ES2267146T3 - Factor viii porcino e hibridos del mismo. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A PROTEINAS DEL FACTOR VIII, A PROCEDIMIENTOS DE OBTENCION DE LAS MISMAS Y A ADN QUE CODIFICA PARA DICHAS PROTEINAS.

Description

Factor VIII porcino e híbridos del mismo. A

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere generalmente a un factor VIII híbrido que contiene secuencias de aminoácidos de factor VIII humano y animal, o que tiene secuencias de aminoácidos de factor VIII humano y antifactor VIII, y los procedimientos para preparar y usar los mismos.

Esta aplicación es una continuación en parte del documento PCT/US94/13200 titulado "Hybrid Human/Animal Factor VIII" presentado el 15 de noviembre de 1994 por la Emory University; el cual reivindica la prioridad del documento U.S. Serial No 08/212,133 titulado "Hybrid Human/Animal Factor VIII" presentado el 11 de marzo de 1994 por John S. Lollar y Marschall S. Runge; el cual es continuación en parte del documento U.S. Serial No 07/864,004 titulado "Hybrid Human/Porcine Factor VIII" presentado el 7 de abril de 1992 por John S. Lollar y Marschall S. Runge, el cual fue publicado como U.S. Patent No 5,364,771 el 15 de noviembre de 1994.

La coagulación de la sangre comienza cuando las plaquetas se adhieren a las paredes cortadas de un vaso sanguíneo herido, en una zona de lesión. Posteriormente, en una cascada de reacciones reguladas enzimáticamente, moléculas de fibrinógeno soluble son convertidas por la enzima trombina en hebras insolubles de fibrina que mantienen a las plaquetas unidas en un trombo. En cada paso de la cascada, un precursor proteico es convertido en una proteasa que separa al siguiente precursor proteico en la serie. Los cofactores son requeridos en la mayoría de los pasos.

El factor VIII circula en sangre como un precursor inactivo, unido fuerte y no covalentemente al factor de von Willebrand. El factor VIII es activado proteolíticamente por la trombina o por el factor Xa, el cual lo disocia del factor de von Willebrand, y activa su función pro-coagulante en la cascada. En su forma activa, la proteína factor VIIIa es un cofactor que incrementa la eficacia catalítica del factor IXa hacia la activación del factor X, en varios órdenes de magnitud.

Las personas con deficiencias de factor VIII o de anticuerpos contra el factor VIII, que no son tratadas con factor VIII, sufren hemorragias internas incontroladas que pueden causar toda una serie de importantes síntomas, desde reacciones inflamatorias en articulaciones, hasta casi la muerte. Los hemofílicos graves, cuyo número ronda los 10.000 afectados en los Estados Unidos, pueden ser tratados con infusión de factor VIII humano, que devolverá la capacidad coagulante normal de la sangre si se administra con la suficiente frecuencia y concentración. La definición clásica de factor VIII es, de hecho, aquella sustancia presente en el plasma sanguíneo normal, que corrige el defecto de coagulación en plasma, derivado de individuos con hemofilia A.

El desarrollo de anticuerpos ("inhibidores" o "anticuerpos inhibidores") que inhiben la actividad del factor VIII, es una seria complicación en el manejo de pacientes con hemofilia. Los autoanticuerpos se desarrollan en aproximadamente el 20% de los pacientes con hemofilia A, en respuesta a las infusiones terapéuticas de factor VIII. En pacientes con hemofilia A sin tratar previamente, que desarrollan inhibidores, el inhibidor aparece normalmente durante el año de tratamiento. Adicionalmente, los autoanticuerpos que inactivan el factor VIII se desarrollan ocasionalmente en individuos con niveles de factor VIII previamente normales. Si el título del inhibidor es suficientemente bajo, los pacientes pueden ser tratados incrementando la dosis de factor VIII. Pero a menudo el título del inhibidor es tan alto que no puede ser superado por el factor VIII. Una estrategia alternativa es evitar la necesidad de factor VIII durante la hemostasis normal, usando preparaciones complejas de factor IX (por ejemplo, KONYNE®, Proplex®) o factor VIIIa humano recombinante. Adicionalmente, puesto que el factor VIII porcino normalmente tiene sustancialmente menos reactividad con los inhibidores que el factor VIII humano, se utiliza una preparación de factor VIII porcino parcialmente purificado (HYATE®). Sin embargo, los inhibidores pueden desarrollarse contra el factor VIII porcino tras una o más infusiones.

Muchas preparaciones de factor VIII humano derivado del plasma, de varios grados de pureza, están disponibles comercialmente para el tratamiento de la hemofilia A. Estas incluyen un factor VIII parcialmente purificado derivado de la sangre extraída de muchos donantes, que es tratada con calor y detergentes para los virus, pero que contiene un nivel significativo de proteínas antigénicas; un anticuerpo monoclonal-factor VIII purificado que tiene menores niveles de impurezas antigénicas y contaminación viral; y un factor VIII humano recombinante, cuyas pruebas clínicas están en proceso. Desafortunadamente, el factor VIII humano es inestable en condiciones fisiológicas de concentración y pH, está presente en la sangre en una concentración extremadamente baja (0,2 \mug/ml de plasma), y tiene una baja actividad coagulante específica.

Los hemofílicos requieren una sustitución diaria del factor VIII, para prevenir la hemorragia y la artropatía hemofílica resultante. Sin embargo, los suministros han sido insuficientes, y aparecen problemas en el uso terapéutico debido a la dificultad en el aislamiento y la purificación, la inmunogenidad, y la necesidad de eliminar los riesgos de infectividad por SIDA y hepatitis. El uso de factor VIII humano recombinante, o de factor VIII porcino parcialmente purificado, no resolverá todos los problemas.

Los problemas asociados con el comúnmente utilizado (y comercialmente disponible) factor VIII derivado del plasma, han estimulado un interés significativo en el desarrollo de un factor VIII mejor. Existe una necesidad de una molécula de factor VIII más potente, para que se puedan liberar más unidades de actividad coagulante por molécula; una molécula de factor VIII que sea estable en una concentración y pH fisiológicos seleccionados; una molécula de factor VIII que sea menos apta para provocar producción de anticuerpos inhibidores; y una molécula de factor VIII que evada la detección inmune en pacientes que ya han adquirido anticuerpos contra el factor VIII humano.

Es por tanto un objetivo de la presente invención, el proporcionar un factor VIII que corrija la hemofilia en un paciente con déficit de factor VIII, o que tenga inhibidores del factor VIII.

Es también un objetivo de la presente invención, el proporcionar procedimientos para el tratamiento de los hemofílicos.

Es además otro objetivo de la presente invención, el proporcionar un factor VIII que sea estable en una concentración y pH fisiológicos.

Es incluso otro objetivo de la presente invención, el proporcionar un factor VIII que tenga una actividad coagulante mayor que la del factor VIII humano.

Es un objetivo adicional de la presente invención, el proporcionar un factor VIII contra el que se produzcan menos anticuerpos.

El documento WO 94/11503 desvela un factor VIII híbrido humano/porcino en el cual la región de residuos 336-740 del factor VIII humano, es reemplazado por la región porcina correspondiente.

El documento WO 95/24427 desvela un factor VIII híbrido humano/porcino en el cual la región de residuos 484-509 del factor VIII humano, es reemplazado por la región porcina correspondiente.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona moléculas purificadas y aisladas de factor VIII híbrido, y fragmentos de las mismas, con actividad coagulante, que incluyen factor VIII híbrido que tiene secuencias de aminoácidos de factor VIII derivadas de humano y de cerdo, o de otros mamíferos no humanos (a los cuales nos referiremos como "animales"); o en una segunda forma de realización, incluye un factor VIII híbrido equivalente que tiene secuencias de aminoácidos de factor VIII derivadas de humanos o de animales, o de ambos, y secuencias de aminoácidos de identidad desconocida ("secuencia de aminoácidos antifactor VIII"), preferiblemente sustituidas en una región antigénica y/o inmunogénica del factor VIII. Alguien experto en la materia, notará que pueden prepararse numerosas construcciones de factor VIII híbrido que incluyan, aunque no quedan limitadas a, factor VIII humano/animal con una mayor actividad coagulante que el factor VIII humano ("actividad coagulante superior"); factor VIII humano/equivalente no inmunogénico; factor VIII humano/animal o humano/equivalente no antigénico; factor VIII humano/equivalente o humano/animal no inmunogénico, con una actividad coagulante superior; factor VIII humano/equivalente/animal o humano/animal no antigénico, con una actividad coagulante superior; factor VIII humano/equivalente/animal o humano/animal no inmunogénico, no antigénico; y factor VIII humano/animal/equivalente no inmunogénico, no antigénico, con una actividad coagulante superior.

La molécula de factor VIII híbrido es producida mediante aislamiento y recombinación de subunidades o dominios de factor VIII humano y animal; o mediante ingeniería genética de los genes del factor VIII humano y animal.

En una forma de realización preferida, los procedimientos de ADN recombinante son utilizados para sustituir con elementos de un factor VIII animal, los correspondientes elementos de un factor VIII humano, dando lugar a moléculas de factor VIII híbrido humano/animal. En una segunda forma de realización preferida, los procedimientos de ADN recombinante son utilizados para reemplazar uno o más aminoácidos en el factor VIII humano o animal, o en un factor VIII híbrido humano/animal, con aminoácidos cuya secuencia no tiene identidad conocida respecto al factor VIII, preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tenga menos inmunorreactividad con los anticuerpos inhibidores del factor VIII que aparecen naturalmente ("secuencia de aminoácidos no-antigénica"), y/o sea menos apta para provocar la producción de anticuerpos contra el factor VIII ("secuencia de aminoácidos no-inmunogénicos"), que el factor VIII humano. Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos que puede ser utilizada para reemplazar una secuencia inmunogénica o antigénica, es una secuencia de residuos de alanina.

En otra forma de realización, las subunidades del factor VIII son aisladas y purificadas a partir de plasma humano o animal, y se produce factor VIII híbrido humano/animal tanto mediante mezcla de subunidades de cadena pesada animal con subunidades de cadena ligera humana, como mediante mezcla de subunidades de cadena pesada humana con subunidades de cadena ligera animal, produciendo de ese modo moléculas híbridas cadena ligera humana/cadena pesada animal, y cadena pesada humana/cadena ligera animal. Estas moléculas híbridas son aisladas mediante cromatografía de intercambio iónico.

Alternativamente, son aislados y purificados uno o más dominios, o dominios parciales, del factor VIII, a partir del plasma humano o animal, y se produce factor VIII híbrido humano/animal mediante la mezcla de dominios, o dominios parciales, de una de las especies, con dominios, o dominios parciales, de la segunda especie. Las moléculas híbridas pueden aislarse mediante cromatografía de intercambio iónico.

Los métodos descritos para la preparación de factor VIII híbrido altamente purificado, tienen los pasos: (a) aislamiento de subunidades de factor VIII humano derivado de plasma, y de subunidades de factor VIII animal derivado de plasma, seguido de la reconstitución de la actividad coagulante mediante la mezcla de las subunidades animales y humanas, seguido del aislamiento de factor VIII híbrido animal/humano mediante cromatografía de intercambio iónico; (b) aislamiento de dominios, o dominios parciales, de factor VIII humano derivado de plasma, y de dominios, o dominios parciales, de factor VIII animal derivado de plasma, seguido de la reconstitución de la actividad coagulante mediante la mezcla de los dominios humanos y animales, seguido de aislamiento del factor VIII híbrido humano/animal cromatografía de intercambio iónico; (c) construcción de dominios, o dominios parciales, de factor VIII animal, mediante tecnología de ADN recombinante, e intercambio recombinante de dominios de factor VIII humano y animal, para producir factor VIII híbrido animal/humano con capacidad coagulante; (d) creación de un factor VIII híbrido animal/humano mediante sustitución de residuos específicos de aminoácidos del factor VIII de una de las especies, por los correspondientes residuos únicos de aminoácidos del factor VIII de la otra especie; o (e) creación de una molécula de factor VIII equivalente híbrido, que contenga secuencias de aminoácidos animal o humana, o ambas, en la que los residuos específicos de aminoácidos del factor VIII son sustituidos con residuos de aminoácidos que tienen una identidad de secuencia desconocida para el factor VIII, usando mutagénesis en sitio dirigido.

Algunas formas de realización de factor VIII híbrido o factor VIII equivalente híbrido, tienen una actividad específica mayor que la del factor VIII humano, e igual o mayor que la del factor VIII porcino. Algunas formas de realización de factor VIII híbrido o factor VIII equivalente híbrido, tienen igual o menor inmunorreactividad con los anticuerpos inhibidores del factor VIII y/o menos inmunogenicidad en humanos o animales, comparado con el factor VIII humano o porcino.

También se proporcionan las composiciones farmacéuticas y los procedimientos para tratar a los pacientes que tengan déficit de factor VIII, comprendiendo la administración del factor VIII híbrido o del factor VIII equivalente híbrido.

Breve descripción de las ilustraciones

Las Figuras 1A-1H vistas juntas, dan una comparación de secuencia alineada de las secuencias de aminoácidos del factor VIII del ser humano, del cerdo y del ratón.

Descripción detallada de las definiciones de la invención

A menos que se especifique o indique de otro modo, tal como se usa aquí, "factor VIII" se refiere a cualquier molécula de proteína de factor VIII funcional de cualquier animal, cualquier factor VIII híbrido o factor VIII modificado, "factor VIII híbrido" o "proteína híbrida" significa cualquier molécula de proteína de factor VIII funcional, o fragmento del mismo, que comprende la secuencia de aminoácidos del factor VIII humano, porcino, y/o especies de mamíferos ni humanos, ni porcinos. Estas combinaciones incluyen, aunque no quedan limitadas a, cualquiera, o todas, de las siguientes moléculas de factor VIII, o fragmentos del mismo: (1) humano/porcino; (2) humano/mamífero ni humano, ni porcino, como humano/ratón; (3) porcino/mamífero ni humano, ni porcino, como ratón/perro. Estas combinaciones también incluyen moléculas de factor VIII híbrido equivalente, o fragmentos de las mismas, tal como se define abajo, que comprenden la secuencia de aminoácidos del factor VIII de origen híbrido, humano, porcino, o mamífero ni humano, ni porcino, en la cual la secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia de identidad no conocida para el factor VIII, es sustituida. Estas combinaciones híbridas también incluyen secuencias de aminoácidos de factor VIII híbrido derivado de más de dos especies, como es el caso del humano/cerdo/ratón, o de dos o más especies en las cuales la secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia de identidad no conocida para el factor VIII, es sustituida. A menos que se indique de otro modo, "factor VIII híbrido" incluye fragmentos del factor VIII híbrido, que pueden ser usados, tal como se describe abajo en una forma de realización ejemplar, como sondas para propósitos de investigación, o como reagentes de diagnóstico.

Tal como se utiliza aquí, "factor VIII de mamífero" incluye factor VIII con una secuencia de aminoácidos derivada de cualquier mamífero no-humano, a menos que se especifique de otro modo. "Animal", tal como se utiliza aquí, se refiere al cerdo y a otros mamíferos no-humanos.

Una "proteína de fusión" o "factor VIII de fusión, o fragmento del mismo", tal como se utiliza aquí, es el producto de un gen híbrido en el que la secuencia codificante para una de las proteínas es ampliamente alterada, por ejemplo, mediante la fusión de parte de la misma con la secuencia codificante para una segunda proteína de un gen distinto, para producir un gen híbrido que codifique la proteína de fusión. Tal como se utiliza aquí, una proteína de fusión es un subconjunto de la proteína del factor VIII híbrido descrito en esta aplicación.

Un ácido nucleico "correspondiente", o un aminoácido, o una secuencia de ambos, tal como se utiliza aquí, es uno que está presente en un sitio, en una molécula de factor VIII, o de factor VIII híbrido, o un fragmento de las mismas, y que tiene la misma estructura y/o función que un sitio en la molécula de factor VIII de otra especie, aunque el número de ácidos nucleicos o aminoácidos puede no ser idéntico. Una secuencia que "se corresponde a" otra secuencia de factor VIII, se corresponde sustancialmente a esa secuencia, e híbrida a la secuencia de la SEC ID Nº diseñada, bajo condiciones estrictas. Una secuencia que "se corresponde a" otra secuencia de factor VIII, también incluye una secuencia que da lugar a la expresión de un factor VIII o factor VIII híbrido procoagulante reivindicado, o un fragmento del mismo, e hibridaría a la SEC ID Nº diseñada, pero para la redundancia del código genético.

Un residuo o secuencia de aminoácidos "único", tal como se utiliza aquí, se refiere a una secuencia o residuo de aminoácidos en la molécula de factor VIII de una especie que es distinta de la secuencia o residuo homólogo en la molécula de factor VIII de otra especie.

"Actividad específica", tal como se utiliza aquí, se refiere a la actividad que corregirá el defecto de coagulación del déficit de factor VIII humano en plasma. La actividad específica se mide en unidades de actividad coagulante por miligramo de proteína de factor VIII total, en un ensayo estándar en el cual el tiempo de coagulación del plasma con déficit de factor VIII se compara con aquel del plasma humano normal. Una unidad de actividad del factor VIII es la actividad presente en un milímetro de plasma humano normal. En el ensayo, a menor tiempo de formación del coagulo, mayor es la actividad del factor VIII que está siendo probado. El factor VIII híbrido humano/porcino tiene actividad de coagulación en un ensayo con factor VIII humano. Esta actividad, así como la de otras moléculas de factor VIII híbrido o híbrido equivalente, o fragmentos de las mismas, pueden ser menores, iguales o mayores que la actividad del factor VIII humano, tanto recombinante como derivado del plasma.

Las secuencias de nucleótido ADNc y de aminoácidos predichos del factor VIII humano, son mostradas en SEC ID Nºs: 1 y 2, respectivamente. El factor VIII es sintetizado como una proteína de cadena única de aproximadamente 300 KDa, con homología interna de secuencia que define la secuencia "dominio" NH_{2}-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. En una molécula de factor VIII, un "dominio", tal como se utiliza aquí, es una secuencia continua de aminoácidos que se define por identidad interna de secuencia de aminoácidos y por sitios de rotura proteolítica por la trombina. A menos que se especifique de otro modo, los dominios del factor VIII incluyen los siguientes residuos de aminoácidos, cuando las secuencias se alinean con la secuencia de aminoácidos humana (SEC ID Nº: 2): A1, residuos Ala1-Arg372; A2, residuos Ser373-Arg740; B, residuos Ser741-Arg1648; A3, residuos Ser1690-Ile2032; C1, residuos Arg2033-Asn2172; C2, residuos Ser2173-Tyr2332. La secuencia A3-C1-C2 incluye residuos Ser1690-Tyr2332. La secuencia restante, residuos Glu1649-Arg1689, es normalmente mencionada como el péptido de activación de cadena ligera del factor VIII. El factor VIII es activado proteolíticamente por la trombina o por el factor Xa, que lo disocia del factor de von Willebrand, formando el factor VIIIa, que tiene función pro-coagulante. La función biológica del factor VIIIa es aumentar la eficacia catalítica del factor IXa con respecto la activación del factor X, en varios órdenes de magnitud. El factor VIIIa activado por trombina es un heterotrímero A1/A2/A3-C1-C2 de 160 KDa que forma un complejo con el factor IXa y con el factor X sobre la superficie de las plaquetas o monocitos. Un "dominio parcial", tal como se utiliza aquí, es una secuencia continua de aminoácidos que forma parte de un dominio.

Las "subunidades" del factor VIII humano o animal, tal como se utiliza aquí, son las cadenas ligeras y pesadas de la proteína. La cadena pesada del factor VIII contiene tres dominios, A1, A2, y B. La cadena ligera del factor VIII también contiene tres dominios, A3, C1, y C2.

El factor VIII híbrido, o fragmentos del mismo, puede crearse (1) sustituyendo con subunidades derivadas de plasma animales o subunidades derivadas de plasma humanas (cadenas pesadas o ligeras), las subunidades derivadas de plasma humanas o subunidades derivadas de plasma animales correspondientes; (2) sustituyendo con dominios humanos o dominios animales (A1, A2, A3, B, C1, y C2), los dominios animales o dominios humanos correspondientes; (3) sustituyendo con partes de dominios humanos o partes de dominios animales, las partes de dominios animales o partes de dominios humanos; (4) sustituyendo con al menos una secuencia específica que incluya uno o más aminoácidos únicos humanos o uno o más aminoácidos únicos animales, los correspondientes aminoácidos animales o humanos; (5) sustituyendo con una secuencia de aminoácidos con secuencia de identidad no conocida para el factor VIII, al menos una secuencia que incluya uno o más residuos de aminoácidos específicos, en factor VIII humano, animal, o híbrido, o fragmentos del mismo. Un factor VIII híbrido, un factor VIII híbrido equivalente, o fragmentos de los mismos, denominado "Sin dominio B", tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquiera de las construcciones de factor VIII híbrido descritas aquí, a las que les falta el dominio B.

Los términos "epítopo", "sitio antigénico", y "determinante antigénico", tal como se utilizan aquí, se usan de manera sinónima, y se definen como una porción del factor VIII humano, animal, híbrido, o híbrido equivalente, o un fragmento del mismo, que es reconocida por un anticuerpo. Puede estar constituido por un número cualquiera de residuos de aminoácidos, y puede depender de las estructuras primaria, secundaria y terciaria de la proteína. De acuerdo con este descubrimiento, un factor VIII híbrido, un factor VIII híbrido equivalente, o un fragmento de los mismos, que incluya al menos un epítopo, puede ser usado como un reagente en la prueba de diagnóstico descrita más abajo. En algunas formas de realización, el factor VIII híbrido, o el híbrido equivalente, o fragmentos de los mismos, no presenta reactividad cruzada, o presenta menos reactividad cruzada, frente a todos los anticuerpos inhibidores de factor VIII que aparecen naturalmente, que el factor VIII humano o porcino.

El término "sitio inmunogénico", tal como se utiliza aquí, se define como una región del factor VIII humano o animal, del factor VIII híbrido o del híbrido equivalente, o de fragmentos de los mismos, que da lugar específicamente a la producción de anticuerpos contra el factor VIII, híbrido, o híbrido equivalente, o fragmentos de los mismos, en un humano o en animal, tal como se mide mediante protocolos de rutina, como el inmunoensayo, p.e. ELISA, o la prueba Bethesda aquí descrita. Puede estar constituido por cualquier número de residuos de aminoácidos, y puede depender de la estructura primaria, secundaria o terciaria de la proteína. En algunas formas de realización, el factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, o fragmentos de los mismos, no es inmunogénico, o es menos inmunogénico en un factor VIII animal o humano, que en un factor VIII humano o porcino.

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Tal como se utiliza aquí, una "molécula equivalente de factor VIII híbrido, o un fragmento de la misma" o "un factor VIII híbrido equivalente, o un fragmento del mismo", es una molécula activa de factor VIII, o de factor VIII híbrido, o un fragmento de la misma, que comprende al menos una secuencia que incluye uno o más residuos de aminoácidos que tienen una secuencia de identidad no conocida para la secuencia de factor VIII humano o animal, que sustituye al menos una secuencia que incluye uno o más residuos de aminoácidos específicos en el factor VIII humano, animal, o híbrido, o fragmentos del mismo. La secuencia de uno o más residuos de aminoácidos que tienen una secuencia de identidad no conocida para la secuencia de factor VIII humano o animal, es también mencionada aquí como "secuencia de aminoácidos foráneos". En una forma de realización preferida, los aminoácidos que tienen identidad de secuencia desconocida para la secuencia de factor VIII, son residuos de alanina. En otra forma de realización preferida, la secuencia específica de factor VIII para la cual son sustituidos los aminoácidos que tienen identidad de secuencia desconocida para la secuencia de factor VIII, incluye un sitio antigénico que es inmunorreactivo para anticuerpos inhibidores del factor VIII, que aparecen de manera natural, de tal manera que la molécula equivalente de factor VIII híbrido, o fragmento de la misma, es menos inmunorreactiva, o no es inmunorreactiva con los anticuerpos inhibidores de factor VIII. En otra forma de realización más, la secuencia específica de factor VIII para la cual son sustituidos los aminoácidos que tienen identidad de secuencia desconocida para el factor VIII, incluye un sitio inmunogénico que produce la formación de anticuerpos inhibidores de factor VIII en un animal o en un humano, de tal modo que la molécula equivalente de factor VIII híbrido, o fragmento de la misma, es menos inmunogénica.

La "deficiencia de factor VIII", tal como se utiliza aquí, incluye deficiencia en la actividad coagulante causada por la producción de factor VIII defectuoso, por producción inadecuada o nula de factor VIII, o por inhibición total o parcial del factor VIII por parte de inhibidores. La hemofilia A es un tipo de deficiencia de factor VIII, provocado por un defecto en un gen X, y por la ausencia o deficiencia de la proteína de factor VIII que este codifica.

Tal como se utiliza aquí, las "pruebas diagnósticas" incluyen pruebas que de algún modo utilizan la interacción antígeno-anticuerpo para detectar y/o cuantificar la cantidad de un anticuerpo en particular que está presente en una muestra de prueba, para ayudar en la selección de terapias médicas. Hay muchos ensayos conocidos por los expertos en la materia. Tal como se utiliza aquí, sin embargo, el ADN del factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, o fragmentos del mismo, y la proteína expresada a partir de aquel, puede ser sustituido, total o parcialmente, por los correspondientes reagentes en los ensayos conocidos de otro modo, por lo que los ensayos modificados pueden ser usados para detectar y/o cuantificar los anticuerpos contra el factor VIII. Es el uso de esos reagentes, el ADN de factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, o fragmentos del mismo, o la proteína expresada a partir de ese, lo que permite la modificación de análisis conocidos, para la detección de anticuerpos contra factor VIII humano o animal, o contra factor VIII híbrido, o híbrido equivalente. Estos análisis incluyen, aunque no quedan limitados a, ELISAs, ensayos de inmunodifusión, e inmunoblots. Los procedimientos apropiados para practicar cualquiera de esos ensayos, son conocidos por los expertos en la materia. Tal como se utiliza aquí, el factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, o los fragmentos del mismo, que incluye al menos un epítopo de la proteína, puede ser usado como reagente diagnóstico. Entre los ejemplos de otros ensayos en los cuales el factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, o fragmentos del mismo, puede ser usado, se incluyen el ensayo Bethesda y los ensayos de anticoagulación.

