DE4340798A1

DE4340798A1 - Thrombininhibitor aus Speichel von Protostomiern

Info

Publication number: DE4340798A1
Application number: DE19934340798
Authority: DE
Inventors: Bernard Dr Haendler; Christiane Dr Noeske-Jungblut
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1993-11-25
Filing date: 1993-11-25
Publication date: 1995-06-01

Description

Die Erfindung betrifft Proteine, die Thrombininhibitoren aus Speichel von Protostomiern sind.

Stand der Technik

Thrombin hat eine Schlüsselfunktion bei der Thrombusbildung in Blutgefäßen.

Es katalysiert die Spaltung von Fibrinogen zu Fibrin. Es führt zur Bildung von Blutgerinnseln. Weiterhin induziert es die Aggregation von Blutplättchen.

Das Enzym ist in der Pathogenese verschiedener Krankheiten, wie z. B. arteriel ler und venöser Thrombose oder Arteriosklerose, involviert.

Deshalb ist der Einsatz eines Thrombininhibitors zur Therapie von Thrombosen erfolgversprechend. Die wichtigsten bisher bekannten Thrombininhibitoren sind Antithrombin III-Heparin und Hirudin. Antithrombin III ist ein im Plasma vorkommendes Protein mit einem Molekulargewicht von 58 kDa. Antithrombin III bindet zuerst an Heparin, das ein Polysaccharid ist. Dann bindet der Antithrombin III-Heparin-Komplex an Thrombin und inhibiert dieses Throm bin. Es entsteht ein sehr stabiler Komplex aus Thrombin und Antithrombin III und Antithrombin III wird von Thrombin gespalten. Neben Thrombin hemmt Antithrombin III auch andere Serinproteasen wie z. B. Faktor Xa (Pratt,C.W. und Church, F.C. (1991) "Antithrombin: Structure and Function", Seminars in Hema tology 28 : 3-9).

Aus dem Blutegel Hirudo medicinalis wurde das Protein Hirudin isoliert. Es hat ein Molekulargewicht von etwa 7 kDa und bindet über ionische Wechselwirkung an das Thrombin. Es ist spezifisch für Thrombin (Johnson, P.H. et al. (1989) "Biochemistry and Genetic engineering of hirudin", Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15 : 302-315).

Beschreibung der Erfindung

Neben den zuvor erwähnten Thrombininhibitoren, die zum Stand der Technik zählen, sind weitere Inhibitoren notwendig, die einen anderen Wirkmechanis mus, oder eine gesteigerte Aktivität besitzen.

Die Erfindung liefert natürliche oder synthetisch herstellbare Proteine, die Thrombininhibitoren sind und aus dem Speichel von Insekten, die Säugetierblut saugen, isolierbar sind.

Bevorzugt sind erfindungsgemäße Proteine, die aus der Raubwanze Triatoma pallidipennis isolierbar sind.

Die erfindungsgemäßen Proteine können natürlichen Ursprungs sein. Die Proteine werden gewonnen, indem der Speichel gereinigt wird. Ebenfalls ist es möglich, die Proteine aus den Speicheldrüsen zu isolieren oder die das Protein synthetisierenden Zellen aus der Speicheldrüse zu nehmen und in Kultur zu halten. Die von dieser Zellkultur produzierten Überstände werden geerntet und aufgearbeitet. Der Zellüberstand wird gereinigt und die erfin dungsgemäßen Proteine isoliert und angereichert. Alle Anreicherungsstufen der Isolierung und der Reinigung sind Teil der Erfindung. Bevorzugt sind die Anreicherungsstufen der Isolierung und Reinigung, bei denen die erfindungs gemäßen Proteine zu pharmazeutischen Zwecken verwendet werden können.

So werden Reinigungen von 50% des Thrombininhibitors bezogen auf das Ge samtprotein erzielt, bevorzugt sind 85%, mehr bevorzugt 95% und am meisten bevorzugt 99% des Thrombininhibitors bezogen auf das Gesamtprotein.

Die Erfindung umfaßt nicht allein die Proteine, die von Triatoma pallidipennis isolierbar sind, sondern auch Proteine, die von anderen Insektenarten syntheti siert werden können. So sind neben den Proteine, die von Triatoma pallidi pennis isolierbar sind, die zur Gruppe der bevorzugtesten zählen, weitere Pro teine bevorzugt, die von Triatoma infestans, Triatoma dimidiata, Triatoma maculata, Rhodnius prolixus, Panstrongylus megistus und Panstrongylus infestans stammen.

Ebenso ist es möglich, die erfindungsgemäßen Proteine synthetisch herzustel len. Dazu zählt die Proteinsynthese nach J.M. SEWART and J.D. YOUNG, San Franzisco, 1969 and J. MEIENHOFER, Hormonal Proteins and Peptides Vol. 2 p 46, Academic Press (New York), 1973 und E. SCHODER and K. LUBKE, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York) 1965. Zu den syn thetisch hergestellten Proteinen zählen auch die rekombinanten Proteine, die nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Je nach Wirtsorganismus kön nen die erfindungsgemäßen Proteine glykosyliert oder, wenn sie in Prokaryon ten synthetisiert werden, unglykosyliert sein.

Die Funktion der Inhibitoren ist in verschiedenen Testsystemen zu ermitteln. In den Beispielen 2 bis 4 und 9 sind gängige Testverfahren beschrieben.

Die erfindungsgemäßen Proteine sind in dem Speichel von Insekten, die Säu getierblut saugen, festzustellen. Diese Proteine werden üblicherweise von Zellen der Speicheldrüsen synthetisiert. Daher können die Proteine aus dem Speichel isoliert werden. Die erfindungsgemäßen Proteine sind nicht auf diese Herstellungsweise und Isolierung beschränkt. Vielmehr sind alle synthetisch hergestellten, erfindungsgemäßen Thrombininhibitoren mitumfaßt, die sich in dem Speichel nachweisen und daraus isolieren lassen.

N-Terminale Sequenzen des reifen Proteins

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein natürliches oder synthetisch herstellbares Protein, das ein Thrombininhibitor ist und aus dem Speichel von Insekten, die Säugetierblut saugen, bevorzugt aus Triatoma pallidipennis, isolierbar ist,

a) wobei das Protein als aktives Protein eine N-terminale Sequenz wie folgt besitzt: oder
b) wobei das Protein als aktives Protein allelische Modifikationen der zuvor unter a) genannten N-terminalen Aminosäure-Sequenz aufweist, wobei eine oder zwei Aminosäuren der N-terminalen Aminosäure-Se quenz substituiert, deletiert oder insertiert sind, ohne dabei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen, oder
c) wobei das Protein als aktives Protein posttranslationale Modifika tionen der N-terminalen Sequenzen unter a) und b) aufweist, die nicht wesentlich die Aktivität des aktiven Proteins beeinflussen.

Sequenzen der reifen Proteine

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Protein, das ein Thrombininhibitor ist und

d) das als aktives reifes Protein eine der folgenden Sequenzen besitzt:
- i) Sequence Identifer No. 1 (Sequenz Protokoll Nr. 1);
- ii) Sequence Identifer No. 2 (Sequenz Protokoll Nr. 2);
- iii) Sequence Identifer No. 3 (Sequenz Protokoll Nr. 3) und
- iv) Sequence Identifer No. 4 (Sequenz Protokoll Nr. 4); oder
e) das als aktives reifes Protein allelische Modifikationen einer der zuvor unter d) genannten Aminosäure-Sequenzen aufweist, wobei wenigstens eine Aminosäure der Aminosäure-Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert ist, ohne dabei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen, oder
f) das als aktives reifes Protein posttranslationale Modifikationen einer der Sequenzen unter d) und e) aufweist, die nicht wesentlich die Aktivität des akti ven Proteins beeinflussen.

Alle allelischen Modifikationen, die die Substitutionen, die Deletionen und/oder die Insertionen von bis zu 30 Aminosäuren umfassen, gehören zur Gruppe der erfindungsgemäßen Proteine. Bevorzugt sind Deletionen, Substitutionen und/oder Insertionen von bis zu 20 Aminosäuren, mehr bevorzugt von bis zu 10 Aminosäuren, am meisten bevorzugt sind die Deletionen, Substitutionen und/oder Insertionen von einer, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht oder neun Aminosäuren.

