JP2003508019A - 修飾されたｖｉｉｉ因子 - Google Patents

修飾されたｖｉｉｉ因子

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Abstract

(57)【要約】 ヒトのＶＩＩＩ因子の特定アミノ酸の座が、ＶＩＩＩ因子で治療された後に阻害的な抗体を生ずる血友病患者の抗体と相互作用する。Ａ２ドメインの位置４８４〜５０８の１以上のアミノ酸で置換によってアミノ酸配列を変えて修飾されたＶＩＩＩ因子が開示される。修飾されたＶＩＩＩ因子は血友病者の凝固因子サプリメントとして有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出題に対するクロスリファレンス 本出願は、１９９９年５月２０日付の米国特許出願第０９／３１５,１７９号
からの優先権を請求するものである。
【０００２】 連邦研究支援の承認 政府は、本発明に導く研究の資金を一部提供した国立衛生研究所助成金第４２
４６２１５号に基づき発生する本発明に対する権利を有する者である。
【０００３】 発明の背景 本発明は一般に、ヒト及び動物のＶＩＩＩ因子アミノ酸配列をもつか又はヒト
ＶＩＩＩ因子及び非ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列をもつハイブリッドＶＩＩＩ因子
、及びその調製及び使用方法に関する。
【０００４】 血液凝固は、病巣部位において損傷を受けた血管の切断された壁に血小板が付
着した時に起こる。その後、酵素で調節される反応カスケードの中で、可溶性フ
ァブリノーゲン分子が、酵素トロンビンにより、血栓内で血小板をまとめて保持
するフィブリンの不溶性ストランドへと変換される。該カスケード内の各ステッ
プにおいて、タンパク質前駆物質は、系列内の次のタンパク質前駆物質を分割す
るプロテアーゼへと変換される。大部分のステップで補因子が必要となる。
【０００５】 ＶＩＩＩ因子は、フォン・ウィルブランド因子に対し非共有的にかつ密に結合
した血液中の不活性前駆物質として循環する。ＶＩＩＩ因子は、トロンビン又は
Ｘａ因子によってタンパク質分解的に活性化させられ、このトロンビン又はＸａ
因子がそれをフォン・ウィルブランド因子から解離させカスケード内のそのプロ
凝固性機能を活性化させる。その活性形態において、タンパク質ＶＩＩＩａ因子
は、Ｘ因子活性化に向かってのＩＸａ因子の触媒効率を数ケタ分増大させる補因
子である。
【０００６】 ＶＩＩＩ因子での治療を受けていない、ＶＩＩＩ因子又は対ＶＩＩＩ因子抗体
欠損症を患う人は、関節内の炎症性反応から早期死亡に至るまでの一定範囲の重
大な症候をひき起こす可能性のある制御されていない内出血に苦しんでいる。米
国で約１００００人にのぼる重症血友病素因者は、充分な頻度及び濃度で投与さ
れた場合に血液の正常な凝固能力を回復させることになるヒトＶＩＩＩ因子の輸
注による治療を受けることができる。事実、ＶＩＩＩ因子は従来、血友病Ａ患者
から誘導された血漿中の血液凝固欠陥を矯正する正常な血漿内に存在する物質と
して定義づけされている。
【０００７】 ＶＩＩＩ因子の活性を阻害する抗体（「阻害物質」又は「阻害性抗体」）の発
生は、血友病患者の管理における重大な合併症である。ＶＩＩＩ因子の治療的輸
注に応答して、血友病Ａ患者のほぼ２０％において自己抗体が発生している。そ
れ以前には治療を受けておらずに阻害物質を発生させた患者では、通常１年未満
の治療期間内に阻害物質が発生する。さらに、それまで正常なＶＩＩＩ因子レベ
ルを有していた患者において、時としてＶＩＩＩ因子を不活性化させる自己抗体
が発生する。阻害物質の力価が充分に低い場合、ＶＩＩＩ因子用量を増加させる
ことによって患者を管理することができる。しかしながら往々にして、阻害物質
力価は非常に高くそのためＶＩＩＩ因子によってそれに対抗することはできない
。代替的な１つの戦略は、第ＩＸ因子複合調製物[例えばＫＯＮＹＮＥ（登録商
標）、Proplex（登録商標）]又は組換え型ヒト第ＶＩＩａ因子を用いて正常な止
血中にＶＩＩＩ因子に対する需要を迂回させることにある。さらに、ブタＶＩＩ
Ｉ因子はヒトＶＩＩＩ因子に比べ阻害物質との反応性が通常実質的に低いことか
ら、部分的に精製されたブタＶＩＩＩ因子調製物[ＨＹＡＴＥ：Ｃ（登録商標）]
が使用される。ヒトＶＩＩＩ因子に対し阻害性抗体を発生させた数多くの患者は
ブタＶＩＩＩ因子での治療を受けて成功しており、かかる治療を長期間にわたり
寛容していた。しかしながら、単数又は複数回の輸注の後にブタＶＩＩＩ因子に
対して阻害物質が発生しうることから、ブタＶＩＩＩ因子の投与も完全な解決法
ではない。
【０００８】 血友病Ａの治療用として、さまざまな純度のヒト血漿由来のＶＩＩＩ因子のい
くつかの調製物が市販されている。これらには、ウイルスに対して加熱処理又は
洗剤処理されているものの有意なレベルで抗原性タンパク質を含有する、数多く
のドナーのプールされた血液から誘導された部分精製済みＶＩＩＩ因子；抗原性
不純物及びウイルス汚染のレベルがより低いモノクローナル抗体で精製されたＶ
ＩＩＩ因子；及び現在その臨床試験が行なわれている組換え型ヒトＶＩＩＩ因子
が含まれる。残念なことに、ヒトＶＩＩＩ因子は、生理的濃度及びｐＨで不安定
であり、血中に極めて低濃度（血漿１mlあたり０.２μｇ）でしか存在せず、特
異的血液凝固活性が低い。
【０００９】 血友病素因者は、出血及びその結果発生する変形性血友病関節症を防止するべ
くＶＩＩＩ因子を毎日交換することを必要とする。しかしながら供給は不適切で
あり、分離及び精製上の問題、免疫原性及びエイズ及び肝炎感染性のリスクを除
去する必要性に起因して、治療的使用には問題がある。組換え型ヒトＶＩＩＩ因
子又は部分的に精製されたブタＶＩＩＩ因子の使用によっても、全ての問題が解
決されるわけではない。
【００１０】 一般に使用されている市販の血漿由来ＶＩＩＩ因子に付随する問題は、より優
れたＶＩＩＩ因子製品の開発に対する多大な関心を刺激してきた。従って、１分
子あたりより多くの血液凝固活性単位を送達できるようにより高い効力をもつＶ
ＩＩＩ因子分子； 選択されたｐＨ及び生理的濃度で安定しているＶＩＩＩ因子
分子； 阻害性抗体の産生をひき起こす可能性がより低いＶＩＩＩ因子分子； そ
してヒトＶＩＩＩ因子に対する抗体をすでに獲得した患者における免疫検出を回
避するＶＩＩＩ因子分子に対するニーズが存在している。
【００１１】 従って、本発明の目的は、ＶＩＩＩ因子が欠損しているか又はＶＩＩＩ因子に
対する阻害物質を有する患者における血友病を矯正するＶＩＩＩ因子を提供する
ことにある。
【００１２】 本発明のさらなる目的は、血友病素因者の治療方法を提供することにある。
【００１３】 本発明のさらにその他の目的は、選択されたｐＨ及び生理学的濃度で安定して
いるＶＩＩＩ因子を提供することにある。
【００１４】 本発明のさらにその他の目的は、ヒトＶＩＩＩ因子よりも大きい凝固活性をも
つＶＩＩＩ因子を提供することにある。
【００１５】 本発明のさらなる目的は、それに対し産生される抗体が比較的少ないＶＩＩＩ
因子を提供することにある。
【００１６】 発明の要約 本発明は、ヒト及びブタ又はその他の非ヒト哺乳動物（本書ではまとめて「動
物」と呼ぶ）から誘導されたＶＩＩＩ因子アミノ酸配列をもつハイブリッドＶＩ
ＩＩ因子を内含するか又は第２の実施形態においては、好ましくはＶＩＩＩ因子
の抗原性及び／又は免疫原性領域内で置換されている、ＶＩＩＩ因子に対する既
知の配列同一性を全くもたないアミノ酸配列（非ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列）及
びヒト又は動物又はその両方から誘導されたＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を有する
ハイブリッド等価物のＶＩＩＩ因子を内含する、凝固活性をもつ分離され精製さ
れたハイブリッドＶＩＩＩ因子分子及びその断片を提供する。当業者であれば、
制限的な意味なく、ヒトＶＩＩＩ因子に比べて大きい凝固活性（「より優れた凝
固活性」）をもつヒト／動物ＶＩＩＩ因子；非免疫原性ヒト／等価物ＶＩＩＩ因
子；非抗原性ヒト／等価物又はヒト／動物ＶＩＩＩ因子； より優れた凝固活性
をもつ非免疫原性ヒト／動物又はヒト／等価物ＶＩＩＩ因子； より優れた凝固
活性をもつ非抗原性ヒト／動物又はヒト／動物／等価物ＶＩＩＩ因子；非免疫原
性、非抗原性ヒト／等価物又はヒト／等価物／動物ＶＩＩＩ因子；及びより優れ
た凝固活性をもつ非免疫原性、非抗原性ヒト／動物／等価物ＶＩＩＩ因子を含め
た数多くのハイブリッドＶＩＩＩ因子構成体を調製できることを認識することだ
ろう。
【００１７】 ハイブリッドＶＩＩＩ因子分子は、ヒト及び動物のＶＩＩＩ因子のサブユニッ
ト又はドメインの分離及び組換え或いはヒト及び動物のＶＩＩＩ因子遺伝子の遺
伝子工学処理により産生される。
【００１８】 好ましい実施形態においては、ヒトＶＩＩＩ因子の対応する要素の代りに動物
のＶＩＩＩ因子の要素を用い、結果としてハイブリッドヒト／動物ＶＩＩＩ因子
分子を得るために、組換え型ＤＮＡ方法が使用される。第２の好ましい実施形態
においては、ヒト又は動物のＶＩＩＩ因子内又はハイブリッドヒト／動物ＶＩＩ
Ｉ因子内の単数又は複数のアミノ酸を、ＶＩＩＩ因子との既知の配列同一性を全
くもたないアミノ酸、好ましくはＶＩＩＩ因子に対する自然に発生する阻害性抗
体との免疫反応性がヒトＶＩＩＩ因子に比べて低いアミノ酸配列（「非抗原性ア
ミノ酸配列」）及び／又はヒトＶＩＩＩ因子に比べてＶＩＩＩ因子に対する抗体
の産生を惹起する可能性の低いアミノ酸配列（「非免疫原性アミノ酸配列」）で
置換するために、組換え型ＤＮＡ方法が使用される。免疫原性又は抗原性配列と
置換するのに使用できるアミノ酸配列の一例は、アラニン残基の配列である。
【００１９】 その他の実施形態においては、ＶＩＩＩ因子のサブユニットは、ヒト又は動物
の血漿から分離及び精製され、ハイブリッドヒト／動物ＶＩＩＩ因子は、動物の
Ｈ鎖サブユニットとヒトＬ鎖サブユニットの混合又はヒトＨ鎖サブユニットと動
物のＬ鎖サブユニットの混合のいずれかにより産生され、かくしてヒトＬ鎖／動
物Ｈ鎖及びヒトＨ鎖／動物Ｌ鎖のハイブリッド分子が産生される。これらのハイ
ブリッド分子はイオン交換クロマトグラフィによって分離される。
【００２０】 代替的には、ＶＩＩＩ因子の単数又は複数のドメイン又は部分的ドメインが、
ヒト又は動物の血漿から分離され精製され、１つの種からのドメイン又は部分的
ドメインを第２の種のドメイン又は部分的ドメインと混合することにより、ハイ
ブリッドヒト／動物ＶＩＩＩ因子が産生される。ハイブリッド分子は、イオン交
換クロマトグラフィにより分離できる。
【００２１】 （ａ） 血漿由来のヒトＶＩＩＩ因子のサブユニットと血漿由来の動物ＶＩＩ
Ｉ因子のサブユニットの分離とそれに続くヒト及び動物のサブユニットの混合に
よる凝固活性の再構築、及びそれに続く、イオン交換クロマトグラフィによるハ
イブリッドヒト／動物ＶＩＩＩ因子の分離；（ｂ） 血漿由来のヒトＶＩＩＩ因
子のドメイン又は部分的ドメインと血漿由来の動物ＶＩＩＩ因子のドメイン又は
部分的ドメインの分離、及びそれに続くヒト及び動物のドメインの混合による凝
固活性の両構築、及びそれに続くイオン交換クロマトグラフィによるハイブリッ
ドヒト／動物ＶＩＩＩ因子の分離；（ｃ） 組換え型ＤＮＡ技術による動物のＶ
ＩＩＩ因子のドメイン又は部分的ドメインの構築及び凝血活性をもつハイブリッ
ドヒト／動物ＶＩＩＩ因子を産生するための動物及びヒトのＶＩＩＩ因子のドメ
インの組換え型交換；（ｄ） １つの種のＶＩＩＩ因子の特異的アミノ酸残基を
その他の種のＶＩＩＩ因子の対応するユニークアミノ酸残基と置き換えることに
よるハイブリッドヒト／動物ＶＩＩＩ因子の創造；又は（ｅ） ＶＩＩＩ因子の
特異的アミノ酸残基が部位特異的突然変異誘発によりＶＩＩＩ因子に対する既知
の配列同一性を全くもたないアミノ酸残基と置き換えられている、ヒト又は動物
のアミノ酸配列又はその両方をもつハイブリッド等価物ＶＩＩＩ因子分子の創造
、という段階を有する、高度に精製されたハイブリッドＶＩＩＩ因子を調製する
ための方法が記述されている。
【００２２】 本書で記述されているブタＶＩＩＩ因子をコードする全ＤＮＡ配列の決定によ
り、初めて、適切な宿主細胞内でブタＶＩＩＩ因子をコードするＤＮＡを発現さ
せることによる全長ブタＶＩＩＩ因子の合成が可能となった。従って、精製され
た組換え型ブタＶＩＩＩ因子が、本発明の１つの態様である。ブタＶＩＩＩ因子
の各ドメインをコードするＤＮＡならびにその任意の特定された断片を同様に、
独自でか又はヒトＶＩＩＩ因子をコードするＤＮＡと組合わせた形で発現させて
、本書に記述するハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子を作ることができる。さ
らに、Ｂドメインの全て又は一部が欠失したブタｆｖＩＩＩ（Ｂドメイン無しの
ブタｆｖＩＩＩ）は、Ｂドメインの単数又は複数のコドンの欠失を有するブタｆ
ｖＩＩＩをコードするＤＮＡの発現により、本発明の一部として利用可能となっ
ている。
【００２３】 ハイブリッド又はハイブリッド等価物のＶＩＩＩ因子の一部の実施形態は、ヒ
トＶＩＩＩ因子のものよりも大きくかつブタＶＩＩＩ因子に等しいかそれより大
きい特異的活性を有する。ハイブリッド又はハイブリッド等価物のＶＩＩＩ因子
の一部の実施形態は、ヒト又はブタのＶＩＩＩ因子に比べて、ヒト又はブタにお
けるより低い免疫原性及び／又はＶＩＩＩ因子に対する阻害性抗体に等しいか又
はより低い免疫反応性を有する。
【００２４】 同様に提供されているのは、医薬組成物及びハイブリッド又はハイブリッド等
価物のＶＩＩＩ因子を投与する段階を含むＶＩＩＩ因子欠損症患者の治療方法で
ある。
【００２５】 （発明の詳細な説明） 相反する規定又は指示の無いかぎり、本書で使用される「ＶＩＩＩ因子」とい
うのは、任意の動物、任意のハイブリッドＶＩＩＩ因子又は修飾されたＶＩＩＩ
因子からのあらゆる機能的ＶＩＩＩ因子タンパク質分子を意味し、「ハイブリッ
ドＶＩＩＩ因子」又は「ハイブリッドタンパク質」というのは、ヒト、ブタ及び
／又は非ヒト、非ブタ哺乳動物種由来のＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含むあらゆ
る機能的ＶＩＩＩ因子タンパク質分子又はその断片を意味する。かかる組合せに
は、（１）ヒト／ブタ；（２）ヒト／非ヒト、非ブタ哺乳動物例えばヒト／マウ
ス；（３）ブタ／非ヒト、非ブタ哺乳動物、例えば、マウス／イヌといったハイ
ブリッドＶＩＩＩ因子分子又は断片のいずれか又は全てが包含されるが、これら
に制限されるわけではない。かかる組合せには同様に、ＶＩＩＩ因子に対する既
知の配列同一性を全くもたないアミノ酸配列が置換されているハイブリッド、ヒ
ト、ブタ、又は非ヒト、非ブタ哺乳動物由来のＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含む
、さらに以下で定義するようなハイブリッドＶＩＩＩ因子等価分子又はその断片
も包含される。かかるハイブリッド組合せには同様に、ＶＩＩＩ因子に対する既
知の配列同一性を全くもたないアミノ酸配列が置換されている２つ以上の種又は
ヒト／ブタ／マウスといった２つ以上の種から誘導されたハイブリッドＶＩＩＩ
因子アミノ配列も包含される。相反する指示のないかぎり、「ハイブリッドＶＩ
ＩＩ因子」には、研究目的のプローブとして又は診断用試薬として、１つの実施
例の中で以下に記述するように使用することのできる、ハイブリッドＶＩＩＩ因
子の断片も包含される。
【００２６】 本書で使用される「哺乳動物ＶＩＩＩ因子」には、相反する規定のないかぎり
、任意の非ヒト哺乳動物から誘導されたアミノ酸配列を伴うＶＩＩＩ因子が含ま
れる。本書で使用される[動物]というのは、ブタ及びその他の非ヒト哺乳動物を
示す。
【００２７】 本書で使用される「融合タンパク質」又は「融合ＶＩＩＩ因子又はその断片」
というのは、１つのタンパク質のためのコーディング配列が、例えば融合タンパ
ク質をコードするハイブリッド遺伝子を産生するために異なる遺伝子からの第２
のタンパク質のためのコーディング配列にその一部分を融合させることによって
広範に改変されているようなハイブリッド遺伝子の産物のことである。本書で使
用されているように、融合タンパク質は、本出願で記述されているハイブリッド
ＶＩＩＩ因子タンパク質のサブセットである。
【００２８】 本書で使用されているような、「対応する」核酸又はアミノ酸又はそのいずれ
かの「対応する」配列とは、核酸又はアミノ酸番号は同一でないかもしれないも
のの、その他の種のＶＩＩＩ因子分子内の１つの部位としての機能及び／又は構
造が同じである、ＶＩＩＩ因子又はハイブリッドＶＩＩＩ因子分子又はその断片
内の一部位に存在するもののことである。その他のＶＩＩＩ因子配列「に対応す
る」配列は、実質的にかかる配列に対応し、ストリンジェント条件下で指定され
た配列番号の配列に対してハイブリッド形成する。その他のＶＩＩＩ因子配列「
に対応する」配列は同様に、ＶＩＩＩ因子又は請求されているプロ凝固性ハイブ
リッドＶＩＩＩ因子又はその断片の発現を結果としてもたらし、遺伝子コードの
冗長性は別にして、指定された配列番号にハイブリッド形成することになる配列
も包含される。
【００２９】 本書で使用するような「ユニーク」アミノ酸残基又は配列というのは、その他
の種のＶＩＩＩ因子分子内の相同な残基又は配列とは異なる１つの種のＶＩＩＩ
因子分子内のアミノ酸配列又は残基のことである。
【００３０】 本書で使用する「特異的活性」というのは、ヒトＶＩＩＩ因子欠損性血漿の凝
固欠陥を矯正することになる活性のことである。特異的活性は、ヒトＶＩＩＩ因
子欠損性血漿の血液凝固時間を正常なヒトの血漿のものと比較する標準的検定に
おいて、合計ＶＩＩＩ因子タンパク質１ミリグラムあたりの血液凝固活性の単位
で測定される。ＶＩＩＩ因子活性の１単位は、正常なヒトの血漿１ミリリットル
中に存在する活性である。検定において、血塊形成のための時間が短かくなれば
なるほど、検定対象のＶＩＩＩ因子の活性は大きくなる。ハイブリッドヒト／ブ
タＶＩＩＩ因子は、ヒトＶＩＩＩ因子検定において、凝固活性を有する。この活
性は、その他のハイブリッド又はハイブリッド等価物のＶＩＩＩ因子分子又はそ
の断片のものと同様、血漿由来の又は組換え型のいずれかのヒトＶＩＩＩ因子の
ものよりも小さくても、同等であっても又は大きくてもよい。
【００３１】 ヒトＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡヌクレオチド及び予測されたアミノ酸配列は、そ
れぞれ配列番号１及び２に示されている。ＶＩＩＩ因子は、「ドメイン」配列Ｎ
Ｈ2−Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２−ＣＯＯＨを定義する内部配列相同性
をもつ約３００ｋＤａの１本鎖タンパク質として合成される。ＶＩＩＩ因子分子
において、本書で使用する「ドメイン」は、内部アミノ酸配列同一性及びトロン
ビンによるタンパク質分解性分割部位によって定義されるアミノ酸の連続的配列
のことである。相反する規定のないかぎり、ＶＩＩＩ因子ドメインは、ヒトアミ
ノ酸配列（配列番号２）と整列させたとき以下のアミノ酸残基を包含する： Ａ
１、残基Ａｌａ１−Ａrg３７２；Ａ２、残基Ser３７３−Ａrg７４０；Ｂ、残基
Ｓer７４１−Ａrg１６４８；Ａ３、残基Ｓer１６９０−Ｉle２０３２；Ｃ１、残
基Ａrg２０３３−Ａsn２１７２；Ｃ２、残基Ｓer２１７３−Ｔyr２３３２。Ａ３
−Ｃ１−Ｃ２配列には、残基Ｓer１６９０−Ｔyr２３３２が含まれる。残りの配
列、残基Ｇlu１６４９−Ａrg１６８９は通常、ＶＩＩＩ因子Ｌ鎖活性化ペプチド
と呼ばれる。ＶＩＩＩ因子は、フォン・ウィルブランド因子からそれを解離して
、プロ凝固性機能をもつＶＩＩＩａ因子を形成するトロンビン又はＸａ因子によ
って、タンパク質分解により活性化される。ＶＩＩＩａ因子の生物学的機能は、
Ｘ因子に向かうＩＸａ因子の触媒効率を数ケタ分増大させることにある。トロン
ビンで活性化されるＶＩＩＩａ因子は、血小板又は単球の表面上でＩＸａ因子及
びＸ因子と複合体を形成する１６０ｋＤａのＡ１／Ａ２／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ヘテ
ロ三量体である。本書で使用されている「部分的ドメイン」というのは、１つの
ドメインの一部を成す連続するアミノ酸配列である。
【００３２】 本書で使用されるヒト又は動物のＶＩＩＩ因子の「サブユニット」は、タンパ
ク質のＨ鎖及びＬ鎖である。ＶＩＩＩ因子のＨ鎖は、３つのドメイン、Ａ１、Ａ
２及びＢを含む。ＶＩＩＩ因子のＬ鎖も、３つのドメイン、Ａ３、Ｃ１及びＣ２
を含む。
【００３３】 ハイブリッドＶＩＩＩ因子又はその断片は、（１）対応するヒトサブユニット
又は動物サブユニットに対する分離された血漿由来の動物のサブユニット又はヒ
トサブユニット（Ｈ鎖又はＬ鎖）の置換によって；（２）対応する動物のドメイ
ン又はヒトのドメインに対するヒトのドメイン又は動物のドメイン（Ａ１、Ａ２
、Ａ３、Ｂ、Ｃ１及びＣ２）の置換によって； （３）動物のドメイン又はヒト
のドメインの一部分に対するヒトのドメイン又は動物のドメインの一部分の置換
によって； （４）対応する動物又はヒトのアミノ酸（単複）に対する単数又は
複数のユニークなヒト又は動物のアミノ酸を含む少なくとその他の特異的配列の
置換によって； 又は、（５）ヒト、動物又はハイブリッドのＶＩＩＩ因子又は
その断片の中の単数又は複数の特異的アミノ酸残基を含む少なくとその他の配列
に対する、ＶＩＩＩ因子と既知の配列同一性を全くもたないアミノ酸配列の置換
によって、作ることができる。本書で使用されている、「Ｂドメインの無い」ハ
イブリッドＶＩＩＩ因子、ハイブリッド等価物のＶＩＩＩ因子又はそのいずれか
の断片というのは、Ｂドメイン又はその一部が欠如している本書に記述されたハ
イブリッドＶＩＩＩ因子構成体のいずれか１つのことである。
【００３４】 本書で使用される「エピトープ」、「抗原部位」及び「抗原決定基」という語
は、同義語として用いられ、１つの抗体によって特異的に認識されるヒト、動物
、ハイブリッド又はハイブリッド等価物のＶＩＩＩ因子又はその断片の一部分と
して定義づけされる。これは、任意の数のアミノ酸残基で構成され得、タンパク
質の一次、二次又は三次構造により左右され得る。本開示に従うと、少なくとそ
の他のエピトープを包含するハイブリッドＶＩＩＩ因子、ハイブリッドＶＩＩＩ
因子等価物又はそのいずれかの断片を、以下で記述する診断検定における試薬と
して使用することができる。いくつかの実施形態においては、ハイブリッド又は
ハイブリッド等価物のＶＩＩＩ因子又はその断片は、交叉反応性をもたないか又
は、ヒト又はブタのＶＩＩＩ因子に比べて全ての天然に発生する阻害性ＶＩＩＩ
因子抗体との交叉反応性が低いものである。
【００３５】 本書で用いられる「免疫原性部位」という語は、本書で記述する例えばＥＬＩ
ＳＡといった免疫決定法又はベセスダ検定といったような日常的プロトコルによ
って測定されるようなヒト又は動物におけるＶＩＩＩ因子、ハイブリッド、ハイ
ブリッド等価物又は断片に対する抗体の産生を特異的に惹起するヒト又は動物の
ＶＩＩＩ因子、ハイブリッド又はハイブリッドの等価物のＶＩＩＩ因子の領域と
して定義づけされる。それは、任意のアミノ酸残基で構成され得、タンパク質の
一次、二次又は三次構造に左右され得る。いくつかの実施形態においては、ハイ
ブリッド又はハイブリッド等価物のＶＩＩＩ因子又はその断片は、非免疫原性で
あるか又は、ヒト又はブタのＶＩＩＩ因子に比べ動物又はヒトにおける免疫原性
が低い。
【００３６】 本書で使用されている「ハイブリッドＶＩＩＩ因子等価物分子又はその断片」
又は「ハイブリッド等価物のＶＩＩＩ因子又はその断片」というのは、ヒト、動
物又はハイブリッドのＶＩＩＩ因子又はその断片内の単数又は複数の特異的アミ
ノ酸残基を包含する少なくとその他の配列に対し置換されたヒト又は動物のＶＩ
ＩＩ因子配列と既知の同一性を全くもたない単数又は複数のアミノ酸残基を包含
する少なくとその他の配列を含む活性ＶＩＩＩ因子又はハイブリッドのＶＩＩＩ
因子分子又はその断片のことである。ヒト又は動物のＶＩＩＩ因子配列との既知
の同一性を全くもたない単数又は複数のアミノ酸残基の配列は同様に本書では「
非ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列」と呼ばれている。好ましい実施形態においては、
ＶＩＩＩ因子配列に対する既知の配列同一性を全くもたないアミノ酸（単複）は
、アラニン残基である。その他の好ましい実施形態においては、ＶＩＩＩ因子配
列に対する既知の配列同一性を全くもたないアミノ酸（単複）で置換される特異
的ＶＩＩＩ因子配列には、結果として得られるハイブリッドＶＩＩＩ因子等価物
分子又はその断片のＶＩＩＩ因子阻害性抗体との免疫反応性が比較的低いか全く
無いような形で、天然のＶＩＩＩ因子阻害性抗体との免疫反応性のある抗原部位
が含まれる。さらにその他の好ましい実施形態においては、ＶＩＩＩ因子配列に
対する既知の配列同一性を全くもたないアミノ酸（単複）で置換される特異的Ｖ
ＩＩＩ因子配列には、結果として得られるハイブリッドＶＩＩＩ因子等価物分子
又はその断片の免疫原性が比較的低くなるような形で、動物又はヒトにおけるＶ
ＩＩＩ因子阻害性抗体の形成を惹起する免疫原性部位が含まれる。
【００３７】 本書で使用される「ＶＩＩＩ因子欠損症」には、欠陥ＶＩＩＩ因子の産生、Ｖ
ＩＩＩ因子の不適切な産生又は無産生、又は阻害物質によるＶＩＩＩ因子の部分
的又は完全な阻害によってひき起こされる血液凝固活性の欠損症が包含される。
血友病Ａは、Ｘ連鎖遺伝子の欠陥及びそれがコードするＶＩＩＩ因子タンパク質
の不在又は欠損の結果として起こる一つのタイプのＶＩＩＩ因子欠損症である。
【００３８】 本書で使用されている「診断検定」には、医学的療法の選択を助けるためテス
ト標本内に存在する特定の抗体の量を検出しかつ／又は数量化するために、抗原
−抗体相互作用を一定のやり方で利用する検定が含まれる。当業者にとっては既
知のこのような検定が数多く存在している。しかしながら本書で使用されている
ように、ハイブリッド又はハイブリッド等価物ＶＩＩＩ因子ＤＮＡ又はその断片
及びそこから発現されたタンパク質は、全体的に又は部分的に、別途既知の検定
において対応する試薬に代って置換させることができ、かくして、修正された検
定をＶＩＩＩ因子に対する抗体の検定及び／又は数量化に使用することが可能で
ある。ヒト又は動物のＶＩＩＩ因子又はハイブリッドのヒト／動物／ＶＩＩＩ因
子に対する抗体の検出のための既知の検定の修正を可能にするのは、これらの試
薬、ハイブリッド又はハイブリッド等価物ＶＩＩＩ因子 ＤＮＡ又はその断片又
はそこから発現されたタンパク質の使用である。かかる検定には、ＥＬＩＳＡ、
免疫拡散検定及び免疫ブロット法が含まれるが、これらに制限されるわけではな
い。これらの検定法のいずれかを実施するのに適した方法は、当業者にとっては
既知のものである。本書で使用されている、タンパク質の少なくとその他のエピ
トープを内含するハイブリッド又はハイブリッド等価物ＶＩＩＩ因子又はその断
片は、診断試薬として使用することができる。ハイブリッド又はハイブリッド等
価物ＶＩＩＩ因子又はその断片を使用できるその他の検定の例としては、ベセズ
ダ検定及び抗凝固検定が含まれる。
【００３９】 ヒト又は動物のＶＩＩＩ因子又はヒト／動物ハイブリッドＶＩＩＩ因子又は修
飾されたＶＩＩＩ因子をコードするＤＮＡの「発現産物」は、制限的な意味なく
グリコシル化、タンパク質分解分割などを含む基準となるＤＮＡによりコードさ
れたタンパク質の翻訳前又は後の修飾のこのような特長を包含する、適切な宿主
細胞内での基準ＤＮＡの発現から得られる産物である。当該技術分野においては
、かかる修飾が発生可能であり、宿主細胞型及びその他の要因に応じて幾分か異
なるものであり得、かつ、プロ凝固性活性を保持しながら、産物の分子のイソ型
を結果としてもたらし得るということが知られている。例えば、本書に参考とし
て包含されているLind, P.et al., Eur. J. Biochem,２３２；１９２７（１９９
５）を参照のこと。
【００４０】 「免疫反応性減少性」アミノ酸は、ここでは、抗体−抗原対の結合エネルギー
に対する貢献度が全くないわけではないが僅かであるようなアミノ酸として定義
される。免疫反応性減少性であるものとして知られているいくつかのアミノ酸の
制限的意味のない例には、アラニン、メチオニン、ロイシン、セリン及びグリシ
ンが包含されている。一定の与えられた抗原−抗体対内の一定の与えられたアミ
ノ酸置換によって達成可能な免疫反応性の減少は、同様に、タンパク質の立体配
座、エピトープアクセス可能性などに対し置換が及ぼす可能性のあるいずれかの
効果によって左右されるということがわかるだろう。
【００４１】 方法の一般的記述 米国特許出願番号第０７／８６４,００４号は、ヒト又はブタのＶＩＩＩ因子
分子の要素がその他の種のＶＩＩＩ因子分子の対応する要素に置換させられてい
る、凝固活性をもつハイブリッドのヒト／ブタＶＩＩＩ因子分子の発見について
記述していた。米国特許出願第０８／２１２,１３３号及びＰＣＴ／ＵＳ９４／
１３２００号は、１つの種のＶＩＩＩ因子分子の要素がその他の種のＶＩＩＩ因
子分子の対応する要素に置換させられている、プロ凝固性ハイブリッドヒト／動
物及びハイブリッド等価物ＶＩＩＩ因子分子について記述している。
【００４２】 本発明は、精製度の高いヒトＶＩＩＩ因子と比べて標準的クローニング検定に
おいてより大きい凝固活性をもち；かつ／又はヒト又はブタのＶＩＩＩ因子に比
べヒト又はブタのＶＩＩＩ因子に対する阻害性抗体に対する免疫反応性が低く；
かつ／又はヒト又はブタのＶＩＩＩ因子に比べてヒト又は動物における免疫原性
が低く；かつ／又はその他の治療上有用な特性をもつものを含めた、ハイブリッ
ドのヒト／動物、動物／動物及び等価物のＶＩＩＩ因子分子、修飾済みＶＩＩＩ
因子分子及びその断片及びかかるハイブリッド及び修飾済みＶＩＩＩ因子分子を
コードする核酸配列を提供する。これらのハイブリッド及び／又は修飾済みのＶ
ＩＩＩ因子分子は、以下のように構築することができる。
【００４３】 本書では、少なくとも５つのタイプの活性ハイブリッドヒト／ブタ又はハイブ
リッド等価物のＶＩＩＩ因子分子又はその断片、これらのハイブリッドＶＩＩＩ
因子分子をコードする核酸配列及びそれらを調製する方法が開示されている：こ
れはすなわち、（１）対応するブタ又はヒトサブユニットに対しヒト又はブタ置
換（すなわちＨ鎖又はＬ鎖）を置換することにより；（２）対応するブタ又はヒ
