ES2238284T3 - Factor viii modificado. - Google Patents

Abstract

Un factor VIII humano modificado que comprende una sustitución de aminoácido en una o más posiciones que corresponde a las posiciones 490, 493, 498 y 504 de la SEC ID Nº 2, dicha sustitución siendo una inserción de un aminoácido que reduce la inmunorreactividad del aminoácido de origen natural, dicho factor VIII modificado que tiene actividad procoagulante.

Description

Factor VIII modificado.

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de la patente de Estados Unidos Nº 09/315.179 presentada el 20 de mayo de 1999.

Agradecimiento del soporte de investigación federal

El gobierno tiene derechos en esta invención que surge de los Institutos Nacionales de Salud concesión Nº HL46215 que parcialmente financió la investigación que conduce a esta invención.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere en general a un factor VIII híbrido que tiene secuencia de aminoácidos del factor VIII humano y animal o que tiene la secuencia de aminoácidos del factor VIII humano y no - factor VIII y los procedimientos de preparación y uso de los mismos.

La coagulación de la sangre comienza cuando las plaquetas se adhieren a la pared cortada de un vaso sanguíneo lesionado en un sitio de lesión. Consecuentemente, en una cascada de reacciones reguladas enzimáticamente, las moléculas de fibrinógeno solubles se convierten mediante la enzima trombina en hebras insolubles de fibrina que mantienen las plaquetas juntas en un trombo. En cada etapa en cascada, un precursor proteico se convierte en una proteasa que escinde el siguiente precursor proteico en la serie. Se requieren cofactores en la mayoría de las etapas.

El factor VIII circula como un precursor inactivo en sangre, unido estrechamente y no covalentemente al factor de von Willebrand. El factor VIII se activa proteolíticamente por la trombina o el factor Xa, que se disocia a partir del factor de von Willebrand y activa su función procoagulante en la cascada. En su forma activa, el factor proteico VIIIa es un cofactor que aumenta la eficacia catalítica del factor IXa hacia la activación del factor X en varios órdenes de magnitud.

Las personas con deficiencias en el factor VIII o anticuerpos contra el factor VIII que no se tratan con el factor VIII sufren hemorragias internas no controladas que pueden causar una serie de síntomas serios, a partir de reacciones inflamatorias en articulaciones hasta muerte temprana. Los hemofílicos graves, que alcanzan aproximadamente 10.000 en los Estados Unidos, se pueden tratar con infusión del factor VIII humano que reestablecerá la capacidad de coagulación normal de la sangre si se administra con suficiente frecuencia y concentración. La definición clásica del factor VIII, de hecho, es la sustancia presente en plasma sanguíneo normal que corrige el efecto de coagulación derivado de individuos con hemofilia A.

El desarrollo de anticuerpos ("inhibidores" o "anticuerpos inhibidores") que inhiben la actividad del factor VIII es una grave complicación en la dirección de pacientes con hemofilia. Los autoanticuerpos se desarrollan en aproximadamente el 20% de pacientes con hemofilia A en respuesta a infusiones terapéuticas del factor VIII. En pacientes con hemofilia A no tratados previamente que desarrollan inhibidores, el inhibidor usualmente se desarrolla en el transcurso de un año de tratamiento. Adicionalmente, los autoanticuerpos que inactivan el factor VIII ocasionalmente se desarrollan en individuos con niveles del factor VIII normales previamente. Si el título del inhibidor es suficientemente bajo, los pacientes se pueden dirigir incrementando las dosis del factor VIII. Sin embargo, a menudo el título del inhibidor es tan alto que no se puede doblegar por el factor VIII. Una estrategia alternativa es derivar la necesidad del factor VIII durante la hemostasis normal usando preparaciones complejas del factor IX (por ejemplo, KONYNE ®, Proplex ®) o factor VIIa. Adicionalmente, ya que el factor VIII porcino usualmente tiene sustancialmente menos reactividad con inhibidores que el factor VIII humano, se usa una preparación del factor VIII humano porcino parcialmente purificado (HYATE:C ®). Muchos pacientes que han desarrollado anticuerpos inhibidores al factor VIII humano de han tratado exitosamente con el factor VIII porcino y han tolerado tal tratamiento durante largos períodos de tiempo. Sin embargo, la administración del factor VIII porcino no es una solución completa debido a que los inhibidores pueden desarrollar el factor VIII porcino después de una o más infusiones.

Varias preparaciones de factor VIII derivado de plasma humano de grados variables de pureza están disponibles comercialmente para el tratamiento de hemofilia A. Éstos incluyen un factor VIII parcialmente purificado derivado de la sangre reunida de muchos dadores que se trata con calor y detergente para virus pero que contienen un nivel significativo de proteínas antigénicas; un factor VIII purificado del anticuerpo monoclonal que tiene niveles inferiores de impurezas antigénicas y contaminación viral; y factor VIII humano recombinante, ensayos clínicos para los que están en vías de ejecución. Desafortunadamente, el factor VIII humano es inestable a concentraciones fisiológicas y pH, está presente en sangre a una concentración extremadamente baja (0,2 \mug/ml de plasma), y tiene una actividad coaguladora específica baja.

Los hemofílicos requieren reemplazo diario del factor VIII para prevenir hemorragia y la artropatía hemofílica deformante resultante. Sin embargo, los suministros han sido inadecuados y se producen problemas en el uso terapéutico debido a la dificultad en el aislamiento y purificación., inmunogenicidad, y la necesidad de retirar el riesgo de infección por SIDA y hepatitis. El uso del factor VIII humano recombinante o factor VIII porcino parcialmente purificado no resolverá todos los problemas.

Los problemas asociados al factor VIII derivado de plasma, comúnmente usado, disponible comercialmente han estimulado el interés significativo en el desarrollo de un producto del factor VIII mejor. Existe una necesidad de una molécula de factor VIII más potente de manera que se pueda distribuir más actividad de coagulación por molécula; una molécula del factor VIII que es estable a un pH seleccionado y concentración fisiológica; una molécula del factor VIII que es menos apta para ocasionar la producción de anticuerpos inhibitorios; y una molécula del factor VIII que evada detección inmune en pacientes que han adquirido ya anticuerpos para el factor VIII humano.

Por lo tanto es un objeto de la presente invención proporcionar un factor VIII que corrige hemofilia en un paciente deficiente en el factor VIII o que tiene inhibidores para el factor VIII.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar procedimientos para el tratamiento de hemofílicos.

Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar un factor VIII que es estable a un pH seleccionado y concentración fisiológica.

Es todavía otro objeto de la presente invención proporcionar un factor VIII que tiene mayor actividad coagulante que el factor VIII humano.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un factor VIII contra el que se produce menos anticuerpo.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona moléculas del factor VIII híbrido, aislado, purificado y fragmentos del mismo con actividad coagulante que incluye el factor VIII híbrido que tiene la secuencia de aminoácidos del factor VIII derivado del hombre y cerdo u otro mamífero no humano (juntos denominados en esta memoria descriptiva como "animal"); o en una segunda realización incluyendo un factor VIII equivalente híbrido que tiene la secuencia de aminoácidos del factor VIII derivada del hombre o animal o ambos y se describe la secuencia de aminoácidos que no tiene identidad de secuencia conocida al factor VIII ("secuencia de aminoácidos del no factor VIII"), preferiblemente sustituida en una región antigénica y/o inmunogénica del factor VIII. Los expertos en la técnica se darán cuenta que se pueden preparar numerosas construcciones del factor VIII híbrido incluyendo, pero sin limitación, el factor VIII humano/animal que tiene mayor actividad coagulante que el factor VII humano ("actividad coagulante superior"); factor VIII no inmunogénico humano/equivalente; factor VIII no antigénico humano/equivalente o humano/animal; factor VIII no inmunogénico humano/animal o humano/equivalente que tiene actividad coagulante superior; factor VIII no antigénico humano/animal o humano/animal/equivalente que tiene actividad coagulante superior; factor VIII no inmunogénico, no antigénico humano/equivalente o humano/equivalente/animal; y factor VIII no inmunogénico, no antigénico humano/animal/equivalente que tiene una actividad coagulante superior.

La molécula del factor III híbrido se produce mediante aislamiento y recombinación de subunidades o dominios del factor VIII humano y animal; o mediante ingeniería genética del factor VIII humano y animal.

En una realización preferida, se usan procedimientos de ADN recombinante para sustituir elementos del factor VIII animal por los correspondientes elementos del factor VIII humano, que dan como resultado moléculas del factor VIII híbrido humano/animal. En una segunda realización preferida, se usan procedimientos de ADN recombinante para reemplazar uno o más aminoácidos en el factor VIII humano o animal o en un factor VIII híbrido humano/animal con aminoácidos que no tienen identidad de secuencia conocida al factor VIII, preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene menos inmunorreactividad con anticuerpos inhibidores de origen natural para el factor VIII ("secuencian de aminoácidos no antigénica") y/o es menos apta para mostrar la producción de anticuerpos para el factor VIII ("secuencia de aminoácidos no inmunogénica") que el factor VIII humano. Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos que se puede usar para reemplazar la secuencia inmunogénica o antigénica es una secuencia de residuos de alanina.

En otra realización, se aíslan y purifican subunidades del factor VIII del plasma humano o animal, y se produce el factor VIII humano/animal bien mediante mezcla de subunidades de cadena pesada de animal con subunidades de cadena ligeras humana o mediante la mezcla de subunidades de cadena pesada humana con subunidades de cadena ligera animal, por lo tanto produciendo moléculas híbridas de cadena ligera humana/cadena pesada animales y cadena pesada humana/cadena ligera animal. Estas moléculas híbridas se aíslan mediante cromatografía de intercambio iónico.

Como alternativa, uno o más dominios o dominios parciales del factor VIII se aíslan y se purifican a partir de plasma humano o animal, y el factor VIII híbrido humano/animal se produce mediante la mezcla de dominios o dominios parciales a partir de una especie con dominios o dominios parciales de la segunda especie. Las moléculas híbridas se pueden aislar mediante cromatografía de intercambio iónico.

Los procedimientos para preparar el factor VIII híbrido altamente purificado se describen teniendo las etapas de: (a) aislamiento de subunidades del factor VIII humano derivado de plasma y subunidades del factor VIII animal derivado de plasma, seguido de la reconstitución de la actividad coagulante mediante la mezcla de subunidades humanas y animales, seguida del aislamiento del factor VIII humano/animal mediante cromatografía de intercambio iónico; (b) aislamiento de dominios o dominios parciales del factor VIII humano derivado de plasma y dominios o dominios parciales del factor VIII animal derivado de plasma, seguido de la reconstitución de la actividad coagulante mediante la mezcla de dominios humanos y animales, seguido del aislamiento del factor VIII humano/animal híbrido mediante cromatografía de intercambio iónico; (c) construcción de dominios o dominios parciales del factor VIII animal mediante tecnología de ADN recombinante, e intercambio recombinante de dominios del factor VIII animal y humano para producir el factor VIII híbrido humano/animal con actividad coagulante; (d) creación del factor VIII híbrido humano/animal mediante reemplazo de residuos de aminoácidos específicos del factor VIII de una especie con los correspondientes residuos de aminoácidos únicos del factor VIII de la otra especie; o (e) creación de una molécula del factor VIII equivalente híbrido que tiene una secuencia de aminoácidos animal o humana o ambas, en la que los residuos de aminoácidos específicos del factor VIII se reemplazan con residuos de aminoácidos que no tienen identidad de secuencia conocida al factor VIII mediante mutagénesis dirigida al sitio.

La determinación de la secuencia de ADN entera que codifica el factor VIII porcino expuesta en esta memoria descriptiva ha permitido, por primera vez, la síntesis del factor VIII porcino de longitud completa mediante la expresión del ADN que codifica el factor VIII porcino en una célula hospedadora adecuada. El factor VIII porcino recombinante purificado es por lo tanto un aspecto de la presente invención. El ADN que codifica cada dominio del factor VIII porcino así como cualquier fragmento específico del mismo, se puede expresar de manera similar, bien por sí mismo o en combinación con el ADN que codifica el factor VIII humano para preparar el factor VIII híbrido humano/porcino descrito en esta memoria descriptiva. Además, el fVIII porcino que tiene todo o parte del domino B suprimido (fVIII porcino sin dominio B) se hace disponible como parte de la presente invención, mediante expresión del ADN que codifica el fVIUII porcino que tiene una supresión de uno o más codones del domino B.

Algunas realizaciones del factor VIII híbrido o equivalente híbrido tienen actividad específica mayor que la del factor VIII humano e igual o mayor que la del factor VIII porcino. Algunas realizaciones del factor VIII híbrido o equivalente híbrido tienen igual o menos inmunorreactividad con anticuerpos inhibidores para el factor VIII y/o menos inmunogenicidad en seres humanos o animales, comparada con el factor VIII humano o porcino.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas y procedimientos para tratar pacientes que tienen deficiencia del factor VIII que comprende la administración del factor VIII híbrido o equivalente híbrido.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A - 1H tomadas juntas proporcionan una comparación de secuencias alineadas de las secuencias ácidas del factor VIII humano, de cerdo y de ratón.

Breve descripción de la invención

Salvo que se especifique o se indique otra cosa, como se usa en esta memoria descriptiva, "factor VIII" significa cualquier molécula proteica del factor VIII funcional de cualquier animal, cualquier factor VIII híbrido o factor VIII modificado, "factor VIII híbrido" o "proteína híbrida" significa cualquier molécula proteica del factor VIII funcional o fragmento del mismo que comprende la secuencia de aminoácidos del factor VIII de especies humanas, porcinas, y/o no humanos, de mamíferos no porcinos. Tales combinaciones incluyen, pero no se limitan a, cualquiera o todas las moléculas del factor VIII híbrido siguiente o fragmentos de las mismas: (1) humano/porcino; (2) humano/no humano, de mamífero no porcino, tal como humano/ratón, mamífero (3) porcino/no humano, de mamífero no porcino, tal como ratón/perro. Tales combinaciones también incluyen moléculas equivalentes del factor VIII híbrido o fragmentos de las mismas, como se definen adicionalmente más adelante, comprendiendo una secuencia de aminoácidos del factor VIII de origen híbrido, humano, porcino, o no humano, de mamífero no porcino en la que se sustituye la secuencia de aminoácidos que no tiene identidad de secuencia conocida al factor VIII. Tales combinaciones híbridas también incluyen secuencia amino del factor VIII híbrido derivada de más de dos especies, tales como humano/cerdo/ratón, o de dos o más especies en la que se sustituye la secuencia de aminoácidos que no tiene identidad de secuencia conocida al factor VIII. Salvo que se indique otra cosa, "factor VIII híbrido" incluye fragmentos del factor VIII híbrido, que se puede usar, como se describe más adelante en una realización ejemplar, como sondas para propósitos de investigación o como reactivos de diagnóstico.

Como se usa en esta memoria descriptiva, "factor VIII de mamíferos" incluye el factor VIII con secuencia de aminoácido derivada de cualquier mamífero no humano, salvo que se especifique otra cosa. "Animal", como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a cerdo y otros mamíferos no humanos.

Una "proteína de fusión" o "fragmento VIII de fusión o fragmento del mismo", como se usa en esta memoria descriptiva, es el producto de un gen híbrido en el que la secuencia codificadora para una proteína se altera extensivamente, por ejemplo, fusionando parte de ella a la secuencia codificadora de una segunda proteína de un gen diferente para producir un gen híbrido que codifica la proteína de fusión. Como se usa en esta memoria descriptiva, una proteína de fusión es un subconjunto de la proteína del factor VIII híbrido descrita en esta solicitud.

Un ácido nucleico o aminoácido o secuencia "correspondiente" de bien, como se usa en esta memoria descriptiva, se presenta en un sitio en una molécula de factor VIII o de factor VIII híbrido o fragmento del mismo que tiene la misma estructura y/o función como un sitio en la molécula del factor VIII de otra especie, aunque el número de ácido nucleico o aminoácido puede no ser idéntico. Una secuencia "correspondiente a" otra secuencia del factor VIII sustancialmente corresponde a tal secuencia, y se hibrida a la secuencia de la SEC ID Nº designada en condiciones rigurosas. Una secuencia "correspondeinte a" otra secuencia del factor VIII también incluye una secuencia que da como resultado la expresión de un factor VIII o factor VIII híbrido procoagulante reivindicado o fragmento del mismo y se hibridaría a la SEC ID Nº designada, excepto por la redundancia del código genético.

Un residuo de aminoácidos o secuencia "única" como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a una secuencia o residuo de aminoácidos en la molécula del factor VIII de una especie que es diferente del residuo o secuencia homóloga en la molécula del factor VIII de otra especie.

"Actividad específica", como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a la actividad que corregirá el defecto de coagulación del plasma deficiente del factor VIII. La actividad específica se mide en unidades de actividad de coagulación por miligramo de proteína del factor VIII total en un ensayo convencional en el que el tiempo de coagulación del plasma deficiente en factor VIII humano se compara con el del plasma humano normal. Una unidad de actividad del factor VIII es la actividad presente en un mililitro de plasma normal humano. En el ensayo, cuanto más corto es el tiempo de formación de coágulo, mayor es la actividad del factor VIII que se está ensayando. El factor VIII híbrido humano/porcino tiene actividad de coagulación en un ensayo de factor VIII. Esta actividad, así como la de otras moléculas de factor VIII híbrido o híbrido equivalente o fragmentos de las mismas, pueden ser menos que, igual a, o mayor que la de cualquier factor VIII humano derivado de plasma o recombinante.

Las secuencias de nucleótidos del ADNc del factor VIII humano y de aminoácidos predichas se muestran en las SEC ID Números 1 y 2, respectivamente. El factor VIII se sintetiza como una proteína de cadena sencilla de 300 kDa con homología de secuencias internas que define la secuencia del "dominio" NH_{2} - A1 - A2 - B - A3 - Cl - C1 - C2 - COOH. En una molécula del factor VIII, un "dominio", como se usa en esta memoria descriptiva, es una secuencia continua de aminoácidos que se define mediante la identidad de la secuencia de aminoácidos interna y sitios de escisión proteolítica por trombina. Salvo que se especifique otra cosa, los dominios del factor VIII incluyen los siguientes residuos de aminoácidos, cuando las secuencias se alinean con la secuencia de aminoácidos humana (SEC ID Nº: 2): A1, residuos Ala 1 - Arg 372; A2, residuos Ser 373 - Arg 740; B, residuos Ser 741 - Arg 1648; A3, residuos Ser 1690 - Ile 2032; C1, residuos Arg 2033 - Asn 2172; C2, residuos Ser 2173 - Tyr 2332. La secuencia A3 - C1 - C2 incluye los residuos Ser 1690 - Tyr 2332. La secuencia restante, residuos Glu 1649 - Arg 1689, usualmente se refiere como el péptido de activación de la cadena ligera del factor VIII. El factor VIII se activa proteolíticamente por la trombian o factor Xa, que la disocia del factor de von Willebrand, formando el factor VIIIa, que tiene función procoagulante. La función biológica del factor VIIIa es incrementar la eficacia catalítica del factor IXa hacia la activación del factor X en varios órdenes de magnitud. El factor VIIIa activado por trombina es un heterotrímero de 160 kDa A1/A2/A3 - C1 - C2 que forma un complejo con el factor IXa y factor X sobre la superficie de las plaquetas o monocitos. Un "dominio parcial" como se usa en esta memoria descriptiva, es una secuencia continua de aminoácidos que forman parte de un dominio.

"Subunidades" del factor VIII humano o animal, como se usa en esta memoria descriptiva, son las cadenas pesada y ligera de la proteína. La cadena pesada del factor VIII contiene tres dominios, A1, A2, y B. La cadena ligera del factor VIII también contiene tres dominios A3, C1, y C2.

El factor VIII híbrido o fragmento del mismo se puede preparar (1) mediante sustitución de subunidades aisladas, derivadas de plasma o subunidades humanas (cadenas ligera o pesada) para subunidades humanas o subunidades animales correspondientes; (2) mediante sustitución de dominios humanos o dominios animales (A1, A2, A3, B, C1, y C2) para los dominios animales correspondientes o dominios humanos; (3) mediante sustitución de partes de dominios humanos o dominios animales para partes o dominios animales o dominios humanos; (4) mediante sustitución de al menos una secuencia específica que incluye uno o más aminoácido(s) humano(s) o animal(es) único(s) para el(los) correspondiente(s) aminoácido(s) animal(es) o humano(s); o (5) mediante la sustitución de la secuencia de aminoácidos que no tiene identidad de secuencia conocida al factor VIII para al menos una secuencia que incluye uno o más residuo(s) de aminoácido(s) específico(s) en el factor VIII humano, animal, o híbrido o los fragmentos del mismo. Un factor VIII híbrido "sin dominio B", factor VIII híbrido equivalente, o fragmento de cualquiera, como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a una de las construcciones del factor VIII híbrido descritas en esta memoria descriptiva que carece del dominio B, o una porción del mismo.

Los términos "epítopo", "sitio antigénico", y "determinante antigénico", como se usa en esta memoria descriptiva, se usan de manera sinónima y se definen como una porción del factor VIII humano, animal, híbrido, o equivalente híbrido o fragmento del mismo que se reconoce específicamente por un anticuerpo. Puede estar constituido por cualquier número de residuos de aminoácidos, y puede ser dependiente de la estructura primaria, secundaria y terciaria de la proteína. De acuerdo con esta descripción, un factor VIII híbrido, equivalente del factor VIII híbrido, o fragmento de cualquiera que incluye al menos un epítope se puede usar como reactivo en los ensayos de diagnósticos descritos más adelantes. En algunas realizaciones, el factor VIII híbrido o equivalente híbrido o fragmento del mismo no es de reactividad cruzada o o es de menos reactividad cruzada con todos los anticuerpos del factor VIII inhibidores de origen natural que el factor VIII humano o porcino.

El término "sitio inmunogénico", como se usa en esta memoria descriptiva se define como una región del factor VIII humano o animal, factor VIII híbrido o equivalente híbrido, o fragmento del mismo que específicamente muestra la producción del anticuerpo al factor VIII, híbrido equivalente híbrido, o fragmento en un ser humano o animal, según se mide mediante protocolos rutinarios, tal como inmunoensayo, por ejemplo ELISA, o el ensayo Bethesda, descrito en esta memoria descriptiva. Puede consistir en cualquier número de aminoácidos, y puede depender de la estructura primaria, secundaria, o terciaria de la proteína. En algunas realizaciones, el factor VIII híbrido o equivalente híbrido o fragmento del mismo es no inmunogénico o menos inmunogénico en un animal o humano que el factor VIII humano o porcino.

Como se usa en esta memoria descriptiva, "una molécula equivalente del factor VIII híbrido o fragmento del mismo" o "factor VIIII equivalente híbrido o fragmento del mismo" es un factor VIII activo o molécula del factor VIII híbrido o fragmento del mismo que comprende al menos una secuencia que incluye uno o más residuos de aminoácidos que no tienen identidad conocida a la secuencia del factor VIII humano o animal sustituida por al menos una secuencia que incluye uno o más residuos de aminoácidos específicos en el factor VIII humano, animal, o híbrido o fragmento del mismo. La secuencia de uno o más residuos de aminoácidos que no tienen identidad conocida a la secuencia del factor VIII humano o animal también se denomina en esta memoria descriptiva "secuencia de aminoácidos del no factor VIII". En una realización preferida, el(los) aminoácido(s) que no tiene(n) identidad de secuencia conocida a la secuencia del factor VIII son residuos alanina. En otra realización preferida, la secuencia del factor VIII específico para la que el(los) aminoácido(s) que no tiene(n) identidad de secuencia conocida a la secuencia del factor VIII están sustituidas e incluye un sitio antigénico que es inmunorreactivo con anticuerpos inhibidores del factor VIII de origen natural, de manera que la molécula equivalente del factor VIII híbrido resultante o fragmento del mismo es menos inmunorreactivo o no inmunortreactivo con anticuerpos inhibidores del factor VIII. Todavía en otra realización preferida, la secuencia del factor VIII híbrido específico para la que el(los) aminoácido(s) que no tiene(n) identidad de secuencia conocida a la secuencia del factor VIII están sustituidas e incluye un sitio inmunogénico que muestra la formación de los anticuerpos inhibidores del factor VIII en un animal o ser humano, de manera que la molécula equivalente del factor VIII híbrido resultante o fragmento del mismo es menos inmuno-
génica.

"Deficiencia del factor VIII", como se usa en esta memoria descriptiva, incluye deficiencia en actividad coagulante producida por la producción del factor VIII defectuoso, mediante producción inadecuada o no producción del factor VIII, o mediante inhibición parcial o total del factor VIII por inhibidores. La hemofilia A es un tipo de deficiencia del factor VIII que se produce de un defecto en un gen unido a X y codifica la ausencia o deficiencia de la proteína del factor VIII.

Como se usa en esta memoria descriptiva, "ensayos diagnósticos" incluyen ensayos que de alguna manera utilizan la interacción antígeno - anticuerpo para detectar y/o cuantifican la cantidad de un anticuerpo particular que está presente en una muestra de ensayo para ayudar en la selección de terapias médicas. Existen muchos de tales ensayos conocidos por los expertos en la técnica. Sin embargo, como se usa en esta memoria descriptiva el ADN del factor VIII híbrido o equivalente híbrido o fragmento del mismo y la proteína expresada del mismo, en conjunto o en parte, se puede sustituir por los reactivos correspondiente en los ensayos conocidos de otra manera, mediante la cual los ensayos modificados se pueden usar para detectar y/o cuantificar anticuerpos para el factor VIII. El uso de estos reactivos, el ADN del factor VIII híbrido o equivalente híbrido o fragmento del mismo o proteína expresada del mismo, que permite modificación de ensayos conocidos para detección de anticuerpos al factor VIII humano animal o al factor VIII híbrido humano/animal. Tales ensayos incluyen, pero no se limitan a ELISA, ensayos de inmunodefición, e inmunotransferencia. Los procedimientos adecuados para practicar cualquiera de estos ensayos los conocen los expertos en la técnica. Como se usa en esta memoria descriptiva, el factor VIII híbrido o equivalente híbrido o fragmento del mismo que incluye al menos un epítope de la proteína se puede usar como el reactivo de diagnóstico. Los ejemplos de los otros ensayos en los que el factor VIII híbrido o equivalente híbrido o fragmento del mismo se puede usar incluyen el ensayo de Bethesda y ensayos de anticoagula-
ción.

El "producto de expresión" de un ADN que codifica un factor VIII humano o animal o un factor VIII híbrido humano/animal o un factor VIII modificado es el producto obtenido a partir de la expresión del ADN referenciado en una célula hospedadora adecuada, que incluye tales características de modificación pre - o post - traduccional de proteína codificada por el ADN de referencia, incluyendo, pero sin limitación, glucosilación, escisión proteolítica y similares. Se sabe en la técnica que tales modificaciones se pueden producir y pueden diferir en algo dependiendo del tipo de célula hospedadora y otros factores, y puede dar como resultado isoformas moleculares del producto, con retención de actividad procoagulantye. Véase, por ejemplo, Lind, P. y col., Eur. J. Biochem. 232: 1927 (1995) incorporado en esta memoria descriptiva como referencia.

Aminoácidos "reductores de inmunorreactividad" se definen en esta memoria descriptiva como aquellos aminoácidos que son contribuidores menores, si en todo, a la energía de enlace de un par antígeno - anticuerpo. Los ejemplos no limitantes de algunos aminoácidos conocidos que son reductores de inmunorreactividad incluyen alanina, metionina, leucina, serina y glicina. Se entenderá que la reducción de inmunorreactividad alcanzable por una sustitución de aminoácidos dada en un par antígeno - anticuerpo también dependerá de cualquier efecto que la sustitución pueda tener en una conformación proteica, accesibilidad de epítopes y similares.

Descripción general de procedimientos

El documento de Estados Unidos nº de serie 07/864.004 describió el descubrimiento de moléculas del factor VIII híbrido humano/porcino que tienen actividad coagulante, en la cual se sustituyen elementos de la molécula del factor VIII de ser humano o de cerdo por los elementos correspondientes de la molécula del factor VIII de las otras especies. El documento de Estados Unidos nº de serie 08/212.133 y el documento PCT/US94/13200 describen moléculas del factor VIII híbrido humano/animal e híbrido equivalente, en los que los que los elementos de la molécula del factor VIII de una especie se sustituyen por los elementos correspondientes de la molécula del factor VIIII de la otra especie.

