbindung in der Zusammensetzung eine Verbindung enthält, die FVII/FVIIa bindet und eine durch FVII/FVIIa vermittelte Aktivierung von FX verhindert. Die Sets umfassen gegebenenfalls Zubehör, wie z.B. einen zweiten Behälter, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer enthält, und Anleitungen zur Verwendung der Zusammensetzung zur Behandlung einer Störung.

Ebenfalls geoffenbart sind Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von koagulopathischen Störungen, insbesondere solchen, die durch die Beteiligung von FVII/FVIIa oder des TF-FVIIa-Komplexes gekennzeichnet sind. Daher stellt die Erfindung die Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer durch FVII/FVIIa oder TF-FVIIa vermittelten Krankheit oder Störung in einem Wirt bereit, der es benötigt, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Erfindung an den Wirten. Mithilfe der Verfahren kann ein mit FVII/FVIIa oder TF-FVIIa in Verbindung stehender Vorgang verhindert, blockiert oder gehemmt werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Eindämmung der Schwere oder des Grades von Gewebeverletzung in Zusammenhang mit Blutgerinnung verwendet.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung verschiedene Dosierungsformen für die Verbindungen der vorliegenden Erfindung bereit, einschließlich, aber nicht einge schränkt auf solche für parenterale, orale, rektale und pulmonale Verabreichung einer Verbindung. In bevorzugten Aspekten der vorliegenden Erfindung wird eine therapeutische Dosierungsform bereitgestellt, die zum Inhalieren geeignet ist, und die Erfindung stellt eine therapeutische Behandlung von Krankheiten oder Störungen, die einen durch FVII/FVIIa vermittelten oder damit verbundenen Vorgang oder Vorfall umfassen, wie beispielsweise die Aktivierung von FX, durch pulmonale Verabreichung einer Verbindung der Erfindung bereit. Genauer gesagt betrifft die Erfindung die pulmonale Verabreichung der Verbindungen der Erfindung, insbesondere der Peptidverbindungen, durch Inhalation. Somit stellt die vorliegende Erfindung eine Aerosolformulierung bereit, die eine Menge einer Verbindung der Erfindung, genauer gesagt einer Peptidverbindung der Erfindung, die wirksam ist, um einen durch FVII/FVIIa vermittelten oder damit verbundenen Vorgang oder Vorfall zu blockieren oder zu verhindern, und ein Dispergiermittel umfasst. In einer Ausführungsform kann die Verbindung der Erfindung, insbesondere die Peptidverbindung der Erfindung, in Form einer flüssigen Aerosolformulierung bereitgestellt werden. Alternativ dazu kann die Verbindung als Aerosolformulierung in Form eines trockenen Pulvers bereitgestellt werden. Somit werden gemäß vorliegender Erfindung Formulierungen bereitgestellt, die eine wirksame, nichtinvasive Alternative zu anderen parenteralen Verabreichungswegen für die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von durch FVII/FVIIa oder TF-FVIIa vermittelten oder damit verbundenen Vorgängen darstellen.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 zeigt die Hemmung von FX-Aktivierung durch ausgewählte Peptide;
2A und 2B. 2A zeigt die Hemmung des TF-abhängigen extrinsischen Gerinnungsweges durch verschiedene Peptide, gemessen durch eine dosisabhängige Verlängerung der Prothrombinzeit (PT) in normalem menschlichem Plasma. 2B zeigt die Ergebnisse (kein Beweis für einer Verlängerung der Gerinnungsdauer) im oberflächenabhängigen intrinsischen Weg, bestimmt durch die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) in normalem menschlichem Plasma.
3 zeigt die Hemmung der Bindung von TF183b (Seq.-ID Nr. 23) an FVIIa oder TF-FVIIa durch ausgewählte Peptide.
4 zeigt die Aminosäuresequenzen ausgewählter Peptide und ihre IC₅₀-Werte in Bezug auf die Hemmung von FX-Aktivierung sowie die IC₅₀-Werte in Bezug auf die Hemmung der Bindung von TF183b an entweder FVIIa oder TF-FVIIa. "Ac-" steht für einen CH₃CO-modifizierten N-Terminus; "-NH₂" oder "-amid" steht für einen NH₂-modifizierten C-Terminus; "aca" steht für Aminocapronsäure; "Biotin", "bi" oder "b" steht für Biotin; "Z" steht für die Z-Consensus-Domäne von Protein A (AQHDEAVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPNVDMN, Seq.-ID Nr. 98). TF53 (Seq.-ID Nr. 1); TF57 (Seq.-ID Nr. 2) TF64 (Seq.-ID Nr. 3); TF65 (Seq.-ID Nr. 4); TF66 (Seq.-ID Nr. 5) TF67 (Seq.-ID Nr. 6) TF68 (Seq.-ID Nr. 7); TF69 (Seq.-ID Nr. 8); TF70 (Seq.-ID Nr. 9); TF71 (Seq.-ID Nr. 10); TF72 (Seq.-ID Nr. 11); TF73 (Seq.-ID Nr. 12); TF78 (Seq.-ID Nr. 13); TF79 (Seq.-ID Nr. 14); TF80 (Seq.-ID Nr. 15); TF81 (Seq.-ID Nr. 16); TF99 (Seq.-ID Nr. 17); TF100 (Seq.-ID Nr. 18); TF100Z (Seq.-ID Nr. 19); TF153 (Seq.-ID Nr. 20); TF175 (Seq.-ID Nr. 21); TF176 (Seq.-ID Nr. 22); TF183 und TF183b (Seq.-ID Nr. 23); TF197 (Seq.-ID Nr. 24); TF198 (Seq.-ID Nr. 25); TF201Z (Seq.-ID Nr. 26); TF202Z (Seq.-ID Nr. 27); TF203Z (Seq.-ID Nr. 28); TF204Z (Seq.-ID Nr. 29); TF205Z (Seq.-ID Nr. 30); TF206Z (Seq.-ID Nr. 31); TF207Z (Seq.-ID Nr. 32); TF208Z (Seq.-ID Nr. 33); TF209Z (Seq.-ID Nr. 34); TF210Z (Seq.-ID Nr. 35); TF211Z (Seq.-ID Nr. 36); F212Z (Seq.-ID Nr. 37); TF213Z (Seq.-ID Nr. 38); TF214Z (Seq.-ID Nr. 39); TF215Z (Seq.-ID Nr. 40); TF216Z (Seq.-ID Nr. 41); TF219Z (Seq.-ID Nr. 42); TF220Z (Seq.-ID Nr. 43); TF221Z (Seq.-ID Nr. 44); TF222Z (Seq.-ID Nr. 45); TF223Z (Seq.-ID Nr. 46); TF224Z (Seq.-ID Nr. 47); TF225Z (Seq.-ID Nr. 48); TF226Z (Seq.-ID Nr. 49); TF227Z (Seq.-ID Nr. 50); TF228Z (Seq.-ID Nr. 51); TF229Z (Seq.-ID Nr. 52); TF230Z (Seq.-ID Nr. 53); TF231Z (Seq.-ID Nr. 54); TF232Z (Seq.-ID Nr. 55); TF233Z (Seq.-ID Nr.56); TF234Z (Seq.-ID Nr. 57); TF235Z (Seq.-ID Nr. 58); TF236Z (Seq.-ID Nr. 59); TF247Z (Seq.-ID Nr. 60); TF248Z (Seq.-ID Nr. 61); TF261Z (Seq.-ID Nr. 62); TF262Z (Seq.-ID Nr. 63); TF263Z (Seq.-ID Nr. 64); TF264Z (Seq.-ID Nr. 65).
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen Definitionen
Die in den Ansprüchen und in der Beschreibung verwendeten Begriffe sind, sofern nicht anders angegeben, wie nachstehend definiert.
In der gesamten Beschreibung verwendete Abkürzungen umfassen: FIXa für Faktor IXa und FIX für das Zymogen Faktor IX; FXa für Faktor Xa und FX für das Zymogen Faktor X; FVII für das Zymogen Faktor VII; FVIIa für Faktor VIIa; TF für Gewebefaktor; TF-FVIIa für den Komplex aus Gewebefaktor und Faktor VIIa; FVII/FVIIa für FVII und/oder FVIIa; sTF oder TF_1-219 für einen löslichen Gewebefaktor, der aus den Aminosäureresten 1 bis 219 der extrazellulären Domäne besteht; TF_1-243 für einen Membrangewebefaktor, der aus den Aminosäureresten 1 bis 243 der extrazellulären und der Transmembran-Domäne besteht (Paborsky et al., J. Biol. Chem. 266, 21911-21916 (1991)); PT für Prothrombinzeit; APTT für aktivierte partielle Thromboplastinzeit.
Die Begriffe "Wirkstoff" und "Verbindung" werden innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung austauschbar verwendet und umfassen alle Moleküle oder Substanzen, welche die Wechselwirkung zwischen FVII/FVIIa und einer Peptidverbindung der vorliegenden Erfindung blockieren oder verhindern. Solche Moleküle umfassen kleine organische und bioorganische Moleküle, z.B. Peptidmimetika und Peptidanaloge, Antikörper, Immunadhäsine, Proteine, Peptide, Glykoproteine, Glykopeptide, Glykolipide, Polysaccharide, Oligosaccharide, Nucleinsäuren, pharmakologische Wirkstoffe und ihre Metabolite und dergleichen.
Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen Peptidanaloge oder -mimetika der Peptidverbindungen der vorliegenden Erfindung. Dazu gehören beispielsweise Peptide, welche nicht natürlich vorkommende Aminosäuren enthalten, solange die Verbindung, wie hierin beschrieben, FVII-FVIIa-Hemmwirkung beibehält. Auf ähnliche Weise können Peptidmimetika und -analoge chemische Strukturen aufweisen, die keine Aminosäure sind, die Struktur der Peptidverbindungen der vorliegenden Erfindung nachahmen und die beschriebene FVII/VIIa-Hemmwirkung beibehalten. Solche Verbindungen sind im Allgemeinen dadurch charakterisiert, dass sie, in Bezug auf Größe, Ladung oder Hydrophobie, die in der geeigneten räumlichen Ausrichtung vorhanden ist, ähnliche physikalische Eigenschaften aufweisen wie ihre Gegenstücke, die Peptidverbindungen. Ein spezifisches Beispiel für eine peptidmimetische Verbindung ist eine Verbindung, worin die Amidbindung zwischen einer oder mehreren der Aminosäuren durch beispielsweise eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung oder andere auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Bindung ersetzt ist (siehe beispielsweise Sawyer, in Peptide Based Drug Design, 378–422, ACS, Washington, D.C. (1995)).
Der Begriff "Peptid" wird hierin für eingeschränkte (d.h. ein Strukturelement aufweisend, wie beispielsweise die Gegenwart von Aminosäuren, die eine β-Schleife oder ein β-Faltblatt initiieren, oder beispielsweise durch die Gegenwart von disulfidgebundenen Cys-Resten zyklisiert) oder uneingeschränkte (z.B. lineare) Aminosäuresequenzen aus weniger als etwa 50 Aminosäureresten, vorzugsweise weniger als etwa 40 Aminosäureresten, einschließlich Multimere, wie z.B. Dimere davon oder zwischen denselben, verwendet. Von den Peptiden aus weniger als etwa 40 Aminosäureresten sind Peptide aus zwischen etwa 10 und etwa 30 Aminosäureresten bevorzugt und Peptide aus etwa 20 Aminosäureresten besonders bevorzugt. Beim Lesen der vorliegenden Beschreibung werden Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung jedoch erkennen, dass nicht die Länge eines bestimmten Peptids sondern seine Fähigkeit, FVII/FVIIa zu binden und mit der Peptidverbindung wie hierin beschrieben um die Bindung zu konkurrieren, das Peptid unterscheiden. Daher sind Aminosäuresequenzen aus 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 und 25 Aminosäureresten mit gleich hoher Wahrscheinlichkeit Verbindungen innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung.
Der Begriff "Aminosäure" wird innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung im weitesten Sinne gebraucht und umfasst die natürlich vorkommenden L-α-Aminosäuren oder -reste. Hierin werden die herkömmlichen Ein- und Dreibuchstabencodes für natürlich vorkommende Aminosäuren verwendet (Lehninger, A.L., Biochemistry, 2. Aufl., S. 71–92, Worth Publishers, New York, New York (1975)). Der Begriff umfasst D-Aminosäuren sowie chemisch modifizierte Aminosäuren, wie z.B. Aminosäureanaloge, natürlich vorkommende Aminosäuren, die normalerweise nicht in Proteine inkorporiert sind, wie z.B. Norleucin, und chemisch synthetisierte Verbindungen mit Eigenschaften, die auf dem Gebiet der Erfindung typischerweise Aminosäuren zugeordnet werden. Analoge oder Mimetika von Phenylalanin oder Prolin, welche die gleiche Konformationseinschränkung der Peptidverbindungen ermöglichen wie natürliches Phe oder Pro sind beispielsweise in die Definition von Aminosäure eingeschlossen. Solche Analoge und Mimetika werden hierin als "funktionelle Äquivalente" einer Aminosäure bezeichnet. Weitere Beispiele für Aminosäuren wurden von Roberts und Vellaccio in "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Gross und Meiehofer, Hrsg., Bd. 5, 341, Academic Press, Inc., New York, New York (1983), angeführt, das durch Verweis hierin aufgenommen ist.
Der Begriff "konservative" Aminosäuresubstitution bezieht sich in dieser Erfindung auf Aminosäuresubstitutionen, die funktionell äquivalente Aminosäuren substituieren. Konservative Aminosäureveränderungen führten zu stillen Veränderungen in der Aminosäuresequenz des resultierenden Peptids. Beispielsweise können eine oder mehrere Aminosäuren mit ähnlicher Polarität als funktionelle Äquivalente fungieren und zu einer stillen Änderung in der Aminosäuresequenz des Peptids führen. Die größten Gruppen von konservativen Aminosäuresubstitionen umfassen:

(1) hydrophob: His, Trp, Tyr, Phe, Met, Leu, Ile, Val, Ala;
(2) neutral hydrophil: Cys, Ser, Thr;
(3) polar: Ser, Thr, Asn, Gln;
(4) sauer/negativ geladen: Asp, Glu;
(5) geladen: Asp, Glu, Arg, Lys, His;
(6) positiv geladen: Arg, Lys, His;
(7) basisch: His, Lys, Arg;
(8) Reste, die auf die Kettenausrichtung Einfluss ausüben: Gly, Pro; und
(9) aromatisch: Trp, Tyr, Phe, His

