DE4304731A1

DE4304731A1 - Thrombininhibitor aus Speichel von Protostomiern

Info

Publication number: DE4304731A1
Application number: DE19934304731
Authority: DE
Inventors: Christiane Dr Noeske-Jungblut
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1993-02-12
Filing date: 1993-02-12
Publication date: 1994-08-18

Description

Die Erfindung betrifft ein Protein, das ein Thrombininhibitor aus Speichel von Protostomiern ist.

Stand der Technik

Thrombin hat eine Schlüsselfunktion bei der Thrombusbildung in Blutgefäßen. Es katalysiert die Spaltung von Fibrinogen zu Fibrin. Es führt zur Bildung von Blutgerinnseln. Weiterhin induziert es die Aggregation von Blutplättchen. Das Enzym ist in der Pathogenese verschiedener Krankheiten, wie z. B. arteriel ler und venöser Thrombose oder Arteriosklerose, involviert.

Deshalb ist der Einsatz eines Thrombininhibitors zur Therapie von Thrombosen erfolgversprechend. Die wichtigsten bisher bekannten Thrombininhibitoren sind Antithrombin III-Heparin und Hirudin. Antithrombin III ist ein im Plasma vorkommendes Protein mit einem Molekulargewicht von 58 kDa. Antithrombin III bindet zuerst an Heparin, das ein Polysaccharid ist. Dann bindet der Antithrombin III - Heparin - Komplex an Thrombin und inhibiert dieses Throm bin. Es entsteht ein sehr stabiler Komplex aus Thrombin und Antithrombin III und Antithrombin III wird von Thrombin gespalten. Neben Thrombin hemmt Antithrombin III auch andere Serinproteasen wie z. B. Faktor Xa (Pratt,C.W. und Church, F.C. (1991) "Antithrombin: Structure and Function", Seminars in Hematology 28 : 3-9).

Aus dem Blutegel Hirudo medicinalis wurde das Protein Hirudin isoliert. Es hat ein Molekulargewicht von etwa 7 kDa und bindet über ionische Wechselwirkung am Thrombin. Es ist spezifisch für Thrombin (Johnson, P.H. et al. (1989) "Biochemistry and Genetic engineering of hirudin", Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15 : 302-315).

Beschreibung der Erfindung

Neben den zuvor erwähnten Thrombininhibitoren, die zum Stand der Technik zählen, sind weitere Inhibitoren notwendig, die einen anderen Wirkmechanis mus, oder eine gesteigerte Aktivität besitzen.

Die Erfindung liefert ein natürliches oder synthetisch herstellbares Protein, das ein Thrombininhibitor ist und aus dem Speichel von Insekten, die Säugetierblut saugen, isolierbar ist.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Protein, das aus der Raubwanze Triato ma pallidipennis isolierbar ist.

Das erfindungsgemäße Protein kann natürlichen Ursprungs sein. Das Protein wird gewonnen, indem der Speichel gereinigt wird. Ebenfalls ist möglich, das Protein aus den Speicheldrüsen zu isolieren oder die das Protein synthetisie renden Zellen aus der Speicheldrüse zu nehmen und in Kultur zu halten. Die von dieser Zellkultur produzierten Überstände werden geerntet und aufgearbei tet. Der Zellüberstand wird gereinigt und das erfindungsgemäße Protein iso liert und angereichert. Alle Anreicherungsstufen der Isolierung und der Reini gung sind Teil der Erfindung. Bevorzugt sind die Anreicherungsstufen der Iso lierung und Reinigung, bei denen das erfindungsgemäße Protein zu pharma zeutischen Zwecken verwendet werden kann. So werden Reinigungen von 50 % des Thrombininhibitors bezogen auf das Gesamtprotein erzielt, bevorzugt sind 85%, mehr bevorzugt 95% und am meisten bevorzugt 99% des Throm bininhibitors bezogen auf das Gesamtprotein.

Die Erfindung umfaßt nicht allein das erfindungsgemäße Protein, das von Tria toma pallidipennis isolierbar ist, sondern auch Proteine, die von anderen Insektenarten synthetisiert werden können. So sind neben dem erfindungs gemäßen Protein, das von Triatoma pallidipennis isolierbar ist und das das be vorzugteste ist, weitere Proteine bevorzugt, die von Triatoma infestans, Triato ma dimidiata, Triatoma maculata, Rhodnius prolixus, Panstrongylus megistus und Panstrongylus infestans stammen.

Ebenso ist es möglich, das erfindungsgemäße Protein synthetisch herzustellen. Dazu zählt die Proteinsynthese nach J.M. SEWART and J.D. YOUNG, San Franzisco, 1969 and J. MEIENHOFER, Hormonal Proteins and Peptides Vol. 2 p 46, Academic Press (New York), 1973 und E. SCHODER and K. LUBKE, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York) 1965. Zu den synthetisch her gestellten Proteinen zählen auch die rekombinanten Proteine, die nach bekann ten Verfahren hergestellt werden. Je nach Wirtsorganismus kann das erfin dungsgemäße Protein glykosyliert oder, wenn es in Prokaryonten synthetisiert wird, unglykosyliert sein.

Die Funktion des Inhibitors ist in verschiedenen Testsystemen zu ermitteln. In den Beispielen 2 bis 4 und 9 sind gängige Testverfahren beschrieben.

Das erfindungsgemäße Protein ist in dem Speichel von Insekten, die Säuge tierblut saugen, festzustellen. Dieses Protein wird üblicherweise von Zellen der Speicheldrüsen synthetisiert. Daher kann das Protein aus dem Speichel isoliert werden. Das erfindungsgemäße Protein ist nicht auf diese Herstellungsweise und Isolierung beschränkt. Vielmehr sind alle synthetisch hergestellten, erfin dungsgemäßen Thrombininhibitoren mitumfaßt, die sich im dem Speichel nachweisen und daraus isolieren lassen.

