DE69736068T2

DE69736068T2 - Faktor viii vom schwein und hybride davon

Info

Publication number: DE69736068T2
Application number: DE69736068T
Authority: DE
Inventors: S. John Decatur LOLLAR
Original assignee: Emory University
Current assignee: Emory University
Priority date: 1996-06-26
Filing date: 1997-06-26
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2017-06-27
Also published as: AU3643397A; AU717686B2; HK1022480A1; ES2267146T3; JP3611860B2; WO1997049725A9; CA2258502A1; DK0939767T3; JP3683897B2; ATE328896T1; EP0939767A1; PT939767E; EP0939767A4; US5859204A; JP2000513934A; DE69736068D1; CA2258502C; EP1561757A1; JP2004141173A; WO1997049725A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft allgemein einen hybriden Faktor VIII mit einer humanen und tierischen Faktor VIII Aminosäuresequenz oder mit humanem Faktor VIII und nicht Faktor VIII Aminosäuresequenzen und Verfahren zur Herstellung und Verwendung davon.
Diese Anmeldung ist eine Continuation-In-Part der PCT/US94/13200 mit dem Titel „Hybrider humaner/tierischer Faktor VIII", eingereicht am 15. November 1994 von der EMORY Universität; welche die Priorität der US Serial Nr. 08/212,133 mit dem Titel „Hybrider humaner/tierischer Faktor VIII", eingereicht am 11. März 1994 von John S. Lollar und Marschall S. Runge, beansprucht; die eine Continuation-In-Part der US Serial Nr. 07/864,004 mit dem Titel „Hybrider humaner/vom Schwein stammender Faktor VIII", eingereicht am 07. April 1992 von John S. Lollar und Marschall S. Runge, die als US-Patent Nr. 5,364,771 am 15. November 1994 erteilt wurde.
Die Blutgerinnung beginnt, wenn Plättchen an die abgeschnittene bzw. verletzte Wand eines verletzten Blutgefäßes an einer Läsionsstelle anheften. Anschließend, in einer Kaskade von enzymatisch regulierten Reaktionen, werden lösliche Fibrinogenmoleküle durch das Enzym Thrombin in unlösliche Stränge von Fibrin umgewandelt, welche die Plättchen in einem Thrombus zusammenhalten. In jedem Schritt der Kaskade wird ein Proteinvorläufer zu einer Protease umgewandelt, die den nächsten Proteinvorläufer in der Reihe spaltet. Kofaktoren werden bei den meisten Schritten benötigt.
Der Faktor VIII zirkuliert als ein inaktiver Vorläufer im Blut, fest und nicht kovalent an den von Willebrand Faktor gebunden. Der Faktor VIII wird proteolytisch durch Thrombin oder Faxtor Xa aktiviert, was ihn von dem von Willebrand Faktor dissoziiert und seine prokoagulierende Funktion in der Kaskade aktiviert. In seiner aktiven Form ist der Proteinfaktor VIIIa ein Kofaktor, der die katalytische Wirksamkeit von Faktor IXa gegenüber Faktor X Aktivierung um einige Größenordnungen steigert.
Menschen mit Defizienzen in dem Faktor VIII oder Antikörpern gegen den Faktor VIII, die nicht mit Faktor VIII behandelt werden, leiden an unkontrollierten inneren Blutungen, die eine Reihe von ernsten Symptomen verursachen können, von entzündlichen Reaktionen in den Gelenken bis zu frühem Tod. Schwere Bluter, deren Zahl ungefähr 10.000 in den Vereinigten Staaten beträgt, können mit einer Infusion mit humanem Faktor VIII behandelt werden, was die normale Gerinnungsfähigkeit des Blutes wiederherstellt, wenn er mit ausreichender Frequenz und Konzentration verabreicht wird. Die klassische Definition von Faktor VIII ist in der Tat, dass er jene Substanz ist, die in normalem Blutplasma anwesend ist, die den Gerinnungsdefekt in Plasma, das von Individuen mit Hämophilie abgeleitet ist, korrigiert.
Die Entwicklung von Antikörpern (Inhibitoren) oder „inhibitorischen Antikörpern", welche die Aktivität des Faktor VIII inhibieren, ist eine ernste Komplikation in der Behandlung von Patienten mit Hämophilie. In ungefähr 20 % der Patienten mit Hämophilie A entwickeln sich Autoantikörper als Antwort auf die therapeutischen Infusionen von Faktor VIII. In zuvor unbehandelten Patienten mit Hämophilie A, die Inhibitoren entwickeln, entwickelt sich der Inhibitor für gewöhnlich innerhalb eines Jahres der Behandlung. Zusätzlich entwickeln sich Autoantikörper, die den Faktor VIII inaktivieren, gelegentlich in Individuen mit zuvor normalen Faktor VIII Mengen. Wenn der Inhibitor Titer niedrig genug ist, können die Patienten durch Erhöhen der Dosis des Faktor VIII behandelt werden. Jedoch ist der Inhibitor Titer häufig so hoch, dass er nicht durch Faktor VIII überlagert werden kann. Eine alternative Strategie ist es, den Bedarf an Faktor VIII während der normalen Hämostase unter Verwendung von Faktor IX Komplex Präparation (z.B. KONYNE^®, Proplex^®) oder rekombinantem humanen Faktor VIIIa zu umgehen. Weil zusätzlich Faktor VIII vom Schwein für gewöhnlich im Wesentlich eine geringere Reaktivität mit Inhibitoren als humaner Faktor VIII aufweist, wird eine teilweise gereinigte Faktor VIII Präparation vom Schwein (HYATE:C^®) verwendet. Jedoch können sich Inhibitoren gegen den Faktor VIII vom Schwein nach einer oder mehreren Infusionen entwickeln.
Verschiedene Präparationen von humanem Plasma-abgeleiteten Faktor VIII mit unterschiedlichen Reinheitsgraden sind kommerziell für die Behandlung von Hämophilie A erhältlich. Diese schließen einen teilweise gereinigten Faktor VIII, der von dem vereinigten Blut von vielen Spendern abgeleitet ist, das hinsichtlich Viren, Hitze und Detergenz behandelt ist, aber eine signifikante Menge an antigenen Proteinen enthält; einen monoklonalen Antikörper-gereinigten Faktor VIII, der niedrigere Mengen an antigenen Verunreinigungen und viralen Kontaminationen aufweist; und rekombinanten Faktor VIII, für den klinische Versuche stattfinden, ein. Leider ist humaner Faktor VIII bei physiologischen Konzentrationen und pH instabil, er ist im Blut in einer extrem niedrigen Konzentration (0,2 μg/ml Plasma) anwesend und weist eine geringe spezifische Gerinnungsaktivität auf.
Bluter benötigen den täglichen Austausch des Faktor VIII, um Blutungen und die resultierende deformierende hämophile Arthropathie zu verhindern. Jedoch waren die Vorräte unzureichend, und Probleme treten in der therapeutischen Verwendung aufgrund der Schwierigkeit bei der Isolierung und Reinigung, der Immunogenität und der Notwendigkeit, das AIDS- und Hepatitis-Infektionsrisiko zu entfernen, auf. Die Verwendung von rekombinantem humanen Faktor VIII oder teilweise gereinigtem Faktor VIII vom Schwein wird nicht alle die Probleme lösen.
Die Probleme, die mit dem für gewöhnlich verwendeten, kommerziell erhältlichen, vom Plasma abgeleiteten Faktor VIII assoziiert sind, haben ein signifikantes Interesse an der Entwicklung eines besseren Faktor VIII Produkts stimuliert. Es besteht ein Bedarf für ein wirksameres Faktor VIII Molekül, so dass mehr Einheiten von Gerinnungsaktivität pro Molekül verabreicht werden können; ein Faktor VIII Molekül, das bei einem gewählten pH und einer physiologischen Konzentration stabil ist; ein Faktor VIII Molekül, das weniger dazu neigt, die Bildung von inhibitorischen Antikörpern zu bewirken; und ein Faktor VIII Molekül, das dem Immunnachweis in Patienten ausweicht, die bereits Antikörper gegen den humanen Faktor VIII erworben haben.
Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Faktor VIII bereitzustellen, der Hämophilie in einem Patienten korrigiert, der in dem Faktor VIII defizient ist oder Inhibitoren gegen den Faktor VIII aufweist.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren für die Behandlung von Blutern bereitzustellen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Faktor VIII bereitzustellen, der bei einem gewählten pH und physiologischer Konzentration stabil ist.
Es ist noch ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Faktor VIII bereitzustellen, der eine größere koagulierende Aktivität aufweist als humaner Faktor VIII.
Es ist ein zusätzliches Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Faktor VIII bereitzustellen, gegen den weniger Antikörper gebildet wird.
Die WO 94/11503 offenbart einen humanen/vom Schwein stammenden hybriden Faktor VIII, in dem die Region der Reste 336-740 im humanen Faktor VIII durch die entsprechende Region des Schweins ersetzt ist.
Die WO 95/24427 offenbart einen humanen/vom Schwein stammenden hybriden Faktor VIII, in dem die Region der Reste 484-509 im humanen Faktor VIII durch die entsprechende Region des Schweins ausgetauscht ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte, gereinigte, hybride Faktor VIII Moleküle und Fragmente davon mit koagulierender Aktivität bereit, einschließlich einem hybriden Faktor VIII mit einer Faktor VIII Aminosäuresequenz, die vom Menschen und Schwein und anderen nicht humanen Säugetieren (auf die zusammen hier als „Tier bzw. tierisch" Bezug genommen wird) stammen; oder in einer zweiten Ausführungsform wird ein hybrider äquivalenter Faktor VIII mit einer Faktor VIII Aminosäuresequenz beschrieben, die vom Menschen oder vom Tier oder von beiden abgeleitet ist, und eine Aminosäuresequenz, die keine bekannte Sequenzidentität mit dem Faktor VIII aufweist („nicht Faktor VIII Aminosäuresequenz"), die vorzugsweise in einer antigenen und/oder immunogenen Region des Faktor VIII substituiert ist. Der Fachmann wird erkennen, dass zahlreiche hybride Faktor VIII Konstrukte hergestellt werden können, einschließlich aber nicht beschränkt auf humanen/tierischen Faktor VIII mit größerer koagulierender Aktivität als humaner Faktor VIII („überlegene koagulierende Aktivität"); nicht immunogenen humanen/äquivalenten Faktor VIII; nicht antigenen humanen/äquivalenten oder humanen/tierischen Faktor VIII; nicht immunogenen humanen/tierischen oder humanen/äquivalenten Faktor VIII mit überlegener koagulierender Aktivität; nicht antigenen humanen/tierischen oder humanen/tierischen/äquivalenten Faktor VIII mit überlegener koagulierender Aktivität; nicht immunogenen, nicht antigenen humanen/äquivalenten oder humanen/äquivalenten/tierischen Faktor VIII; und nicht immunogenen, nicht antigenen humanen/tierischen/äquivalenten Faktor VIII mit überlegener koagulierender Aktivität.
Das hybride Faktor VIII Molekül wird durch Isolierung und Rekombination von humanen und tierischen Faktor VIII Untereinheiten und Bereichen bzw. Domänen gebildet; oder durch genetische Veränderung der humanen und tierischen Faktor VIII Gene.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden rekombinante DNA Verfahren verwendet, um Elemente des tierischen Faktor VIII mit den korrespondierenden Ele menten des humanen Faktor VIII zu substituieren, was zu hybriden humanen/tierischen Faktor VIII Molekülen führt. In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform werden rekombinante DNA Verfahren verwendet, um eine oder mehrere Aminosäuren in dem humanen oder tierischen Faktor VIII oder in einem hybriden humanen/tierischen Faktor VIII gegen Aminosäuren auszutauschen, die keine bekannte Sequenzidentität mit Faktor VIII aufweisen, vorzugsweise eine Sequenz von Aminosäuren, die weniger Immunreaktivität mit den natürlich auftretenden inhibitorischen Antikörpern gegen Faktor VIII („nicht antigene Aminosäuresequenz") aufweist und/oder die weniger dazu neigt, die Bildung von Antikörpern gegen Faktor VIII („nicht immunogene Aminosäuresequenz") als humaner Faktor VIII hervorzurufen. Ein Beispiel einer Aminosäuresequenz, die verwendet werden kann, um eine immunogene oder antigene Sequenz auszutauschen, ist eine Sequenz aus Alaninresten.
In einer anderen Ausführungsform werden Untereinheiten des Faktor VIII aus humanem oder tierischem Plasma isoliert und gereinigt, und hybrider humaner/tierischer Faktor VIII wird entweder durch Mischen der tierischen Untereinheiten der schweren Kette mit den humanen Untereinheiten der leichten Kette oder durch Mischen der humanen Untereinheiten der schweren Kette mit den tierischen Untereinheiten der leichten Kette gebildet, wodurch humane leichte Kette/tierische schwere Kette und humane schwere Kette/tierische leichte Kette Hybridmoleküle gebildet werden. Diese Hybridmoleküle werden durch Ionenaustauschchromatographie isoliert.
Alternativ dazu werden eine oder mehrere Domänen oder partielle Domänen von Faktor VIII aus humanem oder tierischem Plasma isoliert und gereinigt, und hybrider humaner/tierischer Faktor VIII wird durch Mischen der Domänen oder partiellen Domänen aus einer Spezies mit Domänen oder partiellen Domänen der zweiten Spezies gebildet. Die Hybridmoleküle können durch Ionenaustauschchromatographie isoliert werden.
Es werden Verfahren zur Herstellung von hoch gereinigtem hybriden Faktor VIII beschrieben, welche die Schritten umfassen: (a) Isolierung von Untereinheiten aus von Plasma abgeleitetem humanen Faktor VIII und Untereinheiten aus von Plasma abgeleitetem tierischen Faktor VIII, gefolgt von Rekonstitution von koagulierender Aktivität durch Mischen von humanen und tierischen Untereinheiten, gefolgt von Isolierung von hybridem humanen/tierischen Faktor VIII durch Ionenaustausch-chromatographie; (b) Isolierung von Domänen oder partiellen Domänen aus von Plasma abgeleitetem humanen Faktor VIII und Domänen oder partiellen Domänen aus von Plasma abgeleitetem tierischen Faktor VIII, gefolgt durch Rekonstitution der koagulierende Aktivität durch Mischen von humanen und tierischen Domänen, gefolgt durch Isolierung von hybridem humanen/tierischen Faktor VIII durch Ionen-austauschchromatographie; (c) Konstruktion von Domänen oder partiellen Domänen von tierischem Faktor VIII durch rekombinante DNA Technologie, und rekombinanter Austausch von Domänen von tierischem und humanem Faktor VIII, um hybriden humanen/tierischen Faktor VIII mit koagulierender Aktivität zu bilden; (d) Bildung von hybridem humanen/tierischen Faktor VIII durch Austauschen von spezifischen Aminosäureresten des Faktor VIII von einer Spezies gegen die korrespondierenden einzigartigen Aminosäurereste des Faktor VIII der anderen Spezies; oder (e) Bildung eines hybriden äquivalenten Faktor VIII Moleküls mit humaner oder tierischer Aminosäuresequenz oder beidem, in dem die spezifischen Aminosäurereste des Faktor VIII gegen Aminosäurereste, die keine bekannte Sequenzidentität zu Faktor VIII aufweisen, durch seitengerichtete Mutagenese ausgetauscht sind.
Einige Ausführungsformen von hybridem oder hybridem äquivalenten Faktor VIII weisen eine größere spezifische Aktivität auf als jene von humanem Faktor VIII oder gleich zu oder größer als jener von Faktor VIII vom Schwein. Einige Ausführungsformen des hybriden oder hybriden äquivalenten Faktor VIII weisen gleiche oder geringere Immunreaktivität mit inhibitorischen Antikörpern gegen Faktor VIII und/oder geringere Immunogenität in Menschen oder Tieren, im Vergleich zu humanem oder Faktor VIII vom Schwein auf.
Ebenfalls bereitgestellt werden pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Patienten mit Faktor VIII Defizienzen, umfassend das Verabreichen des hybriden oder hybriden äquivalenten Faktor VIII.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A–1H stellen zusammen genommen einen ausgerichteten Sequenzvergleich der Faktor VIII Säuresequenzen des Menschen, des Schweins und der Maus bereit.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER DEFINITIONEN DER ERFINDUNG
Außer es ist anders beschrieben oder angegeben, bedeutet, so wie hier verwendet, "Faktor VIII" irgendein funktionelles Faktor VIII Proteinmolekül von irgendeinem Tier, irgendeinem hybriden Faktor VIII oder einem modifizierten Faktor VIII, "hybrider Faktor VIII" oder "hybrides Protein" bezeichnet irgendein funktionelles Faktor VIII Proteinmolekül oder Fragment davon, umfassend eine Faktor VIII Aminosäuresequenz vom Menschen, vom Schwein und/oder nicht humanen, nicht vom Schwein abgeleiteten Säugerspezies. Solche Kombinationen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf irgendwelche oder alle der folgenden hybriden Faktor VIII Moleküle oder Fragmente davon: (1) human/vom Schwein stammend: (2) human/nicht human, andere Säuger als vom Schwein stammend, wie human/Maus; (3) vom Schwein stammend/nicht human, andere Säuger als vom Schwein stammend, wie Maus/Hund. Solche Kombinationen schließen auch hybride Faktor VIII äquivalente Moleküle oder Fragmente davon ein, wie unten weiter definiert ist, umfassend eine Faktor VIII Aminosäuresequenz hybriden, humanen, vom Schwein stammenden oder nicht humanem, nicht vom Schwein stammenden Säugerursprungs, in der eine Aminosäuresequenz mit keiner bekannten Sequenzidentität zu Faktor VIII substituiert ist. Solche hybriden Kombinationen schließen auch eine hybride Faktor VIII Aminosäuresequenz ein, die von mehr als zwei Spe zies abgeleitet ist, wie Mensch/Schwein/Maus, oder von zwei oder mehr Spezies, in der die Aminosäuresequenz, die keine bekannte Sequenzidentität zu Faktor VIII aufweist, substituiert ist. Außer es ist anders angegeben, schließt "hybrider Faktor VIII" Fragmente des hybriden Faktor VIII ein, die, wie unten in einer exemplarischen Ausführungsform beschrieben ist, als Sonden für Forschungszwecke oder als diagnostische Reagenzien verwendet werden können.
So wie hier verwendet, schließt "Säuger Faktor VIII" einen Faktor VIII mit einer Aminosäuresequenz ein, die von irgendeinem nicht humanen Säuger abgeleitet ist, außer es ist anders angegeben. "Tier" bzw. "tierisch", so wie hier verwendet, betrifft das Schwein und andere nicht humane Säuger.
Ein "Fusionsprotein" oder "Fusionsfaktor VIII oder ein Fragment davon", so wie hier verwendet, ist das Produkt eines hybriden Gens, in dem die kodierende Sequenz für ein Protein extensiv verändert ist, z.B. durch Fusionieren eines Teils von ihm an die kodierende Sequenz für ein zweites Protein von einem anderen Gen, um ein hybrides Gen herzustellen, welches das Fusionsprotein kodiert. So wie hier verwendet, ist ein Fusionsprotein ein Untersatz des hybriden Faktor VIII Proteins, das in dieser Anmeldung beschrieben ist.
Eine "korrespondierende" Nukleinsäure oder Aminosäure oder Sequenz von beiden, so wie hier verwendet, ist eine, die an einer Stelle in einem Faktor VIII oder einem hybriden Faktor VIII Molekül oder Fragment davon anwesend ist, das die selbe Struktur und/oder Funktion wie die Stelle in dem Faktor VIII Molekül einer anderen Spezies aufweist, obwohl die Nukleinsäure- oder Aminosäurezahl nicht identisch sein muss. Eine Sequenz, die "korrespondierend ist zu" einer anderen Faktor VIII Sequenz, korrespondiert im Wesentlichen zu einer solchen Sequenz und hybridisiert mit der Sequenz der angegebenen SEQ ID NR. unter stringenten Bedingungen. Eine Sequenz, die "korrespondierend ist zu" einer anderen Faktor VIII Sequenz, schließt auch eine Sequenz ein, die zu der Expression eines Faktor VIII oder eines beanspruchten prokoagulierenden hybriden Faktor VIII oder Frag ment davon führt und an die angegebene SEQ ID NR. aufgrund der Redundanz des genetischen Kodes hybridisieren würde.
Ein/eine "einzigartige/r" Aminosäurerest oder Sequenz, so wie hier verwendet, betrifft eine Aminosäuresequenz oder einen Rest in dem Faktor VIII Molekül einer Spezies, die/der verschieden ist von dem homologen Rest oder der Sequenz in dem Faktor VIII Molekül einer anderen Spezies.
"Spezifische Aktivität", so wie hier verwendet, betrifft die Aktivität, die den koagulierenden Defekt eines humanen Faktor VIII defizienten Plasmas korrigieren wird. Die spezifische Aktivität wird in Einheiten von Gerinnungsaktivität pro mg Gesamtfaktor VIII Protein in einem Standardassay gemessen, in dem die Gerinnungszeit des humanen Faktor VIII defizienten Plasmas mit jener von normalem humanen Plasma verglichen wird. Eine Einheit der Faktor VIII Aktivität ist die Einheit, die in einem Milliliter von normalem humanen Plasma anwesend ist. In dem Assay bedeutet, je kürzer die Zeit für die Gerinselbildung ist, desto größer ist die Aktivität des untersuchten Faktor VIII. Hybrider humaner/vom Schwein stammender Faktor VIII weist eine koagulierende Aktivität in einem humanen Faktor VIII Assay auf. Diese Aktivität, ebenso wie jene von anderen hybriden oder hybriden äquivalenten Faktor VIII Molekülen oder Fragmente davon, kann geringer, gleich oder größer sein als jene von entweder Plasma abgeleitetem oder rekombinantem humanen Faktor VIII.
Die humane Faktor VIII cDNA Nukleotid- und vorhergesagten Aminosäuresequenzen sind jeweils in den SEQ ID NR: 1 und 2 gezeigt. Der Faktor VIII wird als ein ungefähr 300 kDa einzelkettiges Protein mit einer inneren Sequenzhomologie synthetisiert, welche die "Domänen" Sequenz NH₂-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH definiert. In einem Faktor VIII Molekül ist eine "Domäne", so wie hier verwendet, eine kontinuierliche Sequenz einer Aminosäure, die durch innere Aminosäuresequenzidentität und Stellen der proteolytischen Spaltung durch Thrombin definiert ist. Außer es ist anders angegeben, schließen Faktor VIII Domänen die folgenden Aminosäurereste ein, wenn die Sequenzen mit der humanen Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 2) ausgerichtet sind: A1, Reste Ala1-Arg372; A2, Reste Ser373-Arg740; B, Reste Ser741-Arg1648; A3, Reste Ser1690-Ile2032; C1, Reste Arg2033-Asn2172; C2, Reste Ser2173-Tyr2332. Die A3-C1-C2 Sequenz schließt die Reste Ser1690-Tyr2332 ein. Die verbleibende Sequenz, die Reste Glu1649-Arg1689, wird für gewöhnlich als das Faktor VIII leichte Kette Aktivierungspeptid bezeichnet. Der Faktor VIII wird proteolytisch durch Thrombin oder Faktor Xa aktiviert, die ihn von dem von Willebrand Faktor dissoziieren, Faktor VIIIa bilden, der prokoagulierende Funktion aufweist. Die biologische Funktion von Faktor VIIIa ist es, die katalytische Effizienz von Faktor XIa gegenüber Faktor X Aktivierung um einige Größenordnungen zu erhöhen. Der Thrombin aktivierte Faktor VIIIa ist ein 160 kDa A1/A2/A3-C1-C2 Heterotrimer, das einen Komplex mit dem Faktor IXa und dem Faktor X auf der Oberfläche von Plättchen oder Monozyten bildet. Eine "partielle Domäne", so wie hier verwendet, ist eine kontinuierliche Sequenz aus Amiosäuren, die einen Teil einer Domäne bilden.
"Untereinheiten" von humanem oder tierischem Faktor VIII, so wie hier verwendet, sind die schweren und leichten Ketten des Proteins. Die schwere Kette von Faktor VIII enthält drei Domänen, A1, A2 und B. Die leichte Kette von Faktor VIII enthält auch drei Domänen, A3, C1 und C2.
Der hybride Faktor VIII oder ein Fragment davon kann hergestellt werden (1) durch Austausch von isolierten, Plasma-abgeleiteten tierischen Untereinheiten oder humanen Untereinheiten (schwere oder leichte Ketten) gegen korrespondierende humane Untereinheiten oder tierische Untereinheiten; (2) durch Austausch von humanen Domänen oder tierischen Domänen (A1, A2, A3, B1, C1 und C2) gegen korrespondierende tierische Domänen oder humane Domänen; (3) durch Austausch von Teilen von humanen Domänen oder tierischen Domänen gegen Teile von tierischen Domänen oder humanen Domänen; (4) durch Austausch von mindestens einer spezifischen Sequenz, die mindestens eine oder mehrere einzigartige humane oder tierische Aminosäuresequenz(en) einschließt, gegen die korrespondierende/n tierische/n oder humane/n Aminosäuresequenz(en); oder (5) durch Austausch einer Aminosäuresequenz, die keine bekannte Sequenzidentität zu dem Faktor VIII aufweist, gegen mindestens eine Sequenz, die mindestens eine oder mehrere spezifische Aminoäurerest(e) in humanem, tierischem oder hybridem Faktor VIII oder Fragmenten davon einschließt. Ein "B domänenloser" hybrider Faktor VIII, hybrider äquivalenter Faktor VIII oder ein Fragment von beiden, so wie hier verwendet, betrifft irgendeines der hybriden Faktor VIII Konstrukte, die hier beschrieben sind, denen die B Domäne fehlt.
Die Begriffe "Epitop", "antigene Stelle" und "antigene Determinante", so wie hier verwendet, werden synonym verwendet und sind als ein Abschnitt des humanen, tierischen, hybriden oder hybriden äquivalenten Faktor VIII oder eines Fragments davon definiert, das spezifisch durch einen Antikörper erkannt wird. Es kann aus irgendeiner Zahl von Aminosäureresten bestehen, und es kann von der primären, sekundären oder tertiären Struktur des Proteins abhängen. In Übereinstimmung mit dieser Offenbarung kann ein hybrider Faktor VIII, ein hybrides Faktor VIII Äquivalent oder ein Fragment von beiden, das mindestens ein Epitop einschließt, als ein Reagens in den unten beschriebenen diagnostischen Assays verwendet werden. In einigen Ausführungsformen ist ein hybrider oder hybrider äquivalenter Faktor VIII oder ein Fragment davon nicht kreuzreaktiv oder weniger kreuzreaktiv mit allen natürlich vorkommenden inhibitorischen Faktor VIII Antikörpern als humaner oder vom Schwein stammender Faktor VIII.
Der Begriff "immunogene Stelle", so wie hier verwendet, ist definiert als eine Region des humanen oder tierischen Faktor VIII, hybriden oder hybriden äquivalenten Faktor VIII oder eines Fragments davon, das spezifisch die Bildung von Antikörper gegen Faktor VIII, ein Hybrid, ein Hybrid-Äquivalent oder ein Fragement in einem Menschen oder einem Tier hervorruft, wie durch Routineprotokolle, wie Immunassay, z.B. ELISA, oder dem Bethesda Assay, der hier beschrieben ist, gemessen wird. Sie kann aus irgendeiner Anzahl von Aminosäureresten bestehen, und sie kann von der Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur des Protein abhängen. In einigen Ausführungsformen ist der hybride oder hybride äquivalente Faktor VIII oder ein Fragment davon nicht immunogen oder weniger immunogen in einem Tier oder einem Menschen als der humane oder vom Schwein stammende Faktor VIII.
So wie hier verwendet, ist ein "hybrides Faktor VIII äquivalentes Molekül oder Fragment davon" oder ein "hybrider äquivalenter Faktor VIII oder ein Fragment davon" ein aktives Faktor VIII oder hybrides Faktor VIII Molekül oder Fragment davon, das mindestens eine Sequenz einschließlich einem oder mehreren Aminosäurereste/n umfasst, der/die keine bekannte Identität zu der humanen oder tierischen Faktor VIII Sequenz aufweist, ausgetauscht gegen mindestens eine Sequenz einschließlich einer oder mehreren spezifischen Aminosäurereste/n in dem humanen, tierischen oder hybriden Faktor VIII oder Fragmente davon. Die Sequenz eines oder mehrerer Aminosäurereste, die keine bekannte Identität zu einer humanen oder tierischen Faktor VIII Sequenz aufweisen, wird hier auch als eine "nicht Faktor VIII Aminosäuresequenz" bezeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist/sind die Aminosäure/n, die keine bekannte Sequenzidentität mit der Faktor VIII Sequenz aufweist/aufweisen, Alaninreste. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform schließt die spezifische Faktor VIII Sequenz, gegen welche die Aminosäure/n mit keiner bekannten Sequenzidentität zu einer Faktor VIII Sequenz ausgetauscht wurde, eine antigene Stelle ein, die immunreaktiv mit natürlich vorkommenden Faktor VIII inhibitorischen Antikörpern ist, so dass das daraus resultierende hybride Faktor VIII äquivalente Molekül oder Fragment davon, weniger immunreaktiv oder nicht immunreaktiv mit Faktor VIII inhibitorischen Antikörpern ist. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform schließt die spezifische hybride Faktor VIII Sequenz, gegen welche die Aminosäure/n mit keiner bekannten Sequenzidentität zu der Faktor VIII Sequenz ausgetauscht wurde/n, eine immunogene Stelle ein, welche die Bildung von Faktor VIII inhibitorischen Antikörpern in einem Tier oder einem Menschen hervorruft, so dass das resultierende hybride Faktor VIII äquivalente Molekül oder Fragment davon weniger immunogen ist.
