ES2235154T3 - Factor viii hibrido humano y porcino. - Google Patents
Factor viii hibrido humano y porcino.Info
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Abstract
UN FACTOR VIII DE COAGULACION HIBRIDO HUMANO/PORCINO ES PRODUCIDO POR AISLAMIENTO Y RECOMBINACION DE SUBUNIDADES DE FACTOR VIII HUMANO Y PORCINO, O POR INGENIERIA GENETICA DE LOS GENES DEL FACTOR VIII HUMANO Y PORCINO. SUBUNIDADES DE FACTOR VIII QUE HAN SIDO PURIFICADAS DE PLASMA HUMANO O PORCINO SON AISLADAS, Y SE PRODUCE FACTOR VIII HUMANO/PORCINO MEZCLANDO BIEN SUBUNIDADES DE CADENA PESADA PORCINA CON SUBUNIDADES DE CADENA HUMANA LIGERA O BIEN MEZCLANDO SUBUNIDADES DE CADENA PESADA HUMANA CON SUBUNIDADES DE CADENA LIGERA PORCINA, POR LO QUE SE PRODUCEN MOLECULAS HIBRIDAS DE CADENA LIGERA HUMANA/CADENA PESADA PORCINA Y CADENA PESADA HUMANA/CADENA LIGERA PORCINA. ESTAS MOLECULAS HIBRIDAS SON AISLADAS POR CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO. ALTERNATIVAMENTE, METODOS RECOMBINATORIOS DE DNA SE USAN PARA CAMBIAR ELEMENTOS DE FACTOR VIII PORCINO POR LOS CORRESPONDIENTES ELEMENTOS DE FACTOR VIII HUMANO PARA PRODUCIR FACTOR VIII HIBRIDO HUMANO/PORCINO.
Description
Factor VIII híbrido humano y porcino.
Esta invención se refiere en general a un factor
VIII híbrido humano/porcino y a procedimientos de preparación y uso
del mismo.
La coagulación sanguínea empieza cuando las
plaquetas se adhieren a la pared de corte de un vaso sanguíneo
lesionado en un sitio de lesión. Posteriormente, en una cascada de
reacciones reguladas enzimáticamente, se convierten las moléculas de
fibrinógeno soluble mediante la enzima trombina en cadenas
insolubles de trombina que mantienen juntas las plaquetas en un
trombo. En cada etapa de la cascada, se convierte un precursor
proteico en una proteasa que escinde el siguiente precursor proteico
en la serie. Son necesarios cofactores en la mayoría de las etapas.
En su forma activa, la proteína factor VIII es un cofactor que es
necesario para la activación del factor X por la proteasa factor IX
activado.
El factor VIII o factor antihemofílico se observó
en plasma y se nombró en los años 30. En los años 40, se asoció una
deficiencia de factor VIII con el trastorno de coagulación hemofilia
A. Se encontró que el factor VIII estaba ligado al cromosoma X y se
planteó la hipótesis de que era una proteína. Trabajos que
implicaron plasma bovino, humano y porcino identificaron en los años
80 el factor VIII como una proteína, aunque su fuente celular
definitiva permanece incierta.
Es desconocido cómo funciona exactamente el
factor VIII en la coagulación sanguínea. Es conocido que el factor
VIII se activa a factor VIIIa proteolíticamente mediante la trombina
o el factor Xa. En combinación con calcio y fosfolípido, el factor
VIIIa hace al factor IXa un activador más eficaz del factor X
mediante un mecanismo desconocido.
La gente deficiente en factor VIII o que tiene
anticuerpos contra el factor VIII que no se tratan con factor VIII
padecen hemorragias internas incontroladas que pueden causar una
serie de graves síntomas, desde reacciones inflamatorias en
articulaciones a la muerte temprana. Los hemofílicos graves, que
ascienden aproximadamente a 10.000 en los Estados Unidos, pueden
tratarse con infusión de factor VIII, que recuperará la capacidad de
coagulación normal de la sangre si se administra con suficiente
frecuencia y concentración. La definición clásica de factor VIII, de
hecho, es aquella sustancia presente en plasma sanguíneo normal que
corrige el defecto de coagulación en plasma derivado de individuos
con hemofilia A.
Están disponibles comercialmente varias
preparaciones de factor VIII derivado de plasma humano de grados
variables de pureza para el tratamiento de la hemofilia A. Estas
incluyen un factor VIII parcialmente purificado derivado de la
sangre combinada de muchos donantes que se trata con calor y
detergente por los virus, pero que contiene un nivel significativo
de proteínas antigénicas; un factor VIII purificado con anticuerpo
monoclonal que tiene niveles menores de impurezas antigénicas y
contaminación viral; y factor VIII recombinante humano, para el que
están en desarrollo ensayos clínicos. Adicionalmente, está
disponible una preparación de factor VIII porcino parcialmente
purificado para tratar pacientes con inhibidores del factor VIII
humano, concretamente aquellos que tienen moléculas de anticuerpo en
circulación que se unen a y neutralizan factor VIII humano.