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein natürliches oder synthetisch herstellbares Protein, das ein Thrombininhibitor ist und aus dem Speichel von Insekten, die Säugetierblut saugen, bevorzugt aus Triatoma pallidipennis, isolierbar ist, wobei das Protein als aktives Protein eine N-terminale Sequenz wie folgt besitzt:

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Protein, das als aktives Protein eine N- terminale Sequenz wie folgt besitzt:

wobei Xaa eine natürliche Aminosäure ist.

Eine natürliche Aminosäure ist eine der 20 üblicherweise bei der Proteinbio synthese auftretenden Aminosäuren. (siehe Albert L. LEHNINGER (1977) Bio chemie, Weinheim, New York, 2. Auflage, Seiten 59 bis 61).

Mehr bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Protein, das als aktives Protein

a) eine N-terminale Sequenz wie folgt besitzt: oder
b) allelische Modifikationen der zuvor genannten N-terminalen Aminosäure- Sequenz aufweist, wobei eine oder zwei Aminosäuren der N-terminalen Aminosäure-Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert sind, ohne da bei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen, oder
c) posttranslationale Modifikationen der N-terminalen Sequenzen unter a) und b) aufweist, die nicht wesentlich die Aktivität des aktiven Proteins beeinflussen.

Am meisten bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Protein, das ein rekombinan tes Protein ist. Dabei kann das Protein glykosyliert sein.

Das erfindungsgemäße Protein umfaßt das reife Protein und ein Vorläufer- Protein, welches sich aus einer "Signal-Sequence" (Signal-Sequenz) und der Sequenz des reifen Proteins zusammensetzt. Dabei geht die "Signal-Sequenz" der Sequenz des reifen Proteins voraus. Das reife Protein beginnt mit der zu vor genannten N-terminalen Sequenz. Die "Signal-Sequenz" ist für die Durch dringung des endoplasmatischen Retikulums erforderlich.

Weiterhin umfaßt die Erfindung Bindungsmoleküle, Einzelketten-Proteine (Single Chain Proteins), Antikörper oder Fragmente der Antikörper, die Domä nen auf dem reifen, erfindungsgemäßen Protein spezifisch erkennen. Wenn das gereinigte erfindungsgemäße Protein vorliegt, ist es für den Fachmann leicht möglich, monoklonale Antikörper herzustellen. Dabei wird die bekannte Methode von Koehler und Milstein und deren Weiterführungen angewendet. Dabei wird im einzelnen in konventioneller Methode eine Maus mit dem gerei nigten Protein mehrfach immunisiert, die Milzzellen entnommen und mit geeig neten Tumorzellen fusioniert. Die Hybride werden anschließend selektioniert.

Das Protein der Erfindung kann aus dem Speichel der Raubwanze Triatoma pallidipennis isoliert werden. Die Reinigung erfolgt durch eine Gelfiltration und eine anschließende Affinitätschromatographie an Thrombin-Sepharose (siehe Beispiel 1). Das Protein hat die zuvor beschriebene N-terminale Aminosäure- Sequenz. Es hat ein Molekulargewicht von ca. 18 000 ± 3000 Da. Der isoelektrische Punkt liegt im Bereich von pH 4,5 bis 5,2, wenn die im Beispiel 8 beschriebene Methode angewendet wird.

Das Protein der Erfindung hemmt die Wirkung von Thrombin bei der Blutgerin nung und bei der Aktivierung von Plättchen und im amidolytischen Test. Die Test-Systeme sind in den Beispielen 2, 3, 4 und 9 beschrieben. Das Protein hemmt die Gerinnung in einer Konzentration von 8 nmol/l bei einer Thrombin konzentration von 1,27 nmol/l. Es hemmt die Thrombin-induzierte Plättchen- Aggregation zu 100% in einer Konzentration von 15 ng/ml. Diese Konzentra tion entspricht bei einer eingesetzten Thrombinkonzentration von 0,06 lU/ml = 0,812 pmol/ml (IU = Internationale Einheiten) einem molaren Verhältnis von Thrombin zum Protein der Erfindung von etwa 1 : 1. Dagegen hemmt das Protein der Erfindung die Aktivität von Thrombin im amidolytischen Test bei ei nem Verhältnis von Thrombin zum Protein der Erfindung von 1 : 87 nur zu etwa 50%. Das Protein der Erfindung verlängert in einer Konzentration von 35 nmol/l die Thrombin-Zeit (1 IU/ml) um das 5-fache.

Das Protein der Erfindung ist spezifisch für Thrombin. Andere Serinproteasen (z. B. Faktor Xa oder Trypsin) werden auch bei einem 40-fachen Überschuß nicht nachweislich gehemmt (s. Beispiel 7).

Die Erfindung umfaßt weiterhin eine cDNA oder DNA, die einen Thrombininhibi tor mit einem N-terminalen Ende kodiert, wobei der Thrombininhibitor aus Speichel von Insekten, die Säugetierblut saugen, isolierbar ist, und

aa) wobei die das N-terminale Ende kodierende cDNA oder DNA die folgende Aminosäure-Sequenz kodiert: oder
bb) wobei die cDNA oder DNA allelische Modifikationen der Aminosäure- Sequenz unter aa) kodiert, worin eine oder zwei Aminosäuren der N-terminalen Aminosäure- Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert sind, ohne dabei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen.

Unter N-terminaler Aminosäure-Sequenz ist die zuvor genannte Sequenz von 15 Aminosäuren zu verstehen.

Bevorzugt ist eine cDNA oder DNA, die einen Thrombininhibitor mit einem N- terminalen Ende kodiert,
wobei der Thrombininhibitor aus Speichel von Insekten, die Säugetierblut saugen, isolierbar ist,
und

cc) wobei die das N-terminale Ende kodierende cDNA oder DNA die folgende Aminosäure-Sequenz kodiert: worin Xaa eine natürliche Aminosäure ist, oder
dd) wobei die cDNA oder DNA allelische Modifikationen der Aminosäure- Sequenz unter cc) kodiert, worin eine oder zwei Aminosäuren der N-terminalen Aminosäure- Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert sind, ohne dabei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen.