"Faktor VIII Deffizienz", so wie hier verwendet, schließt eine Deffizienz in der Gerinnungsaktivität ein, die verursacht wird durch die Bildung von defektem Faktor VIII, durch inadäquate oder keine Bildung von Faktor VIII oder durch partielle oder vollständige Inhibierung von Faktor VIII durch Inhibitoren. Hämophilie A ist eine Art von Faktor VIII Defizienz, die aus einem Defekt in einem X-verknüpften Gen und der Abwesenheit oder Defizienz des Faktor VIII Proteins, das es kodiert, herrührt.
So wie hier verwendet, schließt "diagnostische Assays" Assays ein, die in einer Weise die Antigen-Antikörper Interaktion verwenden, um die Menge eines bestimmten Antikörpers, der in einer Testprobe anwesend ist, nachzuweisen und/oder zu quantifizieren, um bei der Auswahl von medizinischen Therapien zu helfen. Es gibt viele solche Assays, die dem Fachmann bekannt sind. So wie hier verwendet, können die hybride oder hybride äquivalente Faktor VIII DNA oder ein Fragment davon und ein davon exprimiertes Protein, im Ganzen oder zum Teil gegen die entsprechenden Reagenzien in den ansonsten bekannten Assays ausgetauscht werden, wodurch die modifizierten Assays verwendet werden können, um Antikörper gegen den Faktor VIII nachzuweisen und/oder zu quantifizieren. Es ist die Verwendung dieser Reagenzien, der hybriden oder hybrid äquivalenten Faktor VIII DNA oder eines Fragments davon oder eines davon exprimierten Proteins, die/das die Modifikation von bekannten Assays für den Nachweis von Antikörpern gegen humanen oder tierischen Faktor VIII oder gegen einen hybriden humanen/tierischen Faktor VIII erlaubt/erlauben. Solche Assays schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf ELISAs, Immundiffusionsassays und Immunoblots. Geeignete Verfahren zur Durchführung irgendeines dieser Assays sind dem Fachmann bekannt. So wie hier verwendet, kann ein hybrider oder hybrider äquivalenter Faktor VIII oder ein Fragment davon, der/das mindestens ein Epitop des Proteins einschließt, als ein diagnostisches Reagens verwendet werden. Beispiele von anderen Assays, in denen der hybride oder hybride äquivalente Faktor VIII oder ein Fragment davon verwendet werden kann, schließt den Bethesda Assay und Antikoagulationsassays ein.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER VERFAHREN
Die US Serial Nr. 07/864,004 beschreibt die Entdeckung von hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII Molekülen mit koagulierender Aktivität, in denen Elemente des Faktor VIII Moleküls vom Menschen oder vom Schwein gegen die entsprechenden Elemente aus dem Faktor VIII Molekül der anderen Spezies ausgetauscht sind. Die US Serial Nr. 08/212,133 und die PCT/US94/13200 beschreiben prokoagulierende hybride humane/tierische und hybride äquivalente Faktor VIII Moleküle, in denen Elemente des Faktor VIII Moleküls der einen Spezies gegen die entsprechenden Elemente des Faktor VIII Moleküls der anderen Spezies ausgetauscht sind.
Die vorliegende Erfindung stellt hybride humane/tierische, tierische/tierische und äquivalente Faktor VIII Moleküle und Fragmente davon, und die Nukleinsäuresequenzen, die solche Hybride kodieren, bereit, von denen einige eine größere koagulierende Aktivität in einem Standard Gerinnungsassay aufweisen, wenn sie mit hochgereinigtem humanen Faktor VIII verglichen werden; und/oder die weniger immunreaktiv gegen inhibitorische Antikörper gegen humanen oder vom Schwein stammenden Faktor VIII sind, als humaner oder vom Schwein stammender Faktor VIII; und/oder die weniger immunogen in einem Menschen oder einem Tier als humaner oder vom Schwein stammender Faktor VIII sind. Diese hybriden Faktor VIII-Moleküle werden wie folgt konstruiert.
Mindestens fünf Arten von aktiven hybriden humanen/vom Schwein stammenden oder hybride äquivalente Faktor VIII-Moleküle oder Fragmente davon, die Nukleinsäuresequenzen, die diese hybriden Faktor VIII-Moleküle kodieren und die Verfahren zu ihrer Herstellung sind hier offenbart: Jene erhalten (1) durch Austauschen einer humanen oder vom Schwein stammenden Untereinheit (d.h. schwere Kette oder leichte Kette) gegen die entsprechende vom Schwein stammende oder humane Untereinheit; (2) durch Austauschen einer oder mehrerer humaner oder vom Schwein stammender Domäne/n (d.h. A1, A2, A3, B, C1 und C2) gegen die entsprechende/n vom Schwein stammende/n oder humane/n Domäne/n; (3) durch Austauschen eines kontinuierlichen Teils von einer oder mehreren humanen oder vom Schwein stammenden Domäne/n gegen den entsprechenden Teil eines oder mehrerer vom Schwein stammender oder humaner Domäne/n; (4) durch Austauschen mindestens einer spezifischen Sequenz, einschließlich einer oder mehrerer einzigartiger Aminosäure Reste in dem humanen oder vom Schwein stammenden Faktor VIII gegen die entsprechende vom Schwein stammende oder humane Sequenz; und (5) durch Austauschen mindestens einer Sequenz, einschließlich oder mehrerer Aminosäure Reste mit keiner bekannten Sequenzidentität zu Faktor VIII ("nicht Faktor VIII Aminosäuresequenz") gegen mindestens eine spezifische Sequenz eines oder mehrerer Aminosäuren in einem humanen, vom Schwein stammenden, oder hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII.
Mindestens fünf Arten der aktiven hybriden humanen/nicht humanen, nicht vom Schwein stammenden Säuger oder hybriden äquivalenten Faktor VIII-Moleküle oder Fragmente davon und die Nukleinsäuresequenzen, die sie kodieren, können ebenfalls durch dieselben Verfahren hergestellt werden: jene erhalten (1) durch Austauschen einer humanen oder nicht humanen, nicht vom Schwein stammenden Säuger Untereinheit (d.h. schwere Kette oder leichte Kette) gegen die entsprechende nicht humane, nicht vom Schwein stammende Säuger oder humane Untereinheit; (2) durch Austauschen einer oder mehrerer humaner oder nicht humaner, nicht vom Schwein stammender Säuger Domäne/n (d.h. A1, A2, A3, B, C1 und C2) gegen die entsprechende nicht humane, nicht vom Schwein stammende Säuger oder humane Domäne/n; (3) durch Austauschen eines kontinuierlichen Teils einer oder mehrerer humaner oder nicht humaner, nicht vom Schwein stammender Säuger Domäne/n gegen den entsprechenden Teil einer oder mehrerer nicht humaner, nicht vom Schwein stammender Säuger oder humaner Domäne/n; (4) durch Austauschen mindestens einer spezifischen Sequenz einschließlich einer oder mehrerer einzigartiger Aminosäure Reste in dem humanen oder nicht humanen, nicht vom Schwein stammenden Säuger Faktor VIII gegen die entsprechende nicht humane, nicht vom Schwein stammende Säuger oder humane Sequenz; und (5) durch Austauschen mindestens einer Sequenz einschließlich einem oder mehrerer Aminosäure Rest/e mit keiner bekannten Sequenzidentität zu Faktor VIII ("nicht Faktor VIII Aminosäuresequenz") gegen mindestens eine spezifische Sequenz einer oder mehrerer Aminosäure/n in dem humanen, nicht huma nen, nicht vom Schwein stammenden Säuger, oder hybriden humanen/nicht humanen, nicht vom Schwein stammenden Säuger Faktor VIII.
Weiterhin wird der Fachmann einfach erkennen, dass dieselben Verfahren verwendet werden können, um mindestens fünf Arten von aktiven hybriden Faktor VIII-Molekülen oder Fragmenten davon herzustellen, die den Arten (1) – (5) in den vorherigen zwei Absätzen entsprechen, die eine Faktor VIII Aminosäuresequenz aus zwei oder mehr nicht humanen Säugern, wie Schwein/Maus umfassen, und weiterhin eine nicht Faktor VIII Aminosäuresequenz umfassen.
Hybride humane/tierische, tierische/tierische und äquivalente Faktor VIII Proteine oder Fragmente davon, die oben unter den Gruppen (1) – (3) aufgelistet sind, werden hergestellt durch Isolierung von Untereinheiten, Domänen oder kontinuierlichen Teilen von Domänen von Plasma abgeleitetem Faktor VIII, gefolgt durch Rekonstitution und Reinigung. Hybride humane/tierische, tierische/tierische und äquivalente Faktor VIII Proteine oder Fragmente davon, die oben unter den Gruppen (3) – (5) beschrieben sind, werden durch rekombinante DNA Verfahren hergestellt. Das hybride Molekül kann einen größeren oder geringeren Prozentsatz von humaner als tierischer Sequenz enthalten, in Abhängigkeit von dem Ursprung der verschiedenen Regionen, wie im Detail unten beschrieben ist.
Weil die gegenwärtigen Informationen anzeigen, dass die B Domäne kein inhibitorisches Epitop aufweist und keinen Effekt auf die Faktor VIII Funktion aufweist, ist in einigen Ausführungsformen die B Domäne in den aktiven Hybriden oder hybriden äquivalenten Faktor VIII Molekülen oder Fragmenten davon ("B(–) Faktor VIII"), die durch irgendeines der hier beschriebenen Verfahren hergestellt sind, deletiert.
Es ist in Beispiel 4 gezeigt, dass hybrider humaner/vom Schwein stammender Faktor VIII, der eine schwere Kette vom Schwein und eine humane leichte Kette aufweist und dem ersten Typ des Hybrids entspricht, die oben aufgelistet sind, eine größere koagulierende Aktivität in einem Standard Gerinnungsassay im Ver gleich zu dem humanen Faktor VIII aufweist. Der hybride humane/tierische oder äquivalente Faktor VIII mit koagulierender Aktivität, ob die Aktivität höher, gleich oder niedriger ist als von humanem Faktor VIII, kann in der Behandlung von Patienten mit Inhibitoren verwendet werden, weil diese Inhibitoren weniger mit hybriden humanen/tierischen oder äquivalentem Faktor VIII als mit entweder humanem oder vom Schwein stammendem Faktor VIII reagieren können.
Herstellung von hybriden Faktor VIII Molekülen aus isolierten humanen und tierischen Faktor VIII Untereinheiten durch Rekonstitution:
Die vorliegende Erfindung stellt hybride humane/tierische Faktor VIII Moleküle oder Fragmente davon, mit Austauschen von Untereinheit Substitutionen, die Nukleinsäuresequenzen, die diese Hybride kodieren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Isolierung und Verfahren zur Charakterisierung ihrer prokoagulierender Aktivität bereit. Ein Verfahren, das aus Verfahren modifiziert ist, die von Fay, P.J. et al., 265 J. Biol. Chem. 6197 (1990); und Lollar, J.S., et al., 263 J. Biol. Chem. 10451 (1988) beschrieben ist, schließt die Isolierung von Untereinheiten (schwere und leichte Ketten) von humanem und tierischem Faktor VIII, gefolgt von Rekombination der humanen schweren Kette und tierischen leichten Kette oder von Rekombination der humanen leichten Kette und der tierischen schweren Kette ein.
Die Isolierung von sowohl humanen als auch tierischen individuellen Untereinheiten schließt die Dissoziation des leichte Kette/schwere Kette Dimers ein. Dies wird zum Beispiel durch Chelatieren von Calcium mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), gefolgt von monoS^TM HPLC (Pharmacia-LKB, Piscataways, NJ) erreicht. Hybride humane/tierische Faktor VIII Moleküle werden aus isolierten Untereinheiten in der Anwesenheit von Calcium rekonstituiert. Hybrider humane leichte Kette/tierische schwere Kette oder tierische leichte Kette/humane schwere Kette Faktor VIII wird aus nicht umgesetzten schweren Ketten durch monoS^TM HPLC durch Verfahren für die Isolierung von vom Schwein stammenden Faktor VIII, wie beschrieben wurde von Lollar, J.S., et al., 71 Blood 137-143 (1988) isoliert.
Diese Verfahren, die in einer Ausführungsform verwendet werden, um aktiven hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII herzustellen, die im Detail in den Beispielen unten beschrieben ist, führen zu hybriden humanen leichte Kette/vom Schwein stammende schwere Kette Molekülen mit einer größer als sechsfachen der prokoagulierenden Aktivität des humanen Faktor VIII.
Andere hybride humane/nicht humane, nicht vom Schwein stammende Säuger Faktor VIII Moleküle können hergestellt, isoliert und hinsichtlich Aktivität durch dieselben Verfahren charakterisiert werden. Der Fachmann wird einfach erkennen, dass diese Verfahren auch verwendet werden können, um hybriden tierischen/tierischen Faktor VIII, wie Schwein/Maus, herzustellen, zu isolieren und hinsichtlich der Aktivität zu charakterisieren, wobei die leichte oder schwere Kette einer Spezies mit der schweren oder leichten Kette der anderen Spezies kombiniert wird.
Herstellung von hybriden Faktor VIII Molekülen aus isoliertem humanen und tierischen Faktor VIII Domänen durch Rekonstitution:
Die vorliegende Erfindung stellt hybride humane/tierische Faktor VIII Moleküle oder Fragmente davon mit Domänen Austauschen bzw. Substitutionen, die Nukleinsäuresequenzen, die sie kodieren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Isolierung, und Verfahren zur Charakterisierung ihrer prokoagulierenden Aktivität bereit. Ein Verfahren schließt die Isolierung einer oder mehrerer Domänen des humanen und einer oder mehrerer Domänen des tierischen Faktor VIII, gefolgt durch Rekombination von humanen und tierischen Domänen, um einen hybriden humanen/tierischen Faktor VIII mit koagulierender Aktivität zu bilden, ein, wie von Lollar P., et al., 267(33) J. Biol. Chem. 23652-13657 (25. Nov. 1992) für den humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII beschrieben ist.
Insbesondere wird ein hybrider humaner/vom Schwein stammender Faktor VIII mit der Sustitution der vom Schwein stammenden A2 Domäne gegen die humane A2 Domäne bereitgestellt, wobei diese Ausführungsform ein Verfahren darstellt, durch das ein Domänen substituierter hybrider humaner/nicht humaner, nicht vom Schwein stammender Säuger Faktor VIII konstruiert werden kann. Plasma abgeleitete, nicht humane, nicht vom Schwein stammende Säuger und humane A1/A3-C1-C2 Dimere werden durch die Dissoziation der A2 Domäne von dem Faktor VIIIa isoliert. Dies wird zum Beispiel in der Anwesenheit von NaOH erreicht, wonach das Gemisch verdünnt und das Dimer unter Verwendung von monoS^TM HPLC (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) eluiert wird. Die A2 Domäne wird aus dem Faktor VIIIa als ein geringerer Bestandteil in der monoS^TM HPLC isoliert. Hybride humane/tierische Faktor VIII Moleküle werden durch Mischen äquivalenter Volumina der A2 Domäne der einen Spezies und dem A1/A3-C1-C2 Dimer der anderen Spezies rekonstituiert.
Hybride humane/tierische Faktor VIII oder Fragmente davon mit einer oder mehrere Domänen Substitutionen wird/werden aus dem Gemisch von nicht umgesetzten Dimeren und A2 durch monoS^TM HPLC durch Verfahren für die Isolierung von vom Schwein stammendem Faktor VIII isoliert, wie beschrieben ist von Lollar, J.S., et al., 71 Blood 137-143 (1988). Es können auch Routineverfahren verwendet werden, um die A1, A3, C1, C2 und B Domänen des Faktor VIII von anderen Spezies herzustellen und zu isolieren, wobei irgendeine oder mehrere gegen die korrespondierende Domäne in dem Faktor VIII einer anderen Spezies substituiert werden kann/können. Der Fachmann wird einfach erkennen, dass diese Verfahren auch verwendet werden können, um Domänen substituierten hybriden tierischen/tierischen Faktor VIII, wie Schwein/Maus herzustellen, zu isolieren und hinsichtlich Aktivität zu charakterisieren.
Diese Verfahren, die im Detail in den Beispielen unten beschrieben sind, führen zu hybriden Faktor VIII Molekülen mit prokoagulierender Aktivität.
Herstellung von hybriden Faktor VIII Molekülen durch rekombinantes Engineering der Sequenzen, die humane, tierische und hybride Faktor VIII Untereinheiten, Domänen oder Teile von Domänen kodieren:
Substitution von Untereinheiten, Domänen, kontinuierlichen Teilen von Domänen:
Die vorliegende Erfindung stellt, aktive rekombinante hybride humane/tierische und hybride äquivalente Faktor VIII Moleküle und Fragmente davon mit Untereinheit, Domänen und Aminosäuresequenz Substitutionen, die Nukleinsäuresequenzen, welche diese Hybride kodieren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Isolierung und Verfahren zur Charakterisierung ihrer Koagulanz, immunreaktiven und immunogenen Eigenschaften bereit.
Das humane Faktor VIII Gen wurde isoliert und in Säugerzellen exprimiert, wie berichtet von Toole, J.J., et al., 312 Nature 342-347 (1984) (Genetics Institute); Gitschier, J., et al., 312 Nature 326-330 (1984) (Genentech); Wood, W.I., et al., 312 Nature 330-337 (1984) (Genentech); Vehar, G.A., et al., 312 Nature 337-342 (1984) (Genentech); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; US Patent Nr. 4,757,006, und die Aminosäuresequenz wurde aus cDNA abgeleitet. Das US Patent Nr. 4,965,199 an Capon et al. offenbart ein rekombinantes DNA Verfahren für die Herstellung von Faktor VIII in Säuger Wirtszellen und die Reinigung von humanem Faktor VIII. Über die humane Faktor VIII Expression in CHO (Chinesische Hamster Ovar) Zellen und BHKC (Baby Hamster Nierenzellen) wurde ebenfalls berichtet. Der humane Faktor VIII wurde modifiziert, um einen Teil oder die vollständige B Domäne zu deletieren (US Patent Nr. 4,868,112), und der Austausch der humanen Faktor VIII B Domäne gegen die humane Faktor V B Domäne wurde versucht (US Patent Nr. 5,004,803). Die cDNA Sequenz, die den humanen Faktor VIII kodiert, und die vorhergesagte Aminosäuresequenz sind jeweils in den SEQ ID NR: 1 und 2 gezeigt.
Der vom Schwein stammende Faktor VIII wurde isoliert und aus dem Plasma gereinigt (Fass, D.N., et al., 59 Blood 594 (1982)). Die partielle Aminosäuresequenz des vom Schwein stammenden Faktor VIII, die den Anteilen der N terminalen leichten Kette Sequenz mit Homologie zu Ceruloplasmin und dem Koagulationsfaktor V entspricht, und die weitestgehend nicht korrekt angeordnet ist, wurden beschrieben von Church et al., 81 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6934 (1984). Toole, J.J., et al., 312 Nature 342-347 (1984) beschrieben die partielle Sequenzierung des N terminalen Endes von vier Aminosäure Fragmenten des vom Schwein stammenden Faktor VIII, aber sie charakterisierten nicht die Fragmente auf ihre Positionen in dem Faktor VIII Molekül. Die Aminosäuresequenz der B und eines Teils der A2 Domänen des vom Schwein stammenden Faktor VIII wurden berichtet von Toole, J.J., et al., 83 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5939-5942 (1986). Die cDNA Sequenz, welche die vollständige A2 Domäne des vom Schwein stammenden Faktor VIII kodiert und die vorhergesagte Aminosäuresequenz und hybrider humaner/vom Schwein stammender Faktor VIII mit Substitutionen für alle Domänen, alle Untereinheiten und spezifische Aminosäuresequenzen wurden in der US Serial Nr. 07/864,004 mit dem Titel "Hybrid Human/Porcine factor VIII" offenbart, eingereicht am 07. April 1992 von John S. Lollar und Marschall S. Runge, die als US Patent Nr. 5,364,771 am 15. November 1994 erteilt wurde, und in der WO 93/20093. Die cDNA Sequenz, welche die A2 Domäne des vom Schwein stammenden Faktor VIII mit Sequenzidentität in den Resten 373 – 740 im reifen humanen Faktor VIII kodiert, wie in SEQ ID NR: 1 gezeigt, und die vorhergesagte Aminosäuresequenz sind jeweils in den SEQ ID NR: 3 und 4 gezeigt. Kürzlich wurde über die Nukleotid und korrespondierenden Aminosäuresequenzen der A1 und A2 Domänen des vom Schwein stammenden Faktor VIII und über einen chimären Faktor VIII mit Schwein A1 und/oder A2 Domänen, die gegen die korrespondierenden humanen Domänen substituiert wurden, in der WO 94/11503 berichtet.
Sowohl vom Schwein stammender als auch humaner Faktor VIII wurden aus dem Plasma als ein Protein mit zwei Untereinheiten isoliert. Die Untereinheiten, bekannt als die schwere Kette und die leichte Kette, werden durch eine nicht kovalente Bindung zusammengehalten, die Calcium oder andere zweiwertige Metallionen benötigt. Die schwere Kette des Faktor VIII enthält drei Domänen, A1, A2 und B, die kovalent verbunden sind. Die leichte Kette von Faktor VIII enthält auch drei Domänen, als A3, C1 und C2 bezeichnet. Die B Domäne weist keine bekannte biologische Funktion auf und kann aus dem Molekül proteolytisch oder durch rekombinante DNA Technologieverfahren ohne signifikante Veränderung in irgend einem messbaren Parameter des Faktor VIII entfernt werden. Humaner rekombinanter Faktor VIII weist eine ähnliche Struktur und Funktion zu Plasma abgeleitetem Faktor VIII auf, obwohl er nicht glykosyliert ist, außer er wird in Säugerzellen exprimiert.
Sowohl humaner als auch vom Schwein stammender aktivierter Faktor VIII ("Faktor VIIIa") weist drei Untereinheiten aufgrund der Spaltung der schweren Kette zwischen den A1 und A2 Domänen auf. Diese Struktur wird als A1/A2/A3-C1-C2 bezeichnet. Humaner Faktor VIIIa ist nicht stabil unter den Bedingungen, die vom Schwein stammenden Faktor VIIIa stabilisieren, vermutlich aufgrund der schwächeren Assoziation der A2 Untereinheit des humanen Faktor VIIIa. Die Dissoziation der A2 Untereinheit des humanen und vom Schwein stammenden Faktor VIIIa ist mit dem Verlust von Aktivität in dem Faktor VIIIa Molekül assoziiert.
Insbesondere wird als eine exemplarische und eine bevorzugte Ausführungsform ein aktiver rekombinanter hybrider humaner/vom Schwein stammender Faktor VIII mit einer substituierten A2 Domäne, die ihn kodierende Nukleinsäuresequenz und die Verfahren zur Herstellung, Isolierung und Charakterisierung seiner Aktivität bereitgestellt. Die Verfahren, durch die dieses hybride Konstrukt hergestellt wird, können auch verwendet werden, um einen aktiven rekombinanten hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII oder Fragmente davon mit Substitutionen von Untereinheiten, kontinuierlichen Teilen von Domänen oder anderen Domänen als A2 herzustellen. Der Fachmann wird erkennen, dass diese Verfahren auch zeigen, wie andere rekombinante hybride humane/nicht humane, nicht vom Schwein stammende Säuger oder tierische/tierische hybride Faktor VIII Moleküle oder Fragmente davon hergestellt werden können, in denen Untereinheiten, Domänen oder kontinuierliche Teile von Domänen substituiert sind.
Rekombinanter hybrider humaner/vom Schwein stammender Faktor VIII wird hergestellt ausgehend von humaner cDNA (Biogen, Inc.), welche die Faktor VIII Sequenz kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt der Faktor VIII, der von der cDNA kodiert wird, die Domänen A1-A2-A3-C1-C2 ein, er weist die ge samte B Domäne nicht auf, und entspricht den Aminosäure Resten 1 – 740 und 1649 – 2332 von einzelkettigem humanen Faktor VIII (siehe SEQ ID NR: 2), gemäß dem Nummerierungssystem von Wood et al., 312 Nature 330-337 (1984).
Einzelne Untereinheiten, Domänen oder kontinuierliche Teile von Domänen von vom Schwein stammender oder humaner Faktor VIII cDNA kann kloniert und gegen die korrespondierenden humanen oder vom Schwein stammenden Untereinheiten, Domänen oder Teile von Domänen durch etablierte Mutagenese Techniken substituiert werden. Zum Beispiel beschreiben Lubin, I.M., et al., 269(12) J. Biol. Chem. 8639-8641 (März 1994) Techniken für das Substituieren der vom Schwein stammenden A2 Domäne gegen die humane Domäne unter Verwendung geeigneter Restriktionsstellen. Andere Verfahren zum Substituieren irgendeiner willkürlichen Region der Faktor VIII cDNA einer Spezies gegen die Faktor VIII cDNA einer anderen Spezies schließen Spleißen durch überlappende Extension ("SOE") ein, wie beschrieben von Horton, R.M., et al., 217 Meth. Enzymol. 270-279 (1993).
Die hybride Faktor VIII cDNA, die Untereinheiten, Domänen oder Teile von Domänen oder das gesamte hybride cDNA Molekül kodiert, werden in Expressionsvektoren für die abschließende Expression von aktiven hybriden humanen, vom Schwein stammenden Faktor VIII Protein Molekülen in kultivierten Zellen durch etablierte Techniken, kloniert, wie beschrieben von Selden, R.F., "Introduction of DNA into mammalian cells", in Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hrsg. (1991).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine hybride humane/vom Schwein stammende cDNA, die den Faktor VIII kodiert, in dem die vom Schwein stammende Sequenz eine Domäne oder einen Teil einer Domäne kodiert, wie die A2 Domäne oder eine Teildomäne, in einen Säuger Expressionsvektor inseriert, wie ReNeo, um ein hybrides Faktor VIII Konstrukt zu bilden. Eine vorläufige Charakterisierung des hybriden Faktor VIII wird durch Insertion der hybriden cDNA in den ReNeo Säuger Expressionsvektor und die transiente Expression des hybriden Proteins in COS-7 Zellen erreicht. Eine Bestimmung, ob aktives hybrides Protein exprimiert wird, kann anschließend angestellt werden. Das Expressionsvektor Konstrukt wird weiterhin verwendet, um Zellen in Kultur, wie Baby Hamster Nierenzellen, unter Verwendung von Standardverfahren, wie Liposomen vermittelte Transfektion (Lipofectin^TM, Life Technologies, Inc.) stabil zu transifizieren. Die Expression von rekombinantem hybriden Faktor VIII Protein kann zum Beispiel bestätigt werden durch Sequenzieren, Northern und Western Blotten oder Polymerase Kettenreaktion (PCR). Hybrides Faktor VIII Protein in dem Kulturmedium, in dem die Zellen, die stabil das Protein exprimieren, gehalten werden, können präzipitiert, pelletiert, gewaschen und in einem geeigneten Puffer resuspendiert werden, und das rekombinante hybride Faktor VIII Protein kann durch Standardtechniken, einschließlich Immun Affinitätschromatographie unter Verwendung von zum Beispiel monoklonaler Anti A2-Sepharose^TM gereinigt werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird der hybride Faktor VIII, der eine Untereinheit, Domäne oder Aminosäuresequenz Substitutionen umfasst, als ein Fusionsprotein aus einem rekombinanten Molekül exprimiert, in dem eine Sequenz, die ein Protein oder Peptid kodiert, die zum Beispiel die Stabilität, Sekretion, Detektion, Isolierung oder ähnliches verstärkt, an den Ort angrenzend an die Faktor VIII kodierende Sequenz inseriert wird. Etablierte Protokolle für die Verwendung von homologen oder heterologen Spezies Expressionskontrollsequenzen schließen zum Beispiel Promotoren, Operatoren und Regulatoren ein, die in der Herstellung von Fusionsproteinen bekannt und routinemäßig im Stand der Technik verwendet werden. Siehe Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M., et al., Hrsg.), Wiley Interscience, N.Y.
Der gereinigte hybride Faktor VIII oder ein Fragment davon können hinsichtlich Immunreaktivität und koagulierender Aktivität durch Standard Assays untersucht werden, einschließlich zum Beispiel dem Plasma freien Faktor VIII Assay, dem einstufigen Gerinnungsassay und dem Enzym-gebundenen Immunosorbent Assay unter Verwendung von rekombinantem humanen Faktor VIII als einem Standard.
Andere Vektoren, einschließlich sowohl Plasmid und eukaryonter viraler Vektoren, können verwendet werden, um ein rekombinantes Genkonstrukt in eukaryonten Zellen in Abhängigkeit von der Präferenz und der Bewertung des Fachmanns zu exprimieren (siehe zum Beispiel Sambrook et al. Kapitel 16). Andere Vektoren und Expressionssysteme, einschließlich bakterieller, Hefe und Insekten Zellsysteme, können verwendet werden, aber sind aufgrund von Unterschieden in der oder dem Mangel an Glykosylierung nicht bevorzugt.
Rekombinantes humanes Faktor VIII Protein kann in einer Vielzahl von Zellen exprimiert werden, die herkömmlich für die Kultur und rekombinanten Säuger Proteinexpression verwendet werden. Eine bevorzugte Zelllinie, die von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, erhältlich ist, sind Baby Hamster Nierenzellen, die unter Verwendung von Routineverfahren und Medien kultiviert werden.
Dieselben Verfahren, die für die Herstellung von hybridem humanen/vom Schwein stammendem Faktor VIII mit Untereinheit, Domänen oder Aminosäuresequenz Substitutionen eingesetzt werden, können verwendet werden, um ein anderes rekombinantes hybrides Faktor VIII Protein und Fragmente davon und die Nukleinsäuresequenzen, die diese Hybride kodieren, wie human/nicht human, nicht vom Schwein stammender Säuger oder tierisch/tierisch herzustellen. Ausgehend von Primern aus der bekannten humanen DNA Sequenz wurden die murine und ein Teil der vom Schwein stammenden Faktor VIII cDNA kloniert. Faktor VIII Sequenzen von anderen Spezies zur Verwendung in der Herstellung eines hybriden humanen/tierischen oder tierischen/tierischen Faktor VIII Moleküls können unter Verwendung der bekannten humanen und vom Schwein stammenden DNA Sequenz als ein Ausgangspunkt erhalten werden. Andere Techniken, die eingesetzt werden können, schließen PCR Amplifikationsverfahren mit tierischer Gewebe DNA und die Verwendung einer cDNA Bibliothek von dem Tier ein, um die Faktor VIII Sequenz auszuklonieren.