Descripción general de los procedimientos

El documento U.S. Serial Nº 07/864,004 describía el descubrimiento de moléculas de factor VIII híbrido humano/porcino que tenían actividad coagulante, en las cuales los elementos de la molécula de factor VIII de humano o de cerdo, son sustituidos por elementos correspondientes de la molécula de factor VIII de otras especies. Los documentos U.S. Serial Nº 08/212,133 y PCT/US94/13200 describen las moléculas de factor VIII híbrido humano/animal, e híbrido equivalente, procoagulantes, en las que los elementos de la molécula de factor VIII de una de las especies es sustituida por los elementos correspondientes de la molécula de factor VIII de la otra especie.

La presente invención proporciona moléculas de factor VIII híbrido humano/animal, animal/animal, y equivalente, y fragmentos de las mismas, y las secuencias del ácido nucleico que codifican esos híbridos, algunos de los cuales tienen una mayor actividad coagulante en un ensayo de coagulación estándar, cuando se los compara con el factor VIII humano altamente purificado; y/o son menos inmunorreactivos a los anticuerpos inhibidores del factor VIII humano o porcino, si se comparan con el factor VIII humano o porcino; y/o son menos inmunogénicos en un humano o animal, que el factor VIII humano o animal. Estas moléculas de factor VIII híbrido pueden ser construidas tal como se indica a continuación.

Aquí se desvelan al menos cinco tipos de moléculas de factor VIII activo, híbrido humano/porcino, o híbrido equivalente, o fragmentos de las mismas; las secuencias de ácido nucleico que codifican esas moléculas de factor VIII híbrido; y los métodos para prepararlas: aquellas obtenidas (1) sustituyendo con una subunidad humana o porcina (es decir, cadena pesada o cadena ligera), la correspondiente subunidad porcina o humana; (2) sustituyendo con uno o más dominios humanos o porcinos (es decir, A1, A2, A3, B, C1, y C2), los correspondiente dominios porcinos o humanos; (3) sustituyendo con una parte continua de uno o mas dominios humanos o porcinos, la correspondiente parte de uno o más dominios porcinos o humanos; (4) sustituyendo con al menos una secuencia específica que incluya uno o más residuos únicos de aminoácidos en factor VIII humano o porcino, la correspondiente secuencia porcina o humana; y (5) sustituyendo con al menos una secuencia que incluya uno o más residuos de aminoácidos que tienen secuencia de identidad no conocida del factor VIII ("secuencia de aminoácidos antifactor VIII"), al menos una secuencia específica de uno o más aminoácidos en factor VIII humano, porcino, o híbrido humano/porcino.

También pueden prepararse con los mismos métodos al menos cinco tipos de moléculas de factor VIII activo, híbrido humano/mamífero ni humano, ni porcino, o híbrido equivalente, o fragmentos de las mismas, y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican: aquellas obtenidas (1) sustituyendo con una subunidad humana o no humana, mamífera no-porcina (es decir, cadena pesada o cadena ligera), la correspondiente subunidad no humana, mamífero no porcina o humana; (2) sustituyendo con uno o mas dominios humanos o no humanos, mamífero no porcino (es decir, A1, A2, A3, B, C1, y C2), los correspondientes dominios no humanos, mamífero no porcinos o humanos; (3) sustituyendo con una parte continua de uno o mas dominios humanos o no humanos, mamífero no porcinos, la parte correspondiente de uno o mas dominios no humanos, mamífero no porcinos o humanos; (4) sustituyendo con al menos una secuencia específica que incluya uno o más residuos únicos de aminoácidos en factor VIII humano o no humano, mamífero no porcino, la correspondiente secuencia no humana, mamífero no porcina; y (5) sustituyendo con al menos una secuencia que incluya uno o más residuos de aminoácidos que tienen secuencia de identidad no conocida del factor VIII ("secuencia de aminoácidos antifactor VIII"), al menos una secuencia específica de uno o más aminoácidos en factor VIII humano, no humano, mamífero no porcino, o híbrido humano/mamífero ni humano, ni porcino.

Es más, alguien experto en la materia reconocerá fácilmente que se pueden usar los mismos métodos para preparar al menos cinco tipos de moléculas de factor VIII híbrido activo, o fragmentos de las mismas, correspondientes a los tipos (1)-(5) en los dos párrafos previos, que comprendan una secuencia de aminoácidos del factor VIII de dos o más ma-
míferos no humanos, como es porcino/ratón, y que comprenda incluso una secuencia de aminoácidos antifactor VIII.

Las proteínas de factor VIII híbrido humano/animal, animal/animal, y equivalente, o los fragmentos de las mismas, listadas en los grupos (1)-(3) mencionados más arriba, son creadas mediante aislamiento de subunidades, dominios o partes continuas de dominios de factor VIII derivado de plasma, seguido de reconstitución y purificación. Las proteínas de factor VIII híbrido humano/animal, animal/animal, y equivalente, o fragmentos de las mismas, descritas en los grupos (3)-(5) mencionados más arriba, son creados mediante métodos de ADN recombinante. La molécula híbrida puede contener un porcentaje mayor o menos de secuencia humana respecto a la animal, dependiendo del origen de las distintas regiones, tal como se describe abajo más detalladamente.

Puesto que la información corriente indica que el dominio B no tiene epítopo inhibitorio, y no tiene efecto conocido sobre la función del factor VIII, en algunas formas de realización se elimina el dominio B de las moléculas de factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, o fragmentos de las mismas ("factor VIII B(-)") preparadas por cualquiera de los métodos aquí descritos.

Se demuestra en el Ejemplo 4 que el factor VIII híbrido humano/porcino que comprende la cadena pesada porcina y la cadena ligera humana, y que se corresponde con el primer tipo de híbrido listado más arriba, tiene una mayor actividad específica coagulante en un ensayo de coagulación estándar, si se compara con el factor VIII humano. El factor VIII híbrido humano/animal, o equivalente, con actividad coagulante, si la actividad es mayor, igual o menor que la del factor VIII humano, puede ser útil en el tratamiento de pacientes con inhibidores, pues estos inhibidores pueden reaccionar en menor medida con el factor VIII híbrido humano/animal, o equivalente, comparado con cualquier factor VIII humano o porcino.

Preparación, mediante reconstitución, de moléculas de factor VIII híbrido a partir de subunidades de factor VIII animal y humano

La presente invención proporciona moléculas de factor VIII híbrido humano/animal, o fragmentos de las mismas, con sustituciones de subunidades, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican esos híbridos, procedimientos para prepararlas y aislarlas, y procedimientos para caracterizar su actividad procoagulante. Un método, modificado por procedimientos informados por Fay, P.J., et al., 265 J. Biol. Chem. 6197 (1990); y Lollar, J.S., et al., 263 J. Biol. Chem. 10451 (1988), implica el aislamiento de las subunidades (cadenas pesada y ligera) de factor VIII humano y animal, seguido de una recombinación de cadena pesada de ser humano, y cadena ligera animal, o mediante recombinación de cadena ligera humana y cadena pesada animal.

El aislamiento de las subunidades individuales, tanto humanas como animales, implica la disociación del dímero cadena ligera o pesada. Esto se ha conseguido, por ejemplo, mediante quelación de calcio con ácido etilen-diamin-tetra-acético (EDTA), seguido de monoS^{TM} HPLC (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ). Las moléculas de factor VIII híbrido humano/animal son reconstituidas a partir de subunidades aisladas, en presencia de calcio. El factor VIII híbrido de cadena ligera humana/cadena pesada animal, o cadena ligera animal/cadena pesada humana, es aislado a partir de cadenas pesadas sin reaccionar, mediante monoS^{TM} HPLC, por procedimientos para el aislamiento de factor VIII porcino, tal como se describe en Lollar, J.S., et al., 71 Blood 137-143 (1988).

Estos métodos, utilizados en una forma de realización para preparar factor VIII híbrido humano/porcino activo, son descritos en detalle en los ejemplos inferiores, y dan lugar a moléculas híbridas de cadena ligera humana/cadena pesada porcina con una actividad procoagulante seis veces mayor que el factor VIII humano.

Pueden prepararse otras moléculas de factor VIII híbrido humano/no humano, de mamífero no porcino, y pueden ser aisladas, y caracterizadas para la actividad mediante los mismos métodos. Alguien experto en la materia reconocerá fácilmente que esos métodos pueden utilizarse también para preparar, aislar y caracterizar para la actividad, al factor VIII híbrido animal/animal, como porcino/ratón, comprendiendo el que la cadena ligera o pesada de una especie sea combinada con la cadena pesada o ligera de la otra especie.

Preparación de moléculas de factor VIII híbrido a partir de dominios de factor VIII humano y animal, mediante reconstitución

La presente invención proporciona moléculas de factor VIII híbrido humano/animal, o fragmentos de las mismas, con sustituciones de dominios, las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican, métodos para prepararlas y aislarlas, y métodos para caracterizar su actividad procoagulatoria. Un método implica el aislamiento de uno o más dominios de factor VIII humano, y uno o más dominios de factor VIII animal, seguido de recombinación de dominios humano y animal para formar el factor VIII híbrido humano/animal con actividad coagulante, tal como describe Lollar, P., et al., 267(33) J. Biol. Chem. 23652-23657 (Nov. 25, 1992) para el factor VIII híbrido humano/porcino.

Se ha proporcionado específicamente un factor VIII híbrido humano/porcino con sustitución del dominio A2 humano por el dominio A2 porcino, cuya forma de realización ilustra un método por el cual puede construirse un factor VIII híbrido humano/no humano, mamífero no porcino, con el dominio sustituido. Los dímeros A1/A3-C1-C2 no humanos, mamífero no porcinos y humanos, derivados del plasma, son aislados por disociación del dominio A2 del factor VIIIa. Esto se consigue, por ejemplo, en presencia de NaOH, tras lo cual la mezcla se diluye y el dímero es eluído usando monoS^{TM} HPLC (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ). Se aísla el dominio A2 a partir del factor VIIIa como un componente menor en la monoS^{TM} HPLC. Las moléculas de factor VIII híbrido humano/animal son reconstituidas mezclando volúmenes iguales del dominio A2 de una de las especies, y el dímero A1/A3-C1-C2 de la otra especie.

El factor VIII híbrido humano/animal, o fragmentos del mismo, con una o más sustituciones de dominios, es aislado de la mezcla de dímeros sin reaccionar y A2, mediante monoS^{TM \ HPLC}, usando los procedimientos para el aislamiento de factor VIII porcino, tal como describe Lollar, J.S., et al., 71 Blood 137-143 (1988). También pueden usarse procedimientos de rutina para preparar y aislar los dominios A1, A3, C1, C2, y B del factor VIII de una de las especies, pudiendo ser uno cualquiera o más de uno de esos dominios, sustituidos por el dominio correspondiente del factor VIII de la otra especie. Alguien experto en la materia reconocerá fácilmente que esos procedimientos pueden usarse también para preparar, aislar, y caracterizar para la actividad, un factor VIII híbrido animal/animal, como porcino/ratón, con el dominio sustituido.

Estos procedimientos, descritos en detalle en los ejemplos inferiores, dan lugar a moléculas híbridas del factor VIII con actividad procoagulante.

Preparación de moléculas de factor VIII híbrido, mediante ingeniería recombinante de las secuencias que codifican para las subunidades, dominios, o partes de dominios, del factor VIII humano, animal e híbrido Sustitución de subunidades, dominios, partes continuas de dominios

La presente invención proporciona moléculas de factor VIII activo, recombinante híbrido humano/animal e híbrido equivalente, y fragmentos de las mismas, con sustituciones de subunidad, dominio, y secuencia de aminoácidos; las secuencias de ácido nucleico que codifican para esos híbridos; procedimientos para prepararlos y aislarlos, y métodos para caracterizar sus propiedades coagulante, inmunorreactiva, e inmunogénica.

El gen del factor VIII humano fue aislado y expresado en células de mamífero, tal como informó: Toole, J.J., et al., 312 Nature 342-347 (1984) (Genetics Institute); Gitschier, J., et al., 312 Nature 326-330 (1984) (Genentech); Wood, W.I., et al., 312 Nature 330-337 (1984) (Genentech); Vehar, G.A., et al., 312 Nature 337-342 (1984) (Genentech); documento WO 87/0497; documento WO 88/08035; documento WO 88/03558; Patente U.S. Nº 4,757,006, y la secuencia de aminoácidos se dedujo a partir del ADNc. La patente U.S. Nº 4,965,199 de Capon et al., desvela un procedimiento de ADN recombinante para producir factor VIII en células huésped de mamífero, y purificación de factor VIII humano. Se ha informado sobre la expresión de factor VIII humano en células de ovario de hámster chino (CHO) y en células de riñón de cría de hámster (BHKC). El factor VIII humano ha sido modificado para eliminar parte de, o todo, el dominio B (Patente U.S. Nº 4,868112), y se ha intentado la sustitución del dominio B del factor VIII por el dominio B del factor V (Patente U.S. Nº 5,004,803). La secuencia cADN que codifica el factor VIII humano y las secuencias de aminoácidos predichos, son mostradas en SEC ID Nºs: 1 y 2, respectivamente.

El factor VIII porcino ha sido aislado y purificado a partir del plasma (Fass D.N., et al., 59 Blood 594 (1982)). Church et al., 81 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6934 (1984) describió una secuencia de aminoácidos parcial de factor VIII porcino, correspondiente a porciones de la secuencia N-terminal de la cadena ligera, con homología con la ceruloplasmina y el factor de coagulación V, y localizada muy incorrectamente. Toole, J.J., et al., 312 Nature 342-347 (1984) describió la secuenciación parcial del final N-terminal de cuatro fragmentos de aminoácidos del factor VIII porcino, pero no caracterizó los fragmentos según sus posiciones en la molécula de factor VIII. Toole J.J., et al., 83 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 5939-5942 (1986) informó sobre la secuencia de aminoácidos de los dominios B y parte de la A2, del factor VIII porcino. La secuencia de ADNc codificante del dominio A2 completo del factor VIII porcino, y de la secuencia predicha de aminoácidos, y el factor VIII híbrido humano/porcino con sustituciones de todos sus dominios, todas las unidades y secuencias de aminoácidos, fueron desvelados en el documento U.S. Serial Nº 07/864,004 titulado "Hybrid Human/Porcine factor VIII", presentado el 7 de abril de 1992 por John S. Lollar y Marschall S. Runge, y que fue publicado como Patente U.S. nº 5,364,771 el 15 de noviembre de 1994, y en el documento WO 93/20093. La secuencia de ADNc codificante del dominio A2 del factor VIII porcino que tiene la identidad de secuencia para los residuos 373-740 en el factor VIII humano maduro, tal como se muestra en ID SEC NO: 1, y la secuencia predicha de aminoácidos, se muestran en ID SEC Nos: 3 y 4, respectivamente. Más recientemente, se informó en el documento WO 94/11503 sobre las secuencias de nucleótidos y los correspondientes aminoácidos de los dominios A1 y A2 del factor VIII porcino, y un quimérico factor VIII con dominios A1 y/o A2 humanos sustituidos por los correspondientes dominios porcinos.

Tanto el factor VIII humano como el porcino son aislados a partir del plasma como una proteína de dos subunidades. La subunidades, conocidas como la cadena pesada y la cadena ligera, se mantienen unidas por un enlace no covalente que requiere calcio u otros iones metálicos divalentes. La cadena pesada del factor VIII contiene tres dominios, A1, A2, y B, que están enlazados covalentemente. La cadena ligera del factor VIII también tiene tres dominios, designados A3, C1, y C2. El dominio B no tienen función biológica conocida y puede ser eliminado proteolíticamente de la molécula, o mediante tecnología de ADN recombinante, sin que exista alteración significante en ningún parámetro mensurable del factor VIII. EL factor VIII humano recombinante tiene una estructura y función similar a la del factor VIII derivado de plasma, aunque no está glucosilado a menos que se exprese en células de mamífero.

Tanto el factor VIII activado de humano, como el porcino ("factor VIIIa") tienen tres subunidades, debido a la rotura de la cadena pesada entre los dominios A1 y A2. Esta estructura se designa A1/A2/A3-C1-C2. El factor VIIIa humano no es estable bajo las condiciones que estabilizan al factor VIIIa porcino, presumiblemente por causa de la asociación más débil de la subunidad A2 del factor VIIIa humano. La disociación de la subunidad A2 del factor VIIIa humano y porcino está asociada con la pérdida de actividad en la molécula de factor VIIIa.

Proporcionado específicamente como una forma de realización preferida y ejemplar, está el factor VIII activo recombinante híbrido humano/porcino, que tiene el dominio A2 sustituido; la secuencia de ácidos nucleicos que lo codifican; y los métodos para preparar, aislar y caracterizar su actividad. Los procedimientos mediante los cuales se prepara esta construcción de híbrido, también pueden utilizarse para preparar factor VIII activo recombinante híbrido humano/porcino, o fragmentos del mismo, que tiene sustitución de dos subunidades, de partes continuas de dominios, o dominios distintos que A2. Alguien experto en la materia reconocerá fácilmente que estos modelos también demuestran cómo pueden prepararse otras moléculas de factor VIII recombinante híbrido humano/mamífero ni humano, ni porcino o híbrido animal/animal, o fragmentos de las mismas, en las que se sustituyan las subunidades, los dominios o pares de dominios continuos.

EL factor VIII recombinante híbrido humano/porcino se prepara comenzando con ADNc humano (Biogen, Inc.) que codifica la secuencia de factor VIII. En una forma de realización preferida, el factor VIII codificado por el ADNc incluye los dominios A1-A2-A3-C1-C2, faltándole el dominio B entero, y se corresponde a los residuos de aminoácidos 1-740 y 1649-2332 de factor VIII humano de cadena única (ver ID SEC NO: 2), de acuerdo al sistema de numeración de Wood et al., 312 Nature 330-337 (1984).

Las subunidades individuales, dominios, o partes continuas de dominios, del ADNc del factor VIII porcino o humano pueden ser clonados y sustituidos por las correspondientes subunidades, dominios, o partes de dominios, humanas o porcinas, mediante técnicas de mutagénesis establecidas. Por ejemplo, Lubin, I.M., et al., 269(12) J. Biol. Chem. 8639-8641 (Marzo 1994) describe técnicas para sustituir el dominio A2 humano con el dominio porcino, utilizando sitios de restricción convenientes. Otros métodos para sustituir cualquier región arbitraria del ADNc del factor VIII de una de las especies con el ADNc de la otra especie, incluyen el empalme mediante el solapamiento de la extensión ("SOE"), tal como describe Horton, R.M., et al., 217 Meth. Enzymol. 270-279 (1993).

El ADNc del factor VIII híbrido que codifica las subunidades, los dominios, o partes de dominios, o las moléculas enteras de ADNc híbrido, son clonadas en vectores de expresión para la expresión máxima de las moléculas de proteína del factor VIII activo híbrido humano/porcino, en células cultivadas mediante técnicas establecidas, tal como describe Seldan R.F., "Introduction of DNA into mammalian cells", en Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds (1991).

En una forma de realización preferida, un ADNc híbrido humano/porcino codificante del factor VIII, en el que la secuencia porcina que codifica un dominio, o parte de un dominio, como el dominio A2 o parte del dominio, se inserta en una vector de expresión de mamíferos, como es ReNeo, para formar una construcción de factor VIII híbrido. La caracterización preliminar del factor VIII se consigue mediante la inserción del ADNc híbrido en el vector de expresión de mamíferos ReNeo, y la expresión transitoria de la proteína híbrida en células COS-7. Se puede realizar una determinación de si la proteína híbrida activa es expresada. La construcción del vector de expresión se usa incluso para transfectar establemente células en cultivo, como son las células del riñón de las crías de hámster, utilizando métodos que son rutina en el arte, como es la transfección mediada por liposomas (Lipofectin^{TM}, Life Technologies, Inc.). La expresión de la proteína de factor VIII híbrido recombinante puede ser confirmada, por ejemplo, mediante secuenciado, Northern y Western blotting, o por la reacción en cadena de polimerasa (PCR). La proteína de factor VIII híbrido, que se encuentra en el medio de cultivo en donde se mantienen las células transfectadas expresando establemente la proteína, puede ser precipitada, sedimentada, lavada y resuspendida en un tampón apropiado, y la proteína de factor VIII híbrido recombinante puede ser purificada mediante técnicas estándar, incluyendo la cromatografía de inmunoafinidad, usando, por ejemplo, anti-A2 monoclonal-Sepharose^{TM}.

En una forma de realización más avanzada, el factor VIII que comprende sustituciones de subunidad, dominio, o secuencia de aminoácidos, se expresa como una proteína de fusión a partir de una molécula recombinante en la que la secuencia que codifica una proteína o péptido que mejora, por ejemplo, estabilidad, secreción, detección, aislamiento, o similares, es insertada en un lugar adyacente a la secuencia codificante del factor VIII. En la preparación de proteínas de fusión se conocen y son usados rutinariamente en el arte, protocolos establecidos para el uso de secuencias de control de la expresión de especies homólogas o heterólogas que incluyen, por ejemplo, promotores, operadores, y reguladores. Ver Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M., et al., eds), Wiley Interscience, N.Y.

El factor VIII híbrido purificado, o un fragmento del mismo, puede ser probado para medir la inmunorreactividad y la actividad coagulante mediante ensayos estándar que incluyen, p.e., el ensayo del factor VIII libre de plasma, el ensayo de coagulación de una etapa, y el ensayo del inmunoabsorbente unido a enzima, utilizando factor VIII humano recombinante purificado como un estándar.

Otros vectores, incluyendo tanto vectores plásmidos como vectores virales eucarióticos, pueden usarse para expresar una construcción de gen recombinante en células eucarióticas, dependiendo de la experiencia y juicio del profesional habilidoso (ver, por ejemplo, Sambrook et al., Capítulo 16). Otros vectores y sistemas de expresión, incluyendo sistemas de bacterias, levaduras y de células de insecto, pueden ser utilizados pero no son preferidos debido a diferencias en, o falte de, glicosilación.

La proteína del factor VIII híbrido recombinante puede ser expresada en distintas células usadas comúnmente para cultivo y expresión de proteínas recombinantes de mamíferos. Una línea celular preferida, disponible en la Colección de Tipos de Cultivos Americana (American Type Culture Collection), Rockville, MD, es la de células de riñón de cría de hámster, que son cultivadas usando procedimientos y medios de rutina.

Los mismos métodos utilizados para preparar factor VIII híbrido humano/porcino que tiene sustitución de subunidad, domino o secuencia de aminoácido, pueden utilizarse para preparar otra proteína de factor VIII híbrida recombinante, y fragmentos de la misma, y las secuencias de ácidos nucleicos que codifican esos híbridos, como los humano/mamífero ni humano, ni porcino o animal/animal. Comenzando con cebadores de la secuencia de ADN humano conocida, se han clonado ADNc del factor VIII de roedor y parte del factor VIII porcino. Las secuencias de factor VIII de otras especies para su uso en la preparación de una molécula de factor VIII híbrida humano/animal o animal/animal, puede obtenerse usando las secuencias conocidas de ADN humano y porcino como punto de inicio. Otras técnicas que pueden emplearse incluyen los métodos de amplificación PCR con ADN de tejido animal, y el uso de una genoteca de ADNc del animal para clonar la secuencia del factor VIII.

Como forma de realización ejemplar, la proteína del factor VIII híbrido humano/ratón puede crearse como se indica a continuación. Los clones de ADN correspondientes al homólogo de ratón del gen del factor VIII humano, han sido aislados y secuenciados, y se ha predicho la secuencia de aminoácidos de la proteína de factor VIII de ratón, tal como se describe en Elder, G., et al., (16(2) Genomics 374-379 (May 1993)), que también incluye una comparación de las secuencias predichas de aminoácidos de las moléculas de factor VIII de ratón, humano, y parte del porcino. La secuencia de ADNc del factor VIII de ratón, y la secuencia predicha de aminoácidos, se muestran en la ID SEC:5 e ID: SEC:8, respectivamente. En una forma de realización preferida, pueden usarse métodos de amplificación de ARN con secuenciado transcripto (RAWTS) descritos en Sarkar, G., and S.S. Sommer, 244 Science 331-334 (1989). Brevemente, los pasos son (1) síntesis de ADNc con oligo(dT) o un oligonucleótido cebador específico de ARNm; (2) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la que uno o ambos oligonucleótidos contienen un promotor del fago unido a una secuencia complementaria a la región a ser amplificada; (3) transcripción con un promotor del fago; y (4) secuenciado dideoxi del transcripto mediado por transcriptasa inversa, que es cebado con un oligonucleótido anidado (interno). Además de revelar información de la secuencia, este método puede generar una producto de traducción in vitro al incorporar una señal de iniciación de la traducción en el cebador PCR apropiado: y puede ser usado para obtener información de la nueva secuencia ARNm de otras especies.

Sustitución de aminoácidos

La presente invención proporciona moléculas de factor VIII híbrido recombinante humano/animal y animal/animal, o fragmentos de las mismas, que comprenden al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos únicos de una especie, que sustituyen a la correspondiente secuencia de aminoácidos de la otra especie, o fragmentos de la misma, secuencias de ácidos nucleicos que codifican esos híbridos, métodos para prepararlos y aislarlos, y métodos para caracterizar sus propiedades coagulante, inmunogénica e inmunorreactiva.