Sequenzen der reifen Proteine mit Signalsequenz

Eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Proteine bestehen in einem Protein, das aus einer Signalsequenz und einem reifen erfindungsge mäßen Protein besteht,

g) wobei das Protein eine der folgenden Sequenzen besitzt:
- i) Sequence Identifier No. 5 (Sequenz Protokoll Nr. 5);
- ii) Sequence Identifier No. 6 (Sequenz Protokoll Nr. 6);
- iii) Sequence Identifier No. 7 (Sequenz Protokoll Nr. 7) und
- iv) Sequence Identifier No. 8 (Sequenz Protokoll Nr. 8); oder
h) wobei das Protein allelische Modifikationen einer der zuvor unter g) ge nannten Aminosäure-Sequenzen aufweist, wobei wenigstens eine Aminosäure der Aminosäure-Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert ist, ohne dabei die Aktivität des reifen aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen, oder
i) wobei das Protein posttranslationale Modifikationen einer der Sequenzen unter g) und h) aufweist, die nicht wesentlich die Aktivität des aktiven reifen Proteins beeinflussen.

Alle allelischen Modifikationen, die die Substitutionen, die Deletionen und/oder die Insertionen von bis zu 32 Aminosäuren umfassen, gehören zur Gruppe der erfindungsgemäßen Proteine. Bevorzugt sind Deletionen, Substitutionen und/oder Insertionen von bis zu 21 Aminosäuren, mehr bevorzugt von bis zu 11 Aminosäuren, am meisten bevorzugt sind die Deletionen, Substitutionen und/oder Insertionen von einer, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht oder neun Aminosäuren.

Am meisten bevorzugt sind erfindungsgemäße Proteine, die rekombinante Proteine sind. Dabei können die Proteine glykosyliert sein.

Die erfindungsgemäßen Proteine umfassen die reifen Proteine und die ent sprechenden Vorläuferproteine, welche sich aus einer "Signal-Sequence" (Signal-Sequenz) und der Sequenz des reifen Proteins zusammensetzen. Da bei geht die "Signal-Sequenz" der Sequenz des reifen Proteins voraus. Das reife Protein beginnt mit der zuvor genannten N-terminalen Sequenz unter Punkt a). Die "Signal-Sequenz" ist für die Durchdringung des endoplasmati schen Retikulums erforderlich.

cDNA oder DNA kodierend für die erfindungsgemäßen Proteine

Die Erfindung umfaßt weiterhin auch cDNA oder DNA, die einen reifen Throm bininhibitor kodiert,

aa) wobei die cDNA oder DNA eine der folgenden Aminosäure-Sequenzen kodiert:
- i) Sequence Identifier No. 1 (Sequenz Protokoll Nr. 1);
- ii) Sequence Identifier No. 2 (Sequenz Protokoll Nr. 2);
- iii) Sequence Identifier No. 3 (Sequenz Protokoll Nr. 3) und
- iv) Sequence Identifier No. 4 (Sequenz Protokoll Nr. 4), oder
bb) wobei die cDNA oder DNA allelische Modifikationen einer der Ami nosäure-Sequenzen unter aa) kodiert, worin wenigstens eine Aminosäure der Aminosäure-Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert ist, ohne dabei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen.

Die allelischen Modifikationen sind zuvor unter dem Punkt "Sequenzen der reifen Proteine" definiert worden.

Weiterhin umfaßt die Erfindung eine cDNA oder DNA, die einen Thrombininhibi tor kodiert,

cc) wobei die cDNA oder DNA eine der folgenden Nukleotidsequenzen be sitzt:
- i) Sequence Identifier No. 9 (Sequenz Protokoll Nr. 9);
- ii) Sequence Identifier No. 10 (Sequenz Protokoll Nr. 10);
- iii) Sequence Identifier No. 11 (Sequenz Protokoll Nr. 11) und
- iv) Sequence Identifier No. 12 (Sequenz Protokoll Nr. 12), oder
dd) wobei die cDNA oder DNA eine allelische Modifikation einer der Nukleo tidsequenzen unter cc) aufweist, wobei wenigstens ein Nukleotid substituiert, deletiert oder insertiert ist, ohne dabei die Aktivität des Proteins, das von der allelischen Modifikation der Nukleotidsequenz unter cc) kodiert wird, wesentlich zu beeinflussen.

Alle DNA-Konstrukte zählen auch dann zu den aufgezählten erfindungsge mäßen Sequenzen, wenn solche Nukleotide ausgetauscht werden, die aufgrund des degenerierten Kodes dieselbe Aminosäure kodieren. Der Austausch der artiger Nukleotide ist offensichtlich und die sich entsprechenden Aminosäuren sind in jedem Biochemielehrbuch offenbart. (R. KNIPPERS, 1982, 3. Auflage, Molekulare Genetik, Georg Thieme Verlag).

Alle allelischen Modifikationen, die zu einer Veränderung der Aminosäure-Se quenz führen, gehören zur Erfindung, sofern diese Modifikationen die Substitu tionen, die Deletionen und/oder die Insertionen von bis zu 30 Aminosäuren umfassen. Bevorzugt sind Deletionen, Substitutionen und/oder Insertionen von bis zu 20 Aminosäuren, mehr bevorzugt von bis zu 10 Aminosäuren, am meisten bevorzugt sind die Deletionen, Substitutionen und/oder Insertionen von einer, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht oder neun Aminosäuren.

Weiterhin umfaßt die Erfindung auch ein genetisches Material, das neben der das reife Protein kodierenden Sequenz ebenfalls auch eine Signalsequenz ent hält. Diese Signalsequenz ist in der cDNA-Bank gefunden worden, auch ande re Signalsequenzen sind denkbar, die eine Expression und Sekretion des Pro teins erlauben.

Somit umfaßt die Erfindung eine cDNA oder DNA, die einen Thrombininhibitor mit Signalsequenz kodiert,

ee) wobei die cDNA oder DNA eine der folgenden Nukleotidsequenzen be sitzt:
- i) Sequence Identifier No. 13 (Sequenz Protokoll Nr. 13);
- ii) Sequence Identifier No. 14 (Sequenz Protokoll Nr. 14);
- iii) Sequence Identifier No. 15 (Sequenz Protokoll Nr. 15) und
- iv) Sequence Identifier No. 16 (Sequenz Protokoll Nr. 16), oder
ff) wobei die cDNA oder DNA eine allelische Modifikation einer der Nukleo tidsequenzen unter ee) aufweist, wobei wenigstens ein Nukleotid substituiert, deletiert oder insertiert ist, ohne dabei die Aktivität des reifen Proteins, das ein schießlich seiner Signalsequenz von der allelischen Modifikation der Nukleotid sequenz unter ee) kodiert wird, wesentlich zu beeinflussen.

Die allelischen Modifikationen sind zuvor unter dd) definiert worden.

Wenn die Aktivität des Proteins angegeben wird, um festzustellen, ob die alleli sche Modifikation unter die Gruppe der erfindungsgemäßen Proteine zählt, so ist immer das reife Protein zu messen, auch wenn die Signalsequenz ebenfalls angeführt ist. Sollte die Signalsequenz angegeben sein, so ist die Funktion immer an dem Protein zu messen, daß nach Entfernen der Signalsequenz er halten wird.

Weiterhin umfaßt die Erfindung Bindungsmoleküle (zum Beispiel Peptide oder deren Derivate), Einzelketten-Proteine (Single Chain Proteins), Antikörper oder Fragmente der Antikörper, die Domänen auf dem reifen, erfindungsgemäßen Protein spezifisch erkennen. Wenn das gereinigte erfindungsgemäße Protein vorliegt, ist es für den Fachmann leicht möglich, monoklonale Antikörper herzu stellen. Dabei wird die bekannte Methode von Köhler und Milstein und deren Weiterführungen angewendet. Dabei wird im einzelnen in konventioneller Me thode eine Maus mit dem gereinigten Protein mehrfach immunisiert, die Milz zellen entnommen und mit geeigneten Tumorzellen fusioniert. Die Hybride werden anschließend selektioniert.