Außerdem können strukturell ähnliche Aminosäuren einige der spezifischen Aminosäuren konservativ ersetzen. Gruppen von strukturell ähnlichen Aminosäuren umfassen: (Ile, Leu und Val); (Phe und Tyr); (Lys und Arg); (Gln und Asn); (Asp und Glu); und (Gly und Ala). In diesem Zusammenhang versteht sich, dass Aminosäuren basierend auf Sperrigkeit, Ladung und/oder Hydrophobie der Seitenketten substituiert werden.
Aminosäurereste können in Bezug auf ihre Seitenkettengruppen ferner in zyklische oder nichtzyklische, aromatische oder nichtaromatische eingeteilt werden, wobei diese Bezeichnungen Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung geläufig sind.
Peptide, die durch die hierin beschriebenen Festphasensyntheseverfahren synthetisiert werden, sind beispielsweise nicht auf Aminosäuren eingeschränkt, für welche Gene für die Aminosäuren umfassenden Substitutionen kodieren. Aminosäuren, die häufig vorkommen und für die nicht der genetische Code kodiert, sind beispielsweise jene, die in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 90/01940 beschrieben und in der nachstehenden Tabelle I zusammengefasst sind, sowie z.B. 2-Aminoadipinsäure (Aad) für Glu und Asp; 2-Aminopimelinsäure (Apm) für Glu und Asp; 2-Aminobuttersäure (Abu) für Met und Leu und andere aliphatische Aminosäuren; 2-Aminoheptansäure (Ahe) für Met, Leu und andere aliphatische Aminosäuren; 2-Aminoisobuttersäure (Aib) für Gly; Cyclohexylalanin (Cha) für Val und Leu und Ile; Homoarginin (Har) für Arg und Lys; 2,3-Diaminopropionsäure (Dpr) für Lys, Arg und His; N-Ethylglycin (EtGly) für Gly, Pro und Ala; N-Ethylglycin (EtGly) für Gly, Pro und Ala; N-Ethylasparagin (EtAsn) für Asn und Gln; Hydroxyllysin (Hyl) für Lys; Allohydroxyllysin (AHyl) für Lys; 3- (und 4-) Hydroxyprolin (3Hyp, 4Hyp) für Pro, Ser und Thr; Alloisoleucin (Alle) für Ile, Leu und Val; p-Amidinophenylalanin für Ala; N-Methylglycin (MeGly, Sarcosin) für Gly, Pro und Ala; N-Methylisoleucin (Melle) für Ile; Norvalin (Nva) für Met und andere aliphatische Aminosäuren; Norleucin (Nle) für Met und andere aliphatische Aminosäuren; Ornithin (Orn oder Or) für Lys, Arg und His; Citrullin (Cit) und Methioninsulfoxid (MSO) für Thr, Asn und Gln; -methylphenylalanin (MePhe), Trimethylphenylalanin, halogeniertes (F, Cl, Br und I) Phenylalanin, Trifluoroylphenylalanin für Phe.
Ein nützliches Verfahren zur Identifizierung bestimmter Reste oder Regionen der Verbindung für eine andere Aminosäuresubstitution, als sie hierin beschrieben ist, nennt sich Alanin-Scanning-Mutagenese und wurde von Cunningham und Wells, Science 244, 1081–1085 (1989), beschrieben. Hier wird ein Rest oder eine Gruppe von gewünschten Resten identifiziert (beispielsweise geladene Reste, wie z.B. Arg, Asp, His, Lys und Glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure ersetzt, um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit dem wässrigen Umfeld in oder außerhalb der Zelle zu beeinflussen. Regionen, die funktionelle Empfindlichkeit gegenüber der Substitution aufweisen, werden dann verfeinert, indem weitere oder andere Variationen an oder für die Substitutionsstellen eingeführt werden. Während als Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenzvariation vorbestimmt ist, braucht die Art der Mutation selbst nicht vorbestimmt zu sein. Um beispielsweise die Wirksamkeit einer Mutation an einer gegebenen Stelle zu optimieren, kann Ala-Scanning oder zufallsbestimmte Mutagenese am Zielcodon oder an der Zielregion durchgeführt und die exprimierte Verbindung auf die optimale Kombination gewünschter Aktivität gescreent werden.
Phagen-Display von Protein- oder Peptidbibliotheken bietet eine weitere Möglichkeit zur Selektion von Verbindungen mit verbesserter Affinität, geänderter Spezifität oder erhöhter Stabilität (Smith, G.P., Curr. Opin. Biotechnol. 2, 668–673 (1991); Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401–404 (1997)). Proteine mit hoher Affinität, die bei monovalentem Display als Fusionen mit dem M13-Gen-III-Hüllprotein dargestellt sind (Clackson, T., et al., Trends Biotechnol 12, 173–183 (1994)), können durch Klonierung und Sequenzierung der entsprechenden DNA identifiziert werden, die nach mehreren Bindungsselektionsdurchgängen in den Phagemidteilchen verpackt ist.
Andere Verbindungen umfassen die Fusion von immunogenen Polypeptiden, wie beispielsweise von bakteriellen Polypeptiden, wie z.B. β-Lactamase, eines Enzyms, wofür ein E.coli-Trp-Locus kodiert, oder eines Hefeproteins, oder anderer Polypeptide, wie beispielsweise der Z-Domäne von Protein A, an den N- oder C-Terminus der hierin beschriebenen Verbindungen, sowie eine C-terminate Fusion mit Proteinen mit langer Halbwertszeit, wie z.B. einer konstanten Region eines Immunglobulins oder anderer Immunglobulinregionen, Albumin oder Ferritin, wie in WO 89/02922 beschrieben, die am 6. April 1989 veröffentlicht wurde. Ferner können auch freie funktionelle Gruppen auf den Seitenketten der Aminosäurereste durch Amidierung, Acylierung oder eine andere Substitution modifiziert werden, durch die beispielsweise die Löslichkeit der Verbindungen geändert werden kann, ohne ihre Aktivität zu beeinträchtigen. "Ac-" bezeichnet beispielsweise einen CH₃CO-modifizierten N-Terminus und "-NH2" einen -NH₂-modifzierten C-Terminus.
Bevorzugte Aminosäuresequenzen innerhalb des Kontexts der vorliegenden Erfindung sind nicht natürlich vorkommende Aminosäuresequenzen. Mit nicht natürlich vorkommend ist gemeint, dass die Aminosäuresequenz in der Natur nicht vorkommt. Bevorzugt sind nicht natürlich vorkommende Aminosäuresequenzen aus zwischen etwa 10 und 30 Aminosäureresten, vorzugsweise etwa 20 Aminosäureresten. Dazu gehören Peptide, Peptidanaloge und -mimetika, die natürlich sowie nicht natürlich vorkommende Aminosäuren umfassen. Insbesondere bevorzugt sind, wie oben beschrieben, Sequenzen, die aus natürlich vorkommenden Aminosäuren bestehen.
Der Begriff "Multimerisationsdomäne" bezieht sich in bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung auf den Abschnitt des Moleküls, an den die Verbindung, insbesondere die Peptidverbindung, gebunden wird, entweder direkt oder über eine "Linkerdomäne". Die Multimerisationsdomäne ist eine Aminosäuredomäne, die gemäß bevorzugten Ausführungsformen die Wechselwirkung zwischen zwei oder mehr Multimerisationsdomänen erleichtert. Während die Multimerisationsdomäne die Wechselwirkung zwischen zwei oder mehr Multimerisationsdomänen fördert, besteht im Kontext der vorliegenden Erfindung nicht die Voraussetzung, dass das an eine Multimerisationsdomäne gebundene Peptid als Teil eines Multimers vorliegen muss.
Gemäß bevorzugten Aspekten der vorliegenden Erfindung ist die Multimerisationsdomäne ein Polypeptid, das eine stabile Wechselwirkung zwischen zwei oder mehr Multimerisationsdomänen fördert. Nichteinschränkende Beispiele für eine Multimerisationsdomäne sind eine Immunglobulinsequenz, wie z.B. eine konstante Region eines Immunglobulins, ein Leucin-Zipper, eine hydrophobe Region, eine hydrophile Region, ein Polypeptid, das ein freies Thiol umfasst, welches eine intermolekulare Disulfidbindung zwischen zwei oder mehr Multimerisationsdomänen bildet, oder z.B. eine "protuberance-into-cavity"-Domäne, wie sie im US-Patent Nr. 5.731.168 beschrieben ist. In diesem Patent werden Protuberanzen gebildet, indem kleine Aminosäure-Seitenketten am Verbindungsteil eines ersten·Polypeptids durch eine größere Seitenkette (z.B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt werden. Gegebenenfalls werden auf dem Verbindungsteil eines zweiten Polypeptids kompensierende Höhlungen mit gleicher oder ähnlicher Größe wie die Protuberanzen gebildet, indem große Aminosäure-Seitenketten durch kleinere ersetzt werden (z.B. Alanin oder Threonin).
Daher stellt in einem bevorzugten Aspekte die Multimerisationsdomäne den Abschnitt eines Moleküls bereit, der eine stabile Wechselwirkung zwischen zwei oder mehr Multimerisationsdomänen fördert oder ermöglicht und die Bildung von Dimeren und anderen Multimeren aus monomeren Multimerisationsdomänen fördert oder ermöglicht. Vorzugsweise sind Multimerisationsdomänen gemäß diesem Aspekt der Erfindung Domänen aus konstanten Regionen von Immunglobulinen. Konstante Domänen von Immunglobulinen bringen den Vorteil mit sich, dass sie die In-vivo-Halbwertszeit der Verbindungen der Erfindung im Kreislauf verbessern und es Fachleuten gegebenenfalls ermöglichen, in bestimmten Aspekten der Erfindung eine "Effektorfunktion", wie sie nachstehend beschrieben wird, einzubauen.
In der vorliegenden Beschreibung und den vorliegenden Ansprüchen wurden die Reste in Immunglobulin-Schwerketten gemäß dem EU-Index nummeriert, wie er in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Aufl., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA (1991) beschrieben ist, was durch Verweis hierin aufgenommen ist. Der "EU-Index gemäß Kabat" bezieht sich auf die Nummerierung der Reste des menschlichen IgG1-EU-Antikörpers.
"Antikörper" (Ab) und "Immunglobuline" (Ig) sind typischerweise Glykoproteine mit den gleichen Struktureigenschaften. Während Antikörper Bindungsspezifität gegenüber einem bestimmten Antigen aufweisen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper als auch andere antikörperähnliche Moleküle ohne Antigenspezifität. Polypeptide der letzteren Art werden beispielsweise in geringen Mengen vom Lymphsystem und in größeren Mengen von Myelomen produziert.
"Antikörper" und "Immunglobuline" sind üblicherweise heterotetramere Glykoproteine mit etwa 150.000 Dalton, die aus zwei identischen Leicht- (L-) Ketten und zwei identischen Schwer- (H-) Ketten bestehen. Jede Leichtkette ist durch eine kovalente Disulfidbindung an eine Schwerkette gebunden, während die Anzahl der Disulfidbindungen zwischen Schwerketten verschiedener Immunglobulin-Isotypen variiert. Jede Schwer- und Leichtkette weist außerdem in regelmäßigen Abständen Disulfidbrücken innerhalb der Kette auf. Jede Schwerkette umfasst eine Amino- (N-) terminale variable Domäne (VH) gefolgt von einer Carboxy- (C-) terminalen konstanten Domäne. Jede Leichtkette weist eine variable N-terminale Domäne (VL) und eine C-terminale konstante Domäne auf; die konstante Domäne der Leichtkette (CL) ist übereinstimmend mit der ersten konstanten Domäne (CH1) der Schwerkette angeordnet, und die variable Leichtkettendomäne ist übereinstimmend mit der variablen Domäne der Schwerkette angeordnet. Gemäß der Domänendefinition von Immunglobulin-Polypeptidketten weisen leichte (L-) Ketten zwei konformationsähnliche Domänen VL und CL auf; und Schwerketten wiesen vier Domänen (VH, CH1, CH2 und CH3) auf, die jeweils eine Disulfidbrücke innerhalb der Kette aufweisen.
Je nach Aminosäuresequenz der konstanten (C-) Domäne der Schwerketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. Jede Immunglobulinklasse kann in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, beispielsweise IgG, IgG, IgG, IgG₄, IgA₁ und IgA₂. Die konstanten Schwerkettendomänen, die den verschiedenen Immunglobulinklassen entsprechen, sind die α-, δ-, ε-, γ- bzw. μ-Domäne. Leichtketten von Antikörpern jeder Wirbeltierspezies können basierend auf der Aminosäuresequenz ihrer konstanten Domänen einer von zwei Typen zugeordnet werden, Kappa (κ) oder Lambda (λ). Sequenzuntersuchungen haben gezeigt, dass die μ-Kette von IgM fünf Domänen umfasst: VH, CHμ1, CHμ2, CHμ3 und CHμ4. Die Schwerkette von IgE (ε) umfasst ebenfalls fünf Domänen.

Die Strukturen der Untereinheiten und die dreidimensionale Konfiguration von verschiedenen Klassen von Immunglobulinen sind allgemein bekannt. Davon sind IgA und IgM polymer; und jede Untereinheit enthält zwei Leicht- und zwei Schwerketten. Die Schwerkette von IgG (γ) enthält eine Länge einer Polypeptidkette, die zwischen der CHγ1- und CHγ2-Domäne liegt und als Hinge-Region bekannt ist. Die α-Kette von IgA weist eine Hinge-Region auf, die eine O-gebundene Glykosylierungsstelle enthält, und die μ- und ε-Kette weisen keine zur Hinge-Region der γ- und α-Kette analoge Sequenz auf, enthalten aber eine vierte konstante Domäne, die den anderen fehlt. Die Domänenzusammensetzung von Immunglobulinketten kann wie folgt zusammengefasst werden:

Leichtkette	λ = Vλ Cλ κ=VκCκ
Schwerkette	IgG (γ) = VH CHγ1, Hinge CHγ2 CHγ3 IgM (μ) = VH CHμ1 CHμ2 CHμ3 CHμ4 IgA (α) = VH CHα1 Hinge CHα2 CHα3 IgE (ε) = VH CHε1 CHε2 CHε3 CHε4 IgD (δ) = VH CHδ1 Hinge CHδ2 CHδ3

Die "CH2-Domäne" einer menschlichen IgG-Fc-Region (auch als "Cγ2"-Domäne bezeichnet) erstreckt sich normalerweise von etwa Aminosäure 231 bis etwa Aminosäure 340. Die CH2-Domäne ist in der Hinsicht einzigartig, dass sie nicht eng mit einer anderen Domäne gepaart ist. Stattdessen sind zwei N-gebundene verzweigte Kohlenhydratketten zwischen den beiden CH2-Domänen eines intakten nativen IgG-Moleküls angeordnet.
Die "CH3-Domäne" umfasst die Reste, die C-terminal zu einer CH2-Domäne in einer FC-Region liegen (d.h. von etwa Aminosäurerest 341 bis etwa Aminosäurerest 447 eines IgG).
Eine "Hinge-Region" ist im Allgemeinen als Region definiert, die sich von Glu216 bis Pro230 von menschlichem IgG1 erstreckt (Burgon, Molec. Immunol. 22, 161–206 (1985)). Hinge-Regionen anderer IgG-Isotypen können übereinstimmend mit der IgG1-Sequenz angeordnet werden, indem der erste und letzte Cysteinrest, welche S-S-Bindungen zwischen Schwerketten bilden, an der gleichen Position angeordnet werden.
Die "untere Hinge-Region" einer Fc-Region ist normalerweise als die Reste direkt C-terminal zur Hinge-Region definiert, d.h. die Reste 233 bis 239 der Fc-Region.
Ein durch TF-FVIIa vermittelter oder damit verbundenen Vorgang oder Vorfall oder, dem entsprechend, eine mit Plasma FVII/FVIIa verbundene Aktivität gemäß vorliegender Erfindung ist jeder Vorfall, der die Gegenwart von FVIIa erfordert. Der allgemeine Mechanismus der Blutgerinnselbildung wurde von Ganong in "Review of Medical Physiology", 13. Aufl., 411–414, Lange, Los Altos, Kalifornien, USA (1987), beschrieben. Die Koagulation erfordert die Zusammenwirkung zweier Vorgänge, die Produktion von Thrombin, welche ein Thrombozytenaggregation auslöst, und die Bildung von Fibring, das die Thrombozytenklumpen stabil macht. Der Vorgang umfasst mehrere Stufen, wobei jede die Gegenwart von separaten Proenzymen und Procofaktoren erfordert. Der Vorgang endet in einer Fibrinvernetzung und Thrombenbil dung. Fibrinogen wird durch die Wirkung von Thrombin in Fibrin übergeführt. Thrombin wiederum wird durch die proteolytische Spaltung von Prothrombin gebildet. Diese Proteolyse wird durch FXa bewirkt, das an die Oberfläche von aktivierten Thrombozyten bindet und in Gegenwart von FVa und Calcium Prothrombin spaltet. TF-FVIIa ist für die proteolytische Aktivierung von FX durch den extrinsischen Koagulationsweg erforderlich. Daher umfasst ein Vorgang, der durch TF-FVIIa vermittelt wird oder damit in Zusammenhang steht, oder eine Aktivität, die mit GVII/FVIIa zusammenhängt, alle Schritte einer Koagulationskaskade von der Bildung des TF-FVIIa-Komplexes bis zur Bildung eines Fibrin-Thrombozytenklumpens und erfordert anfänglich die Gegenwart von FVII/FVIIa. Der TF-FVIIa-Komplex initiiert beispielsweise den extrinsischen Weg durch Aktivierung von FX zu FXa, FIX zu FIXa und ferner FVII zu FVIIa.
Ein durch TF-FVIIa vermittelter oder damit zusammenhängender Vorgang oder durch FVII/FVIIa vermittelte oder damit zusammenhängende Aktivität kann mithilfe von Standardverfahren, wie sie beispielsweise in Roy, S., J. Biol. Chem. 266, 4665-4668 (1991), O'Brien, D., et al., J. Clin. Invest. 82, 206–212 (1988), Lee et al., Biochemistry 36, 5607–5611 (1997), Kelly et al., J. Biol. Chem. 272, 17467–17472 (1997), beschrieben wurden, bequem auf die Überführung von chromogenen Substraten oder Faktor X in Faktor Xa in Gegenwart von Faktor VII und anderen notwendigen Reagenzien gemessen werden.
Mit TF-FVIIa in Zusammenhang stehende Krankheiten oder Störungen umfassen chronische thromboembolische Krankheiten oder Störungen, die mit Fibrinbildung zusammenhängen, einschließlich Gefäßerkrankungen, wie z.B. tiefe Venenthrombose, Arterienthrombose, Schlaganfall, Tumormetastasen, Thrombolyse, Arteriosklerose und Restenose nach Angioplastie, akute und chronische Indikationen, wie z.B. Entzündungen, septischen Schock, Septikämie, Hypotension, Atemnotsyndrom bei Erwachsenen (ARDS), akute Verbrauchskoagulopathie (DIC) und andere Krankheiten. Die mit RF-FVIIa in Zusammenhang stehenden Störungen sind nicht auf koagulopathische Störungen in vivo eingeschränkt, wie sie oben angeführt wurden, son den umfassen auch pathologische oder unerwünschte Koagulation in Zusammenhang mit Blutzirkulation durch Stents oder künstliche Klappen oder in Zusammenhang mit extrakorporaler Zirkulation, einschließlich Blut, das bei Verfahren wie Dialyse, Blutfiltration oder Blutumleitung während einer Operation aus einem Patienten abgeleitet wird.
Der Begriff "pulmonale Verabreichung" bezieht sich hierin auf die Verabreichung einer Formulierung der Erfindung durch Inhalation in die Lunge. Der Begriff "Inhalation" bezieht sich hierin auf die Aufnahme von Luft in die Alveolen. In spezifischen Beispielen kann die Aufnahme durch Selbstverabreichung einer Formulierung der Erfindung durch Inhalieren oder durch Verabreichung mithilfe eines Respirators, z.B. an einen Patienten, der an einem Respirator hängt, erfolgen. In Zusammenhang mit einer Formulierung der Erfindung ist der Begriff "Inhalation" ein Synonym für "pulmonale Verabreichung".
Der Begriff "parenteral" bezieht sich hierin auf die Einbringung einer Verbindung der Erfindung in den Körper auf anderem Weg als durch den Darm, insbesondere auf intravenösem (i.v.), intraarteriellem (i.a.), intraperitonealem (i.p.), intramuskulärem (i.m.), intraventrikulärem und subkutanem (s.c.) Weg.
Der Begriff "Aerosol" bezieht sich hierin auf eine Suspension in der Luft. Insbesondere bezieht sich Aerosol auf die Zerstäubung einer Formulierung der Erfindung und ihre Suspension in der Luft. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Aerosolformulierung eine Formulierung, die eine Verbindung der vorliegenden Erfindung umfasst, die zur Aerosolisierung, d.h. zur Zerstäubung und Suspension in der Luft, zum Zwecke der Inhalation oder pulmonalen Verabreichung geeignet ist.
Der Begriff "Behandlung" umfasst im Kontext der vorliegenden Erfindung therapeutische Behandlungen sowie prophylaktische oder Unterdrückungsmaßnahmen für die betreffende Krankheit oder Störung. Somit umfasst der Begriff Behandlung beispielsweise die Verabreichung eines Mittels vor oder nach Beginn einer Krankheit oder Störung, wodurch alle Anzeichen der Krankheit oder Störung verhindert oder ausgelöscht werden. Auch die Verabreichung des Mittels nach der klinischen Manifestation einer Krankheit, um die Symptome der Krankheit zu bekämpfen, gehören zur "Behandlung" der Krankheit. Ferner umfasst die "Behandlung" der Krankheit die Verabreichung des Mittels nach Beginn einer Krankheit und nachdem sich klinische Symptome entwickelt haben, sodass die Verabreichung sich auf klinische Parameter der Krankheit oder Störung auswirkt, wie z.B. den Grad einer Gewebeverletzung oder das Ausmaß von Leukozytenbewegung, und eventuell eine Linderung der Krankheit.
Patienten, die "eine Behandlung benötigen", umfassen Säugetiere, wie z.B. Menschen, die schon an der Krankheit oder Störung leiden, einschließlich solcher, bei denen die Krankheit oder Störung verhindert werden soll.
Der Begriff "Acyl" bezieht sich im weitesten Sinne auf gesättigte oder ungesättigte, unverzweigte, verzweigte oder zyklische Ketten aus etwa 1 bis etwa 16 Kohlenstoffatomen, die eine Carboxylgruppe enthalten. Somit umfasst der Begriff Acyl beispielsweise Gruppen wie Formyl, Acetyl, Benzoyl und dergleichen. Der Begriff "hydrophobes Acyl" bezieht sich auf eine (R1-C(=O)-)-Gruppe, worin R¹ Alkyl, Aryl oder eine andere nichtpolare Gruppe ist.
Ausführungsformen der Erfindung
Auswahl der Verbindungen
Die vorliegende Erfindung stellt Verbindungen und Zusammensetzungen bereit, die einen durch FVII/FVIIa vermittelten oder damit zusammenhängenden Vorgang, wie beispielsweise die katalytische Überführung von FVII in FVIIa, FIX in FIXa oder FX in FXa, hemmen und so anfängliche Vorgänge des extrinsischen Wegs der Blutgerinnung blockieren. Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich durch ihre Fähigkeit, mit einer Peptidverbindung aus 4 um die Bindung von FVII/FVIIa zu konkurrieren, und können wie folgt selektiert werden.
Als In-vitro-Test-Systeme zur Bestimmung, ob eine Verbindung die "Fähigkeit" aufweist, mit einer oben genannten Peptidverbindung zu konkurrieren, können Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung beliebige herkömmliche Konkurrenztests verwenden. Solche Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Konkurrenztestsysteme, bei denen Verfahren, wie z.B. Radioimmuntests, Enzymimmunoassays (EIA), vorzugsweise Enzym-gebundene Immunosorptionstests (ELISA), "Sandwich"-Immunoassays, Radioimmunoassays, Fluoreszenzimmunoassays und Immunelektrophoresetests eingesetzt werden, um nur einige zu nennen.
Zu diesem Zweck wird die gewählte Peptidverbindung aus 8 mit einer detektierbaren Gruppierung markiert (die detektierbar markierte Peptidverbindung wird hierin "Tracer" genannt") und mit einer Kandidatenverbindung für die Bindung von FVII/FVIIa einem Konkurrenztest unterzogen. Zahlreiche detektierbare Markierungen sind verfügbar, die vorzugsweise in die folgenden Kategorien eingeteilt werden können:

(a) Radioisotope, wie z.B. ³⁵S, ¹⁴C, ²⁵I, ³H und ¹³¹I. Die Peptidverbindung kann beispielsweise unter Verwendung der in Current Protocols in Immunology, Bd. 1 und 2, Coligen et al., Hrsg., Wiley-Interscience, New York, New York, USA (1991), beschriebenen Verfahren mit dem Radioisotop markiert werden, und die Radioaktivität kann unter Verwendung von Szintillationszählung gemessen werden.
(b) Fluoreszenzmarkierungen, wie z.B. Seltenerdchelate (Europiumchelate) oder Fluorescein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Lissamin, Phycoerythrin und Texas-Rot, sind verfügbar. Die Fluoreszenzmarkierungen können beispielsweise unter Verwendung der in Current Protocols in Immunology, w.o., beschriebenen Verfahren an die Peptidverbindungen konjugiert werden. Die Fluoreszenz kann unter Verwendung eines Fluorimeters quantifiziert werden.
(c) Verschiedene Enzym-Substrat-Markierungen sind verfügbar, und das US-Patent Nr. 4.275.149 gibt eine Übersicht über einige davon. Das Enzym katalysiert vorzugsweise eine chemische Änderung des chromogenen Substrats, die mithilfe verschie dener Verfahren gemessen werden kann. Beispielsweise kann das Enzym eine Farbänderung in einem Substrat katalysieren, die spektralphotometrisch gemessen werden kann. Alternativ dazu kann das Enzym die Fluoreszenz oder Chemolumineszenz des Substrats ändern. Verfahren zur Quantifizierung einer Änderung der Fluoreszenz sind oben beschrieben. Das chemolumineszente Substrat wird durch eine chemische Reaktion elektronisch angeregt und kann dann Licht emittieren, das gemessen werden kann (beispielsweise mithilfe eines Chemoluminometers), oder gibt Energie an einen Fluoreszenzakzeptor ab. Beispiele für enzymatische Markierungen umfassen Luciferasen (z.B. Glühwürmchen-Luciferase und bakterielle Luciferase; US-Patent Nr. 4.737.456), Luciferin, 2,3-Dihydrophthalazindione, Malatdehydrogenase, Unease, Peroxidase, wie z.B. Meerrettichperoxidase (HRP), alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Glucoamylase, Lysozym, Saccharidoxidasen (z.B. Glucoseoicidase, Galactoseoxidase und Glucose-5-phosphatdehydrogenase), heterozyklische Oxidasen (z.B. Uricase und Xanthinoxidase), Lactoperoxidase, Microperoxidase und dergleichen.