El dominio A2 es necesario para la actividad procoagulante de la molécula de factor VIII. Hay estudios que demuestran que el factor VIII porcino tiene seis veces más actividad procoagulante que el factor VIII humano (Lollar, P., and E.T. Parker 266 J. Biol. Chem. 12481-12486 (1991)), y que la diferencia en actividad coagulante entre el factor VIII humano y el porcino parece estar basada en una diferencia en la secuencia de aminoácidos entre uno o más residuos en el dominio A2 de humano y porcino (Lollar, P., et al., 267 J. Biol. Chem. 23652-23657 (1992)). Es más, se cree que los dominios A2 y C2, y posiblemente una tercera región de cadena ligera en la molécula de factor VIII humano, llevan los epítopos hacia los cuales reaccionan la mayoría, si no todos, de los anticuerpos inhibidores, de acuerdo con Hoyer, L.W., and D. Scandella, 31 Semin. Hematol. 1-5 (1994).

Las moléculas de factor VIII recombinante híbrido humano/animal, animal/animal, o equivalente, o fragmentos de las mismas, pueden crearse mediante sustitución de al menos una secuencia específica que incluya uno o más aminoácidos únicos de los dominios A2, C2, y/u otros dominios del factor VIII de una de las especies, por la secuencia correspondiente de la otra especie, donde las secuencias de aminoácidos difieren entre las moléculas de las dos especies, tal como se ilustra abajo con más detalle. En una forma de realización preferida ejemplar descrita aquí, la presente invención proporciona factor VIII recombinante híbrido humano/porcino activo, que comprende una secuencia de aminoácidos porcina que sustituye la correspondiente secuencia de aminoácidos humana, que incluye un epítopo, donde el factor VIII híbrido ha disminuido, o no tiene inmunorreactividad con los anticuerpos inhibidores para el factor VIII. En una forma de realización más avanzada, las moléculas de factor VIII híbrido recombinante activo también pueden crearse comprendiendo una secuencia de aminoácidos de más de una especie, que sustituye a la correspondiente secuencia en una tercera especie. Las moléculas recombinantes híbridas equivalentes también pueden hacerse, comprendiendo factor VIII humano, animal, o híbrido, que incluya al menos una secuencia que incluya uno o más aminoácidos que tienen identidad de secuencia no conocida para el factor VIII, tal como se describe más abajo.

Cualquier construcción de factor VIII híbrido que tiene sustitución de aminoácidos específicos, tal como la descrita, puede ser analizada mediante procedimientos estándar para la actividad coagulante y para la reactividad con anticuerpos inhibidores para el factor VIII, para la identificación de moléculas de factor VIII híbrido con actividad coagulante aumentada y/o inmunorreactividad a anticuerpos disminuida. Puede identificarse también que las moléculas híbridas han reducido la actividad coagulante en comparación con el factor VIII humano o porcino, pero también ha disminuido la reactividad a los anticuerpos. Alguien experto en la materia reconocerá que las moléculas de factor VIII, o fragmentos de las mismas, que tienen menos, igual o mayor actividad coagulante, comparadas con el factor VIII humano o porcino, son útiles para el tratamiento de pacientes que tienen deficiencia de factor VIII. Los métodos aquí descritos para preparar factor VIII recombinante híbrido humano/porcino activo, con sustitución de aminoácidos específicos, pueden ser utilizados para preparar proteína de factor VIII activo recombinante híbrido humana/no humana, mamífero no porcino, factor VIII híbrido animal-1/animal-2, y factor VIII híbrido equivalente, y fragmentos del mismo.

Moléculas de factor VIII híbrido con actividad coagulante alterada

La presente invención proporciona moléculas de factor VIII recombinante procoagulante híbrido humano/animal, animal/animal, o equivalente, o fragmentos de las mismas, que comprenden al menos una secuencia específica que incluye uno o más aminoácidos únicos con actividad procoagulante en el factor VIII de una de las especies, que sustituye a la correspondiente secuencia de aminoácidos del factor VIII de la otra especie, usando técnicas establecidas de mutagénesis dirigida a un sitio, tal como las descritas aquí. Se seleccionan las secuencias específicas a utilizar en la sustitución, y se preparan las construcciones híbridas, y analizan para ver la actividad coagulante, tal como se indica a continuación. Existe un factor VIII híbrido humano/porcino, que comprende sustituciones en el dominio A2, que se proporciona específicamente como una forma de realización preferida y ejemplar. Se entiende que alguien experto en la materia, puede utilizar estos métodos para preparar otras moléculas de factor VIII híbrido humano/animal, animal/animal, o equivalente, o fragmentos de las mismas, que tienen actividad coagulante alterada, preferiblemente actividad coagulante incrementada en comparación con el factor VIII humano.

La base para la mayor actividad coagulante en el factor VIII porcino parece ser la disociación espontánea de la subunidad A2 del factor VIIIa humano, más rápida que la del factor VIIIa porcino, lo que conlleva la pérdida de actividad, de acuerdo con Lollar, P., and C.G. Parker, 265 J. Biol. Chem. 1688-1692 (1990); Lollar, P., et al. 267 J. Biol. Chem. 23652-23657 (1992); Fay, P.J., and T.M. Smudzin, 267, J. Biol. Chem. 13246-13250 (1992).

Se muestra en la Figura 1C una comparación de la alineación de las secuencias de aminoácidos de los dominios A2 de los factores VIII humano y porcino (la numeración de residuos comienza en la posición 373 con respecto a la longitud total de la secuencia del factor VIII humano, ID SEC NO: 2). Para la preparación de una molécula de factor VIII híbrido humano/porcino con actividad coagulante alterada, se muestran en la Tabla I los candidatos objetivo iniciales para la mutagénesis, que se revelaron durante la comparación de las secuencias de aminoácidos del A2 humano y porcino (ID SEC NOs: 2 y 6, respectivamente), con el dominio A2 humano.

TABLA I Secuencia de aminoácidos humanos, candidatos objetivo para la mutagenésis (ID SEC NO: 2)

Secuencia	Residuos	Desajustes	Carga de cambios
398-403	6	4	1
434-444	10	4	3
484-496	13	7	3
598-603	6	4	2
536-541	6	4	0
713-722	10	6	2
727-737	11	6	2

La Tabla I y las letras en negrita de las figuras 1A-1B, ilustran siete secuencias en las secuencias de aminoácidos del dominio A2 de humano y de cerdo (ID SEC NOs: 2 y 6, respectivamente), que constituyen solo el 17% del dominio A2, pero incluyen el 70% de las diferencias entre las secuencias de los dominios A2 humano y porcino.

Se describe una construcción recombinante híbrida humano/porcina, en la que los aminoácidos Ser373-Glu604 en el dominio A2 (Ser373-Arg740) del factor VIII humano han sido reemplazados con la secuencia porcina homóloga. Esa construcción no reacciona con los inhibidores de A2 y tiene la misma actividad coagulante que el factor VIII B(-) humano. Se describe una molécula híbrida derivada del plasma que comprende una sustitución completa de dominio A2 porcino en el factor VIII humano, que ha incrementado la actividad coagulante en comparación con el factor VIII humano. La comparación de estas construcciones indica que una región entre los residuos Asp605 y Arg740, es la responsable de la diferencia en actividad entre el factor VIII humano y el porcino. Esta región puede definirse más específicamente creando sistemáticamente moléculas de factor VIII recombinante híbrido humano/porcino con sustituciones porcinas en la región entre Asp605 y Arg740, usando técnicas establecidas de mutagénesis dirigida a un sitio, por ejemplo, el método empalme por extensión de solapa (SOE) que ha sido extensamente utilizado para crear moléculas de factor VIII híbrido que contengan sustituciones porcinas en la región terminal-NH_{2} del A2. Esas moléculas pueden expresarse en células COS-7 y en células de riñón de crías de hámster, tal como se describió antes. Pueden ser purificadas hasta la homogeneidad usando procedimientos conocidos en el arte, como son la cromatografía en heparin-Sefarosa^{TM} y la cromatografía de inmunoafinidad. La concentración de proteína puede ser estimada mediante absorción de la luz ultravioleta a A_{280}m y la actividad específica de las construcciones puede ser determinada dividiendo la actividad coagulante (medida en unidades por ml, mediante un ensayo de coagulación de una etapa) por A_{280}. El factor VIII humano tiene una actividad específica de aproximadamente 3.000-4.000 U/A_{280}, mientras que el factor VIII porcino tiene una actividad específica de aproximadamente 20.000 U/A_{280}. En una forma de realización preferida, el factor VIII procoagulante recombinante híbrido humano/porcino tiene una actividad específica de 20.000 U/A_{280} y contiene una cantidad mínima de sustitución porcina en el dominio A2.

Tal como se describe aquí, las técnicas de mutagénesis dirigidas a un sitio se utilizan para identificar proteína híbrida con actividad coagulante que puede ser aumentada, igualada a, o reducida, en comparación con el factor VIII humano, pero que preferiblemente es aumentada. En la forma de realización híbrida porcino/humano, las secuencias específicas humanas son reemplazadas con secuencias porcinas, utilizando preferiblemente el método de empalme por extensión de solapa (SOE), tal como se describe en Ho, S.N., et al., 77 Gene 51-59 (1994), y en los Ejemplos 7 y 8. También puede utilizarse la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, tal como se hizo para enlazar la secuencia de aminoácidos con parte del dominio A2 humano (ver Ejemplo 7). Como el análisis funcional de los híbridos revela actividad coagulante, la secuencia puede ser incluso diseccionada y mapeada para dar una secuencia procoagulante, mediante técnicas de análisis de mutación del punto estándar.

La presente invención contempla que el ADNc y la proteína del factor VIII híbrido puedan ser caracterizados mediante procedimientos que están establecidos y son rutina, como es el secuenciado de ADN; los ensayos de actividad coagulante; masa del factor VIII híbrido purificado, mediante ELISA y mediante absorbancia UV a 280 nm; actividad coagulante específica (U/mg); SDS-PAGE del factor VIII híbrido purificado; y similares. Pueden requerirse otros métodos conocidos de pruebas para medir la efectividad clínica, como son los análisis de aminoácidos, carbohidratos, sulfatos, o iones metálicos.

Un factor VIII recombinante híbrido que tiene actividad coagulante superior, comparado con el factor VIII humano, puede ser menos caro de crear que el factor VIII derivado de plasma, y puede disminuir la cantidad de factor VIII requerido para el tratamiento eficaz de la deficiencia de factor VIII.

Moléculas de factor VIII híbrido con inmunorreactividad reducida

Los epítopos que son inmunorreactivos con los anticuerpos que inhiben la actividad coagulante del factor VIII ("inhibidores" o "anticuerpos inhibidores") han sido caracterizados basándose en relaciones estructura-función conocidas en el factor VIII. Presumiblemente, los inhibidores podrían actuar mediante la interrupción de cualquiera de las interacciones macromoleculares asociadas con la estructura de dominios del factor VIII, o de sus asociaciones con el factor de von Willebrand, con la trombina, el factor Xa, el factor IXa, o el factor X. Sin embargo, más del 90% de los anticuerpos inhibidores del factor VIII humano, actúan uniéndose a los epítopos localizados en los dominios A2 de 40 kDa o C2 de 20 kDa del factor VIII, interrumpiendo funciones específicas asociadas con esos dominios, tal como describen Fulcher et al., 82 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7728-7732 (1985), y Scandella et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6152-6156 (1988). Adicionalmente a los epítopos de A2 y C2, puede haber un tercer epítopo en los dominios A3 o C1 de la cadena ligera del factor VIII, de acuerdo con Scandella et al., 82 Blood 1767-1775 (1993). La significancia de este tercer epítopo putativo es desconocida, pero parece contar en una fracción menor de la reactividad de epítopos en el factor VIII.

Los anticuerpos Anti-A2 bloquean la activación del factor X, tal como se muestra en Lollar et al., J. Clin. Invest. 2497-2504 (1994). Estudios previos de mapeado por mutagénesis de supresión, descritos por Ware et al., 3 Blood Coagul. Fibrinolysis 703-716 (1992), localizaban el epítopo de A2 dentro de una región de 20 kDa del final NH_{2} terminal del dominio A2 de 40 kDa. Los ensayos de competición inmunoradiométrica han indicado que los inhibidores de A2 reconocen tanto un epítopo común como epítopos meticulosamente agrupados, tal como describen Scandella et al., 67 Thromb. Haemostas. 665-671 (1992), y tal como se demuestra en el Ejemplo 8.

La presente invención proporciona moléculas de factor VIII activo recombinante híbrido e híbrido equivalente, y fragmentos de las mismas, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican a esos híbridos, los métodos de preparación y aislamiento de los híbridos, y métodos para caracterizarlos. Estos híbridos comprenden moléculas de factor VIII humano/animal, animal/animal, o híbrido equivalente, además comprenden al menos una secuencia de aminoácidos específicos, incluyendo uno o más aminoácidos únicos del factor VIII de una de las especies que sustituyen a la correspondiente secuencia de aminoácidos del factor VIII de la otra especie; o comprenden al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que tienen identidad de secuencia no conocida para el factor VIII, que sustituye secuencias de aminoácidos específicos en factor VIII humano, animal o híbrido. En comparación con el factor VIII humano o porcino, el factor VIII híbrido resultante ha reducido, o no tiene, inmunorreactividad para los anticuerpos inhibidores del factor VIII.

Utilizando la aproximación descrita en la sección previa con respecto a la sustitución de aminoácidos en la molécula de factor VIII, se emplea el análisis mutacional para seleccionar la correspondiente secuencia de aminoácidos de una especie, preferiblemente porcina, que sirve para sustituir al menos una secuencia que incluya uno o más aminoácidos en el factor VIII de otra especie, preferiblemente humana, o para sustituir una secuencia de aminoácidos de una molécula de factor VIII equivalente híbrido, que incluye una o más regiones críticas en los dominios A2, C2, o cualquier otro dominio, hacia los que se dirigen los anticuerpos inhibidores. Los métodos son descritos en detalle más abajo. La construcción híbrida recombinante procoagulante resultante ha reducido, o no tiene, inmunorreactividad a los anticuerpos inhibidores, en comparación con el factor VIII humano, usando ensayos estándar. A través de la sustitución sistemática de las cada vez más pequeñas secuencias de aminoácidos, seguido de ensayos de inmunorreactividad con la construcción híbrida, tal como se describe abajo, se mapea el epítopo en cualquier dominio del factor VIII, se sustituye por secuencias de aminoácidos que tienen menos, o no tienen, inmunorreactividad, y se prepara un factor VIII híbrido.

Se entiende que alguien experto en la materia puede usar esta aproximación, combinando mapeado de epítopos, construcción de moléculas de factor VIII híbrido, y análisis mutacional de las construcciones, para identificar y reemplazar al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que comprenden un epítopo en los dominios A2, C2, y/u otros dominios hacia los cuales se dirigen los anticuerpos inhibidores; y para construir factor VIII recombinante procoagulante híbrido humano/animal, animal/animal, o equivalente, y los fragmentos del mismo, habiendo disminuido, o no existiendo, la inmunorreactividad en comparación con el factor VIII humano o porcino. Esta aproximación es usada, tal como se describe en el Ejemplo 8, para preparar como forma de realización ejemplar, un factor VIII recombinante procoagulante híbrido humano/porcino que tiene sustituciones de aminoácidos porcinos en el dominio A2 humano, y no teniendo antigenicidad hacia los anticuerpos anti-factor VIII.

Normalmente, el factor VIII porcino tiene reacción limitada, o no la tiene, con los anticuerpos inhibidores del factor VIII humano. Las moléculas de factor VIII recombinante híbrido humano/porcino que han disminuido su reactividad, o no existe la misma, hacia los anticuerpos inhibidores, basado en la sustitución de aminoácidos en el dominio A2, son preparadas, como un ejemplo de cómo el factor VIII híbrido puede prepararse usando el factor VIII de otras especies y sustituciones en otros dominios distintos que A2, tal como sigue. Se clona el dominio A2 porcino mediante técnicas de clonación estándar, similares a las descritas más arriba en los Ejemplos 6, 7, y 8, y entonces se cortan y empalman con el dominio A2 utilizando procedimientos de rutina, como son el usar sitios de restricción para cortar el ADNc, o para empalmarlo mediante extensión de la solapa (SOE). La secuencia de aminoácidos porcinos resultante se usa para sustituir dentro del dominio A2 humano, para formar una construcción de factor VIII híbrido, que está inserta en un pequeño vector de expresión mamífero, preferiblemente ReNeo, es transfectada establemente en células cultivadas, preferiblemente células de riñón de cría de hámster, y expresada, tal como se describe más arriba. El factor VIII híbrido se usa en ensayo de inmunorreactividad, por ejemplo con anticuerpos anti-A2, mediante el ensayo Bethesda de rutina o mediante ensayo de sustrato cromogénico libre de plasma. La unidad Bethesda (UB) es el método estándar de medición de títulos inhibidores. Si el título Bethesda no es medible (< 0,7 UB/mg IgG) en el híbrido, entonces se eliminaba un epítopo A2 humano en la región de la correspondiente secuencia porcina sustitutiva. El epítopo es estrechado progresivamente, y el epítopo A2 específico puede por tanto se determinado para producir una molécula híbrida humana/porcina con tan poca secuencia porcina como sea posible. Tal como se describe aquí, se ha identificado y sustituido en el dominio A2 humano, una secuencia de 25 residuos correspondiente a los aminoácidos Arg484-Ile508, que es crítica para la inmunorreactividad inhibidora. Dentro de esta secuencia hay solo nueve diferencias entre el factor VIII humano y el porcino. Esta región puede ser posteriormente analizada y sustituida.

También pueden prepararse las moléculas de factor VIII híbrido humano/porcino que han disminuido, o no tienen, la reactividad con los anticuerpos inhibidores, basadas en la sustitución de secuencias de aminoácidos en los dominios C1, C2, u otros dominios, con o sin sustitución en el dominio A2. El epítopo C2, por ejemplo, puede ser mapeado usando la aproximación homóloga de exploración combinada con mutagénesis dirigida al sitio. Mas específicamente, los procedimientos pueden ser los mismos o similares a los descritos aquí para la sustitución de aminoácidos en el dominio A2, incluyendo la clonación del C2 porcino u otros dominios, usando por ejemplo TI-PCR o mediante el sondeo de una genoteca de ADNc de hígado porcino con C2 humano u otro ADN de dominio; las técnicas de sitio de restricción y/o SOE sucesivos para mapear y reemplazar simultáneamente los epítopos en el C2 o en otros dominios; la sustitución por el C2 humano u otro dominio en factor VIII B(-); la inserción en un vector de expresión, como el pBluescript; la expresión en células cultivadas; y el ensayo de rutina para comprobar la inmunorreactividad. Para los ensayos, puede llevarse a cabo la reactividad del factor VIII híbrido C2 con un inhibidor específico del C2, MR (Scandella, D., et al., Thromb. Haemostasis 67: 665-671 (1992) y Lubin et al. (1994)), y/o con otros anticuerpos específicos para C2, preparados mediante cromatografía de afinidad.

El dominio C2 está constituido por los residuos de aminoácidos 2173-2332 (ID SEC NO: 2). Dentro de esta región de 154 aminoácidos, la actividad inhibidora parece estar dirigida hacia una región de 65 aminoácidos ubicada entre los residuos 2248 y 2312, de acuerdo con Shima, M., et al., 69 Thromb. Haemostas. 240-246 (1993). Si las secuencias C2 del factor VIII humano y del porcino son idénticas aproximadamente en el 85% en esta región, como así sucede en otra parte, en las regiones funcionalmente activas del factor VIII, habría aproximadamente diez diferencias entre las secuencias de aminoácidos del C2 del factor VIII humano y porcino, que se pueden usar como objetivos iniciales para construir híbridos con la secuencia C2 sustitutiva.

Es probable que de un modo clínicamente significativo, los epítopos del factor VIII estén confinados a los dominios A2 y C2. Sin embargo, si se identifican los anticuerpos para otras regiones (los dominios A1, A3, B, o C1) del factor VIII, los epítopos pueden ser mapeados y eliminados utilizando la aproximación descrita aquí para las moléculas de factor VIII híbrido humano/porcino no antigénico.

Más específicamente, puede conseguirse también el mapeado del segundo epítopo putativo de cadena ligera y/o cualquier otro epítopo en cualquier otro dominio de factor VIII humano o animal. Inicialmente, la determinación de la presencia de un tercer epítopo inhibidor en los dominios A3 o C1, puede realizarse del siguiente modo. Usando secuencias de aminoácidos de factor VIII humano ("H") y porcino ("P") como un modelo, se construirán los híbridos sin dominio B A1_{P}-A2_{P}-A3_{P}-C1_{H}-C2_{P} y A1_{P}-A2_{P}-A3_{H}-C1_{P}-C2_{P}. El IgG inhibidor del plasma de aproximadamente 20 pacientes (de la doctora Dorothea Scandella, Cruz Roja Americana) que tienen pocos títulos, o indetectables, contra el factor VIII porcino, se probará contra los híbridos. Si el tercer epítopo está en el dominio A3, se espera que el IgG inhibidor reaccione con A1_{P}-A2_{P}-A3_{H}-C1_{P}-C2_{P} pero no con A1_{P}-A2_{P}-A3_{P}-C1_{H}-C2_{P}. En cambio, si el tercer epítopo está en el dominio C1, entonces se espera que el IgG inhibidor reaccione con A1_{P}-A2_{P}-A3_{P}-C1_{H}-C2_{P} pero no con A1_{P}-A2_{P}-A3_{H}-C1_{P}-C2_{P}. Si un tercer epítopo es identificado, este será caracterizado por los procedimientos descritos aquí para los epítopos A2 y C2.

Por ejemplo, los anticuerpos específicos para el epítopo del dominio A3 o del C1, pueden ser aislado a partir del IgG total del paciente mediante cromatografía de afinidad, usando los híbridos A1_{P}-A2_{P}-A3_{H}-C1_{P}-C2_{P} y A1_{P}-A2_{P}-A3_{P}-C1_{H}-C2_{P}, y por eliminación de los anticuerpos específicos de C2 haciendo pasar el factor VIII recombinante por C2-Sefarosa^{TM}. El tercer epítopo putativo será identificado mediante construcciones SOE en las que, en una forma preferida de realización, porciones de los dominios A3 o C1 del factor VIII humano son sistemáticamente reemplazados con secuencia porcina.

Moléculas de factor VIII híbrido con inmunogenidad reducida

Una molécula es inmunogénica cuando puede inducir la producción de anticuerpos en humanos o animales. La presente invención proporciona una molécula de factor VIII recombinante procoagulante híbrido humano/animal o animal/animal, molécula equivalente de factor VIII híbrido, o fragmento de las mismas, que es menos inmunogénica que el factor VIII "silvestre" humano o porcino, en humano o animal, que comprende al menos una secuencia específica de aminoácidos, incluyendo uno o más aminoácidos específicos del factor VIII de una de las especies, que sustituye a la correspondiente secuencia de aminoácidos que tiene la actividad inmunogénica del factor VIII de la otra especie; o al menos una secuencia de aminoácidos que incluye uno o más aminoácidos con identidad no conocida para el factor VIII, que sustituye a una secuencia de aminoácidos del factor humano, animal o híbrido. Este híbrido puede ser utilizado para reducir la incidencia del desarrollo del inhibidor en un humano o animal, y para tratar la deficiencia de factor VIII, y sería preferido en el tratamiento de pacientes con hemofilia sin tratar previamente. En una forma preferida de realización, el factor VIII híbrido comprende una secuencia de aminoácidos del factor VIII humano, e incluso comprende uno o más residuos de alanina que sustituyen a una secuencia de aminoácidos humana con actividad inmunogénica, dando lugar a una molécula recombinante procoagulante híbrida equivalente, o fragmento de la misma, que tiene inmunogenidad reducida, o no tiene inmunogenidad, en humano o animal.

El proceso descrito aquí, referente a mapeo y análisis mutacional de epítopos, combinado con sustitución de la secuencia de aminoácidos no antigénica en una molécula de factor VIII, usando factor VIII híbrido humano/porcino, produce moléculas híbridas con baja. Usando este modelo y los procedimientos asociados, cualquiera de las construcciones descritas aquí pueden ser alteradas mediante técnicas de mutagénesis dirigidas a sitios, para remover tantos epítopos funcionales como sea posible para minimizar la capacidad del sistema inmune para reconocer al factor VIII híbrido, y de ese modo disminuir su inmunogenidad.

Un procedimiento que puede ser utilizado para reducir aún más la antigenicidad y para construir un factor VIII híbrido menos inmunogénico, es la mutagénesis por escaneo de alanina, de secuencias específicas seleccionadas en factor VIII equivalente híbrido, humano o animal, descrita por Cunningham, B.C., and J.A. Wells, 244 Science 1081-1085 (1989). En la mutagénesis por escaneo de alanina, las cadenas laterales de los aminoácidos que están envueltas putativamente en un epítopo, son reemplazadas por residuos de alanina mediante mutagénesis dirigida al sitio. Mediante comparación de la unión de anticuerpos de los mutantes de alanina a la proteína "silvestre", puede determinarse la contribución relativa de las cadenas laterales individuales a la interacción de unión. Las sustituciones de alanina son, probablemente, especialmente útiles, puesto que las contribuciones de la cadena lateral a la unión de anticuerpos, son eliminadas tras el carbono \beta, pero, a diferencia de la sustitución de glicina, normalmente no se altera la conformación de la cadena principal. La sustitución de alanina no impone mayores efectos estéricos, hidrofóbicos o electrostáticos que los que dominan las interacciones proteína-proteína.

En las interacciones de proteínas antígeno-anticuerpo, hay normalmente entre 15-20 cadenas laterales de antígenos en contacto con el anticuerpo. Las interacciones de cadena lateral, al contrario que las interacciones de cadena principal, dominan las interacciones de proteína-proteína. Recientes estudios han sugerido que solo unos pocos (aproximadamente entre 3 y 5) de esas interacciones de cadena lateral, contribuyen a la mayoría de le energía de enlace. Ver Clackson, T., and J.A. Wells, 267 Science 383-386 (1995). Un análisis extensivo del crecimiento de epítopos de hormona para varios anticuerpos monoclonales de roedor, revelaron la siguiente jerarquía para las contribuciones de la cadena lateral a la energía de enlace: Arg > Pro > Glu - Asp - Phe - Ile, con Trp, Ala, Gly y Cys no sometidos a prueba (Jin, L., et al., 226 J. Mol. Biol. 851-865 (1992). Los resultados con el epítopo A2 descritos aquí son consistentes con esto, puesto que 12 de los 25 residuos en el segmentos de A2 484-508, contenían estas tres cadenas laterales (Tabla 1).