Die Proteine der Erfindung können aus dem Speichel der Raubwanze Triatoma pallidipennis isoliert werden. Die Reinigung erfolgt durch eine Gelfiltration und eine anschließende Affinitätschromatographie an Thrombin-Sepharose (siehe Beispiel 1). Die Proteine haben die zuvor beschriebenen Aminosäure-Sequen zen. Sie haben ein Molekulargewicht von ca. 18000 ± 3000 Da (siehe Bei spiel 6). Der isoelektrische Punkt liegt im Bereich von pH 4,5 bis 5,2, wenn die im Beispiel 8 beschriebene Methode angewendet wird.

Die Proteine der Erfindung hemmen die Wirkung von Thrombin bei der Blutge rinnung und bei der Aktivierung von Plättchen und im amidolytischen Test. Die Test-Systeme sind in den Beispielen 2, 3, 4 und 9 beschrieben. Die Pro teine hemmen die Gerinnung in einer Konzentration von 8 nmol/l bei einer Thrombinkonzentration von 1,27 nmol/l. Sie hemmen die Thrombin-induzierte Plättchen-Aggregation zu 100% in einer Konzentration von 15 ng/ml. Diese Konzentration entspricht bei einer eingesetzten Thrombinkonzentration von 0,06 lU/ml = 0,812 pmol/ml (lU = Internationale Einheiten) einem molaren Verhältnis von Thrombin zum erfindungsgemäßen Protein von etwa 1 : 1. Da gegen hemmen die Proteine der Erfindung die Aktivität von Thrombin im amidolytischen Test bei einem Verhältnis von Thrombin zum erfindungsge mäßen Protein von 1 : 87 nur zu etwa 50%. Die Proteine der Erfindung verlän gern in einer Konzentration von 35 nmol/l die Thrombin-Zeit (1 lU/ml) um das 5- fache.

Die Proteine der Erfindung sind spezifisch für Thrombin. Andere Serinprotea sen (z. B. Faktor Xa oder Trypsin) werden auch bei einem 40-fachen Überschuß nicht nachweislich gehemmt (s. Beispiel 7).

Vektoren mit der erfindungsgemäßen DNA

Ein weiterer Teil der Erfindung ist ein Vektor, der eine erfindungsgemäße cDNA oder DNA, weiterhin einen passenden Promotor und gegebenenfalls einen pas senden Enhancer enthält. Ebenfalls kann auch noch eine "Signal-Sequenz" umfaßt sein. Vektoren sind ausführlich in den europäischen Publikationen EP 0 480 651, EP 0 462 632 und EP 0 173 177 beschrieben.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in einer eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszelle, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist.

Allelische Modifikationen

Die meisten Deletionen, Insertionen und Substitutionen scheinen keine durch greifende Änderung in der Charakteristik des Proteins der Erfindung zur Folge zu haben. Da es schwer ist, den genauen Effekt einer Substitution, einer Deletion oder einer Insertion im voraus anzugeben, muß die Funktion des ver änderten Proteins mit der Funktion des erfindungsgemäßen Proteins verglichen werden. Die hierfür zu verwendenden Methoden sind beispielhaft in den Beispielen 2 bis 4 und 9 angegeben. Als Standard dient das Protein gemäß der Seq. ld. No. 1 bis 4, ebenfalls auch das Protein, das nach Beispiel 1 gerei nigt wird, und auch die Reinigungsmethode des Beispiels 1 für das Vergleichs protein.

Der genetische Code ist degeneriert, das bedeutet, daß die meisten Aminosäu ren von mehr als einem Codon aus drei Nukleotiden kodiert werden. Daher führen einige allelische Modifikationen auf der Ebene der Nukleotide nicht zu einer Änderung der Aminosäure-Sequenz. Daher ereignen sich allelische Modifikationen vornehmlich auf der Ebene der DNA und können sich sekundär auf die Aminosäure-Sequenz auswirken.

Die cDNA- oder DNA-Sequenzen, die die erfindungsgemäßen Proteine kodie ren, können gemäß konventioneller Techniken modifiziert werden, um Varianten der erfindungsgemäßen Proteine herzustellen, die im wesentlichen die gleiche Aktivität wie die beschriebenen und charakterisierten Proteine der Erfindung besitzen. Dabei wird die Aktivität so gemessen, wie es in den Beispielen 2 bis 4 und 9 beschrieben ist.

Aminosäuren können wie in der Tabelle 1 dargestellt substituiert werden, ohne dabei die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinflussen. In jedem einzel nen Fall ist durch den Aktivitätstest zu entscheiden, welchen Einfluß die Verän derung auf die Funktion des Proteins hat.

Übliche Substituierung von Aminosäuren in einem Protein
Ursprüngliche Aminosäure
Beispielsweise vorgenommene Substituierung
Ala
Gly, Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala, Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gln, Glu
Met	Leu, Tyr, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

Die Funktionen oder die immunologische Identität werden wesentlich verän dert, wenn Substituenten gewählt werden, die bei der Substituierung weniger konservativ als die in Tabelle 1 gezeigten Aminosäuren sind. Derartige we sentliche Veränderungen lassen sich durch Substituierungen mit Aminosäuren erzielen, die sich mehr in ihrer Struktur und in den funktionellen Gruppen unterscheiden. Wesentliche Veränderungen wirken sich dahingehend aus, daß die dreidimensionale Struktur verändert wird und/oder daß zum Beispiel die Faltblatt-Struktur oder die helikale Struktur beeinflußt wird. Auch Wech selwirkungen der Ladungen und der hydrophoben Ketten sind bei den Ver änderungen zu beachten.

Die Mutationen werden durch die Homologie (Similarity) zweier zum Vergleich anstehender Proteine definiert. Der Ausdruck Homologie umfaßt ähnliche Aminosäuren (zum Beispiel Tabelle 1) und Lücken in den Sequenzen der Ami nosäuren (Homologie = similarity). Die erfindungsgemäßen Proteine haben Aminosäure-Sequenzen, die eine Homologie von wenigstens 80%, bevorzugt 90%, mehr bevorzugt 95% und am meisten bevorzugt 98% der erfindungs gemäßen Strukturen besitzt, wie sie durch die Sequenzen unter d) oder g) (Seq. ld. No. 1 bis 8) definiert sind und wie sie weiterhin nach der Reinigung gemäß Beispiel 1 erhalten werden.

Wie zuvor erwähnt, umfaßt die Erfindung auch Modifikationen der DNA oder cDNA. Diese modifizierten Sequenzen hybridisieren unter stringenten Bedin gungen mit den DNA-Sequenzen, die die erfindungsgemäßen Proteine kodieren (siehe Sequenzen unter aa); cc) und ee)). Die cDNA- oder DNA-Sequenzen haben Nukleotid-Sequenzen, die eine Identität einschließlich kurzer (bis 15 Nukleotide) Deletionen und Insertionen von wenigstens 70%, bevorzugt 82%, mehr bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt von 95% mit den erfindungs gemäßen cDNA- oder DNA-Sequenzen besitzen (siehe aa), cc) und ee)). Die Identität einschließlich der kurzen (bis 15 Nukleotide) Deletionen und Insertio nen kann durch eine Hybridisierung gemessen werden, wie sie in R. KNIPPERS, Molekulare Genetik, 1982, dritte Auflage, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York beschrieben ist.

Posttranslationale Modifikationen

Unter den zuvor erwähnten posttranslationalen Modifikationen versteht man Veränderungen, die während oder nach der Translation auftreten. Hierzu zählen die Glykosylierung, die Ausbildung von Disulfid-Brücken, die chemische Modifikationen der Aminosäuren, so zum Beispiel die Sulfatierung, die im Zu sammenhang mit dem Hirudin beschrieben ist. (J.W. FENTON (1989) "Thrombin Interactions with Hirudin", Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15 : 265-268).