トドメイン（単複）に対し単数又は複数のヒト又はブタドメイン（すなわちＡ１
、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ1 及びＣ２）を置換することにより、；（３）単数又は複
数のブタ又はヒトドメインの対応する部分に対して単数又は複数のヒト又はブタ
ドメインの連続的部分を置換することにより；（４）対応するブタ又はヒト配列
に対しヒト又はブタのＶＩＩＩ因子内の単数又は複数のユニークなアミノ酸配列
を含む少なくとも１個の特異的配列を置換することにより、；及び（５）ヒト、
ブタ又はハイブリッドのヒト／ブタＶＩＩＩ因子内の単数又は複数のアミノ酸の
少なくとも１個の特異的配列に対して、ＶＩＩＩ因子に対する既知の配列同一性
を全くもたない単数又は複数のアミノ酸残基（「非ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列」
）を包含する少なくとも１個の配列を置換することにより得られるものである。
修飾済みＶＩＩＩ因子分子は、特定された位置に単数又は複数のアミノ酸置換を
有する。
【００４４】 同じ方法により、少なくとも５つのタイプの活性ハイブリッドヒト／非ヒト、
非ブタ哺乳動物又はハイブリッド等価物ＶＩＩＩ因子分子又はその断片及びそれ
らをコードする核酸配列も調製可能である： すなわち、（１）対応する非ヒト
、非ブタ哺乳動物又はヒトのサブユニットに対してヒト又は非ヒト、非ブタ哺乳
動物サブユニット（すなわちＨ鎖又はＬ鎖）を置換することにより；（２）対応
する非ヒト、非ブタ哺乳動物又はヒトのドメイン（単複）に対して、単数又は複
数のヒト又は非ヒト、非ブタ哺乳動物のドメイン（すなわちＡ１、Ａ２、Ａ３、
Ｂ、Ｃ1 及びＣ２）を置換することによって、；（３）単数又は複数の非ヒト、
非ブタ哺乳動物又はヒトのドメインの対応する部分に対して単数又は複数のヒト
又は非ヒト、非ブタ哺乳動物のドメインの連続する部分を置換することにより、
；（４）対応する非ヒト、非ブタ哺乳動物又はヒトの配列に対してヒト又は非ヒ
ト、非ブタ哺乳動物ＶＩＩＩ因子内の単数又は複数のユニークなアミノ酸残基を
包含する少なくとも１個の特異的配列を置換することにより；及び（５）ヒト、
非ヒト、非ブタ哺乳動物又はハイブリッドヒト／非ヒト、非ブタ哺乳動物のＶＩ
ＩＩ因子の中の単数又は複数のアミノ酸の少なくとも１個の特異的配列に対して
、ＶＩＩＩ因子に対する既知の配列同一性を全くもたない単数又は複数のアミノ
酸残基（「非ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列」）を包含する少なくとも１個の配列を
置換することにより得られるものである。個々のアミノ酸置換は、コーディング
ＤＮＡの対応するセグメントの部位特異的突然変異誘発によって得ることができ
る。
【００４５】 さらに、当業者であれば、ブタ／マウスといった２種以上の非ヒト哺乳動物か
らのＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含みさらには非ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を含
む前出の２つのパラグラフの中のタイプ（１）〜（５）に対応する、少なくとも
５つのタイプの活性ハイブリッドＶＩＩＩ因子分子又はその断片を調製するため
に、同じ方法を使用できるということを容易に認識することだろう。
【００４６】 以上にグループ（１）〜（３）の下で列挙したハイブリッドのヒト／動物、動
物／動物及び等価物のＶＩＩＩ因子タンパク質又はその断片は、血漿由来のＶＩ
ＩＩ因子のサブユニット、ドメイン又はドメインの連続的部分を分離しその後ひ
き続き再構築及び精製を行なうことによって作られる。以上の（３）〜（５）の
グループの下で記述されたハイブリッドのヒト／動物、動物／動物及び等価物の
ＶＩＩＩ因子タンパク質又はその断片は、組換え型ＤＮＡ方法によって作られる
。ハイブリッド分子は、以下でさらに詳細に記述されているように、さまざまな
領域の起源に応じて、動物配列よりも多い又は少ない百分率でヒト配列を含有す
ることができる。
【００４７】 現在の情報では、Ｂドメインがいかなる阻害性エピトープももたず、ＶＩＩＩ
因子機能に対する既知の効果を全くもたないことから、一部の実施形態では、Ｂ
ドメインは、本書で記述された方法のいずれかにより調製された活性のハイブリ
ッド又はハイブリッド等価物のＶＩＩＩ因子分子又はその断片（「Ｂ（−）因子
ＶＩＩＩ」）内で欠失している。
【００４８】 実施例４では、ブタＨ鎖及びヒトＬ鎖を含みかつ上述の第１のタイプのハイブ
リッドに対応するハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子が、ヒトＶＩＩＩ因子に
比べ標準的クローニング検定中でより大きい特異的凝固活性を有することが示さ
れている。凝固活性をもつハイブリッドヒト／動物又は等価物ＶＩＩＩ因子は、
その活性がヒトＶＩＩＩ因子のものよりも高い、等しい又は低いのいずれである
かにかかわらず、阻害物質をもつ患者の治療において有用であり得るが、これは
、これらの阻害物質がヒト又はブタのいずれかのＶＩＩＩ因子との反応性よりも
低い反応性しかハイブリッドヒト／動物又は等価物のＶＩＩＩ因子に対してもち
得ないからである。
【００４９】 再構築による分離されたヒト及び動物のＶＩＩＩ因子サブユニットからのハイ ブリッドＶＩＩＩ因子分子の調製 本発明は、サブユニット置換を伴うハイブリッドヒト／動物ＶＩＩＩ因子分子
又はその断片、これらのハイブリッドをコードする核酸配列、それらを調製し分
離する方法、及びそのプロ凝固活性を特徴づけするための方法を提供する。Fay,
P. J. et al.（１９９０）J. Biol. Chem.２６５：６１９７；及びLollar. J.S
. et al.（１９８８）J. Biol. Chem.２６３：１０４５１、により報告された手
順から修正された１つの方法には、ヒト及び動物のＶＩＩＩ因子のサブユニット
（Ｈ鎖及びＬ鎖）の分離とそれに続くヒトＨ鎖と動物Ｌ鎖の組換え又はヒトＬ鎖
と動物Ｈ鎖の組換えが関与している。
【００５０】 ヒト及び動物の両方の個々のサブユニットの単離には、Ｌ鎖／Ｈ鎖２量体の解
離が関与する。これは、例えばエチレンジアミノ四酢酸（ＥＤＴＡ）でのカルシ
ウムのキレート化とそれに続くmonoＳ（商標）ＨＰＬＣ（Pharmacia-ＬＫＢ，Pi
scataway, NJ）によって達成される。ハイブリッドのヒト／動物ＶＩＩＩ因子分
子は、カルシウムの存在下で単離済みサブユニットから再構築される。Lollar,
J.S. et al.(１９８８）Blood ７１：１３７−１４３によって記述されているよ
うなブタのＶＩＩＩ因子の単離手順により、mono Ｓ（商標）ＨＰＬＣにより未
反応のＨ鎖から、ハイブリッドヒトＬ鎖／動物Ｈ鎖又は動物Ｌ鎖／ヒトＨ鎖のＶ
ＩＩＩ因子が単離される。
【００５１】 １つの実施形態において活性ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子を調製する
ために使用され、以下の例で詳述されている、これらの方法は、ヒトＶＩＩＩ因
子のプロ凝固活性の６倍以上のプロ凝固活性をもつハイブリッドヒトＬ鎖／ブタ
Ｈ鎖分子を結果としてもたらす。
【００５２】 同じ方法により、その他のハイブリッドヒト／非ヒト、非ブタ哺乳動物のＶＩ
ＩＩ因子分子を調製し、単離しかつ活性について特徴づけすることができる。当
業者であれば、これらの方法が同様に、その他の種のＨ鎖又はＬ鎖と組合わされ
た１つの種のＬ鎖又はＨ鎖を含む、ブタ／マウスといったようなハイブリッド動
物／動物／ＶＩＩＩ因子を調製し、単離し活性について特徴づけするためにも使
用可能であることを容易に認識することだろう。
【００５３】 再構築による分離されたヒト及び動物のＶＩＩＩ因子ドメインからのハイブリ ッドＶＩＩＩ因子分子の調製 本発明は、ドメイン置換を伴うハイブリッドヒト／動物ＶＩＩＩ因子分子又は
その断片、それらをコードする核酸配列、それらを調製し単離する方法、及びそ
のプロ凝固活性を特徴づけするための方法を提供する。１つの方法には、ヒトの
ＶＩＩＩ因子の単数又は複数のドメイン及び動物のＶＩＩＩ因子の単数又は複数
のドメインを単離することそしてそれに続いて、ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩ
Ｉ因子についてLollar. P et al.（１９９２年１１月２５日）J. Biol. Chem.２ ６７（３３） ：２３６５２−２３６５７によって記述されているように凝固活性
をもつハイブリッドヒト／動物ＶＩＩＩ因子を形成するべくヒト及び動物のドメ
インを組換えすることが関与している。
【００５４】 特定的に提供されているのは、ドメイン置換されたハイブリッドヒト／非ヒト
、非ブタ哺乳動物のＶＩＩＩ因子を構築できる方法が実施形態により例示されて
いる、ヒトＡ２ドメインに対するブタＡ２ドメインの置換を伴うハイブリッドヒ
ト／ブタＶＩＩＩ因子である。血漿由来の非ヒト、非ブタ哺乳動物及びヒトのＡ
１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ニ量体が、ＶＩＩＩ因子からのＡ２ドメインの解離によっ
て単離される。これは、例えばＮａＯＨの存在下で達成され、その後、混合物は
希釈され、二量体はmonoＳ（商標）ＨＰＬＣ（Pharmacia−ＬＫＢ，Piscataway,
ＮＪ）を用いて溶出される。Ａ２ドメインは、monoＳ（商標）ＨＰＬＣにおい
て二次成分としてＶＩＩＩ因子から単離される。ハイブリッドヒト／動物ＶＩＩ
Ｉ因子分子は、１つの種のＡ２ドメインとその他の種のＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２
ニ量体を等量ずつ混合することにより再構築される。
【００５５】 単数又は複数のドメイン置換を伴うハイブリッドのヒト／動物ＶＩＩＩ因子又
はその断片は、Lollar, J.S. et al.（１９８８）Blood ７１：１３７−１４３
によって記述されているように、ブタＶＩＩＩ因子の単離手順により、mono Ｓ
（商標）ＨＰＬＣによって未反応のニ量体及びＡ２の混合物から単離される。そ
のうちの任意の単数又は複数のものをその他の種のＶＩＩＩ因子内の対応するド
メインに置換させることのできる、１つの種のＶＩＩＩ因子のＡ１、Ａ３、Ｃ１
、Ｃ２及びＢドメインを調製し単離するために、日常的方法を使用することも可
能である。当業者であれば、ブタ／マウスといったようなドメイン置換されたハ
イブリッドの動物／動物ＶＩＩＩ因子を調製し単離し活性について特徴づけする
ためにこれらの方法を使用することもできるということを直ちに認識することだ
ろう。
【００５６】 以下の例で詳述するこれらの方法は、プロ凝固活性をもつハイブリッドＶＩＩ
Ｉ因子を結果としてもたらす。
【００５７】 ヒト、動物及びハイブリッドのＶＩＩＩ因子サブユニット、ドメイン又はドメ インの一部分をコードする配列の組換え工学処理によるハイブリッドＶＩＩＩ因 子分子の調製 サブユニット、ドメイン、ドメインの連続的部分の置換 本発明は、サブユニット、ドメイン及びアミノ酸配列の置換を伴う活性の、組
換え型ハイブリッドヒト／動物及びハイブリッド等価物ＶＩＩＩ因子分子及びそ
の断片、これらのハイブリッドをコードする核酸配列、これらを調製し単離する
方法、そしてその凝固、免疫反応性及び免疫原性特性を特徴づけする方法を提供
している。
【００５８】 ヒトＶＩＩＩ因子遺伝子は、Toole, J.J. et al.（１９８４）Nature ３１２
：３４２−３４７（Genetics Institute） ；Gitschier, J. et al.（１９８４
）Nature ３１２：３２６−３３０（Genentech）：Wood, W.I.et al.（１９８４
）Nature ３１２：３３０−３３７（Genentech）；Vehar, G.A. et al.（１９８
４）Nature ３１２：３３７−３４２（Genentech）；ＷＯ ８７／０４１８７；
ＷＯ ８８／０８０３５；ＷＯ ８８／０３５５８；米国特許 第４,７５７,０
０６号により報告されているとおり、哺乳動物の細胞において単離され発現され
、ｃＤＮＡからアミノ酸配列が演繹された。Capon et al.に対する米国特許第４
,９６５,１９９号は、哺乳動物の宿主細胞内でＶＩＩＩ因子を産生するための組
換え型ＤＮＡ方法及びヒトＶＩＩＩ因子の精製について開示している。ＣＨＯ（
チャイニーズハムスタ卵巣）細胞及びＢＨＫＣ（ベビーハムスター腎細胞）上で
のヒトＶＩＩＩ因子の発現が報告されてきた。Ｂドメインの一部又は全部を欠失
させるためにヒトＶＩＩＩ因子が修飾され（米国特許第４,８６８,１１２号）、
ヒト第Ｖ因子ＢドメインでのヒトＶＩＩＩ因子 Ｂドメインの置換が試みられて
きた（米国特許第５,００４,８０３号）。ヒトＶＩＩＩ因子をコードするｃＤＮ
Ａ配列及び予測されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び２に示されてい
る。配列番号１では、コーディング配列はヌクレオチド位置２０８で始まり、ト
リプレットＧＣＣは、配列番号２で示されているようにアミノ酸番号１（Ａｌａ
）に対するコドンである。
【００５９】 ブタＶＩＩＩ因子が血漿から単離され精製された〔Fass, D.N. et al.(１９８
２)Blood ５９：５９４〕。セルロプラスミン及び凝固因子Ｖに対する相同性を
もち大幅に不適切に位置特定されたＮ末端Ｌ鎖配列の一部分に対応するブタＶＩ
ＩＩ因子の部分的アミノ酸配列が、Church et al.(１９８４)Proc. Natl. Acad.
Sci.ＵＳＡ ８１：６９３４により記述された。Toole, J.J. et al.（１９８４
）Nature ３１２：３４２−３４７は、ブタＶＩＩＩ因子の４つのアミノ酸断片
のＮ末端の部分的配列決定について記述したが、ＶＩＩＩ因子分子内でのその位
置に関して断片を特徴付けることはしなかった。ブタＶＩＩＩ因子のＢドメイン
及びＡ２ドメインの一部分のアミノ酸配列は、Toole, J.J. et al.（１９８６）
Proc. Natl. Acad. Sci,ＵＳＡ ８３：５９３９−５９４２によって報告された
。ブタＶＩＩＩ因子の完全なＡ２ドメインをコードするｃＤＮＡ配列及び予測さ
れたアミノ酸配列、及び全てのドメイン、全てのサブユニット及び特異的アミノ
酸配列の置換をもつハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子については、１９９４
年１１月５日に米国特許第５,３６４,７７１号として発行されたJohn S. Lollar
及び Marschall S. Runge による１９９２年４月７日付けの「ハイブリッドヒ
ト／ブタＶＩＩＩ因子」という表題の米国特許出願第０７／８６４、００４号の
中及びＷＯ９３／２００９３の中で開示された。配列番号１で示されたような成
熟ヒトＶＩＩＩ因子内の残基３７３−７４０に対し配列同一性をもつブタＶＩＩ
Ｉ因子のＡ２ドメインをコードするｃＤＮＡ配列及び予測されたアミノ酸配列は
、それぞれ配列番号３及び４に示されている。より最近では、対応するヒトドメ
インに対し置換されたブタＡ１及び／又はＡ２ドメインを伴うキメラＶＩＩＩ因
子及びブタＶＩＩＩ因子のＡ１及びＡ２ドメインのヌクレオチド及び対応するア
ミノ酸配列が、ＷＯ９４／１１５０３号で報告された。完全なＡ１ドメイン、活
性化ペプチド、Ａ３、Ｃ１及びＣ２ドメインならびにコードされたアミノ酸配列
を包含する、ブタのＶＩＩＩ因子をコードする全ヌクレオチド配列は、１９９９
年１月１２日付で発行された米国特許第５,８５９,２０４号内で開示されている
。
【００６０】 ブタ及びヒトのＶＩＩＩ因子は両方共、２サブユニットのタンパク質として血
漿から単離される。Ｈ鎖及びＬ鎖として知られているサブユニットは、カルシウ
ム又はその他の２価の金属イオンを必要とする非共有結合によりまとめて保持さ
れる。ＶＩＩＩ因子のＨ鎖は共有結合でリンクされた３つのドメイン、Ａ１、Ａ
２及びＢを含有する。ＶＩＩＩ因子のＬ鎖は同様に、Ａ３、Ｃ１及びＣ２と呼ば
れる３つのドメインをも含有する。Ｂドメインは、既知の生物学的機能を全くも
たず、タンパク質分解によってか又は組換え型ＤＮＡ技術の方法により、ＶＩＩ
Ｉ因子のいずれの測定可能なパラメータにも有意な改変無く除去又は部分除去さ
れ得る。ヒト組換え型ＶＩＩＩ因子は、哺乳動物の細胞内で発現されないかぎり
グリコシル化されないものの、血漿由来のＶＩＩＩ因子と類似の構造及び機能を
もつ。
【００６１】 ヒト及びブタの活性化されたＶＩＩＩ因子（「ＶＩＩＩａ因子」）は、Ａ１と
Ａ２の両方ドメイン間のＨ鎖の分割に起因して３つのサブユニットを有する。こ
の構造は、Ａ１／Ａ２／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と呼ばれる。ヒトＶＩＩＩ因子は、ブ
タのＶＩＩＩＡ因子を安定化させる条件下で安定していないが、これはおそらく
、ヒトのＶＩＩＩＡ因子のＡ２サブユニットの会合がより弱いものであるためと
思われる。ヒト及びブタのＶＩＩＩＡ因子のＡ２サブユニットの分離は、ＶＩＩ
ＩＡ因子分子内の活性の喪失と結びつけられる。Yakhyaev, A. et al.（１９９
７）Blood ９０：Suppl.１、アブストラクト＃１２６は、低密度リポタンパク質
受容体関連タンパク質によるＡ２ドメインの結合を報告し、かかる結合により媒
介されるＡ２の細胞取込みが、ＶＩＩＩ因子活性をダウンレギュレートするよう
に作用することを示唆している。
【００６２】 代表的態様として特定的に提供されているのは、置換されたＡ２ドメインをも
つ活性組換え型ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子、それをコードする核酸配
列及び調製、単離及びその活性の特徴づけ方法である。このハイブリッド構成体
の調製方法は同様に、サブユニット、ドメインの連続的部分又はＡ２以外のドメ
インの置換をもつ活性の組換え型ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子又はその
断片を調製するために使用することもできる。当業者であれば、これらの方法が
同様に、サブユニット、ドメイン又はドメインの連続的部分が置換されているそ
の他の組換え型ハイブリッドヒト／非ヒト、非ブタ哺乳動物又は動物／動物のハ
イブリッドＶＩＩＩ因子分子又はその断片をいかにして調製できるのかをも実証
しているということを認識することだろう。
【００６３】 関連するＶＩＩＩ因子配列をコードするヒトｃＤＮＡ〔Biogen, Inc.〕又はブ
タｃＤＮＡ（本書に記述されているもの）から出発して、組換え型ハイブリッド
ヒト／ブタＶＩＩＩ因子が調製される。好ましい実施形態においては、ｃＤＮＡ
によりコードされたＶＩＩＩ因子は、ドメイン Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２
を包含し、全Ｂドメインは欠如しており、Wood et al.(１９８４）Nature ３１
２：３３０−３３７の番号づけシステムに従って一本鎖ヒトＶＩＩＩ因子のアミ
ノ酸残基１−７４０及び１６４９〜２３３２（配列番号２参照）に対応する。
【００６４】 ブタ又はヒトのＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの個々のサブユニット、ドメイン又は連
続的部分は、確立された突然変異誘発技術によってクローニングされかつ対応す
るヒト又はブタのサブユニット、ドメイン又はドメインの一部分に代って置換す
ることができ、又そうされてきた。例えば、Lubin, IM. et al.(１９９４)J.Bio
l. Chem. ２６９（１２）：８６３９−８６４１は、適切な制限部位を用いてヒ
トドメインに対しブタＡ２ドメインを置換するための技術を記述している。その
他の種のＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡに対して１つの種のＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡのいず
れかの任意の領域を置換するためのその他の方法としては、Horton, R.M. et al
.(１９９３)Merh. Enzymol ２１７：２７０−２７９によって記述されているよ
うな、オーバーラップ拡張によるスプライシング（「ＳＯＥ」）が含まれる。
【００６５】 サブユニット、ドメイン又はドメインの一部分をコードするハイブリッドＶＩ
ＩＩ因子ｃＤＮＡ又は全ハイブリッドｃＤＮＡ分子は、Selden, R.F.「哺乳動物
細胞内へのＤＮＡの導入」 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Au
subet et al., eds（１９９１）中により記述されているように、確立された技
術によって培養細胞内での活性ハイブリッド ヒト／ブタ ＶＩＩＩ因子タンパク
質分子の究極の発現のため発現ベクター内にクローニングされる。
【００６６】 好ましい実施形態においては、ブタの配列がＡ２ドメイン又は部分ドメインと
いったようなドメイン又は部分ドメインをコードしているＶＩＩＩ因子をコード
するハイブリッドのヒト／ブタｃＤＮＡが、ＲｅＮｅｏといったような哺乳動物
発現ベクター内に挿入されてハイブリッドのＶＩＩＩ因子構成体を形成する。ハ
イブリッドＶＩＩＩ因子の予備的特徴づけは、ＲｅＮｅｏ 哺乳動物発現ベクタ
ー内にハイブリッドｃＤＮＡを挿入しＣＯＳ−７細胞内でハイブリッドタンパク
質を過渡的に発現することによって達成される。次に活性ハイブリッドタンパク
質が発現されているか否かの決定を行なうことができる。発現ベクター構成体は
さらに、リポゾーム媒介トランスフェクションといったような当該技術分野にお
いては日常的作業である方法を用いてベビーハムスターの腎臓細胞といったよう
な培養中の細胞を安定した形でトランスフェクションするために使用される（Li
pofectin（商標），Life Technologier, Inc.)。組換え型ハイブリッドＶＩＩＩ
因子タンパク質の発現は、配列決定、ノーザン及びウェスタンブロット法又はポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により確認できる。タンパク質を安定した形で発
現するトランスフェクションを受けた細胞が中に維持される培地内のハイブリッ
ドＶＩＩＩ因子タンパク質は、適切な緩衝液中で沈降、ペレット化、洗浄及び再
懸濁することができ、組換え型ハイブリッドＶＩＩＩ因子タンパク質は、例えば
モノクローナル抗−Ａ２−Sepharose（商標）を用いてイムノアフィニティクロ
マトグラフィを含む標準的技術により精製し得る。
【００６７】 さらなる実施形態においては、サブユニット、ドメイン又はアミノ酸配列置換
を含むハイブリッドＶＩＩＩ因子は、例えば安定性、分泌、欠失、単離などを増
強するタンパク質又はペプチドをコードする配列がＶＩＩＩ因子コード配列に隣
接した場所に挿入されている組換え型分子から融合タンパク質として発現されて
いる。融合タンパク質の調製において例えばプロモータ、作働遺伝子及び調節遺
伝子を含む同種又は異種の発現制御配列を使用するための確立されたプロトコル
が、すでに知られており、当該技術分野において日常的に用いられている。 Cur rent Protocol in Molecular Biology （分子生物学における現行プロトコル）（
Ausubel. F.M., et al., eds），Wiley Interscience,N.Y. を参照のこと。発現
は、Ｂドメインの一部分を包含することにより増強される。特に、「ＳＱ」と呼
ばれるＢドメインの部分を包含することで〔Lind, P. et al.（１９９５）上述
〕、有利な発現がもたらされることになる。「ＳＱ」構成体には、ＢドメインＮ
末端の５つのアミノ酸とＢドメインＣ末端の９つのアミノ酸を除き、ヒトＢドメ
インの全てが欠如している。
【００６８】 精製されたハイブリッドＶＩＩＩ因子又はその断片は、精製された組換え型ヒ
トＶＩＩＩ因子を標準として用いて、例えば無血漿ＶＩＩＩ因子検定、一段階式
血液凝固検定及び酵素結合免疫吸着検定法を含む標準的検定により、免疫反応性
及び凝固活性について検定し得る。
【００６９】 プラスミド及び真核性ウイルスベクターの両方を包含するその他のベクターも
、有能な実務家の好み及び判断に応じて、真核細胞内で組換え型遺伝子構成体を
発現するのに使用することができる（例えば、Sambrook et al., 第１６章参照
）。細胞、酵母及び昆虫細胞系を包含するその他のベクター及び発現系を使用す
ることもできるが、グリコシル化の差異又は欠如のため好まれない。
【００７０】 組換え型ハイブリッドＶＩＩＩ因子タンパク質を、培養及び組換え型哺乳動物
タンパク質発現のために一般に使用されるさまざまな細胞の中で発現させること
が可能である。特に、数多くのげっ歯類細胞系統が、大型タンパク質の発現のた
めの特に有用な宿主であることが発見されている。American Type Culture Coll
ection（米国標準培養収集機関）Rockville, ＭＤ.から入手可能な好ましい細胞
系統としては、ベビーハムスター腎細胞、及び日常的手順及び培地を用いて培養
されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞がある。
【００７１】 サブユニット、ドメイン又はアミノ酸配列置換をもつハイブリッドヒト／ブタ
ＶＩＩＩ因子を調製するために利用されるのと同じ方法を、その他の組換え型ハ
イブリッドＶＩＩＩ因子タンパク質及びその断片及び、ヒト／非ヒト、非ブタ哺
乳動物又は動物／動物といったようなこれらのハイブリッドをコードする核酸配
列を調製するために使用することができる。既知のヒトＤＮＡ配列由来のプライ
マから始めて、マウスのＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ及びブタＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの
一部がクローニングされた。ハイブリッドヒト／動物又は動物／動物ＶＩＩＩ因
子分子を調製する上で使用するためのその他の種のＶＩＩＩ因子配列は、出発点
として既知のヒト及びブタＤＮＡ配列を用いて得ることができる。利用可能なそ
の他の技術には、動物の組織ＤＮＡを用いたＰＣＲ増幅、及びＶＩＩＩ因子配列
をクローニングして取り出すための動物由来のｃＤＮＡライブラリの使用、が含
まれる。
【００７２】 １つの代表的態様として、ハイブリッドヒト／マウスＶＩＩＩ因子タンパク質
を以下のように作ることができる。ヒトＶＩＩＩ因子遺伝子のマウス相同体に対
応するＤＮＡクローンが、単離され、配列決定され、マウス、ヒトのＶＩＩＩ因
子分子及びブタのＶＩＩＩ因子分子の一部の予測されたアミノ酸配列の比較を包
含するElder. G., et al（１９９３）Genomics １６（２）；３７４−３７９の
中で記述されている通りに、マウスＶＩＩＩ因子タンパク質のアミノ酸配列が予
測された。マウスＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ配列及び予測されたアミノ酸配列は、そ
れぞれ配列番号５及び配列番号８の中に示されている。好ましい実施形態におい
ては、Sarkar, G et al.（１９８９）Science ２４４：３３１−３３４内に記述
された転写配列決定（transcript sequencing)（ＲＡＷＴＳ）方法でのＲＮＡ増
幅を使用することができる。簡単に言うと、その段階としては、（１）オリゴ（
ｄＴ）又はｍＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプライマでのｃＤＮＡ合成；（２
）増幅されるべき領域と相補的な配列に付着されたファージプロモータを１つの
又は両方のオリゴヌクレオチドが含んでいるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；
（３）ファージプロモータでの転写；及び（４）ネストされた（内部）オリゴヌ
クレオチドでプライミングされる転写体の逆転写酵素媒介ジデオキシ配列決定、
がある。配列情報の明示に加えて、この方法は、適切なＰＣＲプライマ内に翻訳
開始シグナルを取込むことによりin vitro翻訳産物を生成することができ、その
他の種からの新規ｍＲＮＡ配列情報を得るために使用可能である。
【００７３】 アミノ酸（単複）の置換 本発明は、その他の種の対応するアミノ酸配列又はその断片に対し置換された
１つの種の単数又は複数のユニークなアミノ酸を内含する少なくとその他の配列
を含んで成る活性の組換え型ハイブリッドヒト／動物及び動物／動物ＶＩＩＩ因
子分子又はその断片、これらのハイブリッドをコードする核酸配列、それらを調
製し単離するための方法及びそれらの凝固、免疫原性及び免疫反応性特性活性を
特徴づけする方法を提供している。
【００７４】 Ａ２ドメインは、ＶＩＩＩ因子分子のプロ凝固活性のために必要である。研究
から、ブタのＶＩＩＩ因子がヒトのＶＩＩＩ因子よりも６倍大きいプロ凝固活性
を有すること（Lollar, P. et al.(１９９１）J.Biol.Chem.２６６：１２４８１
−１２４８６）及びヒト及びブタのＶＩＩＩ因子の間の凝固活性の差がヒトとブ
タのＡ２ドメイン内の単数又は複数の残基の間のアミノ酸配列の差異に基づくも
のと思われること（Lollar, P.et al.（１９９２）J.Biol.Chem.２６７：２３６
５２−２３６５７）が示されている。さらに、ヒトＶＩＩＩ因子分子内のＡ２及
びＣ２ドメイン及び場合によっては第３のＬ鎖領域は、全てとはいわないまでも
大部分の阻害性抗体がHoyer（１９９４）Semin. Hewatol. ３１：１−５.に従っ
て反応するエピトープを宿すと考えられている。
【００７５】 組換え型ハイブリッドヒト／動物、動物／動物又は等価物のＶＩＩＩ因子分子
又はその断片は、以下でより詳しく例示されるように２つの種の分子間でアミノ
酸配列が異なっている、その他の種の対応する配列に対する１つの種のＶＩＩＩ
因子のＡ２、Ｃ２及び／又はドメインからの単数又は複数のユニークアミノ酸が
包含する少なくとその他の特異的配列の置換によって作ることができる。本書で
記述されている好ましい実施例においては、本発明は、１つのエピトープを包含
する対応するヒトアミノ酸配列に対して置換させられたブタのアミノ酸配列を含