Beispiele für Enzym-Substrat-Kombinationen umfassen:

(i) Meerrettichperoxidase (HRP) mit Wasserstoffperoxidase als Substrat, worin die Wasserstoffperoxidase einen Farbstoffvorläufer (z.B. ABTS, o-Phenylendiamin (OPD) oder 3,3',5,5'-Tetramethylbezidinhydrochlorid (TMB)) oxidiert;
(ii) alkalische Phosphatase (AP) mit p-Nitrophenylphosphat als chromogenes Substrat; und
(iii) β-D-Galactosidase (β-D-GaI) mit einem chromogenen Substrat (z.B. p-Nitrophenyl-β-D-galactosidase) oder fluorogenen Substrat (4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosidase).

Bei einem bestimmten Test wird der Tracer zusammen mit immobilisiertem FVII/FVIIa in verschiedenen Konzentrationen einer unmarkierten Kandidatenverbindung inkubiert. Steigende Konzentrationen erfolgreicher Kandidatenverbindungen konkurrieren mit dem Tracer wirksam um die Bindung von immobilisiertem FVII/FVIIa. Die Konzentration einer unmarkierten Kandidatenverbindung, bei der maximal 50 % des Tracers verdrängt werden, wird als IC₅₀ bezeichnet und spiegelt die FVII/FVIIa-Bindungsaffinität der Kandidatenverbindung wider. Daher weist eine Kandidatenverbindung mit einem IC₅₀ von 1 mM eine deutlich schwächere Wechselwirkung mit FVII/FVIIa auf als ein Kandidatenpeptid mit einem IC₅₀ von 1 μM.
Demgemäß stellt die Erfindung eine Verbindung mit der Fähigkeit bereit, wie beschrieben in einem In-vitro-Test um die Bindung von FVII/FVIIa zu konkurrieren. Vorzugsweise weist die Verbindung einen "IC₅₀" für FVIIa von weniger als 1 μM auf. Bevorzugt von diesen Verbindungen sind Verbindungen mit einem IC₅₀ von weniger als etwa 100 nM und vorzugsweise weniger als etwa 10 nM oder weniger als etwa 1 nM. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen gemäß diesem Aspekt der Erfindung weisen die Verbindungen einen IC₅₀ für FVIIa von weniger als etwa 100 pM und noch bevorzugter weniger als etwa 10 pM auf.
Ein bevorzugter In-vitro-Test für die Bestimmung der Fähigkeit einer Kandidatenverbindung, mit einer Peptidverbindung aus 5 zu konkurrieren, sieht wie folgt aus und wird in Beispiel 1 genauer beschrieben. Die Fähigkeit von Peptiden, mit einem Tracer um die Bindung an FVIIa zu konkurrieren, wird mithilfe eines ELISA überwacht. Verdünnungen eines Kandidatenpeptids in einem Puffer werden zusammen mit einem Tracer 1 h lang zu Mikrotiterplatten zugesetzt, die mit TF-FVIIa beschichtet sind (in den Beispielen näher beschrieben). Die Mikrotiterplatte wird mit einem Waschpuffer gewaschen, und die Menge des an FVIIa gebundenen Tracers wird gemessen.
In bestimmten Ausführungsformen ist der Tracer Seq.-ID Nr. 4 und wird in einer Konzentration von 10 μM zur FVII/FVIIa-beschichteten Platte zugesetzt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Tracer (Seq.-ID Nr. 4) in einer Konzentration von 5 nM zur FVII/FVIIa-beschichteten Platte zugesetzt.
Verbindungen, die auf diese Weise selektiert werden, werden auf ihre Fähigkeit getestet, FVII/FVIIa-Aktivierung von FX zu hemmen oder blockieren. Der Begriff "hemmen" oder "blockieren" in Bezug auf die Beschreibung eines Merkmals der Kandidatenverbindung der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Verbindung, die, wenn sie in einem herkömmlichen chromogenen Test für FX-Aktivierung (siehe Roy, S., J. Biol. Chem. 266, 4665-4668 (1991), O'Brien, D., et al., J. Clin. Invest. 82, 206-212 (1988), Lee et al., Biochemistry 36, 5607–5611 (1997), Kelly et al., J. Biol. Chem. 272, 17467–17472 (1997)) in einer Konzentration von etwa 10 μM zugesetzt wird, in Gegenwart von Faktor FVII und anderer erforderlichen Reagenzien eine zumindest 50%ige Hemmung der Überführung von Faktor X in Faktor Xa ergibt. Vorzugsweise ergibt die Verbindung eine 50%ige Hemmung bei einer Konzentration von etwa 1 μM und noch bevorzugter eine 50%ige Hemmung bei einer Konzentration von etwa 100 mM. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform ergibt die Verbindung der vorliegenden Erfindung eine zumindest 50%ige Hemmung der Überführung von Faktor X in Faktor Xa, wenn sie in einer Konzentration von etwa 10 nM oder weniger vorhanden ist.
Peptide und deren Analoge
Gemäß bevorzugten Aspekten der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung ein zyklisches Peptid oder ein Analog davon. Vorzugsweise weist die Verbindung die folgende Formel auf: X_i-Cys₁-X_j-Cys₂-X_k worin X_i nicht vorhanden oder ein Peptid aus zwischen 1 und 100 Aminosäuren, vorzugsweise zwischen etwa 1 und 50 Aminosäuren, noch bevorzugter zwischen etwa 1 und 10 Aminosäuren ist; X_j 5 Aminosäuren ist und X_k nicht vorhanden oder ein Peptid aus zwischen 1 und 100 Aminosäuren, vorzugsweise zwischen etwa 1 und 50 Aminosäuren und noch bevorzugter zwischen etwa 1 und 10 Aminosäuren ist, solan ge das zyklische Peptid oder Analog davon die oben beschrieben qualitative biologische Aktivität beibehält.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die oben beschriebenen Peptide, welche die folgende Sequenz umfassen:
Trp₁-Glu₁-Val-Leu-Cys₁-Trp₂-Thr₁-Trp₃-Glu₂-Thr₂-Cys₂-Glu₃-Arg (Seq.-ID Nr. 4)
Peptide innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung konkurrieren in einem In-vitro-Test mit Seq.-ID Nr. 4 um die Bindung von FVII/FVIIa, wobei zwischen 1 und 8 Aminosäuren von Seq.-ID Nr. 4, vorzugsweise zwischen 1 und 6 Aminosäuren von Seq.-ID Nr. 4, noch bevorzugter zwischen 1 und 2 von Seq.-ID Nr. 4 substituiert sind. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist Trp₁ eine der aus Trp, Phe, Tyr, Leu, Ile, Met, Val und Ala bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure; Glu₁ eine beliebige Aminosäure; Val eine aus der aus Val, Trp, Phe, Tyr, Leu, Ile, Met und Ala bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure; Leu eine aus der aus Leu, Trp, Phe, Tyr, Ile, Met, Val und Ala bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure; Trp₂ eine aus der aus Trp, Phe, Tyr, Leu, Ile, Met, Val und Ala bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure; Thr₁ eine beliebige Aminosäure; Trp₃ eine aus der aus Trp, Phe, Tyr, Leu, Ile, Met, Val und Ala bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure; Glu₂ eine beliebige Aminosäure; Thr₂ eine beliebige Aminosäure; Glu₃ eine beliebige Aminosäure und Arg eine aus der aus Arg, Lys, Leu, Trp, His, Met und Ile bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure.
Bevorzugte Aminosäuren gemäß diesem Aspekt der Erfindung umfassen die Sequenz Trp₁-Glu₁-Val-Leu-Cys₁-Trp₂-Thr₁-Trp₃-Glu₂-Thr₂-Cys₂-Glu₃-Arg (Seq.-ID Nr. 4) oder konkurrieren in einem In-vitro-Test mit Seq.-ID Nr. 4 um die Bindung von FVII/FVIIa, wobei zwischen 1 bis 8 Aminosäuren von Seq.-ID Nr. 4, noch bevorzugter zwischen 1 und 6 Aminosäuren von Seq.-ID Nr. 4, noch bevorzugter zwischen 1 und 4 Aminosäuren und noch bevorzugter 1 oder 2 Aminosäuren der Seq.-ID Nr. 4 substituiert sind. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist Trp₁ eine aus der aus Trp, Phe und Leu bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure; Glu₁ eine beliebige Aminosäure; Val eine aus Val und Ile bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure; Leu eine aus der aus Leu, Ile, Met, Val und Ala bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure; Trp₂ eine aus der aus Trp, Phe, Tyr, Leu und Met bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure; Thr₁ eine beliebige Aminosäure; Trp₃ eine aus der aus Trp, Phe und Tyr bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure; Glu₂ eine beliebige Aminosäure; Thr₂ eine beliebige Aminosäure; Glu₃ eine beliebige Aminosäure; und Arg ist eine aus der aus Arg, Lys, Leu und Trp bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure.
Die oben genannten Peptide weisen vorzugsweise einen IC₅₀ für FVII/FVIIa von weniger als 1 μM, noch bevorzugter weniger als 100 nM und insbesondere weniger als 10 nM auf. Außerdem binden die Peptide vorzugsweise FVII/FVIIa und hemmen Aktivität in Zusammenhang mit FVIIa, ausgewählt aus der aus Aktivierung von FVII, Aktivierung von FIX und Aktivierung von FX bestehenden Gruppe. Vorzugsweise konkurriert das Peptid mit einem Peptid der vorliegenden Erfindung um die Bindung von FVII/FVIIa und blockiert die Aktivierung von FX. Vorzugsweise weist das Peptid einen IC₅₀ für die Hemmung von FX-Aktivierung von weniger als 10 μM, noch bevorzugter weniger als 100 nm und insbesondere weniger als 5 nM auf.
Bevorzugte Peptide der vorliegenden Erfindung weisen die folgende Formel auf: X_i-Cys₁-X_j-Cys₂-X_k worin X_i nicht vorhanden oder zwischen 1 und 100 Aminosäuren ist; X_j 5 Aminosäuren ist und X_k nicht vorhanden oder zwischen 1 und 100 Aminosäuren ist. Vorzugsweise sind X_i und X_k zwischen 1 und 50 Aminosäuren und noch bevorzugter zwischen 1 und 10 Aminosäuren.
Nicht einschränkende Beispiele für die bevorzugten Peptide der vorliegenden Erfindung umfassen die Peptide aus 4. Im Allgemeinen weist ein bevorzugtes Peptid die folgende Formel auf: X_i-Cys₁-X_j-Cys₂-X_k worin
X_j die folgende Formel aufweist -Xaa₈-Xaa₉-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂- und Xaa₈ eine aus der aus Trp, Thr, Ala, Phe, Leu, Met und Tyr bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; Xaa₉ eine aus der aus Thr, Asp und Ala bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; Xaa₁₀ eine aus der aus Trp, Ala, Phe, Leu und Tyr bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; Xaa₁₁ eine aus der aus Glu, Ala, Arg und Gln bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; und Xaa₁₂ eine aus der aus Gly, Asp, Thr, Ser und Ala bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist.
Weitere bevorzugte Beispiele umfassen Peptide der folgenden Formel: Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Cys-Xaa₈-Xaa₉-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Cys-Xaa₁₄-Xaa₁₅-Xaa₁₆-Xaa₁₇-Xaa₁₈ worin Xaa₁ eine beliebige Aminosäure ist; Xaa₂ eine beliebige Aminosäure ist; Xaa₃ eine aus der aus Trp, Phe, Leu, Ala, Met und Val bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; Xaa₄ eine beliebige Aminosäure ist; Xaa₅ eine aus der aus Val, Ile, Ala, Trp und Tyr bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; Xaa₆ eine aus der aus Leu, Ile, Met, Val und Ala bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; Xaa₈ eine aus der aus Trp, Phe, Leu, Met, Ala und Val bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; Xaa₉ eine beliebige Aminosäure ist; Xaa₁₀ eine aus der aus Trp, Phe, Met und Tyr bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; Xaa₁₁ eine beliebige Aminosäure ist; Xaa₁₂ eine beliebige Aminosäure ist; Xaa₁₄ eine beliebige Aminosäure ist, mit der Ausnahme von Pro; Xaa₁₅ eine aus der aus Arg, Lys, Leu, Trp, His und Met bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure ist; Xaa₁₆ eine beliebige Aminosäure ist; Xaa₁₇eine beliebige Aminosäure ist; und Xaa₁₈ eine beliebige Aminosäure ist.
In diesem Zusammenhang sei auf die Beispiele für Peptide in 4 hingewiesen. Bevorzugte Peptide werden wie oben erläutert und unter Berücksichtigung der folgenden Aminosäureauswahl konstruiert: Xaa₃ ist aus der aus Trp, Phe, Leu und Ala bestehenden Gruppe ausgewählt; und Xaa₇ ist aus der aus Trp, Phe, Leu, Met und Ala bestehenden Gruppe ausgewählt. Noch bevorzugter wird das oben beschriebene Schema verwendet und die Aminosäuren werden wie folgt ausgewählt: Xaa₃ wird aus der aus Trp, Phe und Leu bestehenden Gruppe ausgewählt; Xaa₅ wird aus der aus Val und Ile bestehenden Gruppe ausgewählt; Xaa₆ wird aus der aus Leu, Ile, Met und Val bestehenden Gruppe ausgewählt; Xaa₈ wird aus der aus Trp, Phe, Leu und Met bestehenden Gruppe ausgewählt; Xaa₁₀ wird aus der aus Trp und Phe bestehenden Gruppe ausgewählt; und Xaa₁₅ wird aus der aus Arg, Lys, Leu und Trp bestehenden Gruppe ausgewählt.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Hemmung von FVIIa-Aktivität bereit, das den Schritt des Kontaktierens von FVII/FVIIa mit einem Peptid gemäß der Erfindung, wie es oben beschrieben ist, in Gegenwart eines Gewebefaktors und unter Bedingungen umfasst, welche die Bindung der Verbindung an FVIIa ermöglichen.
Zudem stellt die Erfindung ein Verfahren zur Auswahl einer Verbindung bereit, welche FVII/FVIIa-Aktivierung von FX blockiert, das folgende Schritte umfasst:
das Kontaktieren von FVII/FVIIa mit einem Peptid gemäß der Erfindung in Gegenwart und Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls unter Bedingungen, welche die spezifische Bindung des Peptids gemäß der Erfindung an FVII/FVIIa ermöglichen;
das Detektieren des Ausmaßes an spezifischer Bindung des Peptids gemäß der Erfindung an FVII/FVIIa, die in Gegenwart und Abwesenheit der Kandidatenverbindung stattfindet, worin das Ausmaß der Bindung in Gegenwart der Kandidatenverbindung in Bezug auf das Ausmaß der Bindung in Abwesenheit des Kandidatenmoleküls ein Indikator für die Fähigkeit der Kandidatenverbindung ist, FVII/FVIIa-Aktivierung von FX zu blockieren.
Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der Aktivierung von FX bereit, umfassend das Kontaktieren von FVII/FVIIa mit einer Verbindung, welche die Wechselwirkung von FVII/FVIIa mit einem Peptid gemäß der Erfindung verhindert. Der Kontaktierungsschritt findet in vitro statt.
Die oben genannten Verbindungen können verwendet werden und sind in einem Verfahren zur Hemmung von FVIIa-Aktivität besonders bevorzugt, das folgende Schritte umfasst:

a) Kontaktieren von FVIIa mit einer Verbindung von Interesse, insbesondere mit den im vorhergehenden Abschnitt beschriebenen Peptiden und Peptidanaloge, in Gegenwart oder Abwesenheit eines Gewebefaktors und unter Bedingungen, welche die Bindung der Verbindung an FVIIa ermöglichen; und gegebenenfalls
b) Messen oder Bewerten des Ausmaßes an FX-Aktivierung, die in Gegenwart der Verbindung von Interesse stattfindet. Gemäß bestimmten Aspekten der Erfindung wird ein herkömmlicher FX-Aktivierungstest, wie er hierin beschrieben ist, zusammen mit dem oben genannten Verfahren eingesetzt, um das Ausmaß an FX-Aktivierung, das durch die Verbindung von Interesse blockiert oder gehemmt wird, zu messen. Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung kann in vitro oder in vivo umgesetzt werden.