Los hemofílicos requieren la sustitución diaria
de factor VIII para evitar la artropatía hemofílica deformante que
aparece después de muchos años de hemorragias recurrentes en las
articulaciones. Sin embargo, los suministros de concentrados de
factor VIII no han sido nunca suficientemente abundantes para tratar
adecuadamente a los hemofílicos debido a problemas en la producción
comercial y el uso terapéutico. Por ejemplo, el derivado de plasma
utilizado habitualmente es difícil de aislar y purificar, es
inmunogénico y requiere tratamiento para eliminar el riesgo de
infectividad por virus del SIDA y la hepatitis. El factor VIII
recombinante humano puede reducir los dos últimos problemas. El
factor VIII porcino puede presentar también una alternativa, puesto
que el factor VIII humano es inestable a concentraciones y pH
fisiológicos y está presente en la sangre a una concentración
extremadamente baja (0,2 \mug/ml de plasma), y su actividad
específica de coagulación es baja, comparada con el factor VIII
porcino.
Puesto que muchos inhibidores de factor VIII
humano reaccionan menos fuertemente con factor VIII porcino, el
factor VIII porcino se utiliza actualmente para corregir la
deficiencia de factor VIII en pacientes con afecciones en las que no
responden a infusiones de factor VIII humano. Es una limitación del
factor VIII porcino el desarrollo de anticuerpos inhibidores contra
él después de una o más infusiones.
Los problemas asociados al factor VIII derivado
de plasma comercialmente disponible utilizado habitualmente han
estimulado un significativo interés en el desarrollo de un mejor
producto factor VIII. Existe la necesidad de una molécula de factor
VIII más potente de modo que puedan suministrarse más unidades de
actividad de coagulación por molécula; una molécula de factor VIII
que sea estable a un pH seleccionado y a concentración fisiológica;
una molécula de factor VIII que sea menos apta para producir
anticuerpos inhibidores; y una molécula de factor VIII que evite la
detección inmune en pacientes que han adquirido ya anticuerpos
contra el factor VIII humano.
Es por lo tanto un objeto de la presente
invención proporcionar un factor VIII que corrija la hemofilia en un
paciente deficiente en factor VIII o que tenga inhibidores de factor
VIII humano.
Es un objeto adicional de la presente invención
proporcionar procedimientos para el tratamiento de hemofílicos.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un factor VIII con una eficacia aumentada en ensayos de
coagulación de factor VIII.
Es aún otro objeto de la presente invención
proporcionar un factor VIII que sea estable a un pH seleccionado y a
concentración fisiológica.
Se produce un factor de coagulación VIII híbrido
humano/porcino mediante aislamiento y recombinación de subunidades
de factor VIII humano y porcino o mediante ingeniería genética de
genes del factor VIII humano y porcino.
En la realización preferida, se aíslan y
purifican subunidades de factor VIII de plasma humano o porcino, y
se produce factor VIII híbrido humano/porcino mediante mezcla de
subunidades de cadena pesada porcina con subunidades de cadena
ligera humana o mediante mezcla de subunidades de cadena pesada
humana con subunidades de cadena ligera porcina, produciendo así
moléculas híbridas de cadena ligera humana/cadena pesada porcina y
cadena pesada humana/cadena ligera porcina. Estas moléculas híbridas
se aíslan mediante cromatografía de intercambio iónico.
Como alternativa, se utilizan procedimientos de
ADN recombinante para intercambiar elementos del factor VIII porcino
por los correspondientes elementos del factor VIII humano, dando
como resultado también moléculas de factor VIII híbrido
humano/porcino.
Se describen procedimientos para preparar factor
VIII híbrido humano/porcino altamente purificado que tienen las
etapas de: (a) aislamiento de subunidades de factor VIII humano
derivado de plasma y subunidades de factor VIII porcino derivado de
plasma, seguido de reconstitución de la actividad coagulante
mediante mezcla de subunidades humanas y porcinas, seguido de
aislamiento de factor VIII híbrido humano/porcino mediante
cromatografía de intercambio iónico; (b) construcción de dominios de
factor VIII porcino mediante tecnología de ADN recombinante, seguido
de intercambio de dominios de factor VIII porcino y humano; o (c)
creación de factor VIII híbrido humano/porcino mediante sustitución
de restos aminoacídicos específicos de factor VIII humano por restos
aminoacídicos del factor VIII porcino homólogo mediante mutagénesis
dirigida a sitio.
El factor VIII híbrido humano/porcino resultante
tiene una actividad específica mayor que el factor VIII humano e
igual o ligeramente menor que el factor VIII porcino.
La Figura 1 (técnica anterior) es una
representación en diagrama de una molécula de factor VIII que
muestra las subunidades (cadenas ligera y pesada) y los
dominios.
Como se utiliza en la presente memoria, "factor
VIII híbrido humano/porcino" designa una molécula de proteína
factor VIII funcional con secuencia derivada de factor VIII humano y
porcino. Este factor VIII híbrido humano/porcino tiene una actividad
específica igual a o mayor que el factor VIII porcino y tiene
actividad en un ensayo de factor VIII humano. En algunas
realizaciones, este factor VIII híbrido humano/porcino no es
reactivo cruzado con todos los anticuerpos de factor VIII
humano.