Die Glykosylierung ist eine wesentliche Funktion des endoplasmatischen Reti kulums und/oder des Golgi-Apparates. Die Sequenz und die Verästelung der Oligosaccharide wird in dem endoplasmatischem Retikulum gebildet und in dem Golgi-Apparat verändert. Die Oligosaccharide können N-verknüpfte Oligo saccharide (Asparagin-verknüpfte) oder O-verknüpfte Oligosaccharide (Serin-, Threonin- oder Hydroxylysin-verknüpfte) sein. Die Form der Glykosylierung ist von dem produzierenden Zelltyp und von der Art abhängig, von der der ent sprechende Zelltyp stammt. Das Ausmaß und die Art der Glykosylierung kann durch Substanzen beeinflußt werden, wie es in der europäischen Publikation EP 0 222 313 beschrieben ist. Die Variierung der Glykosylierung kann die Funktion des Proteins verändern.

Proteine bilden häufig kovalente Bindungen innerhalb der Ketten aus. Diese Disulfid-Brücken werden zwischen zwei Cysteinen hergestellt. Dabei wird das Protein spezifisch gefaltet. Die Disulfid-Brücken stabilisieren die dreidimensio nale Struktur der Proteine.

Weiterhin können die Aminosäuren so verändert werden, wie es in der inter nationalen Publikation WO 91/10684 beschrieben ist. Ebenfalls kann das Protein sulfatiert sein. Diese Veränderung ist im Zusammenhang mit Hirudin beschrieben.

Isolierung und Herstellung der erfindungsgemäßen Proteine

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der erfindungs gemäßen Proteine mit den folgenden Schritten:
Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem Vektor transformiert ist, welcher eine erfindungsgemäße cDNA oder DNA enthält,
und
Isolieren und Reinigen des oder der Proteine.

Die Proteine werden bevorzugt gemäß Beispiel 1 gereinigt. Jedoch sind auch andere Isolierungs- und Reinigungs-Methoden möglich:
Methods of Enzymology, Volume 182: Guide to Protein Purification, ed. Murray P. DEUTSCHER, Academic Press, 1990;
Protein Purification Application - A Practical Approach, ed. E.L.V. HARRIS and S. ANGEL, IRL-Press 1990;
Protein Purification, Principles and Practice, Ropert SCOPES, Springer- Verlag 1982; and
Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applica tions, ed. H.-C. JANSON and L. RYDEN, VCH publishers 1989.

Die Erfindung umfaßt ebenfalls ein Verfahren zur Reinigung erfindungsgemäßer Proteine, wobei die Proteine isoliert, über wenigstens eine Säule gereinigt und anschließend eingeengt werden. Bevorzugt sind Chromatographie-Säulen oder Adsorptionschromatographie-Säulen.

Die Erfindung umfaßt darüber hinaus ein Verfahren zur Reinigung von erfin dungsgemäßen Proteinen, wobei das Verfahren aus folgenden Schritten be steht:
Auftragen des Speichels auf eine "Superose 12 HR-Säule" und Eluieren und
erneute Auftragung auf einer CH-aktivierten Sepharose-Säule, an der zuvor Thrombin gekoppelt wurde, und Eluieren.

Die Reinigung ist ausführlich im Beispiel 1 beschrieben.

Verwendung als Arzneimittel

Die Proteine gemäß der Erfindung besitzen pharmakologische Effekte und sind deshalb als pharmazeutische Wirkstoffe verwendbar. Die Erfindung umfaßt ebenfalls ein Arzneimittel, das eines der erfindungsgemäßen Proteine oder ein Gemisch davon enthält. Weiterhin gehört zur Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eines der erfindungsgemäßen Proteine oder ein Ge misch erfindungsgemäßer Proteine enthält, in Gegenwart von pharmazeutisch verträglichen und annehmbaren Verbindungen und Trägern. Ebenfalls umfaßt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eines der pharmazeutisch aktiven, erfindungsgemäßen Proteine oder deren Gemisch und ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder einen pharmazeutisch verträgli chen Träger enthält.

Insbesondere zeigen die erfindungsgemäßen Proteine gemäß der Sequenz- Protokolle Nr. 1 bis 4 eine Inhibierung der Thrombinaktivität.

Die Inhibierung der Thrombinaktivität kann im Gerinnungstest (siehe Beispiel 2), im Blutplättchen-Aggregationstest (siehe Beispiel 3), im amidolytischen Test (siehe Beispiel 4) und durch Messen der Thrombin-Zeit (siehe Beispiel 9) nach gewiesen werden. Die Messung der Thrombin-Zeit ist das bevorzugte Test system.

Die erfindungsgemäßen Proteine zeigen eine Verlängerung der Thrombinzeit bei Konzentrationen von 10 bis 60 nmol/l (Thrombinkonzentration 1 lU / ml). Bei einer Konzentration von 58 nmol/l erfolgt eine 9-fache Verlängerung. Höhere Konzentrationen sind anwendbar, ohne das Testsystem zu stören. Somit sind die erfindungsgemäßen Proteine in Konzentrationen von 10 bis 200 nmol/l einsetzbar.

Die Versuchsergebnisse dieses in vitro Testes zeigen, daß die erfindungsge mäßen Proteine als Arzneimittel oder zur medizinischen Behandlung verwendet werden können. Diese Versuchsergebnisse lassen sich von dem in vitro Testsystem auf ein in vivo System übertragen, da es sich bei dem Gerin nungstest um eine etablierte Versuchsanordnung handelt. (M. TALBOT (1989) "Biology of Recombinant Hirudin, A New Prospect in the Treatment of Throm bosis" Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15 : 293-301). Die Proteine der Erfindung können deshalb zur Behandlung und Prävention von Thrombo sen, instabiler Angina oder Arteriosklerose, oder zur Prävention eines Wieder verschlusses von Gefäßen nach PTCA/PTA (Angioplastie mit einem Ballon katheter) oder zur Verhinderung der Blutgerinnung bei der Hämodialyse dienen.

Die Proteine der Erfindung können als ein antithrombotisches und/oder anti arteriosklerotisches Medikament bei Säugern, insbesondere Menschen, zur Behandlung von thrombotischen und/oder arteriosklerotischen Beschwerden eingesetzt werden. Diese können beim Reißen von arteriosklerotischen Aggregationen (Plaques), bei Zerstörung von Endothelgewebe, wie zum Bei spiel bei Sepsis, bei Transplantaten oder bei instabiler Angina, auftreten. Sie können ebenfalls verwendet werden, um erneute Verschlüsse nach der Be handlung von myokardialen Infarkten und/oder bei Fibrinolyse oder Angioplastie zu vermeiden. Dabei kann das Protein der Erfindung vor, bei und/oder nach der Einführung des Katheters verabreicht werden.

Die Erfindung liefert weiterhin

(i) die Verwendung eines der erfindungsgemäßen Proteine oder deren Gemisch zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Thrombosen, instabiler Angina oder Arteriosklerose, oder zur Präven tion eines Wiederverschlusses von Gefäßen nach PTCA/PTA oder zur Verhinderung der Blutgerinnung bei der Hämodialyse;
(ii) ein Verfahren zur Behandlung von Thrombosen, instabiler Angina oder Arteriosklerose, oder zur Prävention eines Wiederverschlusses von Gefäßen nach PTCA/PTA oder Throm bolyse oder zur Verhinderung der Blutgerinnung bei der Hämodialyse, welches Verfahren eine Verabreichung einer Proteinmenge gemäß der Erfindung umfaßt, wobei die Menge die Krankheit unterdrückt, und wobei die Proteinmenge einem Patienten gegeben wird, der ein solches Medi kament benötigt;
(iii) eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Thrombosen, instabiler Angina oder Arteriosklerose, oder zur Prävention eines Wiederverschlusses von Gefäßen nach PTCA/PTA oder Throm bolyse oder zur Verhinderung der Blutgerinnung bei der Hämodialyse, welche Behandlung eines der erfindungsgemäßen Proteine oder deren Gemisch und wenigstens einen pharmazeutisch verträglichen Träger und Zusatz umfaßt.

Für diese therapeutische Wirkung sind unterschiedliche Dosen geeignet. Sie hängen beispielsweise von dem verwendeten Protein, von dem Wirt, von der Art der Verabreichung und von der Art und der Schwere der zu behandelnden Zustände ab.