Die Sequenzen der Peptidbeispiele (4) in Kombination mit den hierin angeführten Informationen zur dosisabhängigen Verlängerung der Prothrombinzeit (2A) können zusammen mit den IC₅₀-Werten für die Hemmung von FX-Aktivierung und FVIIa-Affinität (4) bei der Planung und Auswahl von Peptiden verwendet werden. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können beispielsweise die Lehren der Erfin dung nutzen, um ein Peptid zu entwerfen, das bei Sättigungskonzentrationen FX-Aktivierung in unterschiedlichem Grad hemmt oder die Prothrombinzeit in unterschiedlichem Ausmaß verlängert. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können beispielsweise ein Kernpeptid mit z.B. der Aminosäuresequenz von TF65 (Seq.-ID Nr. 4) auswählen. N-terminate Aminosäureadditionen können ausgewählt werden, um die Affinität des Peptids für FVII/FVIIa zu verbessern, während C-terminate Aminosäureadditionen ausgewählt werden können, um das Ausmaß der Hemmung von FX-Aktivierung zu beeinflussen oder die Prothrombinzeit zu verlängern. Die Auswahl von TF65 (Seq.-ID Nr. 4) und der Zusatz von 2 N-terminalen Glu-Resten stellt ein Peptid mit einem erhöhten IC₅₀ für FVIIa bereit, wie es in 4 zu sehen ist (Seq.-ID Nr. 23). Der Zusatz von C-terminalen Aminosäure, wie z.B. -Gly-Glu-Gly zu Seq.-ID Nr. 23, ergibt ein Peptid mit verbesserter Affinität für FVIIa und verstärkter Fähigkeit, FX-Aktivierung über Seq.-ID Nr. 4 zu hemmen, wie beispielsweise bei TF100 (Seq.-ID Nr. 18) und TF100Z (Seq.-ID Nr. 19) zu sehen ist. Anhand dieser Informationen können Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung Peptide mit unterschiedlichen Affinitäten und unterschiedlichen Ausmaßen der Hemmung von FX-Aktivierung und der Verlängerung der Prothrombinzeit konstruieren.
Die Fähigkeit, das Ausmaß der Hemmung von FX-Aktivierung und der Verlängerung der Prothrombinzeit zu beeinflussen kann in therapeutischen Bereichen von Nutzen sein, in denen ein Antikoagulans nützlich wäre, in denen sich Überantikoagulation jedoch als klinisch unsicher erweisen könnte. Somit kann sich ein Peptid mit dem gewünschten Ausmaß an Hemmung von FX-Aktivierung und Verlängerung der Prothrombinzeit als wirksam herausstellen, mit dem zusätzlichen Vorteil, dass es sicherer ist, sodass Blutungskomplikationen aufgrund von Überdosierung minimiert werden.
Chemische Synthese
Ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Erfindung umfasst eine chemische Synthese. Diese kann unter Verwendung von Verfahren umgesetzt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind (siehe Kelley, R.F., und Winkler, M.E., in Genetic Engineering Principles and Methods, Bd. 12, 1–19, Setlow, J.K., Hrsg., Plenum Press, New York, New York, USA 1990); Stewart, J.M., und Young, J.D., Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA (1984); siehe auch US-Patente Nr. 4.105.603; 3.972.859; 3.842.067 und 3.862.925).
Peptide der Erfindung können am besten durch Festphasen-Peptidsynthese (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1964); Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5132 (1985)) hergestellt werden. Festphasensynthese beginnt am Carboxyl-Terminus des vermeintlichen Peptids, indem eine geschützte Aminosäure an einen inerten festen Träger gebunden wird. Der inerte feste Träger kann ein beliebiges Makromolekül sein, das als Anker für den C-Terminus der Ausgangsaminosäure dienen kann. Typischerweise ist der makromolekulare Träger ein vernetztes Polymerharz (z.B. ein Polyamid- oder Polystyrolharz), wie es in 1–1 und 1–2 auf Seite 2 und 4 bei Stewart und Young, w.o., zu sehen ist. In einer Ausführungsform ist die C-terminale Aminosäure an ein Polystyrolharz gebunden, um einen Benzylester zu bilden. Ein makromolekularer Träger wird so ausgewählt, dass die Peptid-Ankerbindung unter den Bedingungen stabil ist, die verwendet werden, um die α-Aminogruppe der blockierten Aminosäuren bei der Peptidsynthese zu entschützen. Wen eine basenlabile α-Schutzgruppe verwendet wird, sollte wünschenswerterweise eine säurelabile Bindung zwischen dem Peptid und dem festen Träger vorhanden sein. Beispielsweise ist ein säurelabiles Etherharz wirksam für eine basenlabile Fmoc-Aminosäure-Peptidsynthese, wie auf Seite 16 bei Stewart und Young, w.o., beschrieben. Alternativ dazu können eine Peptidankerbindung und eine α-Schutzgruppe verwendet werden, die unterschiedlich labil gegenüber Azidolyse sind. Ein Aminomethylharz, wie z.B. Phenylacetamidomethyl- (Pam-) Harz, funktioniert beispielsweise gut bei einer Boc-Aminosäure-Peptidsynthese, wie auf Seite 11–12 bei Stewart und Young, w.o., beschrieben wird.
Nachdem die Ausgangsaminosäure an einen inerten festen Träger gebunden wurde, wird die α-Amino-Schutzgruppe der Ausgangsaminosäure mit beispielsweise Tri fluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid entfernt und in beispielsweise Triethylamin (TEA) neutralisiert. Nach der Entschützung der α-Aminogruppe der Ausgangsaminosäure wird bei der Synthese die nächste α-Amino- und Seittenketten-geschützte Aminosäure addiert. Die verbleibende α-Amino- und, falls erforderlich, Seitenkettengeschützten Aminosäure werden dann nacheinander in der gewünschten Reihenfolge durch Kondensation aneinander gebunden, um eine den festen Träger gebundene Zwischenverbindung zu erhalten. Alternativ dazu können auch einige Aminosäuren aneinander gebunden werden, um ein Fragment des gewünschten Peptids zu bilden, wonach das Peptidfragment der wachsenden Festphase-Peptidkette hinzugefügt wird.
Die Kondensationsreaktion zwischen zwei Aminosäuren oder zwischen einer Aminosäure und einem Peptid oder zwischen einem Peptid und einem Peptid kann gemäß herkömmlichen Kondensationsverfahren, wie z.B. dem Axisverfahren, Mischsäureanhydridverfahren, DCC-(N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid-) oder DIC- (N,N'-Diisopropylcarbodiimid-) Verfahren, Aktivesterverfahren, p-Nitrophenylesterverfahren, BOP-(Benzotriazol-1-yl-oxy-tris[dimethylamino]phosphoniumhexafluorphosphat-) Verfahren, N-Hydroxybernsteinsäureimidoesterverfahren usw., und dem Woodward-Reagens-K-Verfahren durchgeführt werden.
Normalerweise wird bei der chemischen Synthese von Peptiden jede reaktive Seitenkettengruppe der Aminosäuren mit geeigneten Schutzgruppen geschützt. Diese Schutzgruppen werden schließlich entfernt, nachdem die gewünschte Polypeptidkette sequenziell zusammengebaut wurde. Auch der Schutz der α-Aminogruppe auf einer Aminosäure oder einem Peptidfragment ist üblich, während die C-terminate Carboxylgruppe der Aminosäure oder des Peptidfragments mit der freien N-terminalen Aminogruppe der wachsenden Festphase-Polypeptidkette reagiert, wonach die α-Aminogruppe selektiv entfernt wird, um die Addition der nächsten Aminosäure oder des nächsten Peptidfragments zur Festphase-Polypeptidkette zu ermöglichen. Demgemäß wird bei der Polypeptidsynthese normalerweise eine Zwischenverbindung hergestellt, die jeden der Aminosäurereste in der gewünschten Sequenz in der Peptidkette enthält, in der einzelne Reste immer noch Seitenketten-Schutzgruppen aufweisen. Diese Schutzgruppen können im Wesentlichen gleichzeitig entfernt werden, um das gewünschte Polypeptidprodukt herzustellen, gefolgt von der Entfernung der Festphase.
α- und ε-Amino-Seitenketten können mit Benzyloxycarbonyl- (Abkürzung Z-), Isonicotinyloxycarbonyl- (iNOC-), o-Chlorbenzyloxycarbonyl- [(Z(2Cl)-], p-Nitrobenzyloxycarbonyl- [Z(NO₂)-], p-Methoxybenyloxycarbonyl- [Z(OMe)-], t-Butoxycarbonyl-(Boc-), t-Amyloxycarbonyl- (Aoc-), Isobornyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl-, 2-(4-Biphenyl)-2-propyloxycarbonyl- (Bpoc-), 9-Fluorenylmethoxycarbonyl- (Fmoc-), Methylsulfonyethoxycarbonyl- (Msc-), Trifluoracetyl-, Phthalyl-, Formyl-, 2-Nitrophenylsulphenyl- (NPS-), Diphenylphosphinothioyl- (Ppt-) und Dimethlyphosphinothioyl-(Mpt-) Gruppen und dergleichen geschützt werden.
Beispiele für Schutzgruppen für die funktionelle Carboxylgruppe sind Benzylester (OBzl), Cyclohexylester (Chx), 4-Nitrobenzylester (ONb), t-Butylester (Obut), 4-Pyridylmethylester (OPic) und dergleichen. Oft sollten die spezifischen Aminosäuren, wie z.B. Arginin, Cystein und Serin, die eine andere funktionelle Gruppe aufweisen als Amino- und Carboxylgruppen, durch eine geeignete Schutzgruppe geschützt werden. Die Guanidinogruppe von Arginin kann beispielsweise mit Nitro, p-Toluolsulfonyl, Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, p-Methoxybenzolsulfonyl, 4-Methoxy-2,6-dimethylbenzolsulfonyl (Nds), 1,3,5-Trimethylphenysulfonyl (Mts) und dergleichen geschützt werden. Die Thiolgruppe von Cystein kann mit p-Methoxybenzyl, Trityl und dergleichen geschützt werden.
Viele der oben beschriebenen blockierten Aminosäuren sind im Handel erhältlich, wie beispielsweise von Novabiochem (San Diego, Kalifornien, USA), Bachem CA (Torrence, Kalifornien, USA) oder Peninsula Labs (Belmont, Kalifornien, USA).
Stewart und Young, w.o., stellen detaillierte Informationen über Verfahren zur Herstellung von Peptiden bereit. Der Schutz von α-Aminogruppen wird auf Seite 14–18 beschrieben, und die Seitenkettenblockierung ist auf Seite 18–28 beschrieben. Eine Tabelle der Schutzgruppen für Amino-, Hydroxyl- und Sulfhydrylfunktionen ist auf Seite 149–151 bereitgestellt.
Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz erhalten wurde, kann das Peptid vom festen Träger abgespalten, gewonnen und gereinigt werden. Das Peptid wird vom festen Träger durch ein Reagens abgetrennt, das die Bindung zwischen Peptid und fester Phase aufbrechen kann und gegebenenfalls blockierte funktionelle Gruppen auf Seitenketten des Peptids entschützt. In einer Ausführungsform wird das Peptid durch Azidolyse mit flüssiger Flusssäure (HF) von der festen Phase abgespalten, die auch restliche Schutzgruppen auf Seitenketten entfernt. Vorzugsweise enthält, um eine Alkylierung von Resten im Peptid zu vermeiden (z.B. eine Alkylierung von Methionin-, Cystein- und Tyrosinresten), das Azidolysereaktionsgemisch Thiokresol und Kresolfänger. Nach der HF-Abspaltung wird das Harz mit Ether gewaschen, und das freie Peptid wird aus der festen Phase extrahiert und dann mit Essigsäurelösungen gewaschen. Die vereinigten Waschflüssigkeiten werden gefriergetrocknet und das Peptid wird gereinigt.
Peptide mit Disulfidbindungen
Wie oben beschrieben werden manche Ausführungsformen der Erfindung durch die Bildung einer Disulfidbindung zwischen Cysteinresten zyklisiert. Solche Peptide können durch chemische Synthese, wie sie oben beschrieben ist, und darauf folgende Zyklisierung durch ein herkömmliches Verfahren, das bei der Bildung von Disulfidbindungen eingesetzt wird, hergestellt werden. Beispielsweise können Peptide mithilfe von Sulfhydrylen in reduzierter Form aus einer Festphasensynthese gewonnen werden, die in einer verdünnten Lösung gelöst sind, worin die intramolekulare Cysteinkonzentration die intermolekulare Cysteinkonzentration übersteigt, um die Bildung einer intramolekularen Disulfidbindung zu optimieren, wie beispielsweise Peptidkonzentrationen von 25 mM bis 1 μM, noch bevorzugter 500 μM bis 1 μM, noch bevorzugter 25 μM bis 1 μM, gefolgt von einer Oxidation, indem die freien Sulfhydrylgrup pen einem schwachen Oxidationsmittel ausgesetzt werden, das ausreicht, um intramolekulare Disulfidbindungen zu bilden, z.B. molekularer Sauerstoff mit oder ohne Katalysatoren, wie z.B. Metallkationen, Kaliumferricyanid, Natriumtetrathionat usw. In einer Ausführungsform werden die Peptide wie im nachstehenden Beispiel 2 zyklisiert. Alternativ dazu können die Peptide wie von Pelton et al., J. Medikament. Chem. 29, 2370–2375 (1986), beschrieben zyklisiert werden.
Die Zyklisierung kann beispielsweise durch die Bildung einer Disulfidbindung oder einer Lactambindung zwischen Cys-Resten erhalten werden. Reste, die zur Bildung einer Disulfidbindung fähig sind, umfassen beispielsweise Cys, Pen, Mpr und Mpp und ihre 2-Aminogruppen-hältigen Äquivalente. Reste, die zur Bildung einer Lactambrücke fähig sind, umfassen beispielsweise Asp, Glu, Lys, Orn, α,β-Diaminobuttersäure, Diaminoessigsäure, Aminobenzoesäure und Mercaptobenzoesäure. Die Verbindungen hierin können beispielsweise über eine Lactambindung zyklisiert werden, welche die Seitenkettengruppe eines nicht angrenzenden Rests verwendet kann, um eine kovalente Bindung an die N-terminale Aminogruppe von Cys oder einer andere Aminosäure zu bilden. Alternative Brückenstrukturen können ebenfalls verwendet werden, um die Verbindungen der Erfindung zu zyklisieren, einschließlich beispielsweise Peptide und Peptidmimetika, die über -S-S-, -CH₂-S-, -CH₂-O-CH₂-, Lactamester- oder andere Bindungen zyklisieren können.
Rekombinante Synthese
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung eine Stoffzusammensetzung, die isolierte Nucleinsäure, vorzugsweise DNA, umfasst, die für ein hierin beschriebenes Peptid kodiert. DNA, die für die Peptide der Erfindung kodiert, kann durch verschiedene auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf chemische Synthese durch eines der von Engels et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 28, 716–734 (1989), beschrieben Verfahren, wobei die gesamte Offenbarung durch Verweis hierin aufgenommen ist, wie z.B. das Triester-, Phosphit-, Phosphoramidit- und H-Phosphonatverfahren. In einer Ausführungsform werden beim Entwurf der kodierenden DNA Codons verwendet, die von der Expressionswirtszelle bevorzugt werden. Alternativ dazu kann auch für das Peptid kodierende DNA so verändert werden, dass sie für eine oder mehrere Varianten kodiert, indem DNA-Rekombinationsverfahren, wie z.B. ortsspezifische Mutagenese (Kunkel et al., Methods Enzymol. 204, 125–139 (1991); Carter, P., et al., Nucl. Acids. Res. 13, 4331 (1986); Zoller, M.J., et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1982)), Kasettenmutagenese (Wells, J.A., et al., Gene 34, 315 (1985)), Restriktionsselektionsmutagenese (Wells, J.A., et al., Philos. Trans. R. Soc. London, SerA 317, 415) und dergleichen, eingesetzt werden.
Ferner umfasst die Erfindung eine Expressionskontrollsequenz, die operabel an das DNA-Molekül gebunden ist, das für ein Peptid der Erfindung kodiert, und einen Expressionsvektor, wie z.B. ein Plasmid, der das DNA-Molekül umfasst, worin die Kontrollsequenz durch eine Wirtszelle erkannt wird, die mit dem Vektor transformiert ist. Im Allgemeinen enthalten Plasmidvektoren Replikations- und Kontrollsequenzen, die von mit der Wirtszelle verträglichen Spezies stammen. Der Vektor umfasst normalerweise eine Replikationsstelle sowie Sequenzen, die für Proteine kodieren, die zur Bereitstellung phänotypischer Selektion in transformierten Zellen fähig sind.
Geeignete Wirtszellen zur Expression der DNA umfassen prokaryotische Zellen, Hefezellen oder höhere eukaryotische Zellen. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Eubakterien, wie beispielsweise gramnegative oder grampositive Organismen, wie z.B. Enterobacteriaceae wie E. coli. Verschiedene E.coli-Stämme sind im Handel erhältlich, wie z.B. E.coli-K12-Stamm MM294 (ATCC Nr. 31.446); E. coli X1776 (ATCC Nr. 31.537); E.coli-Stamm W3110 (ATCC Nr. 27.325) und K5 772 (ATCC Nr. 53.635).
Neben Prokaryoten können auch eukaryotische Organismen, wie beispielsweise Hefe, oder von vielzelligen Organismen stammende Zellen als Wirtszellen verwendet werden. Geeignete Vektoren für die Expression in Hefe-Wirtzszellen, Nie z.B. in herkömmlicher Backhefe oder Saccharomyces cerevisiae, umfassen episomal replizie rende Vektoren, die auf dem 2-Mikron-Plasmid basieren, Integrationsvektoren und künstliche Hefechromosom- (YAC-) Vektoren. Für eine Expression geeignete Wirtszellen können auch von vielzelligen Organismen stammen. Beispiele für Zellen von Wirbellosen umfassen Insektenzellen, wie z.B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9, sowie Pflanzenzellen. Für die Expression in Insekten-Wirtszellen, wie z.B. Sf9-Zellen, umfassen geeignete Vektoren Baculovirusvektoren. Für die Expression in Pflanzen-Wirtszellen, insbesondere Dikotylen-Pflanzenwirten, wie z.B. Tabak, umfassen geeignete Expressionsvektoren Vektoren vom Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens.
Beispiele für nützliche Säugetier-Wirtszellen umfassen eine mit SV40 transformierte Affennierenlinie CV1 (COS-7, ATCC CRL 1651); eine menschliche embryonale Nierenlinie (293-Zellen oder 293-Zellen, die zur Züchtung in einer Suspensionskultur subkloniert wurden, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CTL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Mäuse-Sertoli-Zellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); Aftennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Nierenzellen von der Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratte-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäuse-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen und eine menschliche Hepatom-Zelllinie (Hep G2).
Für die Expression in prokaryotischen Wirten geeignete Vektoren umfassen pBR322 (ATCC Nr. 37.017), phGH107 (ATCC Nr. 40.011), pB075, pS0132, pRIT5, Vektoren der pRIT20- oder pRIT30-Reihe (Nilsson und Abrahmsen, Meth. Enzymol. 185, 144-161 (1990)), pRIT2T, pKK233-2, pDR540 und pPL-Lamda. Prokaryotische Wirtszelle, welche die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung enthalten, umfassen den E.-coli-K12-STamm 294 (ATCC Nr. 31.446), den E.-coli-Stamm JM101 (Messing et al., Nucl. Acid Res. 9, 309 (1981)), den E.-coli-Stamm B, den E.-coli-Stamm X1776 (ATCC Nr. 31.537), E. coli c600 (Appleyard, Genetics 39, 440 (1954)), E. coli W3110 (F-, gamma-, protrophisch, ATCC Nr. 27.315), E.-coli-Stamm 27c7 (W3110, tonA, phoA E15 (argF-lac)169, ptr3, degP41, ompT, kan^r), (US-Patent Nr. 5.288.931, ATCC Nr. 55.244), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Serratia marcesans und Pseudomonas.
Für die Expression in Säugetier-Wirtszellen nützliche Vektoren umfassen Vektoren von SV40, Vektoren vom Cytomegalovirus, wie z.B. die pRK-Vektoren, einschließlich pRK5 pRK7 (Suva et al., Science 237, 893–896 (1987); EP 307.247 (15.3.1989), EP 278.776 (17.8.1988)), Vektoren von Vacciniaviren oder anderen Pockenviren und retrovirale Vektoren, wie z.B. Vektoren vom Moloney-Mäsueleukämievirus (MoMLV).
