DE60019122T2

DE60019122T2 - Veränderter faktor viii

Info

Publication number: DE60019122T2
Application number: DE60019122T
Authority: DE
Inventors: S. John LOLLAR
Original assignee: Emory University
Current assignee: Emory University
Priority date: 1999-05-20
Filing date: 2000-05-16
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2020-05-17
Also published as: US20030166536A1; EP1200105A1; US6376463B1; JP3964622B2; DE60019122D1; HK1043543A1; ES2238284T3; AU5023700A; AU765442B2; PT1200105E; CA2374675A1; CY1110360T1; US7033791B2; WO2000071141A1; CA2374675C; EP1200105A4; JP2003508019A; ATE291923T1; EP1200105B1

Description

QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Die vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität der U.S. Anmeldung Nr. 09/315.179, die am 20. Mai 1999 angemeldet wurde.
BESTÄTIGUNG DER BUNDESFORSCHUNGSUNTERSTÜTZUNG
Die Regierung hat Rechte an der vorliegenden Erfindung, die aus dem National Institutes of Health Grant Nr. HL46215 hervorgehen, der die Forschung, die zu der vorliegenden Erfindung führte, teilweise finanziell unterstützte.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein einen Hybridfaktor VIII mit einer humanen oder Tier-Faktor VIII-Aminosäuresequenz oder eine Nicht-Faktor VIII-Aminosäuresequenz und Verfahren zur Herstellung und deren Verwendung.
Die Blutkoagulation beginnt, wenn Plättchen an der durch Schnitt verletzten Wand eines Blutgefäßes an der Stelle einer Verletzung anhaften. Nachfolgend werden in einer Kaskade enzymatisch regulierter Reaktionen lösliche Fibrinogenmoleküle durch das Enzym Thrombin in unlösliche Fibrinstränge umgewandelt, die die Plättchen in einem Thrombus zusammenhalten. Bei jedem Schritt in der Kaskade wird ein Proteinvorläufer zu einer Protease umgewandelt, die den nächsten Proteinvorläufer in der Reihe spaltet. Bei den meisten Schritten sind Cofaktoren erforderlich.
Der Faktor VIII zirkuliert als ein inaktiver Vorläufer im Blut, der fest und nicht kovalent an einen von Willebrand-Faktor gebunden ist. Der Faktor VIII wird proteolytisch durch Thrombin oder den Faktor Xa aktiviert, der ihn von dem von Willebrand-Faktor trennt und dessen prokoagulierende Funktion in der Kaskade aktiviert. In seiner aktiven Form ist der Proteinfaktor VIIIa ein Cofaktor, der die katalytische Wirksamkeit des Faktors IXa gegenüber der Faktor X-Aktivierung um mehrere Größenordnungen erhöht.
Menschen mit einem Mangel an Faktor VIII oder Antikörpern gegen den Faktor VIII, die nicht mit dem Faktor VIII behandelt werden, leiden an unkontrollierter innerer Blutung, die eine Reihe an ernsten Symptomen, von Entzündungsreaktionen in Gelenken bis zum frühen Tod, verursachen kann. Schwere Hämophile, die sich in den Vereinigten Staaten ungefähr auf 10.000 belaufen, können mit einer Infusion des humanen Faktor VIII behandelt werden, der die normale Koagulationsfähigkeit des Bluts wiederherstellt, wenn er mit ausreichender Häufigkeit und Konzentration verabreicht wird. Die klassische Definition des Faktors VIII ist eigentlich die, dass es die Substanz ist, die im normalen Blutplasma vorhanden ist und die den Koagulationsdefekt im Plasma, das von Individuen mit Hämophilie A stammt, korrigiert.
Die Entwicklung von Antikörpern („Inhibitoren" oder „inhibitorische Antikörper"), die die Aktivität des Faktors VIII hemmen, ist bei der Behandlung von Patienten mit Hämophilie eine ernsthafte Komplikation. In Reaktion auf therapeutische Infusionen mit Faktor VIII entwickeln näherungsweise 20% der Patienten mit Hämophilie A Autoantikörper. In vorher nicht behandelten Patienten mit Hämophilie A, die Inhibitoren entwickeln, entwickelt sich der Inhibitor normalerweise innerhalb eines Jahres der Behandlung. Zusätzlich entwickeln sich gelegentlich Autoantikörper, die den Faktor VIII inaktivieren, in Individuen mit vorher normalen Gehalten an Faktor VIII. Ist der Inhibitortiter genügend niedrig, können Patienten durch Erhöhen der Dosis an Faktor VIII behandelt werden. Häufig ist jedoch der Inhibitortiter so hoch, dass er durch den Faktor VIII nicht niedergedrückt werden kann. Eine alternative Strategie besteht darin, dass der Bedarf an Faktor VIII während der normalen Hämostase unter Verwendung von komplexen Faktor IX-Präparaten (zum Beispiel „KONYNE^®", Proplex^®) oder rekombinantem humanen Faktor VIIa umgangen wird. Da zusätzlich der Schweine-Faktor VIII normalerweise eine wesentlich geringere Reaktivität mit Inhibitoren aufweist, als der humane Faktor VIII, wird ein teilweise gereinigtes Schweine-Faktor VIII-Präparat (HYATE:C^®) verwendet. Viele Patienten, die gegen den humanen Faktor VIII inhibitorische Antikörper entwickelt haben, sind erfolgreich mit dem Schweine-Faktor VIII behandelt worden und haben eine derartige Behandlung über lange Zeiträume hinweg toleriert. Jedoch ist die Verabreichung des Schweine-Faktor VIII keine vollständige Lösung, weil sich nach einer oder mehreren Infusionen Inhibitoren gegen den Schweine-Faktor VIII entwickeln können.
Für die Behandlung von Hämophilie A sind mehrere Präparate des aus dem Plasma stammenden humanen Faktors VIII mit verschiedenen Reinheitsgraden kommerziell erhältlich. Diese umfassen einen teilweise gereinigten Faktor VIII, der aus dem vereinigten Blut von vielen Spendern stammt und der mit Wärme und Detergens gegen Viren behandelt ist, jedoch einen signifikanten Gehalt an antigenen Proteinen enthält; einen monoklonalen Antikörper-gereinigten Faktor VIII, der niedrigere Gehalte an antigenen Verunreinigungen und viralen Verunreinigungen aufweist; und einen rekombinanten humanen Faktor VIII, der sich in der klinischen Erprobung befindet. Leider ist der humane Faktor VIII bei physiologischen Konzentrationen und pH-Wert instabil, er ist im Blut in extrem niedriger Konzentration (0,2 μg/ml Plasma) vorhanden und weist eine geringe spezifische Koagulationsaktivität auf.
Bei Hämophilen ist ein täglicher Austausch des Faktors VIII zur Vermeidung von Blutung der daraus resultierenden deformierenden hämophilen Arthritis erforderlich. Jedoch war die Versorgung ungenügend und infolge Schwierigkeiten bei der Isolierung und Reinigung, Immunogenität und der Notwendigkeit der Entfernung von AIDS und des Hepatitisinfektionsrisikos traten bei der therapeutischen Verwendung Probleme auf. Die Verwendung des rekombinanten humanen Faktors VIII oder des teilweise gereinigten Schweine-Faktors VIII wird nicht alle diese Probleme lösen.
Die mit dem im Allgemeinen verwendeten, handelsüblichen aus dem Plasma stammenden Faktor VIII assoziierten Probleme regten ein signifikantes Interesse an der Entwicklung eines besseren Faktor VIII-Produkts an. Es besteht ein Bedarf an einem wirksameren Faktor VIII-Molekül, so dass mehr Koagulationseinheiten pro Molekül abgegeben werden können; an einem Faktor VIII-Molekül, das bei einem ausgewählten pH-Wert und physiologischer Konzentration stabil ist; an einem Faktor VIII-Molekül, das weniger dazu neigt, eine Erzeugung inhibitorischer Antikörper zu bewirken, und an einem Faktor VIII-Molekül, das den Immunnachweis in Patienten vermeidet, die schon Antikörper gegen den humanen Faktor VIII erworben haben.
Daher besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, einen Faktor VIII bereitzustellen, der Hämophilie in einem Patienten mit Mangel an Faktor VIII oder mit Inhibitoren gegen den Faktor VIII korrigiert.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Verfahren zur Behandlung von Hämophilen bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Faktor VIII bereitzustellen, der bei einem ausgewählten pH-Wert und physiologischer Konzentration stabil ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Faktor VIII bereitzustellen, der eine größere koagulationsfördernde Aktivität als der humane Faktor VIII aufweist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Faktor VIII bereitzustellen, gegen den weniger Antikörper erzeugt werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte gereinigte Hybridfaktor VIII-Moleküle und Fragmente davon mit koagulationsfördernder Aktivität bereit, umfassend einen Hybridfaktor VIII mit einer vom Mensch und Schwein oder nicht-humanen Säuger (die hier zusammen als „Tier" bezeichnet werden) stammenden Faktor VIII-Aminosäuresequenz; oder in einer zweiten Ausführungsform, umfassend einen Hybrid-äquivalenten Faktor VIII mit einer Faktor VIII-Aminosäuresequenz, die vom Mensch oder Tier oder beidem stammt und einer Aminosäuresequenz, die bezüglich dem Faktor VIII keine bekannte Sequenzidentität aufweist („Nicht-Faktor VIII-Aminosäuresequenz"), die vorzugsweise in einer antigenen und/oder immunogenen Region des Faktors VIII substituiert ist, diese werden beschrieben. Der Fachmann wird erkennen, dass zahlreiche Hybridfaktor VIII-Konstrukte hergestellt werden können, umfassend, aber nicht eingeschränkt auf einen Mensch/Tier Faktor VIII mit einer größeren koagulationsfördernden Aktivität als der humane Faktor VIII („bessere koagulationsfördernde Aktivität"); einen nicht-immunogenen humanen/äquivalenten Faktor VIII; nicht-antigenen humanen/äquivalenten oder Mensch/Tier Faktor VIII; nicht-immunogenen Mensch/Tier oder humanen/äquivalenten Faktor VIII mit besserer koagulationsfördernder Aktivität; nicht-antigenen Mensch/Tier oder Mensch/Tier/äquivalenten Faktor VIII mit besserer koagulationsfördernder Aktivität; nicht-immunogenen, nicht-antigenen humanen/äquivalenten oder humanen/äquivalenten/Tier Faktor VIII; und nicht-immunogenen, nicht-antigenen Mensch/Tier/äquivalenten Faktor VIII mit besserer koagulationsfördernder Aktivität.
Das Hybridfaktor VIII-Molekül wird durch Isolierung und Rekombination von humanen und Tier-Faktor VIII-Untereinheiten oder Domänen, oder durch gentechnische Herstellung der humanen und Tier-Faktor VIII-Gene erzeugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden DNA-Rekombinationsverfahren zur Substitution von Elementen des Tier-Faktors VIII für entsprechende Elemente des humanen Faktors VIII verwendet, was zu hybriden Mensch/Tier Faktor VIII-Molekülen führt. In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform werden DNA-Rekombinationsverfahren dazu verwendet, eine oder mehrere Aminosäuren in dem humanen oder Tier-Faktor VIII oder in einem hybriden Mensch/Tier Faktor VIII durch Aminosäuren zu ersetzen, die bezüglich des Faktors VIII keine bekannte Sequenzidentität aufweisen, vorzugsweise durch eine Sequenz von Aminosäuren, die weniger Immunreaktivität gegen natürlich vorkommende inhibitorische Antikörpern gegen den Faktor VIII aufweisen („nicht antigene Aminosäuresequenzen") und/oder weniger dazu neigen, die Erzeugung von Antikörpern gegen den Faktor VIII hervorzurufen („nicht immunogene Aminosäuresequenz") als der humane Faktor VIII. Ein Beispiel einer Aminosäuresequenz, die zum Ersetzen einer immunogenen oder antigenen Sequenz verwendet werden kann, ist eine Sequenz von Alaninresten.
In einer weiteren Ausführungsform werden Untereinheiten des Faktors VIII aus humanem oder Tier-Plasma isoliert und ein hybrider Mensch/Tier Faktor VIII wird entweder durch Mischen von schwere Kette-Untereinheiten vom Tier mit leichte Kette-Untereinheiten vom Mensch oder durch Mischen von schwere Kette-Untereinheiten vom Mensch mit leichte Kette-Untereinheiten vom Tier erzeugt, wodurch humane leichte Kette/Tier-schwere Kette und humane schwere Kette/Tier-leichte Kette Hybridmoleküle erzeugt werden. Diese Hybridmoleküle werden durch Ionenaustauschchromatographie isoliert.
Alternativ dazu werden eine oder mehrere Domänen oder partielle Domänen des Faktors VIII isoliert und von humanem oder Tier-Plasma gereinigt und der hybride Mensch/Tier Faktor VIII wird durch Mischung von Domänen oder partiellen Domänen einer Spezies mit Domänen oder partiellen Domänen einer zweiten Spezies erzeugt. Hybridmoleküle können durch Ionenaustauschchromatographie isoliert werden.
Verfahren zur Herstellung von hochgereinigtem Hybridfaktor VIII sind beschrieben, wobei sie die Schritte aufweisen: (a) Isolierung von Untereinheiten des aus dem Plasma stammenden humanen Faktors VIII und Untereinheiten des aus dem Plasma stammenden Tier-Faktors VIII, gefolgt von Rekonstitution der koagulationsfördernden Aktivität durch Mischen von humanen und Tier-Untereinheiten, gefolgt von Isolierung des hybriden Mensch/Tier Faktors VIII durch Ionenaustauschchromatographie; (b) Isolierung von Domänen oder partiellen Domänen des aus dem Plasma stammenden humanen Faktors VIII und Domänen oder partiellen Domänen des aus dem Plasma stammenden Tier-Faktors VIII, gefolgt von Rekonstitutionstellung der koagulationsfördernden Aktivität durch Mischen von humanen und Tier-Domänen, gefolgt von Isolierung des hybriden Mensch/Tier Faktors VIII durch Ionenaustauschchromatographie; (c) Konstruktion von Domänen oder partiellen Domänen des Tier-Faktors VIII durch DNA-Rekombinationstechnologie, und rekombinanter Austausch von Domänen des Tier- und humanen Faktors VIII zur Herstellung des hybriden Mensch/Tier Faktors VIII mit koagulationsfördernder Aktivität; (d) Erzeugung des hybriden Mensch/Tier Faktors VIII durch Ersetzen spezifischer Aminosäurereste des Faktors VIII einer Spezies durch die entsprechenden einmalig vorhandenen Aminosäurereste des Faktors VIII der anderen Spezies; oder (e) Erzeugung eines Hybrid-äquivalenten Faktor VIII-Moleküls mit einer humanen oder Tier-Aminosäuresequenz oder beiden, in denen spezifische Aminosäurereste des Faktors VIII durch Aminosäurereste mit keiner bekannten Sequenzidentität bezüglich dem Faktor VIII durch ortsspezifische Mutagenese ersetzt sind.
Die Bestimmung der gesamten den Schweine-Faktor VIII kodierenden DNA-Sequenz, die hier ausgeführt ist, hat zum ersten Mal die Synthese des Schweine-Faktor VIII mit vollständiger Länge durch Exprimieren der den Schweine-Faktor VIII kodierenden DNA in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht. Gereinigter rekombinanter Schweine-Faktor VIII ist daher ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Die DNA, die jede Domäne des Schweine-Faktor VIII sowie jedes spezifizierte Fragment davon kodiert, kann entweder durch sich selbst oder in Kombination mit einer den humanen Faktor VIII kodierenden DNA zur Herstellung des hybriden Mensch/Schwein Faktor VIII, ähnlich exprimiert werden, wie hier beschrieben ist. Weiterhin wird der Schweine-fVIII mit der gesamten oder einem Teil der deletierten B-Domäne (B-domänenfreier Schweine-fVIII) als Teil der vorliegenden Erfindung durch Expression der den Schweine-fVIII kodierenden DNA mit einer Deletion von einem oder mehreren Codonen der B-Domäne zur Verfügung gestellt.
Einige Ausführungsformen des hybriden oder Hybrid-äquivalenten Faktors VIII weisen eine größere spezifische Aktivität als der humane Faktor VIII auf und eine gleiche oder größere als die de Schweine-Faktor VIII auf. Einige Ausführungsformen des hybriden oder Hybrid-äquivalenten Faktor VIII weisen eine gleiche oder geringere Immunreaktivität mit inhibitorischen Antikörpern gegen Faktor VIII und/oder eine geringere Immunogenität in Menschen oder Tieren im Vergleich zum Faktor VIII von Mensch oder Schwein auf.
Ebenfalls werden pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Patienten mit Faktor VIII-Mangel bereitgestellt, die das Verabreichen des hybriden oder Hybrid-äquivalenten Faktors VIII umfassen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A–1H stellen zusammen einen angeordneten Sequenzvergleich der humanen, Schweine- und Mäuse-Faktor VIII-Säuresequenzen bereit.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Sofern nicht anders spezifiziert oder angegeben ist, bezeichnet der Begriff „Faktor VIII", wie er hier verwendet wird, jedes funktionale Faktor VIII-Proteinmolekül von jedem Tier, jeden Hybridfaktor VIII oder modifizierten Faktor VIII. Die Begriffe „Hybridfaktor VIII" oder „Hybridprotein" bezeichnen jedes funktionale Faktor VIII-Proteinmolekül oder Fragment davon, das die Faktor VIII-Aminosäuresequenz von Mensch, Schwein und/oder Nicht-Mensch, Nicht-Schwein Säugerspezies umfasst. Derartige Kombinationen umfassen sind aber nicht eingeschränkt auf jedes beliebige oder alle der folgenden Hybridfaktor VIII-Moleküle oder Fragmente davon: (1) Mensch/Schwein; (2) Mensch/Nicht-Mensch, Nicht-Schwein-Säuger, wie zum Beispiel Mensch/Maus; (3) Schwein/Nicht-Mensch, Nicht-Schwein-Säuger, wie zum Beispiel Maus/Hund. Derartige Kombinationen umfassen ebenfalls Hybridfaktor VIII-äquivalente Moleküle oder Fragmente davon, wie untenstehend weiter definiert ist, die eine Faktor VIII-Aminosäuresequenz von hybridem Mensch-, Schwein-, oder Nicht-Mensch-, Nicht-Schwein Säugerursprung ist, in der eine Aminosäuresequenz mit keiner bekannten Sequenzidentität bezüglich dem Faktor VIII substituiert ist. Derartige Hybridkombinationen umfassen ebenfalls eine Hybridfaktor VIII-Aminosequenz, die aus mehr als zwei Spezies, wie zum Beispiel Mensch/Schwein/Maus oder aus zwei oder mehr Spezies abgeleitet ist, in denen eine Aminosäuresequenz mit keiner bekannten Sequenzidentität bezüglich dem Faktor VIII substituiert ist. Sofern nicht anders angegeben ist, umfasst der Begriff „Hybridfaktor VIII" Fragmente des Hybridfaktors VIII, die, wie nachstehend in einer beispielhaften Ausführungsform beschrieben ist, als Sonden für Forschungszwecke oder als Diagnosereagenzien verwendet werden können.
Wie hier verwendet, umfasst der Begriff „Säuger-Faktor VIII" den Faktor VIII, wobei die Aminosäuresequenz von jedem nicht humanen Säuger abgeleitet ist, sofern nicht anderes angegeben ist. Der Begriff „Tier", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Schwein oder andere nicht humane Säuger.
Ein „Fusionsprotein" oder „Fusionsfaktor VIII oder Fragment davon", ist, wie es hier verwendet wird, ist das Produkt eines Hybridgens, in dem die kodierende Sequenz für ein Protein, zum Beispiel durch Fusionieren eines Teils davon an die kodierende Sequenz für ein zweites Protein von einem unterschiedlichen Gen, umfassend verändert ist, um ein Hybridgen, das das Fusionsprotein kodiert, zu erzeugen. Wie hier verwendet wird, ist ein Fusionsprotein ein Teilsatz des Hybridfaktor VIII-Proteins, das in der vorliegenden Anmeldung beschrieben ist.
Eine „entsprechende" Nukleinsäure oder Aminosäure oder Sequenz der beiden ist, wie hier verwendet wird, eine, die an einer Stelle in einem Faktor VIII oder Hybridfaktor VIII-Molekül oder Fragment davon vorhanden ist, die die gleiche Struktur und/oder Funktion aufweist wie eine Stelle in dem Faktor VIII-Molekül einer anderen Spezies, obwohl die Nukleinsäure oder Aminosäurezahl nicht identisch sein muss.
Eine einer anderen Faktor VIII-Sequenz „entsprechenden" Sequenz entspricht im Wesentlichen einer derartigen Sequenz und hybridisiert an die mit der SEQ ID NR bezeichneten Sequenz unter stringenten Bedingungen. Eine einer anderen Faktor VIII-Sequenz „entsprechenden" Sequenz umfasst ebenfalls eine Sequenz, die zur Expression eines Faktors VIII oder des beanspruchten prokoagulierenden Hybridfaktors VIII oder Fragment davon führt und die an die mit SEQ ID NR bezeichnete Sequenz nur aufgrund der Redundanz des genetischen Codes hybridisiert.
Der Begriff „einmalig vorhandener" Aminosäurerest oder -sequenz, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Aminosäuresequenz oder Rest in dem Faktor VIII-Molekül von einer Spezies, die von dem homologen Rest oder Sequenz in dem Faktor VIII-Molekül einer anderen Spezies verschieden ist.
Der Begriff „Spezifische Aktivität", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die Aktivität, die den Koagulationsdefekt von Plasma mit Mangel an humanem Faktor VIII korrigiert. Die spezifische Aktivität wird in Einheiten der Koagulationsaktivität pro Milligramm gesamtes Faktor VIII-Protein in einem Standardassay gemessen, in dem die Koagulationszeit des Plasmas mit Mangel an humanem Faktor VIII mit derjenigen des normalen humanen Plasmas verglichen wird. Eine Einheit der Faktor VIII-Aktivität ist die Aktivität, die in einem Milliliter normalem humanen Plasma vorhanden ist. In dem Assay ist die Aktivität des untersuchten Faktors VIII umso größer, je kürzer die Zeit zur Bildung der Koagulation ist. Der hybride Mensch/Schwein Faktor VIII weist eine Koagulationsaktivität in einem humanen Faktor VIII-Assay auf. Diese Aktivität sowie diejenige von anderen hybriden oder Hybridenäquivalenten Faktor VIII-Molekülen oder Fragmenten davon kann kleiner, gleich oder größer als diejenige des entweder aus dem Plasma stammenden oder rekombinanten humanen Faktors VIII sein.
Das humane Faktor VIII-cDNA-Nukleotid und vorhergesagte Aminosäuresequenzen sind in den SEQ ID NR: 1 beziehungsweise 2 gezeigt. Der Faktor VIII wird als ein einzelkettiges Protein mit näherungsweise 300 kDa mit einer inneren Sequenzhomologie synthetisiert, die die „Domänen"-Sequenz NH₂-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH definiert. In einem Faktor VIII-Molekül ist eine „Domäne", wie hier verwendet wird, eine fortlaufende Sequenz von Aminosäuren, die durch eine innere Aminosäuresequenz identität und Stellen proteolytischer Spaltung durch Thrombin definiert ist. Sofern nicht anders angegeben ist, umfassen Faktor VIII-Domänen die folgenden Aminosäurereste, wenn die Sequenzen entlang der humanen Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 2) angeordnet sind: A1, Reste Ala1-Arg-372; A2, Reste Ser373-Arg740; B, Reste Ser741-Arg1648; A3, Reste Ser1690-Ile2032; C1, Reste Arg2033-Asn2172; C2, Reste Ser2173-Tyr2332. Die A3-C1-C2-Sequenz umfasst die Reste Ser1690-Tyr2332. Die restliche Sequenz, die Reste Glu1649-Arg1689, wird normalerweise als das Faktor VIII-leichte Kette Aktivierungspeptid bezeichnet. Der Faktor VIII wird proteolytisch durch Thrombin oder Faktor Xa aktiviert, der es von dem von Willebrand-Faktor unter Bildung von Faktor VIIIa trennt, der eine prokoagulierende Funktion aufweist. Die biologische Funktion von Faktor VIIIa besteht in der Erhöhung der katalytischen Wirksamkeit des Faktors IXa bezüglich der Faktor X-Aktivierung um mehrere Größenordnungen. Der Thrombin-aktivierte Faktor VIIIa ist ein A1/A2/A3-C1-C2-Heterotrimer von 160 kDa, der mit Faktor IXa und Faktor X auf der Oberfläche von Plättchen oder Monozyten einen Komplex bildet. Der Begriff eine „partielle Domäne", wie er hier verwendet wird, ist eine fortlaufende Aminosäuresequenz, die einen Teil einer Domäne bildet.
Der Begriff „Untereinheiten" des humanen oder Tier-Faktor VIII, wie er hier verwendet wird, bezeichnet die schweren und leichten Ketten des Proteins. Die schwere Kette des Faktors VIII enthält drei Domänen, A1, A2 und B. Die leichte Kette des Faktors VIII enthält ebenfalls drei Domänen A3, C1 und C2.
Der Hybridfaktor VIII oder ein Fragment davon können (1) durch Substitution von isolierten aus den Plasmen stammenden Tier-Untereinheiten oder humanen Untereinheiten (schwere oder leichte Ketten) für entsprechende humane Untereinheiten oder Tier-Untereinheiten; (2) durch Substitution von humanen Domänen oder Tier-Domänen (A1, A2, A3, B, C1 und C2) für entsprechende Tier-Domänen oder humane Domänen; (3) durch Substitution von Teilen von humanen Domänen oder Tier-Domänen für Teile von Tier-Domänen oder humanen Domänen; (4) durch Substitution von mindestens einer spezifische Sequenz, die eine oder mehrere einmalig vorhandene humane oder Tier-Aminosäure(n) umfasst für entsprechende Tier- oder humane Aminosäure(n); oder (5) durch Substitution von einer Aminosäuresequenz, die bezüglich dem Faktor VIII keine bekannte Sequenzidentität aufweist, für mindes tens eine Sequenz, die einen oder mehrere spezifische Aminosäurerest(e) im Mensch-, Tier- oder hybriden Faktor VIII oder Fragmenten davon umfasst, hergestellt werden. Die Begriffe „B-domänenfreier" Hybridfaktor VIII, Hybrid-äquivalenter Faktor VIII oder Fragment von jedem der beiden, wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf jedes der hier beschriebenen Hybridfaktor VIII-Konstrukte, denen die B-Domäne fehlt oder ein Teil davon.
Die Begriffe „Epitop", „antigene Stelle" und „antigene Determinante", wie sie hier verwendet werden, werden synonym verwendet und sind als Teil des humanen, Tierhybriden oder Hybrid-äquivalenten Faktor VIII oder Fragment davon definiert, das spezifisch von einem Antikörper erkannt wird. Es besteht aus jeder Zahl von Aminosäureresten und es kann von der Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur des Proteins abhängen. Gemäß der vorliegenden Offenbarung kann ein Hybridfaktor VIII, ein Hybridfaktor VIII-Äquivalent oder ein Fragment von jedem der beiden, das mindestens ein Epitop umfasst, als Reagenz in den nachstehend beschriebenen Diagnose-Assays verwendet werden. In einigen Ausführungsformen ist der Hybrid- oder der Hybrid-äquivalente Faktor VIII oder ein Fragment davon nicht kreuzreaktiv oder weniger kreuzreaktiv mit allen natürlich vorkommenden inhibitorischen Faktor VIII-Antikörpern als der humane oder Schweine-Faktor VIII.
Der Begriff „immunogene Stelle", wie er hier verwendet wird, ist als eine Region des humanen oder Tier-Faktor VIII, Hybrid- oder Hybrid-äquivalenten Faktor VIII oder ein Fragment davon definiert, das spezifisch die Erzeugung eines Antikörpers gegen den Faktor VIII, Hybrid- oder Hybrid-äquivalenten Faktor oder ein Fragment in einem Menschen oder Tier hervorruft, wie durch Routineprotokolle, wie zum Beispiel Immunassays, zum Beispiel ELISA oder der Bethesda-Assay, wie hier beschrieben ist, gemessen wird. Sie kann aus jeder Zahl von Aminosäureresten bestehen und sie kann von der Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur des Proteins abhängen. In einigen Ausführungsformen ist der Hybrid- oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII oder ein Fragment davon nicht immunogen oder weniger immunogen in einem Tier oder Menschen als der humane oder Schweine-Faktor VIII.
Der Begriff ein „Hybridfaktor VIII-äquivalentes Molekül oder ein Fragment davon" oder „Hybrid-äquivalenter Faktor VIII oder ein Fragment davon" ist, wie er hier ver wendet wird, ist ein aktiver Faktor VIII oder ein Hybridfaktor VIII-Molekül oder ein Fragment davon, das mindestens eine Sequenz umfasst, einschließlich eines oder mehrerer Aminosäurereste, die keine bekannte Identität bezüglich der humanen oder Tier-Faktor VIII-Sequenz aufweisen, die mindestens für eine Sequenz, einschließlich eines oder mehrerer spezifische Aminosäurereste im humanen, Tier- oder Hybridfaktor VIII oder ein Fragment davon substituiert ist. Die Sequenz von einem oder mehreren Aminosäureresten, die bezüglich der humanen oder Tier-Faktor VIII-Sequenz keine bekannte Identität aufweisen, wird hier ebenfalls als „Nicht-Faktor VIII-Aminosäuresequenz" bezeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist (sind) die Aminosäure(n), die bezüglich der Faktor VIII-Sequenz keine bekannte Identität aufweist (aufweisen) Alaninreste. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die spezifische Faktor VIII-Sequenz, für die die Aminosäure(n) mit keiner bekannten Sequenzidentität bezüglich der Faktor VIII-Sequenz substituiert sind, eine antigene Stelle, die mit natürlich vorkommenden Faktor VIII-inhibitorischen Antikörpern immunreaktiv ist, so dass das resultierende Hybridfaktor VIII-äquivalente Molekül oder Fragment davon weniger immunreaktiv oder nicht mit Faktor VIII-inhibitorischen Antikörpern immunreaktiv ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die spezifische Hybridfaktor VIII-Sequenz, für die die Aminosäure(n) mit keiner bekannten Sequenzidentität bezüglich der Faktor VIII-Sequenz substituiert sind, eine immunogene Stelle, die die Bildung von Faktor VIII-inhibitorischen Antikörpern in einem Mensch oder Tier hervorruft, so dass das resultierende Hybridfaktor VIII-äquivalente Molekül oder Fragment davon weniger immunogen ist.
Der Begriff „Faktor VIII-Mangel", wie er hier verwendet wird, umfasst einen Mangel an Koagulationsaktivität, der durch Erzeugung eines defekten Faktor VIII, durch unzulängliche oder keine Erzeugung des Faktor VIII oder durch partielle oder vollständige Inhibierung des Faktor VIII durch Inhibitoren verursacht wird. Hämophilie A ist eine Art Faktor VIII-Mangel, die aus einem Defekt in einem X-verknüpften Gen und der Abwesenheit oder dem Mangel an Faktor VIII-Protein, das es kodiert, resultiert.
Der Begriff „Diagnose-Assays", wie er hier verwendet wird, umfasst Assays, die in gewisser Art die Antigen-Antikörper-Wechselwirkung zum Nachweis und/oder Quantifizierung der Menge eines speziellen Antikörpers verwenden, der in einer Testprobe vorhanden ist, um die Auswahl medizinischer Therapien zu unterstützen. Es gibt vie le Assays, die dem Fachmann bekannt sind. Die Hybrid- oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII-DNA oder ein Fragment davon und das davon exprimierte Protein kann jedoch, wie hier verwendet wird, im Ganzen oder teilweise für die entsprechenden Reagenzien in den ansonsten bekannten Assays substituiert werden, wobei die modifizierten Assays zum Nachweis und/oder Quantifizierung von Antikörpern gegen den Faktor VIII verwendet werden können. Es ist die Verwendung dieser Reagenzien, der Hybrid- oder Hybrid-äquivalenten Faktor VIII-DNA oder eines Fragments davon oder eines davon exprimierten Proteins, das eine Modifikation bekannter Assays für einen Nachweis von Antikörpern gegen den humanen oder Tier-Faktor VIII oder gegen den hybriden Mensch/Tier Faktor VIII erlaubt. Derartige Assays umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf ELISAs, Immundiffusionsassays und Immunoblots. Geeignete Verfahren zur Ausführung eines jeden dieser Assays sind dem Fachmann bekannt. Wie hier verwendet wird, kann der Hybrid- oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII oder ein Fragment davon, das mindestens ein Epitop des Proteins umfasst, als das Diagnosereagenz verwendet werden. Beispiele für andere Assays, in denen der Hybrid- oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII oder ein Fragment davon verwendet werden kann, umfassen den Bethesda-Assay und Antikoaglulationsassays.
Das „Expressionsprodukt" einer einen humanen oder Tier-Faktor VIII oder einen Mensch/Tier-Hybridfaktor VIII oder einen modifizierten Faktor VIII kodierenden DNA ist das Produkt, das aus der Expression der betreffenden DNA in einer geeigneten Wirtszelle, erhalten wird, umfassend derartige Merkmale einer Prä- oder Post-Translationsmodifikation eines Proteins, das durch die betreffende DNA kodiert wird, umfassend aber nicht eingeschränkt auf Glycosylierung, proteolytische Spaltung und dergleichen. Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass solche Modifikationen auftreten und etwas unterschiedlich sein können, in Abhängigkeit von dem Wirtszelltyp und anderen Faktoren, und zu molekularen Isoformen des Produkts mit einer Verzögerung der prokoagulierenden Aktivität führen können. Siehe zum Beispiel Lind, P. et al., Eur. J. Biochem. 232: 1927 (1995), auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird.