む活性組換え型ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子において、ＶＩＩＩ因子に
対する阻害性抗体との免疫反応性が減少しているか又は全く無いハイブリッドＶ
ＩＩＩ因子を提供する。さらなる実施形態においては、第３の種内の対応する配
列に対し置換された複数の種からのアミノ酸配列を含む活性組換え型ハイブリッ
ドＶＩＩＩ因子分子も同様に作ることができる。同様に、以下でさらに詳述する
ように、ＶＩＩＩ因子に対する既知の配列同一性を全くもたない単数又は複数の
アミノ酸を内含する少なくとその他の配列を内含するヒト、動物又はハイブリッ
ドのＶＩＩＩ因子を含んで成る組換え型ハイブリッド等価物分子も作ることがで
きる。
【００７６】 記述されたような特異的アミノ酸置換をもつあらゆるハイブリッドＶＩＩＩ因
子構成体を、増強された凝固活性及び／又は減少した抗体免疫反応性をもつハイ
ブリッドＶＩＩＩ因子分子の同定のためＶＩＩＩ因子に対する阻害性抗体との反
応性について及び凝固活性についての標準的手順によって検定することが可能で
ある。同様に、ヒト又はブタのＶＩＩＩ因子に比べて減少した凝固活性のみなら
ず低下した抗体反応性をも有するハイブリッド分子を同定することもできる。当
業者であれば、ヒト又はブタのＶＩＩＩ因子に比べて少ない、等しい又は大きい
凝固活性をもつハイブリッドＶＩＩＩ因子分子又はその断片が、ＶＩＩＩ因子欠
損症患者の治療に有用であることを認識するだろう。特異的アミノ酸の置換を伴
う活性組換え型ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子を調製するための本書に記
述された方法を用いて、活性の組換え型ヒト／非ヒト、非ブタ哺乳動物のＶＩＩ
Ｉ因子タンパク質、ハイブリッドの動物−１／動物−２ ＶＩＩＩ因子及び、ハ
イブリッドの等価物ＶＩＩＩ因子又はその断片Ｉを調製することが可能である。
【００７７】 改変された凝固活性をもつハイブリッドのＶＩＩＩ因子分子 本発明は、本書で記述されているような確立した部位特異的突然変異誘発技術
を用いて、その他の種のＶＩＩＩ因子の対応するアミノ酸配列に対して置換され
た１つの種のＶＩＩＩ因子内のプロ凝固活性をもつ単数又は複数のユニークなア
ミノ酸を包含する少なくとその他の特異的配列を含んで成る、プロ凝固組換え型
ハイブリッドヒト／動物、動物／動物、又は等価物ＶＩＩＩ因子分子又はその断
片を提供する。置換において使用されるべき特異的配列は、以下のように選択さ
れハイブリッド構成体が調製され凝血活性について検定される。好ましい例示的
実施形態として特定的に提供されるのは、Ａ２ドメイン内にアミノ酸配列Ｂを含
むハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子である。当業者であれば、改変された凝
固活性つまり好ましくはヒトＶＩＩＩ因子に比べて増大した凝固活性をもつその
他のハイブリッドのヒト／動物、動物／動物及び等価物のＶＩＩＩ因子分子又は
その断片を調製するためにこれらの方法を使用できるということがわかる。
【００７８】 ブタＶＩＩＩ因子内のより大きな凝固活性の根拠は、Lollar, P. et al.(１９
９０)J. Biol. Chem.２６５；１６８８−１６９２：Lollar, P. et al.(１９９
２)J. Biol. Chem.２６７：２３６５２−２３６５７；Fay, P.J. et al.(１９９
２）J. Biol. Chem.２６７：１３２４６−１３２５０によると、活性の喪失を導
くブタＶＩＩＩ因子よりも急速なヒトＶＩＩＩ因子のＡ２サブユニットの自発的
解離にあると思われる。
【００７９】 ヒト及びブタのＶＩＩＩ因子 Ａ２ドメインのアミノ酸配列のアラインメント
の比較（残基番号づけは、ヒトＶＩＩＩ因子の全長アミノ酸配列、配列番号２と
の関係において位置３７３で始まる）が、図１Ｃに示されている。改変された凝
固活性をもつハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子分子の調製のために、ヒトＡ
２ドメイン内でのヒト及びブタのＡ２アミノ酸配列（それぞれ配列番号２及び６
）の比較に基づいて顕示された突然変異誘発の初期標的候補が、表Ｉに示されて
いる。 ──────────────────────────────── 表Ｉ 突然変異誘発のヒトアミノ酸配列標的候補（配列番号２） 配列 残基 ミスマッチ 電荷変化 398-403 ６ ４ １ 434-444 １０ ４ ３ 484-496 １３ ７ ３ 598-603 ６ ４ ２ 536-541 ６ ４ ０ 713-722 １０ ６ ２ 727-737 １１ ６ ２ ──────────────────────────────── 表１及び図１Ａ〜１Ｂは、Ａ２ドメインの１７％しか構成しないもののヒト及
びブタのＡ２ドメイン間の配列差の７０％を包含するヒト及びブタのＡ２ドメイ
ンアミノ酸配列（それぞれ配列番号２及び６）内の７つの配列を例示している。
【００８０】 ヒトＶＩＩＩ因子のＡ２ドメイン（Ser３７３〜Arg７４０）内のアミノ酸配列
Ser３７３〜Glu６０４が相同のブタ配列で置換された、組換え型ハイブリッドヒ
ト／ブタ構成体が記述されている。この構成体は、Ａ２阻害物質と反応せず、ヒ
トＢ（−）ＶＩＩＩ因子と同じ凝固活性をもつ。ヒトＶＩＩＩ因子に比べて増大
した凝固活性をもつヒトＶＩＩＩ因子内の完全なブタＡ２ドメイン置換を含む血
漿由来のハイブリッド分子が記述されている。これらの構成体を比較すると、残
基Ａsp６０５とＡrg７４０の間の領域がヒト及びブタのＶＩＩＩ因子間の活性差
の原因であることが明らかになる。この領域は、例えば、Ａ２のＮＨ2末端領域
内にブタの置換を含むハイブリッドのＶＩＩＩ因子分子を作るために広く用いら
れてきた「オーバーラップ拡張によるスプライシング」（ＳＯＥ）方法といった
ような確立された部位特異的突然変異誘発技術を用いることによって、Ａsp６０
５とＡrg７４０の間の領域内にブタの置換を伴う組換え型ハイブリッドヒト／ブ
タＶＩＩＩ因子分子を系統的に作ることによって、さらに特定的に定義し得る。
これらの分子は、上述のとおり、ＣＯＳ−７細胞及びベビーハムスター腎細胞の
中で発現させることができる。これらは、ヘパリシ−Sepharose（商標）及び免
疫親和性クロマトグラフィといったような当該技術分野において既知の方法を用
いて均質性に至るまで精製可能である。タンパク質濃度は、Ａ280での紫外線吸
光により推定でき、構成体の比活性は、Ａ280で（単一段階の血液凝固検定によ
り１mlあたりのユニット数で測定された）凝固活性を除することで決定できる。
ヒトＶＩＩＩ因子は約３０００〜４０００Ｕ／Ａ280の比活性をもち、一方ブタ
のＶＩＩＩ因子は約２００００Ｕ／Ａ280の比活性をもつ。好ましい実施形態に
おいては、プロ凝固性の組換え型ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子は、２０
０００Ｕ／Ａ280の比活性をもち、Ａ２ドメイン内に最少量のブタ置換を含む。
【００８１】 本書で記述するように、ヒトＶＩＩＩ因子に比べて増強されていても、等しく
ても又は低減されていてもよいが好ましくは増強されているハイブリッド タン
パク質を同定するために部位特異的突然変異誘発が使用される。ハイブリッドヒ
ト／ブタの実施形態においては、Ho. S. N, et al. ７７Gene ５１−５９（１９
９４）によって及び例７及び８内で記述されているように、好ましくはオーバラ
ップ拡張によるスプライシング（ＳＯＥ）方法を用いて、特異的ヒト配列がブタ
配列で置換される。ヒトＡ２ドメインの一部分についてアミノ酸配列をループア
ウトするのに行なわれたように（例７参照）、オリゴヌクレオチド特異的突然変
異誘発も使用することができる。ハイブリッドの機能的分析は、凝固活性を明ら
かにすることから、配列をさらに吟味し、標準的な点突然変異分析技術によりプ
ロ凝固性配列についてマッピングすることができる。
【００８２】 本発明は、ハイブリッドＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ及びタンパク質を、ＤＮＡ配列
決定、凝固活性検定、ＥＬＩＳＡ及び精製済みハイブリッドＶＩＩＩ因子の２８
０ｎｍでのＵＶ吸光度による質量、凝固比活性（Ｕ／mg）、精製済みハイブリッ
ドＶＩＩＩ因子のＳＤＳ−ＰＡＧＥなどといった、確立され日常的なものである
方法によって、特徴づけしうる、ということを考慮している。アミノ酸、炭水化
物、硫酸塩又は金属イオン分析といった、臨床的有効性についてのその他の既知
のテスト方法が必要とされる。
【００８３】 ヒトＶＩＩＩ因子に比較してより優れた凝固活性をもつ組換え型ハイブリッド
ＶＩＩＩ因子は、血漿由来のＶＩＩＩ因子よりも作るのに費用がかからず、ＶＩ
ＩＩ因子欠損症の有効な治療に必要とされるＶＩＩＩ因子の量を減少させること
ができる。
【００８４】 低減した免疫反応性をもつハイブリッドＶＩＩＩ因子分子 ＶＩＩＩ因子の凝固活性を阻害する抗体（「阻害物質」又は「阻害性抗体」）
と免疫反応性をもつエピトープが、ＶＩＩＩ因子内の既知の構造−機能関係に基
づいて特徴づけされてきた。恐らく、阻害物質は、ＶＩＩＩ因子のドメイン構造
と結びつけられた巨大分子相互作用又は、フォン・ウィルブランド因子、トロン
ビン、Ｘａ因子、ＩＸａ因子又はＸ因子とのその会合のいずれかを分断すること
によって作用することができると思われる。しかしながら、Fulcher et al.（１
９８５）Proc. Natl. Acad. Sci USA ８２：７７２８−７７３２；及びScandell
a et al.（１９８８）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５：６１５２−６１５６
により記述されているように、ヒトＶＩＩＩ因子に対する阻害性抗体の９０％以
上は、ＶＩＩＩ因子の４０ｋＤａのＡ２ドメイン又は２０ｋＤａのＣ２ドメイン
内にあるエピトープに結合して、これらのドメインと結びつけられた特定の機能
を崩壊することによって作用する。Ａ２及びＣ２エピトープに加えて、Scandell
a et al.（１９９３）Blood ８２：１７６７−１７７５に従うと、ＶＩＩＩ因子
のＬ鎖のＡ３及びＣ１ ドメイン内に第３のエピトープが存在する可能性がある
。この推定上の第３のエピトープの意義は未知であるが、ＶＩＩＩ因子内のエピ
トープ反応性の一部分を説明しているように思われる。
【００８５】 Lollar et al.(１９９４）J. Clin. Invest. ９３：２４９７−２５０４．に
より示されているように、抗Ａ２抗体は、第Ｘ因子の活性化を遮断する。Ware e
t al.(１９９２）Blood Coagul. Fibrinolysis ３：７０３−７１６、により記
述された欠失突然変異誘発による以前のマッピング研究は、Ａ２エピトープが、
４０ｋＤａのＡ２ドメインのＮＨ2末端の２０ｋＤａ領域内にあるものと位置特
定した。競合的免疫ラジオメトリック検定は、Ａ２阻害物質が、Scandella et a
l.（１９９２）Throm. Haemostas ６７：６６５−６７１．により記述され例８
で実証されるように、共通のエピトープ又は狭くクラスタ化したエピトープのい
ずれかを認識するということを示した。
【００８６】 本発明は、活性組換え型ハイブリッド及びハイブリッド等価物のＶＩＩＩ因子
分子又はその断片、これらのハイブリッドをコードする核酸配列、これらを調製
し単離する方法及びこれらを特徴づけする方法を提供している。これらのハイブ
リッドは、その他の種のＶＩＩＩ因子の対応するアミノ酸配列に対して置換され
た１つの種のＶＩＩＩ因子の単数又は複数のユニークなアミノ酸を包含する少な
くとも１個の特異的アミノ酸配列をさらに含むヒト／動物、動物／動物又は等価
物のハイブリッドＶＩＩＩ因子分子を含むか；又は、ヒト、動物又はハイブリッ
ドのＶＩＩＩ因子内の特異的アミノ酸配列に対し置換された、ＶＩＩＩ因子に対
する既知の配列同一性を全くもたない単数又は複数のアミノ酸を包含する少なく
とも１個の配列を含む。結果として得られるハイブリッドのＶＩＩＩ因子は、ヒ
ト又はブタのＶＩＩＩ因子に比べてＶＩＩＩ因子阻害性抗体に対する免疫反応性
が低いか反応性を全くもたない。
【００８７】 ＶＩＩＩ因子分子内のアミノ酸の置換について以上の節で記述したアプローチ
を用いると、阻害性抗体が向けられているＡ２、Ｃ２又はその他のいずれかのド
メイン内の単数又は複数の重要域を包含する、ハイブリッド等価物ＶＩＩＩ因子
分子のアミノ酸配列又は好ましくはヒトであるその他の種のＶＩＩＩ因子内の単
数又は複数のアミノ酸を包含する少なくとも１個の配列に対して置換させられて
いる、好ましくはブタである１つの種の対応するＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を選
択するために、突然変異分析が利用される。これらの方法については以下でさら
に詳細に記述されている。結果として得られるプロ凝固性組換え型ハイブリッド
構成体は、標準的検定を用いてヒトＶＩＩＩ因子に比べた場合、阻害性抗体に対
する免疫反応性が低いか、又は反応性を全くもたない。以下で記述するように、
増々小さくなるアミノ酸配列の系統的置換とそれにつづく免疫反応性についての
ハイブリッド構成体の検定を通して、ＶＩＩＩ因子分子のあらゆるドメイン内の
エピトープは、より低い免疫反応性しかもたないか又はこれを全くもたないアミ
ノ酸配列により置換された状態でマッピングされ、ハイブリッドＶＩＩＩ因子が
調製される。
【００８８】 当業者であれば、阻害性抗体が向けられているＡ２、Ｃ２及び／又はその他の
ドメイン内にエピトープを含む単数又は複数のアミノ酸を包含する少なくとも１
個の配列を同定し置換し、かつ、ヒト又はブタのＶＩＩＩ因子に比べて低い免疫
反応性しかもたないか又は全く反応性をもたないプロ凝固性組換え型ハイブリッ
ドヒト／動物、動物／動物又は等価物のＶＩＩＩ因子又はその断片を構築するた
めに、エピトープマッピング、ハイブリッドＶＩＩＩ因子分子の構築及び構成体
の突然変異分析を組合わせたこのアプローチを使用することができる、というこ
とがわかる。このアプローチは、例８に記述されているように、実施例と同様抗
ＶＩＩＩ因子抗体に対する抗原性を全くもたず、ヒトＡ２ドメイン内にブタのア
ミノ酸置換を有する組換え型プロ凝固性ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子を
調製するために使用される。
【００８９】 通常、ブタＶＩＩＩ因子は、ヒトＶＩＩＩ因子に対する阻害性抗体と、限定的
にか又は全く反応しない。以下のように、Ａ２以外のドメイン内での置換及びそ
の他の種のＶＩＩＩ因子を用いていかにしてハイブリッドＶＩＩＩ因子を調製で
きるかの一例として、ＡＤドメイン内のアミノ酸置換に基づく阻害性抗体との反
応性が減少した又は全くない組換え型ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子分子
が調製される。ブタＡ２ドメインは、例６、７及び８及び以上で記述されたよう
な標準的クローニング技術によってクローニングされ、次に、ｃＤＮＡを切断す
るための制限部位の使用又はオーバーラップ拡張によるスプライシング（ＳＯＥ
）といったような日常的手順を用いてＡ２ドメイン内で切断されスプライスされ
る。結果として得られたブタのアミノ酸配列は、ヒトのＡ２ドメイン内へと置換
されてハイブリッドＶＩＩＩ因子構成体を形成し、この構成体は、好ましくはRe
Neoである。哺乳動物の発現ベクター内に挿入され、好ましくはベビーハムスタ
ー腎細胞である培養細胞内に安定した形で移入され、上述のとおり発現される。
ハイブリッドＶＩＩＩ因子は、例えば日常的なベセズダ検定又は無血漿色素産生
基質検定により、抗Ａ２抗体を用いて免疫反応性について検定される。ベセズダ
単位（ＢＵ）は、阻害物質力価を測定するための標準的な方法である。ベセズダ
力価をハイブリッド内で測定できない場合には（＜０.７ Ｂｕ／mgＩｇＧ）置換
された対応するブタ配列の領域内で、ヒトＡ２エピトープが除去されたのである
。エピトープは漸進的に狭められ、かくして、可能なかぎりわずかなブタ配列し
か伴わないハイブリッドヒト／ブタ分子を産生するために、特異的Ａ２エピトー
プを決定することができる。本書で記述するように、阻害的免疫反応性にとって
きわめて重要であるアミノ酸 Ａrg４８４−Ｉle５０８に対応する２５残基の配
列が同定され、ヒトのＡ２ドメイン内で置換される。この配列内には、ヒトとブ
タのＶＩＩＩ因子の間にはわずか９つの差しかない。この領域をさらに分析し置
換することが可能である。
【００９０】 A2ドメインに置換を有するかまたは有さずに、C1、C2または他のドメインにお
けるアミノ酸配列の置換に基づいて、阻害抗体との低下した反応性を有するかま
たは反応性を有していない、ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子分子をまた製
造することができる。C2エピトープは例えば、部位特異的変異誘発と合わせた相
同走査アプローチを用いて位置決定することができる。より詳細には、その手法
は、A2ドメインにおけるアミノ酸置換について本明細書に記載したのと同じかま
たは同様であることができ、例えば、RT-PCRを用いるかまたは、ヒトC2または他
のドメインDNAを用いてブタ肝臓cDNAライブラリーを調べることによる、ブタC2
または他のドメインをクローン化すること；C2または他のドメインにおけるエピ
トープを位置決定し、かつ同時に置換するための制限部位技術および／または連
続SOE；B(-)ＶＩＩＩ因子におけるヒトC2または他のドメインの置換；発現ベク
ター、例えばpBluescriptへの挿入；培養した細胞における発現；ならびに免疫
反応性についての通常のアッセイを含む。アッセイのために、C2ハイブリッドＶ
ＩＩＩ因子とC2-特異的阻害剤との反応性、MR［スカンデラ(Scandella)ら、(199
2) Thomb. Haemostasis 67:665-671およびルビン(Lubin)ら、(1994)］および／
または親和性クロマトグラフィーにより製造される他のC2特異的抗体を成し遂げ
ることができる。
【００９１】 C2ドメインは、アミノ酸残基2173-2332(配列番号2)からなる。シマ(Shima), M
.ら、Thromb. Haemostas 69:240-246によれば、この154のアミノ酸領域内で、阻
害剤活性は、残基2248-2312間の65のアミノ酸領域に特異的であると思われる。
ヒトおよびブタＶＩＩＩ因子のC2配列がこの領域において約85％同一であるなら
、それは、ＶＩＩＩ因子の機能的に活性な領域のどこか他の場所であるので、ヒ
トおよびブタのＶＩＩＩ因子 C2アミノ酸配列間に約10個の差異があり、これは
、置換されたC2配列を用いてハイブリッドを構成するために最初の標的として使
用することができる。
【００９２】 臨床的に重要なＶＩＩＩ因子エピトープは、A2およびC2ドメインに限られるよ
うである。しかしながら、ＶＩＩＩ因子の他の領域(A1、A3、BまたはC1ドメイン
）に対する抗体が同定されるなら、非抗原性ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因
子分子について本明細書に記載したアプローチを用いて、エピトープを位置決定
し、除去することができる。
【００９３】 より詳細には、推定の第２のＬ鎖エピトープおよび／または任意の他の動物ま
たはヒトのＶＩＩＩ因子ドメインにおける任意の他のエピトープの位置決定をま
た達成することができる。初めに、A3またはC1ドメインにおける第３の阻害剤エ
ピトープの存在の決定を以下のように行うことができる。ヒト(「H」)およびブ
タ(「p」)ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列をモデルとして用いて、A1p-A2p-A3p-C1H-C
2pおよびA1p-A2p-A3H-C1p-C2pのB-ドメイン欠如(domainless)ハイブリッドが構
築される。ブタＶＩＩＩ因子に対して低い力価を有するかまたは力価が検出でき
ない約20人の患者血漿（ドクター ドロテア スカンデラ(Dr. Dorothea Scande
lla)、アメリカン赤十字(American Red Cross)から）からの阻害剤IgGが、ハイ
ブリッドに対して試験される。第３のエピトープがA3ドメインにあるなら、阻害
IgGはA1p-A2p-A3H-C1p-C2pと反応するが、A1p-A2p-A3p-C1H-C2pとは反応しない
ことが予想される。逆に、第３のエピトープがC1ドメインにあるなら、阻害IgG
はA1p-A2p-A3p-C1H-C2pと反応するが、A1p-A2p-A3H-C1p-C2pとは反応しないこと
が予想される。第３のエピトープが同定されるなら、それは、A2およびC2エピト
ープについて本明細書において記載した手順によって特性決定される。
【００９４】 例えば、C1またはA3ドメインエピトープに特異的な抗体は、A1p-A2p-A3H-C1p-
C2pおよびA1p-A2p-A3p-C1H-C2pハイブリッドを用いる親和性クロマトグラフィー
によって、および、組換えＶＩＩＩ因子 C2-Sepharaose（商標）を通すことに
よるC2特異的抗体の除去によって、全患者IgGから分離することができる。推定
の第３のエピトープはSOE構築体によって同定され、ここでは、好ましい実施態
様においては、ヒトＶＩＩＩ因子 A3またはC1ドメインの一部が系統的にブタ配
列で置きかえれられている。
【００９５】 減じられた免疫原性を有するハイブリッドＶＩＩＩ因子分子： 分子は、ヒトまたは動物において抗体の生成を誘発することができるとき、免
疫原性である。本発明は、他の種のＶＩＩＩ因子の免疫原活性を有する対応する
アミノ酸配列が置換された１つの種のＶＩＩＩ因子の１つ以上のユニークアミノ
酸を含む少なくとも１つの特異的アミノ酸配列；または、ヒト、動物もしくはハ
イブリッドの因子のアミノ酸配列が置換されているＶＩＩＩ因子に対する公知の
同一性を有していない１つ以上のアミノ酸を含む少なくとも１つのアミノ酸配列
を含む、ヒトまたは動物における野生型ヒトブタＶＩＩＩ因子より免疫原性が低
い、プロ凝固性(procoagulant)組換えハイブリッドヒト／動物または動物／動物
ＶＩＩＩ因子分子、ハイブリッドＶＩＩＩ因子等価分子またはいずれかの断片を
提供する。このハイブリッドは、動物またはヒトにおいて阻害剤展開の発生率を
低下させるために、かつＶＩＩＩ因子欠乏症を治療するために使用することがで
き、予め治療されていない血友病患者を治療するのに使用するのが好ましい。好
ましい実施態様においては、修飾されたＶＩＩＩ因子は、ヒトＶＩＩＩ因子アミ
ノ酸配列を含み、免疫原活性を有するヒトアミノ酸配列が置換された１つ以上の
アラニン残基をさらに含み、ヒトまたは動物において減じられた免疫原性を有す
るかまたは免疫原性がないプロ凝固性組換えハイブリッド等価分子またはその断
片を生じる。
【００９６】 ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子を用いた、ＶＩＩＩ因子分子における非
抗原アミノ酸配列の置換と合わせた、エピトープ位置決定および変異分析につい
て本明細書で記載したプロセスは、低い抗原性を有するハイブリッド分子を生じ
る。このモデルおよび関連方法を用いて、本明細書で記載した任意のハイブリッ
ド構築体を、部位特異的変異誘発技術によって変えて、できるだけ多くの任意の
機能性エピトープを除去して、ハイブリッドＶＩＩＩ因子を認識する免疫系の能
力を最小にし、それによって免疫原性を減らすことができる。
【００９７】 抗原性をさらに減らし、より小さい免疫原性のハイブリッドＶＩＩＩ因子を構
築するために使用することができる１つの方法は、ヒト、動物またはハイブリッ
ドの等価ＶＩＩＩ因子における選択された特異的アミノ酸配列のアラニン走査変
異誘発(alanine scanning mutagenesis)（カニンガム(Cunningham)、B.C.ら、（
1989）、Science 244:1081-1085により記載された）である。アラニン走査変異
誘発においては、推定でエピトープに関係するアミノ酸側鎖が、部位特異的変異
誘発を用いて、アラニン残基で置換される。アラニン変異体の野生型タンパク質
への抗体結合を比較することによって、個々の側鎖の結合相互作用への相対的寄
与を決定することができる。アラニン置換は特に有用であると思われる。という
のは、抗体結合への側鎖の寄与は、β炭素以外は除去されるが、グリシン置換と
違って、主鎖の配座は通常変えられないからである。アラニン置換は、タンパク
質-タンパク質相互作用を支配する主要な立体的な疎水的または静電気的作用を
賦課することはない。
【００９８】 タンパク質の抗原-抗体相互作用においては、通常約15〜20の、抗体と接触す
る抗原側鎖がある。主鎖相互作用とは反対であるように、側鎖相互作用はタンパ
ク質-タンパク質相互作用を支配する。最近の研究では、わずかだけ（約3〜5）
のこれらの側鎖相互作用が結合エネルギーのほとんどに寄与することが示唆され
た。クラックソン(Clackson), T.ら、(1995) Science 267:383-386参照。幾つか
のネズミモノクローナル抗体について成長ホルモンエピトープの広範囲の分析は
、結合エネルギーへの側鎖の寄与について以下の階層を示し：Arg＞Pro＞Glu-As
p-Phe-Ile、Trp、Ala、GlyおよびCysは試験されていない［ジン(Jin), L.ら、(1
992) J. Mol. Biol. 226:851-865］。本明細書に記載されたA2エピトープについ
ての結果はこれと一致する。というのは、484〜508のA2セグメント中の25個の残
基のうちの12個が、これらの側鎖を含むからである（図1C）。
【００９９】 ある種のアミノ酸残基が抗体によって特によく認識されるという発見は、公知
のエピトープからのこれらの残基の除去がこれらのエピトープを認識する免疫系
の能力を低下させる、すなわち、分子をより小さい免疫原性にすることができる
ことを示す。A2エピトープの場合には、免疫原性の残基は、ＶＩＩＩ因子凝固活
性の喪失なしに置き換えることができる。例えば、HP9においては、Arg484をSer
で置換し、Pro485をAlaで置換し、Arg489をGlyで置換し、Pro492をLeuで置換し
、Phe501をMetで置換する。さらに、実施例８に記載された、ハイブリッドヒト
／ブタＶＩＩＩ因子構築体における免疫反応性を試験するために使用した患者血
漿からの結果は、異なる患者からの抗体が、A2ドメインにおいて同じかまたは非
常に類似の構造領域を認識すること、および、A2阻害剤の結合に関係するA2ドメ
インにおける残基がほとんど変更を示さないと思われることを示す。かくして、
ヒトＶＩＩＩ因子残基484〜508に含まれるA2エピトープは、ＶＩＩＩ因子の他の
構造領域よりよくヒト免疫系により認識されることにおいて、免疫優性なエピト
ープである。完全なプロ凝固性活性を維持しながら、この構造を、別の種からの
非抗原性ＶＩＩＩ因子配列または非ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列で置換すると、免
疫系によるハイブリッドまたはハイブリッド等価なＶＩＩＩ因子の認識を変える
ことが予想される。
【０１００】 エピトープを支配する傾向があるかさ高いおよび／または帯電した残基を小さ
い天然の側鎖（例えばアラニン）で置換する部位特異的変異誘発は、より少ない
免疫原性領域を生じ得ることが予期される。それぞれの重要な阻害剤エピトープ
にこれらの幾つかの置換基を含む分子は、免疫系が、抗原-抗体相互作用の典型
である鍵-鍵穴機構により適合するのが困難であろうと予想される。その低い抗
原性の故に、そのようなハイブリッド分子は、阻害剤でＶＩＩＩ因子欠乏症患者
を治療するのに有用であり得る。そして、その低い免疫原性の故に、予め治療さ
れていない血友病A患者を治療するのに有用であり得る。
【０１０１】 一般的結果は、少しの鍵となる残基のうちの１つの変異は、幾つかの次数の大
きさだけ与えられたタンパク質-タンパク質相互作用のための結合定数を減らす
のに十分であることである。かくして、すべてのＶＩＩＩ因子エピトープは、限
られた数の、阻害剤の展開に不可欠のアミノ酸を含むと思われる。ＶＩＩＩ因子
の各エピトープのために、免疫原活性を有する１つ以上の特定のアミノ酸を含む
少なくとも１つの配列をアラニンで置換することは、野生型ＶＩＩＩ因子より免
疫原性が少ない活性分子を生じ得る。好ましい実施態様においては、ハイブリッ
ドＶＩＩＩ因子はB-ドメイン欠失である。
【０１０２】 免疫原活性を有するＶＩＩＩ因子におけるアミノ酸配列を、ほとんどまたは全
く免疫原活性を有さないアミノ酸配列で置換して、活性な組換えハイブリッドま
たはハイブリッド等価なＶＩＩＩ因子を製造する方法は、典型的実施態様として
、A2ドメインにアミノ酸置換を有するハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子を用
いて、以下のようである。ヒトＶＩＩＩ因子領域484〜508には25個の残基がある
。部位特異的変異誘発を使用して、全部で475個の変異体について、任意のこれ
らの残基が任意の他の19個のアミノ酸で置換されている、単一の変異体を作るこ
とができる。さらに、１つより多い変異を有するハイブリッド分子を構築するこ
とができる。
【０１０３】 ハイブリッド構築体は、フリゲット(Friguet), B.ら、(1985) J. Immunol. Me
thods 77:305-319(1985)に記載されているように、阻害剤抗体についての結合定
数を測定することによって、抗原性についてアッセイすることができる。好まし
い実施態様においては、結合定数は、少なくとも３次数の大きさだけ減らされ、
これは、ベセスダ(bethesda)力価を臨床的に重大でないレベルまで下げる。例え
ば、A2抗体による阻害のIC50（結合定数の粗い尺度）は、実施例８において記載
された、ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子構築体HP2、HP4、HP5、HP7および
HP9で減少され、このことは、ベセスダ(bethesda)力価を測定不能なレベルに下
げることと関連した。例えば、ヒトＶＩＩＩ因子の２重または３重変異体（例え
ば、ヒトＶＩＩＩ因子 Arg484-＞Ala、Arg489-＞Ala、Phe501-＞Ala３重変異体
）は、治療上の使用のために十分に低い抗原性を有する分子を生じることが予想