Gegebenenfalls ist die für das Peptid von Interesse kodierende DNA operabel mit einer Sekretions-Leader-Sequenz verbunden, was zur Sekretion des Expressionsprodukts durch die Wirtszelle in das Kulturmedium führt. Beispiele für Sekretions-Leader-Sequenzen umfassen stII, Ectin, lamB, Herpes GD, Ipp, alkalische Phosphatase, Invertase, MIP.5 und α-Faktor. Ebenfalls geeignet ist die 36 Aminosäuren umfassende Leader-Sequenz von Protein A (Abrahamsen et al., EMBO J. 4, 3901 (1985)).
Wirtszelle werden transfiziert und vorzugsweise mit der oben beschriebenen Expression oder den Klonierungsvektoren dieser Erfindung transformiert und in einem herkömmlichen Nährmedium kultiviert, das auf geeignete Weise modifiziert wurde, um Promotoren zu induzieren, Transformanten zu selektieren und die für die gewünschten Sequenzen kodierenden Gene zu amplifizieren.
Transfektion bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, egal ob wirklich eine kodierende Sequenz exprimiert wird oder nicht. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung sind zahlreiche Transfektionsverfahren bekannt, beispielsweise CaPO₄-Fällung und Elektroporation. Eine Transfektion ist im Allgemeinen erfolgreich, wenn innerhalb der Wirtszelle irgendein Anzeichen der Wirkungsweise dieses Vektors zu erkennen ist.
Transformation bedeutet die Einführung von DNA in einen Organismus, sodass die DNA replizierbar ist, entweder als extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration. Je nach verwendeter Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung eines für solche Zellen geeigneten herkömmlichen Verfahrens durchgeführt. Die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie sie in Abschnitt 1.82 bei Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA (1989) beschrieben ist, wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die nennenswerte Zellwandbarrieren aufweisen. Eine Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation bestimmter Pflanzenzellen verwendet, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983) und in der WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben wurde. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände ist das Calciumphosphat-Ausfällverfahren zu bevorzugen, dass in Abschnitt 16.30–16.37 bei Sambrook et al., w.o., beschrieben ist. Allgemeine Aspekte von Transformationen von Säugetier-Wirtszellsystemen wurden von Axel im US-Patent Nr. 4.399.215, herausgegeben am 16. August 1983, beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem Verbindung gemäß Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977) und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979) durchgeführt. Andere Verfahren zur Einbringung von DNA in Zellen, wie beispielsweise durch Injektion in den Kern, Elektroporation oder Protoplastenfusion können jedoch ebenfalls eingesetzt werden.
Weitere bevorzugte Vektoren können unter Verwendung von Standardverfahren durch Kombination der relevanten Regionen der oben beschriebenen Vektoren konstruiert werden. Relevante Regionen umfassen den Promotor, die Ribosomen-Bindungsstelle, das Gen von Interesse oder eine Genfusion (die Z-Domäne von Protein A und das Gen von Interesse und ein Linker), die Antibiotikaresistenzmarker und die geeigneten Replikationsstartpunkte.
Eine Abänderung der oben beschriebenen Verfahren umfasst die Verwendung von Genfusionen, worin das für das gewünschte Peptid kodierende Gen im Vektor mit einem Gen assoziiert ist, das für ein anderes Protein oder ein Fragment eines anderen Proteins kodiert. Das führt dazu, dass das gewünschte Protein durch die Wirtszelle als Fusion mit einem anderen Protein oder Peptid produziert wird. Das "andere" Protein oder Peptid ist oft ein Protein oder Peptid, das von der Zelle sekretiert werden kann, wodurch es möglich wird, das gewünschte Peptid aus dem Kulturmedium zu isolieren und zu reinigen und die Notwendigkeit aufzuheben, die Wirtszelle zu zerstören, was sonst der Fall ist, wenn das gewünschte Peptid innerhalb der Zelle verbleibt. Alternativ dazu kann das Fusionsprotein intrazellulär exprimiert werden. Die Verwendung von Fusionsproteinen, die stark exprimiert werden, ist von Vorteil.
Die Verwendung von Genfusionen kann, obwohl sie nicht wesentlich ist, die Expression von heterologen Peptiden in Insektenzellen sowie die darauffolgende Reinigungen dieser Genprodukte vereinfachen. Protein-A-Fusionen werden häufig verwendet, weil die Bindung von Protein A, oder genauer gesagt der Z-Domäne von Protein A, an IgG einen "Affinitäts-Handle" zur Reinigung des fusionierten Proteins bereit. Beispielsweise kann eine DNA-Sequenz, die für den gewünschten Peptidliganden kodiert, durch ortsspezifische Mutagenese an das Gen für eine Consensus-Domäne von Protein A fusioniert werden, die als Z-Domäne bekannt ist (Nilsson et al., Protein Engineering 1, 107–113 (1987)). Nach der Expression und Sekretion kann das Fusionsprotein enzymatisch gespalten werden, um ein freies Peptid zu erhalten, dass vom enzymatischen Gemisch gereinigt werden kann (siehe z.B. Varadarajan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5681–5684 (1985); Castellanos-Serra et al., FEBS Letters 378, 171–176 (1996); Nilsson et al., J. Biotechnol. 48, 241–250 (1996)).
Fusionsproteine können unter Verwendung von Chemikalien, wie z.B. Bromcyan, das an einem Methionin spaltet, oder Hydroxylamin, das zwischen einem Asn- und einem Gly-Rest spaltet, gespalten werden. Unter Verwendung von herkömmlichen DNA-Rekombinationsverfahren können die Nucleotid-Basenpaare, die für diese Ami nosäuren kodieren, genau vor dem 5'-Ende des Gens insertiert werden, das für das gewünschte Peptid kodiert.
Alternativ dazu kann eine proteolytische Spaltung eines Fusionsproteins durchgeführt werden. Siehe Carter in Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes, Kap. 13, S. 181–193, Ladisch et al., Hrsg., American Chemical Society Symposium Seriennr. 427 (1990).
Proteasen, wie z.B. Faktor Xa, Thrombin und Substilisin oder deren Mutanten, sowie eine Reihe von anderen Proteasen wurden erfolgreich zur Spaltung von Fusionsproteinen eingesetzt. Gemäß vorliegender Erfindung ist für die Produktion von Peptidliganden aus weniger als etwa 30 Aminosäuren die Protease Trypsin bevorzugt, die hochspezifisch für Arg- und Lys-Reste ist. Trypsin-Spaltung wird von Nilsson et al., J. Biotech. 48, 241 (1996) und Smith et al., Methods Mol. Biol. 32, 289 (1994), allgemein erläutert. Typischerweise wird ein Peptidlinker, der für eine Spaltung durch die verwendete Protease zugänglich ist, zwischen dem "anderen" Protein (z.B. der Z-Domäne von Protein A) und dem gewünschten Peptid insertiert. Unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren werden die Nucleotid-Basenpaare, die für den Linker kodieren, zwischen den Genen oder Genfragmenten insertiert, die für die anderen Proteine kodieren. Eine proteolytische Spaltung des teilweise gereinigten Fusionsproteins, das den korrekten Linker enthält, kann dann entweder am nativen Fusionsprotein oder am reduzierten oder denaturierten Fusionsprotein durchgeführt werden.
Das Peptid kann korrekt gefaltet sein oder auch nicht, wenn es als Fusionsprotein exprimiert wird. Außerdem kann der spezifische Peptidlinker, der die Spaltungsstelle enthält, für die Protease zugänglich sein oder nicht. Diese Faktoren bestimmen, ob das Fusionsprotein denaturiert und rückgefaltet werden muss, und wenn das der Fall ist, ob diese Verfahren vor oder nach der Spaltung durchzuführen sind.
Wenn eine Denaturierung und Umfaltung erforderlich sind, wird das Peptid typischerweise zuerst mit einem Chaotrop, wie z.B. Guanidin-HCl, und dann mit einem Re doxpuffer, der beispielsweise reduziertes und oxidiertes Dithiothreitol oder Glutathion im geeigneten Verhältnis, mit geeignetem pH und mit geeigneter Temperatur enthält, behandelt, sodass das Peptid zu seiner nativen Struktur umgefaltet wird.
Die in dieser Offenbarung genannten Wirtszellen umfassen Zellen in In-vitro-Kulturen sowie Zellen, die sich in einem Wirtstier befinden.
In zyklisierten Ausführungsformen der Erfindung kann das rekombinant produzierte Peptid wie oben beschrieben durch Bildung einer intramolekularen Disulfidbindung zyklisiert werden.
Die Peptidverbindungen der Erfindung können am N-Terminus oder C-Terminus unter Verwendung einer Amino-Schutzgruppe bzw. Carboxy-Schutzgruppe modifiziert werden. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung sind zahlreiche solche Modifikationen bekannt. Beispielsweise kann der N-Terminus eines Peptids oder Peptidanalogs chemisch modifiziert werden, sodass die N-terminale Aminogruppe durch beispielsweise eine Acetyl-, Cyclopentylcarboxy-, Isochinolylcarboxy-, Furoyl-, Tosyl-, Pyrazincarboxy- oder andere solche Gruppe substituiert ist, die wie hierin beschrieben mit einem Substituenten substituiert sein kann. Die N-terminate Aminogruppe auch außerdem mit beispielsweise einer Amidbindung substituiert sein. Es sei darauf hingewiesen, dass der Begriff Aminogruppe hierin sehr allgemein für alle freien Aminogruppen, einschließlich primärer, sekundärer oder tertiärer Aminogruppen, verwendet wird, die in einem Peptid vorhanden sind. Im Gegensatz dazu bezieht sich der Begriff N-Terminus auf die α-Aminogruppe der ersten Aminosäure in einem auf herkömmliche Weise geschriebenem Peptid.
Der N-Terminus eines Peptids der Erfindung kann geschützt werden, indem eine Amino-Schutzgruppe daran gebunden wird. Der Begriff "Amino-Schutzgruppe" wird hierin sehr allgemein für eine chemische Gruppe verwendet, die mit einer freien Aminogruppe, einschließlich beispielsweise der α-Aminogruppe am N-Terminus eines Peptids der Erfindung, reagieren kann. Durch eine Reaktion damit schützt eine Ami no-Schutzgruppe die sonst reaktive Aminogruppe gegen ungewünschte Reaktionen, wie sie beispielsweise während eines Syntheseverfahrens oder aufgrund von Exopeptidaseaktivität stattfinden können.
Eine Modifikation einer Aminogruppe kann auch zusätzliche Vorteile mit sich bringen, einschließlich beispielsweise einer Erhöhung der Löslichkeit oder der Aktivität der Verbindung. Verbindungen mit diesen Modifikationen gehören zu den Verbindungen der vorliegenden Erfindung, weil Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung mithilfe der vorliegenden Offenbarung zu ihrer Konstruktion fähig sind. Auf dem Gebiet der Erfindung sind verschiedene Amino-Schutzgruppen bekannt, wie beispielsweise Acylgruppen, wie z.B. Acetyl-, Picoyl-, tert-Butylacetyl-, tert-Butyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl- und Benzoylgruppen, einschließlich beispielsweise Benzyloxime, wie z.B. 2-Aryl-2-o-benzyloxim, sowie Aminoacylreste, die selbst durch eine Amino-Schutzgruppe modifiziert sein können. Weitere Amino-Schutzgruppen sind beispielsweise in "The Peptides", Bd. 3, Gross und Meinhofer, Hrsg., Academic Press, Inc., New York, New York (1981) und von Greene und Wuts in "Protective Groups in Organic Synthesis", 2. Aufl., 309–405, John Wiley & Sons, New York, New York, USA (1991) beschrieben, die beide durch Verweis hierin aufgenommen sind. Das Produkt einer solchen Modifikation der N-terminalen Aminogruppe eines Peptids oder Peptidanalogs der Erfindung wird hierin als "N-terminales Derivat" bezeichnet.
Auf ähnliche Weise kann eine Carboxylgruppe, wie z.B. die Carboxylgruppe am C-Terminus eines Peptids, unter Verwendung einer Carboxyl-Schutzgruppe chemisch modifiziert werden. Der Begriff "Carboxylgruppe" und "C-Terminus" werden auf die gleiche Weise verwendet wie die Begriffe Aminogruppen und N-Terminus oben. Eine Carboxylgruppe, wie z.B. die am C-Terminus eines Peptids, kann durch Reduktion der C-terminalen Carboxylgruppe zu einem Alkohol oder einem Aldehyd oder durch Bildung eines oralen Esters oder durch Substitution der Carboxylgruppe mit einem Substituenten, wie z.B. Thiazolyl, Cyclohexyl oder einer anderen Gruppe, modifiziert werden. Orale Ester sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und um fassen beispielsweise Alkoxymethylgruppen, wie z.B. Methoxymethyl, Ethoxymethyl, Propoxymethyl, Isopropoxymethyl und dergleichen.
Peptidkombinationen
A. Multimerisationsdomänen
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Peptidverbindungen mit einer Multimerisationsdomäne kombiniert. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden Hybridmoleküle bereitgestellt, die zumindest zwei unterschiedliche Domänen umfassen. Jedes Molekül umfasst einen Peptiddomäne und eine Multimerisationsdomäne. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Peptiddomäne an eine Multimerisationsdomäne, wie beispielsweise eine Immunglobulin-Fc-Region, gebunden, gegebenenfalls über eine flexible Linkerdomäne.
Die Hybridmoleküle der vorliegenden Erfindung werden konstruiert, indem das Peptid mit einer geeigneten Multimerisationsdomäne kombiniert wird. Normalerweise wird bei der Herstellung der Hybridmoleküle der vorliegenden Erfindung Nucleinsäure, die für das Peptid kodiert, operabel an Nucleinsäure gebunden, die für die Multimerisationsdomänensequenz kodiert. Typischerweise kodiert das Konstrukt für. ein Fusionsprotein, worin der C-Terminus des Peptids an den N-Terminus der Multimerisationsdomäne gebunden ist. Fusionen, in denen beispielsweise der N-Terminus des Peptids an den C-Terminus der Multimerisationsdomäne gebunden ist, sind jedoch ebenfalls möglich.
Bevorzugte Multimerisationsdomänen sind Sequenzen von konstanten Immunglobulinregionen. Typischerweise behält in solchen Fusionen das kodierte Hybridmolekül zumindest funktionell aktive Hinge-, CH2- und CH3-Domänen der konstanten Region einer Immunglobulin-Schwerkette bei. Fusionen werden beispielsweise auch am C-Terminus des Fc-Abschnitts einer konstanten Domäne oder direkt N-terminal zur CH1 der Schwerkette oder der entsprechenden Region der Leichtkette vorgenommen.
Die genaue Aminosäurestelle, an der die Fusion des Peptids mit der konstanten Domäne des Immunglobulins vorgenommen wird, ist nicht entscheidend; geeignete Stellen sind allgemein bekannt und können frei gewählt werden, um die biologische Aktivität, Sekretion oder Bindungseigenschaften zu optimieren. In diesem Zusammenhang können Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung auf die in der Literatur beschriebene Konstruktion von verschiedenen Immunadhäsinen zurückgreifen (US-Patente Nr. 5.116.964, 5.714.147 und 5.336.603; Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 399, 68–70 (1989); und Byrn et al., Nature 344, 667–670 (1990); Watson et al., J. Cell. Biol. 110, 2221–2229 (1990); Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991); Linsley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 (1991); Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991); Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27, 2883–2886 (199.1); Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 (1991); Mohler et al., J. Immunol. 151, 1548–1561 (1993); Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060–23067 (1991); Kurschner et al., J. Biol. Chem. 267, 9354–9360 (1992); Chalupny et al., PNAS USA 89, 19369–19364 (1992); Ridgway und Gorman, J. Cell. Biol. 115, Abstract Nr. 1448 (1991)).
Gemäß einem bestimmten Aspekt wird eine Multimerisationsdomäne vom Immunglobulintyp ausgewählt, um ein Multimer, wie z.B. ein Dimer, mit einer Immunglobulin-Fc-Region bereitzustellen. Daher wird das Peptid in bestimmten Aspekten an eine konstante Domäne einer Immunglobulin-Schwerkette gebunden, um ein Multimer bereitzustellen, das eine funktionelle Fc-Domäne umfasst. In diesem Fall wird typischerweise DNA, die für eine Immunglobulinkette-Peptidsequenz kodiert, gemeinsam mit der DNA exprimiert, die für ein Fusionsprotein der Immunglobulin-Schwerkette eines zweiten Peptids kodiert. Bei der Sekretion wird die Hybridschwerkette kovalent gebunden, um eine immunglobulinähnliche Struktur bereitzustellen, die zwei disulfidgebundene Immunglobulin-Schwerketten umfasst.
Vorzugsweise ist die Fc-Region eine menschliche Fc-Region, beispielsweise eine Fc-Region von menschlichem IgG1 (A- und Nicht-A-Allotypen), IgG2, IgG3 oder IgG4 mit nativer Sequenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Peptidsequenz an den N-Terminus der Fc-Region von Immunglobulin G₁ (IgG₁) fusioniert. Es ist möglich, die gesamte konstante Region der Schwerkette an die Peptidsequenz zu fusionieren. Noch bevorzugter werden jedoch eine Sequenz, die in der Hinge-Region gleich stromauf von der Papin-Spaltstelle beginnt, die IgG-Fc chemisch definiert (d.h. Rest 216, wobei der erste Rest der konstanten Region der Schwerkette bei 114 angenommen wird), oder analoge Stellen anderer Immunglobuline bei der Fusion verwendet. In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform wird die Peptid-Aminosäuresequenz an (a) die Hinge-Region und CH2 und CH3 oder (b) die CH1-, Hinge-, CH2- und CH3-Domäne einer IgG-Schwerkette fusioniert; in einer bevorzugten Ausführungsform wird die Peptidligand-Aminosäuresequenz an (a) die Hinge-Region und (b) die CH3-Domäne von IgG1 fusioniert.
Gemäß einem bestimmten Aspekt dieser Ausführungsform sind Hybridmoleküle, die ein Peptid und eine Multimerisationsdomäne umfassen, als Multimere, z.B. Homodimere oder Heterodimere oder sogar Heterotetramere, zusammengesetzt. Homodimere resultieren aus der Paarung oder Vernetzung von zwei Monomeren, die ein Peptid und eine Multimerisationsdomäne umfassen. Es ist jedoch nicht wesentlich, dass zwei identische Monomere gepaart werden. Gemäß einem bestimmten Aspekt der Erfindung kann ein Hybridmolekül, das wie hierin definiert ein Peptid und eine Multimerisationsdomäne, wie z.B. eine konstante Immunglobulindomäne, umfasst, mit einer begleitenden Immunglobulinkette gepaart werden, die einen Arm eines Immunglobulins umfasst. Verschiedene Beispiele für zusammengesetzte Moleküle innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung sind nachstehend aufgelistet:

(a) ACH
(b) ACH-ACH
(c) ACH-VHCH-VLCL
(d) ACH-VHCH worin A jeweils für identische oder unterschiedliche Peptide steht; VL eine variable Domäne einer Immunglobulin-Leichtkette ist; VH eine variable Domäne einer Immunglobulin-Schwerkette ist; CL eine konstante Domäne einer Immunglobulin-Leichtkette ist; CH eine konstante Domäne einer Immunglobulin-Schwerkette ist.

Die hierin beschriebenen Hybridmoleküle werden am besten durch In-Frame-Fusionieren der cDNA-Sequenz, die für den Peptidabschnitt kodiert, an eine Immunglobulin-cDNA-Sequenz hergestellt. Aber auch Fusion an genomische Immunglobulinfragmente kann verwendet werden (siehe beispielsweise Aruffo et al., Cell 61, 1303-1313 (1990); und Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)). Letztere Fusionsart erfordert die Gegenwart von Ig-Regulationssequenzen bei der Expression. cDNAs, die für konstante Regionen einer IgG-Schwerkette kodieren, können, basierend auf veröffentlichten Sequenzen aus cDNA-Bibliotheken von einer Milz oder von Lymphozyten von peripherem Blut, durch Hybridisierungs- oder Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Verfahren isoliert werden. Die für die Peptide und die Immunglobulinteile des Hybridmoleküls kodierenden cDNAs werden gemeinsam in einen Plasmidvektor insertiert, der eine effiziente Expression in den gewählten Wirtszellen kontrolliert.
Alternativ dazu kann, vor allem in Ausführungsformen, bei denen das Peptid durch beispielsweise herkömmliche Festphasesyntheseverfahren synthetisiert wird, das Peptid durch ein beliebiges Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekanntes Mittel an die Multimerisationsdomäne gebunden werden. Eine kovalente Bindung ist typischerweise am besten geeignet, aber je nach Anwendung können auch andere Bindungsformen verwendet werden. Beispiele für geeignete Formen der kovalenten Bindung umfassen Bindungen, die aus der Umsetzung von Molekülen resultieren, die chemische Gruppen mit Aminosäure-Seitenketten in der Multimerisationsdomäne aufweisen, und unter Verwendung verschiedener bifunktioneller Proteinkopplern, wie beispielsweise N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionelle Derivate von Imidoestern (z.B. Dimethyladipimidat-HCL), aktive Ester (z.B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyde (z.B. Glutareldehyd), Bisazidoverbindungen (z.B. Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bisdiazoniumderivate (z.B. Bis-(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanate (z.B. Tolylen-2,6-diisocyanat) und bis-aktive Fluorverbindungen (z.B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol) gebildet werden können.
Peptidfusionen
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Peptid gegebenenfalls an beispielsweise ein anderes Peptid gebunden, entweder direkt oder über einen flexiblen Peptidlinker. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Linkerdomäne eine beliebige Gruppe von Molekülen, die eine räumliche Brücke zwischen zwei oder mehr Peptiddomänen bereitstellt, wie nachstehend genauer beschrieben ist. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden Peptide beispielsweise in einem Fusionsprotein verbunden.
Linkerdomänen
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird die Peptiddomäne gegebenenfalls über einen flexiblen Peptidlinker an beispielsweise eine andere Peptiddomäne oder eine Multimerisationsdomäne gebunden. Die Linkerkomponente des Hybridmoleküls der Erfindung muss nicht unbedingt an der Funktion des Hybridmoleküls mitwirken, kann aber dazu beitragen. Daher ist die Linkerdomäne gemäß vorliegender Erfindung eine beliebige Gruppe von Molekülen, die eine räumliche Brücke zwischen zwei oder mehr Peptiddomänen oder zwischen einer Peptiddomäne und einer Multimerisationsdomäne bereitstellt.
Die Linkerdomäne kann unterschiedliche Längen und Zusammensetzungen aufweisen. Im Allgemeinen ist die Länge der Linkerdomäne und nicht ihre Struktur von Bedeutung. Vorzugsweise ermöglicht die Linkerdomäne eine im Wesentlichen von räumlichen/konformationellen Einschränkungen freie Bindung des Hybridmoleküls an das entsprechende FVII/FVIIa-Molekül. Daher hängt die Länge der Linkerdomäne vom Charakter der beiden funktionellen Domänen, beispielsweise der Peptid- und Multimerisationsdomäne, des Hybridmoleküls ab.
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden erkennen, dass verschiedene Kombinationen von Atomen aufgrund bekannter Abstände zwischen unterschiedlichen Bindungen Moleküle unterschiedlicher Länge bereitstellen (Morrison und Boyd, Organic Chemistry, 3. Aufl., Allyn and Bacon, Inc., Boston, Massachussets, USA (1977)). Die Linkerdomäne kann beispielsweise ein Polypeptid mit variabler Länge sein. Die Aminosäurezusammensetzung des Polypeptids bestimmt die Art und Länge des Linkers. Beispiele für Linkerdomänen umfassen einen oder mehrere Gly- und/oder Ser/Arg-Reste.
Zusammensetzungen für Forschung und Diagnose
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Peptide der Erfindung an ein Makromolekül, wie beispielsweise einen festen Träger, nichtkovalent adsorbiert oder kovalent gebunden. Vorteilhafterweise umfasst die Erfindung sowohl beide mit den Peptiden verbundenen Makromoleküle. Im Allgemeinen ist der feste Träger eine inerte Matrix, wie beispielsweise ein Polymergel, das eine dreidimensionale Struktur, ein Gitter oder ein Netzwerk aus einem Material umfasst. Fast alle Makromoleküle, egal ob synthetisch oder natürlich, können in einer geeigneten Flüssigkeit ein Gel bilden, wenn sie auf geeignete Weise mit einem bifunktionellen Reagens vernetzt werden. Vorzugsweise ist das gewählte Makromolekül zur Verwendung für Affinitätschromatographie geeignet. Die meisten chromatographischen Matrizes, die für Affinitätschromatographie verwendet werden, sind Xerogele. Solche Gele schrumpfen beim Trocknen auf einem festen Träger, der nur die Gelmatrix umfasst. Wenn das ge trocknete Xerogel in der Flüssigkeit resuspendiert wird, saugt die Gelmatrix Flüssigkeit auf, quillt und kehrt in den Gelzustand zurück. Zur Verwendung hierin geeignete Xerogele umfassen Polymergele, wie z.B. Cellulose, vernetzte Dextrane (z.B. Sepharose), Agarose, vernetzte Agarose, Polyacrylamidgele und Polyacrylamid-Agarose-Gele.
Alternativ dazu können Aerogele für Affinitätschromatographie verwendet werden. Diese Gele schrumpfen beim Trocknen nicht, sondern erlauben lediglich das Eindringen der Umgebungsluft. Wenn das trockene Gel einer Flüssigkeit ausgesetzt wird, verdrängt Letzteres die Luft im Gel. Zur Verwendung hierin geeignete Aerogele umfassen poröses Glas und Keramikgele.
Ebenfalls hierin eingeschlossen sind die Peptide der Erfindung, die an derivatisierte Gele gebunden sind, worin die Derivatgruppierungen bei Affinitätschromatographie die Kopplung der Peptidliganden an die Gelmatrix erleichtern und eine sterische Hinderung der Peptid-FVII/FVIIa-Wechselwirkung verhindern. Alternativ dazu können zum gleichen Zweck auch Spacer zwischen der Gelmatrix und dem Peptidliganden angeordnet werden.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung Fusionsproteine bereit, worin ein gewähltes oder gewünschtes Polypeptid an seinem N-Terminus oder seinem C-Terminus oder an beiden Termini an eine oder mehr vorhandene Peptide fusioniert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die Verbindungen, einschließlich der Hybridmoleküle der Erfindung, umfassen, können auf eine Weise formuliert und abgegeben oder verabreicht werden, die am besten für eine zu behandelnde, durch FVII/FVIIa vermittelte Krankheit oder Störung geeignet ist, einschließlich Formulierungen, die zur parenteralen, topischen, oralen, lokalen, Aerosol- oder transderma len Verabreichung oder Abgabe der Verbindungen, geeignet sind. Bei Indikationen, dass die Reduktion von TF-FVIIa-abhängiger Koagulation mit der Zirkulation von Blut durch Stents oder künstliche Klappen zusammenhängt oder mit extrakorporaler Zirkulation, einschließlich Blut, das bei Verfahren wie Dialyse, Blutfiltration oder Blutumleitung während einer Operation aus einem Patienten abgeleitet wird, zusammenhängt, umfassen geeignete Formulierungen solche, die zum Überziehen von Vorrichtungen, wie z.B. Stents, Klappen und Filtrationsvorrichtungen, geeignet sind.
Genauer gesagt umfassen geeignete Zusammensetzungen der Erfindung alle hierin beschriebenen Verbindungen zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wobei die Art des Trägers je nach Verabreichungsart oder Verwendung variiert, wobei beispielsweise bei oraler Verabreichung normalerweise ein fester Träger und bei intravenöser Verabreichung eine flüssige Salzlösung als Träger verwendet wird. Zur lokalen Verabreichung, wie sie beispielsweise geeignet ist, wenn eine TF-FVIIa-abhängige Koagulation mit der Zirkulation von Blut durch künstliche Vorrichtungen, wie z.B. Stents oder Klappen, zusammenhängt, können die Peptide beispielsweise kovalent an die künstliche Vorrichtung gebunden werden, wodurch die Bildung eines lokalen Thrombus verhindert wird. Alternativ dazu kann das Peptid in einer Formulierung bereitgestellt werden, die es dem Peptid erlaubt, langsam aus der Vorrichtung eluiert zu werden, sodass sowohl lokaler als auch systemischer Schutz gegen Vorfälle in Zusammenhang mit TF-FVIIa-abhängiger Koagulation bereitgestellt wird. Ein Beispiel sind mit Stents mit absorbierten Peptiden, die nach Angioplastie oder anderen chirurgischen Eingriffen eingesetzt werden können.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen pharmazeutisch annehmbare Komponenten, die mit dem Gegenstand und der Verbindung der Erfindung verträglich sind. Diese umfassen im Allgemeinen Suspensionen, Lösungen und Elixiere, insbesondere aber biologische Puffer, wie z.B. phosphatgepufferte Salzlösungen, Kochsalzlösungen, Dulbecco-Medien und dergleichen. Aerosole können ebenfalls verwendet werden, und zwar auf Trägern, wie z.B. Stärke, Zucker, mikrokristalliner Zellulose, Verdünnungsmitteln, Granuliermitteln, Gleitmitteln, Bindemit teln, Aufschlussmitteln und dergleichen (im Falle von oralen festen Präparaten, wie z.B. Pulvern, Kapseln und Tabletten).
Der Begriff "pharmazeutisch annehmbar" bedeutet hierin im Allgemeinen durch eine Aufsichtsbehörde der Bundesregierung oder einer bundesstaatlichen Regierung der USA genehmigt wurde oder im amtlichen Arzneibuch der USA oder einem anderen allgemein anerkannten Arzneibuch für die Verwendung an Tieren, insbesondere Menschen, angeführt ist.
Die gewünschte Formulierung kann unter Verwendung der oben genannten Puffer, oder sogar von Exzipienten, wie z.B. Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharincellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen pharmazeutischer Reinheit, hergestellt werden. Eine "PEGylierung" der Zusammensetzungen kann unter Einsatz auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren erreicht werden (siehe beispielsweise die internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 92/16555, das US-Patent Nr. 5.122.614 von Enzon und die internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 92/00748).
Ein bevorzugter Verabreichungsweg der vorliegenden Erfindung sind Aerosole oder Inhalationsformen. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zusammen mit einem Dispergiermittel oder Dispergator in einer Aerosolformulierung in Form eines trockenen Pulvers oder einer Lösung oder Suspension mit einem Verdünner verabreicht werden.
Der Begriff "Dispergiermittel" betrifft hierin ein Mittel, dass die Aerosolisierung der Verbindung oder die Absorption des Proteins in Lungengewebe oder beides unterstützt. Vorzugsweise ist das Dispergiermittel pharmazeutisch annehmbar. Der Begriff "pharmazeutisch annehmbar" bedeutet hierin durch eine Aufsichtsbehörde der Bundesregierung oder einer bundesstaatlichen Regierung der USA genehmigt wurde oder im amtlichen Arzneibuch der USA oder einem anderen allgemein anerkannten Arzneibuch für die Verwendung an Tieren, insbesondere Menschen, angeführt ist.
Geeignete Dispergiermittel sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und umfassen Tenside und dergleichen, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Beispielsweise können Tenside verwendet werden, die im Allgemeinen auf dem Gebiet der Erfindung eingesetzt werden, um oberflächeninduzierte Aggregation der Verbindung, insbesondere der Peptidverbindung zu verringern, die durch die Zerstäubung der das flüssige Aerosol bildenden Lösung verursacht wird. Nicht einschränkende Beispiele für solche Tenside umfassen Polyoxyethylenfettsäureester und -alkohole und Polyoxyethylensorbitanfettsäureester. Die Menge der Tenside variiert, liegt jedoch im Allgemeinen im Bereich von 0,001 bis 4 Gew.-% der Formulierung. In einem spezifischen Aspekt ist das Tensid Polyoxyethylensorbitanmonooleat oder -sorbitantrioleat. Geeignete Tenside sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und können je nach den gewünschten Eigenschaften in Abhängigkeit von der jeweiligen Formulierung, von der Konzentration der Verbindung, vom Verdünner (in einer flüssigen Formulierung), oder von der Form des Pulvers (in einer trockenen Pulverformulierung) gewählt werden.
Außerdem können die flüssigen oder trockenen Formulierungen je nach gewählter Verbindung, gewünschter therapeutischer Wirkung, Qualität des Lungengewebes (z.B. gesunde oder kranke Lunge) und zahlreichen anderen Faktoren weitere Komponenten umfassen, wie nachstehend erläutert wird.
Die flüssigen Aerosolformulierungen enthalten im Allgemeinen die Verbindung und ein Dispergiermittel in einem physiologisch annehmbaren Verdünnungsmittel. Die Trockenpulver-Aerosolformulierungen der vorliegenden Erfindung bestehen aus einer fein verteilten festen Form der Verbindung und einem Dispergiermittel. Die Formulierung muss mit entweder der Flüssigkeit- oder Trockenpulver-Aerosolformulierung aerolisiert werden. Das heißt, sie muss in Flüssigkeit- oder Feststoffteilchen aufgebrochen werden, um sicherzustellen, dass die aerosolisierte Dosis wirklich die Alveolen erreicht. Im Allgemeinen beträgt der massenmittlere dynamische Durchmesser 5 μm oder weniger, um sicherzustellen, dass die Arzneimittelteilchen die Lungenalveolen erreichen (Wearley, L.L., Cri. Rev. in Ther. Drug Carrier Systems 8, 333 (1991)). Der Begriff "Aerosolteilchen" bezieht sich hierin auf die Flüssigkeit- oder Feststoffteilchen, die zur pulmonalen Verabreichung geeignet sind, d.h. die Alveolen erreichen. Andere Überlegungen, wie beispielsweise der Aufbau der Verabreichungsvorrichtungen, weitere Komponenten der Formulierung und Teilcheneigenschaften sind ebenfalls wichtig. Diese Aspekte der pulmonalen Verabreichung eines Arzneimittels sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt, und geübte Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können leicht Änderungen an den Formulierungen, den Aerosolisierungsmitteln und der Konstruktion der Verabreichungsvorrichtung vornehmen.
In Bezug auf den Aufbau der Verabreichungsvorrichtung kann bei der Umsetzung der Erfindung jede auf dem Gebiet der Erfindung bekannt Form von Aerosolisierung verwendet werden, einschließlich, Vernebelung, Zerstäubung oder Pumpenaerosolisierung einer flüssigen Formulierung und Aerosolisierung einer Trockenpulverformulierung, nicht jedoch auf diese eingeschränkt. Eine Verabreichungsvorrichtung, die nur zur Verabreichung von festen Formulierungen dient, soll bereitgestellt werden. Häufig erfordert die Aerosolisierung einer Flüssigkeit- oder Trockenpulverformulierung ein Treibmittel. Das Treibmittel kann jedes beliebige auf dem Gebiet der Erfindung verwendete Treibmittel sein. Spezifische, nicht einschränkende Beispiele für solche nützlichen Treibmittel sind Chlorfluorkohlenstoffe, Fluorkohlenwasserstoffe, Chlorfluorkohlenwasserstoffe oder Kohlenwasserstoffe, einschließlich Trifluormethan, Dichlordifluormethan, Dichlortetrafluorethanol und 1,1,1,2-Tetrafluorethan oder Kombinationen daraus.
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung ist die Vorrichtung zur Aerosolisierung ein Inhalator mit abgemessenen Dosen. Ein Inhalator mit abgemessenen Dosen stellt bei jeder Verabreichung eine bestimmte Dosierung bereit, und keine je nach Verabreichung variierenden Dosierungen. Solch ein Inhalator mit abgemessenen Dosen kann mit entweder einer Flüssigkeit- oder Trockenpulver-Aerosolformulierung verwendet werden. Inhalatoren mit abgemessenen Dosen sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt.
Sobald die Verbindung die Lunge erreicht, wirken verschiedene von der Formulierung abhängige Faktoren auf die Arzneimittelabsorption. Bei der Behandlung einer Erkrankung oder Störung, die bestimmte Werte der Verbindung im Kreislauf erfordern, können sich Faktoren, wie die Aerosolteilchengröße, Aerosolteilchengestalt, Gegenwart oder Abwesenheit von Infektionen, Lungenerkrankungen oder Embolien, auf die Absorption der Verbindungen auswirken. Für jede der hierin beschriebenen Formulierungen können bestimmte Gleitmittel, Absorptionsverstärker, Proteinstabilisatoren oder Suspensionsmittel geeignet sein. Die Wahl dieser zusätzlichen Mittel hängt vom jeweiligen Ziel ab. In Fällen, in denen einen lokale Verabreichung der Verbindungen gewünscht oder angepeilt ist, sind Variablen, wie Absorptionsverstärkung, nicht entscheidend.
Flüssig-Aerosolformulierungen
Die Flüssig-Aerosolformulierungen der vorliegenden Erfindung werden typischerweise mit einem Vernebler verwendet. Der Vernebler kann entweder mit Druckluft oder Ultraschall funktionieren. Jeder beliebige auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Vernebler kann in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie beispielsweise Ultravent (Mallinckrodt, Inc., Lt. Louis, Missouri, USA); Acorn II (Marquest Medical Products, Englewood Colorado, USA), nicht jedoch auf diese beschränkt. Weitere Vernebler, die in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, sind in den US-Patenten Nr. 4.624.251, ausgegeben am 25. November 1986; 3.703.173, ausgegeben am 21. November 1972; 3.561.444, ausgegeben am 9. Februar 1971; und 4.635.627, ausgegeben am 13. Jänner 1971, beschrieben.
Die Formulierung kann einen Träger umfassen. Der Träger ist ein Makromolekül, das im Kreislaufsystem löslich ist und physiologisch annehmbar ist, wobei physiologisch annehmbar bedeutet, dass Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung die Injektion des Trägers an einem Patienten als Teil einer Therapie akzeptieren würden. Der Träger ist vorzugsweise relativ stabil im Kreislaufsystem und weist eine annehmbare Clea rance-Plasmahalbwertszeit auf. Solche Makromoleküle umfassen Sojalecithin, Ölsäure und Sorbitantrioleat, wobei Sorbitantrioleat bevorzugt ist.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können noch weitere Mittel enthalten, die zur Proteinstabilisierung oder Regulierung des osmotischen Drucks von Nutzen sind. Beispiele für solche Mittel umfassen Salze, wie z.B. Natriumchlorid oder Kaliumchlorid, und Kohlenhydrate, wie z.B. Glucose, Galactose oder Mannose, und dergleichen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Trockenpulver-Aerosolformulierungen
Die vorliegende pharmazeutische Formulierung dient auch zur Verwendung als Trockenpulver-Inhalationsformulierung, welche die Verbindung in fein verteilter Pulverform und ein Dispergiermittel umfasst. Die Verbindung liegt im Allgemeinen in Form eines gefriergetrockneten Pulvers vor. Gefriergetrocknete Formen der Peptidverbindungen können durch Standardverfahren erhalten werden.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Trockenpulverformulierung ein fein verteiltes Trockenpulver, das eine oder mehrere Verbindungen der vorliegenden Erfindung, ein Dispergiermittel und außerdem ein Quellmittel enthält. Quellmittel, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Formulierung von Nutzen sind, umfassen Mittel wie Lactose, Sorbit, Saccharose oder Mannit, und zwar in Mengen, welche die Abgabe des Pulvers von der Vorrichtung vereinfachen.
Therapeutische Verfahren
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können bei der Herstellung eines Medikaments verwendet werden, das die biologische Aktivität des TF-FVIIa-Komplexes unterbinden soll. Die Hemmung von TF-FVIIa ist bei Indikationen wünschenswert, bei denen eine Reduktion von TF-FVIIa-abhängiger Koagulation mitspielt. Solche Situationen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die Prävention von Arte rienthrombose in Kombination mit thrombolytischer Therapie. Es wurde angenommen, dass TF-FVIIa bei verschiedenen klinischen Zuständen eine bedeutende Rolle spielt, einschließlich tiefer Venenthrombose, Arterienthrombose, Schlaganfällen, DIC, septischem Schock, kardiopulmonalen Bypass-Operationen, Atemnotsyndrom bei Erwachsenen, hereditärem Angioödem. Inhibitoren von TF-FVIIa können daher eine bedeutende Rolle bei der Regulierung von Entzündungs- und/oder Thromboseerkrankungen spielen.
Somit umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung von Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung von durch TF-FVIIa vermittelten Vorgängen bei einem Menschen, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch Wirksamen Menge der Verbindung der vorliegenden Erfindung an einen Patienten, der die Behandlung benötigt. Eine therapeutische wirksame Menge der Verbindung der vorliegenden Erfindung wird so bestimmt, dass sie die gewünschte Wirkung erzielt. Die therapeutisch einzusetzende Menge variiert je nach therapeutischen Zielen, Verabreichungsweg und zu behandelndem Zustand. Demgemäß sollten die zu verabreichenden Dosen ausreichen, um vorhandenes FVII/FVIIa zu binden und einen inaktiven Komplex zu bilden, was zu verringerter Koagulation beim behandelten Patienten führt.