La presente invención proporciona moléculas del factor VIII híbrido humano/animal, animal/animal, y equivalente, moléculas del factor VIII modificado y fragmentos del mismo, y las secuencias de ácido nucleico que codifican tales híbridos y moléculas del factor VIII modificado, algunas de las cuales tienen actividad coagulante mayor en un ensayo de coagulación habitual cuando se compara con el factor VIII humano altamente purificado; y/o son menos inmunorreactivos a anticuerpos inhibidores al factor VIIII humano o porcino o factor VIII porcino; y/o menos inmunogénicos en un factor VIIII humano o animal que humano o porcino; y/o tienen otras propiedades terapéuticamente útiles. Estas moléculas del factor VIII híbrido y/o modificado se pueden construir como sigue:

Al menos cinco tipos de moléculas del factor VIII activo híbrido humano/porcino o equivalente híbrido o fragmentos del mismo, las secuencias de ácido nucleico que codifican estas moléculas del factor VIII híbrido, y los procedimientos para prepararlas se describen en esta memoria descriptiva: los obtenidos (1) sustituyendo una subunidad humana o porcina (es decir, cadena pesada o cadena ligera) por la subunidad correspondiente porcina o humana; (2) sustituyendo uno o más dominios humanos o porcinos (es decir, A1, A2, A3, B, C1, y C2) para el(los) dominio(s) porcino(s) o humano(s) correspondiente(s); (3) sustituyendo una parte continua de uno o más dominio(s) por la parte correspondiente de uno o más dominio(s) porcino(s) o humano(s); (4) sustituyendo al menos una secuencia específica que incluye uno o más residuo(s) de aminoácido(s) único(s) en el factor VIII humano o porcino por la correspondiente secuencia porcina o humana; y (5) sustituyendo al menos una secuencia que incluye uno o más residuo(s) que no tienen identidad de secuencia conocida con el factor VIII ("secuencia de aminoácidos del no factor VIII") por al menos una secuencia específica de uno o más aminoácidos en el factor VIII humano, porcino, o híbrido humano/porcino. Moléculas del factor VIII modificado tienen uno o más reemplazos de aminoácidos en posiciones específicas.

Al menos cinco tipos de moléculas del factor VIII activo humano/no humano híbrido, de mamífero no porcino o equivalente híbrido o fragmentos del mismo, y las secuencias de ácido nucleico que las codifican, también se pueden preparar mediante los mismos procedimientos. los obtenidos (1) sustituyendo una subunidad humana o no humana, de mamífero no porcino (es decir, cadena pesada o cadena ligera) por la subunidad no humana, de mamífero no porcino o humana correspondiente; (2) sustituyendo uno o más dominio(s) humano(s) o no humano(s), de
mamífero(s) no porcino(s) (es decir, (es decir, A1, A2, A3, B, C1, y C2) por el(los) dominio(s) no humano(s), de mamífero no porcino(s) o humano(s) correspondiente(s); (3) sustituyendo una parte continua de uno o más domi-
nio(s) humano(s) o no humano(s), de mamífero(s) no porcino(s) por la parte correspondiente de uno o más do-
minio(s) no humano(s), de mamífero no porcino(s) o humano(s); (4) sustituyendo al menos una secuencia específica que incluye uno o más residuo(s) de aminoácidos en el factor VIII humano o no humano, de mamífero no porcino por la secuencia no humana, de mamífero no porcino o humana correspondiente; y (5) sustituyendo al menos una secuencia que incluye uno o más residuo(s) de aminoácidos que no tiene identidad de secuencia conocida con el factor VIII ("secuencias de aminoácidos del no factor VIII") por al menos una secuencia específica de uno o más aminoácidos en el factor VIII humano, no humano, de mamífero no porcino, o híbrido humano/no humano, de mamífero no porcino. Los reemplazos de aminoácidos individuales se pueden obtener mediante mutagénesis dirigida al sitio del segmento correspondiente de ADN codificador.

Adicionalmente, los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que se pueden usar los mismos procedimientos para preparar al menos cinco tipos de moléculas del factor VIII híbrido activo o fragmentos del mismo, correspondientes a los tipos (1) - (5) en los dos párrafos anteriores, que comprenden la secuencia de aminoácidos del factor VIII de dos o más mamíferos no humanos, tales como porcino/ratón, y adicionalmente comprendiendo la secuencia de aminoácidos del no factor VIII.

Las proteínas del factor VIII híbrido humano/animal, animal/animal, y equivalente o fragmentos de los mismos listados anteriormente en los grupos (1) - (3) se preparan mediante aislamiento de subunidades, dominios, o partes continuas de dominios del factor VIII derivado de plasma, seguido de reconstitución y purificación. Las proteínas del factor VIII híbrido humano/animal, animal/animal, y equivalente o fragmentos del mismo descritas en los grupos (3) - (5) anteriormente se preparan mediante procedimientos de ADN recombinante. La molécula híbrida puede contener un porcentaje mayor o menor de secuencia humana que animal, dependiendo del origen de las diversas regiones, como se describe en más detalle más adelante.

Ya que la información actual indica que el dominio B no tiene epítope inhibidor y no tiene efecto conocido sobre la función del factor VIII, en algunas realizaciones el domino B se suprime en las moléculas del factor VIII híbrido activo o equivalente híbrido o fragmentos del mismo ("factor B (-)") preparadas mediante cualquiera de los procedimientos descritos en estas memoria descriptiva.

En el ejemplo 4 se muestra que en el factor VIII híbrido humano/porcino que comprende cadena pesada porcina y cadena ligera humana y correspondiente al primer tipo de híbrido listado anteriormente tiene mayor actividad coagulante específico en un ensayo de coagulación habitual comparada con el factor VIII humano. El factor VIII híbrido humano/animal o equivalente con actividad coagulante, si la actividad es mayor, igual a, o menor que la del factor VIII humano, puede ser útil en el tratamiento de pacientes con inhibidores, ya que estos inhibidores pueden reaccionar menos con el factor VIII híbrido humano/animal o equivalente que con cualquier factor VIII humano o porcino.

Preparación de moléculas del factor VIII híbrido de subunidades del factor VIII humano y animal aisladas mediante reconstitución

La presente invención proporciona moléculas del factor VIII híbrido humano/animal o fragmentos del mismo, con sustituciones de subunidades, las secuencias de ácido nucleico que codifican estos híbridos, procedimientos para preparar y aislarlas, y procedimientos para caracterizar su actividad procoagulante. Un procedimiento, modificado a partir de los procedimientos reseñados por Fay, P. J. y col. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6197; y Lollar, J. S. y col., (1988) J. Biol. Chem. 263: 10451, implica el aislamiento de subunidades (cadenas pesada y ligera) del factor VIII humano y animal, seguido de recombinación de cadena pesada humana y cadena ligera animal o mediante recombinación de cadena ligera humana y cadena pesada animal.

El aislamiento de subunidades individuales humanas y animales implica disociación del dímero cadena ligera/cadena pesada. Esto de logra, por ejemplo, mediante quelación de calcio con ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA), seguido de monoS™ HPLC (Pharmacia - LKB, Pisacataway, NJ). Las moléculas del factor VIII híbrido humano/animal se reconstituyen a partir de subuniddes aisladas en presencia de calcio. El factor VIII híbrido de cadena ligera humana/cadena pesada animal o cadena ligera animal/cadena pesada humana se aísla a partir de cadenas pesadas sin reaccionar mediante monoS™ HPLC mediante procedimientos para el aislamiento del factor VIII porcino, tal como describen Lollar, J. S. y col., (1988) Blood 71: 137 - 143.

Estos procedimientos, usados en una realización para preparar el factor VIII híbrido humano/porcino, descritos en detalle en los ejemplos más adelante, dan como resultado moléculas híbridas de cadena ligera humana/cadena pesada porcina con la actividad procoagulante del factor VIII humano seis veces mayor.

Otras moléculas del factor VIII híbrido humano/no humano, de mamífero no porcino se pueden preparar, aislar, y caracterizar para evaluar la actividad mediante los mismos procedimientos. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que estos procedimientos se pueden usar para preparar, aislar, y caracterizar para evaluar la actividad del factor VIII híbrido animal/animal, tal como porcino/ratón, que comprende la cadena ligera o pesada de una especie se combina con la cadena pesada o ligera de la otra especie.

Preparación de moléculas del factor VIII híbrido a partir de dominios del factor VIII humano y animal mediante reconstitución

La presente invención proporciona moléculas del factor VIII híbrido humano/animal o fragmentos del mismo con sustituciones de dominio, las secuencias de ácido nucleico que codifican las codifican, procedimientos para preparar y aislarlas, y procedimientos para caracterizar su actividad procoagulante. Un procedimiento implica el aislamiento de uno o más dominios de ser humano y uno o más dominios del factor VIII animal, seguido de la recombinación de dominios humanos y animales para formar el factor VIII híbrido humano/animal con actividad coagulante, como describen Lollar, P. y col., (25 de noviembre de 1992) J. Biol. Chem. 267 (33): 23652 - 23657, para el factor híbrido humano/porcino.

Específicamente se proporciona un factor VIII híbrido humano/porcino con sustitución del domino A2 porcino para el dominio A2 humano, dicha realización ilustra un procedimiento mediante el cual el factor VIII híbrido humano/no humano dominio - sustituido, de mamífero no porcino se puede construir. Se aíslan dímeros, no humanos derivados de plasma, de mamífero no porcino y A1/A3 - C1 - C2 humanos mediante disociación del dominio A2 a partir del factor VIIIa. Esto se logra, por ejemplo, en presencia de NaOH, después de lo cual la mezcla se diluye y el dímero se eluye usando monoS™ HPLC (Pharmacia - LKB, Pisacataway, NJ). El dominio A2 se aísla a partir del factor VIIIa como un componente menor en la monoS™ HPLC. Las moléculas del factor VIII híbrido humano/animal se reconstituyen mezclando volúmenes iguales del dominio A2 de una especie y el dímero A1/A3 - C1 - C2 de la otra especie.

El factor VIII híbrido humano/animal o los fragmentos del mismo con una o más sustituciones en el dominio se aísla a partir de la mezcla de dímeros sin reaccionar y A2 mediante monoS™ HPLC mediante procedimientos para el aislamiento del factor porcino VIII, como describen Lollar, J. S. y col., (1988) Blood 71: 137 - 143. Se pueden usar procedimientos rutinarios para preparar y aislar los dominios A1, A3, C1, C2, y B del factor VIII de una especie, uno cualquiera o más de los cuales se puede sustituir por el correspondiente dominio en el factor VIII de la otra especie. Los expertos en al técnica reconocerán fácilmente que estos procedimientos se pueden usar para preparar, aislar, y caracterizar para evaluar la actividad del factor VIII híbrido animal/animal dominio - sustituido, tal como porcino/ratón.

Estos procedimientos, descritos en detalle en los ejemplos más adelante, dan como resultado moléculas del factor VIII con actividad procaogulante.

Preparación de moléculas del factor VIII híbrido mediante ingeniería recombinante de las secuencias que codifican subunidades del factor VIII humano, animal e híbrido, o partes de dominios Substitución de subunidades, dominios, partes continuas de dominios

La presente invención proporciona moléculas del factor VIII activas, híbrido humano/animal recombinante y equivalente híbrido y fragmentos de las mismas con sustituciones de subunidades, dominios, y aminoácidos, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican estos híbridos, procedimientos para preparar y aislarlos, y procedimientos para caracterizar sus propiedades coagulantes, inmunorreactivas, e inmunogénicas.

El gen del factor VIII humano se aisló y expresó en células de mamíferos, como indican Toole, J. J. y col., Nature 312: 342 - 347 (Genetics Institute): Gitschier, J. y col., (1984); Nature 312: 326 - 330 (Genentech) Wood, W. I. y col., (1984) Nature 312: 330 - 337 (Genentech): Vehar, G. A. y col., (1984); Nature 312: 337 - 342 (Genentech); documentos 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; patente de Estados Unidos nº 4.757.006, y la secuencia de aminoácidos se dedujo de ADNc, La patente de Estados Unidos Nº 4.965.199 de Capon y col., describe un procedimiento de ADN recombinante para producir el factor VIII en células hospedadoras de mamíferos y purificación del factor VIII. Se ha reseñado la expresión del factor VIII sobre células de CHO (ovario de hámster chino) y BHKC (células de riñón de cría de hámster). El factor VIII humano se ha modificado para suprimir parte o todo el dominio B (patente de Estados Unidos 4.868.112), y se ha intentado el reemplazo del dominio B del factor VIII humano con el dominio B del factor V humano (patente de Estados Unidos nº 5.004.803). La secuencia de ADNc que codifica el factor VIII humano y la secuencia de aminoácidos predicha se muestran en las SEC ID números 1 y 2 respectivamente. En la SEC ID Nº 1, la región codificadora comienza en el nucleótido en posición 208, el triplete GCC siendo el codón para el aminoácido número 1 (Ala) como se proporciona en la SEC ID Nº 2.

El factor VIII porcino se ha aislado y purificado a partir de plasma [Fass, D. N. (1982) Blood 59: 594]. La secuencia de aminoácidos parcial del factor VIII porcino correspondientes a porciones de la secuencia de la cadena ligera N-terminal que tiene homología con ceruloplasmina y factor de coagulación V y localizada incorrectamente en gran medida la describen Church y col., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6934. Toole, J. J. y col., Nature 312: 342 - 347 describieron la secuenciación parcial del extremo N-terminal de cuatro fragmentos de aminoácidos del factor VIII porcino pero no caracterizaron los fragmentos por sus posiciones en la molécula del factor VIII. La secuencia de aminoácidos del B y de la parte de los dominios A2 del factor VIII porcino los reseñaron Toole, J. J. y col., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 83: 5939 - 5942. La secuencia de ADNc que codifica el dominio completo A2 del factor VIII porcino y secuencia predicha de aminoácidos y factor VIII híbrido humano/porcino que tienen sustituciones de todos los dominios, todas las subunidades, y secuencias de aminoácidos específicas se describieron en el documento de Estados Unidos nº de serie 07/864.000 titulado "Hybrid Human/Porcine factor VIII" presentado el 7 de abril de 1992 por John S. Lollar y Marschall S. Runge, que se expidió como patente de Estados Unidos nº 5.364.771 el 15 de noviembre de 1994 y en el documento WO 93/20093. La secuencia de ADNc que codifica el dominio A2 del factor VIII porcino que tiene identidad de secuencia a los residuos 373 - 740 en el factor VIII humano maduro, como se muestra en al SEC ID Nº 1, y la secuencia de aminoácidos predicha se muestra en las SEC ID números 3 y 4, respectivamente. Más recientemente, el nucleótido y las secuencias de aminoácidos correspondientes de los dominios A1 y A2 del factor VIII porcino y un factor VIII quimérico con los dominios A1 y/o A2 porcinos sustituidos con los dominios humanos correspondientes se indican en el documento WO 94/11503. La secuencia de nucleótidos entera que codifica el factor VIII porcino, que incluye el dominio A1 completo, péptido de activación, dominios A3, C1 y C2, así como la secuencia de aminoácidos codificada, se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.859.204, expedida el 12 de enero de 1999.

Tanto el factor VIII porcino como humano se aíslan a partir de plasma en forma de una proteína de dos subunidades. Las subunidades, conocidas como cadena pesada y cadena ligera, se mantienen juntas mediante un enlace no covalente que requiere calcio u otros metales iónicos divalentes. La cadena pesada del factor VIII contiene tres dominios A1, A2, y B, que están unidos covalentemente. La cadena ligara del factor VIII también contiene tres dominios, designados A3, C1, y C2. El dominio B no tiene ninguna función biológica conocida y se puede eliminar, o eliminar parcialmente a partir de la molécula proteolíticamente o mediante procedimientos de la tecnología de ADN recombinante sin alteración significativa de ningún parámetro medible del factor VIII. El factor VIII recombinante humano tiene una estructura y función similar a la del factor VIII derivado de plasma, aunque no está glicosilado salvo que se exprese en células de mamíferos.

Tanto el factor VIII activado humano como porcino ("factor VIIIa") tiene tres subunidades de debidas a la escisión de la cadena pesada entre los dominios A1 y A2. Esta estructura se denomina A1/A2A3-C1-C2. El factor VIIIa humano no es estable en las condiciones que estabilizan el factor VIIIa porcino, presumiblemente debido a la débil asociación de la subunidad A2 del factor VIIIa humano. La disociación de la subunidad A2 del factor VIIIa humano y porcino se asocia a la pérdida de actividad en al molécula del factor VIIIa. Yakhyaev, A. y col., (1997) Blood 90: suppl. 1, Abstract. nº 126, reseñaron la unión del dominio A2 mediante la proteína relacionada con el receptor de la lipoproteína de baja densidad, que sugiere la captación celular de A2 mediada por tal unión actúa para regular hacia a bajo la actividad del factor VIII.

Proporcionada específicamente como una realización ejemplar es el factor VIII híbrido humano/porcino recombinante activo que tiene el dominio A2 sustituido, la secuencia de ácidos nucleicos que lo codifica, y los procedimientos para preparar, aislar y caracterizar su actividad. Los procedimientos mediante esta construcción híbrida se prepara también se puede usar para preparar el factor VIII híbrido humano/porcino recombinante activo o los fragmentos del mismo que tienen sustitución de subunidades, partes continuas de dominios, o dominios distintos de A2. Los expertos en la técnica reconocerán que estos procedimientos también pueden demostrar cómo otras moléculas del factor VIII híbrido humano/no humano recombinante, de mamífero no porcino o híbrido animal/animal o los fragmentos de los mismos se pueden preparar en las que subunidades, dominios o partes continuas de los dominios se sustituyen.

El factor VIII híbrido humano/porcino recombinante se prepara partiendo de ADNc humano (Biogen, Inc.) o ADNc porcino (descrito en esta memoria descriptiva) que codifica la secuencia del factor VIII relevante. En una realización preferida, el factor VIII codificado por el ADNc incluye los dominios A1-A2 -A3-C1-C2, que carece del dominio B entero, y corresponde a residuos de aminoácidos 1 - 740 y 1649 - 2332 del factor VIII humano de cadena sencilla (véase la SEC ID Nº: 2), según el sistema de numeración de Wood y col., (1984) Nature 312: 330 - 337.

Las subunidades individuales, dominios, o partes continuas de dominios del ADNc del factor VIII porcino o humano se pueden y se han clonado y sustituido por las correspondientes subunidades, dominios, o partes de dominios humanas o porcinas mediante técnicas establecidas de mutagénesis. Por ejemplo, Lubin, J. M. y col., (1994) J. Biol. Chem. 269 (12): 8639 - 8641 describen técnicas para sustituir el dominio A2 porcino por el dominio humano que usa sitios de restricción convenientes. Otros procedimientos para sustituir cualquier región arbitraria del ADNc del factor VIII de una especie por el ADNc del factor VIII de otra especie incluyen ayuste por solapamiento de la extensión ("SOE"), como describen R. M. y col (1993) Meth. Enzymol 217: 270 - 279.

El ADNc del factor VIII híbrido que codifica subunidades, dominios, o partes de dominios o las moléculas de ADNc híbrido enteras se clonan en vectores de expresión para la expresión última de las moléculas de las proteínas del factor VIII híbrido humano/porcino en células cultivadas mediante técnicas establecidas, como describen Selden, R. F., "Introduction of DNA into mamalians cells," en Current Protocols in Molecualr Biology, eds. F. M. Ausubel y col., (1991).

En una realización preferida, un ADNc híbrido humano/porcino que codifica el factor VIII, en la que la secuencia porcina codifica un dominio o parte del dominio, de manera que el dominio A2 o parte del dominio, se inserta en un vector de expresión de mamífero, tal como ReNeo, para formar una construcción del factor VIII híbrido. Preliminarmente la caracterización del factor VIII híbrido se lleva a cabo mediante la inserción del ADNc híbrido en el vector de expresión de mamífero ReNeo y expresión transitoria de la proteína híbrida en células COS - 7. Después se puede realizar una determinación de si la proteína activa híbrida se expresa. La construcción del vector de expresión se usa adicionalmente para transfectar establemente células en el cultivo, tales como células de riñón de cría de hámster, usando procedimientos que son rutinarias en la técnica tal como transfección mediada por liposomas (Lipofectin™, Life Technologies, Inc.). La expresión de la proteína del factor VIII híbrido recombinante se puede confirmar, por ejemplo, mediante secuenciación, transferencia de Northern y Western, o reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La proteína del factor VIII híbrido en el medio de cultivo en el que se mantienen las células transfectadas que expresan establemente la proteína se pueden precipitar, sedimentar, lavar, y resuspender en un tampón apropiado, y la proteína del factor VIII híbrido recombinante purificarse mediante técnicas convencionales, que incluyen cromatografía de inmunoafinidad usando, por ejemplo, anti - A2 Sepharose™ monoclonal.

En una realización adicional, un factor VIII híbrido que comprende sustituciones de secuencias de subunidades, dominios, o aminoácidos se expresa como una proteína de fusión a partir de una molécula recombinante en la que la secuencia que codifica una proteína o péptido que mejora, por ejemplo, la estabilidad, secreción, detección, aislamiento, o similares se inserta en un lugar adyacente a la secuencia que codifica el factor VIII. Los protocolos establecidos para uso de secuencia de control de expresión de especies homológogas o heterólogas que incluyen, por ejemplo, promotores, operadores, y reguladores, en la preparación de proteínas de fusión se conocen y se usan de manera rutinaria en la técnica. Véase Current Protocols in Molecualr Biology (Ausubel, F. M. y col., eds), Wiley Interscience. N. Y. La expresión se potencia incluyendo porciones del dominio B. En particular, la inclusión de aquellas partes del dominio B designadas "SQ" [Lind, P. y col., (1995) anterior] da como resultado la expresión favorable. Las construcciones "SQ" carecen del dominio B humano excepto de 5 aminoácidos del extremo N del dominio B y 9 aminoácidos del extremo C del dominio B.

El factor VIII híbrido purificado o fragmento del mismo se puede ensayar para evaluar inmunorreactividad y actividad de coagulación mediante ensayos convencionales que incluyen, por ejemplo, el ensayo del factor VIII libre de plasma, el ensayo de coagulación de una fase, y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima que usan factor VIII humano recombinante purificado como patrón.

Otros vectores, que incluyen vectores tanto plásmidos como virales eucarióticos, se pueden usar para expresar una construcción de gen recombinante en células eucarióticas dependiendo de la preferencia y juicio del facultativo experimentado (véase, por ejemplo, Sambrook y col., capítulo 16). Se pueden usar otros vectores y sistemas de expresión, incluyendo sistemas de células bacterianas, de levaduras, y de insectos pero no se prefieren debido a diferencias en, o a carencia de glicosilación.

La proteína del factor VIII híbrido recombinante se puede expresar en una diversidad de células comúnmente usadas para cultivo y expresión de proteínas de mamífero recombinante. En particular, un número de líneas celulares de roedores se ha encontrado que son especialmente huéspedes útiles para la expresión de proteínas grandes. Las líneas celulares preferidas, disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD, incluyen células de riñón de cría de hámster, y células de ovario de hámster chino (CHO) que se cultivan usando procedimientos y medios de rutina.

Los mismos procedimientos empleados para preparar el factor VIII híbrido humano/porcino que tiene sustitución de secuencia de subunidad, dominio, o aminoácido se pueden usar para preparar otra proteína del factor VIII híbrido recombinante y los fragmentos de la misma y las secuencias de ácido nucleico que codifican estos híbridos, tales como humano/no humano, mamífero no porcino o animal/animal. Comenzando con los cebadores de la secuencia de ADN humano conocida, se han clonado el ADNc del factor VIII murino y parte del porcino. Las secuencias del factor VIII de otras especies para uso en la preparación de una molécula de factor VIII híbrido humano/animal o animal/animal se pueden obtener usando las secuencias de ADN humano y porcino como punto de partida. Otras técnicas que se pueden emplear incluyen procedimientos de amplificación de PCR con ADN de tejido animal, y uso de una genoteca de ADNc del animal para clonar la secuencia del factor VIII.

Como una realización ejemplar, la proteína del factor VIII híbrido humano/ratón se puede preparar como sigue. Los clones de ADN correspondientes al homólogo de ratón del gen del factor VIII humano se han aislado y secuenciado y predicho la secuencia de aminoácidos de la proteína del factor VIII de ratón, como se ha descrito en Elder, G., y col., (1993) Genomics 16 (2): 374 - 379, que también incluye una comparación de las secuencias de aminoácidos predichas de las moléculas del factor VIII de ratón. humano y parte de porcino. La secuencia del ADNc del factor VIII de ratón y secuencia de aminoácidos predicha se muestra en la SEC ID Nº 5 y SEC ID Nº 8, respectivamente. En una realización preferida, se puede usar la amplificación de ARN con procedimientos de secuenciación de transcripciones (RAWTS) descritos en Sarkar, G. y col., (1989) Science 244: 331 - 334. En resumen, las etapas son (1) síntesis de ADNc con oligo (dT) o un cebador de oligonucleótidos específico de ARNm; (2) reacción en cadena de polimerasa (PCR) en la que uno o ambos oligonucleótidos contiene un promotor de fago unido a una secuencia complementaria a la región a amplificar; (3) transcripción con un promotor de fago; y (4) secuenciación didesoxi mediada por transcriptasa inversa de la transcripción, que se ceba con un oligonucleótido anidado (interno). Además de revelar la información de secuencias, este procedimiento puede generar un producto de traducción in vitro incorporando una señal de inicio de la traducción en el cebador de PCR apropiado: y se puede usar para obtener información novedosa de la secuencia de ARNm de otra especie.

Sustitución de aminoácido(s)

La presente invención proporciona moléculas del factor VIII híbrido recombinante humano/animal y animal/animal o fragmentos de las mismas que comprenden al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos únicos de una especie sustituida por la secuencia de aminoácidos correspondiente de otra especie o fragmentos de la misma, secuencias de ácido nucleico que codifican estos híbridos, procedimientos para prepararlos y aislarlos, y procedimientos para caracterizar sus propiedades coagulantes, inmunogénicas e inmunorreacticvas. Previsto por la invención son mutaciones correspondientes a las posiciones 490, 493, 498 y 502 de la SEC ID Nº 2, o las combinaciones de las mismas. Todas las otras mutaciones en esta memoria descriptiva son meramente ejemplares.

El dominio A2 es necesario para la actividad procoagulante de la molécula del factor VIII. Los estudios muestran que el factor VIII porcino tiene actividad procoagulante seis veces mayor que el factor VIII humano (Lollar, P. y col., (1991) J. Biol. Chem. 266: 12481 - 12486, y que la diferencia en actividad coagulante entre el factor VIII humano y porcino parece estar basada en una diferencia en la secuencia de aminoácidos entre uno o más residuos en los dominios A2 humano y porcino (Lollar, P. y col., (1992) J. Biol. Chem. 267: 23652 - 23657. Además, los dominios A2 y C2 y posiblemente una tercera región de cadena ligera en la molécula del factor VIII humano se cree que albergan los epítopes para los que la mayoría, si no todos, los anticuerpos inhibidores reaccionan, según Hoyer (1994) Semin. Hewattol. 31: 1 - 5.

Las moléculas del factor VIII híbrido, recombinante humano/animal, animal/animal, o equivalente o los fragmentos de las mismas se pueden realizar mediante sustitución de al menos una secuencia específica que incluye uno o más aminoácidos únicos de los dominios A2, C2 y/u otros del factor VIII de una especie para la correspondiente secuencia de otra especie, en los que las secuencias de aminoácidos difieren, como se ilustra en más detalle más adelante, entre las moléculas de las dos especies. En una realización preferida ejemplar descrita en esta memoria descriptiva, la presente invención proporciona el factor VIII híbrido recombinante humano/porcino activo que comprende la secuencia de aminoácidos porcina para la secuencia de aminoácidos humana correspondiente sustituida por la secuencia de aminoácidos humana correspondiente que incluye un epítope, en la que el factor VIII híbrido tiene inmunorreactividad decrecida o no tiene con los anticuerpo inhibidores para el factor VIII. En una realización adicional, las moléculas del factor VIII híbrido recombinante también se pueden preparar comprendiendo la secuencia de aminoácidos de más de una especie sustituida por la correspondiente secuencia en una tercera especie. Las moléculas equivalentes híbridas recombinantes también se pueden preparar, comprendiendo el factor VIII humano, animal o híbrido incluyendo al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que no tienen identidad de secuencia conocida al factor VIII, como se describe adicionalmente más adelante.