"Actividad específica", como se utiliza en
la presente memoria, designa la actividad que corregirá el defecto
de coagulación de plasma deficiente en factor VIII humano. La
actividad específica se mide en unidades de actividad de coagulación
por miligramo total de proteína factor VIII en un ensayo estándar en
el que se compara el tiempo de coagulación de plasma deficiente en
factor VIII humano con el de plasma humano normal. Una unidad de
actividad de factor VIII es la actividad presente en 1 ml de plasma
humano normal. En el ensayo, cuanto más corto es el tiempo de
formación de coágulo, mayor es la actividad del factor VIII que se
está ensayando.
Un "factor VIII híbrido" o "proteína
híbrida", como se utiliza en la presente memoria, es una proteína
factor VIII en la que la secuencia aminoacídica deriva en parte de
origen humano y en parte de origen porcino. Este factor VIII híbrido
puede prepararse (1) mediante sustitución de subunidades porcinas o
humanas derivadas de plasma aisladas (cadenas pesada o ligera) por
las correspondientes subunidades humanas o porcinas; (2) mediante
sustitución de dominios humanos o porcinos (A1, A2, A3, B, C1 y C2)
por los correspondientes dominios porcinos o humanos; (3) mediante
sustitución de partes de los dominios humanos o porcinos por partes
de los dominios porcinos o humanos; o (4) mediante cambio de uno o
más resto(s) aminoacídicos en el factor VIII humano por
resto(s) en la correspondiente secuencia porcina. Una
proteína de fusión es el producto de un gen híbrido en el que la
secuencia de codificación de una proteína está extensamente
alterada, por ejemplo al fusionar parte de ella con la secuencia de
codificación de una segunda proteína de un gen diferente para
producir un gen híbrido que codifica la proteína de fusión. Como se
utiliza en la presente memoria, una proteína de fusión es un
subconjunto de la proteína híbrida descrita en esta solicitud.
"Deficiencia de factor VIII", como se
utiliza en la presente memoria, incluye deficiencia en la actividad
de coagulación causada por la producción de un factor VIII
defectivo, mediante la producción inadecuada o nula de factor VIII,
o mediante la inhibición parcial o total del factor VIII por
inhibidores. La hemofilia A es un tipo de deficiencia de factor VIII
como resultado de un defecto en un gen ligado al cromosoma X y a la
ausencia o deficiencia de la proteína factor VIII que codifica.
"Subunidades" de factor VIII humano o
porcino, como se utiliza en la presente memoria, son las cadenas
pesadas y ligeras de la proteína. La cadena pesada del factor VIII
contiene tres "dominios", A1, A2 y B. La cadena ligera del
factor VIII contiene también tres "dominios", A3, C1 y C2.
Pueden construirse de la siguiente manera
moléculas de factor VIII híbrido humano/porcino que tienen mayor
actividad en un ensayo estándar de coagulación comparadas con factor
VIII humano altamente purificado.
Se dan a conocer en la presente memoria cuatro
tipos de factor VIII híbrido humano/porcino y los procedimientos
para prepararlos: los obtenidos (1) combinando una subunidad de
factor VIII de cadena ligera humana y una subunidad de factor VIII
de cadena pesada porcina; (2) combinando una subunidad de factor
VIII de cadena ligera porcina y una subunidad de factor VIII de
cadena pesada humana; (3) sustituyendo el dominio A2 porcino por el
dominio A2 homólogo del factor VIII humano; o (4) sustituyendo el
dominio A2 humano por el dominio A2 homólogo del factor VIII
porcino. La molécula híbrida puede contener un mayor porcentaje de
secuencia humana que porcina o viceversa, dependiendo del origen de
las diversas regiones, como se describe con más detalle a
continuación.
Se muestra a continuación que el factor VIII
híbrido humano/porcino constituido por cadena pesada porcina/cadena
ligera humana y correspondiente al primer tipo de híbrido enumerado
anteriormente tiene mayor actividad coagulante específica en un
ensayo estándar de coagulación en comparación con el factor VIII
humano. El factor VIII híbrido humano/porcino puede ser útil para
tratar pacientes con inhibidores, puesto que estos inhibidores
pueden reaccionar menos bien con factor VIII híbrido humano/porcino
que con factor VIII humano o porcino.
Las proteínas factor XIII híbrido humano/porcino
enumeradas anteriormente pueden prepararse mediante el aislamiento
de subunidades de factor VIII derivado de plasma, seguido de
reconstitución y purificación.
Se preparan y aíslan moléculas de factor VIII
híbrido humano/porcino, y se caracteriza su actividad procoagulante.
Un procedimiento, modificado a partir de los procedimientos
reseñados por Fay, P.J., et al., 265, J. Biol. Chem.
6197 (1990), cuyas enseñanzas se incorporan a la presente memoria; y
Lollar, J.S., et al., 263 J. Biol. Chem. 10451
(1988), cuyas enseñanzas se incorporan a la presente memoria,
implica el aislamiento de subunidades (cadenas pesada y ligera) de
factor VIII humano y porcino, seguido de recombinación de cadena
pesada humana y cadena ligera porcina o mediante recombinación de
cadena ligera humana y cadena pesada porcina.