Als „Immunreaktivitäts-verringernde" Aminosäuren werden hier diejenigen Aminosäuren definiert, die unbedeutend, falls überhaupt zu der Bindungsenergie eines Anti körper-Antigenpaars beitragen. Nicht einschränkende Beispiele einiger Aminosäuren, die als Immunreaktivitäts-verringernd bekannt sind, umfassen Alanin, Methionin, Leucin, Serin und Glycin. Es versteht sich von selbst, dass die Verringerung der Immunreaktivität, die durch eine gegebene Aminosäuresubstitution in einem gegebenen Antigen-Antikörperpaar erreichbar ist, ebenfalls von allen Wirkungen abhängt, die die Substitution auf die Proteinkonformation, Epitopzugänglichkeit und dergleichen haben könnte.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER VERFAHREN
Die U.S. Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 07/864,004 beschreibt die Entdeckung von hybriden Mensch/Schwein Faktor VIII-Molekülen mit koagulationsfördernder Aktivität, in denen Elemente des Faktor VIII-Moleküls vom Menschen oder Schwein für entsprechende Elemente des Faktor VIII-Moleküls der anderen Spezies substituiert sind. Die U.S. Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 08/212,133 und die PCT/US94/13200 beschreiben prokoagulierende hybride Mensch/Tier und Hybrid-äquivalente Faktor VIII-Moleküle, in denen Elemente des Faktor VIII-Moleküls einer Spezies für entsprechende Elemente des Faktor VIII-Moleküls der anderen Spezies substituiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt hybride Mensch/Tier, Tier/Tier und äquivalente Faktor VIII-Moleküle, modifizierte Faktor VIII-Moleküle und Fragmente davon, und die Nukleinsäuresequenzen, die derartige Hybride und modifizierte Faktor VIII-Moleküle kodieren, bereit, von denen einige eine größere koagulationsfördernde Aktivität in einem Standard-Koagulationsassay als im Vergleich zu hoch reinem humanen Faktor VIII aufweisen; und/oder weniger immunreaktiv gegen inhibitorische Antikörper gegen humanen oder Schweine-Faktor VIII sind als humaner oder Schweine-Faktor VIII; und/oder weniger immunogen in einem Mensch oder Tier sind als der humane oder Schweine-Faktor VIII; und/oder andere therapeutische und verwendbare Eigenschaften aufweisen. Diese hybriden und/oder modifizierten Faktor VIII-Moleküle können folgendermaßen konstruiert werden.
Mindestens fünf Arten aktiver hybrider Mensch/Schwein oder Hybrid-äquivalenter Faktor VIII-Moleküle oder Fragmente davon, die Nukleinsäuresequenzen, die diese Hybridfaktor VIII-Moleküle kodieren, und die Verfahren zu deren Herstellung sind hier offenbart: diejenigen, die erhalten werden (1) durch Substitution einer humanen oder Schweine-Untereinheit (das heißt die schwere Kette oder leichte Kette) für die entsprechende Schweine- oder humane Untereinheit; (2) durch Substitution von einer oder mehreren humanen oder Schweine-Domäne(n) (das heißt A1, A2, A3, B, C1 und C2) für die entsprechende(n) Schweine- oder humane Domäne(n); (3) durch Substitution eines fortlaufenden Teils von einer oder mehreren humanen oder Schweine-Domäne(n) für den entsprechenden Teil von einer oder mehreren Schweine- oder humanen Domäne(n); (4) durch Substitution von mindestens einer spezifischen Sequenz, einschließlich eines oder mehrerer einmalig vorhandener Aminosäurerest(e) im humanen oder Schweine-Faktor VIII für die entsprechende Schweine- oder humane Sequenz; und (5) durch Substitution von mindestens einer Sequenz, einschließlich eines oder mehrerer Aminosäurerest(e) mit keiner bekannten Sequenzidentität bezüglich dem Faktor VIII („Nicht-Faktor VIII-Aminosäuresequenz") für mindestens eine spezifische Sequenz von einer oder mehreren Aminosäuren im humanen, Schweine- oder hybriden Mensch/Schwein Faktor VIII. Modifizierte Faktor VIII-Moleküle weisen eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen an spezifizierten Positionen auf.
Ebenfalls können mindestens fünf Arten aktiver hybrider Mensch/Nicht-Mensch, Nicht-Schweine Säuger oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII-Moleküle oder Fragmente davon und Nukleinsäuresequenzen, die diese kodieren, durch dieselben Verfahren hergestellt werden: diejenigen, die erhalten werden: (1) durch Substitution einer humanen oder nicht-humanen, Nicht-Schwein Säuger-Untereinheit (das heißt die schwere Kette oder leichte Kette) für die entsprechende nicht-humane, Nicht-Schwein Säuger oder humane Untereinheit; (2) durch Substitution von einer oder mehreren humanen oder nicht-humanen, Nicht-Schweine Säuger Domäne(n) (das heißt A1, A2, A3, B, C1 und C2) für die entsprechende(n) nicht-humane, Nicht-Schwein Säuger oder humane Domäne(n); (3) durch Substitution eines fortlaufenden Teils von einer oder mehreren humanen oder nicht-humanen, Nicht-Schwein Säuger Domäne(n) für den entsprechenden Teil von einer oder mehreren nicht-humanen, Nicht-Schwein Säuger oder humanen Domäne(n); (4) durch Substitution von mindestens einer spezifischen Sequenz, einschließlich eines oder mehrerer einmalig vorhandener Aminosäurerest(e) im humanen oder nicht-humanen, Nicht-Schwein Säu ger Faktor VIII für die entsprechende nicht-humane, Nicht-Schwein Säuger oder humane Sequenz; und (5) durch Substitution von mindestens einer Sequenz, einschließlich eines oder mehrerer Aminosäurerest(e) mit keiner bekannten Sequenzidentität bezüglich dem Faktor VIII („Nicht-Faktor VIII-Aminosäuresequenz") für mindestens eine spezifische Sequenz von einer oder mehreren Aminosäuren im humanen, nicht-humanen, Nicht-Schwein Säuger oder hybriden humanen/nicht-humanen, Nicht-Schwein Säuger Faktor VIII. Einzelne Aminosäuresubstitutionen können durch ortsspezifische Mutagenese des entsprechenden Segments der kodierenden DNA erhalten werden.
Weiterhin wird der Fachmann leicht erkennen, dass dieselben Verfahren zur Herstellung von mindestens fünf Arten aktiver Hybridfaktor VIII-Moleküle oder Fragmente davon verwendet werden können, die den Arten (1)–(5) in den vorhergehenden zwei Paragraphen entsprechen, umfassend die Faktor VIII-Aminosäuresequenz von zwei oder mehreren nicht-humanen Säugern, wie zum Beispiel Schwein/Maus, und weiterhin umfassend eine Nicht-Faktor VIII-Aminosäuresequenz.
Hybride Mensch/Tier, Tier/Tier, und äquivalente Faktor VIII-Proteine oder Fragmente davon, die vorstehend unter den Gruppen (1)–(3) aufgeführt sind, werden durch Isolierung von Untereinheiten, Domänen oder fortlaufenden Teilen von Domänen des aus dem Plasma stammenden Faktors VIII, gefolgt von Rekonstitutionstellung und Reinigung hergestellt. Hybride Mensch/Tier, Tier/Tier und äquivalente Faktor VIII-Proteine oder Fragmente davon, die unter den Gruppen (3)–(5) beschrieben sind, werden durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt. Das Hybridmolekül kann einen größeren oder kleineren prozentualen Anteil an humaner im Vergleich zur Tier-Sequenz, in Abhängigkeit von dem Ursprung der verschiedenen Regionen, wie nachstehend ausführlicher beschrieben ist, enthalten.
Da die derzeitige Information darauf hinweist, dass die B-Domäne kein inhibitorisches Epitop aufweist und keine Wirkung auf die Funktion des Faktors VIII aufweist, wird in einigen Ausführungsformen die B-Domäne in den aktiven Hybrid- oder Hybrid-äquivalenten Faktor VIII-Molekülen oder Fragmenten davon („B(–) Faktor VIII") durch ein beliebiges der hier beschriebenen Verfahren deletiert.
In Beispiel 4 wird gezeigt, dass der hybride Mensch/Schwein Faktor VIII, der eine schwere Kette vom Schwein und eine humane leichte Kette umfasst und dem ersten Typ der vorstehend aufgeführten Hybride entspricht, eine größere spezifische koagulationsfördernde Aktivität in einem Standard-Koagulationsassay im Vergleich zu dem humanen Faktor VIII aufweist. Der hybride Mensch/Tier oder äquivalente Faktor VIII mit koagulationsfördernder Aktivität kann, unabhängig davon, ob die Aktivität höher, gleich oder niedriger als die des humanen Faktors VIII ist, zur Behandlung von Patienten mit Inhibitoren verwendbar sein, da diese Inhibitoren weniger mit hybriden Mensch/Tier oder äquivalenten Faktor VIII reagieren können, als mit entweder dem humanen oder dem Schweine-Faktor VIII.
Herstellung von Hybridfaktor VIII-Molekülen aus isolierten Faktor VIII-Untereinheiten von Mensch und Tier durch Rekonstitution
Die vorliegende Erfindung stellt hybride Mensch/Tier Faktor VIII-Moleküle oder Fragmente davon mit Substitutionen von Untereinheiten, die diese Hybride kodierenden Nukleinsäuresequenzen, Verfahren zur Herstellung und deren Isolierung und Verfahren zur Charakterisierung ihrer prokoagulierender Aktivität bereit. Ein Verfahren, das ausgehend von Verfahren modifiziert wurde, die von Fay, P. J. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6197; und Lollar, J. S. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 10451 beschrieben wurden, betrifft die Isolierung von Untereinheiten (schwere und leichte Ketten) des humanen und Tier-Faktors VIII, gefolgt von Rekombination der humanen schweren Kette und leichten Kette vom Tier oder von Rekombination der humanen leichten Kette und der schweren Kette vom Tier.
Die Isolierung von sowohl der humanen als auch Untereinheiten vom Tier betrifft die Dissoziation des leichte Kette/schwere Kette-Dimers. Dies wird zum Beispiel durch Chelatbildung von Calcium mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), gefolgt von monoS^TM HPLC (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) erreicht. Hybride Mensch/Tier Faktor VIII-Moleküle werden aus isolierten Untereinheiten In Gegenwart von Calcium rekonstituiert. Ein Hybridfaktor VIII mit humaner leichte Kette/Tier-schwere Kette oder Tier-leichte Kette/humaner schwere Kette wird aus nicht umgesetzten Ketten durch monoS^TM HPLC durch Verfahren zur Isolierung des Schweine-Faktors VIII, wie sie zum Beispiel von Lollar, J. S. et al. (1988) Blood 71: 137–143 beschrieben sind, isoliert.
Diese Verfahren, die in einer Ausführungsform zur Herstellung von aktivem hybriden humanen/Schweine-Faktor VIII verwendet sind und ausführlich in den nachstehenden Beispielen beschrieben sind, führen zu hybriden Molekülen mit humaner leichte Kette/Schwein-schwere Kette mit einer prokoagulierenden Aktivität, die mehr als sechsmal so groß wie die des humanen Faktor VIII ist.
Andere hybride Mensch/Nicht-Mensch, Nicht-Schwein Säuger Faktor VIII-Moleküle können hergestellt, isoliert und bezüglich der Aktivität durch dieselben Verfahren charakterisiert werden. Der Fachmann wird leicht erkennen, dass diese Verfahren ebenfalls zur Herstellung, Isolierung und Charakterisierung bezüglich der Aktivität des hybriden Tier/Tier Faktors VIII verwendet werden können, wie zum Beispiel Schwein/Maus, umfassend die Kombination der leichten oder schweren Kette einer Spezies mit der schweren oder leichten Kette der anderen Spezies.
Herstellung von Hybridfaktor VIII-Molekülen aus isolierten Faktor VIII-Domänen von Mensch und Tier durch Rekonstitution:
Die vorliegende Erfindung stellt hybride Mensch/Tier Faktor VIII-Moleküle oder Fragmente davon mit Substitutionen von Domänen, Nukleinsäuresequenzen, die diese kodieren, Verfahren zur Herstellung und deren Isolierung und Verfahren zur Charakterisierung ihrer prokoagulierenden Aktivität bereit. Ein Verfahren betrifft die Isolierung von einer oder mehreren Domänen des humanen oder von einer oder mehreren Domänen des Tier-Faktors VIII, gefolgt von Rekombination humaner und Tier-Domänen zur Bildung des Mensch/Tier Faktors VIII mit koagulationsfördernder Aktivität, wie es von Lollar, P. et al. (25. Nov. 1992) J. Biol. Chem. 267 (33): 23652–23657, für den hybriden Mensch/Schweine Faktor VIII beschrieben ist.
Insbesondere wird ein hybrider Mensch/Schwein Faktor VIII mit einer Substitution der Schweine-A2-Domäne für die humane A2-Domäne zur Verfügung gestellt, wobei diese Ausführungsform ein Verfahren erläutert, durch das ein Domänen-substituierter hybrider Mensch/Nicht-Mensch, Nicht-Schwein Säuger Faktor VIII konstruiert werden kann. Aus dem Plasma stammende nicht-humane, Nicht-Schwein Säuger und humane A1/A3-C1-C2 Dimere werden durch Dissoziation der A2-Domäne von dem Faktor VIIIa isoliert. Dies wird zum Beispiel in Gegenwart von NaOH ausgeführt, worauf die Mischung verdünnt wird und das Dimer unter Verwendung von monoS^TM HPLC (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) eluiert wird. Die A2-Domäne wird von dem Faktor VIIIa als Nebenkomponente in der monoS^TM HPLC isoliert. Hybride Mensch/Tier Faktor VIII-Moleküle werden durch Mischen gleicher Volumina der A2-Domäne einer Spezies und des A1/A3-C1-C2 Dimers der anderen Spezies rekonstituiert.
Der hybride Mensch/Tier Faktor VIIII oder Fragmente davon mit Substitutionen von einer oder mehreren Domänen wird aus der Mischung von nicht umgesetzten Dimeren und A2 durch monoS^TM HPLC mittels Verfahren zur Isolierung des Schweine-Faktor VIII, entsprechend der Beschreibung von Lollar, J. S. et al. (1988) Blood 71: 137–143 isoliert. Ebenfalls können Routineverfahren zur Herstellung und Isolierung der A1-, A3-, C1-, C2- und B-Domänen des Faktors VIII einer Spezies verwendet werden, wobei jede oder mehrere davon für die entsprechende Domäne im Faktor VIII der anderen Spezies substituiert sein kann. Der Fachmann wird leicht erkennen, dass diese Verfahren ebenfalls zur Herstellung, Isolierung und Charakterisierung bezüglich der Aktivität des hybriden Tier/Tier Faktors VIII mit substituierter Domäne verwendet werden können, wie zum Beispiel Schwein/Maus.
Diese in den nachstehenden Beispielen ausführlich beschriebenen Verfahren führen zu Hybridfaktor VIII-Molekülen mit prokoagulierender Aktivität.
Herstellung von Hybridfaktor VIII-Molekülen durch rekombinante Konstruktion der Sequenzen, die humane, tierische und hybride Faktor VIII-Untereinheiten, Domänen oder Teile von Domänen kodieren:
Substitution von Untereinheiten, Domänen, fortlaufenden Teilen von Domänen:
Die vorliegende Erfindung stellt aktive rekombinante hybride Mensch/Tier und Hybrid-äquivalente Faktor VIII-Moleküle und Fragmente davon mit Substitutionen von Untereinheiten, Domänen und Aminosäuresequenzen, die Nukleinsäuresequenzen, die diese Hybride kodieren, Verfahren zur Herstellung und ihrer Isolierung und Verfahren zur Charakterisierung ihrer koagulationsfördernden, immunreaktiven und immunogenen Eigenschaften bereit.
Das humane Faktor VIII-Gen wurde isoliert und in Säugerzellen exprimiert, wie es von Toole, J. J. et al. (1984) Nature 312: 342–347 (Genetics Institute); Gitschier, J. et al. (1984) Nature 312: 326–330 (Genentech); Wood, W. I. et al. (1984) Nature 312: 330–337 (Genentech); Vehar, G. A. et al. (1984) Nature 312: 337–342 (Genentech); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; U.S. Patent Nr. 4,757,006 berichtet wurde, und die Aminosäuresequenz wurde von der cDNA abgeleitet. Das U.S. Patent mit der Nummer 4,965,199 von Capon et al. offenbart ein DNA-Rekombinantionsverfahren zur Herstellung des Faktors VIII in Säugerwirtszellen und die Reinigung des humanen Faktor VIII. Die humane Faktor VIII-Expression auf CHO-Zellen (Eierstock-Zellen des chinesischen Hamsters) und BHKC (Nierenzellen vom jungen Hamster) wurde berichtet. Der humane Faktor VIII wurde modifiziert, um einen Teil oder die gesamte B Domäne zu deletieren (U.S. Patent Nr. 4,868,112), und es wurde versucht, die B-Domäne des humanen Faktors VIII durch die B-Domänen des humanen Faktors V zu ersetzen (U.S. Patent Nr. 5,004,803). Die den humanen Faktor VIII kodierende cDNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz sind in der SEQ ID NR: 1 beziehungsweise 2 gezeigt. In SEQ ID NR: 1 beginnt die kodierende Region an der Nukleotidposition 208, wobei das Triplet GCC das Kodon für die Aminosäurezahl 1 (Ala) ist, wie in der SEQ ID NR: 2 angegeben ist.
Der Schweine-Faktor VIII wurde aus dem Plasma isoliert und gereinigt [Fass. D. N. et al. (1982) Blood 59: 594]. Eine teilweise Aminosäuresequenz des Schweine-Faktor VIII, die den Teilen der N-terminalen Sequenz der leichten Kette mit einer Homologie bezüglich Ceruloplasmin und dem Koagulationsfaktor V entspricht, und die größtenteils unrichtigen lokalisiert wurde, wurde von Church et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6934 beschrieben. Toole, J. J. et al. (1984) Nature 312: 342–347 beschrieb die teilweise Sequenzierung des N-terminalen Endes von vier Aminosäurefragmenten des Schweine-Faktors VIII, charakterisierte jedoch nicht die Fragmente mit ihren Positionen in dem Faktor VIII-Molekül. Die Aminosäuresequenz der B- und ein Teil der A2-Domänen des Schweine-Faktors VIII wurden von Toole, J. J. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 83: 5939–5942 berichtet. Die die vollständige A2 Domäne des Schweine-Faktors VIII kodierende cDNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz und der hybride Mensch/Schwein Faktor VIII mit Substitutionen von allen Domänen, allen Untereinheiten, und spezifische Aminosäuresequenzen wurden in der Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 07/864, 004, mit dem Titel „Hybrid Human/Porcine factor VIII", die am 7. April, 1992 von John S. Lollar und Marschall S. Runge angemeldet wurde, die als U.S. Patent Nr. 5,364,771 am 15. November 1994 erteilt wurde, und in der WO 93/20093 offenbart. Die cDNA-Sequenz, die die A2-Domäne des Schweine-Faktor sVIII mit einer Sequenzidentität bezüglich den Resten 373–740 in reifem humanen Faktor VIII kodiert, wie in SEQ ID NR: 1 gezeigt ist, und die vorhergesagte Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NR: 3 beziehungsweise 4 gezeigt. In letzter Zeit wurden das Nukleotid und die entsprechenden Aminosäuresequenzen der A1- und A2-Domänen des Schweine-Faktors VIII und ein chimärer Faktor VIII mit Schweine A1- und/oder A-Domänen, die für die entsprechenden humanen Domänen substituiert waren, in der WO 94/11503 berichtet. Die den Schweine-Faktor VIII kodierende gesamte Nukleotidsequenz, einschließlich der vollständigen A1-Domäne, des Aktivierungspeptids, der A3-, C1- und C2-Domäne sowie die kodierte Aminosäuresequenz ist in dem U.S. Patent 5,859,204, das 12. Januar 1999 erteilt wurde, offenbart.
Sowohl der Schweine- als auch der humane Faktor VIII sind aus dem Plasma als Protein mit zwei Untereinheiten isoliert worden. Die Untereinheiten, bekannt als schwere Kette und leichte Kette, werden durch eine nicht kovalente Bindung zusammen gehalten, die Calcium oder andere zweiwertige Metallionen erfordert. Die schwere Kette des Faktors VIII enthält die drei Domänen A1, A2 und B, die kovalent verknüpft sind. Die leichte Kette des Faktors VIII enthält ebenfalls drei Domänen, die mit A3, C1 und C2 bezeichnet sind. Die B-Domäne weist keine bekannte biologische Funktion auf und kann ganz oder teilweise von dem Molekül proteolytisch oder durch Verfahren der DNA-Rekombinationstechnologie ohne signifikante Veränderung eines beliebigen messbaren Parameters des Faktors VIII entfernt werden. Der humane rekombinante Faktor VIII weist eine ähnliche Struktur und Funktion bezüglich des aus dem Plasma stammenden Faktors VIII auf, obwohl er nicht glycosyliert ist, sofern er nicht in Säugerzellen exprimiert wird.
Sowohl der aktivierte humane als auch der Schweine-Faktor VIII („Faktor VIIIa") weisen drei Untereinheiten aufgrund der Spaltung der schweren Kette zwischen den A1- und A2-Domänen auf. Diese Struktur wird mit A1/A2/A3-C1-C2 bezeichnet. Der humane Faktor VIIIa ist unter den Bedingungen, die den Schweine-Faktor VIIIa stabilisieren nicht stabil, vermutlich aufgrund der schwächeren Assoziation der A2-Untereinheit des humanen Faktors VIIIa. Die Dissoziation der A2-Untereinheit und des Schweine-Faktors VIIIa wird ist dem Verlust an Aktivität in dem Faktor VIIIa-Molekül assoziiert. Yakhyæv, A. et al. (1997) Blood 90: Ergänzungsband 1, Auszug, #126 berichtete die Bindung der A2-Domäne durch ein mit einem Rezeptor für Lipoprotein mit niedriger Dichte verwandtes Protein, was darauf hinweist, dass die durch eine derartige Bindung vermittelte Zellaufnahme von A2 die Herabregulierung der Faktor VIII-Aktivität bewirkt.
Als eine beispielhafte Ausführungsform werden speziell der aktive rekombinante hybride Mensch/Schwein Faktor VIII mit substituierter A2-Domäne, die Nukleinsäuresequenz, die diesen kodiert, und die Verfahren zur Herstellung, Isolierung und Charakterisierung seiner Aktivität bereitgestellt. Die Verfahren, durch die dieses Hybridkonstrukt hergestellt wird, können ebenfalls zur Herstellung des aktiven rekombinanten hybriden Mensch/Schwein Faktors VIII oder Fragmenten davon mit Substitution von Untereinheiten, fortlaufenden Teilen von Domänen oder Domänen, die andere als A2 sind, verwendet werden. Der Fachmann wird erkennen, dass diese Verfahren ebenfalls zeigen, wie andere rekombinante hybride Mensch/Nicht-Mensch, Nicht-Schwein Säuger oder Tier/Tier Hybridfaktor VIII-Moleküle oder Fragmente davon, in denen Untereinheiten, Domänen oder fortlaufende Teile von Domänen substituiert sind, hergestellt werden können.
Der rekombinante hybride Mensch/Schwein Faktor VIII wird ausgehend von humaner cDNA (Biogen, Inc.) oder Schweine-cDNA (hier beschrieben), die die relevante Faktor VIII-Sequenz kodiert, hergestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der durch die cDNA kodierte Faktor VIII die Domänen A1-A2-A3-C1-C2, wobei die gesamte B-Domäne fehlt, und entspricht den Aminosäureresten 1–740 und 1649–2332 des einzelkettigen humanen Faktors VIII (siehe SEQ ID NR: 2), gemäß dem Nummerierungssystem von Wood et al (1984) Nature 312: 330–337.
Einzelne Untereinheiten, Domänen oder fortlaufende Teile von Domänen der Schweine- oder humanen Faktor VIII-cDNA können geklont werden und wurden geklont und für die entsprechenden humanen oder Schweine-Untereinheiten, Domänen oder Teile von Domänen durch etablierte Mutagenesetechniken substituiert. Zum Beispiel beschreibt Lubin, I. M. et al. (1984) J. Biol. Chem. 269 (12): 8639–8641 Techniken zur Substitution der Schweine-A2-Domäne für die humane Domäne unter Verwendung praktischer Restriktionsstellen. Andere Verfahren zur Substitution einer beliebigen Region der Faktor VIII-cDNA einer Spezies für die Faktor VIII-cDNA einer anderen Spezies umfassen das Spleißen durch Überlappungsverlängerung („SOE"), wie von Horton, R. M. et al. (1993) Meth. Enzymol 217: 270–279 beschrieben wurde.
Die Hybridfaktor VIII-cDNA, die Untereinheiten, Domänen oder Teile von Domänen kodiert, oder die vollständigen Hybrid-cDNA-Moleküle werden in Expressionsvektoren kloniert, um letztendlich aktive hybride Mensch/Schwein Faktor VIII-Proteinmoleküle in kultivierten Zellen durch etablierte Techniken zu exprimieren, wie von Selden, R. F., „Introduction of DNA into mammalian cells" in Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., Hrsg. (1991) beschrieben ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine den Faktor VIII kodierende hybride Mensch/Schwein cDNA, in der die Schweine-Sequenz eine Domäne oder einen Teil einer Domäne, wie zum Beispiel die A2-Domäne oder einen Teil der Domäne kodiert, in einen Säuger-Expressionsvektor, wie zum Beispiel ReNeo, eingeschoben, um ein Hybridfaktor VIII-Konstrukt zu bilden. Eine vorläufige Charakterisierung des Hybridfaktors VIII wird durch Einschub der Hybrid-cDNA in den ReNeo-Säuger-Expressionsvektor und die transiente Expression des Hybridproteins in COS-7-Zellen erreicht. Dann kann eine Bestimmung, ob aktives Hybridprotein exprimiert wird, durchgeführt werden. Das Expressionsvektorkonstrukt wird weiterhin zum stabilen Transfizieren von Zellen in Kultur, wie zum Beispiel Nierenzellen des jungen Hamsters, unter Verwendung von Routineverfahren aus dem Stand der Technik verwendet, wie zum Beispiel die durch Liposomen vermittelte Transfektion (Lipofectin^TM, Life Technologies, Inc.). Die Expression des rekombinanten Hybridfaktor VIII-Proteins kann zum Beispiel durch Sequenzierung, Northern- und Western-Blotting oder Polymerasekettenreaktion (PCR) bestätigt werden. Das Hybridfaktor VIII-Protein in den Kulturmedien, in denen die transfizierten Zellen, die die Expression des Proteins sta bil exprimieren, bewahrt werden, kann gefällt, pelletisiert, gewaschen und in einem geeigneten Puffer resuspensiert werden, und das rekombinante Hybridfaktor VIII-Protein kann durch Standardtechniken, einschließlich der Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von zum Beispiel monoklonaler Anti-A2-Sepharose^TM gereinigt werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird der Hybridfaktor VIII, der Substitutionen der Untereinheit, Domäne oder Aminosäuresequenz umfasst, als ein Fusionsprotein von einem rekombinanten Molekül exprimiert, dessen Sequenz, die ein Protein oder Peptid kodiert, das zum Beispiel die Stabilität, Sekretion, Nachweis, Isolierung oder dergleichen verbessert, an einer Stelle eingeschoben wird, die zu der den Faktor VIII kodierenden Sequenz benachbart ist. Etablierte Protokolle zur Verwendung von Expressionskontrollsequenzen homologer oder heterologer Spezies, zum Beispiel Promotoren, Operatoren, und Regulatoren, bei der Herstellung von Fusionsproteinen, sind bekannt und werden routinemäßig im Stand der Technik verwendet. Siehe Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M., et al., Hrsg.), Wiley Interscience, N.Y. Die Expression wird erhöht, in dem Teile der B-Domäne eingefügt werden. Insbesondere führt der Einschluß derjenigen Teile der B-Domäne, die mit „SQ" bezeichnet sind [Lind, P. et al. (1995) siehe oben)], zu einer vorteilhaften Expression. Den „SQ"-Konstrukten fehlt die ganze humane B-Domäne mit Ausnahme von 5 Aminosäuren des N-Endes der B-Domäne und 9 Aminosäuren des C-Endes der B-Domäne.
Der gereinigte Hybridfaktor VIII oder ein Fragment davon kann bezüglich der Immunreaktivität und der Koagulationsaktivität durch Standardassays, umfassend zum Beispiel den plasmafreien Faktor VIII-Assay, den Einstufen-Koagulationsassay und den enzymgekoppelten Immunadsorptionsassay unter Verwendung des gereinigten rekombinanten humanen Faktor VIII als Standard, untersucht werden.
Weitere Vektoren, umfassend sowohl Plasmid- als auch eukaryotische virale Vektoren, können zur Expression eines rekombinanten Genkonstrukts in eukaryotischen Zellen in Abhängigkeit von der Präferenz und dem Urteil des Fachmanns verwendet werden (siehe zum Beispiel Sambrook et al., Kapitel 16). Andere Vektoren und Expressionssysteme, einschließlich bakterieller, Hefe- und Insektenzellsysteme, kön nen verwendet werden, jedoch werden sie aufgrund von Unterschieden in der Glycosylierung oder fehlender Glycosylierung nicht bevorzugt.
Das rekombinante Hybridfaktor VIII-Protein kann in einer Vielzahl von Zellen exprimiert werden, die normalerweise für die Kultur und rekombinante Säugerproteinexpression verwendet werden. Insbesondere wurde von einer Zahl von Nagetierzelllinien festgestellt, dass sie besonders verwendbare Wirte zur Expression großer Proteine sind. Bevorzugte Zelllinien, die von der American Type Culture Collection, Rockville, MD erhältlich sind, umfassen Nierenzellen von jungen Hamstern, und Eierstock (CHO)-Zellen des chinesischen Hamsters, die unter Verwendung von Routineverfahren und Medien kultiviert werden.
Dieselben Verfahren, die zur Herstellung des hybriden Mensch/Schwein Faktors VIII mit einer Substitution einer Untereinheit, Domäne oder Aminosäuresequenz verwendet werden, können zur Herstellung eines anderen rekombinanten Hybridfaktor VIII-Proteins und Fragmenten davon und der diese Hybride, wie zum Beispiel Mensch/Nicht-Mensch, Nicht-Schwein Säuger oder Tier/Tier, kodierenden Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Ausgehend von Primern aus der bekannten humanen DNA-Sequenz sind die murine und ein Teil der Schweine-Faktor VIII-cDNA kloniert worden. Faktor VIII-Sequenzen anderer Spezies zur Verwendung bei der Herstellung eines hybriden Mensch/Tier oder Tier/Tier Faktor VIII-Moleküls können unter Verwendung der bekannten humanen und Schweine-DNA-Sequenzen als Ausgangspunkt verwendet werden. Andere Techniken, die verwendet werden können, umfassen PCR-Amplifikationsverfahren mit Gewebe-DNA vom Tier und Verwendung einer cDNA-Bibliothek aus dem Tier, um die Faktor VIII-Sequenz daraus zu klonieren.
Als beispielhafte Ausführungsform kann das hybride Mensch/Maus Faktor VIII-Protein folgendermaßen hergestellt werden. DNA-Klone, die dem Maushomologen des humanen Faktor VIII-Gens entsprechen, sind isoliert und sequenziert worden, und die Aminosäuresequenz des Mäuse-Faktor VIII-Proteins ist, entsprechend der Beschreibung in Elder, G., et al. (1993) Genomics 16 (2): 374–379 vorhergesagt worden, die ebenfalls einen Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenzen von Maus, Mensch und einen Teil von Schweine-Faktor VIII-Molekülen umfasst. Die Mäuse-Faktor VIII-cDNA-Sequenz und vorhergesagte Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NR: 5 beziehungsweise SEQ ID NR: 8 gezeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die RNA-Amplifikation mit Transkriptsequenzierungs(RAWTS)-Verfahren, die in Sarkar, G. et al. (1988) Science 244: 331–334 beschrieben sind, verwendet werden. Kurz gesagt, die Schritte sind (1) cDNA-Synthese mit Oligo(dT)- oder einem mRNA-spezifischen Oligonukleotidprimer; (2) Polymerasekettenreaktion (PCR), bei der eines oder beide Oligonukleotide einen Phagenpromotor enthalten, der an eine Sequenz gebunden ist, die zu der zu amplifizierenden Region komplementär ist; (3) Transkription mit einem Phagenpromotor; und (4) Umkehrtranskriptase-vermittelte Didesoxysequenzierung des Transkripts, das mit einem verschachtelten (inneren) Oligonukleotid geprimt ist. Zusätzlich zur Offenbarung von Sequenzinformation kann dieses Verfahren ein in vitro Translationsprodukt durch Einbau eines Translationsinitiierungssignals in den geeigneten PCR-Primer erzeugen, und es kann dazu verwendet werden, neue mRNA-Sequenzinformation von anderen Spezies zu erhalten.
Substitution von Aminosäure(n):
Die vorliegende Erfindung stellt aktive rekombinante hybride Mensch/Tier und Tier/Tier Faktor VIII-Moleküle oder Fragmente davon bereit, die mindestens eine Sequenz umfassen, umfassend eine oder mehrere einmalig vorhandene Aminosäuren einer Spezies, die für die entsprechende Aminosäuresequenz der anderen Spezies oder Fragmente davon substituiert sind, Nukleinsäuresequenzen, die diese Hybride kodieren, Verfahren zur Herstellung und ihrer Isolierung und Verfahren zur Charakterisierung ihrer koagulationsfördernden immunogenen und immunreaktiven Eigenschaften. Von der Erfindung sind Mutationen vorgesehen, die den Positionen 490, 493, 498 und 502 der SEQ ID NR: 2 oder Kombinationen davon entsprechen. Alle anderen Mutationen hier sind rein beispielhaft.
