FI110669B - Menetelmiä luonnosta eristettävissä tai synteettisesti valmistettavissa olevien trombiini-inhibiittorien valmistamiseksi - Google Patents

Description

Menetelmiä luonnosta eristettävissä tai synteettisesti val mistettavissa olevien trombiini-inhibiittorien valmista miseksi 1 it 66ί 1 ΫΜΜ' 5 Keksintö koskee menetelmää proteiinien valmistami seksi, jotka ovat protostomien syljestä saatuja trombiini-inhibiittoreita.

Tekniikan taso

Trombiinilla on avainfunktio trombien muodostukses-10 sa verisuonissa. Se katalysoi fibrinogeenin hajoamista fib-riiniksi. Se johtaa verihyytymien muodostumiseen. Edelleen se indusoi verihiutaleiden aggregaatiota. Entsyymi liittyy patogeenisestä erilaisiin sairauksiin, kuten esim. valtimoiden ja laskimoiden tromboosiin tai valtimonkovetustau-15 tiin.

Sen vuoksi trombiini-inhibiittorin käyttö trom-boosien hoitoon voidaan olettaa lupaavaksi. Tärkeimmät tähän mennessä tunnetut trombiini-inhibiittorit ovat antit-rombiini III -hepariini ja hirudiini. Antitrombiini III on : 20 plasmassa esiintyvä proteiini, jonka moolimassa on 58 kDa.

_ . Antitrombiini III sitoutuu ensin hepariiniin, joka on po lysakkaridi. Sen jälkeen antitrombiini III - hepariinikomp-_ leksi sitoutuu trombiiniin ja inhiboi tämän trombiinin.

'· Trombiinista ja antitrombiini Ulista muodostuu hyvin sta- : 25 biili kompleksi ja antitrombiini III lohkeaa trombiinista.

*.·' · Trombiinin lisäksi antitrombiini III inhiboi myös muita se- riiniproteaaseja, kuten esim. tekijää Xa [Pratt, C.W. ja Church, F.C. (1991) "Antithrombin: Structure and Function", Seminars in Hematology 28: 3-9].

: 30 Verijuotikkaasta Hirudo medicinalis eristettiin hi- _·· rudiiniproteiini. Sen moolimassa on noin 7 kDa ja se sitou- tuu trombiiniin ionivuorovaikutuksen avulla. Se on trom-biinille spesifinen [Johnson, P.H. et al. (1989) "Biochem-v.' istry and Genetic engineering of hirudin", Seminars in 35 Thrombosis and Hemostasis 15: 302 - 315].

2 -i ' r s · { i lw· ·'*

Keksinnön kuvaus

Tekniikan tasoon kuuluvien edellä mainittujen trom-biini-inhibiittorien lisäksi tarvitaan muita inhibiittorei-ta, joilla on toinen vaikutusmekanismi tai suurempi aktii-5 visuus.

Keksintö tarjoaa käyttöön menetelmiä luonnollisten tai synteettisesti valmistettavien proteiinien valmistamiseksi, jotka ovat trombiini-inhibiittoreita ja jotka voidaan eristää nisäkkäiden verta imevien hyönteisten syljes-10 tä.

Keksinnön mukaisesti saatavat proteiinit, jotka voidaan eristää petoluteesta Triatoma pallidipennis, ovat edullisia.

Keksinnön mukaisesti saatavat proteiinit voivat ol-15 la peräisin luonnosta. Proteiinit saadaan puhdistamalla sylkeä. On myös mahdollista eristää proteiinit sylkirauhasista tai ottaa sylkirauhasesta proteiinia syntetisoivia soluja ja pitää niitä viljelmässä. Tämän soluviljelyn tuottamat supernatantit otetaan talteen ja jatkokäsitellään. ·, ; 20 Solusupernatantti puhdistetaan ja proteiinit eristetään ja ! rikastetaan. Kaikki eristämisen ja puhdistamisen rikastus- vaiheet ovat osa keksintöä. Ne eristämisen ja puhdistamisen • " rikastusvaiheet, joissa proteiineja voidaan käyttää far- “ maseuttisiin tarkoituksiin, ovat edullisia. Siten saadaan · 25 trombiini-inhibiittorin puhtauksia 50 % kokonaisproteiinis- ' ta, edullisesti 85 %, edullisemmin 95 % ja edullisimmin 99 % trombiini-inhibiittoria kokonaisproteiinista.

Keksintö ei käsitä ainoastaan proteiineja, jotka voidaan eristää lajista Triatoma pallidipennis, vaan myös ; 30 proteiinit, jotka voidaan syntetisoida muista hyönteisla- jeista. Siten lajista Triatoma pallidipennis eristettävissä '! . olevien proteiinien lisäksi, jotka kuuluvat edullisimpien ·/·_ ryhmään, ovat edullisia muut proteiinit, jotka ovat peräi- :·*. sin lajeista Triatoma infestans, Triatoma dimidiata, Tria- ..V 35 toma maculata, Rhodnius prolixus, Panstrongylus megistus ja

Panstrongylus infestans.

11C669 3

Keksinnön mukaisesti proteiinit on myös mahdollista valmistaa synteettisesti. Tähän luetaan mukaan julkaisujen J.M. Sewart ja J.D. Young, San Franzisco, 1969 ja J. Meien-hofer, Hormonal Proteins and Peptides Voi 2, s. 46, Acade-5 mic Press (New York) , 1973 ja E. Schoder ja K. Lubke, The Peptides, Voi. 1, Academic Press (New York) 1965 mukaiset proteiinisynteesit. Synteettisesti valmistettuihin proteiineihin kuuluvat myös rekombinanttiproteiinit, jotka valmistetaan tunnetuilla menetelmillä. Aina isäntäorganismin mu-10 kaan keksinnön mukaisesti saatavat proteiinit voivat olla glykosyloituja tai, kun ne syntetisoidaan prokariooteissa, glykosyloimattomia.

Inhibiittorien toiminta voidaan määrittää erilaisissa koesysteemeissä. Esimerkeissä 2 - 4 ja 9 kuvataan 15 käyttökelpoisia koemenetelmiä.

Keksinnön mukaisesti saatavia proteiineja voidaan todeta nisäkkäiden verta imevien nisäkkäiden syljestä. Näitä proteiineja syntetisoivat tavallisesti sylkirauhasten solut. Tämän vuoksi näitä proteiineja voidaan eristää syl- ,. · 20 jestä. Keksintö ei rajoitu tähän valmistustapaan ja eristä- ! miseen. Päinvastoin se käsittää kaikki synteettisesti val mistetut trombiini-inhibiittorit, jotka voidaan osoittaa • ” syljestä ja eristää siitä.

'·' Keksintö koskee menetelmää luonnollisen trombiini- ! 25 inhibiittorin valmistamiseksi, jossa a) aktiivisena proteiinina on seuraava N-terminaalinen sekvenssi:

Ala-Glu.Gly.Asp.Asp.Cys.Ser.Leu.Glu.Lys.Ala.Met.Gly.

.·, · 30 Asp.Phe.Lys.Pro.Glu.Glu.Phe.Phe tai ‘I . b) kypsänä proteiinina on jokin seuraavista sek- vensseistä: (i) sekvenssi tunnusnumero 1 • ·*·' 35 (ii) sekvenssi tunnusnumero 2 11C669 (iii) sekvenssi tunnusnumero 3 tai (iv) sekvenssi tunnusnumero 4 tai c) aktiivisena proteiinina on edellä kohdassa a) 5 tai b) mainitun N-terminaalisen aminohapposekvenssin al- leelisia modifikaatioita, jolloin N-terminaalisen aminohapposekvenssin yksi tai kaksi aminohappoa tai vähintään yksi kypsän proteiinin aminohapoista on korvattu, deletoitu tai insertoitu samalla oleellisesti vaikuttamatta aktiivisen 10 proteiinin aktiivisuuteen, tai d) aktiivisena proteiinina kohdassa a) ja c) mainittujen N-terminaalisten sekvenssien tai kohdassa b) tai c) mainitun kypsän proteiinin sekvenssin translaation jäl- 15 keisiä modifikaatioita, jotka eivät vaikuta tai eivät oleellisesti vaikuta aktiivisen proteiinin aktiivisuuteen, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että eristetään proteiini nisäkkäiden verta imevien hyönteisten syljestä. Nisäkkäiden verta imevä hyönteinen on edullisesti laji Tria-20 toma pallidipennis hyönteinen.

Kaikki alleelliset modifikaatiot, jotka käsittävät enintään 30 aminohapon korvaamiset, deleetiot ja/tai inser-: ' tiot, kuuluvat keksinnön mukaisesti saatavien proteiinien ' ryhmään. Edullisia ovat enintään 20 aminohapon, edullisem- . 25 min enintään 10 aminohapon, deleetiot, korvaamiset ja/tai insertiot ja edullisimpia ovat yhden, kahden, kolmen, neljän, viiden, kuuden, seitsemän, kahdeksan tai yhdeksän aminohapon deleetiot, korvaamiset ja/tai insertiot.

Keksinnön erään toteutusmuodon muodostaa menetelmä, 30 jolla valmistetaan proteiini, joka koostuu signaali-sekvenssistä ja kypsästä proteiinista, jolloin ; . e) proteiinilla on seuraava sekvenssi: : (i) sekvenssi tunnusnumero 5 ·;·. (ii) sekvenssi tunnusnumero 6 35 (iii) sekvenssi tunnusnumero 7 tai (iv) sekvenssi tunnusnumero 8 110669 tai f) aktiivisena proteiinina on kohdassa e) mainitun aminohapposekvenssin alleelisia modifikaatioita, jolloin ainakin yksi aminohapposekvenssin aminohappo on korvattu, 5 deletoitu tai insertoitu samalla oleellisesti vaikuttamatta valmiin aktiivisen proteiinin aktiivisuuteen, tai g) kypsänä proteiinina on kohdan e) tai f) mukaisen sekvenssin translaation jälkeisiä modifikaatioita, jotka 10 eivät vaikuta oleellisesti aktiivisen kypsän proteiinin aktiivisuuteen.

Kaikki alleeliset modifikaatiot, jotka käsittävät enintään 32 aminohapon korvaamiset, deleetiot ja/tai inser-tiot, kuuluvat keksinnön mukaisesti saatavien proteiinien 15 ryhmään. Edullisia ovat enintään 21 aminohapon, edullisemmin enintään 11 aminohapon, deleetiot, korvaamiset ja/tai insertiot ja edullisimpia ovat yhden, kahden, kolmen, neljän, viiden, kuuden, seitsemän, kahdeksan tai yhdeksän aminohapon deleetiot, korvaamiset ja/tai insertiot.

. 20 Keksintö koskee myös menetelmää luonnosta eristet tävissä tai synteettisesti valmistettavissa olevan trombii-ni-inhibiittorin valmistamiseksi, jolloin menetelmälle on : ' tunnusomaista, että viljellään isäntäsolua, joka on trans- '. · formoitu cDNA:ta tai DNA:ta sisältävällä vektorilla, jol- :.· 25 loin : : aa) cDNA tai DNA koodaa seuraavaa amino happosekvenssiä (i) sekvenssi tunnusnumero 1 (ii) sekvenssi tunnusnumero 2 30 (iii) sekvenssi tunnusnumero 3 tai (iv) sekvenssi tunnusnumero 4 ·; . tai : n bb) cDNA tai DNA koodaa jonkin kohdan aa) mukaisen *:*·. aminohapon alleelisia modifikaatioita, jolloin vähintään 35 yksi aminohapposekvenssin aminohapoista on korvattu, dele- 6 11C669 toitu tai insertoitu samalla oleellisesti vaikuttamatta aktiivisen proteiinin aktiivisuuteen, tai cc) cDNA tai DNA käsittää seuraavan mukleotidi-5 sekvenssin: (i) sekvenssi tunnusnumero 9 (ii) sekvenssi tunnusnumero 10 (iii) sekvenssi tunnusnumero 11 tai (iv) sekvenssi tunnusnumero 12 10 tai dd) cDNA tai DNA on jonkin kohdan cc) mukaisen nuk-leotidisekvenssin alleelinen modifikaatio, jolloin vähintään yksi nukleotidi on korvattu, deletoitu tai insertoitu samalla oleellisesti vaikuttamatta kohdan cc) mukaisen nuk-15 leotidisekvenssin alleelisen modifikaation koodaaman aktiivisen proteiinin aktiivisuuteen, tai (ee) cDNA tai DNA koodaa trombiini-inhibiittoria, jossa on signaalisekvenssi ja jolla on seuraava nukleoti-disekvenssi: . 20 (i) sekvenssi tunnusnumero 13 (ii) sekvenssi tunnusnumero 14 (iii) sekvenssi tunnusnumero 15 tai : ' (iv) sekvenssi tunnusnumero 16 ' tai 25 ff) cDNA tai DNA on jonkin kohdan ee) mukaisen nuk- ·/· leotidisekvenssin alleelinen modifikaatio, jolloin vähin tään yksi nukleotidi on korvattu, deletoitu tai insertoitu samalla oleellisesti vaikuttamatta kohdan ee) mukaisen nuk-leotidisekvenssin alleelisen modifikaation signaalisekvens- 30 si mukaan lukien koodaaman kypsän proteiinin aktiivisuu- I | teen, ja , eristetään ja puhdistetaan proteiini.

