MXPA00008829A

MXPA00008829A - Factor viii modificado

Info

Publication number: MXPA00008829A
Application number: MXPA/A/2000/008829A
Authority: MX
Inventors: John S Lollar
Original assignee: Emory University
Priority date: 1998-03-10
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2002-02-26

Abstract

La presente invención se refiere a los loci de aminoácidos específicos del factor VII humano interactúan con anticuerpos inhibidores de pacientes como hemofilia quienes han desarrollado tales anticuerpos después de haber sido tratados con factor VIII. Se describe un factor VIII modificado en el cual la secuencia de aminoácidos ha cambiado por una sustitución en uno o más de los loci específicos. El factor VIII modificado no se inhibe por los anticuerpos inhibidores contra los epítopos del dominio A2 o C2. El factor VIII modificado esútil para hemofílicos, ya sea para evitar o prevenir la acción de los anticuerpos inhibidores.

Description

FACTOR VIII MODIFICADO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona generalmente con factor VIII híbrido que tiene una secuencia de aminoácidos del factor VIII animal o que tiene una secuencia de aminoácidos de factor VIII humano y una secuencia de aminoácidos diferente de factor VIII, y método de preparación y uso de los mismos. La coagulación sanguínea comienza cuando las plaquetas se adhieren a una pared cortada de un vaso sanguíneo dañado y un sitio de lesión, subsecuentemente, en una cascada de reacciones reguladas enzimáticamente, las moléculas de fibrinógeno solubles se convierten por la enzima trombina a cadenas insolubles de fibrina que m ntienen a las plaquetas juntas en un trombo. En cada etapa de la cascada, un precursor de proteína se convierte en una proteasa que separa al siguiente precursor de proteína en la serie. En la mayor parte de las etapas se requieren cofactores . El factor VIII circula como un precursor y activa la sangre, unido de manera firme y no covalentemente al factor de von Willebrand. El factor VIII es activado proteolíticamente por trombina o por factor Xa, el cual se disocia a partir del factor de von Willebrand y activa su función procoagulante en la cascada. En su forma activa, el factor Villa proteínico es REF.: 122963 un factor que incrementa la eficiencia catalítica del factor IXa hacia la activación del factor X en varios ordenes de magnitud. Las personas con deficiencias en el factor VIII o anticuerpos contra el factor VIII quienes no han sido tratados con factor VIII padecen de sangrado interno incontrolable que puede causar diversos síntomas graves, desde reacciones inflamatorias en las articulaciones hasta muerte temprana. Diversos hemofílicos, quienes constituyen aproximadamente 10,000 en los Estados Unidos, pueden ser tratados con infusión de factor VIII humano, el cual restablece la capacidad de coagulado de la sangre normal si se administra con frecuencia y concentración suficiente. De hecho, la definición clásica del factor VIII es aquella sustancia presente en plasma sanguíneo normal que corrige el defecto de coagulación en plasma derivado de individuos con hemofilia A. El desarrollo de anticuerpos ("inhibidores" o "anticuerpos inhibidores") que inhiben la actividad del factor VIII es una complicación grave en el manejo de pacientes con hemofilia. Se desarrollan anticuerpos en aproximadamente 20% de pacientes con hemofilia A en respuesta a las infusiones terapéuticas de factor VIII. En pacientes previamente no tratados con hemofilia A quienes desarrollan inhibidores, el inhibidor puede desarrollarse en el siguiente año de tratamiento. Adicionalmente, los autoanticuerpos que inactivan al factor VIII ocasionalmente se desarrollan en individuos con niveles de factor VIII previamente normales. Si el título de inhibidores es suficientemente bajo, los pacientes pueden ser manejados para incrementar la dosis de factor VIII. Sin embargo, con frecuencia el título de inhibidores tan elevado que no puede ser superado por el factor VIII. Una estrategia alternativa es derivar la necesidad por factor VIII durante la hemostasis normal utilizando preparaciones de complejo de factor IX (por ejemplo KONYNEMR, ProplexMR) o factor Villa humano recombinante. Adicionalmente, puesto que el factor VIII porcino por si no tiene una reactividad sustancialmente menor con los inhibidores en comparación con el factor VIII humano, se utiliza una preparación de factor VIII porcino parcialmente purificada (HYATEC : CHR) . Muchos pacientes quienes han desarrollado anticuerpos inhibidores para el factor VIII humano han sido tratado con éxito con factor VIII porcino y han tolerado tal tratamiento por periodos prolongados de tiempo. Sin embargo, la administración de factor VIII porcino no es una solución completa debido a que se pueden desarrollar inhibidores para el factor VIII porcino después de una o más infusiones . Varias preparaciones de factor VIII derivado de plasma humano de grados variables de pureza están disponibles comercialmente para el tratamiento de hemofilia A. Estas incluyen factor VIII parcialmente purificado derivado de sangre acumulada de muchos donadores que es tratada con calor o detergente para eliminar virus, pero que contiene un nivel importante de proteínas antigénicas; un factor VIII purificado con anticuerpos monoclonales que tiene niveles menores de impureza antigénicas y contaminación viral; y factor VIII humano recombinante, los ensayos clínicos para el cual se encuentran en progreso. Desafortunadamente, el factor VIII humano es inestable a concentraciones y pH fisiológico, está presente en la sangre en una concentración extremadamente baja (0.2 µg/ml de plasma), y tiene baja actividad de coagulación específica. Los hemofílicos requieren la sustitución de factor VIII para evitar el sangrado y la artropatia hemof-ílica deformante resultante.- Sin embargo, los suministros han sido inadecuados y se presentan problemas en el uso terapéutico debido a la dificultad en el aislamiento y purificación, la inmunogenicidad y la necesidad de remover el SIDA y el riesgo de infectividad por hepatitis. El uso de factor VIII humano recombinante o factor VIII porcino parcialmente purificado no resuelve todos los problemas. Los problemas asociados con el factor VIII derivado de plasma disponible comercialmente, utilizado de manera habitual, han estimulado el interés importante en el desarrollo de un mejor producto de factor VIII. Existe la necesidad de una molécula de factor VIII más potente de manera que las unidades de actividad de coagulado se puedan administrar por moléculas : la molécula del factor VIII es estable a un pH y concentració fisiológica seleccionados,- la molécula de factor VIII es meno apta para provocar producción de anticuerpos inhibidores; y l molécula de factor VIII que evade la detección inmune e pacientes quienes de antemano tienen anticuerpos adquirido contra el factor VIII humano. Por lo tanto, un objetivo de la presente invenció es proporcionar un factor VIII que corrija la hemofilia en u paciente deficiente en factor VIII o que tenga inhibidores par el factor VIII. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar métodos para tratamientos de hemofílicos . - Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un factor VIII que sea estable al pH concentración fisiológica seleccionados . Otro objetivo adicional de la presente invención es proporcionar factor VIII que tenga mayor actividad coagulante en comparación con el factor VIII humano. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un factor VIII contra el cual se produzcan menos anticuerpos .

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona moléculas híbridas de factor VIII purificadas y aisladas, y fragmentos de las mismas con actividad coagulante que incluye factor VIII híbrido que tiene una secuencia de aminoácidos de factor VIII derivada de humano y cerdo, u otro mamífero no humano (denominados juntos en la presente como "animal"); o en una segunda modalidad que incluye un factor VIII equivalente híbrido que tenga una secuencia de aminoácidos de factor VIII derivado de una secuencia de aminoácidos humana, animal o ambas, que no tenga una identidad de secuencia conocida con el factor VIII ("secuencia de aminoácidos diferente de factor VIII"), preferiblemente sustituida en la región antigénica o inmunogénica, o ambas, del factor VII?. Una persona experta en la técnica se dará cuenta que se pueden preparar numerosos constructos de factor VIII híbridos que incluyen, pero que no se limitan a factor VIII humano/animal que tiene mayor actividad coagulante en comparación con el factor VIII humano ("actividad coagulante superior"); factor VIII no inmunogénico humano/equivalente; y factor VIII no antigénico humano/equivalente o humano/animal; factor VIII no inmunogénico humano/animal o animal/equivalente que tiene actividad coagulante superior, factor VIII no antigénico humano/animal o humano/animal/equivalente que tiene una actividad coagulante superior; factor VIII no inmunogénico, no antigénico humano/equivalente o humano/equivalente/animal; y factor VIII no inmunogénico, no antigénico humano/animal/equivalente que tiene actividad coagulante superior. La molécula híbrida de factor VIII produce por aislamiento de combinación de subunidades o dominios humanos y animales de factor VIII; o por ingeniería genética de los genes humanos y animales de factor VIII. En uña modalidad preferida, se utilizan métodos de ADN recombinante para sustituir elementos de factor VIII animal por los elementos correspondientes del factor VIII humano, lo que resulta en moléculas híbridas de factor VIII humanas/animales. En una segunda modalidad preferida, se utiliza métodos de ADN recombinante para sustituir uno o más aminoácidos en el factor VIII humano' o animal o en un factor VIII híbrido humano/animal con aminoácidos que no tienen identidad de secuencia conocida con el factor VIII, preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tienen menos inmunorreactividad con anticuerpos inhibidores que se presentan de manera natural con el factor VIII ("secuencia de aminoácidos no antigénicas") y/o menos aptas para inducir la producción de anticuerpos con el factor VIII ("secuencia de aminoácidos no inmunogénicae") que el factor VIII humano. Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos que se puede utilizar para sustituir una secuencia inmunogénica o antigénica es una secuencia de residuos alanina. En otra modalidad, se aislan y purifican subunidades de factor VIII de plasma humano o animal, y se produce un factor VIII híbrido humano/animal ya se por mezcla de las subunidades de cadena pesada animales con las subunidades de cadena ligera humanas o bien por una mezcla de las subunidades de cadena ligera humanas con las subunidades de cadena ligera animales, por lo que se produce una molécula híbrida de cadena ligera humana/cadena pesada animal o de cadena humana pesada/cadena ligera animal . Estas moléculas híbridas se aislan por cromatografía de intercambio iónico. Alternativamente, se aislan y purifican uno o más dominios o dominios parciales del factor VIII del plasma humano o animal, y se produce factor VIII híbrido humano/animal por mezcla de dominios o dominios parciales de una especie con dominios o con dominios parciales de una segunda especie . Las moléculas híbridas se pueden aislar por cromatografía de intercambio iónico. Los métodos para preparar factor VIII híbrido altamente purificado se describen con las etapas de: (a) aislamiento de subunidades de factor VIII humano derivado de plasma y subunidades de factor VIII animal derivado de plasma, seguido por reconstitución de actividad coagulante por una mezcla de subunidades humanas y animales, seguido por aislamiento de factor VIII híbrido humano/animal por cromatografía de intercambio iónico; (b) aislamiento de dominios o dominios parciales de factor VIII humano derivado de plasma y dominios o dominios parciales de factor VIII animal derivado de plasma, seguido por reconstitución de actividad coagulante por mezcla de dominios humanos o animales, seguido por aislamiento de factor VIII híbrido humano/animal por cromatografía de intercambio iónico,- (c) construcción de dominios o dominios parciales de factor VIII animal por tecnología de ADN recombinante, e intercambio recombinante de dominios de factor VIII animal y humano para producir factor VIII híbrido humano/animal con actividad coagulante; (d) creación de factor VIII híbrido humano/animal por sustitución de residuos aminoácidos específicos del factor VIII de una de las especies con los residuos aminoácidos correspondientes únicos del factor VIII de las otras especies; o (e) creación de una molécula de factor VIII equivalente híbrida que tiene una secuencia de aminoácidos humana o animal, o ambas, con residuos aminoácidos específicos del factor VIII que se sustituyen con residuos aminoácidos que no tienen identidad de secuencia conocida con el factor VIII por mutagénesis dirigida al sitio. La determinación de toda la secuencia de .ADN que codifica para el factor VIII porcino que se establece aquí ha sido activada, por primera vez, por la síntesis del factor VIII porcino de longitud completa al expresar el .ADN que codifica para el factor VIII en una célula huésped adecuada. Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es el factor VIII porcino recombinante purificado. El ADN que codifica para cada dominio del factor VIII porcino así como cualquier fragmento especificado en el mismo se puede expresar similarmente, ya se por si mismo o en combinación con ADN que codifica para el factor VIII humano para elaborar factor VIII híbrido humano/porcino descrito en la presente. Además, fVIII porcino tiene la totalidad o una parte del dominio B suprimido (fVIII porcino sin dominio B) que se encuentra disponible como parte de la presente invención, por expresión de ADN que codifica para fVlll porcino, que tiene una supresión de uno más codones del dominio B. Algunas modalidades del factor VIII híbrido o híbrido equivalente tienen actividad específica mayor que la del factor VIII humano y mayor o igual que la del factor VIII porcino. Algunas modalidades del factor VIII híbrido o híbrido equivalente tienen inmunorreactividad igual o menor con anticuerpos inhibidores para el factor VIII y/o menos inmunogenicidad en humanos o animales, en comparación con el factor VIII humano o porcino. También se proporcionan composiciones farmacéuticas y métodos para tratar a pacientes que tienen deficiencia de factor VIII, que comprende administrar el factor VIII híbrido o híbrido equivalente.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1H, tomadas juntas, proporcionan una comparación de la secuencia alineada de la secuencia de aminoácidos del factor VIII humano, de cerdo y de ratón.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se especifique o indique de otra manera, como se utiliza en la presente, "factor VIII" indica cualquier molécula de proteína de factor VIII funcional de cualquier animal y cualquier factor VIII híbrido o factor VIII modificado, "factor VIII híbrido" o "proteína híbrida" indica cualquier molécula de proteína de factor VIII funcional o fragmento de la misma que comprende la secuencia de aminoácidos de factor VIII de especies humanas, porcinas y/o de mamíferos no humanos, no porcinos. Tales combinaciones incluyen, pero no se limitan a, cualquiera o la totalidad de las siguientes moléculas híbridas de factor VIII o fragmentos de las mismas: (1) humana/porcina; (2) humana/no humana, de mamífero no porcina, tales como humana/de ratón; (3) porcina/no humana, de mamífero no porcino tal como ratón/perro. Tales combinaciones también incluyen moléculas equivalentes o fragmentos de las mismas de factor VIII híbrido, como se define adicionalmente después, que comprende la secuencia de aminoácidos del factor VIII de origen híbrido, humano, porcino o no humano, no porcino de mamífero en el cual se sustituye una secuencia de aminoácidos que no tiene identidad de secuencia conocida con el factor VIII. Tales combinaciones de híbridos también incluyen una secuencia de aminoácidos de factor VIII híbrido derivada de más de dos especies tales como humano/cerdo/ratón, o a partir de dos o más especies en la cual la secuencia de aminoácidos que no tiene una identidad de secuencia conocida con el factor VIII está sustituida. A menos que se indique de otra manera, el "factor VIII" híbrido incluye fragmentos del factor VIII híbrido, las cuales se pueden utilizar como se describe abajo en una modalidad ejemplar, como sondas para propósito de investigación o como reactivos de diagnóstico. Como se utiliza en la presente, "factor VIII de mamífero" incluye factor VIII con secuencia de aminoácidos derivada de cualquier mamífero no humano, a menos que se especifique de otra manera. Como se utiliza en la presente, el término "animal" se refiere al cerdo u otros mamíferos no humanos . Una "proteína de fusión" o "factor VIII de fusión o fragmento del mismo", como se utiliza en la presente, es el producto de un gen híbrido en el cual la secuencia codificante para una proteína se altera extensamente, por ejemplo, al fusionar parte de la misma a la secuencia codificante por una segunda proteína a partir de un gen diferente para producir un gen híbrido que codifica para la proteína de fusión. Como se utiliza en la presente, una proteína de fusión es un subconjunto de la proteína del factor VIII híbrido descrita en esta solicitud. Una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos "correspondientes", como se utiliza en la presente, es una presente en el sitio en una molécula de factor VIII o factor VIII híbrido, o un fragmento de la misma que tiene la misma estructura o función, o ambas cosas, que el sitio en la molécula de factor VIII de otra especie, aunque los ácidos nucleicos o número de ácidos nucleicos pueden no ser idénticos. Una secuencia "que corresponde con" "otra secuencia de factor VIII, corresponde sustancialmente con esa secuencia e hibridiza con la secuencia de la SEC. DE IDENT. NO. : designada bajo condiciones astringentes. Una secuencia "que corresponde con" otra secuencia de factor VIII también incluye una secuencia que resulta en la expresión de un factor VIII o un factor VIII híbrido procoagulante reivindicado o un fragmento del mismo y puede hibridizar con la SEC. DE IDENT. NO.: designada por la redundancia del código genético. Un residuo aminoácido o secuencia "única", como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de aminoácido o residuo en la molécula de factor VIII de una especie que es diferente del residuo o secuencia homologa en la molécula de factor VIII de otra especie. El término "actividad específica", como se utiliza en la presente, se refiere a la actividad que corregirá el defecto de coagulación de un plasma deficiente en factor VIII humano. La actividad específica se mide en unidades de actividad coagulante por miligramos de proteína de factor VIII total en un ensayo estándar en el que se compara el tiempo de coagulación de un plasma deficiente en factor VIII humano con un plasma humano normal. Una unidad de actividad de factor VIII es la actividad presente en un mililitro de plasma humano normal . En el ensayo, cuanto más corto sea el tiempo de formación del coagulo,- mayor será la actividad del factor VIII que se ensaye. El factor VIII híbrido' humano/porcino tiene una actividad de coagulación en un ensayo de factor VIII humano. Esta actividad, así como de otras moléculas de factor VIII híbridas o híbridas equivalentes, o fragmentos de las mismas, pueden ser menores que, iguales a, o mayores que las de factor VIII humano ya sea derivado de plasma o bien recombinante. Los nucleótidos de .ADNc para el factor VIII humano y las- secuencias predichas de aminoácidos se muestran en las SEC. DE IDENT. NO.: 1 y 2, respectivamente. El factor VIII se sintetiza como una cadena de proteína única de aproximadamente 300 kDa con una homología de secuencia interna que define la secuencia de "dominio" NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H. En una molécula de factor VIII, como se utiliza en la presente, un "dominio" es una secuencia continua de aminoácidos que se identifica por una identidad de secuencia de aminoácidos internos y sitios de ruptura proteolítica por trombina. A menos que se especifique de otra manera, los dominios de factor VIII incluyen los siguientes residuos aminoácidos, cuando las secuencias se alinean con la secuencia humana de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO.: 2) : Al, residuos Alal-Arg372; A2 , residuos Ser373-Arg740; B, residuos Ser741-Argl648 ; A3 , residuos Serl690-Ile2032; Cl, residuos Arg2033-Asn2172 ; C2 , residuos Ser2173-Tyr2332. La secuencia A3-C1-C2 incluye los residuos Serl690-Tyr2332. La secuencia restante, residuos, habitualmente se denominan como el péptido de activación de cadena ligera del factor VIII. El factor VIII es activado proteolíticamente por trombina o factor Xa, el cual se disocia del factor von Willebrand, factor formador Villa, el cual tiene una función procoagulante. La función biológica del factor Villa es incrementar la eficiencia catalítica del factor IXa hacia la activación del factor X en varios ordenes de magnitud. El factor Villa activado por trombina es un heterotrímero de 160 kDa A1/A2/A3-C1-C2 que forma un complejo con el factor IXa y el factor X en la superficie de las plaquetas o monocitos . Como se utiliza en la presente, un "dominio parcial" es una secuencia continúa de aminoácidos que forma parte de un dominio . Como se utilizan en la presente, las "subunidades" de factor VIII humano o animal, son las cadena pesada y ligera de la protelna. La cadena pesada del factor VIII contiene tres dominios, Al, A2 y B. La cadena ligera del factor VIII también contiene tres dominios, A3 , Cl y C2. El factor VIII híbrido o un fragmento del mismo se puede elaborar (1) por sustitución de las subunidades animales o subunidades humanas derivadas de plasma, aisladas (cadenas pesadas o ligeras) por las subunidades humanas o subunidades animales correspondientes,- (2) por sustitución de dominios humanos o dominios animales (Al, A2, A3 , B, Cl, y C2) por los dominios animales o dominios humanos correspondientes; (3) por sustitución de partes de dominios humanos o dominios animales para partes de dominios animales o dominios humanos; (4) por sustitución de por lo menos una secuencia específica que incluye uno o más aminoácidos humanos o animales únicos, por los aminoácidos animales o humanos correspondientes; o bien (5) por sustitución de una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia de identidad no conocida con el factor VIII por al menos una secuencia que incluye uno o más residuos aminoácidos específicos en el factor VIII humano, animal o híbrido, o fragmentos del mismo. Un factor VIII híbrido sin dominio B, factor VIII híbrido equivalente o fragmento de ambos, como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier constructo de factor VIII híbrido descrito en la presente que carece de dominio B. Los términos "epitopo", "sitio antigénico" y "determinante antigénico", como se utiliza en la presente, se utiliza de manera sinónima y se definen como una porción del factor VIII humano, animal, híbrido o híbrido equivalente, o un fragmento del mismo que es reconocido específicamente por un anticuerpo. Puede consistir de cualquier cantidad de residuos aminoácidos, puede depender de la estructura primaria, secundaria o terciaria de la proteína. De acuerdo con esta descripción, un factor VIII híbrido, un factor VIII híbrido equivalente o un fragmento de cualquier de estos incluye por lo menos un epitopo que se puede utilizar como un reactivo en los ensayos diagnósticos descritos posteriormente. En algunas modalidades, el factor VIII híbrido o híbrido equivalente, o fragmentos de los mismos no dan reacción cruzada o son menos reactivos en reacción cruzada con todos los anticuerpos de factor VIII inhibidores que se presentan de manera natural en comparación con el factor VIII humano o porcino. El término "sitio inmunogénico", como se utiliza en la presente, está definido como una región del factor VIII humano o animal, factor VIII híbrido o híbrido equivalente, o un fragmento del mismo que induce específicamente la producción de anticuerpo por el factor VIII, híbrido, híbrido equivalente o un fragmento en el humano o animal, medidos por protocolos habituales, tales como inmunoensayo, por ejemplo ELISA o por el ensayo de Bethesda, descrito aquí. Puede consistir de cualquier cantidad de residuos aminoácidos, puede depender de la estructura primaria, secundaria o terciaria de la proteína. En algunas modalidades, el factor VIII híbrido o híbrido equivalente, o un fragmento del mismo es no inmunogénico o menos inmunogénico en un animal o en un humano diferente al factor VIII humano o porcino. Como se usa en la presente, una "molécula equivalente del factor VIII híbrido o fragmento del mismo" o "factor VIII equivalente híbrido o fragmento del mismo" es un factor VIII activo o molécula de factor VIII híbrido o fragmento del .mismo que comprende por lo menos una secuencia que incluye uno o más residuos aminoácidos que no tienen identidad conocida con la secuencia de factor VIII humana o animal sustituido con por lo menos una secuencia que incluye uno o más residuos aminoácidos específicos en el factor VIII humano, animal o híbrido, o fragmento del mismo. La secuencia de uno o más residuos aminoácidos que no tienen identidad conocida por la secuencia del factor VIII humano o animal también se denomina en la presente como "secuencia de aminoácido diferente de factor VIII". En una modalidad preferida, los aminoácidos que no tienen identidad de secuencia conocida con la secuencia de factor VIII son residuos alanina. En otra modalidad preferida, la secuencia específica de factor VIII para la cual los aminoácidos que no tienen secuencia de identidad conocida con la secuencia del factor VIII están sustituidos e incluyen un sitio antigénico que es inmunorreactivo con los anticuerpos inhibidores de factor VIII que se presentan de manera natural, de manera que la molécula equivalente de factor VIII híbrido resultante o fragmento de la misma es menos inmunorreactiva o no inmunorreactiva con los anticuerpos inhibidores de factor VIII. En otra modalidad preferida adicional, la secuencia de factor VIII híbrido específica para la cual los aminoácidos que no tienen identidad de secuencia conocida con la secuencia del factor VIII están sustituidos e incluyen un sitio inmunogénico que induce la formación de anticuerpos inhibidores de factor VIII en un animal o humano, de manera que la molécula equivalente de factor VIII híbrida resultante o un fragmento de la misma es menos inmunogénica. Como se utiliza en la presente, la "deficiencia de factor VIII" incluye deficiencia en la actividad de coagulación causada por la producción de factor VIII defectuoso, por producción inadecuada o nula de factor VIII, o bien por inhibición parcial o total de factor VIII por inhibidores. La hemofilia A es un tipo de deficiencia de factor VIII que resulta de un defecto en un gen unido a X y la ausencia o deficiencia de la proteína de factor VIII que codifica.

Como se utiliza en la presente, "ensayos de diagnóstico" incluyen ensayos que de alguna manera utilizan la interacción antígeno-anticuerpo para detectar o cuantificar, o ambas cosas, la cantidad de un anticuerpo particular que está presente en una muestra de prueba para ayudar en la selección de terapias médicas. Existen muchos de tales ensayos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Sin embargo, como se utiliza en la presente, el ADN para el factor VIII híbrido o híbrido equivalente o un fragmento del mismo y la proteína expresada desde el mismo, en totalidad o en parte, se puede sustituir por los reactivos correspondientes en ensayos conocidos de alguna otra manera, por lo que los ensayos modificados se pueden utilizar para detectar o cuantificar, o ambas cosas, anticuerpos para el factor VIII. Es el uso de estos reactivos, el ADN para el factor VIII híbrido o híbrido equivalente, o un fragmento del mismo o proteína expresada del mismo, lo que permite la modificación de los ensayos conocidos para la detección de anticuerpos para el factor VIII humano o animal o para el factor VIII híbrido humano/animal. Tales ensayos incluyen, pero no se limita a ELISA, ensayos de inmunodifusión y ensayos de inmunotransferencia (immunoblot) . Los métodos adecuados para llevar a la práctica cualquiera de estos ensayos son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Como se utiliza en la presente, el factor VIII híbrido o híbrido equivalente, o un fragmento del mismo, que incluye por lo menos un epitopo de la proteína, se puede utilizar como un reactivo de diagnóstico. Los ejemplos de otros ensayos en los cuales se pueden utilizar al factor VIII híbrido o híbrido equivalente, o un fragmento del mismo, incluye el ensayo Bethesda y los ensayos de anticoagulación.