Als eine exemplarische Ausführungsform kann hybrides humanes/Maus Faktor VIII Protein wie folgt hergestellt werden. DNA Klone, die dem Maus Homolog des humanen Faktor VIII Gens entsprechen, wurden isoliert und sequenziert, und die Aminosäuresequenz des Maus Faktor VIII Proteins wurde vorhergesagt, wie beschrieben in Elder, G., et al., (16(2)) Genomics 374-379 (Mai 1993), das auch einen Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenz von Maus, humanen und einem Teil der vom Schwein stammenden Faktor VIII Moleküle einschließt. Die Maus Faktor VIII cDNA Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz sind jeweils in den SEQ ID NR: 5 und SEQ ID NR: 8 gezeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die RNA Amplifikation mit Transkript Sequenzier (RAWTS) Verfahren verwendet werden, wie beschrieben in Sarkar, G., und S.S. Sommer, 244 Science 331-334 (1989). In Kürze sind die Schritte (1) cDNA Synthese mit oligo(dT) oder einem mRNA spezifischen Oligonukleotid Primer; (2) Polymerase Kettenreaktion (PCR), in der eines oder beide Oligonukleotide einen Phagenpromotor enthalten, der an eine Sequenz angeheftet ist, die zu der zu amplifizierenden Region komplementär ist; (3) Transkription mit einem Phagenpromotor; und (4) reverse Transkriptase vermittelte Didesoxysequenzierung des Transkripts, das mit einem Nested (inneren) Oligonukleotid gestartet wird. Zusätzlich dazu, dass es Sequenzinformation aufdeckt, kann dieses Verfahren ein in vitro Translationsprodukt durch Einbauen eines Translationsinitiationssignals in den geeigneten PCR Primer bilden; und es kann verwendet werden, um neue mRNA Sequenzinformationen von anderen Spezies zu erhalten.
Substitution von Aminosäure(n):
Die vorliegende Erfindung stellt aktive rekombinante hybride humane/tierische und tierische/tierische Faktor VIII Moleküle oder Fragmente davon, umfassend mindestes eine Sequenz, die eine oder mehrere einzigartige Aminosäuren der einen Spezies, substituiert gegen die korrespondierende Aminosäuresequenz der anderen Spezies oder Fragmente davon enthält, sowie Nukleinsäuresequenzen, die diese Hybride kodieren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Isolierung, und Verfahren zur Charakterisierung ihrer Koagulanz, immunogenen und immunreaktiven Eigenschaften bereit.
Die A2 Domäne ist notwendig für die prokoagulierende Aktivität des Faktor VIII Moleküls. Studien zeigen, dass der vom Schwein stammende Faktor VIII eine sechsfach größere prokoagulierende Aktivität aufweist als der humane Faktor VIII (Lollar P., und E.T. Parker 266 J. Biol. Chem. 12481-12486 (1991), und dass es erscheint, dass der Unterschied in der koagulierenden Aktivität zwischen humanen und dem vom Schwein stammenden Faktor VIII auf einem Unterschied in der Aminosäuresequenz zwischen einem oder mehreren Resten in den humanen und vom Schwein stammenden A2 Domänen beruht (Lollar, P., et al. J. Biol. Chem. 23652-23657 (1992)). Weiterhin wird angenommen, dass die A2 und C2 Domänen und möglicherweise eine dritte leichte Kette Region in dem humanen Faktor VIII Molekül die Epitope tragen, mit denen, wenn nicht alle, inhibitorischen Antikörper reagieren, gemäß Hoyer, L.W., und D. Scandella, 31 Semin. Hematol. 1-5 (1994).
Rekombinante hybride humane/tierische, tierische/tierische oder äquivalente Faktor VIII Moleküle oder Fragmente davon können durch Substitution mindestens einer spezifischen Sequenz einschließlich einer oder mehreren einzigartigen Aminosäuren aus der A2, C2 und/oder anderen Domänen des Faktor VIII von einer Spezies gegen die korrespondierende Sequenz der anderen Spezies hergestellt werden, wobei die Aminosäuresequenzen, wie detailliert und unten dargestellt ist, zwischen den Molekülen der Spezies unterscheiden. In einer beispielhaften bevorzugten Ausführungsform, die hier beschrieben ist, stellt die vorliegende Erfindung einen aktiven rekombinanten hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII bereit, umfassend eine vom Schwein stammende Aminosäuresequenz, die gegen die korrespondierende humane Aminosäuresequenz ausgetauscht ist, die ein Epitop einschließt, wobei der hybride Faktor VIII eine verringerte oder keine Immunreaktivität mit inhibitorischen Antikörpern gegen Faktor VIII aufweist. In einer weiteren Ausführungsform können auch aktive rekombinante hybride Faktor VIII Moleküle hergestellt werden, die eine Aminosäuresequenz von mehr als einer Spezies, ausgetauscht gegen die korrespondierende Sequenz in einer dritten Spezies aufweisen. Rekombinante hybride äquivalente Moleküle können auch hergestellt werden, die humanen, tierischen oder hybriden Faktor VIII enthalten einschließlich mindestens einer Sequenz, die eine oder mehrere Aminosäuren einschließt, die keine bekannte Sequenzidentität zu Faktor VIII aufweist, wie unten näher beschrieben ist.
Irgendein hybrides Faktor VIII Konstrukt mit einer spezifischen Aminosäure Substitution, wie beschrieben, kann durch Standardverfahren hinsichtlich koagulierender Aktivität und hinsichtlich Reaktivität mit inhibitorischen Antikörpern gegen Faktor VIII für die Identifizierung von hybriden Faktor VIII Molekülen mit gesteigerter koagulierender Aktivität und/oder verringerter Antikörper Immunreaktivität untersucht werden. Es können auch hybride Moleküle identifiziert werden, die eine verringerte koagulierende Aktivität im Vergleich zu humanem oder vom Schwein stammendem Faktor VIII aufweisen, aber die auch eine verringerte Antikörper Reaktivität aufweisen. Der Fachmann wird erkennen, dass hybride Faktor VIII Moleküle oder Fragmente davon mit geringerer, gleicher oder größerer koagulierender Aktivität im Vergleich zu humanem oder vom Schwein stammendem Faktor VIII zur Behandlung von Patienten, die eine Faktor VIII Defizienz aufweisen, verwendet werden können. Die hier beschriebenen Verfahren, um aktiven rekombinanten hybriden humanen, vom Schwein stammenden Faktor VIII mit einem Austausch von spezifischen Aminosäuren herzustellen, können verwendet werden, um ein aktives rekombinantes hybrides humanes/nicht humanes, nicht vom Schwein stammendes Säuger Faktor VIII Protein, einen hybriden tierischen-1/tierischen-2 Faktor VIII und einen hybriden äquivalenten Faktor VIII oder Fragmente davon herzustellen.
Hybride Faktor VIII Moleküle mit veränderter koagulierender Aktivität
Die vorliegende Erfindung stellt prokoagulierende rekombinante hybride humane/tierische, tierische/tierische oder äquivalente Faktor VIII Moleküle oder Fragmente davon bereit, die mindestens eine spezifische Sequenz, einschließlich einer oder mehreren Aminosäuren mit prokoagulierender Aktivität in dem Faktor VIII der einen Spezies ausgetauscht gegen die korrespondierende Aminosäuresequenz des Faktor VIII der anderen Spezies aufweisen, unter Verwendung von etablierten seitengerichteten Mutagenese Techniken, wie hier beschrieben ist. Die spezifischen Sequenzen, die in dem Austausch verwendet werden, werden ausgewählt, und die hybriden Konstrukte werden hergestellt und hinsichtlich koagulierender Aktivität wie folgt untersucht. Insbesondere bereitgestellt wird als eine bevorzugte und exemplarische Ausführungsform ein hybrider humaner/vom Schwein stammender Faktor VIII, der Aminosäure Austausche in der A2 Domäne umfasst. Es wird verstanden, dass der Fachmann diese Verfahren verwenden kann, um andere hybride humane/tierische, tierische/tierische und äquivalente Faktor VIII Moleküle oder Fragmente davon mit veränderter koagulierender Aktivität, vorzugsweise einer gesteigerten koagulierenden Aktivität im Vergleich zu humanem Faktor VIII herzustellen.
Die Basis für die größere koagulierende Aktivität in vom Schwein stammendem Faktor VIII scheint die schnellere spontane Dissoziation der A2 Untereinheit des humanen Faktor VIIIa als des vom Schwein stammenden Faktor VIIIa zu sein, die zum Verlust von Aktivität führt, gemäß Lollar, P., und C.G. Parker, 265 J. Biol. Chem. 1688-1692 (1990); Lollar, P., et al. 267 J. Biol. Chem. 23652-23657 (1992); Fay, P.J., und T.M. Smudzin, 267, J. Biol. Chem. 13246-13250 (1992).
Ein Vergleich der Ausrichtung bzw. des Alignment der Aminosäuresequenzen der humanen und vom Schwein stammenden Faktor VIII A2 Domänen (die Nummerierung der Reste beginnt an Position 373 bezüglich der Gesamtlängen Aminosäuresequenz des humanen Faktor VIII, SEQ ID NR: 2) ist in 1C gezeigt. Zur Herstellung eines hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII Moleküls mit veränderter koagulierender Aktivität sind die anfänglichen Zielkandidaten für die Mutagenese, die sich nach dem Vergleich der humanen und der vom Schwein stammenden A2 Aminosäuresequenzen (jeweils SEQ ID NR: 2 und 6) innerhalb der humanen A2 Domäne zeigten, in Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE I: HUMANE AMINOSÄURESEQUENZ ZIELKANDIDATEN FÜR MUTAGENESE (SEQ ID NR: 2)
Die Tabelle I und die fetten Buchstaben der 1A – 1B zeigen sieben Sequenzen in den Aminosäuresequenzen des Menschen und des Schweins der A2 Domäne (jeweils SEQ ID NR: 2 und 6), die nur 17 Prozent der A2 Domäne bilden, aber 70 Prozent der Sequenzunterschiede zwischen den humanen und vom Schwein stammenden A2 Domänen einschließen.
Ein rekombinantes hybrides humanes/vom Schwein stammendes Konstrukt ist beschrieben, in dem die Aminosäuren Ser373 – Glu604 in der A2 Domäne (Ser373 – Arg740) des humanen Faktor VIII gegen die homologe vom Schwein stammende Sequenz ausgetauscht wurde. Dieses Konstrukt reagiert nicht mit A2 Inhibitoren und weist die gleiche koagulierende Aktivität wie humaner B(–) Faktor VIII auf. Ein Plasma abgeleitetes hybrides Molekül wird beschrieben, das einen vollständigen Austausch der vom Schwein stammenden A2 Domäne in dem humanen Faktor VIII aufweist, der eine gesteigerte koagulierende Aktivität im Vergleich zu humanem Faktor VIII aufweist. Der Vergleich dieser Konstrukte zeigt, dass eine Region zwischen den Resten Asp605 und Arg740 für den Unterschied in der Aktivität zwischen dem humanen und vom Schwein stammenden Faktor VIII verantwortlich ist. Diese Region kann spezifischer durch die systematische Herstellung von rekombinanten hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII Molekülen mit vom Schwein stammenden Austauschen in der Region zwischen Asp605 und Arg740 unter Verwendung von etablierten seitengerichteten Mutagenese Techniken, zum Beispiel durch das "splicing by overlap extension" (SOE) definiert werden, die weitreichend verwendet wurde, um hybride Faktor VIII Moleküle mit vom Schwein stammenden Austauschen in der NH₂-terminalen Region von A2 herzustellen. Diese Moleküle in COS-7 Zellen und Baby Hamster Nierenzellen, wie o ben beschrieben, exprimiert werden. Sie können bis zur Homogenität unter Verwendung von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, wie Heparin-Sepharose^TM und Immun Affinitätschromatographie, gereinigt werden. Die Protein Konzentration kann durch Absorption von ultraviolettem Licht bei A₂₈₀ abgeschätzt werden, und die spezifische Aktivität der Konstrukte kann durch Teilen der koagulierenden Aktivität (gemessen in Einheiten pro ml durch einzelstufigen Gerinnungsassay) durch A₂₈₀ bestimmt werden. Der humane Faktor VIII weist eine spezifische Aktivität von ungefähr 3000-4000 U/A₂₈₀ auf, wohingegen der vom Schwein stammende Faktor VIII eine spezifische Aktivität von ungefähr 20.000 U/A₂₈₀ aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform weist der prokoagulierende rekombinante hybride/vom Schwein stammende Faktor VIII eine spezifische Aktivität von 20.000 U/A₂₈₀ auf und enthält eine minimale Menge eines vom Schwein stammenden Austausches in der A2 Domäne.
So wie hier beschrieben, werden seitengerichtete Mutagenese Techniken verwendet, um ein hybrides Protein mit koagulierender Aktivität zu identifizieren, die erhöht, gleich oder verringert sein kann im Vergleich zu dem humanen Faktor VIII, aber sie ist vorzugsweise erhöht. In einer hybriden humanen/vom Schwein stammenden Ausführungsform sind spezifische humane Sequenzen gegen vom Schwein stammende Sequenzen ausgetauscht, vorzugsweise unter Verwendung des Splicing by Overlap Extensionsverfahrens (SOE), wie von Ho, S.N., et al., 77 Gene 51-59 (1994), und in den Beispielen 7 und 8 beschrieben. Die Oligonukleotid seitengerichtete Mutagenese kann ebenfalls verwendet werden, wie dies geschehen ist, um die Aminosäuresequenz eines Teils der humanen A2 Domäne (siehe Beispiel 7) herauszuloopen. Weil die funktionelle Analyse der Hybride eine koagulierende Aktivität zeigt, kann die Sequenz weiter unterteilt und hinsichtlich der prokoagulierenden Sequenz durch Standard Punktmutationsanalyse Techniken kartiert werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst, dass hybride/s Faktor VIII cDNA und Protein durch Verfahren charakterisiert werden können, die etabliert sind und Routine sind, wie DNA Sequenzierung, Assays für die koagulierende Aktivität, Bestimmung der Masse durch ELISA und durch UV Absorption bei 280 nm von gereinigtem hybriden Faktor VIII, spezifischer koagulierender Aktivität (U/mg), SDS-PAGE des gereinigten hybriden Faktor VIII und ähnlichem. Andere bekannte Verfahren zum Untersuchen von klinischer Wirksamkeit können benötigt werden, wie Aminosäure, Kohlehydrat, Sulfat oder Metallionen Analyse.
Ein rekombinanter hybrider Faktor VIII mit überlegener koagulierender Aktivität im Vergleich zu humanem Faktor VIII kann kostengünstiger herzustellen sein als Plasma abgeleiteter Faktor VIII und kann die für die wirksame Therapie von Faktor VIII Defizienz benötigte Menge von Faktor VIII verringern.
Hybride Faktor VIII Moleküle mit verringerter Immunreaktivität
Epitope, die mit Antikörpern immunreaktiv sind, welche die koagulierende Aktivität des Faktor VIII inhibieren ("Inhibitoren" oder "inhibitorische Antikörper") wurden basierend auf bekannten Struktur-Funktionsverhältnissen in dem Faktor VIII charakterisiert. Wahrscheinlich könnten Inhibitoren durch Zerstören irgendwelcher der makromolekularen Interaktion, die mit der Domänenstruktur des Faktor VIII oder seinen Assoziationen mit dem von Willebrand Faktor, Thrombin, Faktor Xa, Faktor IXa oder Faktor X assoziiert sind, wirken. Jedoch wirken über 90 Prozent der inhibitorischen Antikörper gegen humanen Faktor VIII durch die Bindung von Epitopen, die in der 40 kDa A2 Domäne oder der 20 kDa C2 Domäne des Faktor VIII angeordnet sind, zerstören spezifische Funktionen, die mit diesen Domänen assoziiert sind, wie beschrieben ist von Fulcher et al., 82 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7728-7732 (1985) und Scandella et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6152-6156 (1988). Zusätzlich zu den A2 und C2 Epitopen kann es ein drittes Epitop in der A3 oder C2 Domäne der leichten Kette des Faktor VIII geben, gemäß Scandella et al., 82 Blood 1767-1775 (1993). Die Signifikanz dieses putativen dritten Epitops ist unbekannt, aber es scheint eine kleine Fraktion der Epitop Reaktivität in Faktor VIII zu erklären.
Anti-A2 Antikörper blockieren die Faktor X Aktivierung, wie gezeigt von Lollar et al., 93 J. Clin. Invest. 2497-2504 (1994). Kürzliche Kartierungsstudien durch Deletionsmutagenese, beschrieben von Ware et al., 3 Blood Coagul. Fibrinolysis 703-716 (1992) lokalisierten das A2 Epitop innerhalb einer 20 kDa Region des NH₂-terminalen Endes der 40 kDa A2 Domäne. Kompetitive Immunradiometrische Assays haben gezeigt, dass A2 Inhibitoren entweder ein gemeinsames Epitop oder eng zusammenliegende Epitope erkennen, wie beschrieben von Scandella et al., 67 Thromb. Haemostas. 665-671 (1992), und wie in Beispiel 8 gezeigt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt aktive rekombinante hybride und hybride äquivalente Faktor VIII Moleküle und Fragmente davon, die Nukleinsäuresequenzen, welche die Hybride kodieren, Verfahren zu ihrer Herstellung und Isolierung und Verfahren zu ihrer Charakterisierung bereit. Diese Hybride umfassen humane/tierische, tierische/tierische oder äquivalente hybride Faktor VIII Moleküle, sie umfassen weiterhin mindestens eine spezifische Aminosäuresequenz einschließlich einer oder mehreren einzigartigen Aminosäuren des Faktor VIII einer Spezies, ausgetauscht gegen die korrespondierende Aminosäuresequenz des Faktor VIII der anderen Spezies; oder sie umfassen mindestens eine Sequenz einschließlich einer oder mehreren Aminosäuren mit keiner bekannten Sequenzidentität zu Faktor VIII, ausgetauscht gegen eine spezifische Aminosäuresequenz in dem humanen, tierischen oder hybriden Faktor VIII. Der resultierende hybride Faktor VIII weist eine verringerte oder keine Immunreaktivität gegenüber Faktor VIII inhibitorischen Antikörpern im Vergleich zu humanen oder vom Schwein stammendem Faktor VIII auf.
Unter Verwendung des Ansatzes, der in dem vorigen Abschnitt für den Austausch von Aminosäuren in dem Faktor VIII Molekül beschrieben ist, wird die Mutationsanalyse eingesetzt, um eine entsprechende Faktor VIII Aminosäuresequenz der einen Spezies, vorzugsweise vom Schwein, auszuwählen, die gegen mindestens eine Sequenz einschließlich einer oder mehreren Aminosäuren in dem Faktor VIII der anderen Spezies, vorzugsweise vom Mensch, oder gegen eine Aminosäuresequenz eines hybriden äquivalenten Faktor VIII Moleküls ausgetauscht ist, die eine oder mehrere kritische Region/en in der A2, C2 oder irgendeiner anderen Domäne, gegen die inhibitorische Antikörper gerichtet sind, einschließt. Die Verfahren sind detaillierter unten beschrieben. Das resultierende prokoagulierende rekombinante hybride Konstrukt weist eine verringerte oder keine Immunreaktivität gegenüber inhibitorischen Antikörpern, im Vergleich zu humanem Faktor VIII, unter Verwendung von Standard Assays, auf. Durch den systematischen Austausch von immer kleiner werdenden Aminosäuresequenzen, gefolgt durch Untersuchen des hybriden Konstrukts hinsichtlich Immunreaktivität, wie unten beschrieben, wird das Epitop in irgendeiner Domäne eines Faktor VIII Moleküls kartiert, ausgetauscht gegen eine Aminosäuresequenz mit einer geringeren oder keinen Immunreaktivität, und ein hybrider Faktor VIII wird hergestellt.
Es wird verstanden, dass der Fachmann diesen Ansatz in Kombination mit Epitop Kartierung, Konstruktion von hybriden Faktor VIII Molekülen und Mutationsanalyse der Konstrukte verwenden kann, um mindestens eines Sequenz einschließlich einer oder mehreren Aminosäuren umfassend ein Epitop in der A2, C2 und/oder anderen Domänen, gegen die inhibitorische Antikörper gerichtet sind, zu identifizieren und auszutauschen, und um einen prokoagulierenden rekombinanten hybriden humanen/tierischen, tierischen/tierischen oder äquivalenten Faktor VIII oder Fragmente davon mit verringerter oder keiner Immunreaktivität im Vergleich zu humanem oder vom Schwein stammendem Faktor VIII herzustellen. Dieser Ansatz wird verwendet, wie in Beispiel 8 beschrieben ist, um einen rekombinanten prokoagulierenden hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII mit vom Schwein stammenden Aminosäure Austauschen in der humanen A2 Domäne und keiner Antigenität gegenüber Anti-Faktor VIII Antikörpern als einer exemplarischen Ausführungsformen herzustellen.
Für gewöhnlich weist vom Schwein stammender Faktor VIII eine begrenzte oder keine Reaktion mit inhibitorischen Antikörpern gegen humanen Faktor VIII auf. Die rekombinanten hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII Moleküle mit verringerter oder keiner Reaktivität mit inhibitorischen Antikörpern, basierend auf einem Aminosäure Austausch in der A2 Domäne, werden als ein Beispiel hergestellt, wie hybrider Faktor VIII unter Verwendung des Faktor VIII von anderen Spezies und Substitutionen in anderen Domänen als A2, wie folgt, hergestellt werden kann. Die vom Schwein stammende A2 Domäne wird durch Standard Klonierungstechniken, wie jene, die oben und in den Beispielen 6, 7 und 8 beschrieben sind, kloniert, und anschließend innerhalb der A2 Domäne unter Verwendung von Routineverfahren, wie unter Verwendung von Restriktionsstellen, um die cDNA zu schneiden oder durch Overlap Extension (SOE) zu spleißen, geschnitten und gespleißt. Die resultierende vom Schwein stammende Aminosäuresequenz wird gegen die humane A2 Domäne ausgetauscht, um ein hybrides Faktor VIII Konstrukt zu bilden, das in einen Säuger Expressionsvektor, vorzugsweise Re-Neo, inseriert, stabil in kultivierte Zellen, vorzugsweise Baby Hamster Nierenzellen transfiziert und, wie oben beschrieben, exprimiert wird. Der hybride Faktor VIII wird hinsichtlich Immunreaktivität untersucht, zum Beispiel mit Anti-A2 Antikörpern durch den Routine Bethesda Assay oder durch plasmafreien chromogenen Substrat Assay. Die Bethesda Einheit (BU) ist das Standardverfahren zum Messen von Inhibitor Titern. Wenn der Bethesda Titer in dem Hybrid nicht messbar ist (< 0,7 BU/mg IgG), dann wurde das humane A2 Epitop in der Region der ausgetauschten korrespondierenden vom Schwein stammenden Sequenz eliminiert. Das Epitop wird schrittweise verkleinert, und das spezifische A2 Epitop kann so bestimmt werden, um ein hybrides humanes/vom Schwein stammendes Molekül mit einer so kleinen, vom Schwein stammenden Sequenz wie möglich herzustellen. Wie hier beschrieben, wurde eine Sequenz mit 25 Resten, die den Aminosäuren Arg484 – Ile508 entsprechen, die kritisch ist für die inhibitorische Immunreaktivität, identifiziert und in der humanen A2 Domäne ausgetauscht. Innerhalb dieser Sequenz befinden sich nur neun Unterschiede zwischen humanem und vom Schwein stammendem Faktor VIII. Diese Region kann weiter analysiert und ausgetauscht werden.
Hybride humane/vom Schwein stammende Faktor VIII Moleküle mit verringerter oder keiner Reaktivität mit inhibitorischen Antikörpern, basierend auf dem Austausch von einer Aminosäuresequenz in der C1, C2 oder einer anderen Domäne, mit und ohne Austausch in der A2 Domäne, können ebenfalls hergestellt werden.
Das C2 Epitop kann zum Beispiel unter Verwendung des homologen Scanning Ansatzes kombiniert mit seitengerichteter Mutagenese kartiert werden. Insbesondere können die Verfahren gleich oder ähnlich sein zu jenen, die hier für den Austausch vom Aminosäuren in der A2 Domäne beschrieben sind, einschließlich dem Klonieren der vom Schwein stammenden C2 oder einer anderen Domäne, zum Beispiel unter Verwendung von RT-PCR oder durch das Behandeln einer vom Schwein stammenden Leber cDNA Bibliothek mit einer Sonde mit humaner cDNA von C2 oder einer anderen Domäne; Restriktionsstellen Techniken und/oder anschließende SOE, um die Epitope in der C2 oder einer anderen Domäne zu kartieren und gleichzeitig auszutauschen; Austausch gegen die humane C2 oder eine andere Domäne in dem B(–) Faktor VIII; Insertion in einen Expressionsvektor, wie pBluescript; Expression in kultivierten Zellen; und Routine Assay für die Immunreaktivität. Für die Assays kann die Reaktivität von C2 hybridem Faktor VIII mit einem C2 spezifischen Inhibitor, MR (Scandella, D., et al., Thromb. Haemostasis 67:665-671 (1992) und Lubin et al., (1994) und/oder mit anderen C2 spezifischen Antikörpern, die durch Affinitätschromatographie hergestellt sind, durchgeführt werden.
Die C2 Domäne besteht aus den Aminosäure Resten 2173 – 2332 (SEQ ID NR: 2). Innerhalb dieser 154 Aminosäure Region scheint die Inhibitor Aktivität auf eine 65 Aminosäure Region zwischen den Resten 2248 und 2312 gerichtet zu sein, gemäß Shima, M., et al., 69 Thromb. Haemostas. 240-246 (1993). Wenn die C2 Sequenz des humanen und vom Schwein stammenden Faktor VIII ungefähr 85 % identisch ist in dieser Region, so wie es sie an anderen Stellen in den funktionell aktiven Regionen des Faktor VIII ist, dann wird es ungefähr zehn Unterschiede zwischen der humanen und der vom Schwein stammenden Faktor VIII C2 Aminosäure Sequenz geben, die als anfängliche Ziele verwendet werden können, um Hybride mit ausgetauschter C2 Sequenz zu konstruieren.
Es ist wahrscheinlich, dass klinisch signifikante Faktor VIII Epitope auf die A2 und C2 Domänen beschränkt sind. Wenn jedoch Antikörper gegen andere Regionen (A1, A3, B oder C1 Domänen) des Faktor VIII identifiziert werden, können die Epi tope kartiert und unter Verwendung des hier beschriebenen Ansatzes für die nicht antigenen hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII Moleküle eliminiert werden.
Insbesondere kann die Kartierung des putativen zweiten leichte Kette Epitops und/oder anderer Epitope in irgendeiner anderen tierischen oder humanen Faktor VIII Domäne ebenfalls erreicht werden. Anfänglich kann die Bestimmung der Anwesenheit eines dritten Inhibitor Epitops in den A3 oder C1 Domänen wie folgt durchgeführt werden. Unter Verwendung von humanen ("H") und vom Schwein ("p") stammenden Faktor VIII Aminosäuresequenzen als einem Modell, werden A1_p-A2_p-A3_p-C1_H-C2_p und A1_p-A2_p-A3_H-C1_p-C2_p B Domänen lose Hybride konstruiert. Inhibitor IgG aus ungefähr 20 Patienten (von Dr. Dorothea Scandella, Amerikanisches Rotes Kreuz), die niedrige oder nicht nachweisbare Titer gegen vom Schwein stammenden Faktor VIII aufweisen, werden gegen die Hybride getestet. Wenn das dritte Epitop in der A3 Domäne liegt, wird erwartet, dass inhibitorisches IgG mit A1_p-A2_p-A3_H-C1_p-C2_p, aber nicht mit A1_p-A2_p-A3_H-C1_H-C2_p reagiert. Wenn umgekehrt das dritte Epitop in der C1 Domäne liegt, dann wird erwartet, dass IgG mit A1_p-A2_p-A3_pC1_H-C2_p, aber nicht mit A1_p-A2_p-A3_H-C1_p-C2_p reagiert. Wenn ein drittes Epitop identifiziert wird, wird es durch die hier für die A2 und C2 Epitope beschriebenen Verfahren identifiziert werden.
Zum Beispiel können spezifische Antikörper für das C1 oder A3 Domänen Epitop aus Gesamt Patienten IgG durch Affinitätschromatographie unter Verwendung der A1_p-A2_p-A3_H-C1_p-C2_p und der A1_p-A2_p-A3_PC1_H-C2_p Hybride und durch Elimimierung von C2 spezifischen Antikörpern durch Passage über rekombinante Faktor VIII C2 Sepharose^TM isoliert werden. Das putative dritte Epitop wird durch SOE Konstrukte identifiziert, indem in einer bevorzugten Ausführungsform Abschnitte der humanen Faktor VIII A3 oder C1 Domäne systematisch gegen eine vom Schwein stammende Sequenz ausgetauscht sind.