される。同様の変異を、C2エピトープおよび推定の第３のエピトープにおいて行
うことができる。好ましい実施態様は、２つまたは３つのＶＩＩＩ因子エピトー
プへの２個または３個のアラニン置換を含む。これらの領域への他の置換をまた
行うことができる。
【０１０４】 好ましい実施態様においては、ヒトまたはブタＶＩＩＩ因子より、ヒトおよび
動物における抗原性が小さいか、および／または免疫原性が小さい、ハイブリッ
ド等価ＶＩＩＩ因子分子が同定される。そのようなハイブリッド等価構築体は、
それらの減少した抗原性および／または免疫原性について、動物において試験す
ることができる。例えば、対照ならびに、ＶＩＩＩ因子欠乏症のウサギ、ブタ、
イヌ、マウス、霊長類および他の哺乳動物を、動物モデルとして使用することが
できる。１つの実験プロトコールにおいては、ハイブリッドまたはハイブリッド
等価なＶＩＩＩ因子を計画的に６ヶ月〜１年の期間にわたって動物に、好ましく
は静脈内注入によって、5〜50単位／kg体重、好ましくは10〜50単位／kg体重、
最も好ましくは40単位／kg体重の投与量範囲で、投与することができる。決まっ
た方法（免疫アッセイおよびベセスダ(bethesda)検定を含む）により、試験期間
中にわたる注入後間隔をあけて採取した血漿試料中で、抗体を測定することがで
きる。決まった手順（１段階凝固検定を含む）を用いて、試料中の凝固活性がま
た測定できる。
【０１０５】 ハイブリッド等価なＶＩＩＩ因子分子を、ヒトにおいて、少なくとも２つのタ
イプの臨床的試みにおいて、減ぜられた抗原性および／または免疫原性について
試験することができる。ハイブリッドまたはハイブリッド等価なＶＩＩＩ因子が
阻害抗体と免疫反応性であるかどうかを決定するように設計された、１つのタイ
プの試みにおいては、ハイブリッドまたはハイブリッド等価なＶＩＩＩ因子が、
好ましくは静脈内注入により、治療上のヒトまたはブタＶＩＩＩ因子の凝固活性
を阻害するＶＩＩＩ因子に対する抗体を有する、ＶＩＩＩ因子欠乏症の約25人の
患者に投与される。ハイブリッドまたはハイブリッド等価なＶＩＩＩ因子の投与
量は、5〜50単位／kg体重、好ましくは10〜50単位／kg体重、最も好ましくは40
単位／kg体重の範囲にある。各投与の約１時間後、血液試料からのＶＩＩＩ因子
の回収率を、１段階凝固検定において測定する。注入の約５時間後に試料を再び
採取し、回収率を測定する。全回収率および試料からの因子VIIの消失速度は、
抗体力価および阻害活性の予測である。抗体力価が高いなら、ＶＩＩＩ因子回収
率は通常測定することができない。回収率結果を、血漿由来ヒトＶＩＩＩ因子、
組換えヒトＶＩＩＩ因子、ブタＶＩＩＩ因子および他の普通に使用される治療形
態のＶＩＩＩ因子またはＶＩＩＩ因子置換物を用いて治療した患者における回収
率結果の回収率と比較する。
【０１０６】 ハイブリッドまたはハイブリッド等価なＶＩＩＩ因子が免疫原性であるかどう
か、すなわち、患者が阻害抗体を展開するかどうかを決定するように設計された
、第２のタイプの臨床上の試みにおいては、先の段落において記載したように、
ハイブリッドまたはハイブリッド等価なＶＩＩＩ因子が、約100人の予め治療さ
れていない、ＶＩＩＩ因子に対する抗体を展開しなかった血友病患者に投与され
る。治療は、６ヶ月〜１年の期間にわたってほぼ２週間ごとに行われる。この期
間中１〜３ヶ月の間隔で、血液試料を取り、ベセスダ(bethesda)検定または他の
抗体検定を行って、阻害抗体の存在を決定する。上記したようにして、各注入後
に回収検定をまた行うことができる。結果を、血漿由来ヒトＶＩＩＩ因子、組換
えヒトＶＩＩＩ因子、ブタＶＩＩＩ因子または他の普通に使用される治療形態の
ＶＩＩＩ因子またはＶＩＩＩ因子置換物を受けた血友病患者と比較する。
【０１０７】 ヒトおよび非ブタ、非ヒト哺乳動物ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列を用いた、ハイ ブリッドＶＩＩＩ因子分子の製造 特定のアミノ酸の置換を用いる、ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子を製造
するために使用される方法は、A2、C2および／または他のドメインにおける１個
以上のアミノ酸の置換に基づいて、ヒトまたはブタＶＩＩＩ因子と比べて変えら
れているかまたは同じ凝固活性および／または等しいかまたは減らされた免疫反
応性および／または免疫原性を有する、組換えハイブリッドヒト／非ヒト、非ブ
タ哺乳動物または動物／動物ＶＩＩＩ因子タンパク質を製造するために使用する
ことができる。
【０１０８】 アミノ酸配列同一性の同様の比較を、ヒトおよび非ヒト、非ブタ哺乳動物ＶＩ
ＩＩ因子タンパク質の間で行って、プロ凝固活性、抗-A2および抗-C2免疫反応性
および／または免疫原性または、他のドメインにおける免疫反応性および／また
は免疫原性が存在する、アミノ酸配列を決定することができる。次に、同様の方
法を使用して、ハイブリッドヒト／非ヒト、非ブタ哺乳動物ＶＩＩＩ因子分子を
製造することができる。上記したように、各ハイブリッドの機能分析は、阻害抗
体に対する減じられた反応性および／または減らされた免疫原性、および／また
は増加された凝固活性を明らかにし、その配列は、点変異分析によってさらに詳
細に分析することができる。
【０１０９】 例えば、ハイブリッドヒト／マウスＶＩＩＩ因子分子を、上記したようにして
製造することができる。ヒト（配列番号2）およびマウス（配列番号6）のA2ドメ
インのアミノ酸配列アラインメント(alignment)は、図1Cに示されている。エル
ダー(Elder)らによって報告されたように、マウスcDNA（配列番号5）によりコー
ドされるＶＩＩＩ因子タンパク質は、全体的にヒト配列（配列番号2）への74％
配列同一性（Bドメインが比較から除かれるときには87％同一性）にて、2319個
のアミノ酸を有し、ヒトＶＩＩＩ因子より32個アミノ酸が短い。マウスAおよびC
ドメインにおけるアミノ酸配列（配列番号6）は非常によく保存され、ヒト配列
（配列番号2）に対して84-93％配列同一であり、一方、Bおよび２つの短い酸性
ドメインは42〜70％配列同一性を有する。詳細には、A1、A2およびA3マウスアミ
ノ酸配列（配列番号6）は、対応するヒトアミノ酸配列（配列番号2）に対して85
、85および90％同一である。C1およびC2マウスアミノ酸配列は、対応するヒトア
ミノ酸配列に対して93および84％同一である。予想されるマウスＶＩＩＩ因子ア
ミノ酸配列（配列番号6）においては、番号付けの目的のためのアミノ酸配列同
一性を用いて、A1、A2およびA3ドメインは、ヒトＶＩＩＩ因子アミノ酸1〜372、
373〜740および1690〜2032にそれぞれ相同である。
【０１１０】 トロンビン／Xa因子および１つを除くすべての活性化されたタンパク質C開裂
部位は、マウスＶＩＩＩ因子において保存される。フォン ウィルブランド(von
Willebrand)因子結合のためのチロシン残基がまた保存される。
【０１１１】 エルダー(Elder)らによれば、マウスＶＩＩＩ因子のヌクレオチド配列（配列
番号5）は7519個の塩基を含み、ヒトヌクレオチド配列（配列番号1）との全体的
に67％同一性を有する。ネズミコード配列の6957個の塩基対は、ヒトＶＩＩＩ因
子におけるコード配列の7053個の塩基対との82％配列同一性を有する。Bドメイ
ンが比較に含まれないときには、88％ヌクレオチド配列同一性がある。
【０１１２】 エルダー(Elder)らは、ヒトおよびマウスＶＩＩＩ因子分子は全体的に74％同
一であること、ならびに、変更されるときに血友病へと至る95％のヒト残基がマ
ウスにおいて同一であることを報告する。これらのデータは、ブタＶＩＩＩ因子
分子において凝固活性および／または抗体に対する免疫反応性を有するアミノ酸
配列を同定するのに使用される同じ技術をマウスまたは他の動物のＶＩＩＩ因子
へ適用して、同様のアミノ酸配列を同定し、かつハイブリッド分子を製造するこ
とを支持する。
【０１１３】 ヒトおよび非ヒト、非ブタ哺乳動物ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列および非ＶＩＩ Ｉ因子アミノ酸配列を用いた、減じられた交差反応性を有するハイブリッドＶＩ ＩＩ因子分子の製造 ブタＶＩＩＩ因子は、ヒトＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体を有するＶＩＩＩ因
子欠乏症患者を治療するために臨床的に使用される。ヒト血漿がブタＶＩＩＩ因
子と反応する交差反応性を、ハイブリッドブタ／非ヒト、非ブタ哺乳動物または
ハイブリッド等価ＶＩＩＩ因子の製造によって減らすことができる。好ましい実
施態様においては、決まったベセスダ(bethesda)検定および標準として特定の他
の哺乳動物血漿を使用して、ヒトA2、C2または他のドメイン特異的阻害剤が非ヒ
ト、非ブタ哺乳動物（「他の哺乳動物」）ＶＩＩＩ因子と反応するかどうかの決
定がなされる。通常、阻害剤力価を血漿中で測定するので、精製した他の哺乳動
物ＶＩＩＩ因子は必要ではない。阻害剤が他の哺乳動物ＶＩＩＩ因子、例えばそ
の配列が公知であるネズミＶＩＩＩ因子と反応しないなら、ヒト／ブタハイブリ
ッドを用いて同定されるように、対応する他の哺乳動物配列はブタエピトープ領
域中へと置換することができる。動物の配列が知られたなら、部位特異的変異誘
発技術、例えばクンケル(Kunkel), T.A.ら、(1991) Meth. Enzymol. 204: 125-1
39により記載されたオリゴヌクレオチド仲介変異誘発を使用して、ハイブリッド
ブタ／動物ＶＩＩＩ因子分子を製造することができる。他の動物血漿が、ネズミ
またはブタＶＩＩＩ因子より、A2、C2または他のＶＩＩＩ因子阻害剤との反応性
が小さいなら、ブタエピトープに対応する動物の配列を、決まった方法、例えば
RT-PCRならびに、部位特異的変異誘発によって構築されたハイブリッドヒト／動
物またはブタ／動物ＶＩＩＩ因子によって決定することができる。また、ブタＶ
ＩＩＩ因子に比べて減じられたヒト血漿との交差反応性を有するハイブリッドヒ
ト／動物またはブタ／非ブタ哺乳動物ＶＩＩＩ因子を製造することができ、これ
は、１つ以上の他の動物からの対応するアミノ酸配列置換を有する。さらなる実
施態様においては、ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列との公知の同一性を有していない
アミノ酸配列、好ましくは、ブタエピトープ配列のための、アラニン走査変異誘
発技術を用いたアラニン残基の置換によって、交差反応性を減じることができる
。
【０１１４】 臨床的に重要なエピトープの同定後、阻害剤血漿の広い調査に対して、イン
ビトロ(in vitro)で試験されるときに、ブタＶＩＩＩ因子と比べて小さいかまた
は等しい交差反応性を有する組換えハイブリッドＶＩＩＩ因子分子が発現される
。好ましくは、これらの分子は、これらのドメインにおける免疫反応性アミノ酸
配列が他の哺乳動物の配列で置き換えられた、結合されたA2/C2ハイブリッドで
ある。これらの領域におけるさらなる変異誘発を行って、交差反応性を減じるこ
とができる。望ましくはあるが、減じられた交差反応性は、存在するブタＶＩＩ
Ｉ因子濃縮物よりも利点を有し得る生成物を製造するために必要ではなく、これ
は、汚染ブタタンパク質による副作用を生じ、ブタＶＩＩＩ因子配列の免疫原性
による厄介な作用を生じ得る。ハイブリッドヒト／他の哺乳動物またはブタ／他
の哺乳動物ＶＩＩＩ因子分子は、外来のブタタンパク質を含まない。その上、ブ
タA2ドメインにおいて行った広範なエピトープ位置決定は、95％より多い治療上
のハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子配列がヒトであることを示す。
【０１１５】 ハイブリッドＶＩＩＩ因子等価物の製造 上記し、実施例に記載したＶＩＩＩ因子分子におけるアミノ酸置換の方法をま
た使用して、ヒト、動物またはハイブリッドのＶＩＩＩ因子に抗原性および／ま
たは免疫原性部位を含む少なくとも１つの特定のアミノ酸配列が置換された、Ｖ
ＩＩＩ因子に対する公知のアミノ酸配列同一性を有していない１つ以上のアミノ
酸を包含する少なくとも１つのアミノ酸配列（非ＶＩＩＩ因子配列）を含む、プ
ロ凝固性組換えハイブリッドＶＩＩＩ因子等価分子またはその断片を製造するこ
とができる。得られる活性ハイブリッドＶＩＩＩ因子等価分子は、ＶＩＩＩ因子
阻害抗体との等しいかまたは少ない反応性および／または、未置換のヒト、動物
またはハイブリッドのＶＩＩＩ因子より少ないヒトおよび動物における免疫原性
を有する。
【０１１６】 ヒトまたは動物ＶＩＩＩ因子またはハイブリッドヒト／動物ＶＩＩＩ因子にお
ける凝固活性および／または抗原活性および／または免疫原活性に不可欠のアミ
ノ酸のこれらの配列を置換して、ハイブリッドの等価ＶＩＩＩ因子分子を製造す
ることができる適当なアミノ酸残基は、凝固活性、抗原活性または免疫原活性を
有する動物またはヒトＶＩＩＩ因子アミノ酸配列に対して公知の配列同一性を有
していない任意のアミノ酸を包含する。好ましい実施態様においては、置換する
ことができるアミノ酸は、アラニン変異誘発技術を用いたアラニン残基を包含す
る。
【０１１７】 本明細書に記載されたハイブリッドＶＩＩＩ因子等価分子はまた、動物ＶＩＩ
Ｉ因子配列に対する公知の同一性を有していないアミノ酸残基が、凝固活性、抗
原活性または免疫原活性に不可欠でないアミノ酸残基の代わりに用いられた分子
を包含する。
【０１１８】 上記したように、ハイブリッドＶＩＩＩ因子等価分子の１つの実施態様におい
ては、分子は、阻害剤血漿との減じられた交差反応性を有する。交差反応性ＶＩ
ＩＩ因子における１つ以上のエピトープが、上記したように同定されており、よ
って、非ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列、好ましくは、例えばアラニン走査変異誘発
法を用いてアラニン残基で置換されている。
【０１１９】 好ましい実施態様においては、ＶＩＩＩ因子に対する公知の配列同一性を有し
ていない１つ以上のアミノ酸、好ましくはアラニン残基（好ましくはヒトＶＩＩ
Ｉ因子において、エピトープを含む１つ以上のアミノ酸を含む少なくとも１つの
配列が置換されているか、および／または免疫原性部位を含む１つ以上のアミノ
酸を含む少なくとも１つの配列が置換されている）を包含する少なくとも１つの
配列を含むプロ凝固性組換えハイブリッドＶＩＩＩ因子等価分子が製造される。
得られるハイブリッド等価ＶＩＩＩ因子分子またはその断片は、ＶＩＩＩ因子に
対して阻害抗体との減じられた免疫反応性を有するかまたは免疫反応性を有さず
、および／またはヒトまたは動物において減じられた免疫原性を有するかまたは
免疫原性を有しない。非抗原性のブタユニークアミノ酸配列による置換のために
ヒトＶＩＩＩ因子のA2ドメインにおいて特定の抗原性アミノ酸配列を同定する方
法は、実施例７および８に記載されており、ヒトおよび動物のＶＩＩＩ因子のA2
および他のドメインにおける抗原性配列を同定するための、および、非ＶＩＩＩ
因子アミノ酸配列を置換するための部位特異的変異誘発法、例えばアラニン走査
変異誘発を使用するための例である。
【０１２０】 ヒトＡ２エピトープは実施例８に記載のように２５またはそれ以下のアミノ酸
に狭められたため、ヒトアミノ酸配列を有する限られた数のハイブリッドＶＩＩ
Ｉ因子構築体にアラニンスキャニング突然変異誘発を施し、どれがプロ凝固性で
あり、非免疫活性であり、そして／またはＡ２アミノ酸置換に基づく非免疫原性
ハイブリッドＶＩＩＩ因子構築体であるかを決定することができる。Ａ２ドメイ
ンでは、ハイブリッド構築体において、抗原性と免疫原性両方の低下を達成する
、アラニン置換のための最も可能性の高い候補は、Arg484、Pro485、Tyr487、Se
r488、Arg489、Pro492、Val495、Phe501、およびIle508である。これらの突然変
異体の各々を含むハイブリッド構築体の、ｍＡｂ４１３に対する結合親和性およ
びＡ２特異的患者のＩｇＧのパネルはＥＬＩＳＡにより決定されるであろう。活
性であり、且つ、Ａ２インヒビターに対する結合親和性が２桁以上低下する突然
変異体は、いずれもＡ２置換されたＶＩＩＩ因子分子の候補である。エピトープ
が変化すればするほど免疫原性は低くなるという仮定に基づき、１以上の突然変
異を有する構築体が選択されるであろう。ヒトとブタの両方のＶＩＩＩ因子に共
通するエピトープのための重要残基があるかも知れないことから、Arg484〜Ile5
08間の領域には、その他の候補残基があることもあり得る。例えば、蛋白−蛋白
相互作用にはしばしば荷電残基が関与しているが、事実、Arg490に対するアラニ
ン置換基は、ヒトＶＩＩＩ因子のインヒビターに対して僅か０.２％の反応性を
有するに過ぎない、プロ凝固性ＶＩＩＩ因子を生成する（表VI）。同様に、Lys4
93に対するアラニン置換もまた可能な候補である。
【０１２１】 この方法は、ハイブリッド等価ＶＩＩＩ因子構築体を作製するための、Ｃ２エ
ピトープおよび、Ａ３またはＣ１ドメインにあると思われる推定第三エピトープ
、ならびにＶＩＩＩ因子中に同定されるその他任意のエピトープで実施すること
ができる。
【０１２２】 診断検定 ハイブリッドヒト／動物、動物／動物、または等価ＶＩＩＩ因子 ｃＤＮＡお
よび／またはここから発現される蛋白は、その全体または一部を、例えば人間の
ＶＩＩＩ因子欠損患者の血清および体液の試料を包含する基質中の、ヒトまたは
動物のＶＩＩＩ因子またはハイブリッドヒト／動物因子または等価なＶＩＩＩ因
子に対する阻害抗体の検出のための診断試薬として、検定に使用することができ
る。これらの抗体検定は、例えばＥＬＩＳＡ検定、免疫ブロット、ラジオイムノ
アッセイ、免疫拡散検定、およびＶＩＩＩ因子生物活性の検定（例えば、凝固検
定による）を包含する。これらの試薬の製造技術およびそれらの使用方法は当業
者に知悉されている。例えば、患者の血清試料中の阻害抗体の検出のためのイム
ノアッセイは、少なくとも１個の抗原部位を含む充分量のハイブリッドヒト／動
物ＶＩＩＩ因子を被検試料と反応させることを含むことができる［ここで、この
量は、試料中の阻害抗体と、検出可能な複合体を形成するのに充分である］。
【０１２３】 核酸およびアミノ酸プローブは、ハイブリッドヒト／ブタ、ヒト／非ヒト非ブ
タ哺乳動物、動物／動物、もしくは等価なＶＩＩＩ因子 ｃＤＮＡまたは蛋白分
子もしくはそのフラグメントの配列に基づいて作製することができる。幾つかの
態様において、これらは、市販の色素または酵素的、蛍光、化学ルミネセンスも
しくは放射性標識を用いて標識することができる。このアミノ酸プローブは、例
えば、ヒト、動物、またはハイブリッドヒト／動物ＶＩＩＩ因子の存在が疑われ
る血清またはその他の体液をスクリーニングするために使用することができる。
インヒビターのレベルを患者で定量して健康な対照と比較し、これを例えばＶＩ
ＩＩ因子欠損患者をハイブリッドヒト／動物またはハイブリッド等価ＶＩＩＩ因
子で治療できるかどうかを決定するために使用することができる。このｃＤＮＡ
プローブは、例えばＤＮＡライブラリーのスクリーニングにおいて研究目的に使
用することができる。
【０１２４】 医薬組成物 ハイブリッドヒト／動物、ブタ／非ヒト非ブタ哺乳動物、動物１／動物２，ま
たは等価ＶＩＩＩ因子を含有する医薬組成物は、単独または適当な薬学的安定化
化合物、デリバリー媒質、および／または担体媒質と組み合わせて、Remington
のPharmaceutical Sciences（E.W.Martin）に記載のような既知の方法に従って
製造する。
【０１２５】 一つの好ましい態様では、静脈内注入のための好ましい担体またはデリバリー
媒質は、生理食塩水または燐酸緩衝化食塩水である。
【０１２６】 別の好ましい態様では、好適な安定化化合物、デリバリー媒質、および担体媒
質は、他のヒトまたは動物蛋白、例えばアルブミンを包含するが、これに限定さ
れる訳ではない。
【０１２７】 燐脂質ベシクルまたはリポソーム懸濁液もまた、薬学上許容し得る担体または
デリバリー媒質として好ましい。これらは当業者の知悉する方法に従って製造で
き、例えば、ホスファチジルセリン／ホスファチジルコリンまたはその他の燐脂
質の組成物、または、ＶＩＩＩ因子は負に荷電した燐脂質膜に結合することから
、表面に負の電荷を与える洗浄剤を含み得る。リポソームは、適当な脂質（例え
ばステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジル
コリン、アラカドイルホスファチジルコリン、およびコレステロール）を無機溶
媒に溶解し、次いでこれを蒸発させて容器表面に乾燥脂質の薄膜を残すことによ
って製造できる。次にＶＩＩＩ因子の水溶液をこの容器に導入する。次いで容器
を手で円運動させて脂質を容器側面から遊離させて脂質凝集物を分散させ、それ
によりリポソーム懸濁液を形成させる。
【０１２８】 ハイブリッドまたはハイブリッド等価ＶＩＩＩ因子は、ビタミンＫ依存性凝固
因子、組織因子、およびフォン・ヴィルブランド因子（ｖＷｆ）またはＶＩＩＩ
因子結合部位を含むｖＷｆ、およびシュクロースのような多糖類を包含する、そ
の他の適当な安定化化合物、デリバリー媒質、および／または担体媒質と組み合
わせることができる。
【０１２９】 ハイブリッドまたはハイブリッド等価ＶＩＩＩ因子はさらに、ヒトＶＩＩＩ因
子を到達させるのと同じ方法で、レトロウイルスベクターのようなデリバリー手
段を用いて、遺伝子治療によって到達させることができる。この方法は、ＶＩＩ
Ｉ因子ｃＤＮＡを人間の細胞中に取り込ませ、これをＶＩＩＩ因子欠損患者に直
接移植するか、または、これを、ＶＩＩＩ因子分子を透過するが細胞は透過しな
い移植可能装置に入れ、次いでそれを移植することから成る。好ましい方法はレ
トロウイルス仲介遺伝子転移であろう。この方法では、修飾したレトロウイルス
のゲノム中に外因性遺伝子（例えばＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ）をクローニングする
。この遺伝子はウイルス手段によって宿主細胞のゲノムに挿入され、そこで当該
細胞により発現される。レトロウイルスベクターは、それがウイルスを産生せず
、宿主のウイルス感染を防止するよう修飾する。この種の治療の一般的原則は当
業者に知悉されており、文献に論じられている［例えば、Kohn,D.B.等、(1989)
Transufusion 29:812-820］。
【０１３０】 ハイブリッドＶＩＩＩ因子はハイブリッド分子の半減期および保存期間を増大
させるためｖＷｆに結合させて保存することができる。さらに、ＶＩＩＩ因子の
凍結乾燥は、ｖＷｆ存在下での活性分子の収率を改善することができる。商業的
供給者により用いられているヒトおよび動物ＶＩＩＩ因子の現行保存法を、ハイ
ブリッドＶＩＩＩ因子の保存に利用することができる。これらの方法には、（１
）部分精製状態でのＶＩＩＩ因子の凍結乾燥（さらなる精製なしに注入されるＶ
ＩＩＩ因子「濃縮物」として）；（２）チンマーマン法によるＶＩＩＩ因子の免
疫親和精製およびＶＩＩＩ因子を安定化するアルブミンの存在下での凍結乾燥；
（３）アルブミン存在下での組換えＶＩＩＩ因子の凍結乾燥、が包含される。
【０１３１】 加えて、ハイブリッドＶＩＩＩ因子は、０.６Ｍ ＮａＣｌ、２０mM ＭＥＳ、
および５mM ＣａＣｌ2（pH６.０）中、４℃で無期限に安定であり、また、これ
らの緩衝液中で凍結保存でき、且つ殆ど活性を失わずに融解させることができる
。
【０１３２】 治療の方法 ハイブリッドまたはハイブリッド等価ＶＩＩＩ因子を使用して、阻害抗体を持
つおよび持たない血友病患者において、そして阻害抗体の発現に起因する後天的
ＶＩＩＩ因子欠損の患者において、ＶＩＩＩ因子欠損に起因する制御不能の出血
（例えば、動脈内、頭蓋内、または胃腸管出血）を治療する。活性物質は好まし
くは静脈内投与する。
【０１３３】 さらに、ハイブリッドまたはハイブリッド等価ＶＩＩＩ因子は、当該ハイブリ
ッドを産生するよう遺伝学的に作り替えられた細胞の移植によって、または、上
記のように係る細胞を含む装置の埋め込みによって投与することができる。
【０１３４】 好ましい態様において、単独または安定剤、デリバリー媒質、および／または
担体と組み合わせたハイブリッドもしくはハイブリッド等価ＶＩＩＩ因子の医薬
組成物は、ヒトまたは動物ＶＩＩＩ因子の注入のために用いられるのと同じ方法
に従って、患者に静脈内注入する。
【０１３５】 治療を必要とする患者に投与しなければならないハイブリッドまたはハイブリ
ッド等価ＶＩＩＩ因子組成物の治療用量は、ＶＩＩＩ因子欠損の重篤度に応じて
変わるであろう。一般に、用量レベルは、頻度、作用持続時間、ならびにそれぞ
れの患者の出血エピソードの重篤度および持続時間と調和した単位で調節する。
したがって、ハイブリッドＶＩＩＩ因子は、標準的凝固検定で測定される、出血
を止めるための治療的有効量の該ハイブリッドを患者に到達させるに充分な量の
、薬学上許容し得る担体、デリバリー媒質、または安定剤中に含有させる。
【０１３６】 ＶＩＩＩ因子は、古典的には、血友病Ａの人間に由来する血漿における凝固不
全を是正する、正常血漿中に存在する物質として定義される。精製および部分精
製型のＶＩＩＩ因子のインビトロ凝固活性は、人間の患者でのＶＩＩＩ因子の注
入用量を算出するために使用され、そしてこれは、患者血漿から回収される活性
の、およびインビボ出血異常是正の、信頼し得る指標である。Lusher,J.M.等、3
28 New Engl.J.Med. 328:453-459；Pittman,D.D.等、(1992)Blood 79:389-397；
およびBrinkhous等、(1985) Proc.Natl.Acad.Sci. 82:8752-8755によると、新規
なＶＩＩＩ因子分子のインビトロ標準検定と、イヌの注入モデルまたは人間の患
者でのそれらの挙動との間に食い違いは報告されていない。
【０１３７】 通常、ハイブリッドまたはハイブリッド等価ＶＩＩＩ因子の投与により患者に
おいて達成されるべき血漿ＶＩＩＩ因子の所望レベルは、正常の３０〜１００％
の範囲である。ハイブリッドまたはハイブリッド等価ＶＩＩＩ因子の好ましい投
与方法において、この組成物は、約５ないし５０単位／kg体重の範囲、より好ま
しくは１０〜５０単位／kg体重の範囲の好ましい用量で、そして最も好ましくは
２０〜４０単位／kg体重の用量で静脈内投与され；投与間隔は約８〜２４時間の
範囲であり（重症の血友病患者の場合）；そして治療期間は、日数にして１〜１
０日間、または出血エピソードが解消するまでである。例えば、Roberts,H.R.お
よびM.R.Jones、「血友病および関連病態−プロトロンビンの先天性欠損症（第I
I因子、第V因子、および第VIIないしXII因子）」、Ch.153、1453-1474、1460、H
ematology、Williams,W.J.等編(1990)を参照されたい。インヒビターを有する患
者は、より多くのハイブリッドまたはハイブリッド等価ＶＩＩＩ因子を必要とす
るかも知れず、または、ヒトＶＩＩＩ因子より高い比活性、もしくは低下した抗
体反応性もしくは免疫原性の故に、患者は、より少ないハイブリッドまたはハイ
ブリッド等価ＶＩＩＩ因子を必要とするかも知れない。ヒトまたはブタＶＩＩＩ
因子による治療において、注入されるハイブリッドまたはハイブリッド等価ＶＩ
ＩＩ因子の量は一段階ＶＩＩＩ因子凝固検定によって定められ、また、選ばれた
例においては、注入後に患者の血漿中のＶＩＩＩ因子を測定することによりイン
ビボ回復が決定される。いかなる特定の対象に対しても、個体の必要性および該
組成物を投与しまたはその投与を管理する人間の専門的判断に従い、時間経過に
伴う個別的用量計画が決定されるべきであり、また、本明細書に開示される濃度
範囲は例示に過ぎず、特許請求される当該組成物の範囲または実施の限定を意図
するものではないということが理解されるべきである。
【０１３８】 治療は、必要に応じて、該組成物の静脈内１回投与、または長期間にわたる定
期的もしくは連続投与の形を取り得る。別法として、ハイブリッドまたはハイブ
リッド等価ＶＩＩＩ因子は、リポソームによって１回または様々な時間間隔で数
回、皮下または経口投与することができる。
【０１３９】 ハイブリッドまたはハイブリッド等価ＶＩＩＩ因子はさらに、ヒトＶＩＩＩ因
子に対する抗体を発現した血友病患者においてＶＩＩＩ因子欠損に起因する制御
不能な出血を治療するために使用することもできる。この場合、単独のヒトまた
は動物ＶＩＩＩ因子に優る凝固活性は必要ない。ヒトＶＩＩＩ因子に劣る凝固活
性（即ち、３０００単位／mg未満）は、もしこれが患者血漿中の抗体により中和
されないならば、有用であろう。
【０１４０】 ハイブリッドＶＩＩＩ因子および修飾されたＶＩＩＩ因子は、ヒトＶＩＩＩ因
子とは比活性の点で相違し得るということが本明細書で立証された。ヒトＶＩＩ
Ｉ因子より大きなプロ凝固活性を有する、ハイブリッド、ハイブリッド等価およ
び修飾ＶＩＩＩ因子蛋白は、患者のＶＩＩＩ因子欠損を是正するために要する用
量がより低いため、血友病の治療に有用である。ヒトＶＩＩＩ因子より低いプロ
凝固活性を有するハイブリッド、ハイブリッド等価および修飾ＶＩＩＩ因子は、
さらに、正常なヒトＶＩＩＩ因子に比して少なくとも１％の比活性を有するなら
ば、治療用途にとって好適である。故に、プロ凝固活性を有する本発明に係るハ
イブリッド、ハイブリッド等価または修飾ＶＩＩＩ因子は、ヒトＶＩＩＩ因子の
少なくとも１％の比活性を有すると定義される。
【０１４１】 上記で一般的に記載した、ハイブリッドまたはハイブリッド等価ＶＩＩＩ因子
分子およびそれを単離し、特性決定し、作製し、そして使用する方法は、以下の
非限定的実施例を参照することによりさらに理解されるであろう。
【０１４２】 実施例１：ブタＶＩＩＩ因子およびハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子の検
定 ブタＶＩＩＩ因子は、当該分子の比活性に基づくと、ヒトＶＩＩＩ因子より凝
固活性が高い。これらの結果は実施例４の表IIIに示す。この結論は、ヒトブタ
ＶＩＩＩ因子を公正に比較できる適当な標準曲線の使用に基づくものである。凝
固検定は、血友病Ａ患者から誘導された血漿の凝固時間を短縮する、ＶＩＩＩ因
子の能力に基づくものである。２種類の検定を使用した：一段階および二段階検
定である。
【０１４３】 一段階検定においては、血友病Ａの血漿０.１mL（George King Biomedical,In
c.）を、活性化部分トロンボプラスチン試薬（ＡＰＴＴ）(Organon Teknika)０.