Unter N-terminaler Aminosäure-Sequenz ist diesmal die zuvor beschriebene Sequenz von 21 Aminosäuren zu verstehen.

Mehr bevorzugt ist eine erfindungsgemäße cDNA oder DNA, wobei die Aminosäure Xaa Lysin ist.

Ein weiterer Teil der Erfindung ist ein Vektor, der eine erfindungsgemäße cDNA oder DNA, weiterhin einen passenden Promotor und gegebenenfalls einen passenden Enhancer enthält. Ebenfalls ist auch noch eine "Signal-Sequenz" umfaßt. Vektoren sind ausführlich in den europäischen Publikationen EP 0 480 651, EP 0 462 632 und EP 0 173 177 beschrieben.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in einer eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszelle, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist.

Die zuvor genannten allelischen Modifikationen umfassen Änderungen in der Sequenz der Aminosäuren und der Nukleotide. Sie umfassen daher Verände rungen im Genotyp und gegebenenfalls im Phänotyp. Wenigstens eine Aminosäure oder ein Nukleotid kann substituiert, deletiert oder insertiert (in der Sequenz eingeschoben) sein.

Die meisten Deletionen, Insertionen und Substituierungen scheinen keine durchgreifende Änderung in der Charakteristik des Proteins der Erfindung zur Folge zu haben. Da es schwer ist, den genauen Effekt einer Substituierung, einer Deletion oder einer Insertion im voraus anzugeben, muß die Funktion des veränderten Proteins mit der Funktion des erfindungsgemäßen Proteins ver glichen werden. Die hierfür zu verwendenden Methoden sind zum Beispiel in den Beispielen 2 bis 4 und 9 angegeben. Als Standard dient das Protein, das nach Beispiel 1 gereinigt wird, und auch die Reinigungsmethode des Beispiels 1 für das Vergleichsprotein.

Der genetische Code ist degeneriert, das bedeutet, daß die meisten Amino säuren von mehr als einem Codon aus drei Nukleotiden kodiert werden. Da her führen einige allelische Modifikationen auf der Ebene der Nukleotide nicht zu einer Änderung der Aminosäure-Sequenz. Daher ereignen sich allelische Modifikationen vornehmlich auf der Ebene der DNA und können sich sekundär auf die Aminosäure-Sequenz auswirken.

Die cDNA- oder DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Protein kodiert, kann gemäß konventioneller Techniken modifiziert werden, um Varianten des erfin dungsgemäßen Proteins herzustellen, die im wesentlichen die gleiche Aktivität wie das beschriebene und charakterisierte Protein der Erfindung besitzen. Dabei wird die Aktivität so gemessen, wie es in den Beispielen 2 bis 4 und 9 be schrieben ist.

Aminosäuren können wie in der Tabelle 1 dargestellt substituiert werden, ohne dabei die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinflussen. In jedem einzel nen Fall ist durch den Aktivitätstest zu entscheiden, welchen Einfluß die Verän derung auf die Funktion des Proteins hat.

Übliche Substituierung von Aminosäuren in einem Protein
Ursprüngliche Aminosäure
Beispielsweise vorgenommene Substituierung
Ala
Gly, Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala, Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gln, Glu
Met	Leu, Tyr, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

Die Funktionen oder die immunologische Identität werden wesentlich verän dert, wenn Substituenten gewählt werden, die weniger konservativ als die in Tabelle 1 gezeigten Aminosäuren sind. Derartige wesentlichen Veränderun gen lassen sich durch Substituierungen mit Aminosäuren erzielen, die sich mehr in ihrer Struktur und in den funktionellen Gruppen unterscheiden. We sentliche Veränderungen wirken sich dahingehend aus, daß die dreidimensio nale Struktur verändert wird und/oder daß zum Beispiel die Faltblatt-Struktur oder die helikale Struktur beeinflußt wird. Auch Wechselwirkungen der La dungen und der hydrophoben Ketten sind bei den Veränderungen zu beachten.

Die Mutationen werden durch die Homologie zweier zum Vergleich anstehender Proteine definiert. Der Ausdruck Homologie umfaßt ähnliche Aminosäuren (zum Beispiel Tabelle 1) und Lücken in den Sequenzen der Aminosäuren (Homologie = similarity). Das erfindungsgemäße Protein hat eine Aminosäure- Sequenz, die eine Homologie von wenigstens 80%, bevorzugt 90%, mehr be vorzugt 95% und am meisten bevorzugt 98% der erfindungsgemäßen Struktur besitzt, wie sie durch das N-terminale Ende definiert ist und wie sie weiterhin nach der Reinigung gemäß Beispiel 1 erhalten wird.

Wie zuvor erwähnt umfaßt die Erfindung auch Modifikationen der DNA oder cDNA. Diese modifizierten Sequenzen hybridisieren unter stringenten Bedin gungen mit der DNA, die das erfindungsgemäße Protein kodiert. Die cDNA oder DNA hat eine Nukleotid-Sequenz, die eine Homologie von wenigstens 70 %, bevorzugt 82%, mehr bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt von 95% mit der erfindungsgemäßen cDNA- oder DNA-Sequenz besitzt, die sich aus dem gereinigten Protein nach Beispiel 1 ergibt. Die Homologie kann durch eine Hybridisierung gemessen werden, wie sie in R. KNIPPERS, Molekulare Genetik, 1982, dritte Auflage, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York be schrieben ist.

Unter den zuvor erwähnten posttranslationalen Modifikationen versteht man Veränderungen, die während oder nach der Translation auftreten. Hierzu zählen die Glykosylierung, die Ausbildung von Disulfid-Brücken, die chemische Modifikationen der Aminosäuren, so zum Beispiel die Sulfatierung, die im Zu sammenhang mit dem Hirudin beschrieben ist. (J.W. FENTON (1989) "Thrombin Interactions with Hirudin", Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15 : 265-268).