Die A2-Domäne ist für die prokoagulierende Aktivität des Faktor VIII-Moleküls notwendig. Untersuchungen zeigen, dass der Schweine-Faktor VIII eine um das sechsfache größere Aktivität aufweist als der humane Faktor VIII (Lollar, P. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 12481–12486, und, dass es scheint, dass der Unterschied in der koagulationsfördernden Aktivität zwischen humanem und Schweine-Faktor VIII auf einem Unterschied in der Aminosäuresequenz zwischen einem oder mehreren Resten in den humanen und Schweine-A2-Domänen basiert (Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 23652–23657). Weiterhin wird, entsprechend Hoyer (1994) Semin. Hewatol. 31: 1–5, angenommen, dass sich in den A2- und C2-Domänen und möglicherweise einer dritten Region der leichten Kette in dem humanen Faktor VIII-Molekül die Epitope befinden, mit denen die meisten, wenn nicht alle inhibitorischen Antikörper reagieren.
Rekombinante hybride Mensch/Tier, Tier/Tier oder äquivalente Faktor VIII-Moleküle oder Fragmente davon können durch Substitution von mindestens einer spezifischen Sequenz, umfassend eine oder mehrere einmalig vorhandene Aminosäuren von der A2-, C2- und/oder anderen Domänen des Faktors VIII von einer Spezies, für die entsprechende Sequenz der anderen Spezies hergestellt werden, wobei sich die Aminosäuresequenzen zwischen den Molekülen der beiden Spezies voneinander unterscheiden, wie nachstehend ausführlicher erläutert ist. In einer beispielhaften bevorzugten hier beschriebenen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen aktiven rekombinanten hybriden Mensch/Schwein Faktor VIII bereit, umfassend eine Schweine-Aminosäuresequenz, die für eine entsprechende humane Aminosäuresequenz, die ein Epitop umfasst, substituiert ist, wobei der Hybridfaktor VIII eine verringerte oder keine Immunreaktivität mit inhibitorischen Antikörpern bezüglich dem Faktor VIII aufweist. In einer weiteren Ausführungsform können aktive rekombinante Hybridfaktor VIII-Moleküle ebenfalls hergestellt werden, wobei sie eine Aminosäuresequenz von mehr als einer Spezies, die für die entsprechende Sequenz in einer dritten Spezies substituiert ist, umfassen. Rekombinante Hybrid-äquivalente Moleküle können ebenfalls hergestellt werden, wobei sie einen humanen, Tier- oder Hybridfaktor VIII umfassen, der mindestens eines Sequenz umfasst, die eine oder mehrere Aminosäuren umfasst, die bezüglich dem Faktor VIII keine bekannte Sequenzidentität aufweisen, wie nachstehend weiter beschrieben ist.
Jedes Hybridfaktor VIII-Konstrukt mit einer spezifischen Aminosäuresubstitution, wie sie beschrieben wurde, kann durch Standardverfahren bezüglich der koagulationsfördernden Aktivität und der Reaktivität mit inhibitorischen Antikörpern gegen Faktor VIII zur Identifikation von Hybridfaktor VIII-Molekülen mit erhöhter koagulationsfördernder Aktivität und/oder verringerter Antikörper-Immunreaktivität untersucht wer den. Es können ebenfalls Hybridmoleküle identifiziert werden, die im Vergleich zu humanem oder Schweine-Faktor VIII eine verringerte koagulationsfördernde Aktivität aufweisen, jedoch ebenfalls eine verringerte Antikörperreaktivität aufweisen. Der Fachmann wird erkennen, dass Hybridfaktor VIII-Moleküle oder Fragmente davon mit im Vergleich zum humanen oder Schweine-Faktor VIII geringerer, gleicher oder größerer koagulationsfördernder Aktivität zur Behandlung von Patienten verwendbar sind, die einen Mangel an Faktor VIII aufweisen. Die hier beschriebenen Verfahren zur Herstellung eines aktiven rekombinanten hybriden Mensch/Schwein Faktors VIII mit Substitution spezifischer Aminosäuren können zur Herstellung eines aktiven rekombinanten hybriden Mensch/Nicht-Mensch, Nicht-Schwein Säuger Faktor VIII-Proteins, eines hybriden Tier-1/Tier-2 Faktors VIII und Hybrid-äquivalenten Faktors VIII oder Fragmenten davon verwendet werden.
Hybridfaktor VIII-Moleküle mit veränderter koagulationsfördernder Aktivität:
Die vorliegende Erfindung stellt prokoagulierende rekombinante hybride Mensch/Tier, Tier/Tier oder äquivalente Faktor VIII-Moleküle oder Fragmente davon bereit, umfassend mindestens eine spezifische Sequenz, einschließlich einer oder mehrerer einmalig vorhandener Aminosäuren mit prokoagulierender Aktivität im Faktor VIII von einer Spezies, die für die entsprechende Aminosäuresequenz des Faktors VIII der anderen Spezies unter Verwendung etablierter ortsspezifischer Mutagenesetechniken, wie sie hier beschrieben sind, substituiert sind. Die in der Substitution zu verwendenden spezifischen Sequenzen werden ausgewählt und die Hybridkonstrukte werden hergestellt und bezüglich der koagulationsfördernden Aktivität folgendermaßen untersucht. Insbesondere wird als bevorzugte und beispielhafte Ausführungsform ein hybrider Mensch/Schwein Faktor VIII bereitgestellt, der Aminosäuresubstitutionen in der A2-Domäne umfasst. Es versteht sich von selbst, dass der Fachmann diese Verfahren zur Herstellung anderer hybrider Mensch/Tier, Tier/Tier und äquivalenter Faktor VIII-Moleküle oder Fragmente davon mit veränderter koagulationsfördernder Aktivität, vorzugsweise einer im Vergleich zum humanen Faktor VIII erhöhten koagulationsfördernden Aktivität verwenden kann.
Die Grundlage für die höhere koagulationsfördernde Aktivität in dem Schweine-Faktor VIII scheint die im Vergleich zum Schweine-Faktor VIIIa schnellere spontane Dissoziation der A2-Untereinheit des humanen Faktors VIIIa zu sein, die, gemäß Lollar, P. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 1688–1692; Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 23652–23657; Fay, P. J. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 13246–13250, zu einem Verlust an Aktivität führt.
Ein Vergleich der Anordnung der Aminosäuresequenzen der humanen und Schweine-Faktor VIII-A2-Domänen (Nummerierung der Reste beginnt an Position 373 in Bezug auf die Aminosäure des humanen Faktors VIII mit der vollständigen Länge, SEQ ID NR: 2) ist in 1C gezeigt. Die zur Herstellung eines hybriden Mensch/Schwein Faktor VIII-Moleküls mit veränderter koagulationsfördernder Aktivität anfänglichen Zielkandidaten für eine Mutagenese, die bei dem Vergleich der humanen und Schweine-A2-Aminosäuresequenzen (SEQ ID NR: 2 beziehungsweise 6) innerhalb der humanen A2-Domäne offenbart wurden, sind in Tabelle I gezeigt.
Tabelle I und die 1A–1B erläutern sieben Sequenzen in den Aminosäuresequenzen der humanen und Schweine-A2-Domäne (SEQ ID NR: 2 beziehungsweise 6), die nur 17% der A2-Domäne ausmachen, jedoch 70% der Sequenzunterschiede zwischen den humanen und Schweine A2-Domänen umfassen.
Ein rekombinantes hybrides Mensch/Schwein-Konstrukt wird beschrieben, in dem die Aminosäuren Ser373-Glu604 in der A2-Domäne (Ser373-Arg740) des humanen Faktors VIII durch die homologen Schweinesequenzen ersetzt wurden. Dieses Konstrukt reagierte nicht mit A2-Inhibitoren und weist dieselbe koagulationsfördernde Aktivität wie der humane B(–) Faktor VIII auf. Ein aus dem Plasma stammendes Hybridmolekül wird beschrieben, das eine vollständige Substitution durch die Schweine-A2-Domäne in dem humanen Faktor VIII umfasst, und das eine im Vergleich zum humanen Faktor VIII erhöhte koagulationsfördernde Aktivität aufweist. Ein Vergleich dieser Konstrukte weist darauf hin, dass eine Region zwischen den Resten Asp605 und Arg740 für den Unterschied in der Aktivität zwischen humanem und Schweine-Faktor VIII verantwortlich ist. Diese Region kann spezifischer definiert werden, indem systematisch rekombinante hybride Mensch/Schwein Faktor VIII-Moleküle mit Schweine-Substitutionen in der Region zwischen Asp605 und Arg740 unter Verwendung etablierter ortsspezifischer Mutagenesetechniken hergestellt werden, wie zum Beispiel das „Spleißen durch Überlappungsverlängerung" (SOE)-Verfahren, das umfassend zur Herstellung von Hybridfaktor VIII-Molekülen, die Schweinesubstitutionen in der NH₂-terminalen Region von A2 enthalten, verwendet wurde. Diese Moleküle können in COS-7-Zellen und Nierenzellen des jungen Hamsters exprimiert werden, wie es vorstehend beschrieben ist. Sie können bis zur Homogenität unter Verwendung von Techniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie zum Beispiel Heparin-Sepharose^TM und Immunaffinitätschromatographie, gereinigt werden. Die Proteinkonzentration kann durch Absorption von ultraviolettem Licht bei A₂₈₀ geschätzt werden und die spezifische Aktivität der Konstrukte kann durch Division der koagulationsfördernden Aktivität (gemessen in Einheiten pro ml durch einen Einstufen-Koagulationsassay) durch A₂₈₀ bestimmt werden. Der humane Faktor VIII weist eine spezifische Aktivität von näherungsweise 3000–4000 U/A₂₈₀ auf, wohingegen der Schweine-Faktor VIII eine spezifische Aktivität von näherungsweise 20.000 U/A₂₈₀ aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform weist der prokoagulierende rekombinante hybride Mensch/Schwein Faktor VIII eine spezifische Aktivität von 20.000 U/A₂₈₀ auf und enthält eine minimale Menge an Schweinesubstitution in der A2-Domäne.
Wie hier beschrieben ist, werden ortsspezifische Mutagenesetechniken zur Identifikation von Hybridprotein mit koagulationsfördernder Aktivität, die im Vergleich zum hu manen Faktor VIII erhöht gleich oder verringert sein kann, aber vorzugsweise erhöht ist, verwendet. In der hybriden Mensch/Schwein Ausführungsform werden spezifische humane Sequenzen durch Schweinesequenzen, vorzugsweise unter Verwendung des Spleißen durch Überlappungsverlängerungsverfahrens (SOE), entsprechend der Beschreibung von Ho, S. N., et al., Gene 77: 51–59 (1994) und in den Beispielen 7 und 8, ersetzt. Die Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese kann ebenfalls verwendet, wie sie für die Bildung von Schleifen aus der Aminosäuresequenz heraus für einen Teil der humanen A2-Domäne verwendet wurde (siehe Beispiel 7). Da die funktionale Analyse der Hybride koagulationsfördernde Aktivität offenbart, kann die Sequenz weiter zergliedert und für eine prokoagulierende Sequenz durch Standard Punktmutationsanalysetechniken kartiert werden.
Die vorliegende Erfindung nimmt an, dass die Hybridfaktor VIII-cDNA und Protein durch etablierte und Routineverfahren, wie zum Beispiel die DNA-Sequenzierung, Assays für die koagulationsfördernde Aktivität, Masse durch ELISA und durch UV-Extinktion bei 280 nm des gereinigten Hybridfaktors VIII, spezifische koagulationsfördernde Aktivität (U/mg), SDS-PAGE des gereinigten Hybridfaktors VIII und dergleichen charakterisiert werden kann. Andere bekannte Verfahren zum Testen der klinischen Wirksamkeit können erforderlich sein, wie zum Beispiel Aminosäure-, Kohlenwasserstoff-, Sulfat- oder Metallionenanalyse.
Ein rekombinanter Hybridfaktor VIII mit höherer koagulationsfördernder Aktivität im Vergleich zum humanen Faktor VIII kann in der Herstellung günstiger als der aus dem Plasma stammende Faktor VIII sein und kann die Menge an Faktor VIII erniedrigen, die für eine wirksame Behandlung des Faktor VIII-Mangels erforderlich ist.
Hybridfaktor VIII-Moleküle mit verringerter Immunreaktivität:
Epitope, die mit Antikörpern, die die koagulationsfördernde Aktivität des Faktors VIII hemmen („Inhibitoren" oder „inhibitorische Antikörper"), immunreaktiv sind, wurden basierend auf bekannten Beziehungen zwischen Struktur und Funktion im Faktor VIII charakterisiert. Vermutlich könnten Inhibitoren durch Trennen einer beliebigen der makromolekularen Wechselwirkungen, die mit der Domänenstruktur des Faktors VIII assoziiert sind, oder dessen Assoziationen mit dem von Willebrand-Faktor, Throm bin, Faktor Xa, Faktor IXa oder Faktor X wirksam sein. Jedoch sind mehr als 90% der inhibitorischen Antikörper gegen den humanen Faktor VIII durch Bindung an Epitope, die sich in der 40 kDa A2-Somäne oder 20 kDa C2-Domäne des Faktors VIII befinden, wirksam, indem sie spezifische mit diesen Domänen assoziierte Funktionen zerstören, wie von Fulcher et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7728–7732, und Scandella et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6152–6156 beschrieben wurde. Zusätzlich zu den A2- und C2-Epitopen kann es ein drittes Epitop in der A3- oder C1-Domäne der leichten Kette des Faktors VIII, entsprechend Scandella et al. (1993) Blood 82: 1767–1775 geben. Die Signifikanz dieses mutmaßlichen dritten Epitops ist unbekannt, jedoch scheint es für eine kleinere Fraktion der Epitopreaktivität im Faktor VIII verantwortlich zu sein.
Anti-A2-Antikörper blockieren die Aktivierung des Faktors X, wie von Lollar et al. (1994) J. Clin. Invest. 93: 2497–2504 gezeigt wurde. Frühere Kartierungsuntersuchungen durch Deletionsmutagenese, entsprechend der Beschreibung von Ware et al. (1992) Blood Coagul. Fibrinolysis 3: 703–716, lokalisierten das A2-Epitop innerhalb einer Region von 20 kDa, ausgehend von dem NH₂-terminalen Ende der 40 kDa A2-Domäne. Immunradiometrische Konkurrenzassays weisen darauf hin, dass A2-Inhibitoren entweder ein gemeinsames Epitop oder eine Gruppe von eng beieinander liegenden Epitopen erkennen, wie von Scandella et al. (1992) Throm. Haemostas 67: 665–671 beschrieben wurde und wie in Beispiel 8 gezeigt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt aktive rekombinante hybride und Hybrid-äquivalente Faktor VIII-Moleküle oder Fragmente davon, die diese Hybride kodierenden Nukleinsäuresequenzen, Verfahren zur Herstellung und ihrer Isolierung und Verfahren zu ihrer Charakterisierung bereit. Diese Hybride umfassen Mensch/Tier, Tier/Tier oder äquivalente Hybridfaktor VIII-Moleküle, weiterhin umfassen sie mindestens eine spezifische Aminosäuresequenz, einschließlich einer oder mehrerer einmalig vorhandener Aminosäuren des Faktors VIII von einer Spezies, die für die entsprechende Aminosäuresequenz des Faktors VIII der anderen Spezies substituiert sind; oder sie umfassen mindestens eine Sequenz, einschließlich einer oder mehrerer Aminosäuren mit keiner bekannten Sequenzidentität bezüglich des Faktors VIII, die für die spezifische Aminosäuresequenz im humanen, Tier- oder hybriden Faktor VIII substituiert ist. Der resultierende Hybridfaktor VIII weist im Vergleich zum humanen oder Schwei ne-Faktor VIII eine verringerte oder keine Immunreaktivität bezüglich Faktor VIII-inhibitorischen Antikörpern auf.
Unter Verwendung der in dem vorhergehenden Abschnitt beschriebenen Methode zur Substitution von Aminosäuren in dem Faktor VIII-Molekül wird die Mutationsanalyse zur Auswahl der entsprechenden Faktor VIII-Aminosäuresequenz einer Spezies, vorzugsweise vom Schwein, verwendet, die für mindestens eine Sequenz, einschließlich einer oder mehrerer Aminosäuren in dem Faktor VIII einer anderen Spezies, vorzugsweise Mensch, oder für die Aminosäuresequenz eines Hybrid-äquivalenten Faktor VIII-Moleküls substituiert ist, das eine oder mehrere kritische Region(en) in der A2-, C2- oder jeder anderen Domäne umfasst, gegen die die inhibitorischen Antikörper gerichtet sind. Die Verfahren sind nachstehend ausführlich beschrieben. Das resultierende prokoagulierende rekombinante Hybridkonstrukt weist im Vergleich zum humanen Faktor VIII unter Verwendung von Standardassays eine verringerte oder keine Immunreaktivität gegen inhibitorische Antikörpern auf. Durch systematische Substitution von zunehmend kleineren Aminosäuresequenzen, gefolgt von der Untersuchung des Hybridkonstrukts auf Immunreaktivität, wie nachstehend beschrieben ist, wird das Epitop in jeder Domäne eines Faktor VIII-Moleküls kartiert, substituiert durch eine Aminosäuresequenz mit weniger oder keiner Immunreaktivität, und ein Hybridfaktor VIII wird hergestellt.
Es versteht sich von selbst, dass der Fachmann diese Methode verwenden kann, wobei die Epitopkartierung, Konstruktion der Hybridfaktor VIII-Moleküle und Mutationsanalyse der Konstrukte zur Identifikation und Substitution von mindestens einer Sequenz, einschließlich einer oder mehrerer Aminosäuren, umfassend ein Epitop in der A2-, C2- und/oder anderen Domänen, gegen die inhibitorische Antikörper gerichtet sind, und zur Konstruktion des prokoagulierenden rekombinanten hybriden Mensch/Tier, Tier/Tier oder äquivalenten Faktors VIII oder Fragmente davon mit verringerte oder keiner Immunreaktivität im Vergleich zum humanen oder Schweine-Faktor VIII kombiniert werden. Diese Methode wird entsprechend der Beschreibung in Beispiel 8 zur Herstellung eines rekombinanten prokoagulierenden hybriden Mensch/Schwein Faktors VIII mit Schweine-Aminosäuresubstitutionen in der humanen A2-Domäne und ohne Antigenität gegen Anti-Faktor VIII-Antikörper, als beispielhafte Ausführungsform, verwendet.
Normalerweise weist der Schweine-Faktor VIII eine eingeschränkte oder keine Reaktion mit inhibitorischen Antikörper bezüglich dem humanen Faktor VIII auf. Die rekombinanten hybriden Mensch/Schwein Faktor VIII-Moleküle mit verringerter oder keiner Reaktivität mit inhibitorischen Antikörpern werden basierend auf einer Aminosäuresubstitution in der A2-Domäne hergestellt, ein Beispiel dafür, wie ein Hybridfaktor VIII unter Verwendung des Faktors VIII einer anderen Spezies und Substitutionen in Domänen, die andere als A2 sind, hergestellt werden kann, ist wie folgt. Die Schweine-A2-Domäne wird durch Standardklonierungstechniken, wie zum Beispiel diejenigen, die vorstehend und in den Beispielen 6, 7 und 8 beschrieben sind, kloniert und dann geschnitten und innerhalb der A2-Domäne gespleißt, wobei Routineverfahren, wie zum Beispiel Restriktionsstellen zur Schneiden der cDNA oder das Spleißen durch Überlappungsverlängerung (SOE) verwendet werden. Die resultierende Schweine-Aminosäuresequenz wird in die humane A2-Domäne unter Bildung eines Hybridfaktor VIII-Konstrukts substituiert, das in einen Säuger-Expressionsvektor, vorzugsweise ReNeo, eingeschoben wird, stabil in kultivierte Zellen, vorzugsweise Nierenzellen vom jungen Hamster, transfiziert und, wie vorstehend beschrieben ist, exprimiert wird. Der Hybridfaktor VIII wird bezüglich Immunreaktivität zum Beispiel mit Anti-A2-Antikörpern durch den Routine-Bethesda-Assay oder durch den plasmafreien chromogenen Substratassay untersucht. Die Bethesdaeinheit (BU) ist das Standardverfahren zur Messung von Inhibitortitern. Ist der Bethesdatiter nicht im Hybrid messbar (< 0,7 BU/mg IgG), dann wurde ein humanes A2-Epitop in der Region der substituierten entsprechenden Schweine-Sequenz eliminiert. Das Epitop wird fortschreitend eingeengt und das spezifische A2-Epitop kann daher zur Herstellung eines hybriden Mensch/Schwein Moleküls mit sowenig Schweine-Sequenz wie möglich hergestellt werden. Wie hier beschrieben worden ist, wurde eine Sequenz mit 25 Resten, entsprechend den Aminosäuren Arg484-Ile508, die für die inhibitorische Immunreaktivität entscheidend sind, identifiziert und in die humane A2-Domäne substituiert. Innerhalb dieser Sequenz gibt es nur neun Unterschiede zwischen dem humanen und Schweine-Faktor VIII. Diese Region kann weiter analysiert und substituiert werden.
Es können ebenfalls hybride Mensch/Schwein Faktor VIII-Moleküle mit verringerter oder keiner Reaktivität mit inhibitorischen Antikörpern, basierend auf Substitutionen der Aminosäuresequenz in der C1-, C2- oder einer anderen Domäne mit oder ohne Substitution in der A2-Domäne, hergestellt werden. Das C2-Epitop kann zum Beispiel unter Verwendung der Homologen-Scanningmethode in Kombination mit ortsspezifischer Mutagenese kartiert werden. Insbesondere können die Verfahren dieselben oder ähnlich zu denjenigen sein, die hier für die Substitution von Aminosäuren in der A2-Domäne beschrieben sind, umfassend das Klonieren der Schweine-C2 oder einer andere Domäne, zum Beispiel unter Verwendung von RT-PCR oder durch Sondierung einer Schweineleber-cDNA-Bibliothek mit einer humanen C2- oder einer anderen Domänen-DNA; die Restriktionsstellentechniken und/oder aufeinander folgende SOE, um Epitope in der C2- oder einer anderen Domäne zu kartieren und simultan auszutauschen; die Substitution für die humane C2- oder eine andere Domäne in dem B(–) Faktor VIII; die Insertion in einen Expressionsvektor, wie zum Beispiel pBluescript; die Expression in kultivierten Zellen; und den Routineassay für die Immunreaktivität. Für die Assays kann die Reaktivität des C2-Hybridfaktors VIII mit einem C2-spezifischen Inhibitor, MR [Scandella et al. (1992) Thromb. Haemostasis 67: 665–671 und Lubin et al. (1994)] und/oder anderen C2-spezifischen Antikörpern, die durch Affinitätschromatographie hergestellt werden, durchgeführt werden.
Die C2-Domäne besteht aus den Aminosäureresten 2173–2332 (SEQ ID NR: 2). Innerhalb dieser Region mit 154 Aminosäuren scheint die Inhibitoraktivität gegen eine Region mit 65 Aminosäuren zwischen den Resten 2248 und 2312, gemäß Shima, M. et al. (1993) Thromb. Haemostas 69: 240–246 gerichtet zu sein. Ist die C2-Sequenz des humanen und Schweine-Faktor VIII in dieser Region näherungsweise zu 85% identisch, wie sie es anderswo in den funktional aktiven Regionen des Faktors VIII ist, wird es näherungsweise zehn Unterschiede zwischen den C2-Aminosäuresequenzen des humanen und Schweine-Faktors VIII geben, die als Anfangsziele zur Konstruktion von Hybriden mit substituierter C2-Sequenz verwendet werden können.
Es ist wahrscheinlich, dass klinisch signifikante Faktor VIII-Epitope auf die A2 und C2-Domänen beschränkt sind. Werden jedoch Antikörper gegen andere Regionen (A1-, A3-, B- oder C1-Domänen) des Faktor VIII identifiziert, können die Epitope kar tiert und unter Verwendung der hier für die nicht antigenen hybriden Mensch/Schwein Faktor VIII-Moleküle beschriebenen Methode eliminiert werden.
Insbesondere kann ebenfalls die Kartierung des mutmaßlichen Epitops der zweiten leichten Kette und/oder jedes andere Epitop in jeder anderen Faktor VIII-Domäne vom Tier oder Mensch ausgeführt werden. Die anfängliche Bestimmung des Vorhandenseins eines dritten Inhibitorepitops in den A3- oder C1-Domänen kann folgendermaßen durchgeführt werden. Unter Verwendung der humanen („H") und Schweine („p")-Faktor VIII Aminosäuresequenzen als Modell werden A1_p-A2_p-A3_p-C1_H-C2_P und A1_p-A2_p-A3_H-C1_p-C2_p B-domänenfreie Hybride konstruiert. Gegen die Hybride wird Inhibitor IgG aus dem Plasma von näherungsweise 20 Patienten (von Dr. Dorothea Scandella, American Red Cross), die gegen Schweine-Faktor VIII niedrige oder nicht nachweisbare Tier aufweisen, getestet. Liegt das dritte Epitop in der A3-Domäne, wird erwartet, dass inhibitorisches IgG mit A1_p-A2_p-A3_H-C1_p-C2_P aber nicht mit A1_p-A2_p-A3_p-C1_H-C2_p reagiert. Liegt umgekehrt das dritte Epitop in der C1-Domäne dann wird erwartet, dass inhibitorisches IgG mit A1_p-A2_p-A3_p-C1_H-C2_p aber nicht mit A1_p-A2_p-A3_H-C1_pC2_P reagiert. Wird ein drittes Epitop identifiziert, so wird es durch die hier für die A2- und C2-Epitope beschriebenen Verfahren charakterisiert.
Zum Beispiel können Antikörper, die für das Epitop der C1- oder A3-Domäne spezifisch sind, aus dem gesamten IgG eines Patienten durch Affinitätschromatographie unter Verwendung der mit A1_p-A2_p-A3_H-C1_p-C2_P und A1_pA2_p-A3_p-C1_H-C2_p-Hybride und durch Beseitigung C2-spezifischer Antikörper durch Laufen über C2-Sepharose^TM mit rekombinantem Faktor VIII isoliert werden. Das mutmaßliche dritte Epitop wird durch SOE-Konstrukte identifiziert, in denen, in einer bevorzugten Ausführungsform, Teile der A3- oder C1-Domäne des humanen Faktors VIII systematisch durch eine Schweine-Sequenz ersetzt wurden.
Hybridfaktor VIII-Moleküle mit verringerter Immunogenität:
Ein Molekül ist immunogen, wenn es die Erzeugung von Antikörpern im Menschen oder Tier induzieren kann. Die vorliegende Erfindung stellt ein prokoagulierendes rekombinantes hybrides Mensch/Tier oder Tier/Tier Faktor VIII-Molekül, ein Hybridfaktor VIII-äquivalentes Molekül oder Fragment von beiden bereit, dass weniger im munogen ist als der humane Schweine-Faktor VIII vom Wildtyp im Menschen oder Tier ist, umfassend mindestens eine spezifische Aminosäuresequenz, einschließlich einer oder mehrerer einmalig vorhandener Aminosäuren des Faktors VIII von einer Spezies, die für die entsprechende Aminosäuresequenz des Faktors VIII der anderen Spezies, die eine immunogene Aktivität aufweist, substituiert ist; oder mindestens eine Aminosäuresequenz, einschließlich einer oder mehrerer Aminosäuren mit keiner bekannten Identität bezüglich dem Faktor VIII, die für die Aminosäuresequenz im humanen, tierischen oder Hybridfaktor VIII substituiert sind. Dieses Hybrid kann zur Verringerung eines Auftretens der Inhibitorentwicklung in einem Tier oder Mensch und zur Behandlung des Faktor VIII-Mangels verwendet werden und würde zur Behandlung von vorher unbehandelten Patienten mit Hämophilie bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein modifizierter Faktor VIII die humane Faktor VIII-Aminosäuresequenz, weiterhin umfasst er einen oder mehrere Alaninreste, die für die humane Aminosäuresequenz mit immunogener Aktivität substituiert sind, was zu einem prokoagulierenden rekombinanten Hybrid-äquivalenten Molekül oder Fragment davon mit verringerter oder keiner Immunogenität im Menschen oder Tier führt.
Das hier beschriebene Verfahren der Epitopkartierung und Mutationsanalyse in Kombination mit der Substitution einer nicht-antigenen Aminosäuresequenz in einem Faktor VIII-Molekül unter Verwendung des hybriden Mensch/Schwein Faktors VIII erzeugt Hybridmoleküle mit geringer Antigenität. Unter Verwendung dieses Modells und der damit assoziierten Verfahren kann jedes der hier beschriebenen Hybridkonstrukte durch ortsspezifische Mutagenesetechniken verändert werden, um so viele wie möglich von allen funktionalen Epitopen zur Minimierung der Fähigkeit des Immunsystems, den Hybridfaktor VIII zu erkennen, zu entfernen, wodurch seine Immunogenität verringert wird.
Ein Verfahren, das zur weiteren Verringerung der Antigenität und zur Konstruktion eines weniger immunogenen Hybridfaktors VIII verwendet werden kann, ist die Alanin-Scanning-Mutagenese, die von Cunningham, B. C. et al. (1989) Science 244: 1081–1085 beschrieben ist, von ausgewählten spezifischen Aminosäuresequenzen im humanen, tierischen oder Hybrid-äquivalenten Faktor VIII. Bei der Alanin-Scanning-Mutagenese werden Aminosäureseitenketten, die mutmaßlich mit einem Epitop zu tun haben, durch Alaninreste unter Verwendung von ortsspezifischer Mutagenese ersetzt. Durch Vergleich der Antikörperbindung von Alaninmutanten an Protein vom Wildtyp kann der relative Beitrag der einzelnen Seitenketten an der Bindungswechselwirkung bestimmt werden. Es ist wahrscheinlich, dass Alaninsubstitutionen besonderes verwendbar sind, da Seitenkettenbeiträge an der Antikörperbindung jenseits des β-Kohlenstoffs eliminiert werden, jedoch im Gegensatz zur Glycinsubstitution die Hauptkettenkonformation normalerweise nicht verändert wird. Die Alaninsubstitution führt keine größeren sterische oder hybrophobe oder elektrostatische Wirkungen ein, die die Protein-Protein-Wechselwirkungen beherrschen.
Bei den Proteinantigen-Antikörper-Wechselwirkungen gibt es normalerweise ungefähr 15–20 Antigenseitenketten im Kontakt mit dem Antikörper. Im Gegensatz zu Hauptkettenwechselwirkungen beherrschen Seitenkettenwechselwirkungen Protein-Protein-Wechselwirkungen. Jüngste Untersuchungen deuten darauf hin, dass nur wenige (näherungsweise 3 bis 5) dieser Seitenkettenwechselwirkungen den größten Beitrag an der Bindungsenergie aufweisen. Siehe Clackson, T. et al. (1995) Science 267: 383–386. Eine umfassende Analyse von Epitopen von Wachstumshormonen für mehrere monoklonale Antikörper offenbarte die folgende Hierarchie für Beiträge von Seitenketten an der Bindungsenergie: Arg > Pro > Glu-Asp-Phe-Ile, wobei Trp, Ala, Gly und Cys nicht getestet wurden [Jin, L. et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 851–865]. Ergebnisse mit dem hier beschriebenen A2-Epitop stimmen damit überein, da zwölf der 25 Reste in dem 484–508 A2-Segment diese Seitenketten enthalten (1C).
Das Ergebnis, dass Aminosäurereste besonders gut von Antikörpern erkannt werden, weist darauf hin, dass eine Eliminierung dieser Reste aus einem bekannten Epitop die Fähigkeit des Immunsystems zur Erkennung dieser Epitope verringern kann, das heißt, ein Molekül weniger immunogen machen kann. Im Falle des A2-Epitops können die immunogenen Reste ohne Verlust der koagulationsfördernden Aktivität des Faktors VIII ersetzt werden. Zum Beispiel wird in HP9 Arg484 durch Ser, Pro485 durch Ala, Arg489 durch Gly, Pro492 durch Leu und Phe501 durch Met ersetzt. Weiterhin weisen Ergebnisse von Patientenplasmen, die zum Testen der Immunreaktivität in hybriden Mensch/Schwein Faktor VIII-Konstrukten verwendet wurden, wie in Beispiel 8 beschrieben ist, darauf hin, dass Antikörper von unterschiedlichen Patienten dieselbe oder eine sehr ähnliche strukturelle Region in der A2-Domäne erkennen und, dass die Reste in der A2-Domäne, die an der Bindung von A2-Inhibitoren teilnehmen, eine geringe Variation zu zeigen scheinen. Daher ist das in den Resten 484–508 des humanen Faktors VIII enthaltene A2-Epitop ein immundominantes Epitop, das durch das humane Immunsystem besser erkannt wird, als andere strukturelle Regionen des Faktors VIII. Es wird erwartet, dass ein Ersetzen dieser Struktur durch eine nicht antigene Faktor VIII-Sequenz von einer anderen Spezies oder durch eine Nicht-Faktor VIII-Aminosäuresequenz, unter Beibehaltung der vollständigen prokoagulierenden Aktivität die Erkennung des hybriden oder Hybrid-äquivalenten Faktors VIII durch das Immunsystem ändert.