Keksinnön mukaisesti saatavat proteiinit, jotka *:· ovat rekombinanttiproteiineja, ovat edullisimpia. Tällöin 35 proteiinit voivat olla glykosyloituja.

7 11C669

Keksinnön mukaisesti saatavat proteiinit käsittävät valmiit proteiinit ja vastaavat edeltäjäproteiinit, jotka muodostuvat signaalisekvenssistä ja kypsän proteiinin sekvenssistä. Tällöin "signaalisekvenssi" edeltää kypsän pro-5 teiinin sekvenssiä. Kypsä proteiini alkaa edellä kohdassa a) mainitulla N-terminaalisella sekvenssillä. "Signaalisekvenssi" tarvitaan endoplasmisen retikulumin läpäisyyn.

Keksintö koskee edelleen myös cDNA:ta tai DNA:ta, joka koodaa kypsää trombiini-inhibiittoria, jolloin 10 aa) cDNA tai DNA koodaa jotakin seuraavista amino happosekvensseistä : (i) sekvenssi tunnusnumero 1; (ii) sekvenssi tunnusnumero 2; (iii) sekvenssi tunnusnumero 3; 15 (iv) sekvenssi tunnusnumero 4; tai bb) cDNA tai DNA koodaa jonkin kohdan aa) aminohapposekvenssin alleelisia modifikaatioita, jolloin ainakin yksi aminohapposekvenssin aminohappo on korvattu, deletoitu 20 tai insertoitu samalla oleellisesti vaikuttamatta aktiivisen proteiinin aktiivisuuteen, tai cc) cDNA:ssa tai DNA:ssa on jokin seuraavista nuk-: * leotidisekvensseistä: ‘ (i) sekvenssi tunnusnumero 9; 25 (ii) sekvenssi tunnusnumero 10; '' (iii) sekvenssi tunnusnumero 11; (iv) sekvenssi tunnusnumero 12; tai dd) cDNA:ssa tai DNArssa on kohdan cc) jonkin nuk-30 leotidisekvenssin alleelinen modifikaatio, jolloin ainakin yksi nukleotidi on korvattu, deletoitu tai insertoitu sa-; , maila oleellisesti vaikuttamatta kohdan cc) mukaisen nukle- ·’/· otidisekvenssin alleelisen modifikaation koodaaman proteii- ·;· nin aktiivisuuteen.

..V 35 Alleeliset modifikaatiot on määritelty edellä.

Keksintö koskee edelleen cDNA:ta tai DNA:ta, joka 8 11C669 koodaa trombiini-inhibiittoria, jossa on signaalisekvenssi, j olioin ee) cDNA:ssa tai DNArssa on jokin seuraavista nuk-leotidisekvensseistä: 5 (i) sekvenssi tunnusnumero 13; (ii) sekvenssi tunnusnumero 14; (iii) sekvenssi tunnusnumero 15; (iv) sekvenssi tunnusnumero 16; tai 10 ff) cDNA:ssa tai DNA:ssa on jonkin kohdan ee) mukaisen nukleotidisekvenssin alleelinen modifikaatio, jolloin ainakin yksi nukleotidi on korvattu, deletoitu tai insertoitu samalla oleellisesti vaikuttamatta kohdan ee) mukaisen nukleotidisekvenssin alleelisen modifikaation, 15 signaalisekvenssi mukaan lukien, koodaaman kypsän proteiinin aktiivisuuteen.

Kaikki DNA-rakenteet luetaan mukaan kuuluviin keksinnön mukaisiin sekvensseihin myös silloin, kun vaihdetaan sellaiset nukleotidit, jotka degeneroituneen koodin vuoksi 20 koodaavat samaa aminohappoa. Tällaisten nukleotidien vaihto ‘ on ilmeistä ja vastaavat aminohapot on esitetty jokaisessa biokemian oppikirjassa. (R. Knippers, 1982, 3. painos, : * Molekulare Genetik, Georg Thieme Verlag).

·.’· Kaikki alleeliset modifikaatiot, jotka johtavat ·.· 25 aminohapposekvenssin muuttumiseen, kuuluvat keksinnön pii- : : riin, mikäli nämä modifikaatiot käsittävät enintään 30 ami nohapon korvaamiset, deleetiot ja/tai insertiot. Edullisia ovat enintään 20 aminohapon, edullisemmin enintään 10 aminohapon, deleetiot, korvaamiset ja/tai insertiot ja edulli-30 simpia ovat yhden, kahden, kolmen, neljän, viiden, kuuden, » t seitsemän, kahdeksan tai yhdeksän aminohapon deleetiot, ’·; _ korvaamiset ja/tai insertiot.

:'. Edelleen keksintö käsittää siten myös geneettisen ·;· materiaalin, joka sisältää kypsää proteiinia koodaavan sek- 35 venssin lisäksi myös signaalisekvenssin. Tämä signaalise- \ ; kvenssi on löydetty cDNA-pankista, mutta myös muut signaa- 9 11C669 lisekvenssit, jotka sallivat proteiinin ilmentämisen ja erittymisen, ovat mahdollisia.

Alleeliset modifikaatiot on määritelty edellä.

Kun ilmoitetaan proteiinin aktiivisuus sen toteami-5 seksi, kuuluuko alleelinen modifikaatio keksinnön mukaisesti saatavien proteiinien ryhmään, niin on aina mitattava kypsä proteiini, silloinkin kun myös signaalisekvenssi on esitetty. Jos signaalisekvenssi on ilmoitettu, on aina mitattava funktio siitä proteiinista, joka saadaan signaa-10 lisekvenssin poistamisen jälkeen.

Kun tarjolla on puhdistettua keksinnön mukaista proteiinia, alan ammattimies voi helposti valmistaa mono-klonaalisia vasta-aineita. Tällöin käytetään Köhlerin ja Milsteinin tunnettuja menetelmiä ja niiden kehitelmiä. Täl-15 löin hiiri immunisoidaan vähitellen tavanomaisella menetelmällä puhdistetulla proteiinilla useita kertoja, otetaan pernasoluja ja fuusioidaan sopivien kasvainsolujen kanssa. Sen jälkeen valitaan hybridit.

Keksinnön mukaisesti proteiinit voidaan eristää pe-20 toluteen Triatoma pallidipennis syljestä. Puhdistus tapah-* tuu geelisuodatuksella ja sitä seuraavalla affiniteettikro- ' matografiällä trombiini-Sepharosella (katso esimerkki 1) .

: ’ Proteiineissa on edellä kuvatut aminohapposekvenssit. Nii- ·. * den moolimassa on n. 18 000 ± 3 000 Da (katso esimerkki 6).

·.· 25 Isoelektrinen piste on pH-alueella 4,5 - 5,2, kun käytetään : : esimerkissä 8 kuvattuja menetelmiä.

Keksinnön mukaisesti saatavat proteiinit inhiboivat trombiinin vaikutusta veren hyytymisessä ja verihiutaleiden aktivoitumisessa ja amidolyyttisessä kokeessa. Koesysteemit 30 on kuvattu esimerkeissä 2, 3, 4 ja 9. Proteiinit inhiboivat i · hyytymistä 8 nmol/l:n pitoisuudella trombiinipitoisuuden *; , ollessa 1,27 nmol/1. Ne inhiboivat trombiini-indusoidun ve- ·/· rihiutaleiden aggregaation 100-%risesti 15 ng/ml:n pitoi- *:* suudella. Tämä pitoisuus vastaa käytetyllä trombiinipitoi- ..V 35 suudella 0,06 IU/ml = 0,812 pmol/ml (IU = kansainvälisiä yksikköjä) trombiinin moolisuhdetta keksinnön mukaiseen 10 11C669 proteiiniin noin 1:1. Toisaalta proteiinit inhiboivat trom-biinin aktiivisuutta amidolyyttisessä kokeessa trombiinin suhteen keksinnön mukaiseen proteiiniin ollessa 1:87 vain noin 50-%:isesti. Proteiinit pidentävät 35 nmol/l:n pitoi-5 suudella trombiiniajän (1 IU/ml) 5-kertaiseksi.

Keksinnön mukaisesti saatavat proteiinit ovat spesifisiä trombiinille. Muut seriiniproteaasit (esim. tekijä Xa tai trypsiini) eivät osoitettavasti inhiboidu 40-kertaisellakaan ylimäärällä (ks. esimerkki 7).

10 Vielä erään osan keksintöä muodostaa vektori, joka sisältää keksinnön mukaisen cDNA:n tai DNA:n sekä sopivaa promoottoria ja mahdollisesti sopivaa tehostajaa. Samoin voi mukaan kuulua vielä "signaalisekvenssi". Vektoreita on kuvattu yksityiskohtaisesti julkaisuissa EP 0 480 651, EP 15 0 462 632 ja EP 0 173 177.

Keksinnön vielä erään toteutusmuodon muodostaa eu-karioottinen tai prokarioottinen isäntäsolu, joka on transformoitu keksinnön mukaisella vektorilla.

Useimmilla deleetioilla, insertioilla ja korvaami-20 silla ei näytä olevan seurauksena mitään perusteellista • · muutosta keksinnön mukaisesti saatavan proteiinin ominaisuuksiin. Jos on vaikeaa ennalta ilmoittaa korvaamisen, de- : * leetion tai insertion tarkka vaikutus, muutetun proteiinin • * *. * funktiota täytyy verrata keksinnön mukaisesti saatavan pro- t · ·.; 25 teiinin funktioon. Tähän käytettäviä menetelmiä on esitetty • · : : esimerkinomaisesti esimerkeissä 2 - 4 ja 9. Standardina toimii sekvenssien tunnusnumero 1-4 mukainen proteiini, samoin myös proteiini, joka puhdistetaan esimerkin 1 mukaisesti, ja myös esimerkin 1 puhdistusmenetelmät vertailupro-30 teiinille.

• · !,, Geneettinen koodi degeneroituu, mikä tarkoittaa, ” . että useimpia aminohappoja koodaa useampi kuin yksi kolmen : '· nukleotidin kodoni. Sen vuoksi jotkut alleeliset modifikaa- ·: tiot nukleotiditasolla eivät johda aminohapposekvenssin ..V 35 muuttumiseen. Sen vuoksi alleeliset modifikaatiot tapahtu- » 11 11C669 vat ennen kaikkea DNA-tasolla ja voivat vaikuttaa sekundää-risesti aminohapposekvenssiin.

cDNA- tai DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat keksinnön mukaisesti saatavia proteiineja, voidaan modifioida ta-5 vanomaisten menetelmien mukaisesti proteiinien muunnelmien valmistamiseksi, joilla muunnelmilla on oleellisesti samanlainen aktiivisuus kuin kuvatuilla ja karakterisoiduilla keksinnön mukaisesti saatavilla proteiineilla. Tällöin aktiivisuus mitataan, kuten esimerkeissä 2 - 4 ja 9 on kuvat-10 tu.

Aminohappoja voidaan korvata, kuten taulukossa 1 on esitetty, samalla oleellisesti vaikuttamatta proteiinin toimintaan. Jokaisessa yksittäisessä tapauksessa on ratkaistava aktiivisuuskokeen avulla, mikä vaikutus muutoksel-15 la on proteiinin toimintaan.

Taulukko 1

Aminohappojen tavallinen korvaaminen proteiinissa 20 Alkuperäinen Esimerkinomaisesti aminohappo mainittu korvaaminen .... Ala Gly, Ser

Arg Lys : 25 Asn Gin, His *. Asp Glu ·.'· Cys Ser : .' Gin Asn

Glu Asp : 30 Gly Ala, Pro

His Asn, Gin

Ile Leu, Vai

Leu Ile, Vai

Lys Arg, Gin, Glu 35 Met Leu, Tyr, Ile

Phe Met, Leu, Tyr ·.’1 Ser Thr

Thr Ser ·; . Trp Tyr .·. 40 Tyr Trp, Phe ’1 ' Vai Ile, Leu * » » · · 12 11C 669

Toiminnat tai immunologinen identiteetti muuttuvat oleellisesti, kun valitaan korvaavat aminohapot, jotka ovat korvaamisessa vähemmän konservatiivisia kuin taulukossa 1 esitetyt aminohapot. Tällaisia oleellisia muutoksia voidaan 5 aikaansaada korvaamalla aminohapoilla, jotka rakenteeltaan ja funktionaalisilta ryhmiltään eroavat enemmän. Oleelliset muutokset vaikuttavat siihen suuntaan, että kolmiulotteinen rakenne muuttuu ja/tai että esimerkiksi laskosrakenne tai kierrerakenne joutuu vaikutuksen kohteeksi. Myös varausten 10 ja hydrofobisten ketjujen vuorovaikutuksia on muutoksissa tarkkailtava.

Mutaatiot määritellään kahden vertailtavana olevan proteiinin homologian (similarity) avulla. Ilmaisu "homologia" käsittää samankaltaiset aminohapot (esimerkiksi tau-15 lukko 1) ja aukot aminohappojen sekvensseissä (homologia = similarity). Keksinnön mukaisesti saatavissa proteiineissa on aminohapposekvenssejä, joiden homologia on vähintään 80 %, edullisesti 90 %, edullisemmin 95 % ja edullisimmin 98 % sellaisten keksinnön mukaisten rakenteiden kanssa, jotka on 20 määritelty kohdan d) tai g) sekvenssien avulla (Seq. Id. No. 1-8) ja jotka edelleen on saatu esimerkin 1 mukaisen • a · · [ puhdistuksen jälkeen.