Die Glykosylierung ist eine wesentliche Funktion des endoplasmatischen Retikulums und/oder des Golgi-Apparates. Die Sequenz und die Verästelung der Oligosaccharide wird in dem endoplasmatischem Retikulum gebildet und in dem Golgi-Apparat verändert: Die Oligosaccharide können N-verknüpfte Oligosaccharide (Asparagin-verknüpfte) oder O-verknüpfte Oligosaccharide (Serin-, Threonin- oder Hydroxylysin-verknüpfte) sein. Die Form der Glykosy lierung ist von dem produzierenden Zelltyp und von der Art abhängig, von der der entsprechende Zelltyp stammt. Das Ausmaß und die Art der Glykosylie rung kann durch Substanzen beeinflußt werden, wie es in der Europäischen Publikation EP 0 222 313 beschrieben ist. Die Variierung der Glykosylierung kann die Funktion des Proteins verändern.

Proteine bilden häufig kovalente Bindungen innerhalb der Ketten aus. Diese Disulfid-Brücken werden zwischen zwei Cysteinen hergestellt. Dabei wird das Protein spezifisch gefaltet. Die Disulfid-Brücken stabilisieren die dreidimensio nale Struktur der Proteine.

Weiterhin können die Aminosäuren so verändert werden, wie es in der inter nationalen Publikation WO 91/10684 beschrieben ist. Ebenfalls kann das Protein sulfatiert sein. Diese Veränderung ist im Zusammenhang mit Hirudin beschrieben.

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungs gemäßen Proteins mit den folgenden Schritten:

Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem Vektor transformiert ist, welcher eine erfindungsgemäße cDNA oder DNA enthält,
und
Isolieren und Reinigen des Proteins.

Das Protein wird bevorzugt gemäß Beispiel 1 gereinigt. Jedoch sind auch an dere Isolierungs- und Reinigungs-Methoden möglich:
Methods of Enzymology, Volume 182: Guide to Protein Purification, ed. Murray P. DEUTSCHER, Academic Press, 1990;
Protein Purification Application - A Practical Approach, ed. E.L.V. HARRIS and S. ANGEL, IRL-Press 1990;
Protein Purification, Principles and Practice, Ropert SCOPES, Springer- Verlag 1982; and
Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applica tions, ed. H.-C. JANSON and L. RYDEN, VCH publishers 1989.

Die Aminosäure-Sequenz des erfindungsgemäßen Proteins kann dazu ver wendet werden, die entsprechende DNA- oder cDNA-Sequenz in einer Gen- Bank (Gen Library) zu ermitteln. Dadurch lassen sich auch homologe Se quenzen ermitteln, die ähnliche inhibitorische Funktionen haben können. Solche Sequenzen lassen sich routinemäßig herstellen und auffinden, zum Beispiel durch DNA-Synthetisierer (DNA Synthesizers) und durch eine Suche in einer Gen-Bank. Siehe internationale Publikation WO 90/07861 vom 26. Juli 1990).

Die Erfindung umfaßt ebenfalls ein Verfahren zur Reinigung eines erfindungs gemäßen Proteins, wobei das Protein isoliert, über wenigstens eine Säule ge reinigt und anschließend eingeengt wird. Bevorzugt sind Chromatographie- Säulen oder Adsorptionschromatographie-Säulen.

Die Erfindung umfaßt darüber hinaus ein Verfahren zur Reinigung von einem erfindungsgemäßen Protein, wobei das Verfahren aus folgenden Schritten be steht:
Auftragen des Speichels auf eine "Superose 12 HR-Säule" und Eluieren und
erneute Auftragung auf einer CH-aktivierten Sepharose-Säule, an der zuvor Thrombin gekoppelt wurde, und Eluieren.

Die Reinigung ist ausführlich im Beispiel 1 beschrieben.

Verwendung als Arzneimittel

Die Proteine gemäß der Erfindung besitzen pharmakologische Effekte und sind deshalb als pharmazeutische Wirkstoffe verwendbar. Die Erfindung umfaßt ebenfalls ein Arzneimittel, das ein erfindungsgemäßes Protein enthält. Weiterhin gehört zur Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Protein enthält, in Gegenwart von pharmazeutisch ver träglichen und annehmbaren Verbindungen und Trägern. Ebenfalls umfaßt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein pharmazeu tisch aktives, erfindungsgemäßes Protein und ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.

Insbesondere zeigen die erfindungsgemäßen Proteine mit dem N-terminalen Ende

eine Inhibierung der Thrombinaktivität.

Die Inhibierung der Thrombinaktivität kann im Gerinnungstest (siehe Beispiel 2), im Blutplättchen-Aggregationstest (siehe Beispiel 3) und im amidolytischen Test (siehe Beispiel 4) und durch Messen der Thrombin-Zeit (siehe Beispiel 9) nach gewiesen werden. Die Messung der Thrombin-Zeit ist das bevorzugte Test system.

Die N-terminal definierten, erfindungsgemäßen Proteine zeigen eine Verlänge rung der Thrombinzeit bei Konzentrationen von 10 bis 60 nmol/l (Thrombinkonzentration 1 IU/ml). Bei einer Konzentration von 58 nmol/l er folgt eine 9fache Verlängerung. Höhere Konzentrationen sind anwendbar, ohne das Testsystem zu stören. Somit ist das erfindungsgemäße Protein in Konzentrationen von 10 bis 200 nmol/l einsetzbar. Bei diesem Test wird ein Protein eingesetzt, das nach Beispiel 1 gereinigt worden ist. Dieses Protein ist das bevorzugte Protein der Erfindung. (siehe Fig. 1).