El aislamiento de subunidades individuales de
ambas especies implica la disociación del dímero cadena
ligera/cadena pesada mediante quelación de calcio con ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA), seguido de HPLC en Mono S™
(Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ). Las moléculas de
factor VIII híbrido humano/porcino se reconstituyen a partir de
subunidades aisladas en presencia de calcio. El factor VIII híbrido
de cadena ligera humana/cadena pesada porcina o cadena ligera
porcina/cadena pesada humana se aísla a partir de cadenas pesadas no
reaccionadas mediante HPLC en Mono S™ mediante procedimientos para
el aislamiento de factor VIII porcino, como se describen por
Lollar, J.S., et al., 71 Blood
137-143 (1988), cuyas enseñanzas se incorporan a la
presente memoria.
Estos procedimientos, descritos con detalle en
los ejemplos siguientes, dan como resultado moléculas híbridas de
cadena ligera humana/cadena pesada porcina con más de 6 veces la
actividad procoagulante del factor VIII humano.
Se aisló el gen del factor VIII humano y se
expresó en células de mamífero, como se reseña por Toole, J.J.,
et al., 312 Nature 342-347 (1984)
(Genetics Institute); Gitschier, J. et al., 312 Nature
326-330 (1984) (Genentech); Wood, W.I., et
al., 312 Nature 330-337 (1984)
(Genentech); Vehar, G.A., et al., 312 Nature
337-342 (1984) (Genentech)), cuyas enseñanzas se
incorporan a la presente memoria, y se dedujo la secuencia
aminoacídica del ADNc. La patente de EE.UU. nº 4.965.199 de Capon
et al. da a conocer un procedimiento de ADN recombinante para
producir factor VIII en células de hospedador mamífero y la
purificación de factor VIII humano. Se ha reseñado la expresión de
factor VIII en células CHO (ovario de hámster chino) y BHKC (células
de riñón de hámster recién nacido).
Se muestran la secuencia de ADNc que codifica el
factor VIII y la secuencia aminoacídica predicha en forma de la SEC
Nº ID 3 y la SEC Nº ID 4, respectivamente.
Se prepara el factor VIII híbrido recombinante
humano/porcino partiendo de ADNc humano (Biogen, Inc.) que codifica
la secuencia de factor VIII correspondiente a los dominios
A1-A2-A3-C1-C2.
Este ADNc carece del dominio B completo y corresponde a los residuos
1-740 y 1649-2332 del factor VIII
humano de cadena sencilla (SEC Nº ID 3), según el sistema de
numeración de Wood et al., 312 Nature
330-337 (1984), cuyas enseñanzas se incorporan a la
presente memoria. El dominio B se elimina, puesto que no parece ser
necesario para la función biológica.
Se ha aislado y purificado a partir de plasma el
factor VIII porcino (Fass, D.N., et al., 59 Blood 594
(1982). Se muestran la secuencia aminoacídica de B y parte de
los dominios A2 del factor VIII porcino, como se reseña por Toole,
J.J., et al., 83 Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA
5939-5942 (1986), cuyas enseñanzas se incorporan a
la presente memoria, y la correspondiente secuencia de ADN genómico
en forma de la SEC Nº ID 6 y la SEC Nº ID 5, respectivamente. La
región de codificación en la secuencia nucleotídica comienza en la
posición 675 (GGT CTC TGG...) (SEC Nº ID 5), que corresponde a los
aminoácidos (Gly-Leu-Trp), los
aminoácidos NH_{2} terminales.
Se aislaron tanto factor VIII porcino como humano
a partir de plasma en forma de una proteína de dos subunidades. La
Fig 1 (técnica anterior) ilustra en un diagrama la estructura de
subunidades de la molécula. Las subunidades, conocidas como la
cadena pesada y la cadena ligera, se mantienen juntas mediante un
enlace no covalente que requiere calcio u otros iones metálicos
divalentes. La cadena pesada del factor VIII contiene tres dominios,
A1, A2 y B, que están unidos covalentemente. La cadena ligera del
factor VIII contiene también tres dominios designados A3, C1 y C2.
El dominio B no tiene función conocida y puede eliminarse de la
molécula proteolíticamente o mediante procedimientos de tecnología
de ADN recombinante sin alteración significativa de ningún parámetro
mensurable del factor VIII. El factor VIII recombinante humano tiene
una estructura y función similares al factor VIII derivado de
plasma, aunque no está glicosilado a menos que se exprese en células
de mamífero.
Tanto el factor VIII activado humano como porcino
(factor VIIIa) tienen tres subunidades debido a la escisión de la
cadena pesada entre los dominios A1 y A2. Esta estructura se designa
A1/A2/A3-C1-C2. El factor VIIIa
humano no es estable en las condiciones que estabilizan al factor
VIIIa porcino. Esto es debido a la asociación más débil de la
subunidad A2 del factor VIIIa humano. La disociación de la subunidad
A2 del factor VIIIa humano y porcino está asociada a la pérdida de
actividad.