１mLおよび試料または標準（希釈したクエン酸塩添加正常ヒト血漿より成る）０
.０１mLと共に水浴中３７℃で５分間インキュベートした。インキュベーション
の後、２０mMＣａＣｌ2０.１mLを添加し、フィブリン凝塊の生成に要する時間を
目視により決定した。
【０１４４】 ＶＩＩＩ因子の単位は、クエン酸塩添加正常ヒト血漿１mL中に存在する量とし
て定義する。ブタおよびヒトＶＩＩＩ因子活性を、標準としてのヒト血漿と直接
比較した。血漿標準または精製蛋白の希釈は０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０２Ｍ HE
PES（pH７.４）中に行った。最高希釈を１／５０とし、３または４希釈の血漿に
基づく標準曲線を作製し、log10凝固時間をlog10血漿濃度に対してプロットする
と、直線状のプロットが得られる。未知試料中のＶＩＩＩ因子の単位はこの標準
曲線からの内挿によって決定した。
【０１４５】 一段階検定は、血友病Ａ血漿中に形成されるアクティベーターによるＶＩＩＩ
因子の内因性活性化に依拠し、一方、二段階検定は、プレ活性化ＶＩＩＩ因子の
プロ凝固活性を測定するものである。二段階検定においては、トロンビンと反応
させておいたＶＩＩＩ因子を含有する試料を、前もって３７℃で５分間インキュ
ベートしておいた活性化部分トロンボプラスチンとヒト血友病Ａ血漿の混合物に
加えた。次に、得られた凝固時間を上記の同じヒト標準曲線に基づき、単位／mL
に変換した。二段階検定での相対活性は、ＶＩＩＩ因子をプレ活性化しておいた
が故に一段階検定での活性より高かった。
【０１４６】 実施例２：ヒトおよびブタＶＩＩＩ因子間の機能的相違の特性決定 ブタおよびヒトの血漿由来ＶＩＩＩ因子とヒト組換えＶＩＩＩ因子の単離は、
Fulcher,C.A.等、(1982) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1648-1652；Toole等、(19
84) Nature 312:342-347(Genetics Institute)；Gitschier等、(1984) Nature 3
12:326-330(Genentech)；Wood等、(1984) Nature 312:330-337(Genentech)；Veh
ar等、312 Nature 312:337-342(Genentech)；Fass等、(1982) Blood 59:594；To
ole等、(1986) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5939-5942の文献に記載されている
。これは幾つかの方法で達成できる。これらの調製物は、ヒトとブタのＶＩＩＩ
因子の間に安定性の機能的相違があるものの、全てサブユニットの組成の点で類
似している。
【０１４７】 ヒト組換えおよびブタＶＩＩＩ因子の比較のため、高度精製ヒト組換えＶＩＩ
Ｉ因子（Cutter Laboratories、バークレイ、ＣＡ）およびブタＶＩＩＩ因子［F
ass等、(1982) Blood 59:594の記載に従い免疫精製した］の調製物をMono Q(商
標)(Pharmacia-LKB、ピスカタウェイ、ＮＪ)アニオン交換樹脂（Pharmacia,Inc.
）上の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付した。このMono Q(商標)Ｈ
ＰＬＣ工程の目的は、比較目的のためヒトおよびブタＶＩＩＩ因子を共通の緩衝
液への交換の少量の不純物を取り除くことであった。ＶＩＩＩ因子１０００〜２
０００単位を入れたバイアルをＨ2Ｏ ５mLで再構成した。次いでHepes（２Ｍ、p
H７.４）を加え最終濃度を０.０２Ｍとした。０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.０２Ｍ H
epes、５mM ＣａＣｌ2、pH７.４（緩衝液Ａに０.１５Ｍ ＮａＣｌを添加）で平
衡化したMono Q（商標）ＨＲ５／５カラムにＶＩＩＩ因子を適用し；１０mLの緩
衝液Ａ＋０.１５Ｍ ＮａＣｌで洗浄し；緩衝液Ａ中の０.１５Ｍ〜０.９０Ｍ Ｎ
ａＣｌの直線勾配２０mL、１mL／分の流速で溶出させた。
【０１４８】 ヒト血漿由来ＶＩＩＩ因子（Mono Q(商標)ＨＰＬＣにより精製）およびブタＶ
ＩＩＩ因子の比較のため、免疫親和精製した血漿由来ブタＶＩＩＩ因子を０.０
４Ｍ Hepes、５mM ＣａＣｌ2、０.０１％Tween-80、pH７.４で１：４に希釈し、
ヒトＶＩＩＩ因子について前段落に記載したのと同じ条件下にMono Q(商標)ＨＰ
ＬＣに付した。ヒトおよびブタのＶＩＩＩ因子の単離のためのこれらの方法は、
当業者にとって標準的なものである。
【０１４９】 カラム画分を一段階凝固検定によりＶＩＩＩ因子活性について検定した。材料
のＡ280による活性の単位で表されたこの検定の平均結果を表IIに示すが、これ
は、一段階検定を用いた場合、ブタＶＩＩＩ因子がヒトＶＩＩＩ因子の少なくと
も６倍の活性を有することを示している。
【０１５０】 ───────────────────────── 表II ヒトおよびブタＶＩＩＩ因子凝固活性の比較 活性（Ｕ／Ａ280） ブタ ２１,３００ ヒト血漿由来 ３,６００ ヒト組換え ２,４００ ───────────────────────── 実施例３：ヒトおよびブタＶＩＩＩ因子の安定性の比較 ＶＩＩＩ因子のための一段階検定の結果は、試料中のＶＩＩＩ因子からＶＩＩ
Ｉa因子への活性化と、生成したＶＩＩＩa因子活性の喪失の可能性を反映してい
る。ヒトおよびブタＶＩＩＩ因子の安定性の直接比較を行った。Mono Q(商標)Ｈ
ＰＬＣ（Pharmacia,Inc.、ピスカタウェイ、ＮＪ）からの試料を同じ濃度および
緩衝液組成に希釈し、トロンビンと反応させた。様々な時間に試料を二段階凝固
検定用に採取した。典型的には、ピーク活性（２分において）はブタＶＩＩＩa
因子がヒトＶＩＩＩa因子の１０倍高く、ブタおよびヒトＶＩＩＩa因子の両活性
はその後低下したが、ヒトＶＩＩＩa因子活性はより速やかに低下した。
【０１５１】 一般に、安定なヒトＶＩＩＩa因子を単離する試みは、安定なブタＶＩＩＩa因
子を生成する条件を使用しても成功しない。これを立証するため、Lollar等、(1
989) Biochemistry 28:666に記載のように、Mono Q(商標)ＨＰＬＣ精製したヒト
ＶＩＩＩ因子をトロンビンで活性化し、安定なブタＶＩＩＩa因子を生成する条
件の下でMono S(商標)カチオン交換（Pharmacia,Inc.）ＨＰＬＣに付した。
【０１５２】 ０.２Ｍ ＮａＣｌ、０.０１Ｍ Hepes、２.５mM ＣａＣｌ2（pH７.４）に入れ
たヒトＶＩＩＩ因子４３μg/mL(０.２μM)（総体積１０mL）をトロンビン（０.
０３６μＭ）と１０分間反応させ、この時点でトロンビンを不可逆的に不活性化
するため、ＦＰＲ−ＣＨ2Ｃｌ Ｄ−フェニル−プロリル−アルギニル−クロロメ
チルケトンを０.２μＭ濃度となるまで加えた。次にこの混合物を４０mM ２−(
Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、５mMＣａＣｌ2（pH６.０）で１
：１に希釈し、５mM ＭＥＳ、５mMＣａＣｌ2（pH６.０）(緩衝液Ｂ)に０.１Ｍ
ＮａＣｌを添加したもので平衡化したMono S(商標)ＨＲ５／５ＨＰＬＣカラム（
Pharmacia,Inc.）に２mL／分でロードした。ＶＩＩＩa因子は、１mL／分の、緩
衝液Ｂ中の０.１Ｍ ＮａＣｌから０.９Ｍ ＮａＣｌに至る勾配２０mLによりカラ
ム洗浄無しに溶出した。
【０１５３】 二段階検定で凝固活性を有する画分は、これらの条件下に単一ピークとして溶
出した。ピーク画分の比活性はおよそ７５００Ｕ／Ａ280であった。Mono S(商標
)ＶＩＩＩa因子のピークをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付し、その後蛋白を銀染色すると、ＶＩＩＩ因子
のヘテロ二量体（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２／Ａ１）誘導体に相当する２つのバンドが現
れた。Ａ２断片は低濃度のためこれらの条件での銀染色では同定されなかったが
、125Ｉ標識により微量成分として同定された。
【０１５４】 ヒトＶＩＩＩ因子の結果とは対照的に、Mono S(商標)ＨＰＬＣにより同一条件
下で単離されたブタＶＩＩＩa因子は１.６ｘ１０6Ｕ／Ａ280の比活性を持ってい
た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるブタＶＩＩＩa因子の分析は、Ａ１、Ａ２、および
Ａ３−Ｃ１−Ｃ２サブユニットに相当する３個の断片を示し、ブタＶＩＩＩa因
子が３個のサブユニットを有することを証明した。
【０１５５】 pH６.０でのヒトトロンビン活性化ＶＩＩＩ因子調製物のMono S(商標)ＨＰＬ
Ｃの結果は、ヒトＶＩＩＩa因子安定なブタＶＩＩＩa因子を産生する条件下では
不安定であることを示している。しかしながら、ピーク画分中に微量のＡ２フラ
グメントが同定されたものの、凝固活性が少量のヘテロ三量体ＶＩＩＩa因子か
らもたらされるのか、比活性の低いヘテロ二量体ＶＩＩＩa因子からもたらされ
るのかの決定は、この方法のみからではできなかった。
【０１５６】 この問題を解決するためには、ヒトＶＩＩＩa因子を、それがＡ２サブユニッ
トを失う前に単離する方法が望ましい。この目的のため、Mono S(商標)緩衝液の
pHをpH５に低下させることを含む方法で単離を遂行した。Mono Q(商標)精製した
ヒトＶＩＩＩ因子（０.５mg）をＨ2Ｏで、０.２５Ｍ ＮａＣｌ、０.０１ＭHepes
、２.５mMＣａＣｌ2、０.００５％Tween-80、pH７.４中０.２５mg/mL（１μm）
のＶＩＩＩ因子という最終組成となるまで希釈した（総体積７.０mL）。トロン
ビンを最終濃度０.０７２μｍとなるまで加え、３分間反応させた。次いでＦＰ
Ｒ−ＣＨ2Ｃｌ（０.２μm）でトロンビンを不活性化した。次にこの混合物を４
０mM酢酸ナトリウム、５mMＣａＣｌ2、０.０１％Tween-80、pH５.０で１：１に
希釈し、０.０１M酢酸ナトリウム、５mMＣａＣｌ2、０.０１％Tween-80、pH５.
０に０.１Ｍ ＮａＣｌを添加したもので平衡化したMono S(商標)ＨＲ５／５ＨＰ
ＬＣカラムに２mL／分でロードした。ＶＩＩＩa因子は、１mL／分の、同緩衝液
中の０.１Ｍ ＮａＣｌから１.０Ｍ ＮａＣｌに至る勾配２０mLによりカラム洗浄
無しに溶出した。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により示される検出可
能量のＡ２断片を含むピークにおける凝固活性の回収をもたらした。ピーク画分
の比活性は、pH６.０で回収された活性の１０倍高かった（７５０００Ｕ／Ａ280 対７５００Ｕ／Ａ280）。しかしながら、４℃において無期限に安定である、pH
６.０で単離されたブタＶＩＩＩa因子とは対照的に、ヒトＶＩＩＩa因子の活性
はMono S(商標)からの溶出後数時間にわたり着実に低下した。さらに、pH５.０
で精製し直ちに検定したＶＩＩＩa因子の比活性は、ブタＶＩＩＩa因子のわずか
５％であり、これは、検定前に実質的な解離が起こったことを示すものである。
【０１５７】 これらの結果は、ヒトおよびブタ両者のVIIIa因子が３つのサブユニット（Ａ
１、Ａ２、およびＡ３−Ｃ１−Ｃ２）から構成されることを実証する。サブユニ
ットＡ２の解離は、生理的イオン強度、ｐＨ、および濃度などの幾つかの条件下
におけるヒトおよびブタ両者のVIIIa因子の活性低下の原因である。幾つかの条
件下におけるブタVIIIa因子の相対的安定性は、サブユニットＡ２のより強い解
離のためである。
【０１５８】 実施例４：サブユニットを再構成することによるハイブリッドヒト／ブタVIII
因子の調製 ブタのVIII因子Ｌ鎖およびVIII因子Ｈ鎖を下記のように単離した。ＥＤＴＡの
0.5M溶液、pH7.4をMono Q（商標）で精製したブタのVIII因子に加えて最終濃度0
.05Mとし、室温で18〜24時間そのまま放置した。等量の10mMヒスチジン−Ｃｌ、
10mMＥＤＴＡ、および0.2% v/v Tween 80（pH6.0）（緩衝液Ｂ）を加え、この溶
液を前もって緩衝液Ａプラス0.25M NaCl中で平衡化したMono S（商標）HR 5/5カ
ラムに1 ml／分で注入した。VIII因子Ｈ鎖は、SDS-RAGEによって判定されるよう
に樹脂に結合しなかった。VIII因子Ｌ鎖は緩衝液Ａに溶かした0.1〜0.7M NaCl 2
0mlの直線的勾配により1 ml／分で溶出され、SDS-RAGEによれば均一であった。V
III因子Ｈ鎖は下記の方法でMono Q（商標）HPLC（Pharmacia, Inc., Piscataway
, N.J.）によって単離した。VIII因子Ｈ鎖は、VIII因子Ｌ鎖の精製中Mono S（商
標）に吸着しない。VIII因子Ｈ鎖を含有する通過した材料に0.5M Hepes緩衝液（
pH7.4）を加えることによりpH7.2に調整し、0.1M NaCl、0.02M Hepes、および0.
01% Tween 80（pH7.4）中で平衡化したMono Q（商標）HR 5/5 HPLCカラム（Phar
macia, Inc.）に注入した。カラムをこの緩衝液10mlで洗浄し、VIII因子Ｈ鎖を
この緩衝液に溶かした0.1〜1.0M NaCl 20mlの勾配で溶出した。ヒトのＬ鎖およ
びＨ鎖を同じ方法で単離した。
【０１５９】 ヒトおよびブタのＬおよびＨ鎖を下記のステップに従って再構成した。ヒトま
たはブタのVIIIa因子Ｌ鎖10μl、100μg / mlを、1M NaCl、0.02M Heprs、5mM C
aCl2、および0.01% Tween 80（pH7.4）中において、（１）同じ緩衝液に溶かし
た異種のＨ鎖25μl、60μg / ml、（２）0.02M Hepes 10μlおよび0.01% Tween
80（pH7.4）、および（３）0.6M CaCl2 5μlと、室温で１４時間混合した。混合
物を、0.02M MES、0.01% Tween 80、および5mM CaCl2（pH6）で１／４に希釈し
、0.1M NaCl、0.02M MES、0.01% Tween 80、および5mM CaCl2（pH6）中で平衡化
したMono S（商標）HR 5/5へ注入した。同一の緩衝液に溶かした0.1〜1.0M NaCl
20mlの勾配を1 ml／分で通し、フラクション0.5mlを回収した。各フラクション
の280nmの吸光度を読み取り、各フラクションを一段階血餅形成検定によりVIII
因子活性に対する吸光度で検定した。Ｈ鎖は過剰に存在し、遊離のＬ鎖（Ｈ鎖と
対合していない）もまたMono S（商標）に結合するため、その過剰のＨ鎖は遊離
のＬ鎖が調製物の一部でないことを保証する。再構成実験に続いてMono S（商標
）HPLC精製を、鎖の全ての４つの可能な組合わせ、すなわちヒトのＬ鎖／ヒトの
Ｈ鎖、ヒトのＬ鎖／ブタのＨ鎖、ブタのＬ鎖／ブタのＨ鎖、およびブタのＬ鎖／
ヒトのＨ鎖について行なった。表IIIにヒトのＬ鎖／ブタのＨ鎖のVIII因子が天
然のブタのVIII因子（表II）に匹敵する活性を有することを示し、またブタのＨ
鎖中の構造要素がヒトVIII因子と比べてブタVIII因子の凝固剤活性を増加させる
原因であることを示している。 ──────────────────────────────────── 表III ハイブリッドヒト／ブタVIII因子の凝固剤活性とヒトおよびブタVIII因子の凝 固剤活性の比較 活性（U / A280） ブタのＬ鎖／ブタのＨ鎖 ３０,６００ ヒトのＬ鎖／ブタのＨ鎖 ４４,１００ ブタのＬ鎖／ヒトのＨ鎖 １,１００ ヒトのＬ鎖／ヒトのＨ鎖 １,０００ ──────────────────────────────────── 実施例５：ドメインを再構成することによる活性なハイブリッドヒト／ブタVI
II因子の調製 ブタのＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２二量体、ブタのＡ２ドメイン、ヒトのＡ１／Ａ
３−Ｃ１−Ｃ２二量体、およびヒトのＡ２ドメインを、Lollar等の論文J. Biol.
Chem. 267 (33) :23652−23657 (1992) に従ってそれぞれブタまたはヒトの血
液から単離した。例えば、ブタのＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２二量体を単離するため
に、ブタのVIII因子（140μg）、pH6.0を、３０分間5N NaOHを加えることにより
pH8.0まで上昇させ、Ａ２ドメインの解離および血餅形成検定による９５％不活
性化を生じさせた。混合物を緩衝液Ｂ（20mM Hepes、5mM CaCl2、および0.01% T
ween 80（pH7.4））で１：８に希釈し、緩衝液Ｂ中で平衡化したMono S（商標）
カラムへ注入した。Ａ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２二量体を、緩衝液Ｂに溶かした0.1
〜1.0M NaClの勾配を用いることによって約0.4M NaClにおける単一のシャープな
ピークとして溶出した。ブタのＡ２ドメインを単離するには、ブタのVIII因子を
VIII因子 0.64mgから出発してLollar等の論文Biochem. 28:666−674 (1989) の
方法に従って作成した。遊離のＡ２ドメインを、Mono S（商標）クロマトグラム
中の0.3M NaClにおける二次成分（50μg）として単離した。
【０１６０】 ハイブリッドヒト／ブタVIII因子分子を二量体およびドメインから下記のよう
に再構成した。精製した成分の濃度および緩衝液条件は下記のとおりである。す
なわち、緩衝液Ａ（5mM MES、5mM CaCl2、および0.01% Tween 80（pH6.0））プ
ラス0.3M NaClに溶かした0.63μMのブタＡ２；緩衝液Ｂプラス0.4M NaCl（pH7.4
）に溶かした0.27μMのブタＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２；0.3M NaCl、10mMヒスチジ
ン−ＨＣｌ、5mM CaCl2、および0.01% Tween 20（pH6.0）に溶かした1μMのヒト
Ａ２；0.5M NaCl、10mMヒスチジン−ＨＣｌ、2.5mM CaCl2、および0.1% Tween 2
0（pH6.0）に溶かした0.18μMのヒトＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２。再構成実験は、
等体積のＡ２ドメインおよびＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２二量体を混合することによ
って行なった。ブタＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２二量体との混合実験においては、0.
5M MES、pH6.0の添加によってｐＨを6.0まで下げて70mMとした。
【０１６１】 可能な全ての４つのハイブリッドVIII a因子分子、〔ｐＡ２／（ｈＡ１／Ａ３
−Ｃ１−Ｃ２）〕、〔ｈＡ２／（ｐＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）〕、〔ｐＡ２／（
ｐＡ１／ｐＡ３−Ｃ１−Ｃ２）〕、および〔ｈＡ２／（ｈＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ
２）〕の凝固活性を、二段階血餅形成検定によりいろいろな回数で得た。
【０１６２】 Ａ２ドメインとＡ３−Ｃ１−Ｃ２二量体の混合後の活性の発生は、１時間のう
ちにほぼ完了し、３７℃で少なくとも２４時間安定であった。表IVは、１時間で
検定したときの再構成されたハイブリッドVIIIa因子分子の活性を示す。VIIIa因
子分子の特異的活性を得る二段階検定は一段階検定とは異なり、その値は一段階
検定によって得られたVIII因子分子の活性値と比較することはできない。 ──────────────────────────────────── 表IV ドメインを置換したハイブリッドヒト／ブタVIIIa因子の凝固剤活性の比較 ハイブリッドfVVIIIa 特異的活性（U/mg） ブタＡ２＋ヒトＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ １４０,０００ ブタＡ２＋ブタＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ ７０,０００ ヒトＡ２＋ブタＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ ４０,０００ ヒトＡ２＋ヒトＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ ４０,０００ ──────────────────────────────────── 表IVは、最大の活性がブタＡ２ドメイン／ヒトＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２、次い
でブタＡ２ドメイン／ブタＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２二量体によって呈示されるこ
とを示している。したがって、ブタVIIIa因子のＡ２ドメインをヒトVIIIa因子の
Ａ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２二量体と混合した場合に凝固剤活性が得られた。さらに
、ヒトVIIIa因子のＡ２ドメインをブタVIIIa因子のＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２二量
体と混合した場合に凝固剤活性が得られた。単独ではＡ２、Ａ１、およびＡ３−
Ｃ１−Ｃ２領域は何の凝固剤活性も持たない。
【０１６３】 実施例６：ブタVIII因子のＡ２ドメインの単離および配列決定 ブタVIII因子のＢドメインとＡ２ドメインの一部とをコード化するヌクレオチ
ド配列のみが以前に配列決定されている（Toole等の論文Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 83:5939−5942 (1986)）。全ブタVIII因子Ａ２ドメインに対するｃＤＮＡ
および予想されるアミノ酸配列（それぞれ配列番号:3 および4）を本明細書に開
示する。
【０１６４】 ブタVIII因子Ａ２ドメインをブタ脾臓のＲＮＡ全体の逆転写およびＰＣＲ増幅
によってクローン化した。既知のヒトVIII因子ｃＤＮＡ配列に基づく縮重プライ
マーおよびブタVIII因子配列の一部に基づく正確なブタのプライマーが用いられ
た。ＰＣＲの産物1kbを単離し、Bluescript（商標）（Stratagene）ファージミ
ドベクター中に挿入することによって増幅した。
【０１６５】 ブタＡ２ドメインをジデオキシ配列決定法によって完全配列決定した。ｃＤＮ
Ａおよび予想されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号:3および4で記述される
ようなものである。
【０１６６】 実施例７：組換えハイブリッドヒト／動物VIII因子の調製 ヒトVIII因子のヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列（それぞれ配列番
号:1および2）は文献に記載されている（Toole等の論文Nature 312:342−347 (1
984) (Genetics Institute)、Gitschier等の論文Nature 312:326−330 (1984)
(Genentech)、Wood等の論文Nature 312:330−337 (1984) (Genentech)、Vehar等
の論文Nature 312:337−342 (1984) (Genentech) ）。
【０１６７】 組換えハイブリッドヒト／動物VIII因子を作成するには、ヒトVIII因子ｃＤＮ
Ａ（Biogen Corp.）の領域を除去し、配列アイデンティティーを有する動物ｃＤ
ＮＡ配列を挿入することを必要とする。続いて、ハイブリッドｃＤＮＡを適切な
発現系中で発現させる。一例として、対応するヒトＡ２配列を、一部または全て
のブタＡ２ドメインで置換した、ハイブリッドVIII因子のｃＤＮＡをクローン化
した。最初にヒトVIII因子のＡ２ドメインに対応する全ｃＤＮＡ配列、次いでＡ
２ドメインのより小さな部分を、当業者には一般に知られている方法であるオリ
ゴヌクレオチドの仲介する変異誘発によってループアウトした（例えば、Sambro
ok, J.、 E. F. FritschおよびT. Maniatisの著書「Molecular Cloning: A Labo
ratory Manual」, Chapter 15, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbo
r (1989)を参照されたい）。ステップは下記のとおりである。
【０１６８】 材料 メトキシカルボニル−Ｄ−シクロヘキシルグリシル−グリシル−アルギニン−
ｐ−ニトロアニリド（Spectrozyme（商標）Xa）ならびに抗VIII因子モノクロー
ナル抗体ＥＳＨ４およびＥＳＨ８は、American Diagnostica（Greenwich, CT）
から購入した。単層ホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン（75/25、w/w
）の小胞は、Barenholtz, Y.等の論文Biochemistry 16:2806−2810 (1977) の方
法に従って調製した。組換えデスルファトヒルジンは、Dr. R. B. Wallis, Ciba
-Geigy Pharmaceuticals（Cerritos, CA）から得た。ブタ因子IXa、X、Xa、およ
びトロンビンは、Lollar等の論文Blood 63:1303−1306 (1984) およびDuffy E.