Hybride Faktor VIII Moleküle mit reduzierter Immunogenität
Ein Molekül ist immunogen, wenn es die Herstellung von Antikörpern im Mensch oder Tier induzieren kann. Die vorliegende Erfindung stellt ein prokoagulierendes rekombinantes hybrides humanes/tierisches oder tierisches/tierisches Faktor VIII Molekül, ein hybrides Faktor VIII äquivalente Molekül oder ein Fragment von beiden bereit, das weniger immunogen ist als der Wildtyp humane, vom Schwein stammende Faktor VIII im Menschen oder Tier, umfassend mindestens eine spezifische Aminosäuresequenz, einschließlich einer oder mehreren einzigartigen Aminosäuren des Faktor VIII von einer Spezies, ausgetauscht gegen die korrespondierende Aminosäuresequenz, welche die immunogene Aktivität des Faktor VIII der anderen Spezies aufweist; oder mindestens einer Aminosäuresequenz, einschließlich einer oder mehreren Aminosäuren, die keine bekannte Identität zu Faktor VIII aufweisen, ausgetauscht gegen die Aminosäuresequenz des humanen, tierischen oder hybriden Faktors. Dieses Hybrid kann verwendet werden, um das Auftreten von Inhibitor Entwicklung in einem Tier oder einem Menschen zu verringern und um Faktor VIII Defizienz zu behandeln, und es wäre bevorzugt in der Behandlung von bislang unbehandelten Patienten mit Hämophilie. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der hybride Faktor VIII eine Aminosäuresequenz des humanen Faktor VIII, weiterhin umfassend einen oder mehrere Alanin Reste, ausgetauscht gegen eine humane Aminosäuresequenz mit immunogener Aktivität, was zu einem prokoagulierenden rekombinanten hybriden äquivalenten Molekül oder Fragment davon mit verringerter oder keiner Immunogenität im Mensch oder im Tier führt.
Das hier beschriebene Verfahren zum Epitop Kartieren und der Mutationsanalyse, kombiniert mit dem Austausch einer nicht antigenen Aminosäuresequenz in einem Faktor VIII Molekül, unter Verwendung von hybridem humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII, liefert Hybridmoleküle mit geringer Antigenität. Unter Verwendung dieses Modells und der assoziierten Verfahren, kann irgendeines der hier beschriebenen Hybridkonstrukte durch seitengerichtete Mutagenese Techniken verändert werden, um so viel wie möglich funktionelles Epitop zu entfernen, um die Fähigkeit des Immunsystems zu minimieren, den hybriden Faktor VIII zu erkennen, wodurch seine Immunogenität verringert wird.
Ein Verfahren, das verwendet werden kann, um die Antigenität weiter zu verringern, und um einen weniger immunogenen hybriden Faktor VIII zu konstruieren, ist Alanin Scanning Mutagenese, beschrieben von Cunningham, B.C., und J. A. Wells, 244 Science 1081-1085 (1989), von ausgewählten spezifischen Aminosäuresequenzen in humanem, tierischem oder hybridem äquivalenten Faktor VIII. In der Alanin Scanning Mutagenese werden Aminosäure Seitenketten, die wahrscheinlich in ein Epitop involviert sind, durch Alanin Reste unter Verwendung von seitengerichteter Mutagenese ausgetauscht. Durch Vergleichen der Antikörper Bindung von Alanin Mutanten gegenüber Wildtyp Protein, kann der relative Beitrag der einzelnen Seitenketten zu der Bindungsinteraktion bestimmt werden. Es ist wahrscheinlich, dass Alanin Austausche insbesondere nützlich sind, weil Seitenketten Beiträge zu der Antikörper Bindung gegenüber dem β Kohlenstoff Atom eliminiert werden, aber im Gegensatz zu Glycin Austausch, die Hauptketten Konformation für gewöhnlich nicht verändert ist. Der Alanin Austausch verleiht keine großen sterischen, hydrophoben oder elektrostatischen Wirkungen, welche die Protein-Protein Interaktionen dominieren.
In Protein Antigen-Antikörper Interaktionen befinden sich für gewöhnlich ungefähr 15 – 20 Antigen Seitenketten in Kontakt mit dem Antikörper. Seitenketten Interaktionen, im Gegensatz zu Hauptketten Interaktionen, dominieren Protein Protein Interaktionen. Kürzliche Studien haben vorgeschlagen, dass nur einige wenige (ungefähr 3 bis 5) dieser Seitenketten Interaktionen am meisten zu der Bindungsenergie beitragen. Siehe Clackson, T., und J.A. Wells, 267 Science 383-386 (1995). Eine extensive Analyse der Wachstumshormon Epitope für einige murine monoklonale Antikörper zeigte die folgende Hierarchie für die Seitenketten Beiträge zu der Bindungsenergie: Arg > Pro > Glu > Asp – Phe – Ile, wobei Trp, Ala, Gly, und Cys nicht untersucht wurden (Jin, L., et al., 226 J. Mol. Biol. 851-865 (1992). Die Ergebnisse mit den hier beschriebenen A2 Epitopen stimmen damit überein, weil zwölf der 25 Reste in dem 484-508 A2 Segment diese Seitenketten enthalten (Tabelle 1).
Der Befund, dass bestimmte Aminosäure Reste besonders gut durch Antikörper erkannt werden, zeigt, dass die Eliminierung dieser Reste aus einem bekannten Epitop die Fähigkeit des Immunsystems, diese Epitope zu erkennen, verringern kann, d.h. ein Molekül weniger immunogen machen kann. Im Fall des A2 Epitops können immunogene Reste ohne den Verlust von Faktor VIII koagulierender Aktivität ausgetauscht werden. Zum Beispiel ist in HP9 Arg484 durch Ser ausgetauscht, Pro485 ist durch Ala ausgetauscht, Arg489 ist durch Gly ausgetaucht, Pro492 ist durch Leu ausgetauscht und Phe501 ist durch Met ausgetauscht. Weiterhin zeigen die Ergebnisse aus dem Patientenplasma, das verwendet wurde, um die Immunreaktivität in hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII Konstrukten zu untersuchen, die in Beispiel 8 beschrieben sind, dass Antikörper aus verschiedenen Patienten dieselbe oder eine sehr ähnliche strukturelle Region in der A2 Domäne erkennen, und dass die Reste in der A2 Domäne, die an der Bindung von A2 Inhibitoren teilnehmen, geringe Variation zu zeigen scheinen. Somit ist das A2 Epitop, das in den humanen Faktor VIII Resten 484 – 508 eingeschlossen ist, ein immundominantes Epitop dahingehend, dass es durch das humane Immunsystem besser als andere strukturelle Regionen des Faktor VIII erkannt wird. Von dem Austauschen dieser Struktur gegen eine nicht antigene Faktor VIII Sequenz aus einer anderen Spezies oder gegen eine nicht Faktor VIII Aminosäuresequenz, während die volle prokoagulierende Aktivität aufrechterhalten wird, wird erwartet, dass sie die Erkennung des hybriden oder hybriden äquivalenten Faktor VIII durch das Immunsystem verändert.
Es ist bekannt, dass seitengerichtete Mutagenese, um massige und/oder geladene Reste, die dazu neigen Epitope zu dominieren, gegen kleine neutrale Seitenketten (z.B. Alanin) auszutauschen, eine geringe immunogene Region bilden kann. Es wird erwartet, dass es dem Immunsystem schwer fällt, ein Molekül, das einige dieser Austausche an jedem signifikanten Inhibitor Epitop enthält, durch den Schlüssel-Schloss Mechanismus, der typisch für die Antigen-Antikörpern Interaktionen ist, einzupassen. Aufgrund seiner geringen Antigenität könnte ein solches hybrides Molekül in der Behandlung von Faktor VIII defizienten Patienten mit Inhibitoren verwendet werden, und aufgrund seiner geringen Immunogenität könn te es in der Behandlung von zuvor unbehandelten Patienten mit Hämophilie A verwendet werden.
Es ist ein allgemeines Ergebnis, dass die Mutation einer von wenigen Schlüsselresten ausreichend ist, um die Bindungskonstante für eine gegebene Protein-Protein Interaktion um einige Größenordnungen zu verringern. Somit erscheint es wahrscheinlich, dass alle Faktor VIII Epitope eine begrenzte Anzahl von Aminosäuren enthalten, die kritisch sind für die Inhibitor Entwicklung. Für jedes Epitop in Faktor VIII können Alanin Austausche gegen mindestens eine Sequenz, einschließlich einer oder mehreren spezifischen Aminosäuren mit immunogener Aktivität, ein aktives Molekül bilden, das weniger immunogen ist als der Wildtyp Faktor VIII. In einer bevorzugten Ausführungsform weist der hybride Faktor VIII keine B Domäne auf.
Die Verfahren zur Herstellung eines aktiven rekombinanten hybriden oder hybriden äquivalenten Faktor VIII mit Austausch einer Aminosäuresequenz, die wenig oder keine immunogene Aktivität aufweist, gegen eine Aminosäuresequenz in dem Faktor VIII mit immunogener Aktivität, sind wie folgt, unter Verwendung eines hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII mit Aminosäure Austauschen in der A2 Domäne als einer exemplarischen Ausführungsform. Es gibt 25 Reste in der humanen Faktor VIII Region 484 – 508. Die seitengerichtete Mutagenese kann verwendet werden, um einzelne Mutanten herzustellen, in denen irgendeiner dieser Reste durch irgendeine der anderen 19 Aminosäuren in insgesamt 475 Mutanten ausgetauscht ist. Darüber hinaus können Hybridmoleküle mit mehr als einer Mutation konstruiert werden.
Die Hybridkonstrukte können hinsichtlich Antigenität durch Messen der Bindungskonstante für inhibitorische Antikörper untersucht werden, wie beschrieben von Friguet, B., et al., 77 J. Immunol. Methods 305-319 (1985). In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bindungskonstante um mindestens drei Größenordnungen verringert sein, was den Bethesda Titer auf eine Menge verringern würde, der klinisch nicht signifikant ist. Zum Beispiel wurde der IC₅₀ (eine grobe Messung der Bindungskonstante) der Inhibition durch A2 Antikörper in den hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII Konstrukten HP2, HP4, HP5, HP7 und HP9, wie in Beispiel 8 beschrieben, verringert, und dies war mit einer Verringerung des Bethesda Titers auf eine nicht messbare Menge assoziiert. Es ist bekannt, dass zum Beispiel eine Doppel oder Tripel Alanin Mutante des humanen Faktor VIII (z.B. eine humane Faktor VIII Arg484→Ala, Arg489→Ala, Phe501→Ala Tripel Mutante) ein Molekül mit ausreichend geringer Antigenität für die therapeutische Verwendung bilden wird. Ähnliche Mutationen können in dem C2 Epitop und in dem putativen dritten Epitop durchgeführt werden. Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst zwei oder drei Alanin Austausche in zwei oder drei der Faktor VIII Epitope. Andere Austausche in diesen Regionen können ebenfalls durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden hybride äquivalente Faktor VIII Moleküle identifiziert, die weniger antigen und/oder immunogen im Menschen und Tier sind als entweder humaner oder vom Schwein stammender Faktor VIII. Solche hybriden äquivalenten Konstrukte können in Tieren hinsichtlich ihrer verringerten Antigenität und/oder Immunogenität untersucht werden. Zum Beispiel können Kontroll und Faktor VIII defiziente Kaninchen, Schweine, Hunde, Mäuse und Primaten und andere Säugetiere als Tiermodelle verwendet werden. In einem experimentellen Protokoll können der hybride oder hybride äquivalente Faktor VIII systematisch über einen Zeitraum von sechs Monaten bis ein Jahr an ein Tier, vorzugsweise durch intravenöse Infusion, und in einem Dosisbereich zwischen 5 und 50 Einheiten/kg Körpergewicht, vorzugsweise 10 – 50 Einheiten/kg und am meisten bevorzugt 40 Einheiten/kg Körpergewicht verabreicht werden. Die Antikörper können in Plasmaproben gemessen werden, die zu Intervallen nach der Infusion während der Dauer des Testzeitraums durch Routineverfahren entnommen werden, einschließlich Immun Assay und dem Bethesda Assay. Die koagulierende Aktivität kann auch in Proben mit Routineverfahren, einschließlich dem einstufigen Koagulationsassay, gemessen werden.
Die hybriden äquivalenten Faktor VIII Moleküle können im Menschen hinsichtlich ihrer verringerten Antigenität und/oder Immunogenität in mindestens zwei Arten von klinischen Versuchen getestet werden. In einer Versuchsart, die ausgestaltet ist, um zu bestimmen, ob der hybride oder hybride äquivalente Faktor VIII immunreaktiv mit inhibitorischen Antikörpern ist, wird hybrider oder hybrider äquivalenter Faktor VIII, vorzugsweise durch intravenöse Infusion, an ungefähr 25 Patienten mit Faktor VIII Defizienz verabreicht, die Antikörper gegen Faktor VIII aufweisen, welche die koagulierende Aktivität von therapeutischem humanen oder vom Schwein stammendem Faktor VIII inhibieren. Die Dosis des hybriden oder hybriden äquivalenten Faktor VIII liegt in einem Bereich zwischen 5 und 50 Einheiten/kg Körpergewicht, vorzugsweise 10 – 50 Einheiten/kg und am meisten bevorzugt 40 Einheiten/kg Körpergewicht. Ungefähr 1 Stunde nach jeder Verabreichung wird die Gewinnung von Faktor VIII aus Blutproben in einem einstufigen Koagulationsassay gemessen. Es werden nochmals Proben ungefähr 5 Stunden nach der Infusion entnommen, und die Gewinnung wird gemessen. Die Gesamtgewinnung und die Rate des Verschwindens von Faktor VIII aus den Proben sagt den Antikörper Titer und die inhibitorische Aktivität voraus. Wenn der Antikörper Titer hoch ist kann eine Faktor VIII Gewinnung für gewöhnlich nicht gemessen werden. Die Gewinnungsergebnisse werden mit den Gewinnungen der Gewinnungsergebnisse in Patienten, die mit Plasma abgeleitetem humanen Faktor VIII, rekombinantem humanen Faktor VIII, vom Schwein stammendem Faktor VIII und anderen für gewöhnlich verwendeten therapeutischen Formen von Faktor VIII oder Faktor VIII Austauschen behandelt wurden, verglichen.
In einer zweiten Art des klinischen Versuchs, der ausgestaltet ist, um zu bestimmen, ob der hybride oder hybride äquivalente Faktor VIII immunogen ist, d.h., ob Patienten inhibitorische Antikörper entwickeln werden, wird hybrider oder hybrider äquivalenter Faktor VIII, wie in dem vorhergehenden Absatz beschrieben ist, an ungefähr 100 zuvor unbehandelte Hämophilie Patienten verabreicht, die keine Antikörper gegen Faktor VIII entwickelt haben. Die Behandlungen werden ungefähr alle 2 Wochen über einen Zeitraum von 6 Monaten bis 1 Jahr verabreicht. In 1 bis 3 monatigen Intervallen während dieses Zeitraums werden Blutproben entnom men, und Bethesda Assays oder andere Antikörper Assays werden durchgeführt, um die Anwesenheit von inhibitorischen Antikörpern zu bestimmen. Gewinnungsassays können ebenfalls, wie oben beschrieben, nach jeder Infusion durchgeführt werden. Die Ergebnisse werden mit Hämophilie Patienten verglichen, die Plasma abgeleiteten humanen Faktor VIII, rekombinanten humanen Faktor VIII, vom Schwein stammenden Faktor VIII oder andere für gewöhnlich verwendete therapeutische Formen von Faktor VIII oder Faktor VIII Austauschen erhalten haben.
Herstellung von hybriden Faktor VIII Molekülen unter Verwendung einer humanen und nicht vom Schwein stammenden, nicht humanen Säuger Faktor VIII Aminosäuresequenz
Die Verfahren, die verwendet werden, um hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII mit einem Austausch von spezifischen Aminosäuren herzustellen, können verwendet werden, um rekombinantes hybrides humanes/nicht humanes, nicht vom Schwein stammendes Säuger oder tierisches/tierisches Faktor VIII Protein herzustellen, das im Vergleich zu humanem oder vom Schwein stammendem Faktor VIII eine veränderte oder die gleiche koagulierende Aktivität und/oder die gleiche oder verringerte Immunreaktivität und/oder Immunogenität aufweist, basierend auf dem Austausch von einer oder mehreren Aminosäuren in den A2, C2 und/oder anderen Domänen.
Ähnliche Vergleiche der Aminosäuresequenz Identität können zwischen humanen und nicht humanen, nicht vom Schwein stammenden Säuger Faktor VIII Proteinen angestellt werden, um die Aminosäuresequenzen mit prokoagulierender Aktivität, Anti-A2 und Anti-C2 Immunreaktivität und/oder Immunogenität, oder Immunreaktivität und/oder Immunogenität in anderen Domänen Resten zu identifizieren. Ähnliche Verfahren können anschließend verwendet werden, um hybride humane/nicht humane, nicht vom Schwein stammende Säuger Faktor VIII Moleküle herzustellen. Wie oben beschrieben, wird die funktionelle Analyse jedes Hybrids jene mit verringerter Reaktivität gegenüber inhibitorischen Antikörpern und/oder verringer ter Immunogenität und/oder erhöhter koagulierender Aktivität zeigen, und die Sequenz kann weiter durch Punktmutationsanalyse aufgeteilt werden.
Zum Beispiel können hybride humane/Maus Faktor VIII Moleküle wie oben beschrieben, hergestellt werden. Das Aminosäuresequenz Alignment der A2 Domäne des Menschen (SEQ ID NR: 2) und der Maus (SEQ ID NR: 6) ist in 1C gezeigt. Wie berichtet wurde von Elder et al., weist das Faktor VIII Protein, das durch die Maus cDNA (SEQ ID NR: 5) kodiert wird, 2319 Aminosäuren auf, mit 74 % Gesamt Sequenzidentität zu der humanen Sequenz (SEQ ID NR: 2) (87 Prozent Identität, wenn die B Domäne aus dem Vergleich ausgeschlossen wird), und sie ist 32 Aminosäuren kürzer als humaner Faktor VIII. Die Aminosäuresequenzen in den Maus A und C Domänen (SEQ ID NR: 6) sind hoch konserviert, mit 84 – 93 Prozent Sequenzidentität zu der humanen Sequenz (SEQ ID NR: 2), während die B und zwei kürzere saure Domänen 42 – 70 Prozent Sequenzidentität aufweisen. Insbesondere sind die A1, A2 und A3 Maus Aminosäuresequenzen (SEQ ID NR: 6) 85, 85 und 90 Prozent identisch zu den entsprechenden humanen Aminosäuresequenzen (SEQ ID NR: 2). Die C1 und C2 Maus Aminosäuresequenzen sind 93 und 84 Prozent identisch zu den entsprechenden humanen Aminosäuresequenzen. In der vorhergesagten Maus Faktor VIII Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 6) sind die A1, A2 und A3 Domänen jeweils homolog zu den humanen Faktor VIII Aminosäuren 1 – 372, 373 – 740 und 1690 – 2032, unter Verwendung der Aminosäuresequenz Identität für die Zählzwecke.
Die Thrombin/Faktor Xa und alle bis auf eine aktivierte Protein C Spaltungsstelle sind in dem Maus Faktor VIII konserviert. Der Tyrosin Rest für die Bindung des von Willebrand Faktors ist ebenfalls konserviert.
Gemäß Elder et al. enthält die Nukleotidsequenz (SEQ ID NR: 5) des Maus Faktor VIII 7519 Basen und weist 67 Prozent Gesamtidentität zu der humanen Nukleotidsequenz (SEQ ID NR: 1) auf. Die 6957 Basenpaare der murinen kodierenden Sequenz weisen 82 Prozent Sequenzidentität zu den 7053 Basenpaaren der kodierenden Sequenz in dem humanen Faktor VIII auf. Wenn die B Domäne nicht in den Vergleich eingeschlossen ist, dann gibt es eine 88 Prozent Nukleotidsequenz Identität.
Elder et al. berichten, dass die humanen und Maus Faktor VIII Moleküle insgesamt zu 74 Prozent identisch sind, und dass 95 % der humanen Reste, die, wenn sie verändert sind, zu Hämophilie führen, in der Maus identisch sind. Diese Daten unterstützen die Anwendung derselben Techniken, die verwendet wurden um eine Aminosäuresequenz mit koagulierender Aktivität und/oder Immunreaktivität gegenüber Antikörpern in dem vom Schwein stammenden Faktor VIII Molekül zu identifizieren, auf den Maus oder andere tierische Faktor VIII, um ähnliche Aminosäuresequenzen zu identifizieren und um hybride Moleküle herzustellen.
Herstellung von hybriden Faktor VIII Molekülen mit verringerter Kreuzreaktivität unter Verwendung einer humanen und nicht humanen, nicht vom Schwein stammenden Säuger Faktor VIII Aminosäuresequenz und einer nicht Faktor VIII Aminosäuresequenz
Vom Schwein stammender Faktor VIII wird klinisch verwendet, um Faktor VIII defiziente Patienten zu behandeln, die inhibitorische Antikörper gegen humanen Faktor VIII aufweisen. Die Kreuzreaktivität, in der humanes Plasma mit vom Schwein stammendem Faktor VIII reagiert, kann durch Herstellung eines hybriden vom Schwein stammenden/nicht humanen, nicht vom Schwein stammenden Säuger oder hybriden äquivalenten Faktor VIII verringert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Bestimmung durchgeführt, ob humane A2, C2 oder andere Domänen spezifische Inhibitoren mit nicht humanem, nicht vom Schwein stammendem Säuger ("andere Säuger") Faktor VIII reagieren, unter Verwendung des Routine Bethesda Assay und dem bestimmten anderen Säugerplasma als einem Standard. Inhibitorische Titer werden für gewöhnlich im Plasma gemessen, so dass anderer Säuger Faktor VIII nicht notwendig ist. Wenn die Inhibitoren nicht mit dem Faktor VIII des Säuges reagieren, wie murinem Faktor VIII, dessen Sequenz bekannt ist, dann kann eine entsprechende andere Säugersequenz in der vom Schwein stammende Epitop Region ausgetauscht werden, und sie wird unter Verwendung von humanen/vom Schwein stammenden Hybriden identifiziert. Wenn die tierische Sequenz erst einmal bekannt ist, können seitengerichtete Mutagenese Techniken, wie Oligonukleotid vermittelte Mutagenese, wie beschrieben von Kunkel, T.A., et al., 204 Meth. Enzymol. 125-139 (1991), verwendet werden, um das hybride vom Schwein stammende/tierische Faktor VIII Molekül herzustellen. Wenn andere tierische Plasma weniger reaktiv mit A2, C2 oder anderen Faktor VIII Inhibitoren als muriner oder vom Schwein stammender Faktor VIII sind, kann die tierische Sequenz, die dem vom Schwein stammenden Epitop entspricht, durch Routineverfahren, wie RT-PCR bestimmt werden, und ein hybrider humaner/tierischer oder vom Schwein stammender/tierischer Faktor VIII kann durch seitengerichtete Mutagenese konstruiert werden. Ebenso kann ein hybrider humaner/tierischer oder vom Schwein stammender/nicht vom Schwein stammender Säuger Faktor VIII mit verringerter Kreuzreaktivität mit humanem Plasma im Vergleich zu vom Schwein stammendem Faktor VIII hergestellt werden, der einen entsprechenden Aminosäure Austausch aus einem oder mehreren Tieren aufweist. In einer weiteren Ausführungsform kann die Kreuzreaktivität durch Austausch einer Aminosäuresequenz, die keine bekannte Identität zu einer Faktor VIII Aminosäuresequenz aufweist, vorzugsweise Alanin Reste unter Verwendung der Alanin Scanning Mutagenese Techniken, gegen eine vom Schwein stammende Epitop Sequenz, verringert werden.
Nach der Identifizierung von klinisch signifikanten Epitopen werden rekombinante hybride Faktor VIII Moleküle exprimiert, die eine verringerte oder gleiche Kreuzreaktivität im Vergleich zu vom Schwein stammendem Faktor VIII aufweisen, wenn sie in vitro gegen eine große Breite von inhibitorischem Plasma getestet werden. Vorzugsweise werden diese Moleküle kombinierte A2/C2 Hybride sein, in denen eine immunreaktive Aminosäuresequenz in diesen Domänen durch eine andere Säugersequenz ausgetauscht ist. Eine zusätzliche Mutagenese in diesen Regionen kann durchgeführt werden, um die Kreuzreaktivität zu verringern. Eine verringerte Kreuzreaktivität, obwohl sie gewünscht ist, ist nicht notwendig, um ein Produkt herzustellen, das Vorteile gegenüber dem bestehenden vom Schwein stammenden Faktor VIII Konzentrat aufweist, das Nebenwirkungen aufgrund von kon taminierenden vom Schwein stammenden Proteinen hervorruft, und ungewünschte Wirkungen aufgrund der Immunogenität von vom Schwein stammenden Faktor VIII Sequenzen hervorrufen kann. Ein hybrides humanes/anderes Säuger oder vom Schwein stammendes/anderes Säuger Faktor VIII Molekül wird keine fremden vom Schwein stammenden Proteine enthalten. Zusätzlich deutet die intensive Epitop Kartierung, die in der vom Schwein stammenden A2 Domäne durchgeführt wurde, an, dass mehr als 95 % der therapeutischen hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII Sequenz human sein wird.
Herstellung von hybriden Faktor VIII Äquivalenten:
Die Verfahren, die oben für den Aminosäure Austausch in Faktor VIII Molekülen und in den Beispielen beschrieben sind, können auch verwendet werden, um prokoagulierende rekombinante hybride Faktor VIII äquivalente Moleküle oder Fragmente davon herzustellen, umfassend mindestens eine Aminosäuresequenz einschließlich einer oder mehreren Aminosäuren, die keine bekannte Aminosäuresequenz Identität zu Faktor VIII ("nicht Faktor VIII Sequenz") aufweisen, ausgetauscht gegen mindestens eine spezifische Aminosäuresequenz, die eine antigene und/oder immunogene Stelle in dem humanen, tierischen oder hybriden Faktor VIII einschließt. Das resultierende aktive hybride Faktor VIII äquivalente Molekül weist eine gleiche oder geringere Reaktivität zu Faktor VIII inhibitorischen Antikörpern und/oder eine geringere Immunogenität im Mensch und Tieren als der nicht ausgetauschte humane, tierische oder hybride Faktor VIII auf.
Geeignete Aminosäure Reste, die gegen jene Sequenzen von Aminosäuren ausgetauscht werden können, die kritisch für eine koagulierende und/oder antigene und/oder immunogene Aktivität in humanem oder tierischem Faktor VIII oder hybridem humanen/tierischen Faktor VIII sind, um ein hybrides äquivalentes Faktor VIII Molekül herzustellen, schließen irgendwelche Aminosäuren mit keiner bekannten Sequenzidentität zu der tierischen oder humanen Faktor VIII Aminosäuresequenz aufweisend, ein, die koagulierende, antigene oder immunogene Aktivität aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform schließen die Aminosäuren, die ausgetauscht werden können, Alanin Reste unter Verwendung der Alanin Scanning Mutagenese Techniken ein.
Hybride Faktor VIII äquivalente Moleküle, die hier beschrieben sind, schließen auch jene Moleküle ein, in denen Aminosäure Reste mit keiner bekannten Identität zu der tierischen Faktor VIII Sequenz gegen Aminosäure Reste ausgetauscht sind, die nicht kritisch für die koagulierende, antigene oder immunogene Aktivität sind.
Wie oben beschrieben, weist in einer Ausführungsform eines hybriden Faktor VIII äquivalenten Moleküls das Molekül eine verringerte Kreuzreaktivität mit Inhibitorplasma auf. Eines oder mehrere Epitope in dem kreuzreaktiven Faktor VIII werden identifiziert, wie oben beschrieben, und anschließend gegen eine nicht Faktor VIII Aminosäuresequenz, vorzugsweise Alanin Reste, unter Verwendung von zum Beispiel dem Alanin Scanning Mutagenese Verfahren, ausgetauscht.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein prokoagulierendes rekombinantes hybrides Faktor VIII äquivalente Molekül hergestellt, umfassend mindestens eine Sequenz einschließlich einer oder mehreren Aminosäuren mit keiner bekannten Sequenzidentität zu Faktor VIII, vorzugsweise Alanin Resten, ausgetauscht gegen mindestens eine Sequenz einschließlich einer oder mehreren Aminosäuren einschließlich einem Epitop und/oder gegen mindestens eine Sequenz einschließlich einer oder mehreren Aminosäuren einschließlich einer immunogenen Stelle, vorzugsweise in dem humanen Faktor VIII. Das resultierende hybride äquivalente Faktor VIII Molekül oder Fragment davon weist eine verringerte oder keine Immunreaktivität mit inhibitorischen Antikörpern gegen Faktor VIII und/oder eine verringerte oder keine Immunogenität im Menschen oder Tieren auf. Die Verfahren zum Identifizieren einer spezifischen antigenen Aminosäuresequenz in der A2 Domäne des humanen Faktor VIII zum Austausch gegen eine nicht antigene vom Schwein stammende einzigartige Aminosäuresequenz sind in den Beispielen 7 und 8 beschrieben, und sie sind exemplarisch für das Identifizieren einer antigenen Sequenz in der A2 oder anderen Domänen von humanem oder tierischem Faktor VIII und für die Verwendung von seitengerichteten Mutagenese Verfahren, wie Alanin Scanning Mutagenese, um einen nicht Faktor VIII Aminosäuresequenz auszutauschen.
Weil das humane A2 Epitop auf 25 oder weniger Aminosäuren eingeengt wurde, wie in Beispiel 8 beschrieben, kann die Alanin Scanning Mutagenese mit einer begrenzten Anzahl von hybriden Faktor VIII Konstrukten, die eine humane Aminosäuresequenz aufweisen, durchgeführt werden, um zu bestimmen, welche prokoagulierende, nicht immunreaktive und/oder nicht immunogene hybride Faktor VIII Konstrukte, basierend auf den A2 Aminosäure Austauschen, sind. In der A2 Domäne sind die wahrscheinlichsten Kandidaten für Alanin Austausche, um sowohl eine verringerte Antigenität als auch eine Immunogenität in dem hybriden Konstrukt zu erreichen, Arg484, Pro485, Tyr487, Ser488, Arg489, Pro492, Val495, Phe501 und Ile508. Die Bindungsaffinität eines hybriden Konstrukts, die jede dieser Mutanten für mAb413 und eine Reihe von A2 spezifischen Patienten IgGs umfasst wird durch ELISA bestimmt. Jede Mutante, die aktiv ist und eine Bindungsaffinität für A2 Inhibitoren aufweist, die um mindestens zwei Größenordnungen verringert ist, ist ein Kandidat für das A2 ausgetauschte Faktor VIII Molekül. Konstrukte mit mehr als einer Mutation werden ausgewählt, basierend auf der Annahme, dass je mehr das Epitop verändert ist, desto immunogener wird es sein. Es ist möglich, dass es andere Kandidatenreste in der Region zwischen Arg484 – Ile508 gibt, weil es Schlüsselreste für das Epitop geben kann, die sowohl humanem als auch vom Schwein stammendem Faktor VIII gemeinsam sind. Zum Beispiel sind geladene Reste häufig in Protein-Protein Interaktionen involviert, so dass eine Alanin Substitution für Lys493 ein möglicher Kandidat ist.