DESCRIPCIÓN GENERAL DE LOS MÉTODOS El documento número de serie de los Estados Unidos 07/864,004 describe el descubrimiento de moléculas de factor VIII híbridas humanas/porcinas que tiene actividad coagulante, en las cuales los elementos de la molécula de factor VIII de humano o de cerdo están sustituidos por elementos correspondientes de la-molécula de factor VIII de otra especie. El documento de los Estados Unidos número de serie 08/212,133 y PCT/US94/13200 describe moléculas híbridas o coagulantes de factor VIII humanas/animales e híbridas equivalentes, en las cuales los elementos de la molécula de factor VIII de una especie están sustituidos por elementos correspondientes de la molécula de factor VIII de otras especies. La presente invención proporciona moléculas híbridas humanas/animales, animales/animales y equivalentes de factor VIII, y fragmentos de las mismas, así como secuencias de ácido nucleico que codifican para tales híbridos, algunos de los cuales tienen mayor actividad coagulante en un ensayo de coagulación estándar, cuando se comparan con factor VIII altamente purificado; o son menos inmunorreactivas a anticuerpos inhibidores para el factor VIII humano o porcino en comparación con el factor VIII humano o porcino; o son menos inmunogénicos en un humano o animal en comparación con el factor VIII humano o porcino, o todo lo anterior. Estas moléculas de factor VIII híbrido se pueden construir como sigue. Se describen en la presente por lo menos cinco tipos de moléculas de factor VIII activas híbridas humano/porcino o híbridas equivalentes, o fragmento de las mismas, las secuencias de ácido nucleico que codifican para estas moléculas de factor VIII híbridas, y los métodos para prepararlas se describen aquí: aquellas obtenidas (1) por sustitución de una subunidad humana o porcina (es decir, una cadena pesada o cadena ligera) por la subunidad correspondiente porcina o humana; (2) al sustituir uno o más dominios humanos o porcinos (es decir, Al, A2 , A3 , B, Cl y C2) por los dominios correspondientes porcinos o humanos; (3) por sustitución de una parte continua de uno o más dominios humanos o porcinos por la parte correspondiente de uno o más dominios porcinos o humanos; (4) por sustitución de por lo menos una secuencia específica que incluye uno o más residuos de aminoácidos únicos en el factor VIII humano o porcino por la secuencia correspondiente porcina o humana; y (5) por sustitución de por lo menos una secuencia que incluye uno o más residuos de aminoácidos que no tienen identidad de secuencia conocida con el factor VIII ("secuencia de aminoácidos diferente del factor VIII") por al menos una secuencia específica de uno o más aminoácidos en el factor VIII humano, porcino o híbrido humano/porciño. También se puede preparar por lo mismos métodos por lo menos cinco tipos de moléculas de factor VIII híbridas humanas/no humanas y no porcinas de mamífero o híbridas equivalentes o fragmento de las mismas, y las secuencias de ácidos nucleicos que la codifican: estas se obtienen (1) al sustituir una subunidad de mamífero humana o no humana, no porcina (es decir, la cadena pesada o la cadena ligera) por la subunidad correspondiente no humana, no porcina de mamífero o de humano; (2) al sustituir uno o más dominios humanos o no humanos, no porcinos de mamífero (es 'decir, Al, A2 , A3 , B, Cl y C2) por los dominios correspondientes no humanos, no porcinos de mamífero o humanos,- (3) al sustituir una parte continua de uno o más dominios humanos o no humanos, no porcinos de mamífero por la parte correspondiente de uno o más dominios no humanos, no porcinos de mamífero o humanos; (4) al sustituir por lo menos una secuencia específica que incluye uno o más residuos aminoácidos únicos en el factor VIII humano o no humano, no porcino de mamífero por la secuencia correspondiente no humana, no porcino de mamífero o humana,- y (5) al sustituir por lo menos una secuencia que incluye uno o más residuos de aminoácidos que no tiene identidad de secuencia conocida por el factor VIII ("secuencia de aminoácidos diferentes de factor VIII") por al menos una secuencia específica de uno o más aminoácidos en el factor VIII humano, no humano, no porcino de mamífero o un híbrido humano/no humano, no porcino de mamífero. Además, un experto en la técnica reconocerá fácilmente que los mismos métodos se pueden utilizar para preparar por lo menos cinco tipos de moléculas de factor VIII híbrido activas o fragmento de las mismas, que correspondan con los tipos (l)-(5) en los dos párrafos anteriores, que comprende una secuencia de aminoácidos del factor VIII de dos o más mamíferos no humanos, tales como porcino/de ratón, y que comprenden además una secuencia de aminoácidos diferente del factor VIII. Las proteínas de factor VIII híbrido humano/animal, animal/animal y equivalentes o fragmentos de las mismas proteínas, se incluyen en lo anterior bajo los grupos (l)-(3) y se elaboran por aislamiento de subunidades, dominios o partes continuas de dominios de factor VIII derivado de plasma seguido por reconstitución y purificación. Las proteínas o fragmentos de las mismas de factor VIII híbrido humano/animal, animal/animal o equivalentes, descritas bajo los grupos (3) -(5) anteriores se fabrican por métodos de ADN recombinante . La molécula híbrida puede contener un porcentaje mayor o menor de secuencia humana o animal, dependiendo del origen de las diversas regiones, como se describe con mayor detalle en lo siguiente . Puesto que la información actual indica que el dominio B no tiene un epitopo inhibidor y no tiene un efecto conocido en la función del factor VIII en algunas modalidades el dominio B se suprime en las moléculas de factor VIII equivalentes de activo híbrido o híbrido, o en fragmentos de las mismas ("factor VIII B (-)") preparado por cualquiera de los métodos descritos aquí. En el ejemplo 4 se muestra que el factor VIII híbrido humano/porcino comprende una cadena pesada porcina y una cadena ligera humana que corresponde al primer tipo de híbrido indicado antes con mayor actividad coagulante específica en un ensayo de coagulación estándar en comparación con el factor VIII humano. El factor VIII híbrido humano/animal o equivalente con actividad coagulante, siempre que la actividad coagulante sea mayor, igual o menor que la del factor VIII humano, puede ser útil para tratar pacientes con inhibidores, puesto que los inhibidores pueden reaccionar menos con el factor VIII híbrido humano/animal o equivalente, en comparación con el factor VIII ya sea humano o porcino.

PREPARACIÓN DE MOLÉCULAS DE FACTOR VIII HÍBRIDO A PARTIR DE SUBUNIDADES AISLADAS DE FACTOR VIII HUMANO O ANIMAL. POR RECONSTITUCIÓN; La presente invención proporciona molécula de factor VIII híbridas humanas/animales o fragmentos de las mismas, con sustitución de subunidades, las secuencias de ácido nucleico que codifica para estos híbridos, los métodos para preparar y aislar y los métodos para caracterizar su actividad procoagulante. Un método, modificado por los procedimientos reportados por Fay, P.J. et al., (1990) J. Biol . Chem. 265: 6197; y Lollar, J.S. et al., (1988) ". Biol . Chem. 263: 10451, involucra el aislamiento de subunidades (cadenas pesada y ligera) del factor VIII humano y animal, seguido por recombinación de la cadena pesada humana y la cadena ligera animal, o por recombinación de la cadena ligera humana y la cadena pesada animal . El aislamiento de las subunidades individuales tanto humanas como animales involucra la disociación del dímero de cadena ligera/cadena pesada. Esto se lleva a cabo, por ejemplo, por quelación de calcio con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) , seguido por CLAP en monoSMR (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) . Las moléculas híbridas de factor VIII humano/animal se reconstituyen a partir de subunidades aisladas en presencia de calcio. El factor VIII híbrido de cadena ligera humana/cadena pesada de animal o de cadena ligera de animal/cadena pesada humana se aisla de las cadenas pesadas que no han reaccionado por CLAP en monoSMR por procedimientos para el aislamiento del factor VIII porcino, tales como los que se describe por Lollar, J.S. et al., (1988) Blood 71: 137-143. Estos métodos, utilizados en una modalidad para preparar factor VIII híbrido humano/porcino activo, se describen con detalle en los ejemplos que siguen, que resultan en moléculas híbridas de cadena ligera humana/cadena pesada porcina con más de 6 veces la actividad procoagulante del factor VIII humano. Otras moléculas de factor VIII híbridas humanas/no humanas, no porcinas de mamíferos se pueden preparar, aislar y caracterizar para determinar su actividad por los mismos métodos. Una persona experta en la técnica reconocerá fácilmente que estos métodos también se pueden utilizar para preparar, aislar y caracterizar para determinar actividad de factor VIII híbrido animal/animal, tales como porcino/de ratón, que comprende la cadena ligera o pesada de una especie combinada con la cadena pesada o ligera de la otra especie.

PREPARACIÓN DE MOLÉCULAS DE FACTOR VIII HÍBRIDAS A PARTIR DE DOMINIOS AISLADOS DE FACTOR VIII HUMANO O ANIMAL. POR RECONSTITUCIÓN: La presente invención proporciona moléculas de factor VIII humanas/animal híbridas o fragmentos de las mismas con sustitución de dominio, las secuencias de ácido nucleico que las codifican, métodos para prepararlas y aislarlas, y métodos para caracterizar su actividad procoagulante. Un método involucra el aislamiento de uno o más dominios de los dominios humano o uno o más dominios del factor VIII animal, seguido por recombinación de dominios humano y animal para formar factor VIII híbrido humano/animal con actividad coagulante, como se describe por Lollar, P. et al., (25 de noviembre de 1992) J. Biol . Chem. 267 (33) : 23652-23657, para el factor VIII híbrido humano/porcino . Se proporciona específicamente un factor VIII híbrido humano/porcino con sustitución del dominio A2 porcino por el dominio A2 humano, modalidad la cual ilustra un método mediante el cual se puede construir un factor VIII híbrido humano/no humano, no porcino de mamífero, sustituido en dominio. Los dímeros derivados de plasma no humanos, no porcino de mamífero y humanos A1/A3-C1-C2 se aislan por disociación del dominio A2 a partir del factor Villa. Esto se lleva a cabo, por ejemplo, en presencia de NaOH, después de lo cual la mezcla se diluye y el dímero se eluye utilizando CLAP en monoSMR (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) . Se aisla el dominio A2 del factor Villa como un componente menor en la CLAP en monoSMR. Las moléculas de factor VIII híbridas humanas/animales se reconstituyen al mezclar volúmenes iguales del dominio A2 de una especie y el dímero A1/A3-C1-C2 de la otra especie. El factor VIII híbrido humano/animal o fragmentos del mismo con uno o más sustituciones de dominio se aislan de la mezcla de dímeros que no han reaccionado y A2 por CLAP en monoSMR, por procedimientos para el aislamiento de factor VIII porcino, como se describe por Lollar, J.S. et al., (1988) Blood 71 : 137-143. También se pueden utilizar métodos sistemáticos para preparar y aislar los dominios Al, A3, Cl, C2 y -B del factor VIII de una especie, y cualquiera o más de uno se pueden sustituir por el dominio correspondiente en el factor VIII de la otra especie. Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que estos métodos también se pueden utilizar para preparar, aislar y caracterizar para determinar actividad de un factor VIII híbrido animal/animal sustituido en los dominios, por ejemplo porcino/de ratón. Estos métodos, descritos con detalle en los ejemplos que siguen, resultan en moléculas de factor VIII híbridas con actividad procoagulante.

PREPARACIÓN DE MOLÉCULAS DE FACTOR VIII HÍBRIDAS POR INGENIERÍA RECOMBINANTE DE LAS SECUENCIAS QUE CODIFICAN PARA SUBUNIPADES, DOMINIOS O PARTES DE DOMINIOS DEL FACTOR VIII HUMANO. ANIMAL E HÍBRIDO: Sustitución de subunidades, dominios, partes continuas de los dominios : La presente invención proporciona moléculas híbridas recombinantes de factor VIII humanas/animales e híbridas equivalentes y fragmentos de las mismas con subunidades, dominios y sustitución de secuencias de aminoácidos, las secuencias de aminoácidos que codifican para estos híbridos, los métodos para prepararlos y aislarlos así como métodos para caracterizar su propiedades coagulantes, inmunorreactivas e inmunogénicas . El gen para el factor VIII humano se ha aislado y expresado en células de mamífero, como se reporta por Toóle, J.J. et al., (1984) Nature 312: 342-347 (Genetics Institute) Gitschier, J. et al., (1984) Nature 312: 326-330 (Genentech) Wood, W.I. et al., (1984) Nature 312: 330-337 (Genentech) Vehar, G.A. et al., (1984) Nature 312: 337-342 (Genentech); WO 87/04187; WO 88/ 08035; WO 88/03558; patente de los Estados Unidos No. 4,757,006 y la secuencia de aminoácidos se deduce a partir de ADNc . La patente de los Estados Unidos No. 4,965,199 para Capón et al., describe un método de ADN recombinante para producir el factor VIII en células huéspedes de mamíferos y la purificación de factor VIII humano. La expresión del factor VIII humano en células CHO (ovario de hámster chino) y BHKC (células de riñon de hámster bebé) se han reportado. Se ha modificado el factor VIII humano para suprimir parte o la totalidad del dominio B (patente de los Estados Unidos No. 4,868,112) y se ha intentado la sustitución del dominio B del factor VIII humano con el dominio B de factor V humano (patente de los Estados Unidos No. 5,004,803). La secuencia de .ADNc que codifica para el factor VIII humano y la secuencia predicha de aminoácidos se muestra en las SEC. DE IDENT. NO.: 1 y 2, respectivamente. El factor VIII porcino se ha aislado y purificado de plasma [Fass, D.N. et al., (1982) Blood 59 :594] . Las secuencias parciales de aminoácidos del factor VIII porcino que corresponden con las porciones de la secuencia de cadena ligera N terminal que tiene homología con ceruloplasmina y factor V de coagulación y durante mucho tiempo localizado incorrectamente, se describe por Church et al., (1984) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 81: 6934. Toóle, J.J. et al., (1984) Nature 312 : 342-347 describe el secuenciado parcial del extremo N terminal de cuatro fragmentos de aminoácido de factor VIII porcino pero no caracteriza los fragmentos en sus posiciones en la molécula de factor VIII. La secuencia de aminoácidos de B y parte de los dominios A2 de factor VIII porcino se reportan por Toóle, J.J. et al., (1986) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 83 : 5939-5942. La secuencia de .ADNc se codifica para el dominio A2 completo de factor VIII porcino y la secuencia predicha de aminoácidos y el factor VIII híbrido humano/porcino que tiene sustituciones de los todos los dominios, todas las subunidades y las secuencias específicas de aminoácidos se describen en el documento de los Estados Unidos número de serie 07/864,004, intitulado "Hybrid Human/Porcine factor VIII", presentado el 7 de abril de 1992 por John S. Lollar y Marschall S. Runge, quienes lo presentaron composición patente de los Estados Unidos número 5,364,771 el 15 de noviembre de 1994, y en WO 93/20093. La secuencia de .ADNc que codifica para el dominio A2 del factor VIII porcino tiene una identidad de secuencia por los residuos 373-740 en el factor VIII humano maduro, como se presenta en la SEC. DE IDENT. NO. : 1, y la secuencia predicha de aminoácidos se muestra en las SEC. DE IDENT. NO. : 3 y 4, respectivamen e. Más recien emente, las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos correspondientes de los dominios Al y A2 del factor VIII porcino y el factor VIII quimérico con los dominios Al y/o A2 porcinos sustituidos por los dominios humanos correspondientes se reportan en WO 94/11503. Ambos de factor VIII porcino y humano se aislan en plasma como una proteína de dos subunidades. Estas subunidades, conocidas como la cadena pesada y la cadena ligera, se mantienen juntas por un enlace covalente que requiere calcio u otros iones metálicos divalentes. La cadena pesada del factor VIII contiene tres dominios, Al, A2 y B, los cuales se unen covalentemente. La cadena ligera del factor VIII también contiene tres dominios, denominados A3, Cl y C2. El dominio B no tiene función biológica conocida y se puede remover de la molécula proteolíticamente o por métodos de tecnología de ADN recombinante sin alteración importante en algún parámetro mensurable del factor VIII. El factor VIII recombinante humano tiene una estructura y función similares al factor VIII derivado de plasma, aunque no se glicosila a menos que se exprese en células de mamífero. El factor VIII tanto humano como porcino activado ("factor Villa") tiene- tres subunidades debido a la separación de la cadena pesada entre los dominios Al y A2. Esta estructura se denomina A1/A2/A3 -C1-C2. El factor Villa humano no es estable bajo condiciones que estabilizan al factor Villa porcino, debido probablemente a una asociación más débil de la subunidad A2 del factor Villa humano. La disociación de la subunidad A2 del factor Villa humano y porcino se asocia con pérdida de actividad en la molécula de factor Villa. Utilizando como sonda la secuencia conocida o de partes de la molécula de factor VIII porcina, los dominios de la molécula de factor VIII porcina que no se ha secuenciado hasta ahora se pueden secuenciar por técnicas de clonación establecidas estándar, tales como las descritas en Weis, J.H., "Construction of recombinant DNA libraries", en Current Protocols in Molecular Biolocry, F.M. Ausubel et al., eds. (1991); y Sambrook, J., et al . , Molecular Cloning, A Laboratory Manual . de manera que se puedan construir híbridos de longitud completa. Se proporcionan específicamente como una modalidad ejemplar y preferida el factor VIII humano/porcino híbrido recombinante activo que tiene un dominio A2 sustituido, la secuencia de ácido nucleico que codifica, y métodos para preparar, aislar y caracterizar su actividad. Los métodos por los cuales este constructo híbrido se prepara también se pueden utilizar para preparar el factor VIII humano/porcino híbrido recombinante activo o fragmentos de los mismos que tienen sustitución de subunidades, partes 'continuas de dominios y dominios diferentes de A2. Un experto en la técnica reconocerá que estos métodos también demuestran la manera en que otras moléculas de factor VIII híbridas humanas/no humanas, no porcinas de mamífero o animales/animales híbridas o fragmentos de las mismas, se pueden preparar en cuáles subunidades, dominios o partes continuas de los dominios se sustituyen. El factor VIII recombinante híbrido humano/porcino se prepara a partir de ADNc humano (Biogen, Inc.) o ADNc porcino (descrito aquí) que codifica para la secuencia relevante del factor VIII. En una modalidad preferida, el factor VIII codificado por el ADNc incluye el dominio A1-A2-A3-C1-C2, que carece la totalidad del dominio B, y corresponde los residuos aminoácidos 1-740 y 1649-2332 del factor VIII humano de cadena sencilla (véase la SEC. DE IDENT. NO. : 2) , de acuerdo con el sistema de numeración de Wood et al., (1984) Nature 312 : 330-337. Las subunidades, dominios o partes continuas individuales de los dominios de T?DNc para el factor VIII porcino o humano se pueden y han sido clonados y sustituidos por las subunidades, dominios o partes de dominios humanos o porcinos correspondientes por técnicas de mutagénesis establecidas. Por ejemplo, Lubin, I.M., et al., (1994) J. Biol . Chem. 269 (12) : 8639-8641 describe técnicas para sustituir el dominio A2 porcino para el dominio humano utilizando sitios de restricción convenientes. Otros métodos para sustituir una región arbitraria del ADNc para el factor VIII de una especie por el ADNc para el factor VIII de otra especie incluye el empalme por extensión de superposición ("SOE"), como se describe por Horton, R.M., et al., (1993) Meth. Enzymol 217; 270-279. El /ADNc para el factor VIII híbrido que codifica para las subunidades, dominios o partes de los dominios o para la totalidad de las moléculas de ADNc híbridas se clonan en vectores de expresión para expresión final de las moléculas de proteínas de factor VIII híbridas activas humanas/porcinas en células cultivadas por técnicas establecidas, como se describe por Selden, R.F., "Introduction of DNA into mammalian cells", en Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds. (1991) . En una modalidad preferida, un factor VIII que codifica para .ADNc híbrido humano/porcino, en el cual la secuencia porcina codifica para un dominio o parte de un dominio, tal como el dominio A2 o parte del dominio, se inserta en un vector de expresión de mamífero, tal como ReNeo, para formar un constructo híbrido del factor VIII. La caracterización preliminar del factor VIII híbrido se lleva a cabo por inserción del ADNc híbrido dentro del vector de expresión de mamífero ReNeo y la expresión transitoria -de la proteína híbrida en células COS-7. Después se puede realizar una determinación de la proteína híbrida activa. La expresión del constructo del vector se utiliza adicionalmente para transfectar de manera estable células en cultivo, tales como células de riñon de hámster bebé, utilizando métodos que son habituales en la técnica, tales como transfección mediada por liposomas (LipofectinMR, Life Technologies, Inc.). La expresión de la proteína del factor VIII híbrido recombinante se puede confirmar, por ejemplo, por secuenciado mediante transferencia Northern y Western, o bien por reacción en cadena de polimerasa (PCR) . La proteína del factor VIII híbrido en el medio de cultivo en el cual las células transfectadas expresan de manera estable la proteína se mantienen y se puede precipitar, sedimentar, lavar y resuspender en un amortiguador apropiado, y la proteína de factor VIII híbrida recombinante se purifica por técnicas estándar que incluyen cromatografía de inmunoafinidad utilizado, por ejemplo, anti-A2-SepharoseMR monoclonal . En una modalidad adicional, el factor VIII híbrido que comprende la subunidad, dominio o secuencia de aminoácido de sustituciones se expresa como una proteína de fusión a partir de una molécula recombinante en la cual la secuencia que codifica para una proteína o péptido que mejora, por ejemplo la estabilidad, secreción, detección, aislamiento o similar, se inserta en su lugar adyacente a la secuencia que codifica para el factor VIII. Los protocolos establecidos para el uso de especies homologas o heterólogas de secuencias de control de expresión incluyen, por ejemplo, promotores, operadores y reguladores, en la expresión de proteínas de fusión que se conocen y que se utilizan habitualmente en la técnica. Véase, Current Protocols in Molecular Biolocry (Ausubel, F.M. et al., eds) , Wiley Interscience, N.Y. El factor VIII híbrido purificado o un fragmento del mismo se puede ensayar para determinar inmunorreactividad y actividad de coagulación por ensayos estándar que incluyen, por ejemplo, ensayo de factor VIII libre en plasma, ensayo de coagulación en una etapa, y el ensayo inmunosorbente unido a enzima utilizando el factor VIII humano recombinante purificado como un estándar. Otros vectores, que incluyen tanto a vectores plasmídicos como eucarióticos virales, se pueden utilizar para expresar un constructo de gen recombinante en células eucarióticas dependiendo de la preferencia y juicio de la persona experta quien realiza la práctica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., capitulo 16). Otros vectores y sistemas de expresión incluyen sistemas bacterianos, de levaduras, y de células de insectos se pueden utilizar, pero no se prefieren debido a las diferencias en, o la carencia de glicosilación. La proteína de factor VIII híbrida recombinante se puede expresar en diversas células utilizadas comúnmente para cultivo y expresión de proteína de mamífero recombinante. En particular, se han encontrado numerosas líneas de células de roedor las cuales son huéspedes especialmente útiles para la expresión de proteínas grandes. Las líneas de células preferidas, disponibles de la American Type Culture Colection, Rockville, MD, incluyen células de riñon de hámster bebé y células de ovario de hámster chino (CHO) las cuales se cultivan utilizando procedimientos y medios habituales. Los mismos métodos utilizados para preparar factor VIII híbrido humano/porcino que tenga sustitución en la secuencia de subunidades, dominios o aminoácidos, se pueden utilizar para preparar otra proteína de factor VIII híbrido recombinante y fragmentos de la misma así como ácidos nucleicos que codifican para estos híbridos, tales como humano/no humano, no porcino de mamífero o animal/animal . A partir de los cebadores de la secuencia de ADN humana conocida, se han clonado el ADNc para el factor VIII murino y parte del porcino. Las secuencias de factor VIII de otras especies para uso en la preparación de una molécula de factor VIII híbrida humana/animal o animal/animal se pueden obtener utilizando las secuencias de ADN conocidas humana y porcina como el punto de inicio. Otras técnicas que se pueden utilizar incluyen métodos de amplificación por PCR con ADN de tejido animal, y el uso de una biblioteca de .ADNc de un animal para separar por clonación la secuencia de factor VIII. Como una modalidad ejemplar, se puede elaborar como sigue el factor VIII híbrido de humano/ratón. Se han aislado y secuenciado clonas de ADN que corresponden al homologo de ratón del gen para el factor VIII humano, y se ha predicho la secuencia de aminoácidos de la proteína del factor VIII de ratón, como se describe en Eider, G., et al., (1993) Genomics 16 (2) : 374-379, la cual también incluye una comparación de las secuencias predichas de aminoácidos de moléculas de factor VIII de ratón, humano y parte de la porcina. La secuencia de ADN para el factor VIII de ratón y la secuencia predicha de aminoácidos se muestran en las SEC. DE IDENT. NO. : 5 y SEC. DE IDENT. NO.: 8, respectivamente. En una modalidad preferida, la amplificación de ARN con métodos de secuenciado de transcripto (RAWTS) se describen en Sarkar, G., et al., (1989) Science 244: 331-334, y se pueden utilizar. Brevemente, las etapas son (1) síntesis de ADNc con oligo (dT) de un cebador oligonucleotídico específico para ARNm; (2) reacción en cadena de polimerasa (PCR) en la cual uno o ambos oligonucleótidos contienen un fago promotor unido a una secuencia complementaria a la región que se va a amplificar; (3) transcripción con un promotor fago; y (4) secuenciado didesoxi mediado por transcriptasa inversa del transcripto, el cual se ceba con un oligonucleótido incrustado (interno) . Además de revelar la información de la secuencia, este método para generar un producto de traducción in vitro al incorporar una señal de inicio de traducción dentro del cebador de PCR apropiado; y se puede utilizar para obtener información novedosa de la secuencia de ARNm de otras especies .

Sustitución de los aminoácidos: La presente invención proporciona moléculas de factor VIII activas recombinantes híbridas humanas/animales y animales/animales, o fragmentos de las mismas, que comprende por lo menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos únicos de una especie sustituida por la secuencia aminoácida correspondiente de otra especie o un fragmento de la misma, secuencia de ácido nucleico que codifican para estos híbridos, métodos para prepararlas y aislarlas, y métodos para cambiar sus propiedades coagulante, inmunogénica e inmunorreactiva. El dominio A2 es necesario para la actividad procoagulante de la molécula de factor VIII. Los estudios muestran que el factor VIII porcino tiene seis veces más actividad procoagulante en comparación con el factor VIII humano (Lollar, P., et al . , (1991) J. Biol . Chem. 226: 12481-12486, y que la diferencia en la actividad coagulante entre el factor VIII humano y porcino parece estar basado en una diferencia en la secuencia de aminoácidos entre uno o más residuos en los dominios A2 humano y porcino (Lollar, P., et al., (1992) J. Biol . Chem . 267 : 23652-23657. Además, los dominios A2 y C2 , y posiblemente una tercera región de cadena ligera en la molécula - de factor VIII humano se considera que albergan los epitopos para los cuales reaccionan la mayor parte, sino todos, los anticuerpos inhibidores, de acuerdo con Hoyer (1994) Semin . Hewatol . ¿1: 1-5. Las moléculas de factor VIII recombinantes híbridas humanas/animales, animales/animales o equivalentes, o bien fragmentos de las mismas se pueden elaborar por sustitución de por lo menos una secuencia específica que incluye uno o más aminoácidos únicos a partir de A2 , C2, y/u otro dominios del factor VIII de una especie por la secuencia correspondiente de otra especie, en donde las secuencias de aminoácidos difieren, como se ilustra con mayor detalle abajo, entre las moléculas de las dos especies. En una modalidad preferida ejemplar descrita aquí, la presente invención proporciona un factor VIII activo recombinante híbrido humano/porcino que comprende una secuencia de aminoácidos porcinos sustituida por la secuencia de aminoácidos humanos correspondientes que incluye un epitopo, en donde el factor VIII híbrido tiene inmunorreactividad disminuida o nula, con anticuerpos inhibidores para el factor VIII. En una modalidad adicional, las moléculas de factor VIII activo recombinante híbrido también se pueden elaborar para que comprendan la secuencia de aminoácidos de más de una de las especies sustituidas por la secuencia correspondiente en una tercera especie. Las moléculas recombinantes híbridas equivalentes también se pueden elaborar, para que comprendan factor VIII humano, animal o híbrido, que incluye por lo menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que no tienen identidad de secuencia conocida con el factor VIII, como se describe adicionalmente después. Cualquier constructo para el factor VIII híbrido que tenga sustitución específica de aminoácidos como se describe, se pueden sellar por procedimientos estándar para determinar actividad coagulante y para reactividad con anticuerpos inhibidores para el factor VIII para identificación de moléculas de factor VIII híbridas con actividad coagulante aumentada o inmunorreactividad de anticuerpos disminuida, o ambas . Las moléculas híbridas también se pueden hibridizar para que tengan actividad coagulante reducida en comparación con el factor VIII humano o porcino, pero para que tengan también reactividad de anticuerpo disminuida. Un experto en la técnica reconocerá que las moléculas de factor VIII híbridas o fragmentos de las mismas que tengan actividad coagulante menor, igual o mayor en comparación con el factor VIII humano o porcino, son útiles para tratar pacientes quienes tienen una deficiencia en el factor VIII. Los métodos descritos en la presente para preparar factor VIII recombinante híbrido humano/porcino con sustitución de aminoácidos específicos se pueden utilizar para preparar proteína de factor VIII activa recombinante híbrida humana/no humana, no porcino de mamífero, factor VIII híbrido animal - 1/animal -2 , y factor VIII equivalente híbrido o fragmentos de los mismos.