J. 等の論文J. Biol. Che. 207:7621−7827 (1992) の方法に従って単離した。
アルブミンを含まない純粋な組換えヒトVIII因子は、Baxter-Biotech（Deerfiel
d, IL）から得た。
【０１６９】 ブタVIII因子Ａ２ドメインのクローン化 ブタＡ２ドメインをコード化するｃＤＮＡは、Chomczyneki等の論文Anal. Bio
chem. 162:156−159 (1987) の記述に従って単離した逆転写ブタ脾臓ｍＲＮＡの
ＰＣＲ後に得られた。ｃＤＮＡは、プライマーとしてランダム六量体を備えた第
一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Pharmacia, Piscataway, N.J.）を用いて調製した。
ＰＣＲは、既知の制限ブタＡ２のアミノ酸配列に基づく５′末端の縮重プライマ
ー、５′ＡＡＲＣＡＹＣＣＮＡＡＲＡＣＮＴＧＧＧ３′（配列番号: 11）、およ
びブタＡ２ドメインの３′に直接隣接する既知のブタＤＮＡ配列に基づく３′末
端の正確なプライマー、５′ＧＣＴＣＧＣＡＣＴＡＧＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＡＴ
ＴＣ３′（配列番号: 12）を用いて行なった。これらのオリゴヌクレオチドは、
ヒト配列（配列番号: 1）中のヌクレオチド1186〜1203および2289〜2313番に対
応する。増幅は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega Corp.,Madison, WI）を
用いて３５サイクル（９４℃で１分、５０℃で２分、７２℃で２分）行なった。
増幅した断片1.1kbを、Murchuk, D等の論文Nucl. Acads. Res. 19:1154 (1991)
の記述に従ってＴベクター手順を用いてpBlueScript II KS（Stratagene）のEco
RV部位にクローニングした。Escherichia coli XL1-Blue受容能のある細胞を形
質転換し、プラスミドＤＮＡを単離した。配列決定は、Sequenase（商標）バー
ジョン２．０（U.S. Biochemical Corp.; Amersham LifeScience, Inc., Arling
ton Hts, ILの一事業部）を用いて両方向で行なった。この配列は、同一のブタ
（CircumVent（商標）, New England Biolabs, Beverly, MA）由来の脾臓ＤＮＡ
の独立した逆転写で得たＰＣＲ産物の直接配列決定により得られたものと全く同
じ配列によって確認した。自己抗体ＲＣに対するエピトープを含有する領域は、
ヒトVIII因子（配列番号: 2）中の373〜536番として同定された。
【０１７０】 ハイブリッドヒト／ブタVIII因子のｃＤＮＡの構築および発現 アミノ酸残基741〜1648番（配列番号: 2）をコード化する配列を欠く、Ｂドメ
インのないヒトVIII因子（ＨＢ-、Biogen, Inc., Cambridge, MAから入手）を、
ハイブリッドヒト／ブタVIII因子の構築用出発材料として用いた。ＨＢ-を発現
ベクターＲｅＮｅｏ中へクローニングした。操作を容易にするためにVIII因子に
対するｃＤＮＡを、ＲｅＮｅｏからXhoI ／HpaI 断片として単離し、XhoI ／Hpa
I RVで消化したpBlueScript II KS中へクローニングした。オリゴヌクレオチド
、５′ＣＣＴＴＣＣＴＴＴＡＴＣＣＡＡＡＴＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧＡ
ＡＡＴＴＧＡＣ３′（配列番号: 7）を、Kunkel, T.A.等の論文Merh. Enzymol. 204: 125〜139 (1991) の記述によるウラシル含有ファージＤＮＡを用いる部位特
異的変異誘発反応に使用して、同時にヒトＡ２配列（SEQ 配列番号:1中のヌクレ
オチド1169〜2304番）をループアウトし、SnaBI制限部位を導入した。プラスミ
ドを含有する、Ａ２ドメインのないヒトVIII因子をSnaBIで消化し、続いてClaI
リンカーを加えた。次いでブタＡ２ドメインを、それぞれホスホリル化した５′
プライマーすなわち５′ＧＴＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＡ
ＧＡＣＧ３′（ 配列番号: 8）、および３′プライマーすなわち５′ＧＡＡＧＡ
ＧＴＡＧＴＡＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＡＡＴＧＡＣ３′（配
列番号: 9）を用いてＰＣＲによって増幅した。ClaIリンカーをＰＣＲ産物に加
え、続いて結合させてヒトVIII因子含有ベクターにした。５′および３′末端の
接合を修正するためにそれぞれ配列番号: 8中に示されたオリゴヌクレオチドお
よびヌクレオチド1〜22番（配列番号: 9中の５′ＧＡＡ‐‐‐ＴＴＣ）を用いる
部位特異的変異誘発により、Ａ１／Ａ２およびＡ２／Ａ３接合を修正して正しい
トロンビンの開裂およびフランキング配列を回復した。ＨＰ１と呼ばれる得られ
た構築物において、ヒトＡ２ドメインはブタＡ２ドメインで正しく置換された。
前置産物は、ブタＡ２ドメインのＰＣＲ増幅の結果としてＡ１‐Ａ２接合に不要
のチミンを含有した。この単独塩基を、変異原性オリゴヌクレオチド、５′ＣＣ
ＴＴＴＡＴＣＣＡＡＡＴＡＣＧＴＡＧＣＧＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧ３′（配列
番号:10）を用いてループアウトした。得られたハイブリッドヌクレオチド配列
は、ヒトＡ１、ブタＡ２、ならびにヒトＡ３、Ｃ１，およびＣ２ドメインを有す
る活性なVIII因子をコード化した。
【０１７１】 ヒトVIII因子を含有するpBlueScriptプラスミドとヒト／ブタＡ２VIII因子ｃ
ＤＮＡの間でSpeI／BamHI断片を交換することにより、ＢドメインのないｃＤＮ
Ａの相同ヒト配列を、推定のＡ２エピトープを包含するブタのＮＨ2末端Ａ２ド
メインの63%を含有する領域で置換した。配列は、Ａ２ドメインおよびスプライ
ス部位を配列決定することによって確かめられた。最後に、ＨＢ-中の対応する
配列の代わりに全Ａ２配列を含有するSpeI／ApaI断片で置換し、ＨＰ２構築物を
産出した。
【０１７２】 ＤＥＡＥ−デキストランが仲介するＤＮＡ移入後、「Current Protocols in M
olecular Biology」（Ausubel, F.M.等編）中のSeldon, R.F.の記述、pp.9.21-9
.26, Wiley Interscience, N.Y. に従って、ＣＯＳ−７細胞中のＨＢ-およびＨ
Ｐ２の予備的発現を試験した。活性なVIII因子の発現を確認し、予備的な抗体阻
害調査を行った後、次いでリポソームが仲介する移入（Lipofectin Life Techno
logies, Inc., Gaithersburg, MD）を用いてＨＢ-およびＨＰ２のＤＮＡを生ま
れたばかりのハムスターの腎臓細胞中にしっかりと移入した。プラスミド含有ク
ローンを、ダルベッコの修正イーグル培地−Ｆ１２、すなわちＧ４１８を400μg
/ml含有する10%ウシ胎児血清（DMEM-F12／10%ウシ胎児血清）中の耐Ｇ４１８性
に関して選択し、続いてＧ４１８を100μg/ml含有するDMEM-F12／10%ウシ胎児血
清中で保持した。ＨＢ-およびＨＰ２VIII因子活性の最大の発現を示すコロニー
をリングクローニングによって選択し、さらに特徴を調べるために増やした。
【０１７３】 血漿を含まないVIII因子検定、一段階血餅形成検定、および酵素免疫吸着測定
により、ＨＢ-およびＨＰ２VIII因子の発現を基準として精製した組換えヒトVII
I因子を用いて比較した。ＨＢ-およびＨＰ２に対してそれぞれ2600および2580単
位／mgの特異的凝固剤活性が得られた。ＨＢ-およびＨＰ２は、それぞれ細胞107 個当たり、４８時間当たり1.2および1.4単位／mlを産生した。これは野生型構築
物のもの（2600±200単位／mg）と同じである。ＨＢ-およびＨＰ２の特異活性は
、血漿を含まないVIII因子検定においては見分けがつかなかった。
【０１７４】 Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１、および／またはＣ２ドメイン置換による組換えハイ
ブリッドヒト／動物およびこれと同等のVIII因子の生物学的活性は、ＣＯＳ細胞
哺乳類の一過性発現系の使用により最初に評価することができる。ハイブリッド
ヒト／動物およびこれと同等のｃＤＮＡはＣＯＳ細胞中に移入することができ、
上清は上述のように一段階および二段階凝固検定を使用することによりVIII因子
活性を分析することができる。加えてVIII因子活性は、より高感度であり、より
多数の試料の分析を可能にする色素産生基質検定法を使用することによって測定
することもできる。類似の検定法がVIII因子活性の検定において標準になってい
る（Wood等の論文Nature 312:330−337 (1984)、Toole等の論文Nature 312:342
−347 (1984)）。ＣＯＳ細胞中の組換えVIII因子の発現もまた標準手順である（
Toole等の論文Nature 312:342−347 (1984)、Pittman等の論文Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 85:2429−2433 (1988)）。
【０１７５】 本明細書に記載した組換え分子用の出発材料として用いられるヒトVIII因子ｃ
ＤＮＡを、生物学的活性を有する産物を生み出すＣＯＳ細胞中で発現させた。上
述のようにこの材料は、ハイブリッドヒト／動物のVIII因子分子を比較するため
に基準として用いることができる。検定における活性は、ハイブリッド分子の適
切な比較のための特定の活性に変換される。このためには細胞によって産生され
たVIII因子の質量の測定が必要であり、これは基準として精製したヒトおよび／
または動物のVIII因子による免疫検定によって行なうことができる。VIII因子に
対する免疫検定は、当業者にとっては定型化されている（例えば、Lollar等の論
文Blood 71:137−143 (1988) を参照されたい）。
【０１７６】 実施例８：ハイブリッドヒト／動物およびこれと同等のVIII因子における阻害
活性の決定 多分エピトープとして（すなわち、VIII因子と反応する阻害抗体の認識部位と
して）関わっているヒトおよび動物のVIII因子の配列は、定型化された手順を用
いて、例えば下記に示したようにオーバーラップ拡張によるスプライシング法（
ＳＯＥ）などの部位特異的変異誘発技術と組み合わせて、VIII因子に対する抗体
による検定の使用を通して決定することができる。対応する抗原性のヒトVIII因
子配列と比較して抗原性でない動物の配列を同定することができ、標準の組換え
ＤＮＡ法に従って置換を行なって動物配列を挿入し、ヒト配列を欠失させること
ができる。VIII因子に対して何も既知の配列アイデンティティーを持たないアラ
ニン残基などのアミノ酸の配列もまた、標準の組換えＤＮＡ法により、またはア
ラニン走査変異誘発により置換することができる。ブタのVIII因子は幾つかの阻
害抗体と反応するがヒトのVIII因子より反応性は低く、これはインヒビターによ
る患者の最新治療に対して基盤を与える。組換えハイブリッド形成を行なった後
、それらをBethesdaのインヒビター検定法を含む定型化された検定法によりイン
ビトロで反応性を試験することができる。天然のヒトVIII因子および天然の動物
VIII因子よりも反応性の低いこれら構築物は、置換治療の候補である。
【０１７７】 ヒトのVIII因子と反応する全部ではないとしても大部分の阻害抗体が向けられ
るエピトープは、アミノ酸2332個のヒトVIII因子分子中の２つの領域、すなわち
Ａ２ドメイン（アミノ酸残基373〜740番）およびＣ２ドメイン（アミノ酸残基21
73〜2332番、両配列とも配列番号:2中に示される）に存在すると考えられる。Ａ
２エピトープは、ヒトＡ２ドメインの一部が置換されたヒトアミノ酸配列に対す
る配列アイデンティティーを有するブタ配列によって置換される組換えハイブリ
ッドヒト−ブタVIII因子分子を作成することによって削除された。これは、実施
例７に記載したように標準の分子生物学の技術によりブタＡ２ドメインをクロー
ン化し、次いで制限部位を用いてＡ２ドメイン内でカッティングおよびスプライ
シングを行なうことによって達成された。ＨＰ２と呼ばれる得られた構築物にお
いて、ブタVIII因子の残基373〜604番（配列番号:4）は置換されてヒトＡ２ドメ
イン中に入る。ＨＰ２は、下記の方法を用いて抗ヒトVIII因子抗体との免疫活性
が検定された。
【０１７８】 VIII因子の酵素免疫吸着検定法 ミクロタイタープレートウェルを、ＥＳＨ４すなわちヒトVIII因子Ｌ鎖抗体6
μg/mlの0.15mlで被覆し、一夜インキュベートした。プレートをＨ2Ｏで３回洗
浄した後、ウェルを0.15M NaCl、10mMリン酸ナトリウム、0.05% Tween 20、0.05
% 脱脂粉乳、および0.05%アジ化ナトリウム（pH7.4）で１時間遮断した。感度を
上げるためにVIII因子を含有する試料を、30nMトロンビンで１５分間活性化させ
た。次いでトロンビンを阻害するために組換えデスルファトヒルジンを100nMで
加えた。プレートを再度洗浄し、試料または基準として用いる純粋な組換えヒト
VIII因子（10〜600ng/ml）0.1mlを加えた。２時間インキュベートした後、プレ
ートを洗浄し、ビオチニル化したＥＳＨ８、すなわち別のVIII因子Ｌ鎖抗体0.1m
lを各ウェルに加えた。ＥＳＨ８は、Pierceのヘキサン酸スルホスクシンイミジ
ル−６−（ビオチンアミド）のビオチン化キットを用いてビオチン化した。１時
間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ストレパビジンアルカリ性ホスフ
ァターゼ0.1mlを各ウェルに加えた。プレートをBio-Radのアルカリ性ホスファタ
ーゼ基質試薬キットを用いて現像させ、各ウェルに対して405nmで得られる吸光
度をＶｍａｘミクロタイタープレートリーダー（Molecular Devices, Inc., Sun
nyville, CA）を用いて決定した。未知のVIII因子濃度は、VIII因子標準曲線の
直線部分から決定した。
【０１７９】 VIII因子検定 ＨＢ-およびＨＰ２VIII因子を一段階血餅形成検定法で測定した。これは上記
の記述（Bowie, E.J.W.およびC.A.Owenの「Disorders of Hemostasis 」 (Ramof
fおよびFobes編) 中の記述、pp.43−72, Grunn & Stratton, Inc., Orlando,FL
(1984)）、または下記のように血漿を含まない検定により行なった。ＨＢ-また
はＨＰ２のVIII因子を、0.15M NaCl、20nM Hepes、5mM CaCl2、および0.01% Twe
en 80（pH7.4）中で、10nM IXa因子、425nM X因子、および50μM単層ホスファチ
ジルセリン／ホスファチジルコリン（25/75、w/w）の小胞の存在下で、40nMトロ
ンビンによって活性化した。５分後、0.05M EDTAおよび100nM組換えデスルファ
トヒルジンにより反応を停止し、得られたXa因子をHill-Eubanksの論文J. Biol.
Chem. 265:17854−17858 (1990) の方法に従って色素産生基質検定法により測
定した。これらの条件下において、形成されるXa因子の量は、基準として精製し
た組換えヒトVIII因子（Baxter Biotech, Deerfield, IL）を用いることによっ
て判定されるように、出発VIII因子の濃度に直線的に比例した。
【０１８０】 血餅形成検定に先立ってＨＢ-およびＨＰ２のVIII因子を、ヘパリン−Sepharo
se（商標）クロマトグラフィにより、４８時間順化培地から10〜15単位／mlまで
濃縮した。ＨＢ-およびＨＰ２のVIII因子を、血友病Ａの血漿（George King Bio
medical）に最終濃度1単位／mlになるまで加えた。ＲＣまたはＭＲ血漿あるいは
ｍＡｂの原液413IgG (4μM) 中のインヒビターの力価を、Kasper, C.K.等の論文
Thromb. Diath. Haemorrh. 34:869−872 (1975) の記述に従ってBethesdaの検定
法によって測定した。インヒビターIgGは、Leyte, A. 等の論文J. Biol. Chem. 266 :740−746 (1991) の記述に従って調製した。
【０１８１】 ＨＰ２は抗Ａ２抗体と反応しない。したがって残基373〜603番は、抗Ａ２抗体
に対するエピトープを含有しなければならない。
【０１８２】 ハイブリッドヒト−ブタVIII因子の調製およびオーバーラップ拡張によるスプ ライシングによる検定（ＳＯＥ） Ａ２エピトープをさらにしぼり込むために、ヒトＡ２領域にブタのアミノ酸置
換を有するさらに幾つかのプロ凝固性組換えハイブリッドヒト／ブタVIII B因子
ドメインを持たない分子を調製した。制限部位技術に加えて、Ho等の論文Gene 7 7 :51−59 (1989) に記載の「オーバーラップ拡張によるスプライシング」法（Ｓ
ＯＥ）を用いてブタVIII因子ｃＤＮＡのいずれか任意の領域を置換した。ＳＯＥ
においてはスプライス部位は、所望のｃＤＮＡを産生するようにＰＣＲによって
増幅することができるオリゴヌクレオチドをオーバーラップさせることによって
画定される。通称ＨＰ４からＨＰ１３までの１０種類のｃＤＮＡを作成した。そ
れらをＲｅＮｅｏ発現ベクター中に挿入し、生まれたばかりのハムスターの腎臓
細胞中にしっかり移入し、実施例７に記載のように高レベル（２４時間当たり、
細胞107個当たり0.5〜1μg（約3〜6単位））まで発現させた。VIII因子凝固剤活
性を、Ａ２ドメインすなわちｍＡｂ４１３に対して特異的なモデルマウスのモノ
クローナル阻害抗体の存在および不在下で決定した。インヒビターの不在下で全
ての構築物は、B（‐）ヒトVIII因子と見分けがつかない特異な凝固剤活性を有
していた。
【０１８３】 ハイブリッドヒト／ブタVIII因子構築物を、Bethesdaの検定法を用いて抗Ａ２
インヒビターｍＡｂ４１３との反応性を検定した（Kasper, C.K.等の論文Thromb
. Diath. Haemorrh. 34:869−872 (1975)）。Bethesda単位（BU）は、インヒビ
ターの力価を測定するための標準的な方法である。結果を表Vに示し、組換えヒ
トVIII因子と比較する。 ──────────────────────────────────── 表V アミノ酸を置換したハイブリッドヒト／ブタVIII因子の免疫反応性の比較 構築物 ブタによる置換 阻害、mAb413（BU/mg IgG） ヒトＢ（‐）fVIII なし 1470 ＨＰ４ 373−540 ＜0.7 ＨＰ５ 373−508 ＜0.7 ＨＰ６ 373−444 1450 ＨＰ７ 445−508 ＜0.7 ＨＰ８ 373−483 1250 ＨＰ９ 484−508 ＜0.7 ＨＰ10 373−403 1170 ＨＰ11 404−508 ＜0.7 ＨＰ12 489−508 ＜0.7 ＨＰ13 484−488 ＜0.7 ──────────────────────────────────── ブタの置換の境界は、挿入のＮＨ2−末端及びＣ−末端におけるヒトとブタの
ＶＩＩＩ因子の間で異なる最初のアミノ酸によって定められる。表Ｖに示されて
いるように、ベセスダ価が測定できない場合（＜0.7 BU/mg IgG）、Ａ２エピト
ープは置換されたブタ配列の領域にある。エピトープは、ｍＡｂ４１３とＨＰ９
との非反応性に見られるように、わずか２５の残基から成る残基４８４〜５０９
（配列番号２）まで漸次狭められた。構築体ＨＰ４〜ＨＰ１１までのうちで、Ｈ
Ｐ９が阻害因子と反応しなかった最も「ヒト化」された構築体であった。これは
、Ａ２エピトープの重要な領域が配列Ａｒｇ４８４〜Ｉｌｅ５０８の内部にある
ことを示している。
【０１８４】 この重要な領域におけるヒトとブタＶＩＩＩ因子の間のアミノ酸配列の比較に
基づいて、さらに二つの構築体、ＨＰ１２とＨＰ１３、が作られた。そこでは、
それぞれ、ヒトのアミノ酸配列４８９〜５０８及び４８４〜４８８に対して対応
するブタのアミノ酸配列が置換された。どちらもｍＡｂ４１３と反応しなかった
。このことは、Ａｒｇ４８４〜Ｓｅｒ４８９結合のそれぞれの側の残基がＡ２阻
害因子との反応に重要であるということを示している。ＨＰ１２では、わずか５
残基だけが非ヒト残基であり、ＨＰ１３では、わずか４残基だけが非ヒト残基で
ある。４８４〜５０８、４８４〜４８８及び４８９〜５０８がブタで置換された
ハイブリッドは、４人の患者血漿からのＡ２阻害因子による阻害の減少を示し、
Ａ２エピトープの構造には阻害因子ポピュレーション応答による変化はほとんど
ないことを示唆した。
【０１８５】 阻害因子血漿から調製された二つの抗Ａ２ＩｇＧ５試料と、最もヒト化された
構築体、ＨＰ９、ＨＰ１２及びＨＰ１３の反応性が測定された。ｍＡｂ４１３と
同様に、これらの抗体もＨＰ９、ＨＰ１２及びＨＰ１３と反応しなかったが、対
照の構築体、ＨＰ（−）及びＨＰ８とは反応した。
【０１８６】 決定的なＡ２エピトープを最終的に同定するために４８４〜５０８の間の領域
を同じ手順を用いてさらに分析することができる。
【０１８７】 実施例７及び８で記述した方法を用いて、ヒトＡ２又はその他のドメインでア
ミノ酸置換された他のハイブリッドヒト／非ブタ哺乳類ＶＩＩＩ因子、何らかの
ドメインでアミノ酸置換されたハイブリッドヒト／動物又は動物／動物ＶＩＩＩ
因子、又はハイブリッドVII因子等価分子又はそれらの断片、例えば抗ＶＩＩＩ
因子抗体に対する免疫反応性が弱い又は無いハイブリッドＶＩＩＩ因子など、を
調製することができる。
【０１８８】 実施例９． 部位指向的突然変異誘発によるヒトＶＩＩＩ因子Ａ２阻
害因子反応性の除去 実施例８は、残基４８４及び５０８を境界とするブタの配列をヒトのＶＩＩＩ
因子Ａ２ドメインに挿入することによってＡ２特異的なＶＩＩＩ因子阻害因子の
パネルに対して反応性が顕著に低下した分子が得られることを示した［Healey e
t al., (1995) J. Biol. Chem. 270:14505-14509 も参照］。 この領域では、ヒ
トとブタのＶＩＩＩ因子の間に９つのアミノ酸の差異がある。ヒトＢ−ドメイン
欠如ＶＩＩＩ因子におけるこれら９つの残基、Ｒ４８４、Ｐ４８５、Ｙ４８７、
Ｐ４８８、Ｒ４８９、Ｐ４９２、Ｖ４９５、Ｆ５０１及びＩ５０８（一文字のア
ミノ酸コードを用いる）が、部位指向的突然変異誘発によって個別にアラニンに
変えられた。さらに、クローニングを容易にするために、Ａ２エピトープに対す
る５’及び３’部位でＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡにＭｌｕ１及びＳａｃ２制限部位が
それらの部位に対応するアミノ酸を変えることなく設けられた。９つの変異体は
ベビーハムスター腎細胞に安定に移植され、高いレベルで発現された。９つの細
胞が全て生物的に活性なＶＩＩＩ因子を産生した。それらは部分的に精製され、
Healey et al. が記述しているようにヘパリン−Sepharoseクロマトグラフィー
によって濃縮された。
【０１８９】 変異体の特性が、実施例７におけると同様に、マウスのモノクローナル阻害因
子ＭＡｂ４１３との反応性によって調べられた。この阻害因子は、これまで調べ
られた全てのヒト阻害因子と同じ又は非常に近いクラスターのＡ２ドメインのエ
ピトープを認識する。阻害因子の反応性はベセスダ分析法を用いて測定された。
簡単に言うと、ある阻害因子のベセスダ価とは、標準的な一段階ＶＩＩＩ因子凝
固分析においてＶＩＩＩ因子を５０％阻害するような阻害因子の希釈度である。
例えば、抗体の溶液を１／４２０に希釈して、それが組み換えＶＩＩＩ因子テス
ト・サンプルを５０％阻害した場合、ベセスダ価は４２０Ｕになる。ＭＡｂ４１
３のように純粋なモノクローナルの場合、抗体の質量は知られているので、結果
はＭＡｂ４１３のｍｇ当たりのベセスダ価（ＢＵ）で表される。５０％阻害点を
見出すために、一連のＭＡｂ４１３希釈溶液が作成され、５０％阻害点は曲線適
合手順によって見出された。結果は次の通りである： *表VI 変異 ＭＡｂ４１３価（ＢＵ／ｍｇ） 反応性％ * 野生型、Ｂ（−）ｆVIII ９４００ −− Ｒ４８４→Ａ １６０ １．７ Ｐ４８５→Ａ ４０００ ４２ Ｙ４８７→Ａ ５０ ０．５３ Ｓ４８８→Ａ ３５００ ３７ Ｒ４８９→Ａ １．６ ０．０１５ Ｒ４９０→Ａ −− 〈０．５〉 Ｐ４９２→Ａ ６３０ ６．７ Ｖ４９５→Ａ １０７００ １１３ Ｆ５０１→Ａ １１９００ １２６ Ｉ５０８→Ａ ５６２０ ６０ *野生型に対して これらの結果は、モデルＡ２阻害因子に対するＶＩＩＩ因子の抗原性を、位置
４８４、４８７、４８９及び４９２でアラニン置換を行うことによって因子１０
以上減少させることが可能であるということを示している。反応性はＲ４８９→
Ａでほとんど４けたも減少する。これらのアラニン置換体はいずれもＶＩＩＩ因
子の抗原性及び免疫抗原性を低下させるために治療的に役に立つ可能性がある。
【０１９０】 この結果はアラニン走査性突然変異誘発の有効性を裏付け、さらに阻害的な抗
体に反応するエピトープ内でアミノ酸配列が変化しても生物的活性が保たれるこ
とを示している。ヒトとブタの配列が異なっている９つの部位のうち、５つはま
た、ヒトとマウスの配列が異なっている部位でもある。したがって、これらの位
置でアラニン置換されたＶＩＩＩ因子は、現在知られている哺乳類のＶＩＩＩ因
子で同定される配列が何も知られていない配列を有するハイブリッドＶＩＩＩ因
子等価分子の例である。
【０１９１】 これ以上の修飾、例えば二つのアラニン置換を組み合わせることによる修飾、
によってより広範な患者に対して抗原性を大きく減少させることができる。患者
によって異なるポリクローナル変異抗体がＶＩＩＩ因子Ａ２エピトープの変異体
と反応する可能性があるからである。さらに、免疫抗原性（抗体を誘発する能力
）は、一つより多くのアミノ酸置換を組み込むことによってさらに減少する。そ
のような置換は、アラニン、ブタ特異的なアミノ酸、又は免疫抗原性が低いこと
が知られている他のアミノ酸も含む。位置４９０、４９５及び５０１における置
換は免疫抗原性を低下させるのに役立つと思われる。さらに、これらの置換は、
ある種の患者抗体に対する反応性を低下させそうである。
【０１９２】 アラニンの他に、抗原性を低下させる別のアミノ酸置換が可能であるが、抗原
−抗体結合エネルギーへの主要な寄与因子とされているもの、又はかさばった側
鎖又は荷電を有する側鎖をもつものを避けるように注意を払うことが必要である
。あるエピトープ内での置換がその抗原的な反応性を減少させるアミノ酸は、本
明細書において「免疫反応性を減少させる」アミノ酸と呼ばれる。アラニン以外
に、免疫反応性を減少させる他のアミノ酸としては、限定するものではないが、
メチオニン、ロイシン、セリン、及びグリシンなどがある。あるアミノ酸で達成
できる免疫反応性の減少は、また、置換がタンパク質のコンフォーメーション、
エピトープのアクセスし易さなどに及ぼす影響にも依存することは理解されるで
あろう。
【０１９３】 ヒトとブタの配列の間で異なっている部位以外のＡ２エピトープ（アミノ酸４
８４〜５０８）内部の他の部位におけるアミノ酸置換によって、さらに、阻害的
な抗体に対する反応性を減少させることができる。アラニン走査性突然変異誘発
を用いてＡ２エピトープ内のどんなアミノ酸に対してもアラニン置換体を得るこ
とができる。こうして得られた各修飾ＶＩＩＩ因子のプロ凝固活性及び阻害的な
抗体によるその活性の阻害を分析することができる。アラニン以外の免疫反応性
を減少させる他のアミノ酸を置換することによって、得られる修飾ＶＩＩＩ因子
の抗原性を減少させることができる。アミノ酸代替を単一のＶＩＩＩ因子分子で
組み合わせてそのような置換によって所望の性質が最も大きく得られるようにす
ることができる。
【０１９４】 抗体−ＶＩＩＩ因子相互作用の結合エネルギーに最も大きく寄与するアミノ酸
の置換が最も好ましい。それは、例えば位置４９３、４９６、４９９、５００、
５０２、５０３、５０５及び５０７のいずれかにおける免疫反応性を減少させる
アミノ酸の置換である。位置４８４、４８５、４９９、４９０、４９２、５０１
及び５０８におけるこのタイプの置き換えに関するデータは、この置換によって
プロ凝固活性は保たれ、阻害的な抗体による阻害され易さは減少するということ
を示している。（表VI）ヒスチジン置換が天然の配列で見られる。例えば、位置
５０４でマウスＶＩＩＩ因子のヒスチジンが、ブタとヒトのＶＩＩＩ因子の両方
ではロイシンによって置き換えられている。ブタとマウスのＶＩＩＩ因子は両方
共位置４８７にヒスチジンを有するが、ヒトではそこがチロシンになっている。
位置４８７でチロシンをアラニンに置き換えると、プロ凝固活性があって抗原性
が実質的に減少したものが得られる（表VI）。アナロジーによって、位置４９７
でヒスチジンを免疫反応性を減少させるアミノ酸で置換しても、プロ凝固活性を
保ちながら阻害的な抗体による阻害を減少させることができる。免疫反応性を減
少させるアミノ酸は、また、位置４８６、４８８、４９１、４９４、４９８、５
０４及び５０６に置換することができる。これらの位置に現在あるアミノ酸は抗
体の結合にあまり寄与しそうには思われないが、これらの部位に免疫反応性を減
少させるアミノ酸を置換すると、例えばＳ４８８Ａ、プロ凝固活性の抗体による
阻害の減少に寄与するということが示された（表VI）。
【０１９５】 Ａ２エピトープ内でのヒト、ブタ、マウス（図１Ａ〜１Ｈ）及びイヌ（Camero
n, C. et al., (1998) Thromb. Haemost. 79:317-322）の配列の比較から、この
領域が相当な量の配列の変動を許容するということが明らかである。４つの種全
部で保存されている遺伝子座は１２しかない。それらはどれもプロ凝固活性にと
って不可欠のものとは考えられない。実際、位置４９０で保存されているアルギ
ニンをアラニンで置換した結果は、阻害因子の抗体に対する反応性が低下した活
性の修飾ＶＩＩＩ因子である（Ｒ４９０→Ａ、表VI）。1以上のアミノ酸置換を
行っても、プロ凝固活性に実質的に影響しない。例えば、抗体の結合に関わる二
つのアミノ酸を置換すると、どちらか一つだけのときに比べて抗体による阻害を
大きく減少させることができる。また、多数の置換は、単一アミノ酸の置換に比
べてより広範な患者抗体に対して、得られた修飾ＶＩＩＩ因子の反応性を減少さ
せることができる。
【０１９６】 個々のアミノ酸置換を、抗原性の減少という性質ならびにＶＩＩＩ因子の他の
機能的属性に関して評価することができる。個々のアミノ酸置換によって得られ
る性質を評価することによって、アミノ酸４８４〜５０８の領域に関する限り最
適な性質を有する修飾ＶＩＩＩ因子を得るために望ましい二つ以上のアミノ酸置
換の組み合わせを同定することができる。
【０１９７】 部位指向的突然変異誘発を用いてアミノ酸４８４〜５０８をコードする領域に
おけるＶＩＩＩ因子ＤＮＡを修飾し、所望のアミノ酸置換を有する修飾されたＶ
ＩＩＩ因子をコードする塩基配列を得ることができる。ヒトのＶＩＩＩ因子ＤＮ
Ａ塩基配列の適当な部位で、既存のアミノ酸をコードするトリプレットを部位指
向的突然変異誘発によって変えて所望のアミノ酸をコードすることができる。所
望のアミノ酸をコードするトリプレットは、遺伝コードによって定められている
既知のトリプレットのどれであってもよい。単一のアミノ酸置換をコードするた
めに天然の配列を変更することは、しばしば一つの塩基変化によって、場合によ
ってはもっと多くの、最大で３つの塩基変化によって、遂行できる。部位指向的
突然変異誘発を用いることによって、既存のコーディングを所望のアミノ酸置換
をコードするために必要なものに変えるように全ての必要な塩基置換を直ちに実
行することができる。特定のアミノ酸置換に導く塩基変化のいくつかの例を下に
示す。これらは例示的なものであって、全部を尽くすものではない： Ｒ４８４→Ｇ ＣＧＴ→ ＧＧＴ Ｐ４８５→Ａ ＣＣＴ→ ＧＣＴ Ｌ４８６→Ｓ ＴＴＧ→ ＴＣＧ Ｙ４８７→Ｌ ＴＡＴ→ ＣＴＴ Ｓ４８８→Ｌ ＴＣＡ→ ＴＴＡ Ｒ４８９→Ｓ ＡＧＧ→ ＡＧＴ Ｒ４９０→Ｇ ＡＧＡ→ ＧＧＡ Ｌ４９１→Ｓ ＴＴＡ→ ＴＣＡ Ｐ４９２→Ｌ ＣＣＡ→ ＣＴＡ Ｋ４９３→Ａ ＡＡＡ→ ＧＣＡ Ｇ４９４→Ｓ ＧＧＴ→ ＡＧＴ Ｖ４９５→Ａ ＧＴＡ→ ＧＣＡ Ｋ４９６→Ｍ ＡＡＡ→ ＡＴＧ Ｈ４９７→Ｌ ＣＡＴ→ ＣＴＴ Ｌ４９８→Ｓ ＴＴＧ→ ＴＣＧ Ｋ４９９→Ｍ ＡＡＧ→ ＡＴＧ Ｄ５００→Ａ ＧＡＴ→ ＧＣＴ Ｆ５０１→Ｓ ＴＴＴ→ ＴＣＴ Ｐ５０２→Ｌ ＣＣＡ→ ＣＴＡ Ｉ５０３→Ｍ ＡＴＴ→ ＡＴＧ Ｌ５０４→Ｍ ＣＴＧ→ ＡＴＧ Ｐ５０５→Ａ ＣＣＡ→ ＧＣＡ Ｇ５０６→Ａ ＧＧＡ→ ＧＣＡ Ｅ５０７→Ｇ ＧＡＡ→ ＧＧＡ Ｉ５０８→Ｍ ＡＴＡ→ ＡＴＧ 前記の例は、多くの免疫反応性を減少させるアミノ酸の置換が単一のヌクレオ
チドの変更によって遂行できることを示している。所望する他の置換も同様な仕
方で、遺伝コードを参照して意図するアミノ酸置換体をコードするヌクレオチド
・トリプレットを選択し、部位指向的突然変異誘発によって必要なヌクレオチド
の変更を導入して意図するトリプレットを生成するという仕方で遂行できる。多
重に置換された修飾ＶＩＩＩ因子は、上述のようなヌクレオチド変更の単純な組
み合わせによって作ることができる。例えば、Ｒ４８９→Ａ及びＰ４９２→Ｌの
ようにＡ２ドメインの二つのアミノ酸が置換された修飾ＶＩＩＩ因子は、該当す
る部位にＡＧＧ→ＧＣＧ及びＣＣＡ→ＣＴＡという３つのヌクレオチドの変更を
導入することによって作ることができる。所望する他の変更又は変更の組み合わ
せも、本質的には上で述べたようにして設計して実行することができる。上述の
部位指向的突然変異誘発によって得られる修飾ＶＩＩＩ因子のＤＮＡの塩基配列
は、天然のヒトの塩基配列又は本明細書の他のところで述べる別の仕方で修飾さ
れた塩基配列とは、定められた部位で定められたヌクレオチド置換（単数又は複
数）を有するという点だけが異なっている。プロ凝固活性が前述のように（実施
例１及び８）１段階又は２段階分析によって分析される。阻害価の測定は、上述
のKasper, C. K. et al., 前出、実施例８によるベセスダ分析である。
【０１９８】 実施例１０ Klenow 断片、リン酸化Ｃｌａ１リンカー、Ｎｏｔ１リンカー、Ｔ４リガーゼ
、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼはPromega (Madison, Wisconsin)から購入した
。ポリヌクレオチド・キナーゼはLife Technologies, Inc., Gaithersburg, Mar
yland から購入した。γ32Ｐ−ＡＴＰ（Redivue, ＞5000 Ci/mmol）はAmersham
から購入した。pBluescript II KS-及びE. coli Epicurean XL1 Blue 細胞はStr
atagene (La Jolla, California)から購入した。合成オリゴヌクレオチドはLife
Technologies Inc.又はCruachem, Inc. から購入した。クローニングのために