El descubrir que ciertos residuos de aminoácidos son particularmente bien reconocidos por los anticuerpos, indica que la eliminación de esos residuos del epítopo conocido puede disminuir la habilidad del sistema inmune para reconocer a esos epítopos, es decir, puede hacer menos inmunogénica a una molécula. En el caso del epítopo A2, los residuos inmunogénicos pueden ser reemplazados sin pérdida de la actividad coagulante del factor VIII. Por ejemplo, en HP9, la Arg484 es reemplazada por Ser, la Pro485 es reemplazada por Ala, la Arg489 es reemplazada por Gly, la Pro492 es reemplazada por Leu, y la Phe501 es reemplazada por Met. Es más, los resultados de los plasmas de los pacientes usados para probar la inumunorreactividad en construcciones de factor VIII humano/porcino, descritas en el Ejemplo 8, indican que los anticuerpos de distintos pacientes, reconocen la misma región estructural, o muy similar, en el dominio A2, y que los residuos en el dominio A2 que participan en la unión a los inhibidores de A2, parecen mostrar poca variación. De esta manera, el epítopo A2 incluido en los residuos 484-508 del factor VIII humano, es un epítopo inmunodominante pues el sistema inmune humano lo reconoce mejor que a otras regiones estructurales del factor VIII. Reemplazando esta estructura por secuencia del factor VIII no antigénica de otras especies, o por secuencia de aminoácidos foráneos, a la par que se retiene toda la capacidad procoagulante, se espera alterar el reconocimiento del factor VIII híbrido, o del híbrido equivalente, por parte del sistema inmune.

Se espera que la mutagénesis dirigida al sitio para reemplazar residuos voluminosos y/o cargados, que tienden a dominar los epítopos con cadenas laterales pequeñas, neutrales (p.e. la alanina), pueda producir una región menos inmunogénica. Se espera que una molécula que contenga algunas de estas sustituciones en cada epítopo inhibidor significante, hará más difícil al sistema inmune el poder encajarla mediante el mecanismo de llave-cerradura típico de las interacciones antígeno-anticuerpo. Debido a su baja antigenicidad, una molécula híbrida como esta podría ser útil en el tratamiento de los pacientes con deficiencia del factor VIII con inhibidores, y debido a su baja inmunogenidad, podría ser útil en el tratamiento de pacientes con hemofilia A sin tratamiento previo.

Un resultado general es que la mutación de uno de unos pocos residuos clave, es suficiente para disminuir la constante de enlace para una interacción dada de proteína-proteína, en varios órdenes de magnitud. Por tanto, parece probable que todos los epítopos de factor VIII contienen un número limitado de aminoácidos que son críticos para el desarrollo del inhibidor. Para cada epítopo del factor VIII, las sustituciones con alanina de al menos una secuencia que incluya uno o más aminoácidos específicos que tienen actividad inmunogénica, pueden producir una molécula activa que es menos inmunogénica que el factor VIII "silvestre". En una forma preferida de realización, el factor VIII no tiene dominio B.

Los procedimientos para preparar factor VIII activo recombinante híbrido, o equivalente híbrido, con secuencia de aminoácidos que tienen poca, o no tienen, actividad inmunogénica, que sustituye la secuencia de aminoácidos en el actor VIII que tiene actividad inmunogénica, son los siguientes, usando factor VIII híbrido humano/porcino con sustituciones de aminoácidos en el dominio A2 como forma de realización ejemplar. Hay 25 residuos en la región 484-508 del factor VIII humano. La mutagénesis dirigida a sitio puede usarse para crear mutantes simples en los cuales cualquiera de esos residuos es reemplazado por cualquiera de los otros 19 aminoácidos, para un total de 475 mutantes. Es más, pueden construirse las moléculas híbridas que tienen más de una mutación.

Las construcciones híbridas pueden ser probadas para medir la antigenicidad mediante la medición del enlace constante a través de anticuerpos inhibidores, tal como describe Friguet, B., et al., 77 J. Immunol. Methods 305-319 (1985). En una forma preferida de realización, el enlace constante será reducido por al menos tres órdenes de magnitud, lo que podría bajar el título de Bethesda hasta un nivel que es clínicamente insignificante. Por ejemplo, el IC_{50} (una medida rudimentaria del enlace constante) de la inhibición por parte de anticuerpos A2 se redujo en las construcciones de factor VIII humano/porcino HP2, HP4, HP5, HP7 y HP9, descritas en el Ejemplo 8, y esto se asoció con una reducción en el título de Bethesda hasta un nivel no mensurable. Se espera, por ejemplo, que un mutante de doble o triple alanina del factor VIII humano (es decir, un factor VIII humano Arg484->Ala, Arg489->Ala, Phe501->Ala, triple mutante) producirá una molécula con antigenicidad suficientemente baja como para usarla terapéuticamente. Pueden realizarse mutaciones similares en el epítopo C2 y en el tercer epítopo putativo. Una forma de realización preferida comprende dos o tras sustituciones de alanina en dos o tres epítopos de factor VIII. También pueden hacerse otras sustituciones en esas regiones.

En una forma de realización preferida, se reconocerá que las moléculas de factor VIII equivalente híbrido son menos antigénicas y/o inmunogénicas en factor VIII humano y animal, que cualquier factor VIII humano o porcino. Estas construcciones híbridas equivalentes pueden someterse a prueba en animales, para comprobar su antigenicidad y/o inmunogenicidad reducidas. Por ejemplo, conejos control y conejos deficientes en factor VIII, cerdos, perros, ratones, primates, y otros mamíferos, pueden usarse como modelos animales. En un protocolo experimental, el factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, puede ser suministrado sistemáticamente al animal durante un periodo de seis meses a un año, preferiblemente mediante infusión intravenosa, y en un intervalo de dosis entre 5 y 50 unidades/kg de peso corporal, preferiblemente de 10-50 unidades/kg de peso corporal, y más preferiblemente 40 unidades/kg de peso corporal. Los anticuerpos pueden medirse, en muestras de plasma tomadas a intervalos tras las infusiones, durante toda la duración del periodo de pruebas mediante métodos de rutina, incluyendo el inmunoensayo y el ensayo Bethesda. La actividad coagulante puede medirse también en muestras, con procedimientos de rutina, incluyendo un ensayo de coagulación de una fase.

Las moléculas de factor VIII equivalente híbrido pueden ser probadas en humano, por su reducida antigenicidad y/o inmunogenicidad, en al menos dos tipos distintos de ensayos clínicos. En uno de los tipos de prueba, diseñada para determinar si el factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, es inmunorreactivo con los anticuerpos inhibidores, se administra el factor VIII híbrido o híbrido equivalente, preferiblemente de manera intravenosa, a aproximadamente 25 pacientes que tienen deficiencia del factor VIII, los cuales tienen anticuerpos contra el factor VIII, que inhiben la actividad coagulante y terapéutica del factor VIII humano o porcino. La dosis del factor VIII híbrido o equivalente híbrido está en un intervalo entre 5 y 50 unidades/kg de peso corporal, preferiblemente 10-50 unidades/kg, y más preferiblemente 40 unidades/kg de peso corporal. Aproximadamente 1 hora después de aplicar cada administración, se mide, en un ensayo de coagulación de una fase, la recuperación de factor VIII mediante muestras de sangre. Las muestras se toman de nuevo aproximadamente 5 horas después de la infusión, y se mide la recuperación. La recuperación total y la tasa de desaparición del factor VIII a partir de las muestras, hace prever la actividad inhibidora y el título del anticuerpo. Los resultados de la recuperación se comparan con la recuperación de los resultados de la recuperación en pacientes tratados con factor VIII humano derivado del plasma, factor VIII humano recombinante, factor VIII porcino, y otras formas terapéuticas comúnmente usadas, de factor VIII o de sustitutos de factor VIII.

En un segundo tipo de análisis clínico, diseñado para determinar si el factor VIII híbrido o híbrido equivalente es inmunogénico, es decir, si los pacientes desarrollaran anticuerpos inhibidores, se administra factor VIII híbrido o híbrido equivalente, tal como se describe en el párrafo anterior, a aproximadamente 100 pacientes hemofílicos sin tratar previamente, que no han desarrollado anticuerpos para el factor VIII. Los tratamientos se dan aproximadamente cada 2 semanas, durante un período de 6 meses a 1 año. A intervalos de 1 a 3 meses durante este período, se toman muestras de sangre, y se realizan ensayos de Bethesda o ensayos de anticuerpos, para determinar la presencia de anticuerpos inhibidores. También se pueden hacer los ensayos de recuperación, tal como se describe más arriba, tras cada infusión. Los resultados se comparan con los pacientes hemofílicos que han recibido factor VIII derivado de plasma, factor VIII recombinante humano, factor VIII porcino, u otras formas terapéuticas comúnmente utilizadas de factor VIII o sustitutos de factor VIII.

Preparación de moléculas de factor VIII híbrido utilizando secuencia de aminoácidos de factor VIII mamífero humano, y ni humano ni porcino

Los métodos utilizados para preparar factor VIII híbrido humano/porcino con sustitución de aminoácidos específicos, pueden ser usados para preparar proteína de factor VIII recombinante híbrido humano/mamífero ni humano, ni porcino, o animal/animal, que tiene, comparada con el factor VIII humano o porcino, la actividad coagulante alterada o igual, y/o igual o reducida inmunorreactividad y/o inmunogenicidad, basado en la sustitución de uno o más aminoácidos en los dominios A2, C2, y/u otros dominios.

Pueden realizarse comparaciones similares de identidad de secuencia de aminoácidos, entre proteínas de factor VIII humano, y las proteínas de factor VIII mamífero ni humano, ni animal, para determinar las secuencias de aminoácidos en las que radica la actividad procoagulante, la inmunorreactividad anti-A2 y anti-C2, y o la inmunogenicidad, o inmunorreactividad y/o inmunogenicidad en otros dominios. Pueden usarse entonces procedimientos similares para preparar moléculas de factor VIII híbrido humano/mamífero ni humano ni animal. Tal como se describe más arriba, el análisis funcional de cada híbrido revelará aquellos con reactividad reducida hacia anticuerpos inhibidores, y/o inmunogenicidad reducida, y/o actividad coagulante incrementada, y la secuencia puede ser incluso diseccionada mediante análisis de mutación en punto.

Por ejemplo, las moléculas de factor VIII híbrido humano/ratón pueden prepararse tal como se describen arriba. Se muestra en la Figura 1C la alineación de secuencia de aminoácidos del dominio A2 de humano (ID SEC NO: 2) y de ratón (ID SEC NO: 6). Tal como informa Elder et al., la proteína de factor VIII codificada por el ADNc de ratón (ID SEC NO: 5) tiene 2319 aminoácidos, con el 74% de la identidad de secuencia en conjunto con la secuencia humana (SEC ID NO: 2) (el 87% de identidad, cuando el dominio B es excluido de la comparación), is es 32 aminoácidos más corta que el factor VIII humano. Las secuencias de aminoácidos en los dominios A y C de ratón (ID SEC NO: 6) están altamente conservadas, con el 84-93% de la identidad de secuencia para la secuencia humana (ID SEC NO: 2), mientras que el dominio B y los dos cortos dominios ácidos tienen el 42-70% de la identidad de secuencia. Específicamente, las secuencias de aminoácidos de A1, A2, y A3 de ratón (ID SEC NO: 6) son idénticas en un 85%, 85% y 90% a las secuencias de aminoácidos humanas correspondientes (SEC ID NO: 2). Las secuencias de aminoácidos C1 y C2 de ratón son idénticas en un 93% y 84% a las secuencias de aminoácidos humanas correspondientes. En la secuencia esperada de aminoácidos de factor VIII de ratón (ID SEC NO: 6), los dominios A1, A2, y A3 son homólogos a los aminoácidos 1-372, 373-740, y 1690-2032, respectivamente, de factor VIII humano, usando la secuencia de aminoácidos en numerosos propósitos.

Se conserva en el factor VIII de ratón, el factor Xa/trombina, y todos los sitios de rotura de la proteína C activada, excepto uno. También se conserva el residuo de tirosina para el factor de unión de von Willebrand.

De acuerdo con Elder et al., la secuencia de nucleótidos (ID SEC NO: 5) del factor VIII de ratón, contiene 7519 pares de bases, y tiene el 67% de identidad de secuencia en conjunto con la secuencia de nucleótidos humana (ID SEC NO: 1). Los 6957 pares de bases de la secuencia codificante de roedor tienen el 82% de identidad de secuencia con los 7053 pares de bases de la secuencia codificante en factor VIII humano. Cuando no se incluye el dominio B en la comparación, hay un 88% de identidad de secuencia de nucleótidos.

Elder et al. informan que las moléculas de factor VIII de humano y de ratón son un 74% idénticas en conjunto, y que el 95% de los residuos humanos que llevan a la hemofilia cuando son alterados, son idénticos en el ratón. Estos datos apoyan la aplicación sobre el factor VIII de ratón u otros animales, de las mismas técnicas usadas para identificar secuencias de aminoácidos con actividad coagulante y/o inmunorreactividad a anticuerpos en la molécula de factor VIII porcino, para identificar secuencias similares de aminoácidos, y para preparar moléculas híbridas.

Preparación de moléculas de factor VIII híbrido que tienen reactividad cruzada reducida, usando secuencia de aminoácidos de factor VIII humano y mamífero ni humano, ni porcino, y secuencia de aminoácidos antifactor VIII

El factor VIII porcino es usado clínicamente para tratar a pacientes con deficiencia de factor VIII que tienen anticuerpos inhibidores del factor VIII humano. La reactividad cruzada, en la que el plasma humano reacciona con el factor VIII porcino, puede reducirse mediante la preparación de factor VIII híbrido porcino/mamífero ni humano, ni porcino, o equivalente híbrido. En una forma de realización preferida, se hace una determinación de si inhibidores específicos del A2, el C2, u otros dominios humanos, reaccionan con factor VIII mamífero ni humano, ni porcino ("otros mamífero"), usando el ensayo Bethesda de rutina y el plasma particular de otros mamíferos como estándar. Los títulos inhibidores son normalmente medidos en plasma, así que la purificación del factor VIII de otros mamíferos no es necesaria. Si los inhibidores no reaccionan con el factor VIII de otro mamífero, como es el factor VIII de ratón, cuya secuencia es conocida, entonces la correspondiente secuencia de otro mamífero puede ser sustituir dentro de la región epítopo porcina, tal como se identificó al usar híbridos humano/porcinos. Una vez que la secuencia animal es conocida, pueden usarse las técnicas de mutagénesis dirigidas al sitio, como la mutagénesis mediada por oligonucleótidos descrita por Kunkel, T.A., et al., 204 Meth. Enzymol. 125-139 (1991), para preparar la molécula de factor VIII híbrido porcino/animal. Si otros plasmas animales son menos reactivos al A2, C2 u otros inhibidores de factor VIII, que el factor VIII de roedor o porcino, la secuencia animal correspondiente al epítopo porcino puede ser determinada mediante procedimientos de rutina, como el TI-PCR, y un factor VIII híbrido humano/animal o porcino/animal, construido por mutagénesis dirigida al sitio. También puede prepararse factor VIII híbrido humano/animal o porcino/mamífero no porcino, que tenga reducida la reactividad cruzada con el plasma humano en comparación con el factor VIII porcino, y que tenga la correspondiente sustitución de secuencia de aminoácidos de uno o más animales. En una forma de realización más avanzada, se puede reducir la reactividad cruzada mediante sustitución de la secuencia de aminoácidos que tenga secuencia de aminoácidos con identidad desconocida para el factor VIII, preferiblemente residuos de alanina, para la secuencia epítopo porcina, utilizando técnicas de mutagénesis de escaneo de alanina.

Tras la identificación de los epítopos clínicamente significativos, las moléculas de factor VIII híbrido, expresarán que tienen menos, o la misma, reactividad cruzada que el factor VIII porcino, cuando se realizan pruebas in vitro contra un amplio examen de plasmas inhibidores. Preferiblemente, esas moléculas serán combinadas con híbridos A2/C2 en los que la secuencia inmunorreactiva de aminoácidos de esos dominios, es reemplazada por otra secuencia de mamífero. Puede realizarse mutagénesis adicional en esas regiones, para reducir la reactividad cruzada. La reactividad cruzada, aunque deseable, no es necesaria para producir un producto que puede tener ventajas sobre el concentrado de factor VIII porcino existente, el cual produce efectos secundarios debido a las proteínas porcinas contaminantes, y puede producir efectos secundarios adversos debido a la inmunogenicidad de las secuencias de factor VIII porcinas. Una molécula de factor VIII híbrido humano/otro mamífero o porcino/otro mamífero, no contendrá proteínas porcinas extrañas. Adicionalmente, el mapeado extensivo de epítopos llevado a cabo en el dominio A2 porcino, indica que más del 95% de la secuencia terapéutica de factor VIII híbrido humano/porcino será humana.

Preparación de equivalentes de factor VIII híbrido

Los procedimientos para la sustitución de aminoácidos en moléculas de factor VIII descritas arriba, y en los ejemplos, pueden ser usados también para preparar moléculas equivalentes de factor VIII híbrido procoagulante recombinante, o fragmentos de las mismas, que comprendan al menos una secuencia de aminoácidos que incluya uno o más aminoácidos, teniendo una secuencia de aminoácidos de identidad no conocida para el factor VIII ("secuencia antifactor VIII") que sustituya al menos una secuencia específica de aminoácidos que incluye un sitio inmunogénico y/o antigénico en factor VIII humano, animal o híbrido. La molécula equivalente de factor VIII activo híbrido resultante tienen igual o menor reactividad con los anticuerpos inhibidores de factor VIII, y/o menos inmunogenicidad en humanos y animales, que el factor VIII humano, animal o híbrido sin sustituir.

Los residuos de aminoácidos apropiados que pueden sustituir esas secuencias de aminoácidos críticas para la actividad coagulante y/o antigénica y/o inmunogénica en el factor VIII humano o animal, o en el factor VIII híbrido humano/animal, para preparar una molécula de factor VIII híbrido equivalente, incluyen cualquier aminoácido que tenga secuencia de identidad desconocida para la secuencia de aminoácidos de factor VIII humano o animal que tiene actividad coagulante, antigénica, o inmunogénica. En una forma preferida de realización, los aminoácidos que pueden sustituir son residuos de alanina que utilizan técnicas de mutagénesis de escaneo de alanina.

Las moléculas equivalentes de factor VIII híbrido descritas aquí, también incluyen a aquellas moléculas en las que los residuos de aminoácidos sin identidad conocida para la secuencia de factor VIII animal, sustituyen los residuos de aminoácidos no críticos para la actividad coagulante, antigénica o inmunogénica.

Tal como se describe arriba, en una forma de realización de una molécula equivalente de factor VIII híbrido, la molécula tiene reactividad cruzada con plasmas inhibidores. Se identifican uno o más epítopos en el factor VIII reactivo en la reactividad cruzada, tal como se describe arriba, y entonces se reemplazan por secuencia de aminoácidos foráneos al factor VIII, preferiblemente residuos de alanina, usando, por ejemplo, el método de mutagénesis por escaneo de alanina.

En una forma preferida de realización, se prepara una molécula equivalente de factor VIII híbrido recombinante procoagulante, que comprende al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que tienen identidad desconocida para el factor VIII, preferiblemente residuos de alanina, que sustituyen al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que incluyen un epítopo, y/o al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que incluyen un sitio inmunogénico, preferiblemente en factor VIII humano. La molécula de factor VIII híbrido equivalente resultante, o fragmento de la misma, tiene inmunorreactividad reducida hacia los anticuerpos inhibidores del factor VIII, o carece de ella, y/o tiene inmunogenicidad reducida en animales o humanos, o carece de ella. Los métodos para identificar una secuencia de aminoácidos específica antigénica en el dominio A2 del factor VIII humano, para la sustitución por una secuencia de aminoácidos únicos porcina no antigénica, se describen en los Ejemplos 7 y 8, y son ejemplares para la identificación de una secuencia antigénica en el dominio A2 y en otros dominios del factor VIII humano y animal, y para el uso de métodos de mutagénesis dirigidos al sitio, tal como es la mutagénesis de escaneo de alanina, para sustituir una secuencia de aminoácidos antifactor VIII.

Puesto que el epítopo A2 humano ha sido limitado a 25 o menos aminoácidos, tal como se describe en el Ejemplo 8, la mutagénesis por escaneo de alanina puede realizarse en un número limitado de construcciones de factor VIII híbrido que tienen secuencia de aminoácidos humanos, para determinar cuáles son construcciones de factor VIII híbrido procoagulante, no inmunorreactivo y/o no inmunogénico basados en sustituciones de aminoácidos de A2. En el dominio A2, los candidatos más probables para las sustituciones de alanina, para conseguir tanto antigenicidad reducida como inmunogenicidad reducida en la construcción híbrida, son Arg484, Pro485, Tyr487, Ser488, Arg489, Pro492, Val495, Phe501, e Ile508. Se determinará por ELISA la afinidad en el enlace de una construcción híbrida, que comprende cada uno de esos mutantes, por mAb413 y un panel de A2 específicos de IgGs de pacientes. Cualquier mutante que esté activo y tenga una afinidad en el enlace por los inhibidores de A2 que esté reducida en más de 2 órdenes de magnitud, es un candidato para la molécula de factor VIII con A2 sustituida. Las construcciones que tienen mas de una mutación, serán seleccionadas, basándose en el supuesto de que cuanto más alterado sea el epítopo, menos inmunogénico será el mismo. Es posible que haya otros residuos candidatos en la región entre Arg484-Ile508, puesto que puede haber residuos clave para el epítopo, que son comunes tanto para factor VIII humano como para factor VIII porcino. Por ejemplo, los residuos cargados están envueltos frecuentemente en las interacciones proteína-proteína, así que la sustitución de alanina para el Lys493 es un candidato posible.

Este procedimiento se llevará a cabo en el epítopo C2 y en el tercer epítopo putativo, que se cree que está en los dominios A3 o C1, además de en cualquier otro epítopo identificado en el factor VIII, para preparar construcciones de factor VIII híbrido equivalente.

Ensayos diagnósticos

Puede usarse en ensayos el ADNc del factor VIII híbrido humano/animal, animal/animal, o equivalente, y/o la proteína expresada a partir del mismo, totalmente o en parte, como reagentes para la detección de anticuerpos inhibidores para el factor VIII humano o animal, o para el factor VIII híbrido humano/animal, o para el equivalente, en sustratos que incluyen, por ejemplo, muestras de suero y fluidos corporales de pacientes humanos con deficiencia de factor VIII. Esos análisis de anticuerpos incluyen ensayos como el ELISA, inmunoblots, radioinmunoensayos, ensayos de inmunodifusión, y análisis de la actividad biológica del factor VIII (es decir, mediante ensayo de coagulación). Las técnicas para preparar esos reagentes, y los procedimientos para su uso, son conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, un inmunoensayo para la detección de anticuerpos inhibidores en una muestra de suero de paciente, puede incluir la reacción de la muestra de prueba con una cantidad suficiente del factor VIII híbrido humano/animal que contiene al menos un sitio antigénico, en donde la cantidad es suficiente para formar con los anticuerpos inhibidores, un complejo detectable en la muestra.

Las sondas de ácidos nucleicos y de aminoácidos pueden prepararse basándose en la secuencia del ADNc, de la molécula de proteína, o de fragmentos de los mismos, del factor VIII híbrido humano/porcino, humano/mamífero ni porcino, ni humano, animal/animal, o equivalente. En algunas formas de realización, estas pueden ser etiquetadas usando etiquetas teñidas o enzimáticas, fluorescentes, quimioluminiscentes, o radioactivas, que están disponibles comercialmente. Las sondas de aminoácidos pueden ser usadas, por ejemplo, para revisar suero u otros fluidos corporales donde se sospecha la presencia de inhibidores del factor VIII humano, animal, o híbrido humano/animal. Se pueden cuantificar los niveles de los inhibidores en pacientes, y se pueden comparar con controles sanos, y pueden usarse, por ejemplo, para determinar si un paciente con una deficiencia de factor VIII, puede ser tratado con un factor VIII híbrido humano/animal, o con un híbrido equivalente. El ADNc de las sondas puede utilizarse, por ejemplo, para propósitos de investigación en la revisión de genotecas de ADN.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas que contienen factor VIII híbrido humano/animal, porcino/mamífero ni humano, ni porcino, animal-1/animal-2, o equivalente, solas o en combinación con compuestos estabilizadores, vehículos de entrega, y/o vehículos transportadores, son preparadas de acuerdo con métodos conocidos, tal como se describe en Remintong's Pharmaceutical Sciences by E.W. Martin.

En una forma preferida de realización, los transportadores o vehículos de entrega preferidos para la infusión intravenosa son suero salino fisiológico o suero salino tamponado.

En otra forma de realización preferida, los compuestos apropiados de estabilización, los vehículos de entrega, y los vehículos transportadores, incluyen, aunque no quedan limitados a, otras proteínas humanas y animales como la albúmina.

También se prefieren como transportadores farmacéuticamente aceptables, o como vehículos de entrega, a las vesículas de fosfolípidos, o las suspensiones liposomiales. Estas pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la materia, y pueden contener, por ejemplo, fosfatidilserina/fosfatidilcolina, u otras composiciones de fosfolípidos o detergentes que juntos, transmiten una carga negativa a la superficie, puesto que el factor VIII se une a membranas de fosfolípidos cargadas negativamente. Los liposomas pueden prepararse disolviendo lípidos apropiados (como la estearoil fosfatidil etanolamina, la estearoil fosfatidil colina, la aracadoil fosfatidil colina, y el colesterol) en un solvente inorgánico que es posteriormente evaporado, dejando detrás una fina capa de lípidos secos sobre la superficie del recipiente. El recipiente es entonces arremolinado a mano para quitar el material lipídico de las paredes del recipiente, y para dispersar los agregados lípidos, formando de este modo la suspensión liposomal.