Moléculas de factor VIII híbridas con actividad coagulante alterada: La presente invención proporciona molécula de factor VIII procoagulantes recombinante híbridas humanas/animales, animal/animal o equivalentes, o fragmentos de las mismas, que comprenden por lo menos una secuencia específica que incluye uno o más aminoácidos únicos que tienen actividad procoagulante en el factor VIII de una especie sustituida por la secuencia de aminoácidos correspondientes del factor VIII de otra especie, utilizando técnicas de mutagénesis dirigida la sitio, como se describe aquí. Las secuencias específicas para ser utilizadas en la sustitución se seleccionan y los constructos híbridos se preparan y ensayan para determinar su actividad coagulante, como sigue. Se proporciona específicamente como una modalidad preferida y ejemplar un factor VIII híbrido humano/porcino que comprende sustituciones de aminoácidos en el dominio A2. Se entiende que un experto en la técnica puede utilizar estos métodos para preparar otras moléculas de factor VIII híbridas humanas/animales, animales/animales y equivalentes o fragmentos de las mismas, que tengan actividad coagulante alterada, preferiblemente actividad coagulante aumentada en comparación con el factor VIII. Las bases para una mayor actividad coagulante en el factor VIII porcino parecen ser una disociación espontanea más rápida de la subunidad A2 del factor Villa humano en comparación con el factor Villa porcino, lo que lleva a una pérdida de actividad, de acuerdo con Lollar, P. et al., (1990) J. Biol . Chem. 265: 1688-1692; Lollar, P. Et al., (1992) J. Biol . Chem. 267 : 23652-23657; Fray, P.J., et al., (1992) J. Biol . Chem . 261 : 13246-13250. En la figura ÍC se muestra una comparación de la alineación de las secuencias de aminoácidos de los dominios A2 del factor VIII humano y porcino (la numeración de los residuos comienza en la posición 373 con respecto a la secuencia de aminoácidos de longitud completa del factor VIII humano, SEC. DE IDENT. NO. : 2. Para la preparación de una molécula de factor VIII híbrida humana/porcina con actividad coagulante alterada, en la tabla I se muestra los candidatos objetivo iniciales para mutagénesis, los cuales se evidencian mediante la comparación de las secuencias de aminoácidos A2 humana y porcina (SEC. DE IDENT. NO.: 2 y 6, respectivamente).

TABLA I. CANDIDATOS OBJETIVO DE LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS HUMANOS PARA MUTAGÉNESIS (SEC. DE IDENT. NO. : 2) La tabla I y las letras en negrillas de las figuras 1A-1B ilustran sietes secuencias en las secuencias de aminoácidos de dominio A2 de humano y de cerdo (SEC. DE IDENT. NO.: 2 y 6, respectivamente) que constituyen únicamente 17% del dominio A2 pero que incluyen 70% de las diferencias en la secuencia entre los dominios humano y porcino de A2. Se describe un constructo recombinante híbrido humano/porcino en el cual se ha sustituido los aminoácidos Ser373-Glu604 en el dominio A2 (Ser373-Arg740) del factor VIII humano con la secuencia porcina homologa. Este constructo no reacciona con inhibidores A2 y tiene la misma actividad coagulante que el factor VIII humano B(-). Se describe una molécula híbrida derivada de plasma que comprende una sustitución de dominio A2 porcino completo en el factor VIII humano que tiene actividad coagulante' aumentada en comparación con el factor VIII humano. La comparación de estos constructos indica que una región entre los residuos Asp605 y Arg740 es responsable de la diferencia entre la actividad entre el factor VIII humano y porcino. Esta región se puede definir más específicamente mediante la elaboración sistemática de moléculas de factor VIII y recombinante híbridas humanas/porcinas con sustituciones porcinas en la región entre Asp605 y Arg740 mediante la utilización de técnicas de mutagénesis dirigida al sitio establecida, por ejemplo, mediante el método de "empalme por extensión de superposición" (SOE) que se ha utilizado ampliamente para elaborar moléculas de factor VIII híbridas que contienen sustituciones porcinas en la región NH2 terminal de A2. Estas moléculas se pueden expresar en células COS-7 y células de riñon de hámster bebé como se describe antes. Se pueden purificar a homogeneidad utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como heparina-SepharoseMR y cromatografía de inmunoafinidad. La concentración de proteína se puede estimar por absorción de luz ultravioleta a A280, y se puede determinar la actividad específica de los constructos al dividir la actividad coagulante (medida en unidades por ml en un ensayo de coagulación de etapa única) por A280. El factor VIII humano tiene actividad específica de aproximadamente 3000-4000 U/A280, mientras el factor VIII porcino tiene una actividad específica de aproximadamente 20000 U/A280. En una modalidad preferida, el factor VIII procoagulante recombinante híbrido humano/porcino tiene una actividad específica de 20000 U/A280 y contiene una cantidad mínima de sustitución porcina en el dominio A2. Como se describe aquí, las técnicas de mutagénesis dirigidas a sitios se utilizan para identificar proteína híbrida con actividad coagulante que se puede mejorar, igualar a, o reducir en comparación con el factor VIII humano, pero preferiblemente se incrementa. En la modalidad híbrida humana/porcina, las secuencias humanas específicas se sustituyen con secuencias porcinas, utilizando preferiblemente el método de empalme por extensión de superposición (SOE) , como se describe por Ho, S.N., et al., 77 Gene 51-59 (1994), y en los ejemplos 7 y 8. También se puede utilizar la mutagénesis dirigida a oligonucleótido como se realiza para eliminar los rizos de la secuencia de aminoácidos para una parte del dominio A2 humano (véase ejemplo 7) . Puesto que el análisis funcional de los híbridos revela actividad coagulante, la secuencia puede dividirse adicionalmente y mapearse para determinar secuencias procoagulantes por técnicas de análisis de mutación puntual estándar. La presente invención contempla que el ADNc para el factor VIII híbrido y la proteína se puede caracterizar por métodos que se han establecido y que son habituales, tales como secuenciado de ADN, ensayos de actividad coagulante, determinación de masa por ELISA y por absorbancia UV a 280 nm de factor VIII híbrido purificado, actividad coagulante específica (U/mg) , SDS-PAGE del factor VIII híbrido purificado y similares. Se pueden requerir otros métodos conocidos para determinar la efectividad clínica tales como análisis de aminoácidos, carbohidratos, sulfato o de iones metálicos. Un factor VIII híbrido recombinante que tenga actividad coagulante superior, en comparación con el factor VIII humano, puede ser menos costoso para elaborar el factor VIII derivado de plasma y puede disminuir la cantidad de factor VIII necesaria para un tratamiento efectivo de una deficiencia de factor VIII.

Moléculas de factor VIII híbridas con inmunorreactividad reducida: Los epitopos que son inmunorreactivos con los anticuerpos que inhiben la actividad coagulante del factor VIII ("inhibidores" o "anticuerpos inhibidores") se han caracterizado en base en las relaciones de estructura-función conocidas en el factor VIII. Probablemente, los inhibidores pueden actuar al interrumpir cualquiera de las interacciones macromoleculares asociadas con la estructura de dominio del factor VIII o sus asociaciones con el factor de von Willebrand, trombina, factor Xa, factor IXA o factor X. Sin embargo, más del 90 porciento de los anticuerpos inhibidores para el factor VIII humano actúan al unirse a epitopos que se localizan en el dominio A2 de 40 kDa o al dominio C2 de 20 kDa de factor VIII, interrumpiendo funciones específicas asociadas con estos dominios, como se describe por Fulcher et al., (1985) Proc. Nati . Acad. Sci USA £2: 7728-7732; y Scandella et al., (1988) Proc. Nati . Acad. Sci USA j£J¿; 6152-6156. Además de los epitopos A2 y C2, puede hacer un tercer epitopo en el dominio A3 o Cl de la cadena ligera del factor VIII, de acuerdo con Scandella et al, (1993) Blood ¿2: 1767-1775. Se desconoce la importancia de este tercer epitopo supuesto, pero parece que constituye una fracción menos de la reactividad de epitopo en el factor VIII. Los anticuerpos contra A2 bloquean la activación de factor X, como se muestra por Lollar et al., (1994) ". Clin . Invert . 93 : 2497-2504. Estudios de mapeo previos por mutagénesis de supresión descritos por Ware et al., (1992) Blood Coagul . Fibrinolysis 3 703-716, localizaron al epitopo A2 dentro de una región de 20 kDa del extremo NH2 terminal del dominio A2 de 40 kDa. Los ensayos inmunorradiométricos de competencia ha indicado de los inhibidores de A2 reconocen un epitopo común o epitopos agrupados estrechamente, como se describe por Scandella et al., (1992) Thom . Haemostas 67: 665-671, y como se demuestra en el ejemplo 8. La presente invención proporciona moléculas híbridas recombinantes reactivas o factor VII? equivalente híbrido, o fragmentos del mismo, cuyas secuencias de ácido nucleico codifican para estos híbridos, así como métodos para prepararlas y aislarlas y métodos para caracterizarlas. Estos híbridos comprenden moléculas de factor VIII híbridas humanas/animales, animales/animales o equivalentes, y consisten además de por lo menos de una secuencia específica de aminoácidos que incluye uno o más aminoácidos únicos del factor VIII de una especie sustituido por la secuencia de aminoácidos correspondiente del factor VIII de otra especie, o que comprende por lo menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que no tienen identidad de secuencia conocida con el factor VIII sustituidas por secuencias de aminoácidos - específicas en el factor VIII humano, animal o híbrido. El factor VIII híbrido resultante tiene inmunorreactividad reducida o nula con los anticuerpos inhibidores del factor VIII, en comparación con el factor VIII humano o porcino. Utilizando la solución descrita en la sección previa para la sustitución de aminoácidos en la molécula de factor VIII, se utiliza el análisis mutacional para seleccionar la secuencia de aminoácidos del factor VIII correspondientes de una especie, preferiblemente porcina, la cual se sustituye con por lo menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos en el factor VIII de otra especie, preferiblemente humano, o para la secuencia de aminoácidos de una molécula de factor VIII equivalente híbrida, que incluye una' o más regiones críticas en A2, C2 o cualquier otro dominio al cual se dirijan los anticuerpos inhibidores. Los métodos se describen con mayor detalle en lo siguiente. El constructo híbrido recombinante procoagulante resultante tiene inmunorreactividad reducida o nula con los anticuerpos inhibidores, en comparación con el factor VIII humano, utilizando ensayos estándar. Mediante la sustitución sistemática de secuencias de aminoácidos cada vez más pequeñas seguidas por ensayo de constructo híbrido para inmunorreactividad, como se describe abajo, se puede mapear el epitopo de cualquier molécula de factor VIII, sustituido por una secuencia de aminoácidos que tiene inmunorreactividad menor o nula, y se prepara un factor VIII híbrido. Se entiende que aquellos expertos en la técnica pueden utilizar esta solución para combinar el mapeo de epitopos, la construcción de moléculas híbridas de factor VIII y análisis mutacional de los constructos para identificar y sustituir por lo menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que comprenden un epitopo en los dominios A2, C2 y/u otros dominios de los cuales se dirigen los anticuerpos inhibidores y para construir un factor VIII procoagulante recombinante híbrido humano/animal, animal/animal o equivalente, o fragmentos del mismo que tienen inmunorreactividad disminuida o nula, en comparación con el factor VIII humano o porcino. Esta solución se utiliza como se describe en el ejemplo 8, para preparar un factor VIII recombinante procoagulante híbrido humano/porcino que tiene sustituciones de aminoácidos porcinos en el dominio A2 humano y sin antigenicidad para anticuerpos contra factor VIII, como una modalidad ejemplar. Habitualmente, el factor VIII porcino tiene una reacción limitada o nula, con los anticuerpos inhibidores para el factor VIII humano. Las moléculas de factor VIII humano híbridas recombinantes humanas/porcinas tienen reactividad disminuida o nula con anticuerpos inhibidores en base en la sustitución de aminoácidos en el dominio A2 y se preparan, como un ejemplo de cómo se pueden preparar el factor VIII híbrido utilizando el factor VIII de otras especies y sustituciones en dominios diferentes a A2, como sigue. El dominio A2 porcino se clona por técnicas de clonación estándar, tales como las descritas antes en los ejemplos 6, 7 y 8, y después se cortan y empalman dentro del dominio A2 utilizando procedimientos sistemáticos, tales como sitios de restricción para cortar el ADN, o mediante empalme por extensión de superposición (SOE) . La secuencia resultante de aminoácidos porcinos se sustituye en el dominio A2 humano para formar el constructo de factor VIII híbrido, el cual se inserta dentro de un vector de expresión de mamífero, preferiblemente ReNeo, transfectado establemente en células cultivadas, preferiblemente células de riñon de hámster bebé y se expresa, como se describe antes. El factor VIII híbrido se ensaya para determinar inmunorreactividad, por ejemplo, con anticuerpos contra A2 mediante el ensayo de Bethesda de rutina o por un ensayo de sustrato cromogénico libre de plasma. La unidad Bethesda (BU) es el método estándar para medir títulos de inhibidor. Si el título Bethesda no es mensurable (<0.7 BU/mg IgG) en el híbrido, entonces se elimina el epitopo A2 humano en la región de la secuencia porcina correspondiente sustituida. El epitopo se estrecha progresivamente, y de esta manera se puede determinar el epitopo específico para A2 para producir una molécula híbrida humana/porciña con tan poca secuencia porcina co o sea posible. Como se describe en la presente, una secuencia de 25 residuos que corresponden a los aminoácidos Arg484 - Ile508 que es crítica para inmunorreactividad inhibitoria se ha identificado y se sustituye en el dominio A2 humano. Dentro de esta secuencia únicamente hay nueve diferencias entre el factor VIII humano y porcino. Esta región puede ser analizada adicionalmente y sustituida. Las moléculas de factor VIII híbridas humanas/porcinas que tienen reactividad disminuida o nula con anticuerpos inhibidores en base en la sustitución de secuencia de aminoácidos en los dominios Cl, C2 u otro dominio con o sin sustitución en el dominio A2, también se pueden preparar. El epitopo C2 , por ejemplo, puede ser mapeado utilizando un enfoque de exploración homologa combinado con mutagénesis dirigida al sitio. Más específicamente, los procedimientos pueden ser iguales o similares a los descritos aquí para la sustitución de aminoácidos en el dominio A2, que incluyen la clonación de C2 porcino u otro dominio, por ejemplo, mediante la utilización de RT-PCR o mediante sondeo de una biblioteca de ADNc de hígado porcino con C02 humano u otro ADN de dominio; técnicas de restricción de sitio o SOE sucesiva, o ambas, para mapear y sustituir simultáneamente epitopos en C2 u otro dominio; sustitución por C2 humano u otro dominio en factor VIII B(-); inserción en un vector de expresión, tal como pBluescript; expresión en célula cultivadas; y ensayo de rutina para inmunorreactividad. Para los ensayos, se puede realiza la reactividad del factor VIII híbrido en C2 con un inhibidor específico C2, MR [Scandella et al., (1992) Thomb. Haemostasis 61 : 665-671 y Lubin et al., (1994)], y/u otros anticuerpos específicos para C2 preparados por cromatografía de afinidad. El dominio C2 consiste de los residuos aminoácidos 2173-2332 (SEC. DE IDENT. NO.: 2). Dentro de esta región de 154 aminoácidos, la actividad inhibidora parece estar dirigida a una región de 65 aminoácidos entre los residuos 2248 y 2312, de acuerdo con Shima, M., et al . , (1993) Thomb . Hae ostas 69 : 240-246. Si la secuencia C2 del factor VIII humano y porcino es de aproximadamente 85 por ciento idéntica en esta región, al igual que en otra parte en la regiones funcionalmente activas de factor VIII, habrá aproximadamente 10 diferencias entre la secuencia de aminoácidos de C2 del factor VIII humano y porcino, el cual se puede utilizar como objetivos iniciales para construir híbridos con una secuencia C2 sustituida. Es probable que los epitopos del factor VIII clínicamente significativos estén confinados a los dominios A2 y C2. Sin embargo, si se identifican anticuerpos para otras regiones (dominios Al, A3 , B o Cl) del factor VIII, los epitopos pueden ser mapeados y eliminados mediante la utilización del enfoque descrito aquí para moléculas de factor VIII humanas/porcinas híbridas no antigénicas.

Más específicamente, el mapeo de el segundo epitopo de cadena ligera putativo y/o de cualquier otro epitopo en cualquier otro animal o dominio de factor VIII humano también se puede llevar a cabo. Inicialmente, se puede realizar como sigue una determinación de la presencia del tercer epitopo inhibidor en los dominios A3 o Cl . Utilizando secuencias de aminoácidos de factor VIII humano ("H") y porcino ("p"), como un modelo, se construirán híbridos sin dominio B Alp-A2p-A3p-ClH-C2p y Alp-A2p-A3H-Clp-C2p. Las IgG inhibidoras de plasma de aproximadamente 20 pacientes (del doctor Dorothea Scandella, American Red Cross) , quienes tienen títulos bajos o indetectables contra factor VIII porcino se pueden probar contra los híbridos . Si el tercer epitopo está en el dominio A3, se espera que las IgG inhibidoras reacciones con Alp-A2p-A3H-Clp-C2p, pero no con Alp-A2p-A3p-C1H-C2p. Inversamente, si el tercer epitopo está en el dominio Cl, entonces la IgG inhibidora se espera que reaccione con Alp-A2p-A3p-C1H-C2p pero no con Alp-A2p-A3H-Clp-C2p. Si se identifica un tercer epitopo, se caracterizará por los procedimientos descritos aquí para los epitopos A2 y C2. Por ejemplo, los anticuerpos específicos para el epitopo de dominio Cl o A3 se pueden aislar de las IgG totales de un paciente por cromatografía de afinidad utilizando los híbridos Alp-A2p-A3H-Clp-C2p y Alp-A2p-A3p-C1H-C2p, y por eliminación de los anticuerpos específicos C2 por pasaje sobre factor VIII recombinante C2-SepharaoseMR. El tercer epitopo putativo se identificará por constructos SOE en los cuales, en una modalidad preferida, las porciones del dominio A3 o Cl del factor VIII humano se sustituyen sistemáticamente por la secuencia porcina.

Moléculas de factor VIII híbridas con inmunocrenicidad reducida: Una molécula es inmunogénica cuando puede inducir la producción de anticuerpos en un humano o animal . La presente invención proporciona una molécula de factor VIII procoagulante .recombinante híbrida humana/animal o animal/animal, factor VIII híbrido de molécula equivalente o un fragmento de cualquiera de ellas que sea menos inmunogénico que el factor VIII humano/porcino de tipo silvestre en humano o animal, que comprende por lo menos una secuencia específica de aminoácidos que incluye uno o más aminoácidos únicos del factor VIII de una especie sustituido por la secuencia correspondiente de aminoácidos que tienen actividad inmunogénica del factor VIII de las otras especies; o por lo menos una secuencia de aminoácidos que incluye uno o más aminoácidos que no tienen factor VIII de identidad conocida sustituido por la secuencia de aminoácidos del factor VIII humano, animal o híbrido. Este híbrido se puede utilizar para disminuir la incidencia de desarrollo de inhibidor en un animal o humano y para tratar deficiencias de factor VIII, y se puede preferir en tratar previamente pacientes no tratados anteriormente con hemofilia. En una modalidad preferida, el factor VIII híbrido comprende la secuencia de aminoácidos del factor VIII, y comprende además uno o más residuos alanina sustituidos por una secuencia de aminoácidos que tienen actividad inmunogénica, lo que resulta en una molécula equivalente híbrida recombinante procoagulante o un fragmento de la misma que tiene inmunogenicidad reducida o nula en un humano o animal. El proceso que se describe del mapeo del epitopo y el análisis mutacional combinado con la sustitución de una secuencia de aminoácidos no antigénica en una molécula de factor VIII, utilizando factor VIII humano/porcino híbrido, produce moléculas híbridas con baja ántigenicidad. Utilizando este modelo y los métodos asociados, se puede alterar cualquiera de los constructos híbridos descritos aquí por técnicas de mutagénesis dirigida al sitio para remover tanto epitopo funcional como sea posible para minimizar la disponibilidad del sistema inmune para reconocer al factor VIII híbrido, por lo que se disminuye su inmunogenicidad. Un método que se puede utilizar para reducir adicionalmente la antigenicidad y para construir un factor VIII híbrido menos inmunogénico es mutagénesis de barrido de alanina, descrito por Cunningham, B.C. et al., (1989) Science 244: 1081-1085, de las secuencias específicas seleccionadas de aminoácidos en el factor VIII humano, animal o híbrido equivalente. En la mutagénesis de exploración de alanina, las cadenas laterales de aminoácidos que están involucradas putativamente en un epitopo se sustituyen por residuos alanina mediante la utilización de mutagénesis dirigida al sitio. Al comparar la unión de anticuerpo de los mutantes de alanina con la proteína de tipo silvestre, se puede determinar la contribución relativa de las cadenas laterales individuales con la interacción de unión. Es probable que las sustituciones de alanina sean especialmente útiles, puesto que las contribuciones de cadena lateral a la unión del anticuerpo se eliminan sobrepasando el carbono ß, pero, a diferencia de la sustitución de glicina, la conformación de la cadena principal habitualmente no se altera. La sustitución con alanina no impone un efecto esférico, hidrofóbico o electrostático mayor que el que domina las interacciones proteína-proteína. En una interacción de antígeno-anticuerpo de proteína, éstas son habitualmente de aproximadamente 15-20 antígenos laterales de cadena en contacto con el anticuerpo. Las interacciones de cadena lateral, en oposición con las interacciones de cadena principal, dominan las interacciones proteína-proteína. Estudios recientes han sugerido que únicamente algunas (aproximadamente 3 a 5) de estas interacciones de cadena lateral contribuyen a la mayor parte de la energía de unión. Véase Clackson, T., et al., (1995) Science 267 : 383-386. Un análisis extenso de los epitopos de hormona del crecimiento para varios anticuerpos monoclonales murinos muestran la siguiente jerarquía para las contribuciones de la cadena lateral con la energía de unión: Arg > Pro > Glu - Asp -Phe - lie, con Trp, Ala, Gly, y Cys no se prueba [Jin, L., et al., (1992) J. Mol . Biol . 226: 851-865]. Los resultados con el epitopo A2 descritos aquí son consistentes con esto, puesto que 12 de los 25 residuos en el segmento A2 484-508 contienen estas cadenas laterales (tabla 1) . El hallazgo de que ciertos residuos aminoácidos son reconocidos particularmente bien por los anticuerpos, indica que la eliminación de estos residuos a partir de un epitopo conocido pueden disminuir la capacidad del sistema inmune para reconocer estos epitopos, es decir, pueden volver a la molécula menos inmunogénica. En el caso del epitopo A2 , los residuos inmunogénicos se pueden sustituir sin pérdida de la actividad coagulante del factor VIII. Por ejemplo, en HP9, Arg484 se sustituye por Ser, Pro485 se sustituye por Ala, Arg489 se sustituye por Gly, Pro492 se sustituye por Leu y Phe501 se sustituye por Met. Además, los resultados de los plasmas de pacientes utilizando la inmunorreactividad de prueba en los constructos híbridos de factor VIII humano/porcino, descritos en el ejemplo 8, indican que los anticuerpos de diferentes pacientes reconocen una región estructural igual o muy similar en el dominio A2 que los residuos en el dominio A2 que participan en la unión de inhibidores de A2 parecen mostrar poca variación. Por lo tanto, el epitopo de A2 incluido en los residuos '484-508 del factor VIII humano son un epitopo inmunodominante y se reconoce por el sistema inmune humano en vez de otras regiones estructurales del factor VIII. Al sustituir esta estructura por una secuencia no antigénica de factor VIII de otra especie o por una secuencia de aminoácidos diferente del factor VIII, aunque se retiene la actividad procoagulante completa, se espera que se altere el reconocimiento del factor VIII híbrido o híbrido equivalente por el sistema inmune. Se anticipa que la mutagénesis dirigida a sitio para sustituir residuos de volumen y/o cargados que tienden a dominar los epitopos con cadenas laterales pequeñas y neutras (por ejemplo alanina) pueden producir una región menos inmunogénica. Se espera que una molécula que contenga algunas de estas sustituciones en cada epitopo inhibidor importante será difícil que el sistema inmune la reconozca por el mecanismo de cerradura y llave que es típico de las interacciones antígeno-anticuerpo . Debido a su baja antigenicidad, tal molécula híbrida será útil en el tratamiento de deficiencia de factor VIII en pacientes con inhibidores, y debido a su baja inmunogenicidad, puede ser útil para tratar pacientes previamente no tratados con hemofilia A.