Im allgemeinen sind jedoch bei Tieren zufriedenstellende Resultate zu erwar ten, wenn die täglichen Dosen einen Bereich von 2 µg bis 2000 µg pro kg Kör pergewicht umfassen. Bei größeren Säugetieren, beispielsweise dem Menschen, liegt eine empfohlenen tägliche Dosis im Bereich von 2 bis 2000 µg pro kg Körpergewicht, wenn das nach Beispiel 1 gereinigte Protein verwendet wird. Zum Beispiel wird diese Dosis zweckmäßigerweise in Teildosen bis zu viermal täglich verabreicht. Die täglichen Dosen bei der kurzzeitigen Behand lung von akuten Thromben können mit 20 bis 2000 µg pro kg Körpergewicht höher als die Dosen bei der chronischen Behandlung mit 2 bis 200 µg pro kg Körpergewicht ausfallen.

Ebenfalls sind zufriedenstellende Resultate zu erwarten, wenn das Protein der Erfindung subkutan verabreicht wird. Bevorzugt ist die gezielte Injektion in den Teil des Körpers, in dem sich Thromben gebildet haben.

Die erfindungsgemäßen Proteine können auf jedem üblichen Weg verabreicht werden, insbesondere in Form von Injektionslösungen oder Suspensionen.

Die vorliegende Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, die eines der erfindungsgemäßen Proteine oder deren Gemisch und wenigstens einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Zusatz um fassen. Solche Zusammensetzungen können nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Dabei ist auf Remington′s Pharmaceutical Science, 15^th ed Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980) hinzuweisen.

Die Versuchsergebnisse werden anhand der Figuren verdeutlicht, die im einzel nen folgendes zeigen:

Fig. 1 Verlängerung der Thrombin-Zeit bei Zugabe von erfindungsge mäßem Protein aus Triatoma pallidipennis.

Fig. 2 Inhibierung der Thrombinaktivität im amidolytischen Test (Triatoma = Trombininhibitor aus Triatoma pallidipennis)

Fig. 3 Inhibierung der Thrombinaktivität im Gerinnungstest.

Beispiele Beispiel 1 Gewinnung des Speichels von Triatoma pallidipennis und Reinigung des Proteins der Erfindung

Die Raubwanzen werden durch mechanische Stimulation ihrer Probszis zur Ab sonderung ihres Speichels angeregt. Der Speichel wird auf einer Glasplatte aufgefangen und mit einer silikonisierten, ausgezogenen Pasteurpipette ge sammelt.

Der Speichel wird gefriergetrocknet und in einer Konzentration von 2,5 mg/ml in destilliertem Wasser gelöst. 2 ml dieser Lösung werden über eine "Superose 12 HR 16/50"-Säule (Pharmacia) in 10 mmol/l Tris/HCl, pH 7,4, 0,0001% "Pluronic F68" gelfiltriert. Die im Gerinnungstest (siehe Beispiel 2) aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf eine CH-aktivierte Sepharose (Pharmacia), an die zuvor Thrombin nach den Angaben des Herstellers gekoppelt wurde, aufgetragen. Das Protein der Erfindung bindet an diese mit Thrombin ver sehenen Säule. Zunächst wird die Säule mit Tyrode-Puffer (ohne Serum albumin) gewaschen, dann wird erst mit 10 mmol/l Na-Acetat, pH 4,5, und dann mit 10 mmol/l Glycin, pH 2,5, eluiert. In den Eluaten wird der pH-Wert auf 7 eingestellt. Das 10 mmol/l Glycin Eluat enthält das gereinigte Protein der Erfindung. Es ist aktiv im Gerinnungstest (siehe Beispiel 2), im Plättchen- Aggregationstest (siehe Beispiel 3), im amidolytischen Test (siehe Beispiel 4) und verlängert die Thrombin-Zeit (siehe Beispiel 9). Die Präparation enthält keine in der SDS-Gelelektrophorese detektierbare Verunreinigungen.

Beispiel 2 Inhibierung der Thrombinaktivität im Gerinnungstest

In eine Mikrotiterplatte, die mit Rinderserumalbumin beschichtet ist (0,1% in 0,1 mol/l NaHCO₃, pH 9,5), werden 80 µl 20 mmol/l HEPES, pH 7,4; 0,15 mmol/l NaCl; 20 µl 20 mmol/l CaCl₂; 100 µl einer verdünnten Lösung des Proteins der Erfindung (5-50 ng) und 20 µl Thrombin (0,03 lU = 0,03 Internationale Ein heiten) pipettiert. Nach einer Inkubation 2 Minuten bei 37°C werden 100 µl Fibrinogen (5 mg/ml) zugegeben und 40 Minuten bei 37°C inkubiert. An schließend wird die Absorption bei 405 nm gemessen. 45 ng ( =8 nmol/l) des gereinigten Proteins der Erfindung hemmen die Fibrinogenspaltung vollständig.

Unter den gleichen Testbedingungen zeigt Hirudin die gleiche Wirksamkeit (vollständige Hemmung mit 8 nmol/l). (siehe Fig. 3)

Beispiel 3 Inhibierung der Thrombinaktivität im Blutplättchen-Aggregationstest

500 µl gelfiltrierte Blutplättchen (300 000/ml) werden mit dem Protein dieser Er findung (5-100 ng/ml) für 1 Minute bei 37°C inkubiert. Dann wird die Aggre gation mit Thrombin (0,06 lU/ml) induziert und die Aggregation in einem Aggre gometer aufgezeichnet. Messungen mit dem gereinigten Protein der Erfin dung zeigen, daß bei einer Konzentration von 15 ng/ml die Aggregation zu 100% gehemmt wird.

Beispiel 4 Inhibierung der Thrombinaktivität im amidolytischen Test

In einer Mikrotiterplatte werden 80 µl 100 mmol/l Tris/HCL, pH 7,4; 150 mmol/l NaCl und 0,03 lU (1,35 nmol/l) Thrombin und 100 µl einer verdünnten Lösung des Proteins der Erfindung (32-630 ng) 10 Minuten bei 37°C inkubiert und dann mit 100 µl (50 nmol) des Substrates S2238 (Kabi Vitrum) versetzt. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 37°C wird die Absorption bei 405 nm ge messen. 630 ng (117 nmol/l) hemmen die Aktivität des Thrombins zu ungefähr 50%. Hirudin hemmt in einer Konzentration von 6 nmol/l die Aktivität des Thrombins zu 85%. (siehe Fig. 2)

Beispiel 5 Bestimmung der N-terminalen Aminosäure-Sequenz

Das gereinigte Protein der Erfindung wurde in einem automatischen Amino säuresequenator (Applied Biosystems, Inc.) nach den Instruktionen des Herstel lers sequenziert. Die Sequenz der Aminosäuren 1 bis 21 (vom N-Terminus) ist: Ala-Glu-Gly-Asp-Asp-Cys-Ser-Leu-Glu-Lys-Ala-Met-Gly-Asp-Phe-?-Pro-Gl-u- Glu-Phe-Phe. "?" bedeutet, nicht mit vollständiger Sicherheit identifizierbar. Bei dieser Aminosäure handelt es sich mit einiger Wahrscheinlichkeit um Lysin.

Beispiel 6 SDS-Gelelektrophorese und Bestimmung des Molekulargewichts

Das Protein der Erfindung wurde im reduziertem (Reduktion mit Dithiothreit) und im nicht reduziertem Zustand zusammen mit den Molekulargewichtsmarkern (Electrophoresis Calibration Kit von Pharmacia) Phosporylase b (94 kDa), Album in (67 kDa), Ovalbumin (43 kDa), Carbonic Anhydrase (30 kDa), Trypsin Inhibitor (20,1 kDa) und Lactalbumin (14,4 kDa) auf ein 12,5%-iges SDS-Poly acrylamidgel aufgetragen und nach der Elektrophorese nach Laemmli (1970, Nature 227, 680-685) mit Coomassie brillant blue gefärbt. Im reduzierten Zu stand wandert das Protein der Erfindung während der Elektrophorese nur ge ringfügig oberhalb des Trypsin Inhibitors. Das entspricht einem Molekular gewicht von etwa 21 000 Da. Im nicht reduziertem Zustand wandert das Pro tein der Erfindung zwischen dem Trypsin Inhibitor und Lactalbumin, was einem Molekulargewicht von etwa 18 000 Da entspricht.