Dieses Verfahren wird in dem C2 Epitop und dem putativen dritten Epitop, von dem angenommen wird, dass es in den A3 oder C1 Domänen liegt, ebenso wie jedes andere Epitop, das in dem Faktor VIII identifiziert wird, durchgeführt, um hybride äquivalente Faktor VIII Konstrukte herzustellen.
Diagnostische Assays
Die hybride humane/tierische, tierische/tierische oder äquivalente Faktor VIII cDNA und/oder das davon exprimierte Protein, kann insgesamt oder teilweise in Assays als diagnostische Reagenzien für den Nachweis von inhibitorischen Antikörpern gegen humanen oder tierischen Faktor VIII oder gegen hybriden humanen/tierischen Faktor oder Äquivalenten VIII in Substraten verwendet werden, einschließlich zum Beispiel Proben von Serum und Körperfluiden von menschlichen Patienten mit Faktor VIII Defizienz. Diese Antikörper Assays schließen Assays, wie ELISA Assays, Immunoblots, Radioimmun Assays, Immundiffusionsassays und Assays für Faktor VIII biologische Aktivität (z.B. durch Koagulationsassay) ein. Techniken zur Herstellung dieser Reagenzien und Verfahren zu ihrer Verwendung sind dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel kann ein Immun Assay für den Nachweis von inhibitorischen Antikörpern in einer Patienten Serumprobe das Umsetzen der Testprobe mit einer ausreichenden Menge des hybriden humanen/tierischen Faktor VIII, der mindestens eine antigene Stelle enthält, umfassen, wobei die Menge ausreichend ist, um einen nachweisbaren Komplex mit den inhibitorischen Antikörpern in der Probe zu bilden.
Es können Nukleinsäure und Aminosäure Sonden hergestellt werden, basierend auf der Sequenz der hybriden humanen/vom Schwein stammenden, humanen/nicht humanen, nicht vom Schwein stammenden Säuger, tierischen/tierischen oder äquivalenten Faktor VIII cDNA oder des Protein Moleküls oder Fragmenten davon. In einigen Ausführungsformen können diese unter Verwendung von Farbstoffen oder enzymatischen, fluoreszierenden, chemilumineszierenden oder radioaktiven Markierungen, die kommerziell erhältlich sind, markiert werden. Die Aminosäure Sonden können zum Beispiel verwendet werden, um Seren oder andere Körperfluide zu screenen, in denen die Anwesenheit von Inhibitoren gegen humanen, tierischen oder hybriden humanen/tierischen Faktor VIII vermutet wird. Die Mengen der Inhibitoren können in Patienten quantifiziert und mit gesunden Kontrollen verglichen werden, und sie können zum Beispiel verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Patient mit einer Faktor VIII Defizienz mit einem hybriden hu manen/tierischen oder hybriden äquivalenten Faktor VIII behandelt werden kann. Die cDNA Sonden können zum Beispiel für Forschungszwecke beim Screenen von cDNA Bibliotheken verwendet werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Pharmazeutische Zusammensetzungen enthaltend hybriden humanen/tierischen, vom Schwein stammenden/nicht humanen vom Schwein stammenden Säuger, tierisch-1/tierisch-2 oder äquivalenten Faktor VIII, alleine oder in Kombination mit geeigneten pharmazeutischen stabilisierenden Verbindungen, Transportvehikeln und/oder Trägervehikeln werden gemäß bekannten Verfahren, wie beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences von E.W. Martin, hergestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bevorzugten Träger oder Transportvehikel für intravenöse Infusion physiologische Salzlösung oder Phosphat gepufferte Salzlösung.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform schließen geeignete stabilisierende Verbindungen, Transportvehikel und Trägervehikel ein, aber sind nicht beschränkt auf andere humane oder tierische Proteine, wie Albumin.
Phospholipid Vesikel oder liposomale Suspensionen sind ebenfalls als pharmazeutisch verträgliche Träger oder Transportvehikel bevorzugt. Diese können gemäß den Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden und können zum Beispiel Phosphatidylserin/-Phosphatidylcholin oder andere Zusammensetzungen von Phospholipiden oder Detergenzien, die zusammen der Oberfläche eine negative Ladung verleihen, enthalten, weil Faktor VIII an negativ geladene Phospholipid Membrane bindet. Liposomen können hergestellt werden, durch Lösen geeigneter Lipid(e) (wie Stearoylphosphatidylethanolamin, Stearoylphosphatidylcholin, Arachadoylphosphatidylcholin und Cholesterol) in einem organischen Lösungsmittel, das anschließend verdampft wird, das einen dünnen Film von getrocknetem Lipid auf der Oberfläche des Behälters zurücklässt. Eine wässrige Lösung des hybriden Faktor VIII wird anschließend in den Behälter eingeführt. Der Behälter wird dann mit der Hand geschüttelt, um das Lipid Material von den Seiten des Behälters zu lösen und um die Lipid Aggregate zu dispergieren, wodurch eine liposomale Suspension gebildet wird.
Der hybride Faktor oder hybride äquivalente Faktor VIII können mit anderen geeigneten stabilisierenden Verbindungen, Transportvehikeln und/oder Trägervehikeln, einschließlich Vitamin K abhängigen Gerinnungsfaktoren, Gewebefaktoren und dem von Willebrand Faktor (vWf) oder einem Fragment des vWf, das die Faktor VIII Bindungsstelle enthält, und Polysacchariden, wie Sucrose kombiniert werden.
Hybrider oder hybrider äquivalenter Faktor VIII kann auch durch Gentherapie in derselben Weise wie humaner Faktor VIII transportiert wird, transportiert werden unter Verwendung von Transportmitteln, wie retroviralen Vektoren. Dieses Verfahren besteht aus dem Einbau der Faktor VIII cDNA in humane Zellen, die direkt in einen Faktor VIII defizienten Patienten transplantiert werden, oder die in einer implantierbaren Vorrichtung angeordnet werden, die permeabel für Faktor VIII Moleküle, aber impermeabel für Zellen ist, die anschließend transplantiert wird. Das bevorzugte Verfahren ist retroviral vermittelter Gentransfer. In diesem Verfahren wird ein exogenes Gen (z.B. eine Faktor VIII cDNA) in das Genom eines modifizierten Retrovirus kloniert. Das Gen wird in das Genom der Wirtszelle durch die virale Maschinerie eingeführt, wo es durch die Zelle exprimiert werden wird. Der retrovirale Vektor ist modifiziert, so dass er kein Virus bilden wird, was die virale Infektion des Wirtes verhindert. Die allgemeinen Prinzipien für diese Art der Therapie sind dem Fachmann bekannt und wurden in der Literatur zusammengefasst (z.B. Kohn, D.B. und P.W. Kantoff, 29 Transfusion 812-820, 1989).
Hybrider Faktor VIII kann gebunden an vWf gelagert werden, um die Halbwertszeit und die Lagerungszeit des hybriden Moleküls zu verlängern. Zusätzlich kann die Lyophilisierung von Faktor VIII die Ausbeuten von aktiven Molekülen in der Anwesenheit von vWf verbessern. Gegenwärtige Verfahren zur Lagerung für humanen und tierischen Faktor VIII, die von kommerziellen Lieferanten verwendet werden, können für die Lagerung des hybriden Faktor VIII eingesetzt werden. Diese Verfahren schließen ein: (1) Lyophilisierung von Faktor VIII in einem teilweise gereinigten Zustand (als ein Faktor VIII "Konzentrat" das ohne weitere Reinigung infundiert wird); (2) Immunaffinitätsreinigung von Faktor VIII durch das Zimmerman Verfahren und Lyophilisierung in der Anwesenheit von Albumin, das den Faktor VIII stabilisiert; (3) Lyophilisierung des rekombinanten Faktor VIII in der Anwesenheit von Albumin.
Zusätzlich war hybrider Faktor VIII unbegrenzt stabil bei 4°C in 0,6 M NaCl, 20 mM MES und 5 mM CaCl₂ bei pH 6,0 und kann auch gefroren in diesen Puffern gelagert und mit minimalem Aktivitätsverlust aufgetaut werden.
Verfahren zur Behandlung
Hybrider oder hybrider äquivalenter Faktor VIII wird verwendet, um unkontrollierte Blutung aufgrund von Faktor VIII Defizienz zu behandeln (z.B. intraartikuläre, intrakranielle oder gastrointestinale Hämorrhagie) in Hämophilie Patienten mit und ohne inhibitorischen Antikörpern und in Patienten mit erworbener Faktor VIII Defizienz aufgrund der Entwicklung von inhibitorischen Antikörpern. Die aktiven Materialien werden bevorzugt intravenös verabreicht.
Zusätzlich kann hybrider oder hybrider äquivalenter Faktor VIII durch das Transplantieren von Zellen, die genetisch verändert sind, um das Hybrid zu bilden oder durch Implantierung einer Vorrichtung, die solche Zellen enthält, wie oben beschrieben, verabreicht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden pharmazeutische Zusammensetzungen von hybridem oder hybridem äquivalenten Faktor VIII alleine oder in Kombination mit Stabilisatoren, Transportvehikeln und/oder Trägern in Patienten intravenös gemäß demselben Verfahren infundiert, das für die Infusion von humanem oder tierischen Faktor VIII verwendet wird.
Die Behandlungsdosis einer hybriden oder hybriden äquivalenten Faktor VIII Zusammensetzung, die an einen Patienten verabreicht werden muss, der eine solche Behandlung benötigt, wird in Abhängigkeit von der Schwere der Faktor VIII Defizienz variieren. Im Allgemeinen wird die Dosismenge bezüglich der Frequenz, Dauer und Einheiten an die Schwere und Dauer der Blutungsepisode jedes einzelnen Patienten angepasst. Folglich ist der hybride Faktor VIII in den pharmazeutisch verträglichen Träger, das Transportvehikel oder den Stabilisator in einer Menge eingeschlossen, die ausreichend ist, um an einen Patienten eine therapeutisch wirksame Menge des Hybrids zu verabreichen, um die Blutung zu stoppen, wie durch Standard Gerinnungsassays gemessen wird.
Der Faktor VIII ist klassisch definiert als jene Substanz, die in normalem Blutplasma anwesend ist, welche den Gerinnungsdefekt in Plasma korrigiert, das von Individuen mit Hämophilie A stammt. Die koagulierende Aktivität in vitro von gereinigten oder teilweise gereinigten Formen von Faktor VIII wird verwendet, um die Dosierung von Faktor VIII für Infusionen in humanen Patienten zu berechnen und ist ein verlässlicher Indikator der Aktivität, die aus Patientenplasma gewonnen wird und für die Korrektur des in vivo Blutungsdefekts. Es gibt keine berichteten Unterschiede zwischen Standard Assays von neuen Faktor VIII Molekülen in vitro und ihrem Verhalten in dem Hunde Infusionsmodell oder in humanen Patienten, gemäß Lusher, J.M., et al., 328 New Engl. J. Med. 453-459 (1993); Pittman, D.D., et al., 79 Blood 389-397 (1992); und Brinkhous et al., 82 Proc. Natl. Acad. Sci. 8752-8755 (1985).
Für gewöhnlich liegt die gewünschte Plasma Faktor VIII Menge, die in dem Patienten durch Verabreichung des hybriden oder hybriden äquivalenten Faktor VIII erreicht werden soll, in einem Bereich von 30 – 100 % des Normalen. In einer bevorzugten Weise der Verabreichung des hybriden oder hybriden äquivalenten Faktor VIII wird die Zusammensetzung intravenös in einer bevorzugten Dosis im Bereich von ungefähr 5 bis 50 Einheiten/kg Körpergewicht, weiter bevorzugt in einem Bereich von 10 – 50 Einheiten/kg Körpergewicht und am meisten bevorzugt bei einer Dosis von 20 – 40 Einheiten/kg Körpergewicht verabreicht; die Intervallfrequenz liegt im Bereich von ungefähr 8 bis 24 Stunden (in schwer betroffenen Hämophilie Patienten); und die Dauer der Behandlung in Tagen liegt im Bereich von 1 bis 10 Tagen oder bis die Blutungsepisode beendet ist. Siehe z.B. Roberts, H.R. und M.R. Jones, "Hemophilia and Related Conditions – Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V, and Factors VII to XII)", Kap. 153, 1453-1474, 1460, in Hematology, Williams, W.J., et al., Hrsg. (1990). Patienten mit Inhibitoren können mehr hybriden oder hybriden äquivalenten Faktor VIII benötigen, oder Patienten können weniger hybriden oder hybriden äquivalenten Faktor VIII aufgrund seiner höheren spezifischen Aktivität als humaner Faktor VIII oder verringerter Antikörper Reaktivität oder Immunogenität benötigen. Bei der Behandlung mit humanem oder vom Schwein stammendem Faktor VIII wird die Menge des hybriden oder hybriden äquivalenten Faktor VIII, die infundiert wird, durch einen einstufigen Faktor VIII Koagulationsassay definiert, und in ausgewählten Fällen wird die in vivo Gewinnung durch Messen des Faktor VIII in dem Plasma des Patienten nach der Infusion gemessen. Es wird verstanden, dass für jedes besondere Subjekt spezifische Dosis Verabreichungen über die Zeit in Abhängigkeit von dem individuellen Bedarf und der professionellen Bewertung der Person, welche die Zusammensetzungen verabreicht oder die Verabreichung überwacht, eingestellt werden sollen, und dass die Konzentrationsbereiche, die hier angegeben sind, nur exemplarisch sind und nicht beabsichtigen, den Schutzbereich oder die Ausübung der beanspruchten Zusammensetzung einzuschränken.
Die Behandlung kann die Form einer einzelnen intravenösen Verabreichung der Zusammensetzung oder die periodische oder kontinuierliche Verabreichung über einen verlängerten Zeitraum, wie benötigt, annehmen. Alternativ dazu kann der hybride oder hybride äquivalente Faktor VIII subkutan oder oral mit Liposomen in einer oder mehreren Dosierungen bei verschiedenen Zeitintervallen verabreicht werden.
Hybrider oder hybrider äquivalenter Faktor VIII kann auch verwendet werden, um unkontrollierte Blutung aufgrund von Faktor VIII Defizienz in Hämophilie Patienten zu behandeln, die Antikörper gegen humanen Faktor VIII entwickelt haben. In diesem Fall ist eine koagulierende Aktivität, die jener von humanem oder tierischem Faktor VIII alleine überlegen ist, nicht notwendig. Koagulierende Aktivität, die jener von humanem Faktor VIII (d.h. weniger als 3.000 Einheiten/mg) unterlegen ist, ist nützlich, wenn diese Aktivität nicht durch Antikörper in dem Plasma des Patienten neutralisiert wird.
Das hybride oder hybride äquivalente Faktor VIII Molekül und die Verfahren zu seiner Isolierung, Charakterisierung, Herstellung und Verwendung, die oben allgemein beschrieben sind, werden besser verstanden unter Bezugnahme auf die folgenden nicht beschränken den Beispiele.
Beispiel 1: Assay für vom Schwein stammenden Faktor VIII und hybridem humanen/vom Schwein stammendem Faktor VIII
Vom Schwein stammender Faktor VIII weist mehr koagulierende Aktivität als humaner Faktor VIII, basierend auf der spezifischen Aktivität des Moleküls, auf. Diese Ergebnisse sind in Tabelle III in Beispiel 4 gezeigt. Diese Schlussfolgerung basiert auf der Verwendung von geeigneten Standardkurven, die es erlauben, dass der humane und der vom Schwein stammende Faktor VIII fair verglichen werden können. Koagulationsassays basieren auf der Fähigkeit von Faktor VIII, die Gerinnungszeit von Plasma zu verkürzen, das von einem Patienten mit Hämophilie A abgeleitet ist. Zwei Arten von Assays werden eingesetzt: der einstufige und der zweistufige Assay.
In dem einstufigen Assay wurde 0,1 ml Hämophilie A Plasma (George King Biomedical, Inc.) mit 0,1 ml aktiviertem partiellen Thromboplastin Reagens (APTT) (Organon Teknika) und 0,01 ml Probe oder Standard, die aus verdünntem, zitrierten normalen humanen Plasma besteht, für 5 Min. bei 37°C in einem Wasserbad inkubiert. Die Inkubation wurde gefolgt durch die Zugabe von 0,1 ml 20 mM CaCl₂, und die Zeit für die Entwicklung eines Fibrin Gerinsels wurde durch visuelle Beobachtung bestimmt.
Eine Einheit von Faktor VIII ist definiert als die Menge, die in 1 ml von zitriertem normalen humanen Plasma anwesend ist. Mit humanem Plasma als dem Standard wurden vom Schwein stammende und humane Faktor VIII Aktivität direkt verglichen. Verdünnungen des Plasma Standards oder gereinigter Proteine wurden in 0,15 M NaCl, 0,02 M HEPES, pH 7,4 durchgeführt. Die Standardkurve wurde hergestellt basierend auf 3 oder 4 Verdünnungen des Plasmas, wobei die höchste Verdünnung 1/50 war, und einer log₁₀ Gerinnungszeit, aufgetragen gegen die log₁₀ Plasma Konzentration, was zu einer Gerade führt. Die Einheiten des Faktor VIII in einer unbekannten Probe wurden durch Interpolation von der Standardkurve bestimmt.
Der einstufige Assay beruht auf der endogenen Aktivierung von Faktor VIII durch Aktivatoren, die in dem Hämophilie A Plasma gebildet werden, wohingegen der zweistufige Assay die prokoagulierende Aktivität von präaktiviertem Faktor VIII misst. In dem zweistufigen Assay wurden Proben, die Faktor VIII enthalten, der mit Thrombin umgesetzt wurde, zu einem Gemisch aus aktiviertem partiellen Thromboplastin und humanem Hämophilie A Plasma, das für 5 Min. bei 37°C präinkubiert wurde, zugegeben. Die resultierenden Gerinnungszeiten wurden anschließend in Einheiten/ml umgewandelt, basierend auf derselben humanen Standardkurve, wie oben beschrieben. Die relative Aktivität in dem zweistufigen Assay war größer als die in dem einstufigen Assay, weil der Faktor VIII präaktiviert wurde.
Beispiel 2: Charakterisierung des funktionellen Unterschieds zwischen huma nem und vom Schwein stammendem Faktor VIII
Die Isolierung von vom Schwein stammendem und humanem Plasma abgeleitetem Faktor VIII und humanem rekombinanten Faktor VIII wurden in der Literatur beschrieben in Fulcher, C.A., und T.S. Zimmerman, 79 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1648-1652 (1982); Toole, J.J., et al., 312 Nature 342-347 (1984) (Genetics Institute); Gitschier, J., et al., 312 Nature 326-330 (1984) (Genentech); Wood, W.I., et al., 312 Nature 330-337 (1984) (Genentech); Vehar, G.A., et al., 312 Nature 337- 342 (1984) (Genentech); Fass, D.N., et al., 59 Blood 594 (1982); Toole, J.J., et al., 83 Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 5939-5942 (1986). Dies kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden. Alle diese Präparationen sind ähnlich in der Untereinheiten Zusammensetzung, obwohl es einen funktionellen Unterschied in der Stabilität zwischen humanem und vom Schwein stammendem Faktor VIII gibt.
Für den Vergleich von humanem rekombinanten und vom Schwein stammendem Faktor VIII wurden Präparationen aus hoch gereinigtem humanen rekombinanten Faktor VIII (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) und vom Schwein stammendem Faktor VIII (immun gereinigt, wie beschrieben in Fass, D.N., et al., 59 Blood 594 (1982)) einer Hochdruck Flüssigchromatographie (HPLC) über einer Mono Q^TM (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) Anionen Austausch Säule (Pharmacia, Inc.) unterzogen. Die Zwecke des Mono Q^TM HPLC Schritts war die Eliminierung von kleinen Verunreinigungen des Austausches von humanem und vom Schwein stammendem Faktor VIII in einen gemeinsamen Puffer für Vergleichszwecke. Die Gefäße, die 1000 – 2000 Einheiten des Faktor VIII enthielten, wurden mit 5 ml H₂O rekonstituiert. Hepes (2 M bei pH 7,4) wurde anschließend in einer Endkonzentration von 0,02 M hinzugefügt. Der Faktor VIII wurde auf eine Mono Q^TM HR 5/5 Säule aufgetragen, die in 0,15 M NaCl, 0,02 M Hepes, 5 mM CaCl₂ bei pH 7,4 (Puffer A plus 0,15 M NaCl) äquilibriert worden war; mit 10 ml Puffer A + 0,15 M NaCl gewaschen; und mit einem 20 ml linearen Gradienten, 0,15 M bis 0,90 M NaCl in Puffer A bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Min. eluiert.
Für den Vergleich von humanem Plasma abgeleiteten Faktor VIII (gereinigt durch Mono Q^TM HPLC) und vom Schwein stammendem Faktor VIII, wurde immun gereinigter, Plasma abgeleiteter vom Schwein stammender Faktor VIII 1:4 mit 0,04 M Hepes, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween-80 bei pH 7,4 verdünnt und einer Mono Q^TM HPLC unter denselben Bedingungen unterzogen, die im vorherigen Absatz für den humanen Faktor VIII beschrieben sind. Diese Verfahren für die Isolierung von humanem und vom Schwein stammendem Faktor VIII sind für den Fachmann Standard.
Die Säulenfraktionen wurden hinsichtlich Faktor VIII Aktivität durch einen einstufigen Koagulationsassay untersucht. Die durchschnittlichen Ergebnisse der Assays, ausgedrückt in Einheiten der Aktivität pro A₂₈₀ des Materials, sind in Tabelle II angegeben und zeigen an, dass der vom Schwein stammende Faktor VIII eine mindestens sechsfach größere Aktivität als der humane Faktor VIII aufweist, wenn der einstufige Assay verwendet wird.
TABELLE II: VERGLEICH VON HUMANER UND VOM SCHWEIN STAMMENDER FAKTOR VIII KOAGULIERENDER AKTIVITÄT
Beispiel 3: Vergleich der Stabilität von humanem und vom Schwein stammendem Faktor VIII
Die Ergebnisse des einstufigen Assays für den Faktor VIII spiegeln die Aktivierung von Faktor VIII zu Faktor VIIIa in der Probe und möglicherweise den Verlust der gebildeten Faktor VIIIa Aktivität wieder. Ein direkter Vergleich der Stabilität von humanem und vom Schwein stammendem Faktor VIII wurde durchgeführt. Die Proben aus der Mono Q^TM HPLC (Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.) wurden auf dieselbe Konzentration und Puffer Zusammensetzung verdünnt und mit Thrombin umgesetzt. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben für den zweistufigen Koagulationsassay entnommen. Typischerweise war die Spitzenaktivität (nach 2 Min.) 10-fach größer für den vom Schwein stammenden als für den humanen Faktor VIIIa, und die Aktivitäten von sowohl dem vom Schwein stammenden als auch dem humanen Faktor VIIIa verringerten sich anschließend, wobei sich die Faktor VIIIa Aktivität schneller verringerte.
Im Allgemeinen waren Versuche, stabilen humanen Faktor VIIIa zu isolieren, nicht erfolgreich, selbst wenn Bedingungen verwendet wurden, die stabilen vom Schwein stammenden Faktor VIIIa bilden. Um dies zu zeigen, wurde Mono Q^TM HPLC gereinigter humaner Faktor VIII mit Thrombin aktiviert und einer Mono S^TM Kationen Austausch (Pharmacia, Inc.) HPLC unter Bedingungen unterzogen, die stabilen vom Schwein stammenden Faktor VIIIa bilden, wie beschrieben ist von Lollar, J.S. und C.G. Parker, 28 Biochemistry 666 (1989).
Humaner Faktor VIII, 43 μg/ml (0,2 μM) in 0,2 M NaCl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCl₂, bei pH 7,4, in 10 ml Gesamtvolumen wurde mit Thrombin (0,036 μM) für 10 Min. umgesetzt, zu diesem Zeitpunkt wurde FPR-CH₂Cl D-Phenyl-prolyl-arginyl-Chlormethylketon in einer Konzentration von 0,2 μM für die irreversible Inaktivierung von Thrombin zugegeben. Das Gemisch wurde anschließend 1:1 mit 40 mM 2-(N-Morpholin)-ethansulfonsäure (MES), 5 mM CaCl₂, bei pH 6,0 verdünnt und bei 2 ml/Min. auf eine Mono S^TM HR 5/5 HPLC Säule (Pharmacia, Inc.) geladen, die in 5 mM MES, 5 mM CaCl₂, bei pH 6,0 (Puffer B) plus 0,1 M NaCl äquilibriert worden war. Der Faktor VIIIa wurde ohne das Waschen der Säule mit einem 20 ml Gradient von 0,1 M NaCl bis 0,9 M NaCl in Puffer B 1 ml/Min. eluiert.
Die Fraktion mit koagulierender Aktivität in dem zweistufigen Assay eluierte als eine einzelne Spitze unter diesen Bedingungen. Die spezifische Aktivität der Spitzenfraktion betrug ungefähr 7.500 U/A₂₈₀. Eine Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid Gelelektrophorese (SPS-PAGE) der Mono S^TM Faktor VIIIa Spitze, gefolgt von Silberfärbung des Proteins zeigte zwei Banden, die einem heterodimeren (A3-C1-C2/A1) Derivat von Faktor VIII entspricht. Obwohl das A2 Fragment nicht durch Silberfärbung unter diesen Bedingungen aufgrund seiner niedrigen Konzentration identifiziert wurde, wurde es als ein Spurenbestandteil durch ¹²⁵I-Markierung identifiziert.
Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit humanem Faktor VIII, wies vom Schwein stammender Faktor VIIIa, der durch Mono S^TM HPLC unter den gleichen Bedingungen isoliert wurde, eine spezifische Aktivität von 1,6 × 10⁶ U/A₂₈₀ auf. Die Ana lyse des vom Schwein stammenden Faktor VIIIa durch SDS-PAGE zeigte 3 Fragmente, die den A1, A2 und A3-C1-C2 Untereinheiten entsprechen, was zeigt, dass der vom Schwein stammende Faktor VIIIa diese Untereinheiten besitzt.
Die Ergebnisse der Mono S^TM HPLC der humanen Thrombin aktivierten Faktor VIII Präparationen bei pH 6,0 zeigen, dass der humane Faktor VIIIa unter Bedingungen labil ist, die den stabilen vom Schwein stammenden Faktor VIIIa liefern. Obwohl jedoch Spuren von Mengen des A2 Fragments in der Spitzenfraktion identifiziert wurden, war die Bestimmung, ob die koagulierende Aktivität aus kleinen Mengen eines heterotrimeren Faktor VIIIa oder aus heterodimerem Faktor VIIIa, der eine geringe spezifische Aktivität aufweist, stammt, aus diesem Verfahren alleine nicht möglich.
Ein Weg, um den humanen Faktor VIIIa zu isolieren, bevor er seine A2 Untereinheit verliert, ist wünschenswert, um diese Frage zu lösen. Hierfür wurde die Isolierung in einem Verfahren durchgeführt, das die Reduktion des pH der Mono S^TM Puffer auf pH 5 einschließt. Mono Q^TM gereinigter humaner Faktor VIII (0,5 mg) wurde mit H₂O verdünnt, um eine Endzusammensetzung von 0,25 mg/ml (1 μm) Faktor VIII in 0,25 M NaCl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCl₂, 0,005 % Tween-80 bei pH 7,4 (Gesamtvolumen 7,0 ml) zu ergeben. Thrombin wurde in einer Endkonzentration von 0,072 μm hinzugefügt und für 3 Min. umgesetzt. Thrombin wurde anschließend mit FPR-CH₂Cl (0,2 μm) inaktiviert. Das Gemisch wurde anschließend 1:1 mit 40 mM Natriumacetat, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween-80 bei pH 5,0 verdünnt und bei 2 ml/Min. auf eine Mono S^TM HR 5/5 HPLC Säule, die in 0,01 M Natriumacetat, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween-80 bei pH 5,0 plus 0,1 M NaCl äquilibriert worden war, geladen. Der Faktor VIIIa wurde ohne das Waschen der Säule mit einem 20 ml Gradient von 0,1 M NaCl bis 1,0 M NaCl in demselben Puffer bei 1 ml/Min. eluiert. Dies führte zu der Gewinnung von koagulierender Aktivität in einer Spitze, die nachweisbare Mengen des A2 Fragments enthielt, wie durch SDS-PAGE und Silberfärbung gezeigt wurde. Die spezifische Aktivität der Spitzenfraktion war zehnfach größer als jene, die bei pH 6,0 (75.000 U/A₂₈₀ v. 7.500 U/A₂₈₀) gewonnen wurde. Im Gegensatz jedoch zu vom Schwein stammendem Faktor VIIIa, der bei pH 6,0 isoliert wurde, der bei 4°C unendlich stabil ist, verringerte sich die Aktivität des humanen Faktor VIIIa ständig über einen Zeitraum von einigen Stunden nach der Elution von der Mono S^TM. Zusätzlich beträgt die spezifische Aktivität des Faktor VIIIa, der bei pH 5,0 gereinigt und sofort untersucht wurde, nur 5 % jener von vom Schwein stammender Faktor VIIIa Aktivität, was anzeigt, dass die wesentliche Dissoziation vor dem Assay stattfand.
Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl humaner als auch vom Schwein stammender Faktor VIIIa aus drei Untereinheiten (A1, A2 und A3-C1-C2) zusammengesetzt sind. Die Dissoziation der A2 Untereinheit ist für den Verlust von Aktivität von sowohl humanem als auch vom Schwein stammendem Faktor VIIIa unter bestimmten Bedingungen verantwortlich, wie physiologischer Ionenstärke, pH und Konzentration. Die relative Stabilität des vom Schwein stammenden Faktor VIIIa unter bestimmten Bedingungen liegt an der stärkeren Assoziation der A2 Untereinheit.
Beispiel 4: Herstellung eines hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII durch Rekonstitution mit Untereinheiten
Die leichten Ketten des vom Schwein stammenden Faktor VIII und die schweren Ketten des Faktor VIII wurden wie folgt isoliert. Eine 0,5 M Lösung aus EDTA bei pH 7,4 wurde zu Mono Q^TM gereinigtem, vom Schwein stammendem Faktor VIII in einer Endkonzentration von 0,05 M zugegeben und wurde bei Raumtemperatur für 18 – 24 h stehen gelassen. Ein gleiches Volumen von 10 mM Histidin-Cl, 10 mM EDTA, 0,2 % v/v Tween 80 bei pH 6,0 (Puffer B) wurde zugegeben, und die Lösung wurde bei 1 ml/Min. auf Mono S^TM HR 5/5 Säule aufgetragen, die zuvor in Puffer A plus 0,25 M NaCl äquilibriert worden war. Die schweren Ketten des Faktor VIII banden nicht an das Harz, wie durch SDS-PAGE bewertet wurde. Die leichte Kette des Faktor VIII wurde mit einem linearen, 20 ml, 0,1 – 0,7 M NaCl Gradienten in Puffer A bei 1 ml/Min. eluiert und war homogen in der SDS-PAGE. Die schweren Ketten des Faktor VIII wurden durch Mono Q^TM HPLC (Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.) in der folgenden Weise eluiert. Die schweren Ketten des Faktor VIII adsorbierten nicht an die Mono S^TM während der Reinigung der leichten Ketten des Faktor VIII. Das durchgefallene Material, das schwere Ketten des Faktor VIII enthielt, wurde bei pH 7,2 durch die Zugabe von 0,5 M Hepes Puffer, pH 7,4 eingestellt und auf eine Mono Q^TM HR 5/5 HPLC Säule (Pharmacia, Inc.) aufgetragen, die in 0,1 M NaCl, 0,02 M Hepes, 0,01 % Tween-80, pH 7,4 äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 10 ml dieses Puffers gewaschen, und die schweren Ketten des Faktor VIII wurden in einem 20 ml 0,1 – 1,0 M NaCl Gradient in diesem Puffer eluiert. Humane leichte Ketten und schwere Ketten wurden in derselben Weise isoliert.
Humane und vom Schwein stammende leichte und schwere Ketten wurden gemäß den folgenden Schritten rekonstituiert. Zehn μl leichte Kette des humanen oder vom Schwein stammenden Faktor VIII, 100 μg/ml, wurde in 1 M NaCl, 0,02 M Hepes, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween-80, pH 7,4 mit (1) 25 μl heterologer schwerer Kette, 60 μg/ml in demselben Puffer; (2) 10 μl 0,02 M Hepes, 0,01 % Tween-80, pH 7,4; (3) 5 μl 0,6 M CaCl₂ für 14 Stunden bei Raumtemperatur, gemischt. Das Gemisch wurde 1/4 mit 0,02 M MES, 0,01 % Tween-80, 5 mM CaCl₂, pH 6 verdünnt und auf eine Mono S^TM HR 5/5 aufgetragen, die in 0,1 M NaCl, 0,02 M MES, 0,01 % Tween-80, 5 mM CaCl₂, pH 6,0 äquilibriert worden war. Ein 20 ml Gradient wurde von 0,1 – 1,0 M NaCl in demselben Puffer bei 1 ml/Min. gefahren, und 0,5 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Absorption wurde bei 280 nm der Fraktionen gelesen, und die Fraktionen wurden hinsichtlich Absorption für Faktor VIII Aktivität durch den einstufigen Gerinnungsassay untersucht. Schwere Ketten waren im Überschuss anwesend, weil freie leichte Kette (nicht mit der schweren Kette assoziiert) auch an Mono S^TM bindet; überschüssige schwere Ketten stellen sicher, dass freie leichte Ketten nicht Teil der Präparation sind. Die Rekonstitutionsexperimente, gefolgt von Mono S^TM HPLC Reinigung, wurden mit allen vier möglichen Kombinationen der Ketten durchgeführt: humane leichte Kette/humane schwere Kette, humane leichte Kette/vom Schwein stammende schwere Kette, vom Schwein stammende leichte Kette/vom Schwein stammende schwere Kette, vom Schwein stammende leichte Kette/humane schwere Kette. Die Tabelle III zeigt, dass der Faktor VIII mit der humanen leichten Kette/vom Schwein stammenden schweren Kette eine Aktivität aufweist, die vergleichbar ist zu dem nati ven vom Schwein stammenden Faktor VIII (Tabelle II), was anzeigt, dass strukturelle Elemente in der vom Schwein stammenden schweren Kette für die erhöhte koagulierende Aktivität des vom Schwein stammenden Faktor VIII im Vergleich zu dem humanen Faktor VIII verantwortlich sind.
TABELLE III: VERGLEICH VON HYBRIDER HUMANER/VOM SCHWEIN STAMMENDER FAKTOR VIII KOAGULIERENDER AKTIVITÄT MIT HUMANEM UND VOM SCHWEIN STAMMENDEM FAKTOR VIII
Beispiel 5: Herstellung von aktivem hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII durch Rekonstitution mit Domänen
Das vom Schwein stammende A1/A3-C1-C2 Dimer, die vom Schwein stammende A2 Domäne, das humane A1/A3-C1-C2 Dimer und die humane A2 Domäne wurden jeweils aus vom Schwein stammendem oder humanem Blut isoliert, gemäß dem Verfahren, das beschrieben ist in Lollar, P., et al., 267(33) J. Biol. Chem. 23652-23657 (25. Nov. 1992). Um zum Beispiel das vom Schwein stammende A1/A3-C1-C2 Dimer zu isolieren, wurde vom Schwein stammender Faktor VIIIa (140 μg) bei pH 6,0 auf pH 8,0 durch die Zugabe von 5 N NaOH für 30 Minuten angehoben, um die Dissoziation der A2 Domäne und 95 Prozent Inaktivierung im Gerinnungsassay zu bewirken. Das Gemisch wurde 1:8 mit Puffer B (20 mM HEPES, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween-80, pH 7,4) verdünnt auf eine Mono S Säule aufgetragen, die in Puffer B äquilibriert worden war. Das A1/A3-C1-C2 Dimer eluierte als eine einzelne scharfe Spitze bei ungefähr 0,4 M NaCl unter Verwendung eines 0,1 – 1,0 M NaCl Gradienten in Puffer B. Um die vom Schwein stammende A2 Domäne zu isolieren wurde vom Schwein stammender Faktor VIIIa hergestellt gemäß dem Verfahren von Lollar, P. und C.G. Parker, 28 Biochem. 666-674 (1984), ausgehend von 0,64 mg Faktor VIII. Freie vom Schwein stammende A2 Domäne wurde als ein geringerer Bestandteil (50 μg) bei 0,3 M NaCl in dem Mono S^TM Chromatogramm isoliert.
Hybride humane/vom Schwein stammende Faktor VIII Moleküle wurden aus den Dimeren und Domänen wie folgt rekonstituiert. Die Konzentrationen und Puffer Bedingungen für die gereinigten Bestandteile waren wie folgt: vom Schwein stammende A2, 0,63 μM in Puffer A (5 mM MES; 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween 80, pH 6,0) plus 0,3 M NaCl; vom Schwein stammende A1/A3-C1-C2, 0,27 μM in Puffer B plus 0,4 M NaCl, pH 7,4; humane A2, 1 μM in 0,3 M NaCl, 10 mM Histidin-HCl, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween 20, pH 6,0; humane A1/A3-C1-C2, 0,18 μM in 0,5 M NaCl, 10 mM Histidin-Cl, 2,5 mM CaCl₂, 0,1 % Tween-20, pH 6,0. Die Rekonstitutionsexperimente wurden durchgeführt durch Mischen gleicher Volumina der A2 Domäne und des A1/A3-C1-C2 Dimers. In den Mischexperimenten mit vom Schwein stammendem A1/A3-C1-C2 Dimer wurde der pH auf 6,0 durch die Zugabe von 0,5 M MES, pH 6,0 bei 70 mM erniedrigt.
Die koagulierenden Aktivitäten von allen vier möglichen hybriden Faktor VIIIa Molekülen – [pA2/(hA1/A3-C1-C2)], [hA2/(pA1/A3-C1-C2)], [pA2/(pA1/pA3-C1-C2)] und [hA2/(hA1/A3-C1-C2)] – wurden durch einen zweistufigen Gerinnungsassay zu verschiedenen Zeitpunkten erhalten.
Die Bildung von Aktivität im Anschluss an das Mischen der A2 Domänen und der A1/A3-C1-C2 Dimere war nahezu vollständig nach einer Stunde und war stabil für mindestens 24 Stunden bei 37°C. Die Tabelle IV zeigt die Aktivität von rekonstituiertem hybriden Faktor VIIIa Moleküle, wenn sie nach 1 Stunde untersucht wurden. Der zweistufige Assay, durch den die spezifischen Aktivitäten der Faktor VIIIa Moleküle erhalten wurden, unterscheidet sich von dem einstufigen Assay, und die Werte können nicht mit den Aktivitätswerten der Faktor VIIIa Moleküle verglichen werden, die in einem einstufigen Assay erhalten werden.
TABELLE IV: VERGLEICH DER KOAGULIERENDEN AKTIVITÄTEN VON HYBRIDEM HUMANEN/VOM SCHWEIN STAMMENDEN FAKTOR VIIIa MIT SUBSTITUIERTEN DOMÄNEN
Die Tabelle IV zeigt, dass die größte Aktivität durch das vom Schwein stammende A2 Domäne/humanes A1/A3-C1-C2 Dimer gezeigt wurde, gefolgt von der vom Schwein stammenden A2 Domäne/vom Schwein stammende A1/A3-C1-C2 Dimer.
Wenn somit die A2 Domäne des vom Schwein stammenden Faktor VIIIa mit dem A1/A3-C1-C2 Dimer des humanen Faktor VIIIa gemischt wurde, wurde koagulierende Aktivität erhalten. Wenn weiterhin die A2 Domäne des humanen Faktor VII-Ia mit dem A1/A3-C1-C2 Dimer des vom Schwein stammenden Faktor VIIIa gemischt wurde, wurde koagulierende Aktivität erhalten. Die A2, A1 und A3-C1-C2 Regionen weisen selbst keine koagulierende Aktivität auf.
Beispiel 6: Isolierung und Sequenzierung der A2 Domäne des vom Schwein stammenden Faktor VIII
Nur die Nukleotidsequenz, welche die B Domäne und einen Teil der A2 Domäne des vom Schwein stammenden Faktor VIII kodiert, wurden zuvor sequenziert (Toole, J.J., et al., 83 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5939-5942 (1986)). Die cDNA und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen (jeweils SEQ ID NR: 3 und 4) für die gesamte vom Schwein stammende Faktor VIII A2 Domäne sind hier offenbart.
Die vom Schwein stammende Faktor VIII A2 Domäne wurde durch reverse Transkription der vom Schwein stammenden Milz Gesamt RNA und PCR Amplifikation kloniert; degenerierte Primer, basierend auf der bekannten humanen Faktor VIII cDNA Sequenz und ein exakter vom Schwein stammender Primer basierend auf einem Teil der vom Schwein stammenden Faktor VIII Sequenz wurden verwendet. Ein 1 kb PCR Produkt wurde isoliert und durch Insertion in einen Bluescript^TM (Stratagene) Phagemid Vektor amplifiziert.
Die vom Schwein stammende A2 Domäne wurde vollständig durch Didesoxysequenzierung sequenziert. Die cDNA und die vorhergesagte Aminosäuresequenz sind jeweils in SEQ ID NR: 3 und 4 beschrieben.
Beispiel 7: Herstellung von rekombinanten hybriden humanem/tierischen Faktor VIII
Die Nukleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz (jeweils SEQ ID NR: 1 und 2) des humanen Faktor VIII wurden in der Literatur beschrieben (Toole, J.J., et al., 312 Nature 342-347 (1984) (Genetics Institute); Gitschier, J., et al., 312 Nature 326-330 (1984) (Genentech); Wood, W.I., et al., 312 330-337 (1984) (Genentech); Vehar, G.A., et al., 312 Nature 337-342 (1984) (Genentech)).
Die Herstellung des rekombinanten hybriden humanen/tierischen Faktor VIII erfordert es, dass eine Region der humanen Faktor VIII cDNA (Biogen Corp.) entfernt wird und die tierische cDNA Sequenz mit identischer Sequenz inseriert wird. Anschließend wird die hybride cDNA Sequenz in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert. Als ein Beispiel wurden hybride Faktor VIII cDNAs kloniert, in denen ein Teil oder die vollständige vom Schwein stammende A2 Domäne gegen die entsprechenden humanen A2 Sequenzen ausgetauscht wurden. Anfänglich wurde die gesamte cDNA Sequenz, die der A2 Domäne des humanen Faktor VIII entspricht, und anschließend ein kleinerer Teil der A2 Domäne durch Oligonukleotid vermittelte Mutagenese herausgeloopt, ein Verfahren, das dem Fachmann allgemein bekannt ist (siehe z.B. Sambrook, J., E.F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Kapitel 15, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1989). Die Schritte waren wie folgt:
Materialien
Methoxycarbonyl-D-cyclohexylglycyl-glycl-arginin-p-nitroanilid (Spectrozyme^TM Xa) und die Anti-Faktor VIII monoklonalen Antikörper ESH4 und ESH8 wurden von American Diagnostica (Greenwich, CT) gekauft. Unilamellare Phosphatidylcholin/Phosphatidylserin (75/25, w/w) Vesikel wurden hergestellt gemäß dem Verfahren von Barenholtz, Y., et al., 16 Biochemistry 2806-2810 (1977)). Rekombinantes Desulfatohirudin wurde von Dr. R. B. Wallis, Ciba-Geigy Pharmaceuticals (Cerritos, CA) erhalten. Die vom Schwein stammenden Faktoren IXa, X, Xa und Thrombin wurden isoliert gemäß den Verfahren von Lollar, P., et al., 63 Blood 1303-1306 (1984) und Duffy, E.J. und P. Lollar, 207 J. Biol. Chem. 7621-7827 (1992). Albumin freier reiner rekombinanter humaner Faktor VIII wurde von Baxter-Biotech (Deerfield, IL) erhalten.
Klonierung der vom Schwein stammenden Faktor VIII A2 Domäne
Die cDNA, welche die vom Schwein stammende A2 Domäne kodiert, wurde nach PCR der revers transkribierten vom Schwein stammenden Milz mRNA erhalten, die isoliert wurde wie beschrieben von Chomczynski, P. und Sacchi, N., 162 Anal. Biochem. 156-159 (1987). Die cDNA wurde hergestellt unter Verwendung des cDNA Synthesekits für den ersten Strang mit zufälligen Hexameren als Primern (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung eines 5'-terminalen degenerierten Primers 5' AARCAYCCNAARACNTGGG 3' (SEQ ID NR: 11), basierend auf der bekannten begrenzten vom Schwein stammenden A2 Aminosäuresequenz, und einem 3'-terminalen exakten Primer, 5' GCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTC 3' (SEQ ID NR: 12), beruhend auf der bekannten vom Schwein stammenden DNA Sequenz unmittelbar 3' der vom Schwein stammenden A2 Domäne. Diese Oligonukleotide entsprechen den Nukleotiden 1186 – 1203 und 2289 – 2313 in der humanen Sequenz (SEQ ID NR: 1). Die Amplifikation wurde für 35 Zyklen durchgeführt (1 Minute 94°C, 2 Minuten 50°C, 2 Minuten 72°C) unter Verwendung von Taq DNA Polymerase (Promega Corp., Madison, WI). Das 1,1 Kilobasen amplifizierte Fragment wurde in pBluescript II KS-(Stratagene) in die EcoRV Stelle unter Verwendung des T-Vektor Verfahrens kloniert, wie beschrieben wurde von Murchuk, D., et al., 19 Nucl. Acids Res. 1154 (1991). Escherichia coli XL1-Blue kompetente Zellen wurden transformiert, und Plasmid DNA wurden isoliert. Die Sequenzierung wurde in beide Richtungen unter Verwendung von Sequenase^TM Version 2,0 durchgeführt (US. Biochemical Corp., eine Abteilung von Amersham LifeScience, Inc., Arlington Hts, IL). Diese Sequenz wurde durch eine identische Sequenz bestätigt, die durch direkte Sequenzierung des PCR Produkts aus einer unabhängigen reversen Transkription von Milz RNA aus demselben Schwein erhalten wurde (CircumVent^TM, New England Biolabs, Beverly, MA). Die Region, die das Epitop für den Autoantikörper RC enthält, wurde als 373 – 536 in dem humanen Faktor VIII (SEQ ID NR: 2) identifiziert.
Konstruktion und Expression einer hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII cDNA
B domänenloser humaner Faktor VIII (HB-, von Biogen, Inc. Cambridge, MA), dem die Sequenzen fehlen, die für die Aminosäure Reste 741 – 1648 kodieren (SEQ ID NR: 2), wurde als das Ausgangsmaterial für die Konstruktion eines hybriden humanenlvom Schwein stammenden Faktor VIII verwendet. HB- wurde in den Expressionsvektor ReNeo kloniert. Um die Manipulation zu erleichtern wurde die cDNA für Faktor VIII als ein XhoI/HpaI Fragment aus ReNeo isoliert und in XhoI/EcoRV gespaltenen pBluescript II KS kloniert. Ein Oligonukleotid, 5' CCTTCCTTTATCCAAATACGTAGATCAAGAGGAAATTGAC 3' (SEQ ID NR: 7) wurde in einer seitengerichteten Mutagenese Reaktion unter Verwendung von Uracil enthaltender Phagen DNA verwendet, wie beschrieben von Kunkel, T.A., et al., 204 Meth. Enzymol. 125 – 139 (1991), um gleichzeitig die humane A2 Sequenz (Nukleotide 1169 – 2304 in SEQ ID NR: 1) herauszuloopen und eine SnaBI Restriktionsstelle einzuführen. Das A2-domänenlose humane Faktor VIII enthaltende Plasmid wurde mit SnaBI gespalten, gefolgt durch die Zugabe von ClaI Linkern. Die vom Schwein stammende A2 Domäne wurde anschließend durch PCR amplifiziert unter Verwendung jeweils des phosphorylierten 5'-Primers 5' GTAGCGTTGCCAAGAAGCACCCTAAGACG 3' (SEQ ID NR: 8) und des 3'-Primers 5' GAAGAGTAGTACGAGTTATTTCTCTGGGTTCAATGAC 3' (SEQ ID NR: 9). ClaI Linker wurden zu dem PCR Produkt zugegeben, gefolgt durch Ligation in den humanen Faktor VIII enthaltenden Vektor. Die A1/A2 und A2/A3 Übergänge wurden korrigiert, um die exakten Thrombin Spaltungs- und flankierenden Sequenzen wiederherzustellen durch seitengerichtete Mutagenese unter Verwendung der Oligonukleotide, die in SEQ ID NR: 8 gezeigt sind, und der Nukleotide 1 – 22 (5' GAA ... TTC in SEQ ID NR: 9), um jeweils den 5'- und den 3'-terminalen Übergang zu korrigieren. In dem resultierenden Konstrukt, das als HP1 bezeichnet wird, wurde die humane A2 Domäne exakt gegen die vom Schwein stammende Domäne ausgetauscht. Ein vorläufiges Produkt enthielt ein ungewünschtes Thymin an dem A1-A2 Übergang als ein Ergebnis der PCR Amplifikation der vom Schwein stammenden A2 Domäne. Diese einzelne Base kann unter Verwendung des mutagenen Oligonukleotids 5' CCTTTATCCAAATACGTAGC GTTTGCCAAGAAG 3' (SEQ ID NR: 10) herausgeloopt werden.
Eine Region, die 63 % der vom Schwein stammenden NH₂-terminalen A2 Domäne enthält, die das putative A2 Epitop umfasst, wurde gegen die homologe humane Sequenz der B domänenlosen cDNA substituiert durch Austauschen der SpeI/BamHI Fragmente zwischen den pBluescript Plasmiden, welche die cDNA für den humanen Faktor VIII und den humanen/vom Schwein stammenden A2 Faktor VIII enthalten. Die Sequenz wurde durch Sequenzieren der A2 Domäne und der Spleißstellen bestätigt. Schließlich wurde ein SpeI/ApaI Fragment, das die gesamte A2 Sequenz enthält, anstelle der entsprechenden Sequenz in dem HB-substituiert, was das HP2 Konstrukt lieferte.
Die vorläufige Expression von HB- und HP2 in COS-7 Zellen wurde nach der DEAE Dextran vermittelten DNA Transfektion untersucht, wie beschrieben von Seldon, R.F., in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M., et al., Hrsg.), S. 9.21 – 9.26, Wiley Interscience, N.Y. Nachdem die Expression des aktiven Faktor VIII bestätigt wurde und vorläufige Antikörper Inhibitionsstudien durchgeführt wurden, wurde HB- und HP2 DNA anschließend stabil in Baby Hamster Nierenzellen unter Verwendung der Liposomen vermittelten Transfektion transfiziert (Lipofectin^® Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). Plasmid enthaltende Klone wurden hinsichtlich G418 Resistenz in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium-F12, 10 % fötales Kälberserum (DMEM-F12/10 % fötales Kälberserum), enthaltend 400 μg/ml G418 selektiert, gefolgt von der Aufrechterhaltung in DMEM-F12/10 % fötales Kälberserum enthaltend 100 μg/ml G418. Die Kolonien, die eine maximale Expression von HB- und HP2 Faktor VIII Aktivität zeigten, wurden durch Ringklonieren und der Erweiterung für weitere Charakterisierung selektiert.
Die HB- und HP2 Faktor VIII Expression wurde durch den Plasma freien Faktor VIII Assay, den einstufigen Gerinnungsassay und den Enzym verknüpften Immunosorbent Assay unter Verwendung von gereinigtem rekombinanten humanen Faktor VIII als einen Standard verglichen. Spezifische koagulierende Aktivitäten von 2600 und 2580 Einheiten/mg wurden jeweils für HB- und HP2 erhalten. HB- und HP2 lieferten jeweils 1,2 und 1,4 Einheiten/ml/48 Stunden/10⁷ Zellen. Dies ist identisch zu jenem des Wildtyp Konstrukts (2.600 ± 200 Einheiten/mg). Die spezifischen Aktivitäten von HB- und HP2 waren nicht unterscheidbar in dem Plasma freien Faktor VIII Assay.
Konstruktion und Expression des hybriden humanen, nicht humanen, nicht vom Schwein stammenden Säuger und hybriden äquivalenten Faktor VIII
Die Klonierung von anderen tierischen A1, A3, C1 und C2 Domänen und teilweisen Domänen ist mit derselben Strategie, die für die Klonierung der vom Schwein stammenden A2 Domäne verwendet wurde, machbar. Fragmente und diese Domänen können durch die Loop out Mutagenese Technik kloniert werden. Das Ausschneiden der korrespondierenden Domänen in humanem Faktor VIII und irgendwelcher Fragmente davon, einschließlich einzelner Aminosäure Eliminationen, ist durch die Loop out Mutagenese, wie oben beschrieben, machbar. Alle möglichen Domänen Austausche, Fragmente von Domänen Austauschen oder Austausche von einzelnen Aminosäure Resten sind durch diesen Ansatz, kombiniert mit seitengerichteten Mutagenese Techniken, wie Splicing durch überlappende Extension und Alanin Scanning Mutagenese, möglich.
Die biologische Aktivität von rekombinantem hybriden humanen/tierischen und äquivalentem Faktor VIII mit A1, A2, A3, C1 und/oder C2 Domänen Austauschen können anfänglich durch die Verwendung eines COS-Zellen Säuger transienten Expressionssystem bewertet werden. Hybride humane/tierische und äquivalente cDNA kann in COS-Zellen transfiziert werden, und die Überstände können hinsichtlich Faktor VIII Aktivität durch die Verwendung von einstufigen und zweistufigen Koagulationsassays, wie oben beschrieben, analysiert werden. Zusätzlich kann die Faktor VIII Aktivität durch die Verwendung eines chromogenen Substrat Assays, gemessen werden, der sensitiver ist und die Analyse von größeren Zahlen von Proben erlaubt. Ähnliche Assays sind Standard bei den Assays für Faktor VIII Aktivität (Wood, W.I., et al., 312 Nature 330-337, 1984; Tolle, J.J., et al., 312 Nature 342-347 (1984)). Die Expression von rekombinantem Faktor VIII in COS-Zellen ist auch ein Standardverfahren (Toole, J.J., et al., 312 Nature 342-347, 1984; Pittman, D.D. und R.J. Kaufman, 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2429-2433, 1988). Die humane Faktor VIII cDNA, die als Ausgangsmaterialien für die hier beschriebenen rekombinanten Moleküle verwendet wurde, wurde in COS-Zellen exprimiert, was zu einem Produkt mit biologischer Aktivität führte. Dieses Material, wie oben beschrieben, kann als ein Standard verwendet werden, um hybride humane/tierische Faktor VIII Moleküle zu vergleichen. Die Aktivität in den Assays wird in eine spezifische Aktivität für den richtigen Vergleich der hybriden Moleküle umgewandelt. Hierfür ist eine Messung der Masse des Faktor VIII, der von den Zellen gebildet wird, notwendig, und dies kann durch Immun Assay mit gereinigtem humanen und/oder tierischen Faktor VIII als Standards durchgeführt werden. Immun Assays für Faktor VIII sind Routine für den Fachmann (siehe z.B., Lollar, P., et al., 71 Blood 137-143, 1988).
Beispiel 8: Bestimmung der inhibitorischen Aktivität in hybridem humanen/tierischen und äquivalentem Faktor VIII
Die Sequenzen des humanen und tierischen Faktor VIII, von denen wahrscheinlich ist, dass sie als Epitope involviert sind (d.h. als Erkennungsstellen für inhibitorische Antikörper, die mit Faktor VIII reagieren), können durch Routineverfahren bestimmt werden, zum Beispiel durch die Verwendung eines Assays mit Antikörpern gegen Faktor VIII, kombiniert mit seitengerichteten Mutagenese Techniken, wie Spleißen durch überlappende Extensionsverfahren (SOE), wie unten gezeigt. Sequenzen von tierischem Faktor VIII, die im Vergleich zu den entsprechenden antigenen humanen Sequenzen nicht antigen sind, können identifiziert werden, und Austausche können durchgeführt werden, um tierische Sequenzen zu inserieren und humane Sequenzen zu deletieren, gemäß Standard rekombinanten DNA Verfahren. Sequenzen von Aminosäuren, wie Alanin Reste, die keine bekannte Sequenzidentität zu Faktor VIII aufweisen, können ebenfalls durch Standard rekombinante DNA Verfahren oder durch Alanin Scanning Mutagenese ausgetauscht werden. Der vom Schwein stammende Faktor VIII reagiert weniger als humaner Faktor VIII mit einigen inhibitorischen Antikörpern; dies liefert eine Basis für die herkömmliche Therapie für Patienten mit Inhibitoren. Nachdem die rekombinanten Hybride hergestellt wurden, können sie in vitro hinsichtlich Reaktivität mit Routine Assays untersucht werden, einschließlich dem Bethesda Inhibitor Assay. Jene Konstrukte, die weniger reaktiv sind als nativer humaner Faktor VIII und nativer tierischer Faktor VIII, sind Kandidaten für die Austauschtherapie.
Von den Epitopen, gegen welche die meisten, wenn nicht alle inhibitorischen Antikörper gerichtet sind, die mit humanem Faktor VIII reagieren, wird angenommen, dass sie in zwei Regionen in dem 2332 Aminosäuren humanen Faktor VIII Molekül, der A2 Domäne (Aminosäure Reste 373 – 740) und der C2 Domäne (Aminosäure Reste 2173 – 2332, beide Sequenzen sind in SEQ ID NR: 2 gezeigt) angeordnet sind. Das A2 Epitop wurde durch die Herstellung eines rekombinanten hybriden humanen-vom Schwein stammenden Faktor VIII Molekül eliminiert, in dem ein Teil der humanen A2 Domäne durch die vom Schwein stammende Sequenz ausgetauscht ist, die Sequenzidentität zu der ausgetauschten humanen Aminosäuresequenz aufweist. Dies wurde erreicht, wie in Beispiel 7 beschrieben ist, durch Klonieren der vom Schwein stammenden A2 Domäne durch Standard molekularbiologische Techniken und anschließendes Schneiden und Spleißen innerhalb der A2 Domäne unter Verwendung von Restriktionsstellen. In dem resultierenden Konstrukt, als HP2 bezeichnet, wurden die Reste 373 – 604 (SEQ ID NR: 4) des vom Schwein stammenden Faktor VIII in der humane A2 Domäne ausgetauscht HP2 wurde hinsichtlich Immunreaktivität mit anti-humanen Faktor VIII Antikörpern unter Verwendung der folgenden Verfahren untersucht.