Es wird erwartet, dass die ortsspezifische Mutagenese zur Substitution von sterisch anspruchsvollen und/oder geladenen Resten, die dazu neigen, die Epitope zu beherrschen, durch kleine, neutrale Seitenketten (zum Beispiel Alanin) eine weniger immunogene Region erzeugen kann. Es wird erwartet, dass es für das Immunsystem schwierig wird, für ein Molekül, das ein paar dieser Substitutionen an jedem signifikanten Inhibitorepitop enthält, über den Schlüssel-Schloss-Mechanismus passend zu sein, der für Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen typisch ist. Wegen seiner geringen Antigenität könnte ein derartiges Hybridmolekül zur Behandlung von Patienten mit Faktor VIII-Mangel mit Inhibitoren verwendbar sein, und wegen seiner geringen Immunogenität könnte es zur Behandlung von vorher unbehandelten Patienten mit Hämophilie A verwendbar sein.
Ein allgemeines Ergebnis ist, dass die Mutation von einem oder wenigen Schlüsselresten ausreicht, die Bindungskonstante für eine gegebene Protein-Protein-Wechselwirkung um mehrere Größenordnungen zu erniedrigen. Es scheint daher wahrscheinlich, dass alle Epitope des Faktors VIII eine begrenzte Zahl Aminosäuren enthalten, die für die Inhibitorentwicklung entscheidend sind. Für jedes Epitop im Faktor VIII können Alaninsubstitutionen für mindestens eine Sequenz, einschließlich einer oder mehrerer spezifischer Aminosäuren mit immunogener Aktivität, ein aktives Molekül erzeugen, das weniger immunogen als der Faktor VIII vom Wildtyp ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Hybridfaktor VIII B-domänenfrei.
Die Verfahren zur Herstellung eines aktiven rekombinanten hybriden oder Hybridäquivalenten Faktors VIII mit Substitution einer Aminosäuresequenz mit geringer o der keiner immunogenen Aktivität durch eine Aminosäuresequenz im Faktor VIII mit immunogener Aktivität, wobei der hybride Mensch/Schwein Faktor VIII mit Aminosäuresubstitutionen in der A2-Domäne als eine beispielhafte Ausführungsform verwendet wird, sind wie folgt. In der Region 484–508 des humanen Faktors VIII gibt es 25 Reste. Die ortsspezifische Mutagenese kann zur Herstellung von Einzelmutanten verwendet werden, in denen jeder dieser Reste durch jede der anderen 19 Aminosäuren für insgesamt 475 Mutanten ersetzt wird. Weiterhin können Hybridmoleküle mit mehr als einer Mutation konstruiert werden.
Die Hybridkonstrukte können bezüglich einer Antigenität durch Messung der Bindungskonstante für Inhibitorantikörper untersucht werden, wie von Friguet, B. et al. (1985) J. Immunol. Methods 77: 305–319 (1985) beschrieben ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bindungskonstante um mindestens drei Größenordnungen kleiner sein, was den Bethesdatiter auf einen Gehalt erniedrigen würde, der klinisch nicht signifikant ist. Zum Beispiel wurde der IC₅₀-Wert (ein grobes Maß für die Bindungskonstante) für die Hemmung von A2-Antikörpern in den hybriden Mensch/Schwein Faktor VIII Konstrukten HP2, HP4, HP5, HP7 und HP9, die in Beispiel 9 beschrieben; verringert und dies wurde mit einer Verringerung im Bethesdatiter auf einen nicht messbaren Gehalt assoziiert. Es wird erwartet, dass eine doppelte oder dreifache Alaninmutante des humanen Faktors VIII (zum Beispiel eine humane Faktor VIII Arg- > Ala, Arg489- > Ala, Phe501- > Ala-Dreifachmutante) ein Molekül mit für eine therapeutische Verwendung ausreichend geringer Antigenität erzeugen wird. Ähnliche Mutationen können in dem C2-Epitop und dem mutmaßlichen dritten Epitop durchgeführt werden. Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst zwei oder drei Alaninsubstitutionen in zwei oder drei Faktor VIII-Epitopen. Andere Substitutionen können in diesen Regionen ebenfalls durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Hybrid-äquivalente Faktor VIII-Moleküle identifiziert, die weniger antigen und/oder immunogen im Menschen und Tier als entweder humaner oder Schweine-Faktor VIII sind. Derartige Hybrid-äquivalente Konstrukte können in Tieren auf ihre verringerte Antigenität und/oder Immunogenität getestet werden. Zum Beispiel können eine Kontrolle und Kaninchen, Schweine, Hunde, Mäuse, Primaten und andere Säuger mit Faktor VIII-Mangel als Tiermodelle verwendet werden. In einem experimentellen Protokoll kann der hybride oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII systematisch über einen Zeitraum von sechs Monaten bis einem Jahr dem Tier, vorzugsweise durch intravenöse Infusion und in einer Dosierung im Bereich zwischen 5 und 50 Einheiten/kg Körpergewicht, vorzugsweise 10–50 Einheiten/kg und besonders bevorzugt 40 Einheiten/kg Körpergewicht verabreicht werden. Antikörper können in Plasmaproben, die in Zeitabständen nach den Infusionen über die Dauer des Testzeitraums genommen werden, durch Routineverfahren, einschließlich des Immunoassays und dem Bethesda-Assays, gemessen werden. Die koagulationsfördernde Aktivität kann ebenfalls in Proben mit Routineverfahren, einschließlich des Einstufen-Koagulationsassays, gemessen werden.
Die Hybrid-äquivalenten Faktor VIII-Moleküle können in Menschen auf ihre verringerte Antigenität und/Immunogenität auf mindestens zwei Arten von klinischen Erprobungen getestet werden. Bei einer Erprobungsart, die zur Bestimmung, ob der hybride oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII bezüglich inhibitorischen Antikörpern immunreaktiv ist, ausgelegt ist, wird der hybride oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII vorzugsweise durch intravenöse Infusion näherungsweise 25 Patienten mit Faktor VIII-Mangel verabreicht, die Antikörper gegen den Faktor VIII aufweisen, die die koagulatonsfördernde Aktivität des therapeutischen humanen oder Schweine-Faktors VIII hemmen. Die Dosierung des hybriden oder Hybrid-äquivalenten Faktors VIII liegt im Bereich zwischen 5 und 50 Einheiten/kg Körpergewicht, vorzugsweise 10–50 Einheiten/kg und besonders bevorzugt 40 Einheiten/kg Körpergewicht. Näherungsweise wird 1 Stunde nach jeder Verabreichung die Regenerierung vom Faktor VIII aus Blutproben in einem Einstufen-Koagulationsassay gemessen. Proben werden näherungsweise 5 Stunden nach der Infusion genommen und die Regenerierung wird gemessen. Die gesamte Regenerierung und die Geschwindigkeit des Verschwindens des Faktors VIII aus den Proben sind aus dem Antikörpertiter und der inhibitorischen Aktivität vorhersagbar. Ist der Antikörpertiter zu hoch, kann die Faktor VIII-Regenerierung normalerweise nicht gemessen werden. Die Ergebnisse der Regenerierung werden mit der Regenerierung von Regenerierungsergebnissen bei Patienten mit einem aus dem Plasma stammenden humanen Faktor VIII, einem rekombinanten humanen Faktor VIII, einem Schweine-Faktor VIII und anderen allgemein verwendeten therapeutischen Formen des Faktors VIII oder mit Faktor VIII-Ersatzstoffen verglichen.
Bei einer zweiten Art der klinischen Erprobung, die zur Bestimmung, ob der hybride oder Hybrid-äguivalente Faktor VIII immunogen ist, das heißt, ob Patienten inhibitorische Antikörper entwickeln werden, ausgelegt ist, wird der hybride oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII, entsprechend der Beschreibung in den vorangehenden Abschnitten, näherungsweise 100 vorher unbehandelten Hämophilie-Patienten verabreicht, die gegen den Faktor VIII keine Antikörper entwickelt haben. Die Heilmittel werden näherungsweise alle 2 Wochen über einen Zeitraum von 6 Monaten bis 1 Jahr gegeben. In Zeitabständen von 1 bis 3 Monaten werden während dieses Zeitraums Blutproben gezogen und Bethesda-Assays oder andere Antikörperassays zur Bestimmung des Vorhandenseins inhibitorischer Antikörper durchgeführt. Regenerierungsassays können, wie vorstehend beschrieben ist, nach jeder Infusion durchgeführt werden. Ergebnisse werden mit Hämophilie-Patienten verglichen, die einen aus dem Plasma stammenden Faktor VIII, einen rekombinanten humanen Faktor VIII, einen Schweine-Faktor VIII oder andere im Allgemeinen verwendete therapeutische Formen des Faktors VIII oder Faktor VIII-Ersatzstoffe erhielten.
Herstellung von Hybridfaktor VIII-Molekülen unter Verwendung einer Aminosäuresequenz eines humanen und Nicht-Schwein, Nicht-Mensch Säuger Faktors VIII:
Die zur Herstellung des hybriden Mensch/Schwein Faktors VIII mit Substitution spezifischer Aminosäuren verwendeten Verfahren können zur Herstellung von rekombinantem hybriden Mensch/Nicht-Mensch, Nicht-Schwein Säuger oder Tier/Tier Faktor VIII-Protein verwendet werden, das im Vergleich zum humanen oder Schweine-Faktor VIII eine geänderte oder dieselbe koagulationsfördernde Aktivität und/oder eine gleiche oder verringerte Immunreaktivität und/oder Immunogenität, basierend auf der Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren in der A2-, C2- und/oder anderen Domänen aufweist.
Ähnliche Vergleiche der Aminosäuresequenzidentität können zwischen humanen und nicht-humanen, Nicht-Schwein Säuger Faktor VIII-Proteinen durchgeführt werden, um die Aminosäuresequenzen, in denen die prokoagulierende Aktivität, Anti-A2- und Anti-C2-Immunreaktivität und oder Immunogenität, oder Immunreaktivität und/oder Immunogenität in anderen Domänen liegt, zu bestimmen. Dann können ähnliche Verfahren zur Herstellung von hybriden Mensch/Nicht-Mensch, Nicht-Schwein Säuger Faktor VIII-Molekülen verwendet werden. Wie vorstehend beschrieben ist, wird die funktionale Analyse von jedem Hybrid diejenigen mit verringerter Reaktivität gegen inhibitorische Antikörper und/oder verringerter Immunogenität und/oder verringerter koagulationsfördernder Aktivität offenbaren und die Sequenz kann weiterhin durch Punktmutationsanalyse gründlich untersucht werden.
Hybride Mensch/Maus Faktor VIII-Moleküle können zum Beispiel, wie vorstehend beschrieben ist, hergestellt werden. Die Aminosäuresequenzanordnung der A2-Domäne des Menschen (SEQ ID NR: 2) und der Maus (SEQ ID NR: 6) ist in 1C gezeigt. Wie von Elder et al. berichtet wurde, weist das durch die Mäuse-DNA (SEQ ID NR: 5) kodierte Faktor VIII-Protein 2319 Aminosäuren mit einer Sequenzidentität von insgesamt 74% gegenüber der humanen Sequenz (SEQ ID NR: 2) auf (die Identität beträgt 87%, wenn die B-Domäne aus dem Vergleich ausgeschlossen ist), und es ist um 32 Aminosäuren kürzer als der humane Faktor VIII. Die Aminosäuresequenzen in den Mäuse-A- und C-Domänen (SEQ ID NR: 6) sind mit einer Sequenzidentität von 84–93% gegenüber der humanen Sequenz (SEQ ID NR: 2) hoch konserviert, während die B- und die zwei kurzen sauren Domänen eine Sequenzidentität von 42–70% aufweisen. Insbesondere sind die A1-, A2- und A3-Maus-Aminosäuresequenzen (SEQ ID NR: 6) zu 85, 85 und 90% identisch mit den entsprechenden humanen Aminosäuresequenzen (SEQ ID NR: 2). Die C1- und C2-Maus-Aminosäuresequenzen sind zu 93 und 84% identisch mit den entsprechenden humanen Aminosäuresequenzen. In der vorhergesagten Mäuse-Faktor VIII-Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 6) sind die A1-, A2- und A3-Domänen zu den humanen Faktor VIII-Aminosäuren 1–372, 373–740 beziehungsweise 1690–2032 homolog, wobei die Aminosäuresequenzidentität für Nummerierungszwecke verwendet wurde.
Der Thrombin/Faktor Xa und alle außer einer aktivierten Protein C-Spaltungsstelle sind in dem Mäuse-Faktor VIII konserviert. Der Tyrosinrest für die Bindung des von Willebrand-Faktors ist ebenfalls konserviert.
Gemäß Elder et al., enthält die Nukleotidsequenz (SEQ ID NR: 5) des Mäuse-Faktor VIII 7519 Basen und weist eine Identität von insgesamt 67% mit der humanen Nukleotidsequenz (SEQ ID NR: 1) auf. Die 6957 Basenpaare der murinen Kodierungssequenz weisen eine Sequenzidentität von 82% mit den 7053 Basenpaaren der kodierenden Sequenz im humanen Faktor VIII auf. Ist die B-Domäne nicht in dem Vergleich eingeschlossen, gibt es eine Nukleotidsequenzidentität von 88%.
Elder et al. berichteten, dass humane und Mäuse-Faktor VIII-Moleküle insgesamt zu 74% identisch sind und, dass 95% der humanen Reste, die bei Veränderung zu Hämophilie führen, in der Maus identisch sind. Diese Daten unterstützen die Anwendung derselben Techniken, die zur Identifikation einer Aminosäuresequenz mit koagulationsfördernder Aktivität und/oder Immunreaktivität gegen Antikörper in dem Schweine-Faktor VIII-Molekül verwendet werden, auf den Mäuse- oder anderen Tier-Faktor VIII, um ähnliche Aminosäuresequenzen zu identifizieren und Hybridmoleküle herzustellen.
Herstellung von Hybridfaktor VIII-Molekülen mit verringerter Kreuzreaktivität unter Verwendung einer Mensch und Nicht-Mensch, Nicht-Schwein Säuger Faktor VIII-Aminosäuresequenz und Nicht-Faktor VIII-Aminosäuresequenz:
Der Schweine-Faktor VIII wird zur Behandlung von Patienten mit Faktor VIII-Mangel verwendet, die inhibitorische Antikörper gegen den humanen Faktor VIII aufweisen. Kreuzreaktivität, bei der humanes Plasma mit dem Schweine-Faktor VIII reagiert, kann durch Herstellung eines hybriden Schwein/Nicht-Mensch, Nicht-Schwein Säuger oder Hybrid-äquivalenten Faktors VIII verringert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Bestimmung durchgeführt, ob ein bezüglich einer humanen A2- oder C2 oder anderen Domäne spezifischer Inhibitor mit einem Nicht-Mensch, Nicht-Schwein Säuger („anderer Säuger") Faktor VIII reagiert, wobei der Routine-Bethesda-Assay und das spezielle andere Säugerplasma als Standard verwendet werden. Inhibitortiter werden normalerweise im Plasma gemessen, daher ist ein anderer gereinigter Säuger-Faktor VIII nicht notwendig. Falls die Inhibitoren mit dem anderen Säuger-Faktor VIII, wie zum Beispiel dem murinen Faktor VIII, dessen Sequenz bekannt ist, nicht reagieren, dann kann die entsprechende Sequenz eines anderen Säugers, entsprechend der Identifikation unter Verwendung von humanen/Schweine-Hybriden in die Schweine-Epitopregion substituiert werden. Sobald die Tier-Sequenz bekannt ist, können ortsspezifische Mutagenesetechniken, wie zum Beispiel die von Kunkel, T. A. et al. (1991) Meth. Enzymol 204: 125–139 beschriebene Oliogonukleotid-vermittelte Mutagenese zur Herstellung des hybriden Schwein/Tier Faktor VIII-Moleküls verwendet werden. Sind andere Tierplasmen mit A2-, C2- oder anderen Faktor VIII-Inhibitoren weniger reaktiv als der Schweine-Faktor VIII, kann die dem Schweine-Epitop entsprechende Tier-Sequenz durch Routineverfahren, wie zum Beispiel RT-PCR bestimmt werden, und ein hybrider Mensch/Tier oder Schwein/Tier Faktor VIII durch ortsspezifische Mutagenese konstruiert werden. Ebenfalls kann ein hybrider Mensch/Tier oder Schwein/Nicht-Schwein Säuger Faktor VIII mit verringerter Kreuzreaktivität mit humanem Plasma im Vergleich zum Schweine-Faktor VIII hergestellt werden, der eine entsprechende Aminosäuresequenzsubstitution aus einem oder mehreren anderen Tieren aufweist. In einer weiteren Ausführungsform kann die Kreuzreaktivität durch Substitution einer Aminosäuresequenz mit keiner bekannten Identität bezüglich der Faktor VIII-Aminosäuresequenz verringert werden, vorzugsweise durch Substitution von Alaninresten unter Verwendung von Alanin-Scanning-Mutagenesetechniken für die Schweine-Epitopsequenz.
Nach der Identifikation klinisch signifikanter Epitope werden rekombinante Hybridfaktor VIII-Moleküle exprimiert, die im Vergleich zum Schweine-Faktor VIII weniger oder die gleiche Kreuzreaktivität aufweisen, wenn sie in vitro gegen ein großes Feld an Inhibitorplasmen getestet werden. Diese Moleküle werden vorzugsweise kombinierte A2/C2-Hybride sein, in denen die immunreaktive Aminosäuresequenz in diesen Domänen durch eine andere Säugersequenz ersetzt wurde. In diesen Regionen kann eine zusätzliche Mutagenese zur Verringerung der Kreuzreaktivität durchgeführt werden. Eine verringerte Kreuzreaktivität, obwohl sie wünschenswert ist, ist zur Herstellung eines Produkts nicht notwendig, das gegenüber dem bestehenden Schweine-Faktor VIII-Konzentrat, das aufgrund kontaminierender Schweine-Proteine Nebenwirkungen erzeugen könnte und aufgrund der Immunogenität der Schweine-Faktor VIII-Sequenzen ungerichtete Wirkungen erzeugen könnte, Vorteile aufweisen kann. Ein hybrides Mensch/anderer Säuger oder Schwein/anderer Säuger Faktor VIII-Molekül wird keine fremden Schweine-Proteine enthalten. Zusätzlich weist die in der Schweine-A2-Domäne ausgeführte umfassende Epitopkartierung darauf hin, dass mehr als 95% der therapeutischen hybriden Mensch/Schwein Faktor VIII-Sequenz human sein wird.
Herstellung von Hybridfaktor VIII-Äquivalenten:
Die vorstehend und in den Beispielen beschriebenen Verfahren zur Aminosäuresubstitution in Faktor VIII-Molekülen können ebenfalls zur Herstellung von Molekülen, die zu dem prokoagulierenden rekombinanten Hybridfaktor VIII äquivalent sind, oder Fragmenten davon verwendet werden, umfassend mindestens eine Aminosäuresequenz, einschließlich einer oder mehrerer Aminosäuren mit keiner bekannten Aminosäuresequenzidentität bezüglich dem Faktor VIII („Nicht-Faktor VIII-Sequenz"), die für mindestens eine spezifische Aminosäuresequenz substituiert sind, die eine antigene und/oder immunogene Stelle im humanen, Tier- oder hybriden Faktor VIII umfasst. Das resultierende aktive Hybridfaktor VIII-äquivalente Molekül weist die gleiche oder eine geringere Reaktivität bezüglich Faktor VIII-inhibitorischen Antikörpern und/oder weniger Immunogenität im Menschen und Tieren auf als der nicht substituierte humane, Tier- oder hybride Faktor VIII.
Geeignete Aminosäurereste, die für diejenigen Sequenzen von Aminosäuren substituiert werden können, die für die koagulationsfördernde und/oder antigene und/oder immunogene Aktivität im humanen oder Tier-Faktor VIII oder hybriden Mensch/Tier-Faktor VIII zur Herstellung eines Hybrid-äquivalenten Faktor VIII-Moleküls entscheidend sind, umfassen alle Aminosäuren mit keiner bekannten Sequenzidentität bezüglich der Tier- oder humanen Faktor VIII-Aminosäuresequenz, die eine koagulationafördernde, antigene oder immunogene Aktivität aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Aminosäuren Alaninreste, die unter Verwendung von Alanin-Scanning-Mutagenesetechniken substituiert werden können.
Die hier beschriebenen Hybridfaktor VIII-äquivalenten Moleküle umfassen ebenfalls diejenigen Moleküle, in denen Aminosäurereste mit keiner bekannten Sequenzidentität bezüglich der Tier-Faktor VIII-Sequenz für Aminosäurereste substituiert sind, die für die koagulationsfördernde, antigene oder immunogene Aktivität nicht entscheidend sind.
Wie vorstehend beschrieben ist, weist in einer Ausführungsform eines Hybridfaktor-VIII-äquivalenten Moleküls das Molekül eine verringerte Kreuzreaktivität mit Inhibitorplasmen auf. Eines oder mehrere Epitope werden, wie vorstehend beschrieben ist, in dem kreuzreaktiven Faktor VIII identifiziert und dann durch eine Nicht-Faktor VIII-Aminosäuresequenz, vorzugsweise Alaninreste, unter Verwendung von zum Beispiel dem Alanin-Scanning-Mutgenese-Verfahren ersetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein prokoagulierendes rekombinantes Hybridfaktor VIII-äquivalentes Molekül hergestellt, umfassend mindestens eine Sequenz, einschließlich einer oder mehrerer Aminosäuren mit bekannter Sequenzidentität bezüglich dem Faktor VIII, vorzugsweise Alaninreste, die für mindestens eine Sequenz, einschließlich einer oder mehrerer Aminosäuren, einschließlich einem Epitop und/oder für mindestens eine Sequenz, einschließlich einer oder mehrerer Aminosäuren, einschließlich einer immunogene Stelle, vorzugsweise in dem humanen Faktor VIII substituiert wird. Das resultierende Hybrid-äquivalente Faktor VIII-Molekül oder ein Fragment davon weist eine verringerte oder keine Immunreaktivität mit inhibitorischen Antikörpern gegen den Faktor VIII und/oder einer verringerte oder keine Immunogenität im Menschen oder in Tieren auf. Die Verfahren zur Identifikation einer spezifischen antigenen Aminosäuresequenz in der A2-Domäne des humanen Faktors VIII für die Substitution durch eine nicht antigene einmalig vorhandene Aminosäuresequenz sind in den Beispielen 7 und 8 beschrieben und sind beispielhaft für die Identifikation einer antigenen Sequenz in der A2- und anderen Domänen des humanen und Tier-Faktors VIII und für die Verwendung ortsspezifischer Mutageneseverfahren, wie zum Beispiel die Alanin-Scanning-Mutagenese zur Substitution einer Nicht-Faktor VIII-Aminosäuresequenz.
Da das humane A2-Epitop auf 25 oder weniger Aminosäuren, entsprechend der Beschreibung in Beispiel 8, eingeengt wurde, kann die Alanin-Scanning-Mutagenese mit einer begrenzten Zahl von Hybridfaktor VIII-Konstrukten mit einer humanen Aminosäuresequenz durchgeführt werden, um basierend auf A2-Aminosäuresubstitutionen zu bestimmen, welches prokoagulierende, nicht immunreaktive und/oder nicht immunogene Hybridfaktor VIII-Konstrukte sind. In der A2-Domäne sind die für Alaninsubstitutionen wahrscheinlichsten Kandidaten zum Erreichen von sowohl einer verringerten Antigenität als auch Immunogenität in dem Hybridkonstrukt, Arg484, Pro485, Tyr487, Ser488, Arg489, Pro492, Val495, Phe501 und Ile508. Die Bindungsaffinität eines Hybridkonstrukts, das jede dieser Mutanten für mAb413 und ein Feld von A2-spezifischen IgGs von Patienten umfasst, wird durch ELISA bestimmt. Jede Mutante, die aktiv ist und eine Bindungsaffinität für A2-Inhibitoren aufweist, die um mehr als 2 Größenordnungen verringert ist, ist ein Kandidat für das A2-substituierte Faktor VIII-Molekül. Konstrukte mit mehr als einer Mutation werden basierend auf der Annahme ausgewählt, dass mit zunehmender Veränderung des Epitops es weniger immunogen sein wird. Es ist möglich, dass es andere Kandidaten für Reste in der Region zwischen Arg484-Ile508 gibt, da es für das Epitop Schlüsselreste geben kann, die sowohl dem humanen als auch dem Schweine-Faktor VIII gemeinsam sind. Zum Beispiel sind häufig geladene Reste in Protein-Protein-Wechselwirkungen involviert und tatsächlich erzeugt ein Alaninersatz für Arg490 einen prokoagulierenden Faktor VIII mit nur 0,2% der Reaktivität gegen einen Inhibitor des humanen Faktors VIII (Tabelle VI). Ähnlich ist eine Alaninsubstitution für Lys493 ein möglicher Kandidat.
Dieses Verfahren wird in dem C2-Epitop und dem mutmaßlichen dritten Epitop ausgeführt, von dem angenommen wird, dass es in den A3- oder C1-Domänen liegt, sowie in allen anderen Epitopen, die in dem Faktor VIII identifiziert sind, um Hybrid-äquivalente Faktor VIII-Konstrukte herzustellen.
Diagnose-Assays
Die hybride Mensch/Tier, Tier/Tier oder äquivalenter Faktor VIII-cDNA und/oder deren Proteinexpression kann ganz oder teilweise in Assays als Diagnosereagenzien zum Nachweis inhibitorischer Antikörper gegen den humanen oder Tier-Faktor VIII oder gegen den hybriden Mensch/Tier Faktor VIII oder äquivalenten Faktor VIII in Substraten, einschließlich zum Beispiel Proben von Serum und Körperflüssigkeiten menschlicher Patienten mit Faktor VIII-Mangel, verwendet werden. Diese Antikörperassays umfassen Assays, wie zum Beispiel ELISA-Assays, Immunoblots, Radioimmunoassays, Immundiffusionsassays und eine Assays für die biologische Aktivität des Faktors VIII (zum Beispiel durch einen Koagulationsassay). Techniken zur Herstellung dieser Reagenzien und Verfahren zu deren Verwendung sind dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel kann ein Immunoassay zum Nachweis inhibitorischer Antikörper in der Serumprobe eines Patienten die Umsetzung der Testprobe mit einer ausreichenden Menge an hybridem Mensch/Tier Faktor VIII, der mindestens eine antigene Stelle enthält, umfassen, wobei die Menge zur Bildung eines nachweisbaren Komplex mit den inhibitorischen Antikörpern in der Probe ausreicht.
Nukleinsäure- und Aminosäuresonden können, basierend auf der Sequenz der hybriden Mensch/Schwein, Mensch/Nicht-Mensch, Nicht-Schwein Säuger, Tier/Tier oder äquivalenter Faktor VIII-cDNA oder eines Proteinmoleküls oder Fragmenten davon, hergestellt werden. In einigen Ausführungsformen können diese unter Verwendung von Farbstoffen oder enzymatischen, fluoreszierenden, chemilumineszierenden oder radioaktiven Markierungen, die handelsüblich sind, markiert werden. Die Aminosäuresonden können zum Beispiel zum Screenen von Seren oder anderen Körperflüssigkeiten, wo das Vorhandenseins von Inhibitoren gegen den humanen, Tier- oder hybriden Mensch/Tier Faktor VIII vermutet wird, verwendet werden. Gehalte an Inhibitoren können in Patienten quantitativ bestimmt und mit gesunden Kontrollen verglichen werden, und sie können zum Beispiel zur Bestimmung, ob ein Patient mit Faktor VIII-Mangel mit einem hybriden Mensch/Tier oder Hybrid-äquivalenten Faktor VIII behandelt werden kann, verwendet werden. Die cDNA-Sonden können zum Beispiel für Forschungszwecke beim Screening von DNA-Bibliotheken verwendet werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen hybriden Mensch/Tier, Schwein/Nicht-Mensch, Nicht-Schwein Säuger, Tier-1/Tier-2 oder äquivalenten Faktor VIII allein oder in Kombination mit geeigneten pharmazeutischen Verbindungen zur Stabilisierung, Abgabevehikeln und/oder Trägervehikeln, enthalten, werden gemäß bekannten Verfahren, entsprechend der Beschreibung in Remingtons Pharmaceutical Sciences von E. W. Martin, hergestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die für eine intravenöse Infusion bevorzugten Träger oder Abgabevehikel physiologische Salzlösung oder phosphatgepufferte Salzlösung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen geeignete Verbindungen zur Stabilisierung, Abgabevehikel und Trägervehikel andere humane und tierische Proteine, wie zum Beispiel Albumin, sie sind aber nicht darauf beschränkt.
Phospholipidvesikel oder Liposomensuspensionen werden ebenfalls als pharmazeutisch verträgliche Träger oder Abgabevehikel bevorzugt. Diese können gemäß den dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden und können zum Beispiel Phosphatidylserin/Phosphatidylcholin oder andere Zusammensetzungen von Phospholipiden oder Detergentien enthalten, die zusammen der Oberfläche eine negative Ladung verleihen, da der Faktor VIII an negativ geladene Phospholipidmembranen bindet. Liposomen können durch Lösen von geeignetem Lipid(en) (wie zum Beispiel Stearoylphosphatidylethanolamin, Stearoylphosphatidylcholin, Arachadoylphosphatidylcholin und Cholesterin) in einem anorganischen Lösungsmittel, das dann verdampft wird, wobei ein dünner Film von getrocknetem Lipid auf der Oberfläche des Behälters zurückbleibt, hergestellt werden. Eine wässrige Lösung des Hybridfaktors VIII wird dann in den Behälter eingeführt. Dann wird die Lösung im Behälter von Hand verwirbelt, um das Lipidmaterial von den Seiten des Behälters freizusetzen und die Lipidaggregate zu dispergieren, wobei sich die Liposomensuspension bildet.
Der Hybridfaktor oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII kann mit anderen geeigneten Verbidnungen zur Stabilisierung, Abgabevehikeln und/oder Trägervehikeln, einschließlich Vitamin K abhängigen Koagulationsfaktoren, Gewebefaktoren und dedes von Willebrand-Faktors (vWF) oder ein Fragment des vWF, das die Faktor VIII-Bindungsstelle enthält, und Polysacchariden, wie zum Beispiel Saccharose, kombiniert werden.
Der hybride oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII kann ebenfalls durch Gentherapie auf dieselbe Art, wie der humane Faktor VIII abgegeben werden kann, unter Verwendung von Abgabemittel, wie zum Beispiel retrovirale Vektoren abgegeben werden. Dieses Verfahren besteht aus dem Einbau der Faktor VIII-cDNA in humane Zellen, die direkt in einen Patienten mit Faktor VIII-Mangel transplantiert werden, oder die in eine transplantierbare Vorrichtung gegeben werden können, die für die Faktor VIII-Moleküle durchlässig ist aber für Zellen undurchlässig ist, und die dann transplantiert wird. Das bevorzugte Verfahren wird der retrovirale-vermittelte Gentransfer sein. Bei diesem Verfahren wird ein exogenes Gen (zum Beispiel eine Faktor VIII-cDNA) in das Genom eines modifizierten Retrovirus geklont. Das Gen wird in das Genom der Wirtszelle durch die Virusmaschinerie eingeschoben, wo es durch die Zelle exprimiert wird. Der retrovirale Vektor wird so modifiziert, dass er keinen Virus erzeugt, wodurch eine virale Infektion des Wirts verhindert wird. Die allgemeinen Prinzipien dieser Art der Therapie sind dem Fachmann bekannt und wurden in der Literatur besprochen [zum Beispiel Kohn, D. B. et al. (1989) Transfusion 29: 812–820].
Der Hybridfaktor VIII kann gebunden an vWF zur Erhöhung der Halbwertszeit und Lagerbeständigkeit des Hybridmoleküls gelagert werden. Zusätzlich kann eine Gefriertrocknung des Faktor VIII die Ausbeuten an aktiven Molekülen in Gegenwart von vWf verbessern. Übliche Verfahren zur Lagerung von humanem und Tier-Faktor VIII, die von kommerziellen Lieferanten verwendet werden, können für die Lagerung des Hybridfaktors VIII verwendet werden. Diese Verfahren umfassen: (1) Die Gefriertrocknung des Faktors VIII in einem teilweise gereinigten Zustand (als Faktor VIII-„Konzentrat", das ohne weitere Reinigung durch Infusion eingeführt wird); (2) die Immunaffinitäts-Reinigung des Faktors VIII durch das Zimmerman-Verfahren und Gefriertrocknung in Gegenwart von Albumin, das den Faktor VIII stabilisiert; (3) die Gefriertrocknung des rekombinanten Faktors VIII in Gegenwart von Albumin.
Weiterhin war der Hybridfaktor VIII bei 4°C in 0,6 M NaCl, 20 mM MES und 5 mM CaCl₂ bei einem pH-Wert von 6,0 unbegrenzt stabil und kann ebenfalls in diesen Puffern gefroren gelagert und mit einem minimalen Verlust an Aktivität aufgetaut werden.
Behandlungsverfahren
Der hybride oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII wird zur Behandlung von unkontrolliertem Bluten aufgrund von Faktor VIII-Mangel (zum Beispiel intraartkiluläre, intrakraniale oder gastrointestinale Hämorrhagie) bei Hämophilen mit und ohne inhibitorische Antikörper und in Patienten mit erworbenem Faktor VIII-Mangel aufgrund der Entwicklung von inhibitorischen Antikörpern verwendet. Die aktiven Materialien werden vorzugsweise intravenös verabreicht.