• · - ’ Kuten edellä on mainittu, keksintö käsittää myös ·. * DNA:n tai cDNA:n modifikaatiot. Nämä modifioidut sekvenssit ·.· 25 hybridisoituvat tarkoissa olosuhteissa DNA-sekvenssien : : kanssa, jotka koodaavat keksinnön mukaisesti saatavia pro teiineja [katso sekvenssit kohdissa aa), cc) ja ee)]. cDNA-tai DNA-sekvensseissä on nukleotidisekvenssejä, joiden identiteetti, mukaan luettuna lyhyehköt (enintään 15 nuk-30 leotidin) deleetiot ja insertiot, on vähintään 70-%:isesti, i * edullisesti 82-%:isesti, edullisemmin 90-%:isesti ja edul-t lisimmin 95-%:isesti, sama kuin keksinnön mukaisilla cDNA- J \ tai DNA-sekvensseillä [ks. aa), cc) ja ee)]. Identiteetti, ;· mukaan luettuna lyhyehköt (enintään 15 nukleotidin) delee- 35 tiot ja insertiot, voidaan mitata hybridisoinnin avulla, kuten on kuvattu julkaisussa R. Knippers, Molekulare Gene- 13 1 tC 669 tik, 1982, kolmas painos, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York.

Edellä mainituilla translaation jälkeisillä modifikaatioilla tarkoitetaan muutoksia, jotka ilmenevät trans-5 laation aikana tai sen jälkeen. Näihin kuuluvat gly-kosylointi, disulfidisiltojen muodostus, aminohappojen kemialliset modifikaatiot, kuten esimerkiksi sulfatointi, joka on kuvattu hirudiinin yhteydessä [J.W. Fenton (1989) "Thrombin Interactions with Hirudin", Seminars in Throm-10 bosis and Hemostasis 15: 265 - 268].

Glykosylointi on endoplasmisen retikulumin ja/tai Golgin laitteen oleellinen funktio. Sekvenssi ja oligosak-karidihaarautuminen muodostuvat endoplasmisessa retikulu-missa ja muuttuvat Golgin laitteessa. Oligosakkaridit voi-15 vat olla N-sitoutuneita oligosakkarideja (asparagiinisitou-tuneita) tai O-sitoutuneita oligosakkarideja (seriini-, treoniini- tai hydroksilysiinisitoutuneita). Glykosylointi-muoto riippuu tuottavasta solutyypistä ja lajista, josta vastaava solutyyppi on peräisin. Glykosyloinnin laajuuteen 20 ja laatuun voidaan vaikuttaa sellaisilla aineilla, jollai- i · * siä on kuvattu julkaisussa EP 0 222 313. Glykosyloinnin • · « · vaihtelu voi muuttaa proteiinin toimintaa.

i · • ’ Proteiinit muodostavat usein kovalenttisia sidoksia ketjujen sisällä. Nämä disulf idisillat muodostuvat kahden • · 25 kysteiinin väliin. Tällöin proteiini laskostuu spesifises- • · : : ti. Disulfidisillat stabiloivat proteiinin kolmiulotteisen rakenteen.

Edelleen aminohappoja voidaan muuttaa, kuten kansainvälisessä julkaisussa WO 91/10 684 on kuvattu. Proteii-30 ni voi myös olla sulfatoitunut. Tämä muutos on kuvattu hi- i · rudiinin yhteydessä.

·1 , Keksinnön mukaisesti proteiinit puhdistetaan edul- ! lisesti esimerkin 1 mukaisesti. Myös muut eristämis- ja ·;· puhdistusmenetelmät ovat kuitenkin mahdollisia: ,.V 35 Methods of Enzymology, Volume 182: Guide to Protein Purifi- i » t>; cation, toim. Murray P. Deutscher, Academic Press, 1990; 14 1.C669

Protein Purification Application - A Practical Approach, toim. E.L.V. Harris ja S. Angel, IRL-Press 1990;

Protein Purification, Principles and Practice, Ropert Scopes, Springer-Verlag 1982, ja 5 Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, toim. H.-C. Janson ja L. Ryden, VCH publishers 1989.

Keksinnön mukaisesti proteiinit eristetään, puhdistetaan ainakin yhdellä pylväällä ja sen jälkeen väkevöi-10 dään. Kromatografiapylväät tai adsorptiokromatografiapyl-väät ovat edullisia.

Keksinnön mukaisesti keksinnön mukainen menetelmä lisäksi koostuu seuraavista vaiheista: syljen vieminen "Superose 12 HR -pylvääseen" ja eluointi ja 15 vieminen uudelleen CH-aktivoituun Sepharose-pylvääseen, johon on etukäteen sidottu trombiini, ja eluointi.

Puhdistus on kuvattu yksityiskohtaisesti esimerkissä 1. Käyttö lääkeaineena

Keksinnön mukaisesti saaduilla proteiineilla on . 20 farmakologisia vaikutuksia ja ne ovat sen vuoksi käyttökel- ' poisia farmaseuttisina tehoaineina. Keksinnön mukaisesti • · « » saatavia proteiineja voidaan käyttää lääkeaineena, joka si- • · • ’ sältää yhtä proteiineista tai niiden seosta ja edelleen *.'· farmaseuttisessa koostumuksessa, joka sisältää yhtä prote- • t *,· 25 iineista tai niiden seosta farmaseuttisesti sopivien ja hy- Γ: väksyttävien yhdisteiden ja kantajien läsnä ollessa. Prote iineja voidaan käyttää myös farmaseuttisessa koostumuksessa, joka sisältää yhtä farmaseuttisesti aktiivisista keksinnön mukaisesti saatavista proteiineista tai niiden seos-30 ta ja farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa tai farmaseut- • » tisesti hyväksyttävää kantajaa.

·; t Keksinnön mukaisesti saatavilla proteiineilla, jot- ί ·. ka ovat sekvenssien tunnusnumerot 1-4 mukaisia, on eri- ·;· tyisesti trombiiniaktiivisuutta inhiboiva vaikutus.

35 Trombiiniaktiivisuuden inhibointi voidaan osoittaa t *,,) hyytymiskokeessa (katso esimerkki 2), verihiutaleiden ag- 11C669 gregaatiokokeessa (katso esimerkki 3), amidolyyttisessä kokeessa (katso esimerkki 4) ja mittaamalla trombiiniaika (katso esimerkki 9). Trombiiniajan mittaus on edullinen koesysteemi.

5 Keksinnön mukaisesti saatavat proteiinit pidentävät trombiiniaikaa 10 - 60 nmol/l:n pitoisuuksilla (trom- biinipitoisuus 1 IU/ml). 58 nmol/l:n pitoisuudella tapahtuu 9-kertainen pidentyminen. Suuremmat pitoisuudet ovat käyttökelpoisia, ilman että häiritään koesysteemiä. Siten pro-10 teiinit ovat käyttökelpoisia 10 - 200 nmol/l:n pitoisuuksilla .

Tämän in vitro -kokeen koetulokset osoittavat, että proteiineja voidaan käyttää lääkeaineina tai lääketieteelliseen hoitoon. Nämä koetulokset voidaan siirtää in vitro 15 -koesysteemistä in vivo -systeemiin, koska hyytymiskokeessa on kysymys vakiintuneesta koejärjestelmästä [M. Talbot (1989) "Biology of Recombinant Hirudin, A New Prospect in the Treatment of Thrombosis" Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15: 293 - 301]. Keksinnön mukaisesti saatavia pro-.·. : 20 teiineja voidaan sen vuoksi käyttää tromboosin, epävakaan rasitusrintakivun tai valtimonkovetustaudin hoitoon ja en-.. naltaehkäisyyn tai suonien uudelleen sulkeutumisen ennalta- '. . ehkäisyyn PTCA/PTA:n (pallokatetrilla suoritetun angioplas- / ’ tian) jälkeen tai veren hyytymisen estämiseen hemodialyy- ··· > 25 sissä. Proteiineja voidaan käyttää antitromboottisena ·.· ja/tai antiarterioskleroottisena lääkkeenä nisäkkäissä, erityisesti ihmisissä, tromboottisten ja/tai arterioskle-roottisten häiriöiden hoitoon. Näitä voi esiintyä arterio-skleroottisten kasaumien (plaques) irrotessa, endoteeliku-.·. : 30 doksen hajotessa, kuten esimerkiksi verenmyrkytyksen, siir- .··· rännäisten tai epävakaan rasitusrintakivun yhteydessä. Nii- '· · tä voidaan käyttää myös uudelleen sulkeutumisen välttämi- ·. ' seksi myokardiaalisen infarktin hoidon jälkeen ja/tai fib- rinolyysissä tai angioplastiassa. Tällöin proteiini voidaan ;·. 35 antaa ennen katetrin sisäänvientiä, sen aikana tai sen jäl- keen.

11C 669

Siten keksinnön mukaisesti saatavia proteiineja tai niiden seoksia voidaan käyttää sellaisen lääkkeen valmistukseen, joka on tarkoitettu tromboosin, epävakaan rasitus-rintakivun tai valtimonkovetustaudin hoitoon tai suonten 5 uudelleen sulkeutumisen ennaltaehkäisyyn PTCA/PTA:n jälkeen tai veren hyytymisen estämiseen hemodialyysissä; Tätä terapeuttista vaikutusta varten ovat erilaiset annokset sopivia. Ne riippuvat esimerkiksi käytettävästä proteiinista, isännästä, antotavasta ja hoidettavien tilo-10 jen laadusta ja vakavuudesta.

Yleisesti kuitenkin odotetaan eläimillä tyydyttäviä tuloksia, kun vuorokausiannokset käsittävät alueen 2 pg:sta 2 000 pg:aan kg:aa kohti kehon painosta. Suuremmilla nisäkkäillä, esimerkiksi ihmisillä, suositeltu vuorokausiannos 15 on alueella 2 - 2 000 pg kg: aa kohti kehon painosta, kun käytetään esimerkin 1 mukaisesti puhdistettua proteiinia. Tämä annos annetaan tarkoituksenmukaisesti esimerkiksi osa-annoksina enintään neljä kertaa vuorokaudessa. Vuorokausiannokset akuuttien veritulppien lyhytaikaisessa hoidossa, 20 jolloin ne ovat 20 - 2 000 pg kg:aa kohti kehon painosta, .... voivat olla suurempia kuin annokset kroonisessa hoidossa, .. jolloin ne ovat 2 - 200 pg kg:aa kohti kehon painosta.

Samoin on odotettavissa tyydyttäviä tuloksia, kun / [ keksinnön mukainen proteiini annetaan ihonalaisesti. Injek- ··· · 25 tio kohdistetaan edullisesti siihen kehon osaan, jossa on ·.· muodostunut veritulppia.

Keksinnön mukaisesti saadut proteiinit voidaan antaa millä tahansa tavallisella tavalla, erityisesti injektioliuosten tai -suspensioiden muodossa.

30 Farmaseuttiset koostumukset, jotka sisältävät yhtä .··· keksinnön mukaisesti saatavista proteiineista tai niiden •· seosta ja ainakin yhtä farmaseuttisesti hyväksyttävää kan- *· ' tajaa tai lisäainetta. Tällaiset koostumukset voidaan val- ’”· mistaa tunnetuilla menetelmillä. Näihin viitataan jul- :*.* 35 kaisussa Remington's Pharmaceutical Science, 15. painos,

Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980).

17 11C 669

Koetuloksia on valaistu kuvioiden avulla, joissa on esitetty yksityiskohdittain seuraavaa:

Kuvio 1: Trombiiniajan pidentäminen lisäämällä lajista Triatoma pallidipennis saatua keksinnön mukaista pro-5 teiinia.

Kuvio 2: Trombiiniaktiivisuuden inhiboituminen ami-dolyyttisessä kokeessa (Triatoma = lajista Triatoma pallidipennis saatu trombiini-inhibiittori).

Kuvio 3: Trombiiniaktiivisuuden inhiboituminen hyy-10 tymiskokeessa.

Esimerkit

Esimerkki 1

Syljen saaminen lajista Triatoma pallidipennis ja keksinnön mukaisen proteiinin puhdistaminen 15 Petoluteiden syljen eritys herätetään niiden imu- kärsän mekaanisella stimuloinnilla. Sylki otetaan talteen lasilevylle ja kootaan silikonisoidulla, vedetyllä pasteur-pipetillä.

Sylki pakastuskuivataan ja liuotetaan tislattuun .·. · 20 veteen 2,5 mg/ml:n pitoisuuteen. 2 ml tästä liuoksesta gee- lisuodatetaan "Superose 12 HR 16/50" -pylväällä (Pharmacia) .. 10 mmol/1 Tris/HCl:ssa, pH 7,4, jossa on 0,0001 % "Pluronic *, F68":a. Hyytymiskokeessa (katso esimerkki 2) aktiiviset '· * fraktiot yhdistetään ja viedään CH-aktivoidulle Sepharosel- · 25 le (Pharmacia) , jolle on etukäteen valmistajan ohjeiden mu- ·.· kaan sidottu trombiini. Proteiini sitoutuu tähän trombiinia sisältävään pylvääseen. Aluksi pylväs pestään Tyrode-puskurilla (ilman seerumialbumiinia), sitten eluoidaan ensin 10 mmol/1 Na-asetaatilla, pH 4,5, ja sitten 10 mmol/1 30 glysiinillä, pH 2,5. Eluaatin pH säädetään arvoon 7. 10 ,··· mmol/1 glysiinieluaatti sisältää puhdistetun proteiinin. Se ’· . on aktiivinen hyytymiskokeessa (katso esimerkki 2), veri- ·. · hiutaleiden aggregaatiokokeessa (katso esimerkki 3), amido- lyyttisessä kokeessa (katso esimerkki 4) ja pidentää trom-;·,· 35 biiniaikaa (katso esimerkki 9) . Valmiste ei sisällä SDS- ,··* geelielektroforeesissa todettavia epäpuhtauksia.