El factor híbrido, o el factor VIII híbrido equivalente, pueden combinarse con otros compuestos estabilizadores, vehículos de entrega, y/o vehículos transportadores apropiados, incluyendo los factores de coagulación dependientes de vitamina K, factores de tejido, y el factor de von Willebrand (vWf), o un fragmento de vWf que contiene el sitio de unión del factor VIII, y polisacáridos como la sacarosa.

El factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, puede ser entregado también por terapia génica, de la misma manera en que puede entregarse el factor VIII humano, usando medios de entrega como son los vectores retrovirales. Este método consiste en la incorporación del ADNc de factor VIII en células humanas que son transplantadas directamente en un paciente con factor VIII deficiente; o que son situadas en un dispositivo implantable, permeable a las moléculas de factor VIII, pero impermeable a las células, que es posteriormente transplantado. El método preferido será el de la transferencia génica mediada por retrovirus. En este método, un gen exógeno (por ejemplo, un ADNc de factor VIII) es clonado en el genoma de un retrovirus modificado. El gen es insertado en el genoma de la célula huésped, mediante maquinaria viral, y allí será expresado por la célula. El vector retroviral está modificado de tal modo que no producirá virus, previniendo la infección viral del huésped. Los principios generales para este tipo de terapia, son conocidos por aquellos expertos en la materia, y han sido revisados en la literatura (por ejemplo, Kohn, D.B., and P.W. Kantoff, 29 Transfusion 812-820, 1989).

El factor VIII híbrido puede ser almacenarse unido a vWf para incrementar la vida media y la duración de la molécula híbrida. Adicionalmente, la liofilización del factor VIII puede aumentar la producción de moléculas activas en presencia de vWf. Pueden emplearse métodos corrientes para el almacenamiento de factor VIII humano y animal, usados por proveedores comerciales, para almacenar el factor VIII híbrido. Esos métodos incluyen: (1) liofilización del factor VIII en un estado parcialmente purificado (como un factor VIII "concentrado" que es infundido sin purificación posterior); (2) purificación del factor VIII por inmunoafinidad, mediante el método Zimmerman, y liofilización en presencia de albúmina, que estabiliza al factor VIII; (3) liofilización del factor VIII recombinante en presencia de albúmina.

Adicionalmente, el factor VIII híbrido ha sido indefinidamente estable a 4ºC, en NaCl 0,6 M, MES 20 mM, y CaCl_{2} 5 mM, a pH 6.0, y también puede almacenarse congelado en estos tampones, y descongelarse con pérdida mínima de actividad.

Métodos de tratamiento

El factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, se usa para tratar hemorragia descontrolada debida a deficiencia del factor VIII (p.e. hemorragia gastrointestinal, intra articular, intracraneal) en hemofílicos con y sin anticuerpos inhibidores, y en pacientes con deficiencia de factor VIII, adquirida debido al desarrollo de anticuerpos inhibidores. Los materiales activos son preferiblemente administrados intravenosamente.

Adicionalmente, el factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, puede ser administrado por transplante de células sometidas a ingeniería genética, para producir el híbrido; o mediante la implantación de un dispositivo que contiene dichas células, tal como se describe arriba.

En una forma preferida de realización, las composiciones farmacéuticas del factor VIII híbrido, o equivalente híbrido, solas o en combinación con estabilizadores, vehículos de entrega, y/o transportadores, son infundidas en los pacientes por vía intravenosa, de acuerdo con el mismo procedimiento que se usa para la infusión de factor VIII humano o animal.

Las dosis de tratamiento de la composición con factor VIII híbrido, o equivalente híbrido, que deben ser administradas al paciente que necesita este tratamiento, variarán dependiendo de la gravedad de la deficiencia del factor VIII. Generalmente, el nivel de dosis se ajusta con la frecuencia, duración, y unidades, de acuerdo con la gravedad y duración de cada episodio hemorrágico del paciente. Por consiguiente, el factor VIII híbrido se incluye en el transportador, vehículo de entrega, o estabilizador, farmacéuticamente aceptables, en una cantidad suficiente para liberar en un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del híbrido, para detener la hemorragia, tal como se ha medido mediante ensayos estándar de coagulación.

El factor VIII es definido clásicamente como aquella sustancia presente en plasma sanguíneo normal, que corrige los defectos de coagulación en plasma derivado de individuos con hemofilia A. La actividad coagulante in vitro de las formas purificada y parcialmente purificada del factor VIII, se usa para calcular la dosis de factor VIII para las infusiones en pacientes humanos, y es un indicador fiable de la actividad recuperada del plasma del paciente, y de la corrección del defecto de la hemorragia in vivo. No hay discrepancias reportadas entre los ensayos estándar de moléculas nuevas de factor VIII in vitro, y su comportamiento en el modelo de infusión en perro, o en pacientes humanos, de acuerdo con Lusher, J.M., et al., 328 New Engl. J. Med. 453-459 (1993); Pittman, D.D., et al., 79 Blood 389-397 (1992); y Brinkhous et al., 82 Proc. Natl. Acad. Sci. 8752-8755 (1985).

Normalmente, el nivel de factor VIII que se desea alcanzar en plasma, en el paciente, mediante la administración del factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, se encuentra en el intervalo de 30-100% de normal. En un modo de administración preferido del factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, la composición se da intravenosamente, a una dosis que se encuentra en el rango de entre 5 y 50 unidades/kg de peso corporal, más preferiblemente en el intervalo de 10-50 unidades/kg de peso corporal, y del modo más preferible a una dosis de 20-40 unidades/kg de peso corporal; el intervalo de frecuencia se encuentra en el intervalo de entre 8 y 24 horas (en hemofílicos gravemente afectados); y la duración del tratamiento en días, se encuentra en el intervalo entre 1 y 10 días, o hasta que se resuelva el episodio hemorrágico. Ver, por ejemplo, Roberts, H.R., and M.R. Jones, "Hemophilia and Related Conditions - Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V, and Factors VII to XII)", Ch. 153, 1453-1474, 1460, in Hematology, Williams, W.J., et al., ed. (1990). Los pacientes con inhibidores pueden necesitar más factor VIII híbrido, o equivalente híbrido, o los pacientes pueden requerir menos factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, debido a su mayor actividad específica que la del factor VIII humano, o reactividad a anticuerpos, o inmunogenicidad reducidas. Como en el tratamiento con factor VIII humano o porcino, la cantidad de factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, infundido, se define por el ensayo de coagulación del factor VIII de una fase y, en casos especiales, la recuperación in vivo es determinada midiendo el factor VIII en el plasma del paciente tras la infusión. Se entiende que para cualquier sujeto particular, los regímenes específicos de dosis deberían ajustarse durante el tiempo, de acuerdo con las necesidades del individuo y con el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración establecidos de aquí en adelante, son ejemplares solamente, y no se intenta limitar el alcance o práctica de la composición reivindicada.

El tratamiento puede tomar la forma de una administración intravenosa simple de la composición, o de una administración periódica o continua durante un período de tiempo extendido, según se requiera. Alternativamente, el factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, puede ser administrado subcutáneamente u oralmente con liposomas, en una o varias dosis, a distintos intervalos de tiempo.

El factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, puede usarse también para tratar la hemorragia incontrolada debida a deficiencia de factor VIII en hemofílicos que han desarrollado anticuerpos para el factor VIII humano. En este caso, no es necesario que la actividad coagulante sea superior a la del factor VIII humano o animal solo. La actividad coagulante que es inferior a la del factor VIII humano (es decir, menos de 3.000 unidades/mg), será útil si la actividad no es neutralizada por los anticuerpos en el plasma del paciente.

La molécula de factor VIII híbrido, o híbrido equivalente, y los métodos de aislamiento, caracterización, realización, y uso de, descritos arriba de modo general, serán mejor entendidos con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Ensayo de factor VIII porcino y factor VIII híbrido humano/porcino

El factor VIII porcino tiene más actividad coagulante que el factor VIII humano, basado en la actividad específica de la molécula. Estos resultados se muestran en la Tabla III en el Ejemplo 4. Esta conclusión se basa en el uso de curvas estándar apropiadas, que permiten comparar de manera justa los factores VIII humano y porcino. Los ensayos de coagulación se basan en la capacidad del factor VIII para acortar el tiempo de coagulación del plasma derivado de un paciente con hemofilia A. Se emplearon dos tipos de ensayos: el de una fase y el de dos fases.

En el ensayo de una fase, se incubaron 0,1 ml de plasma con hemofilia A (George King Biomedical Inc.) con 0,1 ml de reagente de tromboplastina parcial activada (APTT) (Organon Teknika), y con 0,01 ml de muestra o estándar constituida por plasma humano citrado normal, durante 5 minutos a 37ºC en un baño de agua. La incubación fue seguida por la adición de 0,1 ml de CaCl_{2} 20 mM, y se determinó el tiempo de desarrollo para un coágulo de fibrina, mediante inspección visual.

Una unidad de factor VIII se define como la cantidad presente en 1 ml de plasma humano citrado normal. Con el plasma humano como estándar, se comparó directamente la actividad de los factores VIII humano y porcino. Las diluciones del estándar de plasma, o de las proteínas purificadas, se hicieron en NaCl 0,15 M, HEPES 0,02 M, pH 7.4. La curva estándar fue construida basándose en 3 o 4 diluciones de plasma, siendo la dilución más alta de 1/50, y en el log_{10} del tiempo de coagulación trazado contra el log_{10} de la concentración en plasma, lo que da lugar a una gráfica lineal. Se determinaron las unidades del factor VIII en una muestra desconocida, mediante interpolación a partir de la curva estándar.

El ensayo de una fase depende de la activación endógena del factor VIII por parte de los activadores formados en el plasma con hemofilia A, mientras que el ensayo de dos fases mide la actividad procoagulante del factor VIII preactivado. En el ensayo de dos fases, las muestras que contienen factor VIII que ha reaccionado con trombina, fueron añadidas a una mezcla de la tromboplastina parcial activada y de plasma humano con hemofilia A que había sido preincubado durante 5 minutos a 37ºC. Los tiempos de coagulación resultantes fueron convertidos a unidades/ml, basado en la misma curva estándar humana descrita arriba. La actividad relativa en el ensayo de dos fases fue mayor que en el ensayo de una fase, debido a que el factor VIII había sido preactivado.

Ejemplo 2 Caracterización de la diferencia funcional entre factor VIII humano y porcino

El aislamiento de factor VIII derivado de plasma porcino y humano, y de factor VIII recombinante humano, había sido descrito en la literatura en Fulcher, C.A., and T.S. Zimmerman, 79 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1648-1652 (1982); Toole, J.J., et al., 312 Nature 342-347 (1984) (Genetics Institute); Gitschier, J., et al., 312 Nature 326-330 (1984) (Genentech); Wood, W.I., et al., 312 Nature 330-337 (1984) (Genentech); Vehar, G.A., et al., 312 Nature 337-342 (1984) (Genentech); Fass, D.N., et al., 59 Blood 594 (1982); Toole, J.J., et al., 83 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 5939-5942 (1986). Esto se puede conseguir de distintos modos. Todas esas preparaciones son similares en composición de subunidades, aunque hay una diferencia funcional en estabilidad entre el factor VIII humano y porcino.

Para la comparación entre el factor VIII recombinante humano y el factor VIII porcino, las preparaciones de factor VIII recombinante humano (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) y factor VIII porcino (inmunopurificado tal como se describe en Fass, D.N., et al., 59 Blood 594 (1982)) altamente purificadas, fueron sometidas a cromatografía líquida de alta presión (HPLC) sobre una columna de intercambio aniónico (Pharmacia, Inc.) Mono Q^{TM} (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ). Los propósitos del paso Mono Q^{TM} HPLC fueron la eliminación de impurezas menores del intercambio de factor VIII humano y porcino en un tampón común para propósitos comparativos. Se reconstituyeron los viales que contenían 1.000-2.000 unidades de factor VIII, con 5 ml de H_{2}O. Después se añadió HEPES (2 M a pH 7.4) a una concentración final de 0,02 M. Se aplicó el factor VIII a una columna Mono Q^{TM} HR 5/5 equilibrada en NaCl 0,15 M, HEPES 0,02 M, CaCl_{2} 5 mM, a pH 7.4 (Tampón A mas NaCl 0,15 M); se lavó con 10 ml de tampón A + NaCl 0,15 M; y se eluyó con gradiente lineal de 20 ml, con NaCl de 0,15 M a 0,90 M, en tampón A, con una tasa de flujo de 1 ml/min.

Para la comparación de factor VIII derivado de plasma humano (purificado mediante Mono Q^{TM} HPLC) con el factor VIII porcino, purificado por inmunoafinidad, se diluyó el factor VIII derivado de plasma porcino, en proporción 1:4, con HEPES 0,04 M, CaCl_{2} 5 mM, Tween-80 0,01%, a pH 7.4, y se sometió a Mono Q^{TM} HPLC bajo las mismas condiciones descritas en el párrafo previo para el factor VIII humano. Estos procedimientos para el aislamiento del factor VIII humano y porcino, son estándar para aquellos expertos en la materia.

Las fracciones de columna fueron analizadas para la actividad del factor VIII, mediante un ensayo de coagulación de una fase. Los resultados medios de los ensayos, expresados en unidades de actividad por A_{280} de material, son mostrados en la Tabla II, e indican que el factor VIII porcino tiene al menos seis veces más actividad que el factor VIII humano, cuando se usa el ensayo de una fase.

TABLA II Comparación de la actividad coagulante de factor VIII humano y porcino

	Actividad (U/A_{280})
Porcino	21.300
Derivado de plasma humano	3.600
Recombinante humano	2.400

Ejemplo 3 Comparación de la estabilidad del factor VIII humano y porcino

Los resultados del ensayo de una fase para el factor VIII, reflejan la activación del factor VIII a factor VIIIa en la muestra, y la posible pérdida de actividad del factor VIIIa formado. Se realizó una comparación directa de la estabilidad de factor VIII humano y porcino. Las muestras de Mono Q^{TM} HPLC (Pharmacia Inc., Piscataway, N.J.) fueron diluidas hasta alcanzar la misma concentración y composición del tampón, y se hicieron reaccionar con trombina. A distintos tiempos, las muestras se extrajeron para realizar el ensayo de coagulación de dos fases. Típicamente, el pico de actividad (a los 2 minutos) fue 10 veces mayor para el factor VIIIa porcino que pare el humano, y las actividades tanto del factor VIIIa porcino como del humano, disminuyeron posteriormente, con la actividad del factor VIIIa humano disminuyendo más rápidamente.

Generalmente, los intentos de aislar factor VIIIa humano estable no tienen éxito, incluso cuando se usan condiciones que producen factor VIIIa porcino estable. Para demostrar esto, se activó con trombina, el factor VIII humano purificado con Mono Q^{TM} HPLC, y se sometió a intercambio catiónico con Mono S^{TM} (Pharmacia, Inc.) HPLC bajo condiciones que produce factor VIIIa porcino estable, tal como describe Lollar, J.S., and C.G. Parker, 28 Biochemistry 666 (1989).

Se hizo reaccionar factor VIII humano, 43 \mug/ml (0,2 mM) en NaCl 0,2 M, HEPES 0,01 M, CaCl_{2} 2,5 mM, a pH 7.4, en 10 ml de volumen total, con trombina (0,036 \muM) durante 10 minutos, tiempo tras el cual se añadió FPR-CH_{2}Cl D-fenil-prolil-arginil-clorometil-cetona a una concentración de 0,2 \muM para inactivación irreversible de la trombina. Después se diluyó la mezcla en 1:1 con ácido 2-(N-morfolino) etano sulfónico (MES) 40 mM, CaCl_{2} 5 mM, a pH 6.0, y se cargó a 2 ml/min en una columna Mono S^{TM} HR 5/5 HPLC (Pharmacia, Inc.) equilibrada con MES 5 mM, CaCl_{2} 5 mM, a pH 6.0 (Tampón B), mas NaCl 0,1 M. El factor VIIIa fue eluído sin lavar la columna, con un gradiente de 20 ml, de NaCl 0,1 M a NaCl 0,9 M, en tampón B, a 1 ml/min.

La fracción con actividad coagulante en el ensayo de dos fases, eluyó como un único pico bajo esas condiciones. La actividad específica de la fracción pico fue de aproximadamente 7.500 U/A_{280}. La electroforesis en gel de dodecil sulfato-poliacrilamida sódica (SDS-PAGE) del pico de factor VIIIa proveniente del Mono S^{TM}, seguida de tinción de plata de la proteína, revelaron dos bandas correspondientes al derivado heterodimérico (A3-C1-C2/A1) del factor VIII. Aunque el fragmento A2 no se identificó mediante la tinción de plata bajo estas condiciones, debido a su baja concentración, si se identificó como un componente traza, mediante etiquetado con ^{125}I.

En contraste con los resultados con el factor VIII humano, el factor VIIIa porcino aislado mediante Mono S^{TM} HPLC bajo las mismas condiciones, tuvo una actividad específica de 1,6 x 10^{6} U/A_{280}. El análisis del factor VIIIa porcino mediante SDS-PAGE reveló 3 fragmentos correspondientes a las subunidades A1, A2, y A3-C1-C2, demostrando que el factor VIIIa porcino tiene tres subunidades.

Los resultados del Mono S^{TM} HPLC de las preparaciones de factor VIII humano activado por trombina, a pH 6.0, indican que el factor VIIIa humano es voluble bajo condiciones que producen factor VIIIa porcino estable. Sin embargo, aunque se identificaron en la fracción pico las cantidades traza del fragmento A2, la determinación de si la actividad coagulante proviene de pequeñas cantidades de factor VIIIa heterotrimérico o de factor VIIIa heterodimérico que tiene una baja actividad específica, no fue posible usando este método solo.

Es deseable encontrar un modo de aislar el factor VIIIa humano antes de que pierda su subunidad A2, para resolver esta cuestión. Para este fin, el aislamiento se consiguió en un procedimiento que implica reducción del pH de los tampones del Mono S^{TM} hasta pH 5. El factor VIII purificado en Mono Q^{TM} (0,5 mg) se diluyó con H_{2}O para dar una composición final de factor VIII 0,25 mg/ml (1 \mum) en NaCl 0,25 M, HEPES 0,01 M, CaCl_{2} 2,5 mM, Tween-80 0,005%, a pH 7.4 (volumen total 7,0 ml). La trombina se añadió a una concentración final de 0,072 mm, y se permitió reaccionar durante 3 minutos. Fue inactivada después con FPR-CH_{2}Cl (0,2 \mum). La mezcla fue diluida entonces a 1:1 con acetato sódico 40 mM, CaCl_{2} 5 mM, Tween-80 0,01%, a pH 5.0, y se cargó a 2 ml/min en una columna Mono S^{TM} HR 5/5 HPLC equilibrada con acetato sódico 0,01 M, CaCl_{2} 5 mM, Tewwn-80 0,01%, a pH 5.0, mas NaCl 0,1 M. Se eluyó el factor VIIIa, sin lavado de columna, con un gradiente de 20 ml, de NaCl 0,1 M a NaCl 1,0 M, en el mismo tampón, a 1 ml/min. Esto dio lugar a la recuperación de la actividad coagulante en un pico que contenía cantidades detectables del fragmento A2, demostrables mediante SDS-PAGE y tinción de plata. La actividad específica de la fracción pico fue diez veces mayor que la recuperada a pH 6.0 (75.000 U/A_{280} vs. 7.500 U/A_{280}). Sin embargo, en contraste con el factor VIIIa porcino aislado a pH 6.0, que es indefinidamente estable a 4ºC, la actividad del factor VIIIa humano disminuyó a ritmo constante durante un período de tiempo de varias horas, tras la elución del Mono S^{TM}. Adicionalmente, la actividad específica del factor VIIIa purificado a pH 5.0 y analizado inmediatamente, es solamente el 5% del factor VIIIa porcino, indicando que una disociación considerable ocurrió antes del ensayo.

Estos resultados demuestran que tanto el factor VIIIa humano como el porcino, están compuestos de tres subunidades (A1, A2, y A3-C1-C2). La disociación de la subunidad A2 es la responsable de la pérdida de actividad, tanto del factor VIIIa como del porcino, bajo unas condiciones determinadas, como son fuerza iónica, pH y concentración fisiológica. La estabilidad relativa del factor VIIIa porcino bajo ciertas condiciones, se debe a la mayor asociación de la subunidad A2.

Ejemplo 4 Preparación del factor VIII híbrido humano/porcino mediante reconstitución con subunidades

Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas del factor VIII porcino fueron aisladas del siguiente modo. Se añadió una solución de EDTA 0,5 M, a pH 7.4, al factor VIII porcino purificado con Mono Q^{TM}, hasta una concentración final de 0,05 M, y se permitió reposar a temperatura ambiente durante 18-24 horas. Se añadió un volumen igual de histidina-C1 10 mM, EDTA 10 mM, Tween-80 0,2% v/v, a pH 6.0 (tampón B), y la solución se aplicó, a 1 ml/min, a una columna Mono S^{TM} HR 5/5 previamente equilibrada con tampón A más NaCl 0,25 M. Las cadenas pesadas del factor VIII no se unieron a las resinas, tal como juzga SDS-PAGE. La cadena ligera del factor VIII fue eluída con un gradiente lineal, de 20 ml, de NaCl 0,1-0,7 M, en tampón A, a 1 ml/min, y se homogeneizó mediante SDS-PAGE. Las cadenas pesadas de factor VIII fueron aisladas mediante Mono Q^{TM} HPLC (Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.) del siguiente modo. Las cadenas pesadas del factor VIII no se adsorben al Mono S^{TM} durante la purificación de las cadenas ligeras del factor VIII. El material de caída que contenía las cadenas pesadas del factor VIII se ajustó a pH 7.2 mediante el añadido de tampón HEPES 0,5 M, pH 7.4, y se aplicó a la columna mono Q^{TM} HR 5/5 HPLC (Pharmacia, Inc.), equilibrada con NaCl 0,1 M, HEPES 0,02 M, Tween-80 0,01%, pH 7.4. La columna fue lavada con 10 ml de este tampón, y las cadenas pesadas del factor VIII fueron eluídas con gradiente, de 20 ml, de NaCl 0,1 M a 1,0 M, en este tampón. Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas se aislaron del mismo modo.

Las cadenas ligeras y pesadas de humano y porcino fueron reconstituidas de acuerdo con los siguientes pasos. Diez \mul de cadena ligera de factor VIII humano o porcino, 100 \mug/ml, se mezclaron en NaCl 1 M, HEPES 0,02 M, CaCl_{2} 5 mM, Tween-80 0,01%, pH 7.4, con (1) 25 \mul de cadena pesada heteróloga, 60 \mug/ml, en el mismo tampón; (2) 10 \mul de HEPES 0,02 M, Tween-80 0,01%, pH 7.4; (3) 5 \mul CaCl_{2} 0,6 M, durante 14 horas a temperatura ambiente. La mezcla fue diluida a ¼ con MES 0,02 M, Tween-80 0,01%, CaCl_{2} 5 mM, pH6, y se aplicó a una Mono S^{TM} Hr 5/5 equilibrada con NaCl 0,1 M, MES 0,02 M, Tween-80 0,01%, CaCl_{2} 5 mM, pH 6.0. Se dejó correr un gradiente de 20 ml, de NaCl 0,1 M a 1,0 M, en el mismo tampón, a 1 ml/min, y se recogieron fracciones de 0,5 ml. Se leyó la absorbancia de las fracciones, a 280 nm, y se analizaron las fracciones con absorbancia para medir la actividad del factor VIII, mediante el ensayo de coagulación de una fase. Las cadenas pesadas estaban presentes en exceso, porque las cadenas ligeras libres (no asociadas a cadenas pesadas) también se unen al Mono S^{TM}; el exceso de cadenas pesadas asegura que las cadenas ligeras libres no son parte de la preparación. Los experimentos de reconstitución seguidos de purificación mediante S^{TM} HPLC, se llevaron a cabo con las cuatro combinaciones posibles de cadenas: cadena ligera humana/cadena pesada humana, cadena ligera humana/cadena pesada porcina, cadena ligera porcina/cadena pesada porcina, cadena ligera porcina/cadena pesada humana. La Tabla III muestra que el factor VIII con cadena ligera humana/cadena pesada porcina tiene una actividad comparable al factor VIII porcino nativo (Tabla II), lo que indica que los elementos estructurales en la cadena pesada porcina, son los responsables de la actividad coagulante incrementada del factor VIII porcino cuando lo comparamos con el factor VIII humano.

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TABLA II Comparación de la actividad coagulante del factor VIII híbrido humano/porcino con factor VIII humano y porcino

	Actividad (U/A_{280})
Cadena ligera porcina/cadena pesada porcina	30.600
Cadena ligera humana/cadena pesada porcina	44.100
Cadena ligera porcina/cadena pesada humana	1.100
Cadena ligera humana/cadena pesada humana	1.000

Ejemplo 5 Preparación del factor VIII híbrido humano/porcino mediante reconstitución con dominios

El dímero porcino A1/A3-C1-C2, el dominio porcino A2, el dímero humano A1/A3-C1-C2, y el dominio humano A2, fueron aislados cada uno de la sangre porcina o humana, de acuerdo con el método descrito en Lollar, P., et al., 267(33) J. Biol. Chem. 23652-23657 (Nov. 25 1992). Por ejemplo, para aislar el dímero porcino A1/A3-C1-C2, se elevó el factor VIIIa a pH 6.0 (140 \mug), hasta pH 8.0, mediante la adición de NaOH 5 N durante 30 minutos, produciendo disociación del dominio A2, e inactivación del 95% mediante ensayo de coagulación. La mezcla fue diluida en 1:8 con tampón B (HEPES 20 mM, CaCl_{2} 5 mM, Tween-80 0,01%, pH 7.4) y se aplicó a una columna Mono S^{TM} equilibrada con tampón B. El dímero A1/A3-C1-C2 se eluyó como un único pico agudo a aproximadamente NaCl 0,4 M, usando el gradiente de NaCl 0,1-1,0 M en tampón B. Para aislar el dominio A2 porcino, se creó el factor VIIIa porcino de acuerdo con el método de Lollar, P., and C.G. Parker, 28 Biochem. 666-674 (1989), comenzando con 0,64 mg de factor VIII. Se aisló el dominio A2 porcino libre, como un componente menor (50 \mug), a NaCl 0,3 M en el cromatograma Mono S^{TM}.