Zusätzlich kann der hybride oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII durch Transplantation von Zellen, die zur Erzeugung des Hybrids gentechnisch hergestellt wurden, oder durch Implantation eines Mittels, das derartige Zellen enthält, wie vorstehend beschrieben wurde, verabreicht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden pharmazeutische Zusammensetzungen des hybriden oder Hybrid-äquivalenten Faktors VIII allein oder in Kombination mit Stabilisatoren, Abgabevehikeln und/oder Trägern Patienten intravenös durch Infusion gemäß demselben Verfahren, das für die Infusion des humanen oder TierFaktor VIII verwendet wird, verabreicht.
Die Behandlungsdosierungen der hybriden oder Hybrid-äquivalenten Faktor VIII-Zusammensetzung, die einem Patienten, der einer derartigen Behandlung bedarf, verabreicht werden müssen, werden in Abhängigkeit von der Schwere des Faktor VIII-Mangels variieren. Im Allgemeinen wird der Dosierungsgehalt mit der Häufigkeit, Dauer und den Einheiten, entsprechend der Schwere und Dauer der Blutungsepisode von jedem Patienten angepasst. Dementsprechend ist der Hybridfaktor VIII in dem pharmazeutisch verträglichen Träger, Abgabevehikel oder Stabilisator in einer Menge eingeschlossen, die ausreicht, an den Patienten eine therapeutisch wirksame Menge des Hybrids zur Beendigung der Blutung abzugeben, entsprechend der Messung durch Standardkoagulationsassays.
Der Faktor VIII wird klassisch als die im normalen Blutplasma vorhandene Substanz definiert, die den Koagulationsmangel im Plasma, das aus Individuen mit Hämophilie A stammt, korrigiert. Die in vitro koagulationsfördernde Aktivität von gereinigten und teilweise gereinigten Formen des Faktors VIII wird zur Berechnung der Dosis des Faktors VIII für Infusionen in menschlichen Patienten verwendet und ist ein verlässlicher Indikator für die regenerierte Aktivität des Plasmen des Patienten und für die Korrektur des in vivo Blutungsmangels. Es wurden keine Diskrepanzen zwischen einem Standardassay der neuen Faktor VIII-Moleküle in vitro und ihrem Verhalten in dem Hunde-Infusionsmodell oder in menschlichen Patienten, gemäß Lusher, J. M. et al. 328 New Engl. J. Med. 328: 453–459; Pittman, D. D. et al. (1992) Blood 79: 389–397 und Brinkhous et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8752–8755, berichtet.
Normalerweise liegt der gewünschte Gehalt an Faktor VIII im Plasma, der in einem Patienten durch Verabreichung des hybriden oder Hybrid-äquivalenten Faktor VIII erreicht werden soll, im Bereich von 30–100% des normalen. In einer bevorzugten Art der Verabreichung des hybriden oder Hybrid-äquivalenten Faktors VIII wird die Zusammensetzung intravenös mit einer bevorzugten Dosierung im Bereich von 5 bis 50 Einheiten/kg Körpergewicht, bevorzugter im Bereich von 10–50 Einheiten/kg Körpergewicht und besonders bevorzugt mit einer Dosierung von 20–40 Einheiten/kg Körpergewicht gegeben, wobei die Frequenz der Zeitabstände im Bereich von ungefähr 8 bis 24 Stunden (bei schwer angegriffenen Hämophilen) liegt; und die Dauer der Behandlung in Tagen im Bereich von 1 bis 10 Tagen oder bis die Blutungsepisode überwunden ist, liegt. Siehe zum Beispiel Roberts, H. R. und M. R. Jones, „Hämophilia and Related Conditions-Congenital Deficiencies of rothrombin (Factor II, Factor V, and Factors VII to XII)" Kapitel 153, 1453–1474, 1460 in Hematology, Williams, W. J. et al. Hrsg. (1990). Patienten mit Inhibitoren können mehr hybriden oder Hybrid-äquivalenten Faktor VIII benötigen, oder Patienten können weniger hybriden oder Hybrid-äquivalenten Faktor VIII, aufgrund seiner höheren spezifischen Aktivität als der humane Faktor VIII oder der verringerten Antikörperreaktivität oder Immunogenität, benötigen. Wie bei der Behandlung mit humanem oder Schweine-Faktor VIII wird die Menge des mittels Infusion verabreichten hybriden oder Hybrid-äquivalenten Faktor VIII durch den Einstufen-Faktor VIII-Koagulationsassay definiert und in ausgewählten Fällen wird die in vivo Regeneration durch Messung des Faktors VIII in dem Plasma des Patienten nach der Infusion bestimmt. Es versteht sich von selbst, dass für jede spezielle Versuchsperson spezifische Dosierungstherapien über die Zeit hinweg gemäß dem individuellen Bedarf und dem professionellen Urteil der verabreichenden oder die Verabreichung beaufsichtigenden Person der Zusammensetzungen angepasst werden sollten und, dass die hier ausgeführten Konzentrationsbereiche nur beispielhaft sind und nicht beabsichtigen, den Rahmen oder die Praxis der beanspruchten Zusammensetzung zu beschränken.
Die Behandlung kann die Form einer einzelnen intravenösen Verabreichung der Zusammensetzung oder einer periodischen oder kontinuierlichen Verabreichung über einen ausgedehnten Zeitraum, entsprechend dem Bedarf, annehmen. Alternativ dazu, kann der hybride oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII subkutan oder oral mit Lipsomen in einer oder mehreren Dosen in variierenden Zeitabständen verabreicht werden.
Der hybride oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII kann ebenfalls zur Behandlung von unkontrolliertem Bluten aufgrund Faktor VIII-Mangel bei Hämophilen, die Antikörper gegen den humanen Faktor VIII entwickelt haben, verwendet werden. In diesem Fall ist die koagulationsfördernde Aktivität, die derjenigen des humanen oder Tier-Faktors VIII allein überlegen ist, nicht notwendig. Eine koagulationsfördernde Aktivität, die geringer als diejenige des humanen Faktors VIII ist (das heißt, geringer als 3.000 Einheiten/mg), wird nützlich sein, wenn diese Aktivität nicht durch Antikörper im Plasma des Patienten neutralisiert ist.
Es wurde hier gezeigt, dass Hybridfaktoren VIII und modifizierte Faktoren VIII sich in der spezifischen Aktivität von dem humanen Faktor VIII unterscheiden können. Hybride, Hybrid-äquivalente und modifizierte Faktor VIII-Proteine mit größerer prokoagulationsfördernder Aktivität im Vergleich zum humanen Faktor VIII sind zur Behandlung von Hämophilie verwendbar, weil niedrigere Dosierungen erforderlich sein werden, um den Faktor VIII-Mangel eines Patienten zu korrigieren. Hybride, Hybrid-äquivalente und modifizierte Faktoren VIII mit niedriger prokoagulierender Aktivität als der humane Faktor VIII sind ebenfalls für eine therapeutische Verwendung geeignet, vorausgesetzt, sie weisen mindestens 1% der spezifischen Aktivität im Vergleich zum normalen humanen Faktor VIII auf. Ein hybrider, Hybrid-äquivalenter oder modifizierter Faktor VIII der vorliegenden Erfindung mit prokoagulierener Aktivität wird daher so definiert, dass er mindestens 1% der spezifischen Aktivität des humanen Faktors VIII aufweist.
Das hybride oder Hybrid-äquivalente Faktor VIII-Molekül und die Verfahren zur Isolierung, Charakterisierung, Herstellung und seiner Verwendung, wie allgemein vorstehend beschrieben ist, wird weiter unter Bezugnahme auf die folgenden nicht einschränkenden Beispiele verständlich.
Beispiel 1: Assay des Schweine-Faktors VIII und des hybriden Mensch/Schwein Faktors VIII.
Der Schweine-Faktor VIII weist eine größere koagulationsfördernde Aktivität als der humane Faktor VIII, basierend auf der spezifischen Aktivität des Moleküls auf. Diese Ergebnisse sind in der Tabelle III im Beispiel 4 gezeigt. Diese Folgerung basiert auf der Verwendung geeigneter Standardkurven, die einen guten Vergleich des humanen Schweine-Faktors VIII gestatten. Koagulationsassays basieren auf der Fähigkeit des Faktors VIII die Koagulationszeit des aus einem Patienten mit Hämophilie A stammenden Plasmas zu verkürzen. Es wurden zwei Arten von Assays angewandt: der Einstufen- und der Zweistufen-Assay.
Bei dem Einstufen-Assay wurden 0,1 ml Hämophilie A-Plasma (George King Biomedical, Inc.) mit 0,1 ml aktiviertem teilweisen Thromboplastinreagenz (APTT) (Organon Teknika) und 0,01 ml Probe oder Standard, bestehend aus verdünntem mit Citrat versetzen humanen Plasma, während 5 Min bei 37°C in einem Wasserbad inkubiert. Nach der Inkubation wurde 0,1 ml 20 mM CaCl₂ zugegeben, und die Zeit für die Entwicklung eines Fibringerinnsels wurde durch visuelle Untersuchung bestimmt.
Eine Einheit des Faktors VIII ist als die Menge definiert, die in 1 ml mit Citrat versetztem normalen humanen Plasma vorhanden ist. Mit dem humanen Plasma als Standard wurde direkt die Aktivität des Schweine- und humanen Faktors VIII verglichen. Verdünnungen des Plasmastandards oder gereinigter Proteine wurden in 0,15 M NaCl, 0,02 M HEPES, pH-Wert 7,4 hergestellt. Die Standardkurve wurde basierend auf 3 oder 4 Verdünnungen des Plasmas, wobei die höchste Verdünnung 1/50 betrug, basierend auf der log₁₀ der Koagulationszeit, die gegen log₁₀ der Plasmakonzentration aufgetragen wird, was zu einer linearen Auftragung führt konstruiert. Die Einheiten des Faktors VIII in einer unbekannten Probe wurden durch Interpolation der Standardkurve bestimmt.
Der Einstufen-Assay ist auf die endogene Aktivierung des Faktors VIII durch Aktivatoren, die in dem Hämophilie A-Plasma gebildet werden, angewiesen, wohingegen der Zweistufen-Assay die prokoagulierende Aktivität des voraktivierten Faktors VIII misst. Bei dem Zweistufen-Assay wurden Proben, die den Faktor VIII, der mit Thrombin umgesetzt worden war, zur einer Mischung von aktiviertem partiellen Thromboplastin und humanem Hämophilie A-Plasma gegeben, die während 5 Min bei 37°C vorinkubiert worden war. Dann wurden die resultierenden Koagulationszeiten in Einheiten/ml, basierend auf derselben vorstehend beschriebenen humanen Standardkurve, umgewandelt. Die relative Aktivität in dem Zweistufen-Assay war höher als in dem Einstufen-Assay, weil der Faktor VIII voraktiviert worden war.
Beispiel 2: Charakterisierung des funktionalen Unterschieds zwischen humanem und Schweine-Faktor VIII.
Die Isolierung des vom Schweine- und humanen Plasma stammenden Faktors VIII und des humanen rekombinanten Faktors VIII ist in der Literatur in Fulcher, C. A. et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1648–1652; Toole et al. (1984) Nature 312: 342–347 (Genetics Institute); Gitschier et al. (1984) Nature 312: 326–330 (Genentech); Wood et al. (1984) Nature 312: 330.337 (Genentech); Vehar et al. Nature 312: 337–342 (Genentech); Fass et al. (982) Blood 59: 594; Toole et al. (986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5939–5942, beschrieben worden. Dies kann auf mehreren Wegen erreicht werden. Alle diese Präparate weisen eine ähnliche Zusammensetzung der Untereinheiten auf; obwohl es einen funktionalen Unterschied in der Stabilität zwischen humanem und Schweine-Faktor VIII gibt.
Zum Vergleich des humanen rekombinanten und Schweine-Faktors VIII wurden Präparate eines hochreinen humanen rekombinanten Faktors VIII (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) und Schweine-Faktors VIII [immungereinigt entsprechend der Beschreibung in Fass et al. (1982) Blood 59: 594] einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) über einer Mono Q^TM (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) Anionenaustauschsäule (Pharmacia, Inc) unterzogen. Die Absichten des Mono Q^TM HPLC-Schritts lagen in der Beseitigung kleinerer Verunreinigungen des Austauschs von humanem und Schweine-Faktor VIII in einen gemeinsamen Puffer für Vergleichszwecke. Glasfläschchen, die 1000–2000 Einheiten Faktor VIII enthielten, wurden mit 5 ml H₂O wiederhergestellt. Dann wurde HEPES (2 M bei pH-Wert 7,4) auf eine Endkonzentration von 0,02 M zugegeben. Der Faktor VIII wurde auf eine Mono Q^TM HR 5/5 Säule gegeben, die in 0,15 M NaCl, 0,02 M HEPES, 5 mM CaCl₂ bei einem pH-Wert von 7,4 (Puffer A zuzüglich 0,15 M NaCl) äquilibriert worden war, mit 10 ml Puffer A + 0,15 M NaCl gewaschen und mit 20 ml linearem Gradienten, 0,15 M bis 0,90 M NaCl in Puffer A mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/Min eluiert.
Zum Vergleich des humanen aus dem Plasma stammenden Faktors VIII (gereinigt durch Mono Q^TM HPLC) mit dem Schweine-Faktor VIII, wurde durch Immunoaffinität gereinigter aus dem Plasma stammender Schweine-Faktor VIII 1:4 mit HEPES, 5 mM CaCl₂, 0,01% Tween-80 bei einem pH-Wert von 7,4 verdünnt und einer Mono Q^TM HPLC unter denselben Bedingungen unterzogen, wie sie in dem vorangehenden Abschnitt für den humanen Faktor VIII beschrieben sind. Diese Verfahren für die Isolierung des humanen und Schweine-Faktors VIII sind für den Fachmann Standardverfahren.
Die Säulenfraktionen wurden bezüglich der Faktor VIII-Aktivität durch einen Einstufen-Koagulationsassay untersucht. Die mittleren Ergebnisse der Assays sind, ausgedrückt in Einheiten der Aktivität pro A₂₈₀ des Materials, in Tabelle II angegeben und weisen darauf hin, dass der Schweine-Faktor VIII eine Aktivität aufweist, die sechsmal so groß wie die des humanen Faktors VIII ist, wenn ein Einstufen-Assay verwendet wird.
Beispiel 3: Vergleich der Stabilität des humanen und Schweine-Faktors VIII.
Die Ergebnisse des Einstufen-Assays bezüglich des Faktors VIII reflektieren die Aktivierung des Faktors VIII zum Faktor VIIIa in der Probe und möglicherweise den Verlust an Aktivität des gebildeten Faktors VIIIa. Es wurde ein direkter Vergleich der Stabilität des humanen und Schweine-Faktors VIII durchgeführt. Proben von der Mono Q^TM HPLC (Pharmacia, Inc. Piscataway, N. J.) wurden auf dieselbe Konzentration und Pufferzusammensetzung verdünnt und mit Thrombin umgesetzt. Zu verschiedenen Zeiten wurden Proben für den Zweistufen-Koagulationsassay entfernt. Die Peakaktivität (bei 2 Min) war typischerweise 10 mal größer für den Schweine- als für den humanen Faktor VIIIa, und die Aktivitäten von sowohl dem Schweine- als auch hu manen Faktor VIIIa nahmen aufeinander folgend ab, wobei die Aktivität des humanen Faktors VIIIa schneller abnahm.
Im Allgemeinen waren Versuche zur Isolierung eines stabilen humanen Faktors VIIIa nicht erfolgreich, selbst, wenn Bedingungen verwendet wurden, die einen stabilen Schweine-Faktor VIIIa erzeugten. Um dies zu zeigen, wurde der mit Mono Q^TM HPLC gereinigte humane Faktor VIII mit Thrombin aktiviert und einer Mono S^TM Kationenaustausch (Pharmacia, Inc.)-HPLC unter Bedingungen unterzogen, die einen stabilen Schweine-Faktor VIIIa erzeugen, wie von Lollar et al. (1989) Biochemistry 28: 666 beschrieben wurde.
Der humane Faktor VIII, 43 μg/ml (0,2 μM) in 0,2 M NaCl, 0,01 M HEPES, 2,5 mM CaCl₂ bei einem pH-Wert von 7,4 in einem Volumen von insgesamt 10 ml wurde mit Thrombin (0,036 μM) während 10 Min umgesetzt, wobei zu diesem Zeitpunkt für eine irreversible Inaktivierung des Thrombins FPR-CH₂Cl D-Phenylpropylarginylchlormethylketon auf eine Konzentration von 0,2 μM zugegeben wurde. Dann wurde die Mischung 1:1 mit 40 mM 2-(N-Morpholin)ethansulfonsäure (MES), 5 mM CaCl₂ bei einem pH-Wert von 6,0 verdünnt und sie wurde mit 2 ml/Min auf eine Mono S^TM HR 5/5 HPLC-Säule (Pharmacia, Inc.) gegeben, die in 5 mM MES, 5 mM CaCl₂ bei einem pH-Wert von 6,0 (Puffer B) zuzüglich 0,1 M NaCl äquilibriert worden war. Der Faktor VIIIa wurde ohne Waschen der Säule mit einem 20 ml Gradient von 0,1 M NaCl bis 0,9 M NaCl in Puffer B mit 1 ml/Min eluiert.
In dem Zweistufen-Assay wurde die Fraktion mit koagulationsfördernder Aktivität unter diesen Bedingungen als einzelner Peak eluiert. Die spezifische Aktivität der Peakfraktion betrug näherungsweise 7.500 U/A₂₈₀. Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) des Mono S^TM-Faktor VIIIa-Peaks, gefolgt von Silberfärbung des Proteins offenbarte zwei Banden, die einem heterodimeren (A3-C1-C2/A1)-Derivat des Faktors VIII entsprachen. Obwohl das A2-Fragment durch die Silberfärbung unter diesen Bedingungen aufgrund seiner niedrigen Konzentration nicht identifiziert wurde, wurde es als ein in Spuren vorkommender Bestandteil durch ¹²⁵I-Markierung identifiziert.
Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit dem humanen Faktor VIII wies der durch Mono S^TM-HPLC isolierte Schweine-Faktor VIIIa unter denselben Bedingungen eine spezifische Aktivität von 1,6 × 10⁶ U/A₂₈₀ auf. Die Analyse des Schweine-Faktor VIIIa durch SDS-PAGE offenbarte 3 Fragmente, die den A1-, A2 und A3-C1-C2-Untereinheiten entsprachen, was zeigte, dass der Schweine-Faktor VIIIa drei Untereinheiten besitzt.
Die Ergebnisse der Mono S^TM-HPLC der humanen Thrombin-aktivierten Faktor VIII-Präparate bei einem pH-Wert von 6,0 wiesen darauf hin, dass der humane Faktor VIII unter Bedingungen, die einen stabilen Schweine-Faktor VIIIa ergeben, instabil ist. Obwohl Spuren von A2-Fragmenten in der Peakfraktion identifiziert wurden, war die Bestimmung, ob die koagulationsfördernde Aktivität aus kleinen Mengen des heterotrimeren Faktors VIIIa oder aus dem heterodimeren Faktor VIIIa, der eine geringe spezifische Aktivität aufweist, resultierte, allein aus diesem Verfahren jedoch nicht möglich.
Zum Lösen dieser Frage ist ein Weg zur Isolierung des humanen Faktors VIIIa bevor er seine A2-Untereinheit verliert, wünschenswert. Zu diesem Zweck wurde die Isolierung mit einem Verfahren ausgeführt, das die Erniedrigung des pH-Werts der Mono S^TM-Puffer auf einen pH-Wert von 5 betrifft. Der mit Mono Q^TM gereinigte humane Faktor VIII (0,5 mg) wurde mit H₂O verdünnt, um eine Endzusammensetzung von 0,25 mg/ml (1 μm) Faktor VIII in 0,25 M NaCl, 0,01 M HEPES, 2,5 mM CaCl₂, 0,005% Tween-80 bei einem pH-Wert von 7,4 (Gesamtvolumen 7,0 ml) zu ergeben. Thrombin wurde auf eine Endkonzentration von 0,072 μm zugegeben und man ließ es 3 Min reagieren. Dann wurde Thrombin mit FPR-CH₂Cl (0,2 μm) inaktiviert. Die Mischung wurde dann 1:1 mit 40 mM Natriumacetat, 5 mM CaCl₂, 0,01% Tween-80 bei einem pH-Wert von 5,0 verdünnt und mit 2 ml/min auf eine Mono S^TM HR 5/5 HPLC-Säule gegeben, die in 0,1 M Natriumacetat, 5 mM CaCl₂, 0,01% Tween-80 bei einem pH-Wert von 5,0 zuzüglich 0,1 M NaCl äquilibriert worden war. Der Faktor VIIIa wurde ohne Waschen der Säule mit einem 20 ml Gradienten von 0,1 M NaCl bis 1,0 M NaCl in demselben Puffer mit 1 ml/Min eluiert. Dies führte zu der Regeneration der koagulationsfördernden Aktivität in einem Peak, der nachweisbare Mengen des A2-Fragments enthielt, wie durch SDS-PAGE und Silberfärbung gezeigt wurde. Die spezifische Aktivität der Peakfraktion war zehnmal so groß, wie die bei einem pH-Wert von 6,0 regenerierte Fraktion (75.000 U/A₂₈₀ gegenüber 7.500 U/A₂₈₀). Im Gegensatz zu dem bei einem pH-Wert von 6,0 isolierten Schweine-Faktor VIIIa, der unbegrenzt bei 4°C stabil ist, nahm jedoch die Aktivität des humanen Faktors VIIIa gleichmäßig über einen Zeitraum von mehreren Stunden nach der Elution von der Mono S^TM ab. Zusätzlich beträgt die spezifische Aktivität des Faktors VIIIa, der bei einem pH-Wert von 5,0 gereinigt und sofort untersucht wurde, nur 5% von derjenigen des Schweine-Faktors VIIIa, was auf eine beträchtliche Dissoziation hinweist, die vor dem Assay stattfand.
Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl der humane als auch der Schweine-Faktor VIIIa aus drei Untereinheiten (A1, A2 und A3-C1-C2) zusammengesetzt sind. Die Dissoziation der A2-Untereinheit ist für den Verlust an Aktivität von sowohl dem humanen als auch Schweine-Faktor VIIIa unter bestimmten Bedingungen, wie zum Beispiel die physiologische Ionenstärke, pH-Wert und Konzentration, verantwortlich. Die relative Stabilität des Schweine-Faktors VIIIa unter bestimmten Bedingungen resultiert aus der stärkeren Assoziation der A2-Untereinheit.
Beispiel 4: Herstellung des hybriden Mensch/Schwein Faktors VIII durch Rekonstitution mit Untereinheiten.
Die leichten Ketten des Schweine-Faktors VIII und schweren Ketten des Faktors VIII wurden folgendermaßen isoliert. Eine 0,5 M EDTA-Lösung bei einem pH-Wert von 7,4 wurde zu mit Mono Q^TM gereinigtem Schweine-Faktor VIII auf eine Endkonzentration von 0,05 M gegeben und man ließ sie bei Raumtemperatur während 18–24 h stehen. Ein gleiches Volumen von 10 mM Histidin-Cl, 10 mM EDTA, 0,2% v/v Tween-80 bei einem pH-Wert von 6,0 (Puffer B) wurde zugegeben und die Lösung wurde mit 1 ml/Min auf eine Mono S^TM HR 5/5-Säule gegeben, die vorher in Puffer A zuzüglich 0,25 M NaCl äquilibriert worden war. Entsprechend der Beurteilung mit SDS-PAGE banden die schweren Ketten des Faktors VIII nicht das Harz. Die leichte Kette des Faktors VIII wurde mit einem linearen 20 ml, 0,1–0,7 M NaCl Gradienten in Puffer A mit 1 ml/Min eluiert und war gemäß SDS-PAGE homogen. Die schweren Ketten des Faktors VIII wurden durch Mono Q^TM-HPLC (Pharmacia, Inc. Piscataway, N. J.) folgendermaßen isoliert. Die schweren Ketten des Faktors VIII adsorbieren nicht an Mono S^TM während der Reinigung der leichten Ketten des Faktors VIII. Das durchgelaufene Material, das die schweren Ketten des Faktors VIII enthielt, wurde auf einen pH-Wert von 7,2 durch Zugabe von 0,5 M HEPES-Puffer, pH-Wert 7,4 eingestellt und auf eine Mono Q^TM HR 5/5 HPLC-Säule (Pharmacia, Inc.) gegeben, die in 0,1 M NaCl, 0,02 M HEPES, 0,01% Tween-80 bei einem pH-Wert von 7,4 äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 10 ml dieses Puffers gewaschen und die schweren Ketten des Faktors VIII wurde mit einem 20 ml 0,1–1,0 M NaCl Gradienten in diesem Puffer eluiert. Die humanen leichten Ketten und schweren Ketten wurden auf dieselbe Weise isoliert.
Die leichten und schweren Ketten von Mensch und Schwein wurden entsprechend den folgenden Schritten rekonstituiert. Zehn μl leichte Kette des humanen oder Schweine-Faktors VIII, 100 μg/ml wurden gemischt in 1 M NaCl, 0,02 HEPES, 5 mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH-Wert von 7,4 mit (1) 25 μl heterologer schwerer Kette, 60 μl/ml in demselben Puffer; (2) 10 μl 0,02 M HEPES, 0,01% Tween-80, pH-Wert 7,4; (3)5 μl 0,6 M CaCl₂ während 14 h bei Raumtemperatur. Die Mischung wurde auf ¼ mit 0,02 M MES, 0,01% Tween-80, 5 mM CaCl₂, pH-Wert 6 verdünnt und auf ein Mono S^TM HR 5/5, das in 0,1 M NaCl, 0,02 M MES, 0,01% Tween-80, 5 mM CaCl₂, pH-Wert 6,0 äquilibriert worden war, gegeben. Ein 20 ml Gradient von 0,1–1,0 M NaCl in demselben Puffer ließ man mit 1 ml/Min durchlaufen und Fraktionen mit 0,5 ml wurden gesammelt. Die Extinktion der Fraktionen wurde bei 280 nm abgelesen und die Fraktionen wurden mittels der Extinktion bezüglich der Faktor VIII-Aktivität durch den Einstufen-Koagulationsassay untersucht. Schwere Ketten waren im Überschuß vorhanden, weil die freie leichte Kette (die nicht mit der schweren Kette assoziiert ist) ebenfalls an Mono S^TM bindet; überschüssige schwere Ketten stellen sicher, dass freie leichte Ketten kein Teil des Präparats sind. Die Rekonstitutionsexperimente, auf die eine Reinigung durch Mono S^TM-HPLC folgte, wurden mit allen vier möglichen Kombinationen der Ketten durchgeführt: humane leichte Kette/humane schwere Kette, humane leichte Kette/Schweine-schwere Kette, Schweine-leichte Kette/Schweine-schwere Kette, Schweine-leichte Kette/humane schwere Kette.
Tabelle III zeigt, dass die humane leichte Kette/Schweine-schwere Kette des Faktors VIII eine Aktivität aufweist, die mit derjenigen des nativen Schweine-Faktors VIII vergleichbar ist (Tabelle II), was darauf hinweist, dass Strukturelemente in der Schweine-schweren Kette für die erhöhte koagulationsfördernde Aktivität des Schweine-Faktors VIII im Vergleich zum humanen Faktor VIII verantwortlich ist.
Beispiel 5: Herstellung eines aktiven hybriden Mensch/Schwein Faktors VIII durch Rekonstitution mit Domänen.
Das Schweine-A1/A3-C1-C2-Dimer, die Schweine-A2-Domäne, das humane A1/A3-C1-C2-Dimer und die humane A2-Domäne wurden jeweils aus dem Blut vom Schwein oder Mensch, entsprechend dem in Lollar et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 (33): 23652–23657 beschriebenen Verfahren, isoliert. Zum Beispiel wurde zur Isolierung des Schweine-A1/A3-C1-C2-Dimers der pH-Wert von 6,0 des Schweine-Faktors VIIIa (140 μg) auf einen pH-Wert von 8,0 durch Zugabe von 5 N NaOH während 30 Minuten erhöht, wobei die Dissoziation der A2-Domäne und eine Inaktivierung von 95% durch den Koagulationsassay bewirkt wurden. Die Mischung wurde 1:8 mit Puffer B (20 mM HEPES, 5 mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH-Wert 7,4) verdünnt und auf eine Mono S-Säule, die in Puffer B äquilibriert worden war, gegeben. Das A1/A3-C1-C2-Dimer eluierte als einzelner scharfer Peak bei näherungsweise 0,4 M NaCl unter Verwendung eines 0,1–1,0 M NaCl Gradienten in Puffer B. Zur Isolierung der Schweine-A2-Domäne wurde der Schweine-Faktor VIIIa entsprechend dem Verfahren von Lollar et al (1989) Biochem. 28: 666–674, ausgehend von 0,64 mg Faktor VIII, hergestellt. Freie Schweine-A2-Domäne wurde als Nebenkomponente (50 μg) bei 0,3 M NaCl in dem Mono S^TM-Chromatogramm isoliert.
Hybride Mensch/Schwein Faktor VIII-Moleküle wurde aus den Dimeren und Domänen folgendermaßen rekonstituiert. Die Konzentrationen und Pufferbedingungen für die gereinigten Komponenten waren wie folgt: Schweine-A2, 0,63 μM in Puffer A (5 mM MES; 5 mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH-Wert 6,0) zuzüglich 0,3 M NaCl; Schweine A1/A3-C1-C2, 0,27 μM in Puffer B zuzüglich 0,4 M NaCl, pH-Wert 7,4, humane A2, 1 μM in 0,3 M NaCl, 10 mM Histidin-HCl, 5 mM CaCl₂, 0,01% Tween-20, pH-Wert 6,0; humane A1/A3-C1-C2, 0,18 μM in 0,5 M NaCl, 10 mM Histidin-Cl, 2,5 mM CaCl₂, 0,1% Tween-20, pH-Wert 6,0. Rekonstitutionsexperimente wurde durch Mischen gleicher Volumina der A2-Domäne und des A1/A3-C1-C2-Dimers ausgeführt. Bei Mischexperimenten mit Schweine-A1/A3-C1-C2-Dimer wurde durch Zugabe von 0,5 M MES, pH-Wert 6,0 auf 70 ml der pH-Wert auf 6,0 erniedrigt.
Die koagulationsfördernden Aktivitäten aller vier möglichen Hybridfaktor VIIIa-Moleküle – [pA2/(hA1/A3-C1-C2)], [hA2/(pA1/A3-C1-C2)], [pA2/(pA1/pA3-C1-C2)] und [hA2/(hA1/A3-C1-C2)] – wurden durch einen Zweistufen-Koagulationsassay zu verschiedenen Zeitpunkten erhalten.
Die Erzeugung der Aktivität nach dem Mischen der A2-Domänen und A1/A3-C1-C2-Dimeren war nach einer Stunde nahezu vollständig und war während mindestens 24 Stunden bei 37°C stabil. Tabelle IV zeigt die Aktivität der rekonstituierten Hybridfaktor VIIIa-Moleküle, wenn sie nach 1 Stunde untersucht wurden. Der Zweistufen-Assay, durch den die spezifischen Aktivitäten der Faktor VIIIa-Moleküle erhalten wurden, unterscheidet sich von dem Einstufen-Assay und die Werte können nicht mit den Aktivitätswerten der Faktor VIII-Moleküle, die durch eine Einstufen-Assay erhalten werden, verglichen werden.
Tabelle IV zeigt, dass die größte Aktivität von dem Schweine-A2-Domäne/humanes A1/A3-C1-C2-Dimer, gefolgt von dem Schweine-A2-Domäne/Schweine-A1/A3-C1-C2-Dimer gezeigt wird. Daher wurde bei Mischung der A2-Domäne des Schweine-Faktors VIIIa mit dem A1/A3-C1-C2-Dimer des humanen Faktors VIIIa koagulationsfördernde Aktivität erhalten. Weiterhin wurde bei Mischung der A2-Domäne des humanen Faktors VIIIa mit dem A1/A3-C1-C2-Dimer des Schweine-Faktors VIIIa koagulationsfördernde Aktivität erhalten. Die A2-, A1- und A3-C1-C3-Regionen weisen selbst keine koagulationsfördernde Aktivität auf.
Beispiel 6: Isolierung und Sequenzierung der A2-Domäne des Schweine-Faktors VIII.
Nur die Nukleotidsequenz, die die B-Domäne und einen Teil der A2-Domäne des Schweine-Faktors VIII kodiert, ist früher sequenziert worden [Toole et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5939–5942]. Hier werden die cDNA und vorhergesagten Aminosäuresequenzen (SEQ ID NR: 3 beziehungsweise 4) für die gesamte Schweine-Faktor VIII-A2-Domäne offenbart.
Die Schweine-Faktor VIII-A2-Domäne wurde durch Umkehrtranskription der gesamten RNA der Schweinemilz und PCR-Amplifikation kloniert, wobei degenerierte Primer, basierend auf der bekannten humanen Faktor VIII-cDNA-Sequenz, und ein exakter Schweine-Primer, basierend auf einem Teil der Schweine-Faktor VIII-Sequenz, verwendet wurden. Ein 1 kb PCR-Produkt wurde isoliert und durch Einschub in einen Bluescript^TM (Stratagene)-Phagemidvektor amplifiziert.
Die Schweine-A2-Domäne wurde durch Didesoxysequenzierung vollständig sequenziert. Die cDNA und vorhergesagten Aminosäuresequenzen sind in den SEQ ID NR: 3 beziehungsweise 4 beschrieben.