Cualquier construcción del factor VIII híbrido que tiene sustitución de aminoácidos específica como se ha descrito se puede ensayar mediante procedimientos convencionales para evaluar la actividad coagulante y para evaluar la reactividad con anticuerpos inhibidores para el factor VIII para la identificación de las moléculas del factor VIII híbrido con actividad coagulante potenciada y/o inmunorreactividad de anticuerpo disminuida. Las moléculas híbridas también se puede confirmar que tienen actividad coagulante reducida comparada con el factor VIII humano o porcino pero también tienen reactividad de anticuerpo disminuida. Los expertos en al técnica reconocerán que las moléculas del factor VIII híbrido. Los expertos en la técnica reconocerán las moléculas del factor VIII o los fragmentos de las mismas que tienen menos, igual o mayor actividad coagulante, comparadas con el factor VIII humano o porcino, son útiles para tratar pacientes que tienen una deficiencia del factor VIII. Los procedimientos descritos en esta memoria descriptiva para preparar el factor VIII híbrido recombinante humano/porcino con sustitución de aminoácidos específicos se pueden usar para preparar proteína del factor VIII híbrido recombinante humano/no humano, de mamífero no porcino, factor VIII híbrido animal - 1/animal - 2, y factor VIII híbrido equivalente o los fragmentos de los mismos.

Moléculas del factor VIII híbrido con actividad coagulante alterada

La presente invención proporciona moléculas del factor VIII híbrido recombinante humano/animal, animal/animal, o equivalente o los fragmentos de las mismas que comprenden al menos una secuencia específica que incluye uno o más aminoácidos que tiene actividad procoagulante en el factor VIII de una especie sustituida por la secuencia de aminoácidos correspondiente del factor VIII de la otra especie, usando técnicas de mutagénesis dirigida al sitio establecidas como se describe en esta memorias descriptiva. Se seleccionan las secuencias específicas a usar en la sustitución y las construcciones híbridas se preparan y ensayan para evaluar la actividad coagulante, como sigue. Proporcionada específicamente como una realización preferida y ejemplar es un factor VIII híbrido humano/porcino que comprende sustituciones de aminoácidos en el dominio A2. Se entiende que los expertos en la técnica usan estos procedimientos para preparar otras moléculas del factor VIII híbrido humano/animal, animal/animal, y equivalente o los fragmentos de las mismas que tienen actividad coagulante alterada, preferiblemente actividad coagulante aumentada comparada con el factor VIII humano.

La base para la mayor actividad coagulante en el factor VIII porcino parece que es la disociación espontánea más rápida de la subuunidad A2 del factor VIIIa humano que el factor VIIIa porcino, que conduce a la perdida de actividad, según Lollar, P. y col., (1990) J. Biol. Chem. 265: 1688 - 1692; Lollar, P. y col., (1992) J. Biol. Chem. 267: 23652 - 23657; Fay, P. J. y col., (1992) J. Biol. Chem. 267: 13246 - 13250;

Una comparación de la alineación de las secuencias de aminoácidos de los dominios del factor VIII humano y porcino (la numeración de residuos comienza en al posición 373 con respecto a la secuencia de aminoácidos de longitud completa del factor VIII humano, SEC ID Nº 2) se muestra en la figura 1C. Para la preparación de una molécula del factor VIII híbrido humano/porcino con actividad coagulante alterada, los candidatos diana iniciales para mutagénesis, que se revelaron tras comparación de las secuencias de aminoácidos de A2 porcino (SEC ID Números 2 y 6, respectivamente) en el dominio A2, se muestran en la tabla I.

TABLA I Candidatos diana de secuencia de aminoácidos humanos para mutagénesis (SEC ID Nº 2)

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1

La tabla I y las figuras 1A - 1B ilustran siete secuencias en las secuencias de aminoácidos del dominio A2 humano y porcino (SEC ID números 2 y 6, respectivamente) que constituyen solamente el 17% del dominio A2 pero incluye el 70% de las diferencias de secuencias entre dominios A2 humanos y porcinos.

Se describe una construcción híbrida recombinante humana/porcina en al que los aminoácidos Ser 373 - Glu 604 en el dominio A2 (Ser 373 - Arg 740) del factor VIII humano se ha reemplazado con al secuencia porcina homóloga. Esta construcción no reacciona con los inhibidores de A2 y tiene la misma actividad coagulante que el factor VIII humano B (-). Se describe una molécula híbrida derivada de plasma que comprende una sustitución del dominio A2 porcino completo en el factor VIII humano que tiene actividad coagulante incrementada comparada con el factor VIII humano. La comparación de estas construcciones indica que una región entre los residuos Asp 605 y Arg 740 es responsable de la diferencia en actividad entre el factor VIII humano y porcino. Esta región se puede definir más específicamente preparando moléculas del factor VIII híbrido recombinante humano/porcino con sustituciones porcinas en la región entre Asp 605 y Arg 740 usando técnicas de mutagénesis dirigida al sitio establecidas, por ejemplo, el procedimiento de "ayuste por solapamiento de la extensión" (SOE) que se ha usado ampliamente para preparar moléculas del factor VIII híbrido que contienen sustituciones porcinas en la región NH_{2} - terminal de A2. Estas moléculas se pueden expresar en células COS - 7 y células de riñón de cría de hámster como se ha descrito anteriormente. Se pueden purificar hasta homogeneidad usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como heparina - Sefarosa ™ y cromatografía de inmunoafinidad. La concentración de proteína se puede estimar mediante absorción de luz ultravioleta a A_{280}, y la actividad específica de las construcciones se puede determinar dividiendo la actividad coagulante (medida en unidades por ml mediante un ensayo de coagulación de una sola fase) por A_{280}. El factor VIII humano tiene una actividad específica de aproximadamente 3000 - 4000 U/A_{280}, mientras que el factor VIII porcino tiene una actividad específica de aproximadamente 20.000 U/A_{280}. En una realización preferida, el factor VIII híbrido humano/porcino recombinante procoagulante tiene una actividad específica de aproximadamente 20.000 U/A_{280} y contiene una cantidad mínima de sustitución porcina en el dominio A2.

Como se describe en esta memoria descriptiva, las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio se usan para identificar proteína híbrida con actividad coagulante que se puede potenciar, igualar a, o reducir, comparada con el factor VIII humano, pero preferiblemente se potencia. En la realización del híbrido humano/porcino, las secuencias específicas humanas se reemplazan con secuencias porcinas, preferiblemente usando el procedimiento de ayuste por solapamiento de la extensión (SOE), como describen Ho, S. N., y col., 77 Gene 51 - 59 (1994), y los ejemplos 7 y 8. También se puede usar mutagénesis dirigida a oligonucleótido, como se realizó para hacer bucles en la secuencia de aminoácidos para la parte del dominio A2 humano (véase el ejemplo 7). Ya que el análisis funcional de los híbridos revela actividad coagulante, la secuencia se puede diseccionar adicionalmente y mapearse para determinar la secuencia procoagulante mediante técnicas convencionales de análisis de mutación puntual.

La presente invención contempla que el ADNc del factor VIII híbrido y la proteína se puede caracterizar mediante procedimientos que están establecidos y son rutinarios, tal como secuenciación de ADN, ensayos de actividad coagulante, masa por ELISA y mediante absorbancia de UV a 280 nm del factor VIII híbrido purificado, actividad coagulante específica (U/mg), SDS - PAGE del factor VIII híbrido purificado, y similares. Se pueden requerir otros procedimientos conocidos de ensayo para evaluar la eficacia clínica, tales como análisis de aminoácidos, carbohidrato, sulfato o de ion metálico.

Un factor VIII híbrido recombinante que tiene actividad coagulante superior, comparada con el factor VIII humano puede ser menos costoso de realizar que el factor VIII derivado de plasma y puede disminuir la cantidad de factor VIII requerida ahora tratamiento eficaz de la deficiencia del factor VIII.

Moléculas del factor VIII híbrido con inmunorreactividad reducida

Los epítopes que son inmunorreactivos con anticuerpos que inhiben la actividad coagulante del factor VIII ("inhibidores" o "anticuerpos inhibidores") se han caracterizado basándose en relaciones de estructura - función conocidas en el factor VIII. Presumiblemente, los inhibidores pueden actuar fragmentando cualquiera de las interacciones macromoleculares asociadas a la estructura del dominio del factor VIII o sus asociaciones con el factor de von Willebrand, trombina, factor Xa, factor Ixa, o factor X. Sin embargo, sobre el 90% de anticuerpos inhibidores del factor VIII humano actúan mediante la unión a epítopes localizados en el dominio A2 de 40 kDa o dominio C2 de 20 kDa del factor VIII, fragmentando las funciones específicas asociadas a estos dominios, como describen Fulcher y col., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82: 7728 - 7732; y Scandella y col., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6152 - 6156. Además de los epítopes A2 y C2, existe un tercer epítope en el dominio A3 o C1 de la cadena ligera del factor VIII, según Scandella y col., (1993) Blood 82: 1767 - 1775: La significación de este tercer epítope supuesto es desconocida, pero parece que es responsable de una fracción menor de la reactividad del epítope en el factor VIII.

Los anticuerpos anti - A2 bloquean la activación del factor X, como muestran Lollar y col., (1994) J. Clin. Invest. 93: 2497 - 2504. Los estudios de mapeo previos mediante mutagénesis de supresión descritos por Ware y col., (1992) Blood Coagul. Fibrinolysis 3: 703 - 716, localizadas en el epítope de A2 dentro de una región de 20 kDa del extremo NH_{2} - terminal del dominio A2 de 40 kDa. Los ensayos inmunorradiométricos de competición han indicado que los inhibidores de A2 reconocen bien un epítope común o epítopes estrechamente agrupados, como describen Scandella y col., (1992) Throm. Haemostas 67: 665 - 671, y como se demuestra en el ejemplo 8.

La presente invención proporciona moléculas del factor VIII híbrido recombinante activo y el híbrido equivalente o los fragmentos de las mismas, las secuencias de ácido nucleico que codifican estos híbridos, procedimientos de para prepararlos y aislarlos, y procedimientos para caracterizarlos. Estos híbridos comprenden moléculas del factor VIII humano/animal, animal/animal, o híbrido equivalente, adicionalmente comprendiendo al menos una secuencia de aminoácidos específica que incluye uno o más aminoácidos únicos del factor VIII de una especie sustituidos por la correspondiente secuencia de aminoácidos del factor VIII de la otra especie; o comprende al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que no tienen identidad de secuencia conocida al factor VIII sustituidos por la secuencia de aminoácidos específica en el factor VIII humano, animal o híbrido. El factor VIII híbrido resultante tiene inmunorreactividad reducida o ninguna para los anticuerpos inhibidores del factor VIII, comparada con el factor VIII humano o porcino.

Usando el planteamiento descrito en la sección anterior para la sustitución de aminoácidos en la molécula del factor VIII, se emplea análisis mutacional para seleccionar la secuencia de aminoácidos correspondiente del factor VIII de una especie, preferiblemente porcina, que se sustituye por al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos en el factor VIII de otra especie, preferiblemente humana, o para una secuencia de aminoácidos de una molécula del factor VIII híbrido equivalente, que incluye una o más regiones crítica (s) en el dominio A2, C2 o cualquier otro a los que se dirigen los anticuerpos inhibidores. Los procedimientos se describen más adelante en más detalle. La construcción híbrida recombinante procoagulante resultante tiene inmunorreactividad reducida o ninguna para los anticuerpos inhibidores, comparada con el factor VIII humano, usando ensayos convencionales. A través de la sustitución sistemática progresivamente de secuencias de aminoácidos más pequeñas mediante ensayo de la construcción híbrida para evaluar inmunorreactividad, como se describe más adelante, se mapea el epítope en cualquier dominio de una molécula del factor VIII, sustituida por la secuencia de aminoácidos tiene menos o ninguna inmunorreactividad, y se prepara un factor VIII híbrido.

Se entiende que los expertos en la técnica pueden usar este planteamiento combinando el mapeo de epítopes, construcción de moléculas del factor VIII híbrido, y análisis mutacional de la construcción para identificar y reemplazar al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que comprende un epítope en los dominios A2, C2 y/u otro a los que los anticuerpos inhibidores se dirigen y para construir el factor VIII equivalente híbrido recombinante humano/animal, animal/animal, o equivalente o los fragmentos de los mismos que tienen inmunorreactividad decrecida o ninguna comparada con el factor VIII humano o porcino. Este planteamiento se usa, como se describe en el ejemplo 8, para preparar un factor VIII híbrido procoagulante recombinante humano/porcino que tiene sustituciones de aminoácidos porcinos en el dominio A2 humano y sin antigenicidad para los anticuerpos anti - factor VIII como una realización ejemplar.

Usualmente, el factor VIII porcino tiene reacción limitada o ninguna con los anticuerpos inhibidores para el factor VIII. Se preparan moléculas del factor VIII híbrido recombinante humano/porcino que tienen reactividad disminuida o ninguna con anticuerpos inhibidores basándose en la sustitución de aminoácidos en el dominio A2, como un ejemplo de cómo se puede preparar el factor VIII híbrido usando el factor VIII de otra especie y sustituciones en dominios distintos del A2, como sigue. El dominio A2 porcino se clona mediante técnicas de clonación convencionales, tales como las descritas anteriormente en los ejemplos 6, 7, y 8, y después se cortan y se ayustan en el dominio A2 usando procedimientos rutinarios, tales como el uso de sitios de restricción para cortar el ADNc o el ayuste por solapamiento de la extensión (SOE). La secuencia de aminoácidos porcina resultante se sustituye en el dominio A2 humano para formar una construcción del factor VIII híbrido, que se inserta en un vector de expresión de mamífero, preferiblemente ReNeo, transfectado establemente en células cultivadas, preferiblemente células de riñón de cría de hámster, y expresado como se ha descrito anteriormente. El actor VIII híbrido se ensaya para evaluar la inmunorreactividad, por ejemplo con anticuerpos anti - A2 mediante el ensayo de Bethesda habitual o mediante ensayo de sustrato cromogénico exento de plasma. La unidad Bethesda (BU) es el procedimiento habitual para medir las titulaciones de los inhibidores. Si la titulación de Bethesda no se puede medir (< 0,7 BU/mg de IgG) en el híbrido, entonces se eliminó el epítope A2 humano en la región de secuencia porcina correspondiente sustituida. El epítope se reduce progresivamente, y el epítope A2 específico se puede de este modo determinar para producir una molécula híbrida humana/porcina con secuencia porcina tan pequeña como sea posible. Como se ha descrito en esta memoria descriptiva, una secuencia de 25 residuos correspondiente a los aminoácidos Arg 484 - Ile 508 que es crítica para la inmunorreactividad inhibidora se ha identificado y sustituido en el dominio A2 humano. Dentro de esta secuencia hay sólo nueve diferencias entre el factor VIII humano y porcino. Esta región se puede además analizar y sustituir.

También se pueden preparar moléculas del factor VIII híbrido humano/porcino que tienen reactividad disminuida o ninguna con anticuerpos inhibidores basándose en sustitución de secuencia de aminoácidos en el dominio A2. El epítope C2, por ejemplo se puede mapear usando el planteamiento de exploración homóloga con mutagénesis dirigida al sitio. Más específicamente, los procedimientos pueden ser los mismos o similares a los descritos en esta memoria descriptiva para la sustitución de aminoácidos en el dominio A2, incluyendo la clonación del dominio C2 porcino u otro, por ejemplo usando RT - PCR o mediante el sondeo de una genoteca de ADNc de hígado porcino con ADN del dominio C2 humano u otro; las técnicas del sitio de restricción y/o SOE sucesivo para mapear y reemplazar simultáneamente los epítopes en el dominio C2 u otro; la sustitución por el dominio C2 u otro en el factor VIII
B(-); la inserción en un vector de expresión, tal como pBluescript; expresión en células cultivadas; y ensayo habitual para evaluar la inmunorreactividad. Para los ensayos, se puede realizar la reactividad del factor VIII híbrido C2 con un inhibidor específico C2, MR [Scandella y col, (1992) Thomb. Haemostasis 67: 665 - 671 y Lubin y col (1994)], y/u otros anticuerpos específicos C2 preparados mediante cromatografía de afinidad.

El dominio C2 consta de los residuos de aminoácidos 2173 - 2332 (SEC ID Nº 2). Dentro de esta región de 154 aminoácidos, la actividad inhibidora parece dirigirse a una región de 65 aminoácidos entre los residuos 2248 y 2312, según Shima, M. y col (1993) Thromb. Haemostas 69: 240 - 246. Si la secuencia de C2 del factor VIII humana y porcina es aproximadamente 85% idéntica en esta región, como es en otra parte en las regiones funcionalmente activas del factor VIII, habrá aproximadamente diez diferencias entre la secuencia de aminoácidos de C2 del factor VIII humano y porcino, que se puede usar como dianas iniciales para construir híbridos con la secuencia de C2.

Es probable que los epítopes del factor VIII clínicamente significativos se confinen a los dominios A2 y C2. Sin embargo, si los anticuerpos para otras regiones (dominios A1, A3, B, o C1) del factor VIII se identifican, los epítopes se pueden mapear y eliminar usando el planteamiento descrito en esta memoria descriptiva para las moléculas del factor VIII híbrido humano/porcino.

Más específicamente el mapeo del segundo epítope de cadena ligera supuesto y/o cualquier otro epítope en cualquier otro dominio del factor VIII animal o humano también se puede llevar a cabo. Inicialmente, la determinación de la presencia de un tercer epítope inhibidor en los dominios A3 o C1 se puede realizar como sigue. Usando secuencias de aminoácidos del factor VIII humano ("H") y porcino ("p") como modelo, se construirán los híbridos sin dominio B A1_{p} - A2_{p} - A3_{p} - C1_{H} - C2_{p} y A1_{p} - A2_{p} - A3_{H} - C1_{p} - C2_{p}. La IgG inhibidora entre aproximadamente 20 plasmas de paciente (del Dr. Dorothea Scandella, American Red Cross) que tienen titulaciones bajas o no detectables frente al factor VIII porcino se analizarán frente a los híbridos. Si el tercer epítope está en el dominio A3, la IgG inhibidora se espera que reaccione con A1_{p} - A2_{p} - A3_{H} - C1_{p} - C2_{p} pero no con A1_{p} - A2_{p} - A3_{p} - C1_{H} - C2_{p}. Recíprocamente, si el tercer epítope está en el dominio C1, entonces la IgG inhibidora se espera que reaccione con A1_{p} - A2_{p} - A3_{p} - C1_{H} - C2_{p} pero no con A1_{p} - A2_{p} - A3_{H} - C1_{p} - C2_{p}. Si se identifica un tercer epítope se caracterizará mediante los procedimientos descritos en esta memoria descriptiva y los epítopes A2 y C2.

Por ejemplo, los anticuerpos específicos para el epítope del dominio C1 o A3 se puede aislar a partir de la IgG del paciente total mediante cromatografía de afinidad usando los híbridos A1_{p} - A2_{p} - A3_{H} - C1_{p} - C2_{p} y A1_{p} - A2_{p} - A3_{p} - C1_{H} - C2_{p}, y mediante la eliminación de los anticuerpos específicos C2 mediante subcultivos sobre factor VIII C2 - Sefarosa ™. El tercer epítope supuesto se identificará mediante construcciones de SOE en las que, en una realización preferida, las porciones del dominio A3 o C1 del factor VIII se reemplazan sistemáticamente con secuencia porcina.

Moléculas del factor VIII híbrido con inmunogenicidad reducida

Una molécula es inmunogénica cuando puede inducir la producción de anticuerpos en un ser humano o animal. La presente invención proporciona una molécula del factor VIII híbrido humano/animal o animal/animal, molécula equivalente del factor VIII híbrido, o fragmento de cualquiera que es menos inmunogénica que el factor VIII humano porcino de tipo salvaje en ser humano o animal, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos específica que incluye uno o más aminoácidos únicos del factor VIII de una especie sustituidos por la secuencia de aminoácidos correspondiente que tiene actividad inmunogénica del factor VIII de la otra especie; o al menos una secuencia de aminoácidos que incluye uno o más aminoácidos que no tiene identidad conocida al factor VIII sustituida por la secuencia de aminoácidos del factor humano, animal o híbrido. Este híbrido se puede usar para reducir la incidencia del desarrollo de inhibidor en un animal o ser humano y tratar la deficiencia del factor VIII, y se preferiría en el tratamiento de pacientes son tratados previamente con hemofilia. En una realización un factor VIII modificado comprende la secuencia de aminoácidos del factor VIII humano, que comprende además uno o más residuos de alanina sustituidos por la secuencia de aminoácidos que tiene actividad inmunogénica, dando como resultado una molécula equivalente híbrida recombinante procoagulante o fragmento de la misma que tiene inmunogenicidad reducida o ninguna en ser humano o animal.

El procedimiento descrito en esta memoria descriptiva de mapeo de epítope y análisis mutacional combinado con sustitución de secuencia de aminoácidos no antigénica en una molécula del factor VIII, usando factor VIII híbrido humano/porcino, produce mopléculas híbridas con baja antigenicidad. Usando este modelo y los procedimientos asociados, cualquiera de las construcciones híbridas descritas en esta memoria descriptiva se puede alterar mediante técnicas de mutagénesis dirigida al sitio para retirar tanto como sea posible de cualquier epítope funcional para minimizar la capacidad del sistema inmune para reconocer el factor VIII híbrido, por lo tanto disminuyendo su inmunogenicidad.

Un procedimiento que se puede usar para reducir adicionalmente la antigenicidad y para construir un factor VIII híbrido menos inmunogénico es mutagénesis por barrido de alanina, descrita por Cunningham, B. C. y col., (1989) Science 244: 1081 - 1085, de secuencias de aminoácidos específicos seleccionados en factor VIII equivalente humano, animal, o híbrido equivalente. En la mutagénesis por barrido de alanina, las cadenas laterales de aminoácidos que están supuestamente implicadas en un epítope se reemplazan con residuos de alanina usando mutageénsis dirigida al sitio. Comparando la unión a anticuerpos de mutantes de alanina a proteína de tipo salvaje, se puede determinar la contribución relativa de cadenas secundarias individuales a la interacción de unión. Las sustituciones de alanina son probablemente especialmente útiles, ya que las contribuciones de la cadena secundaria a la unión anticuerpo se eliminan más allá del carbono \beta, pero, a diferencia de la sustitución de glicina, no se altera habitualmente la conformación de la cadena principal. Las sustitución de alanina no impone efectos hidrófobos o electrostáticos estéricos importantes que dominan las interacciones proteína - proteína.

En las interacciones antígeno - anticuerpo, existen usualmente aproximadamente 15 - 20 cadenas secundarias de antígenos en contacto con el anticuerpo. Las interacciones de cadena secundaria, como opuestas a las interacciones de cadena principal, dominan interacciones proteína - proteína. Los estudios recientes han sugerido que solamente unas pocas (aproximadamente 3 a 5) de estas interacciones de cadenas secundarias contribuyen a la mayor parte de la energía de unión. Véase Clackson, T. y col., (1995) Science 267: 383 - 386. Un análisis extensivo de epítopes de hormona de crecimiento para varios anticuerpos monoclonales murinos revelaron la jerarquía siguiente para las contribuciones de las cadenas secundarias a la energía de unión: Arg > Pro > Glu - Asp - Phe - Ile, con Trp, Ala, Gly, y Cys no ensayado [Jin, L. y col. (1992) J. Mol. Biol. 226: 851 - 865]. Los resultados con el epítope A2 descritos en esta memoria descriptiva son consistentes con esto, ya que doce de los 25 residuos en el segmento A2 484 - 508 contienen estas cadenas secundarias (Fig. 1C).

El hallazgo de que ciertos residuos de aminoácidos se reconocen bien por anticuerpos indica que la eliminación de estos residuos de un epítope conocido puede disminuir la capacidad del sistema inmune para reconocer estos epítopes, es decir puede hacer una molécula menos inmunogénica. En el caso del epítope A2, los residuos inmunogénicos se pueden reemplazar sin pérdida de la actividad coagulante del factor VIII. Por ejemplo, en HP9, Arg 484 se reemplaza por Ser, Pro 485 se reemplaza por Ala, Arg 489 se reemplaza por Gly, Pro 492 se reemplaza por Leu, y Phe 501 se reemplaza por Met. Además, los resultados a partir de los pacientes de plasma usados para ensayar la inmunorreactividad en las construcciones del factor VIII híbrido humano/porcino, descritos en el ejemplo 8, indican que los anticuerpos de diferentes pacientes reconocen la misma o una región estructural muy similar en el dominio A2 que participa en los inhibidores A2 de unión parecen mostrar poca variación. De este modo, el epítope A2 incluidos en los residuos del factor VIII humano 484 - 508 es un epítope inmunodominante porque se reconoce por el sistema inmune humano mejor que otras regiones estructurales del factor VIII. El reemplazo de esta estructura por la secuencia del factor VIII no antigénico de otra especie o por la secuencia de aminoácidos del no factor VIII, aunque reteniendo la actividad procoagulante completa, se espera que alteren el reconocimiento del factor híbrido o híbrido equivalente por el sistema inmune.

Se anticipa que la mutagénesis dirigida al sitio para reemplazar residuos voluminosos y/o cargados que tienden a dominar epítopes con cadenas secundarias pequeñas, neutras (por ejemplo, alanina) puede producir una región inmunogénica menor. Se espera que una molécula que contiene unas pocas de estas sustituciones en cada epítope inhibidor significativo será difícil para el sistema inmune para acoplarse mediante el mecanismo de cerradura - y - llave que es típico de las interacciones antígeno anticuerpo. Debido a su baja antigenicidad, tal molécula híbrida podría ser útil en el tratamiento de pacientes con deficiencia del factor VIII con inhibidores, y debido a su baja inmunogenicidad, puede ser útil en el tratamiento de pacientes con hemofilia A no tratados previamente.

Un resultado general es que la mutación de uno de unos pocos residuos clave es suficiente para disminuir la constante de unión para una interacción proteína - proteína dada en varios órdenes de magnitud. De este modo, parece probable que todos los epítopes del factor VIII contengan un número limitado de aminoácidos que son críticos para del desarrollo del inhibidor. Para cada epítope en el factor VIII, las sustituciones de alanina por al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos específicos que tienen actividad inmunogénica, puede producir una molécula activa que es menos inmunogénica que el factor VIII de tipo salvaje. En una realización preferida, el factor VIII híbrido es sin dominio B.

Los procedimientos para preparar el factor VIII híbrido recombínate o híbrido equivalente con sustitución de secuencia de aminoácidos que tiene poca actividad inmunogénica o ninguna por secuencia de aminoácidos en el factor VIII que tiene actividad inmunogénica son como sigue, uso de factor VIII híbrido humano/porcino con sustituciones de aminoácidos en el dominio A2 como una realización ejemplar. Existen 25 residuos en la región 484 - 508 del factor VIIII. La mutagénesis dirigida al sitio se puede usar para hacer mutantes individuales en los que cualquiera de estos residuos se reemplaza por cualquiera de los otros 19 aminoácidos para un total de 475 mutantes. Además, se pueden construir moléculas híbridas que tienen más de una mutación.

Las construcciones híbridas se pueden ensayar para evaluar antigenicidad midiendo la constante de unión para anticuerpos inhibidores, como describen Friguet, B y col., (1985) J. Immunol. Methods 77: 305 - 319 (1985). En una realización preferida, la constante de unión se reducirá en al menos tres órdenes de magnitud, lo cual reduciría la titulación de Bethesda hasta un nivel que es clínicamente insignificante. Por ejemplo, la CI_{50} (una medición bruta de la constante de unión) de inhibición mediante los anticuerpos A2 se redujo en las construcciones HP2, HO4, HP5, HP7, y HP9 del factor VIII híbrido humano/porcino, descritas en el ejemplo 8, y esto se asoció a una reducción en la titulación de Bethesda hasta un nivel no medible. Por ejemplo, se anticipa que un mutante de alanina doble o triple del factor VIII (por ejemplo, un mutante triple del factor VIII Arg 484- > Ala, Arg 489- > Ala, Phe 501- > Ala) producirá una molécula con antigenicidad suficientemente baja para uso terapéutico. Se pueden hacer mutaciones similares en el epítope C2 y el supuesto tercer epítope. Una realización preferida comprende dos o tres sustituciones de alanina en dos o tres epítopes del factor VIII. También se pueden hacer otras sustituciones en estas regiones.