Un resultado general es que la mutación de uno de los pocos residuos clave es suficiente para disminuir la constante de unión para una interacción dada de proteína-proteína en varios ordenes de magnitud. Por lo tanto, es probable que la totalidad de los epitopos de factor VIII contengan un número limitado de aminoácidos que son críticos para el desarrollo del inhibidor. Para cada epitopo en el factor VIII, las sustituciones por alanina con por lo menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos específicos que tienen actividad inmunogénica, puede producir una molécula activa que es menos inmunogénica que el factor VIII de tipo silvestre. En una modalidad preferida, el factor VIII híbrido carece del dominio B. Los métodos de preparación del factor VIII activo recombinante híbrido o híbrido equivalente con sustitución de la secuencia de aminoácidos que tengan poca o nula actividad inmunogénica para la secuencia de aminoácidos en el factor VIII que tiene actividad inmunogénica, son como sigue, utilizando factor VIII híbrido humano/porcino con sustituciones de aminoácidos en el dominio A2 como una modalidad ejemplar. Existen 25 residuos en la región 484-508 del factor VIII humano. La mutagénesis dirigida al sitio se puede utilizar para elaborar mutantes únicos en los cuales cualquiera de estos residuos es sustituido por cualquiera de los otros 19 aminoácidos para un total de 475 mutantes. Además, se pueden construir moléculas híbridas que tengan más de una mutación. Los constructos híbridos se pueden ensayar para determinar inmunogenicidad al medir la constante de unión para anticuerpos inhibidores, como se describe por Friguet, B., et al., (1985) J. Immunol . Methods 77: 305-319 (1985). En una modalidad preferida, se reducirá la constante de unión en por lo menos 3 ordenes de magnitud, lo cual disminuirá el título Bethesda a un nivel que es clínicamente insignificante. Por ejemplo, la CI50 (una medida cruda de la constante de unión) de inhibición por anticuerpos A2 se reduce en los constructos de factor VIII híbridos humanos/porcinos HP2, HP4, HP5, HP7 y HP9, descritos en el ejemplo 8, y esto se asocia con una reducción en el título Bethesda a un nivel no mensurable. Se anticipa, por ejemplo, que un mutante de alaniná doble o triple de factor VIII humano (por ejemplo, factor VIII humano Arg484->Ala, Arg489- Ala, Phe501->Ala mutante triple) producirá una molécula con antigenicidad suficientemente baja para uso terapéutico. Se pueden realizar mutaciones similares en el epitopo C2 y en tercer epitopo putativo. Una tercera modalidad preferida comprende dos o tres sustituciones alanina dentro de dos o tres epitopos de factor VIII. También se pueden realizar otras sustituciones en estas regiones. En una modalidad preferida, las moléculas de factor VIII equivalentes híbridas se identificarán de manera que sean menos antigénicas o inmunogénicas, o ambas cosas, en un humano y animal, en vez del factor VIII humano o porcino. Tales constructos híbridos equivalentes se pueden probar en animales para determinar su antigenicidad o inmunogenicidad, o ambas, reducidas. Por ejemplo, conejos control y deficientes de factor VIII, cerdos, perros, ratones, primates y otros mamíferos se pueden utilizar como modelos animales. En un protocolo experimental, el factor VIII híbrido o híbrido equivalente se puede administrar sistemáticamente durante un periodo de 6 meses a 1 año al animal, preferiblemente por infusión intravenosa, y en un intervalo de dosificación entre 5 y 50 unidades/kg de peso corporal, preferiblemente 10-50 unidades/kg, y de manera más preferible 40 unidades/kg de peso corporal . Los anticuerpos se pueden medir en muestras de plasma tomadas a intervalos después de las infusiones durante la duración del periodo de prueba por métodos habituales, que incluyen inmunoensayo y el ensayo Bethesda. La actividad coagulante también se puede medir en muestras con procedimientos sistemáticos, que incluyen un ensayo de coagulación de una etapa. Las moléculas de factor VIII híbridas equivalentes se pueden probar en humanos para determinar su antigenicidad o inmunogenicidad, o ambas, reducidas en por lo menos dos tipos de ensayos clínicos. En un tipo de ensayo, diseñado para determinar si el factor VIII híbrido o híbrido equivalente es inmunorreactivo con anticuerpos inhibidores, el factor VIII híbrido o híbrido equivalente se administra, preferiblemente por infusión intravenosa, a aproximadamente 25 pacientes que tienen deficiencia de factor VIII quienes tienen anticuerpos para el factor VIII que inhiben la actividad coagulante del factor VIII terapéutico humano o porcino. La dosificación del factor VIII híbrido o híbrido equivalente está en un intervalo entre 5 y 50 unidades/kg de peso corporal, preferiblemente 10-50 unidades/kg, y de manera más preferible 40 unidades/kg de peso corporal . Aproximadamente 1 hora después de cada administración, la recuperación de factor VIII de las muestras de sangre se mide en un ensayo de coagulación de una etapa. Las muestras se toman nuevamente aproximadamente 5 horas después de la infusión, y se - mide la recuperación. La recuperación total y la velocidad de desaparición del factor VIII de las muestras es predectivo del título de anticuerpos y de la actividad de inhibición. Si el título de anticuerpos es alto, habitualmente no se puede medir la recuperación del factor VIII. Los resultados de recuperación se comparan con la recuperación de los resultados de recuperación en pacientes tratados con factor VIII humano derivado de plasma, factor VIII humano recombinante, factor VIII porcino y otras formas terapéuticas utilizadas comúnmente de factor VIII o sustitutos de factor VIII.

En un segundo tipo de ensayo clínico, diseñado para determinar si el factor VIII híbrido o híbrido equivalente es inmunogénico, es decir, si los pacientes desarrollarán anticuerpos inhibidores, se administra factor VIII híbrido o híbrido equivalente, como se describe en el párrafo precedente, a aproximadamente 100 pacientes hemofílicos previamente no tratados quienes no han desarrollado anticuerpos contra el factor VIII. Los tratamientos se proporcionan aproximadamente cada 2 semanas durante un periodo de 6 mésese a 1 año. A intervalos de 1 a 3 meses durante este periodo, se extraen muestras de sangre y se realizan ensayos Bethesda u otras ensayos de anticuerpos para determinar la presencia de anticuerpos inhibidores . Los ensayos de recuperación también se pueden realizar, como se describe antes, después de cada infusión. Los resultados se comparan con pacientes hemofílicos quienes reciben factor VIII humano derivado de plasma, factor VIII humano recombinante, factor VIII porcino u otras formas terapéuticas utilizadas comúnmente de factor VIII u sustitutos de factor VIII.

Preparación de moléculas híbridas de factor VIII utilizando una secuencia de aminoácidos del factor VIII no porcino, no humano de mamífero: Los métodos utilizados para preparar factor VIII híbrido humano/porcino con sustitución de aminoácidos específicos se puede utilizar para preparar proteína de factor VIII recombinante híbrido humano/no humano, no porcino de mamífero o animal/animal que, en comparación con el factor VIII humano o porcino, tiene una actividad coagulante alterada o igual, una inmunorreactividad o inmunogenicidad, o ambas, igual o reducidas, en base en la sustitución de uno o más aminoácidos en los dominios A2, C2 y/u otros. Se pueden realizar comparaciones similares de la identidad de la secuencia de aminoácidos entre proteínas de factor VIII humanas, no humanas, y no porcinas de mamífero para determinar las secuencias de aminoácidos en los cuales se encuentra la actividad procoagulante, la inmunorreactividad contra A2 , contra C2 o la inmuriogenicidad o bien la inmunorreactividad y la inmunogenicidad en otros dominios . Después se pueden utilizar métodos similares para preparar moléculas de factor VIII híbridas humanas/no humanas no porcinas de mamífero. Como se describe en lo anterior, el análisis funcional de cada híbrido mostrará a aquellos con actividad disminuida para anticuerpos inhibidores, o con inmunogenicidad reducida, o con actividad coagulante aumentada, o cualquiera de las tres, y la secuencia se puede cortar adicionalmente por análisis de mutación puntual .

Por ejemplo, se pueden preparar moléculas de factor VIII híbridas de humano/ratón como ee describe antes. La secuencia de aminoácidos de alineación del dominio A2 de humano (SEC. DE IDENT. NO.: 2) y de ratón (SEC. DE IDENT. NO.: 6) se muestra en la figura ÍC. Como se reporta por Eider et al., la proteína de factor VIII codificada por ADNc de ratón (SEC. DE IDENT. NO. : 5) tiene 2319 aminoácidos, con 74% de identidad de secuencia total con respecto a la secuencia humana (SEC. DE IDENT. NO. : 2) (87 porciento de identidad cuando se excluye el dominio B de la comparación) , y es 32 aminoácidos más corta que el factor VIII humano. Las secuencias de aminoácidos en los dominios A y C de ratón (SEC. DE IDENT. NO. : 6) están altamente conservadas, con un 84-93 porciento de identidad de secuencia con la secuencia humana (SEC. DE IDENT. NO. : 2) , mientras que los dominios B y los dos dominios cortos ácidos tienen 42-70 porciento de identidad de secuencia. Específicamente, las secuencias de aminoácidos de ratón Al, A2 y A3 (SEC. DE IDENT. NO..- 6) son 85, 85 y 90 porciento idénticas a las secuencias humanas correspondientes de los aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO. : 2) . Las secuencias de aminoácidos de ratón Cl y C2 son 93 y 84 porciento idénticas a las secuencias de aminoácidos humanas correspondientes . En la secuencia de aminoácidos de factor VIII de ratón predicha (SEC. DE IDENT. NO.: 6), los dominios Al, A2 y A3 son homólogos con los aminoácidos del factor VIII humano 1-372, 373-740 y 1690-2032 , respectivamente, utilizando la identidad de secuencia de aminoácidos para propósitos de numeración. La trombina/factor Xa y la totalidad excepto un sitio de separación de proteína C activado se conserva en el factor VIII de ratón. También se conserva el residuo tirosina para la unión del factor Willebrand. De acuerdo con Eider et al., la secuencia nucleotídica (SEC. DE IDENT. NO.: 5) del factor VIII de ratón contiene 7519 bases y tiene 67 porciento de identidad total con la secuencia nucleotídica humana (SEC. DE IDENT. NO.: 1). Los 6957 pares de bases de la secuencia codificante murina tiene 82 porciento de identidad de secuencia con las 7053 pares de bases de la secuencia codificante en el factor VIII humano. Cuando no se incluye en la comparación el dominio B, existe un 88 porciento de identidad de secuencia en los nucleótidos. Eider et al . , reportan que las moléculas del factor VIII humanas y de ratón son 74 porciento idénticas en total, y que 95 porciento de los residuos humanos que llevan a hemofilia cuando se alteran, son idénticos en el ratón. Estos datos sustentan la aplicación de las mismas técnicas utilizadas para identificar una secuencia de aminoácidos con actividad coagulante o inmunorreactividad para anticuerpos, o ambas cosas, en la molécula de factor VIII porcina para el ratón u otro factor VIII animal para identificar secuencias de aminoácidos similares y preparar moléculas híbridas.

Preparación de moléculas de factor VIII híbridas que tienen reactividad cruzada reducida utilizando una secuencia de aminoácidos del factor VIII no humano, no porcino de mamífero y una secuencia de aminoácidos que no es de factor VIII: Factor VIII porcino se utiliza clínicamente para tratar pacientes deficientes al factor VIII quienes tienen anticuerpos inhibidores para el factor VIII humano. La reactividad cruzada, en la cual el plasma humana reacciona con el factor VIII porcino, se puede reducir por preparación de factor VIII híbrido porcino/no humano o no porcino de mamífero o híbrido equivalente.- En una modalidad preferida, se realiza una determinación de si los inhibidores humanos A2, C2 u otros inhibidores específicos de dominio reaccionan con factor VIII no humano, no porcino de mamífero ("de otro mamífero"), utilizando el ensayo Bethesda de rutina y otro plasma de mamífero, como el estándar. Los títulos inhibidores habitualmente se miden en plasma, de manera que el factor VIII de otro mamífero no es necesario. Si los inhibidores no reaccionan con factor VIII de otro mamífero, tales como el factor VIII murino, cuya secuencia se conoce, entonces la secuencia correspondiente del otro mamífero se puede sustituir en la región del epitopo porcino, identificada mediante la utilización de híbridos humanos/porcinos. Una vez que se conoce la secuencia del animal, se pueden utilizar técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos, descrita por Kunkel, T.A., et al . , (1991) Meth. Enzymol 204 : 125-139, para preparar la molécula de factor VIII híbrida porcina/animal. Si los plasmas de otros animales son menos reactivos con A2 , C2 u otros inhibidores de factor VIII en comparación con el factor VIII murino o porcino, la secuencia del animal que corresponde con el epitopo porcino se puede determinar por procedimientos sistemáticos, tales como RT-PCR y un factor VIII híbrido humano/animal o porcino/animal construido por mutagénesis dirigida al sitio. Además, el factor VIII híbrido humano/animal o porcino/no porcino de mamífero tiene reactividad cruzada reducida con plasma humano en comparación con el factor VIII porcino y se puede preparar de manera que tenga una sustitución correspondiente con la secuencia de aminoácidos de uno o más animales diferentes. En una modalidad adicional, se puede reducir la reactividad cruzada por sustitución de las secuencias de aminoácidos que no tienen identidad conocida con el factor VIII en la secuencia de aminoácidos, preferiblemente residuos alanina que utilizan técnicas de mutagénesis de exploración de alanina, por secuencia de epitopo porcino. Después de la identificación de los epitopos clínicamente significativos, las moléculas de factor VIII híbridas recombinante se expresarán con una reactividad cruzada menor que o igual, en comparación con el factor VIII porcino cuando se prueben in vi tro contra una amplia gama de plasma inhibidores. Preferiblemente, estas moléculas serán híbridos combinados A2/C2 en los cuales la secuencia inmunorreactiva de aminoácidos en estos dominios se sustituye por secuencia de otro mamífero. La mutagénesis adicional en estas regiones se puede realizar para reducir la reactividad cruzada. La reactividad cruzada reducida, aunque deseable, no es necesaria para elaborar un producto que pueda tener ventajas sobre un concentrado existente de factor VIII porcino, el cual produce efectos colaterales debido a las proteínas porcinas contaminantes y puede producir efectos indeseables debido a la inmunogenicidad de las secuencias de factor VIII porcino. Una molécula híbrida de factor VIII humana/de otro mamífero o porcina/de otro mamífero no contendrá proteínas porcinas extrañas. Adicionalmente, el mapeo del epitopo extenso llevado a cabo por el dominio A2 porcino indica que más del 95% de las secuencias del factor VIII híbrida humana/porcina terapéutica será humana.

Preparación de los equivalentes de factor VIII híbridos : Los métodos para sustitución de aminoácidos en las moléculas de factor VIII descritos antes y en los ejemplos también se pueden utilizar para preparar moléculas equivalentes o fragmentos de las mismas de factor VIII híbrido recombinante procoagulante, que comprende por lo menos una secuencia de aminoácidos que incluye uno o más aminoácidos que no tienen una identidad de secuencia de aminoácidos conocida con el factor VIII ("secuencia diferente de factor VIII") sustituido por al menos una secuencia de aminoácidos específica que incluye un sitio antigénico o inmunogénico, o ambos, en un factor VIII humano, animal o híbrido. La molécula equivalente de factor VIII híbrida activa resultante tiene reactividad igual o menos con los anticuerpos inhibidores de factor VIII y/o menos inmunogenicidad en humanos y animales en comparación con el factor VIII no sustituido humano, animal o híbrido. Los residuos aminoácidos adecuados que se pueden sustituir por aquellas secuencias de aminoácidos críticos para la actividad coagulante, antigénica o inmunogénica, o las tres, en el factor VIII humano o animal o en el factor VIII híbrido humano/animal para preparar una molécula de factor VIII equivalente híbrida incluye cualquier aminoácidos que no tenga identidad de secuencia conocida con el factor VIII animal o humano, secuencia de aminoácidos que tienen actividad coagulante, antigénica o inmunogénica. En una modalidad preferida, los aminoácidos que pueden ser sustituidos incluyen residuos alanina utilizando las técnicas de mutagénesis de exploración de alanina. Las moléculas equivalentes de factor VIII híbridas descritas en la presente también incluyen aquellas moléculas en las cuales los residuos aminoácidos no tienen identidad conocida con las secuencias de factor VIII animales y están sustituidas por residuos aminoácidos que no son críticos ara actividad coagulante, antigénica o inmunogénica. Como se describe en lo anterior, en una modalidad de una molécula equivalente de factor VIII híbrida, la molécula tiene una reactividad cruzada reducida con plasmas inhibidores . Se identifican uno o más epitopos en el factor VIII con reactividad cruzada, como se describe antes, y después se sustituyen por una secuencia de aminoácidos que no es de factor VIII, preferiblemente residuos alanina, utilizando, por ejemplo, el método de mutagénesis de exploración de alanina. En una modalidad preferida, se prepara una molécula equivalente de factor VIII híbrida recombinante procoagulante que comprende por lo menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que no tienen identidad de secuencia conocida con el factor VIII, preferiblemente residuos alanina, sustituidos con por al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que incluyen un epitopo, o por al menos una secuencia que incluye uno o más aminoácidos que incluyen un sitio inmunogénico, o ambos, preferiblemente en el factor VIII humano. La molécula o fragmento de la misma de factor VIII equivalente híbrido resultante tiene inmunorreactividad reducida o nula con anticuerpos inhibidores para el factor VIII, o inmunogenicidad reducida o nula en humanos o animales, o ambas cosas . Los métodos para identificar una secuencia de aminoácidos antigénicos específica en el dominio A2 del factor VIII humano para sustitución por una secuencia de aminoácidos única porcina no antigénicas se describe en los ejemplos 7 y 8 son ejemplares para identificar una secuencia antigénica en el dominio A2 y otros dominios del factor VIII humano y animal y para utilizar métodos de mutagénesis dirigida al sitio -tales como mutagénesis de exploración de alanina para sustituir la secuencia de aminoácidos diferentes del factor VIII. Puesto que el epitopo para A2 humano se ha estrechado a 25 o menos aminoácidos, como se describe en el ejemplo 8, la mutagénesis de exploración de alanina se puede llevar a cabo en un número limitado de constructos de factor VIII híbridos que tienen una secuencia de aminoácidos humanos para determinar cuáles son constructos de factor VIII híbrido procoagulante, no inmunorreactivo o no inmunogénico, o ambos, en base en las sustituciones de aminoácidos en A2. En el dominio A2 , los candidatos más probables para las sustituciones de alanina para obtener tanto antigenicidad como inmunogenicidad reducidas en el constructo híbrido son Arg484, Pro485, Tyr487, Ser488, Arg489, Pro492, Val495, Phe501 e Ile508. La afinidad de unión de un constructo híbrido que comprende cada uno de estos mutantes para mAb413 y un panel de IgG de paciente específico para A2 se determinará por ELISA. Cualquier mutante que sea activo y que tenga una afinidad de unión por inhibidores A2 que esté reducida en más de dos ordenes de magnitud, es un candidato para una molécula de factor VIII sustituida en A2. Los constructos que tienen más de una mutación se seleccionarán, en base en la suposición de que cuántos más epitopos se alteren, menos inmunogénica será. Es posible que existan otros residuos candidatos en la región entre Arg484-Ile508, puesto que puede haber residuos claves para el epitopo que sean comunes para el factor VIII tanto humano como porcino. Por ejemplo, los residuos cargados con frecuencias están involucrados en interacciones proteína-proteína, y de hecho, un sustituto de alanina para Arg490 produce factor VIII procoagulado que tiene únicamente 0.2% de la reactividad para el inhibidor de factor VIII humano (tabla VI) . De manera similar, una sustitución por alanina para Lys493 es un candidato posible. Este procedimiento se llevará a cabo en el epitopo C2 y el tercer epitopo putativo, el cual se considera que está en los dominios A3 o Cl, así como cualquier otro epitopo identificado en el factor VIII, para preparar constructos de factor VIII equivalentes híbridos.

Ensayos de diagnóstico: Los híbridos de ADNc para factor VIII humano/animal, animal/animal o equivalente así como proteínas expresadas a partir del mismo, en totalidad o en parte, se pueden utilizar en ensayos como reactivos de diagnóstico para la detección de anticuerpos inhibidores para el factor VIII humano o animal o para factor VIII híbrido humano/animal equivalente en sustratos que incluyen, por ejemplo, muestras de suero y fluidos corporales de pacientes humanos con deficiencia de factor -VIII. Estos ensayos de anticuerpos incluyen ensayos tales como el ensayo de ELISA, inmunotransferencia, radioinmunoensayos, ensayos de in unodifusión y ensayos para actividad biológica de factor VIII (por ejemplo ensayos de coagulación) . Las técnicas para preparar estos reactivos y métodos para uso de los mismos se conocen por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, un inmunoensayo para detección de anticuerpos inhibidores una muestra de suero de paciente puede incluir hacer reaccionar muestras de prueba con una- cantidad suficiente del factor VIII híbrido humano/animal que contengan por lo menos un sitio antigénico, en donde la cantidad sea suficiente para formar un complejo detectable con los anticuerpos inhibidores en la muestra. Las sondas de ácido nucleico y de aminoácidos se pueden preparar en base a la secuencia del ADNc para el factor VIII híbrido humano/porcino, humano/no humano, no porcino de mamífero, animal/animal o equivalente, o una molécula de proteína o fragmento de las mismas. En algunas modalidades, estas se pueden etiquetar utilizando colorantes o etiquetas enzimáticas, fluorescentes, quimioluminiscentes o radioactivas que están disponibles comercialmente. Las sondas de aminoácidos se pueden utilizar, por ejemplo, para analizar sueros u otros fluidos corporales en donde se sospeche la presencia de inhibidores para el factor VIII humano, animal o híbrido humano/animal . Los niveles de inhibidores se pueden cuantificar en pacientes y se pueden comparar con controles sanos, y se pueden utilizar, por ejemplo, para determinar si se puede tratar a un paciente con deficiencia de factor VIII con un factor VIII híbrido humano/animal o híbrido equivalente. Las sondas de ADNc se pueden utilizar, por ejemplo, para propósitos de investigación en las bibliotecas de análisis ADN.

Composiciones farmacéuticas : Las composiciones farmacéuticas que contienen factor VIII híbrido humano/animal, porcino/no humano, no porcino de mamífero, animal -l/animal -2 o equivalentes, solos o en combinación con compuestos de estabilización farmacéutica apropiados, vehículos de suministro o vehículos portadores, o ambos, se preparan de acuerdo con métodos conocidos como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences por E.W. Martin. En una modalidad preferida, los portadores preferidos o los vehículos de suministro para infusión intravenosa son solución salina fisiológica o solución salina amortiguada con fosfato. En otra modalidad preferida, los compuestos de estabilización adecuados, los vehículos de suministro y los vehículos portadores incluyen, pero no se limitan a otras proteínas humanas o animales tales como albúmina. Las vesículas de fosfolípidos o suspensiones de liposomas también se prefieren como portadores farmacéuticamente aceptables o vehículos de suministro. Estos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica y pueden contener, por ejemplo, fosfatidilserina/-fosfatidilcolina u otras composiciones de fosfolípidos o detergentes que juntas impartan una carga negativa a la superficie, puesto que el factor VIII se une a membranas fosfolipídicas cargadas negativamente. Los liposomas se pueden preparar al disolver los lípidos apropiados (tales como estearoilfosfatidiletanolamina, estearoilfosfatidilcolina, aracadoilfosfatidilcolina, y colesterol) en un solvente orgánico que después se evapora, dejando detrás una película delgada de lípido seco sobre la superficie del envase. Después se introduce en el envase una solución acuosa de factor VIII híbrido. El envase se agita manualmente para liberar el material lipídico de los lados del recipiente y dispersar los agregados lipidíeos, por lo que se forma una suspensión liposómica. El factor híbrido o el factor VIII equivalente híbrido se puede combinar con otros compuestos de estabilización adecuados, vehículos de suministro, vehículos portadores o ambos, que incluyen cofactores de coagulación dependientes de vitamina K, factor tisular y factor de von Willebrand (vWf) o un fragmento de vWf que contiene el sitio de unión del factor VIII, y polisacáridos tales como sacarosa. El híbrido o factor VIII equivalente híbrido también se puede suministrar por terapia de genes de la misma manera que se puede suministrar el factor VIII humano, utilizando un medio de suministro tal como vectores retrovirales . Estos métodos consisten en la incorporación de .ADNc para el factor VIII en células humanas que son transplantadas directamente al paciente deficiente de factor VIII o se colocan en un dispositivo implantable, permeable para las moléculas de factor VIII, pero impermeable a las células, el cual después se transplanta. El método preferido será transferencia de genes mediada por retrovirus. En este método, se clona un gen exógeno (por ejemplo ADNc para factor VIII) dentro del genoma de un retrovirus modificado. El gen se inserta dentro del genoma de la célula huésped por maquinaria viral la cual se expresará por la célula. El vector retroviral se modifica de manera que no producirá virus, evitando la infección viral del huésped. Los principios generales para este tipo de terapia se conocen por aquellos expertos en la técnica y se han revisado en la literatura [por ejemplo, Kohn, D.B., et al . , (1989) Transfusión 29: 812-820] . El factor VIII híbrido se puede almacenar unido a vWf para incrementar la vida media y la vida de anaquel de la molécula híbrida. Adicionalmente, la liofilización del factor VIII puede mejorar los rendimientos de moléculas activas en presencia de vWf . Los métodos actuales para almacenamiento de factor VIII humano, y animal utilizados por proveedores comerciales se pueden utilizar para almacenar factor VIII híbrido. Estos métodos incluyen: (1) liofilización de factor VIII en un estado parcialmente purificado (tal como factor VIII "concentrado" que es infundido sin purificación adicional) ; (2) purificación por inmunoafinidad de factor VIII por el método de Zimmerman y liofilización en presencia de albúmina, la cual estabiliza al factor VIII; (3) liofilización de factor VIII recombinante en presencia de albúmina. Adicionalmente, un factor VIII híbrido ha sido estable indefinidamente a 4°C en NaCL 0.6M, MES 20 mM y CaCl2 5 mM a pH 6.0 y también se puede almacenar congelado en estos amortiguadores y se puede recalentar con pérdida mínima de actividad.

Métodos de tratamiento: El factor VIII híbrido o híbrido equivalente se utiliza para tratar las hemorragias no controladas debidas a deficiencia del factor VIII (por ejemplo hemorragias intraarticular, intracraneal o gastrointestinal) en hemofílicos con 100 anticuerpos inhibidores y en pacientes con deficiencia adquirida para el factor VIII debido al desarrollo de anticuerpos inhibidores . Los materiales activos preferiblemente se administran por vía intravenosa. De manera adicional, se puede administrar factor VIII híbrido o híbrido equivalente por transplante de células sometidas a ingeniería genética para producir el híbrido o por implantación de un dispositivo que contiene tales células, como se describe antes. En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas del factor VIII híbrido o híbrido equivalente, sólo o en combinación con estabilizantes, vehículos y suministro o portadores, o ambas cosas, se somete a infusión en pacientes por vía -intravenosa de acuerdo con el mismo procedimiento al utilizado para la infusión de factor VIII humano o animal . La dosificaciones de tratamiento de la composición del factor VIII híbrido o híbrido equivalente que se deben administrar a un paciente en necesidad de tal tratamiento variarán dependiendo de la gravedad de la deficiencia de factor VIII. Generalmente, el nivel de dosificación se ajusta en cuanto frecuencia, duración y unidades al considerar la gravedad y duración del episodio de hemorragia de cada paciente. En consecuencia, se incluye factor VIII híbrido dentro de un portador farmacéuticamente aceptable, un vehículo de suministro o un estabilizante en una cantidad suficiente para suministrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del híbrido para detener la hemorragia, medida por ensayos de coagulación estándar. El factor VIII se define de manera clásica como aquella sustancia presente en plasma sanguíneo normal que corrige el defecto de coagulación en plasma derivado de fluidos con hemofilia A. La actividad coagulante in vi tro en formas purificadas y parcialmente purificadas de factor VIII se utilizan para calcular la dosis de factor VIII por infusiones en pacientes humanos y es un indicador confiable de la actividad recuperada de plasma de pacientes y de la corrección del defecto de hemorragia in vivo . No existe discrepancias reportadas entre el ensayo estándar de moléculas de factor VIII novedosas in vi tro y su comportamiento en el modelo de infusión en perro o en pacientes humanos, de acuerdo con Lusher, J.M., et al., 328 New Engl . J. Med. 328: 453-459; Pittman, D.D., et al., (1992) Blood 79_L 389-397; y Brinkhous et al., (1985) Proc. Nati . Acad. Sci . 82.: 8752-8755. Habitualmente, la concentración plasmática de factor VIII que se obtiene en el paciente mediante administración del factor VIII híbrido o híbrido equivalente está en el intervalo de 30-100% del normal. En un modo preferido de administración del factor VIII híbrido o híbrido equivalente, la composición se administra por vía intravenosa a una dosificación preferida en el intervalo desde 5 a 50 unidades/kg de peso corporal, de manera más preferible en el intervalo de 10-50 unidades/kg de peso corporal, y de manera más preferible a una dosificación de 20-40 unidades/kg de peso corporal; el intervalo de frecuencia está en el intervalo desde aproximadamente 8 hasta 24 horas (en hemofílicos afectados gravemente) ; y la duración de tratamiento en días está en el intervalo de 1 a 10 días o hasta que se resuelve el episodio de hemorragia. Véase, por ejemplo, Roberts, H.R., y M.R. Jones, "Hemophilia and Related Conditions - Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V, y Factors VII to XII)", Ch. 153, 1453-1474, 1460, en Hematoloay. Williams, W.J., et al., ed. (1990). Los pacientes con inhibidores pueden requerir más factor VIII híbrido o híbrido equivalente, o los pacientes pueden requerir menos factor VIII híbrido o híbrido equivalente debido a su mayor actividad específica en comparación con el factor VIII humano o con una reactividad o inmunogenicidad de anticuerpos disminuida. Al igual que en el tratamiento con el factor VIII humano o porcino, la cantidad de factor VIII híbrido o híbrido equivalente suministrado por infusión se define por el ensayo de coagulación de factor VIII de una etapa, y en casos seleccionados, la recuperación in vivo se determina al medir el factor VIII en el plasma del paciente después de la infusión. Se debe entender que para cualquier suceso particular, los regímenes de dosificación específicos se deben ajustar con respecto al tiempo de acuerdo a la necesidad individual y al juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y los intervalos de concentración que se establecen aquí son ejemplares únicamente y no se pretende que limiten el alcance o la práctica de la composición reivindicada. El tratamiento puede tomar la forma de una administración intravenosa única de la composición, o la administración periódica o continua durante un periodo de tiempo prolongado, según se requiera. Alternativamente, el factor VIII híbrido o híbrido equivalente se puede administrar subcutánea u oralmente con liposomas en una o varias dosis a intervalos de tiempo variable .