ＰＣＲ産物を生成するときは、５’リン酸化プライマーを用いた。ブタＶＩＩＩ
因子ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のための
プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド（ｎｔ）番号づ
けにはヒトＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡを基準として用いる（Wood et al., (1984) 前
出）。
【０１９９】 ブタ脾臓全ＲＮＡが、酸グアニジューム・チオシアネート−フェノール−クロ
ロフォルム抽出法によって単離された［Chomczynski et al., (1987) Anal. Bio
chem. 162: 156-159］。全脾臓ＲＮＡからブタのｃＤＮＡが、別に断らない限り
、Moloney マウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＲＴ）及び反応を開始させるため
にランダム・ヘキサマーを用いて調製された（First-Strand cDNA 合成キット、
Pharmacia Biotech）。ＲＴ反応は４５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．３，６
８ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＤＴＴ、９ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０８ｍｇ／ｍｌ
のウシ血清アルブミン及び１．８ｍＭ デオキシヌクレオチド・トリフォスフェ
ート（ｄＮＴＰ）を含んでいた。ブタのゲノムＤＮＡが脾臓から、標準的な手順
（Strauss, W. M. (1995) 分子生物学における現行のプロトコル、F.M. Ausubel
et al. 編、John Wiley & Sons, pp. 2.2.1-2.2.3）を用いて単離された。アガ
ロース・ゲルからのＤＮＡの単離はGeneclean II（Bio 101）又はQuiex II ゲル
抽出キット（qiagen）を用いて行われた。
【０２００】 ＰＣＲ反応は、Hybaid OmmGene サーモサイクラーを用いて行われた。Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応では、反応物には０．６ｍＭ ＭｇＣｌ 2 、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭ オリゴヌクレオチド・プライマー、５
０Ｕ／ｍｌポリメラーゼ及び０．１体積の第一ストランドｃＤＮＡ反応ミックス
が含まれていた。別に断らない限り、ＰＣＲ産物はゲル精製され、Klenow 断片
によってブラント末端化し、エタノールで沈澱させ、脱リン酸化pBluescript II
KS- のEcoRV部位に結紮するか又はＴ４リガーゼを用いてリン酸化ＣｌａＩリン
カーに結合し、ＣｌａＩによって消化し、Sephacryl S400 クロマトグラフィー
によって精製し、ＣｌａＩカット脱リン酸化pBluescript II KS- に結合した。
別に断らない限り、結合はＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて行われた（Rapid DNA li
gation Kit, Boehringer Mannheim）。インサートを含むpBluescript II KS-プ
ラスミドを用いてE. coli Epicurean XL1-Blue 細胞を形質転換した。
【０２０１】 プラスミドＤＮＡの塩基配列決定は、Applied Biosystems 373a 自動ＤＮＡシ
ーケンサー及びＰＲＩＳＭダイ・ターミネーター・キットを用いて、又はSequen
ase v. 2.0 シーケンシング・キット（Amersham Corporation）を用いて手動で
行った。ＰＣＲ産物の直接塩基配列決定は、オリゴヌクレオチドの32Ｐ-末端の
ラベリングを含めて、サイクル塩基配列プロトコルを用いて行われた（ｄｓＤＮ
Ａサイクル・シーケンシング・システム、Life Technologies）。
【０２０２】 ５’ＵＴＲシーケンス、シグナルペプチド、及びＡ１ドメイン・コドンを含 むブタＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡクローンの単離 Ａ２ドメインへのブタＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ５’は、雌ブタ脾臓全ＲＮＡのネ
スティッド（nested）ＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（５’−
ＲＡＣＥ）プロトコルを用いて増幅された（Marathon ｃＤＮＡ増幅、Clontech,
Version PR55453）。これは、ロックドッキング・オリゴ（ｄＴ）プライマーを
用いる第一ストランドｃＤＮＡ合成［Borson, N.D. et al., (1992) PCR Method
s Appl. 2: 144-148］、E. coli ＤＮＡポリメラーゼＩを用いる第二ストランド
ｃＤＮＡ合成、及び５’拡張二本鎖アダプター、配列番号１３ ５’−ＣＴＡ
ＡＴＡ ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＣＴ ＡＴＡ ＧＧＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＧＧ
ＣＣＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴ−３ ３’−Ｈ2Ｎ−ＣＣＣＧＴＣＣＡ−ＰＯ4−５’ による結合が含まれ、この短い鎖は非特異的なＰＣＲプライミングを減らすため
にアミノ基で３’末端がブロックされており、それは３’末端の８つのヌクレオ
チドと相補的であった（Siebert, P. D., et al., (1995) Nucleic. Acids. Res
. 23: 1087-1088）。ＰＣＲの第一ラウンドは、アダプター特異的なオリゴヌク
レオチド、配列番号１４ ５’−ＣＣＡ ＴＣＣ ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ Ｔ
ＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＣ−３’（ＡＰ１と呼ばれる）をセンス・プライマ
ーとして用い、ブタＶＩＩＩ因子Ａ２ドメイン特異的オリゴヌクレオチド、配列
番号１５ ５’−ＣＣＡ ＴＴＧ ＡＣＡ ＴＧＡ ＡＧＡ ＣＣＧ ＴＴＴ
ＣＴＣ−３’（ｎｔ２０８１〜２１０４）をアンチセンス・プライマーとして用
いて行われた。ＰＣＲの第二ラウンドは、ネスティッド（nested）、アダプター
特異的なオリゴヌクレオチド、配列番号１６ ５’−ＡＣＴ ＣＡＣ ＴＡＴ
ＡＧＧ ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＣＧ ＧＣ−３’（ＡＰ２と呼ばれる）をセンス・
プライマーとして用い、ネスティッド（nested）、ブタＡ２ドメイン特異的オリ
ゴヌクレオチド、配列番号１７ ５’−ＧＧＧ ＴＧＣ ＡＡＡ ＧＣＧ ＣＴ
Ｇ ＡＣＡ ＴＣＡ ＧＴＧ−３’（ｎｔ１４９７〜１５２０）をアンチセンス
・プライマーとして用いて行われた。ＰＣＲは, 抗体で媒介されるホット・スタ
ート手順を採用した市販のキット（Advantage ｃＤＮＡ ＰＣＲ core kit ）を
用いて行われた［Kellog, D. E. et al., (1994) BioTechniques 16: 1134-1137
］。ＰＣＲ条件は、９４℃で６０秒間の変性、続いて３０サイクル（第一のＰＣ
Ｒ）又は２５サイクル（第二のＰＣＲ）の９４℃での３０秒間の変性、３０秒間
６０℃でのアニーリング、そしてチューブ温度を制御して４分間６８℃での伸長
であった。この手順で、プロミネント（prominent）＝１．６ｋｂの産物が得ら
れたが、これは、５’ＵＴＲへ１５０ｂｐ延びている断片の増幅と矛盾しない。
ＰＣＲ産物は、ＣｌａＩリンカーを用いてpBluescript にクローニングされた。
４つのクローンのインサートが両方向で配列決定された。
【０２０３】 これらのクローンの配列には、１３７ｂｐの５’ＵＴＲ、シグナルペプチド、
Ａ１ドメイン及びＡ２ドメインの一部が含まれていた。４部位の少なくとも３つ
で一致に達していた。しかし、クローンは平均して４つのＰＣＲで発生したと見
られる突然変異を含んでおり、これは、複数のラウンドのＰＣＲがクローニング
可能な産物を生成するために必要とされたためであると思われる。従って、我々
は、配列を確認するための別のＰＣＲ産物の合成のために、そしてクローニング
して発現ベクターにするために、シグナルペプチド領域から得られた配列を用い
てセンス鎖リン酸化ＰＣＲプライマー、配列番号１８
【０２０４】
【化１】
【０２０５】 、ＲＥＮＥＯＰＩＧＳＰと呼ばれるもの、を設計した。太字の配列は開始コドン
を表している。これへの配列５’は、ＶＩＩＩ因子の発現に用いられる哺乳類発
現ベクターＲｅＮｅｏへの挿入部位の５’と同一の配列である（Lubin et al.,
(1994) 前出）。この部位はＸｈｏｌ開裂部位を含んでいる（下線）。ＲＥＮＥ
ＯＰＩＧＳＰとｎｔ１４９７〜１５２０オリゴヌクレオチドを用いて、雌ブタ脾
臓ｃＤＮＡをテンプレートとして用いるＴａｑＤＮＡポリメラーゼに媒介される
ＰＣＲ反応を開始させた。他のいくつかのメーカーからのＤＮＡポリメラーゼは
検出できるほどの産物を生成できなかった。ＰＣＲ条件は、９４℃で４分間の変
性、続いて９４℃で１分間の変性を３５サイクル、５５℃で２分間のアニーリン
グ、及び７２℃で２分間の伸長、その後７２℃で５分間の最終伸長ステップ、で
あった。ＰＣＲ産物は、ＣｌａＩリンカーを用いてpBluescript にクローニング
された。これらのクローンの二つのインサートが両方向で配列決定され、一致配
列と突き合わせられた。
【０２０６】 Ａ３、Ｃ１及びＣ２ドメイン・コドンの５’半部を含むブタＶＩＩＩ因子ｃ ＤＮＡクローンの単離 最初、Ｂ−Ａ３ドメイン断片（ｎｔ４５１９〜５５７１）とＣ１−Ｃ２ドメイ
ン断片（ｎｔ６４０５〜６９９０）に対応する二つのブタ脾臓ＲＴ−ＰＣＲ産物
がクローニングされた。得られたＣ２ドメインの３’末端は、ＶＩＩＩ因子の終
端エクソンであるエクソン２６領域にまで延びていた。Ｂ−Ａ３産物は、ブタ特
異的なＢドメイン・プライマー、配列番号１９ ５’ＣＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ
ＧＣＧ ＣＡＴ ＣＴＧ ＧＣＡ ＡＡＧ ＣＴＧ ＡＧＴ Ｔ ３’を用いて
作られた。ここで下線の領域は、ブタのＶＩＩＩ因子においてヒトのＶＩＩＩ因
子のｎｔ４５１９〜４５３０と並ぶ領域に対応する。オリゴヌクレオチドの５’
領域は、元来クローニングのためであったＮｏｔＩ部位を含んでいる。Ｂ−Ａ３
産物を生成するのに用いられるアンチセンス・プライマー、配列番号２０ ５’
−ＧＡＡ ＡＴＡ ＡＧＣ ＣＣＡ ＧＧＣ ＴＴＴ ＧＣＡ ＧＴＣ ＲＡＡ
−３’、はヒトＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡのｎｔ５５４５〜５５７１での配列の逆コ
ンプリメントに基づいていた。ＰＣＲ反応は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ９．０，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2、２．５ｍＭｄＮＴＰｓ、２０μＭプライマー、２５単位／ｍｌＴａ
ｑＤＮＡポリメラーゼ、及び１／２０体積のＲＴ反応ミックスを含んでいた。Ｐ
ＣＲ条件は、９４℃で３分間の変性、続いて９４℃で１分間の変性を３０サイク
ル、５０℃で２分間のアニーリング、そして７２℃で２分間の伸長であった。Ｐ
ＣＲ産物は、Ｔ４ＤＮＡキナーゼを用いてリン酸化され、ＮｏｔＩリンカーが加
えられた。ＮｏｔＩでカットされた後、ＰＣＲ断片はBlueScript II KS- のＮｏ
ｔＩ部位にクローニングされ、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に形質転換された。
【０２０７】 Ｃ１−Ｃ２産物は、知られているヒトｃＤＮＡ配列を用いてセンス及びアンチ
センス・プライマー、それぞれ、配列番号２１ ５’−ＡＧＧ ＡＡＡ ＴＴＣ
ＣＡＣ ＴＧＧ ＡＡＣ ＣＴＴ Ｎ−３’（ｎｔ６４０５〜６４２６）及び
配列番号２２ ５’−ＣＴＧ ＧＧＧ ＧＴＧ ＡＡＴ ＴＣＧ ＡＡＧ ＧＴ
Ａ ＧＣＧ Ｎ−３’（ｎｔ６９６６〜６９９０の逆コンプリメント）、を合成
して作られた。ＰＣＲ条件はＢ−Ａ２産物を生成するのに用いられた条件と同一
であった。得られた断片は、Prime PCR Cloner Cloning System （5 Prime-3Pri
me, Inc., Boulder, Colorado）を用いてｐＮＯＴクローニング・ベクターに結
紮され、ＩＭ１０９細胞で育成された。
【０２０８】 Ｂ−Ａ３及びＣ１−Ｃ２プラスミドを部分的に配列決定して、ブタ特異的なセ
ンス及びアンチセンス・オリゴヌクレオチド、それぞれ、配列番号２３ ５’−
ＧＡＧ ＴＴＣ ＡＴＣ ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＣＣ ＴＧＴ ＴＧ−３’（ｎｔ
４５５１〜４５７３）及び配列番号２４ ５’−ＡＣＡ ＧＣＣ ＣＡＴ ＣＡ
Ａ ＣＴＣ ＣＡＴ ＧＣＧ ＡＡＧ−３’（ｎｔ６５４１〜６５６４）を作っ
た。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、Clontech Advantage
ｃＤＮＡ ＰＣＲキットを用いて２０１３ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ産物を生成した
。この産物はヒトのｎｔ４５５１〜６５６４に対応し、Ｌ鎖活性化ペプチド（ｎ
ｔ５００２〜５１２４）、Ａ３ドメイン（ｎｔ５１２５〜６１１４）及びＣ１ド
メイン（ｎｔ６１１５〜６５７３）の大部分に対応する領域を含んでいる。Ｃ１
−Ｃ２クローンの配列から、ヒトとブタのｃＤＮＡがｎｔ６５６５からＣ１ドメ
インの３’末端まで同一であるということが確立されていた。ＰＣＲ産物はpBlu
escript II KS-のＥｃｏＲＶ部位にクローニングされた。４つのクローンの配列
が両方向で完全に決定された。４部位のうち少なくとも３つで一致に達した。
【０２０９】 Ｃ２ドメイン・コドンの３’半部を含むブタＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡクローン の単離 ヒトのＶＩＩＩ因子のＣ２ドメイン（ヌクレオチド６５７４〜７０５３）は、
エクソン２４〜２６の内部に含まれる［Gitschier J. et al., (1984) Nature 3
12: 326-330］。ヒトのエクソン２６は、ヌクレオチド６９０１〜８８５８に対
応する１９５８ｂｐを含んでいる。これには１４７８ｂｐの翻訳されない３’配
列が含まれる。Ｃ２ドメインの３’末端及び３’ＵＴＲに対応するエクソン２６
ｃＤＮＡをクローニングする試みは、３’ＲＡＣＥによるもの［Siebert et al.
, (1995) 前出］、逆ＰＣＲによるもの［Ochman, H. et al., (1990) Biotechno
logy (N.Y) 8: 759-760］、制限部位ＰＣＲによるもの［Sarkar, G. et al. (19
93) PCR Meth. Appl. 2: 318-322］、「予測できない開始の」ＰＣＲによるもの
［Dominguez, O. et al. (1994) Nucleic. Acids Res. 22: 3247-3248］及びブ
タ肝臓ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによるものも失敗した。３’ＲＡ
ＣＥは、ブタのＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの５’末端をクローニングするのに用いて
成功した同じアダプター結合された二本鎖ｃＤＮＡライブラリーを用いて試みら
れた。従って、この方法の失敗はエクソン２６に対応するｃＤＮＡが存在しない
ためではない。
【０２１０】 Ｃ２ドメインの３’半部をクローニングするために標的遺伝子ウオーキングＰ
ＣＲ法［Parker, J.D. et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 3055-3060］が
用いられた。ブタ特異的なセンス・プライマー、配列番号２５ ５’−ＴＣＡＧ
ＧＧＣＡＡＴＣＡＧＧＡＣＴＣＣ−３’（ｎｔ６９０４〜６９２４）が最初のＣ
２ドメイン配列に基づいて合成され、実験室で得られるオリゴヌクレオチドから
選択される非特異的な「ウオーキング」プライマーによるＰＣＲ反応に用いられ
た。次に、32Ｐ末端標識されたブタ特異的な内部プライマー、配列番号２６ ５
’−ＣＣＧＴＧＧＴＧＡＡＣＧＣＴＣＴＧＧＡＣＣ−３’（ｎｔ６９３２〜６９
５２）を用いて、ＰＣＲ産物をプライマー延長分析の標的にした［Parker et al
. (1991) BioTechniques 10: 94-101］。興味深いことに、テストされた４０の
非特異的プライマーのうち、二つだけがプライマー延長分析でポジティブな産物
を与え、この二つはＣ２ドメインの３’末端におけるヒトの正確な配列及び縮重
配列：配列番号２７ ５’−ＧＴＡＧＡＧＧＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＣＧＣＡＧＣ
Ｃ−３’（ｎｔ７０３０〜７０５３）及び配列番号２８ ５’−ＧＴＡＧＡＧＳ
ＴＳＣＴＧＫＧＣＣＴＣＲＣＡＫＣＣＹＡＧ−３’（ｎｔ７０２７〜７０５３）
に対応していた。これらのプライマーは、最初に通常のＲＴ−ＰＣＲによって産
物を得ようとして設計されたが臭化エチジューム色素結合によって目に見えるよ
うにできるほど十分な産物を得られなかったものである。しかし、ＰＣＲ産物は
より敏感なプライマー延長法によって同定することができた。この産物をゲル精
製して直接配列を決定した。これによってブタＶＩＩＩ因子３’の配列がｎｔ７
０２６まで延長された。
【０２１１】 前述の５’−ＲＡＣＥプロトコルで用いられたアダプター結合された二本鎖ｃ
ＤＮＡライブラリーを用いて生成されたネスティッドＰＣＲ産物のプライマー延
長分析によって別の配列が得られた。第一ラウンドの反応では、ブタの正確なプ
ライマー 配列番号２９ ５’−ＣＴＴＣＧＣＡＴＧＧＡＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣ
ＴＧＴ−３’（ｎｔ６５４１〜６５６４）及びＡＰ１プライマーが用いられた。
第二ラウンドの反応では、配列番号３０ ５’−ＡＡＴＣＡＧＧＡＣＴＣＣＴＣ
ＣＡＣＣＣＣＣＧ−３’（ｎｔ６９１３〜６９３４）及びＡＰ２プライマーが用
いられた。直接のＰＣＲ配列決定によって配列３’がＣ２ドメインの終わり（ｎ
ｔ７０５３）まで延長された。Ｃ２ドメインの配列はＣ２ドメインの３’末端の
近くのｎｔ７０４５を除きユニークであった。反復されたＰＣＲ反応の分析から
この部位ではＡ、Ｇ、又はＡ／Ｇの二重の読みが生じた。
【０２１２】 二つの追加プライマー、配列番号３１ ５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＣＣ
Ａ ＣＧＡ ＧＣＴ ＧＧ−３’（ｎｔ６９７７〜６９９６）及び配列番号３２
５’−ＣＧＣ ＣＣＴ ＧＡＧ ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＧＴ ＴＣＴ ＡＧＧ−
３’（ｎｔ７００８〜７０３１）を用いて配列決定が３’ＵＴＲにまで延長され
た。ほぼ１５ｂｐの３’ＵＴＲ配列が得られたが、配列はいくつかの部位で明瞭
でなかった。次に、３’未翻訳配列についての最良の推定に基づいていくつかの
アンチセンス・プライマーが合成された。これらのプライマーはその３’末端に
ＴＧＡ停止コドンの逆コンプリメントを含んでいた。ある特定センス・プライマ
ー配列番号３３ ５’−ＡＡＴ ＣＡＧ ＧＡＣ ＴＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ Ｃ
ＣＣ Ｇ−３’（ｎｔ６９１３〜６９３４）と３’ＵＴＲアンチセンス・プライ
マー、配列番号３４ ５’−ＣＣＴＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＴＣＡ−３’
を用いて、アガロースゲル電気泳動と臭化エチジューム染色によって目に見える
ＰＣＲ産物がブタ脾臓ゲノムＤＮＡとブタ脾臓ｃＤＮＡの両方から得られた。ク
ローニングのために十分な量の物質を得るために、第二ラウンドのＰＣＲがネス
ティッドセンス・プライマー、配列番号３５ ５’−ＣＣＧＴＧＧＴＧＡＡＣＧ
ＣＴＣＴＧＧＡＣＣ−３’（ｎｔ６９３２〜６９５２）と同じアンチセンス・プ
ライマーを用いて行われた。１４１ｂｐのＰＣＲ産物はＥｃｏＲＶ−カットpBlu
escript II KS-にクローニングされた。ゲノムＤＮＡから得られた３つのクロー
ン及びｃＤＮＡから得られた３つのクローンの配列が両方向で得られた。ｎｔ７
０４５を除いて配列は曖昧さがなく明瞭であったが、ｎｔ７０４５ではゲノムＤ
ＮＡは常にＡであり、ｃＤＮＡは常にＧであった。
【０２１３】 ヒト、ブタ、及びマウスＶＩＩＩ因子の多数ＤＮＡ配列の比較整列（図１Ａ 〜１Ｈ） シグナルペプチド、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１及びＣ２領域の比較整列が、ＣＬ
ＵＳＴＡＬＷプログラム［Thompson, J.D. et al. (1994) Nucleic. Acids. Res
. 22: 4673-4680］を用いて行われた。ギャップ・オープン及びギャップ・イク
ステンションのペナルティーは、それぞれ、１０及び０．０５であった。ヒト、
マウス及びブタＢドメインの比較整列については前に述べた［Elder et al. (19
93) 前出］。ヒトＡ２配列は、配列番号２におけるアミノ酸３７３〜７４０に対
応する。ブタのＡ２アミノ酸配列は配列番号４に与えられており、マウスＡ２ド
メイン・アミノ酸配列は配列番号６、アミノ酸３９２〜７５９に与えられている
。
【０２１４】 実施例１１． 活性な、組み換えＢ−ドメインレス・ブタＶＩＩＩ因子（
ＰＢ-） 材料 クエン酸塩添加血友病Ａ及び正常なプールされたヒト血漿はGeorge King Biom
edical, Inc. から購入した。胎仔うし血清、ジェネティシン（geneticin）、ペ
ニシリン、ストレプトマイシン、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地及びＡＩＭ−Ｖ培地はLi
fe Technologies, Inc. から購入した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼはPromegaか
ら購入した。ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼはNew England Biolabsから購入した
。 ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼとファージミド（phagemid）pBlueScript II KS-
はStratageneから購入した。合成オリゴヌクレオチドはLife Technologies又はC
ruachem, Inc. から購入した。制限酵素はNew England Biolabs又はPromegaから
購入した。クローニングのためにＰＣＲ産物を生成するときには、５’リン酸化
プライマーを用いた。ブタＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドのヌク
レオチド（ｎｔ）番号付けではヒトＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡを基準として用いる［
Wood et al. (1984) Nature 312: 330-337］。ＶＩＩＩ因子発現ベクター（ＨＢ - ／ＲｅＮｅｏと呼ばれる）は、Biogen, Inc.から入手した。ＨＢ-／ＲｅＮｅｏ
は、アンピシリン（ampicillin）及びジェネティシン（geneticin）耐性遺伝子
及びトロンビンで生成されたＳｅｒ７４１〜Ａｒｇ１６４８開裂断片と定義され
る、Ｂドメイン全体を欠いたヒトＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡを含んでいる。ＲｅＮｅ
ｏのＶＩＩＩ因子インサートの３’末端にあるＶＩＩＩ因子Ｃ２ドメインｃＤＮ
Ａの突然変異誘発を簡単にするために、ＮｏｔＩ部位がＨＢ-／ＲｅＮｅｏの停
止コドンに対して２塩基３’に、オーバラップスプライシング延長（ＳＯＥ）突
然変異誘発によって導入された［Horton, R.M. et al. (1993) Methods Enzymol
. 217: 270-279］。この構築体はＨＢ-Ｎｅｏ／ＮｏｔＩと呼ばれる。
【０２１５】 全ＲＮＡは、酸グアニジウム・チオシアネート−フェノール−クロロフォルム
抽出によって単離された［Chomczynski, P. et al. (1987) Anal. Biochem. 162
: 156-159］。ｃＤＮＡはｍＲＮＡからMoloneyマウス白血病ウイルス逆トランス
クリプターゼ（ＲＴ）とランダム・ヘキサマーをメーカー（First-Strand ｃＤ
ＮＡ合成キット、Pharmacia Biotech）からの指示に従って用いて合成された。
プラスミドＤＮＡは、Qiagen Plasmid Maxi Kit （Qiagen, Inc.）を用いて精製
された。ＰＣＲ反応は、Hybaid OmniGene サーモサイクラーを用い、Ｔａｑ、Ｖ
ｅｎｔ又はＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いて行われた。ＰＣＲ産物は、ゲル精
製され、エタノールで沈澱され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてプラスミドＤＮＡ
に結合された（迅速ＤＮＡ結紮キット、Boehringer Mannheim）。インサートを
含むプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉEpicurean XL1-Blue細胞を形質転換させ
た。ＰＣＲによって生成された全ての新しいＶＩＩＩ因子ＤＮＡ配列は、Applie
d Biosystems 373a 自動ＤＮＡシーケンサーとＰＲＩＳＭ色素ターミネーター・
キットを用いるジデオキシ配列決定法によって確認された。
【０２１６】 ブタＣ２ドメインを含むハイブリッドＶＩＩＩ因子発現ベクターＨＰ２０の 構築 Ｃ１ドメインの３’末端及びＣ２ドメインの全部に対応するブタＶＩＩＩ因子
ｃＤＮＡが、既知のブタＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ配列に基づくプライマーを用いて
脾臓全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによってpBluescriptにクローニングされた［Hea
ly, J.F. et al. (1996) Blood 88: 4209-4214］。この構築体及びＨＢ-／Ｒｅ
Ｎｅｏをテンプレートとして用いて、ＳＯＥ突然変異誘発によってヒトＣ１−ブ
タＣ２融合生成物をpBlueScriptに構築した。このプラスミドのＣ１−Ｃ２断片
がＡｐａＩ及びＮｏｔＩによって取り出され、ＡｐａＩ／ＮｏｔＩカットＨＢ-
／ＲｅＮｅｏ／ＮｏｔＩに結合され、ＨＰ２０／ＲｅＮｅｏ／ＮｏｔＩ が生成
された。
【０２１７】 ブタ軽鎖を含むＢドメイン削除ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子の構築 （ＨＰ１８）− ヒトＶＩＩＩ因子Ｌ鎖はアミノ酸残基Ａｓｐ１６４９〜Ｔｙｒ２３３２から成
る。ブタＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの対応する残基がＨＢ-のこの領域に置換されて
、ＨＰ１８と呼ばれるハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ分子が生成
された。これは、ブタのＡ２領域、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、及びＣ２ドメ
インの一部に対応するＰＣＲ産物をＨＰ２０の対応する領域に置換することによ
って行われた。構築を容易にするために、同義的なＡｖｒII部位が、ＳＯＥ突然
変異誘発によってＨＰ２０のＡ２及びＡ３ドメインの接合部のｎｔ２２７３に導
入された。
【０２１８】 ブタシグナルペプチド、Ａ１ドメイン、及びＡ２ドメインを含むＢドメイン 削除ハイブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子の構築（ＨＰ２２）− ヒトＶＩＩＩ因子シグナルペプチド、Ａ１ドメイン及びＡ２ドメインは、アミ
ノ酸残基Ｍｅｔ（−１９）〜Ａｒｇ７４０から成る。ブタＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ
の対応する残基がＨＢ-のこの領域に置換されて、ＨＰ１８と呼ばれる分子が生
成された。さらに、同義的なＡｖｒII部位が、ＳＯＥ突然変異誘発によってＨＰ
２２のＡ２及びＡ３ドメインの接合部のｎｔ２２７３に導入された。ＨＰ２２は
ブタシグナルペプチド−Ａ１−部分Ａ２断片をpBlueScript［Healy et al. (199
6) 前出］で、ＨＰ１と呼ばれるブタＡ２ドメインを含むＢ−ドメイン欠如ハイ
ブリッドヒト／ブタＶＩＩＩ因子［Lubin et al. (1994) 前出］と融合させるこ
とによって構築された。
【０２１９】 ブタＢドメイン欠如ＶＩＩＩ因子の構築（ＰＢ-） ＨＰ１８／ＢＳ（＋ＡｖｒII）のＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ断片がＡｖｒII／Ｎｏｔ
Ｉで消化され、ＡｖｒII／ＮｏｔＩ消化されたＨＰ２２／ＢＳ（＋ＡｖｒII）に
結合されて、Ｂドメイン全体を欠くブタＶＩＩＩ因子である構築体ＰＢ-／ＢＳ
（＋ＡｖｒII）が生成された。ＰＢ−／ＢＳ（＋ＡｖｒII）のＸｂａ／ＮｏｔＩ
断片をＨＰ２２／ＲｅＮｅｏ／ＮｏｔＩ（＋ＡｖｒII）に結合することによって
ＰＢ−がＲｅＮｅｏにクローニングされた。
【０２２０】 組み換えＶＩＩＩ因子分子の発現 ＰＢ-／ＲｅＮｅｏ／ＮｏｔＩ（＋ＡｖｒII）及びＨＰ２２／ＲｅＮｅｏ／Ｎ
ｏｔＩ（＋ＡｖｒII）が前に述べたように［Lubin,I.M. et al. (1994) J. Biol
. Chem. 269: 8639-8641］、ＣＯＳ細胞に一時的に形質移入され、発現された。
ＨＢ-／ＲｅＮｅｏ／ＮｏｔＩ及びｎｏＤＮＡ（疑似）が対照として移入された
。
【０２２１】 ＰＢ-、ＨＰ２２，及びＨＢ-のＶＩＩＩ因子活性が次のように色素産生分析に
よって測定された。ＣＯＳ細胞培養上澄みのサンプルが、０．１５Ｍ ＮａＣｌ
、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ｃＡＣ１２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０，
ｐＨ７．４の中で１０ｎＭのIXａ因子、４２５ｎＭ Ｘ因子及び５０μＭ単層ホ
スファチジルセリン−ホスファチジルコリン（２５／７５ｗ／ｗ）小胞の存在下
で４０ｎＭトロンビンによって活性化された。５分後、０．０５Ｍ ＥＤＴＡと
１００ｎＭ組み換えデスルファトヒルジンによって反応を停止させ、得られたＸ
ａ因子を色素産生基質分析によって測定した。色素産生基質分析では、０．４ｍ
Ｍ Spectrozyme Xaを加えて、パラ−ニトロアニリド放出の速さを４０５ｎｍで
の溶液の吸光度を測定することによって測定した。
【０２２２】 独立に形質移入された重複細胞培養上清の結果（４０５ｎｍでの毎分の吸光度
） ＨＢ- : １３．９ ＰＢ- ：１３９ ＨＰ２２：１００ 疑似：＜０．２ これらの結果は、ブタＢドメイン欠如ＶＩＩＩ因子およびブタＡ１及びＡ２サ
ブユニットから成るＢドメインレスＶＩＩＩ因子が活性を有することを示してお
り、ヒトＢドメインレスＶＩＩＩ因子よりも高い活性を有することを示唆してい
る。
【０２２３】 ＰＢ- が、ヘパリン−セファロース・クロマトグラフィーによって、増殖培地
から部分的に精製され濃縮された。ヘパリン−セファロース（１０ｍｌ）を０．
０７５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ2、０．００５
％Ｔｗｅｅｎ−８０、０．０２％窒化ナトリウム、ｐＨ７．４０と平衡させた。
発現する細胞からの培地（１００〜２００ｍｌ）をヘパリン−セファロースに加
え、それを３０ｍｌの窒化ナトリウムを含まない平衡緩衝液で洗浄した。ＰＢ-
は、０．６５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、０．０１
％Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ７．４０で溶出させ、−８０℃で貯蔵した。ＶＩＩＩ
因子凝固活性の収率は普通５０−７５％であった。
【０２２４】 ブタＢドメイン欠如ＶＩＩＩ因子（ＰＢ-）の安定な発現 形質移入された細胞ラインは、１０％胎仔ウシ血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン
、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むダルベッコの修正イーグル培地−Ｆ
１２で維持された。胎仔ウシ血清は、使用する前に５０℃で１時間加熱して不活
性化された。ＨＢ-／ＲｅＮｅｏ及びＰＢ-／ＲｅＮｅｏ／ＮｏｔＩ（＋ＡｖｒII
）はＢＨＫ細胞に安定に形質移入され、発現する細胞は６００μｇ／ｍｌのジェ
ネティシンを含む増殖培地で維持されることを除き前に述べた一般的なプロトコ
ル［Lubin et al. (1994) Biol. Chem. 269: 8639-8641］を用いてジェネティシ
ン耐性に関して選抜された。集密まで増殖させたコーニングＴ−７５フラスコか
らの細胞を、Ｎｕｎｃトリプル・フラスコの６００μｇ／ｍｌのジェネティシン
を含む培地に移し、集密まで増殖させた。培地を除去し、血清を含まない、ジェ
ネティシンを含まないＡＩＭ−Ｖ培地（Life Technologies, Inc.）に代えた。
ＶＩＩＩ因子の発現が一段ＶＩＩＩ因子凝固活性（上記参照）によってモニター
され、１００〜１５０ｍｌの培地が一日一回、４乃至５日間集められた。ＨＢ-
及びＰＢ-の培地での最大発現レベルは、ＶＩＩＩ因子凝固活性で、それぞれ、
１ｍｌあたり１０２単位及び１ｍｌあたり１０〜１２単位であった。
【０２２５】 ＰＢ-の精製 ６０％飽和硫酸アンモニウムによって培養上澄みからＰＢ-を沈澱させ、次に
、血漿由来ブタＶＩＩＩ因子の精製に関して前に述べたように［Lollar et al.