Die Versuchsergebnisse dieses in vitro Testes zeigen, daß die erfindungsge mäßen Proteine als Arzneimittel oder zur medizinischen Behandlung verwendet werden können. Diese Versuchsergebnisse lassen sich von dem in vitro Testsystem auf ein in vivo System übertragen, da es sich bei dem Gerin nungstest um eine etablierte Versuchsanordnung handelt. (M. TALBOT (1989) "Biology of Recombinant Hirudin, A New Prospect in the Treatment of Throm bosis" Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15 : 293-301). Die Proteine der Erfindung können deshalb zur Behandlung und Prävention von Thrombo sen, instabiler Angina oder Arteriosklerose, oder zur Prävention eines Wieder verschlusses von Gefäßen nach PTCA/PTA (Angioplastie mit einem Ballon katheter) oder zur Verhinderung der Blutgerinnung bei der Hämodialyse dienen. Die Proteine der Erfindung können als ein antithrombotisches und/oder anti arteriosklerotisches Medikament bei Säugern, insbesondere Menschen, zur Behandlung von thrombotischen und/oder arteriosklerotischen Beschwerden eingesetzt werden. Diese können beim Reißen von arteriosklerotischen Aggregationen (Plaques), bei Zerstörung von Endothelgewebe, wie zum Bei spiel bei Sepsis, bei Transplantaten oder bei instabiler Angina, auftreten. Sie können ebenfalls verwendet werden, um erneute Verschlüsse nach der Be handlung von myokardialen Infarkten und/oder bei Fibrinolyse oder Angioplastie zu vermeiden. Dabei kann das Protein der Erfindung vor, bei und/oder nach der Einführung des Katheter verabreicht werden.

Die Erfindung liefert weiterhin

(i) die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins zur Herstellung ei nes Medikaments zur Behandlung von Thrombosen, instabiler Angina oder Arteriosklerose, oder zur Präven tion eines Wiederverschlusses von Gefäßen nach PTCA/PTA oder zur Verhinderung der Blutgerinnung bei der Hämodialyse;
(ii) ein Verfahren zur Behandlung von Thrombosen, instabiler Angina oder Arteriosklerose, oder zur Prävention eines Wiederverschlusses von Gefäßen nach PTCA/PTA oder Throm bolyse oder zur Verhinderung der Blutgerinnung bei der Hämodialyse, welch es Verfahren eine Verabreichung einer Proteinmenge gemäß der Erfindung umfaßt, wobei die Menge die Krankheit unterdrückt und wobei die Proteinmenge einem Patienten gegeben wird, der ein solches Medi kament benötigt;
(iii) eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Thrombosen, instabiler Angina oder Arteriosklerose, oder zur Prävention eines Wiederverschlusses von Gefäßen nach PTCA/PTA oder Throm bolyse oder zur Verhinderung der Blutgerinnung bei der Hämodialyse,

welche Behandlung ein erfindungsgemäßes Protein und wenigstens einen pharmazeutisch verträglichen Träger und Zusatz umfaßt.

Für diese therapeutische Wirkung sind unterschiedliche Dosen geeignet. Sie hängen beispielsweise von dem verwendeten Protein, von dem Wirt, von der Art der Verabreichung und von der Art und der Schwere der zu behandelnden Zustände ab.

Im allgemeinen sind jedoch bei Tieren zufriedenstellende Resultate zu erwar ten, wenn die täglichen Dosen einen Bereich von 2 µg bis 2000 µg pro kg Kör pergewicht umfassen. Bei größeren Säugetieren, beispielsweise dem Menschen, liegt eine empfohlenen tägliche Dosis im Bereich von 2 bis 2000 µg pro kg Körpergewicht, wenn das nach Beispiel 1 gereinigte Protein verwendet wird. Zum Beispiel wird diese Dosis zweckmäßigerweise in Teildosen bis zu viermal täglich verabreicht. Die täglichen Dosen bei der kurzzeitigen Behand lung von akuten Thromben können mit 20 bis 2000 µg pro kg Körpergewicht höher als die Dosen bei der chronischen Behandlung mit 2 bis 200 µg pro kg Körpergewicht ausfallen.

Ebenfalls sind zufriedenstellende Resultate zu erwarten, wenn das Protein der Erfindung subkutan verabreicht wird. Bevorzugt ist die gezielte Injektion in den Teil des Körpers, in dem sich Thromben gebildet haben.

Die erfindungsgemäßen Proteine können auf jedem üblichen Weg verabreicht werden, insbesondere in Form von Injektionslösungen oder Suspensionen.

Die vorliegende Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, die ein erfindungsgemäßes Protein und wenigstens einen pharma zeutisch verträglichen Träger oder Zusatz umfassen. Solche Zusammen setzungen können nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Dabei ist auf Remington′s Pharmaceutical Science, 15^th ed Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980) hinzuweisen.

Die Versuchsergebnisse werden anhand der Figuren verdeutlicht, die im einzel nen folgendes zeigen:

Fig. 1 Verlängerung der Thrombin-Zeit bei Zugabe von erfindungsge mäßem Protein aus Triatoma pallidipennis.

Fig. 2 Inhibierung der Thrombinaktivität im amidolytischen Test (Triatoma = Trombininhibitor aus Triatoma pallidipennis),

Fig. 3 Inhibierung der Thrombinaktivität im Gerinnungstest.

Beispiele Beispiel 1 Gewinnung des Speichels von Triatoma pallidipennis und Reinigung des Proteins der Erfindung

Die Raubwanzen werden durch mechanische Stimulation ihrer Probszis zur Ab sonderung ihres Speichels angeregt. Der Speichel wird auf einer Glasplatte aufgefangen und mit einer silikonisierten, ausgezogenen Pasteurpipette ge sammelt.