En una realización preferida, se identificarán moléculas del factor VIII híbrido equivalente que son menos antigénicas y/o inmunogénicas en ser humano y animal que cualquier factor VIII humano o porcino. Tales construcciones híbridas equivalentes se pueden ensayar en animales para evaluar su antigenicidad reducida y/o inmunogenicidad reducida. Por ejemplo, conejos, cerdos, perros, ratones, primates, y otros mamíferos deficientes en el factor VIII y controles se pueden usar como modelos animales. En un protocolo experimental, el factor VIII híbrido o híbrido equivalente se puede administrar sistemáticamente durante un período de seis meses a un año al animal, preferiblemente mediante infusión intravenosa, y en un intervalo de dosificación entre 5 y 50 unidades/kg de peso corporal, preferiblemente 10 - 50 Unidades/kg, y los más preferiblemente 40 Unidades/kg de peso corporal. Los anticuerpos se pueden medir en muestras de plasma tomadas a intervalos después de las infusiones durante la duración del período de ensayo mediante procedimientos rutinarios, incluyendo inmunoensayo y ensayo de Bethesda. La actividad coagulante también se puede medir en muestras con procedimientos rutinarios, incluyendo los ensayos de coagulación de una fase.

Las moléculas del factor VIII híbrido equivalente se pueden ensayar en seres humanos para evaluar su antigenicidad y/o inmunogenicidad reducida en al menos dos tipos de ensayos clínicos. En un tipo de ensayo, diseñado para determinar si el factor VIII híbrido o híbrido equivalente es inmunorreactivo con anticuerpos inhibidores, se administra factor VIII híbrido o híbrido equivalente, preferiblemente mediante infusión intravenosa, a aproximadamente 25 pacientes que tienen deficiencia del factor VIII que tienen anticuerpos para el factor VIII que inhiben la actividad coagulante del factor VIII humano o porcino. La dosificación del factor VIII híbrido o híbrido equivalente está en un intervalo en el intervalo entre 5 y 50 unidades/kg de peso corporal, preferiblemente 10 - 50 unidades/kg, y los más preferiblemente 40 unidades/kg de peso corporal. Aproximadamente 1 hora después de cada administración, la recuperación del factor VIII a partir de muestras de sangre se mide en un ensayo de coagulación de una fase. Las muestras se toman de nuevo aproximadamente 5 horas después de la infusión, y se mide la recuperación. La recuperación total y la velocidad de desaparición del factor VIII de las muestras predicen la titulación del anticuerpo y actividad inhibidora. Si la titulación del anticuerpo es alta, la recuperación del factor VIII usualmente no se puede medir. Los resultados de recuperación se comparan con la recuperación de los resultados de recuperación en pacientes tratados con factor VIII humano derivado de plasma, factor VIII humano recombinante, factor VIII porcino, y otras formas terapéuticas comúnmente usadas o sustitutos del factor VIII.

En un segundo tipo de ensayo clínico, diseñado para determinar si el factor VIII híbrido o híbrido equivalente es inmunogénico, es decir, si los pacientes desarrollarán anticuerpos inhibidores, se administrará factor VIII híbrido o híbrido equivalente, como se ha descrito en el párrafo precedente, a aproximadamente 100 pacientes hemofílicos no tratados previamente que no han desarrollado anticuerpos para el factor VIII. Los tratamientos se proporcionan aproximadamente cada 2 semanas durante un período de 6 meses a 1 año. En intervalos de 1 a 3 meses durante este período, se extraen muestras de sangre y se realizan ensayos de Bethesda u otro de anticuerpo para determinar la presencia de anticuerpos inhibidores. También se pueden realizar ensayos de recuperación, como se ha descrito anteriormente, después de cada infusión. Los resultados se comparan con pacientes hemofílicos que reciben factor VIIII humano derivado de plasma, factor VIII humano recombinante, factor VIII porcino, u otras formas terapéuticas usadas comúnmente del factor VIII u sustitutos del factor VIIII.

Preparación de moléculas del factor VIII híbrido usando secuencia de aminoácidos humana y no porcina, de mamífero no humano

Los procedimientos usados para preparar el factor VIII híbrido humano/porcino con sustitución de aminoácidos específicos se pueden usar para preparar proteína del factor VIII híbrido recombinante humano/no humano, de mamífero no porcino o animal/animal que tiene, comparado con el factor VIII humano o porcino, actividad coagulante alterada o la misma y/o inmunorreactividad y/o inmunogenicidad igual o reducida, basándose en la sustitución de uno o más aminoácidos en los dominios A2, C2, y/u otros.

Se pueden realizar comparaciones similares de identidad de secuencias de aminoácidos entre proteínas del factor VIII humano y no humano, de mamífero no porcino para determinar las secuencias de aminoácidos en la que reside la actividad procoagulante, inmunorreactividad anti - A2 y anti - C2, y o inmunogenicidad, o inmunorreactividad y/o inmunogenicidad en otros dominios. Se pueden usar procedimientos similares para preparar moléculas del factor VIII híbrido humano/no humano, de mamífero no porcino. Como se ha descrito anteriormente, el análisis funcional de cada híbrido revelará aquellos con reactividad disminuida para anticuerpos inhibidores, y/o inmunogenicidad reducida, y/o actividad coagulante aumentada, y la secuencia se puede adicionalmente diseccionar detenidamente mediante análisis de mutación puntual.

Por ejemplo, las moléculas del factor VIII híbrido humano/ratón se pueden preparar como se ha descrito anteriormente. La alineación de la secuencia de aminoácidos del dominio A2 de seres humanos (SEC ID Nº 2) y ratón (SEC ID Nº 6) se muestra en al figura 1C. Como ha indicado Elder y col, la proteína del factor VIII codificada por el ADNc de ratón (SEC ID Nº 5) tiene 2319 aminoácidos, con 74% de identidad de secuencia en conjunto a la secuencia humana (SEC ID Nº 2) (identidad de 87 cuando el dominio B se excluye de la comparación), y es 32 aminoácidos más corta que el factor VIII humano. Las secuencias de aminoácidos en los dominios A y C de ratón (SEC ID Nº 6) se conservan en gran medida, con 84 - 93% de identidad con la secuencia humana (SEC ID Nº 2), mientras el B y los dos dominios ácidos cortos tienen 42 -70% de identidad de secuencia. Específicamente, las secuencias de aminoácidos de ratón A1, A2, y A3 (SEC ID Nº 6) son 85, 85, y 90% idénticas a las correspondientes secuencias de aminoácidos humanas correspondientes (SEC ID Nº 2). Las secuencias de aminoácidos C1 y C2 son 93 y 84% idénticas a las correspondientes secuencias de aminoácidos humanas correspondientes. En la secuencia de aminoácido del factor VIII de ratón predicha (SEC ID Nº 6), los dominios A1, A2, y A3 son homólogos a los aminoácidos del factor VIII humano 1 - 372, 373 - 740, y 1690 - 2032, respectivamente, usando la identidad de secuencia de aminoácidos para propósitos de numeración.

La trombina/factor Xa y todos los sitios de escisión de la proteína C activados menos uno se conservan en el factor VIII de ratón. El residuo de tirosina para la unión del factor von Willebran también se conserva.

Según Elder y col., la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 5) del factor VIII de ratón contiene 7519 bases y tiene un 67% de identidad en conjunto con la secuencia de nucleótidos humanos (SEC ID Nº 1). Las 6957 pares de bases de la secuencia codificadora murina tiene un 82% de identidad de secuencias con las 7053 pares de bases de la secuencia codificadora en el factor VIII humano. Cuando el dominio B no se incluye en la comparación, existe una identidad de secuencias de nucleótidos del 88%.

Elder y col., describen que las moléculas del factor VIII humano y de ratón son 75% idénticas en conjunto, y que el 95% de los residuos humanos que conducen a hemofilia cuando están alterados son idénticos en el ratón. Estos datos soportan la aplicación de las mismas técnicas usadas para identificar la secuencia de aminoácidos con actividad coagulante y/o inmunorreactividad a anticuerpos en la molécula del factor VIII de ratón u otro animal para identificar secuencias de aminoácidos similares y preparar moléculas híbridas.

Preparación de moléculas del factor VIII híbrido que tienen reactividad cruzada usando la secuencia de aminoácidos del factor VIII humano y no humano, de mamífero no porcino y secuencia de aminoácidos del no factor VIII

El factor VIII porcino se usa clínicamente para tratar pacientes con deficiencia del factor VIII que tienen anticuerpos inhibidores para el factor VIII humano. La reactividad cruzada, en la que reacciona el plasma humano con el factor VIII porcino, se puede reducir mediante preparación del factor VIII híbrido porcino/no humano, de mamífero no porcino o híbrido equivalente. En una realización preferida, una determinación de si A2, C2 humanos, u otros inhibidores específicos de dominio reaccionan con el factor VIII no humano, de mamífero no porcino ("otro mamífero") se hace, usando el ensayo de Bethesda rutinario y el plasma particular de otro mamífero como patrón. Las titulaciones del inhibidor se miden usualmente en plasma, así no es necesario el factor VIII de otro mamífero purificado. Si los inhibidores no reaccionan con el factor VIII de otro mamífero, tal como el factor VIII murino, cuya secuencia se conoce, entonces la otra secuencia de mamífero correspondiente se puede sustituir en la región del epítope porcino, como se identifica usando híbridos humanos/porcinos. Una vez que se conoce la secuencia animal, técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, tal como mutagénesis mediada por oligonucleótidos descrita por Kunkel. T. A. y col., (1999) Meth. Enzymol 204: 125 - 139, se pueden usar para preparar la molécula del factor VIII híbrido porcino/animal. Si otros plasmas de animales son reactivos con inhibidores de A2, C2, u otros del factor VIII que el factor VIII murino o porcino, la secuencia animal correspondiente al epítope porcino se puede determinar mediante procedimientos rutinarios, tales como RT - PCR, y un factor VIII híbrido humano/animal o porcino/animal construido mediante mutagénesis dirigida al sitio. También, el factor VIII híbrido humano/animal o porcino/de mamífero no porcino que tiene reactividad cruzada con plasma humano comparada con el factor VIII porcino se puede preparar para que tenga la sustitución de aminoácidos correspondiente de uno o más otros animales. En una realización adicional, la reactividad cruzada se puede reducir mediante sustitución de la secuencia de aminoácidos que no tiene identidad conocida a la secuencia de aminoácidos del factor VIII, preferiblemente los residuos de alanina que usan técnicas de mutagénesis por barrido, para secuencia de epítopes porcinos.

Después de la identificación de epítopes clínicamente significativos, las moléculas del factor VIII híbrido recombinante se expresarán para que tengan menos que o igual reactividad cruzada comparada con el factor VIII porcino cuando se ensayó in vitro contra una amplia prospección de plasmas inhibidores. Preferiblemente estas moléculas serán híbridos A2/C2 combinados en los que la secuencia de aminoácidos inmunorreactivos en estos dominios se reemplaza por otra secuencia de mamíferos. La mutagénesis adicional en estas regiones se puede realizar para reducir la reactividad cruzada. La reactividad cruzada reducida, aunque deseable, no es necesaria para producir un producto que pueda tener ventajas sobre el factor VIII porcino existente concentrado, que produce efectos secundarios debido a las proteínas porcinas contaminantes y puede producir efectos adversos debido a la inmunogenicidad de las secuencias del factor VIII porcino. Una molécula del factor VIII híbrido humano/otro mamífero o porcino/otro mamífero no contendrá proteínas porcinas extrañas. Adicionalmente, el mapeo de epítope extensivo realizado en el dominio A2 porcino indica que más del 95% de la secuencia del factor VIII híbrido humano/porcino terapéutico será humano.

Preparación de los equivalentes del factor VIII híbrido

Los procedimientos para determinar la sustitución de aminoácidos en las moléculas del factor VIII descritos anteriormente y en los ejemplos también se pueden usar para preparar moléculas equivalentes del factor VIII híbrido recombinante procoagulante o los fragmentos de las mismas que comprenden al menos una secuencia de aminoácidos que incluye uno o más aminoácidos que no tienen identidad secuencia de aminoácidos conocida al factor VIII ("secuencia del no factor VIII") sustituida por al menos una secuencia de aminoácidos específica que incluye un sitio antigénico y/o inmunogénico en el factor VIII humano, animal, o híbrido. La molécula equivalente del factor VIII híbrido activo resultante tiene igual o menor reactividad con anticuerpos inhibidores del factor VIIII y/o menos inmunogenicidad en seres humanos y animales que el factor VIII humano, animal, o híbrido no sustituido.

Los residuos de aminoácidos adecuados que se pueden sustituir por aquellas secuencias de aminoácidos críticos para la actividad coagulante y/o antigénica y/o inmunogénica en el factor humano o animal o factor VIII híbrido humano/animal para preparar una molécula del factor VIII híbrido equivalente incluyen cualquier aminoácido que no tiene identidad de secuencia conocida a la secuencia de aminoácidos del factor VIII animal o humano que tiene actividad coagulante, antigénica, o inmunogénica. En una realización preferida, los aminoácidos que se pueden sustituir incluyen residuos alanina que usan técnicas de mutagénesis por exploración.

Las moléculas equivalentes del factor VIII híbrido descritas en esta memoria descriptiva también incluyen aquellas moléculas en las que los residuos de aminoácidos que no tienen identidad conocida a la secuencia del factor VIII animal se sustituyen por residuos de aminoácidos no críticos a la actividad coagulante, antigénica, o inmunogénica.

Como se ha descrito anteriormente, en una realización de una molécula equivalente del factor VIII, la molécula ha reducido la reactividad cruzada con plasmas inhibidores. Se identifican uno o más epítopes en el factor VIII de reactividad cruzada, como se ha descrito anteriormente, y después se reemplaza la secuencia de aminoácidos del no factor VIII, preferiblemente residuos alanina, usando, por ejemplo, el procedimiento de mutagénesis por barrido de alanina.

En una relación preferida, una molécula equivalente del factor VIII híbrido recombinante procoagulante se prepara comprendiendo al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que no tiene identidad de secuencia conocida al factor VIII, preferiblemente residuos alanina, sustituido por al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que incluye un epítope, y/o por al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos incluyendo un sitio inmunogénico, preferiblemente en el factor VIII. La molécula del factor VIII equivalente híbrido resultante o fragmento de la misma tiene inmunorreactividad reducida o ninguna con anticuerpos inhibidores al factor VIII y/o inmunogenicidad reducida o ninguna en seres humanos o animales. Los procedimientos para identificar la secuencia de aminoácidos específica en el dominio A2 del factor VIII humano para sustitución por la secuencia de aminoácidos única porcina no antigénica se describen en los ejemplos 7 y 8 y son ejemplares para identificar la secuencia antigénica en el A2 y otros dominios del factor VIII humano y animal y para usar procedimientos de mutagénensis dirigida al sitio tal como mutagénesis por barrido de alanina para sustituir la secuencia de aminoácidos del no factor VIII.

Ya que el epítope A2 humano se ha reducido hasta 25 o pocos aminoácidos, como se describe en ejemplo 8, la mutagénesis por barrido de alanina se puede realizar sobre un número limitado de construcciones del factor VIII híbrido que tiene la secuencia de aminoácidos humana para determinar cuales son construcciones del factor VIII híbrido procoagulante, no inmunorreactivo y/o no inmunogénico basándose en las sustituciones de aminoácidos A2. En el dominio A2, los candidatos más probables para las sustituciones de alanina para lograr tanto antigenicidad como inmunogenicidad reducida en la construcción híbrida son Arg 484, Pro 485, Tyr 487, Ser 488, Arg 488, Pro 492, Val 495, Phe 501, e Ile 508. La afinidad de unión de una construcción híbrida que comprende cada uno de estos mutantes para mAb 413 y un panel de Ias IgG de paciente específico A2 se determinará mediante ELISA. Cualquier mutante que sea activo y tenga una afinidad de unión pata inhibidores A2 que se reducen más de 2 órdenes de magnitud es un candidato para la molécula del factor VIII A2 sustituido. Las construcciones que tienen más de una mutación se seleccionarán, basándose en la asunción de que cuanto más se altere el epítope, menos imunogénico será. Es posible que existan otros residuos candidatos en la región entre Arg 484 - Ile 508, ya que pueden ser residuos claves para el epítope que son comunes para el factor VIII tanto humano como porcino. Por ejemplo, los residuos cargados están frecuentemente implicados en las interacciones proteína - proteína, de hecho, un sustituto de alanina por Arg 490 produce un factor VIII procoagulante que tiene solamente 0,2% de la reactividad al inhibidor del factor VIII humano (tabla VI). De manera similar, una sustitución de alanina, para Lys 493 es un candidato
posible.

Este procedimiento se llevará a cabo en el epítope C2 y el tercer epítope supuesto, que se cree que ésta en los dominios A3 o C1, así como cualquier otro epítope identificado en el factor VIII, para preparar construcciones del factor VIII equivalente híbrido.

Ensayos de diagnóstico

El ADNc del factor VIII híbrido humano/animal, animal/animal, o equivalente y/o proteína expresada del mismo, en conjunto o en parte, se puede usar en ensayos como reactivos de diagnóstico para la detección de anticuerpos inhibidores al factor VIII humano o animal o al factor híbrido humano/animal u VIII equivalente en sustratos, incluyendo, por ejemplo, muestras de suero y fluidos corporales de paciente humanos con deficiencia den factor VIII. Estos ensayos de anticuerpos incluyen ensayos tales como ensayos ELISA, inmunotransferencias, radioinmunoensayos, ensayos de inmunodifusión, y ensayo de actividad biológica del factor VIII (por ejemplo, mediante ensayo de coagulación). Las técnicas para preparar estos reactivos y procedimientos para uso del de los mismos los conocen los expertos en la técnica. Por ejemplo, un inmunoensayo para detección de anticuerpos inhibidores en una muestra de suero del paciente puede incluir hacer reaccionar la muestra de ensayo con una cantidad suficiente del factor VIII híbrido humano/animal que contiene al menos un sitio antigénico, en el que la cantidad es suficiente para formar un complejo detectable con los anticuerpos inhibidores en la muestra.

Las sondas de ácidos nucleicos y aminoácidos se pueden preparar basándose en la secuencia del ADNc del factor VIII híbrido humano/porcino, humano/no humano, de mamífero no porcino, animal/animal, o equivalente o molécula de proteína o los fragmentos del mismo. En algunas realizaciones, éstas se pueden marcar usando tintes o marcadores enzimáticos, fluorescentes, quimioluminiscentes, o radiactivos que están comercialmente disponibles. Se pueden usar sondas de aminoácidos, por ejemplo, para seleccionar sueros u otros fluidos corporales donde se sospecha la presencia de inhibidores para el factor VIII híbrido humano/animal. Los niveles de inhibidores se pueden cuantificar en pacientes y comparar a controles sanos, y se pueden usar, por ejemplo, para determinar si un paciente con deficiencia del factor VIII se puede tratar con un factor VIII híbrido humano/animal o híbrido equivalente. Las sondas de ADNc se pueden usar, por ejemplo, para investigar propósitos en la selección de genotecas de ADN.

Composiciones farmacéuticas

Se preparan composiciones farmacéuticas que contienen el factor VIII híbrido humano/animal, porcino/no humano, mamífero no porcino, animal - 1/animal - 2, o equivalente, solo o en combinación con compuestos de estabilización farmacéutica apropiados, portadores de distribución, y/o portadores vehículo, según procedimientos conocidos, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin.

En una realización preferida, los portadores preferidos o portadores de distribución para infusión intravenosa son solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato.

En otra realización preferida, los compuestos de estabilización preferidos, portadores de distribución, y portadores vehículos incluyen pero no se limitan a otras proteínas de seres humanos o animales tales como albúmina.

Las vesículas de fosfolípidos o suspensiones liposomales también se prefieren como portadores o portadores de distribución farmacéuticamente aceptables. Éstos se pueden preparar según los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica y pueden contener, por ejemplo, fosfatidilserina/fosfatidilcolina u otras composiciones de fosfolípidos o detergentes que juntas imparten una carga negativa a la superficie, ya que el factor VIII se une a membranas fosfolipídicas cargadas negativamente. Los liposomas se pueden preparar disolviendo lípido (s) apropiado) (s) (tal como estearoil fosfatidil etanolamina, estearoil fosfatidil colina, aracadoil fosfatidil colina, y colesterol) en un disolvente orgánico que después se evapora, dejando detrás una película fina de lípido seco sobre la superficie del recipiente. Una solución acuosa del factor VIII híbrido se introduce después en el recipiente. Después el recipiente se hace girar a mano para poner en libertad el material lipídico de los lados del recipiente y dispersar los agregados lipídicos, por lo tanto formando la suspensión liposomal.

El factor híbrido o factor VIII híbrido equivalente se puede combinar con otros compuestos de estabilización adecuados, portadores de distribución, y/o portadores vehículos, incluyendo factores de coagulación dependientes de vitamina K, factor de tejidos, y factor de von Willebrand (vWf) o un fragmento de vWf que contiene el sitio de unión del factor VIII, y polisacáridos tales como sacarosa.

El factor VIII híbrido o híbrido equivalente también se puede distribuir mediante terapia génica de la misma manera que el factor VIII se puede distribuir, usando medios de distribución tales como vectores retrovirales. Este procedimiento consiste en una incorporación del ADNc del factor VIII en células humanas que se transplantan directamente en un paciente deficiente en el factor VIII o que se coloca en un dispositivo implantable, permeable a las moléculas del factor VIII pero impermeable a las células, que después se transplanta. El procedimiento preferido será transferencia de genes mediada por retrovirales. En este procedimiento, un gen exógeno (por ejemplo, ADNc del factor VIII) se clona en el genoma de un retrovirus modificado. El gen se inserta en el genoma de la célula hospedadora mediante maquinaria viral donde se expresará en la célula. El vector retroviral se modifica de manera que no producirá virus, previniendo la infección viral del huésped. Los principios generales para este tipo de terapia los conocen los expertos en la técnica y se han revisado en la bibliografía [por ejemplo, Kohn, D. B. y col., (1989) Transfusion 29: 812 - 820].

El factor VIII híbrido se puede almacenar unido a vWf para incrementar la semivida y semivida de la molécula híbrida. Adicionalmente, la liofilización del factor VIII puede mejorar los rendimientos de las moléculas activas en presencia de vWf. Los procedimientos actuales para almacenamiento del factor VIII humano y animal usados por los proveedores comerciales se pueden emplear para almacenamiento del factor VIII híbrido. Estos procedimientos incluyen: (1) liofilización del factor VIII en un estado parcialmente purificado (como un factor VIII "concentrado" que se infunde sin purificación adicional); (2) purificación por inmunoafinidad del factor VIII por el procedimiento de Zimmerman y liofilización en presencia de albúmina, que estabiliza el factor VIII; (3) liofilización del factor VIII recombinante en presencia de albúmina.

Adicionalmente, el factor VIII híbrido ha sido indefinidamente estable a 4ºC en NaCl 0,6 M, MES 20 mM, y CaCl_{2} 5 mM a pH 6,0 y también se puede almacenar congelado en estos tampones y descongelarse con pérdida mínima de actividad.

Procedimientos de tratamiento

El factor VIII híbrido o híbrido equivalente se usa para tratar hemorragia incontrolada debida la deficiencia del factor VIII (por ejemplo, hemorragia intraarticular, intracraneal, o gastrointestinal) en hemofílicos con y sin anticuerpos inhibidores y en pacientes con el factor VIII adquirido debido al desarrollo de anticuerpos inhibidores. Los materiales activos se administran preferiblemente por vía intravenosa.

Adicionalmente, el factor VIII híbrido o híbrido equivalente se puede administrar mediante transplante de células modificadas genéticamente para producir el híbrido mediante implante de un dispositivo que contiene tales células, como se ha descrito anteriormente.

En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas del factor VIII híbrido o híbrido equivalente solo o en combinación con estabilizantes, portadores de distribución, y/o vehículos se infunden en pacientes por vía intravenosa según el mismo procedimiento que se usa para infusión del factor VIII humano o animal.

Las dosificaciones de tratamiento de la composición del factor VIII híbrido o híbrido equivalente que se deben administrar a un paciente en necesidad del tal tratamiento variarán dependiendo de la gravedad de la deficiencia del factor VIII. En general, el nivel de dosificación se ajusta en frecuencia, duración, y unidades en el mantenimiento con la gravedad y duración de cada episodio de hemorragia del paciente. De acuerdo a lo anterior, el factor VIII híbrido se incluye en el vehículo, portador de distribución, o estabilizador farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para distribuir a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del híbrido para parar la hemorragia, como se mide mediante ensayos de coagulación convencionales.

El factor VIII se define de manera clásica como la sustancia presente en plasma sanguíneo normal que corrige el defecto de coagulación en plasma derivado de individuos con hemofilia A. La actividad coagulante in vitro de formas purificadas y parcialmente purificadas del factor VIII se usa para calcular la dosis del factor VIII para infusiones en pacientes humanos y es un indicador fiable de la actividad recuperada de plasma de pacientes y de corrección del defecto de hemorragia in vivo. No se describen discrepancias entre ensayo convencional de las moléculas del factor VIII novedosas in vitro y su conducta en el modelo de infusión de perros o en pacientes humanos, según Lusher, J. M. y col., New Engl. Med. 328: 453 - 459; Pittman, D. D. y col., (1992) Blood 79: 389 - 397; y Brinkhous y col., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8752 - 8755.

Usualmente, el nivel del factor VIII en plasma a lograr en el paciente mediante la administración del factor VIII híbrido o híbrido equivalente está en el intervalo entre 30 y 100% del normal. En una modo preferido de administración del factor VIII híbrido o híbrido equivalente, la composición se proporciona por vía intravenosa a una dosificación preferida en el intervalo entre aproximadamente 5 y 50 unidades/kg de peso corporal, más preferiblemente en un intervalo de 10 - 50 unidades/kg de peso corporal, y los más preferiblemente a una dosis de 20 - 40 unidades/kg de peso corporal; la frecuencia intervalo está en el intervalo entre aproximadamente 8 y 24 horas (en hemofílicos afectados gravemente); y la duración del tratamiento en días está en el intervalo entre 1 y 10 días o hasta que el episodio de hemorragia se resuelva. Véase, por ejemplo, Roberts, H. R., y col., y M. R. Jones, "Hemophilia and Related Conditions - Congenital Deficiencias of Prothrombin (Factor II, Factor V, and Factors VII to XII)," cap. 153, 1453 - 1474, 1460, en Hematology, Williams, W. J. y col., ed. (1990). Los pacientes con inhibidores pueden requerir más factor VIII híbrido o híbrido equivalente, o los pacientes pueden requerir menos factor VIII híbrido o híbrido equivalente debido a su especificidad mayor que el factor VIII o reactividad o inmunogenicidad de anticuerpos disminuida. Como en un tratamiento con el factor VIII humano o porcino, la cantidad de factor VIII híbrido o híbrido equivalente infundido se define mediante el ensayo de coagulación del factor VIII de una fase y, en casos seleccionados, la recuperación in vivo se determina midiendo el factor VIII en plasma de pacientes después de la infusión. Se ha de entender que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específica se deben ajustar durante un tiempo según la necesidad del individuo y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración expuestos en esta memoria descriptiva son ejemplares solamente y no pretenden limitar e alcance o práctica de la composición reivindicada.

El tratamiento puede tomar la forma de una administración intravenosa individual de la composición o administración periódica o continua durante un período extendido de tiempo, según se requiera. Como alternativa, el factor VIII híbrido o híbrido equivalente se puede administrar por vía subcutánea o por vía oral con liposomas en una o varias dosis a intervalos variables de tiempo.