Las moléculas de factor VIII híbrido humano/porcino se reconstituyeron a partir de dímeros y dominios del siguiente modo. Las concentraciones y condiciones tampón para los componentes purificados fueron las siguientes: A2 porcino, 0,63 \muM en tampón A (MES 5 mM, CaCl_{2} 5 mM; Tween-80 0,01%, pH 6.0) más NaCl 0,3 M; A1/A3-C1-C2 porcino, 0,27 \muM en tampón B más NaCl 0,4 M, pH 7.4; A2 humano, 1 \muM en NaCl 0,3 M, histidina-HCl 10 mM, CaCl_{2} 5 mM, Tween 20 0,01%, pH 6.0; A1/A3-C1-C2 humano, 0,18 \muM en NaCl 0,5 M, histidina-C1 10 mM, CaCl_{2} 2,5 mM, Tween-20 0,1%, pH 6.0. Los experimentos de reconstitución se realizaron mezclando volúmenes iguales de dominio A2 y dímero A1/A3-C1-C2. En los experimentos de mezclado con dímero porcino A1/A3-C1-C2, el pH fue bajado hasta 6.0 mediante adición de MES 0,5 M, pH 6.0, a 70 mM.

Las actividades de coagulación de todas las cuatro moléculas de factor VIII híbrido posibles -[pA2/(hA1/A3-C1-C2)], [hA2/(pA1/A3-C1-C2)], [pA2/(pA1/pA3-C1-C2)], y [hA2/(hA1/A3-C1-C2)]- se obtuvieron mediante un ensayo de coagulación de dos fases, en varios tiempos.

La generación de actividad tras la mezcla de los dominios A2 y los dímeros A1/A3-C1-C2 casi se completó tras una hora, y se estabilizó tras pasar al menos 24 horas a 37ºC. La Tabla IV muestra la actividad de las moléculas de factor VIIIa híbrido reconstituido cuando se analizaron tras 1 hora. El ensayo de dos fases, mediante el cual se obtuvieron las actividades específicas de las moléculas de factor VIIIa, difiere del ensayo de una fase, y los valores no pueden compararse con los valores de actividad de las moléculas de factor VIII obtenidos mediante un ensayo de una fase.

TABLA IV Comparación de las actividades coagulantes del factor VIIIa híbrido humano/porcino con dominios sustituidos

fVIIIa híbrido	Actividad específica (U/mg)
A2 porcino + A1/A3-C1-C2 humano	140.000
A2 porcino + A1/A3-C1-C2 porcino	70.000
A2 humano + A1/A3-C1-C2 porcino	40.000
A2 humano + A1/A3-C1-C2 humano	40.000

La Tabla IV muestra que la mayor actividad fue exhibida por el dominio A2 porcino/dímero A1/A3-C1-C2 humano, seguido por el dominio A2 porcino/dímero A1/A3-C1-C2 porcino.

De esta manera, se obtuvo actividad coagulante cuando el dominio A2 del factor VIIIa porcino se mezcló con el dímero A1/A3-C1-C2 del factor VIIIa humano. Es más, cuando el dominio A2 del factor VIIIa humano se mezcló con el dímero A1/A3-C1-C2 de factor VIIIa porcino, se obtuvo actividad coagulante. Las regiones A2, A1, y A3-C1-C2 no tienen actividad coagulante por si mismas.

Ejemplo 6 Aislamiento y secuenciado del dominio A2 de factor VIII porcino

Solamente se había secuenciado previamente la secuencia de nucleótidos codificante para el dominio B y parte del dominio A2 del factor VIII porcino (Toole, J.J., et al., 83 Proc. Nat'l, Acad. Sci. U.S.A. 5939-5942 (1986)). Se desvela aquí el ADNc y las secuencias de aminoácidos predichas (ID SEC NOs: 3 y 4, respectivamente) para el dominio A2 del factor VIII porcino entero.

El dominio A2 del factor VIII porcino se clonó mediante transcripción inversa de ARN total de bazo porcino, y mediante amplificación PCR; se usaron cebadores degenerados basados en la secuencia conocida de ADNc de factor VIII humano, y un cebador porcino exacto basado en una parte de la secuencia de factor VIII porcino. Se aisló un producto de PCR de 1 kb, y se amplificó mediante inserción en un vector fagémido Bluescript^{TM} (Stratagene).

El dominio A2 porcino fue completamente secuenciado mediante secuenciado dideoxi. Las secuencias de ADNc y aminoácidos predichos son los que se describen en las ID SEC NOs: 3 y 4, respectivamente.

Ejemplo 7 Preparación de factor VIII híbrido humano/animal recombinante

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos predichos (ID SEC NOs: 1 y 2, respectivamente) del factor VIII humano han sido descritas en la literatura (Toole, J.J., et al., 312 Nature 342-347 (1984) (Genetics Institute); Gitschier, J., et al., 312 Nature 326-330 (1984) (Genentech); Wood, W. I., et al., 312 330-337 (1984) (Genentech); Vehar, G.A., et al., 312 Nature 337-342 (1984) (Genentech)).

El crear un factor VIII híbrido humano/animal recombinante requiere que una región del ADNc del factor VIII humano (Biogen Corp.) sea eliminada, y que se inserte la secuencia de ADNc animal con identidad de secuencia. Posteriormente, el ADNc híbrido es expresado en un sistema de expresión apropiado. Como ejemplo, los ADNc de factor VIII híbrido se clonaron, en los cuales alguno o todos los dominios A2 porcinos sustituyeron las correspondientes secuencias A2 humanas. Inicialmente, la secuencia entera de ADNc correspondiente al dominio A2 del factor VIII humano, y después una parte más pequeña del dominio A2, fue extraída mediante mutagénesis de oligonucleótidos., un método conocido comúnmente por aquellos expertos en la materia (ver, p.e., Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Chapter 15, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1989). Los pasos fueron los siguientes.

Materiales

La metoxicarbonil-D-ciclohexilglicil-glicil-arginina-p-nitroanilida (Spectrozyme^{TM} Xa) y los anticuerpos monoclonales anti-factor VIII ESH4 y ESH8 fueron adquiridos de American Diagnostica (Greenwich, CT). Se prepararon vesículas unilamelares de fosfatidilcolina/fosfatidilserina (75/25, p/p), de acuerdo con el método de Barenholtz, Y. et al., 16 Biochemistry 2806-2810 (1997). La desulfatohirudina recombinante se obtuvo a partir del Dr. R.B. Wallis, Ciba-Geigy Pharmaceuticals (Cerritos, CA). Se aislaron los factores IXa, X, Xa, y trombina de acuerdo con los métodos de Lollar, P., et al., 63 Blood 1303-1306 (1984), y Duffy E.J., and P. Lollar, 207 J. Biol. Chem. 7621-7827 (1992). El factor VIII humano recombinante puro, libre de albúmina, se obtuvo a partir de Baxter-Biotech (Deerfield, IL).

Clonación del dominio A2 de factor VIII porcino

El ADNc codificante del dominio A2 porcino, se obtuvo siguiendo el PCR del ARNm de bazo porcino, aislado, inversamente transcrito, tal como se describe por Chomczyneki, P., and Sacohi, N., 162 Anal. Biocem. 156-159 (1987). El ADNc se preparó utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera hebra, con hexámeros aleatorios como cebadores (Pharmacia, Piscataway, N.J.). El PCR se llevó a cabo usando un cebador degenerado 5'-terminal, 5' AAR
CAYCCNAARACNTGGG 3' (ID SEC NO: 11), basado en la secuencia limitada de aminoácidos de A2 porcino; y usando un cebador exacto 3'-terminal, 5' GCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTC 3' (ID SEC NO: 12), basado en la secuencia conocida de ADN porcino, inmediatamente 3' del domino A2 porcino. Estos oligonucleótidos corresponden a los nucleótidos 1186-1203 y 2289-2313 en la secuencia humana (ID SEC NO: 1). La amplificación se llevó a cabo durante 35 ciclos (1 minuto 94ºC, 2 minutos 50ºC, 2 minutos 72ºC) usando la ADN polimerasa Taq (Promega Corp., Madison, WI). El fragmento amplificado de 1,1 kb se clonó en un pBluescript II-KS (Stratagene), en el sitio EcoRV, usando el procedimiento del vector T, tal como se describe en Murchuk, D., et al., 19 Nucl. Acids Res. 1154 (1991). Se transformaron las células Escherichia coli XL1-Blue-competentes, y se aisló el ADN plásmido. El secuenciado se llevó a cabo en ambas direcciones, usando Sequenase^{TM} versión 2.0 (U.S. Biochemical Corp., a Division of Amersham LifeSciencie, Inc., Arlington Hts, IL). Esta secuencia se confirmó mediante una secuencia idéntica que se obtuvo por secuenciado directo del producto de PCR, a partir de una transcripción inversa independiente del ARN de bazo del mismo cerdo (CircumBent^{TM}. New England Biolabs, Beverly, MA). Se identificó como 373-536 en el factor VIII humano, a la región que contiene el epítopo para el autoanticuerpo RC (ID SEC NO: 2).

Construcción y expresión de un ADNc de factor VIII híbrido humano/porcino

El factor VIII humano sin dominio B (HB-, de Biogen, Inc. Cambridge, MA), al que le faltan las secuencias que codifican para los residuos de aminoácidos 741-1648 (ID SEC NO: 2), se usó como material de inicio para la construcción de un factor VIII híbrido humano/porcino. Se clonó el HB- en un vector de expresión ReNeo. Para facilitar la manipulación, se aisló el ADNc para el factor VIII, como un fragmento XhoI/HpaI a partir del ReNeo, y se clonó en un Xhol/EcoRV digerido por pBlueScript II KS. Se usó un oligonucleótido, 5' CCTTCCTTTATCCAAATACG
TAGATCAAGAGGAAATTGAC 3' (ID SEC NO: 7), en una reacción de mutagénesis dirigida a un sitio, usando un fago ADN que contiene uracilo, tal como se describe en Kunkel, T.A., et al., 204 Meth. Enzymol. 125-139 (1991), para enlazar y quitar simultáneamente la secuencia A2 humana (nucleótidos 1169-2304 en la ID SEC NO: 1), y para introducir un sitio de restricción SnaBI. El factor VIII humano sin dominio A2 que contiene el plásmido, fue digerido con SnaBI seguido de la adición de ligadores ClaI. El dominio A2 porcino fue posteriormente amplificado mediante PCR, usando el cebador 5' fosforilado, 5' GTAGCGTTGCCAAGAAGCACCCTAAGACG 3' (ID SEC NO: 8) y el cebador 3', 5' GAAGAGTAGTACGAGTTATTTCTCTGGGTTCAATGAC 3' (ID SEC NO: 9), respectivamente. Los ligadores ClaI fueron añadidos al producto de la PCR, seguido del ligado en el vector que contiene el factor VIII humano. Se corrigieron las conexiones A1/A2 y A2/A3 para restaurar las secuencias precisas de corte y flanqueado de la trombina, mediante mutagénesis dirigida al sitio, usando los oligonucleótidos mostrados en la ID SEC NO: 8, y los nucleótidos 1-22 (5' GAA...TTC en la ID SEC NO: 9), para corregir las conexiones terminales 5' y 3', respectivamente. En la construcción resultante, designada HP1, el dominio A2 humano fue exactamente sustituido con el dominio A2 porcino. Un producto preliminar contenía una timina no deseada en la conexión A1-A2, como resultado de la amplificación con PCR del dominio A2 porcino. Esta base única puede ser quitada mediante el oligonucleótido mutagénico 5' CCTTTATCCAAATACGTAGCGTTTGCCAAGAAG 3' (ID SEC NO: 10).

Se sustituyó con una región que contenía el 63% del dominio A2 porcino NH_{2}-terminal, que rodeaba al epítopo A2 putativo, a la secuencia humana homóloga de ANDc sin dominio B, mediante intercambio de fragmentos SpeI/BamHI entre los plásmidos pBluescript que contenían el ADNc del factor VIII humano y del A2 del factor VIII humano/porcino. La secuencia se confirmó mediante secuenciado del dominio A2 y de los sitios de empalme. Finalmente se sustituyó un fragmento SpeI/ApaI, que contenía la secuencia entera de A2, en lugar de la correspondiente secuencia en HB-, produciendo la construcción HP2.

La expresión preliminar de HB- y HP2 en células COS-7, se probó tras la transfección de ADN mediada por DEAE-dextrano, tal como se describe en Seldon, R.F., in Current Protocols in MMolecular Biology (Ausubel, F.M., et al., eds), pp. 9.21-9.26, Wiley Interscience, N.Y. Después de que se confirmara la expresión del factor VIII activo, y que se realizaran los estudios preliminares de inhibición de anticuerpos, el ADN de HB- y HP2 fue establemente transfectado en células de riñón de cría de hámster, usando transfección mediada por liposomas (Lipofectin Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). Los clones que contenían plásmidos se seleccionaron para resistencia a G418 en medio modificado de Dulbecco, medio F12 de Eagle, suero fetal de ternera 10% (DMEM-F12/105 suero fetal de ternera), que contenía G418 400 \mug/ml, seguido de mantenimiento en suero fetal de ternera 10%/DMEM-F12 que contenía G418 100 \mug/ml. Se seleccionaron, mediante clonación en anillo, las colonias que mostraban máxima expresión de actividad de los factores VIII HB- y HP2, y se expandieron para caracterización más avanzada.

La expresión de los factores VIII HB- y HP2 se comparó mediante ensayo de factor VIII libre de plasma, mediante ensayo de coagulación de una fase, y mediante ensayo de enzima unida a inmunoabsorbente, utilizando factor VIII humano recombinante purificado como un estándar. Se obtuvieron las actividades coagulantes específicas de 2.600 y 2.580 unidades/mg para HB- y HP2, respectivamente. HB- y HP2 produjeron 1,2 y 1,4 unidades/ml/48 horas/10^{7} células, respectivamente. Esto es idéntico a lo de las construcciones de tipo "silvestre" (2.600 \pm 200 unidades/mg). Las actividades específicas de HB- y HP2 fueron indistinguibles en el ensayo de factor VIII libre de plasma.

Construcción y expresión de factor VIII híbrido humano/mamífero ni humano, ni porcino, e híbrido equivalente

La clonación de los dominios A1, A3, C1, y C2, y partes de dominios, de otros animales, es factible con la misma estrategia que fue utilizada para la clonación del dominio A2 porcino. Los fragmentos de esos dominios pueden ser clonados mediante técnica de mutagénesis por enlace y corte. La escisión de los correspondientes dominios en el factor VIII humano, y de cualquiera de los fragmentos de los mismos, incluyendo las eliminaciones de un aminoácido simple, es factible mediante la mutagénesis de enlace y corte, tal como se describe arriba. Todos los posibles reemplazos de dominios, reemplazos de fragmentos de dominios, o reemplazos de residuos de aminoácidos simples, son posibles mediante esta aproximación, combinada con técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, tal como empalme mediante extensión de solapas, y mutagénesis por escaneo de alanina.

Puede evaluarse inicialmente la actividad biológica del factor VIII híbrido humano/animal, y equivalente, con sustituciones de dominios A1, A2, A3, C1, y/o C2, mediante el uso del sistema de expresión transitorio de células de mamífero COS. El ADNc híbrido humano/animal, y equivalente, puede ser transfectado dentro de células COS, y pueden analizarse los sobrenadantes para ver la actividad del factor VIII, mediante el uso de ensayos de coagulación de una y dos etapas, como los descritos arriba. Adicionalmente, la actividad del factor VIII puede medirse mediante el uso de un ensayo de sustrato cromogénico, que es más sensible y permite en análisis de mayor número de muestras. Ensayos similares son estándar en el análisis de la actividad del factor VIII (Wood, W.I., et al., 312 Nature 330-337, 1984; Toole, J.J., et al., 312 Nature 342-347, 1984). La expresión del factor VIII recombinante en células COS es también un procedimiento estándar (Toole, J.J., et al., 312 Nature 342-347, 1984; Pittman, D.D., and R.J. Kaufman, 85 Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 2429-2433, 1988). El ADNc de factor VIII humano utilizado como materiales de arranque para las moléculas recombinantes descritas aquí, ha sido expresado en células COS, dando lugar a un producto con actividad biológica. Este material, tal como se describe arriba, puede ser utilizado como un estándar para comparar moléculas de factor VIII híbrido humano/animal. La actividad en los análisis se convierte en actividad específica para realizar una comparación más correcta de las moléculas híbridas. Para esto, es necesaria una medición de la masa del factor VIII producido por las células, y puede realizarse mediante inmunoensayo con factor VIII purificado humano y/o animal como estándares. Los inmunoensayos para el factor VIII son rutina para aquellos expertos en la materia (ver, p.e., Lollar, P., et al., 71 Blood 137-143, 1988).

Ejemplo 8 Determinación de la actividad inhibidora en factor VIII híbrido humano/animal, o equivalente

Las secuencias de factor VIII humano y animal que probablemente están implicadas como epítopos (es decir, como sitios de reconocimiento para los anticuerpos inhibidores que reaccionan con el factor VIII), pueden determinarse usando procedimientos de rutina, por ejemplo mediante el uso de ensayo con anticuerpos para el factor VIII, combinado con técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, tal como el empalme por métodos de extensión de solapas (SOE), tal como se muestra abajo. Pueden identificarse las secuencias de factor VIII animal que no son antigénicas en comparación con las correspondientes secuencias humanas antigénicas, y pueden realizarse sustituciones para insertar secuencias animales, y borrar secuencias humanas, de acuerdo con procedimientos estándar de ADN recombinante. Las secuencias de aminoácidos, como son los residuos de alanina que no tienen identidad conocida para el factor VIII, pueden ser también sustitutos mediante procedimientos estándar de ADN recombinante, o mediante mutagénesis por escaneo de alanina. El factor VIII porcino reacciona menos que el factor VIII humano, con algunos anticuerpos inhibidores; esto proporciona una base para la terapia actual para los pacientes con inhibidores. Después de que se creen los híbridos recombinantes, pueden probarse in vitro para ver la reactividad, mediante ensayos de rutina, incluyendo el ensayo inhibidor de Bethesda. Aquellas construcciones que son menos reactivas que el factor VIII humano nativo y que el factor VIII nativo animal, son candidatos para la terapia de reemplazamiento.

Los epítopos a los que se dirigen la mayoría, si no todos, de los anticuerpos inhibidores reactivos con el factor VIII humano, se cree que residen en dos regiones en la molécula de 2332 aminoácidos de factor VIII humano, el dominio A2 (residuos de aminoácidos 373-740) y el dominio C2 (residuos de aminoácidos 2173-2332, ambas secuencias mostradas en ID SEC NO: 2). El epítopo A2 ha sido eliminado haciendo una molécula de factor VIII híbrido humano/porcino recombinante, en la que la parte del dominio A2 humano, es reemplazada por la secuencia porcina que tiene identidad de secuencia para la secuencia de aminoácidos humana reemplazada. Esto se consiguió, tal como se describe en el Ejemplo 7, mediante clonación del dominio A2 porcino por técnicas estándar de biología molecualar, y posterior corte y empalme con el dominio A2, usando sitios de restricción. En la construcción resultante, designada HP2, los residuos 373-604 (ID SEC NO: 4) del factor VIII porcino fueron sustituyentes en el dominio A2 humano. HP2 fue analizado para ver la inmunorreactividad con los anticuerpos anti-factor VIII humano, usando los siguientes procedimientos.

Ensayo inmunoabsorbente de factor VIII ligado a enzima

Se cubrió la placa de pocillos de microtítulo, con 0,15 ml de ESH4 6 \mug/ml, con un anticuerpo de cadena ligera de factor VIII humano, y se incubó toda la noche. Tras lavar la placa tres veces con H_{2}O, se bloquearon los pocillos durante 1 hora con NaCl 0,15 M, fosfato sódico 10 mM, Tween 20 0,05%, leche seca desnatada 0,05%, azida sódica 0,05%, pH 7.4. Para incrementar la sensibilidad, las muestras que contenían factor VIII fueron activadas con trombina 30 nM durante 15 minutos. La desulfatohirudina recombinante se añadió después, a 100 nM, para inhibir la trombina. Se lavó la placa otra vez, y se añadió 0,1 ml de muestra, o factor VIII recombinante humano puro (10-600 ng/ml), usados como estándar. Tras 2 horas de incubación, se lavó la placa, y se añadió a cada pocillo 0,1 ml de ESH8 biotinilada, otro anticuerpo del factor VIII de cadena ligera. El ESH8 fue biotinilado usando el kit de biotinilación de Pierce, que incluye sulfosuccinimidil-6-(biotinamida)hexanoato. Tras 1 hora de incubación, la placa se lavó y se añadió a cada pocillo 0,1 ml de fosfatasa alcalina strepavidin. La placa se desarrolló usando el kit Bio-Rad de reagente del sustrato alcalin-fosfatasa, y la absorbancia resultante a 405 nm para cada pocillo, fue determinada usando un lector de placa de microtítulo Vmax (Molecular Devices, Inc., Sunnyville, CA). Las concentraciones desconocidas del factor VIII fueron determinadas a partir de la porción lineal de la curva estándar del factor VIII.

Ensayos con factor VIII

Los factores VIII HB- y HP2 fueron medido con un ensayo de coagulación de una fase, que fue realizado tal como se describe arriba (Bowie, E.J.W., and C.A. Owen, in Disorders of Hemostasis (Ratnoff and Forbes, eds) pp. 43-72, Grunn & Stratton, Inc., Orlando, FL (1984)), o mediante un ensayo libre de plasma, tal como sigue. El factor VIII HB- o HP2 fue activado mediante trombina 40 nM en NaCl 0,15 M, HEPES 20 nM, CaCl_{2} 5 mM, Tween 80 0,01%, pH 7.4, en presencia de factor IXa 10 nM, factor X 425 nM, y vesículas de fosfatidilserina/fosfatidilcolina (25/75, p/p) 50 \muM. Tras 5 minutos, la reacción se detuvo con EDTA 0,05 M y desulfatohirudina recombinante 100 nM, y el factor Xa resultante se midió mediante ensayo del sustrato cromogénico, de acuerdo con el procedimiento de Hill-Eubanks, D.C., and P. Lollar, 265 J. Biol. Chem. 17854-17858 (1990). Bajo estas condiciones, la cantidad de Xa formado fue linealmente proporcional a la concentración de factor VIII iniciador, tal como se pudo juzgar al usar factor VIII humano recombinante purificado (Baxter Biotech, Deerfield, IL) como estándar.

Antes del ensayo de coagulación, los factores VIII HB- o HP2 fueron concentrados a partir de medio condicionado a 48 horas, hasta las 10-15 unidades/ml, mediante cromatografía de Heparin-Sepharose^{TM}. Se añadieron los factores VIII HB- o HP2 al plasma con hemofilia A (George King Biomedical) hasta una concentración final de 1 unidad/ml. Los títulos inhibidores en plasma RC o MR, o una solución de reserva de IgG mAb 413 (4 \muM), fueron medidos mediante ensayo Bethesda tal como el descrito por Kasper, C.K., et al., 34 Thromb. Diath. Haemorrh. 869-872 (1975). El IgG inhibidor se preparó tal como se describe en Leyte, A., et al., 266 J. Biol. Chem. 740-746 (1991).

HP2 no reacciona con los anticuerpos anti-A2. Por tanto, los residuos 373-603 deben contener un epítopo para los anticuerpos anti-A2.

Preparación de factor VIII híbrido humano/porcino y ensayo mediante empalme por extensión de solapas (SOE)

Se han preparado muchas moléculas de factor VIII recombinante procoagulante híbrido humano/porcino, sin dominio B, con sustituciones con aminoácidos porcinos en la región del A2 humano para una limitación avanzada del epítopo A2. Junto con las técnicas de sitios de restricción, el procedimiento de "empalme por extensión de solapas" (SOE) tal como lo describe Ho, S.N., et al., 77 Gene 51-59 (1989), ha sido utilizado para sustituir cualquier región arbitraria del ADNc del factor VIII porcino. En el SOE, el sitio de empalme viene definido por oligonucleótidos que se solapan, que pueden ser amplificados para producir el ADNc deseado, mediante PCR. Se han hecho diez construcciones de ADNc, designadas HP4, hasta HP13. Se insertaron en el vector de expresión ReNeo, se transfectaron establemente en células de riñón de cría de hámster, y se expresaron a niveles elevados [0,5-1 \mug (aproximadamente 3-6 unidades)/10^{7} células/24 horas], tal como se describe en el Ejemplo 7. La actividad coagulante del factor VIII se determinó en presencia y en ausencia de un anticuerpo inhibidor monoclonal murino modelo, específico para el dominio A2, mAb413. En la ausencia del inhibidor, todas las construcciones tenían una actividad coagulante específica que era indistinguible de la del factor VIII humano B(-).

Las construcciones de factor VIII híbrido humano/porcino fueron analizadas para ver la reactividad con el inhibidor anti-A2, mAb413, utilizando el ensayo de Bethesda (Kasper, C.K., et al., 34 Thromb. Diath. Haemorrh. 869-872 (1975)). La unidad Bethesda (BU) es el método estándar para medir los títulos inhibidores. Los resultados son mostrados en la Tabla V, y son comparados con los del factor VIII humano recombinante.