Beispiel 7: Herstellung des rekombinanten hybriden Mensch/Tier Faktors VIII
Die Nukleotid- und vorhergesagten Aminosäuresequenzen (SEQ ID NR: 1 beziehungsweise 2) des humanen Faktors VIII sind in der Literatur beschrieben worden (Toole et al. (984) Nature 312: 342–347 (Genetics Institute); Gitschier et al. Nature 312: 326–330 (Genentech); Wood et al. (1984) Nature 312: 330–337 (Genentech); Vehar et al. Nature 312: 337–342 (Genentech)].
Die Herstellung des rekombinanten hybriden Mensch/Tier Faktors VIII erfordert, dass eine Region der humanen Faktor VIII-cDNA (Biogen Corp.) entfernt wird und die Tier-cDNA-Sequenz, die Sequenzidentität aufweist, eingeschoben wird. Danach wird die Hybrid-cDNA in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert. Als Beispiel dafür wurden Hybridfaktor VIII-cDNAs geklont, in denen ein Teil oder die gesamte Schweine-A2-Domäne für die entsprechenden humanen A2-Sequenzen substituiert waren. Anfänglich wurde aus der gesamten cDNA-Sequenz, die der A2-Domäne des humanen Faktors VIII entspricht, und dann aus einem kleineren Teil der A2-Domäne durch Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese, die für den Fachmann ein allgemein bekanntes Verfahren ist (siehe zum Beispiel Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Kapitel 15, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1989) eine herausgehende Schleife gebildet. Die Schritte waren wie folgt.
Materialien.
Methoxycarbonyl-D-cyclohexylglycyl-glycylarginin-p-nitroanilid (Spectrozyme^TM Xa) und Anti-Faktor VIII-monoklonale Antikörper ESH4 und ESH8 wurde von American Diagnostica (Greenwich, CT) bezogen. Unilamellare Phosphatidylcholin/Phosphatidylserin (75/25, w/w)-Vesikel wurden gemäß dem Verfahren von Barenholtz, Y. et al., 16 Biochemistry 2806–2810 (1977)) hergestellt. Rekombinantes Desulfathirudin wurde von Dr. R. B. Wallis, Ciba-Geigy Pharmaceuticals (Cerritos, CA) erhalten. Die Schweine-Faktoren IXa, X, Xa und Thrombin wurden gemäß den Verfahren von Lollar et al. (1984) Blood 63: 1303–1306, und Duffy, E. J. et al. (1992) J. Biol. Chem. 207: 7621–7827 isoliert. Albuminfreier reiner rekombinanter humaner Faktor VIII wurde von Baxter-Biotech (Deerfield, IL) erhalten.
Klonierung der Schweine-Faktor VIII-A2-Domäne.
Die die Schweine-A2-Domäne kodierende cDNA wurde nach einer PCR der umgekehrt transkriptierten Schweinemilz-mRNA und Isolierung, entsprechend der Beschreibung von Chomczyneki et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 156–159, erhalten. Die cDNA wurde unter Verwendung des erster Strang-cDNA-Synthesekits mit zufälligen Hexameren als Primern (Pharmacia, Piscataway, N. J.) hergestellt. Die PCR wurde unter Verwendung eines 5'-terminalen degenerierten Primers 5' AARCAYCCNAARACNTGGG 3' (SEQ ID NR: 1), basierend auf der bekannten eingeschränkten Schweine-A2-Aminosäuresequenz, und eines 3'-terminalen exakten Primers, 5'-GCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTC 3' (SEQ ID NR: 12), basierend auf der bekannten Schweine-DNA-Sequenz unmittelbar 3' bezüglich der Schweine-A2-Domäne, ausgeführt. Diese Oligonukleotide entsprechend den Nukleotiden 1186–1203 und 2289–2313 in der humanen Sequenz (SEQ ID NR: 1). Die Amplifikation wurde für 35 Zyklen (1 Minute 94°C, 2 Minuten 50°C, 2 Minuten 72°C) unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase (Promega Corp., Madison, WI) ausgeführt. Das 1,1-Kilobasen amplifizierte Fragment wurde in pBluescript II KS-(Stratagene) an der EcoRV-Stelle unter Verwendung des T-Vektor-Verfahrens, entsprechend der Beschreibung von Murchuk, D. et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 1154, kloniert. Escherichia coli XL1-Blue-kompetente Zellen wurde transformiert und Plasmid-DNA wurde isoliert. Eine Sequenzierung wurde in beide Richtungen unter Verwendung der Sequenase^TM-Version 2.0 (U.S. Biochemical Corp., eine Abteilung der Amersham LIfeScience, Inc., Arlington Hts, IL) ausgeführt. Diese Sequenz wurde durch eine identische Sequenz bestätigt, die durch direkte Sequenzierung des PCR-Produkts aus einer unabhängigen Umkehrtranskription von Milz-RNA aus demselben Schwein erhalten wurde (CircumVent^TM, New England Biolabs, Beverly, MA). Die Region, die das Epitop für den Autoantikörper RC enthielt, wurde als 373–536 im humanen Faktor VIII (SEQ ID NR: 2) identifiziert.
Aufbau und Expression der hybriden Mensch/Schwein Faktor VIII-cDNA.
Der B-domänenfreie humane Faktor VIII (HB^– von Biogen, Inc. Cambridge, MA), dem die Sequenzen fehlen, die die Aminosäurereste 741–1648 (SEQ ID NR: 2) kodieren, wurde als Ausgangsmaterial zur Konstruktion eines hybriden Mensch/Schwein Faktors VIII verwendet. HB^– wurde in den Expressionsvektor ReNeo kloniert. Zur Vereinfachung der Manipulation wurde die cDNA für den Faktor VIII als XhoI/HpaI-Fragment aus ReNeo isoliert und in den mit XhoI/EcoRV verdauten pBlueScript II KS kloniert. Ein Oligonukleotid, 5' CCTTCCTTTATCCAAATACGTAGATCAAGAGGAAATTGAC 3' (SEQ ID NR: 7) wurde in einer ortsspezifischen Mutagenesereaktion unter Verwendung von Uracil enthaltender Phagen-DNA, entsprechend der Beschreibung von Kunkel, T. A. et al. (1991) Meth. Enzymol 204: 125–139, verwendet, um gleichzeitig mit der humanen A2-Sequenz (Nukleotide 1169–2304 in SEQ ID NR: 1) eine herausgehende Schleife zu bilden und eine SnaBI-Restriktionsstelle einzuführen. Der A2-domänenfreie humane Faktor VIII, der das Plasmid enthielt, wurde mit SnaBI, gefolgt von Addition der ClaI-Linker, verdaut. Die Schweine-A2-Domäne wurde dann durch PCR unter Verwendung des phosphorylierten 5'-Primers 5' GTAGCGTTGCCAAGAAGCACCCTAAGACG 3' (SEQ ID NR: 8) beziehungsweise des 3'-Primers 5' GAAGAGTAGTACGAGTTATTTCTCTGGGTTCAATGAC 3' (SEQ ID NR: 9) amplifiziert. ClaI-Linker wurden zu dem PCR-Produkt, gefolgt von Ligation in den den humanen Faktor VIII enthaltenden Vektor, gegeben. Die A1/A2- und A2/A3-Verbindungsstellen wurden zur Wiederherstellung der genauen Thrombinspaltung und der flankierenden Sequenzen durch ortsspezifische Mutagenese korrigiert, wobei das in der SEQ ID NR: 8 gezeigte Oligonukleotid und die Nukleotide 1–22 (5' GAA ... TTC in SEQ ID NR: 9) zur Korrektur der 5'- beziehungsweise 3'-teminalen Verbindungsstellen verwendet wurden. In dem resultierenden Konstrukt, bezeichnet mit HP1 war die humane A2-Domäne exakt mit der Schweine-A2-Domäne substituiert. Ein vorläufiges Produkt enthielt ein ungewolltes Thymin an der A1-A2-Verbindungsstelle als Ergebnis der PCR-Amplifikation der Schweine-A2-Domäne. Aus dieser einzelnen Base wurde durch Verwendung des mutagenen Oligonukleotids 5' CCTTTATCCAAATACGTAGCGTTTGCCAAGAAG 3' (SEQ ID NR: 10) eine herausgehende Schleife gebildet. Die resultierende hybride Nukleotidsequenz ko dierte den aktiven Faktor VIII, der die humane A1-, Schweine-A2- und humane A3-, C1- und C2-Domäne aufwies.
Eine Region, die 63% der Schweine-NH₂-terminalen A2-Domäne enthielt, die das mutmaßliche A2-Epitop umfasst, wurde für die homologe humane Sequenz der B-domänenfreien cDNA durch Austausch von SpeI/BamHI-Fragmenten zwischen den pBluescript-Plasmiden substituiert, die den humanen Faktor VIII und die humane/Schweine-A2-Faktor VIII-cDNA enthielten. Die Sequenz wurde durch Sequenzierung der A2-Domäne und Spleißstellen bestätigt. Schließlich wurde ein SpeI/ApaI-Fragment, das die gesamte A2-Sequenz enthielt, für die entsprechende Sequenz in HB^– unter Herstellung des HP2-Konstrukts substituiert.
Eine vorläufige Expression von HB^– und HP2 in COS-7-Zellen wurde nach DEAE-Dextran-vermittelter DNA-Transfektion, entsprechend der Beschreibung von Seldon, R. F., in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M., et al., Hrsg.), Seiten 9.21–9.26, Wiley Interscience, N.Y. getestet. Nach Bestätigung der Expression des aktiven Faktors VIII und der Durchführung vorläufiger Antikörper-Inhibierungsuntersuchungen wurde HB^– und HP2-DNA stabil in Nierenzellen des jungen Hamsters unter Verwendung von Lipsom-vermittelter Transfektion transfiziert (Lipofectin^® Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). Plasmid-enthaltende Klone wurden bezüglich der G418-Resistenz in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium-F12, 10% fötalem Kälberserum (DMEM-F12/10% fötales Kälberserum), das 400 μg/ml G418 enthielt, ausgewählt, worauf eine Aufbewahrung in DMEM-F12/10% fötales Kälberserum, das 100 μg/ml G418 enthielt, folgte. Die Kolonien, die eine maximale Expression der HB^– und HP2 Faktor VIII-Aktivität zeigten, wurden durch Ringklonierung ausgewählt und für eine weitere Charakterisierung vergrößert.
Die HB^– und HP2 Faktor VIII-Expression wurde durch einen plasmafreien Faktor VIII-Assay, einen Einstufen-Koagulationsassay und einen enzymgekoppelten Immunadsorptionsassay unter Verwendung des rekombinanten humanen Faktors VIII als Standard verglichen. Für HB^– beziehungsweise HP2 wurden spezifische koagulationsfördernde Aktivitäten von 2600 und 2580 Einheiten/mg erhalten. HB^– beziehungsweise HP2 erzeugten 1,2 und 1,4 Einheiten/ml/48 Stunden/10⁷ Zellen. Dies ist identisch mit dem des Konstrukts vom Wildtyp (2.600 ± 200 Einheiten/mg). Die spezi fischen Aktivitäten von HB^– und HP2 waren in dem plasmafreien Faktor VIII-Assay nicht voneinander zu unterscheiden.
Die biologische Aktivität des rekombinanten hybriden Mensch/Tier und äquivalenten Faktors VIII mit Substitutionen der A1-, A2-, A3-, C1- und/oder C2-Domäne kann anfänglich durch Verwendung eines transienten Säuger-Expressionssystems mit COS-Zellen bewertet werden. Die hybride Mensch/Tier und äquivalente cDNA kann in COS-Zellen transfiziert werden und Überstände können bezüglich der Faktor VIII-Aktivität durch Verwendung eines Einstufen- und Zweistufen-Koagulationsassays, entsprechend der vorstehenden Beschreibung, analysiert werden. Zusätzlich kann die Faktor VIII-Aktivität durch Verwendung eines chromogenen Substrat-Assays, der empfindlicher ist und die Analyse einer größeren Zahl von Proben gestattet, gemessen werden. Ähnliche Assays sind Standardassays für die Faktor VIII-Aktivität [Wood et al. (1984) Nature 312: 330–337; Toole et al. (1984) Nature 312: 342–347]. Die Expression des rekombinanten Faktors VIII in COS-Zellen ist ebenfalls ein Standardverfahren [Toole et al. (1984) Nature 312: 342–347; Pittman et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2429–2433].
Die cDNA des humanen Faktors VIII wird als Ausgangsmaterial für die hier beschriebenen rekombinanten Moleküle verwendet, die in COS-Zellen exprimiert wurden, wobei sich ein Produkt mit biologischer Aktivität ergab. Diese Material, wie es vorstehend beschrieben ist, kann als Standard zum Vergleich hybrider Mensch/Tier Faktor VIII-Moleküle verwendet werden. Die Aktivität in den Assays wird zu einer spezifischen Aktivität für einen geeigneten Vergleich der Hybridmoleküle umgewandelt. Dafür ist eine Messung der Masse des Faktors VIII, der von den Zellen erzeugt wird, notwendig und dies kann mit einem Immunoassay mit gereinigtem humanen und/oder Tier-Faktor VIII als Standard durchgeführt werden. Immunoassays für den Faktor VIII sind für den Fachmann Routineverfahren [siehe zum Beispiel Lollar et al. (1988) Blood 71: 137–143].
Beispiel 8: Bestimmung der inhibitorischen Aktivität im hybriden Mensch/Tier und äquivalenten Faktor VIII.
Sequenzen des humanen und Tier-Faktors VIII, von denen wahrscheinlich ist, dass sie Epitope betreffen (das heißt Erkennungsstellen für inhibitorische Antikörper, die mit dem Faktor VIII reagieren), können unter Verwendung von Routineverfahren, zum Beispiel durch Verwendung eines Assays mit Antikörpern gegen Faktor VIII, kombiniert mit ortsspezifischen Mutagenesetechniken, wie zum Beispiel dem Spleißen durch Überlappungsverlängerungsverfahren (SOE), wie nachstehend gezeigt ist, bestimmt werden. Sequenzen des Tier-Faktors VIII, die im Vergleich zu entsprechenden antigenen humanen Sequenzen nicht antigen sind, können identifiziert werden und Substitutionen können zum Einschub von Tiersequenzen und zur Deletion humaner Sequenzen gemäß Standard-DNA-Rekombinationsverfahren, durchgeführt werden. Sequenzen von Aminosäuren, wie zum Beispiel Alaninreste mit keiner bekannten Sequenzidentität bezüglich des Faktors VIIII, können ebenfalls durch Standard-DNA-Rekombinationsverfahren oder durch Alanin-Scanning-Mutagenese substituiert werden. Der Schweine-Faktor VIII reagiert weniger als der humane Faktor VIII mit einigen inhibitorischen Antikörpern; dies liefert eine Basis für eine gegenwärtige Therapie für Patienten mit Inhibitoren. Nach der Herstellung der rekombinanten Hybride können sie in vitro bezüglich der Reaktivität mit Routineassays, einschließlich des Bethesda-Inhibitorassays, getestet werden. Diejenigen Konstrukte, die weniger reaktiv als der native humane Faktor VIII und der native Tier-Faktor VIII sind, sind Kandidaten für eine Austauschtherapie.
Es wird angenommen, dass die Epitope, gegen die die meisten, wenn nicht alle inhibitorischen Antikörper, die mit dem humanen Faktor VIII reagieren können, gerichtet sind, sich in zwei Regionen in dem humanen Faktor VIII-Molekül mit 2332 Aminosäuren befinden, in der A2-Domäne (Aminosäurereste 373–740) und C2-Domäne (Aminosäurereste 2173–2332, wobei beide Sequenzen in SEQ ID NR: 2 gezeigt sind). Das A2-Epitop wurde durch Herstellung eines rekombinanten hybriden Mensch-Schwein Faktor VIII-Moleküls eliminiert, in dem ein Teil der humanen A2-Domäne durch die Schweine-Sequenz, die eine Sequenzidentität mit der ersetzten humanen Aminosäuresequenz aufweist, ersetzt wurde. Dies wurde, wie in Beispiel 7 beschrieben ist, durch Klonierung der Schweine-A2-Domäne mit Standardtechniken der Molekularbiologie und anschließendem Schneiden und Spleißen innerhalb der A2-Domäne unter Verwendung von Restriktionsstellen erreicht. In dem mit HP2 bezeichneten resultierenden Konstrukt wurden die Reste 373–604 (SEQ ID NR: 4) des Schweine-Faktors VIII in die humane A2-Domäne substituiert. HP2 wurde bezüglich der Immunreaktivität mit anti-humanen Faktor VIII-Antikörpern unter Verwendung der folgenden Verfahren untersucht.
Enzymgekoppelter Immunadsorptionsassay für den Faktor VIII
Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit 0,15 ml 6 μg/ml ESH4, ein humaner Faktor VIII leichte Kette-Antikörper beschichtet und über Nacht inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Platte mit H₂O wurden die Vertiefungen während 1 Stunde mit 0,15 M NaCl, 10 mM Natriumphosphat, 0,05% Tween-20, 0,05% fettfreier Trockenmilch, 0,05% Natriumazid, pH-Wert 7,4 blockiert. Zur Erhöhung der Empfindlichkeit wurden die den Faktor VIII enthaltenden Proben mit 30 nM Thrombin während 15 Minuten aktiviert. Dann wurde Desulfathirudin mit 100 nM zur Inhibierung von Thrombin zugegeben. Die Platte wurde wiederum gewaschen und 0,1 ml der Probe oder reiner rekombinanter humaner Faktor VIII (10–600 ng/ml), der als Standard verwendet wurde, wurde zugegeben. Nach Inkubation während 2 Stunden wurde die Platte gewaschen und 0,1 ml biotinylierter ESH8, ein weiterer Faktor VIII leichte Kette-Antikörper, wurde zu jeder Vertiefung gegeben. ESH8 wurde unter Verwendung des Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamid)hexanoat-Biotinylierungskits von Pierce biotinyliert. Nach Inkubation während 1 Stunde wurde die Platte gewaschen und 0,1 ml Streptavidin-alkalische Phosphatase wurde zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platte wurde unter Verwendung des alkalische Phosphatasesubstrat-Reagenzkits von Bio-Rad entwickelt und die resultierende Extinktion wurde für jede Vertiefung unter Verwendung eines Vmax-Mikrotiterplattenlesers (Molecular Devices, Inc., Sunnyville, CA) bei 405 nm bestimmt. Unbekannte Konzentrationen an Faktor VIII wurden aus dem linearen Teil der Standardkurve für den Faktor VIII bestimmt.
Faktor VIII-Assays.
HB^– und HP2-Faktor VIII wurden in einem Einstufen-Koagulationsassay, der entsprechend der vorstehenden Beschreibung durchgeführt wurde [Bowie, E. J. W. und C. A. Owen, in Disorders of Hemostasis (Ratnoff und Forbes, Hrsg.) Seiten 43–72, Grunn & Stratton, Inc., Orlando, FL (1984)] oder durch einen plasmafreien Assay, wie folgt, gemessen. HB^– und HP2 Faktor VIII wurden durch 40 nM Thrombin in 0,15 M NaCl, 20 nM HEPES, 5 mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH-Wert 7,4 in Gegenwart von 10 nM Faktor IXa, 425 nM Faktor X und 50 μM unilamelaren Phosphatidylserin/Phosphatidylcholin (25/75, w/w)-Vesikeln aktiviert. Nach 5 Minuten wurde die Reaktion mit 0,05 M EDTA und 100 nM rekombinantem Desulfathirudin gestoppt und der resultierende Faktor Xa wurde durch einen chromogenen Substratassay, gemäß dem Verfahren von Hill-Eubanks et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 17854–17858, gemessen. Unter diesen Bedingungen war die Menge an gebildetem Faktor Xa linear proportional zu der Ausgangskonzentration des Faktors VIII, gemäß der Beurteilung durch Verwendung von gereinigtem rekombinanten humanen Faktor VIII (Baxter Biotech, Deerfield, IL) als Standard.
Vor dem Koagulationsassay wurden der HB^– und HP2 Faktor VIII durch Heparin-Sepharose^TM-Chromatographie aus einem während 48 Stunden konditionierten Medium auf 10–15 Einheiten/ml eingeengt. HB^– oder HP2 Faktor VIII wurden zu Hämophilie A-Plasma (George King Biomedical) auf eine Endkonzentration von 1 Einheit/ml gegeben. Inhibitortiter in RC- oder MR-Plasma oder eine Stammlösung mAb 413 IgG (4 μM) wurden durch den Bethesda-Assay, entsprechend der Beschreibung von Kasper, C. K. et al. (1975) Thromb. Diath. Haemorrh 34: 869–872 gemessen. Inhibitor-IgG wurde entsprechend der Beschreibung von Leyte, A. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 740–746 hergestellt.
HP2 reagiert nicht mit Anti-A2-Antikörpern. Daher müssen die Reste 373–603 ein Epitop für Anti-A2-Antikörper enthalten.
Herstellung des hybriden Mensch-Schwein Faktors VIII und Assay durch Spleißen durch Überlappungsverlängerung (SOE)
Mehrere verschiedene prokoagulationsfördernde rekombinante hybride Mensch/Schwein Faktor VIII B-domänenfreie Moleküle mit Substitutionen von Schweine-Aminosäure in der humanen A2-Region sind zur weiteren Einengung des A2-Epitops hergestellt worden. Neben Restriktionsstellentechniken sind das „Spleißen durch Überlappungsverlängerungs-"Verfahren (SOE), entsprechend der Beschreibung von Ho et al. (1989) Gene 77: 51–59, zur Substitution jeder beliebigen Region der Schweine-Faktor VIII-cDNA verwendet worden. Beim SOE wird die Spleißstelle durch die überlappenden Oligonukleotide definiert, die zur Herstellung der gewünschten cDNA durch PCR amplifiziert werden können. Zehn cDNA-Konstrukte, bezeichnet mit HP4 bis HP13, sind hergestellt worden. Sie wurden in den ReNeo-Expressionsvektor eingeschoben, stabil in Nierenzellen des jungen Hamsters transfiziert und auf hohe Gehalte [0,5–1 μg (näherungsweise 3–6 Einheiten/24 Stunden], entsprechend der Beschreibung in Beispiel 7, exprimiert. Die koagulationsfördernde Aktivität des Faktors VIII wurde in Gegenwart und Abwesenheit eines modellhaften murinen monoklonalen inhibitorischen Antikörpers, der A2-Domänen-spezifisch ist, mAb413, bestimmt. In Abwesenheit des Inhibitors wies jedes der Konstrukte eine spezifische koagulationsfördernde Aktivität auf, die von derjenigen des B(–) humanen Faktors VIII ununterscheidbar war.
Die hybriden Mensch/Schwein Faktor VIII-Konstrukte wurden bezüglich der Reaktivität mit dem Anti-A2-Inhibitor mAb413 unter Verwendung des Bethesda-Assays [Kasper et al. (1975) Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 869–872] untersucht. Die Bethesdaeinheit (BU) ist das Standardverfahren zur Messung von Inhibitortitern. Die Ergebnisse sind in Tabelle V gezeigt und werden mit dem rekombinanten Faktor VIII verglichen.
Die Grenzen der Schweine-Substitutionen sind durch die ersten Aminosäuren definiert, die einen Unterschied zwischen humanem und Schweine-Faktor VIII an den NH₂-terminalen und C-terminalen Enden des Einschubs aufweisen. Ist der Bethesda-Titer nicht messbar (< 0,7 BU/mg IgG), dann liegt ein A2-Epitop in der Region der substituierten Schweine-Sequenz, wie in Tabelle V gezeigt ist. Das Epitop wurde zunehmend auf die Reste 484–509 (SEQ ID NR: 2) eingeengt, wobei es aus nur 25 Resten bestand, wie anhand des Beispiels für die Nicht-Reaktivität von mAb413 mit HP9 erläutert wurde. Unter den Konstrukten HP4 bis HP11 war HP9 das „am meisten humanisierte" Konstrukt, das nicht mit dem Inhibitor reagiert. Dies weist darauf hin. Dass eine kritische Region in dem A2-Epitop innerhalb der Sequenz Arg484-Ile508 lokalisiert ist.
Basierend auf einem Vergleich der Aminosäuresequenz zwischen humanem und Schweine-Faktor VIII in dieser kritischen Region, wurden zwei weitere Konstrukte, HP12 und HP13 hergestellt, in denen die entsprechende Schweine-Aminosäuresequenz für die humanen Aminosäuren 489–508 beziehungsweise 484–488 substituiert wurde. Keine der beiden reagiert mit mAb413. Dies weist darauf hin, dass Reste, die auf jeder Seite von Arg488-Ser489 gebunden sind, für die Reaktion mit A2-Inhibitoren wichtig sind. In HP12 sind nur 5 Reste nicht-human und in HP13 sind nur 4 Reste nicht-human. Die 484–508, 484–488 und 489–508 Schweine-substituierten Hybride zeigten eine verringerte Inhibierung durch A2-Inhibitoren aus dem Plasma von vier Patienten, was darauf hinweist, dass es gemäß der Antwort der Inhibitorpopulation eine geringe Variation in der Struktur des A2-Epitops gibt.
Es wurde die Reaktivität der meisten humanisierten Konstrukte, HP9, HP12 und HP13 mit zwei Anti-A2 IgG5-Präparaten, die aus Inhibitor-Plasmen hergestellt wurden, bestimmt. Wie mAb413 reagierten diese Antikörper nicht mit HP9, HP12 und HP13, jedoch reagierten sie mit den Kontrollkonstrukten HP(–) und HP8.
Die Region zwischen 484–508 kann weiterhin bezüglich einer endgültigen Identifizierung des kritischen A2-Epitops unter Verwendung derselben Verfahren analysiert werden.
Die in den Beispielen 7 und 8 beschriebenen Verfahren können zur Herstellung eines anderen hybriden humanen Mensch/Nicht-Schwein Säuger Faktors VIII mit Aminosäuresubstitution in der humanen A2- oder anderen Domänen, eines hybriden Mensch/Tier oder Tier/Tier Faktors VIII mit Aminosäuresubstitution in einer beliebigen Domäne oder von Hybridfaktor VIII äquivalenten Molekülen oder Fragmenten von jedem von diesen verwendet werden, wobei ein derartiger Hybridfaktor VIII eine verringerte oder fehlende Immunreaktivität mit Anti-Faktor VIII-Antikörpern aufweist.
Beispiel 9: Eliminierung der Reaktivität des humanen Faktors VIII A2- Inhibitors durch ortsspezifische Mutagenese
Beispiel 8 zeigte, dass die Substitution der durch die Reste 484 und 508 begrenzten Schweine-Sequenz in die humane Faktor VIII-A2-Domäne ein Molekül ergibt, das eine merklich verringerte Reaktivität mit einem Feld A2-spezifischer Faktor VIII-Inhibitoren aufweist [siehe ebenfalls Healey et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 14505–14509]. In dieser Region gibt es zwischen 9 Unterschiede zwischen den Aminosäuren des humanen und Schweine-Faktors VIII. Diese neun Reste in dem humanen B-domänenfreien Faktor VIII, R484, P485, Y487, P488, R489, P492, V495, F501 und I508 (unter Verwendung des Einbuchstaben-Aminocodes) wurden individuell durch ortsspezifische Mutagenese zu Alanin geändert. Zusätzlich wurden zur Vereinfachung des Klonierens Mlu1 und Sac2-Restriktionsstellen in die Faktor VIII-cDNA an den Stellen 5' und 3' bezüglich des A2-Epitops eingesetzt, ohne die diesen Stellen entsprechenden Aminosäuren zu verändern. Die neun Mutanten wurden stabil in Nierenzellen des jungen Hamsters transfiziert und auf hohe Gehalten exprimiert. Alle neun erzeugten einen biologisch aktiven Faktor VIII. Sie wurden teilweise gereinigt und durch Heparin-Sepharose-Chromatographie, entsprechend der Beschreibung von Healey et al., konzentriert.
Die Mutanten sind über ihre Reaktivität mit dem murinen monoklonalen Inhibitor MAb413, wie in Beispiel 7, charakterisiert worden. Dieser Inhibitor erkennt dasselbe oder ein sehr nahe liegendes aneinander gelagertes Epitop in der A2-Domäne, wie alle bis heute untersuchten humanen Inhibitoren. Die Inhibitorreaktivität wurde unter Verwendung des Bethesda-Assays gemessen. Kurz, der Bethesda-Titer eines Inhibitors ist die Verdünnung des Inhibitors, die den Faktor VIII um 50% in einem Standard-Einstufen Faktor VIII-Koagulationsassay inhibiert. Wird zum Beispiel die Lösung eines Antikörpers auf 1/420 verdünnt und inhibiert sie die rekombinante Faktor VIII-Testprobe um 50%, so beträgt der Bethesda-Titer 420 U. Im Falle eines reinen monoklonalen Inhibitors, wie MAb413 mit unbekannter Masse des Antikörpers werden die Ergebnisse in Bethesda-Einheiten (BU) pro mg MAb413 ausgedrückt. Zum Feststellen des Punkts mit einer Inhibierung von 50% wurde ein Bereich von Verdünnungen des MAb413 hergestellt und eine Inhibierung von 50% wurde mittels eines Kurvenanpassungsverfahrens gefunden. Die Ergebnisse sind wie folgt:
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass es möglich ist, die Antigenität des Faktors VIII gegen den Modell-A2-Inhibitor um einen Faktor von mehr als 10 zu verringern, indem Alaninsubstitutionen an den Positionen 484, 487, 489 und 492 durchgeführt werden. Die Reaktivität von R489 → A ist nahezu um 4 Größenordnungen verringert. Jede dieser Alaninsubstitutionen kann therapeutisch zur Verringerung der Antigenität und der Immunogenität des Faktors VIII verwendbar sein.
Diese Ergebnisse bestätigen die Wirksamkeit der Alanin-Scanning-Mutagenese und zeigen weiterhin, dass die biologische Aktivität selbst bei Änderung der Aminosäuresequenz innerhalb eines Epitops, das bezüglich eines inhibitorischen Antikörpers reaktiv ist, bewahrt wird. Fünf von neun Stellen, an denen sich die humanen und Schweine-Sequenzen voneinander unterscheiden, sind ebenfalls Stellen, an denen sich die humanen von den murinen Sequenzen unterscheiden. Die Faktoren VIII mit Alaninsubstitutionen an diesen Positionen sind daher Beispiele für ein Hybridfaktor VIII-äquivalentes Molekül, das eine Sequenz mit keiner bekannten Sequenzidentität bezüglich einem beliebigen derzeit bekannten Säuger-Faktor VIII aufweist.
Eine weitere Modifikation, zum Beispiel durch Kombinieren von zwei Alaninsubstitutionen, kann ebenfalls für eine stark verringerte Antigenität für einen größeren Bereich von Patienten sorgen, da polyklonale variante Antikörper, die sich von Patient zu Patient unterscheiden, mit Varianten des Faktor VIII A2-Epitops reagieren können. Zusätzlich wird die Immunogenität (die Fähigkeit, Antikörper zu induzieren) weiter durch den Einbau von mehr als einer Aminosäuresubstitution verringert. Derartige Substitutionen können sowohl Alanin, Schweine-spezifische Aminosäuren als auch andere Aminosäuren umfassen, von denen bekannt ist, dass sie ein geringes immunogenes Potential aufweisen. Es ist wahrscheinlich, dass die Substitutionen an den Positionen 490, 495 und 501 zur Verringerung der Immunogenität verwendbar sind. Zusätzlich ist es wahrscheinlich, dass diese Substitutionen die Reaktivität gegen bestimmte Antikörper des Patienten verringern.
Neben Alaninsubstitutionen können andere wirksame die Antigenität verringernde Aminosäuresubstitutionen durchgeführt werden, solange darauf geachtet wird, dass die vorher erwähnten zur Antigen-Antikörper-Bindungsenergie Beitragenden oder solche mit sterisch anspruchsvollen oder geladenen Seitenketten vermieden werden. Aminosäuren, deren Substitutionen innerhalb eines Epitops die antigene Reaktivität davon verringern, werden hier „die Immunreaktivität verringernde" Aminosäuren genannt. Neben Alanin umfassen andere die Immunreaktivität verringernde Aminosäu ren ohne Einschränkung Methionin, Leucin, Serin und Glycin. Es versteht sich von selbst, dass die durch eine gegebene Aminosäure erreichbare Verringerung der Immunreaktivität ebenfalls von allen Wirkungen abhängen wird, die die Substitution auf die Proteinkonformation, Epitopzugänglichkeit und dergleichen haben wird.
Weiterhin sind Aminosäuresubstitutionen an anderen Stellen innerhalb des A2-Epitops (Aminosäuren 484–508), neben denjenigen, die sich zwischen humanen und Schweine-Sequenzen unterscheiden, in der Lage, die Reaktivität gegen inhibitorische Antikörper zu verringern. Die Alanin-Scanning-Mutagenese kann verwendet werden, um Alaninsubstitutionen für jede Aminosäure innerhalb des A2-Epitops bereitzustellen. Jeder resultierende modifizierte Faktor VIII kann bezüglich der prokoagulierenden Aktivität und der Inhibierung dieser Aktivität durch einen inhibitorischen Antikörper untersucht werden. Andere die Immunreaktivität verringernde Aminosäuren neben Alanin können zur Verringerung der Antigenität des resultierenden modifizierten Faktors VIII substituiert werden. Die Aminosäuresubstitutionen können in einem einzelnen Faktor VIII-Molekül zur Maximierung der erwünschten Eigenschaften, die aus solchen Substitutionen resultieren, kombiniert werden.