18 11C€69

Esimerkki 2

Trombiiniaktiivisuuden inhiboi tuminen hyytymiskokeessa

Mikrotiitterilevylle, joka on päällystetty naudan 5 seerumialbumiinilla (0,1 % 0,1 mol/1 NaHC03:ssa, pH 9,5), pipetoidaan 80 μΐ 20 iranol/1 HEPES:ä, pH 7,4; 0,15 mmol/1

NaClra; 20 μΐ 20 mmol/1 CaCl2:a; 100 μΐ keksinnön mukaisen proteiinin laimennettua liuosta (5-50 ng) ja 20 μΐ trombiinpa (0,03 IU = 0,03 kansainvälistä yksikköä). Kun on in-10 kuboitu 2 minuuttia 37 °C:ssa, lisätään 100 μΐ fibrinogee- niä (5 mg/ml) ja inkuboidaan 40 minuuttia 37 °C:ssa. Sen jälkeen mitataan absorptio 405 nm:n aallonpituudella. 45 ng (= 8 nmol/1) puhdistettua proteiinia inhiboi fibrinogeenin hajoamisen täydellisesti. Samoissa koeolosuhteissa hiru-15 diinilla on sama vaikutus (täydellinen inhibointi 8 nmol/l:n pitoisuudella) (katso kuvio 3).

Esimerkki 3

Trombiiniaktiivisuuden inhiboituminen verihiutaleiden aggregaatiokokeessa . 20 500 μΐ geelisuodatettuja verihiutaleita (300 000/ .... ml) inkuboidaan tämän keksinnön mukaisesti saatavan protoja iinin kanssa (5 - 100 ng/ml) minuutti 37 °C:ssa. Sen jäi- • · keen indusoidaan aggregaatio trombiinilla (0,06 IU/ml) ja » · ’ # aggregaatio rekisteröidään aggregometrillä. Mittaukset puh- · h· 25 distetulla proteiinilla osoittavat, että 15 ng/ml:n pitoi- ·.* suudella aggregaatio inhiboituu 100-% : isesti.

Esimerkki 4

Trombiiniaktiivisuuden inhiboituminen amidolyytti-sessä kokeessa 30 Mikrotiitterilevyllä inkuboidaan 80 μΐ 100 mmol/1 ,··· Tris/HCl:a, pH 7,4; 150 mmol/1 NaCl:a ja 0,03 IU (1,35 ’· · nmol/1) trombiinia ja 100 μΐ proteiinin laimennettua liuos- *. ’ ta (32 - 630 ng) 10 minuuttia 37 °C:ssa ja sitten lisätään 100 μΐ (50 nmol) substraattia S2238 (Kabi Vitrum). Kun on ;·.* 35 inkuboitu 30 minuuttia 37 °C:ssa, mitataan absorptio 405 nm:n aallonpituudella. 630 ng (117 nmol/1) inhiboi trombii- i9 11C669 nin aktiivisuuden suunnilleen 50-%:isesti. Hirudiini inhiboi 6 nmol/l:n pitoisuudella trombiinin aktiivisuuden 85-%:isesti (katso kuvio 2).

Esimerkki 5 5 N-terminaalisen aminohapposekvenssin määrittäminen

Keksinnön mukaisesti puhdistettu proteiini sekvens-soitiin automaattisessa aminohapposekvenaattorissa (Applied Biosystems, Inc.) valmistajan ohjeiden mukaan. Aminohappojen 1-21 sekvenssi (N-päätteestä) on: Ala-Glu-Gly-Asp- 10 Asp-Cys-Ser-Leu-Glu-Lys-Ala-Met-Gly-Asp-Phe-?-Pro-Glu-Glu-Phe-Phe. "?" tarkoittaa, että ei voitu identifioida täydellä varmuudella. Tämän aminohapon kohdalla on melko todennäköisesti kyse lysiinistä.

Esimerkki 6 15 SDS-geelielektroforeesi ja moolimassan määrittämi nen

Keksinnön mukainen proteiini vietiin pelkistetyssä (pelkistys ditiotreitillä) ja ei-pelkistetyssä tilassa yhdessä molekyylipainomerkki (Electrophoresis Calibration 20 Kit, Pharmacia), fosforylaasi b:n (94 kDa) , albumiinin (67 kDa), ovalbumiinin (43 kDa), karboksyylihappo (30 kDa), trypsiini-inhibiittorin (20,1 kDa) ja laktalbumiinin (14,4 • · kDa) kanssa 12,5-%:iselle SDS-polyakryyliamidigeelille ja, * ’ sen jälkeen kun oli suoritettu elektroforeesi Laemmlin muhi 25 kaan (1970, Nature 227, 680 - 685), värjättiin Coomassie • · ’.· brillant bluella. Pelkistetyssä tilassa proteiini liikkuu elektroforeesin aikana vain hyvin vähän trypsiini-inhibiittorin yläpuolelle. Tämä vastaa noin 21 000 Da:n moolimassaa. Ei-pelkistetyssä tilassa proteiini liikkuu 30 trypsiini-inhibiittorin ja laktalbumiinin välille, mikä ,·*· vastaa noin 18 000 Da: n moolimassaa.

^ > Esimerkki 7 ‘ Keksinnön mukainen proteiini ei inhiboi seriinipro- teaaseja tekijää Xa ja trypsiiniä ;·.· 35 Tekijän Xa ja trypsiinin aktiivisuus mitataan seu- ’·.· raavalla kokeella. 80 pl:aan 50 mmol/1 Tris-HCl:a, pH 8,0, 20 11C 669 227 mmol/1 NaCl, lisätään tekijän Xa määritystä varten 0,004 IU (0,653 pmol) tekijää Xa (American Diagnostica) ja 0,5 pg (28 pmol) keksinnön mukaisesti saatavaa proteiinia ja trypsiinin määritystä varten 0,004 IU (0,019 pmol) tryp-5 siiniä (Sigma) ja 0,016 pg (0,817 pmol) keksinnön mukaisesti saatavaa proteiinia ja inkuboidaan 2 minuuttia 37 °C:ssa. Kun on lisätty 0,05 pmol substraattia S2222 (Ka-bi Vitrum) , inkuboidaan 20 minuuttia 37 °C:ssa ja sen jälkeen mitataan absorptio 405 nm:n aallonpituudella. Näiden 10 seosten absorptio on täsmälleen yhtä suuri kuin absorptio seoksilla, joissa ei ole keksinnön mukaisesti saatavaa proteiinia, so. proteiini ei inhiboi tekijän Xa eikä trypsiinin aktiivisuutta.

Esimerkki 8 15 Isoelektrinen fokusointi

Proteiini viedään geelille isoelektristä fokusointia varten pH-alueella 3-9 (Pharmacia) ja fokusoidaan yhdessä standardiproteiinien kanssa (Calibration Kit, pH 3 -10, Pharmacia). Keksinnön mukaisesti saatavan proteiinin 20 fokusointikohta oli soijapaputrypsiini-inhibiittorin (I.P. r>>t = 4,55) ja β-laktoglobuliini A:n (I.P. = 5,2) kohtien vä lillä.

« > • ·

Esimerkki 9 ’ Trombiiniajan pidentyminen • « 25 Trombiiniaika on koeplasmaan lisätyn eksogeenisen ·,· trombiinin aktiivisuuden mittana. 0,1 ml:aan plasmaa lisä tään 50 pl proteiinin liuosta erilaisina laimennoksina (6 -58 nmol/1) ja 50 pl dietyylibarbituraattiasetaattipusku-ria, jonka pH on 7,6, ja inkuboidaan minuutti 37 °C:ssa.

30 Kun on lisätty 0,1 ml trombiiniliuosta (3 IU/ml), mitataan < * k aika hyytymisen alkamiseen asti (Biomatic 2000 Coagulome- '1 . ter, Sarstedt) . Keksinnön mukaisesti saatava proteiini, jo- » ·.’· ka on 35 nmol/l:n pitoisuutena, pidentää hyytymisaikaa ver- tailuseokseen verrattuna 5-kertaiseksi (katso kuvio 1).

;·!·’ 35 21 V1669

Esimerkki 10

Sisäisten aminohapposekvenssien määrittäminen Lys C:llä katkaisun jälkeen

Puhdistettu proteiini (59 pg) pelkistetään 10-5 %:isella 2-merkaptoetanolilla (2 tuntia huoneenlämpötilassa käyttäen N2:ä suojakaasuna) ja sitten saatetaan reagoimaan 4-vinyylipyridiinin kanssa (2 tuntia huoneenlämpötilassa käyttäen N2:ä suojakaasuna). Kun on suoritettu dialyysi 25 mmol/1 Tris/HCl:ä, pH 8,5; 1 mmol/1 EDTA:a vastaan, lisä-10 tään koetin, jossa on 1 pg Lys C:tä (Boehringer Mannheim), ja inkuboidaan 6 tuntia 37 °C:ssa. Tämä katkaisuseos viedään Supersper RP-18, 4 pm (250 x 4 mm, MZ-Analysentechnik, Mainz) -pylvääseen ja eluoidaan gradientilla 0,l-%:isesta TFAista H20:ssa 0,08-%:iseen TFA:oon 70-%:isessa asetonit-15 rillissä (HPLC-laitteisto Watersilta). Rekisteröidään absorptio 280 nm:n ja 214 nm:n aallonpituuksilla ja eluaatti fraktioidaan. Fraktiot, jotka vastaavat absorptiopiikkiä, haihdutetaan kuiviin ja otetaan talteen 30 pl:aan H20:a. Yksittäiset fraktiot sekvenssoidaan automaattisessa amino-·. ; 20 happosekvenaattorissa (Applied Biosystems Inc.) valmistajan ohjeiden mukaan. Tällöin saadaan selville seuraavat sekvenssit (lähtien kulloinkin N-päätteestä, "?" tarkoittaa, ' että ei identifioitu yksiselitteisesti): '· ' 1. Ala-Met-Gly-Asp-Phe-Lys-Pro-Glu-Glu-Phe-Phe-?- :,·: 25 Gly-Thr-Arg(?)-Tyr-Leu-Ala (aminohapon Arg määritys on epä- · ·* varma) .

2. Gly-Phe-Thr-Gln-Ile-Val-Glu-Ile-Gly-Tyr-Asn-Lys- 3. Asn-Gly-Glu-Gln-Tyr-Ser-Phe-Lys-

Esimerkki 11 * 30 Keksinnön mukaisten cDNA:ien molekyylikloonaus ... Kun keksinnön mukaisesti saatavan proteiinin N- , terminaalisen pään sekvenssi on tunnettu, voidaan määrittää vastaava nukleotidisekvenssi (katso WO 90/07 861) .

'f. aa) Spesifisten koettimien valmistus PCR:llä ..V 35 Keksinnön mukaisten cDNA:ien määrittämiseksi synte- tisoidaan ensin primer (aluke, aloituskappale), joka johde- 22 11C 669 taan etukäteen Edman-hajotuksessa saadusta aminohapposekvenssistä. Alukkeen syntetisoidut oligonukleotidisekvens-sit käytetään keksinnön mukaisen cDNA:n fragmentin amplifi-oimiseen PCR:llä (Polymerase Chain Reaction = polyme-5 raasiketjureaktio) (katso US-patentti 4 800 159). Valmistetaan kaksi oligonukleotidialuketta siten, että johdetaan keksinnön mukaisesti saatavan täydellisen proteiinin N-terminaalisen alueen etukäteen osittain määritetyn aminohapposekvenssin ja yhden sen fragmentin nukleotidisekvens-10 si. Tällöin käytetään seuraavia aminohapposekvenssejä: täydellisen proteiinin N-terminaalinen sekvenssi: Ala-Glu-Gly-Asp-Asp-Cys-Ser-Leu-Glu-Lys-Ala-Met-Gly-Asp- 5 10

Phe 15 15 ja fragmentin N-terminaalinen sekvenssi: Gly-Phe-Thr-Gln-Ile-Val-Glu-Ile-Gly-Tyr-Asn-Lys 5 10 12

Matriisi templaatti koostuu cDNA:sta, joka on peräisin po-· 20 ly-A+-RNA: sta, joka on etukäteen eristetty lajin Triatoma pallidipennis sylkirauhasista (Sambrock et ai.: Molekular

Cloining (kappale 7, s. 18 - 22, Cold Spring Harbor Labora-• * tory Press, 1989) .