El factor VIII híbrido o híbrido equivalente también se puede usar para tratar hemorragia no controlada debida a la deficiencia del factor VIII en hemofílicos que tienen anticuerpos desarrollados para el factor VIII humano. En este caso, la actividad coagulante que es superior a la del factor VIII humano o animal solo no es necesaria. La actividad coagulante que es inferior a la del factor VIII humano (es decir, menos que 3.000 unidades/mg) será útil si la actividad no se neutraliza por anticuerpos en el plasma de pacientes.

Se ha demostrado en esta memoria descriptiva que el factor VIII híbrido y factor VIII modificado puede diferir en actividad específica del factor VIII humano. Las proteínas del factor VIII híbrido, híbrido equivalente y modificado que tienen mayor actividad procoagulante del factor VIII humano son útiles en el tratamiento de hemofilia debido a que se requerirán dosificaciones inferiores para corregir la deficiencia del factor VIII. El factor VIII híbrido o híbrido equivalente y modificado que tiene actividad procoagulante menor que el factor VIII son también adecuados para uso terapéutico con tal que tengan al menos 1% de actividad específica comparada con el factor VIII humano. Un factor VIII híbrido, híbrido equivalente o modificado de la presente invención que tiene actividad procoagulante se define por lo tanto por tener al menos 1% de la actividad específica del factor VIII humano.

La molécula del factor VIII híbrido o híbrido equivalente y los procedimientos para aislamientos, caracterización, preparación, y uso generalmente descritos anteriormente se entenderán adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Ensayo del factor VIII porcino y factor VIII híbrido humano/porcino

El factor VIII porcino tiene más actividad coagulante que el factor VIII humano, basándose en la actividad específica de la molécula. Estos resultados se muestran en la tabla III en el ejemplo 4. Esta conclusión se basa en el uso de curvas patrones apropiadas que permiten el factor VIII humano porcino se comparar justamente. Los ensayos de coagulación se basan en la capacidad del factor VIII para acortar el tiempo de coagulación de plasma derivado de un paciente con hemofilia A. Se emplearon dos tipos de ensayo: el ensayo de dos fases y el de dos fases.

En un ensayo de una fase, 0,1 ml de plasma de hemolfilia A (George King Biomedical, Inc.) se incubó con 0,1 ml de reactivo de tromboplastina parcial activado (APTT) (Organon Teknika) y 0,01 ml de muestra o patrón, que consisten en plasma diluido, plasma normal humano citrado, durante 5 minutos a 37ºC en baño de agua. A la incubación siguió la adición de 0,1 ml de CaCl_{2} mM, y el tiempo para el desarrollo de un coágulo de fibrina se determinó mediante inspección visual.

Una unidad del factor VIII se define como la cantidad presente en 1 ml de plasma humano normal citrado. Con plasma humano como patrón, la actividad del factor VIII, porcino y humano se compararon directamente. Las diluciones de las proteínas patrones o purificadas en plasma se realizaron en NaCl 0,15 M, HEPES 0,02 M, pH 7,4. La curva patrón se construyó basándose en 3 ó 4 diluciones de plasma, siendo la dilución más alta 1/50, y sobre el log_{10} del tiempo de coagulación representado gráficamente contra log_{10} de la concentración en plasma, que da como resultado una representación gráfica lineal. Las unidades del factor VIII en una muestra no conocida se determinaron mediante interpolación de la curva patrón.

El ensayo de una fase se basa en la activación endógena del factor VIII mediante activadores formados en el plasma de hemofilia A, mientras que el ensayo de dos fases mide la actividad procoagulante del factor VIII preactivado. En el ensayo de dos fases, muestras que contenían el factor VIII que se habían hecho reaccionar con trombina se añadieron a una mezcla de tromboplastina parcial activada y plasma de hemofilia A humano que se había preincubado durante 5 minutos a 37ºC. Después los tiempos de coagulación resultantes se convirtieron en unidades/ml, basándose en la curva patrón humana descrita anteriormente. La actividad relativa en el ensayo de dos fases era más alta en el ensayo de una fase debido a que se había preactivado el factor VIII.

Ejemplo 2 Caracterización de la diferencia funcional entre factor VIII humano y porcino

El aislamiento de factor VIII derivado de plasma humano y factor VIII recombinante humano se han descrito en la bibliografía en Fulcher, C. A. y col., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1648 - 1652; Toole y col., (1984) Nature 312: 342 - 347 (Genetics Institute); Gitschier y col., (1984) Nature 312: 326 - 330 (Genentech); Wood y col., (1984) Nature 312: 330 - 337 (Genentech); Vehar y col., 312 Nature 312: 337 - 342 (Genentech); Fass y col., (1982) Blood 59: 594; Toole y col., (1986) Proc. natl. Acad. Sci. USA 83: 5939 - 5942. Esto se puede llevar acabo en varios días. Todas estas preparaciones son similares en composición de subunidades, aunque existe una diferencia funcional en estabilidad entre factor VIII humano y porcino.

Para comparación de factor VIII humano recombinante y porcino, preparaciones del factor VIII humano recombinante purificado (Cutre Laboratories, Berkeley, CA) y factor VIII porcino [inmunopurificado como se describe en Fass y col., (1982) Blood 59: 594] se sometió a cromatografía líquida de alta presión (HPLC) sobre una columna de intercambio aniónico (Pharmacia, Inc) Mono Q™ (Pharmacia - LKB, Piscataway, NJ). Los propósitos de la etapa de Mono Q™ HPLC eran eliminación de impurezas menores de intercambio de factor VIII humano y porcino en un tampón común para propósitos comparativos. Se reconstituyeron viales que contenían 1000 - 2000 unidades de factor VIII con 0,5 ml de H_{2}O. Después se añadió Hepes (2 M a pH 7,4) hasta una concentración final de 0,02 M. El factor VIII se aplicó a una columna Mono Q™ HR 5/5 equilibrada en NaCl 0,15 M, Hepes 0,02 M, CaCl_{2} 5 mM, a pH 7,4 (Tampón A más NaCl 0,15 M); se lavó con 10 ml de tampón A + NaCl 0,15 M; y se eluyó con un gradiente lineal de 20 ml, NaCl 0,15 M a 0,90 M en tampón A a un caudal de 1 ml/min.

Para comparación del factor VIII derivado de plasma humano (purificado mediante Mono Q™ HPLC) y factor VIII porcino, factor VIII porcino derivado de plasma, purificado por inmunoafinidad, se diluyó 1:4 con Hepes 0,04 M, CaCl_{2} 5 nM, Tween - 80 al 0,01%, a pH 7,4, y se sometió a Mono Q (TM HPLC en las mismas condiciones descritas en el párrafo anterior para el factor VIII humano. Estos procedimientos para el aislamiento del factor VIII humano y porcino son habituales para los expertos en la técnica.

Las fracciones de columna se ensayaron para evaluar la actividad del el factor VIII mediante un ensayo de coagulación de una fase. Los resultados medios de los ensayos, expresados en unidades de actividad por A_{280} de material, se proporcionan en la tabla II, e indican que el factor VIII porcino tiene al menos seis veces mayor la actividad que el factor VIII humano cuando se usa el ensayo de una fase.

TABLA II Comparación de actividad coagulante del factor VIII humano y porcino

		\hskip-1cm Actividad (U/A_{280})
	Porcino	\hskip-2.5mm 21.300
	Derivado de plasma humano	3.600
	Recombinante humano	2.400

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Comparación de la estabilidad del factor VIII humano y porcino

Los resultados del ensayo de una fase para el factor VIII reflejan la activación del factor VIII al factor VIIIa en la muestra y posiblemente pérdida de la actividad del factor VIIIa formado. Se realiza una comparación directa de la estabilidad del factor VIII humano y porcino. Las muestras de Mono Q™ HPLC (Pharmacia, Inc., Pisacataway, N. J.) se diluyeron a la misma concentración y composición de tampón y se hicieron reaccionar con trombina. En diversos momentos, se retiraron muestras para el ensayo de coagulación de dos etapas. Típicamente, la actividad pico (a 2 min) era 12 veces mayor para el factor VIIIa porcino que para el humano, y las actividades de tanto el factor VIIIa porcino como humano disminuyeron posteriormente, con la actividad del factor VIIIa decreciendo más rápidamente.

En general, los intentos para aislar el factor VIIIa humano estable no es exitosos incluso cuando se usan condiciones que producen factor VIIIa porcino estable. Para demostrar esto, el factor VIII humano purificado por Mono Q™ HPLC se activó con trombinba y se sometió a intercambio catiónico HPLC Mono S™ (Pharmacia, Inc) en condiciones que producen factor VIIIa porcino estable, como describen Lollar y col., (1989) Biochemistry 28: 666.

El factor VIII humano, 43 \mug/ml (0,2 \mugM) en NaCl 0,2 M, Hepes 0,01 M, CaCl_{2} 2,5 mM, a pH 7,4, en un volumen total de 10 ml, se hizo reaccionar con trombina (0,36 \muM) durante 10 minutos, tiempo en el que se añadió FPR - CH_{2}Cl D-fenilpropil-arginil-clorometil cetona hasta una concentración de 0,2 \muM para la inactivación irreversible de trombina. Después la mezcla se diluyó 1:1 con ácido 2-(N-morfolino) etano sulfónico 40 mM (MES), CaCl_{2} 5 mM, a pH 6,0, y se cargó a 2 ml/min en una columna Mono S™ HR 5/5 HPLC (Pharmacia, Inc) equilibrada en MES 5 mM, CaCl_{2} 5 mM, a pH 6,0, (tampón B) más NaCl 0,1 M. El factor VIIIa se eluyó sin columna lavando con 20 ml de gradiente de NaCl 0,1 M a NaCl 0,9 M en tampón B a 1 ml/min.

La fracción con actividad coagulante en el ensayo de dos fases se eluyó como un pico solo en estas condiciones. La actividad específica de la fracción pico era aproximadamente 7.5000 U/A_{280} electroforesis del dodecil sulfato sódico - gel de poliacrilamida (SDS - PAGE) del pico del factor VIIIa de Mono S™, seguido de tinción por plata de la proteína, reveló dos bandas correspondientes a un derivado heterodimérico (A3 - C1 - C2/A1) del factor VIII. Aunque el fragmento A2 no se identificó mediante tinción por plata en estas condiciones en estas condiciones debido a su baja concentración, se identificó como un constituyente en pequeña cantidad mediante marcaje con ^{125}I.

En contraposición a los resultados con el factor VIII, el factor VIIIa porcino aislado mediante Mono S™ HPLC en las mismas condiciones tenía una actividad específica de 1,6 x 10^{6} U/A_{280}. El análisis del factor VIIIa porcino mediante SDS - PAGE reveló 3 fragmentos correspondientes a las subunidades A1, A2, y A3 - C1 - C2, demostrando que el factor VIIIa porcino posee tres subunidades.

Los resultados de Mono S™ HPLC de las preapariciones del factor VIII activados por trombina a pH 6,0 indican que el factor VIIIa humano es lábil en condiciones que producen el factor VIIIa porcino estable. Sin embargo, aunque las cantidades en pequeñas cantidades del fragmento A2 se identificaron en la fracción pico, la determinación de si la actividad coagulante que se produjo a partir de pequeñas cantidades del factor VIIIa heterotrimérico o a partir de factor VIIIa heterodimérico que tiene una actividad específica inferior no era posible a partir de este procedimiento solo.

Una forma de aislar el a humano antes de que pierda su subunidad A2 es deseable para resolver esta cuestión. A este extremo, el aislamiento se realizó en un procedimiento que implica la reducción del pH del los tampones Mono™ hasta pH 5. El factor VIII humano purificado por Mono Q™ (0,5 mg) se diluyó con H_{2}O para proporcionar una composición final de 0,25 mg/ml (1 \mum) de factor VIII en NaCl 0,25 M, Hepes 0,01 M, CaCl_{2} 2,5 mM, Tween - 80 al 0,005%, a pH 7,4 (volumen 7,0 ml). Se añadió trombina hasta una concentración final de 0,072 \mum y se dejó que reaccionara durante 3 minutos. Después se inactivó la trombina con FRP - CH_{2}Cl (0,2 \mum). Después la mezcla se diluyó 1:1 con acetato de sodio 40 mM, CaCl_{2} 5 mM, Tween - 80 al 0,01%, a pH 5,0, y se cargó a 2 ml/min en una columna Mono S™ HR 5/5 HPLC equilibrada en acetato de sodio 0,01 M, CaCl_{2} 5 mM, Tween - 80 al 0,01%, a pH 5,0, más NaCl 0,1 M. El factor VIIIa se eluyó sin columna lavando 20 ml de gradiente de NaCl 0,1 M a NaCl 1,0 M en el mismo tampón a 1 ml/min. Esto dio como resultado la recuperación de la actividad coagulante en un pico que contenía cantidades detectables del fragmento A2 como se muestra mediante SDS - PAGE y tinción por plata. La actividad específica de la fracción pico era 10 veces mayores que la recuperada a pH 6,0 (75.000 U/ A_{280} v. 7.500 U/A_{280}). Sin embargo, en contraposición al factor VIIIa aislado a pH 6.0, que es indefinidamente estable a 4ºC, la actividad del factor VIIIa humano decreció constantemente durante un período de varias horas después de la elución a partir de Mono S™. Adicionalmente, la actividad del factor VIIIa purificado a pH 5,0 y ensayado inmediatamente después es solamente 5% la del factor VIIIa porcino, indicando que la disociación sustancial se produce antes de ensayar.

Estos resultados demuestran que tanto el factor VIII humano como el porcino se componen de tres subunidades (A1, A2, y A3-C1-C2). La disociación de la subunidad A2 es responsable de la pérdida de actividad del factor VIIIa tanto humano como porcino en ciertas condiciones, tales como resistencia iónica fisiológica, pH, y concentración. La estabilidad relativa del factor VIIIa porcino en ciertas condiciones se debe a la fuerte asociación de la subunidad A2.

Ejemplo 4 Preparación del factor VIII híbrido humano/porcino mediante reconstitución con subunidades

Las cadenas ligeras del factor VIII porcino y las cadenas pesadas del factor VIII se aislaron como sigue. Una solución 0,5 M de EDTA a pH 7,4 se añadió al factor VIII porcino purificado por Mono Q™ hasta una concentración final de 0,05 M y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 18 - 24 h. Se añadió un volumen igual de histidina 10 mM - Cl, EDTA 10 mM, Tween 80 al 0,2% v/v, a pH 6,0 (Tampón B), y la solución se aplicó a 1 ml/min a una columna Mono S™ 5/5 previamente equilibrada en tampón A más NaCl 0,25 M. Las cadenas pesadas del factor VIII no se unieron a la resina, como se juzgó mediante SDS - PAGE. La cadena ligera del factor VIII se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0,1 - 0,7 m, 20 ml en tampón A a 1 ml/min y era homogénea mediante SDS - PAGE. Las cadenas pesadas del factor VIII se aislaron mediante mono Q™ HPLC (Pharmacia, Inc., Pisacataway, N. J.) de la manera siguiente. Las cadenas pesadas del factor VIII no se absorben a mono S™ durante la purificación de las cadenas ligeras del factor VIII. El material a través de la bajada que contenía las cadenas pesadas del factor VIII se ajustó hasta pH 7,2 mediante la adición de tampón Hepes 0,5 M, pH 7,4, y se aplicó a una columna mono Q™ HR 5/5 HPLC (Pharmacia, Inc) equilibrada en NaCl 0,1 M, Hepes 0,02 M, Tween - 80 al 0,01%, pH 7,4. La columna se lavó con 10 ml de este tampón, y las cadenas pesadas del factor VIII se eluyeron con 20 ml de un gradiente de NaCl 0,1 - 1,0 M en este tampón. Las cadenas ligeras humanas y cadenas pesadas se aislaron de la misma manera.

Las cadenas pesadas y ligeras humanas y porcinas se reconstituyeron según las siguientes etapas. Se mezclaron diez \mug/ml de la cadena ligera del factor VIII humano o porcino, 100 \mu/ml en NaCl 1 M, Hepes 0,02 M, CaCl_{2} 5 mM, Tween - 80 al 0,01%, pH 7,4, con (I) 25 \mul de cadena pesada heteróloga, 60 \mug/ml, en el mismo tampón; (2) 10 \mul de Hepes 0,02 M, Tween - 80 al 0,01%, pH 7,4; (3) 5\mul de CaCl_{2} 0,6 mM, durante 14 horas a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con MES 0,02 M, Tween - 80 al 0,01%, CaCl_{2} 5 mM, pH 6 y se aplicó a Mono S™ Hr 5/5 equilibrada en NaCl 0,1 M, MES 0,02 M, Tween - 80 al 0,01%, CaCl_{2} 5 mM, pH 6,0. Se desarrollaron 20 ml de gradiente de NaCl 0,1 - 1,0 M en el mismo tampón a 1 ml/min, y se recogieron fracciones de 0,5 ml. Se leyó la absorbancia a 280 nm de fracciones, y las fracciones se ensayaron con absorbancia para la actividad del factor VIII mediante un ensato de coagulación de una fase. Las cadenas pesadas estaban presentes en exceso, debido a que la cadena ligera libre (no asociada a la cadena pesada) también se una a Mono S™; las cadenas pesadas en exceso aseguran que las cadenas ligeras libres no son parte de la preparación. Los experimentos de reconstitución seguidos de purificación por Mono S™ HPLC se realizaron con las cuatro combinaciones posibles de cadenas: cadena ligera humana/cadena pesada humana, cadena ligera humana/cadena pesada porcina, cadena ligera porcina/cadena pesada porcina, cadena ligera porcina/cadena pesada humana. La tabla III muestra que el factor VIII de cadena ligera humana/cadena pesada porcina tiene actividad comparable con el factor VIII porcino nativo (tabla II) indicando que los elementos estructurales en la cadena pesada porcina son responsables de la actividad coagulante incrementada del factor VIII porcino comparado con el factor VIII humano.

TABLA III Comparación de actividad coagulante del factor VIII híbrido humano/porcino con factor VIII humano y porcino

		\hskip-1cm Actividad (U/A_{280})
	Cadena ligera porcina/cadena pesada porcina	\hskip-2.5mm 30.600
	Cadena ligera humana/cadena pesada porcina	\hskip-2.5mm 44.100
	Cadena ligera porcina/cadena pesada humana	1.100
	Cadena ligera humana/cadena pesada humana	1.000

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Preparación de factor VIII activo híbrido humano/porcino mediante reconstitución con dominios

El dímero porcino A1/A3-C1-C2, el dominio A2 porcino, el dímero A1/A3-C1-C2, y el dominio A2 humano se aislaron cada uno a partir de sangre porcina o humana, según el procedimiento descrito en Lollar y col., (1992) J. Biol. Chem. 267: (33): 23652 - 23657. Por ejemplo, para aislar el dímero A1/A3 - C1 - C2 porcino, factor VIIIa porcino
(140 \mug) a pH 6,0 se aisló hasta pH 8,0 mediante la adición de NaOH 5 N durante 30 minutos, produciendo la disociación del dominio A2 e inactivación del 95% mediante ensayo de coagulación. La mezcla se diluyó 1:8 tampón B (HEPES 20 mM, CaCl_{2} 5 mM, Tween - 80 al 0,01%, pH, 7,4) y se aplicó a una columna mono S equilibrada en tampón B. El dímero A1/A3 -C-C2 se eluyó como un pico agudo individual a aproximadamente NaCl 0,4 M usando gradiente de NaCl 0,1 - 1,0 M. Para aislar el dominio A2 porcino, el factor VIIIa porcino se preparó según el procedimiento de Lollar y col., (1989) Biochem 28: 666 - 674, comenzando con 0,64 mg de factor VIII. El dominio A2 porcino libre se aisló en forma de un compuesto menor (50 \mug) a NaCl 0,3 M en el cromatograma de Mono S™.

Las moléculas del factor VIII híbrido humano/porcino se reconstituyeron a partir de los dímeros y dominios como sigue. Las concentraciones y condiciones de tampón para los componentes purificados eran como sigue: A2 porcino, 0,63 \muM en tampón A (MES 5 mM, CaCl_{2} 5 mM, Tween - 80 al 0,01%, pH, 6,0 ) más NaCl 0,3 M; porcina A1/A3-C1-C2, en tampón B 0,24 \muM más NaCl 0,4 M, pH 7,4; A2 humano, 1 \muM en NaCl 0,3 M, histidina 10 mM - HCl, CaCl_{2} 5 mM, Tween - 80 al 0,01%, pH, 6,0; humano A1/A3-C1-C2, 0,18 \muM en NaCl 0,5 M, histidina 10 mM - Cl, CaCl_{2} 2,5 mM, Tween - 80 al 0,1%, pH, 6,0. Los experimentos de reconstitución se realizaron mezclando volúmenes iguales de dominio A2 y dímero A1/ A3-C1-C2. En los experimentos de mezcla con dímero A1/ A3-C1-C2, el pH se redujo hasta 6,0 mediante la adición de MES 0,5 M, pH 6,0, hasta 70 mM.

Las actividades de coagulación de las cuatro moléculas posibles del factor VIII híbrido [pA2(hA1/A3-C1-C2], [hA2(pA1/A3-C1-C2], [pA2(pA1/ pA3- C1-C2], y [hA2(hA1/A3-C1-C2], se obtuvieron mediante el ensayo de coagulación de dos fases en diversos momentos.

La generación de la actividad después de la mezcla de los dominios A2 y dímeros A1/A3-C1-C2 era casi completa en una hora y era estable durante al menos 24 horas a 37ºC. La tabla IV muestra la actividad de las moléculas del factor VIIIa híbrido reconstituido cuando se ensayan en 1 hora. El ensayo de dos fases, mediante el que se obtienen las actividades específicas de las moléculas del factor VIIIa, difiere del ensayo de una fase, y los valores no se pueden comparar con los valores de actividad de las moléculas del factor VIII obtenidos mediante el ensayo de una fase.

TABLA IV Comparación de actividades coagulantes del factor VIIIa híbrido humano/porcino dominio - sustituido

	fVIIIa híbrido	\hskip-1.5cm Actividad específica (U/mg)
	A2 porcino + A1/A3-C1-C2 humano	\hskip-2.5mm 140.000
	A2 porcino + A1/A3-C1-C2 porcino	70.000
	A2 humano + A1/A3-C1-C2 porcino	40.000
	A2 humano + A1/A3-C1-C2 humano	40.000

La tabla IV muestra que la mayor actividad se exhibe mediante el dominio A2/ dímero A1/ A3-C1-C2 humano, seguido del dominio A2 porcino/ dímero A1/ A3-C1-C2 porcino. De este modo, cuando el dominio A2 del factor VIIIa porcino se mezcló con el dímero A1/ A3-C1-C2 del factor VIIIa humano, se obtuvo actividad coagulante. Adicionalmente, cuando el dominio A2 del factor VIIIa humano se mezcló con el dímero A1/ A3-C1-C2 del factor VIIIa porcino, se obtuvo actividad coagulante. Mediante ellos mismos, las regiones A2, A1 y A3-C1-C2 no tienen actividad coagulante.

Ejemplo 6 Aislamiento y secuenciación del dominio A2 del factor VIII porcino

Solamente la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio B y parte del dominio A2 del factor VIII porcino se han secuenciado previamente [Toole y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 5939 - 5942]. El ADNc y secuencia de aminoácidos predicha (SEC ID números 3 y 4, respectivamente) para el dominio del factor VIII porcino entero se describen en esta memoria descriptiva.

El dominio A2 del factor VIII se clonó mediante transcripción inversa del ARN total de bazo porcino y amplificación de PCR; se usaron cebadores degenerados basándose en la secuencia del ADNc del factor VIII humano conocida y un cebador exacto porcino basándose en una parte de la secuencia del factor VIII porcino. Se aisló un producto de PCR de 1 kb y amplificó mediante inserción en un factor de fagémido Bluescript ™ (Stratagene).

El dominio A2 porcino se secuenció completamente mediante secuenciación didesoxi. El ADNc y secuencia de aminoácidos predicha son como se describe en las SEC ID números 3 y 4, respectivamente.

Ejemplo 7 Preparación del factor VIII híbrido humano/animal recombinante

El nucleótido y las secuencias de aminoácidos predichas (SEC ID números 1 y 2, respectivamente) del factor VIII humano se han descrito en la bibliografía [Toole y col., (1984) Nature 312: 342 - 347 (Genetics Institute); Gitschier y col., Nature 312: 326 - 330 (Genentech); Wood, y col., (1984) Nature 312: 330 - 337 (Genentech); Vehar y col., Nature 312: 337 - 342 (Genentech)].

La realización del factor VIII híbrido humano/animal recombinante requiere que un ADNc del factor VIII humano (Biogen Corp.) se retire y la secuencia del ADNc animal que tiene identidad de secuencia se inserte. Posteriormente, al ADNc se expresa en un sistema de expresión apropiado. Como ejemplo, los ADNc del factor VIII híbrido se clonaron en los cuales alguno o todos el dominio A2 porcino se sustituyó por las secuencias A2 humanas correspondientes. Inicialmente, al secuencia de ADNc entera correspondiente al dominio A2 del factor VIII humano y después una pequeña parte del dominio A2 formó bucles mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos, un procedimiento conocido comúnmente por los expertos en la técnica (véase por ejemplo, Sambrook, J., E. F. Fritcsch, y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, capítulo 15, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1989). Las etapas fueron como sigue:

Materiales

Metoxicarbonil-D-ciclohexilglicil-glicil-arginina-p-nitroanilida Spectrozyme™ Xa) y los anticuerpos monoclonales anti - factor VIII ESH4 y ESH8 se compraron en American Diagnostica (Greenwich, CT). Vesículas de fosfatidilcolina/fosfatidilserina unilamelar (75/25, p/p) se prepararon según el procedimiento de Barenholtz, Y., y col., 16 Biochemistry 2806 - 2810 )1977)). Se obtuvo desulfatohirudin recombinante del Dr. R. B. Wallis, CIba - Geigy Pharmaceuticals (Cerritos, CA). Los factores IXa, X, Xa y trombina porcinos se aislaron según los procedimientos de Lollar y col., (1984) Blood 63: 1303 - 1306, y Duffy, E. J. y col., (1992) J. Biol. Chem. 207: 7621 - 7827. El factor VIII humano recombinante puro exento de albúmina se obtuvo de Baxter - Biotech (Deerfield, IL).

Clonación del dominio del factor VIII porcino

El ADNc que codifica el dominio A2 porcino se obtuvo siguiendo la PCR de ARNm de bazo de transcripción inversa aislado como describen Chomczyneki, P. y col., (1987) Anal. Biochem. 62: 156 - 159. El ADNc se preparó usando el kit de síntesis de ADNc de la primera cadena con hexámeros al azar como cebadores (Pharmacia, Pisacataway, N. J.). La PCR se llevó a cabo usando un cebador degenerado 5' - terminal 5'AARCAYCCNAARACNTGGG3' (SEC ID Nº: 11), basándose en la secuencia de aminoácidos de A2 porcina limitada, y el cebador exacto 3' - terminal 5'GCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTC3' (SEC ID: Nº 12), basándose en la secuencia de ADN porcina conocida inmediatamente 3' del dominio A2 porcino. Estos oligonucleótidos corresponden a los nucleótidos 1186 - 1203 y 2289 - 2313 en la secuencia humana (SEC ID Nº 1). La amplificación se llevó a cabo durante 35 ciclos (1 minuto 94ºC, 2 minutos 50ºC, 2 minutos 72ºC) usando la Taq ADN polimerasa, (Promega Corp., Madison, WI). El fragmento amplificado de 1,1 kilobase se clonó en pBluescript II KS - (Stratagene) en el sitio EcoRV usando el procedimiento del vector T, como describieron Murchuk, D. y col., (1991) Nucl. Acids. Res. 19: 1154. Las células XL1 - Blue - competentes de Escherichia coli se transformaron, y se aisló el ADN de plásmido. La secuenciación se llevó a cabo en ambas direcciones usando Sequenase™ versión 2.0 (U. S. Biochemical Corp., una División de Amersham Life Science, Inc., Arlington Hts, IL). Esta secuencia se confirmó mediante una secuencia idéntica que se obtuvo mediante secuenciación directa del producto de PCR a partir de una transcripción inversa independiente de ARN de bazo del mismo cerdo (Circuí Vent™, New England Biolabs, Beverly, MA). La región que contiene el epítope para autoanticuerpo RC se identificó como 373 - 536 en el factor VIII humano (SEC ID Nº 2).