Der Austausch derjenigen Aminosäuren, die am meisten zur Bindungsenergie einer Antikörper-Faktor VIII-Wechselwirkung beitragen, ist besonders bevorzugt. Diese umfassen Substitutionen einer die Immunreaktivität verringernden Aminosäure an jeder der Positionen 493, 496, 499, 500, 502, 503, 505 und 507. Die Daten für die Substitutionen dieses Typs an den Positionen 484, 485, 499, 490, 492, 501 und 508 haben gezeigt, dass derartige Substitutionen die prokoagulierende Aktivität bewahren und die Empfindlichkeit gegen Inhibierung durch inhibitorische Antikörper verringern. (Tabelle IV) Histidinsubstitutionen sind in natürlich vorkommenden Sequenzen beobachtet worden. Zum Beispiel wird an der Position 504 das Histidin des Mäuse-Faktors VIII durch Leucin in sowohl dem Schweine- als auch humanen Faktor VIII ausgetauscht. Sowohl der Schweine- als auch der Mäuse-Faktor VIII weisen ein Histidin an der Position 487 auf, an der der humane Faktor VIII Tyrosin aufweist. Die Substitution des Tyrosin durch Alanin an der Position 487 führt zu einem aktiven Prokoagulans mit einer im Wesentlichen verringerten Antigenität (Tabelle VI). Mittels Analogie kann die Substitution von Histidin an der Position 497 durch eine die Immunreaktivität verringernde Aminosäure ebenfalls zur Retention der prokoagulieren den Aktivität führen und zur Verringerung der Inhibierung durch inhibitorische Antikörper beitragen. Die Immunreaktivität verringernden Aminosäuren können ebenfalls an den Positionen 486, 488, 491, 494, 498, 504 und 506 substituiert werden. Obwohl es scheint, dass die an diesen Positionen vorkommenden Aminosäuren weniger wahrscheinlich zur Antikörperbindung beitragen, ist gezeigt worden (Tabelle IV), dass die Substitution einer die Immunreaktivität verringernden Aminosäure an derartigen Stellen, zum Beispiel S488A, zur Verringerung der Antikörperinhibierung der prokoagulierenden Aktivität beiträgt.
Aus einem Vergleich der humanen, Schweine-, murinen (1A–1H) und Hunde[Cameron, C. et al. (1989) Throm. Haemost. 79: 317–322] Sequenzen innerhalb des A2-Epitops, ist es offensichtlich, dass die Region eine signifikante Menge an Sequenzvariabilität toleriert. Unter allen vier Spezies sind nur 12 Loci konserviert. Von keinem von diesen kann angenommen werden, dass er für die prokoagulierende Aktivität wesentlich ist. Tatsächlich führt die Substitution des konservierten Arginin an der Position 490 (R490 → A, Tabelle VI) durch Alanin zu einem aktiven modifizierten Faktor VIII, der eine verringerten Reaktivität gegen inhibitorische Antikörper aufweist. Es können ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen durchgeführt werden, ohne die prokoagulierende Aktivität wesentlich zu beeinflussen. Zum Beispiel kann die Substitution von zwei Aminosäuren, die mit der Antikörperbindung zu tun haben, die Inhibierung durch einen Antikörper im größeren Maße verringern als nur eine von beiden. Ebenfalls können mehrfache Substitutionen den resultierenden modifizierten Faktor VIII weniger empfänglich gegen eine größere Vielfalt von Antikörpern eines Patienten machen, als eine einzelne Aminosäuresubstitution.
Einzelne Aminosäuresubstitutionen können bezüglich ihrer Eigenschaften einer verringerten Antigenität, sowie anderer funktionaler Eigenschaften des Faktors VIII bewertet werden. Durch Bewertung der Eigenschaften, die einzelne Aminosäuresubstitutionen verleihen, ist es möglich, gewünschte Kombinationssubstitutionen von zwei oder mehreren Aminosäuren zu identifizieren, um einen modifizierten Faktor VIII bereitzustellen, der optimierte Eigenschaften aufweist, soweit die Region der Aminosäuren 484–508 betroffen ist.

Die ortsspezifische Mutagenese kann zur Modifikation der Faktor VIII-DNA in der die Aminosäuren 484–508 kodierenden Region verwendet werden, um eine Sequenz bereitzustellen, die den modifizierten Faktor VIII kodiert, der eine erwünschte Aminosäuresubstitution aufweist. An der geeigneten Stelle der humanen Faktor VIII-DNA-Sequenz kann das Triplett, das eine vorkommende Aminosäure kodiert, Triplett durch ortsspezifische Mutagenese so geändert werden, dass es die gewünschte Aminosäure kodiert. Das die gewünschte Aminosäure kodierende Triplett kann jedes der durch den genetischen Code spezifizierten bekannten Tripletts sein. Die Änderung der natürlichen Sequenz zur Kodierung einer einzelnen Aminosäuresubstitution kann häufig mit einer einzelnen Basensubstitution, gelegentlich mehreren, bis zu maximal drei Basensubstitutionen erreicht werden. Unter Verwendung der ortsspezifischen Mutagenese können alle notwendigen Substitutionen leicht ausgeführt werden, um die bestehende Kodierung in diejenige zu ändern, die zur Kodierung der gewünschten Aminosäuresubstitution benötigt wird. Einige Beispiele für Basenänderungen, die zu spezifizierten Aminosäuresubstitutionen führen, sind nachstehend angegeben. Diese sind nur beispielhaft und nicht umfassend:

R484 → G GGT	CGT →
P485 → A GCT	CCT →
L486 → S TCG	TTG →
Y487 → L CTT	TAT →
S488 → L TTA	TCA →
R489 → S AGT	AGG →
R490 → G GGA	AGA →
L491 → S TCA	TTA →
P492 → L CTA	CCA →

K493 → A GCA	AAA →
G494 → S AGT	GGT →
V495 → A GCA	GTA →
K496 → M ATG	AAA →
H497 → L CTT	CAT →
L498 → S TCG	TTG →
K499 → M ATG	AAG →
D500 → A GCT	GAT →
F501 → S TCT	TTT →
P502 → L CTA	CCA →
I503 → M ATG	ATT →
L504 → M ATG	CTG →
P505 → A GCA	CCA →
G506 → A GCA	GGA →
E507 → G GGA	GAA →
I508 → M ATG	ATA →

Die vorstehenden Beispiele zeigen, dass viele die Immunreaktivität verringernde Aminosäuresubstitutionen durch einzelne Nukleotidänderungen ausgeführt werden können. Andere gewünschte Substitutionen können auf ähnliche Weise ausgeführt werden, wobei auf den genetischen Code Bezug genommen wird, um ein gewünschtes Nukleotidtriplett auszuwählen, das den beabsichtigten Aminosäuresubstituenten kodiert, und wobei anschließend die zur Erzeugung des beabsichtigten Tripletts notwendigen Nukleotidänderungen durch ortsspezifische Mutagenese eingeführt werden. Ein mehrfach substituierter modifizierter Faktor VIII kann durch einfache Kombinationen von Nukleotidänderungen, wie zum Beispiel die gerade beschriebenen, ausgeführt werden. Zum Beispiel kann ein modifizierter Faktor VIII, der zwei ausgetauschte Aminosäuren der A2-Domäne, zum Beispiel R498 → A und P492 → L, aufweist, durch Einführung von AGG → GCG und CCA → CTA an geeigneten Stellen, eine Änderung von drei Nukleotiden, hergestellt werden. Jede andere gewünschte Änderung oder Kombination von Änderungen kann, wie im Wesentlichen gerade beschrieben worden ist, entworfen und ausgeführt werden. Die aus der ortsspezifischen Mutagenese folgende modifizierte Faktor VIII-DNA-Sequenz unterscheidet sich dann von der natürlichen humanen Sequenz oder von anderweitig modifizierten Sequenzen, wie sie anderswo hier beschrieben sind, nur dadurch, dass sie die definierte Nukleotidsubstitution(en) an der definierten Stelle aufweist. Die prokoagulierende Aktivität wird, wie vorher beschrieben ist (Beispiele 1 und 8), entweder durch den Einstufen- oder Zweistufen-Assay untersucht. Der Assay für den Inhibitortiter ist der Bethesda-Assay, der vorstehend und von Kaspar, C. K. et al., siehe oben, Beispiel 8, beschrieben ist.
Beispiel 10
Das Klenow-Fragment, phosphorylierte ClaI-Linker, NotI-Linker, T4 Ligase und Taq-DNA-Polymerase wurden von Promega (Madison, Wisconsin) bezogen. Die Polynukleotidkinase wurde von Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland bezogen. γ³²P-ATP (Redivue, > 5000 Ci/mmol) wurde von Amersham bezogen. pBluescript II KS- und E. coli epicuräische XL1-Blue Zellen wurden von Stratagene (La Jolla, Kalifornien) bezogen. Synthetische Oligonukleotide wurden von Life Technologies, Inc. oder Cruachem, Inc. bezogen. 5'-phosphorylierte Primer wurden verwendet, wenn PCR-Produkte für Klonierungszwecke hergestellt wurden. Die Nukleotid(e)- Nummerierung der Oligonukleotide, die als Primer für die Polymerasekettenreaktions(PCR)-Amplifikation von Schweine fVIII-cDNA, oder genomischer DNA verwendet wurden, verwendet die humane fVIII-cDNA als Bezugspunkt (Wood et al. (1984) siehe oben).
Die gesamte RNA der Schweinemilz wurde durch saure Guanidiniumthiocanat-Phenol-Chloroform-Extraktion [Chomczynski et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 156–159] isoliert. Schweine-cDNA wurde aus der gesamten Milz-RNA unter Verwendung der Moloney murinen Leukämie Virus-Umkehrtranskriptase (RT) und zufälligen Hexameren zum Primen der Reaktion (Erster-Strang-cDNA-Synthese-Kit, Pharmacia Biotech) hergestellt, sofern nicht anders angegeben ist. RT-Reaktionen enthielten 45 mM Tris-Cl, pH-Wert 8,3, 68 mM KCl, 15 mM DTT, 9 mM MgCl₂, 0,08 mg/ml Rinderserumalbumin und 1,8 mM Didesodynukleotidtriphosphat (dNTP). Schweine genomische DNA wurde aus der Milz unter Verwendung eines Standardverfahrens isoliert (Strauss, W. M. (1995) In Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., Hrsg. John Wiley & Sons, Seiten 2.2.1–2.2.3). Die Isolierung der DNA aus Agarosegelen wurde unter Verwendung von Geneclean II (Bio 101) oder Quiex Gel Extraction Kit (Qiagen) durchgeführt.
PCR-Reaktionen wurde unter Verwendung eine Hybaid OmniGene Thermocyclers durchgeführt. Bei PCR-Reaktionen, die Taq-DNA-Polymerase verwendeten, umfassten die Reaktionen 0,6 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTPs, 0,5 μM Oligonukleotidprimer, 50 U/ml Polymerase und 0,1 Volumen der Erster-Strang-cDNA-Reaktionsmischung. Sofern nicht anders angegeben ist wurden die PCR-Produkte Gel-gereinigt, mit dem Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen, mit Ethanol gefällt und entweder an die EcoRV-Stelle des dephosphorylierten pBluescript II KS- ligiert oder mit phosphorylierten ClaI-Linker unter Verwendung von T4-Ligase ligiert, mit ClaI verdaut, durch Sephacryl S400-Chromatographie gereinigt und an mit ClaI geschnittenen dephosphorylierten pBluescript II-KS ligiert. Die Ligationen wurden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (Rapid DNA Ligationskit, Boehringer Mannheim) durchgeführt, außer es ist anders angegeben. Den Einschub enthaltende pBluescript II KS-Plasmide wurden zur Transformierung von E. coli epicuräische XL1-Blue-Zellen verwendet.
Die Sequenzierung von Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines 373a DNA-Sequenzierungsautomaten von Applied Biosystems und des PRISM-Farbstoff-Terminatorkits oder manuell unter Verwendung von Sequenase mit dem 2.0 Sequenzierungskit (Amersham Corporation) durchgeführt. Eine direkte Sequenzierung von PCR-Produkten, einschließlich ³²P-Endmarkierung von Oligonukleotiden wurde unter Verwendung eines Zyklus-Sequenzierungsprotokoils (dsDNA Cyle Sequencing System, Life Technologies) durchgeführt.
Isolierung von Schweine-fVIII-cDNA-Klonen, die eine 5' UTR-Sequenz, ein Signalpeptid und Codone der A1-Domäne enthalten
Die Schweine-fVIII-cDNA 5' zu der A2-Domäne wurde durch verschachtelte RT-PCR der gesamten RNA der weiblichen Schweinemilz unter Verwendung einer 5' Schnellamplifikation des cDNA-Enden (5'-RACE)-Protokolls (Marathon cDNA Amplification, Clontech, Version PR55453) amplifiziert. Dies umfasste die Synthese des ersten Strangs der cDNA unter Verwendung eines Lock-Docking Oligo(dT)-Primers [Borson, N. D. et al. (1992) PCR Methods Appl. 2: 144–148], eine Synthese des zweiten Strangs der cDNA unter Verwendung der E. coli DNA-Polymerase 1, und eine Ligation mit einem 5' verlängerten Doppelstrangadaptor, SEQ ID NR: 13 5'-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3 3'-H₂N-CCCGTCCA-PO₄-5' dessen kurzer Strang an dem 3'-Ende mit einer Aminogruppe zur Verringerung von unspezifischem PCR-Priming blockiert war und der zu den 8 Nukleotiden an dem 3'-Ende komplementär war (Siebert, P. D., et al. (1995) Nucleic. Acids. Res. 23: 1087–1088). Die erste PCR-Runde wurde unter Verwendung eines Adaptor-spezifischen Oligonukleotids, SEQ ID NR: 14 5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3' (bezeichnet mit AP1) als Sense-Primer, und einem Schweine-fVIII-A2-Domäne-spezifischen Oligonukleotid SEQ ID NR: 15 5'-CCA TTG ACA TGA AGA CCG TTT CTC-3' (nt 2081–2104) als Antisense-Primer durchgeführt. Die zweite PCR-Runde wurde unter Verwendung eines verschachtelten Adaptor-spezifischen Oligonukleotids, SEQ ID NR: 16 5'-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3' (bezeichnet mit AP2) als Sense-Primer und einem verschachtelten Schweine-A2-Domäne-spezifischen Oligonukleotid SEQ ID NR: 17 5'-GGG TGC AAA GCG CTG ACA TCA GTG-3' (n7 1497–1520) als Antisense-Primer durchgeführt. Die PCR wurde unter Verwendung eine kommerziellen Kits (Advantage cDNA PCR Kernkit) ausgeführt, das ein Antikörper-vermitteltes Hot-Start Protokoll verwendet [Kellogg, D. E. et al. (1994) Biotechniques 16: 1134–1137]. Die PCR-Bedingungen umfassten die Denaturierung bei 94°C während 60 Sek, gefolgt von 30 Zyklen (erste PCR) oder 25 Zyklen (zweite PCR) Denaturierung während 30 Sek bei 94°C, Annealing während 60 Sek bei 60°C und Verlängerung während 4 Min bei 68°C unter Verwendung einer Rohrtemperaturkontrolle. Dieses Verfahren ergab ein hervorstechendes ≈ 1,6 kb Produkt, das mit der Amplifikation eines Fragments übereinstimmt, das sich näherungsweise 150 bp in die 5'-UTR verlängerte. Das PCR-Produkt wurde in pBluescript unter Verwendung von ClaI-Linkern kloniert. Die Einschübe für vier Klone wurden in beide Richtungen sequenziert.
Die Sequenz dieser Klone umfasste Regionen, die 137 bp von 5'UTR, dem Signalpeptid, der A1-Domäne und Teil der A2-Domäne entsprachen. Ein Consensus wurde an mindestens 3 von 4 Stellen erreicht. Die Klone enthielten jedoch durchschnittlich 4 anscheinend durch PCR erzeugte Mutationen, vermutlich aufgrund der mehrfachen PCR-Runden, die zur Erzeugung eines klonierbaren Produkts erforderlich waren. Daher verwendeten wird die aus dem Signalpeptid erhaltene Sequenz zur Konstruktion eines Sense-Strang phosphorylierten PCR-Primers, SEQ ID NR: 18 5'-CCT CTC GAG CCA CCA TGT CGA GCC ACC ATG CAG CTA GAG CTC TCC ACC TG-3', bezeichnet mit RENEOPIGSP, für die Synthese eines weiteren PCR-Produkts zur Bestätigung der Sequenz und für die Klonierung in einen Expressionsvektor. Die Sequenz. in Fettdruck stellt das Startcodon dar. Die Sequenz 5' zu dieser stellt eine Sequenz dar, die zu der 5' von der Einschubstelle in den Säugerexpressionsvektor ReNeo identisch ist, der zur Expression von fVIII verwendet wird (Lubin et al. (1994) s.o.). Diese Stelle umfasst eine Xho-Spaltungsstelle (unterstrichen). RENEOPIGSP und das nt 1497–1520 Oligonukleotid wurden zum Primen einer Taq-DNA-Polymerase-vermittelten PCR-Reaktion unter Verwendung von cDNA der weiblichen Schweinemilz als Templat verwendet. DNA-Polymerasen von mehreren Herstellern gelang es nicht, ein nachweisbares Produkt zu ergeben. PCR-Bedingungen umfassten die Denaturierung bei 94°C während vier Min, gefolgt von 35 Zyklen Denaturierung während 1 Min bei 94°C, Annealing während 2 Min bei 55°C und Verlängerung während 2 Min bei 72°C, gefolgt von einem letzten Verlängerungsschritt während 5 Min bei 72°C. Das PCR-Produkt wurde in den pBluescript unter Verwendung von ClaI-Linkern kloniert. Die Einschübe dieser Klone wurden in beide Richtungen sequenziert und stimmten mit der Consensus-Sequenz überein.
Isolierung von Schweine-fVIIII-cDNA-Klonen, die A3-, C1 und die 5'-Hälfte der Codone der C2-Domäne enthalten.
Anfänglich wurden zwei Schweinemilz-RT-PCR-Produkte kloniert, die einem B-A3-Domänenfragment (nt 4519–5571) und einem C1-C2-Domänenfragment (nt 6405–6990) entsprachen. Das 3'-Ende der C2-Domäne, das erhalten wurde, erstreckte sich in die Exon 26 Region, die das endständige Exon in fVIII ist. Das B-A3-Produkt wurde unter Verwendung des Schweine-spezifischen B-Domänenprimers, SEQ ID NR: 19 5' CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T 3' hergestellt, wobei die unterstrichene Region einer Region im Schweine-fVIII entspricht, die zu nt 4519–4530 im humanem fVIII vergleichend angeordnet ist. Die 5'-Region des Oligonukleotids umfasst eine NotI-Stelle, die ursprünglich für Klonierungszwecke gedacht war. Der zur Erzeugung des B-A3-Produkts verwendete Antisense-Primer, SEQ ID NR: 20 5'-GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA-3', basierte auf dem umgekehrten Komplement der humanen fVIII-cDNA-Sequenz bei nt 5545–5571. Die PCR-Reaktion enthielt 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl, pH-Wert 9,0, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM MgCl₂. 2,5 mM dNTPs, 20 μM Primer, 25 Einheiten/ml Taq-DNA-Polymerase und 1/20 Volumen der RT-Reaktionsmischung. Die PCR-Bedingungen waren Denaturierung bei 94°C während 3 Min, gefolgt von 30 Zyklen Denaturierung während 1 Min bei 94°C, Annealing während 2 Min bei 50°C, Verlängerung während 2 Min bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung von T4 DNA-Kinase phosphoryliert und NotI-Linker wurden zugegeben. Nach Schneiden mit NotI wurden die PCR-Fragmente in die NotI-Stelle von BlueScript II KS-kloniert und in XL1-Blue-Zellen transformiert.
Das C1-C2-Produkte wurde unter Verwendung der bekannten humanen cDNA-Sequenz hergestellt, um die Sense- und Antisense-Primer, SEQ ID NR: 21 5'-AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N-3' (nt 6405–6426) beziehungsweise SEQ ID NR: 22 5'-CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N-3' (umgekehrte Komplement von nt 6966–6990) zu synthetisieren. Die PCR-Bedingungen waren zu denjenigen, die zur Erzeugung des B-A2-Produkts verwendet wurden, identisch. Das resultierende Fragment wurde an den pNOT-Klonierungsvektor unter Verwendung des Prime PCR Cloner Cloning Systems (5 Prime-3 Prime, Inc., Boulder, Colorado) ligiert und in JM109-Zellen vermehrt.
Die B-A3- und C1-C2-Plasmide wurden teilweise zur Herstellung der Schweine-spezifischen Sense- und Antisense-Oligonukleotide, SEQ ID NR: 23 5'-GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG-3' (nt 4551–4573) beziehungsweise SEQ ID NR: 24 5'-ACA GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG-3' (nt 6541–6564, sequenziert. Diese Oligonukleotide wurden als Primer zur Erzeugung eines 2013 bp RT-PCR-Produkts unter Verwendung eines Clontech Advantage cDNA-PCR-Kits verwendet. Dieses den humanen nt 4551–6564 entsprechende Produkt umfasst die Region, die der leichten Kette des Aktivierungspeptids (nt 5002–5124), A3-Domäne (nt 5125–6114) und dem größten Teil der C1-Domäne (nt 6115–6573) entspricht. Die Sequenz des C1-C2-Klons hat bewiesen, dass die humanen und Schweine-cDNAs von nt 6565 bis zu dem 3'-Ende der C1-Domäne identisch waren. Das PCR-Produkt klonierte in die EcoRV-Stelle des pBluescript II KS-. Vier Klone wurden vollständig in beide Richtungen sequenziert. Ein Consensus wurde in mindestens 3 von 4 Stellen erreicht.
Isolierung von Schweine-fVIII-cDNA-Klonen, die die 3'-Hälfte der Codone der C2-Domäne enthalten.
Die C2-Domäne des humanen fVIII (Nukleotide 6574–7053) ist innerhalb der Exone 24–26 enthalten (Gitschier J. et al. (1984) Nature 312: 326–330]. Das humane Exon 26 enthält 1958 bp, die den Nukleotiden 6901–8858 entsprechen. Es umfasst 1478 bp der 3'-untranslatierten Sequenz. Versuche des Klonierens der Exon 26-cDNA, die dem 3'-Ende der C2-Domäne und der 3'UTR entspricht, durch RACE [Siebert et al. (1995) s.o.], inverse PCR [Ochman, H. et al (1990) Biotechnology (N.Y.) 8: 759–760], Restriktionsstellen-PCR [Sarkar, G. et al. (1993) PCR Meth. Appl. 2: 318–322], „unvorhersagbar geprimte" PCR [Dominguez, O. et al. (1994) Nucleic. Acids Res. 22: 3247–3248] und durch Screening einer Schweineleber-cDNA-Bibliothek misslangen. 3' RACE wurde unter Verwendung derselben Adaptor-ligierten Doppelstrang-cDNA-Bibliothek, die erfolgreich zum Klonieren des 5'-Endes der Schweine-fVIII-cDNA verwendet wurde, in Angriff genommen. Daher lag das Versagen dieses Verfahrens nicht an der Abwesenheit der dem Exon 26 entsprechenden cDNA.
Ein gezieltes Gen-Walking-PCR-Verfahren [Parker, J. D. et al. (1991) Nucleic. Acids. Res. 19: 3055–3060] wurde zur Klonierung der 3'-Hälfte der C2-Domäne verwendet. Ein Schweine-spezifischer Sense-Primer, SEQ ID NR: 25 5'-TCAGGGCAATCAGGACTCC-3' (nt 6904–6924) wurde, basierend auf der anfänglichen C2-Domänensequenz synthetisiert und in einer PCR-Reaktion mit unspezifischen „Walking"-Primern, die aus im Labor verfügbaren Oligonukleotide ausgewählt waren, verwendet. Auf die PCR-Produkte wurde dann durch eine Primerverlängerungsanalyse [Parker et al (1991) BioTechniques 10: 94–101] unter Verwendung eines ³²P-endmarkierten Schweine-spezifischen inneren Primers, SEQ ID NR: 26 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932–6952) gezielt. Interessanterweise ergaben von den 40 unspezifischen getesteten Primern nur zwei positive Produkte bei der Primerverlängerungsanalyse und diese zwei entsprechen einer exakten und einer degenerierten humanen Sequenz am 3'-Ende der C2-Domäne: SEQ ID NR: 27 5'-GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' (nt 7030–7053) und SEQ ID NR: 28: 5'-GTAGAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCYAG-3' (nt 7027–7053). Diese Primer wurden anfänglich so ausgelegt, dass sie ein Produkt durch herkömmliche RT-PCR ergeben, jedoch misslang es ihnen, ausreichend Produkt zu ergeben, das durch Ethidiumbromidfarbstoff-Bindung sichtbar gemacht werden konnte. Jedoch konnte ein PCR-Produkt durch das empfindlichere Primerverlängerungsverfahren identifiziert werden. Dieses Produkt wurde Gel-gereinigt und direkt sequenziert. Dieses verlängerte die Sequenz von Schweine-fVIII nach nt 7026.
Eine zusätzliche Sequenz wurde durch Primerverlängerungsanalyse eines verschachtelten PCR-Produkts erhalten, das unter Verwendung der Adaptor-ligierten Doppelstrang-cDNA-Bibliothek, die in dem vorher beschriebenen 5'-RACE-Protokoll verwendet wurde, erzeugt wurde. Die Reaktion der ersten Runde verwendete den exakten Schweine-Primer SEQ ID NR: 29 5'-CTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGT-3' (nt 6541–6564) und den AP1-Primer. Die Reaktion der zweiten Runde verwendete SEQ ID NR: 30 5'-AATCAGGACTCCTCCACCCCCG-3' (nt 6913–6934) und den AP2-Primer. Die direkte PCR-Sequenzierung verlängerte die Sequenz 3' zu dem Ende der C2-Domäne (nt 7053). Die C2-Domänensequenz war einmalig vorhanden, abgesehen von nt 7045 in der Nähe des 3'-Endes der C2-Domäne. Eine Analyse wiederholter PCR-Reaktionen ergab entweder A, G oder eine doppelte Ablesung von A/G an dieser Stelle. Die Sequenzierung wurde in die 3' UTR unter Verwendung von zwei zusätzlichen Primern, SEQ ID NR: 31 5'-GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3' (nt 6977–6996) und SEQ ID NR: 32 5'-CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG-3' (nt 7008–7031) verlängert. Näherungsweise 15 bp der 3'-UTR-Sequenz wurden erhalten, obwohl die Sequenz an mehreren Stellen unklar war. Dann wurden mehrere Antisense-Primer, basierend auf den besten Schätzungen der 3'-untranslatierten Sequenz, synthetisiert. Diese Primer umfassten das umgekehrte Komplement des TGA-Stopp-Codons an ihren 3'-Enden. PCR-Produkte wurde von sowohl der Schweinemilz-genomischen DNA als auch von der Schweinemilz-cDNA, die durch Agarosegel-Elektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht wurden, unter Verwendung eines spezifischen Sense-Primers SEQ ID NR: 33 5'-AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G-3' (nt 6913–6934) und des 3'-UTR Antisense-Primers, SEQ ID NR: 34 5'-CCTTGCAGGAATTCGATTCA-3' erhalten. Zum Erhalten ausreichender Mengen an Material für Klonierungszwecke wurde eine zweite PCR-Runde unter Verwendung eines verschachtelten Primers, SEQ ID NR: 35 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932–6952) und desselben Antisense-Primers durchgeführt. Das 141 bp PCR-Produkt wurde in EcoRV-geschnittenen pBluescript II KS- kloniert. Die Sequenz von drei aus der genomischen DNA stammenden Klone und drei aus der cDNA stammenden Klone wurde in beide Richtungen erhalten. Die Sequenz war abgesehen bei nt 7045, wo die genomische DNA immer A und die cDNA immer G war, unzweifelhaft.
Mehrfache DNA-Sequenzanordnungen des humanen Schweine- und Mäuse-fVIII (1A–H).
Die Anordnungen des Signalpeptids, A1-, A2-, A3-, C1- und C2-Regionen wurden unter Verwendung des CLUSTALW-Programms [Thompson, J. D. et al. (1994) Nucleic. Acids. Res. 22: 4673–4680] ausgeführt. Strafen für offene Lücke und Lückenausdehnung betrugen 10 beziehungsweise 0,05. Die Anordnungen der humanen, Mäuse- und Schweine-B-Domänen sind früher beschrieben worden [Elder et al. (1993) s.o.]. Die humane A2-Sequenz entspricht den Aminosäuren 373–740 in der SEQ ID NR: 2. Die Schweine-A2-Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR: 4 angegeben, und die Aminosäuresequenz der Mäuse-A2-Domäne ist in SEQ ID NR: 6 mit den Aminosäuren 392–759 angegeben.
Beispiel 11: Expression des aktiven rekombinanten 8-domänenfreien Schweine-Faktors VIII (PB^–)
Materialien
Mit Citrat versetztes Hämophilie A-Plasma und Plasma von normalem vereinigten humanen Blut wurden von George King Biomedical, Inc. bezogen. Fötales Rinderserum, Geneticin, Penicillin, Streptomycin, DMEM/F12-Medium und AlM-V-Medium wurden von Life Technologies, Inc. bezogen. Taq-DNA-Polymerase wurde von Promega bezogen. Vent-DNA-Polymerase wurde von New England Biolabs bezogen. Pfu-DNA-Polymerase und das Phagemid pBlueScript II KS^– wurden von Stratagene bezogen. Synthetische Oligonukleotide wurden von Life Technologies oder Cruachem, Inc. bezogen. Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs oder Promega bezogen. 5'-phosphorylierte Primer wurden verwendet, wenn PCR-Produkte für Klonierungszwecke erzeugt wurden. Die Nukleotid (nt)-Nummerierung der Oligonukleotide, die als Primer für die Polymerasekettenreaktions(PCR)-Amplifikation der Schweine-fVIII-cDNA oder genomischen DNA verwendet wurden, verwendet die humane fVIII-cDNA als Bezugspunkt [Wood et al. (1984) Nature 312: 330–337]. Ein mit HB^–/ReNeo bezeichneter fVIII-Expressionsvektor wurde von Biogen, Inc erhalten. HB^–/ReNeo enthält Ampicillin- und Geneticin-resistente Gene und eine humane fVIII-cDNA, der die gesamte B-Domäne fehlt, die als das durch Thrombin erzeugte Ser741-Arg1648 Spaltungsfragment definiert ist. Zur Vereinfachung der Mutagenese der fVIII-C2-Domänen-cDNA, die an dem 3'-Ende des fVIII-Einschubs in ReNeo liegt, wurde eine NotI-Stelle zwei Basen 3' zu dem Stopp-Codon von HB^–/ReNeo durch Spleißen durch Überlappungsverlängerungs (SOE)-Mutagenese eingeführt [Horton, R. M. et al. (1993) Methods Enzymol. 217: 270–279]. Dieses Konstrukt wird als HB^–ReNeo/NotI bezeichnet.
Die gesamte RNA wurde durch saure Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion [Chomczynski, P. et al. (1987) Anal. Biochem. 162: 156–159] isoliert. Die cDNA wurde ausgehend von der RNA unter Verwendung von Moloney muriner Leukämievirus-Umkehrtranskriptase (RT) und zufälligen Hexameren gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Anweisungen (Erster Strang cDNA Synthese-Kit, Pharma cia Biotech) synthetisiert. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen Plasmid Maxi Kits (Qiagen, Inc.) gereinigt. PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung eines Hybaid OmniGene Thermocyclers unter Verwendung von Taq-, Vent- oder Pfu-DNA-Polymerasen durchgeführt. PCR-Produkte wurden Gel-gereinigt, mit Ethanol gefällt und in Plasmid-DNA unter Verwendung von T4 DNA-Ligase ligiert (Rapid DNA Ligationskit, Boehringer Mannheim). Die den Einschub enthaltenden Plasmide wurden zur Transformation von E. coli epicuräischen XL1-Blue-Zellen verwendet. Neue durch PCR erzeugte fVIII-DNA-Sequenzen wurden durch Didesoxysequenzierung unter Verwendung eines 373a DNA-Sequenzierungsautomaten und des PRISM Farbstoff-Terminatorkits sequenziert.
Konstruktion eines hybriden fVIII-Expressionsvektors HP20, der die Schweine-C2-Domäne enthält.
Eine Schweine-fVIII-cDNA, die dem 3'-Ende der C1-Domäne und der gesamten C2-Domäne entspricht, wurde in den pBluescript durch RT-PCR aus der gesamten Milz-RNA unter Verwendung von Primern kloniert, die auf einer bekannten Schweine-fVIII-cDNA-Sequenz basieren [Healy, J. F. et al. (1996) Blood 88: 4209–4214]. Dieses Konstrukt und HB^–/ReNeo wurden als Template zum Aufbau eines humanen C1-Schweine-C2-Fusionsprodukts in pBlueScript durch SOE-Mutagenese verwendet. Das C1-C2-Fragment in diesem Plasmid wurde mit ApaI und NotI entfernt und in mit ApaI/NotI geschnittenen HB^–/ReNeo/NotI zur Herstellung von HP20/ReNeo/NotI ligiert.
Aufbau des hybriden Mensch/Schwein fVIII mit deletierter B-Domäne, der die Schweine-leichte Kette enthält (HP18)-
Die humane fVIII-leichte Kette besteht aus den Aminosäureresten Asp1649-Tyr2332. Die entsprechenden Reste in der Schweine fVIII-cDNA wurden für diese Region von HB^– zur Erzeugung eines mit HP18 bezeichneten hybriden Mensch/Schwein fVIII-Moleküls substituiert. Dies wurde durch Substitution eines PCR-Produkts, das einer Schweine-A2-Region, der A3-Domäne, der C1-Domäne und einem Teil der C2-Domäne entsprach, für die entsprechende Region in HP20 durchgeführt. Zur Vereinfachung der Konstruktionen wurde eine synonyme AvrII-Stelle in nt 2273 an der Ver bindungsstelle der A2- und A3-Domänen von HP20 durch SOE-Mutagenese eingeführt.