'· ’ Matriisialoituskappale (sense primer) : :.: 25 5'-GCI GA (A/G) GGI GA(C/T) GA(C/T) TG(C/T) TCI CTI GA (A/G) AA (A/G) GCI AT G GGI GA(C/T) TT-3'

Ei-matriisialoituskappale (antisense primer): 5'-TT (G/A)TT (G/A)TA ICC (G/A)AT (T/C)TC IAC (G/A)AT (T/C)TG IGT (G/A)AA-3 30 A = desoksiadenosiini; C = desoksisytidiini ; '1 . G = desoksiguanosiini ; T = desoksitymidiini ja ;··.’ I = desoksi-inosiini ;.V 35 23 11C 669 PCR koostuu 40 syklistä. Yksi sykli on seuraavanlainen: a) 2 minuutin denaturointi 94 °C:ssa, b) 90 sekunnin hybridisointi 52 °C:ssa ja c) 2 minuutin pidentäminen 72 °C:ssa.

5 Edellä kuvatulla menetelmällä saadulla PCR- monistustuotteella on agaroosigeelillä yksi vyöhyke. Se eristetään agaroosigeelistä, jolla on alhainen sulamispiste ja siirretään suoraan PCR-plasmidiin (Stratagene) ja sub-kloonataan. Menetelmä vastaa valmistajan esittämää menetel-10 mäkuvausta (pCR-Script™ SK(+) Cloning Kit, Stratagen). In-sertiotuotteen DNA-sekvenssi vastaa PCR-tuotteen sekvenssiä ja määritetään kuten julkaisussa Sanger et ai. Proc Natl Acad Sei USA (1977) 74: 5463 - 5467 on kuvattu.

bb) cDNA-pankin valitsemismenetelmä ja keksinnön 15 mukaisten cDNA-kloonien eristäminen

Noin 400 000 primääristä kloonia, jotka on saatu lajin T. pallidipennis sylkirauhas-cDNA-pankista (cDNA-kirjasto), siirretään nailonkalvoille (Pall Biosupport East Hills, NY, USA) ja seulotaan, kuten valmistaja määrää. Täl-, . 20 löin käytetään leimattua koetinta, joka on saatu edellä ku- ' * vatun PCR-monistusmenetelmän avulla. Valitsemismenettely suoritetaan kaksi kertaa, minkä jälkeen faagi-DNA muutetaan • ' plasmidi-DNA:ksi ja suoritetaan tämän plasmidin insertin ·.'· (DNA sijoitettu) sekvenssianalyysi. Siten aikaansaadaan • · ·,· . 25 neljä cDNA-sekvenssiä, jotka on kuvattu sekvenssi tunnusnu- : : meroilla 13 - 16, jolloin ainoastaan aminohappoja -17 - -9 koodaavat kolmikot Ti 28:sta ja Ti 45:stä ja aminohappoa -18 koodaava kolmikko Ti 12:sta puuttuvat.

Eristetystä DNA:sta sekvenssoidaan kulloinkin kum-30 pikin säie. Koodaavasta DNA:sta johdettu aminohapposekvens-si vastaa täydellisesti aminohapposekvenssiä, joka havait-, tiin edellä keksinnön mukaisesti puhdistetun proteiinin Ed- man-hajotuksen avulla.

*: * · Pisin cDNA-klooni (Til2) alkaa nukleotideillä TG, 35 jotka vastaavat metioniinin epätäydellistä aloituskodonia. Tämä käy ilmi, kun otetaan huomioon toinen eristetty klooni 24 110669 (Ti5), joka löytyi 600 000 faagia käsittävällä valitsemismenetelmällä samasta cDNA-pankista, jota käytettiin Til2:n, Ti28:n ja Ti45:n valitsemisessa.

5 Taulukko 2

Asemat, joissa keksinnön mukaisesti saatavilla proteiineilla on eroja

Klooni

Ti5 Til2 Ti28 Ti45 10 Asema 8 Ile Leu Leu Leu

Asema 32 Gly Gly Asp Asp

Asema 72 Vai Vai Vai Ala

Asema 74 Asn Asn Asn Lys

Asema 77 Gly Asp Asp Asp 15 Asema 86 Ser Gly Gly Gly

Asema 114 Thr Ile Ile Thr

Asema 127 Leu Phe Phe Phe

Asema 139 Lys Asn Asn Asn 20 Keksinnön mukaisesti saatavan proteiinin neljä cDNA-sekvenssiä valitaan, identifioidaan ja sekvenssoidaan » i · · edellä kuvattujen menetelmien mukaisesti. Johdetussa amino- * · : ‘ happosekvenssissä on eroja ainoastaan yhdeksässä asemassa.

\ * Erot on lueteltu taulukossa 2.

·.· 25 Neljän valmiin proteiinin identiteetti (identity) I · : : ja samankaltaisuus (similarity) on noin 95 tai 98 % aina sen mukaan, mikä vertailupari valitaan.

Esimerkki 12

Keksinnön mukaisesti saatavaa proteiinia koodaavan 30 plasmidin valmistus ja E. colissa. valmistetun proteiinin • » ilmentäminen ja puhdistus , Jos DNA-sekvenssit tunnetaan, niin kyseessä oleviin : DNA-sekvensseihin voidaan sitoa sopivia promoottoreja ja ·:· mahdollisesti sopivia vahvistajia, niin että saadaan käyt- 35 tökelpoinen vektori (M. Wirth, L. Schumacher ja H. Hauser, H.S. Conradt (toim. ) Protein Glycosylation, Cellular Bio- 25 110 6 6 9

technical and Analytical Aspects, Vol. 15, 49 - 52, VCH

publishers, Weinheim, 1991); sekä J. Krätzschmar et ai. (1992) Gene 116: 281 - 284. Tällaisen vektorin ilmentyminen on mahdollista eukariooteissa (esimerkiksi hamsterin poi-5 kasten munuaissoluissa). Edelleen DNA-sekvenssejä voidaan insertoida sopiviin prokarioottisiin vektoreihin E. coli -kannoissa ilmentämistä varten.

a) Plasmidin valmistus (i) Esisiirtäminen 10 Rakenne rekombinanttiproteiinin ilmentämiseksi pro- kariooteissa valmistetaan siten, että käytetään kaupallisesti saatavissa olevaa plasmidia pKK233-2, joka sisältää IPTG-indusoituvan trc-promoottorin. Ilmentämiseen sopiva vektori käsittää tämän plasmidin pKK233-2, jossa ovat in-15 sertoituina sekä proteiinia koodaava sekvenssi että signaa-lisekvenssi. Signaalisekvenssi on modifioitu signaalise-kvenssi, joka on peräisin E. colin erittämästä proteiinista syklofiliini a. Signaalisekvenssiä ja koodaavaa DNA:ta käytetään myötävirtaan (downstream) promoottorista, jolloin 20 muodostuu pKK/ cph [T. Hayano (1991) Biochemistry 30: 3041 - 3048] .

* · ·

Proteiinia koodaavat sekvenssit insertoidaan ilmen-·’ ' tämisplasmidiin ja näin saatu rakenne (pKK/cph-proteiini) * i ’. ’ käytetään sopivien (kompetent) E. coli JM 105 -solujen • * ·.· 25 transformaatioon.

: (ii) Plasmidin pKK/cph muodostaminen

Seuraavaa toistensa kanssa osittain päällekkäin menevää ja komplementaarista oligodesoksinukleotidien paria käytetään syklofiliinin a signaalisekvenssiä koodaavan 30 DNA:n kopioimiseen. Tällöin syklofiliinisekvenssin vastaava C-terminaalinen pää modifioidaan bakteerien signaalipepti-*; , daasia varten optimaalisen katkaisukohdan muodostamiseksi.

! Modifiointi käsittää sen, että C-terminaalisen pään seitse- ·;· män viimeistä kolmikkoa vaihdetaan kolmikkoihin, jotka koo- ..V 35 daavat seuraavaa aminohapposekvenssiä: Phe-Ser-Ala-Ser-Ala- 26 110669

Leu-Ala (R.E. Dalbey ja G. von Heijne (1992) TIBS 17: 474 -478) .

Sense-oligonukleotidisekvenssi: (sense oligo) 5'-GCGATAACAT GTTCÄAAAGC ACCCTGGCGG CGATGGCTGC TGTTTTCGCT 5 CTGTCTG-3';

Antisense-oligonukleotidisekvenssi: (antisense oligo) 5'-CGCTATAAGC TTCTGCAGGC TAGCGCGCTC GCGCTGAAAG CAGACACAGT CGAAACAG-3'

Kun aloitussekvenssi on liitetty ja sen jälkeen ty-10 tärkappaleet käänteiskopioitu käyttämällä Taq-polymeraasia, katkaistaan DNA-fragmentit Afllllrlla ja HindIII:lla. Kat-kaisukohdat on alleviivattu. Sen jälkeen subkloonataan DNA-fragmentti plasmidin pKK233-2 Ncol- ja Hindlll-kohdan välillä. Nhel-kohta, joka helpottaa yhdessä Hindlll-kohdan 15 kanssa cDNA-kappaleen jatkosubkloonausta, on merkitty lihavoinnilla .

(il) Plasmidin muodostaminen keksinnön mukaisesti saatavan proteiinin kanssa

Valmista proteiinia (Ti28 = Seq. Id. No 2) koodaa- ,·, 20 van sekvenssin monistamiseksi käytetään seuraavaa paria • » aloitussekvenssissä (primer). Tällöin insertioon plasmidiin pKK/cph käytetään alleviivattuja Nhel-ja Hindlll- » · • ’ katkaisukohtia.

i i ’· * Sense-oligonukleotidisekvenssi: (sense oligo) • · •, 25 5'-GCGÄTAGCTA GCAGCAGAAG GTGACGAC-3'; • ·

Antisense-oligonukleotidisekvenssi: (antisense oligo) 5'-GCGATAGGAT CCAAGCTTÄC TAACAAATTT CATTAGCATC AGG-3' PCR:ä (polymerase chain reaction = polymeraasiketjureaktio) varten suoritetaan kymmenen sykliä, jotka koos-30 tuvat 2 minuutista 94 °C:ssa, 2 minuutista 30 °C:ssa ja 2,5 * · minuutista 72 °C:ssa, jolloin käytetään 2 pg matriisisäiet-'! . tä (mallia). Monistettu DNA eristetään alhaisessa lämpöti- '/· lassa sulavasta agaroosigeelistä, katkaistaan Nhel:llä ja G* HindIII:lla ja siirretään plasmidiin pKK/cph, joka on ai- ;.V 35 kaisemmin katkaistu samoilla restriktioendonukleaaseilla.

27 1-C669 Näin saatu rakenne tutkitaan koodaavan DNA:n ja koodaavaan DNA:hän liitetyn DNA:n kokonaissekvenssoinnin avulla.

(lii) E. colin transformaatio E. coli JM 105 -solut transformoidaan käyttäen 5 CaCl2-menetelmää. Tällöin käytetään 1 yg pKK/cph-DNA:ta, joka koodaa keksinnön mukaisesti saatavaa proteiinia.

b) Keksinnön mukaisesti E. colilla valmistetun proteiinin puhdistus ja karakterisointi

Transformoitujen E. coli -solujen viljelmään lisä-10 tään IPTG:tä (1 mmol/1) ja inkuboidaan 37 °C:ssa kuusi tuntia (IPTG = isopropyyli-B-D-tiogalaktosidi). Solut erotetaan sentrifugoimalla ja niille annetaan osmoottinen sokki (sakkaroosi- ja sen jälkeen H20-käsittely). Näin saatu pe-riplasmafraktio inhiboi hyytymiskokeessa (vertaa esimerkki 15 2) trombiinin aktiivisuutta. Inhibointiaktiivisuus puhdis tetaan ioninvaihtokromatografiällä DE-52-selluloosalla ja trombiiniaffiniteettikromatografiällä (vertaa esimerkki 1).

Puhdistetulla fraktiolla on sama inhibointiaktiivisuus kuin sylkiproteiinilla. Sillä on identtinen vaste SDS-,·. : 20 polyakryyliamidielektroforeesissa (vertaa esimerkki 6).

Edelleen se vastaa N-terminaalisessa aminohapposekvenssissä valmista sylkiproteiinia.