TABLA V Comparación de la inmunorreactividad del factor VIII híbrido humano/porcino con aminoácidos sustituidos

Construcción	Sustitución porcina	Inhibición por mAb413
		(BU/mg IgG)
fVIII humano B(-)	Ninguna	1470
HP4	373-540	<0,7
HP5	373-508	<0,7
HP6	373-444	1450
HP7	445-508	<0,7
HP8	373-483	1250
HP9	484-508	<0,7
HP10	373-403	1170
HP11	404-508	<0,7
HP12	489-508	<0,7
HP13	484-488	<0,7

Los límites de las sustituciones porcinas están definidos por los primeros aminoácidos que difieren entre el factor VIII humano y el porcino, en los finales NH_{2}-terminal y C-terminal de la inserción. Tal como se muestra en la Tabla V, si el título Bethesda no es medible (<0,7 BU/mg IgG), entonces hay un epítopo A2 en la región de la secuencia porcina sustituida. El epítopo ha sido progresivamente limitado a los residuos 484-509 (ID SEC NO: 2), constituido por solo 25 residuos, tal como viene ejemplificado por la falta de reactividad del mAb413 con el HP9. Entre las construcciones HP4 y HP11, HP9 fue la construcción más "humanizada" que no reaccionó con el inhibidor. Esto indica que la región crítica en el epítopo A2, se localiza dentro de la secuencia Arg484-Ile508.

Basándose en una comparación de la secuencia de aminoácidos en esta región crítica, entre factor VIII humano y porcino, se hicieron dos construcciones más, HP12 y HP13, en las que la correspondiente secuencia de aminoácidos porcina sustituyó a los aminoácidos humanos 489-508 y 484-488, respectivamente. Ninguno reaccionó con mAb413. Esto indica que los residuos a cada lado del enlace Arg488-Ser489, son importantes para la reacción con los inhibidores de A2. En HP12 solamente 5 residuos no son humanos, y en HP13 solamente 4 residuos no son humanos. Los híbridos sustituidos con 484-508, 484-488, y 489-508 porcino, mostraron una inhibición disminuida por parte de los inhibidores de A2 procedentes del plasma de cuatro pacientes, sugiriendo que hay poca variación en la estructura del epítopo A2, de acuerdo con la respuesta de la población inhibidora.

Se determinó la reactividad de las construcciones más humanizadas, HP9, HP12, y HP13, con dos preparaciones de IgG5 anti-A2 preparadas a partir de plasma inhibidor. Como con mAb413, estos anticuerpos no reaccionaron con HP9, HP12, y HP13, pero si reaccionaron con las construcciones control, HP(-) y HP8.

La región entre 484-508 puede ser analizada más a fondo para la identificación final del epítopo A2 crítico, utilizando los mismos procedimientos.

Los procedimientos descritos en los Ejemplos 7 y 8 pueden ser utilizados para preparar otros factores VIII híbridos humano/mamífero no porcino, con sustitución de aminoácidos en el A2 humano u otros dominios; factor VIII híbrido humano/animal o animal/animal con sustitución de aminoácidos en cualquier dominio; o moléculas equivalentes de factor VIII híbrido, o fragmentos de cualquiera de ellas, como factor VIII híbrido con inmunorreactividad reducida, o ausente, hacia los anticuerpos anti-factor VIII.

Ejemplo 9 Eliminación de la reactividad del factor VIII humano hacia el inhibidor de A2, mediante mutagénesis dirigida al sitio

El Ejemplo 8 demostró que la sustitución con la secuencia porcina vinculada a los residuos 484 y 508, del dominio A2 en el factor VIII humano, produce una molécula que tiene marcadamente reducida la reactividad con un panel de inhibidores del factor VIII específicos para A2 (ver también Healey et al., J. Biol. Chem. 270: 14505-14509, 1995). En esta región, hay 9 diferencias de aminoácidos entre el factor VIII humano y el porcino. Esos nueve residuos en el factor VIII humano, sin dominio B, R484, P485, Y487, P488, R489, P492, V495, F501, e I508 (usando el código amino de letra única), fueron individualmente cambiados por alanina mediante mutagénesis dirigida al sitio. Adicionalmente, los sitios de restricción Mlu1 y Sac2 fueron situados en el ADNc del factor VIII, en los sitios 5' y 3' en relación con el epítopo A2, sin cambiar los aminoácidos correspondientes a esos sitios, para facilitar la clonación. Los nueve mutantes fueron transfectados establemente dentro de células de riñón de crías de hámster, y expresaron a niveles elevados. Los nueve produjeron factor VIII biológicamente activo. Fueron parcialmente purificados y concentrados mediante cromatografía de heparin-Sepharose, tal como describen Healey et al.

Los mutantes han sido caracterizados por su reactividad con el inhibidor monoclonal de origen roedor, mAb413, como en el Ejemplo 7. Este inhibidor reconoce el mismo epítopo, o uno muy estrechamente agrupado, en el dominio A2, al igual que lo hacen todos los inhibidores humanos estudiados hasta la fecha. La reactividad con el inhibidor fue medida usando el ensayo de Bethesda. Brevemente, el título de Bethesda de un inhibidor, es la dilución del inhibidor que inhibe el factor VIII en un 50%, en un ensayo de coagulación para el factor VIII, de una fase. Por ejemplo, si la solución del anticuerpo está diluida 1/420, y esta inhibe la muestra de prueba del factor VIII recombinante en un 50%, el título de Bethesda es 420 U. En el caso de un monoclonal puro, como mAb413, la masa del anticuerpo es conocida, así que los resultados se expresan en unidades Bethesda (UB) por mg de mAb413. Pare encontrar le punto de inhibición 50%, se realizó un intervalo de diluciones de mAb413, y se descubrió la inhibición 50% mediante un procedimiento de ajuste a la curva. Los resultados son los siguientes:

TABLA IV

Mutación	Título mAb413 (UB/mg)	% Reactividad *
fVIII B(-), Tipo "silvestre"	9.400	- -
484 - -> A	160	1,7
P485 - -> A	4.000	42
Y487 - -> A	50	0,53
S488 - -> A	3.500	37
R489 - -> A	1,6	0,015
P492 - -> A	630	6,7
V495 - -> A	10.700	113
F501 - -> A	11.900	126
I508 - -> A	5.620	60
* Relativo al tipo "silvestre"

Estos resultados indican que es posible reducir la antigenicidad del factor VIII hacia el modelo inhibidor A2, por sobre un factor de 10, haciendo sustituciones de alanina en las posiciones 484, 487, 489, y 492. La reactividad de la R489 - -> A está reducida en cerca de 4 órdenes de magnitud. Cualquiera de esas sustituciones con alaninas puede ser útil terapéuticamente, para reducir la antigenicidad y la inmunogenicidad del factor VIII.

Los resultados confirman la eficacia de la mutagénesis por escaneo de alanina, e incluso demuestran que la actividad biológica es retenida incluso aunque la secuencia de aminoácidos haya sido alterada con un epítopo reactivo a un anticuerpo inhibidor. Cinco de los nueve sitios donde las secuencias humana y porcina difieren, son también sitios donde las secuencias de humano y roedor difieren. Los factores VIII que tienen sustituciones de alanina en esas posiciones, son por tanto ejemplos de una molécula equivalente de factor VIII híbrido que tiene una secuencia con identidad de secuencia no conocida, con cualquier factor VIII de mamífero conocido ahora.

Una modificación posterior, p.e. combinando dos sustituciones de alanina, puede proporcionar también una antigenicidad muy reducida para una amplia serie de pacientes, puesto que los anticuerpos de variante policlonal que difieren de paciente a paciente, pueden reaccionar con variantes del epítopo A2 del factor VIII. Adicionalmente, la inmunogenicidad (la capacidad para inducir anticuerpos) está aún más reducida por la incorporación de más de una sustitución de aminoácidos. Estas sustituciones pueden incluir tanto alanina, como aminoácidos específicos porcinos, u otros aminoácidos que se sepa que tienen bajo potencial inmunogénico. Las sustituciones en las posiciones 495 y 501 son probablemente útiles para reducir la inmunogenicidad. Además, estas sustituciones probablemente reducen la reactividad a ciertos anticuerpos de pacientes.

Otras sustituciones eficaces de aminoácidos, reductoras de la antigenicidad, junto con la alanina, pueden ser realizadas mientras se tenga cuidado para evitar aquellas sustituciones previamente apuntadas como que son contribuyentes principales en la energía de enlace antígeno-anticuerpo, o que tienen cadenas laterales voluminosas o cargadas. Los aminoácidos cuyas sustituciones en un epítopo reducen la reactividad antigénica del mismo, son denominados aminoácidos "reductores de inmunorreactividad". Junto con la alanina, otros aminoácidos reductores de la inmunorreactividad incluyen, sin limitación, metionina, leucina, serina, y glicina. Se entenderá que la reducción de inmunorreactividad alcanzable por un aminoácido dado, también dependerá de cualquier efecto que la sustitución pueda tener sobre la conformación de la proteína, la accesibilidad al epítopo y similares.

Ejemplo 10

Se adquirieron de Promega (Madison, Wisconsin): fragmento Klenow, ligadores ClaI fosforilados, ligadores NotI, ligasa T4 y ADN polimerasa Taq. La polinucleótido quinasa fue adquirida de Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland. \gamma^{32}P-ATP (Redivue, >5.000 Ci/mmol) fue adquirida de Amersham. Las células pBlueScript II KS- y E.coli Epicurean XL1-Blue fueron adquiridas de Stratagene (La Jolla, California). Oligonucleótidos sintéticos fueron adquiridos de Life Technologies, Inc. o de Cruachem, Inc. Se usaron cebadores 5'-fosforilados cuando se produjeron los productos del PCR para propósitos de clonación. El conteo de nucleótidos (nt), para los oligonucleótidos usados como cebadores en la amplificación, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), del ADNc del factor VIII porcino o del ADN genómico, utiliza el ADNc de fVIII humano como referencia (Wood et al. (1984) supra).

El ARN total de bazo porcino fue aislado mediante extracción ácida con tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio (Chomczynski, P. and Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162: 156-159). El ADNc porcino se preparó a partir de ARN total de bazo, usando transcriptasa inversa (TI) en virus de leucemia Moloney de roedor, y usando hexámeros aleatorios para cebar la reacción (Kit de síntesis del ADNc de primera hebra, Pharmacia Biotech), a menos que se indique de otro modo. Las reacciones TI contenían Tris-Cl 45 mM, pH 8.3, KCl 68 mM, DTT 15 mM, MgCl_{2} mM, albúmina de suero bovina 0,08 mg/ml, y desoxinucleótido trifosfato (dNTP) 1,8 mM. El ADN genómico porcino fue aislado a partir del bazo, usando un procedimiento estándar (Strauss, W.M. (1995) In Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., editors, John Wiley & Sons, pp. 2.2.1-2.2.3). Se realizó el aislamiento de ADN mediante geles de agarosa, usando Geneclean II (Bio 101), o el kit de extracción, en gel, Quiez (Qiagen).

Las reacciones de PCR se realizaron usando un termociclo Hybaid OmniGene. Para las reacciones PCR que emplean ADN polimerasa Taq, las reacciones incluyen MgCl_{2} 0,6 mM, dNTPs 0,2 mM, oligonucleótidos cebadores 0,5 \muM, polimerasa 50 U/ml y 0,1 volúmenes de mezcla de reacción con ADNc de primera hebra. Excepto donde se indique de otro modo, los productos del PCR fueron purificados mediante gel; se les dejaron los finales romos mediante el fragmento Klenow; se precipitaron con etanol; y, o bien se ligaron al sitio EcoRV del pBluescript II KS, defosforilado, o bien se ligaron con los ligadores ClaI fosforilados usando ligasa T4; fueron digeridos con ClaI; purificados mediante una cromatografía Sephacryl S400; y ligados al pBluescript II KS- defosforilado-con corte en ClaI. Las uniones fueron hechas usando la ADN ligasa T4 (kit de ligado Rapid ADN, Boehringer Mannheim), excepto donde se indique de otro modo. Los plásmidos pBluescript II KS- que contienen insertos, se usaron para transformar células E.coli Epicurean XL1-Blue cells.

El secuenciado del ADN plásmido se realizó usando un secuenciador de ADN automático Applied Biosystems 373A, y el kit dye terminator PRISM, o bien de modo manual, usando el kit Sequenasa v. 2.0 (Amersham Corporation). Se realizó secuenciado directo de los productos PCR, incluyendo etiquetado de oligonucleótidos en el final ^{32}P, usando un protocolo de ciclo de secuenciado (dDNA Cycle Sequencing System, Life Techonologies).

Aislamiento de los clones de ADNc del fVIII porcino, que contienen codones de una secuencia UTR 5', de un péptido señal y del dominio A1. El cADN de fVIII porcino, del 5' al dominio A2, fue amplificado mediante PCR-TI anidada de ARN total de bazo de cerdo hembra, usando un protocolo de amplificación rápida 5' de finales del ADNc (5'-RACE) (Marathon cDNA Amplification, Clontech, Version PR55453). Esto incluyó síntesis de ADNc de primera hebra, usando un cebador oligo(dT) bloqueante del atraque (Borson, N.D. et al. (1992) PCR Methods Appl. 2: 144-148), y síntesis de ADNc de segunda hebra, usando E.coli ADN polimerasa I, y unión con un adaptador 5' de doble hebra extendida, ID SEC NO: 13,

	5'-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3'
	3'-H_{2}N-CCCGTCCA-PO_{4}-5'

cuya hebra corta estaba bloqueada en el final 3' con un grupo amino para reducir el cebado no específico del PCR, y que era complementario a los 8 nucleótidos en el final 3' (Siebert, P.D., et al. (1995) Nucleic. Acids. Res. 23: 1087-1088). La primera ronda de PCR se realizó usando un oligonucleótido adaptador específico, ID SEC NO: 14, 5'-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3' (designado AP1) como cebador del sentido, y un oligonucleótido específico del dominio A2 del fVIII porcino, ID SEC NO: 15, 5'-CCA TTG ACA TGA AGA CCG TTT CTC-3' (nt 2081-2104) como cebador del sentido contrario. La segunda ronda de PCR se realizó usando un oligonucleótido adaptador específico anidado, ID SEC NO: 16, 5'-ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3' (designado AP2) como cebador del sentido, y un oligonucleótido específico del dominio A2 porcino, anidado, ID SEC NO: 17, 5'-GGG TGC AAA GCG CTG ACA TCA GTG-3' (nt 1497-1520) como cebador del sentido contrario. La PCR se llevó a cabo usando un kit comercial (Advantage cDNA PCR core kit) que emplea un protocolo de inicio caliente mediado por anticuerpos (Kellogg, D.E. et al. (1994) BioTechniques 16:1134-1137). Las condiciones de la PCR incluyeron desnaturalización a los 94ºC durante 60 segundos, seguido de 30 ciclos (primera PCR) o 25 ciclos (segunda PCR) de desnaturalización durante 30 segundos a 94ºC, templando durante 30 segundos a 60ºC, y alargando durante 4 minutos a 68ºC, usando un control de tubo de temperatura. Este procedimiento produjo un producto destacado, de \approx 1,6 kb, que fue consecuente con la amplificación de un fragmento que se extendía aproximadamente 150 pb en el UTR 5'. El producto de la PCR fue clonado en pBluescript usando ligadores ClaI. Los insertos de cuatro clones fueron secuenciados en ambas direcciones.

La secuencia de esos clones incluyeron regiones correspondientes a 137 pb del UTR 5', el péptido señal, el dominio A1 y parte del dominio A2. Se alcanzó un consenso en al menos 3 de los 4 sitios. Sin embargo, los clones contenían una media de 4 evidentes mutaciones generadas en la PCR, presumiblemente debido a las múltiples rondas de PCR requeridas para generar un producto clonable. Por lo tanto, usamos secuencias obtenidas de la región del péptido señal para diseñar un cebador PCR de sentido de hebra fosforilada, ID SEC NO: 18, 5'-CCT CTC GAG CCA CCA TGT CGA GCC ACC ATG CAG CTA GAG CTC TCC ACC TG-3', designado RENEOPIGSP, para la síntesis de otro producto PCR para confirmar la secuencia, y para clonar en el vector de expresión. La secuencia en negrita representa el codón de inicio. La secuencia de 5' a esta, representa una secuencia idéntica a la 5' del sitio de inserción en el vector de expresión mamífero ReNeo usado para la expresión de fVIII (Lubin et al. (1994) supra.). Este sitio incluye un sitio de corte Xho1 (subrayado). RENEOPIGSP y el oligonucleótidos nt 1497-1520, fueron usados para cebar una reacción PCR mediada por ADN polimerasa Taq, utilizando ADNc de bazo femenino porcino como plantilla. Las ADN polimerasas de muchos otros fabricantes fallaron en la producción de un producto detectable. Las condiciones de PCR incluyeron desnaturalización a 94ºC durante 4 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización durante 1 minuto a 94ºC, templando durante 2 minutos a 55ºC, y alargando durante 2 minutos a 72ºC, seguido por una elongación final durante 5 minutos a 72ºC. El producto de la PCR se clonó en un pBluescript usando ligadores ClaI. Los insertos de dos de esos clones fueron secuenciados en ambas direcciones, y encajaron con la secuencia consenso.

Aislamiento de clones de ADNc de fVIII porcino que contienen codones de A3, C1 y la mitad 5' del dominio A2. Inicialmente, se clonaron dos productos de TI-PCR de bazo porcino, correspondientes a un fragmento de dominio B-A3 (nt 4519-5571) y a un fragmento de dominio C1-C2 (nt 6405-6990). El final 3' del dominio C2 que se obtuvo, se extendía hasta la región exón 26, la cual es el exón terminal en fVIII. El producto B-A3 se creó usando el cebador específico del dominio B porcino, ID SEC NO: 19, 5' CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T 3', donde la región subrayada corresponde a una región en el fVIII porcino que se alinea con la nt 4519-4530 en el fVIII humano. La región 5' del oligonucleótido incluye un sitio NotI, que estaba originalmente destinado para propósitos de clonación. El cebador de sentido contrario usado en la generación del producto B-A3, ID SEC NO: 20, 5'-GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA-3' estaba basado en el complemento inverso de la secuencia de ADNc humana en la nt 5545-5571. La reacción de PCR contenía KCl 50 mM, Tris-Cl 10 mM, pH 9.0, Triton X-100 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM, dNTPs 2,5 mM, cebadores 20 \muM, 25 unidades/ml de ADN polimerasa Taq y 1/20 en volumen de la mezcla de reacción TI. Las condiciones de la PCR fueron desnaturalización a 94ºC durante 3 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturalización durante 1 minuto a 94ºC, templado durante 2 minutos a 50ºC, y elongación durante 2 minutos a 72ºC. Los productos de PCR fueron fosforilados usando ADN quinasa T4 y se añadieron ligadores NotI. Tras cortar con NotI, se clonaron los fragmentos PCR en el sitio NotI del BlueScrpt II KS, y se transformaron dentro de células XL1-Blue.

El producto C1-C2 fue realizado usando la secuencia conocida de ADNc humano para sintetizar cebadores para los dos sentidos, ID SEC NO: 21, 5'-AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N-3' (nt 6405-6426) e ID SEC NO: 22, 5'-CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N-3' (complemento inverso de los nt 6966-6990), respectivamente. Las condiciones de la PCR fueron idénticas a las usadas para generar el producto B-A2. El fragmento resultante se ligó al vector clonador pNOT usando el Prime PCR Cloner Cloning System (5 Prime-3 Prime, Inc., Boulder, Colorado), y se desarrolló en células JM109.

Los plásmidos B-A3 y C1-C2 fueron secuenciados parcialmente para crear los oligonucleótidos de sentido normal y sentido inverso específicos de porcino, ID SEC NO: 23 5'-GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG-3' (nt 4551-4573) e ID SEC NO: 24 5'-ACA GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG-3' (nt 6541-6564), respectivamente. Estos oligonucleótidos se usaron como cebadores para generar un producto TI-PCR de 2.013 pb utilizando un kit Clontech Advantage cDNA PCR. Este producto, que se corresponde con los nt 4551-6564 humanos, incluye la región correspondiente al péptido de activación de cadena ligera (nt 5002-5124), el dominio A3 (nt 5125-6114) y la mayor parte del dominio C1 (nt 6115-6573). La secuencia del clon C1-C2 había establecido que los ADNc porcino y humano del nt 6565 al final 3' del dominio C1 eran idénticos. El producto PCR se clonó en el sitio EcoRV del pBluescript II KS-. Se secuenciaron completamente cuatro clones en ambas direcciones. Se alcanzó un consenso en al menos 3 de los 4 sitios.

Aislamiento de los clones de ADNc de fVIII que contienen la mitad 3' de los codones del dominio C2. El dominio C2 del fVIII humano (nucleótidos 6574-7053) está contenido en los exones 24-26 (Gitschier, J. et al. (1984) Nature 312: 326-330). El exón 26 humano contiene 1.958 pb, correspondientes a los nucleótidos 6091-8858. Estos incluyen 1478 pb de la secuencia 3' sin traducir. Los intentos de clonar el ADNc del exón 26, correspondiente al final 3' del dominio C2, y al UTR 3' mediante RACE 3' (Siebert et al. (1995) supra), PCR inversa (Ochman, H. et al. (1990) Biotechnology (N.Y.). 8: 759-760), PCR por sitio de restricción (Sarkar, G. et al. (1993) PCR Meth. Appl. 2: 318-322), PCR "impredeciblemente cebada" (Dominguez, O. and C. Lopez-Larrea (1994) Nucleic. Acids Res. 22: 3247-3248), y mediante revisión de una genoteca de ADNc de hígado porcino, fallaron. Se intentó el RACE 3' usando la misma genoteca de ADNc de doble hebra ligado a adaptador que se había usado exitosamente para clonar el final 5' del ADNc del fVIII porcino. Por lo tanto, el fallo de este método no se debió a la ausencia de ADNc correspondiente al exón 26.

Se usó un procedimiento de PCR mediante "targeted gene walking" (Parker, J.D. et al. (1991) Nucleic. Acids. Res. 19: 3055-3060) para clonar la mitad 3' del domino C2. Se sintetizó un cebador de sentido normal específico de porcino, ID SEC NO: 25 5'-TCAGGGCAATCAGGACTCC-3' (nt 6904-6924), en base a la secuencia inicial del dominio C2, y se usó en una reacción PCR con cebadores "walking" inespecíficos seleccionados a partir de oligonucleótidos disponibles en el laboratorio. Los productos de la PCR fueron entonces marcados como objetivo mediante un análisis de extensión del cebador (Parker J.D. and G.C. Burmer (1991) BioTechniques 10: 94-101), utilizando un cebador interno específico de porcino, marcado en el final con ^{32}P, ID SEC NO: 26 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952). De modo interesante, de los 40 cebadores inespecíficos probados, solo dos produjeron productos positivos en un análisis de extensión del cebador, y esos dos se correspondieron con una secuencia humana exacta y degenerada en el final 3' del dominio C2: ID SEC NO: 27 5'-GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' (nt 7030-7053) e ID SEC NO: 28 5'-GTAGAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCYAG-3' (nt 7027-7053). Estos cebadores habían sido diseñados inicialmente para dar lugar a un producto mediante PCR-TI convencional, pero se falló al no producir suficiente producto para ser visualizado mediante tinción de unión a bromuro de etidio. Sin embargo, el producto de la PCR pudo ser identificado mediante el método de extensión del cebador, que es más sensible. Este producto fue purificado en gel y secuenciado directamente. Esto extendió la secuencia del 3' de fVIII porcino hasta la nt 7026.

Se obtuvo una secuencia adicional mediante el análisis de extensión del primer de un producto de PCR anidado, generado al utilizar la genoteca de ADN de doble hebra ligado a adaptador usada en el protocolo RACE-5' descrito previamente. La primera ronda de reacción usó el cebador porcino exacto IDE SEC NO: 29 5'-CTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGT-3' y el cebador AP1. La segunda ronda de reacción usó ID SEC NO: 30 5'-AATCAGGACTCCTCCACCCCCG-3 (nt 6913-6934) y el cebador AP2. El PCR directo extendió la secuencia 3' hasta el final del dominio C2 (nt 7053). La secuencia del dominio C2 fue única, excepto en el nt 7045 cercano al final 3' del dominio C2. El análisis de las reacciones PCR repetidas produjeron en este sitio tanto A, como G o una doble lectura de A/G.

El secuenciado se extendió dentro de la UTR 3' usando dos cebadores adicionales, ID SEC NO: 31 5'-GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3' (nt 6977-6996) e ID SEC NO: 32 5'-CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG-3' (nt 7008-7031). Se obtuvieron aproximadamente 15 pb de la secuencia UTR 3', aunque la secuencia era confusa en varios sitios. Entonces se sintetizaron varios cebadores de sentido contrario en los mejores cálculos de la secuencia 3' sin traducir. Esos cebadores incluyeron el complemento inverso del codón TGA de parada, en su término 3'. Se obtuvieron los productos de PCR tanto a partir de ADN genómico de bazo porcino como de ANDc de bazo porcino, que fueron visualizados mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio, utilizando un cebador específico de sentido normal ID SEC NO: 33 5'-AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G-3' (nt 6913-6934) y el cebador UTR de sentido inverso, ID SEC NO: 34 5'-CCTTGCAGGAATTCGATTCA-3'. Para obtener cantidades suficientes de material para los propósitos de clonación, se realizó una segunda ronda de PCR usando un cebador anidado de sentido normal, ID SEC NO: 35 5'-CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952), y el mismo cebador de sentido inverso. Se clonó el producto de PCR de 141 pb en un pBluescript II KS- con corte en EcoRV-. Se obtuvo la secuencia de tres clones derivados del ADN genómico, y de tres clones derivados del ADNc, en ambas direcciones. La secuencia fue inequívoca, excepto en el nt 7045, donde el ADN genómico fue siempre A y el ADNc fue siempre G.