Die therapeutische Wirksamkeit wird an der Verbesserung eines oder mehrerer Symptome gemessen, die mit der von TF-FVIIa abhängigen Koagulation zusammenhängen. Solche therapeutisch wirksamen Dosierungen können von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung leicht bestimmt werden und variieren je nach Alter, Geschlecht und Zustand des zu behandelnden Patienten. Geeignete Dosierungsbereiche für systemische Verabreichung liegen typischerweise zwischen etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg oder mehr und hängen vom Verabreichungsweg ab. Gemäß der vorliegenden Erfindung liegt eine bevorzugte therapeutische Dosierung zwischen etwa 1 μg/kg Körpergewicht und etwa 5 mg/kg Körpergewicht. Geeignete Therapieformen umfassen beispielsweise intravenöse Injektion oder Infusion, und zwar in ausrei chendem Maße, um die Konzentration im Blut in den für die angepeilte Therapie festgelegten Bereichen zu halten.
Die durch anomale Thrombose gekennzeichneten Zustände umfassen solche, welche die Arterien- und Venensysteme betreffen. In Bezug auf das Koronararteriensystem kennzeichnet anomale Thrombenbildung beispielsweise eine Ruptur einer bestehenden arteriosklerotischen Plaque, welche die Hauptursache für akute Myokardinfarkte und instabile Angina darstellt, sowie die Bildung eines okklusiven Koronarthrombus, der entweder aus einer thrombolytischen Therapie oder perkutaner transluminaler Koronarangioplastie (PTCA) resultiert. In Bezug auf das Venensystem kennzeichnet eine anomale Thrombenbildung den Zustand, der bei Patienten beobachtet wird, die einer Operation in den unteren Extremitäten oder im Bauchbereich unterzogen wurden, denn diese leiden oft aufgrund geringerer Durchblutung in der betroffenen Extremität an Thrombenbildung im Venensystem und neigen zu Lungenembolien. Anomale Thrombenbildung kennzeichnet ferner disseminierte intravasale Koagulopathie, die im Allgemeinen bei septischem Schock, bestimmten Vireninfektionen und Krebs mit beiden Gefäßsystemen zusammenhängt, ein Zustand, bei dem es zu einem raschen Verbrauch von Koagulationsfaktoren und systemischer Koagulation kommt, was in der Bildung von lebensgefährlichen Thromben im gesamten Mikrogefäßsystem resultiert und somit zum Versagen mehrerer Organe führt.
Die nachstehenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung. Die Offenbarungen aller Literaturhinweise in der Beschreibung sind durch Verweis hierin aufgenommen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Identifikation und Charakterisierung von Peptiden die FVIIa binden und FX-Aktivierung und Gerinnung hemmen
Verfahren
Phagenbibliotheken – Die Phagenbibliothek eines polyvalenten Peptids mit Zufallssequenz wurde bereits beschrieben (Lowman, H.B., et al., Biochemistry 37, 8870 (1998)). Die Peptidbibliotheken wiesen die Form X_iCX_jCX_k (worin X eine der 20 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren ist, j = 4 bis 10 ist und i+j+k = 18 ist), einer uneingeschränkten Bibliothek X₂₀ und X₄CX₂GPX₄CX₄ auf. Jede der 10 Bibliotheken wies mehr als 10⁸ Klone auf.
Selektionsbedingungen – TF_1-243 (Paborsky, L.R., et al., J. Biol. Chem. 266, 21911 (1991)) oder ein rekombinanter menschlicher FVIIa (jeweils 2 μg/ml) wurde durch Inkubieren über Nacht bei 4 °C direkt auf Maxisorp-Platten (Nunc) in 50 mM Ammoniumbicarbonat, pH 9,3 immobilisiert. Die Wells wurden unter Verwendung eines Sortierpuffers (50 mM HEPES, pH 7,2, 5 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 1 % BSA) 1 h lang bei 25 °C blockiert. Rekombinanter menschlicher FVIIa (2 μg/ml) in Sortierpuffer wurden über einen Zeitraum von 30 min zu den Wells zugesetzt, die vorher mit TF überzogen und blockiert worden waren, um den TF-FVIIa-Komplex zu bilden. Phagen von den oben beschriebenen Bibliotheken wurden in 3 Gruppen gepoolt. Pool A enthielt X_iCX_jCX_k, worin j = 5 bis 7 ist; Pool B enthielt X₄CX₂GPX₄CX₄, X₂₀ und X_iCX_jCX_k, worin j = 4 ist; Pool E enthielt X_iCX_jCX_k, worin j = 8 bis 10 ist. Phagen von jedem Pool wurde mit den immobilisierten Zielen in einem Sortierpuffer 3 h lang bei 25 °C inkubiert im Allgemeinen wurden etwa 5 × 10¹⁰ Phagen zu Beginn jedes Durchgangs zugesetzt. Ungebundene Phagen wurden durch wiederholtes Waschen mit einem Waschpuffer (50 mM HEPES, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,005 % Tween 20) entfernt; verbleibende Phagen wurden mit 500 mM KCl, 10 mM HCl, pH 2 eluiert. Die eluierten Phagen wurden dann über Nacht bei 37 °C in XL1-Blue-Zellen mit VCSM13-Helferphagen (Stratagene) vermehrt. Eine Anreicherung konnte überwacht werden, indem die Anzahl der Phagen, die an einen mit dem Ziel überzogenen Well band, titriert und mit einem mit BSA überzogenem Well verglichen wurde.
FX-Aktivierungstest – Aktivierung von FX durch TF-FVIIa wurde bei Raumtemperatur als Funktion der Peptidkonzentration überwacht. Die einzelnen Testproben enthielten 100 μl 460 mM relipidiertes TF_1-243 (Kelley, R.F., et al., Blood 89, 3219–3227 (1997)) und 30 pM FVIIa in HBS/Ca-Puffer (20 mM HEPES, pH 7,4, 5 mM CaCl₂, 150 mM NaCl, 0,1 % PEG 8000); nach 20 min wurden 25 μl in HBS/Ca-Puffer verdünntes Peptid zugesetzt. Nach einer 30-minütigen Inkubation wurde die Reaktion durch den Zusatz von 25 μl 1 μM FX in HBS/Ca initiiert (Anmerkung: Das ergibt eine Endkonzentration von 306 pM TF_PC, 20 pM FVIIa und 166 mM FX). Für eine kinetische Analyse wurde die Endkonzentration von FX zwischen 20 und 500 mM variiert. Aliquoten von 25 μl wurden nach 1, 3, 5, 7 und 9 min entfernt und in 25 μl 50 mM EDTA gequencht. Das in den einzelnen Aliquoten gebildete FXa konnte durch Zusatz von 100 μl 250 μM Spectrozyme FXa (American Diagnostica), 50 mM Tris, pH 8, 50 mM NaCl, 0,0025 % Triton X-100 gemessen werden. Die bei den einzelnen Peptidkonzentrationen gebildeten Mengen FXa waren proportional zur anfänglichen Neigung des Absorptionsvermögens bei 405 nm vs. Zeit. Sigmoide Kurven wurden durch eine nichtlineare Regressionsanalyse an eine Vier-Parameter-Gleichung angepasst (Marquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11, 431–441 (1963)); die Konzentration der einzelnen Peptide, die erforderlich ist, um im Test ein Sigmal mit der Hälfte der maximalen Stärke zu erzeugen, wurde aus den Kurven berechnet und wird als IC₅₀-Wert bezeichnet.
Gerinnungstests – Auf Prothrombinzeit (PT) und aktivierter partieller Thromboplastinzeit (APTT) basierende Gerinnungstests wurden in citrierten, gepoolten, normalen Plasmen (vom Menschen oder von verschiedenen Tierarten) durchgeführt. Die Gerinnungszeiten wurden unter Verwendung eines automatischen Koagulationsanaly sators ACL 300 (Coulter Corp., Miami, Florida, USA) und im Handel erhältlicher Reagenzien wie folgt bestimmt.
Für den PT-Test wurden wässrige Lösungen eines Inhibitors mit verschiedenen Konzentrationen in einer Menge von 1 Teil Inhibitor pro 9 Teile Plasma zu citriertem, gepooltem, normalem Plasma zugesetzt. Nach einer 30-minütigen Inkubation wurden diese Gemische zu den Probenbehältern des Analysators ACL 300 zugesetzt. Innovin^® (bade International Inc., Miami, Florida, USA), ein Gemisch aus menschlichem, relipidiertem Gewebefaktor und Ca²⁺-Ionen wird zu den Reagensbehältern zugesetzt. Präzise Volumina von Probe und Innovin^® (50 μl Probe, 100 μl Innovin^®) werden automatisch zu Zellen auf einem Acrylrotor transferiert, der vorher bei 37 °C äquilibriert wurde. Nach einer 2-minütigen Inkubationsdauer wird die Koagulation initiiert wenn die beiden Komponenten durch Zentrifugation vermischt werden. Die Koagulation wird optisch überwacht und die Gerinnungszeit wird in Sekunden angegeben. In diesem System beträgt die Gerinnungszeit von Kontrollplasma (Plasma plus Inhibitor-Verdünner) beträgt typischerweise 8 bis 10 Sekunden. Die x-fache Verlängerung ist die Gerinnungszeit des Inhibitors bezogen auf die Gerinnungszeit der Kontrolle.
Für den APTT-Test werden Inhibitor und Plasma vermischt und wie oben beschrieben in die Probenbehälter des Analysators ACL 300 transferiert. Actin FS^® und CaCl₂ (bade International Inc., Miami, Florida, USA) werden zu den Reagensbehältern 1 bzw. 2 zugesetzt. Präzise Volumina von Probe (53 μl) und Actin FS^® (53 μl) werden automatisch zu Zellen auf einem Rotor transferiert, der vorher bei 37 °C äquilibriert wurde, und durch Zentrifugation vermischt. Nach einer 2-minütigen Aktivierungsdauer wird die Koagulation durch den Zusatz von CaCl₂ (53 μl) initiiert. Die Koagulation wird optisch überwacht und die Gerinnungszeit wird in Sekunden angegeben. Die ATPP von Plasmakontrollen beträgt typischerweise 12 bis 32 Sekunden, je nach Art des im Test verwendeten Plasmas. Die x-fache Verlängerung ist die Gerinnungszeit des Inhibitors bezogen auf die Gerinnungszeit der Kontrolle.
Phagen-ELISA – Die Fähigkeit von Peptiden, mit Peptidphagen um die Bindung an TF-FVIIa zu konkurrieren, wurde mithilfe eines Phagen-ELISA überwacht. Peptidverdünnungen in einem Sortierpuffer wurden über einen Zeitraum von 30 min zu Mikrotiterplatten zugesetzt, die mit dem TF-FVIIa-Komplex überzogen waren (wie oben beschrieben). Etwa 10¹¹ monovalente Phagen mit der TF100-Peptidsequenz wurden dann über weitere 15 min zugesetzt. Die Mikrotiterplatte wurde mit einem Waschpuffer gewaschen, und die an FVIIa gebundenen Phagen wurden mithilfe eines monoklonalen Anti-gVIII/HRP-Antikörperkonjugats (HRP/Anti-M13 Conjugate, Pharmacia Amersham Biotech) detektiert. Die Menge an gebundenem HRP wurde mithilfe eines ABTS/H₂O₂-Substrats und durch Überwachung des Absorptionsvermögens bei 405 nm gemessen. Das Absorptionsvermögen bei 405 nm wurde über der Peptidkonzentration aufgetragen, die ursprünglich dem Well zugesetzt wurde. S-Kurven wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse an eine Vier-Parameter-Gleichung angepasst (Marquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11, 431–441 (1963)); die Konzentration der einzelnen Peptide, die erforderlich ist, um im Test ein Sigmal mit der Hälfte der maximalen Stärke zu erzeugen, wurde aus den Kurven berechnet und wird als IC₅₀-Wert bezeichnet.
Partielle und komplette Randomisierung auf monovalenten Phagen – Monovalente Bibliotheken, die eine einzelne Kopie eines Peptids auf der Oberfläche einer Phage aufweisen, die über eine Linkersequenz an das Endprotein gebunden ist, für das gIII kodiert, wurden durch matrizengerichtete Einzelstrang-Mutagenese (Kunkel, T.A., et al., Methods Enzymol. 204, 125–139 (1991)) des Phagemids t4.g3 konstruiert. Das Phagemid t4.g3 ist ein Derivat von pA4G32 (Dennis, M.S., und Lazarus, R.A., J. Biol. Chem. 269, 22129–22136 (1994)), worin die für APPI kodierende Sequenz, die an gIII fusioniert war, durch einen 60-bp-Spacer ersetzt wurde, der im Leseraster an eine Linkersequenz und gIII fusioniert wurde; außerdem wurde das CMP'-Gen in eine einzigartige hincII-Stelle im AMP'-Gen insertiert. Die Veränderung der Arzneimittelresistenz wurde darauf ausgerichtet, Kontamination durch verwandte polyvalente Klone mit schwächerer Affinität zu verhindern, welche die Population aufgrund von Aviditätswirkung übernehmen könnten (Cwirla, S.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 6378–6381 (1990)). Partiell randomisierte Bibliotheken wurden entworfen, um eine Tendenz zu den Peptidsequenzen aufrecht zu erhalten, die in den anfänglichen polyvalenten Bibliotheken identifiziert wurden, während an jeder Aminosäureposition eine 50%ige Mutationsrate erlaubt wird. Diese Mutationsrate wurde durch Synthese der Oligos mit einem 70-10-10-10-Gemisch von Basen (worin jede Base in der dotierten Region des Oligo unter Verwendung eines Gemischs gebunden ist, das 70 der Base, die zu Wildtypsequenzen beiträgt, und 10 % der anderen 3 Basen enthält) erreicht. Im Gegensatz dazu wurde eine komplette Randomisierung in Bibliotheken durch Synthese von Oligos unter Verwendung von NNS für bestimmte Codons erreicht, um Abschnitte eines dargestellten Peptids vollkommen zu randomisieren, während andere Abschnitte der Sequenz konstant gehalten werden.
Peptidsynthese – Peptide wurden im 0,25-mmol-Maßstab unter Verwendung eines PEG-Polysytrolharzes entweder durch manuelle oder automatisierte (Perseptive Pioneer) auf Fmoc basierende Festphasensynthese synthetisiert. Die Kopplung der einzelnen Aminosäuren wurde mithilfe von 2-(H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und N-Hydroxybenzotriazol (HOBt) mit Diisopropylethylamin (DIPEA) in Dimethylacetamid (DMA) erreicht. Peptide, die mit einem Carboxyl-terminalen Amid endeten, wurden auf Rink-Amidharz hergestellt. Eine Acetylierung des Amino-Terminus wurde durch Essigsäureanhydrid in 10 % Triethylamin in Dichlormethan erreicht. Seitenketten-Schutzgruppen wurden entfernt, und das Peptid wurde mit 95%iger Trilfuoressigsäure (TFA) und 5%igem Triisopropylsilan vom Harz abgespalten. Eine gesättigte Iodlösung in Essigsäure wurde zugesetzt, um die Disulfidbindungen zu oxidieren. Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Wasser/Acetonitril-Gradienten mit 0,1 % TFA gereinigt und gefriergetrocknet. Peptide wurden durch analytische HPLC >95 % gereinigt, und ihre Identität wurde durch Massenspektrometrie bestätigt.
Produktion von Petpid-Z-Fusionen – Phagenpeptide, die zur Bindung an TF-FVIIa ausgewählt wurden, wurden durch E. coli (27C7) als Fusionen an die Z-Domäne von Protein A exprimiert und sekretiert, wobei ein flexibler Linker (GGGSGG) (Seq.-ID Nr. 99) verwendet wurde. Oligos wurden entworfen, um die kodierende Sequenz für die Phagenpeptidesequenzen zwischen die stII-Signalsequenz und die Z-Domäne im Plasmid pZCT zu insertieren (Starovasnik et al., Protein Sci. 8, 1423–1431 (1999)). Zellen wurden in Phosphat-limitierte Medien gezüchtet, und Peptid-Z-Fusionen wurden unter Verwendung einer IgG-Affinitätssäule wie beschrieben vom Medium gereinigt (Dennis et al., Proteins: Structure, Function, and Genetics 15, 312–321 (1993)).
Produktion von TF182 und TF183b – Tf183 wurde in E. coli exprimiert und wie oben beschrieben durch einen flexiblen Linker an die Z-Domäne von Protein A fusioniert. Das TF183-Peptid, EEWEVLCWTWETCER (Seq.-ID Nr. 23) konnte durch schonenden Verdau mit Trypsin, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC von der TF183-Z-Fusion isoliert werden. Eine spezifische N-terminale Markierung von gereinigtem TF183 mit Biotin, um TF183b herzustellen, wurde unter Verwendung von NHS-LC-Biotin (Pierce) gemäß den Empfehlungen des Herstellers erreicht.
FVIIa-Bindungs-ELISA – Die Fähigkeit von Peptiden, mit biotinyliertem TF183 (TF183b) (oder anderen hierin beschriebenen Peptiden, die wie beschrieben biotinyliert werden können) um die Bindung von FVIIa konkurrieren, wurde unter Verwendung eines FVIIa-Bindungs-ELISA oder eines TF-FVIIa-Bindungs-ELISA überwacht. Mikrotiterplatten wurden über Nacht mit 2 μg/ml rekombinantem menschlichem FVIIa oder 2 μg/ml TF_1-243 (Paborsky, L.R., et al., J. Biol. Chem. 266, 21911 (1991)) in 50 mM Ammoniumbicarbonat, pH 9 bei 4 °C überzogen; alle anderen Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Platten wurden dann mit 1 % BSA in einem Testpuffer (50 mM HEPES, pH 7,2, 5 mM CaCl₂, 150 mM NaCl) blockiert. Für den TF-FVIIa-ELISA wurde rekombinanter menschlicher FVIIa (2 μg/ml) in 1 % BSA in einem Testpuffer über 30 min zu den Wells zugesetzt, die vorher mit TF überzogen und blockiert worden waren, um den TF-FVIIa-Komplex zu bilden. Peptidverdünnungen in einem Testpuffer plus 0,05 % Tween 20 wurden zusammen mit 5 nM TF183b über 1 h zur Mikrotiterplatte zugesetzt. Die Mikrotiterplatte wurde 3-mal mit dem Testpuffer plus 0,05 % Tween 20 gewaschen, und das gebundene biotinylierte Peptid wurde mit einem Streptavidin/HRP-Konjugat (Strepatvidin-POD, Roche Molecular Biochemicals) detektiert. Die Menge an gebundenem HRP wurden unter Verwendung eines ABTS/H₂O₂-Substrats (Kirkegaard and Perry Laboratories) und durch Überwachung des Absorptionsvermögens bei 405 nm gemessen. Das Absorptionsvermögen bei 405 nm wurde über der Peptidkonzentration aufgetragen, die ursprünglich dem Well zugesetzt wurde. S-Kurven wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse an eine Vier-Parameter-Gleichung angepasst (Marquardt, J. Soc. Indust. Appl. Math. 11, 431–441 (1963)); die Konzentration der einzelnen Peptide, die erforderlich ist, um im Test ein Signal mit der Hälfte der maximalen Stärke zu erzeugen, wurde aus den Kurven berechnet und wird als IC₅₀-Wert bezeichnet.
Screening-Test unter Verwendung des FVIIa-Bindungs-ELISA – Der oben beschriebene FVIIa-Bindungs-ELISA kann auch verwendet werden, um auf eine beliebige Verbindung zu screenen, die Peptide der vorliegenden Erfindung an der Bindung an FVIIa hindern würde. Dies könnte wie oben beschrieben durchgeführt werden oder wie nachstehend modifiziert werden. Ein Bindungskonkurrenztest zum Hochdurchsatzscreenen von chemischen Bibliotheken wurde entwickelt, um Inhibitoren von Peptidbindung zu identifizieren. Der Test wird in opak-weißen, hochbindenden Platten mit 384 Wells durchgeführt, die mit 1 μg/ml FVIIa überzogen und mit BSA blockiert sind. Die Probe, eine Kontrolle oder ein Testpuffer (20 μl) und ein biotinyliertes Peptid (z.B. TF183b oder andere hierin beschriebene Peptide, die wie beschrieben biotinyliert werden können) (20 μl) werden zu den einzelnen Wells zugesetzt, und die Platten werden 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Probe oder Kontrolle kann mit dem biotinyliertem Peptide um die Bindung an FVIIa auf der Platte konkurrieren. Das ungebundene biotinylierte Peptid wurde durch sechsmaliges Waschen der Platte entfernt, und 40 μl treptavidin-Europium werden zugesetzt. Während der darauf folgenden 30-minütigen Inkubation bindet das Streptavidin-Europium an das biotinylierte Peptid, das auf der Platte verbleibt. Nach sechsmaligem Waschen, um ungebundenes Streptavidin-Europium zu entfernen, werden 40 μl Verstärkerlösung den einzelnen Wells zugesetzt, um das Europium aus dem vorhandenen nichtfluoreszierenden Chelat zu lösen und dieses durch ein stark fluoreszierendes Chelat zu ersetzen. Die Fluoreszenz wird bei Anregung bei 340 nm und Emission bei 615 nm nach einer 100 μs langen Verzögerung auf einem Wallac-Victor-Mikrotiterplattenlesegerät abgelesen. Die vorliegende Erfindung Bindungshemmung wird in Bezug auf Kontrollen mit Testpuffern als Probe berechnet.
Ergebnisse
Polyvalente Peptidphagen die an TF-FVIIa binden – Polyvalente Peptidbibliotheken wurden in Bezug auf immobilisiertes TF-FVIIa in 3 Pools sortiert (als A, B und E bezeichnet). Polyvalentes Phagen-Display (Scott, J.K., und Smith, G.P., Science 249, 386–390 (1990); Lowman, H.B., Annu. Rev. Biophy. Biomol. Struct. 26, 401–424 (1997); Wells, J.A., und Lowman, H.B., Curr. Opin. Biotechnol. 3, 255–362 (1992)) wurde verwendet, um die Bindung durch Aviditätswirkung zu verstärken. Nach vier Selektions- und Amplifikationsdurchgängen war die Anreicherung in Pool A, d.h. die Anzahl an Phagen, die aus einem mit TF-FVIIa überzogenem Well eluiert wurde, dividiert durch die Anzahl an Phagen, die aus einem mit BSA überzogenem Well eluiert wurde, 10.000fach. Die DNA von sechs zufälligen Klonen aus jedem Pool wurde sequenziert. Die Klone aus Pool A waren alle Geschwister eines einzelnen Klons mit der abgeleiteten Peptidsequenz SAEWEBLCWTWEGCGSVGLV (Seq.-ID Nr. 1), die als TF53 bezeichnet wird. Phagen mit dieser Sequenz banden spezifisch an immobilisierten FVIIa oder TF-FVIIa, nicht aber an Wells, die entweder mit TF oder BSA überzogen waren. Außerdem band dieser Klon sowohl an kovalent als auch nichtkovalent an der aktiven Stellen blockierten TF-FVIIa, worin die aktive Stelle von FVIIa mit biotinlyiertem EGR-Chlormethylketon alkyliert oder durch TF7l-C, einem Kunitz-Domäne-Inhibitor (Dennis, M.S., und Lazarus, R.A., J. Biol. Chem. 269, 22129–22136 (1994)) blockiert war, was darauf hinweist, dass das Peptid an FVIIa band, aber an einer anderen Stelle als der aktiven Stelle – einer Exostelle.
Partielle Randomisierung – Die anfänglichen Peptidbibliotheken, die entworfen wurden, kodierten für eine potenzielle Diversität von mehr als 20²⁰ (10²⁶) verschiedenen Klonen, während die tatsächlichen Bibliotheken, die hergestellt wurden, nur etwa 10⁹ Klone enthielten, was einen sehr kleinen Teil der potenziellen Diversität darstellt. Um die Suche einzuengen und die Peptiddiversität innerhalb des Bereichs der anfangs ausgewählten Peptide doch weiter zu untersuchen, wurde ein partielles Randomisierungsverfahren eingesetzt. Dieses Verfahren erhält eine Tendenz zu den Wildtypsequenzen aufrechterhalten, während an jeder Aminosäureposition eine 50%ige Mu tationsrate (auf Aminosäureebene) eingeführt wird; somit würde ein Phagen-präsentiertes 10-Aminosäuren-Peptid zufällige Mutationen aufweisen. Außerdem führte die Annahme weiterer Affinitätsverbesserungen zur Konstruktion dieser Bibliotheken auf monovalenten Phagen durch Fusion an gIII, um die Aviditätswirkungen aufzuheben (Lowman, H.B., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401–424 (1997); Lowman, H.B., et al., Biochemistry 30, 10832–10838 (1991); Wells, J.A., und Lowman, H.B., Curr. Opin. Biotechnol. 3, 355–362 (1992)).
Eine monovalente partielle Randomisierungsbibliothek, die der TF53-Sequenz entspricht, wurde konstruiert und für vier Durchgänge auf TF-FVIIa sortiert. Eine 100.000fache Anreicherung wurde beobachtet. Wiederum wurden zufällige Klone ausgewählt und sequenziert; die abgeleiteten Peptidsequenzen sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengefasst.
Tabelle I Durch partielle Randomisierung selektierte Sequenzen