Der Speichel wird gefriergetrocknet und in einer Konzentration von 2,5 mg/ml in destilliertem Wasser gelöst. 2 ml dieser Lösung werden über eine "Superose 12 HR 16/50"-Säule (Pharmacia) in 10 mmol/l Tris/HCl, pH 7,4, 0,0001% "Pluronic F68" gelfiltriert. Die im Gerinnungstest (siehe Beispiel 2) aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf eine CH-aktivierte Sepharose (Pharmacia), an die zuvor Thrombin nach den Angaben des Herstellers gekoppelt wurde, aufgetragen. Das Protein der Erfindung bindet an diese mit Thrombin ver sehenen Säule. Zunächst wird die Säule mit Tyrode-Puffer (ohne Serum albumin) gewaschen, dann wird erst mit 10 mmol/l Na-Acetat, pH 4,5, und dann mit 10 mmol/l Glycin, pH 2,5, eluiert. In den Eluaten wird der pH-Wert auf 7 eingestellt. Das 10 mmol/l Glycin Eluat enthält das gereinigte Protein der Erfindung. Es ist aktiv im Gerinnungstest (siehe Beispiel 2), im Plättchen- Aggregationstest (siehe Beispiel 3), im amidolytischen Test (siehe Beispiel 4) und verlängert die Thrombin-Zeit (siehe Beispiel 9). Die Präparation enthält keine in der SDS-Gelelektrophorese detektierbaren Verunreinigungen.

Beispiel 2 Inhibierung der Thrombinaktivität im Gerinnungstest

In eine Mikrotiterplatte, die mit Rinderserumalbumin beschichtet ist (0,1% in 0,1 mol/l NaHCO₃, pH 9,5), werden 80µl 20 mmol/l HEPES, pH 7,4; 0,15 mmol/l NaCl; 20 µl 20 mmol/l CaCl₂; 100 µl einer verdünnten Lösung des Proteins der Erfindung (5-50 ng) und 20 µl Thrombin (0,03 IU = 0,03 Internationale Einheiten) pipettiert. Nach einer Inkubation 2 Minuten bei 37°C werden 100 µl Fibrinogen (5 mg/ml) zugegeben und 40 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Absorption bei 405 nm gemessen. 45 ng (=8 nmol/l) des gereinigten Proteins der Erfindung hemmen die Fibrinogenspaltung vollständig. Unter den gleichen Testbedingungen zeigt Hirudin die gleiche Wirksamkeit (vollständige Hemmung mit 8 nmol/l). (siehe Fig. 3).

Beispiel 3 Inhibierung der Thrombinaktivität im Blutplättchen-Aggregationstest

500 µl gelfiltrierte Blutplättchen (300 000/ml) werden mit dem Protein dieser Er findung (5-100 ng/ml) für 1 Minute bei 37°C inkubiert. Dann wird die Aggre gation mit Thrombin (0,06 IU/ml) induziert und die Aggregation in einem Aggre gometer aufgezeichnet. Messungen mit dem gereinigten Protein der Erfin dung zeigen, daß bei einer Konzentration von 15 ng/ml die Aggregation zu 100 % gehemmt wird.

Beispiel 4 Inhibierung der Thrombinaktivität im amidolytischen Test

In einer Mikrotiterplatte werden 80 µl 100 mmol/l Tris/HCL, pH 7,4; 150 mmol/l NaCl und 0,03 IU (1,35 nmol/l) Thrombin und 100 µl einer verdünnten Lösung des Proteins der Erfindung (32-630 ng) 10 Minuten bei 37°C inkubiert und dann mit 100 µl (50 nmol) des Substrates S2238 (Kabi Vitrum) versetzt. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 37°C wird die Absorption bei 405 nm ge messen. 630 ng (117 nmol/l) hemmen die Aktivität des Thrombins zu ungefähr 50%. Hirudin hemmt in einer Konzentration von 6 nmol/l die Aktivität des Thrombins zu 85%. (siehe Fig. 2).

Beispiel 5 Bestimmung der N-terminalen Aminosäure-Sequenz

Das gereinigte Protein der Erfindung wurde in einem automatischen Amino säuresequenator (Applied Biosystems, Inc.) nach den Instruktionen des Herstel lers sequenziert. Die Sequenz der Aminosäuren 1 bis 21 (vom N-Terminus) ist:
Ala--Glu-Gly-Asp-Asp-Cys-Ser-Leu-Glu-Lys-Ala-Met-Gly-Asp-Phe-?-Pro-Glu- Glu-Phe-Phe. "?" bedeutet, nicht mit vollständiger Sicherheit identifizierbar. Bei dieser Aminosäure handelt es sich mit einiger Wahrscheinlichkeit um Lysin.

Beispiel 6 SDS-Gelelektrophorese und Bestimmung des Molekulargewichts

Das Protein der Erfindung wurde im reduzierten (Reduktion mit Dithiothreit) und im nicht reduzierten Zustand zusammen mit den Molekulargewichtsmarkern (Electrophoresis Calibration Kit von Pharmacia) Phosporylase b (94 kDa), Albumin (67 kDa), Ovalbumin (43 kDa), Carbonic Anhydrase (30 kDa), Trypsin Inhibitor (20,1 kDa) und Lactalbumin (14,4 kDa) auf ein 12,5%-iges SDS-Poly acrylamidgel aufgetragen und nach der Elektrophorese nach Laemmli (1970, Nature 227, 680-685) mit Coomassie brillant blue gefärbt. Im reduzierten Zu stand wandert das Protein der Erfindung während der Elektrophorese nur ge ringfügig oberhalb des Trypsin Inhibitors. Das entspricht einem Molekular gewicht von etwa 21 000 Da. Im nicht reduziertem Zustand wandert das Protein der Erfindung zwischen dem Trypsin Inhibitor und Lactalbumin, was ei nem Molekulargewicht von etwa 18 000 Da entspricht.

Beispiel 7 Das Protein der Erfindung hemmt nicht die Serinproteasen Faktor Xa und Trypsin.