Puesto que la secuencia nucleotídica del dominio
B porcino es conocida, pueden construirse híbridos completos. Los
dominios individuales de ADNc del factor VIII porcino pueden
clonarse y sustituirse por los correspondientes dominios humanos
mediante técnicas de mutagénesis establecidas. Estas moléculas de
ADNc de factor VIII pueden clonarse en vectores de expresión para la
expresión última de moléculas de proteína factor VIII híbrido
humano/porcino.
Se secuenció el dominio A2 completo del factor
VIII, homólogo a los residuos 372-740 en el factor
VIII humano maduro (SEC Nº ID 3), y se predijo la secuencia
aminoacídica. Estas secuencias se muestran en forma de la SEC Nº ID
1 y la SEC Nº ID 2, respectivamente.
Las composiciones farmacéuticas que contienen
factor VIII híbrido humano/porcino solo o en combinación con
compuestos de estabilización farmacéutica, vehículos de suministro
y/o vehículos portadores apropiados, se preparan según
procedimientos conocidos, como se describen en "Remington's
Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin, cuyas enseñanzas se
incorporan a la presente memoria.
En una realización preferida, los vehículos o
vehículos de suministro preferidos para infusión intravenosa son
solución salina fisiológica o solución salina tamponada con
fosfato.
En otra realización preferida, los compuestos de
estabilización, vehículos de suministro y vehículos portadores
adecuados incluyen, pero sin limitación, otras proteínas humanas o
porcinas tales como albúmina.
Las vesículas fosfolipídicas o suspensiones
liposomales son también preferidas como vehículos o vehículos de
suministro farmacéuticamente aceptables. Estas pueden prepararse
según procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, y
pueden contener, por ejemplo, fosfatidilserina/fosfatidilcolina u
otras composiciones de fosfolípidos o detergentes que confieren
conjuntamente una carga negativa a la superficie, puesto que el
factor VIII se une a membranas fosfolipídicas cargadas
negativamente. Los liposomas pueden prepararse disolviendo (un)
lípido(s) apropiado(s) (tales como
estearoilfosfatidiletanolamina, estearoilfosfatidilcolina,
aracadoilfosfatidilcolina y colesterol) en un disolvente inorgánico
que después se evapora, dejando una fina película de lípido seco
sobre la superficie del recipiente. Se introduce después una
solución acuosa del factor VIII híbrido humano/porcino en el
recipiente. Se hace girar después el recipiente a mano para liberar
el material lipídico de las paredes del recipiente y para dispersar
los agregados lipídicos, formando así la suspensión liposomal.
El factor VIII híbrido humano/porcino puede
combinarse con otros compuestos de estabilización, vehículos de
suministro y/o vehículos portadores adecuados, incluyendo factores
de coagulación dependientes de vitamina K, factor tisular y factor
de von Willebrand (vWf) o un fragmento de vWf que contiene el sitio
de unión del factor VIII, y polisacáridos tales como sacarosa.
El factor VIII híbrido humano/porcino puede
suministrarse también mediante terapia génica del mismo modo que
puede suministrarse el factor VIII humano, utilizando medios de
suministro tales como vectores retrovirales. Este procedimiento
consiste en la incorporación de ADNc del factor VIII a células
humanas que se transplantan directamente a un paciente deficiente de
factor VIII, o que se disponen en un dispositivo implantable
permeable a moléculas de factor VIII pero impermeable a células, que
después se transplanta. El procedimiento preferido será
transferencia génica mediada por retrovirus. En este procedimiento,
se clona un gen exógeno (por ejemplo un ADNc del factor VIII) en el
genoma de un retrovirus modificado. Se inserta el gen mediante la
maquinaria viral en el genoma de la célula hospedadora, donde se
expresará por la célula. Se modifica el vector retroviral de modo
que no producirá virus, evitando la infección viral del hospedador.
Los principios generales de este tipo de terapia son conocidos por
los expertos en la técnica y se han revisado en la bibliografía (por
ejemplo Kohn, D.B., y P.W. Kantoff, 29 Transfusion
812-820, 1989).
El factor VIII híbrido humano/porcino puede
almacenarse unido a vWf para aumentar la semivida y la vida en
almacenamiento de la molécula híbrida. Adicionalmente, la
liofilización del factor VIII puede mejorar los rendimientos de
moléculas activas en presencia de vWf. Pueden emplearse los
procedimientos actuales para almacenamiento de factor VIII humano y
porcino utilizados por suministradores comerciales para el
almacenamiento de factor VIII híbrido humano/porcino. Estos
procedimientos incluyen: (1) liofilización del factor VIII en un
estado parcialmente purificado (en forma de un "concentrado" de
factor VIII que se infunde sin purificación adicional); (2)
purificación mediante inmunoafinidad del factor VIII mediante el
procedimiento de Zimmerman y liofilización en presencia de albúmina,
que estabiliza el factor VIII; (3) liofilización del factor VIII
recombinante en presencia de albúmina.
Adicionalmente, el factor VIII híbrido
humano/porcino ha sido indefinidamente estable a 4ºC en NaCl 0,6 M,
MES 20 mM y CaCl_{2} 5 mM a pH 6,0, y también puede almacenarse
congelado en estos tampones y descongelarse con una pérdida mínima
de actividad.