– Peptidsequenzen wurden von der DNA-Sequenz von Klonen abgeleitet, die nach 4 Selektionsdurchgängen erhalten wurden.
– Die Frequenz stellt die Häufigkeit der einzelnen Klone innerhalb der Gesamtzahl von Klonen dar, die aus dem Pool sequenziert wurden.
– Fett gedruckte Reste bezeichnen die Wildtypsequenz, die wie im Text beschrieben partiell randomisiert wurde.

Verschiedene Aminosäurepositionen in der TF53-Sequenz wurden zu 100 % beibehalten, wobei mehrere Codons an vielen dieser Positionen auftraten; Aminosäuren vom Wildtyp waren immer noch an jeder Position vorhanden, was den Bibliothekenaufbau widerspiegelt. Reste, die nach partieller Randomisierung stark beibehalten wurden, können entweder durch direkte Kontakte oder aufgrund von strukturellen Gründen entscheidend für die Bindung sein. Die große Variation der selektierten Sequenzen am C-Terminus weist darauf hin, dass diese Region eventuell weniger wichtig für die Bindung an TF-FVIIa ist.
Volle Reifung – Um die Affinitätsreifung zu vollenden, wurde eine dritte Bibliothekengruppe konstruiert, die Positionen fixierte, die zu 100 % konserviert wurden, und die restlichen Positionen vollkommen randomisierte. Außerdem wurde die Rolle von Resten behandelt, welche die Disulfidschleife flankierten, indem Bibliotheken konstruiert wurden, denen entweder Abschnitte des Amino- oder Carboxyl-Terminus oder von beiden fehlten. Somit wurden drei monovalente Bibliotheken konstruiert, die in Tabelle II beschrieben sind. In Durchgang vier wurde bei jeder Bibliothek eine 100.000fache Anreicherung beobachtet; die Sequenzen von zufälligen Klonen sind in Tabelle II angeführt. Obwohl diese Bibliotheken (mit 12 vollkommen randomisierten Aminosäurepositionen) bei weitem nicht komplett waren, zeigte ein Vergleich der drei Bibliotheken an den meisten Positionen eine klare Übereinstimmung in Bezug auf optimale Aminosäure.
Tabelle II Durch ausgewählte volle Randomisierung der A-Reihe selektierte Sequenzen

– Peptidsequenzen wurden von der DNA-Sequenz von Klonen abgeleitet, die nach 4 Selektionsdurchgängen erhalten wurden.
– Schattierte Reste bezeichnen die Wildtypsequenz, die fixiert wurde; unterstrichene Reste wurden wie im Text beschrieben voll randomisiert.
– "o" bedeutet keine Aminosäure.

Charakterisierung von Peptiden, die an TF-FVIIa binden – Um die Aktivität der Sequenzen zu bewerten, die aus den Phagen-präsentierten Bibliotheken selektiert wurden, wurden Peptide, die aus diesen Bibliotheken ausgewählten Sequenzen entsprachen, chemisch synthetisiert. Somit wurden das Peptid TF57 (SEEWEVLCWTWEDCRLEGLE) (Seq.-ID Nr. 2), das einem Klon von einem partiell randomisierten Phagen aus der Bibliothek A2 entsprach, und die Peptide TF100 (EEWEVLCWTWETCERGEG) (Seq.-ID Nr. 18) und TF183 (EEWEVLCWTWETCER) (Seq.-ID Nr. 23), die dem Consensus der voll gereiften Sequenz entsprachen, chemisch synthetisiert oder von in E. coli exprimierten Z-Fusionen gereinigt. Daten zu diesen Peptiden sowie zu der TF100Z-Fusion sind in den beiliegenden Abbildungen zusammengefasst.
Obwohl Peptide nur aufgrund ihrer Bindung an den TF-FVIIa-Komplex ausgewählt wurden, waren die Erfinder auch daran interessiert, funktionell relevante Peptide zu finden, d.h. Peptide, welche die TF-FVIIa-katalysierte Aktivierung von FX zu FXa in dosisabhängiger Weise hemmen würden; indem sie die Bindung und/oder den Umsatz von FX beeinträchtigen. Somit wurde diese auf ihre Fähigkeit getestet, FX-Aktivierung zu hemmen; die Hemmung von FX-Aktivierung durch ausgewählte Peptid ist in 1 zu sehen. Die Sequenzen der gewählten Peptide und die IC₅₀-Werte der Hemmung von FX-Aktivierung sind in 4 zu sehen. Viele der Peptide wurden wie erläutert als Peptid-Z-Fusionen getestet. Sequenzen von einem späteren Zeitpunkt des Reifungsprozesses waren wirksamer, was die Wirksamkeit dieses Verfahrens belegt.
Aufgrund ihrer Aktivität, FX-Aktivierung bei Verwendung von gereinigten Komponenten zu blockieren, waren die hierin beschriebenen Peptide wirksame Antikoagulanzien. Die Hemmung des TF-abhängigen extrinsischen Gerinnungsweges, gemessen durch die dosisabhängige Verlängerung der Prothrombinzeit (PT), ist in 2A zu sehen. Wichtig ist, dass die Erfinder keinerlei Beweise für eine Verlängerung der Gerinnungszeit im oberflächenabhängigen intrinsischen Weg finden konnten, bestimmt durch die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) (2B). Das lässt vermu ten, dass diese Peptide keine der Serinproteasen hemmt, die am intrinsischen Weg mitwirken, wozu Thrombin, FXa, FIXa, FXIa, Plasma-Kallikrein und FXIIa gehören.
FVIIa-Bindungs-ELISA – Die Fähigkeit von Peptiden, mit einer biotinylierten Version von TF183 (TF183b) (oder anderen hierin beschriebenen Peptiden, die wie beschrie ben biotinyliert werden können) um die Bindung an FVIIa konkurrieren können, wurde durch einen FVIIa-Bindungs-ELISA überwacht; die Hemmung der TF183-Bindung an FVIIa oder TF-FVIIa durch ausgewählte Peptide ist in 3 zu sehen. Die Sequenzen von gewählten Peptiden und die IC₅₀-Werte ihrer Hemmung der Bindung von TF183b an entweder FVIIa oder TF-FVIIa ist in 4 zu sehen. Der FVIIa-Bindungs-ELISA kann auch verwendet werden, um für Verbindungen zu screenen, die Peptide der vorliegenden Erfindung an der Bindung an FVIIa hindern würden. Dies könnte unter Verwendung verschiedener Reagenzien durchgeführt werden, um das biotinylierte Peptid zu detektieren. Außerdem könnten verschiedene hierin beschriebene Peptide verwendet werden, um die gleiche Art von Test zu entwickeln. Somit wurde ein Bindungskonkurrenztest zum Hochdurchsatzscreenen von chemischen Bibliotheken entwickelt, um Inhibitoren von Peptidbindung zu identifizieren.

Claims

Peptid, das i) die Sequenz Trp₁-Glu₁-Val-Leu-Cys₁-Trp₂-Thr₁-Trp₃-Glu₂-Thr₂-Cys₂-Glu₃-Arg (Seq.-ID Nr. 4) umfasst, ii) in einem In-vitro-Test mit Seq.-ID Nr. 4 um die Bindung von FVII/FVIIa konkurriert und von 1 bis 8 Aminosäuren von Seq.-ID Nr. 4 aufweist, die wie folgt substituiert sind: Trp₁ ist eine Aminosäure, die aus der aus Trp, Phe, Tyr, Leu, Ile, Met, Val und Ala bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Glu₁ ist eine beliebige Aminosäure; Val ist eine Aminosäure, die aus der aus Val, Trp, Phe, Tyr, Leu, Ile, Met und Ala bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Leu ist eine Aminosäure, die aus der aus Leu, Trp, Phe, Tyr, Ile, Met, Val und Ala bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Trp₂ ist eine Aminosäure, die aus der aus Trp, Phe, Tyr, Leu, Ile, Met, Val und Ala bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Thr₁ ist eine beliebige Aminosäure; Trp₃ ist eine Aminosäure, die aus der aus Trp, Phe, Tyr, Leu, Ile, Met, Val und Ala bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Glu₂ ist eine beliebige Aminosäure; Thr₂ ist eine beliebige Aminosäure; Glu₃ ist eine beliebige Aminosäure; Arg ist eine Aminosäure, die aus der aus Arg, Lys, Leu, Trp, His, Met und Ile bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und iii) das Peptid aus ii) umfasst.
Peptid nach Anspruch 1, das i) die Sequenz Trp₁-Glu₁-Val-Leu-Cys₁-Trp₂-Thr₁-Trp₃-Glu₂-Thr₂-Cys₂-Glu₃-Arg (Seq.-ID Nr. 4) umfasst, ii) in einem In-vitro-Test mit Seq.-ID Nr. 4 um die Bindung von FVII/FVIIa konkurriert und von 1 bis 8 Aminosäuren von Seq.-ID Nr. 4 aufweist, die wie folgt substituiert sind: Trp₁ ist eine Aminosäure, die aus der aus Trp, Phe und Leu bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Glu₁ ist eine beliebige Aminosäure; Val ist eine Aminosäure, die aus der aus Val und Ile bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Leu ist eine Aminosäure, die aus der aus Leu, Ile, Met, Val und Ala bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Trp₂ ist eine Aminosäure, die aus der aus Trp, Phe, Tyr, Leu, und Met bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Thr₁ ist eine beliebige Aminosäure; Trp₃ ist eine Aminosäure, die aus der aus Trp, Phe und Tyr bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Glu₂ ist eine beliebige Aminosäure; Thr₂ ist eine beliebige Aminosäure; Glu₃ ist eine beliebige Aminosäure; Arg ist eine Aminosäure, die aus der aus Arg, Lys, Leu und Trp bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und iii) das Peptid aus ii) umfasst.
Peptid nach Anspruch 2 mit einem IC₅₀ für FVII/FVIIa von weniger als 1 μM.
Peptid nach Anspruch 3 mit einem IC₅₀ für FVII/FVIIa von weniger als 100 nM.
Peptid nach Anspruch 4 mit einem IC₅₀ für FVII/FVIIa von weniger als 10 nM.
Peptid nach Anspruch 5, das FVII/FVIIa bindet und FVIIa-Aktivität hemmt.
Peptid nach Anspruch 6, das eine mit FVIIa zusammenhängende Aktivität blockiert, das aus der aus Aktivierung von FVII, Aktivierung von FIX und Aktivierung von FX bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Peptid nach Anspruch 7, das die Aktivierung von FX hemmt.
Peptid nach Anspruch 8 mit einem IC₅₀ zur Hemmung von FX-Aktivierung von weniger als 10 μM.
Peptid nach Anspruch 9 mit einem IC₅₀ zur Hemmung von FX-Aktivierung von weniger als 100 nM.
Peptid nach Anspruch 10 mit einem IC₅₀ zur Hemmung von FX-Aktivierung von weniger als 5 nM.
Peptid nach Anspruch 11 mit der folgenden Formel: X_i-Cys₁-X_j-Cys₂-X_k worin X_i nicht vorhanden ist oder 1 bis 100 Aminosäuren umfasst; X_j 5 Aminosäuren umfasst und X_k nicht vorhanden ist oder 1 bis 100 Aminosäuren umfasst.
Peptid nach Anspruch 12, worin X_i und X_k 1 bis 50 Aminosäuren umfassen.
Peptid nach Anspruch 13, worin X_i und X_k 1 bis 10 Aminosäuren umfassen.
Peptid nach Anspruch 14 mit der Formel Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Xaa₅-Xaa₆-Cys-Xaa₈-Xaa₉-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂-Cys-Xaa₁₄-Xaa₁₅-Xaa₁₆-Xaa₁₇-Xaa₁₈ worin Xaa₁ eine Aminosäure ist; Xaa₂ eine Aminosäure ist; Xaa₃ eine Aminosäure ist, die aus der aus Trp, Phe, Leu, Ala, Met und Val bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Xaa₄ eine Aminosäure ist; Xaa₅ eine Aminosäure ist, die aus der aus Val, Ile, Ala, Trp und Tyr bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Xaa₆ eine Aminosäure ist, die aus der aus Leu, Ile, Met, Val und Ala bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Xaa₈ eine Aminosäure ist, die aus der aus Trp, Phe, Leu, Met, Ala und Val bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Xaa₉ eine Aminosäure ist; Xaa₁₀ eine Aminosäure ist, die aus der aus Trp, Phe, Met und Tyr bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Xaa₁₁ eine Aminosäure ist; Xaa₁₂ eine Aminosäure ist; Xaa₁₄ eine Aminosäure mit Ausnahme von Prolin ist; Xaa₁₅ eine Aminosäure ist, die aus der aus Arg, Lys, Leu, Trp, His und Met bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Xaa₁₆ eine Aminosäure ist; Xaa₁₇ eine Aminosäure ist; und Xaa₁₈ eine Aminosäure ist.
Peptid nach Anspruch 15, worin Xaa₃ aus der aus Trp, Phe, Leu und Ala bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Xaa₅ aus der aus Val, Ile und Ala bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und Xaa₈ aus der aus Trp, Phe, Leu, Met und Ala bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Peptid nach Anspruch 16, worin Xaa₃ aus der aus Trp, Phe und Leu bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Xaa₅ aus der aus Val und Ile bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Xaa₆ aus der aus Leu, Ile, Met und Val bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Xaa₈ aus der aus Trp, Phe, Leu und Met bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Xaa₁₀ aus der aus Trp und Phe bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und Xaa₁₅ aus der aus Arg, Lys, Leu und Trp bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Peptid nach Anspruch 17, worin -Xaa₈-Xaa₉-Xaa₁₀-Xaa₁₁-Xaa₁₂- -Trp-Thr-Trp-Glu-Thr (Seq.-ID Nr. 100) ist.
In-vitro-Verfahren zur Hemmung von FVIIa-Aktivität, folgenden Schritt umfassend: a) Kontaktieren von FVIIa mit einem Peptid nach Anspruch 1 in Gegenwart eines Gewebefaktors und unter Bedingungen, welche die Bindung der Verbindung an FVIIa ermöglichen.
Verfahren zur Auswahl einer Verbindung, welche FVII/FVIIa-Aktivierung von FX blockiert, folgende Schritte umfassend: (1) Kontaktieren von FVII/FVIIa mit einer Verbindung nach Anspruch 1 in Gegenwart und Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls unter Bedingungen, welche die spezifische Bindung der Verbindung nach Anspruch 1 an FVII/FVIIa ermöglichen; (2) Detektieren des Ausmaßes an spezifischer Bindung der Verbindung nach Anspruch 1 an FVII/FVIIa, die in Gegenwart und Abwesenheit der Kandidatenverbin dung stattfindet, worin das Ausmaß der Bindung in Gegenwart der Kandidatenverbindung in Bezug auf das Ausmaß der Bindung in Abwesenheit des Kandidatenmoleküls ein Indikator für die Fähigkeit der Kandidatenverbindung ist, FVII/FVIIa-Aktivierung von FX zu blockieren.
In-vitro-Verfahren zur Hemmung der Aktivierung von FX, umfassend das Kontaktieren von FVII/FVIIa mit einer Verbindung, welche die Wechselwirkung von FVII/FVIIa mit einer Verbindung nach Anspruch 1 verhindert.
Verfahren zur Hemmung der Aktivierung von FX nach Anspruch 21, umfassend das Kontaktieren von FVII/FVIIa mit einer Verbindung, welche die Wechselwirkung von FVII/FVIIa mit Seq.-ID Nr. 4 verhindert.
Verfahren zur Behandlung einer durch TF/FVIIa vermittelten Krankheit oder Störung.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer durch TF/FVIIa vermittelten Krankheit in einem Wirt, der es benötigt, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Peptids nach Anspruch 1 an den Wirten.
Verwendung nach Anspruch 25, worin die durch TF/FVIIa vermittelte Krankheit oder Störung Gewebeschädigung in Zusammenhang mit Blutgerinnung ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 18 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Peptid nach Anspruch 27 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 28, die zum Inhalieren geeignet ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 29, die ein Trockenpulver ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 29, die eine Flüssigkeit ist.