Die Aktivität von Faktor Xa und von Trypsin werden mit dem folgenden Test gemessen. Zu 80 µl 50 mmol/l Tris/HCl pH 8,0, 227 mmol/l NaCl, werden für die Faktor Xa Bestimmung 0,004 IU (0,653 pmol) Faktor Xa (American Diagnostica) und 0,5 µg (28 pmol) des Proteins der Erfindung und für die Tryp sin-Bestimmung 0,004 IU (0,019 pmol) Trypsin (Sigma) und 0,016 µg (0,817 pmol) des Proteins der Erfindung gegeben und für 2 Minuten bei 37°C inku biert. Nach Zugabe von 0,05 µmol des Substrates S2222 (Kabi Vitrum) wird für 20 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend die Absorption bei 405 nm gemessen. Die Absorption dieser Ansätze ist genauso hoch wie die von An sätzen ohne das Protein der Erfindung, d. h. das Protein hemmt weder die Aktivität von Faktor Xa noch die von Trypsin.

Beispiel 8 Isoelektrische Fokussierung

Das Protein der Erfindung wird auf ein Gel für isoelektrische Fokussierung im Bereich von pH 3 bis 9 (Pharmacia) aufgetragen und zusammen mit Standard proteinen (Calibration Kit pH 3 bis 10 von Pharmacia) fokussiert. Die Fokussie rungsstelle des Proteins der Erfindung lag zwischen der des Sojabohnen- Trypsininhibitors (I.P. = 4,55) und der von β-Lactoglobulin A (I.P. = 5,2).

Beispiel 9 Verlängerung der Thrombin-Zeit

Die Thrombin-Zeit mißt die Aktivität von exogenem Thrombin, das zum Test plasma zugesetzt wird. Zu 0,1 ml Plasma werden 50 µl Lösung des Proteins der Erfindung in verschiedenen Verdünnungen (6 bis 58 nmol/l) und 50 µl Diäthylbarbiturat-Acetat-Puffer mit pH 7,6 gegeben und 1 Minute bei 37°C in kubiert. Nach Zugabe von 0,1 ml Thrombin-Lösung (3 IU/ml) wird die Zeit bis zum Gerinnungseintritt gemessen (Biomatic 2000 Coagulometer von Sarstedt). Das Protein der Erfindung, das in einer Konzentration von 35 nmol/l vorliegt, verlängert die Gerinnungszeit im Vergleich zu einem Kontrollansatz um das 5- fache.

Beispiel 10 Bestimmung von internen Aminosäuresequenzen nach Spaltung mit Lys C

Das gereinigte Protein der Erfindung (59 µg) wird mit 10% 2-Mercaptoethanol reduziert (2 Stunden bei Raumtemperatur unter N₂) und dann mit 4-Vinylpyridin umgesetzt (2 Stunden bei Raumtemperatur unter N₂). Nach einer Dialyse gegen 25 mmol/l Tris/HCl, pH 8,5; 1 mmol/l EDTA wird die Probe mit 1 µg Lys C (Boehringer Mannheim) versetzt und 6 Stunden bei 37°C inkubiert. Dieser Spaltansatz wird auf eine Supersper RP-18, 4 µm (250×4 mm, MZ- Analysentechnik, Mainz)-Säule aufgetragen und mit einem Gradienten 0,1% TFA in H₂O-0,08% TFA in 70% Acetonitril eluiert (HPLC-Anlage von Waters). Die Absorption bei 280 nm und bei 214 nm wird aufgezeichnet und das Eluat wird fraktioniert. Die Fraktionen, die den Absorptions-Peaks entsprechen, werden zur Trockne gebracht und in 30 µl H₂O aufgenommen. Einzelne Fraktionen werden in einem automatischen Aminosäuresequenator (Applied Biosystems Inc.) nach den Instruktionen des Herstellers sequenziert. Dabei ergeben sich folgende Sequenzen (Start jeweils vom N-Terminus, "?" bedeutet, nicht eindeutig identifiziert):
1. Ala-Met-Gly-Asp-Phe-Lys-Pro-Glu-Glu-Phe-Phe-?-Gly- Thr-Arg(?)-Tyr-Leu-Ala (Die Bestimmung der Aminosäure Arg ist mit Unsicherheit behaftet.)
2. Gly-Phe-Thr-Gln-lle-Val-Glu-lle-Gly-Tyr-Asn-Lys- 3. Asn-Gly-Glu-Gln-Tyr-Ser-Phe-Lys- (Beispiel 10 geht über die Offenbarung der DE-P 42 41 659.0 [Anmeldetag 4. Dezember 1992] hinaus).

Wenn die Sequenz des N-terminalen Endes des erfindungsgemäßen Proteins bekannt ist, läßt sich eine korrespondierende Nukleotidsequenz ermitteln. (siehe WO 90/07861) Diese wird in einer PCR angereichert. (siehe US-Pa tent 4,800,159) Mit Hilfe der vermehrten Nukleotid-Sequenzen kann in einer Genbank, die aus mRNA von Speicheldrüsen der Raubwanze Triatoma pallidi pennis hergestellt worden ist, ein mit der Nukleotidsequenz hybridisierendes Gen ermittelt werden. (siehe R. KNIPPERS, Molekulare Genetik, (1982) Stutt gart, New York, 3. Auflage). Die hybridisierte DNA wird so ermittelt, wie es in SANGER et al. Proc Natl Acad Sci USA (1977) 74 : 5463-5467 beschrieben ist.

Liegt die DNA-Sequenz vor, so werden ein passender Promotor und gegebe nenfalls ein passender Enhancer mit der DNA-Sequenz verbunden, so daß ein brauchbarer Vektor vorliegt. (M. WIRTH, L. SCHUMACHER and H. HAUSER, in h.S. CONRADT (ed) Protein Glycosylation, Cellular Biotechical and Analytical Aspects Vol 15, 49-52, VCH publishers, Weinheim, 1991) Ebenfalls auch J. KÄTZSCHMAR et al. (1992) Gene 116 : 281-284. Die Expression eines solchen Vektors ist je nach Konstruktion desselben in Prokaryonten oder Eu karyonten möglich.