El factor VIII híbrido o híbrido equivalente también se puede utilizar para tratar hemorragia no controlada debido a deficiencia de factor VIII en hemofílicos quienes han desarrollado anticuerpos para factor VIII humano. En este caso, no es necesario que la actividad coagulante sea superior a la del factor VIII humano o animal por si sólo. La actividad coagulante que sea inferior a la del factor VIII humano (es decir, menor de 3000 unidades/mg) será útil si tal actividad no es neutralizada por anticuerpos en el plasma del paciente. La molécula de factor VIII híbrida o híbrida equivalente y los métodos para aislamiento, caracterización, elaboración y utilización se describen de manera general en lo anterior y se comprenderán adicionalmente con referencia -a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1: Ensayo de factor VIII porcino y factor VIII híbrido humano/porcino El factor VIII porcino tiene más actividad coagulante en comparación con el factor VIII humano, en base en la actividad específica de la molécula. Estos resultados se muestran en la Tabla III en el Ejemplo 4. Esta conclusión se basa en el uso de curvas estándar apropiadas que permiten que se compare fácilmente el factor VIII humano y porcino. Los ensayos de coagulación se basan en la capacidad del factor VIII para acortar el tiempo de coagulación del plasma derivado de un paciente con hemofilia A. Se utilizan dos tipos de ensayos; el de una etapa y el ensayo de dos etapas . En el ensayo de una etapa, se incuba 0.1 ml de plasma con hemofilia A (George King Biomedical, Inc.) con 0.1 ml de reactivo de tromboplastina parcial activada (APTT) (Organon Teknika) y 0.01 ml de muestra o estándar, que consiste de plasma humano normal citritado y diluido, durante 5 minutos a 37°C en un baño de agua. La incubación es seguida por la adición de 0.1 ml de CaCl2 20 M y el momento de desarrollo del coágulo de fibrina se determina por inspección visual . Se define una unidad de factor VIII como la cantidad presente en 1 ml de plasma humano normal citratado. Con el plasma humano como estándar, la actividad del factor VIII porcino y humano se compara directamente . Las diluciones del plasma estándar o proteínas purificadas se realizan en NaCl 0.15 M, HEPES 0.02 M, pH 7.4. La curva estándar se construye en base en 3 o 4 diluciones de plasma, la dilución más alta es 1/50 y se gráfica el tiempo de coagulación log10 contra la concentración plasmática log10, lo que resulta en una gráfica lineal. Se determinan las unidades del factor VIII en una muestra desconocida por interpolación a partir de la curva estándar. El ensayo de una etapa se basa en la activación endógena del factor VIII por activadores formados en el plasma con hemofilia A, mientras que los ensayos de dos etapas mide la actividad procoagulante del factor VIII preactivado. En el - ensayo de dos etapas, las muestras que contienen factor VIII que se han hecho reaccionar con trombina se agregan a una mezcla de tromboplastina parcial activada y plasma con hemofilia A humano, que ha sido preincubado durante 5 minutos a 37°C. Los tiempos de coagulación resultantes después se convierten a unidades/ml, en base en la misma curva estándar humana descrita antes. La actividad relativa de los ensayos de dos etapas es mayor que en el ensayo de una etapa debido a que el factor VIII ha sido preactivado.

Ejemplo 2: Caracterización de la diferencia funcional entre el factor VIII humano y porcino El aislamiento del factor VIII porcino y humano derivado de plasma así como el factor VIII recombinante humano se ha descrito en la literatura en Fulcher, C.A. et al. (1982) Proc. Nati. Acad. Sci. USA .79: 1648 -1652 ,- Toóle et al. (1984) Nature .312.: 342-347 (Genetics Institute) ; Gitschier et al. (1984) Nature 312:326-330 (Genentech); Wood et al. (1984) Nature 3_12:330-337 (Genentech); Vehar et al. 312 Nature 312:337-342 (Genentech); Fass et al. (1982) Blood 59:594.- Toóle et al. (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA £3: 5939 -5942. Esto se puede llevar a cabo de varias maneras. Todas estas preparaciones son similares en cuanto a composición de subunidades, aunque existe una diferencia funcional en la estabilidad entre el factor VIII humano y porcino. Para comparación del factor VIII recombinante humano y porcino, se someten preparaciones de factor VIII recombinante humano altamente purificado (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) y factor VIII porcino [inmunopurificado como se describe en Fass et al. (1982) Blood 59.: 594] a cromatografía líquida de * alta presión (CLAP) sobre una columna de intercambio aniónico mono Q" (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) (Pharmacia, Inc.). Los propósitos de la etapa de CLAP Mono QMR son la eliminación de impurezas menores de intercambio de factor VIII humano y porcino dentro de un amortiguador común para propósitos comparativos. Se reconstituyen frascos que contienen 1000-2000 unidades de factor VIII con 5 ml de H20. Hepes (2 M a pH 7.4) se agrega posteriormente a una concentración final de 0.02 M. El factor VIII se aplica a una columna Mono QMR HR 5/5 equilibrada con NaCl 0.15 M; Hepes 0.02 M, CaCl2 5 mM a pH 7.4 (amortiguador A más NaCl 0.15 M) ; se lava con 10 ml de amortiguador A + NaCl 0.15 M; y se eluye con un gradiente lineal de 20 ml, NaCl 0.15 M a 0.90 M en amortiguador A a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Para comparación del factor VIII derivado de plasma humano (purificado por CLAP en Mono QHR) y el factor VIII porcino, se diluye el factor VIII porcino derivado de plasma, purificado por inmunoafinidad 1:4 con Hepes 0.04 M, CaCl2 5 mM, Tween-80 0.01%, pH 7.4 , y se somete a CLAP en Mono QMR bajo las mismas condiciones descritas en el párrafo previo para el factor VIII humano. Estos procedimientos para el aislamiento del factor VIII humano porcino son estándar para aquéllos expertos en la técnica. Las fracciones de las columnas se ensayan para determinar la actividad VIII mediante el ensayo de coagulación de una etapa. Los resultados promedio de los ensayos, expresados en unidades de actividad por A280 de material, se proporcionan en la tabla II, e indican que el factor VIII porcino tiene por lo menos seis veces más actividad que el factor VIII humano, cuando se utiliza el ensayo de una etapa.

TABLA II: COMPARACIÓN DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE DEL FACTOR VIII Y PORCINO Actividad (U/A280) Porcino 21,300 Humano, derivado de plasma 3,600 Humano recombinante 2,400 Ejemplo 3 : Comparación de la estabilidad del factor VIII humano y porcino Los resultados del ensayo de una etapa del factor VIII reflejan la activación del factor VIII a factores Villa en la muestra y posiblemente la pérdida de la actividad del factor Villa formado. Se realiza una comparación directa de la estabilidad del factor VIII humano y porcino. Se diluyen muestras de CLAP en Mono QMR (Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.) a la misma concentración y composición amortiguadora y se hacen reaccionar con trombina. En diversos momentos, las muestras se remueven del ensayo de coagulación de dos etapas. Típicamente, la actividad pico (a los 2 min) es 10 veces mayor para el factor Villa porcino que el factor humano, y las actividades de ambos factores Villa porcino y humano disminuyen subsecuentemente, en donde la actividad del factor Villa humano disminuye más rápidamente. De manera general, los intentos por aislar factor Villa humano estable no han tenido éxito incluso cuando se utilizan las condiciones que producen factor Villa porcino estable. Para demostrar esto, el factor VIII humano purificado por CLAP en Mono Q"R se activa con trombina y se somete a CLAP de intercambio catiónico en Mono SMR (Pharmacia, Inc.) bajo condiciones que producen factor Villa porcino estable como se describe por Lollar et al. (1989) Biochemistry 28:666. El factor VIII humano, 43 µg/ml (0.2 µM) en NaCl 0.2 M, Hepes 0.01 M, CaCl2 2.5 mM, a pH 7.4 en un volumen total de 10 ml, se hace reaccionar con trombina (0.036 µM) durante 10 min, tiempo en el cual se agrega FPR-CH2C1 D-fenil-prolil- arginil-clorometilcetona a una concentración de 0.2 µM para inactivación irreversible de trombina. La mezcla después se diluye 1:1 con ácido 2- (N-morfolino) etansulfónico 40 mM (MES), CaCl2 5 mM a pH 6.0 y se carga a 2 ml/min en una columna de CLAP Mono SMR HR 5/5 (Pharmacia, Inc.) equilibrada con MES 5 mM, CaCl2 5 mM a pH 6.0 (Amortiguador B) más NaCl 0.1 M. El factor Villa se eluye sin lavado de columna con un gradiente de 20 ml ' de NaCl 0.1 N a' NaCl 0.9 M en amortiguador B a l ml/min. La fracción con actividad coagulante en el ensayo de dos etapas eluye como un pico único bajo estas condiciones. La actividad específica de la fracción del pico es de aproximadame e 7,500 U/A280. La elec roforesis en dodeciisulfato de sodio gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) del pico del factor Villa de Mono SHR, seguido por tinción con plata de la proteína, muestra dos bandas que corresponden a un derivado heterodimérico (A3-C1-C2/A1) del factor VIII. Aunque el fragmento A2 no se identifica por la tinción con plata bajo estas condiciones debido a su baja concentración, se identifica como un constituyente en cantidades mínimas por etiquetado con 125 T En contraste con los resultados con el factor VIII humano, el factor Villa porcino aislado por CLAP en Mono SMR bajo las mismas condiciones tiene una actividad específica de 1.6 x 106 U/A280. El análisis del factor Villa porcino por SDS-PAGE muestra 3 fragmentos que corresponden a las subunidades Al, A2 y A3-C1-C2, que demuestran que el factor Villa porcino posee tres subunidades . Los resultados de CLAP en Mono SMR de preparaciones VIII humanas activadas por trombina a pH 6.0 indican que el factor Villa humano es lábil bajo condiciones que vuelven estable al factor Villa porcino. Sin embargo, aunque las cantidades mínimas del fragmento A2 se identifican en la fracción pico, la determinación de la actividad coagulante que resulta de las cantidades pequeñas del factor Villa trimérico o del factor Villa heterodimérico que tiene una baja actividad específica no es posible sólo por este método. Una manera de aislar factor Villa humano antes de que pierda su subunidad A es deseable para resolver esta cuestión. Para este fin, el aislamiento se lleva a cabo en un procedimiento que involucra la reducción del pH de los amortiguadores Mono SM hasta pH 5. Se diluye el factor VIII humano purificado en Mono QHR (0.5 mg) con H20 para proporcionar una composición final de 0.25 mg/ml (1 µm) del factor VIII en NaCl 0.25 M, Hepes 0.01 M, CaCl2 2.5 mM, Tween-80 0.005% a pH 7.4 (volumen total de 7.0 ml) . Se agrega trombina hasta una concentración final de 0.072 µm y se permite que reaccione durante 3 min. La trombina después se inactiva con FPR-CH2C12 (0.2 µm) . La mezcla se diluye después 1:1 con acetato de sodio 40 mM, CaCl2 5 mM, Tween-80 0.01% a pH 5.0 y se carga a 2 ml/min sobre una columna de CLAP de Mono SMR hr 5/5 equilibrada con acetato de sodio en 0.01 M, CaCl2 5 mM, Tween-80 0.01% a pH 5.0 más NaCl 0.1 M. El factor Villa se eluye sin lavado de la columna con un gradiente de 20 ml de NaCl 0.1 M hasta NaCl 1.0 M en el mismo amortiguador a 1 ml/min. Esto resulta en una recuperación de actividad de coagulante en un pico que contiene cantidades detectables del fragmento A2 como se muestra por SDS-PAGE y tinción con plata. La actividad específica de la fracción del pico es 10 veces mayor que la de lo recuperado a pH 6.0 (75,000 U/A280 v. 7,500 U/A280) . Sin embargo, en contraste con el factor Villa porcino aislado a pH 6.0, el cual es indefinidamente estable a 4°C, la actividad del factor Villa disminuye de manera estable durante un período de varias horas después de la elución a partir de Mono SHR. Adicionalmente, la actividad específica del factor Villa purificado a pH 5.0 se ensaya inmediatamente y es de únicamente 5% de la del factor Villa porcino, lo que indica que se produce disociación sustancial antes del ensayo. Estos resultados demuestran que el factor Villa tanto humano como porcino está constituido de tres unidades (Al, A2, y A3-C1-C2) . La disociación de la subunidad A2 es responsable de la pérdida de actividad de factor Villa humano como porcino bajo ciertas condiciones, tales como fuerza iónica fisiológica, pH y concentración. La estabilidad relativa del factor Villa porcino bajo ciertas condiciones es debido a la asociación más fuerte de la subunidad A2.

Ejemplo 4: Preparación de factor VIII híbrido humano/porcino por reconstitución con subunidades Las cadenas ligeras del factor VIII porcino y las cadenas pesadas de factor VIII se aislan como sigue. Se agrega una solución 0.5 M de EDTA a pH 7.4 a factor VIII porcino purificado en Mono QMR a una concentración final de 0.05 M y se permite que repose a temperatura ambiente durante 18-24 h. Se agrega un volumen igual de histidina-Cl 10 mM, EDTA 10 mM, Tween 80 0.2% v/v a pH 6.0 (Amortiguador B) , y la solución se aplica a 1 ml/min a una columna Mono SMR HR 5/5 previamente equilibrada en amortiguador A más NaCl 0.25 M. Las cadenas pesadas del factor VIII no se unen a la resina, a juzgar por SDS-PAGE. La cadena ligera del factor VIII se eluye con 20 ml de un gradiente lineal de NaCl 0.1-0.7 M en amortiguador A a 1 ml/min y son homogéneas en SDS-PAGE. Las cadenas pesadas del factor VIII no se absorben en Mono SMR durante la purificación de las cadenas ligeras del factor VIII. El material que cae a través que contiene las cadenas pesadas del factor VIII se ajusta a pH 7.2 por la adición de amortiguador Hepes 0.5 M, pH 7.4, y se aplica a una columna de CLAP Mono QMR HR5/5 (Pharmacia, Inc.) equilibrada con NaCl 0.1 M, Hepes 0.02 M y Tween-80 0.01%, pH 7.4. La columna se lava con 10 ml de este amortiguador, y las cadenas pesadas del factor VIII se eluye con un gradiente de 20 ml de NaCl 0.1-1.0 M en este amortiguador. Las cadenas ligeras humanas y las cadenas pesadas se aislan de la misma manera. Las cadenas ligeras y pesadas humanas y porcinas se reconstituyen de acuerdo con las siguientes etapas . Se mezclan 10 µl de cadena ligera de factor VIII o porcino con NaCl 1 N, Hepes 0.02 M, CaCl2 5 mM, Tween-80 0.01%, pH 7.4 con (1) 25 µl de cadena pesada heteróloga, 60 µg/ml en el mismo amortiguador,- (2) 10 µl de Hepes 0.02 M, Tween-80 0.01%, pH 7.4; (3) 5 µl de CaCl2 0.6 M durante 14 h a temperatura ambiente. La mezcla se diluye 1/4 con MES 0.02 M, Tween-80 0.01%, CaCl2 5 mM, pH 6, y se aplica a Mono SMR Hr5/5 equilibrada con NaCl 0.1 M, MES 0.02 M, Tween-80 0.01%, CaCl2 5 mM, pH 6.0. Se corre un gradiente de 20 ml de NaCl 0.1-1.0 M en el mismo amortiguador a 1 ml/min, y se recolectan fracciones de 0.5 ml . La absorbancia se lee a 280 nm de las fracciones, y las fracciones se ensayan con absorbancia para determinar actividad del factor VIII mediante el ensayo de coagulación de una etapa. Las cadenas pesadas están presentes en exceso, debido a que la cadena ligera libre (no asociada con la cadena pesada) también se une a Mono SMR; el exceso de cadenas pesadas asegura que las cadenas ligeras libres no son parte de la preparación. Los experimentos de reconstitución seguidos por juridicción por CLAP en Mono SMR se realizan con las cuatro combinaciones posibles de cadena: cadena ligera humana/cadena pesada humana, cadena ligera humana/cadena pesada porcina, cadena ligera porcina/cadena pesada porcina, cadena ligera porcina/cadena pesada humana. La Tabla III muestra que la cadena ligera humana/cadena pesada porcina del factor VIII tiene actividad comparable con el factor VIII porcino nativo (Tabla II) , lo que indica que los elementos estructurales en la cadena pesada porcina son los responsables de la actividad coagulante aumentada del factor VIII porcino en comparación con el factor VIII humano.

TABLA III: COMPARACIÓN DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE DEL FACTOR VIII HÍBRIDO HUMANO/PORCINO CON EL FACTOR VIII HUMANO Y PORCINO Actividad (O/A~ñ0) Cadena ligera porcina/cadena pesada porcina 30,600 Cadena ligera humana/cadena pesada porcina 44,100 Cadena ligera porcina/cadena pesada humana 1,100 Cadena ligera humana/cadena pesada humana 1,000 Ej mplo 5. Preparación de factor VIII humano activo híbrido humano /porcino por reconstitución con dominios.

El dímero porcino A1/A3-C1-C2, el dominio A2 porcino, el dímero A1/A3-C1-C2, y el dominio A2 humano se aisla, cada uno, de sangre porcina o humana, de acuerdo con el método descrito en Lollar et al. (1992) J. Biol . Chem. 267 (33) :23652-23657. Por ejemplo, para aislar el dímero porcino A1/A3-C1-C2 el factor Villa porcino (140 µg) a pH 6.0 se incrementa a pH 8.0 por adición de NaOH 5 N durante 30 minutos, lo que produce la disociación del dominio A2 y 95% de inactivación por ensayo de coagulación. La mezcla se diluye 1:8 con amortiguador B (HEPES 20 mM, CaCl2 5 mM, Tween-80 0.01%, pH 7.4) y se aplica a una columna Mono S equilibrada en amortiguador B. El dímero A1/A3-C1-C2 eluye como un pico agudo único a aproximadamente NaCl 0.4 M mediante la utilización de un gradiente de NaCl 0.1-1.0 M en amortiguador B. Para aislar el dominio A2 porcino, el factor Villa porcino se elabora de acuerdo con el método de Lollar et al. (1989) Biochem 28 : 666- 614 a partir de 0.64 mg del factor VIII. El dominio A2 porcino libre se aisla como un componente menor (50 µg) a NaCl 0.3 M en el cromatograma de Mono SMR. Se reconstituyen moléculas del factor VIII híbridas humanas/porcinas a partir de los dímeros y dominios y como sigue . Las concentraciones y condiciones de amortiguador para los componentes purificados son como sigue : A2 porcina. 0.63 µM en amortiguador A (MES 5 mM; CaCl2 5 mM, Tween 80 0.01%, pH 6.0) más NaCl 0.3 M; A1/A3-C1-C2 porcino, 0.27 µM en amortiguador B más NaCl 0.4 M, pH 7.4; A2 humano. 1 µM en NaCl 0.3 M, histidina-HCl 10 mM, CaCl25 mM, Tween 20 0.01%, pH 6.0; A1/A3-C1-C2 humana. 0.18 µM en NaCl 0.5 M, histidina-Cl 10 mM, CaCl2 2.5 mM, Tween-20 0.1%, pH 6.0. Los experimentos de reconstitución se realizaron al mezclar volúmenes iguales del dominio A2 y del dímero A1/A3-C1-C2. En experimentos de mezclado con dímero A1/A3-C1-C2 porcino, se disminuye el pH a 6.0 por adición de MES 0.5 M, pH 6.0, a 70 mM. Las actividades de coagulación de las cuatro posibles moléculas híbridas de factor Villa posibles - [pA2/ (hAl/A3-Cl-C2)] , [hA2/ (pAl/A3 -C1-C2 ) ] , [p'A2 / ( pAl /A3 - C 1 - C2 ) ] y [hA2/ (hAl/A3-Cl-C2) ] se obtienen por un ensayo de coagulación de dos etapas en diversos tiempos. La generación de actividad después del mezclado de los dominios A2 y de los dímeros A1/A3-C1-C2 es casi completa en una hora y es estable durante por lo menos 24 horas a 37°C. La Tabla IV muestra la actividad de las moléculas de factor Villa híbridas reconstituidas cuando se ensaya en 1 hora. El ensayo de dos etapas, mediante el cual se obtienen las actividades específicas de las moléculas del factor Villa, difieren del ensayo de una etapa, y los valores no se pueden comparar con los valores de actividad de las moléculas de factor VIII obtenidas por un ensayo de una etapa.

TABLA IV: COMPARACIÓN DE LAS ACTIVIDADES COAGULANTES DEL FACTOR Villa HÍBRIDO SUSTITUIDO EN EL DOMINIO, HUMANO/PORCINO Híbrido de fVIIIa Actividad específica (U/mg) A2 porcino + A1/A3-C1-C2 humano 140,000 A2 porcino + A1/A3-C1-C2 porcino 70,000 A2 humano + A1/A3-C1-C2 porcino 40,000 A2 humano + A1/A3-C1-C2 humano 40,000 La Tabla IV muestra que la mayor actividad se exhibe por en dímero de dominio A2 porcino/Al/A3-Cl-C2 humano, seguido por el dominio A2 porcino/dímero A1/A3-C1-C2 porcino. Por lo tanto, cuando el dominio A2 del factor Villa porcino se mezcla con el dímero A1/A3-C1-C2 del factor Villa humano se obtiene actividad coagulante. Además, cuando el dominio A2 del factor Villa humano se mezcla con el dímero A1/A3-C1-C2 del factor Villa porcino, se obtiene actividad coagulante. Por sí mismos, las regiones A2 , Al y A3-C1-C2 no tienen actividad coagulante.

Ejemplo 6: Aislamiento y secuenciado del dominio A2 del factor VIII porcino Únicamente la secuencia nucleotídica que codifica para el dominio B y parte del dominio A2 del factor VIII porcino se ha secuenciado previamente [Toóle et al. (1986) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 83..5939-5942] . Las secuencias de ADNc y de aminoácidos predichos (SEC. DE IDENT. NOs : 3 y 4 respectivamente] , para la totalidad del dominio A2 del factor VIII porcino se describen en la presente. El dominio A2 del factor VIII porcino se clona por transcripción inversa del ARN total de bazo porcino y por amplificación por PCR; los cebadores degenerados basados en la secuencia de ADNc para el factor VIII humano conocida y el cebador porcino exacto basado en una parte de la secuencia de factor VIII porcino son los que se utilizan. Se aisla y amplifica un producto de PCR de 1 kb, por inserción en un vector fagémido BluescriptMR (Stratagene) . El dominio A2 porcino es secuenciado completamente por secuenciado didesoxi . El ADN y las secuencias predichas de aminoácidos son como se describen en las SEC. DE IDENT. NOs: 3 y 4, respectivamente.

Preparación 7 : Preparación de factor VIII recombinante híbrido humano/animal El nucl eót ido y las secuencias predi chas de aminoácidos (SEC . DE IDENT. NOs : 1 y 2 , respectivamente) del factor VIII humano se han descrito en la literatura [Toóle et al . (1984) Nature 312 : 342 -347 (Genetics Institute) ; Gitschier et al . Nature ¿12 : 326-330 (Genentech) ; Wood, et al . (1984) Nature 312 : 330-337 (Genentech) ; Vehar et al . Nature 312 : 337-342 (Genentech) ] . En la elaboración del factor VIII recombinante híbrido humano/animal requiere que una región del' AD?c de factor VIII humano (Biogen Corp.) se remueva y que la secuencia de AD?c animal tenga la identidad de secuencia para ser insertado. Subsecuentemente, el AD?c híbrido se expresa en un sistema de expresión apropiado. Como un ejemplo, los AD?c del factor VIII híbridos se clonan en los cuales algunos o la totalidad del dominio porcino A2 se sustituye por las secuencias A2 humanas correspondientes. Inicialmente, la totalidad de las secuencias de AD?c completa que corresponde al dominio A2 del factor VIII humano y después a una parte más pequeña del dominio A2 , se forma un rizo por mutagénesis mediada por oligonucleótido, un método conocido comúnmente por aquéllos expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, J., E.F. Fritsch, y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratorv Manual. Capítulo 15, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1989) . Las etapas son como sigue.

Materiales Se adquieren metoxicarbonil-D-ciclohexilglicil-glicil-arginina-p-nitroanilida (SpectrozymeMR Xa) y anticuerpos monoclonales contra el factor VIII ESH4 y ESH8 de American Diagnostica (Greenwich, CT) . Se preparan vesículas unilamelares de fosfatidilcolina/fosfatidilserina (75/25, p/p) de acuerdo con el método de Barenholtz, Y., et al . , 16 Biochemistry 2806-2810 (1977) . Se obtiene la desulfatoirudina recombinante del Dr. R. B. Wallis, Ciba-Geigy Pharmaceuticals (Cerritos, CA) . Los factores porcinos IXa, X, Xa, y trombina se aislan de acuerdo con los métodos de Lollar et al. (1984) Blood 6¿: 1303-1306 y Duffy, E.J. et al. (1992) J. Biol . Chem. 207: 7621-7827. Se obtiene el factor VIII humano recombinante puro libre de albúmina a partir de Baxter-Biotech (Deerfield, IL) .