110669 28

(1) ALLGEMEINE ANGABEN

(i) ANMELDER:

(A) NAME: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT

(B) STRASSE: MIJLLERSTRASSE178

5 (C) ORT: 13353 BERLIN

(E) LAND: DEUTSCHLAND

(F) POSTLEITZAHL: 13353 (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Thrombininhibltor aus

Speichel von Protostomiern 10 (ill) ANZAHL DER SEQUENZEN: 29 Sequenzprotokolle

(iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG

(A) DATENTREÄGER: DISKETTE

(B) COMPUTER: 486/INTEL

(C) BETRIEBSSYSTEM: WINDOWS

15 (D) SOFTWARE: WINWORD; (v) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG: PCT/DE 93/91172 110669 29 (2) ANGABENZU SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENZKENNZEICHEN SEQUENZLÄNGE: 142 Aminosäuren 5 ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKClLS: reifes Protein Ti 12 URSPRIJNGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/ISOLAT: Ti 12 10 MERKMAL: als reifes Protein:Thrombininhibitor SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1: 15

Ala Glu Gly Asp Asp Cys Ser Leu Glu Lys Ala Met Gly Asp Phe 5 10 15

Lys Pro Glu Glu Phe Phe Asn Gly Thr Trp Tyr Leu Ala His Gly 20 20 25 30

Pro Gly Val Thr Ser Pro Ala Val Cys Gin Lys Phe Thr Thr Ser 35 40 45 25 Gly Ser Lys Gly Phe Thr Gin lie Val Glu lie Gly Tyr Asn Lys 50 55 60

Phe Glu Ser Asn Val Lys Phe Gin Cys Asn Gin Val Asp Asn Lys 65 70 75 30

Asn Asp Glu Gin Tyr Ser Phe Lys Cys Lys Gly Ser Asp Asn Thr 80 85 90

Glu Phe Glu Ala Asp Phe Thr Phe lie Ser Val Ser Tyr Asp Asn 35 95 100 105 .·.· Phe Ala Leu Val Cys Arg Ser lie lie Phe Thr Ser Gin Pro Lys 110 115 120 40 Glu Asp Asp Tyr Leu Val Phe Glu Arg Thr Lys Ser Asp Thr Asp 125 130 135

Pro Asp Ala Asn Glu lie Cys 140 30 11C 669 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENZKENNZEICHEN SEQUENZLÄNGE: 142 Aminosäuren 5 ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKLJLS: reifes Protein Ti 28 URSPRLINGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/ISOLAT: Ti 28 10 MERKMAL: als reifes Protein:Thrombininhibitor SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2: 15 Ala Glu Gly Asp Asp Cys Ser Leu Glu Lys Ala Met Gly Asp Phe 5 10 15

Lys Pro Glu Glu Phe Phe Asn Gly Thr Trp Tyr Leu Ala His Gly 20 25 30 20

Pro Asp Val Thr Ser Pro Ala Val Cys Gin Lys Phe Thr Thr Ser 35 40 45

Gly Ser Lys Gly Phe Thr Gin lie Val Glu lie Gly Tyr Asn Lys 25 50 55 60

Phe Glu Ser Asn Val Lys Phe Gin Cys Asn Gin Val Asp Asn Lys 65 70 75 30 Asn Asp Glu Gin Tyr Ser Phe Lys Cys Lys Gly Ser Asp Asn Thr 80 85 90

Glu Phe Glu Ala Asp Phe Thr Phe lie Ser Val Ser Tyr Asp Asn \'· 95 100 105 • 35 *;·. Phe Ala Leu Val Cys Arg Ser lie lie Phe Thr Ser Gin Pro Lys : V 110 115 120

Glu Asp Asp Tyr Leu Val Phe Glu Arg Thr Lys Ser Asp Thr Asp 40 125 130 135

Pro Asp Ala Asn Glu lie Cys 140 31 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3: 11C669 (i) SEQUENZKENNZEICHEN SEQUENZLÄNGE: 142 Aminosäuren ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz 5 TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKLJLS: reifes Protein Ti 45 URSPRIJNGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/ISOLAT: Ti 45 MERKMAL: als reifes Protein:Thrombininhibitor 10 SEQUENZBESGHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

Ala Glu Gly Asp Asp Cys Ser Leu Glu Lys Ala Met Gly Asp Phe 15 5 10 15

Lys Pro Glu Glu Phe Phe Asn Gly Thr Trp Tyr Leu Ala His Gly 20 25 30 20 Pro Asp Val Thr Ser Pro Ala Val Cys Gin Lys Phe Thr Thr Ser 35 40 45

Gly Ser Lys Gly Phe Thr Gin lie Val Glu lie Gly Tyr Asn Lys 50 55 60 25

Phe Glu Ser Asn Val Lys Phe Gin Cys Asn Gin Ala Asp Lys Lys 65 70 75 , , Asn Asp Glu Gin Tyr Ser Phe Lys Cys Lys Gly Ser Asp Asn Thr 30 80 85 90

Glu Phe Glu Ala Asp Phe Thr Phe lie Ser Val Ser Tyr Asp Asn 95 100 105 ·,’· 35 Phe Ala Leu Val Cys Arg Ser lie Thr Phe Thr Ser Gin Pro Lys .· 110 115 120 :Y Glu Asp Asp Tyr Leu Val Phe Glu Arg Thr Lys Ser Asp Thr Asp 125 130 135 40

Pro Asp Ala Asn Glu lie Cys 140 32 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4: 1 (i) SEQUENZKENNZEICHEN SEQUENZLÄNGE: 142 Aminosäuren ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz 5 TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKIJLS: reifes Protein Ti 5 URSPRIJNGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/ISOLAT: Ti 5 MERKMAL: als reifes Protein:Thrombininhibitor 10 SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

Ala Glu Gly Asp Asp Cys Ser lie Glu Lys Ala Met Gly Asp Phe 5 10 15 15

Lys Pro Glu Glu Phe Phe Asn Gly Thr Trp Tyr Leu Ala His Gly 20 25 30

Pro Gly Val Thr Ser Pro Ala Val Cys Gin Lys Phe Thr Thr Ser 20 35 40 45

Gly Ser Lys Gly Phe Thr Gin lie Val Glu lie Gly Tyr Asn Lys 50 55 60 25 Phe Glu Ser Asn Val Lys Phe Gin Cys Asn Gin Val Asp Asn Lys 65 70 75

Asn Gly Glu Gin Tyr Ser Phe Lys Cys Lys Ser Ser Asp Asn Thr 80 85 90 30

Glu Phe Glu Ala Asp Phe Thr Phe lie Ser Val Ser Tyr Asp Asn 95 100 105 : , Phe Ala Leu Val Cys Arg Ser lie Thr Phe Thr Ser Gin Pro Lys 35 110 115 120 .·.· Glu Asp Asp Tyr Leu Val Leu Glu Arg Thr Lys Ser Asp Thr Asp 125 130 135 40 Pro Asp Ala Lys Glu lie Cys 140 I » I » 33 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5: ^ 10669 (i) SEQUENZKENNZEICHEN SEQUENZLÄNGE: 160 Aminosäuren ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz 5 TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKLILS: reifes Protein mit Signalsequenz Ti 12 URSPRLJNGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/ISOLAT: Ti 12 MERKMAL: als reifes Protein:Thrombininhibitor 10 SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

Met Lys Thr -18 -17 15 He Ile Ala Val Thr He Phe Gly He Leu Thr Cys Ala Tyr Ala -15 -10 -5 -1

Ala Glu Gly Asp Asp Cys Ser Leu Glu Lys Ala Met Gly Asp Phe 5 10 15 20

Lys Pro Glu Glu Phe Phe Asn Gly Thr Trp Tyr Leu Ala His Gly 20 25 30

Pro Gly Val Thr Ser Pro Ala Val Cys Gin Lys Phe Thr Thr Ser 25 35 40 45

Gly Ser Lys Gly Phe Thr Gin He Val Glu He Gly Tyr Asn Lys 50 55 60 30 Phe Glu Ser Asn Val Lys Phe Gin Cys Asn Gin Val Asp Asn Lys 65 70 75 : : Asn Asp Glu Gin Tyr Ser Phe Lys Cys Lys Gly Ser Asp Asn Thr 80 85 90 35

Glu Phe Glu Ala Asp Phe Thr Phe He Ser Val Ser Tyr Asp Asn 95 100 105

Phe Ala Leu Val Cys Arg Ser He He Phe Thr Ser Gin Pro Lys 40 110 115 120

Glu Asp Asp Tyr Leu Val Phe Glu Arg Thr lie Lys Ser Asp Thr ,·[ ' 125 130 135 ’·’ 45 Asp Pro Asp Ala Asn Glu He Cys 140 34 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6: 110669 (i) SEQUENZKENNZEICHEN SEQUENZLÄNGE: 160 Aminosäuren ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz 5 TOPOLOGI E: linear ART DES MOLEKLJLS: reifes Protein Ti 28 URSPRLJNGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/ISOLAT: Ti 28 MERKMAL: als reifes Protein:Thrombininhibitor 10 SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

Met Lys Thr -18

Ile Ile Ala Val Thr lie Phe Gly lie Leu Thr Cys Ala Tyr Ala 15 -15 -10 -9 -8 -5 -1

Ala Glu Gly Asp Asp Cys Ser Leu Glu Lys Ala Met Gly Asp Phe 5 10 15 20

Lys Pro Glu Glu Phe Phe Asn Gly Thr Trp Tyr Leu Ala His Gly 20 25 30

Pro Asp Val Thr Ser Pro Ala Val Cys Gin Lys Phe Thr Thr Ser 25 35 40 45

Gly Ser Lys Gly Phe Thr Gin lie Val Glu lie Gly Tyr Asn Lys , · 50 55 60 30 Phe Glu Ser Asn Val Lys Phe Gin Cys Asn Gin Val Asp Asn Lys ; ' 65 70 75 • Asn Asp Glu Gin Tyr Ser Phe Lys Cys Lys Gly Ser Asp Asn Thr 80 85 90 35

Glu Phe Glu Ala Asp Phe Thr Phe lie Ser Val Ser Tyr Asp Asn 95 100 105

Phe Ala Leu Val Cys Arg Ser lie lie Phe Thr Ser Gin Pro Lys 40 110 115 120

Glu Asp Asp Tyr Leu Val Phe Glu Arg Thr Lys Ser Asp Thr Asp * 125 130 135 1

Pro Asp Ala Asn Glu lie Cys 140 35 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7: 110669 (i) SEQUENZKENNZEICHEN SEQUENZUMMGE: 160 Aminosäuren ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz 5 TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKLJLS: reifes Protein mit signalsequenz Ti 45 URSPRLJNGIICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/iSOLAT: Ti 45 MERKMAL: als reifes Protein:Thrombininhibitor 10 SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

Met Lys Thr -18 15 Ile Ile Ala Val Thr lie Phe Gly lie Leu Thr Cys Ala Tyr Ala -15 -10 -9 -8 -5 -1

Ala Glu Gly Asp Asp Cys Ser lie Glu Lys Ala Met Gly Asp Phe 20 5 10 15

Lys Pro Glu Glu Phe Phe Asn Gly Thr Trp Tyr Leu Ala His Gly 20 25 30 25 Pro Asp Val Thr Ser Pro Ala Val Cys Gin Lys Phe Thr Thr Ser 35 40 45

Gly Ser Lys Gly Phe Thr Gin lie Val Glu lie Gly Tyr Asn Lys 50 55 60 30 .... Phe Glu Ser Asn Val Lys Phe Gin Cys Asn Gin Ala Asp Lys Lys ' 65 70 75 t * I ·

Asn Asp Glu Gin Tyr Ser Phe Lys Cys Lys Gly Ser Asp Asn Thr 35 80 85 90 • > • » ·’* Glu Phe Glu Ala Asp Phe Thr Phe lie Ser Val Ser Tyr Asp Asn : V 95 100 105 40 Phe Ala Leu Val Cys Arg Ser lie Thr Phe Thr Ser Gin Pro Lys 110 115 120

Glu Asp Asp Tyr Leu Val Phe Glu Arg Thr Lys Ser Asp Thr Asp 125 130 135 ; · 45

Pro Asp Ala Asn Glu lie Cys ‘I . 140 * • · t · 36 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8: 110669

(i) SEQUENZKENNZEiCHEN

SEQUENZLÄNGE: 160 Aminosäuren ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz 5 TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKLJLS: reifes Protein Ti 5 URSPRLJNGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/ISOLAT: Ti 5 MERKMAL: als reifes Protein:Thrombininhibitor 10 SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

Met Lys Thr -18

Ile Ile Ala Val Thr lie Phe Gly lie Leu Thr Cys Ala Tyr Ala 15 -15 -10 -5 -1

Ala Glu Gly Asp Asp Cys Ser lie Glu Lys Ala Met Gly Asp Phe 5 10 15 20 Lys Pro Glu Glu Phe Phe Asn Gly Thr Trp Tyr Leu Ala His Gly 20 25 30

Pro Gly Val Thr Ser Pro Ala Val Cys Gin Lys Phe Thr Thr Ser 35 40 45 25

Gly Ser Lys Gly Phe Thr Gin lie Val Glu lie Gly Tyr Asn Lys 50 55 60

Phe Glu Ser Asn Val Lys Phe Gin Cys Asn Gin Val Asp Asn Lys 30 65 70 75 ’· ‘ Asn Gly Glu Gin Tyr Ser Phe Lys Cys Lys Ser Ser Asp Asn Thr 80 85 90 35 Glu Phe Glu Ala Asp Phe Thr Phe lie Ser Val Ser Tyr Asp Asn ,· 95 100 105 * » f > .·,· Phe Ala Leu Val Cys Arg Ser lie Thr Phe Thr Ser Gin Pro Lys 110 115 120 40

Glu Asp Asp Tyr Leu Val Leu Glu Arg Thr Lys Ser Asp Thr Asp 125 130 135

Pro Asp Ala Lys Glu lie Cys 45 140 i * * t > » » * » 37 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9: (i) SEQUENZKENNZEICHEN II 1)00? SEQUENZLÄNGE: 429 Nukleotide ART DER SEQUENZ: Nukleotid-Sequenz 5 STRANGFORM: ' Einzelstrangform TOPOLOGIE: linear HYPOTHETISCH: nein ANTISENS: _ nein