Construcción y expresión de una ADNc del factor VIII híbrido humano/porcino

El factor VIII humano sin dominio B (HB, de Biogen, Inc. Cambridge, MA), que carece de las secuencias que codifican los residuos de aminoácidos 741 - 1648 (SEC ID Nº 2), se usó como material de partida para la construcción de un factor VIII híbrido humano/porcino. HB se clonó en el vector de expresión ReNeo. Para facilitar la manipulación, el ADNc para el factor VIII se aisló como un fragmento XhoI/HpaI a partir de ReNeo y se clonó en pBluescript II KS digerido con XhoI/EcoRV. Un oligonucleótido 5' CCTTCCTTTATCCAAATACGTAGATCAAGAGGAAATT
GAC 3' (Sec Id nº 7), se usó en la reacción de mutagénesis dirigida al sitio usando el ADN del fago que contiene uracilo, como describen Kunkel, T. A. y col., (1991) Meth. Enzynol 204: 125 - 139, para formar bucles simultáneamente la secuencia de A2 humana (nucleótidos 1169 - 2304 en la SEC ID Nº 1) y se introduce un sitio de restricción SnaBI. El factor VIII humano de A2 sin dominio que contenía plásmido se digirió con SnaBI seguido de la adición de engarces ClaI. Después el dominio porcino A2 se amplificó mediante PCR usando el cebador en 5' fosforilado 5' GTAGCGTTGCCAAGAAGCACCCTAAGACG 3' (SEC ID Nº 8) y el cebador 3' 5' GAAGAGTAGTACGAGT
TATTTCTCTGGGTTCAATGAC 3' (SEC ID Nº 9), respectivamente. Los engarces ClaI se añadieron al producto de PCR seguido de ligamiento en el vector que contiene el factor VIII. Las uniones A1/A2 y A2/A3 se corrigieron para restablecer las secuencias de escisión de trombina y las flanqueantes precisas mediante mutagénesis dirigida al sitio usando el nucleótido mostrado en la SEC ID Nº 8 y nucleótidos 1 - 22 (%' GAA ... TTC en la SEC ID Nº 9) para corregir las uniones 5' - y 3' - terminales, respectivamente. En la construcción resultante, designada HP1, el dominio A2 humano estaba exactamente sustituido con el dominio A2 porcino. Un producto preliminar contenía una timina no deseada en la unión A1 - A2 como resultado de la amplificación de PCR del dominio A2 porcino. Esta base individual formó bucles mediante el uso del oligonucleótido mutagénico 5' CCTTTATCCAAATACGTAGCGTTTGC
CAAGAAG 3' (SEC ID Nº 10). La secuencia de nucleótidos híbrida resultante codificó el factor VIII activo codificado por que tiene los dominios A1 humano, A2 porcino y A3, C1 y C2 humano.

Una región que contiene 63% del dominio A2 NH_{2} terminal porcino, que comprende el epítope A2 supuesto, se sustituyó por la secuencia humana homóloga del ADNc sin dominio B mediante intercambio de los fragmentos SpeI/BamHI entre los plásmidos pBluescript que contienen el factor VIII humano y el ADNc del factor VIII humano/porcino A2. La secuencia se confirmó mediante secuenciación del dominio A2 y sitios de ayuste. Finalmente, un fragmento SpeI/ApaI, que contiene la secuencia entera A2, se sustituyó en lugar de la secuencia correspondiente en HB, produciendo la construcción HB.

La expresión preliminar de HB y HP2 en células COS - 7 se ensayaron después de transfección de ADN mediada por DEAE - dextrano, como describe Seldon, R. F. en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. MN., y col., eds), pp. 9.21 - 9.26, Wiley Interscience, N. Y. Después la expresión del factor VIII activo se confirmó y se realizaron estudios de inhibición de anticuerpos, después se transfectaron el ADN de HB y HP establemente en células de riñón de cría de hámster usando transfección mediada por liposomas (Lipofectin ® Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). Los plásmidos que contenían clones se seleccionaron para evaluar resistencia en medio F12 de Eagle modificado de Dulbecco, suero de ternera fetal al 10% (DMEM - F12 /suero de ternera fetal al 10%) conteniendo 400 \mug/ml de G418, seguido de mantenimiento en DMEM - F12/suero de ternera fetal al 10% conteniendo 100 \mug/ml de G418. Las colonias que muestran expresión máxima de actividad del factor VIII de HB y HP2 se seleccionaron mediante clonación en anillo y se expandieron para caracterización adicional.

La expresión del factor VIII de HB y HP2 se compararon mediante el ensayo del factor VIII exento de plasma, ensayo de coagulación de una fase, y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima usando factor VIII humano recombinante humano como patrón. Las actividades coagulantes específicas de 2600 y 2580 unidades/mg se obtuvieron para HB y HP2 respectivamente. HB y HP2 produjeron 1,2 y 1,4 unidades/ml/48 horas/10^{7} células, respectivamente. Esto es idéntico a la de la construcción de tipo salvaje (2.600 \pm 200 unidades/mg). Las actividades específicas de HB y HP2 eran indistinguibles en el ensayo del factor VIII exento de plasma.

La actividad biológica del factor VIII híbrido recombinante humano/animal y equivalente con las sustituciones de los dominios A1, A2, A3, C1 y/o C2 se pueden evaluar inicialmente mediante el uso de un sistema de expresión transitorio de mamíferos en células COS. El ADNc híbrido humano/animal y equivalente se pueden transfectar en células COS, y los sobrenadantes se pueden analizar para evaluar la actividad del factor VIII mediante el uso de ensayos de coagulación de una fase y dos fases como se ha descrito anteriormente. Adicionalmente, la actividad del factor VIII se puede medir mediante el uso de un ensayo de sustrato cromogénico, que es más sensible y permite el análisis de un número mayor de muestras. Los ensayos similares son convencionales en el ensayo de actividad del factor VIII [Wood y col., (1984) Nature 312: 330 - 337; Toole y col., (1984) Nature 312: 342 - 347]. La expresión del factor VIII recombinante en células COS es también un procedimiento habitual Toole y col., (1984) Nature 312: 342 - 347; Pittman y col., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2429 - 2433].

El ADNc del factor VIII humano usado como materiales de partida para las moléculas recombinantes descritas en esta memoria descriptiva se han expresado en células COS produciendo un producto con actividad biológica. Este material, como se ha descrito anteriormente, se puede usar como patrón para comparar las moléculas del Toole y col., (1984) Nature 312: 342 - 347 híbrido humano/animal. La actividad en los ensayos se convierte en una actividad específica para comparación apropiada de las moléculas híbridas. Para esto, es necesaria una medición de la masa del l factor VIII producida por las células si es necesario y se puede hacer mediante inmunoensayo con factor VIII purificado humano y/o animal como patrones. Los inmunoensayos para el factor VIII son rutinarios para los expertos en la técnica [Véase, por ejemplo, Lollar y col., (19888) Blood 71: 137 - 143].

Ejemplo 8 Determinación de la actividad inhibidora en el factor VIII híbrido humano/animal y equivalente

Las secuencias del Toole y col., (1984) Nature 312: 342 - 347 humano y animal probablemente están implicadas como epítopes (es decir, como sitios de reconocimiento para anticuerpos inhibidores que reaccionan con el factor VIII) se pueden determinar usando procedimientos rutinarios, por ejemplo, mediante el uso de ensayo con anticuerpos para el factor VIII combinado con técnicas de mutagénesis dirigida al sitio tales como por procedimientos de ayuste por solapamiento de la extensión (SOE), como se muestra más adelante. Se pueden identificar las secuencias del factor VIII animal que son no antigénicos comparadas con las secuencias de humano antigénico correspondiente, y se pueden realizar sustituciones para insertar secuencias animales y suprimir secuencias humanas según los procedimientos de ADN recombinante convencionales. Las secuencias de aminoácidos tales como residuos de alanina que no tienen identidad de secuencia conocida al factor VIII también se pueden sustituir mediante procedimientos de ADN recombinante habitual o mediante mutagénesis por barrido de alanina. El factor VIII porcino reacciona menos que el factor VIII humano con algunos anticuerpos inhibidores; esto proporciona una base para la terapia actual de pacientes con inhibidores. Después de que se preparan los híbridos recombinantes se pueden ensayar in vivo para evaluar la reactividad con ensayos rutinarios, que incluyen el ensayo inhibidor de Bethesda. Las construcciones que son menos reactivas que el factor VIII humano nativo y el factor VIII animal nativo son candidatos para terapia de
reemplazo.

Los epítopes a los que la mayoría, si no todos, los anticuerpos inhibidores reaccionan con el factor VIII humano se dirigen se cree que residen en dos regiones en el aminoácido 2332 de la molécula del factor VIII humano, el dominio A2 (residuos de aminoácidos 373 - 740) y el dominio C2 (residuos de aminoácidos 2173- 2332), ambas secuencias mostradas en al SEC ID Nº 2). El epítope A2 se ha eliminado preparando una molécula del factor VIII híbrido humano - porcino recombinante en la que parte del dominio A2 humano se reemplaza por la secuencia porcina que tiene identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos humano reemplazada. Esto se llevó a cabo, como se ha descrito en el ejemplo 7, mediante la clonación del dominio A2 porcino mediante técnicas de biología molecular convencionales y después cortando y ayustando con el dominio A2 usando sitios de restricción. En la construcción resultante, designada HP2, los residuos 373 - 604 (SEC ID Nº 4) del factor VIII porcino se sustituyeron en el dominio A2 humano. HP2 se ensayó para evaluar la inmunoeactividad con anticuerpos del factor VIII anti humano usando los siguientes procedimientos.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima del factor VIII

Los pocillos de las placas de micorotitulación se recubrieron con 0,15 ml de 6 \mug/ml de ESH4, un anticuerpo de cadena ligera del factor VIII, y se incubaron durante una noche. Después la placa se lavó tres veces con H_{2}O los pocillos se bloquearon durante 1 hora con NaCl 0,15 M, fosfato sódico 10 mM, Tween 20 al 0,05%, lecha grasa no grasa al 0,05% azida sódica al 0,05%, pH 7,4, para incrementar la sensibilidad, se activaron muestras que contenían factor VIII con trombina 30 nM durante 15 minutos. Después se añadió desulfatohirudina recombinante a 100 nM para inhibir trombina. La placa se lavó otra vez y se añadieron 0,1 ml de muestra o factor VIII humano puro recombinante (10 - 600 ng/ml), usado como patrón. Después de 2 horas de incubación, la placa se lavó y se añadió a cada pocillo 0,1 ml de ESH8 biotinilado, otro factor de anticuerpo de cadena ligera del factor VIII. ESH8 se biotiniló usando el kit se biotinilación de sulfosuccinimidil-6-(biotinamida)hexanoato de Pierce. Después de 1 hora de incubación, la placa se lavó y se añadió a cada pocillo 0,1 ml de estreptavidina fosfatasa alcalina. La placa se desarrolló usando el kit de reactivo de sustrato de fosfatasa alcalina de Bio - Rad, y la absorbancia resultante a 405 nm para cada pocillo se determinó usando un lector de placas de microtitulación Vmax (Molecular Devices, Inc., Sunnyville, CA). Las concentraciones del factor VIII desconocido se determinaron a partir de la porción lineal de la curva patrón del factor VIII.

Ensayos de factor VIII

El factor VIII de HB y HP2 se midieron en un ensayo de coagulación de una fase, que se realizó como se ha descrito anteriormente [Bowie, E. J. W., y C. A. Owen, en Disorders of Hemostasis (Ratnoff y Forbes, eds) pp. 43 - 72, Grunn y Stratton, Inc., Orlando, FL (1984)], o mediante un ensayo exento de plasma como sigue. El factor VIII de HB y HP2 se activó mediante trombina 40 nM en NaCl 0,15 M, HEPES 20 nM, y CaCl_{2} 5 mnM, Tween 80 al 0,01%, pH 7,4, en presenc1a de factor IXa 10 nM, factor X 425 nM, y vesículas de fosfatidilserina/fosfatidilcolina (25/75, p/p) unilamelares 50 \muM. Después de 5 minutos, la reacción se detuvo con EDTA 0,05 M y desulfatohirudina recombinante 100 nM, y el factor Xa resultante se midió mediante ensayo de sustrato cromogénico, según el procedimiento de Hill - Eubanks y col., (1990) J. Biol. Chem. 265: 17854 - 17858. En estas condiciones, la cantidad del factor Xa formado era linealmente proporcional a la concentración del factor VIII de partida como se juzgó usando el factor VIII humano recombinante purificado (Baxter Biotech, Deerfield, IL) como patrón.

Antes del ensayo de coagulación, el factor VIII de HP o HP2 se concentraron a partir medio acondicionado durante 48 horas hasta 10 - 15 unidades/ml mediante cromatografía en heparina - Sefarosa ™. El factor VIII de HB o HP2 se añadió a plasma de hemofilia A (George King Biomedical) hasta una concentración final de 1 unidad/ml. Los títulos de los inhibidores en plasma RC o MR o una solución madre de mAb 413 IgG (4 \muM) se midieron mediante el ensayo de Bethesda como describen Kasper, C. K. y col (1975) Thromb. Diíta. Haemorrh 34: 869 - 872. Se preparó la IgG del inhibidor como describen Leyte, A. y col (1991) J. Biol. Chem. 266: 740 - 746.

HP2 no reacciona con anticuerpos anti A2. Por lo tanto, los residuos 373 - 603 deben contener un epítope para anticuerpos anti - A2.

Preparación del factor VIII híbrido humano - porcino y ensayo mediante ayuste por solapamiento de la extensión (SOE)

Se han preparado varias más moléculas sin dominio del factor VIII B híbrido porcino recombinante coagulante con sustituciones de aminoácidos porcinos en al región A2 para reducir adicionalmente el epítope A2. Además técnicas en el sitio de restricción, el procedimiento de "ayuste por solapamiento de la extensión" (SOE) como describen Ho y col., (1989) Gene 77: 51 - 59, se han usado para sustituir cualquier región arbitraria del ADNc del factor VIII porcino. En SOE, el sitio de ayuste se define mediante oligonucleótidos de superposición que se pueden amplificar para producir el ADNc deseado mediante PCR. Se han preparado diez construcciones de ADNc, designados HP4 a HP13. Se insertaron en el vector de expresión ReNeo, transfectados establemente en células de riñón de cría de hámster, y se expresaron a altos niveles [0,5 - 1 \mug (aproximadamente 3 - 6 unidades)/10^{7} células/24 horas] como se ha descrito en el ejemplo 7. La actividad coagulante del factor VIII se determinó en presencia y ausencia de un anticuerpo inhibidor monoclonal murino específico para el dominio A2, mAb413. En ausencia del inhibidor, todas las construcciones tenían una actividad coagulante específica que era indistinguible del factor VIII humano
B(-).

Las construcciones del factor VIII híbrido humano/porcina se ensayaron para evaluar la reactividad con el mAb413 inhibidor anti - A2 usando el ensayo Besad [Kasper y col., (1975) Thromb. Diíta. Haemorrh. 34: 869 - 872]. La unidad Bethesda(BU) es el procedimiento habitual para medir titulaciones de los inhibidores. Los resultados se muestran en la tabla V, y se comparan con el factor VIII humano recombinante.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA V Comparación de inmunorreactividad de factor VIII híbrido humano/porcino aminoácido - sustituido

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Los límites de las sustituciones porcinas se definen por los primeros aminoácidos que difieren entre el factor VIII porcino en los extremos NH_{2}-terminal y C-terminal de la inserción. Como se muestra en la tabla V, si la titulación de Bethesda no es medible (< 0,7 BU/mg de IgG), después un epítope A2 se sitúa en la región de la secuencia se secuencia porcina sustituida. El epítope se da reducido progresivamente a los residuos 484 - 509 (SEC ID Nº 2), constituidos por 25 residuos solamente, como se ejemplifica mediante la no reactividad de mAb413 con HP9. Entre las construcciones HP4 a HP11, HP9 era la construcción más "humanizada" que no reacciona con el inhibidor. Esto indica que una región crítica en el epítope A2 se localiza en la secuencia Arg 484 - Ile 508.

Basándose en una comparación entre el factor VIII humano y porcino de la secuencia de aminoácidos en esta región crítica, se realizaron dos construcciones más, HP12 y HP134, en las que la secuencia de aminoácidos porcina correspondiente se sustituyó por los aminoácidos 484 - 488, respectivamente. Ninguno reacciona con mAb13. Esto indica que los residuos en cada lado del enlace Arg 488 - Ser 489 son importantes para la reacción con los inhibidores A2. En HP12 solamente 5 residuos son no humanos, y en HP13 solamente 4 residuos son no humanos. Los híbridos porcinos sustituidos 484 - 508, 484 - 488, y 489 - 508 mostraron una disminución en la inhibición mediante los inhibidores A2 de cuatro plasmas de pacientes, sugiriendo que existe poca variación en la estructura del epítope A2 según la respuesta de la población del inhibidor.

Se determinó la reactividad de las construcciones más humanizadas, HP9, HP12 y HP13, con dos preparaciones de IgG5 anti - A2 preparadas a partir de los plasmas de inhibidores. Como mAb413, estos anticuerpos no reaccionaron con HP9, HP12, y HP13, pero reaccionaron con las construcciones control HP (-) y HP8.

La región entre 484 - 508 se puede analizar adicionalmente para identificación final del epítope A2, usando los mismos procedimientos.

Los procedimientos descritos en los ejemplos 7 y 8 se pueden usar para preparar otro factor VIII híbrido humano7 de mamífero no porcino con sustitución de aminoácidos en el dominio A2 humano u otros dominios, sustituidos híbrido humano/animal o animal/animal con sustitución de aminoácidos en cualquier dominio, o moléculas equivalentes del factor VII híbrido o fragmentos de cualquiera de éstos, tal como el factor VIII híbrido que tienen inmunorreactividad reducida o ausente con anticuerpos anti - factor VIII.

Ejemplo 9 Eliminación de la reactividad del inhibidor A2 del factor VIII humano mediante mutagénesis dirigida al sitio

El ejemplo 8 mostró que las sustitución de la secuencia porcina unida mediante los residuos 484 y 508 en el dominio A2 del factor VIII humano produce una molécula que ha disminuido notablemente la reactividad con un panel de inhibidores del factor VIII específico de A2 [véase también Healey y col., (1995) J. Biol. Chem. 270: 14505 - 14509]. En esta región, existen 9 diferencias de aminoácidos entre el factor VIII humano y porcino. Estos nuevos residuos en el factor VIII sin dominio B humano, R484, P485, Y487, P488, R489, P492, V495, F501, e I508 (usando el código de aminoácido se una sola letra), se cambiaron individualmente a alanina mediante mutagénesis dirigida al sitio. Adicionalmente, los sitios de restricción Mlu1 y Sac2 se colocaron en el ADNc del factor VIII en los sitios 5' y 3' con relación al epítope A2, sin cambiar los aminoácidos correspondientes a estos sitios, para facilitar la clonación. Los nueve mutantes se trasnfectaron establemente en células de riñón de cría de hámster y se expresaron a altos niveles. Los nueve produjeron factor VIII biológicamente activo. Se purificaron parcialmente y se concentraron mediante cromatografía den heparina - Sefarosa como han descrito Healey y col.

Los mutantes se han caracterizado por su reactividad con el inhibidor murino monoclonal MAb413 como en el ejemplo 7. Este inhibidor reconoce el mismo o un epítope muy estrechamente agrupado en el dominio A2 como todos los inhibidores humanos estudiados hasta la fecha. La reactividad inhibidora se midió usando un ensayo Bethesda. En resumen, la titulación de Bethesda de un inhibidor es la dilución de inhibidor que inhibe el factor VIII en un 50% en un ensayo convencional de coagulación del factor VIII de una fase. Por ejemplo, si la solución de anticuerpo se diluye 1/420 e inhibe la muestra de ensayo del factor VIII recombinante en un 50%, la titulación de Bethesda es 420 U. En el caso de un monoclonal puro como MAb413, la masa de anticuerpo es conocida, así que los resultados se expresan en unidades Bethesda (BU) por mg de MAb413. Para encontrar el punto de inhibición del 50%, se realizó un intervalo de diluciones de MAb413 y se encontró una inhibición del 50% mediante un procedimiento de ajuste de curva. Los resultados son como sigue:

*TABLA VI

6

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Estos resultados indican que es posible reducir la antigenicidad del factor VIII hacia el modelo inhibidor A2 en un factor de 10 realizando sustituciones de alanina en las posiciones 484, 487, 489, y 492. La reactividad de R489 \rightarrow A se reduce en aproximadamente 4 órdenes de magnitud. Cualquiera de estas sustituciones de alanina puede ser terapéuticamente útil para reducir la antigenicidad y la inmunogenicidad del factor VIII.

Los resultados confirman la eficacia de mutagénesis por barrido de alanina y adicionalmente demuestran que la actividad biológica se conserva incluso aunque la secuencia de aminoácidos se ha alterado en un epítope reactivo a un anticuerpo inhibidor. Cinco de los nueve sitios en los que las secuencias humanas y porcinas difieren son también sitios en los que las secuencias humanas y murinas difieren. Los factores VIII que tienen sustituciones de alanina en estas posiciones son por lo tanto ejemplos de una molécula equivalente del factor VIII híbrido que tiene una secuencia con identidad de secuencia no conocida con cualquier factor VIII de mamífero conocido actualmente.

Una modificación adicional, por ejemplo, combinando dos sustituciones de alanina, también puede proporcionar antigenicidad reducida en gran medida para un intervalo mayor de pacientes, ya que los anticuerpos variantes policlonales que difieren de paciente a paciente pueden reaccionar con variantes del epítope A2 del factor VIII. Además, la inmunogenicidad (la capacidad de inducir anticuerpos) se reduce adicionalmente mediante incorporación de más de una sustitución de aminoácidos. Tales sustituciones pueden incluir tanto alanina, aminoácidos específicos de porcino, como otros aminoácidos conocidos que tienen potencial inmunogénica baja. Las sustituciones en las pociones 490, 495 y 501 son probablemente útiles en la reducción de inmunogenicidad. Además, estas sustituciones probablemente reducen la reactividad a ciertos anticuerpos de pacientes.

Otras sustituciones de aminoácidos que reducen la antigenicidad, además de alanina, se pueden realizar tan largas como cuidado se tome para evitar las indicadas previamente por ser contribuidores principales a la energía de unión de antígeno - anticuerpo, o que tiene cadenas laterales voluminosas o cargadas. Los aminoácidos cuyas sustituciones en un epítope reducen la reactividad antigénica del mismo se denominan aminoácidos "reductores de inmunorreactividad" en esta memoria descriptiva. Además de la alanina, otros aminoácidos reductores de inmunorreactividad incluyen, sin limitación, metionina, leucina, serina y glicina. Se entenderá que la reducción de la inmunorreactividad que se puede lograr mediante un aminoácido también dependerá de cualquier efecto que la sustitución pueda tener sobre la conformación de proteínas, accesibilidad de epítope y similares.

Las sustituciones de aminoácidos en otros sitios dentro del epítope A2 (aminoácidos 484 - 508) además de las que difieren entre las secuencias humanas y porcinas, son además capaces de reducir la reactividad hacia anticuerpos inhibidores. La mutagénesis por barrido de alanina se puede usar para proporcionar sustituciones de alanina para cualquier aminoácido dentro del epítope A2. Cada factor VIII modificado resultante se puede ensayar para evaluar la actividad procoagulante y para inhibición de la actividad mediante un anticuerpo inhibidor. Otros aminoácidos reductores de inmunorreactividad además de alanina se pueden sustituir para reducir antigenicidad del factor VIII modificado resultante. Los reemplazos de aminoácidos se pueden combinar en una molécula del factor VIII individual para maximizar las propiedades deseadas que se producen da tales sustituciones.

El reemplazo de esos aminoácidos que contribuyen a la mayoría de la energía de unión de una interacción anticuerpo - factor VIII es el más preferido. Estos incluyen la sustitución de un aminoácido reductor de inmunorreactividad en cualquier posición 493, 496, 499, 500, 502, 503, 505, y 507. Los datos para los reemplazos de este tipo, en las posiciones 484, 485, 499, 490, 492, 501 y 508 han demostrado que tales reemplazos conservan la actividad procoagulante y disminuyen la susceptibilidad a la inhibición mediante anticuerpos inhibidores. (Tabla VI) Los reemplazos de histidina se han observado en secuencias de origen natural. Por ejemplo, en la posición 504 la histidina del factor VIII de ratón se reemplaza por leucina en el factor VII tanto porcino como humano. El factor VII tanto porcino como de ratón tienen una histidina en la posición 487, donde el factor VIII tiene tirosina. El reemplazo de tirosina con alanina en la posición 487 da como resultado procoagulante activo con antigenicidad sustancialmente reducida (Tabla VI). Por analogía, el reemplazo de histidina en la posición 497 por un aminoácido reductor de inmunorreactividad también puede dar como resultado la retención de actividad procoagulante y contribuye a reducir la inhibición por anticuerpos inhibidores. Los aminoácidos reductores de inmunoreactividad también se pueden sustituir en las posiciones 486, 488, 491, 494, 498, 504 y 506. Aunque los aminoácidos existentes en estas posiciones parece menos probable que contribuyan a la unión de anticuerpos, se ha demostrado (tabla VI) que la sustitución de un aminoácido reductor de inmunorreactividad en tales sitios, por ejemplo, S488A, contribuye a reducir la inhibición de anticuerpos de actividad procoagulante.

De una comparación de las secuencias humana, porcina, murina (Fig. 1A - 1H) y canina [Cameron, C. y col., (1998) Thromb. Haemost. 79: 317 - 322] en el epítope A2, es evidente que al región tolera una cantidad significativa de variabilidad de secuencia. Solamente12 loci se conservan entre las cuatro especies. Ninguna de éstas se puede considerar que es esencial para actividad procoagulante. De hecho, el reemplazo por alanina de la arginina conservada en la posición 490 (R490 \rightarrow A, tabla VI) da como resultado el factor VIII modificado activo que tiene actividad reducida para un anticuerpo inhibidor. Uno o más reemplazos de de aminoácidos se pueden realizar sin afectar sustancialmente la actividad procoagulante. Por ejemplo, el reemplazo de dos aminoácidos implicados en al unión a anticuerpos puede reducir la inhibición por un anticuerpo en un mayor grado que cualquiera solo. También, múltiples reemplazos pueden hacer que el factor VIII resultante modificado sea menos responsable a una variedad más amplia de anticuerpos de pacientes que un solo reemplazo de aminoácidos.

Los reemplazos de aminoácidos individuales se pueden evaluar para sus propiedades de antigenicidad reducida, así como para otros atributos funcionales del factor VIII. Evaluando las propiedades conferidas por reemplazos de aminoácidos individuales, es posible identificar los reemplazos de combinación de dos o más aminoácidos que proporcionan un factor VIII modificado que tiene propiedades optimizadas, en la medida en lo que concierne a la región de aminoácidos 484 - 508.