Faktor VIII Enzym verbundener Immunosorbent Assay
Die Vertiefungen der Mikrotiter Platte wurden mit 0,15 ml 6 μg/ml ESH4, einem Antikörper gegen die leichte Kette des humanen Faktor VIII, beschichtet und über Nacht inkubiert. Nachdem die Platte dreimal mit H₂O gewaschen wurde, wurden die Vertiefungen für 1 Stunde mit 0,15 M NaCl, 10 mM Natriumphosphat, 0,05 % Tween 20, 0,05 % Magermilch Trockenpulver, 0,05 % Natriumazid, pH 7,4 blockiert. Um die Sensitivität zu erhöhen, wurden die Proben, die Faktor VIII enthalten, mit 30 nM Thrombin für 15 Minuten aktiviert. Rekombinantes Desulfatohirudin wurde anschließend bei 100 nM zugegeben, um das Thrombin zu inhibieren. Die Platte wurde nochmals gewaschen, und 0,1 ml der Probe oder reiner rekombinanter humaner Faktor VIII (10 – 600 ng/ml), der als Standard verwendet wurde, wurden zugegeben. Nach einer 2-stündigen Inkubation wurde die Platte gewaschen, und 0,1 ml biotinylierter ESH8, ein anderer Antikörper gegen die leichte Kette des Faktor VIII, wurde zu jeder Vertiefung zugegeben. ESH8 wurde unter Verwendung des Pierce Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamid)hexonat Biotinylierungskit biotinyliert. Nach einer 1-stündigen Inkubation wurde die Platte gewaschen, und 0,1 ml Streptavidin alkalische Phosphatase wurde zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platte wurde unter Verwendung des Bio-Rad alkalische Phosphatase Substrat Reagens Kit entwickelt, und die resultierende Absorption bei 405 nm wurde für jede Vertiefung unter Verwendung eines Vmax Mikrotiter Platten Lesegeräts bestimmt (Mole cular Devices, Inc., Sunnyville, CA). Unbekannte Faktor VIII Konzentrationen wurden aus dem linearen Abschnitt der Faktor VIII Standardkurve bestimmt.
Faktor VIII Assays
HB- und HP2 Faktor VIII wurden in einem einstufigen Gerinnungsassay gemessen, der durchgeführt wurde wie oben beschrieben (Bowie, E.J.W. und C.A. Owen, in Disorders of Hemostasis (Ratnoff und Forbes, Hrsg.) S. 43-72, Grunn & Stratton, Inc., Orlando, FL (1984)) oder durch einen Plasma freien Assay wie folgt. HB- oder HP2 Faktor VIII wurde durch 40 nM Thrombin in 0,15 M NaCl, 20 nM HEPES, 5 mM CaCl₂, 0,01 % Tween 80, pH 7,4 in der Anwesenheit von 10 nM Faktor IXa, 425 nM Faktor X und 50 μM unilamellaren Phosphatidylserin/Phosphatidylcholin (25/75, w/w) Vesikeln aktiviert. Nach 5 Minuten wurde die Reaktion mit 0,05 M EDTA und 100 nM rekombinantem Desulfatohirudin abgestoppt, und der resultierende Faktor Xa wurde durch einen chromatogenen Substrat Assay gemessen, gemäß dem Verfahren von Hill-Eubanks, D.C. und P. Lollar, 265 J. Biol. Chem. 17854-17858 (1990). Unter diesen Bedingungen war die Menge des gebildeten Faktor Xa linear proportional zu der Ausgangs Faktor VIII Konzentration, wie unter Verwendung von gereinigtem rekombinanten humanen Faktor VIII (Baxter Biotech, DeerField, IL) als dem Standard bewertet wurde.
Vor dem Gerinnungsassay wurden HB- oder HP2 Faktor VIII aus dem für 48 Stunden konditionierten Medium auf 10 – 15 Einheiten/ml durch Heparin-Sepharose^TM Chromatographie konzentriert. HB- oder HP2 Faktor VIII wurden zu Hämophilie A Plasma (George King Biomedical) in einer Endkonzentration von 1 Einheit/ml zugegeben. Die Inhibitor Titer in RC or MR Plasma oder eine Stocklösung von mAb 413 IgG (4 μM) wurden durch den Bethesda Assay gemessen, wie beschrieben ist von Kasper, C.K., et al., 34 Thromb. Diath. Haemorrh. 869-872 (1975). Inhibitor IgG wurde hergestellt wie beschrieben von Leyte, A., et al., 266 J. Biol. Chem. 740-746 (1991).
HP2 reagiert nicht mit Anti-A2 Anitkörpern. Deshalb müssen die Reste 373 – 603 ein Epitop für Anti-A2 Antikörper enthalten.
Herstellung von hybridem humanen-vom Schwein stammenden Faktor VIII und Assay durch Spleißen durch überlappende Extension (SOE)
Einige weitere prokoagulierende rekombinante hybride humane/vom Schwein stammende Faktor VIII B domänenlose Moleküle mit vom Schwein stammenden Aminosäure Austauschen in der humanen A2 Region wurden hergestellt, um das A2 Epitop weiter einzugrenzen. Neben den Restriktionsstellen Techniken, wurde das "Spleißen durch überlappende Extension" Verfahren (SOE), wie beschrieben von Ho, S.N., et al., 77 Gene 51-59 (1989), verwendet, um irgendeine willkürliche Region der vom Schwein stammenden Faktor VIII cDNA auszutauschen. In der SOE wird die Spleißstelle definiert durch überlappende Oligonukleotide, die amplifiziert werden können, um die gewünschte cDNA durch PCR herzustellen. Zehn cDNA Konstrukte, als HP4 bis HP13 bezeichnet, wurden hergestellt. Sie wurden in den ReNeo Expressionsvektor inseriert, stabil in Baby Hamster Nierenzellen transfiziert und in hohen Mengen exprimiert [0,5 – 1 μg (ungefähr 3 – 6 Einheiten)/10⁷ Zellen/24 Stunden], wie in Beispiel 7 beschrieben ist. Die Faktor VIII koagulierende Aktivität wurde in der Anwesenheit und Abwesenheit eines Modell murinen monoklonalen inhibitorischen Antikörpers, der spezifisch für die A2 Domäne ist, mAb413, bestimmt. In der Abwesenheit von Inhibitor wiesen alle die Konstrukte eine spezifische koagulierende Aktivität auf, die von jener des B(–) humanen Faktor VIII nicht unterscheidbar war.
Die hybriden humanen/vom Schwein stammenden Faktor VIII Konstrukte wurden hinsichtlich Reaktivität mit dem Anti-A2 Inhibitor mAb413 unter Verwendung des Bethesda Assay untersucht (Kasper, C.K., et al., 34 Thromb. Diath. Haemorrh. 869-872 (1975)). Die Bethesda Einheit (BU) ist ein Standardverfahren zum Messen von Inhibitor Titern. Die Ergebnisse sind in der Tabelle V gezeigt, und sie werden mit dem rekombinanten humanen Faktor VIII verglichen.
TABELLE V: VERGLEICH DER IMMUNREAKTIVITÄT VON HYBRIDEM HUMANEN/VOM SCHWEIN STAMMENDEN FAKTOR VIII MIT AUSGETAUSCHTEN AMINOSÄUREN
Die Grenzen der vom Schwein stammenden Austausche werden durch die erste Aminosäure, die sich zwischen dem humanen und vom Schwein stammenden Faktor VIII an dem NH₂-terminalen und dem C-terminalen Ende der Insertion unterscheidet, definiert. Wie in der Tabelle V gezeigt ist, wenn der Bethesda Titer nicht messbar ist (< 0,7 BU/mg IgG), dann liegt ein A2 Epitop in der Region der ausgetauschten vom Schwein stammenden Sequenz. Das Epitop wurde schrittweise auf die Reste 484 – 509 (SEQ ID NR: 2) eingegrenzt, das nur aus 25 Resten besteht, wie durch die Nichtreaktivität von mAb413 mit HP9 exemplarisch gezeigt ist. Unter den Konstrukten HP4 bis HP11, war HP9 das am meisten "humanisierte" Konstrukt, das nicht mit dem Inhibitor reagierte. Dies zeigt, dass eine kritische Region in dem A2 Epitop innerhalb der Sequenz Arg484 – Ile508 angeordnet ist.
Basierend auf einem Vergleich zwischen humanem und vom Schwein stammendem Faktor VIII der Aminosäuresequenz in dieser kritischen Region wurden zwei weitere Konstrukte, HP12 und HP13 hergestellt, in denen die entsprechende vom Schwein stammende Aminosäuresequenz gegen jeweils die humanen Aminosäuren 489 – 508 und 484 – 488 ausgetauscht waren. Keines davon reagiert mit mAb413. Dies zeigt, dass die Reste auf jeder Seite der Arg488 – Ser489 Grenze für die Reaktion mit A2 Inhibitoren wichtig sind. In HP12 sind nur 5 Reste nicht human, und in HP13 sind nur 4 Reste nicht human. Die 484 – 508, 484 – 488 und 489 – 508 vom Schwein stammenden ausgetauschten Hybride zeigten eine verringerte Inhibition durch A2 Inhibitoren aus Plasma von vier Patienten, was nahe legt, dass es eine geringe Variation in der Struktur des A2 Epitops gemäß der Inhibitor Populationsantwort gibt.
Die Reaktivität der am meisten humanisierten Konstrukte, HP9, HP12 und HP13 mit zwei Anti-A2 IgGS Präparationen, die aus Inhibitor Plasma hergestellt wurden, wurde bestimmt. Wie mAb413 reagierten diese Antikörper nicht mit HP9, HP12 und HP13, aber sie reagierten mit den Kontrollkonstrukten HP(–) und HP8.
Die Region zwischen 484 – 508 kann weiter für die Endidentifizierung des kritischen A2 Epitops unter Verwendung derselben Verfahren weiter analysiert werden.
Die Verfahren, die in den Beispielen 7 und 8 beschrieben sind, können verwendet werden, um einen anderen hybriden humanen/nicht vom Schwein stammenden Säuger Faktor VIII mit einem Aminosäure Austausch in der humanen A2 oder anderen Domänen, einen hybriden humanen/tierischen oder tierischen/tierischen Faktor VIII mit einem Aminosäure Austausch in irgendeiner Domäne, oder ein hybrides Faktor VIII äquivalentes Molekül oder Fragmente von irgendeinem davon, herzustellen, solche hybride Faktor VIII weisen eine verringerte oder abwesende Immun Reaktivität mit Anti-Faktor VIII Antikörpern auf.
Beispiel 9: Eliminierung von humaner Faktor VIII A2 Inhibitor Reaktivität durch seitengerichtete Mutagenese
Beispiel 8 zeigte, dass der Austausch der vom Schwein stammenden Sequenz, die durch die Reste 484 und 508 begrenzt ist, in der humanen Faktor VIII A2 Domäne ein Molekül liefert, das eine merklich verringerte Reaktivität gegenüber einer Auswahl von A2 spezifischen Faktor VIII Inhibitoren aufweist (siehe auch Healey et al., J. Biol. Chem. 270:14505-14509, 1995). In dieser Region gibt es 9 Aminosäure Unterschiede zwischen dem humanen und dem vom Schwein stammenden Faktor VIII. Diese neun Reste in dem humanen B domänenlosen Faktor VIII, R484, P485, Y487, P488, R489, P492, V495, F501 und I508 (unter Verwendung des Aminosäure Kodes mit einzelnen Buchstaben), wurden einzeln gegen Alanin durch seitengerichtete Mutagenese ausgetauscht. Zusätzlich wurden MluI und SacII Restriktionsstellen in der Faktor VIII cDNA an den Seiten 5' und 3' relativ zu dem A2 Epitop angeordnet, ohne die Aminosäuren zu verändern, die diesen Stellen entsprechen, um die Klonierung zu erleichtern. Die neun Mutanten wurden stabil in Baby Hamster Nierenzellen transfiziert und in großen Mengen exprimiert. Alle neun lieferten biologisch aktiven Faktor VIII. Sie wurden teilweise gereinigt und durch Heparin-Sepharose Chromatographie, wie von Healey et al. beschrieben, konzentriert.
Die Mutanten wurden hinsichtlich ihrer Reaktivität mit dem murinen monoklonalen Inhibitor mAb413, wie in Beispiel 7, charakterisiert. Dieser Inhibitor erkennt das gleiche oder ein sehr nahe angrenzendes Epitop in der A2 Domäne, wie alle humanen Inhibitoren, die bis heute untersucht wurden. Die Inhibitor Reaktivität wurde unter Verwendung des Bethesda Assay gemessen. In Kürze ist der Bethesda Titer eines Inhibitors die Verdünnung des Inhibitors, der den Faktor VIII um 50 % in einem Standard einstufigen Faktor VIII Gerinnungsassay inhibiert. Wenn zum Beispiel die Lösung des Antikörpers 1/420 verdünnt wird und sie die rekombinante Faktor VIII Testprobe um 50 % inhibiert, beträgt der Bethesda Titer 420 U. Im Fall eines reinen monoklonalen Antikörpers, wie mAb413, ist die Masse des Antikörpers bekannt, so dass die Ergebnisse in Bethesda Einheiten (BU) pro mg mAb413 ausgedrückt werden. Um den 50 % inhibitorischen Punkt zu finden, wurde eine Verdünnungsreihe von mAb413 hergestellt, und die 50 % Inhibition wurde durch ein Kurven Anpassungsverfahren gefunden. Die Ergebnisse sind wie folgt: TABELLE VI

* relative zu Wildtyp

Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, die Antigenität von Faktor VIII gegenüber dem Modell A2 Inhibitor um über einen Faktor von 10 zu verringern, indem Alanin Austausche an den Positionen 484, 487, 489 und 492 vorgenommen werden. Die Reaktivität von R489 → A ist um nahezu 4 Größenordnungen verringert. Irgendeine dieser Alanin Austausche kann therapeutisch nützlich sein, um die Antigenität und die Immunogenität von Faktor VIII zu verringern.
Die Ergebnisse bestätigen die Wirksamkeit der Alanin Scanning Mutagenese und zeigen weiterhin, dass die biologische Aktivität zurückbehalten wird, selbst wenn die Aminosäuresequenz innerhalb eines Epitops verändert wurde, das mit einem inhibitorischen Antikörper reaktiv ist. Fünf der neun Stellen, an denen die humane und die vom Schwein stammende Sequenz sich unterscheiden, sind auch Stellen, an denen sich die humane und die murine Sequenz unterscheiden. Die Faktoren VIII mit Alanin Austauschen an diesen Positionen sind deshalb Beispiele eines hybriden Faktor VIII äquivalenten Moleküls mit einer Sequenz mit unbekannter Sequenzidentität mit irgendeinem gegenwärtig bekannten Säuger Faktor VIII.
Weitere Modifikationen, z.B. Kombinieren von zwei Alanin Austauschen, kann ebenfalls eine stark verringerte Antigenität für einen größeren Bereich von Patienten bereitstellen, weil polyklonale Varianten von Antikörpern, die sich von Patient zu Patient unterscheiden, mit Varianten des Faktor VIII A2 Epitops reagieren können. Zusätzlich wird die Immunogenität (die Fähigkeit, Antikörper zu induzieren) weiter durch den Einbau von mehr als einem Aminosäure Austausch verringert. Solche Austausche können sowohl Alanin, vom Schwein stammende spezifische Aminosäuren oder andere Aminosäuren, von denen bekannt ist, dass sie ein geringes immunogenes Potenzial aufweisen, einschließen. Die Austausche an den Positionen 495 und 501 sind wahrscheinlich nützlich bei der Verringerung der Immunogenität. Zusätzlich ist es wahrscheinlich, dass diese Austausche die Reaktivität gegenüber gewissen Antikörpern von Patienten verringern.
Andere wirksame Antigen verringernde Aminosäure Austausche, neben Alanin, können durchgeführt werden, solange darauf geachtet wird, dass jene, die zuvor als Hauptbeitrag zu der Antigen-Antikörper Bindungsenergie erkannt wurden, oder die unförmige oder geladene Seitenketten aufweisen, vermieden werden. Aminosäuren, deren Austausche innerhalb eines Epitops die antigene Reaktivität verringern, werden deshalb hier als "Immunreaktivitäts verringernde" Aminosäuren bezeichnet. Neben Alanin schließen andere Immunreaktivitäts verringernde Aminosäuren, ohne Einschränkung, Methionin, Leucin, Serin und Glycin ein. Es wird verstanden, dass die Verringerung der Immunreaktivität, die durch eine gegebene Aminosäure erreichbar ist, auch von anderen Wirkungen abhängig sein wird, die der Austausch auf die Protein Konformation, Epitop Erreichbarkeit und ähnliches haben wird.
Beispiel 10
Klenow Fragment, phosphorylierte ClaI Linker, NotI Linker, T4 Ligase und Taq DNA Polymerase wurden von Promega bezogen (Madison, Wisconsin). Polynukleotid Kinase wurde von Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland bezo gen. γ³²P-ATP (Redivue, > 5000 Ci/mmol) wurde von Amersham bezogen. pBluescript II KS- und E. coli Epicurean XL1-Blue Zellen wurden von Stratagene (La Jolla, Kalifornien) bezogen. Synthetische Oligonukleotide wurden von Life Technologies, Inc. oder Cruachem, Inc. bezogen. 5'-phosphorylierte Primer wurden verwendet, wenn die PCR Produkte für Klonierungszwecke hergestellt wurden. Die Nukleotid (nt) Nummerierung von Oligonukleotiden, die als Primer für die Polymerase Kettenreaktion (PCR) Amplifikation der vom Schwein stammenden fVIII cDNA oder genomischen DNA verwendet wurden, verwendet die humane fVIII cDNA als Referenz (Wood et al. (1984) supra).
Vom Schwein stammende Gesamt RNA aus der Milz wurde durch saure Guanidinthiocyanatphenolchloroform Extraktion isoliert (Chomczynski, P. und N. Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162:156-159). Vom Schwein stammende cDNA wurde aus Gesamt RNA aus der Milz unter Verwendung der Moloney murinen Leukämie Virus reversen Transkriptase (RT) und zufälligen Hexameren, um die Reaktion zu starten (cDNA Synthese Kit für den ersten Strang, Pharmacia Biotech), außer es ist anders angegeben, hergestellt. Die RT Reaktionen enthielten 45 mM Tris-Cl, pH 8,3, 68 mM KCl, 15 mM DTT, 9 mM MgCl₂, 0,08 mg/ml Rinderserumalbumin und 1,8 mM Desoxynukleotidtriphosphat (dNTP). Die vom Schwein stammende genomische DNA wurde aus Milz unter Verwendung eines Standardverfahrens isoliert (Strauss, W.M. (1995) in Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., Herausgeber, John Wiley & Söhne, S. 2.2.1-2.2.3). Die Isolierung von DNA aus Agarosegelen wurde unter Verwendung eines Geneclean II (Bio 101) oder Quiex II Gel Extraktionskits (Qiagen) durchgeführt.
Die PCR Reaktionen wurden unter Verwendung eines Hybaid OmniGene Thermocycler Geräts durchgeführt. Für PCR Reaktionen, die Taq DNA Polymerase einsetzen, schlossen die Reaktionen 0,6 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTPs, 0,5 μM Oligonukleotid Primer, 50 U/ml Polymerase und 0,1 × Volumen des cDNA Reaktionsmixes für den ersten Strang ein. Mit der Ausnahme, wo es anders angegeben ist, wurden die PCR Produkte über ein Gel gereinigt, es wurden mit Klenow Fragment stumpfe Enden erzeugt, sie wurden mit Ethanol präzipitiert und entweder in die EcoRV Stelle eines dephosphorylierten pBluescript II KS- ligiert oder mit phosphorylierten ClaI Linkern unter Verwvendung von T4 Ligase ligiert, mit ClaI gespalten, durch Sephacryl S400 Chromatographie gereinigt und in einen ClaI geschnittenen, dephosphorylierten pBluescript II KS- ligiert. Die Ligationen wurden unter Verwendung von T4 DNA Ligase durchgeführt (Rapid DNA Ligationskit, Boehringer Mannheim), mit der Ausnahme, wo es anders angegeben ist. Insert tragende pBluescript II KS- Plasmide wurden verwendet, um E. coli Epicurean XL1-Blue Zellen zu transformieren.
Die Sequenzierung von Plasmid DNA wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems 373a automatischen DNA Sequenziergeräts und des PRISM Dye Terminator Kits oder manuell unter Verwendung des Sequenaee v. 2.0 Sequenzier Kits (Amersham Corporation) durchgeführt. Die direkte Sequenzierung der PCR Produkte, einschließlich ³²P-Endmarkierung der Oligonukleotide wurde unter Verwendung eines Zyklus Sequenzier Protokolls durchgeführt (dsDNA Cycle Sequencing System, Life Technologies).
Isolierung von vom Schwein stammenden fVIII cDNA Klonen, die eine 5' UTR Sequenz, ein Signalpeptid und A1 Domänen Kodons enthalten
Die vom Schwein stammende fVIII cDNA 5' zu der A2 Domäne wurde durch nested RT-PCR einer Gesamt RNA, die von der Milz eines weiblichen Schweins stammt, unter Verwendung eines 5' Rapid Amplifikation von cDNA Enden (5'-RACE) Protokolls amplifiziert (Marathon cDNA Amplification, Clontech, Version PR55453). Dies schloss eine Synthese des ersten Strangs unter Verwendung eines Lock Docking oligo(dT) Primers (Borson, N.D. et al. (1992) PCR Methods Appl. 2:144-148), die cDNA Synthese des zweiten Strangs unter Verwendung von E. coli DNA Polymerase I und die Ligation mit einem 5' verlängerten doppelsträngigen Adaptor, SEQ ID NR: 13
5'-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3 3'-H₂N-CCC GTC CA-PO₄-5',
ein, dessen kurzer Strang an dem 3'-Ende mit einer Amino Gruppe blockiert war, um das nicht spezifische PCR Priming zu verringern, und das komplementär war zu den 8 Nukleotiden am 3'-Ende (Siebert, P.D., et al. (1995) Nucleic. Acids. Res. 23:1087-1088). Die erste Runde der PCR wurde unter Verwendung eines Adaptor spezifischen Oligonukleotids, SEQ ID NR: 14 5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3' (als AP1 bezeichnet) als Sense Primer, und einem vom Schwein stammenden fVIII A2 Domänen spezifischen Oligonukleotid SEQ ID NR: 15 5'-CCA TTG ACA TGA AGA CCG TTT CTC-3' (nt 2081 – 2104) als Antisense Primer durchgeführt. Die zweite Runde der PCR wurde unter Verwendung eines nested, Adaptor spezifischen Nukleotids, SEQ ID NR: 16 5'-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3' (als AP2 bezeichnet) als Sense Primer und einem nested, vom Schwein stammenden A2 Domänen spezifischen Oligonukleotid SEQ ID NR: 17 5'-GGG TGC AAA GCG CTG ACA TCA GTG-3' (nt 1497-1520) als Antisense Primer durchgeführt. Die PCR wurde unter Verwendung eines kommerziellen Kits durchgeführt (Advantage cDNA PCR Core Kit), der ein Antikörper vermitteltes Heißstart Protokoll einsetzt (Kellogg, D.E. et al. (1994) BioTechniques 16:1134-1137). Die PCR Bedingungen schlossen die Denaturierung bei 94°C für 60 Sekunden, gefolgt von 30 Zyklen (erste PCR) oder 25 Zyklen (zweite PCR) einer Denaturierung für 30 Sekunden bei 94°C, die Anlagerung für 30 Sekunden bei 60°C und die Verlängerung für 4 Min. bei 68°C unter Verwendung einer Gefäßtemperatur Kontrolle, ein. Das Verfahren lieferte ein hauptsächliches ∼ 1,6 kB Produkt, das mit der Amplifikation eines Fragments übereinstimmt, das sich ungefähr 150 bp in den 5' UTR erstreckt. Das PCR Produkt wurde in pBluescript unter Verwendung von ClaI Linkern kloniert. Die Inserts von vier Klonen wurde in beide Richtungen sequenziert.
Die Sequenz dieser Klone schloss Regionen ein, die 137 bp des 5' UTR, dem Signal Peptid, der A1 Domäne und einem Teil der A2 Domäne entsprechen. Ein Konsensus wurde in mindestens 3 der 4 Stellen erreicht. Jedoch enthielten diese Klone durchschnittlich 4 offensichtliche PCR gebildete Mutationen, wahrscheinlich aufgrund der vielfachen Runden von PCR, die benötigt wurden, um ein klonierbares Produkt zu bilden. Deshalb verwendeten wir die Sequenz, die aus der Signal Peptid Region erhalten wurde, um einen Sense Strang phosphorylierten PCR Pri mer zu gestalten, SEQ ID NR: 18 5'-CCT CTC GAG CCA CCA TGT CGA GCC ACC ATG CAG CTA GAG CTC TCC ACC TG-3', als RENEOPIGSP bezeichnet, für die Synthese eines anderen PCR Produkts, um die Sequenz zu bestätigen, und für die Klonierung in einen Expressionsvektor. Die Sequenz in fetten Buchstaben stellt das Start Kodon dar. Die Sequenz 5' davon stellt die Sequenz dar, die identisch ist zu dem 5' der Insertionsstelle in den Säuger Expressionsvektor Re-Neo, der für die Expression von fVIII verwendet wurde (Lubin et al. (1994) supra). Diese Stelle schließt eine XhoI Spaltungsstelle (unterstrichen) ein. RENEOPIGSP und das nt 1497 – 1520 Oligonukleotid wurden verwendet, um eine Taq DNA Polymerase vermittelte PCR Reaktion unter Verwendung einer cDNA, die von der Milz eines weiblichen Schweins stammt, als eine Matrize, zu starten. Die DNA Polymerasen von einigen anderen Herstellern konnte kein nachweisbares Produkt liefern. Die PCR Bedingungen schlossen die Denaturierung bei 94°C für 4 Min. gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung für 1 Min. bei 94°C, der Anlagerung für 2 Min. bei 55°C und der Verlängerung für 2 Min. bei 72°C, gefolgt von einem abschließenden Verlängerungsschritt für 5 Min. bei 72°C ein. Das PCR Produkt wurde in pBluescript unter Verwendung von ClaI Linkern kloniert. Die Inserts von zwei dieser Klone wurden in beide Richtungen sequenziert und stimmten mit der Konsensus Sequenz überein.
Isolierung von vom Schwein stammenden fVIII cDNA Klonen, die A3, C1 und die 5'- Hälfte der C2 Domänen Kodons enthalten
Anfänglich wurden zwei vom Schwein stammende Milz RT PCR Produkte kloniert, die einem B-A3 Domänen Fragment (nt 4519 – 5571) und einem C1-C2 Domänen Fragment (nt 6405 – 6990) entsprechen. Das 3'-Ende der C2 Domäne, das erhalten wurde, erstreckte sich in die Exon 26 Region, die das terminate Exon in fVIII ist. Das B-A3 Produkt wurde unter Verwendung eines vom Schwein stammenden spezifischen B Domänen Primers hergestellt, SEQ ID NR: 19 5' CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T 3', in dem die unterstrichene Region einer Region in dem vom Schwein stammenden fVIII entspricht, die mit nt 4519 – 4530 in humanem fVIII übereinstimmt. Die 5' Region des Oligonukleotids schließt eine NotI Stelle ein, von der ursprünglich beabsichtigt war, sie für Klonierungszwecke zu verwenden. Der Antisense Primer, der zur Herstellung des B-A3 Produkts verwendet wurde, SEQ ID NR: 20 5'-GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA-3' beruhte auf dem reversen Komplement der humanen fVIII cDNA Sequenz bei nt 5545 – 5571. Die PCR Reaktion enthielt 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl, pH 9,0, 0,1 % Triton X-100, 1,5 mM MgCl₂, 2,5 mM dNTPs, 20 μM Primer, 25 Einheiten/ml Taq DNA Polymerase und 1/20 Volumen des RT Reaktionsmixes. Die PCR Bedingungen waren Denaturierung bei 94°C für 3 Min., gefolgt von 30 Zyklen der Denaturierung für 1 Min. bei 94°C, Anlagerung für 2 Min. bei 50°C und Verlängerung für 2 Min. bei 72°C. Die PCR Produkte wurden unter Verwendung von T4 DNA Kinase phosphoryliert, und NotI Linker wurden hinzugefügt. Nach dem Schneiden mit NotI wurden die PCR Fragmente in die NotI Stelel des pBluescript II KS- kloniert und in XL1-Blue Zellen transformiert.
Das C1-C2 Produkt wurde unter Verwendung der bekannten humanen cDNA Sequenz hergestellt, um jeweils die Sense und Antisense Primer zu synthetisieren, SEQ ID NR: 21 5'-AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N-3' (nt 6405 – 6426) und SEQ ID NR: 22 5'-CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N-3' (reverses Komplement von nt 6966 – 6990). Die PCR Bedingungen waren identisch zu jenen, die verwendet wurden, um das B-A2 Produkt herzustellen. Das resultierende Fragment wurde in den pNOT Klonierungsvektor unter Verwendung des Prime PCR Cloner Cloning Systems (5 Prime-3 Prime, Inc., Boulder, Colorado) ligiert und in JM109 Zellen angezogen.
Die B-A3 und C1-C2 Plasmide wurden teilweise sequenziert, um jeweils die vom Schwein stammenden spezifischen Sense und Antisense Oligonukleotide herzustellen, SEQ ID NR: 23 5'-GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG-3' (nt 4451 – 4573) und SEQ ID NR: 24 5'-ACA GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG-3' (nt 6541 – 6564). Diese Oligonukleotide wurden als Primer verwendet, um ein 2013 bp RT-PCR Produkt unter Verwendung des Clontech Advantage cDNA PCR Kit herzustellen. Dieses Produkt, das den humanen nt 4551 – 6564 entspricht, schließt die Region ein, die dem Aktivierungspeptid der leichten Kette (nt 5002 – 5124), der A3 Domäne (nt 5125 – 6114) und dem größten Teil der C1 Domäne (nt 6115 – 6573) entspricht. Die Sequenz des C1-C2 Klons zeigte, dass die humane und vom Schwein stammende cDNA von nt 6565 zu dem 3'-Ende der C1 Domäne identisch sind. Das PCR Produkt wurde in die EcoRV Stelle von pBluescript II KS-kloniert. Vier Klone wurden vollständig in beide Richtungen sequenziert. Ein Konsensus wurde in mindestens 3 von 4 Stellen erreicht.