ART DES MOLEKIJLS: reifes Protein Ti 12 kodierende cDNA

10 URSPRLjNGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/ISOLAT: Ti 12

ZELLTYP: EINZELLIGER ORGANISMUS

MERKMAL: kodierend fur ein reifes Protein:Thrombininhibitor SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9: 15 GCA GAA GGT GAC GAC TGT TCA TTA GAA AAA GCT ATG GGG GAC TTT 045 AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG GCT CAT GGA 090 CCG GGC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT ACT ACT AGT 135 GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG TAC AAC AAA 180 20 TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GTT GAT AAT AAA 225 AAT GAC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA GGT AGT GAT AAT ACT 27 0 GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC TAT GAT AAC 315 TTT GCT TTA GTT TGT AGA AGT ATC ATA TTT ACA TCA CAG CCT AAG 360 GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTC GAA CGG ACT AAA AGT GAC ACA GAT 405 • 25 CCT GAT GCT AAT GAA ATT TGT TAG 429 I ♦ 38 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10: (i) SEQUENZKENNZEICHEN 110669' SEQUENZLÄNGE: 429 Nukleotide ART DER SEQUENZ: Nukleotid-Sequenz 5 STRANGFORM: Einzelstrangform TOPOLOGIE: linear HYPOTHETISCH: nein ANTISENS: nein

ART DES MOLEKLJLS: fur reifes Protein Ti 28 kodierende cDNA

10 URSPRLJNGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/ISOLAT: Ti 28

ZELLTYP: EINZELLIGER ORGANISMUS

MERKMAL: kodierend fur ein reifes Protein:Thrombininhibitor SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10: 15 GCA GAA GGT GAC GAC TGT TCA TTA GAA AAA GCT ATG GGG GAC TTT 045 AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG GCT CAT GGA 090 CCG GAC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT ACT ACT AGT 135 20 GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG TAC AAC AAA 180 TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GTT GAT AAT AAA 225 AAT GAC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA GGT AGT GAT AAT ACT 270 GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC TAT GAT AAC 315 TTT GCT TTA GTT TGT AGA AGT ATC ATA TTT ACA TCA CAG CCT AAG 360 25 GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTC GAA CGG ACT AAA AGT GAC ACA GAT 405 CCT GAT GCT AAT GAA ATT TGT TAG 429 • I · • I · • ·

• I

• 1 > * 39 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11: (i) SEQUENZKENNZEICHEN λΑΓ\660 SEQUENZLÄNGE: 429 Nukleotide UUOO^ ART DER SEQUENZ: Nukleotid-Sequenz 5 STRANGFORM: Einzelstrangform TOPOLOGIE: linear HYPOTHETISCH: nein ANTISENS: nein

ART DES MOLEKIJLS: fur reifes Protein Ti 12 kodierende cDNA

10 URSPRIJNGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/ISOLAT: Ti 45

ZELLTYP: EINZELLIGER ORGANISMUS

MERKMAL: kodierend fur ein reifes Protein:Thrombininhibitor SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11: 15 GCA GAA GGT GAT GAC TGT TCA TTA GAA AAA GCT ATG GGG GAC TTT 045 AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG GCT CAT GGA 09 0 CCG GAC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT ACT ACT AGT 135 GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG TAC AAC AAA 180 20 TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GCT GAC AAA AAA 225 AAT GAC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA GGT AGT GAT AAT ACT 270 GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC TAT GAT AAC 315 TTT GCT CTA GTT TGT AGA AGT ATC ACA TTT ACA TCA CAG CCT AAG 360 GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTC GAA CGG ACT AAA AGT GAC ACA GAT 405 ’ 25 CCT GAT GCT AAT GAA ATT TGT TAG 429 »

* I t I

t I

* ( ( » 40 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12: (i) SEQUENZKENNZEICHEN' AAf\HCC\ SEQUENZLÄNGE: 429 Nukleotide I lUOO? ART DER SEQUENZ: Nukleotid-Sequenz 5 STRANGFORM: Einzelstrangform TOPOLOGIE: linear HYPOTHETISCH: nein ANTISENS: nein

ART DES MOLEKLJLS: fur reifes Protein Ti 5 kodierende c DNA

10 URSPRClNGUCHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/ISOLAT: Ti 5

ZELLTYP: EINZELLIGER ORGANISMUS

MERKMAL: kodierend fur ein reifes Protein:Thrombininhibitor SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12: 15 GCA GAA GGT GAT GAC TGT TCA ATA GAA AAA GCT ATG GGG GAC TTT 045 AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG GCT CAT GGA 090 CCG GGC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT ACT ACT AGT 135 GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG TAC AAC AAA 180 20 TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GTT GAC AAT AAA 225 AAT GGC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA AGT AGT GAT AAT ACT 270 GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC TAT GAT AAC 315 TTT GCT CTA GTT TGT AGA AGT ATC ACA TTT ACA TCA CAG CCT AAG 360 GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTA GAA CGG ACT AAA AGT GAC ACA GAT 405 25 CCT GAT GCT AAA GAA ATT TGT TAG 429 > · » » t * · I · » » I . > * t

V i I

41 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN

SEQUENZLÄNGE: 483 Nukleotide ' iUOOy ART DER SEQUENZ: Nukleotid-Sequenz 5 STRANGFORM: Einzelstrangform TOPOLOGIE: linear HYPOTHETISCH: nein ANTISENS: nein ART DES MOLEKIILS: fur reifes Protein Ti 12 mit Signalsequenz kodierende

10 cDNA

URSPRIJNGUCHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/ISOLAT: Ti 12

ZELLTYP: EINZELLIGER ORGANISMUS

MERKMAL: kodierend fur ein reifes Protein:Thrombininhibitor 15 SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13: ATG AAG ACG ATC ATT GCA GTG ACA ATT TTT GGA ATT TTG ACA TGT 045 GCA TAT GCA GCA GAA GGT GAC GAC TGT TCA TTA GAA AAA GCT ATG 090 GGG GAC TTT AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG 135 20 GCT CAT GGA CCG GGC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT 180 ACT ACT AGT GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG 225 TAC AAC AAA TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GTT 270 GAT AAT AAA AAT GAC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA GGT AGT 315 GAT AAT ACT GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC 360 \ 25 TAT GAT AAC TTT GCT TTA GTT TGT AGA AGT ATC ΑΤΑ TTT ACA TCA 405 CAG CCT AAG GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTC GAA CGG ACT AAA AGT 450 GAC ACA GAT CCT GAT GCT AAT GAA ATT TGT TAG 483 42 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14: (i) SEQUENZKENNZEICHEN 11Π669

SEQUENZLÄNGE: 483 Nukleotide 1 ,UUU

ART DER SEQUENZ: Nukleotid-Sequenz 5 STRANGFORM: * Einzelstrangform TOPOLOGIE: linear HYPOTHETISCH: nein ANTISENS: nein ART DES MOLEKIJLS: fur reifes Protein Ti 28 mit Signalsequenz kodierende

10 cDNA

URSPRLJNGUCHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/ISOLAT: Ti 28

ZELLTYP: EINZELLIGER ORGANISMUS

MERKMAL: kodierend fCir ein reifes Protein:Thrombininhibitor 15 SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14: ATG AAG ACG ATC ATT GCA GTG ACA ATT TTT GGA ATT TTG ACA TGT 045 GCA TAT GCA GCA GAA GGT GAC GAC TGT TCA TTA GAA AAA GCT ATG 090 GGG GAC TTT AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG 135 20 GCT CAT GGA CCG GAC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT 180 ACT ACT AGT GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG 225 TAC AAC AAA TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GTT 270 GAT AAT AAA AAT GAC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA GGT AGT 315 GAT AAT ACT GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC 360 : 25 TAT GAT AAC TTT GCT TTA GTT TGT AGA AGT ATC ΑΤΑ TTT ACA TCA 405 . CAG CCT AAG GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTC GAA CGG ACT AAA AGT 450 GAC ACA GAT CCT GAT GCT AAT GAA ATT TGT TAG 483 43 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16: 110669 (i) SEQUENZKENNZEICHEN SEQUENZLÄNGE: 483 Nukleotide 5 ART DER SEQUENZ: Nukleotid-Sequenz STRANGFORM: Einzelstrangform TOPOLOGIE: linear HYPOTHETISCH: nein ANTISENS: nein 10 ART DES MOLEKLILS: fur reifes Protein Ti 45 mit Signalsequenz kodierende

cDNA

URSPRCJNGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/ISOLAT: Ti 45

ZELLTYP: EINZELLIGER ORGANISMUS

15 MERKMAL: kodierend fur ein reifes Protein:Thrombininhibitor SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15: ATG AAG ACG ATC ATT GCA GTG ACA ATT TTT GGA ATT TTG ACA TGT 045 GCA TAT GCA GCA GAA GGT GAT GAC TGT TCA TTA GAA AAA GCT ATG 090 20 GGG GAC TTT AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG 135 GCT CAT GGA CCG GAC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT 180 ACT ACT AGT GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG 225 TAC AAC AAA TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GCT 270 GAC AAA AAA AAT GAC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA GGT AGT 315 25 GAT AAT ACT GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC 360 TAT GAT AAC TTT GCT CTA GTT TGT AGA AGT ATC ACA TTT ACA TCA 405 , CAG CCT AAG GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTC GAA CGG ACT AAA AGT 450 GAC ACA GAT CCT GAT GCT AAT GAA ATT TGT TAG 483 * t » t 44 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16: (i) SEQUENZKENNZEICHEN SEQUENZLÄNGE: 483 Nukleotide ART DER SEQUENZ: Nukleotid-Sequenz 110669 5 STRANGFORM: Einzelstrangform TOPOLOGIE: linear HYPOTHETISCH: nein ANTISENS: nein ART DES MOLEKIJLS: fur reifes Protein Ti 5 mit Signalsequenz kodierende

10 _ cDNA

URSPRLINGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis INDIVIDUUM/ISOLAT: Ti 5

ZELLTYP: EINZELLIGER ORGANISMUS

MERKMAL: kodierend fur ein reifes Protein:Thrombininhibitor 15 SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16: ATG AAG ACG ATC ATT GCA GTG ACA ATT TTT GGA ATT TTG ACA TGT 045 GCA TAT GCA GCA GAA GGT GAT GAC TGT TCA ATA GAA AAA GCT ATG 090 20 GGG GAC TTT AAA CCA GAG GAG TTT TTC AAT GGA ACG TGG TAT TTG 135 GCT CAT GGA CCG GGC GTA ACA AGT CCA GCT GTC TGT CAG AAA TTT 180 ACT ACT AGT GGA AGC AAA GGT TTC ACC CAA ATT GTT GAA ATA GGG 225 TAC AAC AAA TTT GAA AGT AAC GTG AAA TTC CAA TGC AAT CAA GTT 270 GAC AAT AAA AAT GGC GAA CAA TAT TCT TTC AAA TGC AAA AGT AGT 315 ·. 25 GAT AAT ACT GAA TTC GAA GCA GAT TTT ACA TTT ATT AGT GTA AGC 360 TAT GAT AAC TTT GCT CTA GTT TGT AGA AGT ATC ACA TTT ACA TCA 405 CAG CCT AAG GAA GAT GAT TAT TTG GTA TTA GAA CGG ACT AAA AGT 450 GAC ACA GAT CCT GAT GCT AAA GAA ATT TGT TAG 483 • » * 1 I » I I a 45 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17: (i) SEQUENZKENNZEICHEN 1 lUOOy SEQUENZLÄNGE: 15 Aminosäuren 5 ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKLJLS: N-terminales Proteinfragment URSPROnGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis MERKMAL: als reifes Protein:Thrombininhibitor 10 SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

Ala Glu Gly Asp Asp Cys Ser Leu Glu Lys Ala Met Gly Asp Phe 5 10 15 15 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

(1) SEQUENZKENNZEICHEN

SEQUENZLÄNGE: 21 Aminosäuren ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz TOPOLOGIE: linear 20 ART DES MOLEKLJLS: N-terminales Proteinfragment URSPRCiNGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis MERKMAL: als reifes Protein:Thrombininhibitor SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18: 25 Ala Glu Gly Asp Asp Cys Ser Leu Glu Lys Ala Met Gly Asp Phe 5 10 15

Xaa Pro Glu Glu Phe Phe 20 30 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19: (i) SEQUENZKENNZEICHEN SEQUENZLÄNGE: 21 Aminosäuren ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz 35 TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKLJLS: N-terminales Proteinfragment :/· URSPRLJNGUCHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis MERKMAL: als reifes Protein:Thrombininhibitor '·; . SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19: :/. 40 ’Ala Glu Gly Asp Asp Cys Ser Leu Glu Lys Ala Met Gly Asp Phe ;v‘ 5 10 15 './ Lys Pro Glu Glu Phe Phe 20 46 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20: 11Π6Α0 (1) SEQUENZKENNZEICHEN I I U 0 0 ^ SEQUENZLÄNGE: 18 Aminosäuren ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz 5 TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKLJLS: N-terminales Proteinfragment nach Spaltung mit

Lys C

URSPRLJNGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis MERKMAL: als reifes Protein:Thrombininhibitor 10 SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:

Ala Met Gly Asp Phe Lys Pro Glu Glu Phe Phe Xaa Gly Thr Arg 5 15 15

Tyr Leu Ala 15 18 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:

(1) SEQUENZKENNZEICHEN

SEQUENZLÄNGE: 12 Aminosäuren 20 ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKLJLS: N-terminales Proteinfragment nach Spaltung mit

Lys C

URSPRLJNGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis 25 MERKMAL: als reifes Protein:Thrombininhibitor SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21: ’ Gly Phe Thr Gin Ile Val Glu lie Gly Tyr Asn Lys 5 10 30 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22: (i) SEQUENZKENNZEICHEN SEQUENZLÄNGE: 8 Aminosäuren ; * ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz : V 35 TOPOLOGIE: __ linear ART DES MOLEKLJLS: N-terminales Proteinfragment nach Spaltung mit