La mutagénesis dirigida al sitio se puede usar para modificar el ADN del factor VIII en la región que codifica los aminoácidos 484 - 508 de manera que proporcione una secuencia que codifica el factor VIII modificado que tiene un reemplazo de aminoácidos deseado. En el sitio apropiado de la secuencia de ADN del factor VIII humano, el triplete que codifica un aminoácido existente se puede cambiar por mutagénesis dirigida al sitio que codifica el aminoácido deseado. El triplete que codifica el aminoácido deseado puede ser cualquiera de los tripletes conocidos especificados en el código genético. La alteración de la secuencia natural que codifica una sustitución de aminoácidos individual se puede llevar a cabo a menudo con un cambio de una sola base, ocasionalmente más, hasta un máximo de tres bases. Mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio, todas las sustituciones de bases necesarias se pueden llevar fácilmente a cabo de manera que alteren el código existente al necesario para codificar la sustitución de aminoácidos deseada. Algunos ejemplos de cambios de bases que conducen a las sustituciones de aminoácidos especificadas se proporcionan más adelante. Éstas son solamente ejemplares, y no exhaustivas:

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}

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Los ejemplos anteriores demuestran que muchas sustituciones de aminoácidos reductores de inmunorreactividad se pueden llevar a cabo mediante cambios de nucleótidos individuales. Otras sustituciones deseadas se pueden llevar a cabo de una manera similar, haciendo referencia al código genético para seleccionar un triplete nucleótido deseado que codifica el sustituyente se aminoácidos propuesto, después introduciendo los cambios de nucleótidos necesarios para generar el triplete propuesto, mediante mutagénesis dirigida al sitio. El factor VIII modificado sustituido de forma múltiple se puede realizar mediante combinaciones simples de cambios de nucleótidos tales como los recién descritos. Por ejemplo, un factor VIII modificado que tiene dos aminoácidos del dominio A2 reemplazados, por ejemplo, R489 \rightarrow A y P492 \rightarrow L se pueden realizar introduciendo AGG \rightarrow GCG y CCA \rightarrow CTA en los sitios apropiados, un cambio de tres nucleótidos. Se puede diseñar y llevar a cabo cualquier otro cambio o combinación deseada de cambios, esencialmente como se ha descrito. La secuencia de ADN del factor VIII que se produce de la mutagénesis dirigida al sitio difiere entonces de la secuencia humana natural o de secuencias modificadas de otra manera como se ha descrito en otra parte en esta memoria descriptiva, solamente teniendo las(s) sustitución(es) de nucleótidos en el sitio definido. La actividad procoagulante se ensaya como se ha descrito anteriormente, (ejemplos 1 y 8), mediante cualquiera de los ensayos de de una fase o de dos fases. El ensayo para la titulación del inhibidor es el ensayo Bethesda, descrito anteriormente y por Kasper, C. K. y col., anteriormente, ejemplo 8.

Ejemplo 10

El fragmento Klenow, engarces ClaI fosforilado, engarces NotI, ligasa de Ta, y Taq ADN polimerasa se compraron en Promega (Madison, Wisconsin). La polinucleótido quinasa se compró en Life Technologies, Inc Gaithersburg, Maryland. \gamma^{32}P-ATP (Redivue, > 5000 Ci/mmol) se compró en Amersham. pBluescript II KS- y células Eipicurean XL1-Blue de E. coli se compraron en Stratagene (La Jolla, California).Los oligonucleótidos sintéticos se compraron en Life Technologies, Inc. o Cruachem, Inc. Los cebadores 5' fosforilados se usaron cuando se produjeron productos de PCR para propósitos de clonación. La numeración de nucleótidos (nt) de oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ADNc del fVIII porcino o ADN genómico usa el ADNc del fVIII humano como referencia (Wood y col., (1984) anteriormente).

El ARN total de bazo porcino se aisló mediante extracción en tiocianato de guanidinio ácido-fenol-cloroformo [Chomczynski P. y col., (1987) Anal. Biochem. 162: 156 - 159]. El ADNc porcino se preparó a partir de ARN total de bazo usando transcriptasa inversa (RT) de virus de la leucemia murina de Moloney (kit de síntesis de la primera cadena de ADNc, Pharmacia Biotech) salvo que se indique de otra manera. Las reacciones de RT contenían Tris - Cl 45 mM, pH 8,3, KCl 68 mM, DTT 15 mM, MgCl_{2} 9 mM, 0,8 mg/ml de albúmina sérica bovina y desoxinucleótido trifosfato (dNTP) 1,8 mM. El ADN genómico porcino se aisló a partir de bazo usando un procedimiento convencional (Strauss, W. M. (1995) en Current Protocol in Molecular Biology, F. M. Ausubel y col., editores, John Wiley y Sons, pp. 2.2.1. - 2. 2.3) El aislamiento de ADN a partir de geles de agarosa se realizó usando Geneclean II (Bio 101) o kit de extracción Quiex II Gel (Qiagen).

Las reacciones de PCR se realizaron usando un termociclador Hybaid OmniGene. Para las reacciones de PCR que emplean Taq ADN polimerasa, las reacciones incluían MgCl_{2} 0,6 mM, dNTPs 0,2 mM, cebadores de oligonucleótidos 0,5 \muM, polimerasa 50 U/ml y 0,1 volumen de mezcla de reacción de ADNc de primera cadena. Excepto cuando se indique de otra manera, los productos de PCR se purificaron en gel, extremo - romo con fragmento Klenow, se precipitaron con etanol, y bien se ligaron al sitio EcoRV de pBuescript II KS desfosforilado o se ligaron con engarces ClaI fosforilado usando ligasa de T4, se digirieron con ClaI, se purificaron mediante cromatografía en Sephacryl S4000, y se ligó a ClaI - cortado, pBluescript II KS desfosforilado. Las ligaciones se realizaron usando ADN ligasa de T4 (kit de ligación rápida de ADN, Boehringer Mannheim) excepto cuando se indica de otra manera. Los plásmidos pBluescript II KS que contienen inserciones se usaron para transformar células de Epicurean XL1 - Blue de E. coli.

La secuenciación de ADN de plásmidos se realizó usando un secuenciador de ADN automático 373a de Applied Biosystems y el kit terminador de tinte PRISM o manualmente usando el kit de secuenciación Sequenase v. 2.0 (Amersham Corporation). La secuenciación directa de los productos de PCR, incluyendo marcaje de oligonucleótidos en el extremo con ^{32}P usando un protocolo de secuenciación de ciclos (sistema de secuenciación de ciclos dsADN, Life Technologies).

Aislamiento de clones de ADNc de fVIII porcino que contiene la secuencia de 5' UTR, péptido señal y codones del dominio A1

El ADNc de 5' del fVIII porcino al dominio A2 se amplificó mediante RT - PCR anidado de ARN total de bazo de hembra de cerdo usando un protocolo de rápida amplificación en 5' de extremo de extremos de ADNc (5' - RACE) (amplificación de ADNc Marathon, Clontech, Versión PR55453). Esto incluye la síntesis del ADNc de la primera cadena usando un oligo (dT) cebador de acoplamiento a cerradura [Borson, N. D. y col (1992) PCR Methods Appl. 2: 144 - 148], síntesis de ADNc de la segunda cadena usando ADN polimerasa I de E. coli, y ligación con un adaptador de doble cadena extendida, SEC ID Nº 13 5' -CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT - 3' cuya cadena corta se bloqueó en el extremo 3' con de un grupo amino para reducir el cebado de PCR no específico y que era complementario a los 8 nucleótidos en el extremo 3' (Siebert, P. D. y col., (1995) Nucleic Acid. Res. 23: 1087 - 1088). La primera ronda de PCR se realizó usando un oligonucleótido específico del adaptador, SEC ID Nº 14, 5' - CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC - 3' (designado AP1) como cebador de polaridad positiva, y un oligonucleótido específico de dominio A2 de fVIII porcino SEC ID Nº 15 5' - CCA TTG ACA TGA AGA CCG TTT CTC - 3' (nt 2081 - 2104) como cebador de polaridad opuesta. La segunda ronda de PCR se realizó usando un oligonucleótido anidado, específico de adaptador, SEC ID Nº 16 5' - ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC - 3' (designado AP2) como cebador de polaridad positiva, y un oligonucleótido anidado, específico de dominio A2 porcino, SEC ID Nº 17 5' - GGG TGC AAA GCG CTG ACA TCA GTG - 3' (nt 1497 - 1520) como cebador de de polaridad opuesta. La PCR se llevó a cabo usando un kit comercial (kit de núcleo de PCR de ADNc de Advantage) que emplea un protocolo de inicio por calor mediado por anticuerpo [Kellogg, D. E. y col., (1994) Biotechniques 16: 1134 - 1137]. Las condiciones de PCR incluyeron desnaturalización a 94ºC durante 60 segundos, seguido de 30 ciclos (primera PCR) o 25 ciclos (segunda PCR) o desnaturalización durante 30 segundos a 94ºC, hibridación durante 30 segundos a 60ºC y elongación durante 4 minutos a 58ºC usando control de temperatura del tubo. Este procedimiento produjo un producto prominente = 1,6 kb que era consistente con amplificación de un fragmento que se extiende aproximadamente 150 bp en el 5' UTR. El producto de PCR se clonó en pBluescript usando engarces ClaI. Las inserciones de cuatro clones se secuenciaron en ambas direcciones.

La secuencia de estos clones incluían las regiones correspondientes a 137 bp de 5' UTR, el péptido señal, el dominio A1 y parte del dominio A2. Se alcanzó un consenso en al menos 3 ó 4 sitios. Sin embargo, los clones contenían una media de 4 mutaciones aparentes generadas por PCR, presumiblemente debido a múltiples rondas de PCR requeridas para generar un producto clonable. Por lo tanto, los inventores usaron la secuencia obtenida a partir de la región del péptido señal para diseñar un cebador de PCR fosforilado de la cadena de polaridad positiva, SEC ID Nº 18 5' - CCT CTC GAG CCA CCA TGT CGA GCC ACC ATG CAG CTA GAG CTC TCC ACC TG - 3', designado RENEOPIGSP, para la síntesis de otro producto de la PCR para confirmar la secuencia y para clonar en un vector de expresión. La secuencia en letra negrita representa el codón de partida. La secuencia 5' a ésta representa la secuencia idéntica a la 5' de la inserción en el vector de expresión ReNeo usado para la expresión de fVIII (Lubin y col., (1994) anteriormente). Este sitio incluye un sitio de escisión Xho 1 (subrayado) RENEOPIGSP y el oligonucleótido nt 1497 - 1520 se usaron para cebar una reacción de PCR mediada por la Taq ADN polimerasa usando ADNc de bazo de hembra de porcino como molde. Las ADN polimerasas de otros fabricantes no produjeron un producto detectable. Las condiciones de PCR incluían desnaturalización a 94ºC durante cuatro minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización durante 1 minuto a 94ºC, hibridación durante 2 minutos a 55ºC y elongación durante 2 minutos a 72ºC, seguido de una etapa de elongación final durante 5 minutos a 72ºC. El producto de PCR se clonó en pBluescript usando engarces ClaI. Las inserciones de dos de estos clones se secuenciaron en ambas direcciones y se emparejaron a las secuencias de consenso.

Aislamiento de clones de ADNc de fVIII porcino que contienen A3, C1 y la mitad 5' de los codones del dominio C2

Inicialmente, se clonaron dos productos de RT - PCR de bazo porcino, correspondiente a un fragmento del dominio B - A3 (nt 4519 - 5571) y un fragmento del dominio C1 - C2 (nt 6405 - 6990). El extremo 3' del dominio C2 que se obtuvo extendido en la región del exón 26, que es el exón terminal en fVIII. El producto fVIII se realizó usando el cebador del dominio B específico de porcino, SEC ID Nº 19 5' CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T 3', donde la región subrayada corresponde a una región en el fVIII porcino que se alinea con el nt 4519 - 4530 en fVIII humano. La región 5' del oligonucleótido incluye un sitio NotI que se propuso originalmente para propósitos de clonación. El cebador de polaridad opuesta usado en la generación del producto B - A3, SEC ID Nº 20 5' - GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA - 3' se basó en el complemento inverso de al secuencia de ADNc del fVIII humano en el nt 5545 - 5571. La reacción de PCR contenía KCl 50 mM, Tris - Cl 10 mM, pH 9,0, Triton X - 100 al 0,1%, MgCl_{2} 1,5 mM, dNTPs 2,5 mM, cebadores 20 \muM, 25 unidades/ml de Taq ADN polimerasa y volumen 1/20 de mezcla de reacción de RT. Las condiciones de PCR eran desnaturalización a 94ºC durante 3 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturalización durante 1 minuto a 94ºC, hibridación durante 2 minutos a 50ºC y elongación durante 2 minutos a 72ºC. Los productos de PCR se fosforilaron usando ADN quinasa de T4 y se añadieron engarces NotI. Después de cortar con NotI, se clonaron los fragmentos de PCR en el sitio NotI de Bluescript II KS- y se transformaron en células HL1 - Blue.

El producto C1 - C2 se realizó usando la secuencia de ADNc humano conocida para sintetizar cebadores de polaridad positiva y de polaridad opuesta, SEC ID Nº 21 5' - AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N - 3' (nt 6405 - 6426) y SEC ID Nº 22 5' - CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N 3' (complemento inverso del nt 6966 - 6990), respectivamente. Las condiciones de PCR eran idénticas a las usadas para generar el producto B - A2. El fragmento resultante se ligó al vector de clonación pNOT usando el sistema de clonación de PCR Prime Cloner (5 Prime - 3, Prime, Inc., Boulder, Colorado) y se desarrollaron en células JM109.

Los plásmidos B-A3 y C1-C2 se secuenciaron parcialmente para preparar los oligonucleótidos de polaridad positiva y polaridad opuesta específicos de porcino, SEC ID Nº 23, 5' - GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG - 3' (nt 4551 - 4573) y SEC ID Nº 24 5' - ACA GCC CAT CAA CTC CAT GCG AAG - 3' (nt 6541 - 6564), respectivamente. Estos oligonucleótidos se usaron como cebadores para generar un producto de RT - PCR de 2013 bp usando un kit de PCR de ADNc de Clontech Advantage. Este producto, que corresponde a nt 4551 - 6564 humano, incluye la región correspondiente al péptido de activación de cadena ligera (nt 5002 - 5124), dominio A3 (nt 5125 - 6116) y la mayoría del dominio C1 (nt 6115 - 6573). La secuencia del clon C1- C2 había establecido que los ADNc humano y porcino de nt 6565 al extremo 3' del dominio C1 eran idénticos. El producto de PCR se clonó en el sitio EcoRV de pBluescript II KS-. Cuatro clones se secuenciaron completamente en ambas direcciones. Se alcanzó un consenso en al menos 3 de 4 sitios.

Aislamiento de lso clones de ADNc del fVIII que contienen la mitad 3' de los codones del dominio C2

El dominio C2 de fVIII humano (nucleótidos 6574 - 7053) está contenido dentro de los exones 24 - 26 [Gitschier J. y col (1984) Nature 312: 326 - 330]. El exón 26 contiene 1958 bp, correspondiente a los nucleótidos 6901 - 8858. Incluye 1478 bp de la secuencia 3' no traducida. Los intentos para clonar el ADN del exón correspondiente al extremo 3' del dominio C2 y el 3' UTR mediante 3' RACE [Siebert y col., (1995) anteriormente], PCR inversa [Ochman, H. y col., (1990) Biotechnology (NY). 8: 759 - 760], PCR del sitio de restricción [Sarkar, G. y col., (1993) PCR Meth. Appl. 2: 318 - 322], PCR "cebado impredeciblemente" [Domínguez, O. y col., (1994) Nucleic. Acids. Res. 22: 3247 - 3248] y seleccionando una genoteca de ADNc de hígado porcino fracasaron. 3' RACE se intentó usando la misma genoteca de ADNc de doble cadena ligada al adaptador que se usó para clonar con éxito el extremo 5' del ADNc del fVIII porcino. De este modo, el fracaso de este procedimiento no se debía a la ausencia del ADNc correspondiente al exón 26.

Un procedimiento de PCR ambulante del gen dirigido [Parker, J. D. y col. (1991) Nucleic. Acids. Res. 19: 3055 - 3060] se usó para clonar la mitad 3' del dominio C2. Un cebador de polaridad positiva específico de porcino, SEC ID Nº 25 5' - TCAGGGCAATCAGGACTCC - 3' (nt 6904 - 6924) se sintetizó basándose en al secuencia del dominio C2 inicial y se usó en una región de PCR con cebadores "ambulantes" seleccionados entre los oligonucleótidos disponibles en el laboratorio. Los productos de PCR se dirigieron después mediante análisis por extensión de cebador [Parker y col., (1991) BioTechniques 10: 94 - 101] usando un cebador interno específico de porcino marcado en el extremo con^{32}P, SEC ID Nº 26 5' - CCGTGGTGAACGCTCTGGACC - 3' (nt 6932 - 6952). De manera interesante, de los 40 cebadores no específicos ensayados, solamente dos produjeron productos positivos sobre el análisis por extensión de cebador y estos dos correspondían a una secuencia exacta y humana degenerada en el extremo 3' del dominio C2: SEC ID Nº 27 5' - GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC - 3' (nt 7030 - 7053) y la SEC ID Nº 28 5' - GTA
GAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCYAG – 3', (nt 7027 - 7053). Estos cebadores se habían diseñado para producir un producto mediante RT - PCR convencional pero no producían suficiente producto que se pudiera visualizar mediante unión al tinte bromuro de etidio. Sin embargo, un producto de PCR se podría identificar mediante el procedimiento de extensión de cebador más sensible. Este producto se purificó en gel y se secuenció directamente. Esto extendió la secuencia de 3' de fVIII porcino a nt 7026.

Se obtuvo una secuencia adicional mediante análisis por extensión de cebador de un producto de PCR anidado generado usando la genoteca de ADNc de doble cadena ligada al adaptador usada en el protocolo 5' - RACE descrito anteriormente. La primera reacción de ronda usaba el cebador exacto porcino SEC ID Nº 29 5' - CTTCGCATG
GAGTTGATGGGCTGT - 3' (nt 6541 - 6564) y el cebador AP1. La segunda reacción de ronda usaba la SEC ID Nº 30 5' - AATCAGGACTCCTCCACCCCCG - 3' (nt 6913 - 6934) y el cebador AP2. La secuenciación directa de PCR extendió la secuencia 3' al extremo del dominio C2 (nt 7053). La secuencia del dominio C2 era única excepto en el nt 7045 cerca del extremo 3' del dominio C2. El análisis de las reacciones de PCR repetidas produjo A, G o una lectura doble de A/G en este sitio.

La secuenciación se extendió en el 3' UTR usando dos cebadores adicionales, SEC ID Nº 31 5' - GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG - 3' (nt 6977 - 6996) y la SEC ID Nº 32 5' - CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG - 3' (nt 7008 - 7031). Se obtuvieron aproximadamente15 bp de la secuencia de 3' UTR, aunque la secuencia no estaba clara en varios sitios. Después se sintetizaron varios cebadores de polaridad opuesta basándose en las mejores estimaciones de la secuencia 3' no traducida. Estos cebadores incluyeron el complemento inverso del codón de parada TGA en sus extremos 3'. Los productos de PCR se obtuvieron a partir del ADN genómico de bazo porcino y ADNc de bazo porcino que se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio usando un cebador de polaridad opuesta específico SEC ID Nº 33 5' - AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G - 3' (nt 6913 - 6934) ) y el cebador de polaridad opuesta en 3' UTR, SEC ID Nº 34 5' - CCTTGCAGGAATTCGATTCA - 3'. Para obtener cantidades suficientes de material para propósitos de clonación, una segunda ronda de PCR se realizó usando un cebador de polaridad positiva anidado, SEC ID Nº 35 5' - CCGTGGTGAACGCTCTGGACC - 3' (nt 6932 - 6952) y el mismo cebador de polaridad opuesta. El producto de PCR de 141 bp se clonó en pBluescript II KS- cortado por EcoRV. La secuencia de los tres clones derivados de ADN genómico y tres clones derivados de ADNc se obtuvieron en ambas direcciones. La secuencia era inequívoca excepto en el nt 7045, donde el ADN genómico era siempre A y ADNc era siempre G.

Alineamientos de la secuencia de ADN múltiple de fVIII humano, porcino, y de ratón (Fig. 1A - 1H)

Las alineaciones del péptido señal, A1, A2, A3, C1 y C2 y regiones C2 se realizaron usando el programa CLUSTAL W [Thompson, J. D. y col., (1994) Nucleic. Acids. Res. 22: 4673 - 4680]. La abertura de hueco y las penalizaciones por extensión de hueco eran 10 y 0,5 respectivamente Las alineaciones de los dominios B humano, de ratón, y de cerdo se han descrito previamente [Elder col., (1993) anterior]. La secuencia de A2 humana corresponde a los aminoácidos 373 - 740 en al SEC ID Nº 2. La secuencia de aminoácidos de A2 porcino se proporciona en la SEC ID Nº 4, y la secuencia de aminoácidos del dominio A2 de ratón se proporciona en la SEC ID Nº 6, aminoácidos 392 - 759.

Ejemplo 11 Expresión de factor VIII porcino sin dominio B recombinante (PB) Materiales

Plasmas humanos reunidos de hemofilia citrados y normal se compraron en Geroge King Biochemical, Inc, suero bovino fetal, geneticina, penicilina, estreptomicina, medio DMEM/F12 y medio AIM - V se compraron en Life
Technologies, Inc, Taq ADN polimerasa se compró en Promega. La Vent ADN polimerasa se compró en New England Biolabs. Pfu ADN polimerasa y el fagémido pBluescript II KKS- se compraron en Stratagene. Los oligonucleótidos se compraron en Life Technologies o Cruachem, Inc. Las enzimas de restricción se compraron en New England Biolabs o Promega. Se usaron cebadores 5' - fosforilados cuando los productos de PCR se producían para propósitos de clonación. La numeración de nucleótidos (nt) de oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ADNc de fVIII porcino o ADN genómico usa el ADNc del fVIII humano como referencia [Wood y col., (1984) Nature 312: 330 - 337]. Un vector de expresión de fVIII, designado HB ^{-}/ReNeo, se obtuvo en Biogen, Inc., HB ^{-}/ReNeo contiene genes de resistencia a ampicilina y geneticina y un ADNc de fVIII humano que carece del dominio B entero, definido como el fragmento de escisión Ser 741 - Arg 1648 producido por trombina. Para simplificar la mutagénesis del ADNc del dominio C2 del fVIII, que está en el extremo 3' de la inserción de fVIII en ReNeo, un sitio NotI se introdujo dos bases 3' al codón de parada de HB^{-}/ReNeo mediante mutagénesis de ayuste por solapamiento de la extensión [Horton, R. M. y col., (1993) Methods Enzymol. 217: 270 - 279]. Esta construcción se designa HB^{-}ReNeo/NotI.

El ARN total se aisló mediante extracción con tiacianato de guanidinio ácido - fenol - cloroformo [Chomczynski P. y col., (1987) Anal. Biochem. 62: 156 - 159]. El ADNc se sintetizó a partir de ARNm usando transcriptasa inversa (RT) de virus de la leucemia murina de Moloney y hexámeros al azar según las instrucciones proporcionadas por el fabricante (kit de síntesis de ADNc de primera cadena, Pharmacia Biotech). El ADN de plásmido se purificó usando un kit Plasmad Maxi de Qiagen (Qiagen, Inc.,). Las reacciones de PCR se realizaron usando un termociclador Hybaid Omnigene que usa Taq, Vent, o Pfu ADN polimerasas. Los productos de PCR se purificaron en gel, se precipitaron con etanol, y se ligaron en ADN de plásmido usando ADN ligasa de T4 (kit de ligacióin de ADN Rapid, Boehringer Mannheim). Se usaron plásmidos que contienen inserciones para transformar células Epicurean XL1 - Blue de E. coli. Todas las secuencias de ADN de fVIII novedosas generadas por PCR se confirmaron mediante secuenciación didesoxi usando un secuenciador de ADN automático 373a de Applied Biosytems y el kit terminador de tinte PRISM.

Construcción de un vector de expresión de fVIII híbrido, HP20, que contiene el dominio C2 porcino

Un ADNc de fVIII porcino correspondiente al extremo 3' del dominio C1 y todo el dominio C2 se clonó en pBluescript mediante RT - PCR a partir de ARN total de bazo usando cebadores basándose en la secuencia de ADNc del fVIII porcino [Healy, J. F. (1996) Blood 88: 4209 - 4214]. Esta construcción y HB^{-}/ReNeo se usaron como moldes para construir un producto de fusión de C1 humano y C2 porcino en pBluescript mediante mutagénesis de SOE. El fragmento C1 - C2 en este plásmido se retiró con ApaI y NotI y se ligó en HB^{-}/ReNeo/NotI cortado por ApaI/NotI para producir HP20/ReNeo/NotI.

Construcción de fVIII híbrido humano/porcino suprimido el dominio B conteniendo la cadena ligera porcina (HP18)

La cadena ligera del fVIII humano consta de los residuos de aminoácidos Asp 1649 - Tyr 2332. Los residuos correspondientes en el ADN del porcino se sustituyeron por esta región de HB^{-} para producir una molécula de fVIII híbrido humano/porcino designada HP18. Esto se realizó sustituyendo un producto de PCR correspondiente a la región A2 porcina, el dominio A2, el dominio A3, el dominio C1, y parte del dominio C2 por la correspondiente región en HP20. Para facilitar las construcciones, un sitio sinónimo AvrII se introdujo en el nt 2273 en la unión de los dominios A2 y A3 de HP20 mediante mutagénesis SOE.

Construcción de fVIII híbrido humano/porcino suprimido dominio B que contiene el péptido señal porcino, dominio A1 y dominio A2 (HP22)

El péptido señal fVIII humano, el dominio A1 y los dominios A2 constan de residuos de aminoácidos Met (19) - Arg 740. Los residuos correspondientes en el ADNc del fVIII porcino se sustituyeron por esta región de HB^{-} para producir una molécula designada HP22. Adicionalmente, un sitio sinónimo AvrII se introdujo en el nt 2273 en al unión de los dominios A2 y A3 de HP22 mediante mutagénesis SOE. HP22 se construyó mediante fusión de un fragmento A2 péptido señal - A1 - parcial porcino en pBluescript [Healy, y col (1996) Blood anteriormente] con un fVIII híbrido humano/ porcino sin dominio B que contiene el dominio A2 porcino, designado HP1 Libin y col., (1994) anteriormente].

Construcción de fVIII - (PB^{-}) sin dominio B porcino

Un fragmento SpeI/NotI de HP18/BS (+ AvrII) se digirió con AvrII/NotI y se ligó en HO22/BS digerido con AvrII/NotI (+ AvrII) para producir una construcción PB^{-}/BS (+ AvrII), que consta del fVIII porcino que carece del dominio B entero. PB- se clonó en ReNeo ligando un fragmento XbaINotI de PB^{-}/BS ((+ AvrII) en HP22/ReNeo/NotI (+ AvrII).

Expresión de moléculas de fVIII recombinantes

PB^{-}/ReNeo/NotI (+ AvrII) y HP22/ReNeo/NotI (+AvrII) se transfectaron transitoriamente en células COS y se expresaron como se ha descrito previamente [Lubin, I. M. y col., (1994) J. Biol. Chem. 269: 8639 -8641]. HB^{-}/ReNeo/
NotI y no ADN (simulado) se transfectaron como control.

La actividad de fVIII de PB^{-}, HP22 y HB^{-} se se midieron mediante un ensayo cromogénico como sigue. Las muestras de fVIII en sobrenadantes de cultivo de células COS se activaron mediante trombina 40 nM en NaCl 0,15 M, HEPES 20 mM, cAC12 5 Mn, Tween - 80 al 0,1%, pH 7,4 en presencia de factor IXa 10 nM, factor X 425 nM, y vesículas de fosfatidilserina - fosfatidilcolina (25/75 p/p). Después de 5 minutos, se detuvo la reacción con EDTA 0,05M y desulfatohirudina recombinante 10 nm y el factor Xa resultante se midió mediante ensayo de sustrato cromogénico. En el ensayo de sustrato cromogénico, se añadió Spectrozyme Xa 0,4 mM y la velocidad de liberación de para - nitroanilida se determinó midiendo la absorbancia de la solución a 405 nm.

Los resultados de los sobrenadantes de cultivo celular duplicado transfectado independientemente (absorbancia a 405 nm por minuto)

HB: 13,9

PB: 139

HP22: 100

simulado: < 0,2

Estos resultados indican que el fVIII sin dominio B porcino y fVIII sin dominio B constituido por las subunidades A1 y A2 porcinas se activan y sugieren que tienen actividad superior que el fVIII sin dominio B humano.

PB se purificó parcialmente y se concentró a partir del medio de crecimiento mediante cromatografía en heparina - Sefarosa. La heparina - Sefarosa (10 ml) se equilibró con NaCl 0,075 M, HEPES 10 mM, CaCl_{2} 2,2 mM, Tween - 80 al 0,005%, azida sódica al 0,02%, pH 7,40. Se aplicó medio (100 - 200 ml) de células de expresión a la heparina Sefarosa, que después se lavó con 30 ml de tampón de equilibrio sin azida sódica. PB^{-} se eluyó con NaCl 0,65 M, HEPES 20 mM, CaCl_{2} 5 mM, Tween - 80 al 0,01%, pH 7,40 y se almacenó a -80ºC. El rendimiento de la actividad coagulante del fVIII era típicamente 50 - 75%.