(1993) ＶＩＩＩ因子／ＶＩＩＩａ因子. Methods Enzymol. 222: 128-143］Ｗ３
−３インムノアフィニティー・クロマトグラフィー及びモノＱ高圧液体クロマト
グラフィーによって精製した。ＰＢ-の 特異的凝固活性は一段凝固分析［Lolla
r et al. (1993) 前出］によって測定されたが、血漿由来のブタＶＩＩＩ因子と
同様であった。
【０２２６】 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で分析すると、ＰＢ-調製物は見
かけの分子質量が１６０ｋＤａ、８２ｋＤａ、及び７６ｋＤａという３つのバン
ドを含んでいた。８２ｋＤａ及び７６ｋＤａのバンドは、前にＡ１−Ａ２及びａ
ｐ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ドメインを含むヘテロダイマーとして記述されている（こ
こでａｐは活性化ペプチドを指す）［Toole et al. (1984) Nature 312: 342-34
7］。１６０ｋＤａのバンドは、フッ化ポリビニリデン膜に移され、ＮＨ2−末端
の配列決定が行われ、単一鎖ＶＩＩＩ因子のＮＨ2末端配列であるＡｒｇ−Ｉｌ
ｅ−Ｘｘ−Ｘｘ−Ｔｙｒ（ここでＸｘは未決定を表す）が得られた［Toole et a
l. (1984) 前出］。すなわち、ＰＢ-は部分的にＡ２及びＡ３ドメインの間の開
裂によって、二つの形態、単一鎖Ａ１−Ａ２−ａｐ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２タンパク
質とＡ１−Ａ２／ａｐ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ヘテロダイマー、から成るように処理
される。組み換えＨＢ- の同様な処理が報告されている［Lind et al. (1995) E
ur. J. Biochem. 232: 19-27］。
【０２２７】 ブタＶＩＩＩ因子の特性決定 我々は、５’ＵＴＲの１３７ｂｐ、シグナルペプチド・コーディング領域（５
７ｂｐ）、及びＡ１（１１１９ｂｐ）、Ａ３（９９０ｂｐ）、Ｃ１（４５６ｂｐ
）、及びＣ２（４８３ｂｐ）ドメインに対応するブタＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡ配
列を決定した。以前に発表したＢドメイン及び軽鎖活性化ペプチド領域［Toole
et al. (1986) 前出］及びＡ２ドメイン［Lubin et al. (1994), 前出］の配列
と合わせて、ここで報告される配列は翻訳された生成物に対応するブタＶＩＩＩ
因子ｃＤＮＡの決定を完成する。５’ＵＴＲ領域、シグナルペプチド及びＡ１ド
メインｃＤＮＡを含む断片が、５’−ＲＡＣＥ ＲＴ−ＰＣＲプロトコルを用い
てクローニングされた。ヒトＣ２配列に基づくプライマーは、Ａ３，Ｃ１，及び
Ｃ２ドメインの５’半部のクローニングに導くＲＴ−ＰＣＲ産物を生成すること
に成功した。Ｃ２ドメインの３’半部に対応するｃＤＮＡ及び３’ＵＴＲｃＤＮ
Ａはクローニングすることが難しいことが分かった。残りのＣ２ドメインは、結
局、標的遺伝子ウオーキングＰＣＲ手順によってクローニングされた［Parker e
t al. (1991) 前出］。
【０２２８】 ここで報告される配列配列番号３６は、Ｃ２ドメインの３’末端の近くのｎｔ
７０４５を除けば曖昧さがなく、このｎｔ７０４５は上述のようにＡ又はＧであ
る。対応するコドンは、それぞれ、ＧＡＣ（Ａｓｐ）及びＡＡＣ（Ａｓｎ）であ
る。ヒト及びマウスコドンは、それぞれ、ＧＡＣ及びＣＡＧ（Ｇｌｎ）である。
これがポリモルフィズム（多形性）を表しているのか、それとも再現性があるＰ
ＣＲのアーチファクトであるのか、分かっていない。ＧＡＣ及びＡＡＣの両方の
コドンに対応するブタＣ２ドメイン置換を含む組み換えハイブリッドヒト／ブタ
Ｂ−ドメインレスＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡは安定して発現され、プロ凝固活性に何
も検出できる差異はない。このことは、これら二つのＣ２ドメインの変型には何
も機能的な差異はないということを示している。
【０２２９】 ブタＶＩＩＩ因子全長の予測されるアミノ酸配列配列番号３７と、発表されて
いるヒト［Wood et al. (1984) 前出］及びマウス［Elder et al. (1993) 前出
］の配列との比較整列（アラインメントalignment）が図１Ａ〜１Ｈに、翻訳後
の変更、タンパク質分解開裂、及び他の巨大分子による認識の部位と合わせて示
されている。整列させた配列の同一度が表VII に示されている。前に述べたよう
に、これらの種のＢドメインは、ＡドメインやＣドメインよりも開きが大きい。
これは、大きなサイズにも関わらずＢドメインには知られている機能が何もない
という所見［Elder et al. (1993) 前出；Toole et al. (1986) 前出］と矛盾し
ない。本発明の結果は、ブタＶＩＩＩ因子のＢドメインは活性にとって必要ない
ということを裏付けている。本明細書に示された配列データに基づいて、ブタＢ
ドメインのコドンの全部又は一部を削除されたブタＶＩＩＩ因子をコードするＤ
ＮＡを発現させることによって、Ｂドメインの全部又は一部を削除されたブタＶ
ＩＩＩ因子を合成することができる。Ａ１ドメインＡＰＣ／IXａ因子開裂ペプチ
ド（残基３３７〜３７２）及びＬ鎖活性化ペプチドに対応する配列にも大きな開
きがある（表VII ）。この３３７〜３７２ペプチドを生成するための位置３３６
におけるトロンビン開裂部位は、マウスではこの残基がアルギニンではなくグル
タミンであるため明らかに失われている［Elder et al. (1993) 前出］。トロン
ビン開裂ペプチド（又はマウスＶＩＩＩ因子では、痕跡である可能性がある３３
７〜３７２活性化ペプチド）の比較的急速な開きはフィブリノペプチドについて
以前に注意されている［Creighton, T.E. (1993) タンパク質：構造及び分子的
性質、W.H. Freeman, New York, pp. 105-138、の中で］。開裂した後のこれら
のペプチドが機能を欠いていることが急速な開きの理由かもしれないと言われて
きた。ヒトＶＩＩＩ因子におけるＡｒｇ５６２は、ＶＩＩＩ因子及びＶＩＩＩａ
因子の不活性化の際の活性化されたタンパク質Ｃの重要な開裂部位であると提唱
されている［Fay, P.J. (1991) J. Biol. Chem. 266: 20139-20145］。この部位
はヒト、ブタ、及びマウスのＶＩＩＩ因子で保存されている。
【０２３０】 可能なＮ−結合グリコシル化部位（ＮＸＳ／Ｔ、ここでＸはプロリンでない）
が図１Ａ〜１Ｈに見られる。保存されているＮ−結合グリコシル化部位は８つあ
る：１つはＡ１ドメインに、１つはＡ２ドメインに、４つはＢドメインに、１つ
はＡ３ドメインに、そして１つはＣ１ドメインにある。Ａ及びＣドメインの１９
のシステインは保存されているが、Ｂドメインのシステインでは開きがある。Ｖ
ＩＩＩ因子における７つのジスルフィド結合のうち６つはＶ因子およびセルロプ
ラスミンの相同部位にあり、両方のＣドメインのジスルフィド結合はＶ因子に見
られる［McMullen, B.A. (1995) Protein Sci. 4: 740-746］。ヒトＶＩＩＩ因
子は硫酸化チロシンを位置３４６、７１８、７１９、７２３、１６６４及び１６
８０に含んでいる［Pittman, D.D. et al. (1992) Biochemistry 31: 3315-3325
; Michnick, D.A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20095-20102］。これら
の残基はマウスＶＩＩＩ因子及びブタＶＩＩＩ因子で保存されるが（図１）、Ｃ
ＬＵＳＴＡＬＷプログラムはヒトＶＩＩＩ因子におけるＴｙｒ３４６に対応する
マウスのチロシンを整列させることができなかった。
【０２３１】 マウス及びブタの血漿は、ヒト血友病Ａ血漿の凝固欠陥を矯正することができ
、これはこれらの種のＡ及びＣドメインにおける残基の保存レベルと合致する。
ブタＶＩＩＩ因子のプロ凝固活性はヒトＶＩＩＩ因子の活性よりも高い［Lollar
, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 23652-23657］。ここで述べたように
発現され精製される組み換えブタＶＩＩＩ因子（Ｂドメインを削除したもの）も
また、ヒトＶＩＩＩ因子よりも大きな比（specific）プロ凝固活性を示し、血漿
から得られるブタＶＩＩＩ因子と同程度である。これは、活性Ａ１／Ａ２／Ａ３
−Ｃ１−Ｃ２ＶＩＩＩａ因子ヘテロトリマーからのＡ２サブユニットの自発解離
率の減少によるものかもしれない。プロ凝固活性のこの差異が種の適応の一例と
しての機能の進化的変化を反映しているかどうか［Perutz, M.F. (1996) Adv. P
rotein Chem. 36: 213-244］はまだ分からない。今や翻訳される産物に対応する
ブタＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ配列は完全であるから、相同体スキャンニング突然変
異誘発［Cunningham, B.C., et al. (1989) Science 243: 1330-1336］が、ヒト
とブタのＶＩＩＩ因子の間に、後者の優れた活性の原因となっている構造的な差
異を同定する手段を提供するかもしれない。
【０２３２】 普通、ブタＶＩＩＩ因子は、ＶＩＩＩ因子を移入された血友病患者で生ずる、
又は一般人において自己抗体として生ずる阻害的な抗体とあまり反応しない。こ
れが、阻害的な抗体を有する患者の管理でブタＶＩＩＩ因子濃縮物を用いる根拠
である［Hay and Lozier (1995) 前出］。たいていの阻害因子はＡ２ドメイン又
はＣ２ドメインにあるエピトープに向けられている［Fulcher, C.A. et al. (19
85) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7728-7732; Scandella, D. et al. (1988
) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6152-6156; Scandella, D. et al. (1989)
Blood 74: 1618-1626］。さらに、Ａ３又はＣ１ドメインにある重要性が不明の
エピトープが同定されている［Scandella et al. (1989) 前出；Scandella, D.
et al. (1989) Blood 82: 1767-1775; Nakai, H. et al. (1994) Blood 84: 224
a］。相同体走査突然変異誘発によってＡ２エピトープが残基４８４〜５０８に
マップされている［Healey et al. (1995) 前出］。この２５残基のセグメント
では、同一配列の比率が比較的低い（１６／２５又は６４％）。この領域は、そ
れに対する抗体が阻害的であるという事実に基づくと機能的に重要であると思わ
れるが、それが明らかに比較的急速に遺伝的にドリフトしてきたということは興
味深い。ブタＡ２ドメイン及びＡ３ドメインの比較整列は、Ａ２エピトープがＡ
３ドメインの対応する領域と検出できるほどの相同性を有していないことを示し
ている。
【０２３３】 削除マッピングによって、ヒトＶＩＩＩ因子のＣ２阻害因子エピトープを残基
２２４８〜２３１２の内部に位置づけることが提案されている［Scandella, D.
et al. (1995) Blood 86: 1811-1819］。この６５残基のセグメントではヒトと
ブタのＶＩＩＩ因子は８３％同一である。しかし、Ｃ２エピトープを調べるため
のこの領域の相同体走査突然変異誘発から、Ｃ２エピトープの主要な決定因子は
予想外にもヒトのアミノ酸２１８１〜２２４３（配列番号２）及び図１Ｈに対応
する領域にあったことを明らかにした。
【０２３４】 ヒトＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインのいろいろな部分がブタＶＩＩＩ因子の対応
する部分で置き換えられたヒト−ブタ・ハイブリッドＶＩＩＩ因子タンパク質が
、本明細書で述べた戦略を用いて作られた（実施例８）。いろいろなＣ２−ハイ
ブリッドＶＩＩＩ因子の合成は、配列番号３７に与えられているブタＣ２領域を
コードするヌクレオチド配列を用いてハイブリッドをコードするＤＮＡを構築す
ることによって遂行された。各ハイブリッドＤＮＡは、形質移入された細胞で、
ハイブリッドＶＩＩＩ因子を成長培地から部分的に精製できるほどに発現された
。阻害因子がないときの活性が一段凝固分析によって測定された。
【０２３５】 ５つのヒト阻害因子の組を用いて各ハイブリッドＶＩＩＩ因子をテストした。
抗ＶＩＩＩ因子抗体を含む阻害血漿は、組み換えヒトＣ２ドメインがその阻害を
中和できることに基づいてヒトＣ２ドメインに向けられたものであることが以前
に示されていた。全てのテスト血漿において、阻害価はＣ２ドメイン又はＬ鎖に
よって７９％より大きく中和されたが、ヒト組み換えＡ２ドメインによっては１
０％未満しか中和されなかった。さらに、Ｃ２−ハイブリッドＶＩＩＩ因子は、
Ｃ２ドメインと結合するマウスのモノクローナル抗体に対してテストされ、ヒト
Ｃ２阻害因子抗体と同様に、それはＶＩＩＩ因子のリン脂質及びフォン・ビレブ
ランド因子との結合を阻害した。
【０２３６】 抗体阻害価をＣ２−ハイブリッドＶＩＩＩ因子と比較することによって、ヒト
Ｃ２阻害因子エピトープの主要な決定因子は残基２１８１〜２２４３の領域（配
列番号２、図１Ｈも参照）であることが示された。ＯＯＯＨ末端から残基２２５
３までの領域に向けられた抗Ｃ２抗体は、５つの患者血清のうち４つで同定され
なかった。ヒトのアミノ酸残基番号２１８１〜２１９９及び２２０７〜２２４３
に対応するブタの配列を比較すると、二つの領域が抗体結合に寄与していること
は明らかであった。ヒトの残基２１８１〜２２４３に対応するブタのアミノ酸配
列は配列番号３７において１９８２〜２０４４という番号になっている。１９８
２〜２０４４という番号のブタアミノ酸をコードするブタの配列は、配列番号３
５において５９４４〜６１３２という番号のヌクレオチドである。
【０２３７】 図１Ｈを参照すると、領域２１８１〜２２４３にはヒトとブタの配列に１６の
アミノ酸の差異があることが分かる。差異は、残基２１８１、２１８２、２１８
８、２１９５〜２１９７、２１９９、２２０７、２２１６、２２２２、２２２４
〜２２２７、２２３４、２２３８及び２２４３に見られる。これらの番号の残基
の1以上でアミノ酸の置換を行って、ヒトの抗Ｃ２阻害因子抗体に反応しない修
飾されたヒトＶＩＩＩ因子を作ることができる。アラニン走査的突然変異誘発は
、前述のように、天然に見られる残基に対するアラニン置換を生成するのに便利
な方法である。本明細書で述べているように、アラニン以外のアミノ酸で置換す
ることもできる。個々のアミノ酸、特にヒト／ブタ又はヒト／マウスの間で同一
でないもの、又は抗体結合に最も寄与しそうなもの、のアラニン置換によって、
阻害的な抗体に対する反応性が低い修飾されたＶＩＩＩ因子を生み出すことがで
きる。
【０２３８】 さらに、残基２１８１〜２２４３という定められた領域に免疫抗原的である可
能性が低いアミノ酸を挿入するという戦略は免疫抗原性の低い修飾されたＶＩＩ
Ｉ因子を生み出す。免疫抗原性の低いＶＩＩＩ因子は、血友病Ａの患者の治療に
天然の配列のＶＩＩＩ因子よりも好ましいＶＩＩＩ因子サプリメントとして有用
である。免疫抗原性の低いＶＩＩＩ因子によって治療された患者は阻害的な抗体
を生じにくく、したがって、生涯にわたる治療の効果の低さに苦しむことも少な
くなりそうである。
【０２３９】 図１Ａ〜１Ｈを合わせたものは、ヒト、ブタ、及びマウスのＶＩＩＩ因子アミ
ノ酸配列を整列比較したものになっている。図１Ａは、シグナルペプチド領域を
比較している（ヒト、配列番号４０；ブタ、配列番号３７、アミノ酸１〜１９；
マウス、配列番号６、アミノ酸１〜１９）。図１Ａ〜１Ｈにおけるアミノ酸は成
熟タンパク質の最初のアラニンをアミノ酸番号１として番号づけされており、シ
グナルペプチドのアミノ酸にはマイナスの番号が割り当てられているということ
に注意しよう。配列番号２におけるヒトのＶＩＩＩ因子配列も成熟タンパク質の
最初のアラニンをアミノ酸番号１として始まっている。マウスＶＩＩＩ因子（配
列番号６）及びブタＶＩＩＩ因子（配列番号３７）のアミノ酸配列では、成熟タ
ンパク質の最初のアミノ酸（アラニン）はアミノ酸番号２０である。図１Ａ〜１
Ｈは、ヒト、マウス、及びブタのＶＩＩＩ因子の対応する配列を、最大のアミノ
酸同一度の領域が並ぶように整列させて示している。図１Ａ〜１Ｈのアミノ酸番
号はヒトのＶＩＩＩ因子にしか適用されない。
【０２４０】 図１Ｂは、ヒト（配列番号２、アミノ酸１〜３７２）、ブタ（配列番号３７、
アミノ酸２０〜３９１）及びマウス（配列番号６、アミノ酸２０〜３９１）のＡ
１ドメインのアミノ酸配列を与えている。図１Ｃは、ヒト（配列番号２、アミノ
酸３７３〜７４０）、ブタ（配列番号３７、アミノ酸３９２〜７５９）及びマウ
ス（配列番号６、アミノ酸３９２〜７５９）のＶＩＩＩ因子Ａ２ドメインのアミ
ノ酸配列を与えている。図１Ｄは、ヒト（配列番号２、アミノ酸７４１−１６４
８）、ブタ（配列番号３７、アミノ酸７６０〜１４４９）、及びマウス（配列番
号６、アミノ酸７６０〜１６４０）のＶＩＩＩ因子Ｂドメインのアミノ酸配列を
与えている。
【０２４１】 図１Ｅは、ヒト、ブタ及びマウス（それぞれ、配列番号２、アミノ酸１６４９
〜１６８９；配列番号３７、アミノ酸１４５０〜１４９０；配列番号６、アミノ
酸１６４１〜１６７８）のＶＩＩＩ因子のＬ鎖活性化ペプチドのアミノ酸配列を
比較している。図１Ｆは、ヒト、ブタ及びマウスのＶＩＩＩ因子のＡ３ドメイン
の配列比較を行っている（それぞれ、配列番号２、アミノ酸１６９０〜２０１９
；配列番号３７、アミノ酸１４９１〜１８２０；配列番号６、アミノ酸１６７９
〜２００６）。図１Ｇは、ヒト、ブタ及びマウスのＶＩＩＩ因子のＣ１ドメイン
のアミノ酸配列を与えている（それぞれ、配列番号２、アミノ酸２０２０〜２１
７２；配列番号３７、アミノ酸１８２１〜１９７３；配列番号６、アミノ酸２０
０７〜２１５９）。図１Ｈは、ヒト、ブタ及びマウスのＶＩＩＩ因子のＣ２ドメ
インの配列データを与えている（それぞれ、配列番号２、アミノ酸２１７３〜２
３３２；配列番号３７、アミノ酸１９７４〜２１３３；配列番号６、アミノ酸２
１６０〜２３１９）。
【０２４２】 ダイアモンドはチロシン硫酸化部位、IXａ因子、リン脂質及びタンパク質Ｃに
関して提案されている結合部位は二重に下線が引かれており、抗Ａ２及び抗Ｃ２
阻害的抗体の結合に関わる領域はイタリックになっている。星印は保存されるア
ミノ酸配列を強調している。配列番号３６（ブタＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ）及び配
列番号３７（演繹されたブタＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列）も参照。ヒトの番号
づけシステムを基準として用いている（Wood et al. (1984) 前出）。Ａ１、Ａ
２及びＢドメインは、位置３７２と７４０のトロンビン開裂部位及び１６４８に
おける未知のプロテアーゼ開裂部位によって、それぞれ、残基１〜３７２，３７
３〜７４０及び７４１〜１６４８と定義される［Eaton, D.L. et al. (1986) Bi
ochenistry 25: 8343-8347］。Ａ３、Ｃ１及びＣ２ドメインは、それぞれ、残基
１６９０〜２０１９、２０２０〜２１７２及び２１７３〜２３３２と定義される
［Vehar et al. (1984) 前出］。トロンビン（IIａ因子）、IXａ因子、Ｘａ因子
及びＡＰＣの開裂部位［Fay et al. (1991) 前出；Eaton, D. et al. (1986) Bi
ochemistry 25: 505-512; Lamphear, B.J. et al. (1992) Blood 80: 3120-3128 ］は反応性のアルギニンの上に酵素ネームを付けて示している。酸性ペプチド
はＶＩＩＩ因子Ｌ鎖からトロンビン又はＸａ因子によって位置１６８９で開裂さ
れる。IXａ因子［Fay,P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 20522-20527;
Lenting, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7150-7155］、リン脂質［Fo
ster, P.A. et al. (1990) Blood 75: 1999-2004］及びタンパク質Ｃ［Walker,
F.J. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 1484-1489)］に関して提案されてい
る結合部位は二重の下線が付けられている。抗Ａ２の結合に関わる領域［Lubin
et al. (1994) 前出; Healey et al. (1995) 前出］；及び抗Ｃ２阻害的抗体に
ついて以前に提案された領域はイタリックになっている。ここで同定されたＣ２
阻害因子エピトープ（ヒト・アミノ酸２１８１−２２４３）は図１Ｈに一本の下
線で示されている。チロシン硫酸化部位［Pittman et al. (1992) 前出; Michnj
ck et al. (1994) 前出］は ◆で示されている。
【０２４３】 Ｂドメインを欠くＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列は配
列番号３８で与えられ、対応する演繹されたアミノ酸配列は配列番号３９で与え
られている。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａは、ヒト、ブタ及びマウスのＶＩＩＩ因子酸配列の整列させた配列比較
を提供している。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、ヒト、ブタ及びマウスのＶＩＩＩ因子酸配列の整列させた配列比較
を提供している。
【図１Ｃ】 図１Ｃは、ヒト、ブタ及びマウスのＶＩＩＩ因子酸配列の整列させた配列比較
を提供している。
【図１Ｄ】 図１Ｄは、ヒト、ブタ及びマウスのＶＩＩＩ因子酸配列の整列させた配列比較
を提供している。
【図１Ｅ】 図１Ｅは、ヒト、ブタ及びマウスのＶＩＩＩ因子酸配列の整列させた配列比較
を提供している。
【図１Ｆ】 図１Ｆは、ヒト、ブタ及びマウスのＶＩＩＩ因子酸配列の整列させた配列比較
を提供している。
【図１Ｇ】 図１Ｇは、ヒト、ブタ及びマウスのＶＩＩＩ因子酸配列の整列させた配列比較
を提供している。
【図１Ｈ】 図１Ｈは、ヒト、ブタ及びマウスのＶＩＩＩ因子酸配列の整列させた配列比較
を提供している。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１２月４日（２００１．１２．４）
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｄ（続き）】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図１Ｈ】
【手続補正書】
【提出日】平成１４年７月３０日（２００２．７．３０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ｄ】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｄ（続き）
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ｄ（続き）】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｅ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ｅ】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｆ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ｆ】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 15/01 Ａ６１Ｋ 37/48 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｘ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA07 DA02 EA04 FA01 GA11 GA25 HA01 HA03 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 4C084 AA06 AA07 AA13 CA53 CA56 CA59 DC15 MA66 NA06 NA14 ZA531 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA66 EA24 FA72 FA74 GA26

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号２の位置４８４〜５０８の1以上におけるアミノ酸
    置換を含む修飾されたヒトＶＩＩＩ因子であって、前記置換は天然のアミノ酸に
    対して免疫反応性を減少させるアミノ酸を挿入するものであり、前記修飾された
    ＶＩＩＩ因子がプロ凝固活性を有することを特徴とする修飾されたＶＩＩＩ因子
    。
  2. 【請求項２】 該修飾されたＶＩＩＩ因子は修飾されないＶＩＩＩ因子に比
    べて阻害的抗体に対する反応性が減少していることを特徴とする請求項１に記載
    の修飾されたＶＩＩＩ因子。
  3. 【請求項３】 該アミノ酸の置換が、４９０、４９３、４９６、４９９、５
    ００、５０２、５０３、５０５及び５０７から成る群から選択される1以上の位
    置でなされることを特徴とする請求項１に記載の修飾されたＶＩＩＩ因子。
  4. 【請求項４】 該アミノ酸の置換が、４８６、４９１、４９４、４９８、５
    ０４及び５０６から成る群から選択される1以上の位置でなされることを特徴と
    する請求項１に記載の修飾されたＶＩＩＩ因子。
  5. 【請求項５】 該アミノ酸の置換が位置４９７でなされることを特徴とする
    請求項１に記載の修飾されたＶＩＩＩ因子。
  6. 【請求項６】 該アミノ酸の置換が位置４９０でなされることを特徴とする
    請求項１に記載の修飾されたＶＩＩＩ因子。
  7. 【請求項７】 修飾されたヒトＶＩＩＩ因子Ａ２ドメインをコードするＤＮ
    Ａであって、前記ＤＮＡは配列番号２の位置４８４〜５０８から選ばれる1以上
    のアミノ酸位置でコード変化を生ずる1以上のヌクレオチド置換を有し、前記変
    化は選ばれた位置において免疫反応性を減少させるアミノ酸をコードすることを
    特徴とするＤＮＡ。
  8. 【請求項８】 該選ばれるアミノ酸位置が４９０、４９３、４９６、４９９
    、５００、５０２、５０３、５０５及び５０７から成る群から選択されることを
    特徴とする請求項７に記載のＤＮＡ。
  9. 【請求項９】 該選ばれるアミノ酸位置が４８６、４９１、４９４、４９８
    、５０４及び５０６から成る群から選択されることを特徴とする請求項７に記載
    のＤＮＡ。
  10. 【請求項１０】 該選ばれるアミノ酸位置がアミノ酸位置４９７であること
    を特徴とする請求項７に記載のＤＮＡ。
  11. 【請求項１１】 該選ばれるアミノ酸位置がアミノ酸位置４９０であること
    を特徴とする請求項７に記載のＤＮＡ。
  12. 【請求項１２】 ヒト又はヒト／哺乳類ハイブリッドのＶＩＩＩ因子をコー
    ドするＤＮＡの発現産物であって、前記ＤＮＡは修飾されたＡ２ドメインをコー
    ドするＤＮＡを含み、該ＤＮＡは配列番号２の位置４８４〜５０８から選ばれる
    1以上のアミノ酸位置でコード変化を生ずる1以上のヌクレオチド置換を有し、前
    記変化は選ばれた位置において免疫反応性を減少させるアミノ酸をコードするこ
    とを特徴とするＤＮＡの発現産物。
  13. 【請求項１３】 該修飾されたＡ２ドメインをコードするＤＮＡは、４９０
    、４９３、４９６、４９９、５００、５０２、５０３、５０５及び５０７から成
    る群から選択される1以上のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換をコードしてい
    ることを特徴とする請求項１２に記載の発現産物。
  14. 【請求項１４】 該修飾されたＡ２ドメインをコードするＤＮＡは、４８６
    、４９１、４９４、４９８、５０４及び５０６から成る群から選択される1以上
    のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換をコードしていることを特徴とする請求項
    １２に記載の発現物。
  15. 【請求項１５】 該修飾されたＡ２ドメインをコードするＤＮＡは、位置４
    ９７におけるアミノ酸置換をコードしていることを特徴とする請求項１２に記載
    の発現産物。
  16. 【請求項１６】 該修飾されたＡ２ドメインをコードするＤＮＡは、位置４
    ９０におけるアミノ酸置換をコードしていることを特徴とする請求項１２に記載
    の発現産物。
  17. 【請求項１７】 修飾された哺乳類ＶＩＩＩ因子Ａ２ドメインを作成する方
    法であって、 ヒトＶＩＩＩ因子の４８４〜５０８に対応する位置でアミノ酸をコードする1
    以上のコドンで該ドメインをコードするＤＮＡを突然変異させるステップ、それ
    によってアミノ酸をコードする1以上の突然変異したコドンが対応する天然に生
    ずるコドンに対して置換される、及び 該突然変異したコドンを含むＤＮＡを、独立に又はＶＩＩＩ因子の別のドメイ
    ンをコードするＤＮＡとの隣接する翻訳可能な配列として、宿主細胞で発現させ
    て修飾されたＶＩＩＩ因子Ａ２ドメインを作成するステップ、 を含む方法。
  18. 【請求項１８】 該突然変異させるＤＮＡがヒトのＤＮＡであることを特徴
    とする請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 該突然変異させるＤＮＡがブタのＤＮＡであることを特徴
    とする請求項１７に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 該突然変異させるＤＮＡがマウスのＤＮＡであることを特
    徴とする請求項１７に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 突然変異したコドンが免疫反応性を減少させるアミノ酸を
    コードすることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 突然変異したコドンが４９０、４９３、４９６、４９９、
    ５００、５０２、５０３、５０５及び５０７から成る群から選択される位置にお
    けるアミノ酸をコードすることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 突然変異したコドンが４８６、４９１、４９４、４９８、
    ５０４及び５０６から成る群から選択される位置におけるアミノ酸をコードする
    ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 突然変異したコドンが位置４９７におけるアミノ酸をコー
    ドすることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 突然変異したコドンが位置４９０におけるアミノ酸をコー
    ドすることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
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