Lys C

URSPRIJNGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis MERKMAL: als reifes Protein:Thrombininhibitor 40 SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22: # » , Asn Gly Glu Gin Tyr Ser Phe Lys :/. 5

* I

47 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:

(1) SEQUENZKENNZEICHEN

SEQUENZLÄNGE: 44 Nukleotide I 10 00 9 ART DER SEQUENZ: Nukleotid-Sequenz 5 STRANGFORM: Einzelstrangform TOPOLOGIE: linear HYPOTHETISCH: ja ANTISENS: nein ART DES MOLEKIJLS: Matritzen-Startstuck 10 HERKUNFT DES MOLEKIJLS: von der Aminosäure-Sequenz abgeleitet MERKMALE: N = Inosin SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23: GCN GAR GGN GAY GAY TGY TCN CTN GAR AAR GCN ATG GGN GAY TT 44 15 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24: (i) SEQUENZKENNZEICHEN SEQUENZLÄNGE: 32 Nukleotide ART DER SEQUENZ: Nukleotid-Sequenz 20 STRANGFORM: Einzelstrangform TOPOLOGIE: linear HYPOTHETISCH: ja ANTISENS: ja ART DES MOLEKIJLS: Nicht-Matritzen-Startstuck 25 HERKUNFT DES MOLEKIJLS: VON DER Aminosäure-Sequenz abgeleitet . . MERKMAL: N = Inosin SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24: : · TTR TTR TAN CCR ATY TCN ACR ATY TGN GTR AA 32 30 : .-. (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25: (i) SEQUENZKENNZEICHEN SEQUENZLÄNGE: 7 Aminosäuren ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz 35 TOPOLOGIE: linear ART DES MOLEKIJLS: Peptidfragment URSPR1JNGLICHE HERKUNFT: Speicheldruse von Triatoma pallidipennis MERKMAL: C-terminale Ende des modifizierten Cyclophilins a SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25: :·; > 40

Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala 5 48 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:

(1) SEQUENZKENNZEICHEN

SEQUENZLÄNGE: 57 Nukleotide 110669 ART DER SEQUENZ: Nukleotid-Sequenz 5 STRANGFORM: Einzelstrangform TOPOLOGIE: linear HYPOTHETISCH: ja ANTISENS: nein ART DES MOLEKLJLS: Matritzen-Startstiick 10 HERKUNFT DES MOLEKLJLS: abgeleitet von einer Aminosäure-Sequenz des modifizierten Cyclophilins a SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26: GCGATAACAT GTTCAAAAGC ACCCTGGCGG CGATGGCTGC 40 15 TGTTTTCGCT CTGTCTG 57 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN

SEQUENZLÄNGE: 58 Nukleotide 20 ART DER SEQUENZ: Nukleotid-Sequenz STRANGFORM: Einzelstrangform TOPOLOGIE: linear HYPOTHETISCH: ja ANTISENS: ja 25 ART DES MOLEKLJLS: Nicht-Matritzen-Startstuck HERKUNFT DES MOLEKIJLS: abgeleitet von einer Aminosäure-Sequenz des ' ’ modifizierten Cyclophilins a SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27: i ’ 30 CGCTATAAGC TTCTGCAGGC TAGCGCGCTC GCGCTGAAAG 40 / ! CAGACACAGT CGAAACAG 58 L ’ ‘ (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN

35 SEQUENZLÄNGE: 28 Nukleotide ART DER SEQUENZ: Nukleotid-Sequenz STRANGFORM: Einzelstrangform TOPOLOGIE: linear HYPOTHETISCH: ja :,, 40 ANTISENS: nein ART DES MOLEKLJLS: Matritzen-StartstOck :, ‘ * HERKUNFT DES MOLEKIJLS: abgeleitet von einer Aminosäure-Sequenz des ·. erfindungsgemäBen Proteins Ä SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28: 45 GCGATAGCTA GCAGCAGAAG GTGACGAC 28 49 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN

SEQUENZLÄNGE: 43 Nukleotide 110669 ART DER SEQUENZ: Nukleotid-Sequenz 5 STRANGFORM: Einzelstrangform TOPOLOGIE: linear HYPOTHETISCH: ja ANTISENS: ja ART DES MOLEKLJLS: Nicht-Matrizen-Startstuck 10 URSPRLJNGLICHE HERKUNFT : abgeleitet von einer Aminosäure-Sequenz des erfindungsgemäBen Proteins SEQUENZBESCHRE1BUNG: SEQ ID NO: 29: GCGATAGGAT CCAAGCTTAC TAACAAATTT CATTAGCATC AGG 43 15 51062ADEM1ΧΧ00-Ρ Expression 08.05.95 12:58

Claims (10)

110669

1. Menetelmä luonnollisen trombiini-inhibiittorin valmistamiseksi, jossa 5 a) aktiivisena proteiinina on seuraava N- terminaalinen sekvenssi: Ala-Glu-Gly-Asp-Asp-Cys-Ser-Leu-Glu-Lys-Ala-Met-Gly- Asp-Phe-Lys-Pro-Glu-Glu-Phe-Phe 10 tai b) kypsänä proteiinina on jokin seuraavista sekvensseistä : (i) sekvenssi tunnusnumero 1 (ii) sekvenssi tunnusnumero 2 15 (iii) sekvenssi tunnusnumero 3 tai (iv) sekvenssi tunnusnumero 4 tai c) aktiivisena proteiinina on edellä kohdassa a) tai b) mainitun N-terminaalisen aminohapposekvenssin allee- ,·. · 20 lisiä modifikaatioita, jolloin N-terminaalisen aminohap posekvenssin yksi tai kaksi aminohappoa tai ainakin yksi kypsän proteiinin aminohapoista on korvattu, deletoitu tai * ' insertoitu samalla oleellisesti vaikuttamatta aktiivisen ’· ' proteiinin aktiivisuuteen, 25 tai :,· d) aktiivisena proteiinina kohdassa a) ja c) mai nittujen N-terminaalisten sekvenssien tai kohdassa b) tai c) mainitun kypsän proteiinin sekvenssin translaation jälkeisiä modifikaatioita, jotka eivät vaikuta tai eivät 30 oleellisesti vaikuta aktiivisen proteiinin aktiivisuuteen, ... tunnettu siitä, että eristetään proteiini nisäkkäi- . den verta imevien hyönteisten syljestä. ·.’* 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, ; tunnettu siitä, että proteiini koostuu signaalise- 35 kvenssistä ja kypsästä proteiinista, jolloin i e) proteiinilla on seuraava sekvenssi: 110669 (i) sekvenssi tunnusnumero 5 (ii) sekvenssi tunnusnumero 6 (iii) sekvenssi tunnusnumero 7 tai 5 (iv) sekvenssi tunnusnumero 8 tai f) aktiivisena proteiinina on kohdassa e) mainitun aminohapposekvenssin alleelisia modifikaatioita, jolloin ainakin yksi aminohapposekvenssin aminohappo on korvattu, 10 deletoitu tai insertoitu samalla oleellisesti vaikuttamatta valmiin aktiivisen proteiinin aktiivisuuteen, tai g) kypsänä proteiinina on kohdan e) tai f) mukaisen sekvenssin translaation jälkeisiä modifikaatioita, jotka 15 eivät vaikuta oleellisesti aktiivisen kypsän proteiinin aktiivisuuteen .

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini puhdistetaan ainakin yhdellä pylväällä ja sen jälkeen väkevöidään. ,·, 20 4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen me- ’ netelmä, tunnettu siitä, että ,, sylki viedään "Superose 12 HR -pylvääseen" ja ’ eluoidaan, ’· * viedään uudelleen CH-aktivoituun Sepharose- 25 pylvääseen, johon on etukäteen sidottu trombiini, ja V eluoidaan.

5. Menetelmä luonnosta eristettävissä tai synteet tisesti valmistettavissa olevan trombiini-inhibiittorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään 30 isäntäsolua, joka on transformoitu cDNA:ta tai DNA:ta si-sältävällä vektorilla, jolloin . aa) cDNA tai DNA koodaa seuraavaa amino- happosekvenssiä :* (i) sekvenssi tunnusnumero 1 35 (ii) sekvenssi tunnusnumero 2 (iii) sekvenssi tunnusnumero 3 tai 110669 (iv) sekvenssi tunnusnumero 4 tai bb) cDNA tai DNA koodaa jonkin kohdan aa) mukaisen aminohapon alleelisia modifikaatioita, jolloin vähintään 5 yksi aminohapposekvenssin aminohapoista on korvattu, dele-toitu tai insertoitu samalla oleellisesti vaikuttamatta aktiivisen proteiinin aktiivisuuteen, tai cc) cDNA tai DNA käsittää seuraavan mukleotidise-10 kvenssin: (i) sekvenssi tunnusnumero 9 (ii) sekvenssi tunnusnumero 10 (iii) sekvenssi tunnusnumero 11 tai (iv) sekvenssi tunnusnumero 12 15 tai dd) cDNA tai DNA on jonkin kohdan cc) mukaisen nuk-leotidisekvenssin alleelinen modifikaatio, jolloin vähintään yksi nukleotidi on korvattu, deletoitu tai insertoitu 20 samalla oleellisesti vaikuttamatta kohdan cc) mukaisen nuk-leotidisekvenssin alleelisen modifikaation koodaaman aktii- » · visen proteiinin aktiivisuuteen, tai (ee) cDNA tai DNA koodaa trombiini-inhibiittoria, * jossa on signaalisekvenssi ja jolla on seuraava nukleoti- 25 disekvenssi: (i) sekvenssi tunnusnumero 13 (ii) sekvenssi tunnusnumero 14 (iii) sekvenssi tunnusnumero 15 tai (iv) sekvenssi tunnusnumero 16 30 tai ff) cDNA tai DNA on jonkin kohdan ee) mukaisen nuk-, leotidisekvenssin alleelinen modifikaatio, jolloin vähin- !,’· tään yksi nukleotidi on korvattu, deletoitu tai insertoitu samalla oleellisesti vaikuttamatta kohdan ee) mukaisen nuk-V 35 leotidisekvenssin alleelisen modifikaation signaalisekvens- 53 110669 si mukaan lukien koodaaman kypsän proteiinin aktiivisuuteen, ja eristetään ja puhdistetaan proteiini.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että käytetään eukaryoottisia tai prokaryoottisia isäntäsoluja, jotka on transformoitu vektorilla, joka sisältää patenttivaatimuksessa 5 määriteltyä cDNA:ta tai DNA:ta. 7. cDNA tai DNA, tunnettu siitä, että se 10 koodaa kypsää trombiini-inhibiittoria, jolloin aa) cDNA tai DNA koodaa jotakin seuraavista aminohapposekvensseistä : (i) sekvenssi tunnusnumero 1; (ii) sekvenssi tunnusnumero 2; 15 (iii) sekvenssi tunnusnumero 3; (iv) sekvenssi tunnusnumero 4; tai bb) cDNA tai DNA koodaa jonkin kohdan aa) aminohapposekvenssin alleelisia modifikaatioita, jolloin ainakin 20 yksi aminohapposekvenssin aminohappo on korvattu, deletoitu tai insertoitu samalla oleellisesti vaikuttamatta aktiivi- I · I I sen proteiinin aktiivisuuteen, tai cc) cDNA:ssa tai DNA:ssa on jokin seuraavista nuk-leotidisekvensseistä: 25 (i) sekvenssi tunnusnumero 9; V (ii) sekvenssi tunnusnumero 10; (iii) sekvenssi tunnusnumero 11; (iv) sekvenssi tunnusnumero 12; tai ,·, 30 dd) cDNArssa tai DNA:ssa on kohdan cc) jonkin nuk- * » ,·.· leotidisekvenssin alleelinen modifikaatio, jolloin ainakin '! . yksi nukleotidi on korvattu, deletoitu tai insertoitu sa- *,’· maila oleellisesti vaikuttamatta kohdan cc) mukaisen nuk- leotidisekvenssin alleelisen modifikaation koodaaman prote-35 iinin aktiivisuuteen. 54 110669 8. cDNA tai DNA, tunnettu siitä, että se koodaa trombiini-inhibiittoria, jossa on signaalisekvenssi, jolloin ee) cDNA:ssa tai DNA:ssa on jokin seuraavista nuk-5 leotidisekvensseistä: (i) sekvenssi tunnusnumero 13; (ii) sekvenssi tunnusnumero 14; (iii) sekvenssi tunnusnumero 15; (iv) sekvenssi tunnusnumero 16; 10 tai ff) cDNA:ssa tai DNA:ssa on jonkin kohdan ee) mukaisen nukleotidisekvenssin alleelinen modifikaatio, jolloin ainakin yksi nukleotidi on korvattu, deletoitu tai insertoitu samalla oleellisesti vaikuttamatta kohdan ee) 15 mukaisen nukleotidisekvenssin alleelisen modifikaation, signaalisekvenssi mukaan lukien, koodaaman kypsän proteiinin aktiivisuuteen.

9. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukaisen cDNA:n tai DNA:n . 20 sekä sopivaa promoottoria ja mahdollisesti sopivaa vahvis- ; tajaa.

10. Eukaryoottinen tai prokaryoottinen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 9 mukaisella vektorilla. 25 Bt ,k 110669