Clonación del dominio A2 del factor VIII porcino El ADNc que codifica para el dominio A2 porcino se obtiene después de PCR del ARNm del bazo porcino, sometido a trancripción inversa, aislado como se desea por Chomczyneki et al. (1987) Anal. Biochem. 1£2: 156-159. El ADNc se prepara utilizando un equipo de síntesis de ADN de primera cadena con hexámeros aleatorios como cebadores (Pharmacia, Piscataway, N.J.) . La PCR se lleva a cabo utilizando un cebador degenerado 5' terminal, 5' AARCAYCCNAARACNTGGG 3" (SEC. DE IDENT. NO: 11), basados en la secuencia conocida limitada de aminoácidos A2 porcinos, y un cebador exacto 3 ' terminal, 5 ' GCTCGCACTAGGGGGTCTTGAATTC 3' (SEC. DE IDENT. NO: 12), basada en una secuencia conocida de ADN porcino inmediatamente 3 ' respecto al dominio A2 porcino. Estos oligonucleótidos corresponden a los nucleótidos 1186-1203 y 2289-2313 en la secuencia humana (SEC. DE IDENT. NO: 1) . La amplificación se lleva a cabo durante 35 ciclos (1 minuto 94 °C, 2 minutos 50 °C, 2 minutos 72°C) utilizando ADN polimerasa Taq (Promega Corp., Madison, Wl) . El fragmento amplificado de 1.1 kilobase se clona en pBluescript II KS- (Stratagene) en el sitio JScoRV utilizando el procedimiento de vector T, como se describe por Murchuk D. et al., (1991) Nucí . Acids Res . J¡):1154. Se transforman células competentes de Escherichia coli XLl-Blue y se aisla el ADN plasmídico. El secuenciado se lleva a cabo en ambas direcciones utilizando SequenaseMR versión 2.0 (U.S. Biochemical Corp., a División of Amersham LifeScience, Inc., Arlington Hts, IL) . Esta secuencia se confirma por una secuencia idéntica que se obtiene por secuenciado directo del producto de PCR a partir de una transcripción inversa independiente del ARN de bazo a partir del mismo cerdo (CircumVentMR, New England Biolabs, Beverly, MA) . La región que contiene el epitopo para el autoanticuerpo RC se identifica como 373-536 en el factor VIII humano (SEC. DE IDENT. NO: 2) Construcción y expresión de un ADNc para factor VIII híbrido humano/porcino El factor VIII humano que carece del dominio B (HB", de Biogen, Inc. Cambridge, MA) , el cual carece de las secuencias que codifican para los residuos aminoácidos 741-1648 (SEC. DE IDENT. NO: 2), se utiliza como el material inicial para la construcción de un factor VIII híbrido humano/porcino .

Se clona HB" dentro del vector de expresión ReNeo. Para facilitar la manipulación, el ADNc para el factor VIII se aisla como un fragmento Xhol/Hpal a partir de ReNeo y se clona en pBluescript II KS digerido con Xhol/EcoRV. Se utiliza un oligonucleótido 5 * CCTTCCTTTATCCAAATACGTAGATCAAGAGGAAATTGAC 3 ' (SEC. DE IDENT. NO: 7) en una reacción de mutagénesis dirigida al sitio utilizando ADN de fago que contiene uracilo, como se describe por Kunkel, T.A. et al. (1991) Meth . Enzymol 204:125-139, para formar un rizo simultáneamente de la secuencia A2 humana (nucleótidos 1169-2304 en la SEC. DE IDENT. NO: 1) e introducir un sitio de restricción SnaBI . El factor VIII humano que carece del dominio A2 y que contiene el plásmido se digiere con SnaBI , seguido por la adición de enlazadores Clal. El dominio A2 porcino después se amplifica por PCR utilizando el cebador 5' fosforilado, 5' GTAGCGTTGCCAAGAAGCACCCTAAGACG 3' (SEC . DE IDENT . NO : 8 ) y cebador 3 ' , 5 ' GAAGAGTAGTACGAGTTATTTCTCTGGGTTCAATGAC 3' (SEC. DE IDENT. NO: 9), respectivamente. Se agregan los enlazadores Clal al producto de PCR seguido por ligación dentro del vector que contiene al factor VIII humano. Las uniones A1/A2 y A2/A3 se corrigen para restaurar las secuencias precisas de separación de trombina y flanqueo mediante utagénesis dirigida al sitio utilizando el oligonucleótido que se muestra en las SEC. DE IDENT. NO: 8 y los nucleótidos 1-22 (5' GAA ... TTC en la SEC. DE IDENT. NO: 9) para corregir las uniones terminales 5' y 3', respectivamente. En el constructo resultante, denominado HP1, el dominio A2 humano es sustituido exactamente con el dominio A2 porcino. Un producto preliminar contiene una timina no deseada en la unión A1-A2 como resultado de la amplificación por PCR del dominio A2 porcino. Esta sola base se somete a rizo mediante el uso de un oligonucleótido mutagénico 5' CCTTTATCCAAATACGTAGCGTTTGCCAAGAAG 3' (SEC. DE IDENT. NO: 10). La secuencia nucleotídica híbrida resultante que codifica al factor VIII activo y que tiene Al humano, A2 porcino y A3 humano, y los dominios Cl y C2. Una región que contenga 63% del dominio A2 NH2 terminal porcino, el cual abarca al epitopo putativo de A2, se sustituye por la secuencia humana homologa del ADNc sin dominio B al intercambiar los fragmentos Spel / Barri?? entre los plásmidos pBluescript que contienen el factor VIII humano, y el ADN del factor VIII y humana/A2 porcina. Esta secuencia se confirma por secuenciado del dominio A2 y los sitios de empalme. Finalmente, un fragmento Spel/Apal , que contiene la totalidad de la secuencia A2 completa, se sustituye en su lugar con las secuencias correspondientes en HB", lo que produce el constructo HP2. La expresión preliminar de HB" y HP2 en células COS-7 es probada después de la transfección de 7?DN mediada por DEAE-dextrano, como se describe por Seldon, R.F., en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M., et al., eds), pp. 9.21-9.26, Wiley Interscience, N.Y. Después de que se confirma la expresión de factor VIII activo y los estudios de inhibición de anticuerpo preliminar sé realiza, el ADN HB" HP2 después se transfecta establemente en células de riñon de hámster bebé utilizando la transfección mediada por liposoma (LipofectinMR Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) . Las clonas que contienen plásmido se seleccionan para determinar la resistencia a G418 en medio de Eagle modificado por Dulbecco-F12, suero bovino fetal 10% (DMEM-F12/suero bovino fetal 10%) que contiene 400 µg/ml de G418, seguido por el mantenimiento en DMEM-F12/10% de suero bovino fetal que contiene 100 µg/ml de G418. Las colonias que muestran expresión máxima de la actividad del factor VIII HB" y HP2 se seleccionan por clonación de anillo y se expanden para caracterización adicional . La expresión de factor VIII HB" HP2 se compara con un ensayo del factor VIII libre de plasma, un ensayo de recubrimiento en una etapa y el factor VIII humano como un estándar. Las actividades coagulantes específicas de 2600 y 2580 unidades/mg se obtiene para HB" y HP2, respectivamente. HB" y HP2 producen 1.2 y 1.4 unidades/ml/48 horas/107 células, respectivamente. Esto es idéntico al constructo de tipo silvestre (2,600 + 200 unidades/mg) . Las actividades específicas de HB" y HP2 son indiferenciables en el ensayo de factor VIII libre de plasma. La actividad biológica del factor VIII recombinante híbrido humano/animal- y de un factor VIII equivalente con sustituciones en los dominios Al, A2,' A3, Cl y/o C2 se pueden evaluar inicialmente utilizando un sistema de expresión transitorio de mamífero COS-cell. El ADNc híbrido humano/y equivalente se puede transfectar en células COS, y los sobrenadantes se pueden analizar para determinar la actividad del factor VIII mediante el uso de los ensayos de coagulación de una etapa y de dos etapas como se describen antes. Adicionalmente, se puede medir la actividad del factor VIII mediante el uso de un ensayo de sustrato cromogénico, el cual es más sensible y permite el análisis de cantidades más grandes de muestras. Los ensayos similares son estándares en el ensayo para determinar la actividad del factor VIII [Wood et al. (1984) Nature ¿12:330-337; Toóle et al. (1984) Nature 312 : 342-347] . La expresión del factor VIII recombinante en células COS también es un procedimiento estándar [Toóle et al. (1984) Nature 312:342-347; Pittman et al. (1988) Proc. Nati . Acad. Sci . USA ¿5:2429-2433] . El AD?c del factor VIII humano se utiliza como los materiales iniciales para las moléculas recombinantes descritas en la presente que se han expresado en células COS lo que proporciona un producto con actividad biológica. Este material, como se describe en lo anterior, se puede utilizar como un estándar para comparar moléculas de factor VIII híbridas humanas/animales . La actividad en los ensayos se convierte a una actividad específica para comparación adecuada de las moléculas híbridas. Para esto, es necesaria una medición de la masa del factor VIII producida por las células, y esto se puede realizar por inmunoensayo con factor VIII purificado humano y/o estándar, como estándares . Los inmunoensayos para el factor VIII son habituales para aquéllos expertos en la técnica [véase, por ejemplo, Lollar et al. (1988) Blood 71 : 137-143] .

Ejemplo 8. Determinación de la actividad inhibidora en f a c t o r VII I h íbri do h um an o / an i m a l y equivalente .

Las secuencias del factor VIII humano o animal probablemente estén involucrados como epitopos (es decir, como sitios de reconocimiento para anticuerpos inhibidores que reaccionan con el factor VIII) se pueden determinar utilizando procedimientos de rutina, por ejemplo mediante el uso de ensayo con anticuerpos para el factor VIII combinado con técnicas de mutagénesis dirigida al sitio tales como empalme por métodos de extensión superpuestos (SOE) , como se muestra abajo. Las secuencias del factor VIII animal que no son antigénicas en comparación con las secuencias humanas antigénicas y se pueden realizar sustituciones para insertar secuencias animales y suprimir las secuencias humanas de acuerdo con métodos estándares de ADN recombinante. Las secuencias de aminoácidos tales como los residuos alanina que no tienen una identidad de secuencia conocida con el factor VIII también se pueden sustituir por métodos ADN recombinante estándar o por mutagénesis de exploración de alanina. El factor VIII porcino reacciona menos que el factor VIII humano con algunos anticuerpos inhibidores; esto proporciona una base para la terapia actual para pacientes con inhibidores. Después de que se elaboran los híbridos recombinantes, se pueden probar in vitro para determinar reactividad con ensayos de rutina, que incluyen el ensayo de inhibidor Bethesda. Aquéllos constructos que son menos reactivos que el factor VIII humano nativo y el factor VIII animal nativo son candidatos para terapia de sustitución. Los epitopos a los cuales están dirigidos la mayor parte, si no todos los anticuerpos inhibidores reactivos con el factor VIII humano se considera que residen en dos regiones en la molécula de factor VIII humana de 2332 aminoácidos, el dominio A2 (residuos aminoácidos 373-740) y el dominio C2 (residuos aminoácidos 2173-2332, ambas secuencias se muestran en la SEC. DE IDENT. NO: 2) . Se ha eliminado el epitopo A2 al elaborar una molécula de factor VIII híbrida humana-porcina recombinante en la cual parte del dominio A2 humano está sustituido por la secuencia porcina que tiene identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos humanos sustituidos . Esto se lleva a cabo como se describe en el Ejemplo 7, por clonación del dominio A2 porcino por técnicas de biología molecular estándar y después se corta y empalma dentro del dominio A2 utilizando sitios de restricción. En el constructo resultante, denominado HP2, los residuos 373-604 (SEC. DE IDENT. NO: 4) del factor VIII porcino se sustituyen en el dominio A2 humano. Se realiza un ensayo de HP2 para determinar inmunorreactividad con anticuerpos contra el factor VIII humano utilizando los siguientes métodos.

Ensayo inmunoabsorbente unido a enzima de factor VIII Se recubren pozos de placas de microtitulación con 0.15 ml de 6 µg/ml de ESH4, un anticuerpo de cadena ligera de factor VIII humano, y se incuban durante la noche. Después la placa se lava tres veces con H20, los pozos se bloquean durante 1 hora con NaCl 0.15 M, fosfato de sodio 10 mM, Tween 20 0.05%, leche seca sin grasa 0.05%, azida de sodio 0.05%, pH 7.4. Para incrementar la sensibilidad, las muestras que contienen factor VIII se activan con trombina 30 mM durante 15 minutos. Después se agrega desulfatohirudina recombinante a 100 nM para inhibir la trombina. La placa se lava nuevamente y se agregan 0.1 ml de la muestra de factor VIII humano recombinante puro (10-600 ng/ml) , utilizado como estándar. Después de una incubación de 2 horas, la placa se lava y se agrega a cada pozo 0-1 ml de ESH8 biotinado, otro anticuerpo de cadena ligera de factor VIII. ESH8 se biotina utilizando el equipo de biotinación de sulfosuccinimidil-6- (biotinamida) hexanoato de Pierce. Después de incubación durante l hora, la placa se lava y se agregan a cada pozo 0.1 ml de fosfatasa alcalina con estreptavidina. La placa se revela utilizando el equipo de reactivo de sustrato de fosfatasa alcalina Bio-Rad, y la absorbancia resultante a 405 nm para cada pozo se determina mediante la utilización del lector de placa de microtitulación Vmax (Molecular Devices, Inc., Sunnyville, CA) . Se determinan las concentraciones desconocidas de factor VIII a partir de la porción lineal de la curva estándar del factor VIII.

Ensayos de factor VIII Se miden HB" y HP2 de factor VIII en un ensayo de coagulación de una etapa el cual se realiza como se describe antes [Bowie, E.J.W., y C.A. Owen, en Disorders of Hemostasis (Ratnoff y Forbes, eds) pp. 43-72, Grunn & Stratton, Inc., Orlando, FL (1984)], o por un ensayo libre de plasma como sigue. Se activa factor VIII HB" o HP2 por trombina 40 nM en NaCl 0.15 M, Hepes 20 nM, CaCl25 mM, Tween 80 0.01%, pH 7.4 en presencia de factor IXa, 10 nM, factor X 425 nM y vesículas unilamelares de fosfatidilserina/fosfatidilcolina (25/75, p/p) 50 µM. Después de 5 minutos, la reacción se detiene con EDTA 0.05 M y desulfatoirudina recombinante 100 nM, y el factor Xa resultante se mide por el ensayo de sustrato cromogénico, de acuerdo con el método de Hill-Eubanks et al (1990) J. Biol . Chem. 265 : 17854-17858. Bajo estas condiciones, la cantidad de factor Xa formado es linealmente proporcional a la concentración de factor VIII inicial a juzgar por el factor VIII humano recombinante purificado utilizado (Baxter Biotech, Deerfield, IL) como el estándar. Antes del ensayo de coagulación, el factor VIII HB" o HP2 se concentra de medio acondicionado 48 horas hasta 10- 15 unidades/ml por cromatografía en heparina-SepharoseMR. Se agrega factor VIII HB" o HP2 a plasma con hemofilia A (George King Biomedical) hasta una concentración final de 1 unidad/ml. Los títulos inhibidores en plasma RC o MR o una solución concentrada de mAb 413 IgG (4 µM) se miden por el ensayo Bethesda como se describe por Kasper, C.K. et al. (1975) Thromb . Diath . Haemorrh ¿4:869-872. La IgG inhibidora se prepara como se describe por Leyte, A. et al. (1991) <J. Biol . Chem. 266:740-746. HP2 no reacciona con anticuerpos contra A2. Por lo tanto, los residuos 373-603 deben contener un epitopo para anticuerpos contra A2.

Preparación del factor VIII híbrido humano-porcino y ensayo por empalme por extensión de superposición (SOE) Se han preparado varias moléculas sin dominio B de factor VIII híbridas humanas /porciñas recombinan es procoagulantes con sustituciones de aminoácidos porcinos en la región A2 humana para definir mejor el epitopo A2. Además de las técnicas de sitio de restricción, se han utilizado el método de "empalme por extensión de superposición" (SOE) como se describe por Ho et al. (1989) Gene 77:51-59, para sustituir cualquier región arbitraria del ADNc para factor VIII porcino.

El SOE, el sitio de empalme se define por oligonucleótidos superpuestos que pueden ser amplificados para producir el ADNc deseado por PCR. Se han elaborado 10 constructos de ADNc, designados HP4 a HP13. Se pueden insertar en el vector de expresión ReNeo, transfectada establemente en células de riñon de hámster bebé y se expresan a altas concentraciones [0.5-1 µg (aproximadamente 3-6 unidades) /107 células/24 horas] como se describe en el Ejemplo 7. Se determina la actividad coagulante de factor VIII en presencia y ausencia de un modelo de anticuerpo inhibidor monoclonal murino específico para el dominio A2 , mAb413. En ausencia de inhibidor, la totalidad de los constructos tienen actividad coagulante específica que es indiferenciable de factor VIII humano B(-) . Los constructos de factor VIII híbridos humanos/porcinos se ensayan para determinar reactividad con el mAb413 inhibidor contra A2 utilizando el ensayo Bethesda [Kasper et al. (1975) Thromb. Diath . Haemorrh . ¿4:869-872]. La unidad Behtesda (BU) es el método estándar para medir los títulos inhibidores . Los resultados se muestran en la Tabla V, y se comparan con el factor VIII humano recombinante.

TABLA V: COMPARACIÓN DE INMUNORREACTIVIDAD DE FACTOR VIII HÍBRIDO HUMANO/PORCINO CON AMINOÁCIDOS SUSTITUIDOS Constructo Sustitución Inhibición por mAb413 porcina (BU/mg de IgG) fVIII B(-) humano ninguno 1470 HP4 373 - -540 <0.7 HP5 373 - -508 <0.7 HP6 373 - -444 1450 HP7 445 - -508 <0.7 HP8 373 - -483 1250 HP9 484 - -508 <0.7 HP10 373 - -403 1170 HP11 404 - -508 <0.7 HP12 489- -508 <0.7 HP13 484 - -488 <0.7 Los límites de las sustituciones porcinas se definen por los primeros aminoácidos que difieren entre el factor VIII humano y porcino en los extremos NH2 terminal y C terminal de la inserción. Como se muestra en la Tabla V, si el título Bethesda no es mensurable (<0.7 BU/mg IgG) , entonces un epitopo A2 se encuentra en la región de la secuencia porcina sustituida. El epitopo ha sido definido progresivamente hasta los residuos 484-509 (SEC. DE IDENT. NO: 2), y consiste de únicamente 25 residuos, como se ejemplifica por la carencia de reactividad de mAb413 con HP9. Entre los constructos desde HP4 hasta HPll, HP9 es el constructo más "humanizado" en donde la región crítica en el epitopo A2 se localiza dentro de la secuencia Arg484-Ile508. En base en una comparación entre el factor VIII y porcino de la secuencia de aminoácidos en esta región crítica, se producen dos constructos adicionales, HP12 y HP13, en los cuales la correspondencia de la secuencia de aminoácidos porcinos se sustituye por aminoácidos humanos 489-508 y 484-488, respectivamente. Ninguno reacciona con MaB413. Esto indica que los residuos en cada lado de la unión Arg488-Ser489 son importantes para la reacción con los inhibidores A2. En HP12, únicamente 5 residuos no son humanos y en HP13, únicamente 4 residuos no son humanos. Las secuencias 484-508, 484-488 y 489-508 porcinas de híbridos sustituidos mostrados disminuyen la inhibición por inhibidores de A2 de cuatro plasmas de paciente, lo que sugiere que existe poca variación en la estructura del epitopo A2 de acuerdo con la respuesta de la población del inhibidor. Se determinó la reactividad de la mayor parte de los constructos humanizados, HP9, HP12 y HP13 , con dos preparaciones de IgG5 contra A2, preparadas a partir de plasmas inhibidores. Al igual que mAb413, estos anticuerpos no reaccionan con HP9, HP12 y HP13, pero reaccionan con los constructos control HP(-) y HP8. La región entre 484-508 se puede analizar adicionalmente para una identificación final del epitopo A2 crítico, utilizando los mismos procedimientos. Los métodos descritos en los Ejemplos 7 y 8 se pueden utilizar para preparar otro factor VIII híbrido humano/porcino de mamífero con sustitución de aminoácidos en la región A2 humana o en otros dominios, factor VIII híbrido humano/animal o animal/animal con sustitución de aminoácidos en cualquier dominio, o moléculas equivalentes a factor VII híbrido o fragmentos de cualquiera de estas, tales como el factor VIII híbrido que tenga inmunorreactividad reducida o ausente con anticuerpos contra factor VIII.

Ejemplo 9. Eliminación de la reactividad del inhibidor A2 del factor VIII humano por mutagénesis dirigida al sitio El ejemplo 8 muestra que la sustitución de la secuencia porcina unida por los residuos 484 y 508 dentro del dominio A2 de factor VIII humano proporciona una molécula que tiene una reactividad notablemente disminuida con un panel de inhibidores de factor VIII específicos para A2 [véase también Healey et al. (1995) J. Biol . Chem. ¿70:14505-14509] . En esta región existen nueve diferencias en aminoácidos entre el factor VIII humano y el porcino. Estos nueve residuos en el factor VIII sin dominio B humano, R484, P485, Y487, P488, R489, P492, V495, F501, e 1508 (utilizando el código de aminoácidos de una sola letra) , se cambian individualmente a alanina mediante mutagénesis dirigida al sitio. Adicionalmente, se colocan los sitios de restricción lul y Sac2 en el ADNc para el factor VIII en los sitios 5' y 3' en relación al epitopo A2, sin cambiar los aminoácidos correspondientes a estos sitios, para facilitar la clonación. Los nueve mutantes se transfectan establemente en células de riñon de hámster bebé y se expresan en altas concentraciones. La totalidad de los nueve produce factor VIII biológicamente activo. Se purifican y concentran parcialmente por cromatografía en heparina-Sepharose como se describe por Healey et al . Los mutantes han sido caracterizados por su reactividad con el inhibidor monoclonal murino Mab413 como en el Ejemplo 7. Este inhibidor reconoce el mismo epitopo o un epitopo agrupado muy cercanamente en el dominio A2 al igual que todos los inhibidores humanos estudiados hasta ahora. Se mide la reactividad del inhibidor utilizando el ensayo Bethesda. Brevemente, el título Bethesda de un inhibidor es la dilución de inhibidor que inhibe al factor VIII en 50% en un ensayo de coagulación de factor VIII de una etapa, estándar. Por ejemplo, si la solución de anticuerpo se diluye 1/420 e inhibe a la muestra de prueba de factor VIII recombinante en 50%, el título Bethesda es de 420 U. En el caso de un anticuerpo monoclonal puro como Mab413, se conoce la masa del anticuerpo, de manera que los resultados se expresan en unidades Bethesda (BU) por mg de Mab413. Para encontrar el punto de inhibición al 50%, se realiza una escala de diluciones de Mab413 y se encuentra la inhibición en 50% por el procedimiento de ajuste de curva. Los resultados son como siguen: Tabla VI Mutación Título de Mab413 (BU/mg) % de reactividad* Tipo silvestre, fVIII B(-) 9400 484 - A - 160 1.7 P485 ? A 4000 42 Y487 ? A 50 0.53 P488 ? A 3500 37 P489 - A 1.6 0.015 R490 - A <0.2> P492 ? A 630 6.7 V495 - A 10700 113 F501 - A 11900 126 1508 ? A 5620 60 * En relación al tipo silvestre Estos resultados indican que es posible reducir la antigenicidad del factor VIII hacia el inhibidor de modelo A2 sobre un factor de 10 al realizar sustituciones con alanina en las posiciones 484, 487, 489, y 492. La reactividad de R489 -A se reduce en casi 4 órdenes de magnitud. Cualquiera de estas sustituciones con alanina puede ser terapéuticamente útil para reducir la antigenicidad y la inmunogenicidad del factor VIII. Los resultados confirman la eficacia de la mutagénesis de exploración con alanina y demuestran adicionalmente que se retiene actividad biológica incluso aunque la secuencia de aminoácidos haya sido alterada dentro de un epitopo reactivo con un anticuerpo inhibidor. Cinco de los nueve sitios fueron secuencias humanas y porcinas difieren y también son sitios en donde difieren las secuencias humanas y murinas. Los factores VIII tienen sustituciones de alanina en estas posiciones y por lo tanto son ejemplos de una molécula equivalente del factor VIII híbrida que tiene una secuencia sin identificación de secuencia conocida con cualquier factor VIII de mamífero conocido hasta ahora. Una modificación adicional, por ejemplo al combinar dos sustituciones alanina, también puede proporcionar antigenicidad muy reducida para un intervalo más amplio de pacientes, puesto que los anticuerpos variantes policlonales difieren de un paciente a otro y pueden reaccionar con variantes del epitopo A2 del factor VIII. Además, la inmunogenicidad (capacidad para inducir anticuerpos) se reduce adicionalmente por incorporación de más de una sustitución de aminoácidos. Tales sustituciones pueden incluir tanto alanina, aminoácidos específicos porcinos u otros aminoácidos conocidos que se sabe tienen bajo potencial inmunogénico. Las sustituciones en las posiciones 490, 495 y 501 es probable que sean útiles para reducir inmunogenicidad. Además, es probable que estas sustituciones reduzcan la reactividad a ciertos ' anticuerpos de pacientes . Otras sustituciones de aminoácidos reductoras de antigenicidad, efectivas además de la alanina, pueden realizarse en la medida en que se tenga precaución de evitar aquéllas indicadas previamente como contribuyentes principales a la energía de unión de antígeno-anticuerpo o que tengan cadenas voluminosas o laterales cargadas . Los aminoácidos cuyas sustituciones dentro de un epitopo reducen la reactividad antigénica del mismo se denominan aminoácidos "reductores de inmunorreactividad" en la presente. Además de alanina, otros aminoácidos reductores de inmunorreactividad incluyen, sin limitación, metionina, leucina, serina y glicina. Se comprenderá que la reducción de inmunorreactividad que se puede obtener por un aminoácido dado también dependerá del efecto que pueda tener cualquier sustitución en la conformación de la proteína, accesabilidad del epitopo y similar.