Isolierung von vom Schwein stammenden fVIII cDNA Klonen, welche die 3'-Hälfte der C2 Domänen Kodons enthalten
Die C2 Domäne von humanem fVIII (Nukleotide 6574 – 7053) ist innerhalb der Exons 24 – 26 enthalten (Gitschier, J. et al. (1984) Nature 312:326-330). Das humane Exon 26 enthält 1958 bp, das den Nukleotiden 6901 – 8858 entspricht. Es schließt 1478 bp der 3' nicht translatierten Sequenz ein. Versuche, die Exon 26 cDNA zu klonieren, die dem 3'-Ende der C2 Domäne und dem 3' UTR entspricht, durch 3' RACE (Siebert et al. (1995) supra), inverse PCR (Ochman, H. et al. (1990) Biotechnology (N.Y.). 8:759-760), Restriktionsstellen PCR (Sarkar, G. et al. (1993) PCR Meth. Appl. 2:318-322), "nicht vorhersagbar geprimte" PCR (Dominguez, O. und C. Lopez-Larrea (1994) Nucleic. Acids Res. 22:3247-3248) und durch Screenen einer vom Schwein stammenden Leber cDNA Bibliothek, scheiterten. Eine 3' RACE wurde unter Verwendung derselben Adaptor ligierten doppelsträngigen cDNA Bibliothek versucht, die verwendet wurde, um erfolgreich das 5'-Ende der vom Schwein stammenden fVIII cDNA zu klonieren. Somit war das Versagen dieses Verfahrens nicht in der Abwesenheit von cDNA, die dem Exon 26 entspricht, begründet.
Ein gezieltes Gen Walking PCR Verfahren (Parker, J.D. et al. (1991) Nucleic. Acids. Res. 19:3055-3060) wurde verwendet, um die 3'-Hälfte der C2 Domäne zu klonieren. Ein vom Schwein stammender spezifischer Sense Primer, SEQ ID NR: 25 5'-TCAGGGCAATCAGGACTCC-3' (nt 6904 – 6924) wurde basierend auf der anfänglichen C2 Domänen Sequenz synthetisiert und in einer PCR Reaktion mit nicht spezifischen "Walking" Primern verwendet, die aus Oligonukleotiden, die im Labor zur Verfügung stehen, ausgewählt wurden. Auf die PCR Produkte wurde anschließend durch Primer Extensionsanalyse (Parker, J.D. und G.C. Burmer (1991) BioTechniques 10:94-101) unter Verwendung eines ³²P-endmarkierten vom Schwein stammenden spezifischen internen Primers (SEQ ID NR: 26 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932 – 6952) abgezielt. Interessanterweise lieferten von den 40 nicht spezifischen untersuchten Primern nur zwei positive Produkte in der Primer Extensionsanalyse, und diese zwei entsprachen einer exakten und einer degenerierten humanen Sequenz an dem 3'-Ende der C2 Domäne: SEQ ID NR: 27 5'-GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' (nt 7030 – 7053) und SEQ ID NR: 28 5'-GTAGAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCYAG-3' (nt 7027 – 7053). Diese Primer wurden anfänglich gestaltet, um ein Produkt durch herkömmliche RT PCR zu erhalten, aber sie scheiterten, ein ausreichendes Produkt zu liefern, das durch Ethidiumbromid Farbstoffbindung optisch dargestellt werden konnte. Jedoch konnte ein PCR Produkt durch das sensitivere Primer Extensionsverfahren identifiziert werden. Diese Produkt wurde Gel gereinigt und direkt sequenziert. Es verlängerte die Sequenz von vom Schwein stammendem fVIII 3' auf nt 7026.
Eine zusätzliche Sequenz wurde durch Primer Extensionsanalyse eines nested PCR Produkts erhalten, das unter Verwendung der Adaptor ligierten doppelsträngigen cDNA Bibliothek, die in dem 5'-RACE Protokoll, wie zuvor beschrieben, verwendet wurde, hergestellt wurde. Die erste Runde der Reaktion verwendete den vom Schwein stammenden exakten Primer SEQ ID NR: 29 5'-CTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGT-3' (nt 6541 – 6564) und den AP1 Primer. Die zweite Runde der Reaktion verwendete den SEQ ID NR: 30 5'-AATCAGGACTCCTCCACCCCCG-3' (nt 6913 – 6934) und den AP2 Primer. Die direkte PCR Sequenzierung verlängerte die Sequenz 3' zu dem Ende der C2 Domäne (nt 70539. Die C2 Domänensequenz war einzigartig, mit der Ausnahme des Nukleotids 7045 nahe dem 3'-Ende der C2 Domäne. Die Analyse der wiederholten PCR Reaktionen lieferten entweder A, G oder eine Doppellesung von A/G an dieser Stelle.
Die Sequenzierung wurde in den 3' UTR unter Verwendung von zwei zusätzlichen Primern verlängert, SEQ ID NR: 31 5'-GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3' (nt 6977 – 6996) und SEQ ID NR; 32 5'-CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG-3' (nt 7008 – 7031). Ungefähr 15 bp der 3' UTR Sequenz wurden erhalten, obwohl die Sequenz an einigen Stellen unklar war. Verschiedene Antisense Primer wurden anschließend basierend auf der besten Abschätzung der 3' nicht translatierten Sequenz synthetisiert. Diese Primer schlossen das reverse Komplement des TGA Stopp Kodons an ihren 3'-Enden ein. PCR Produkte wurden aus sowohl der vom Schwein stammenden Milz genomischen DNA als auch der vom Schwein stammenden Milz cDNA erhalten, die durch Agarose Gelelektrophorese und Ethidiumbromid Färbung optisch dargestellt wurden unter Verwendung eines spezifischen Sense Primers SEQ ID NR: 33 5'-AAT CAG GAG TCC TCC ACC CCC G-3' (nt 6913 – 6934) und des 3' UTR Antisense Primers, SEQ ID NR: 34 5'-CCTTGCAGGAATTCGATTCA-3'. Um ausreichende Mengen an Material für Klonierungszwecke zu erhalten wurde eine zweite PCR Runde unter Verwendung eines nested Sense Primers, SEQ ID NR: 35 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGAACC-3' (nt 6932 – 6952) und desselben Antisense Primers durchgeführt. Das 141 bp PCR Produkt wurde in EcoRV geschnittenen pBluescript II KS- kloniert. Es wurden von drei Klonen, die von genomischer DNA und von drei Klonen, die von cDNA abgeleitet waren, in beiden Richtungen erhalten. Die Sequenz war unzweideutig mit der Ausnahme von nt 7045, wo die genomische DNA immer ein A und die cDNA immer ein G aufwies.
Multiple DNA Sequenz Alignments von humanem, vom Schwein stammendem und Maus fVIII
(1A – 1H). Es wurden Alignments des Signal Peptids der A1, A2, A3, C1 und C2 Regionen unter Verwendung des CLUSTALW Programms durchgeführt (Thompson, J.D. et al. (1994) Nucleic. Acids. Res. 22:4673-4680). Die Gap Open und die Gap Extensionsstrafen waren jeweils 10 und 0,05. Die Alignments der humanen, Maus und vom Schwein stammenden B Domänen wurden zuvor beschrieben (Elder et al. (1993) supra). Die humane A2 Sequenz entspricht den A minosäuren 373 – 740 in SEQ ID NR: 2. Die vom Schwein stammende A2 Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR: 4 angegeben, und die Maus A2 Domänen Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 392 – 759 angegeben.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Wir haben die cDNA Sequenz des vom Schwein stammenden fVIII, die 137 bp des 5' UTR entspricht, die Signal Peptid kodierende Region (57 bp) und die A1 (1119 bp), A3 (990 bp), C1 (456 bp) und C2 (483 bp) Domänen bestimmt. Zusammen mit der zuvor veröffentlichten Sequenz der B Domäne und der Aktivierungspeptid Regionen der leichten Kette (Toole et al. (1986) supra) und der A2 Domäne (Lubin et al. (1994) supra) vervollständigt die hier beschriebene Sequenz die Bestimmung der vom Schwein stammenden fVIII cDNA, die dem translatierten Produkt entspricht. Ein Fragment, das die 5' UTR Region, das Signal Peptid und die A1 Domäne der cDNA einschließt, wurde unter Verwendung eines 5'-RACE RT-PCR Protokolls kloniert. Ein Primer basierend auf der humanen C2 Sequenz war erfolgreich in der Herstellung eines RT-PCR Produkts, das zu der Klonierung der A3, C1 und der 5'-Hälfte der C2 Domäne führt. Die cDNA, die der 3'-Hälfte der C2 Domäne entspricht und die 3' UTR cDNA zeigten sich als schwierig zu klonieren. Das Verbleibende der C2 Domäne wurde schließlich durch ein gezieltes Gene Walking PCR Verfahren (Parker et al. (1991) supra) kloniert.
Die Sequenz, die hier als SEQ ID NR: 36 beschrieben ist, war unzweideutig mit Ausnahme an nt 7045 nahe dem 3'-Ende der C2 Domäne, das entweder A oder G sein kann, wie oben beschrieben. Das entsprechende Kodon ist GAC (Asp) oder AAC (Asn). Die humanen und Maus Kodons sind jeweils GAC und CAG (Gln). Ob dies einen Polymorphismus oder ein reproduzierbares PCR Artefakt darstellt, ist unbekannt. Rekombinante hybride humane/vom Schwein stammende B domänenlose fVIII cDNAs enthaltend vom Schwein stammende C2 Domänen Austausche, die sowohl dem GAC als auch dem AAC Kodon entsprechen, wurden stabil exprimiert mit keinen nachweisbaren Unterschieden in der prokoagulierenden Ak tivität. Dies zeigt, dass es keinen funktionellen Unterschied zwischen diesen beiden C2 Domänen Varianten gibt.
Das Alignment der vorhergesagten Aminosäuresequenz des Gesamtlängen vom Schwein stammenden fVIII, SEQ ID NR: 37, mit den veröffentlichten humanen (Wood et al. (1984) supra) und der murinen (Elder et al. (1993) supra) Sequenzen ist in den 1A – 1H zusammen mit den Stellen für posttranslationale Modifikation, proteolytische Spaltung und Erkennung durch andere Makromoleküle gezeigt. Der Grad der Identität der ausgerichteten Sequenzen ist in Tabelle VII gezeigt. Wie zuvor angemerkt sind die B Domänen dieser Spezies unterschiedlicher als die A oder C Domänen. Dies stimmt mit der Beobachtung überein, dass die B Domäne keine bekannte Funktion aufweist, mit Ausnahme ihrer großen Größe (Elder et al. (1993) supra; Toole et al. (1986) supra). Es gibt auch mehr Unterschiede in den Sequenzen, die dem A1 Domänen APC/Faktor IXa Spaltungspeptid (Reste 337 – 372) und dem Aktivierungspeptid der leichten Kette (Tabelle VII) entsprechen. Die Thrombin Spaltungsstelle an Position 336, um das 337 – 372 Peptid zu bilden, ist anscheinend in der Maus verloren, weil dieser Rest ein Glutamin anstelle von Arginin ist (Elder et al. (1993) supra). Die relativ schnelle Abweichung von Thrombin gespaltenen Peptiden (oder in dem Maus fVIII ein mögliches geringfügiges 337 – 372 Aktivierungspeptid) wurde zuvor für die Fibrin Peptide bemerkt (Creighton, T. E. (1993) In Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman, New York, S. 105 – 138). Der Verlust der biologischen Funktion dieser Peptide, sobald sie einmal gespalten sind, wurde als ein möglicher Grund für die schnelle Abweichung angeführt. Es wurde vorgeschlagen, dass Arg562 in humanem fVIII die wichtigere Spaltungsstelle für aktiviertes Protein C während der Inaktivierung von fVIII und fVIIIa ist (Fay, P.J. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:20139-20145). Diese Stelle ist in humanem, vom Schwein stammendem und Maus fVIII konserviert.
Die potenziellen N-verknüpften Glykosylierungsstellen sind auch in Fettschrift in 1A – 1H gezeigt. Es gibt acht konservierte N-verknüpfte Glykosylierungsstellen: eine in der A1 Domäne, eine in der A2 Domäne, vier in der B Domäne, eine in der A3 Domäne und eine in der C1 Domäne. Die 19 A und C Domänen Cysteine sind konserviert, wohingegen es Abweichungen der B Domänen Cysteine gibt. Sechs der sieben Disulfid Verknüpfungen in fVIII werden an homologen Stellen in Faktor V und Ceruloplasmin gefunden, und beide C Domänen Disulfid Verknüpfungen werden in Faktor V gefunden (McMullen, B.A. et al. (1995) Protein Sci. 4:740-746). Humanes fVIII enthält geschwefeltes Tyrosin an Positionen 346, 718, 719, 723, 1663 und 1680 (Pittman, D.D. et al. (1992) Biochemistry 3:3315-3325; Michnik, D.A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20095-20102). Diese Reste sind in Maus fVIII und in vom Schwein stammendem fVIII (1) konserviert, obwohl es dem CLUSTALW Programm nicht gelang, das Maus Tyrosin, das dem Tyr346 in humanem fVIII entspricht, anzuordnen.
Maus und vom Schwein stammendes Plasma können den Gerinnungsdefekt in humanem Hämophilie A Plasma korrigieren, was mit der Ebene der Konservierung von Resten in den A und C Domänen dieser Spezies übereinstimmt. Die prokoagulierende Aktivität von vom Schwein stammendem fVIII ist jener von humanem fVIII überlegen (Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:23652-23657). Dies kann in einer verringerten spontanen Dissoziationsrate der A2 Untereinheit aus dem aktiven A1/A2/A3-C1-C2 fVIIIa Heterotrimer begründet sein. Ob dieser Unterschied in der prokoagulierenden Aktivität eine evolutionäre Änderung in der Funktion als ein Beispiel von Spezies Anpassung (Perutz, M.F. (1996) Adv. Protein Chem. 36:213-244) wiederspiegelt, ist unbekannt. Da jetzt die vom Schwein stammende fVIII cDNA Sequenz, die dem translatierten Produkt entspricht, vollständig ist, kann homologe Scanning Mutagenese (Cunningham, B.C., et al. (1989) Science 243:1330-1336) einen Weg liefern, um strukturelle Unterschiede zwischen humanem und vom Schwein stammendem fVIII zu identifizieren, die für die überlegene Aktivität des zuletzt genannten verantwortlich sind.
Vom Schwein stammender fVIII ist typischerweise weniger reaktiv mit inhibitorischen Antikörpern, die in Hämophilie Patienten entstehen, die mit fVIII transfundiert wurden, oder die als Autoantikörper in der allgemeinen Bevölkerung entstehen. Dies ist die Basis für die Verwendung von vom Schwein stammendem fVIII Konzentrat in dem Management von Patienten mit inhibitorischen Antikörpern (Hay und Lozier (1995) supra). Die meisten Inhibitoren sind gegen Epitope gerichtet, die in der A2 Domäne oder C2 Domäne angeordnet sind (Fulcher, C.A. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7728-7732; Scandella, D. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6152-6156; Scandella, D. et al. (1989) Blood 74: 1618-1626). Zusätzlich wurde ein Epitop mit unbekannter Signifikanz identifiziert, das entweder in der A3 oder C1 Domäne angeordnet ist (Scandella et al. (1989) supra; Scandella, D. et al. (1993) Blood 82:1767-1775; Nakai, H. et al. (1994) Blood 84:224a). Das A2 Epitop wurde auf die Reste 484 – 508 durch homologe Scanning Mutagenese kartiert (Healey et al. (1995) supra). In diesem 25 Reste Segment gibt es einen relativ geringen Anteil von identischen Sequenzen (16/25 oder 64 %). Es ist interessant, dass diese Region, die funktionell wichtig zu sein scheint, basierend auf der Tatsache, dass Antikörper gegen sie inhibitorisch sind, anscheinend einem relativ schnellen genetischen Shift unterworfen wurde. Das Alignment der vom Schwein stammenden A2 Domäne und der A3 Domänen zeigt, dass das A2 Epitop keine nachweisbare Homologie mit der entsprechenden Region in der A3 Domäne teilt.
Von dem C2 Inhibitor Epitop wurde durch Deletionskartierung vorgeschlagen, dass es innerhalb der Reste 2248 – 2312 angeordnet ist (Scandella, D. et al. (1995) Blood 86:1811-1819). Humaner und vom Schwein stammender fVIII sind zu 83 % identisch in diesem 65 Reste Segment. Jedoch hat die homologe Scanning Mutagenese dieser Region, um das C2 Epitop zu charakterisieren, gezeigt, dass eine Haupt Determinante des C2 Epitops unerwartet in der Region der Aminosäuren 2181 – 2243 (SEQ ID NR: 2) und Fig. H angeordnet war.
Es wurden humane-vom Schwein stammende hybride Faktor VIII Proteine hergestellt, in denen verschiedene Abschnitte der C2 Domäne des humanen Faktor VIII durch die entsprechenden Abschnitte des vom Schwein stammenden Faktor VIII, unter Verwendung der hier beschriebenen Strategie, ausgetauscht wurden (Beispiel 8). Die Synthese der verschiedenen C2 hybriden Faktor VIII wurde erreicht durch die Konstruktion hybrider kodierender DNA unter Verwendung der Nukleotidsequenz, welche die vom Schwein stammende C2 Region kodiert, die in SEQ ID NR: 37 angegeben ist. Jede hybride DNA wurde in transfizierten Zellen exprimiert, so dass die hybriden Faktor VIII teilweise aus dem Wachstumsmedium gereinigt werden konnten. Die Aktivität, in der Abwesenheit irgendeines Inhibitors, wurde durch den einstufigen Gerinnungsassay gemessen.
Eine Reihe von fünf humanen Inhibitoren wurde verwendet, um jeden hybriden Faktor VIII zu untersuchen. Von dem Inhibitor Plasma, die Anti-Faktor VIII Antikörper enthalten, wurde zuvor gezeigt, dass sie gegen die humane C2 Domäne gerichtet sind, basierend auf der Fähigkeit von rekombinanter humaner C2 Domäne, die Inhibition zu neutralisieren. In all den Test Plasma wurde der Inhibitor Titer größer als 79 % durch die C2 Domäne oder die leichte Kette, aber weniger als 10 % durch die rekombinante humane A2 Domäne neutralisiert. Zusätzlich wurden die C2 hybriden Faktor VIII gegen einen murinen monoklonalen Antikörper getestet, der die C2 Domäne bindet, und, wie humane C2 Inhibitor Antikörper, inhibierte er die Bindung von Faktor VIII an Phospholipid und an den von Willebrand Faktor.
Durch Vergleichen der Antikörper Inhibitor Titer gegen die C2 hybriden Faktor VIII, wurde gezeigt, dass die Hauptdeterminante des humanen C2 Inhibitor Epitops die Region der Reste 2181 – 2243 ist (SEQ ID NR: 2, siehe auch 1H). Es wurden keine Anti-C2 Antikörper in vier der fünf Patienten Seren identifiziert, die gegen eine Region COOH terminal der Reste 2253 gerichtet sind. Beim Vergleich der Hybride mit der vom Schwein stammenden Sequenz von 2181 – 2199 und 2207 – 2243, ist offensichtlich, dass beide Regionen zu der Antikörper Bindung beitragen.
Unter Bezugnahme auf 1H kann gesehen werden, dass die in der Region 2181 – 2243 16 Aminosäure Unterschiede zwischen der humanen und der vom Schwein stammenden Sequenz auftreten. Die Unterschiede werden in den Resten 2181, 2182, 2188, 2195 – 2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224 – 2227, 2234, 2238 und 2243 gefunden. Der Aminosäure Austausch an einer oder mehr dieser nummerierten Reste kann durchgeführt werden, um einen modifizierten humanen Faktor VIII herzustellen, der mit humanen Anti-C2 Inhibitor Antikörpern nicht reaktiv ist. Die Alanin Scanning Mutagenese liefert ein geeignetes Verfahren zur Herstel lung von Alanin Austauschen gegen natürlich auftretende Reste, wie zuvor beschrieben. Andere Aminosäuren als Alanin können ebenfalls ausgetauscht werden, wie hier beschrieben wurde. Die Alanin Austausche für einzelne Aminosäuren, insbesondere jene die nicht identisch zwischen human/vom Schwein stammend oder human/Maus sind, oder von denen sehr wahrscheinlich ist, dass sie zu der Antikörper Bindung beitragen, können einen modifizierten Faktor VIII mit verringerter Reaktivität gegenüber inhibitorischen Antikörpern liefern.
Zusätzlich liefert die Strategie des Einführens von Aminosäuren mit geringerem immunogenen Potenzial in der definierten Region der Reste 2181 – 2243 modifizierte Faktor VIII mit verringerter Immunogenität. Faktor VIII mit verringerter Immunogenität kann als ein Faktor VIII Ersatz für die Behandlung von Hämophilie A Patienten in der Anwesenheit von Faktor VIII mit natürlicher Sequenz verwendet werden. Für Patienten, die mit Faktor VIII mit verringerter Immunogenität behandelt wurden, ist es weniger wahrscheinlich, dass sie inhibitorische Antikörper entwickeln, und es ist deshalb weniger wahrscheinlich, dass sie unter der verringerten Wirksamkeit der Behandlung über ihre Lebenszeit leiden.
1 Alignment der vorhergesagten Aminosäuresequenzen in humanem, vom Schwein stammendem und Maus fVIII
Die 1A – 1H liefern zusammengenommen einen ausgerichteten Sequenzvergleich der Faktor VIII Aminosäuren des Menschen, des Schweins und der Maus. 1A vergleicht die Signal Peptid Regionen (human, SEQ ID NR: 40; vom Schwein stammend, SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 1 – 19; murin, SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 1 – 19). Die 1B gibt die Aminosäuresequenzen für die A1 Domäne des Menschen (SEQ ID NR: 2, Aminosäuren 1 -372), des Schweins (SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 20 – 391) und der Maus (SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 20 – 391). Die 1C liefert die Aminosäuresequenzen für die Faktor VIII A2 Domänen vom Menschen (SEQ ID NR: 2, Aminosäuren 373 – 740), dem Schwein (SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 392 – 759) und der Maus (SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 392 – 759). Die 1 D liefert die Aminosäuresequenzen der B Domänen des hu manen Faktor VIII (SEQ ID NR: 2, Aminosäuren 741 – 1648), vom Schwein (SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 760 – 1449) und von der Maus (SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 760 – 1640). Die 1E vergleicht die Aminosäuresequenzen Aktivierungspeptiden der leichten Kette des Faktor VIII des Menschen, des Schweins und der Maus (jeweils SEQ ID NR: 2, Aminosäuren 1649 – 1689; SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 1450 – 1490; und SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 1641 – 1678). Die 1 F liefert den Sequenzvergleich für die A3 Domänen vom Menschen, dem Schwein und der Maus (jeweils SEQ ID NR: 2, Aminosäuren 1690 – 2019; SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 1491 – 1820; und SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 1679 – 2006). Die 1G liefert die Aminosäuresequenzen der Faktor VIII C1 Domänen des Menschen, des Schweins und der Maus (jeweils SEQ ID NR: 2, Aminosäuren 2020 – 2172; SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 1821 – 1973; und SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 2007- 2159). Die 1H liefert die Sequenzdaten für die C2 Domänen des Faktor VIII des Menschen, des Schweins und der Maus (jeweils SEQ ID NR: 2, Aminosäuren 2173 – 2332; SEQ ID NR: 37, Aminosäuren 1974 – 2133; und SEQ ID NR: 6, Aminosäuren 2160 – 2319).
Die Sterne (diamonds???) stellen Tyrosin Sulfatierungsstellen dar, potenzielle Glykosylierungsstellen sind fett geschrieben, wahrscheinliche Bindungsstellen für Faktor Xa, Pospholipid und Protein C sind doppelt unterstrichen, und Regionen, die in die Bindung von Anti-A2 und Anti-C2 inhibitorischen Antikörpern involviert sind, sind kursiv geschrieben. Sterne heben Aminosäuresequenzen hervor, die konserviert sind. Siehe auch SEQ ID NR: 36 (vom Schwein stammende Faktor VIII cDNA) und SEQ ID NR: 37 (abgeleitete Aminosäuresequenz für vom Schwein stammenden Faktor VIII). Das humane Nummerierungssystem wird als Referenz verwendet (Wood et al. (1984) supra). Die A1, A2 und B Domänen sind durch Thrombin Spaltungsstellen an den Positionen 372 und 740 und eine unbekannte Protease Spaltungsstelle bei 1648 als jeweils die Reste 1 – 372, 373 – 740 und 741 – 1648 definiert (Eaton, D.L. et al. (1986) Biochemistry 25:8343-8347). Die A3, C1 und C2 Domänen sind jeweils als die Reste 1690 2019, 2020 – 2172 und 2173 – 2332 definiert (Vehar et al. (1984) supra). Die Spaltungsstellen für Thrombin (Faktor IIa), Faktor IXa, Faktor Xa und APC (Fay et al. (1991) supra; Eaton, D. et al. (1986) Biochemistry 25:505-512; Lamphear, B.J. und P.J. Fay (1992) Blood 80:3120-3128) sind dadurch gezeigt, dass der Enzym Name über dem reaktiven Arginin angegeben ist. Ein saures Peptid wird von der fVIII leichten Kette durch Thrombin oder Faktor Xa an Position 1689 gespalten. Erwartete Bindungsstellen für Faktor IXa (Fay, P.J. et al. (1993) J. Biol. Chem. 269: 20522-20527; Lenting, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7150-7155), Phospholipid (Foster, P.A. et al. (1990) Blood 75:1999-2004) und Protein C (Walker, F.J. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 1484-1489) sind doppelt unterstrichen. Die Regionen, die in die Bindung von Anti-A2 (Lubin et al. (1994) supra; Healey et al. (1995) supra) und zuvor vorgeschlagene Regionen für Anti-C2 inhibitorische Antikörper sind kursiv geschrieben. Das Anti-C2 Epitop, das wie hier beschrieben identifiziert wurde, ist durch eine einzelne unterstrichene Linie in 1H gezeigt. Die Tyrosin Sulfatierungsstellen (Pittman et al. (1992) supra; Michnik et al. (1994) supra) sind durch ⧫ gezeigt. Die Erkennungssequenzen für die potenzielle N-verknüpfte Glykosylierung (NXS/T, wobei X kein Prolin ist) sind in Fett gezeigt.
Die Nukleotidsequenz, die das Faktor VIII Protein kodiert, das die B Domäne nicht aufweist, ist in SEQ ID NR: 38 angegeben, und die korrespondierende abgeleitete Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NR: 39 bereitgestellt.

Claims

Isolierte und gereinigte DNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche die in SEQ ID NO:37 dargestellte Aminosäuresequenz des vom Schwein stammenden Faktor VIII kodiert.
DNA nach Anspruch 1, umfassend die in SEQ ID NO:36 dargestellte Nukleotidsequenz.
Isolierte und gereinigte DNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche den in SEQ ID NO:37 durch die Aminosäuren 20 bis 391 dargestellten A1-Bereich des vom Schwein stammenden Faktor VIII kodiert.
DNA nach Anspruch 3, umfassend die in SEQ ID NO:36 durch die Positionen 58 bis 1173 dargestellte Nukleotidsequenz.
Isolierte und gereinigte DNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche den in SEQ ID NO:37 durch die Aminosäuren 1491 bis 1820 dargestellten A3-Bereich des vom Schwein stammenden Faktor VIII kodiert.
DNA nach Anspruch 5, umfassend die in SEQ ID NO:36 durch die Positionen 4471 bis 5460 dargestellte Nukleotidsequenz.
Isolierte und gereinigte DNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche den in SEQ ID NO:37 durch die Aminosäuren 1821 bis 1973 dargestellten C1-Bereich des vom Schwein stammenden Faktor VIII kodiert.
DNA nach Anspruch 7, umfassend die in SEQ ID NO:36 durch die Positionen 5461 bis 5919 dargestellte Nukleotidsequenz.
Isolierte und gereinigte DNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche den in SEQ ID NO:37 durch die Aminosäuren 1974 bis 2133 dargestellten C2-Bereich des vom Schwein stammenden Faktor VIII kodiert.
DNA nach Anspruch 9, umfassend die in SEQ ID NO:36 durch die Positionen 5920 bis 6399 dargestellte Nukleotidsequenz.
DNA, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche ein Protein kodiert, welches mindestens die in SEQ ID NO:37 dargestellten A1-, A2-, A3-, C1- und C2-Bereiche des vom Schwein stammenden Faktor VIII einschließt, wobei das Protein prokoagulierende Aktivität aufweist.
Verfahren zum Herstellen eines Proteins mit prokoagulierender Aktivität, wobei das Verfahren die Expression der DNA nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 11 in einem geeigneten Wirtsorganismus und die Isolierung des exprimierten Proteins umfaßt.
Verfahren zum Herstellen eines hybriden Faktor VIII-Moleküls oder eines Fragments davon mit koagulierender Aktivität, wobei das Verfahren die Expression einer DNA, die das hybride Faktor VIII-Molekül oder ein Fragment davon mit koagulierender Aktivität kodiert, umfaßt und wobei diese DNA die DNA nach einem der Ansprüche 3 bis 10 ist.
Verfahren zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von Patienten mit Faktor VIII-Mangel, wobei das Verfahren das Herstellen eines Faktor VIII-Moleküls oder eines Fragments davon gemäß Anspruch 12 oder 13 und das Formulieren derselben in eine pharmazeutische Zusammensetzung entweder allein oder in Kombination mit Stabilisatoren, Transportvehikeln und/oder Träger umfaßt.
Verfahren zum Herstellen eines Proteins nach Anspruch 12 oder 13 oder Verfahren zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei das Faktor VIII-Molekül oder das Fragment davon als ein Fusionsprotein von einem rekombinanten Molekül, in dem eine ein Protein oder Peptid, das die Stabilität, Sekretion, den Nachweis oder die Isolation verstärkt, kodierende Sequenz an einer der Faktor VIII kodierenden Sequenz benachbarten Stelle eingefügt ist, exprimiert wird.
DNA nach Anspruch 11, wobei das Protein keinen B-Bereich aufweist.