SEQ ID NO: 1
ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz
SEQUENZLÄNGE: 15 Aminosäuren
ART DES MOLEKÜLS: N-terminales Proteinfragment
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: Speicheldrüse von Triatoma pallidipennis
EIGENSCHAFTEN: als reifes Protein: Thrombininhibitor.

SEQ ID NO: 2
ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz
SEQUENZLÄNGE: 21 Aminosäuren
ART DES MOLEKÜLS: N-terminales Proteinfragment
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: Speicheldrüse von Triatoma pallidipennis
EIGENSCHAFTEN: als reifes Protein: Thrombininhibitor.

SEQ ID NO: 3
ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz
SEQUENZLÄNGE: 21 Aminosäuren
ART DES MOLEKÜLS: N-terminales Proteinfragment
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: Speicheldrüse von Triatoma pallidipennis
EIGENSCHAFTEN: als reifes Protein: Thrombininhibitor.

SEQ ID NO: 4
ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz
SEQUENZLÄNGE: 21 Aminosäuren
ART DES MOLEKÜLS: N-terminales Proteinfragment nach Spaltung mit Lys C
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: Speicheldrüse von Triatoma pallidipennis
EIGENSCHAFTEN: als reifes Protein: Thrombininhibitor

"?" Unbestimmt; Arg(?) = Mit Unsicherheit.

SEQ ID NO: 5
ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz
SEQUENZLÄNGE: 12 Aminosäuren
ART DES MOLEKÜLS: N-terminales Proteinfragment nach Spaltung mit Lys C
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: Speicheldrüse von Triatoma pallidipennis
EIGENSCHAFTEN: als reifes Protein: Thrombininhibitor.

SEQ ID NO: 6
ART DER SEQUENZ: Aminosäure-Sequenz
SEQUENZLÄNGE: 7 Aminosäuren
ART DES MOLEKÜLS: N-terminales Proteinfragment nach Spaltung mit Lys C
URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: Speicheldrüse von Triatoma pallidipennis
EIGENSCHAFTEN: als reifes Protein: Thrombininhibitor.

Claims

1. Ein natürliches oder synthetisch herstellbares Protein, das ein Thrombin inhibitor ist und aus dem Speichel von Insekten, die Säugetierblut saugen, iso lierbar ist.

2. Ein Protein nach Anspruch 1, das aus der Raubwanze Triatoma pallidi pennis isolierbar ist.

3. Ein Protein nach einem der Ansprüche 1 und 2, das als aktives Protein eine N-terminale Sequenz wie folgt besitzt:

4. Ein Protein nach einem der Ansprüche 1 und 2, das als aktives Protein eine N-terminale Sequenz wie folgt besitzt: wobei Xaa eine natürliche Aminosäure ist.

5. Ein Protein nach einem der Ansprüche 1 und 2, das als aktives Protein

a) eine N-terminale Sequenz wie folgt besitzt: oder
b) allelische Modifikationen der zuvor genannten N-terminalen Aminosäure- Sequenz aufweist, wobei eine oder zwei Aminosäuren der N-terminalen Aminosäure-Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert sind, ohne da bei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen, oder
c) posttranslationale Modifikationen der N -terminalen Sequenzen unter a) und b) aufweist, die nicht wesentlich die Aktivität des aktiven Proteins beeinflussen.

6. Ein Protein nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Protein ein rekombinantes Protein ist.

7. Ein Protein nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Protein glykosyliert ist.

8. Eine cDNA oder DNA, die einen Thrombininhibitor mit einem N-termina len Ende kodiert,
wobei der Thrombininhibitor aus Speichel von Insekten, die Säugetierblut saugen, isolierbar ist,
und

9. Eine cDNA oder DNA, die einen Thrombininhibitor mit einem N-termina len Ende kodiert, wobei der Thrombininhibitor aus Speichel von Insekten, die Säugetierblut saugen, isolierbar ist, und

cc) wobei die das N-terminale Ende kodierende cDNA oder DNA folgende Aminosäure-Sequenz kodiert: worin Xaa eine natürliche Aminosäure ist, oder
dd) wobei die cDNA oder DNA allelische Modifikationen der Aminosäure- Sequenz unter cc) kodiert, worin eine oder zwei Aminosäuren der N-terminalen Aminosäure- Sequenz substituiert, deletiert oder insertiert sind, ohne dabei die Aktivität des aktiven Proteins wesentlich zu beeinflussen.

10. Eine cDNA oder DNA nach Anspruch 9, wobei die Aminosäure Xaa Lysin ist.

11. Ein Vektor, der eine cDNA oder DNA nach einem der Ansprüche 8 bis 10, weiterhin einen passenden Promotor und gegebenenfalls einen passenden Enhancer enthält.

12. Eine eukaryontische oder prokaryontische Wirtszelle, die mit einem Vek tor nach Anspruch 11 transformiert ist.

13. Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit folgenden Schritten:
Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem Vektor transformiert ist, welcher eine cDNA oder DNA nach einem der Ansprüche 8 bis 10 enthält,
und Isolieren und Reinigen des Proteins.

14. Ein Verfahren zur Reinigung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Protein isoliert, über wenigstens eine Säule gereinigt und an schließend eingeengt wird.

15. Ein Verfahren zur Reinigung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Verfahren aus folgenden Schritten besteht:
Auftragen des Speichels auf eine "Superose 12 HR-Säule" und Eluieren und erneute Auftragung auf einer CH-aktivierten Sepharose-Säule, an der zuvor Thrombin gekoppelt wurde, und Eluieren.

16. Ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 13 bis 15 als pharma zeutischer Wirkstoff.

17. Ein Arzneimittel, das ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 13 bis 15 enthält.

18. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 13 bis 15 enthält, in Gegenwart von pharmazeutisch verträglichen und annehmbaren Verbindungen und Trägern.

19. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 13 bis 15 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Thrombosen oder instabiler Angina oder Arteriosklerose, oder zur Prä vention eines Wiederverschlusses von Gefäßen nach PTCA/PTA oder zur Verhinderung der Blutgerinnung bei der Hämodialyse.