Ejemplo X Se adquiere el fragmento Klenow, enlazadores Clal fosforilados, enlazadores Notl, ligasa T4, y ADN polimerasa Taq de Promega (Madison, Wisconsin) . La polinucleótido cinasa se adquiere de Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland. ?3P-ATP (Redivue, >5000Ci/mmol) se adquiere de Amerhsma . pBluescript II KS- y células E. coli Epicurean XLl-Blue se adquieren de Stratagene (La Jolla, California) . Los oligonucleótidos sintéticos se adquieren de Life Technologies, Inc. o Cruachem, Inc., los cebadores 5 ' -fosforilados se utilizan y después se elaboran productos de PCR para propósitos de clonación. La numeración de nucleótidos (nt) de los oligonucleótidos utilizados como cebadores para la amplificación por reacción en cadena' de polimerasa (PCR) del ADNc para fVIII porcino o el ADN genómico utiliza ADNc para fVIII humano como referencia (Wood et al. (1984) supra) . El ARN total porcino del bazo se aisla por extracción con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo [Chomczynski et al. (1987) Anal. Biochem. 162:156-159] . El ADNc porcino se prepara a partir de ARN total de bazo utilizando transcriptasa inversa (RT) de virus de leucemia murino Moloney y hexámeros aleatorios para cebar la reacción (equipo de síntesis de ADNc de primera cadena, Pharmacia Biotech) a menos que se indique de otra manera. Las reacciones de RT contienen Tris-Cl 45 mM, pH 8.3, KCl 68 mM, DTT 15 mM, MgCl2 9 mM, albúmina sérica bovina 0.08 mg/ml y trifosfato de desoxinucleótido 1.8 mM. • (dNTP) . El ADN genómico porcino se aisla del bazo utilizando un procedimiento estándar (Strauss, W.M. (1995) en Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., editores, John Wiley & Sons, pp. 2.2.1-2.2.3). El aislamiento de .ADN a partir de gel de agarosa se realiza utilizando Geneclean II (Bio 101) o el equipo de extracción de gel Quiex II (Qiagen) . Las reacciones de PCR se realizan utilizando un termociclador Hybaid OmniGene. Para las reacciones por PCR utilizando ADN polimerasa Taq, las reacciones incluyen MgCl2 0.6 mM, dNTPs 0.2 mM, cebadores oligonucleotídicos 0.5 µM, 50 U/ml de polimerasa y 0.1 volumen de mezcla de reacción de .ADNc de primera cadena. Excepto en donde se indique de otra manera, los productos de PCR se purifican en gel, los extremos se vuelven romos con fragmento Klenow, se precipitan con etanol y se ligan al sitio EcoRV o de pBluescript II KS-desfosforilado o se ligan con enlazadores Clal fosforilado utilizando T4 ligasa digerido con Clal, purificado por cromatografía en Sephacryl S400 y se ligan a Clal-corte, pBluescript II KS- desfosforilado. Las ligaciones se realizan utilizando ADN ligasa T4 (equipo de ligación rápido de ADN, Boehringer Mannheim) excepto en donde se indique de otra manera. Los plásmidos pBluescript II KS- que contienen el inserto se utilizan para transformar células E. coli Epicurean XLl-Blue. El secuenciado del ADN plasmídico se realiza utilizando un secuenciador de ADN automatizado de Applied Biosystems 373a y el equipo terminador de colorante PRISM o manualmente utilizando equipo de secuenciado Sequenase v. 2.0 (Amersham Corporation) . El secuenciado directo de los productos PCR incluye el etiquetado en el extremo con 32P de oligonucleótidos y se realiza utilizando un protocolo de secuenciado de ciclo (dsDNA Cycle Sequencing System, Life Technologies) .

Aislamiento de las clonas de ADNc para fVIII porcino que contienen la secuencia 5' UTR, el péptido señal y los codones de dominio Ai El ADN para fVIII porcino, 5' respecto al dominio A2 se amplifica por RT-PCR encajado de ARN total de bazo de cerdo hembra utilizando el protocolo de amplificación rápida 5' de los extremos ADNc (5' -RACE) (Marathón cDNA Amplification, Clontech, Versión PR55453) . Este incluye la síntesis de ADNc de la primera cadena utilizando un cebador oligo (dT) de instalación e inmovilización [Borson, N.D. et al. (1992) PCR Methods Appl . ¿:144-148], la síntesis de la segunda cadena de ADNc utilizando ADN polimerasa I de E. coli , y la ligación con un adaptador de cadena doble extendido 5', SEC. DE IDENT. NO: 13 5 ' -CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3 3 ' -H2N-CCCGTCCA-P04-5 ' cuya cadena corta se bloquea en el extremo 3 ' con un grupo de aminoácidos para reducir el cebador PCR no específico y el cual es complementario a los 8 - nucleótidos en el extremo 3' (Siebert, P.D. et al. (1995) Nucleic. Acids . Res . 2¿: 1087-1088) . La primera ronda de PCR se realiza utilizando un oligonucleótido específico para adaptador, SEC. DE IDENT. NO: 14 5 '-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-31 (denominado API) como cebador directo, y el dominio A2 para fVIII porcino específico para el oligonucleótido de la SEC. DE IDENT. NO: 15 5 ' -CCA TTG ACA TGA AGA CCG TTT CTC-3 ' (nt 2081-2104) como cebador antisentido. La segunda ronda de PCR se realiza utilizando un oligonucleótido encajado, específico para adaptador, SEC. DE IDENT. NO: 16 5 ' -ACT CAC TAT AGG GCT CGA GCG GC-3 ' (designado AP2) como cebador directo, y un oligonucleótido específico de dominio A2 porcino, encajado, SEC. DE IDENT. NO: 17 (nt 1497-1520) co o cebador antisentido. La PCR se lleva a cabo utilizando un equipo comercial (equipo de núcleo PCR ADNc Advantage) el cual utiliza un protocolo de inicio caliente mediado por anticuerpo [Kellogg, D.E. et al. (1994) BioTechniques 16:1134-1137]. Las condiciones de PCR incluyen la desnaturalización a 94 °C durante 60 seg, seguido por 30 ciclos (primer PCR) o 25 ciclos (segunda PCR) de desnaturalización durante 30 seg a 94°C, reasociación durante 30 seg a 60°C y elongación durante 4 min a 68°C utilizando un control de temperatura de tubo. Este procedimiento proporciona un producto prominente de «1.6 kb el cual es consistente con la amplificación de un fragmento que se extiende aproximadamente 150 pb dentro de 5' UTR. El producto de PCR se clona en pBluescript utilizando enlazadores Clal . Los insertos de las cuatro clonas se secuencían en ambas direcciones . La secuencia de estas clonas incluye regiones que corresponden a 137 pb de 5' UTR, el péptido señal, el dominio Al y parte del dominio A2. Se alcanza un consenso en por lo menos 3 de 4 sitios. Sin embargo, las clonas contienen un promedio de 4 mutaciones aparentes generadas por -PCR, probablemente debido a las rondas múltiples de PCR necesarias para generar un producto clonable. Por lo tanto, utilizamos la secuencia obtenida de cualquier región de péptido señal para diseñar un cebador de PCR fosforilado de cadena directa, SEC. DE IDENT. NO: 18 5' -CCT CTC GAG CCA CCA TGT CGA GCC ACC ATG CAG CTA GAG CTC TCC ACC TG-3', denominado RENEOPIGSP, para la síntesis de otro producto de PCR para confirmar la secuencia y la clonación dentro de un vector de expresión. La secuencia en negrillas representa el codón de inicio. La secuencia 5' a esta representa la secuencia idéntica a la de 5 ' del sitio de inserción dentro del vector de expresión de mamífero ReNeo utilizado para la expresión de fVIII (Lubin et al. (1994) supra) . Este sitio incluye un sitio de separación Xhol (subrayado) . RENEOPIGSP y el nt 1497-1520 oligonucleótido se utiliza para cebar una reacción de PCR mediada por ADNn polimerasa Taq utilizando ADNc de bazo hembra porcino como plantilla. Las ADN polimerasas de otros fabricantes fallan en proporcionar un producto detectable. Las condiciones de PCR incluyen la desnaturalización a 94 °C durante cuatro minutos, seguido por 35 ciclos de desnaturalización durante 1 minuto a ' 94°C, reasociación durante 2 minutos a 55°C y elongación durante 2 min a 72 °C, seguido por una etapa de elongación final durante 5 min a 72 °C. El producto de PCR se clona en pBluescript utilizando enlazadores Clal. Los insertos de dos de estas clonas se secuencían en ambas direcciones y se -hacen coincidir con la secuencia de consenso.

Aislamiento de clonas de ADNc de fVIII porcino que contienen A3 , Cl y la mitad 5 ' de los codones del dominio C2 Inicialmente, se clonan dos productos de RT-PCR de bazo porcino, que corresponden a un fragmento de dominio B-A3 (nt 4519-5571) y un fragmento de dominio C1-C2 (nt 6405-6990) .

Se obtiene el extremo 3 ' del dominio C2 extendido dentro de la región 26 del exón, la cual es el exón terminal en fVIII. El producto B-A3 se elabora utilizando el cebador de dominio B específico porcino, SEC. DE IDENT. NO: 19 5' CGC GCG GCC GCG CAT CTG GCA AAG CTG AGT T 3 ' , en donde la región subrayada corresponde a una región en fVIH porcino que se alinea con nt 4519-4530 en fVIII humano. La región 5' del oligonucleótido incluye un sitio Notl que originalmente se diseñan para propósitos de clonación. El cebador antisentido utilizado para generar el producto B-A3, SEC. DE IDENT. NO: 20 5 ' -GAA ATA AGC CCA GGC TTT GCA GTC RAA-3 ' se basa en el complemento inverso de la secuencia de ADNc para fVIII humano en nt 5545-5571. La reacción de PCR contiene KCl 50 mM, Tris-Cl 10 mM, pH 9.0, Tritón X-100, 0.1%, MgCl21.5 mM, dNTP 2.5 mM, cebadores 20 µM, 25 unidades/ml de ADN polimerasa Tag y 1/20 volumen de mezcla de reacción RT. Las condiciones de PCR son desnaturalización a 94°C durante 3 -min, seguido por 30 ciclos de desnaturalización durante 1 min a 94°C, reasociación durante 2 min a 50 °C y elongación durante 2 min a 72 °C. Los productos de PCR se fosforilan utilizando ADN cinasa T4 y se agregan los enlazadores Notl. Después de cortar con Notl, los fragmentos de PCR se clonan en el sitio Notl de pBluescript II KS- y se transforman en células XLl-Blue. El producto C1-C2 se elabora utilizando la secuencia de ADNc humano conocido para sintetizar cebadores directo y antisentido, SEC. DE IDENT. NO: 21 5 ' -AGG AAA TTC CAC TGG AAC CTT N-3! (nt 6405-6426) y la SEC. DE IDENT. NO: 22 5' -CTG GGG GTG AAT TCG AAG GTA GCG N-3 ' (complemento inverso de nt 6966- 6990) , respectivamente. Las condiciones de PCR son idénticas a las utilizadas para generar el producto B-A2. El f agmento - resultante se liga al vector de clonación pNOT utilizando el sistema de clonación de donador PCR prime (5 Prime-3 Prime, Inc., Boulder, Colorado) y se hacen crecer en células JM109. Los plásmidos B-A3 y C1-C2 se secuencían parcialmente para elaborar los oligonucleótidos específicos porcinos directo y antisentido, SEC. DE IDENT. NO: 23 5 ' -GAG TTC ATC GGG AAG ACC TGT TG-3' (nt 4551-4573) y SEC. DE IDENT. NO: 245 ' -ACA GCC CAT CA CTC CAT GCG AAG-3 ' (nt 6541-6564), respectivamente. Estos oligonucleótidos se utilizan como cebadores para generar un producto de RT-PCR de 2013 pb utilizando un equipo de PCR para ADNc Clontech Advantage. Este producto, el cual corresponde a nt 4551-6564 humano, - incluye la región que corresponde al péptido de activación de la cadena' ligera (nt 5002-5124), dominio A3 (nt 5125-6114) y la mayor parte del dominio Cl (nt 6115-6573) . La secuencia de la clona C1-C2 ha establecido que los ADNc humano y porcino de nt 6565 hacia el extremo 3' del dominio Cl son idénticos . El producto de PCR clonado dentro del sitio EcoRV de pBluescript II KS- . Se secuencían completamente cuatro clonas en ambas direcciones. Se alcanza un consenso en por lo menos 3 de 4 sitios. Aislamiento de clonas de ADNc para fVIII porcino que contiene la mitad 3 ' de los condones del dominio C2 El dominio C2 de fVIII humano (nucleótidos 6574-7053) está contenido dentro de los exones 24-26 [Gitschier J. et al. (1984) Nature ¿12 : 326-330] . El exón 26 humano contiene 1958 pb, que corresponden a los nucleótidos 6901-8858. Incluye 1478 pb de la secuencia 3' no traducida. Los intentos por clonar el AD?c del exón 26 que corresponde al extremo 3' del dominio C2 y 3' UTR por 3* RACE [Siebert et al. (1995) supra] , PCR inversa [Ochman, H. et al. (1990) Bioteciinologry- (?.Y.). 8:759-760], PCR de sitio de restricción [Sarkar, G. et al. (1993) PCR Meth. Appl .2:318-322] PCR "cebado impredeciblemente" [Domínguez, O. et al. (1994) Nucleic. Acids Res . ¿2:3427-3248] y por análisis de una biblioteca de AD?c hepática porcina no han tenido éxito.

Se ha intentado 3' RACE utilizando la misma biblioteca de AD? de cadena doble ligada al adaptador que se utilizó para tener éxito en la clonación del extremo 5' del AD?c de fVIII porcino, la falla de este método no se debe a la a la ausencia de AD?c que corresponde al exón 26. Se utilizó un procedimiento de PCR de avance de gen dirigido [Parker, J.D. et al. (1991) Nucleic. Acids . Res . l£:3055-3060] para clonar la mitad 3' del dominio C2. Se sintetiza un cebador directo específico porcino SEC. DE IDE?T. O: 25 5'-TCAGGGCAATCAGGACTCC-3' (nt 6904-6924) basado en la secuencia de dominio C2 inicial se utiliza en una reacción de PCR con cebadores "de avance" no específicos que se seleccionan de oligonucleótidos disponibles en el laboratorio. Los productos de PCR después se dirigen por análisis de extensión de cebador [Parker et al. (1991) BioTecnhiques 10:94-101] utilizando un cebador interno específico porcino marcado en el extremo con 32P, SEC. DE IDENT. NO: 26 5 ' -CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3' (nt 6932-6952) . De manera interesante, de los 40 cebadores no específicos probados, únicamente dos proporcionan productos positivos en el análisis de extensión de cebador y estos dos corresponden a una secuencia exacta humana degenerada en el extremo 3' del dominio C2 : SEC. DE IDENT. NO : 27 5'-GTAGAGGTCCTGTGCCTCGCAGCC-3' (nt 7030-7053) y SEC. DE IDENT. NO.-285' -GTAGAGSTSCTGKGCCTCRCAKCCTCG-3' , (nt 7027-7053). Estos cebadores inicialmente se han diseñado para proporcionar un producto por RT-PCR convencional, pero no proporcionan productos suficiente que pueda ser visualizado por unión al colorante de bromuro de etilo. Sin embargo, se puede identificar un producto de PCR por el método de extensión de cebador más sensible. Este producto se purifica en gel se secuencia directamente. Esto amplía la secuencia de fVIII porcino 3' a nt 7026. Se obtiene una secuencia adicional por análisis de extensión de cebador de un producto de PCR encajado generado utilizando la biblioteca de ADNc de cadena doble ligada a adaptador utilizada en el protocolo 5 ' -RACE descrito previamente. La primera ronda de reacción utiliza el cebador exacto porcino de la SEC. DE IDENT. NO: 29 5 ' -CTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGT-3 ' (nt 6541-6564) y el cebador API. La segunda ronda de reacción utiliza la SEC. DE IDENT. NO: 30 5' -AATCAGGACTCCTCCACCCCCG-3 ' (nt 6913-6934) y el cebador AP2. El secuenciado por PCR directa extiende la secuencia 3 ' al extremo del dominio C2 (nt 7053) . La secuencia del dominio C2 es única excepto en nt 7045 cerca del extremo 3 ' del dominio C2. El análisis de las reacciones de PCR repetidas proporciona ya sea A o G o una doble lectura A/G en este sitio. El secuenciado se extiende dentro de 3 'UTR utilizando dos cebadores adicionales, SEC. DE IDENT. N0:31 5 ' -GGA TCC ACC CCA CGA GCT GG-3' (nt 6977-6996) y SEC. DE IDENT. NO:32 5 ' -CGC CCT GAG GCT CGA GGT TCT AGG-3' (nt 7008-7031). Se obtienen aproximadamente 15 pb de la secuencia 3 'UTR, aunque la secuencia no está clara en varios sitios . Después se sintetizan diversos cebadores antisentido en base en los mejores estimados de la secuencia no traducida 3 ' . Estos cebadores incluyen el complemento inverso del codón de detención TGA en su parte 3 ' terminal . Los productos de PCR se obtienen a partir de ADN genómico de bazo porcino y ADNc de bazo porcino que se visualizan en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio utilizando un cebador directo específico SEC. DE IDENT. NO: 33 5' -AAT CAG GAC TCC TCC ACC CCC G-31 (nt 6913-6934) y el cebador antisentido 3 'UTR, SEC. DE IDENT. NO: 34 5 ' -CCTTGCAGG.AATTCGATTCA-3 ' . Para obtener cantidades suficientes de material para propósitos de clonación, se realiza una segunda ronda de PCR utilizando el cebador directo encajado, SEC. DE IDENT. NO:355 ' -CCGTGGTGAACGCTCTGGACC-3 ' (nt 6932-6952) y el mismo cebador antisentido. El producto de PCR de 141 pb se clona dentro de EcoRV-corte pBluescript II KS-. La secuencia de las tres clonas derivadas del ADN genómico y tres clonas derivadas de ADNc se obtiene en ambas direcciones . La secuencia es inequívoca, excepto en nt 7045, en donde el 7ADN genómico siempre es A y el ADNc siempre es G.

Alineaciones de secuencia de ADN múltiples de fVIII humano, porcino y de ratón (figura 1A-1H) Las alineaciones del péptido señal, las regiones Al, A2, A3, Cl y C2 se realizan utilizando el programa CLUSTALW [Thompson, J.D. et al. (1994) Nucleic. Acids . Res . 22:4673-4680] . Los castigos por apertura de separación y extensión de separación son de 10 y 0.05, respectivamente. Las alineaciones de los dominios humano, de ratón y de cerdo B se han descrito previamente [Eider et al. (1993) supra] . La secuencia A2 humana corresponde a los aminoácidos 373-740 en la SEC. DE IDENT. NO: 2. La secuencia porcina de aminoácidos A2 se proporciona en la SEC. DE IDENT. NO : 4 , y la secuencia del dominio de aminoácidos A2 de ratón se proporciona en la SEC. DE IDENT. NO: 6, aminoácidos 392-759.

Ejemplo 11 Expresión del factor VIII porcino sin dominio B recombinante activo (PB') Materiales Se adquieren plasmas humanos acumulados con hemofilia citritado y normal de George King Bio edical, Inc. Se adquiere suero bovino fetal, geneticina, penicilina, estreptomicina, medio DMEM/F12 y medio AIM-V de la Life Technologies Inc. Se adquiere ADN polimerasa Taq de Promega. Se adquiere ADN polimerasa Vent de New England Biolabs. Se adquieren ADN polimerasa Pfu y el fagémido pBluescripII KS" de Stratagene. Los oligonucleótidos sintéticos de adquieren de Life Technologies o Cruachem, Inc. Las enzimas de restricción se adquieren de New England Biolabs o P omega. Los cebadores 5'-fosforilados se utilizan cuando los productos de PCR se producen para propósitos de clonación. La numeración nucleotídica (nt) de los oligonucleótidos utilizados como cebadores para la amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) del ADNc o el ADN genómico de fVIII porcino utiliza como referencia .ADNc de fVIII humano [Wood et al. (1984) Nature 312:330-3371. Se obtiene un vector de expresión para fVIII denominado HB"/ReNeo de Biogen, Inc. HB'ReNeo contiene genes de resistencia a ampicilina y genes lisina y el ADNc para fVIII que carece de la totalidad del dominio B, definido como el fragmento de separación Ser741-Argl648. Para simplificar la mutagénesis del ADNc para el dominio C2 de VIII, el cual esta en el extremo 3' del inserto de fVIII en ReNeo, se introduce un sitio Notl dos bases 3 ' respecto al codón de detención de HB"/ReNeo por mutagénesis de empalme por extensión de superposición (SOE) [Horton, R.M. et al (1993) Methods Enzymol . 217 : 270-2791. Este constructo se denomina HB" ReNeo/Notl. Se aisla ARN total por extracción con tiocianato de ácido de guanidinio-fenol-cloroformo [Chomczynski, P. et al . (1987) Anal . Biochem. 162:156-159] . Se sintetiza ADNc a partir de ARNm utilizando la transcriptasa inversa del virus de leucemia murino Moloney (RT) y exámeros aleatorios de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (First-Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia, Biotech) . El ADN plasmídico se purifica utilizando Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Inc.). Las reacciones por PCR se realizan utilizando un termociclador Hybaid OmniGene utilizando las ADN polimerasas Taq, Vent o Pfu. Los productos de PCR se purifican en gel, se precipitan con etanol y se ligan en el ADN plasmídico utilizando ADN ligasa T4 (equipo de ligación de ADN Rapid, Boehringer Mannheim) . Se utilizan plásmidos que contienen inserto para transformar células E. coli Epicurean XLl-Blue. Todas las secuencias de ADN de fVIII novedosas generadas por PCR se confirman por secuenciado didesoxi utilizando un secuenciador de ADN automatizado de Applied Biosystems 373a y el equipo terminador de colorante PRISM.

Construcción de un vector de fVIII híbrido. HP20, que contiene el dominio C2 porcino Un ADNc de fVHI que corresponde al extremo 3' del dominio Cl y la totalidad del dominio C2 se clonan en pBluescript por RT-PCR a partir de ARN total del bazo utilizando cebadores basados en la secuencia de ADNc para fVIII porcino conocido [Healy, J.F. et al. (1996) Blood 88:4209-4214] . Este constructo y HB"/ReNeo se utilizan como plantillas para construir un producto de fusión de Cl humano-C2 porcino en pBluescript por mutagénesis SOE. El fragmento C1-C2 en este plásmido se remueve con Apal y Notl y se liga en Apal/Notl-cut HB"/ReNeo/NotI para producir HP20/ReNeo/NotI .

Construcción de fVIII híbrido humano/porcino , carente del dominio B que contiene la cadena ligera porcina (HP18) - La cadena ligera de fVIII humano consiste de los re s i duo s ami noá c i do s Asp l 649 - Tyr2 3 3 2 . Lo s re s i duo s correspondientes en el ADNc de fVIII porcino se sustituyen por esta región de HB" para producir una molécula de fVIII híbrido humano/porcino denominada HP18. Esto se realiza al sustituir un producto de PCR que corresponde a la región A2 porcina, el dominio A3, el dominio Cl y parte del dominio C2 por la región correspondiente en HP20. Para facilitar las construcciones, se introduce un sitio Avrll sinónimo dentro de nt 2273 en la unión de los dominios A2 y A3 de HP20 por mutagénesis SOE.

Construcción del fVIII híbrido humano/porcino carente del dominio B que contiene el péptido señal porcino, el dominio Al y el dominio A2 (HP22)- El péptido señal de fVIII humano, el dominio Al y los dominios A2 consisten de residuos aminoácidos Met (-19) -Arg740. Los residuos correspondientes en el ADNc VIII porcino se sustituyen por esta región de HB" para producir una molécula denominada HP22. Adicionalmente, se introduce un sitio Avrll sinónimo dentro de nt 2273 en la unión de los dominios A2 y A3 de HP22 por mutagénesis SOE. Se construye HP22 por fusión de un péptido señal porcino-Al-fragmento A2 parcial en pBluescript [Healy et al, (1996) supra] con un fVIII híbrido humano/porcino sin dominio B que contiene el dominio A2 porcino denominado HP1 [Lubin et al. (1994) supra] .

Construcción de fVIII porcino sin dominio B- (PB") Se digiere un fragmento Spel/Notl de HP18/BS (+ Avrll) con Arvll/Notl y se liga en HP22/BS (+ Avrll) digerido con AvrlI/NOtl para producir un constructo PB'/BS (+ Avrll) , el cual consiste de fVHI porcino que carece de la totalidad del dominio B. se clona PB- dentro de ReNeo por ligación con un fragmento de Xba/Notl de PB"/BS (+ Avrll) dentro de HP22/ReNeo/NotI (+ Avrll) .

Expresión de moléculas fVIII recombinantes Se transfectan transitoriamente PB'/ReNeo/Notl (+ Avrll) y HP22/ReNeo/NotI (+AvrII) dentro de células COS, y se expresan como se describe previamente [Lubin, I.M. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:8639-8641]. HB"/ReNeo/NotI y sin ADN (en falso) se transfectan como un control. La actividad de fVIII de PB", HP22 y HB" se mide por ensayos cromogénicos como sigue. Se activan muestras de fVIII en sobrenadantes de cultivo de células COS por trombina 40 mM en NaCl 0.15 M, HEPES 20 mM, CaCl2 5 mM, Tween 80 0.01%, pH 7.4 en presencia de factor IXa, 10 nM, factor X 425 nM y 50 µm de vesículas unilamelares de fosfatidilserina- [fosfatidilcolina (25/75, p/p) . Después de 5 minutos, la reacción se detiene con EDTA 0.05 M y desulfatohirudina recombinante 10 nM, y el factor Xa resultante se mide por ensayo de sustrato cromogénico. En el ensayo de sustrato cromogénico, se agrega Spectozyme Xa 0.4 mM, y la velocidad de liberación de para-nitroanilida se mide al medir la absorbancia de la solución a 405 nm. Los resultados de sobrenadante de cultivo de células duplicados transfectados independientemente (absorbancia a 405 nm por minuto) HB": 13.9 PB": 139 HP22: 100 falso: <0.2 Estos resultados indican que el fVIII sin dominio B porcino y fVIII sin dominio B consiste de las subunidades Al y A2 porcinas y son activas y sugieren que tienen una actividad superior al fVIII sin dominio B humano. Se purifica parcialmente y se concentra PB" a partir de medio de crecimiento por cromatografía de heparina-Sepharose. Se equilibra heparina-Sepharose (10 ml) con NaCl 0.075 M, HEPES 10 mM, CaCl2 2.5 mM, Tween-80 0.005%, azida de sodio 0.02%, pH 7.40, el medio (100-200 ml) para expresar células se aplica a heparina-Sepharose el cual después se lava con 30 ml de amortiguador de equilibrio sin azida de sodio. Se eluye PB" con NaCl 0.65 M, HEPES 20 mM, CaCl2 5 mM, Tween-80 0.01%, pH 7.40 y se almacena a -80°C. El rendimiento de la actividad coagulante de fVHI típicamente es de 50-75%.

Expresión estable de fVIII sin dominio B porcino (PB-) Las líneas de células transfectadas se mantienen en medio de Eagle modificado por Dulbecco-F12 que contiene suero bovino fetal 10%, 50 U/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina. El suero bovino fetal se inactiva por calor a 50°C durante una hora antes de su uso. Se transfecta establemente HB"/ReNeo y PB"/ReNeo/NotI (+ Avrll) en células BHK, y se selecciona por resistencia a geneticina utilizando un protocolo general que ha sido descrito previamente [Lubin et al. (1994) Biol. Chem. 269.-8639-86411 excepto que las células que expresan se mantienen en medio de crecimiento que contiene 600 µg/ml de geneticina. Las células de matraces Corning T-75 que crecen a confluencia se transfieren a matraces triples Nun en medio que contiene 600 µg/ml de geneticina y que crecen hasta confluencia. Este medio se remueve y se sustituye con medio AIM-V libre de suero (Life Technologies, Inc.) sin geneticina. Se monitorea la expresión del factor VIII por actividad coagulante de factor VIII de una etapa ( vide supra) y 100-150 ml de medio de recolecta una vez al día durante cuatro a cinco días . Los niveles máximos de expresión en medio para HB" y PB" son de 1-2 unidades por ml y 10-12 unidades por ml de actividad coagulante de factor VIII respectivamente.