Aufbau des hybriden Mensch/Schwein fVIII mit deletierter B-Domäne, der das Schweine-Signalpeptid, die A1-Domäne und A2-Domäne enthält (HP22)-
Das humane fVIII-Signalpeptid, A1-Domäne und A2-Domäne bestehen aus den Aminosäureresten Met(-19)-Arg740. Die entsprechenden Reste in der Schweine-fVIII-cDNA wurden für diese Region von HB^– zur Erzeugung eines mit HP22 bezeichneten Moleküls substituiert. Zusätzlich wurde eine synonyme AvrII-Stelle in nt 2273 an der Verbindungsstelle der A2- und A3-Domänen von HP22 durch SOE-Mutagenese eingeführt. HP22 wurde durch Fusion eines Schweine-Signalpeptid-A1-teilweises A2-Fragment in pBlueScript [Healy et al. (1996) s.o.] mit einem B-domänenfreien hybriden Mensch/Schwein fVIII, der die Schweine-A2-Domäne enthielt und mit HP1 bezeichnet ist [Lubin et al. (1994) s.o.], konstruiert.
Aufbau des Schweine-B-domänenfreien fVIII-(PB^–)
Ein SpeI/NotI-Fragment von HP18/BS (+ AvrII) wurde mit AvrII/NotI verdaut und in mit AvrII/NotI verdauten HP22/BS (+ AvrII) zur Herstellung eines Konstrukts PB^–/BS (+ AvrII) ligiert, das aus dem Schweine-fVIII, dem die gesamte B-Domäne fehlt, bestand. PB– wurde in ReNeo durch Ligation eines Xba/NotI-Fragments von PB^–/BS (+ AvrII) in HP22/ReNeo/NotI (+ AvrII) kloniert.
Expression der rekombinanten fVIII-Moleküle
PB^–/ReNeo/NotI (+ AvrII) und HP22/ReNeo/NotI (+ AvrII) wurden transient in COS-Zellen transfiziert und entsprechend der früheren Beschreibung [Lubin, I. M. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 8639–8641] exprimiert. HB^–/ReNeo/NotI und keine DNA (Mock) wurden als Kontrolle transfiziert.
Die fVIII-Aktivität von PB^–, HP22 und HB^– wurde durch einen chromogenen Assay wie folgt gemessen. fVIII-Proben in COS-Zellkulturüberständen wurden durch 40 nM Thrombin in 0,15 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM cAC12, 0,01% Tween-80, pH-Wert 7,4 in Gegenwart von 10 nM Faktor IXa, 425 nM Faktor X und 50 μM unilamellare Phosphatidylserin-Phosphatidylcholin (25/75 w/w) Vesikel aktiviert. Nach 5 Min wurde die Reaktion mit 0,05 M EDTA und 100 nM rekombinantem Desultathirudin gestoppt und der resultierende Faktor Xa wurde durch einen chromogenen Substratassay gemessen. Bei dem chromogenen Substratassay wurden 0,4 mM Spectrozyme Xa zugegeben und die Geschwindigkeit der Freisetzung von para-Nitroanilid wurde durch Messung der Extinktion der Lösung bei 405 nm gemessen.
Ergebnisse der unabhängig voneinander transfizierten doppelten Zellkulturüberstände (Extinktion bei 405 nm pro Minute)
HB^–: 13,9
PB^–: 139
HP22: 100
Mock: < 0,2
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der B-domänenfreie Schweine-fVIII und ein B-domänenfreien fVIII, der aus den Schweine-A1- und A2-Untereinheiten besteht, aktiv sind, und deuten darauf hin, dass sie bezüglich des humanen B-domänenfreien fVIII eine höhere Aktivität aufweisen.
PB^– wurde aus dem Wachstumsmedium durch Heparin-Sepharose-Chromatographie teilweise gereinigt und konzentriert. Heparin-Sepharose (10 ml) wurde mit 0,075 M NaCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCl₂, 0,005% Tween-80, 0,02% Natriumazid, pH-Wert 7,40 äquilibriert. Das Medium (100–200 ml) von den exprimierenden Zellen wurde auf Heparin-Sepharose gegeben, das dann mit 30 ml Äquilibrierungspuffer ohne Natriumazid gewaschen wurde. PB^– wurde mit 0,65 M NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM CaCl₂, 0,01% Tween-80, pH-Wert 7,40 eluiert und bei –80°C gelagert. Die Ausbeute an fVIII-koagulationsfördernder Aktivität betrug typischerweise 50–75%.
Stabile Expression des 8-domänenfreien Schweine-fVIII (PB^–)
Transfizierte Zelllinien wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium F12 aufbewahrt, das 10% fötalem Rinderserum, 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin enthielt. Fötales Rinderserum wurde mittels Wärme bei 50°C während einer Stunde vor Verwendung inaktiviert. HB^–/Re Neo und PB^–ReNeo/NotI (+ AvrII) wurden stabil in BHK-Zellen transfiziert und bezüglich der Geniticin-Resistenz unter Verwendung eines allgemeinen Protokolls ausgewählt, das früher beschrieben worden ist [Lubin et al. (1994) Biol. Chem. 269: 8639–8641), abgesehen davon, dass die exprimierenden Zellen in einem Wachstumsmedium bewahrt wurden, das 600 μg/ml Geneticin enthielt. Zellen aus Corning T-75 Kolben, die zur Konfluenz vermehrt wurden, wurden in Nunc Dreifachkolben in ein Medium, das 600 μg/ml Geneticin enthielt, überführt und zur Konfluenz vermehrt. Das Medium wurde entfernt und durch serumfreies AlM-V-Medium (Life Technologies, Inc.) ohne Geneticin ersetzt. Die Faktor VIII-Expression wurde über die Einstufen-Faktor VIII-koagulationsfördernde Aktivität (siehe oben) überwacht und 100–150 ml Medium wurden einmal täglich während vier bis fünf Tagen gesammelt. Die maximalen Expressionsgehalte im Medium betrugen für HB^– und PB^– 102 Einheiten pro ml beziehungsweise 10–12 Einheiten pro ml an Faktor VIII-koagulationsfördernder Aktivität.
Reinigung von PB^–
PB^– wurde aus dem Kulturüberstand unter Verwendung von 60% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt und dann durch W3-3-Immunaffinitätschromatographie und Mono Q Hochdruckflüssigkeitschromatographie, wie vorher für die Reinigung des aus dem Plasma stammenden Schweine-Faktor VIII beschrieben wurde (Lollat et al. (1993) Faktor VIII/Faktor VIIIa. Methods Enzymol. 222: 128–143], gereinigt. Die spezifische koagulationsfördernde Aktivität von PB^– wurde durch einen Einstufen-Koagulationsassay gemessen [Lollar et al. (1993) s.o.] und war ähnlich zu derjenigen des aus dem Plasma stammenden Schweine-Faktors VIII.
Bei Analyse durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese enthielt das PB^–-Präparat drei Banden mit scheinbaren Molekularmassen von 160 kDa, 82 kDa und 76 kDa. Die 62 kDa und 76 kDa Banden sind früher als Heterodimer beschrieben worden, das die A1-A2- und ap-A3-C1-C2-Domänen enthielt (wobei ap sich auf ein Aktivierungspeptid bezieht) [Toole et al. (1984) Nature 312: 342–347]. Die 160 kDa Bande wurde auf eine Polyvinylidenfluoridmembran überführt und einer NH2-terminalen Sequenzierung unterzogen, die Arg-Ile-Xx-Xx-Tyr (wobei Xx Unbestimmtes darstellt) ergab, das die NH2-terminate Sequenz eines Einzelketten-Faktors VIII ist [Toole et al. (1984) s.o.]. Daher wird PB^– teilweise durch Spaltung zwischen den A2- und A3-Domänen so verarbeitet, dass es aus zwei Formen besteht, einem einzelkettigen A1-A2-ap-A3-C1-C2-Protein und einem A1-A2/ap-A3-C1-C2-Heterodimeren. Eine ähnliche Verarbeitung von rekombinantem HB^– wurde berichtet [Lind et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232: 19–27].
Charakterisierung von Schweine-Faktor VIII
Wir haben die cDNA-Sequenz des Schweine-Faktors VIII bestimmt, die dem 137 bp der 5' UTR, der kodierenden Region des Signalpeptids (57 bp) und den A1- (1119 bp), A3- (990 bp), C1- (456 bp) und C2- (483 bp) Domänen entspricht. Zusammen mit der früher veröffentlichten Sequenz der B-Domäne und den leichte Kette-Aktivierungspeptidregionen [Toole et al. (1986) s.o.] und der A2-Domäne [Lubi et al. (1994) s.o.] vervollständigt die hier berichtete Sequenz die Bestimmung der Schweine-fVIII-cDNA, die dem translatierten Produkt entspricht. Ein Fragment, das die 5'-UTR-Region, Signalpeptid und A1-Domäne-cDNA umfasste, wurde unter Verwendung eines 5'-RACE RT-PCR-Protokolls kloniert. Ein auf der humanen C2-Sequenz basierender Primer erzeugte erfolgreich ein RT-PCR-Produkt, das zur Klonierung der A3-, C1- und 5'-Hälfte der C2-Domäne führte. Die Klonierung der cDNA, die der 3'-Hälfte der C2-Domäne entsprach, und der 3' UTR-cDNA erwies sich als schwierig. Die restliche C2-Domäne wurde schließlich durch ein gezieltes Gen-Walking-PCR-Verfahren kloniert [Parker et al. (1991) s.o.].
Die hier berichtete Sequenz SEQ ID NR: 36 war unzweideutig, abgesehen bei nt 7045 in der Nähe des 3'-Endes der C2-Domäne, das entweder A oder G ist, wie vorstehend hier beschrieben wurde. Das entsprechende Codon ist GAC (Asp) oder AAC (Asn). Die humanen und Mäuse-Codone sind GAC beziehungsweise CAG (Gln). Ob dies einen Polymorphismus oder ein reproduzierbares PCR-Artefakt darstellt, ist unbekannt. Die rekombinanten hybriden Mensch/Schwein B-domänenfreie fVIII-cDNAs, die Schweine-C2-Domäne-Substitutionen enthalten, die sowohl den GAC- als auch AAC-Codonen entsprechen, sind ohne nachweisbaren Unterschied in der prokoagulierenden Aktivität stabil exprimiert worden. Dies weist darauf hin, dass es keinen funktionalen Unterschied zwischen diesen zwei C2-Domänenvarianten gibt.
Die Anordnung der vorhergesagten Aminosäuresequenz des Schweine-fVIII mit voller Länge SEQ ID NR: 37 mit den veröffentlichten humanen [Wood et al. (1984) s.o.] und murinen [Elder et al. (1993) s.o.] Sequenzen wird in den 1A–1H zusammen mit den Stellen für eine post-translationale Modifikation, proteolytische Spaltung und Erkennung durch andere Makromoleküle gezeigt. Der Identitätsgrad der angeordneten Sequenzen ist in Tabelle VII gezeigt. Wie vorher bemerkt wurde divergieren die B-Domänen dieser Spezies mehr als die A- oder C-Domänen. Dies stimmt mit der Beobachtung überein, dass die B-Domäne trotz ihrer größeren Größe keine bekannte Funktion aufweist [Elder et al. (1993) s.o.; Toole et al. (1986) s.o.]. Die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung bestätigen, dass die B-Domäne des Schweine-Faktors VIII für die Aktivität nicht notwendig ist. Basierend auf den hier dargestellten Sequenzdaten kann ein Schweine-fVIII, bei dem die gesamte oder ein Teil der B-Domäne deletiert ist, durch Expression der Schweine-fVIII kodierenden DNA, von der alle oder ein Teil der Codone der Schweine-B-Domäne deletiert sind, synthetisiert werden. Es gibt ebenfalls eine größere Abweichung der Sequenzen, die dem Spaltungspeptid des A1-Domänen-APC/Faktors IXa (Reste 337–372) und dem leichte Kette-Aktivierungspeptid (Tabelle VII) entsprechen. Die Thrombinspaltungsstelle an der Position 336 zur Erzeugung des 337–372 Peptids ist anscheinend in der Maus verloren gegangen, da dieser Rest Glutamin anstelle von Arginin ist [Elder et al. (1993) s.o.]. Die relativ schelle Divergenz der Thrombinspaltungspeptide (oder in Mäuse-fVIII ein möglicherweise restliches 337–372 Aktivierungspeptid) ist früher für Fibrinpeptide beschrieben worden [Creighton, T. E. (1993) In Proteins: Structures and Molecular Properties, W. H. Freeman, New York, Seiten 105–138]. Das Fehlen einer biologischen Funktion bei diesen Peptiden, sobald sie gespalten wurden, ist als ein möglicher Grund für die schnelle Divergenz zitiert worden. Es wurde vorgeschlagen, dass Arg562 in humanem fVIII die wichtigste Spaltungsstelle für aktiviertes Protein C während der Inaktivierung von fVIII und fVIIIa ist [Fay, P. J. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 20139–20145]. Diese Steile ist im humanen, Schweine- und Mäuse fVIII konserviert.
Potentielle N-gebundene Glycosylierungsstellen (NXS/T, wobei X nicht Prolin ist) können in den 1A–1H gesehen werden. Es gibt acht konservierte N-gebundene Glycosylierungsstellen: eine in der A1-Domäne, eine in der A2-Domäne, vier in der B-Domäne, eine in der A3-Domäne und eine in der C1-Domäne. Die 19 Cysteine der A- und C-Domäne sind konserviert, wohingegen bei Cysteinen der B-Domäne eine Divergenz auftritt. Sechs von sieben Disulfidverknüpfungen in fVIII werden an homologen Stellen im Faktor V und Ceruloplasmin vorgefunden und beide Disulfidverknüpfungen der C-Domäne werden im Faktor V vorgefunden [McMullen, B. A. et al. (1995) Protein Sci. 4: 740–746]. Der humane fVIII enthält sulfatisierte Tyrosine an den Positionen 346, 718, 719, 723, 1664 und 1680 [Pittman, D. D. et al. (1992) Biochemistry 31: 3315–3325; Michnick, D. A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 20095–20102]. Diese Reste sind im Mäuse-fVIII und Schweine-fVIII konserviert (1), obwohl es dem CLUSTALW-Programm nicht gelang, das Mäuse-Tyrosin, das Tyr346 im humanen fVIII entsprach, anzuordnen.
Mäuse- und Schweine-Plasma können den Koagulationsfehler im humanen Hämophilie A-Plasma korrigieren, was mit dem Niveau der Konservierung von Resten in den A- und C-Domänen dieser Spezies übereinstimmt. Die prokoagulierende Aktivität von Schweine-fVIII ist derjenigen des humanen fVIII überlegen [Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 23652–23657]. Der rekombinante Schweine-Faktor VIII (mit deletierter B-Domäne), der entsprechend der Beschreibung hier exprimiert und gereinigt ist, zeigt ebenfalls eine größere spezifische koagulationsfördernde Aktivität als der humane fVIII, der mit dem aus dem Plasma stammenden Schweine-fVIII vergleichbar ist. Dies kann auf eine verringerte spontane Dissoziationsgeschwindigkeit der A2-Untereinheit von dem aktiven A1/A2/A3-C1-C2-fVIIIa-Heterotrimer zurückzuführen sein. Ob dieser Unterschied in der prokoagulierenden Aktivität eine evolutionäre Änderung in der Funktion, als Beispiel einer Speziesanpassung, widerspiegelt [Perutz, M. F. (1996) Adv. Protein Chem. 36: 213–244] ist nicht bekannt. Nun, da die Schweine-fVIII-cDNA-Sequenz, die dem translatierten Produkt entspricht, vollständig ist, kann eine homologe Scanning-Mutagenese [Cunningham, B. C., et al. (1989) Science 243: 1330–1336] einen Weg zur Identifikation struktureller Unterschiede zwischen humanem und Schweine-fVIII, die für die überlegene Aktivität der letzteren verantwortlich sind, bereitstellen.
Schweine-fVIII ist typischerweise weniger reaktiv gegenüber inhibitorischen Antikörpern, die in Hämophilen hervorgerufen werden, die einer Transfusion mit fVIII unterzogen wurden, oder die als Autoantikörper in der allgemeinen Population hervorgerufen werden. Dies ist die Basis zur Verwendung von Schweine-fVIII-Konzentrat bei der Behandlung von Patienten mit inhibitorischen Antikörpern [Hay und Lozier (1995) s.o.]. Die meisten Inhibitoren richten sich gegen Epitope, die sich in der A2-Domäne oder C2-Domäne befinden [Fulcher, C. A. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7728–7732; Scandella, D. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6152–6156; Scandella, D. et al. (1989) Blood 74: 1618–1626]. Zusätzlich wurde ein Epitop mit unbekannter Signifikanz identifiziert, das entweder in der A3- oder C1-Domäne ist [Scandella et al. (1989) s.o.; Scandella, D. et al. (1993) Blood 82: 1767–1775; Nakai, H. et al. (1994) Blood 84: 224a]. Das A2-Epitop wurde auf die Reste 484–508 durch homologe Scanning-Mutagenese kartiert [Haeley et al. (1995) s.o.]. In diesem Segment mit 25 Resten gibt es einen relativ geringen Anteil an identischer Sequenz (16/25 oder 64%). Es ist interessant, dass diese Region, die, basierend auf der Tatsache, dass Antikörper gegen sie inhibitorisch sind, funktional bedeutend zu sein scheint, offenbar einer relativ schnelleren genetischen Drift unterworfen ist. Die Anordnung der Schweine-A2-Domäne und A3-Domänen weist darauf hin, dass das A2-Epitop keine nachweisbare Homologie mit der entsprechenden Region in der A3-Domäne gemeinsam hat.
Durch Deletionskartierung wurde vorgeschlagen, dass das C2-Inhibitor-Epitop des humanen fVIII sich innerhalb der Reste 2248–2312 befindet [Scandella, D. et al. (1995) Blood 86: 1811–1819]. Der humane und Schweine-fVIII sind zu 83% in diesem 65 Reste-Segment identisch. Jedoch offenbarte die homologe Scanning-Mutagenese dieser Region zur Charakterisierung des G2-Epitops, dass eine wichtige Determinante des C2-Epitops unerwartet in der den humanen Aminosäuren 2181–2243 (SEQ ID NR: 2) und 1H entsprechenden Region lokalisiert war.
Es wurden Mensch-Schwein Hybridfaktor VIII-Proteine hergestellt, in denen verschiedene Teile der C2-Domäne des humanen Faktors VIII durch die entsprechenden Teile des Schweine-Faktors VIII unter Verwendung der hier beschriebenen Strategie ersetzt wurden. (Beispiel 8) Die Synthese verschiedener C2-Hybridfaktoren VIII wurde durch Konstruktion der das Hybrid kodierenden DNA erreicht, wobei die Nukleotidsequenz, die die in der SEQ ID NR: 37 angegebene Schweine-C2-Region verwendet. Jede Hybrid-DNA wurde in transfizierten Zellen exprimiert, so dass die Hybridfaktoren VIII teilweise aus dem Wachstumsmedium gereinigt werden konnten.
In Abwesenheit eines jeglichen Inhibitors wurde die Aktivität durch einen Einstufen-Koagulationsassay gemessen.
Eine Reihe von fünf humanen Inhibitoren wurde zum Testen von jedem Hybridfaktor VIII verwendet. Es wurde früher gezeigt, dass, basierend auf der Fähigkeit der rekombinanten humanen C2-Domäne zur Neutralisation der Inhibierung, Inhibitor-Plasmen, die den Anti-Faktor VIII-Antikörper enthielten, gegen die humane C2-Domäne gerichtet sind. In allen Testplasmen wurde der Inhibitortiter zu mehr als 79 durch die C2-Domäne oder leichte Kette aber zu weniger als 10% durch die rekombinante humane A2-Domäne neutralisiert. Zusätzlich wurden die C2-Hybridfaktoren VIII gegen einen murinen monoklonalen Antikörper getestet, der die C2-Domäne bindet, und wie humane C2-Inhibitor-Antikörper inhibierte er die Bindung des Faktors VIII an Phospholipid und an den von Willebrand-Faktor.
Durch Vergleich der Antikörper-Inhibitortiter gegen die C2-Hybridfaktoren VIII wurde gezeigt, dass die wichtigste Determinante des humanen C2-Inhibitor-Epitops die Region mit den Resten 2181–2243 (SEQ ID NR: 2, siehe ebenfalls 1H) ist. Anti-C2-Antikörper, die auf eine zum Rest 2253 COOH-terminate Region zielten, wurden in vier von fünf Patientenseren nicht identifiziert. Beim Vergleich von Hybriden mit einer Schweine-Sequenz, die den humanen Aminosäureresten mit den Nummern 2181–2199 und 2207–2243 entsprach, wurde es offensichtlich, dass beide Regionen zur Antikörperbindung beitragen. Die den humanen Resten 2181–2243 entsprechende Schweine-Aminosäuresequenz wird in der SEQ ID NR: 37 mit 1982–2044 nummeriert. Die Sequenz der Schweine-DNA, die die Schweine-Aminosäuren mit den Nummern 1982–2044 kodiert, sind die Nukleotide mit den Nummern 5944–6132 in der SEQ ID NR: 35.
Unter Bezugnahme auf 1H ist ersichtlich, dass es in der Region 2181–2243 16 Unterschiede in Aminosäuren zwischen den humanen und Schweine-Sequenzen gibt. Die Unterschiede wurden bei den Resten 2181, 2182, 2188, 2195–2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224–2227, 2234, 2238 und 2243 gefunden. Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren dieser nummerierten Reste können zur Herstellung eines modifizierten humanen Faktors VIII, der gegen humane Anti-C2-Inhibitor-Antikörper nicht reaktiv ist, ausgeführt werden. Die Alanin-Scanning-Mutagenese stellt ein bequemes Verfahren zur Erzeugung von Alaninsubstitutionen für natürlich vorkommende Reste zur Verfügung, wie früher beschrieben wurde. Aminosäuren, die andere als Alanin sind, können genauso gut substituiert werden, wie hier beschrieben ist. Alaninsubstitutionen für einzelne Aminosäuren, insbesondere solche, die zwischen Mensch/Schwein oder Mensch/Maus nicht identisch sind, oder von denen es höchst wahrscheinlich ist, dass sie zur Antikörperbindung beitragen, können einen modifizierten Faktor VIII mit verringerter Aktivität gegen inhibitorische Antikörper ergeben.
Zusätzlich ergibt die Strategie des Einschiebens von Aminosäuren mit geringerem Potential in der definierten Region der Reste 2181–2243 immunogen zu sein, modifizierte Faktoren VIII mit verringerter Immunogenität. Ein Faktor VIII mit verringerter Immunogenität ist verwendbar als Ergänzung für einen Faktor VIII zur Behandlung von Hämophilie A-Patienten, der gegenüber dem Faktor VIII mit natürlicher Sequenz zu bevorzugen ist. Patienten, die mit dem Faktor VIII mit verringerter Immunogenität behandelt wurden, entwickeln mit geringerer Wahrscheinlichkeit inhibitorische Antikörper und es ist daher weniger wahrscheinlich, dass sie an einer verringerten Wirksamkeit der Behandlung über ihre Lebzeiten hinweg leiden.
Die zusammen genommenen 1A–1H stellen eine Anordnung zum Sequenzvergleich der Aminosäuresequenzen des humanen, Schweine- und Mäuse-Faktors VIII bereit. 1A vergleicht Signalpeptidregionen (human, SEQ ID NR: 40, Schwein, SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 1–19; murin, SEQ ID NR: 6. Aminosäuren 1–19). Es ist anzumerken, dass die Aminosäuren in den 1A–1H mit dem ersten Alanin des reifen Proteins als Nummer 1 nummeriert sind, wobei den Aminosäuren des Signalpeptids negative Zahlen zugeordnet sind. Die humane fVIII-Sequenz in SEQ ID Nr.: 2 beginnt ebenfalls mit dem ersten Alanin des reifen Proteins als Aminosäure Nummer 1. In den Aminosäuresequenzen des Mäuse-fVIII (SEQ ID Nr.: 6) und Schweine-fVIII (SEQ ID NR: 37) ist die erste Aminosäure (Alanin) der reifen Sequenz die Aminosäure Nummer 20. Die 1A–1H zeigen eine Anordnung der entsprechenden Sequenzen des humanen, Mäuse- und Schweine-fVIII, so, dass die Regionen mit der größten Aminosäureidentität nebeneinander gestellt sind. Die Aminosäurenummern in den 1A–1H gelten nur für den humanen fVIII. 1B gibt die Aminosäuresequenzen für die humane (SEQ ID NR: 2, Aminosäuren 1–372), Schweine- (SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 20–391) und murine A1-Domäne (SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 20–391) an. 1C stellt Aminosäuresequenzen für die Faktor VIII-A2-Domänen vom Menschen (SEQ ID NR: 2, Aminosäuren 373–740), Schwein (SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 392–759) und Maus (SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 392–759) bereit. 1D stellt die Aminosäuresequenzen für die B-Domänen des Faktors VIII vom Menschen (SEQ ID NR: 2, Aminosäuren 741–1648), Schwein (SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 760–1449) und Maus (SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 760–1640) bereit. 1E vergleicht die Aminosäuresequenzen der Faktor VIII leichte Kette-Aktivierungspeptide von Mensch, Schwein und Maus (SEQ ID NR: 2, Aminosäuren 1649–1689; SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 1450–1490; beziehungsweise SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 1641–1678). 1F stellt den Sequenzvergleich für A3-Domänen des humanen, Schweine- und Mäuse-Faktors VIII bereit (SEQ ID NR: 2, Aminosäuren 1690–2019,; SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 1491–1820; beziehungsweise SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 1679–2006). 1G stellt die Aminosäuresequenzen der C1-Domänen des Faktors VIII von Mensch, Schwein und Maus bereit (SEQ ID NR: 2, Aminosäuren 2020–2172; SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 1821–1973 beziehungsweise SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 2007–2159). 1H stellt Sequenzdaten für die C2-Domänen der Faktor VIII-C2-Domänen von Mensch, Schwein und Maus bereit (SEQ ID NR: 2, Aminosäuren 2173–2332; SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 1974–2133 beziehungsweise SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 2160–2319).
Die Rauten stellen Tyrosinsufatisierungsstellen, für den Faktor IXa vorgeschlagene Bindungsstellen, Phosholipid und Protein C, die doppelt unterstrichen sind, und Regionen dar, die die Bindung von Anti-A2- und Anti-C2-inhibitorischen Antikörpern betreffen, die kursiv gedruckt sind. Sternchen heben Aminosäuresequenzen hervor, die konserviert sind. Siehe ebenfalls SEQ ID NR: 36 (Schweine-Faktor VIII-cDNA) und SEQ ID NR: 37 (vom Schweine-Faktor VIII abgeleitete Aminosäuresequenz). Das Nummerierungssystem beim Mensch wird als Bezugssystem verwendet [Wood et al. (1984) s.o.]. Die A1-, A2- und B-Domänen sind durch Thrombin-Spaltungsstellen an den Positionen 372 und 740 und einer nicht bekannten Protease-Spaltungsstelle an der Position 1648 als Reste 1–372, 373–740 beziehungsweise 741–1648 definiert [Eaton, D. L. et al. (1986) Biochemistry 25: 8343–8347]. Die A3-, C1 und C2-Domänen sind als Reste 1690–2019, 2020–2172 beziehungsweise 2173–2332 definiert [Vehar et al. (1984) s.o.]. Spaltungsstellen für Thrombin (Faktor IIa), Faktor IXa, Faktor Xa und APC [Fay et al. (1991) s.o.; Eaton, D. et al. (1986) Biochemistry 25: 505–512; Lamphear, B. J. et al. (1992) Blood 80: 3120–3128] werden durch Stellen des Enzymnamens über das reaktive Arginin angezeigt. Ein saures Peptid wird von der fVIII-leichten Kette durch Thrombin oder Faktor Xa an der Position 1689 abgespalten. Bindungsstellen, die für den Faktor IXa [Fay, P. J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 20522–20527; Lenting, P. J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 7150–7155), Phospholipid [Foster, P. A. et al. (1990) Blood 75: 1999–2004] und Protein C [Walker, F. J. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 1484–1489] vorgeschlagen sind, sind doppelt unterstrichen. Regionen, die in der Bindung von Anti-A2 [Lubin et al. (1994) s.o.; Healey et al. (1995) s.o.] involviert sind und früher für Anti-C2-inhibitorische Antikörper vorgeschlagen wurden, sind in Kursivdruck. Das C2-Inhibitor-Epitop, wie es hier beschrieben ist (humane Aminosäuren 2181–2243) wird durch einfache Unterstreichung in 1H angezeigt. Tyrosinsulfatisierungsstellen [Pittman et al. (1992) s.o.; Michnick et al. (1994) s.o.] sind durch ♦ angezeigt.
Die Nukleotidsequenz, die den Faktor VIII mit fehlender B-Domäne kodiert, ist in SEQ ID NR: 38 angegeben und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NR: 39 bereitgestellt.

Claims

Modifizierter humaner Faktor VIII, umfassend eine Aminosäure-Substitution an einer oder mehreren Position(en), die den Positionen 490, 493, 498 und 504 von SEQ ID NR: 2 entsprechen, wobei die Substitution eine Insertion einer Immunoreaktivitäts-reduzierenden Aminosäure für eine natürlich vorkommende Aminosäure ist und wobei der modifizierte Faktor VIII prokoagulierende Aktivität aufweist.
Modifizierter Faktor VIII nach Anspruch 1, wobei der modifizierte Faktor VIII eine reduzierte Reaktivität gegenüber einem inhibitorischen Antikörper im Vergleich zum nicht-modifizierten Faktor VIII aufweist.
Modifizierter Faktor VIII nach Anspruch 1, wobei die Aminosäure-Substitution an einer oder mehreren Position(en), ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 490 und 493, durchgeführt wird.
Modifizierter Faktor VIII nach Anspruch 1, wobei die Aminosäure-Substitution an einer oder mehreren Position(en), ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 498 und 504, durchgeführt wird.
Modifizierter Faktor VIII nach Anspruch 1, wobei eine Aminosäure-Substitution an Position 490 durchgeführt wird.
DNA, die eine modifizierte humane Faktor VIII A2-Domäne kodiert, wobei die DNA eine oder mehrere Nukleotid-Substitution(en) aufweist, die in einem Wechsel der Kodierung an einer oder mehreren Aminosäure-Position(en), die den Positionen 490, 493, 498, 499 und 504 von SEQ ID NR: 2 entsprechen, resultieren, wobei dieser Wechsel eine Immunoreaktivitäts-reduzierende Aminosäure an der ausgesuchen Position kodiert.
DNA nach Anspruch 6, wobei die ausgesuchte Aminosäure-Position aus der Gruppe, bestehend aus 490 und 493, ausgewählt ist.
DNA nach Anspruch 6, wobei die ausgesuchte Aminosäure-Position aus der Gruppe, bestehend aus 498 und 504, ausgewählt ist.
DNA nach Anspruch 6, wobei die ausgesuchte Aminosäure-Position Aminosäure-Position 490 ist.
Expressionsprodukt einer humanen oder hybriden Mensch/Säuger Faktor VIII kodierenden DNA, wobei die DNA eine DNA, die eine modifizierte A2-Domäne kodiert, umfaßt und die DNA eine oder mehrere Nukleotid-Substitution(en) aufweist, die in einem Wechsel der Kodierung an einer oder mehreren Aminosäure-Position(en), die den Positionen 490, 493, 498 und 504 von SEQ ID NR: 2 entsprechen, resultieren, wobei der Wechsel eine Immunoreaktivitäts-reduzierende Aminosäure an der ausgesuchten Position kodiert.
Expressionsprodukt nach Anspruch 10, wobei die die modifizierte A2-Domäne kodierende DNA eine Aminosäure-Substitution an einer oder mehreren der Aminosäure-Position(en), ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 490 und 493, kodiert.
Expressionsprodukt nach Anspruch 10, wobei die die modifizierte A2-Domäne kodierende DNA eine Aminosäure-Substitution an einer oder mehreren Aminosäure-Position(en), ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 498 und 504, kodiert.
Expressionsprodukt nach Anspruch 10, wobei die die modifizierte A2-Domäne kodierende DNA eine Aminosäure-Substitution an Position 490 kodiert.
Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Säuger-Faktor VIII A2-Domäne, umfassend die Schritte des Mutierens der die Domäne kodierenden DNA an einem oder mehreren Kodon(s), welche Aminosäuren an den Positionen, die den Positionen 490, 493, 498 und 504 des wie in SEQ ID NR: 2 gezeigten humanen Faktors VIII entsprechen, kodieren, wodurch ein oder mehrere mutierte Kodon(s), die eine Aminosäure kodieren, für ein entsprechendes natürlich vorkommendes Kodon substituiert wird und in einer Wirtszelle die mutierte Kodons umfassende DNA entweder unabhängig voneinander oder in einer angrenzenden translatierbaren Sequenz mit DNA, die eine andere Domäne des Faktors VIII kodiert, exprimiert wird, wodurch eine modifizierte Faktor VIII A2-Domäne hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die zu mutierende DNA humane DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die zu mutierende DNA Schweine-DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die zu mutierende DNA Mäuse-DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei ein mutiertes Kodon eine Immunoreaktivitäts-reduzierende Aminosäure kodiert.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei ein mutiertes Kodon eine Aminosäure an einer Position, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 490 und 493, kodiert.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei ein mutiertes Kodon eine Aminosäure an einer Position, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 498 und 504, kodiert.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei ein mutiertes Kodon eine Aminosäure an Position 490 kodiert.