Beispiel 7 Das Protein der Erfindung hemmt nicht die Serinproteasen Faktor Xa und Trypsin

Die Aktivität von Faktor Xa und von Trypsin werden mit dem folgenden Test gemessen. Zu 80 µl 50 mmol/l Tris/HCl pH 8,0, 227 mmol/l NaCl, werden für die Faktor Xa Bestimmung 0,004 lU (0,653 pmol) Faktor Xa (American Diagnostica) und 0,5 µg (28 pmol) des Proteins der Erfindung und für die Tryp sin-Bestimmung 0,004 lU (0,019 pmol) Trypsin (Sigma) und 0,016 µg (0,817 pmol) des Proteins der Erfindung gegeben und für 2 Minuten bei 37°C inku biert. Nach Zugabe von 0,05 µmol des Substrates S2222 (Kabi Vitrum) wird für 20 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend die Absorption bei 405 nm gemessen. Die Absorption dieser Ansätze ist genauso hoch wie die von An sätzen ohne das Protein der Erfindung, d. h. das Protein hemmt weder die Aktivität von Faktor Xa noch die von Trypsin.

Beispiel 8 Isoelektrische Fokussierung

Das Protein der Erfindung wird auf ein Gel für isoelektrische Fokussierung im Bereich von pH 3 bis 9 (Pharmacia) aufgetragen und zusammen mit Standard proteinen (Calibration Kit pH 3 bis 10 von Pharmacia) fokussiert. Die Fokussie rungsstelle des Proteins der Erfindung lag zwischen der des Sojabohnen- Trypsininhibitors (I.P. = 4,55) und der von β-Lactoglobulin A (I.P. = 5,2).

Beispiel 9 Verlängerung der Thrombin-Zeit

Die Thrombin-Zeit mißt die Aktivität von exogenem Thrombin, das zum Test plasma zugesetzt wird. Zu 0,1 ml Plasma werden 50 µl Lösung des Proteins der Erfindung in verschiedenen Verdünnungen (6 bis 58 nmol/l) und 50 µl Diäthylbarbiturat-Acetat-Puffer mit pH 7,6 gegeben und 1 Minute bei 37°C in kubiert. Nach Zugabe von 0,1 ml Thrombin-Lösung (3 lU/ml) wird die Zeit bis zum Gerinnungseintritt gemessen (Biomatic 2000 Coagulometer von Sarstedt).

Das Protein der Erfindung, das in einer Konzentration von 35 nmol/l vorliegt, verlängert die Gerinnungszeit im Vergleich zu einem Kontrollansatz um das 5- fache. (siehe Fig. 1)

Beispiel 10 Bestimmung von internen Aminosäuresequenzen nach Spaltung mit Lys C

Das gereinigte Protein der Erfindung (59 µg) wird mit 10% 2-Mercaptoethanol reduziert (2 Stunden bei Raumtemperatur unter N₂) und dann mit 4-Vinylpyridin umgesetzt (2 Stunden bei Raumtemperatur unter N₂). Nach einer Dialyse gegen 25 mmol/l Tris/HCl, pH 8,5; 1 mmol/l EDTA wird die Probe mit 1 µg Lys C (Boehringer Mannheim) versetzt und 6 Stunden bei 37°C inkubiert. Dieser Spaltansatz wird auf eine Supersper RP-18, 4 µm (250 × 4 mm, MZ-Analysen technik, Mainz) -Säule aufgetragen und mit einem Gradienten 0,1% TFA in H₂O -0,08% TFA in 70% Acetonitril eluiert (HPLC-Anlage von Waters). Die Ab sorption bei 280 nm und bei 214 nm wird aufgezeichnet und das Eluat wird fraktioniert. Die Fraktionen, die den Absorptions-Peaks entsprechen, werden zur Trockne gebracht und in 30 µl H₂O aufgenommen. Einzelne Fraktionen werden in einem automatischen Aminosäuresequenator (Applied Biosystems Inc.) nach den Instruktionen des Herstellers sequenziert. Dabei ergeben sich folgende Sequenzen (Start jeweils vom N-Terminus, "?" bedeutet, nicht eindeu tig identifiziert):

1. Ala-Met-Gly-Asp-Phe-Lys-Pro-Glu-Glu-Phe-Phe-?-Gly- Thr-Arg(?)-Tyr-Leu-Ala (Die Bestimmung der Aminosäure Arg ist mit Un sicherheit behaftet.)
2. Gly-Phe-Thr-Gln-Ile-Val-Glu-Ile-Gly-Tyr-Asn-Lys-
3. Asn-Gly-Glu-Gln-Tyr-Ser-Phe-Lys-

Beispiel 11 Molekulare Klonierung von den erfindungsgemäßen cDNAs

Wenn die Sequenz des N-terminalen Endes des erfindungsgemäßen Proteins bekannt ist, läßt sich eine korrespondierende Nukleotidsequenz ermitteln. (siehe WO 90/07861)

aa) Herstellung von spezifischen Proben bei der PCR

Um die erfindungsgemäßen cDNA zu ermitteln, wird zuerst der Primer (Vorlage, Startstück) synthetisiert, der von der zuvor im Edman-Abbau ermittelte Ami nosäuresequenz abgeleitet wird. Die synthetisierten Oligonucleotidesequen zen des Primers werden genutzt, um mit der PCR (Polymerase Chain Reaction = Polymerase-Kettenreaktion) ein Fragment der erfindungsgemäßen cDNA zu amplifizieren. (siehe US-Patent 4,800,159). Zwei Oligonukleotid-Primer werden hergestellt, indem die Nukleotid-Sequenz von der zuvor teilweise bestimmten Aminosäure-Sequenz des N-terminalen Be reichs des vollständigen erfindungsgemäßen Proteins und eines seiner Frag mente hergeleitet wird. Dabei werden die folgenden Aminosäure-Sequenzen verwendet:

N-terminale Sequenz des vollständigen Proteins:

und N-terminale Sequenz des Fragmentes:

Die Matrize (template) besteht aus der cDNA, die von einer poly-A⁺-RNA stammt, welche zuvor aus den Speicheldrüsen von Triatoma pallidipennis iso liert worden ist (SAMBROCK et al.: Molekular Cloining (Chapter 7, pp 18-22, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Matritzen-Startstück (Sense primer)

Nicht-Matrizen-Startstück (Antisense primer)

A = Desoxyadenosin; C = Desoxycytidin;
G = Desoxyguanosin; T = Desoxythymidin und
I = Desoxyinosin

Die PCR setzt sich aus 40 Zyklen zusammen. Ein Zyklus sieht wie folgt aus:

a) 2 Minuten Denaturierung bei 94°C,
b) 90 Sekunden Hybridisierung bei 52°C und
c) 2 Minuten Verlängerung bei 72°C.

Das durch das zuvor beschriebene Verfahren gewonnene PCR-Vermehrungspro dukt weist auf einem Agarose-Gel eine Bande auf. Diese wird von dem Agarose-Gel, das einen niedrigen Schmelzpunkt aufweist, isoliert und direkt in das PCR Plasmid (Stratagene) überführt und subkloniert. Das Verfahren ent spricht der Beschreibung aus dem Protokoll des Herstellers (pCR-Script^TM SK(+) Cloning Kit von Stratagen). Die DNA-Sequenz des Insertionsproduktes entspricht der Sequenz des PCR-Produktes und wird so ermittelt, wie es in SANGER et al. Proc Natl Acad Sci USA (1977) 74 : 5463-5467 beschrieben ist.

bb) Selektionsverfahren der cDNA-Bank und Isolierung des erfindungs gemäßen cDNA-Klons

Etwa 400 000 primäre Klone aus der Speicheldrüsen-cDNA-Bank von T palli dipennis (cDNA library) werden auf Nylonmembranen (Pall Biosupport East Hills, NY, USA) transferiert und gescreent, wie es der Hersteller vorschreibt. Eine markierte Probe, die mit Hilfe der zuvor beschriebenen PCR-Ver mehrungsmethode gewonnen worden ist, wird dabei verwendet. Das Selek tionsverfahren wird zweimal durchgeführt, gefolgt von einer Umwandlung der Phagen-DNA in Plasmid-DNA und eine Sequenzanalyse des Inserts (eingebaute DNA) dieses Plasmids. Dadurch werden vier cDNA-Sequenzen ermittelt, die in den Sequenz Identifier 13 bis 16 abgebildet sind, wobei lediglich die Triplika für die Aminosäuren -17 bis -9 bei Ti 28 und Ti 45 und das Triplika für die Aminosäure -18 bei Ti 12 fehlen.