Purificación de PB" Se precipita PB" de sobrenadante de cultivo utilizando sulfato de amonio saturado 60% y después se purifica por cromatografía de inmunoafinidad W3-3 y cromatografía líquida de alta presión mono Q como se describe previamente para la purificación de factor VIII porcino derivado de plasma [Lollar et al. (1993) Factor VIH/factor Villa. Methods Enzymol. 222 :128-1431. La actividad coagulante específica de PB" se mide por el ensayo de coagulación de una etapa [Lollar et al. (1993) supra] y es similar a la del factor VIII porcino derivado de plasma. Cuando se analiza por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, la preparación de PB" contiene tres bandas de masas moleculares aparentes de 160 k a, 82 kDa y 76 kDa. Las bandas de 82 kDa y 76 kDa se han descrito previamente como heterodímeros que contienen los dominios A1-A2 y AP-A3-C1-C2 (en donde ap se refiere a un péptido de activación) [Toóle et al. (1984) Nature ¿1¿: 342-347] . La banda de 160 kDa se transfiere a una membrana de fluoruro de polivinilideno y se somete a secuenciado terminal NH2, el cual proporciona Arg-lie.

Xx-Xx-Tyr (en donde Xx representa no determinado) el cual es la secuencia terminal NH2 del factor VIII de cadena sencilla [Toóle et al. (1984) supra] . Por lo tanto, PB" es procesado parcialmente por separación entre los dominios A2 y A3, de manera que consiste de dos formas, una cadena sencilla de proteína Al-A2-ap-A3-Cl-C2 y un heterodímero Al-A2/ap-A3-Cl-C2.

Se ha reportado un procesamiento similar de HB" recombinante [Lind et al. (1995) Eur. J. Biochem. ¿32:19-27] .

Caracterización del factor VIII porcino Hemos determinado la secuencia de ADNc de fVIII que corresponde a 137 pb de 5 'UTR, la región codificante del péptido señal (57 pb) y los dominios Al (1119 pb) , A3 (990 pb) , Cl (456 pb) y C2 (483 pb) . Junto con una secuencia publicada previamente del dominio B y la región del péptido de activación de la cadena ligera [Toóle et al. (1986) supra] y el dominio A2 [Lubin et al. (1994) supra] , la secuencia reportada aquí completa la determinación del ADNc para fVIII porcino que corresponde al producto traducido. Un fragmento que incluye la región 5 'UTR, el péptido señal y el ADNc para el dominio Al se clona utilizando el protocolo 5 ' -RACE RT-PCR. Un cebador basado en la secuencia C2 humana tiene éxito en producir un producto de RT-PCR que lleva a la clonación de A3-C1 y la mitad 5' del dominio C2. El ADNc que corresponde a la mitad 3 ' del dominio C2 y ADNc de UTR 3' demuestra ser difícil de clonar. El resto del dominio C2 finalmente se clona por procedimiento de PCR de gen de desplazamiento dirigido [Parker et al. (1991) supra] .

La secuencia reportada aquí SEC. DE IDENT. NO: 36 es inequívoca excepto en nt 7045 cerca del extremo 3 ' del dominio C2, el cual es ya sea A o G, como se describe en lo anterior. El codón correspondiente es GAC (Asp) o AAC (Asn) . Los codones humanos y de ratón son GAC y CAG (Gln) , respectivamente. Se desconoce si representa un polimorfismo o un artefacto reproducible por PCR. Los ADNc para fVIII sin dominio B recombinantes híbridos humanos/porcinos que contienen sustituciones del dominio C2 porcino que corresponden a los codones tanto GAC como AAC se han expresado establemente sin diferencia detectable en la actividad procoagulante. Esto indica que no hay diferencia funcional entre estos dos variantes del dominio C2. La alineación de la secuencia predicha de aminoácidos de la SEC. DE IDENT. NO: 37 fVIII porcina de longitud completa con las secuencias humanas [Wood et al. (1984) supra] y murina (Eider et al, . (1993) supra] se muestra en la figura 1A-1H junto con los sitios de modificación post-traduccional, ruptura proteolítica y reconocimiento por otras macromoléculas . El grado de identidad de las secuencias alineadas se muestra en la tabla VIII. Como se indica previamente, los dominios B de estas especies son más divergentes que los -dominios A o C. Esto es consistente con la observación de que el dominio B no tiene una función conocida pese a su gran tamaño [Eider et al. (1993) supra; Toóle et al. (1996) supra]. Los resultados de la presente invención confirman que el dominio B de fVIII porcino no son necesarios para actividad. En base en los datos de secuencia presentados aquí, fVIII tiene la totalidad o parte del dominio B suprimido y puede ser sintetizado por expresión de DN que codifica para fVIII porcino que tiene suprimido del mismo una parte de codones del dominio B porcino. También existe más divergencia de secuencias que corresponden con el dominio Al del péptido de separación APC/factor IXa (residuos 337-372) y el péptido de activación de la cadena ligera (tabla VII) . El sitio de separación de trombina en la posición 336 para generar el péptido 337-372 aparentemente se pierde en el ratón puesto que este residuo es glutamina en vez de arginina [Eider et al. (1993) supra]. La divergencia relativamente rápida de los péptidos de separación de trombina (o en fVIII de ratón posiblemente por un péptido de activación de vestigio 337-372) se ha notado previamente para los fibrinopéptidos [Creighton, T. E. (1993) En Proteins : Structures and Molecular Properties, W..H. Freeman, New York, pp. 105-138] . La carencia de función biológica de estos péptidos una vez que sean separados se ha mencionado como una posible razón para la divergencia rápida. Se ha propuesto que Arg562 en fVIII humano sea el sitio de separación más importante para la proteína C activada durante la inactivación de fVIIl y fVilla [Fay, P.J. et al. (1991) J. Biol. Chem. 2££:20139-20145] . Este sitio se conserva en fVIIl humano, porcino y de ratón.

Los posibles sitios de glicosilación unidos a N también se muestran en negrillas en la figura 1A-1H. Existen ocho sitios de glicosilación unidos a N conservados : uno en el dominio Al y uno en el dominio A2, cuatro en el dominio B, uno en el dominio A3, y uno en el dominio Cl. Se conservan las cisteínas en los dominios A y C 19, mientras que existe divergencia de las cisteínas del dominio B. Seis de los siete enlaces disulfuro en fVIII se encuentran en sitios homólogos en el factor V y ceruloplas ina, y ambos enlaces disulfuro del dominio C se encuentran en el factor V [McMullen, B.A. et al. (1995) Protein Sci. 4:740-746]. El fVIII humano contiene tirosinas sulfatadas en las posiciones 346, 718, 719, 723, 1664 y 1680 [Pittman, D.D. et al. (1992) Biochemistry 31:3315-3325; Michnick, D.A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:20095-201021. Estos residuos se conservan en fVIII 'de ratón y fVIII porcino (figura 1) , aunque el programa CLUSTALW no alinea la tirosina de ratón correspondiente a Tyr346 en fVIH humano. El plasma de ratón y de cerdo puede corregir el defecto de coagulación en el plasma humano con hemofilia A, lo cual concuerda con el nivel de conservación de residuos en los dominios A y C de estas especies . La actividad procoagulante de fvill es superior al de fVIII humano [Lollar, P. et al. (1992) J. Biol. Chem. ¿6.7:23652-23657] . El factor VIII porcino recombinante (carente del dominio B) expresado y purificado como se describe en la presente también muestra mayor actividad coagulante específica en comparación con fVIII humano, y es comparable con fVlll porcino derivado de plasma. Esto puede deberse a una velocidad de disociación espontánea disminuida de la subunidad A2 del heterotrímero de fVilla A1/A2/A3-C1-C2 activo. Se desconoce si esta diferencia en la actividad procoagulante refleja un cambio evolutivo- en la función como un ejemplo de adaptación de las especies [Perutz, M.F. (1996) Adv. Protein Chem. ¿6:213-244] . Ahora que la secuencia de ADNc fVIII porcina que corresponde con el producto traducido esta completa, la mutagénesis de exploración homologa [Cunningham B.C., et al. (1989) Science 24¿: 1330-1336] puede proporcionar una manera de identificar diferencias estructurales entre fVIII humano y porcino que son responsables de la actividad superior de este último. fVIII porcino típicamente' es menos reactivo con anticuerpos inhibidores que surgen en hemofílicos quienes han sido sometidos a transfusión con fVIII o los cuales surgen como autoanticuerpos en la población en general. Esta es la base de utilizar concentrado de fVIII porcino en el manejo de pacientes con anticuerpos inhibidores [Hay and Lozier (1995) supra] . La mayor parte de los inhibidores se dirigen con epitopos localizados en el dominio A2 o dominio C2 [Fulcher, C.A. et al. (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA ¿2: 7728-7732 ; Scandella, D. et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85 : 6152-6156.-Scandella, D. et al. (1989) Blood 74.: 1618 -1626] .

Adicionalmente, se ha identificado un epitopo de importancia desconocida que se encuentra ya sea en el dominio A3 o Cl [Scandella et al. (1989) supra; Scandella, D. et al. (1993) Blood 82:1767-1775; Nakai, H. et al. (1994) Blood 84:224a] . El epitopo A2 ha sido mapeado a los residuos 484-508 por mutagénesis de exploración homologa [Healey et al. (1995) supra] . En este segmento de 25 residuos, existe una porción relativamente baja de secuencia idéntica (16/25 o 64%) . Es interesante que esta región, la cual aparece como funcionalmente importante en base en el hecho de que los anticuerpos para la misma son inhibidores, aparentemente se a sometido a un desplazamiento genético relativamente más rápido. La alineación del dominio A2 porcino y los dominios A3 indican que el epitopo A2 no comparte homología detectable con la región correspondiente en el dominio A3. El epitopo inhibidor de C2 de fVIII humano se ha propuesto que se localiza dentro de los residuos 2248-2312 por mapeo de supresión [Scandella, D. et al. (1995) Blood 86.: 1811-1819] . El fVIII humano y porcino es 83% idéntico en este segmento de 65 residuos. Sin embargo, la mutagénesis de exploración homologa de esta región para caracterizar el epitopo C2 ha mostrado que un determinante principal del epitopo C2 se localiza inesperadamente en la región que corresponde a los aminoácidos humanos 2181-2243 (SEC. DE IDENT. NO: 2) y la figura ÍH.

Las proteínas del factor VIII híbridas humanas-porcinas se fabrican en las cuales diversas porciones del dominio C2 del factor VIII humano se sustituye por las porciones correspondientes de factor VIII porcino, utilizando la estrategia descrita aquí (ejemplo 8) . La síntesis de los diversos factores VIII híbridos con C2 se lleva a cabo al construir un ADN que codifica para el híbrido, utilizando una secuencia nucleotídica que codifica para la región C2 porcina que se proporciona en la SEC. DE IDENT. NO: 37. Cada 7ADN híbrido se expresa en células transfectadas, de manera que los factores VIII híbridos pueden ser purificados parcialmente a partir del medio de crecimiento. Se mide la actividad, en ausencia de cualquier inhibidor, por el ensayo de coagulación de una etapa. Se utiliza una batería de cinco inhibidores humanos para probar cada factor VIII híbrido." Los plasmas inhibidores que contienen anticuerpo contra el factor VIII se han demostrado previamente que están dirigidos contra el dominio C2 humano, en base en su capacidad de neutralizar la inhibición del dominio C2 humano recombinante . En todos los plasmas de prueba, el título de inhibidor se neutraliza más de 79% por el dominio C2 o la cadena ligera, pero menos de 10% por el dominio A2 humano recombinante. Además, los factores VIII híbridos de C2 se prueban contra el anticuerpo monoclonal murino, el cual une al dominio C2, y anticuerpos inhibidores de C2 humanos similares, que inhiben la unión del factor VIII a fosfolípido y al factor de von Willebrand. Al comparar los títulos de inhibidor de anticuerpo contra los factores VIII híbridos C2, el determinante principal del epitopo inhibidor C2 humano se muestra que es la región de los residuos 2181-2243 (SEC. DE IDENT. N0:2, véase también figura ÍH) . Los anticuerpos contra C2 dirigidos a una región COOH terminal para el residuo 2253 no se identifican en cuatro de los cinco sueros de pacientes . Al comparar los híbridos que tienen una secuencia porcina que corresponde con los residuos aminoácidos números 2181-2199 y 2207-2243, es evidente que ambas regiones contribuyen a la unión de anticuerpo. La secuencia de aminoácidos porcino que corresponde a los residuos humanos porcino 2181-2243 se numera 1982-2044 en la SEC. DE IDENT. NO:37. La secuencia de ADN porcino que codifica para aminoácidos porcinos se numera 1982-2044 y son los nucleótidos numerados 5944-6132 en la SEC. DE IDENT. NO: 35. Con referencia a la figura ÍH, se puede ver que en la región 2181-2243, existen 16 diferencias de aminoácidos entre las secuencias humana y porcina. Las diferencias se encuentran en los residuos 2181, 2182, 2188, 2195-2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224-2227, 2234, 2238 y 2243. La sustitución de aminoácidos en uno o más de estos residuos numerados se puede llevar a cabo para realizar un factor VIII humano modificado no reactivo para anticuerpos inhibidores contra C2 humanos . La mutagénesis de exploración con alanina proporciona un método conveniente para generar sustituciones con alanina para residuos que se presentan de manera natural, como se ha descrito previamente. Se pueden sustituir también aminoácidos diferentes a alanina, como se describe aquí. Las sustituciones de alanina para aminoácidos individuales, especialmente aquellos los cuales no son idénticos entre humanos/porcino o humanos/ratón o los cuales es más probable que contribuyan a la unión del anticuerpo, pueden proporcionar un factor VIII modificado con reactividad reducida por anticuerpos inhibidores . Además, la estrategia de insertar aminoácidos con menor potencial para ser inmunogénicos en la región definida de los residuos 2181-2243 proporciona factores VIII modificados que tienen inmunogenicidad reducida. El factor VIII con inmunogenicidad reducida es útil como un suplemento de factor VIII para el tratamiento de pacientes con hemofilia A con preferencia al factor VIII de secuencia natural. Los pacientes tratados con factor VIII de inmunogenicidad reducida es menos probable que desarrollen anticuerpos inhibidores y por lo tanto es menos probable que padezcan de efectividad reducida del tratamiento durante sus vidas . Las figuras 1A-1H, tomadas juntas, proporcionan una comparación de secuencia alineada de las secuencias de aminoácidos de factor VIII de humano, cerdo y ratón. La figura ÍA compara las regiones de péptido señal (humano, SEC. DE IDENT. NO: 40; porcino, SEC. DE IDENT. NO: 37, aminoácidos 1-19; murino, SEC. DE IDENT. NO: 6, aminoácidos 1-19) . Nótese que los aminoácidos en la figura 1A-1H se numeran en la primera alanina de la proteína madura como número 1, con los aminoácidos del péptido señal se les asignan números negativos . La secuencia de fVIII humano en la SEC. DE IDENT. NO: 2 también comienza con la primera alanina de la proteína madura como el aminoácido número 1. En las secuencias de aminoácidos de f lll de ratón (SEC. DE IDENT. NO:6) y fVIII porcino (SEC. DE IDENT. NO:37), el primer aminoácido (alanina) de la secuencia madura es el aminoácido número 20. La figura 1A-1H muestra una alineación de las secuencias correspondientes de fVIII humano, de ratón y de cerdo, de manera que las regiones con mayor identidad de aminoácidos están yuxtapuestas . Los números de aminoácidos en las figuras 1A-1H se aplican únicamente a fVIII humano. La figura IB muestra las secuencias de aminoácidos para el dominio Al de humano (SEC. DE IDENT. NO:2, aminoácidos 1-372) , porcino (SEC. DE IDENT. NO.37, aminoácidos 20-391) y murino (SEC. DE IDENT. NO:6, aminoácidos 20-391). La figura ÍC proporciona secuencias de aminoácidos para los dominios A2 del factor VIII a partir de humano (SEC. DE IDENT. N0:2, aminoácidos 373-740), cerdo (SEC. DE IDENT. NO:37, aminoácidos 392-759) y ratón (SEC. DE IDENT. NO: 6, aminoácidos 392-759). La figura ID proporciona las secuencias de aminoácidos de los dominios B del factor VIII humano (SEC. DE IDENT. NO:2, aminoácidos 741-1648), cerdo (SEC. DE IDENT. NO: 37, aminoácidos 760-1449) y ratón (SEC. DE IDENT. NO : 6 , aminoácidos 760-1640). La figura 1E compara las secuencias de aminoácidos de los péptidos de activación de la cadena ligera de factor VIII de humano, cerdo y ratón (SEC. DE IDENT. NO:2, aminoácidos 1649-1689; (SEC. DE IDENT. NO:37, aminoácidos 1450-1490; y (SEC. DE IDENT. NO:6, aminoácidos 1641-1678, respectivamente). La figura 1F proporciona la comparación de secuencia para los dominios A3 del factor VIII de humano, cerdo y ratón (SEC. DE IDENT. NO.-2, aminoácidos 1690-2019; SEC. DE IDENT. NO:37, aminoácidos 1491-1820; y SEC. DE IDENT. NO:6, aminoácidos 1679-2006, respectivamente. La figura 1G proporciona las secuencias de aminoácidos de los dominios Cl del factor VIII de humano, cerdo y ratón (SEC. DE IDENT. NO:2, aminoácidos 2020-2172; SEC. DE IDENT. NO:37, aminoácidos 1821-1973 y SEC. DE IDENT. NO: 6, aminoácidos 2007-2159, respectivamente) . La figura ÍH proporciona datos de secuencia para los dominios C2 de los dominios C2 del factor VIII de humano, cerdo y ratón (SEC. DE IDENT. NO: 2, aminoácidos 2173-2332; SEC. DE IDENT. NO:37, aminoácidos 1974-2133 y SEC. DE IDENT. NO:6, aminoácidos 2160-2319, respectivamente) . Los rombos representan sitios de sulfatación de tirosina, los sitios de glicosilación potenciales están con negrillas, los sitios de unión propuesta para el factor IXa, el fosfolípido y la proteína C están con subrayado doble, y las regiones involucradas en la unión de anticuerpos inhibidores contra A2 y contra C2 están en cursivas. Los asteriscos resaltan secuencias de aminoácidos los cuales están conservados. Véase también la SEC. DE IDENT. NO: 36 (ADNc para el factor VIII porcino) y la SEC. DE IDENT. NO: 37 (secuencia deducida de aminoácidos para el factor VIII porcino. El sistema de numeración humano se utiliza como referencia (Wood et al . (1984) supra] . Los dominios Al, A2 y B se definen por los sitios de separación de trombina en las posiciones 372 y 740 y un sitio de separación de proteasa desconocido en 1648 como residuo 1-372, 373-740 y 741-1648, respectivamente [Eaton, D.L. et al. (1986) Biochemistry 2¿: 8343-8347] . Los dominios A3-C1 y C2 se definen como residuos 1690-2019, 2072-2172 y 2173-2332 respectivamente [Vehar et al. (1984) supra] . Los sitios de separación para trombina (factor lia) , factor IXa, factor Xa y APC [Fay et al. (1991) supra; Eaton, D. et al. (1986) Biochemistry ¿5:505-512; Lamphear, B.J. et al. (1992) Blood ¿0_: 3120-3128 se muestran al colocar el nombre de la enzima sobre la arginina reactiva. Un péptido ácido se separa de la cadena ligera de fVIII por trombina o factor Xa en la posición 1689. Los sitios de unión propuestos para el factor IXa [Fay, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. ¿69:20522-20527; Lenting, P.J. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7150-7155) , fosfolípido (Foster, P.A. et al. (1990) Blood 75:1999-2004) y proteína C (Walker, F.J. et al. (1990) J. Biol. Chem. ¿65:1484-1489] se subrayan doble. Las regiones involucradas en la unión de anti A2 [Lubin et al. (1994) supra; Healey et al. (1995) supra] ; y los anticuerpos inhibidores para anti-C2 propuestos previamente están en cursivas. El epitopo inhibidor de C2 identificado como se describe en la presente (aminoácidos humanos 2181-2243) se muestra por un subrayado sencillo en la figura ÍH. Los sitios de sulfatación de tirosina [Pittman et al. (1992) supra ; Michnick et al. (1994) supra] se muestran por . Las secuencias de reconocimiento para la glicosilación N unida potencial (NXS/T, donde X no es prolina) se muestran en negrillas. La secuencia nucleotídica que codifica para la proteína de factor VIII que carece de dominio B se proporciona en la SEC. DE IDENT . NO: 38 y la secuencia deducida correspondiente de aminoácidos en la SEC. DE IDENT. NO: 39. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma sé refiere .

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las s iguientes reivindicaciones :

1. Un ADN aislado y purificado, caracterizado porque comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia de aminoácidos del factor VIII porcino, que se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 37.

2. El 7ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia nucleotídic-a que se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 36.

3. .ADN aislado y purificado, caracterizado porque comprende una secuencia nucleotídica que codifica para el dominio Al de factor VIII porcino, como se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 37 de los aminoácidos 20-391.

4. El ADN de conformidad con la reivindicación 3 , caracterizado porque comprende la secuencia nucleotídica que se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 36, de las posiciones 58-1173.

5. 7ADN aislado y purificado, caracterizado porque comprende una secuencia nucleotídica que codifica para el dominio A3 de factor VIII porcino, como se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 37 de los aminoácidos 1491-1820.

6. El 7ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende la secuencia nucleotídica que se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 36, de las posiciones 4471-5460.

7. 7ADN aislado y purificado, caracterizado porque comprende una secuencia nucleotídica que codifica para el dominio Cl de factor VIII porcino, como se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 37 de los aminoácidos 1821-1973.

8. El ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende la secuencia nucleotídica que se establece en la SEC. DE IDENT. NO:36, de las posiciones 5461-5919.

9. ADN aislado y purificado, caracterizado porque comprende una secuencia nucleotídica que codifica para el dominio C2 de factor VIII porcino, como se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 37 de los aminoácidos 1974-2133.

10. El ADN de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende la secuencia nucleotídica que se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 36, de las posiciones 5920-6399.

11. El ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia nucleotídica codifica para la secuencia de aminoácidos que se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 39.

12. El ADN de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende la secuencia nucleotídica que se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 38.

13. Un ADN que codifica para factor VIII híbrido humano/porciño, caracterizado porque comprende una sustitución de ADN que codifica para factor VIII porcino, en donde la secuencia nucleotídica que codifica para los aminoácidos números 2181-2243 del factor VIII humano está sustituida por los nucleótidos que codifican para los aminoácidos 1982-2044 de la SEC. DE IDENT. NO: 37.

14. El ADN de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizado porque el ADN que codifica para factor VIII porcino es de los nucleótidos 5944-6132 de la SEC. DE IDENT. NO: 36.

15. ADN que codifica para factor VIII porcino, caracterizado porque comprende codones gue codifican para los aminoácidos 20-2133 de la SEC. DE IDENT. NO: 37.

16. El ADN de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porgue tiene la secuencia de nucleótidos 58-6399 de la SEC. DE IDENT. NO: 36.

17. 7ADN gue codifica para factor VIII porcino sin dominio B, caracterizado porgue comprende los codones gue codifican para los aminoácidos 20-1443 de la SEC. DE IDENT. NO .-39.

18. -ADN, de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque tiene la secuencia de nucleótidos 60-4331 de la SEC. DE IDENT. NO: 38.

19. Producto de expresión proteínico, aislado y purificado, caracterizado porque es el del ADN de conformidad con la reivindicación 17.

20. Producto de expresión proteínico, aislado y purificado, caracterizado porque es del ADN de conformidad con la reivindicación 18.

21. Factor VIII humano modificado, caracterizado porque comprende una sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones 2181-2243, de conformidad con la SEC. DE IDENT. NO:2, tal sustitución es la inserción de un aminoácido reductor de inmuno-reactividad para el aminoácido gue se presenta de manera natural, el factor VIII modificado tiene actividad procoagulante.

22. El factor VIII modificado, de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porgue la sustitución se realiza en una o más de las posiciones 2181, 2182, 2195, 2196-2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224, 2225, 2226, 2227, 2228, 2234, 2238 y 2243 de acuerdo con la SEC. DE IDENT. NO:2.

23. El factor VIII modificado, de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porgue la sustitución se realiza en uno o más de las posiciones 2181, 2195, 2196, 2207, 2226, 2227, 2228 y 2234.

24. Un método para modificar un factor VIII de manera gue se reduzca la reactividad a un anticuerpo inhibidor, y que se retenga la actividad procoagulante, caracterizado porque comprende sustituir un aminoácido que se presenta de manera natural por un aminoácido que reduce la inmuno-reactividad en por lo menos una posición dentro de los aminoácidos números 2181-2243, de acuerdo con la SEC. DE IDENT. NO: 2.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porgue el aminoácido está sustituido con los aminoácidos números 2181-2243, de acuerdo con la SEC. DE IDENT. NO : 2 , al expresar ADN que codifica para un factor VIII modificado, el .ADN tiene por lo menos un codón modificado para codificar para la sustitución de aminoácidos dentro de los aminoácidos números 2181-2243.

26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el aminoácido reductor de inmuno-reactividad es alanina, metionina, leucina, serina o glicina.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porgue el aminoácido reductor de inmuno-reactividad es alanina.

28. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porgue la sustitución de un aminoácido reductor de inmuno-reactividad se realiza en por lo menos una de las posiciones número 2181, 2182, 2195, 2196, 2197, 2199, 2207, 2216, 2222, 2224, 2225, 2226, 2227, 2228, 2234, 2238 o 2243 de acuerdo con la SEC. DE IDENT. NO:2.

29. Un método para elaborar factor VIII porcino, caracterizado porque comprende expresar .ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos que se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 37 que incluye por lo menos los aminoácidos 20-2133 en una célula de huésped de mamífero adecuada en un medio de cultivo, y purificar la proteína de factor VIII de la célula o del medio de cultivo.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el ADN tiene una secuencia nucleotídica esencialmente como se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 36, que incluye por lo menos los nucleótidos 58-6399.

31. E l mé t odo de conf ormidad con l a reivindicación 29, caracterizado porque el ADN codifica para la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 37.

32. El mét odo de conf ormidad con l a reivindicación 31, caracterizado porgue el ADN tiene la secuencia nucleotídica gue se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 36.

33. Un método para elaborar factor VIII porcino sin dominio B, caracterizado porgue comprende expresar ADN gue codifica para la secuencia de aminoácidos gue se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 39, gue incluye por lo menos los aminoácidos 20-1443 en una célula huésped de mamífero adecuada en un medio de cultivo, y purificar la proteína de factor VIII de la célula o del medio de cultivo.

34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porgue el ADN tiene una secuencia nucleotídica esencialmente como se establece en la SEC. DE IDENT. NO:38, gue incluye por lo menos los nucleótidos 60-4331.

35. E l mé t odo de conf ormi dad con l a reivindicación 33, caracterizado porgue el ADN codifica para la secuencia de aminoácidos gue se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 39.

36. El método de conf ormidad con la reivindicación 33, caracterizado porgue el ADN tiene la secuencia nucleotídica gue se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 38 a partir del nucleótido número 3 al nucleótido número 4331.