Se utiliza factor VIII híbrido humano/porcino
para tratar hemorragia incontrolada debida a deficiencia de factor
VIII (por ejemplo hemorragia intraarticular, intracraneal o
gastrointestinal) en hemofílicos con y sin anticuerpos inhibidores y
en pacientes con deficiencia adquirida de factor VIII debido al
desarrollo de anticuerpos inhibidores. Los materiales activos se
administran preferiblemente por vía intravenosa.
Adicionalmente, puede administrarse factor VIII
híbrido humano/porcino mediante transplante de células modificadas
por ingeniería genética para producir el híbrido o mediante
implantación de un dispositivo que contiene dichas células, como se
describe anteriormente.
En una realización preferida, se infunden
composiciones farmacéuticas de factor VIII híbrido humano/porcino
solo o en combinación con estabilizantes, vehículos de suministro
y/o vehículos a pacientes por vía intravenosa según el mismo
procedimiento que se utiliza para la infusión de factor VIII humano
o porcino.
Las dosificaciones de tratamiento de la
composición de factor VIII híbrido humano/porcino que deben
administrarse a un paciente necesitado de dicho tratamiento variarán
dependiendo de la gravedad de la deficiencia de factor VIII.
Generalmente, se ajusta el nivel de dosificación en frecuencia,
duración y unidades según la gravedad y la duración del episodio
hemorrágico de cada paciente. En consecuencia, el factor VIII
híbrido humano/porcino se incluye en el vehículo, vehículo de
suministro o estabilizante farmacéuticamente aceptable en una
cantidad suficiente para suministrar a un paciente una cantidad
terapéuticamente eficaz del híbrido para detener la hemorragia,
medido mediante ensayos estándar de coagulación.
Habitualmente, el nivel plasmático deseado de
factor VIII a alcanzar en el paciente mediante la administración del
factor VIII híbrido humano/porcino está en el intervalo de
30-100% del normal. En un modo de administración
preferido del factor VIII híbrido humano/porcino, la composición se
administra por vía intravenosa a una dosificación preferida en el
intervalo de aproximadamente 20 a 50 unidades/kg de peso corporal;
el intervalo de frecuencia está en el intervalo de aproximadamente 8
a 24 hora (en hemofílicos gravemente afectados); y la duración del
tratamiento en días está en el intervalo de 1 a 10 días o hasta que
se resuelva el episodio hemorrágico. Véase, por ejemplo, Roberts
H.R., y M.R. Jones, "Hemophilia and Related Conditions -
Congenital Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V, and
Factors VII to XII)", cap. 153, 1453-1474, 1460,
en Hematology, Williams, W.J., et al., ed., 1990. Los
pacientes con inhibidores pueden requerir más factor VIII híbrido
humano/porcino, o los pacientes pueden requerir menos factor VIII
híbrido humano/porcino debido a su mayor actividad específica que el
factor VIII humano. Como en el tratamiento con factor VIII humano o
porcino, la cantidad de factor VIII infundida se define mediante el
ensayo de coagulación de factor VIII de una etapa y, en casos
seleccionados, se determina la recuperación in vivo midiendo
el factor VIII en el plasma del paciente después de la infusión. Ha
de entenderse que, para cualquier sujeto particular, los regímenes
de dosificación específicos deben ajustarse frente al tiempo según
la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que
administra o supervisa la administración de las composiciones, y que
los intervalos de concentración indicados en la presente memoria son
sólo ejemplares y no se pretende que limiten el alcance o la
práctica de la composición reivindicada.
El tratamiento puede tomar la forma de una sola
administración intravenosa de la composición o la administración
periódica o continua durante un periodo extendido de tiempo, según
sea necesario. Como alternativa, el factor VIII híbrido
humano/porcino puede administrarse por vía subcutánea u oral con
liposomas en una o varias dosis a intervalos variables de
tiempo.
La molécula de factor VIII híbrido humano/porcino
y los procedimientos para el aislamiento, caracterización,
preparación y uso de la misma que se describen en general
anteriormente se entenderán adicionalmente con referencia a los
siguientes ejemplos no limitantes.
El factor VIII porcino tiene más actividad
coagulante que el factor VIII humano, basándose en la actividad
específica de la molécula. Estos resultados se muestran en la Tabla
II en el ejemplo 4. Esta conclusión está basada en el uso de curvas
patrón apropiadas que permiten comparar bien el factor VIII humano y
porcino. Los ensayos de coagulación están basados en la capacidad
del factor VIII de acortar el tiempo de coagulación de derivado de
plasma de un paciente con hemofilia A. Se emplearon dos tipos de
ensayos: el ensayo de una etapa y de dos etapas.
En el ensayo de una etapa, se incubaron 0,1 ml de
plasma de hemofilia A (Georg King Biomedical, Inc.) con 0,1 ml de
reactivo de tromboplastina parcialmente activada (APTT) (Organon
Teknika) y 0,01 ml de muestra o patrón, constituido por plasma
humano normal citrado diluido, durante 5 min a 37ºC en un baño de
agua. La incubación fue seguida por la adición de 0,1 ml de
CaCl_{2} 20 mM, y se determinó el tiempo de desarrollo de un
coágulo de fibrina mediante inspección visual.