Je beide Stränge der isolierten DNA werden sequenziert. Die von der kodie renden DNA abgeleitete Aminosäure-Sequenz stimmt vollständig mit der Ami nosäure-Sequenz überein, die zuvor mittels des Edman-Abbaus von dem erfin dungsgemäßen gereinigten Protein herausgefunden worden ist.

Der längste cDNA Klone (Ti12) beginnt mit den Nukleotiden TG, die einem un vollständigen Startkodon für Methionin entsprechen. Dieses wird offensicht lich, wenn ein weiterer isolierter Klon (Ti5) berücksichtigt wird, der bei einem Selektionierungsverfahren mit 600 000 Phagen derselben cDNA-Bank gefunden wurde, welche bei der Selektionierung von Ti12, Ti28 und Ti45 verwendet wurde.

Tabelle 2

Positionen, in denen die erfindungsgemäßen Proteine Unterschiede besitzen

Die vier cDNA-Sequenzen des erfindungsgemäßen Proteins werden gemäß der zuvor beschriebenen Methode selektioniert, identifiziert und sequenziert. Lediglich 9 Positionen weisen Unterschiede in der abgeleiteten Aminosäure- Sequenz auf. Die Unterschiede sind in der Tabelle 2 aufgelistet.

Die Identität (Identity) und Ähnlichkeit (Similarity) der vier reifen erfindungsge mäßen Proteine ist etwa 95 oder 98%, je nachdem welcher Vergleichspartner gewählt wird.

Beispiel 12 Herstellung eines das erfindungsgemäße Protein kodierenden Plasmids und Expression und Reinigung des in E. coli hergestellten Proteins

Sind die DNA-Sequenzen bekannt, so lassen sich passende Promotoren und gegebenenfalls passende Enhancer mit den jeweiligen DNA-Sequenzen ver binden, so daß dann ein brauchbarer Vektor vorliegt. (M. WIRTH, L. SCHUMACHER and H. HAUS ER, in H.S. CONRADT (ed) Protein Glycosylation, Cellular Biotechnical and Analytical Aspects VoI 15, 49-52, VCH publishers Weinheim, 1991); ebenfalls auch J. KRÄTZSCHMAR et al. (1992) Gene 116: 281-284. Die Expression eines solchen Vektors ist in Eukaryonten (zum Beispiel Baby Hamster Kidney Cells) möglich. Weiterhin lassen sich die DNA- Sequenzen in passende prokaryontische Vektoren zur Expression in E. coli Stämmen einbauen.

a) Herstellung des Plasmids (i) Vorüberlegung

Das Konstrukt zur Expression des erfindungsgemäßen rekombinanten Proteins in Prokaryonten wird hergestellt, indem das kommerziell erhältliche Plasmid pKK233-2 eingesetzt wird, das den IPTG-induzierbaren trc Promotor enthält.

Der zur Expression geeignete Vektor umfaßt dieses Plasmid pKK233-2, in dem sowohl die kodierende Sequenz des erfindungsgemäßen Proteins als auch eine Signalsequenz inseriert sind. Die Signalsequenz ist eine modifizierte Signal sequenz, die auf das sekretierte E. coli Protein Cyclophilin a zurückzuführen ist.

Die Signalsequenz und die kodierende DNA wird stromabwärts (downstream) von dem Promotor eingesetzt, wodurch das pKK/cph entsteht (T. HAYANO (1991) Biochemistry 30 : 3041-3048).

Die kodierenden Sequenzen des erfindungsgemäßen Proteins werden in das Expressions-Plasmid inseriert und das so erhaltene Konstrukt (pKK/cph-Protein) wird für die Transformation von kompetenten E. coli JM 105 - Zellen benutzt.

(ii) Konstruktion des Plasmids pKK/cph

Das folgende Paar von sich teilweise überlappenden und komplementären Oligodesoxynukleotiden wird verwendet, um die kodierende DNA für die Signal sequenz von Cyclophilin a nachzubilden. Dabei wird das entsprechende C- terminale Ende der Cyclophilin-Sequenz modifiziert, um eine optimale Spalt stelle für die bakterielle Signalpeptidase zu bilden. Die Modifikation besteht darin, daß die letzten sieben Triplika des C-terminalen Endes gegen Triplika ausgetauscht werden, die folgende Aminosäure-Sequenz kodieren: Phe-Ser- Ala-Ser-Ala-Leu-Ala (R.E. DALBEY and G. von HEIJNE (1992) TIBS 17 : 474- 478).

Sinn-tragende Oligonucleotid-Sequenz: (Sense oligo)

Nicht-sinntragende Oligonukleotid-Sequenz: (Antisens oligo)

Nach dem Anlagern der Startersequenz und der anschließenden Komplettie rung der Tochterstücke unter Verwendung von Taq Polymerase werden die DNA Fragmente mit AflIII und HindIII gespalten. Die Spaltungsstellen sind unterstrichen. Danach wird das DNA-Fragment zwischen der NcoI- und HindIII-Stelle des Plasmids pKK233-2 subkloniert. Die NheI-Stelle, die zusammen mit der HindIII Stelle die weitere Subklonierung von cDNA-Stücken erleichtert, wird durch Fettdruck kenntlich gemacht.

(ii) Konstruktion des Plasmids mit dem erfindungsgemäßen Protein

Das folgende Paar an Startsequenzen (Primer) wird verwendet, um die kodie rende Sequenz für das reife erfindungsgemäße Protein (Ti28 = Seq. ld. No 2) zu vervielfältigen. Dabei werden die NheI und HindIII Schnittstellen, die unter strichen sind, für die Insertion in das Plasmid pKK/cph benötigt.

Sinn-tragende Oligonucleotid-Sequenz (Sense oligo)

Nicht-sinntragende Oligonukleotid-Sequenz: (Antisens oligo)

Zehn Zyklen bestehend aus 2 Minuten bei 94°C, 2 Minuten bei 30°C und 2,5 Minuten bei 72°C werden für die PCR (Polymerase Chain Reaktion = Polyme rase-Ketten-Reaktion) durchgeführt, wobei 2 µg Matrizenstrang (Template) ein gesetzt werden. Die vervielfältigte DNA wird auf einem niedrig-schmelzenden Agarose-Gel isoliert, mit NheI und HindIII gespalten und in das Plasmid pKK/cph überführt, das zuvor mit denselben Restriktionsendonukleasen gespal ten wurde. Das so erhaltene Konstrukt wird mit Hilfe einer Totalsequenzierung der kodierenden DNA und der die kodierende DNA flankierenden DNA über prüft.

(iii) Transformation von E. coli

E. coli JM 105 - Zellen werden unter Anwendung des CaCl₂ - Verfahrens transformiert. Dabei wird 1 µg pKK/cph DNA, die das erfindungsgemäße Protein kodiert, verwendet.

b) Reinigung und Charakterisierung des mit E. coli hergestellten erfindungsgemäßen Proteins

Eine Kultur der transformierten E. coli - Zellen wird mit IPTG (1 mmol/l) versetzt und bei 37°C für sechs Stunden inkubiert. (IPTG = Isopropyl-β-D- Thiogalactosid). Die Zellen werden abzentrifugiert und einem osmotischen Schock (Saccharose- und anschließende H₂O-Behandlung) unterworfen. Die so gewonnene Periplasmafraktion inhibiert im Gerinnungstest (vergleiche Bei spiel 2) die Aktivität von Thrombin. Die inhibitorische Aktivität wird durch Ionenaustauscherchromatographie an DE-52 Zellulose und Thrombin affinitätschromatographie gereinigt. (vergleiche Beispiel 1) Die gereinigte Fraktion hat die gleiche inhibitorische Aktivität wie das Speichel protein. Es zeigt identisches Verhalten in einer SDS-Polyacrylamidelektropho rese (vergleiche Beispiel 6). Weiterhin stimmt es in der N-terminalen Ami nosäuresequenz mit dem reifen Speichelprotein überein.

SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 3

SEQ ID NO: 4

SEQ ID NO: 5

SEQ ID NO: 6

SEQ ID NO: 7

SEQ ID NO: 8

SEQ ID NO: 9

SEQ ID NO: 10

SEQ ID NO: 11

SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 13

SEQ ID NO: 14

SEQ ID NO: 15

SEQ ID NO: 16

SEQ ID NO: 17

SEQ ID NO: 18

SEQ ID NO: 19

SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO: 22

SEQ ID NO: 23

SEQ ID NO: 24

SEQ ID NO: 25

SEQ ID NO: 26

SEQ ID NO: 27

SEQ ID NO: 28

SEQ ID NO: 29

Claims

1. Natürliche oder synthetisch herstellbare Proteine, die Thrombininhibi toren sind und aus dem Speichel von Insekten, die Säugetierblut saugen, iso lierbar sind.

2. Proteine nach Anspruch 1, die aus der Raubwanze Triatoma pallidipen nis isolierbar sind.

3. Ein Protein nach einem der Ansprüche 1 und 2,

a) das als aktives Protein eine N-terminale Sequenz wie folgt besitzt: oder
b) das als aktives Protein allelische Modifikationen der zuvor unter a) ge nannten N-terminalen Aminosäure-Sequenz aufweist, wobei eine oder zwei Aminosäuren der N-terminalen Aminosäure-Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert sind, ohne dabei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu be einflussen, oder
c) das als aktives Protein posttranslationale Modifikationen der N-termina len Sequenzen unter a) und b) aufweist, die nicht wesentlich die Aktivität des aktiven Proteins beeinflussen.

4. Ein Protein, das ein Thrombininhibitor ist und

d) das als aktives reifes Protein eine der folgenden Sequenzen besitzt:
- i) Sequence Identifier No. 1 (Sequenz Protokoll Nr. 1)
- ii) Sequence Identifier No. 2 (Sequenz Protokoll Nr. 2)
- iii) Sequence Identifier No. 3 (Sequenz Protokoll Nr. 3) und
- iv) Sequence Identifer No. 4 (Sequenz Protokoll Nr. 4) oder
e) das als aktives reifes Protein allelische Modifikationen einer der zuvor unter d) genannten Aminosäure-Sequenzen aufweist, wobei wenigstens eine Aminosäure der Aminosäure-Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert ist, ohne dabei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen, oder
f) das als aktives reifes Protein posttranslationale Modifikationen einer der Sequenzen unter d) und e) aufweist, die nicht wesentlich die Aktivität des akti ven Proteins beeinflussen.

5. Ein Protein, bestehend aus einer Signalsequenz und einem reifen Protein nach einem der Ansprüche 1 und 2,

g) wobei das Protein eine der folgenden Sequenzen besitzt:
- i) Sequence Identifier No. 5 (Sequenz Protokoll Nr. 5)
- ii) Sequence Identifier No. 6 (Sequenz Protokoll Nr. 6)
- iii) Sequence Identifier No. 7 (Sequenz Protokoll Nr. 7) und
- iv) Sequence Identifer No. 8 (Sequenz Protokoll Nr. 8) oder
h) wobei das Protein allelische Modifikationen einer der zuvor unter g) ge nannten Aminosäure-Sequenzen aufweist, wobei wenigstens eine Aminosäure der Aminosäure-Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert ist, ohne dabei die Aktivität des reifen aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen oder
i) wobei das Protein posttranslationale Modifikationen einer der Sequenzen unter g) und h) aufweist, die nicht wesentlich die Aktivität des aktiven reifen Proteins beeinflussen.

6. Ein Protein nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Protein ein rekombinantes Protein ist.

7. Ein Protein nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Protein glykosyliert ist.

8. Eine cDNA oder DNA, die einen reifen Thrombininhibitor kodiert,

aa) wobei die cDNA oder DNA eine der folgenden Aminosäure-Sequenzen kodiert:
- i) Sequence Identifier No. 1 (Sequenz Protokoll Nr. 1)
- ii) Sequence Identifier No. 2 (Sequenz Protokoll Nr. 2)
- iii) Sequence Identifier No. 3 (Sequenz Protokoll Nr. 3) und
- iv) Sequence Identifer No. 4 (Sequenz Protokoll Nr. 4) oder
bb) wobei die cDNA oder DNA allelische Modifikationen einer der Aminosäure- Sequenzen unter aa) kodiert,
worin wenigstens eine Aminosäure der Aminosäure-Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert ist, ohne dabei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen.

9. Eine cDNA oder DNA, die einen Thrombininhibitor kodiert,

cc) wobei die cDNA oder DNA eine der folgenden Nukleotidsequenzen besitzt:
- i) Sequence Identifier No. 9 (Sequenz Protokoll Nr. 9)
- ii) Sequence Identifier No. 10 (Sequenz Protokoll Nr. 10)
- iii) Sequence Identifier No. 11 (Sequenz Protokoll Nr. 11) und
- iv) Sequence Identifer No. 12 (Sequenz Protokoll Nr. 12) oder
dd) wobei die cDNA oder DNA eine allelische Modifikation einer der Nukleo tidsequenzen unter cc) aufweist, wobei wenigstens ein Nukleotid substituiert deletiert oder insertiert ist, ohne dabei die Aktivität des Proteines, das von der allelischen Modifikation der Nukleotidsequenz unter cc) kodiert wird, wesentlich zu beeinflussen.

10. Eine cDNA oder DNA, die einen Thrombininhibitor mit Signalsequenz kodiert,

ee) wobei die cDNA oder DNA eine der folgenden Nukleotidsequenzen besitzt:
- i) Sequence Identifier No. 13 (Sequenz Protokoll Nr. 13)
- ii) Sequence Identifier No. 14 (Sequenz Protokoll Nr. 14)
- iii) Sequence Identifier No. 15 (Sequenz Protokoll Nr. 15) und
- iv) Sequence Identifer No. 16 (Sequenz Protokoll Nr. 16) oder
ff) wobei die cDNA oder DNA eine allelische Modifikation einer der Nukleo tidsequenzen unter ee) aufweist, wobei wenigstens ein Nukleotid substituiert, deletiert oder insertiert ist, ohne dabei die Aktivität des reifen Proteines, das einschließlich seiner Signalsequenz von der allelischen Modifikation der Nukleotidsequenz unter ee) kodiert wird, wesentlich zu beeinflussen.

11. Ein Vektor, der eine cDNA oder DNA nach einem der Ansprüche 8 bis 10, weiterhin einen passenden Promotor und gegebenenfalls einen passenden Enhancer enthält.

12. Eine eukaryontische oder prokaryontische Wirtszelle, die mit einem Vek tor nach Anspruch 11 transformiert ist.

13. Ein Verfahren zur Herstellung der Proteine nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit folgenden Schritten:
Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem Vektor transformiert ist, welcher eine cDNA oder DNA nach einem der Ansprüche 8 bis 10 enthält, und
Isolieren und Reinigen der Proteine.

14. Ein Verfahren zur Reinigung von Proteinen nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Proteine isoliert, über wenigstens eine Säule gereinigt und an schließend eingeengt werden.

15. Ein Verfahren zur Reinigung von Proteinen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 13 bis 14, wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht:
Auftragen des Speichels auf eine "Superose 12 HR-Säule" und Eluieren und
erneute Auftragung auf einer CH-aktivierten Sepharose-Säule, an der zuvor Thrombin gekoppelt wurde, und Eluieren.

16. Eines der Proteine oder deren Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 13 bis 15 als pharmazeutischer Wirkstoff.

17. Ein Arzneimittel, das eines der Proteine oder deren Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 13 bis 15 enthält.

18. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eines der Proteine oder deren Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 13 bis 15 enthält, in Gegenwart von pharmazeutisch verträglichen und annehmbaren Verbindungen und Trägern.

19. Verwendung eines der Proteine oder deren Gemisch nach einem der An sprüche 1 bis 7 und 13 bis 15 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behand lung von Thrombosen oder instabiler Angina oder Arteriosklerose, oder zur Prä vention eines Wiederverschlusses von Gefäßen nach PTCA/PTA oder zur Verhinderung der Blutgerinnung bei der Hämodialyse.