Expresión estable de fVIII sin dominio B porcino (PB^{-})

Se mantuvieron líneas celulares transfectadas en medio F12 de Eagle modificado de Dulbecco que contiene suero fetal bovino al 10%, de 50 U/ml penicilina, 50 g/ml de estreptomicna. Se inactivó por calor suero fetal bovino a 50ºC durante una hora antes de uso. HB^{-}/ReNeo y PB^{-}ReNeo/NotI (+ AvrII) se trasnfectaron establemente en células BHK y se seleccionaron para evaluar resistencia a geneticina usando un protocolo general que se ha descrito previamente [Lubin y col., (1994) Biol Chem. 269: 8639 - 8641] excepto que las células que se expresan se mantuvieron en medio de crecimiento que contenía 600 \mug/ml de geneticina. Las células de matraces T - 75 de Corning desarrolladas hasta confluencia se transfectaron a matraces triples Nunc en medio que contenían 600 \mug/ml de geneticina y se desarrollaron hasta confluencia. El medio se retiró y se reemplazó con medio AIM - V, exento de suero (Life Technologies, Inc.) sin geneticina. La expresión del factor VIII se controló mediante actividad coagulante del factor VIII de una fase (vide supra) y 100 - 150 ml de medio se recogió una vez al día durante cuatro a cinco días. Los niveles de expresión máximo en medio para HB^{-} y PB^{-} eran 102 unidades por ml y 10 - 12 unidades por ml de actividad coagulante del factor VIII, respectivamente.

Purificación de PB^{-}

PB^{-} se precipitó con sobrenadante de cultivo usando sulfato amónico saturado al 60% y después de purificó mediante cromatografía de inmunoafinidad W3 - 3 y cromatografía líquida de alta presión mono Q como se ha descrito previamente para la purificación de factor VIII porcino derivado de plasma [Lollar y col., (1993) FactorVIII/factor VIIIa. Methods Enzymol. 222: 128 - 143]. La actividad coagulante específica se PB^{-} se midió mediante un ensayo de coagulación de una fase [Lollar y col., (1993) anteriormente] y era similar al factor VIII porcino derivado de plasma.

Cuando se analizó mediante electroforesis en gel ASS - poliacrilamida, la preparación de PB^{-} contenía tres bandas de masas moleculares aparentes 160 kDa, 82 kDa, y 76 kDa. Las bandas de 82 kDa y 76 kDa se han descrito previamente como heterodímero que contiene dominios A1-A2 y ap-A3-C1C2 (donde ap se refiere a un péptido de activación) [Toole y col., (1984) Nature 312: 342 - 347]. La banda de 160 kDa se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno y se sometió a secuenciación NH2-terminal, que produjo Arg - Ile - Xx - Xx - Tyr (donde Xx representa no determinado) que es la secuencia NH2-terminal del factor VIII de cadena sencilla [Toole y col., (184) anteriormente]. De este modo PB^{-} se procesa parcialmente mediante escisión entre los dominios A2 y A3, de manera que consta de dos formas, una proteína A1-A2-ap-A3-C1-C2 y un heterodíemro A1-A2/ap-A3-C1-C2. Se ha descrito el procesamiento similar de HB^{-} [Lind y col., (1995) Eur. J. Biochem. 232: 19 - 27].

Caracterización del factor VIII porcino

Los inventores han determinado la secuencia de ADNc del factor VIII porcino correspondiente a 137 bp del 5' UTR, la región que codifica el péptido señal (57 bp), y los dominios A1 (1119 bp), A3 (990 bp), C1 (456 bp) y C2 (483 bp). Junto con la secuencia previamente publicada del dominio B y las regiones péptidicas de activación de cadena ligera [Toole y col., (1986) anteriormente] y el dominio A2 [LKubin y col., (1994) anteriormente], la secuencia reseñada en este documento completa la determinación del ADNc del fVIII porcino correspondiente al producto traducido. Un fragmento que incluía la región 5' UTR, péptido señal, y ADNc del dominio A1 se clonó usando un protocolo 5' - RACE RT -PCR. Un cebador basado en la secuencia C2 humana era exitoso en la producción de un producto RT - PCR que condujo a la clonación del dominio A3, C1, y la mitad 5' del dominio C2. El ADNc correspondiente a la mitad 3' del dominio C2 y ADNc de 3' UTR evidenció dificultad para clonarse. El resto del dominio C2 se clonó por último mediante un procedimiento de PCR ambulante de gen dirigido [Parker y col., (1991) anteriormente].

La secuencia reseñada en esta memoria descriptiva SEC ID Nº 36 era inequívoca excepto en el nt 7045 cerca del extremo 3' del dominio C2, que es A o G como se ha descrito en esta memoria descriptiva anteriormente. El codón correspondiente es GAC (Asp) o AAC (Asn). Los codones humanos y de ratón son GAC y CAG (Gln), respectivamente. Si esto representa un polimorfismo o artefacto de PCR reproducible se desconoce. Los ADNc del fVIII sin dominio B híbrido /humano porcino recombinante que contiene las sustituciones del dominio C2 porcino correspondiente a tanto los codones GAC como AAC se han expresado establemente sin diferencia detectable en la actividad procoagulante. Esto indica que no existe una diferencia funcional entre estas dos variantes del dominio C2.

La alineación de la secuencia de aminoácidos predicha de la SEC ID Nº 37 del fVIII porcino de longitud completa con las secuencias humana publicada [Wood y col., (1984) anteriormente] y murina [Elder y col., (1993) anteriormente] se muestra en la figura 1A - 1H junto con los sitios para modificación post - traduccional, escisión proteolítica, reconocimiento por otras macromoléculas. El grado de identidad de las secuencias alineadas se muestra en la tabla VII. Como se ha indicado previamente, los dominios B de estas especies son más divergentes que los dominios A o C. Estos es consistente con la observación de que el dominio B no tiene función conocida, a pesar de su gran tamaño [Elder y col., (1993) anteriormente; Toole y col., (1996) anteriormente]. Los resultados de la presente invención confirman que el dominio B o factor VIII porcino no es necesario para actividad. Basándose en los datos de la secuencias presentados en esta memoria descriptiva, el factor VIII porcino que tiene toda o parte del dominio B suprimido se puede sintetizar mediante la expresión del ADN que codifica el fVIII porcino que ha suprimido de alí todo o parte de los codones del dominio B porcino. También existe más divergencia de secuencias que corresponden al péptido de escisión del dominio A1/factor IXa (residuos 337 - 372) y el péptido de activación de cadena ligera (Tabla VII). El sitio de escisión en la posición 336 para generar el péptido 337 - 372 está perdido aparentemente en el ratón ya que este residuo es glutamina en lugar de arginina [Elder y col., (1993) anteriormente]. La divergencia relativamente rápida de los péptidos de escisión de trombina (o en fVIII de ratón posiblemente un péptido de activación 337 - 372 vestigial) se ha indicado anteriormente para los fibrinopéptidos [Creighton, T. E. (1993) en Proteins: Structures and Molecular Properties, W. H. Freeman, Nueva York, pp. 105 - 138]. La pérdida de la función biológica de estos péptidos una vez que sew ha escindido se ha citado como una razón posible para la rápida divergencia. Arg 562 in fVIII humano se ha propuesto que es el sitio de escisión más importante para la proteína C activada durante la activación del fVIII y fVIIIa [Fay y col., P. J. (1991) J. Biol. Chem. 266: 20139 - 20145]. Este sitio se conserva en fVIII humano, porcino y de ratón.

Los sitios de glicosilación ligados a N (NXS/T donde X no es prolina) se puede observar en al figura 1A - 1H. Existen ocho sitios de glicosilación ligados a N conservados: uno en el dominio A1, uno en el dominio A2, cuatro en el dominio A3, y uno en el dominio C1. Las 19 cisteínas del dominio A y C se conservan, mientras que existe divergencia de las cisteínas del dominio B. Seis de los siete enlaces disulfuro en fVIII se encuentran en los sitios homólogos en el factor V y ceruloplasmina, y ambos enlaces disulfuro del dominio C se encuentran en el factor V [McMullen, B. A. y col., (1995) Protein Sci. 4: 740 -746]. El fVIII humano contiene tirosinas sulfatadas en als posiciones 346, 718, 719, 723, 1664, y 1680 [Pittman, D. D. y col., (1992) Biochemistry 31: 3315 - 3325; Michnick, D. A. y col., (1994) J. Biol. Chem. 269: 20095 - 20102]. Estos residuos se conservan en el fVIII de ratón y el fVIII porcino (Fig. 1), aunque el programa CLUSTAL W no alinea la tirosina de ratón correspondiente a Tyr 346 en fVIII humano.

El plasma de ratón y cerdo puede corregir el defecto de coagulación en plasma de hemofilia A humano, que es consistente con el nivel de conservación de residuos en los dominios A y C de estas especies. La actividad procoagulante del fVIII porcino es superior a la del fVIII humano [Lollar, P. y col., (1992) J. Biol. Chem. 267: 23652 - 23657]. El fVIII porcino recombinante (dominio B suprimido) expresado y purificado como se ha descrito en esta memoria descriptiva también muestra actividad coagulante específica mayor de el fVIII humano, siendo comparable con al del fVIII porcino derivado de plasma. Esto se puede deber a una tasa de disociación espontánea disminuida de la subunidad A2 del heterodímero del fVIII A1/A2/A3-C1-C2. Si esta diferencia en la actividad procoagulante refleja un cambio evolutivo en función como un ejemplo de la adaptación de especie. [Perutz, M. F. (1996) Adv. Protein. Chem. 36: 213 - 244] se desconoce. Ahora que la secuencia del ADNc del fVIII porcino correspondiente al producto traducido es completa, la mutagénesis por barrido homólogo [Cunningham, B. B. y col., (1989) Science 243: 1330 - 1336] puede proporcionar una forma de identificar diferencias estructurales entre fVIII humano y porcino que son responsables de la superior actividad del último.

El fVIII porcino es típicamente menos reactivo con anticuerpos inhibidores que surgen en hemofílicos que han sido transfundidos con fVIII o que surgen como autoanticuerpos en la población general. Esto es la base para usar concentrado de fVIII porcino en la dirección de pacientes con anticuerpos inhibidores [Hay y Lozier (1995) anteriormente]. La mayoría de los inhibidores se dirigen contra epítopes localizados en el dominio A2 o dominio C2 [Fulcher, C. A. y col., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7728 - 7732; Scandella, D. y col., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6152 - 6156; Scandella, D. y col., (1989) Blood 74: 1618 - 1626]. Adicionalmente, un epítope de significado desconocido se ha identificado que está en el dominio A3 o C11 [Scandella y col., (1989) anteriormente; Scandella, D. y col., (1993) Blood 82: 1767 - 1775; Nakai, H. y col., (1994) Blood 84: 224a]. El epítope A2 se ha mapeado para los residuos 484 - 508 mediante mutagénesis por barrido homólogo [Healey y col., (1995) anteriormente]. En este residuo de 25 residuos, existe relativamente baja proporción de secuencia idéntica (16/25 ó 64%). Es interesante que esta región, que es funcionalmente importante basándose en el hecho de que los anticuerpos para ella son inhibidores, aparentemente se haya sometido a desplazamiento genético relativamente más rápido. La alineación del dominio A2 porcino y los dominios A3 indican que el epítope A2 no comparte homología detectable con la región correspondiente en el dominio A3.

El epítope inhibidor C2 del fVIII humano se ha propuesto que se localiza dentro de los residuos 2248 - 2312 mediante mapeo de supresión [Scandella, D. y col., (1995) Blood 86: 1811 - 1819]. El fVIII humano y porcino son 83% idénticos en este segmento de 65 residuos. Sin embargo, la mutagénesis por barrido homóloga de esta región para caracterizar el epítope C2 ha revelado que un determinante importante del epítope C2 se localizada inesperadamente en al región correspondiente a los aminoácidos 2181 - 2243 (SEC ID Nº 2) y la figura 1H.

Se prepararon las proteínas del factor VIII híbrido humano - porcino en las que diversas porciones del dominio C2 del factor VIII humano se reemplazaron por las porciones correspondientes del VIII porcino, usando la estrategia descrita en esta memoria descriptiva. (Ejemplo 8). La síntesis de los diversos factores VIII híbridos C21 se logró mediante la construcción del ADN codificador híbrido, usando la secuencia de nucleótidos que codifica la región porcina C2 en la SEC ID Nº 37. Cada ADN híbrido se expresó en células transfectadas, de manera que los factores VIII híbridos se podrían purificar parcialmente a partir del medio de crecimiento. La actividad, en ausencia de cualquier inhibidor, se midió mediante un ensayo de coagulación de una fase.

Se usó una batería de cinco inhibidores humanos para ensayar cada factor VIII híbrido. Los plasmas inhibidores que contienen anticuerpo anti factor VIII se ha mostrado previamente que se dirigen contra el dominio C2 humano, basándose en la capacidad del dominio C2 humano recombinante para neutralizar la inhibición. En todos los plasmas de ensayo, la titulación del inhibidor se neutralizó más del 79% mediante el dominio C2 o cadena de cadena ligera pero menos que el 10% por el dominio A2 humano recombinante. Además los factores VIII híbridos C2 se ensayaron contra un anticuerpo monoclonal murino, que se une al dominio C2, y como los anticuerpos inhibidores C2 humanos, inhibe la unión del factor VIII a fosfolípido y al factor von Willebrand.

Comparando las titulaciones inhibidoras de los anticuerpos contra los factores VIII híbridos - C2, el determinante importante del epítope inhibidor se mostró que es la región de los residuos 2181 - 2243 (SEC ID Nº 2, véase también la figura 1H). Los anticuerpos anti C2 dirigidos a una región COOH - terminal al residuo 2253 no se identificaron en suero de cuatro de los cinco pacientes. Comparando los híbridos que tienen secuencia porcina correspondiente a los residuos de aminoácidos humanos números 2181 - 2199 y 2207 - 2243, era evidente que ambas regiones contribuyen a la unión a anticuerpos. La secuencia de aminoácidos porcina correspondiente a los residuos humanos 2181 - 2243 se numera 1982 - 2044 en la SEC ID Nº 37. La secuencia de ADN porcino que aminoácidos porcinos numerados 1982 - 2044 es la de nucleótidos numerados 5944 - 6132 en la SEC ID Nº 35.

Con relación a la figura 1H, se puede observar que en la región 2181 - 2243, existen 16 diferencias de aminoácidos entre las secuencias humanas y porcinas. Las diferencias se encuentran en los residuos 2181, 2182, 2188, 2195 - 2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224 - 2227, 2234, 2238 y 2243. El reemplazo de aminoácidos en uno o más de estos residuos numerados se puede llevar a a cabo para preparar un factor VIII humano modificado no reactivo a los anticuerpos inhibidores anti - C2 humanos. La mutagénesis por barrido de alanina proporciona un procedimiento conveniente para generar sustituciones de alanina para residuos de origen natural, como se ha descrito previamente. Los aminoácidos de alanina se pueden sustituir también, como se ha descrito en esta memoria descriptiva. Las sustituciones de alanina para aminoácidos individuales, especialmente los que no son idénticos entre humano/porcino o humano/de ratón o que son lo más probablemente contribuyen a la unión a anticuerpos, pueden producir un factor VIII modificado con reactividad reducida a anticuerpos inhibidores.

Además, la estrategia de inserción de aminoácidos con potencial más bajo para ser inmunogénica en la región definida de residuos 2181 - 2243 produce factores VIII modificados que tienen inmunogenicidad reducida. El factor VIII de inmunogenicidad reducida es útil como un suplemento del factor VIII para tratamiento de pacientes de hemofilia A en preferencia al factor VIII de secuencia natural. Los pacientes tratados con el factor VIII de inmunogenicidad es menos probable que desarrollen anticuerpos inhibidores, y por lo tanto es meno probable que sufran una reducción de eficacia de tratamiento a lo largo de su vida.

Las figuras 1A - 1H tomadas juntas proporcionan una comparación de secuencias alineadas de las secuencias de aminoácidos del factor VIII de ratón. La Figura 1A compara las regiones de péptidos señal (humana, SEC ID Nº 40; porcina SEC ID 37, aminoácidos 1 - 19; murina, SED ID Nº 6, aminoácidos 1 - 19). Hay que destacar que los aminoácidos en la figura 1A - 1H se numeran en al primera alanina de la proteína madura como numero 1, con los aminoácidos del péptido señal asignados con números negativos. La secuencia del fVIII humano en al SEC ID Nº 2 también comienza con la primera alanina de la proteína madura como aminoácido número 1. En la secuencia de aminoácidos del fVIII de ratón (SEC ID Nº 6) y fVIII porcino (SEC ID Nº 37), el primer aminoácido (alanina) de la secuencia murina es el aminoácido número 20. La figura 1A - 1H muestra una alineación de las correspondientes secuencias del fVIII humano, de ratón y de cerdo, de manera que las regiones con mayor número de aminoácidos idénticos se yuxtaponen. Los números de aminoácidos en al Fig 1A - 1H se aplican al fVIII humano solamente. La figura 1B proporciona las secuencias de aminoácidos para el dominio A1 de seres humanos (SEC ID Nº 2, aminoácidos 1 - 372), porcino (SEC ID Nº 37, aminoácidos 20 - 391), y murino (SEC ID Nº 6, aminoácidos 20 - 391). La figura 1C proporciona secuencias de aminoácidos para los dominios A2 del factor VIII de seres humanos (SEC ID Nº 2, aminoácidos 373 - 740), cerdo (SEC ID N1 37, aminoácidos 392 - 759) y ratón (SEC ID Nº 6, aminoácidos 392 - 759). La figura 1C proporciona la secuencia de aminoácidos de los dominios B del factor VIII humano (SEC ID Nº 2, aminoácidos 741 - 1648), cerdo (SEC ID Nº 37, aminoácidos 760 - 1449) y ratón (SEC ID Nº 6, aminoácidos 760 - 1640). La figura 1E compara las secuencias de aminoácidos de los péptidos de activación de la cadena ligera del factor VIII de seres humanos, cerdo, y ratón SEC ID Nº 2, aminoácidos 1649 - 1689, SEC ID Nº 37, aminoácidos 1450 - 1490; y SEC ID Nº 6, aminoácidos 1641 - 1678, respectivamente). La figura 1F proporciona la comparación de secuencias para los dominios A3 del factor VIII humano, de cerdo, y de ratón (SEC ID Nº 2, aminoácidos 1690 - 2019; SEC ID Nº 37, aminoácidos 1491 - 1820; y SEC ID Nº 6, aminoácidos 1679 - 2006, respectivamente. La figura 1G proporciona la secuencia de aminoácidos de los dominios C1 del factor VIII de seres humanos, cerdo y ratón SEC ID Nº 2, aminoácidos 2020 - 2172, SEC ID Nº 37, aminoácidos 1821 - 1973; y SEC ID Nº 6, aminoácidos 2007 - 2159, respectivamente). La figura 1H proporciona los datos de secuencia para los dominios C2 de los dominios del factor VIII de seres humanos, cerdo y ratón SEC ID Nº 2, aminoácidos 2173 - 2332, SEC ID Nº 37, aminoácidos 1974 - 2133; y SEC ID Nº 6, aminoácidos 2160 - 2319, respectivamente).

Los diamantes representan sitios de sulfatación de tirosina, sitios de unión propuestos para el factor IXa, fosfolípido y proteína C están subrayados de manera doble, y regiones implicadas en la unión de anticuerpos inhibidores anti - C2 y anti - A2 están en letras itálicas. Los asteriscos resaltan las secuencias de aminoácidos que se conservan. Véase también la SEC ID Nº 36 (ADNc del factor VIII porcino) y la SEC ID Nº 37 (secuencia de aminoácidos deducida del factor VIII porcino). El sistema de numeración humano se usa como la referencia [Wood y col., (1984) anteriormente]. Los dominios A1, A2, y B se definen mediante sitios de escisión de trombina en las posiciones 372 y 740 y un sitio de escisión de proteasa desconocido en 1648 como residuos 1 - 372, 373 - 740, y 741 - 1648, respectivamente [Eaton, D. L. y col (1986) Biochemistry 25: 8343 - 8347]. Los dominios A3, C1, y C2 se definen como residuos 1690 - 2019, 2020 - 2172, y 2173 - 2332, respectivamente [Vehar y col., (1984) anteriormente]. Los sitios de escisión para trombina (factor IIa), factor Ixa, factor Xa y APC [Fay y col., (1991) anteriormente; Eaton, D. y col., (1986) Biocemistry 25: 505 - 512; Lamphear, B. J. y col., (1992) Blood 80: 3120 - 3128] se muestran colocando el nombre de la enzima sobre la arginina reactiva. Un péptido ácido se escinde a partir de la cadena ligera del fVIII mediante trombina o factor Xa en al posición 1689. Los sitios de unión propuestos para el factor Ixa [Fay, P. J. y col., (1994) J. Biol. Chem. 269: 20522 - 20527; Lenting, P. J. y col., (1994) J. Biol. Chem. 269: 7150 - 7155), fosfolípido (Foster, P. A. y col., (1990) Blood 75: 1999 - 2004) y proteína C (Walker, F. J. y col., (1990) J. Biol. Chem. 265: 1484 - 1489] están subrayados doblemente. Las regiones implicadas en la unión de anti - A2 [Lubin y col., (1994) anteriormente; Healey y col., (1995) anteriormente]; y propuesto previamente para los anticuerpos inhibidores anti - C2 están en letras itálicas. El epítope inhibidor C2 identificado como se define en esta memoria descriptiva (aminoácidos humanos 2181 - 2243) se muestra mediante un solo subrayado en la figura 1H. Los sitios de sulfatación de tirosina [Pittman y col., (1992) anteriormente; Michnick y col., (1994) anteriormente] se muestran mediante \Diamondblack.

La secuencia de nucleótidos que codifican la proteína del factor VIII que carece del dominio B se proporciona en la SEC ID Nº 38, y la correspondiente secuencia de aminoácidos deducida se proporciona en la SEC ID Nº 39.

\vskip1.000000\baselineskip

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 17

gggtgcaaag cgctgacatc agtg

24

<210> 18

<211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 18

cctctcgagc caccatgtcg agccaccatg cagctagagc tctccacctg

50

<210> 19

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 19

cgcgcggccg cgcatctggc aaagctgagt t

31

<210> 20

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 20

gaaataagcc caggctttgc agtcraa

27

<210> 21

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<220>

<221> misc_característica

<222> (1)..(22)

<223> en la posición 22 n es a o t o g o c

<400> 21

aggaaattcc actggaacct tn

22

<210> 22

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<221> misc_característica

<222> (1)..(25)

<223> en la posición 25 n es a o t o g o c

<400> 22

ctgggggtga attcgaaggt agcgn

25

<210> 23

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 23

gagttcatcg ggaagacctg ttg

23

<210> 24

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 24

acagcccatc aactccatgc gaag

24

<210> 25

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 25

tcagggcaat caggactcc

19

<210> 26

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 26

ccgtggtgaa cgctctggac c

21

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 27

gtagaggtcc tgtgcctcgc agcc

24

<210> 28

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 28

gtagagstsc tgkgcctcrc akccyag

27

<210> 19

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 29

cttcgcatgg agttgatggg ctgt

24

<210> 30

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 30

aatcaggact cctccacccc cg

22

<210> 31

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 31

ggatccaccc cacgagctgg

20

<210> 32

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 32

cgccctgagg ctcgaggttc tagg

24

<210> 33

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 33

aatcaggact cctccacccc cg

22

<210> 34

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 34

ccttgcagga attcgattca

20

<210> 35

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

<400> 35

ccgtggtgaa cgctctggac c

21

<210> 36

<211> 6402

<212> ADN

<213> Sus scrofa

<221> CDS

<222> (1)..(6399)

\newpage

<400> 36

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 37

<211> 2133

<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 37

21

22

23

24

25

26

27

28

<210> 38

<211> 4334

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: factor VIII que carece del dominio B<220>

<221> CDS

<222> (3)..(4331)

\newpage

<400> 38

29

30

31

32

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 39

<211> 1443

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 39

36

37

38

39

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

<210> 40

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

42

Claims (21)

1. Un factor VIII humano modificado que comprende una sustitución de aminoácido en una o más posiciones que corresponde a las posiciones 490, 493, 498 y 504 de la SEC ID Nº 2, dicha sustitución siendo una inserción de un aminoácido que reduce la inmunorreactividad del aminoácido de origen natural, dicho factor VIII modificado que tiene actividad procoagulante.

2. Un factor VIII modificado según a reivindicación 1 en el que el factor VIII modificado tiene reactividad reducida para un anticuerpo inhibidor comparado con el factor VIII no modificado.

3. El factor VIII modificado de la reivindicación 1 en el que la sustitución de aminoácido se realiza en una o más posiciones seleccionada entre el grupo constituido por 490 y 493.

4. El factor VIII modificado de la reivindicación 1 en el que la sustitución de aminoácido se realiza en una o más posiciones seleccionada entre el grupo constituido por 498 y 504.

5. El factor VIII modificado de la reivindicación 1 en el que la sustitución de aminoácido se realiza en la posición 490.

6. El ADN que codifica el dominio A2 del factor VIII humano modificado, dicho ADN teniendo una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado un cambio de codificación en una o más posiciones de aminoácidos que corresponden a las posiciones 490, 493, 499 y 504 de la SEC ID Nº 2, dicho cambio codificando un aminoácido que reduce la inmunorreactividad en la posición elegida.

7. ADN según la reivindicación 6 en el que la posición de aminoácido elegida se selecciona entre el grupo constituido por 490 y 493.

8. ADN según la reivindicación 6 en el que la posición de aminoácido elegida se selecciona entre el grupo constituido por 498 y 504.

9. ADN según la reivindicación 6 en el que la posición de aminoácido elegida es la posición de aminoácido 490.

10. El producto de expresión de ADN que codifica el factor VIII humano o híbrido humano/de mamífero, dicho ADN comprendiendo ADN que codifica un dominio A2 modificado, el ADN teniendo una o más sustituciones de nucleótidos que dan como resultado un cambio de codificación en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones de aminoácidos 490, 493, 498 y 504 de la SEC ID Nº 2, dicho cambio codificando un aminoácido que reduce la inmunorreactividad en la posición elegida.

11. El producto de expresión de la reivindicación 10 en el que el ADN que codifica el dominio A2 modificado codifica una sustitución de aminoácido en una o más posiciones de aminoácido seleccionada entre el grupo constituido por 490 y 493.

12. El producto de expresión de la reivindicación 10 en el que el ADN que codifica el dominio A2 modificado codifica una sustitución de aminoácido en una o más posiciones de aminoácido seleccionada entre el grupo constituido por 498 y 504.

13. El producto de expresión de la reivindicación 10 en el que el ADN que codifica el dominio A2 modificado codifica una sustitución de aminoácido en la posición 490.

14. El procedimiento de preparación de un dominio A2 del factor VIII de mamífero modificado que comprende las etapas de mutación de ADN que codifica el dominio en uno o más codones que codifica aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 490, 493, 498 y 504 del factor VIII humano como se muestra en la SEC ID Nº 2, en el que uno o más codones mutados que codifican un aminoácido se sustituye con un codón de origen natural correspondiente, y la expresión en un ADN de célula hospedadora que comprende los codones mutados, bien independientemente o en una secuencia traducible contigua con ADN que codifica otro dominio del factor VIII, en el que se prepara un dominio A2 del factor VIII.

15. El procedimiento de la reivindicación 14 en el que el ADN a mutar es ADN humano.

16. El procedimiento de la reivindicación 14 en el que el ADN a mutar es ADN porcino.

17. El procedimiento de la reivindicación 14 en el que el ADN a mutar es ADN murino.

18. El procedimiento de la reivindicación 14 en el que un codón mutado codifica un aminoácido que reduce la inmunorreactividad.

\newpage

19. El procedimiento de la reivindicación 18 en el que un codón mutado codifica un aminoácido en una posición seleccionada entre el grupo constituido por 490 y 493.

20. El procedimiento de la reivindicación 18 en el que un codón mutado codifica un aminoácido en una posición seleccionada entre el grupo constituido por 498 y 504.

21. El procedimiento de la reivindicación 18 en el que un codón mutado codifica un aminoácido en la posición 490.