Se define una unidad de factor VIII como la
cantidad presente en 1 ml de plasma humano normal citrado. Con
plasma humano como patrón, se compararon directamente la actividad
de factor VIII porcino y humano. Se realizaron diluciones del patrón
de plasma o proteínas purificadas con NaCl 0,15 M, HEPES 0,02 M, pH
7,4. Se construyó la curva patrón basándose en 3 ó 4 diluciones de
plasma, siendo la dilución mayor 1/50, y representando el tiempo de
coagulación en log10 frente a la concentración plasmática en log10,
lo que da como resultado una gráfica lineal. Se determinaron las
unidades de factor VIII en una muestra desconocida mediante
interpolación de la curva
patrón.
patrón.
El ensayo de una etapa se basa en la activación
endógena del factor VIII mediante activadores formados en el plasma
de hemofilia A, mientras que el ensayo de dos etapas mide la
actividad procoagulante de factor VIII preactivado. En el ensayo de
dos etapas, se añadieron muestras que contenían factor VIII que se
había hecho reaccionar con trombina a una mezcla de tromboplastina
parcialmente activada y plasma humano de hemofilia A que se había
preincubado durante 5 min a 37ºC. Se convirtieron después los
tiempos de coagulación resultantes en unidades/ml, basándose en la
misma curva patrón humana descrita anteriormente. La actividad
relativa en el ensayo de dos etapas fue mayor que en el ensayo de
una etapa debido a que el factor VIII se había preactivado.
Se ha descrito en la bibliografía el aislamiento
de factor VIII porcino y humano derivado de plasma y factor VIII
recombinante humano. Fulcher, C.A. y T.S. Zimmerman, 79 Proc.
Nat'l. Acad. Sci. USA 1648-1652 (1982); Toole,
J.J., et al., 312 Nature 342-347
(1984) (Genetics Institute); Gitschier, J., et al., 312
Nature 326-330 (1984) (Genentech); Wood,
W.I.,. et al., 312 Nature 330-337
(1984) (Genentech); Vehar, G.A., et al., 312 Nature
337-342 (1984) (Genentech); Fass, D.N., et
al., 59 Blood 594 (1982); Toole, J.J., et al., 83
Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 5939-5942 (1986).
Esto puede conseguirse de diversos modos. Todas estas preparaciones
son similares en la composición de subunidades, aunque esta es la
primera descripción de la diferencia funcional entre factor VIII
humano y porcino, no observada anteriormente en parte debido a la
falta de uso de un patrón común con el que compararlos.
Para la comparación de factor VIII recombinante
humano y porcino, se sometieron preparaciones de factor VIII
recombinante humano altamente purificado (Cutter Laboratories,
Berkeley, CA) y factor VIII porcino (inmunopurificado como se
describe en Fass, D.N., et al., 59 Blood 594 (1982)) a
cromatografía líquida de alta presión (HPLC) en una columna de
intercambio aniónico Mono Q™ (Pharmacia-LKB,
Piscataway, NJ) (Pharmacia, Inc.) Los fines de la etapa de HPLC en
Mono Q™ fueron la eliminación de las impurezas minoritarias y el
intercambio de factor VIII humano y porcino en un tampón común con
fines comparativos. Se reconstituyeron viales que contenían
1000-2000 unidades de factor VIII con 5 ml de
H_{2}O. Se añadió después Hepes (2 M a pH 7,4) a una concentración
final de 0,02 M. Se aplicó factor VIII a una columna Mono Q™ HR 5/5
equilibrada con NaCl 0,15 M, Hepes 0,02 M, CaCl_{2} 5 mM a pH 7,4
(tampón A más NaCl 0,15 M); se lavó con 10 ml de tampón A + NaCl
0,15 M; y se eluyó con un gradiente lineal de 20 ml de NaCl 0,15 M a
0,90 M en tampón A a un caudal de 1 ml/min.
Para comparación del factor VIII humano (derivado
de plasma y purificado mediante HPLC en Mono Q™) y factor VIII
porcino, se diluyó 1:4 factor VIII porcino derivado de plasma
purificado por inmunoafinidad con Hepes 0,04 M, CaCl_{2} 5 mM,
Tween-80 al 0,01% a pH 7,4, y se sometió a HPLC en
Mono Q™ en las mismas condiciones descritas en el párrafo anterior
para el factor VIII humano. Estos procedimientos para el aislamiento
de factor VIII humano y porcino son estándar para los expertos en la
técnica.