Alineamientos de múltiples secuencias de ADN de fVIII humano, porcino y de ratón (Fig. 1A-1H). Los alineamientos del péptido señal, y de las regiones A1, A2, A3, C1 y C2, se hicieron usando el programa CLUSTALW (Thompson, J.D. et al. (1994) Nucleic. Acids. Res. 22: 4673-4680). Las penalizaciones de hueco abierto y de extensión de hueco fueron respectivamente 10 y 0,05. Las alineaciones de los dominios B de humano, ratón y cerdo han sido descritas previamente (Elder et al. (1993) supra). La secuencia A2 humana se corresponde a los aminoácidos 373-740 en la ID SEC NO: 2. La secuencia de aminoácidos de A2 porcina se da en la ID SEC NO: 4, y la secuencia de aminoácidos del dominio A2 de ratón se da en la ID SEC NO: 6, con los aminoácidos 392-759.

Resultados y discusión

Hemos determinado la secuencia de ADNc del fVIII porcino correspondiente a los 137 pb del UTR 5', la región codificante del péptido señal (57 pb), y los dominios A1 (1119 pb), A3 (990 pb), C1 (456 pb), y C2 (483 pb). Junto con la secuencia del dominio B previamente publicada, y las regiones del péptido de activación de cadena ligera (Toole et al. (1986) supra), y el dominio A2 (Lubin et al. (1994) supra), la secuencia presentada aquí completa la determinación del ADNc del fVIII porcino correspondiente al producto traducido. Se clonó un fragmento que incluía el ADNc de la región UTR 5', el péptido señal, y el dominio A1, utilizando un protocolo de PCR-TI de tipo RACE-5'. Un cebador basado en la secuencia de C2 humano dio lugar exitosamente a un producto PCR-TI que llevó a clonar los dominios A3, C1 y la mitad 5' del C2. El ADNc correspondiente a la mitad 3' del dominio C2, y el ADNc del UTR 3', se demostraron difíciles de clonar. El resto del dominio C2 fue finalmente clonado mediante un procedimiento de PCR "targeted gene walking" (Parker et al. (1991) supra).

La secuencia presentada aquí con ID SEC NO: 36 fue inequívoca, excepto en el nt 7045, cerca del final 3' del dominio C2, que es tanto A o G, tal como se describe aquí, más arriba. El codón correspondiente es GAC (Asp) o AAC (Asn). Los codones de humano y ratón son GAC y CAG (Gln), respectivamente. Se desconoce si esto representa un polimorfismo o un artefacto PCR reproducible. Los ADNc de fVIII recombinante híbrido humano/porcino sin dominio B, que contienen sustituciones en el dominio C2 porcino, correspondientes tanto a los codones GAC como ACC, han sido expresados establemente sin diferencias detectables en la actividad procoagulante. Esto indica que no hay diferencia funcional entre estas dos variantes del dominio C2.

Se muestra en la Fig. 1A-1H la alineación de la secuencia de aminoácidos predicha del fVIII porcino en toda su longitud, ID SEC NO: 37, con las secuencias humana (Wood et al. (1984) supra) y de roedor (Elder et al. (1993) supra) publicadas, junto con los sitios para modificación post-traducción, rotura proteolítica, y reconocimiento mediante otras macromoléculas. El grado de identidad de las secuencias alineadas, se muestra en la Tabla VII. Tal como se indicó anteriormente los dominios B de esas especies son más divergentes que los dominios A y C. Esto es consistente con la observación de que el dominio B no tiene función conocida, a pesar de su gran tamaño (Elder et al. (1993) supra; Toole et al. (1986) supra). Hay también más divergencia de secuencias correspondiente al APC dominio A1/péptido de ruptura del factor IXa (residuos 337-372), y al péptido de activación de cadena ligera (Tabla VII). El sitio de ruptura por trombina en la posición 336, para generar el péptido 337-372, aparentemente se ha perdido en el ratón, puesto que este residuo es glutamina en lugar de arginina (Elder et al. (1993) supra). La relativamente rápida divergencia de los péptidos de rotura por trombina (o en fVIII de ratón, un péptido de activación 337-372 posiblemente vestigial), ha sido indicada previamente para los fibrinopéptidos (Creighton, T.E. (1993) In Proteins: Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman, New York, pp. 105-138). La falta de función biológica de esos péptidos una vez que se han cortado, ha sido citada como una razón posible para la rápida divergencia. Se ha propuesto que el Arg652 en el fVIII humano es el sitio más importante de corte para la proteína C activada, durante la inactivación del fVIII y el fVIIIa (Fay,
P.J. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 20139-20145). Este sitio se conserva en los fVIII humano, porcino y de ratón.

También se muestran en negrita en las figuras 1A-1H, los sitios potenciales de glicosilación ligada a N. Hay ocho sitios de glicosilación ligada a N conservados: uno en el dominio A1, uno en el dominio A2, cuatro en el dominio B, uno en el dominio A3, y uno en el dominio C1. Las 19 cisteínas de los dominios A y C son conservadas, mientras que existe divergencia en las cisteínas del dominio B. Seis de las siete uniones por disulfuro en fVIII se encuentran como sitios homólogos en el factor V y en la ceruloplasmina, y ambas uniones disulfuro en el dominio C, se encuentra en el factor V (McMullen, B.A. et al. (1995) Protein Sci. 4: 740-746). El fVIII humano contiene tirosinas sulfatadas en las posiciones 346, 718, 719, 723, 1664, y 1680 (Pittman, D.D. et al. (1992) Biochemistry 31: 3315-3325; Michnick, D.A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 20095-20102). Estos residuos se conservan en fVIII de ratón y en fVIII porcino (Fig. 1), aunque el programa CLUSTALW falló al alinear la tirosina de ratón correspondiente a la Tyr346 en fVIII humano.

El plasma de ratón y cerdo pueden corregir los defectos de coagulación en el plasma humano con hemofilia A, lo cual es consistente con el nivel de conservación de residuos en los dominios A y C de esas especies. La actividad procoagulante del fVIII porcino es superior a la del fVIII humano (Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 23652-23657). Esto puede deberse a una tasa disminuida de disociación espontánea de la subunidad A2 del heterotrímero A1/A2/A3-C1-C2 del fVIIIa. Se desconoce si esta diferencia en la actividad procoagulante refleja un cambio evolutivo en la función, como un ejemplo de la adaptación de las especies (Perutz, M.F. (1996) Adv. Protein Chem. 36: 213-244). Ahora que está completa la secuencia de ADNc de fVIII porcino correspondiente al producto traducido, la mutagénesis por escaneado del homólogo (Cunningham, B.C., et al. (1989) Science 243: 1330-1336) puede proporcionar un medio para identificar diferencias estructurales entre fVIII humano y porcino, que son responsables de la actividad superior del segundo.

El fVIII porcino es típicamente menos reactivo con los anticuerpos inhibidores que aparecen en hemofílicos que han recibido transfusiones con fVIII, o que surgen como auto-anticuerpos en la población general. Esta es la base del uso de fVIII concentrado en el tratamiento de pacientes con anticuerpos inhibidores (Hay and Lozier (1995) supra). La mayoría de los inhibidores se dirigen contra epítopos localizados en el dominio A2 o en el dominio C2 (Fulcher, C.A. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7728-7732; Scandella, D. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6152-6156; Scandella, D. et al. (1989) Blood 74: 1618-1626). Adicionalmente, se ha identificado un epítopo de significancia desconocida que está en el dominio A3 o en el C1 (Scandella et al. (1989) supra; Scandella, D. et al (1993) Blood 82: 1767-1775; Nakai, H. et al. (1994) Blood 84: 224a). El epítopo A2 ha sido mapeado en los residuos 484-508 mediante mutagénesis del escaneo de homólogos (Healey et al. (1995) supra). En este segmento de 25 residuos, hay relativamente baja proporción de secuencias idénticas (16/25 o 64%). Es interesante que esta región, que parece ser funcionalmente importante, basado en el hecho que los anticuerpos contra ella son inhibidores, ha estado sujeta aparentemente a deriva genética relativamente más rápida. La alineación del dominio A2 porcino y de los dominios A3 indica que el epítopo A2 comparte homología indetectable con la correspondiente región en el dominio A3.

Se había propuesto que el epítopo inhibidor C2 estuviera localizado en los residuos 2248-2312, mediante mapeo de supresión (Scandella, D. et al. (1995) Blood 86:1811-1819). Los fVIII humano y porcino son idénticos en un 83% en este segmento de 65 residuos. Sin embargo, la mutagénesis de escaneado de homólogos de esta región para caracterizar el epítopo C2, ha revelado que un determinante mayor del epítopo C2 estaba localizado inesperadamente en la región de los aminoácidos 2181-2243 (ID SEC NO: 2), y Fig. 1H.

Las proteínas del factor VIII híbrido humano/porcino fueron creadas de manera que las porciones del dominio C2 del factor VIII humano fueron reemplazadas por las correspondientes porciones del factor VIII porcino, usando la estrategia aquí descrita (Ejemplo 8). La síntesis de los distintos factores VIII híbridos en C2 fue conseguida mediante la construcción de ADN codificante híbrido, usando la secuencia de nucleótidos codificante para la región C2 porcina dada en ID SEC NO: 37. Cada ADN híbrido se expresó en células transfectadas, de modo que los factores VIII híbridos pudieran ser parcialmente purificados a partir del medio de crecimiento. La actividad, en ausencia de cualquier inhibidor, se midió mediante el ensayo de coagulación de una fase.

Se usó una batería de cinco inhibidores humanos para probar cada factor VIII híbrido. Se había demostrado previamente que los plasmas inhibidores que contenían anticuerpo anti-factor VIII estaban dirigidos contra el dominio C2 humano, basado en la capacidad del dominio C2 humano recombinante para neutralizar la inhibición. En todas las pruebas de los plasmas, el título inhibidor fue neutralizado por encima del 79% por el dominio C2 o por la cadena ligera, pero por debajo del 10% por el dominio A2 humano recombinante. Además, los factores VIII híbridos en C2 fueron probados contra un anticuerpo monoclonal de roedor, que se une al dominio C2, y al igual que los anticuerpos inhibidores del C2 humano, este inhibió la unión del factor VIII al fosfolípido, y al factor de von Willebrand.

Comparando los títulos de anticuerpos inhibidores contra los factores VIII híbridos en C2, se demostró que el mayor determinante del epítopo inhibidor de C2 humano era la región de residuos 2181-2243 (ID SEC NO: 2, ver también Fig. 1H). Los anticuerpos anti-C2 dirigidos hacia una región COOH-terminal en el residuo 2253 no fueron identificados en cuatro de los cinco sueros de pacientes. En comparación con los híbridos que tenían secuencia porcina de 2181-2199 y 2207-2243, era evidente que ambas regiones contribuyen a la unión de los anticuerpos.

En referencia a la Fig. 1H, puede verse que en la región 2181-2243, hay 16 diferencias de aminoácidos entre las secuencias humana y porcina. Las diferencias se encuentran en los residuos 2181, 2182, 2188, 2195-2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224-2227, 2234, 2238 y 2243. El reemplazo de aminoácidos en uno o más de esos residuos numerados, puede llevarse a cabo para crear un factor VIII humano modificado, no reactivo a los anticuerpos inhibidores anti-C2 humano. La mutagénesis por escaneado de alanina proporciona un método conveniente para generar sustituciones de alanina en residuos que aparecen de manera natural, tal como se describió previamente. También se pueden usar como sustitutos otros aminoácidos además de la alanina, tal como se describe aquí. Las sustituciones de alanina para aminoácidos individuales, especialmente aquellos que no son idénticos entre humano/porcino o humano/ratón, o los que contribuyen más probablemente a la unión con anticuerpos, pueden producir un factor VIII modificado con reactividad reducida hacia anticuerpos inhibidores.

Además, la estrategia de insertar aminoácidos con bajo potencial para ser inmunogénicos, en la región definida de los residuos 2181-2243, da lugar a factores VIII modificados que tienen inmunogenicidad reducida. El factor VIII con inmunogenicidad reducida es útil como un factor VIII suplementario para el tratamiento de pacientes con hemofilia A, en preferencia al factor VIII con secuencia natural. Los pacientes tratados con factor VIII con inmunogenicidad reducida tienen menos probabilidad de desarrollar anticuerpos inhibidores, y por tanto tienen menos probabilidad de sufrir una baja eficacia del tratamiento a lo largo de su vida.

Fig. 1

Alineación de secuencias predichas de aminoácidos de fVIII de humano, porcino y ratón

Las Fig. 1A-1H tomadas juntas, proporcionan una comparación de secuencias alineadas de secuencias de aminoácidos de factor VIII de humano, cerdo y ratón. La Fig. 1A compara las regiones del péptido señal (humano, ID SEC NO: 40; porcino, ID SEC NO: 37, aminoácidos 1-19; de roedor, ID SEC NO: 6, aminoácidos 1-19). La Fig. 1B da las secuencias de aminoácidos para el dominio A1 de humano (ID SEC NO: 2, aminoácidos 1-372), porcino (ID SEC NO: 37, aminoácidos 20-391), y de roedor (ID SEC NO: 6, aminoácidos 20-391). La Fig. 1C proporciona secuencias de aminoácidos para los dominios A2 del factor VIII de humano (ID SEC NO: 2, aminoácidos 373-740), cerdo (ID SEC NO: 37, aminoácidos 392-759) y ratón (ID SEC NO: 6, aminoácidos 392-759). La Fig. 1D proporciona las secuencias de aminoácidos de los dominios B del factor VIII humano (ID SEC NO: 2, aminoácidos 741-1648), de cerdo (ID SEC NO: 37, aminoácidos 760-1449) y de ratón (ID SEC NO: 6, aminoácidos 760-1640). La Fig. 1E compara las secuencias de aminoácidos de los péptidos de activación de cadena ligera del factor VIII de humano, cerdo y ratón (ID SEC NO: 2, aminoácidos 1649-1689; ID SEC NO: 37, aminoácidos 1450-1490; e ID SEC NO: 6, aminoácidos 1641-1678, respectivamente). Fig. 1F proporciona la comparación de secuencias de dominios A3 del factor VIII de humano, cerdo y ratón (ID SEC NO: 2, aminoácidos 1690-2019; ID SEC NO: 37, aminoácidos 1491-1820; e ID SEC NO: 6, aminoácidos 1679-2006, respectivamente). La Fig. 1G proporciona la secuencia de aminoácidos de los dominios C1 del factor VIII de humano, cerdo y ratón (ID SEC NO: 2, aminoácidos 2020-2172; ID SEC NO: 37, aminoácidos 1821-1973; e ID SEC NO: 6, aminoácidos 2007-2159, respectivamente). La Fig. 1H proporciona los datos de secuencia para los dominios C2 de los dominios C2 de factor VIII de humano, cerdo y ratón (ID SEC NO: 2, aminoácidos 2173-2332; ID SEC NO: 37, aminoácidos 1974-2133; e ID SEC NO: 6, aminoácidos 2160-2319, respectivamente).

Los diamantes representan sitios de sulfatación de tirosina, los sitios de glicosilación potencial están en negrita, los sitios propuestos de unión para el factor IXa, fosfolípidos y proteína C están subrayados con doble línea, y las regiones involucradas en la unión a anticuerpos inhibidores anti-C2 y anti-A2 están marcadas en itálica. Los asteriscos resaltan las secuencias de aminoácidos que están conservadas. Ver también las ID SEC NO: 36 (ADNc de factor VIII porcino) e ID SEC NO: 37 (secuencia deducida de aminoácidos del factor VIII porcino). El sistema de numeración humano se usa como referencia (Wood et al. (1984) supra). Los dominios A1, A2, y B, se definen mediante los sitios de corte por trombina, en las posiciones 372 y 740, y por un sitio de corte por proteasa desconocida, en el 1648, como residuos 1-372, 373-740, y 741-1648, respectivamente (Eaton, D.L. et al. (1986) Biochemistry 25:8343-8347). Los dominios A3, C1, y C2, se definen como residuos 1690-2019, 2020-2172, y 2173-2332, respectivamente (Vehar et al. (1984) supra). Los sitios de corte por trombina (factor IIa), factor IXa, factor Xa, y APC (Fay et al. (1991) supra; Eaton, D. et al. (1986) Biochemistry 25: 505-512; Lamphear, B.J. and P.J. Fay (1992) Blood 80:3120-3128), se muestran mediante la ubicación del nombre de la enzima sobre la arginina reactiva. Se separa un péptido ácido de la cadena ligera del factor VIII mediante trombina o factor Xa, en la posición 1689. Los sitios de unión propuestos para el factor IXa (Fay, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20522-20527; Lenting P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7150-7155), fosfolípidos (Foster, P.A. et al. (1990) Blood 75:1999-2004), y proteína C (Walker, F.J. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:1484-1489) están doblemente subrayados. Las regiones involucradas en la unión a anticuerpos inhibidores anti-A2 (Lubin et al. (1994) supra; Healey et al. (1995) supra) y previamente propuestas para anti-C2, están en itálica. El epítopo anti-C2 identificado tal como se ha descrito aquí, se muestra con un subrayado simple en la Fig. 1H. Los sitios de sulfatación de tirosina (Pittman et al. (1992) supra; Michnick et al. (1994) supra) se muestran con un \blacklozenge. Las secuencias de reconocimiento para glicosilación potencial unida a N (NXS/T, donde X no es prolina) se muestran en negrita.

La secuencia de nucleótidos codificante para la proteína de factor VIII donde falta el dominio B, es dada en la secuencia ID SEC NO: 38, y la correspondiente secuencia deducida de aminoácidos se proporciona en la ID SEC NO: 39.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: UNIVERSIDAD DE EMORY

\hskip3.9cm

LOLLAR, John S.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Factor VIII modificado

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 40

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Greenlee, Winner and Sullivan, P.C.

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(B)

CALLE: 5370 Manhattan Circle Suite 201

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(C)

CIUDAD: Boulder

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(D)

ESTADO: Colorado

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(E)

PAÍS: USA

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(F)

CÓDIGO ZIP: 80303

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(v)

FORMATO DE LECTURA POR EL ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disquette

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(B)

ORDENADOR: IMB PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

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(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: WO sin asignar

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(B)

FECHA DEL ARCHIVO: 26 de junio de 1997

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/607,707

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(B)

FECHA DEL ARCHIVO: 26 de junio de 1996

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: WO PCT/US94/13200

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(B)

FECHA DEL ARCHIVO: 15 de noviembre de 1994

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/212,133

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(B)

FECHA DEL ARCHIVO: 11 de marzo de 1994

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 07/864,004

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DEL ARCHIVO: 07 de abril de 1992

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL AGENTE/ABOGADO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Greenlee, Lorance L.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE MATRÍCULA: 27.894

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 75-95F

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 303/499-8080

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 303/499-8089

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9009 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO DE TEJIDO: hígado

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 5125..7053

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /producto = "Estructura de dominio"

\hskip6.5cm

/nota = "Equivalente al dominio A3-C1-C2"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..2277

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /producto = "Estructura de dominio"

\hskip6.5cm

/nota = "Equivalente al dominio A1-A2"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..2277

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /producto = "Dominio"

\hskip6.5cm

/nota = "ADNc codificante del factor VIII humano"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 1:

1

2

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2332 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO DE TEJIDO: hígado

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

8

9

10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1130 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO DE TEJIDO: sangre

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..1130

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /producto = "región"

\hskip6.5cm

/nota = "ADNc codificante del dominio A2 del factor VIII porcino"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 3:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 368 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: YES

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Porcino

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO DE TEJIDO: bazo

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..368

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Secuencia de aminoácidos predicha del dominio A2 del factor VIII porcino, definido como residuos homólogos al factor VIII humano, aminoácidos 373-740. Los residuos 1-4 son de una secuencia de aminoácidos porcina conocida."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 4:

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7493 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: repeat_unit

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..407

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /rpt_type = "terminal"

\hskip6.5cm

/nota = "5' UTR"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 7471..7476

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /función = "señal poliA"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: repeat_unit

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 7368..7493

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /rpt_type = "terminal"

\hskip6.5cm

/nota = "3' UTR"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 408..7367

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /producto = "factor VIII de coagulación"

\vskip0.800000\baselineskip

(x)

INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

AUTORES: Elder, F.

\hskip4.63cm

Lakich, D.

\hskip4.63cm

Gitschier, J.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TÍTULO: Secuencia del ADNc del factor VIII de roedor

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REVISTA: Genomics

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

VOLUMEN: 16

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

PAGES: 374-379

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

FECHA: 1993

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 5:

16

17

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2319 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Mus musculus

\vskip0.800000\baselineskip

(x)

INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

AUTORES: Elder, F.

\hskip4.63cm

Lakich, D.

\hskip4.63cm

Gitschier, J.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TÍTULO: Secuencia del ADNc del factor VIII de roedor

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REVISTA: Genomics

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

VOLUMEN: 16

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

PAGES: 374-379

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

FECHA: 1993

\vskip0.500000\baselineskip

(K)

RESIDUOS RELEVANTES EN LA ID SEC NO: 6: DE 1 A 2319

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

23

24

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTCCTTTA TCCAAATACG TAGATCAAGA GGAAATTGAC

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGCGTTGC CAAGAAGCAC CCTAAGACG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGAGTAGT ACGAGTTATT TCTCTGGGTT CAATGAC

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTTATCCA AATACGTAGC GTTTGCCAAG AAG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..19

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "R es A o G y N es A, T, G o C."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AARCAYCCNA ARACNTGGG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCGCACTA GGGGGTCTTG AATTC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: ambas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /des = "cebador oligonucleótido, de cadena doble desde los nucleótidos 37-44, final 3' de la hebra corta bloqueada con un grupo amino."

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 37..44

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Con doble hebra en la región con los nucleótidos 37-44, el final 3' está bloqueado con un grupo amino para reducir la cebadura no específica"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAATACGAC TCACTATAGG GCTCGAGCGG CCGCCCGGGC AGGT

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATTGACAT GAAGACCGTT TCTC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTGCAAAG CGCTGACATC AGTG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCTCGAGC CACCATGTCG AGCCACCATG CAGCTAGAGC TCTCCACCTG

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGCGGCCG CGCATCTGGC AAAGCTGAGT T

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 25..27

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "En la posición 25, R es A o G"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAATAAGCC CAGGCTTTGC AGTCRAA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 21..22

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "En la posición 22, N es A, G, C o T."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGAAATTCC ACTGGAACCT TN

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..25

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "En la posición 25, N es A, G, C o T."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGGGGTGA ATTCGAAGGT AGCGN

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGTTCATCG GGAAGACCTG TTG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAGCCCATC AACTCCATGC GAAG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAGGGCAAT CAGGACTCC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGTGGTGAA CGCTCTGGAC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGAGGTCC TGTGCCTCGC AGCC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..27

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "S es G o C, K es G o T, R es A o G, e Y es C o T."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGAGSTSC TGKGCCTCRC AKCCYAG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCGCATGG AGTTGATGGG CTGT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATCAGGACT CCTCCACCCC CG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCACCC CACGAGCTGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCCCTGAGG CTCGAGGTTC TAGG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATCAGGACT CCTCCACCCC CG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTGCAGGA ATTCGATTCA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGTGGTGAA CGCTCTGGAC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6402 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Cerdo

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..6402

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 36:

27

28

29

30

31

32

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2134 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

38

39

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4334 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

AISLADO INDIVIDUAL: Factor VIII sin el dominio B

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 3..4334

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 38:

43

44

45

46

47

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1444 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

49

50

51

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: SI

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..19

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Péptido señal del factor VIII humano."

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe}

\sac{Cys Phe Ser}

Claims (16)

1. ADN aislado y purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del factor VIII porcino, expuesta en ID SEC NO: 37.

2. ADN de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en ID SEC NO: 36.

3. ADN aislado y purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio A1 del factor VIII porcino, tal como la expuesta en ID SEC NO: 37, entre los aminoácidos 20-391.

4. ADN de la reivindicación 3, que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en ID SEC NO: 36, entre las posiciones 58-1173.

5. ADN aislado y purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio A3 del factor VIII porcino, tal como la expuesta en ID SEC NO: 37, entre los aminoácidos 1491-1820.

6. ADN de la reivindicación 5, que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en ID SEC NO: 36, entre las posiciones 4471-5460.

7. ADN aislado y purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio C1 del factor VIII porcino, tal como la expuesta en ID SEC NO: 37, entre los aminoácidos 1821-1973.

8. ADN de la reivindicación 7, que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en ID SEC NO: 36, entre las posiciones 5461-5919.

9. ADN aislado y purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio C2 del factor VIII porcino, tal como la expuesta en ID SEC NO: 37, entre los aminoácidos 1974-2133.

10. ADN de la reivindicación 9, que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en ID SEC NO: 36, entre las posiciones 5920-6399.

11. ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, incluyendo los dominios A1, A2, A3, C1 y C2 del factor VIII porcino, tal como la expuesta en ID SEC NO: 37, teniendo dicha proteína actividad procoagulante.

12. Un procedimiento para crear una proteína que tenga actividad procoagulante, comprendiendo dicho procedimiento la expresión del ADN de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 u 11 en un organismo hospedador apropiado, y aislando la proteína aislada.

13. Un procedimiento para crear una molécula de factor VIII híbrido, o un fragmento de la misma, con actividad coagulante, comprendiendo ese procedimiento la expresión del ADN codificante de dicha molécula de factor VIII híbrido, o fragmento de la misma, con actividad coagulante, donde dicho ADN es el ADN de cualquiera de las reivindicaciones entre la 3 y la 10.

14. Un procedimiento para crear una composición farmacéutica para tratar pacientes que tienen deficiencia del factor VIII, comprendiendo ese procedimiento una molécula de factor VIII, o fragmento de la misma, de acuerdo con la reivindicación 12 o la 13, y formulando la misma en una composición farmacéutica, ya sea sola o en combinación con estabilizantes, vehículos liberadores y/o transportadores.

15. Un procedimiento para crear una proteína de acuerdo con las reivindicaciones 12 o 13, o un procedimiento para crear una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, donde la molécula de factor VIII, o fragmento de la misma, se expresa como una proteína de fusión a partir de una molécula recombinante en la cual una secuencia que codifica una proteína o péptido que mejora la estabilidad, la secreción, la detección o el aislamiento, es insertada en un sitio adyacente a la secuencia condificante del factor VIII.

16. El ADN de la reivindicación 11 donde la proteína no tiene el dominio B.