Se ensayó la actividad del factor VIII en las
fracciones de columna mediante un ensayo de coagulación de una
etapa. Se dan los resultados promedio de los ensayos, expresados en
unidades de actividad por A_{280} del material en la Tabla I, y se
indica que el factor VIII porcino tiene al menos seis veces más
actividad que el factor VIII humano cuando se utiliza el ensayo de
una etapa.
| Actividad (U/A_{280}) | ||
| Porcino | 21.300 | |
| Humano derivado de plasma | 3.600 | |
| Recombinante humano | 2.400. |
Los resultados del ensayo de una etapa para el
factor VIII reflejan la activación del factor VIII a factor VIIIa en
la muestra y posiblemente la pérdida de actividad del factor VIIIa
formado. Se realizó una comparación directa de la estabilidad de
factor VIII humano y porcino. Se diluyeron las muestras de HPLC en
Mono Q™ a la misma concentración y se hizo reaccionar la composición
en tampón con trombina. Se retiraron en diversos momentos muestras
para el ensayo de coagulación de dos etapas. Típicamente, la
actividad máxima (a los 2 min) fue 10 veces mayor para factor VIIIa
porcino que para humano, y las actividades tanto de factor VIIIa
porcino como humano se redujeron posteriormente, reduciéndose más
rápidamente la actividad del factor VIIIa humano.
Generalmente, los intentos de aislar factor VIIIa
humano estable no son exitosos incluso cuando se utilizan
condiciones que producen factor VIIIa porcino estable. Para
demostrar esto, se activó factor VIII humano purificado mediante
HPLC con Mono Q™ con trombina y se sometió a HPLC de intercambio
catiónico en Mono-S™ (Pharmacia, Inc.) en
condiciones que producen un factor VIIIa porcino estable (Lollar,
J.S., y Parker, C.G., 28 Biochemistry 666, 1989, cuyas
enseñanzas se incorporan a la presente memoria).
Se hizo reaccionar factor VIII humano, 43
\mug/ml (0,2 \muM), en NaCl 0,2 M, Hepes 0,01 M, CaCl_{2} 2,5
M a pH 7,4 en 10 ml de volumen total con trombina (0,036 \muM)
durante 10 min, en cuyo momento se añadió
FPR-CH_{2}Cl,
D-fenilprolilarginilclorometilcetona, a una
concentración de 0,2 \muM para la inactivación irreversible de la
trombina. Se diluyó después la mezcla 1:1 con ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) 40 mM, CaCl_{2}
5 mM a pH 6,0, y se cargó a 2 ml/min en una columna de HPLC Mono S™
HR 5/5 equilibrada con MES 5 mM, CaCl_{2} 5 mM a pH 6,0 (tampón B)
más NaCl 0,1 M. Se eluyó el factor VIIIa sin lavado de columna con
20 ml de un gradiente desde NaCl 0,1 M a NaCl 0,9 M en tampón B a 1
ml/min.
Se eluyó la fracción con actividad coagulante en
el ensayo de dos etapas en forma de un solo pico en estas
condiciones. La actividad específica de la fracción de pico fue
aproximadamente de 7.500 U/A_{280}. La electroforesis en gel de
poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio
(SDS-PAGE) del pico de factor VIIIa en Mono S™,
seguido de tinción con plata de la proteína, reveló dos bandas
correspondientes a un derivado heterodimérico
(A3-C1-C2/A1) del factor VIII.
Aunque el fragmento A2 no se identificó mediante tinción con planta
en estas condiciones debido a su baja concentración, se identificó
como un oligoconstituyente mediante marcaje con ^{125}I.
En contraposición con los resultados con factor
VIII humano, el factor VIIIa porcino aislado mediante HPLC en Mono
S™ en las mismas condiciones tenía una actividad específica de 1,6 a
10[ ] U/A_{280}. El análisis del factor VIIIa porcino mediante
SDS-PAGE reveló 3 fragmentos correspondientes a las
subunidades A1, A2 y A3-C1-C2,
demostrando que el factor VIIIa porcino posee las tres
subunidades.
Los resultados de la HPLC en Mono S™ de
preparaciones de factor VIII humano activado con trombina a pH 6,0
indican que el factor VIIIa humano es lábil en condiciones que
proporcionan factor VIIIa porcino estable. Sin embargo, a pesar de
que se identificaron cantidades traza de fragmento de A2 en la
fracción de pico, la determinación de si la actividad coagulante
daba como resultado pequeñas cantidades de factor VIIIa
heterotrimérico o de factor VIIIa heterodimérico que tuviera una
baja actividad específica no fue posible con este procedimiento
solo.
Es deseable un modo de aislar factor VIIIa humano
antes de que pierda su subunidad A2 para resolver esta cuestión. Con
este fin, se realizó el aislamiento en un procedimiento que implica
la reducción del pH de los tampones Mono S™ a pH 5. Se diluyó el
factor VIII humano purificado (0,5 mg) en Mono Q™ con H_{2}O,
proporcionando una composición final de 0,25 mg/ml (1 \muM) de
factor VIII en NaCl 0,25 M, Hepes 0,01 M, CaCl_{2} 2,5 mM,
Tween-80 al 0,005% a pH 7,4 (volumen total 7,0 ml).
Se añadió trombina a una concentración final de 0,072 \muM y se
dejó reaccionar durante 3 min. Se inactivó después la trombina con
FPR-CH_{2}Cl (0,2 \muM). Se diluyó después la
mezcla 1:1 con acetato de sodio 40 mM, CaCl_{2} 5 mM,
Tween-80 al 0,01% a pH 5,0, y se cargó a 2,0 ml/min
en una columna Mono S™ HR 5/5 equilibrada con acetato de sodio 0,01
M, CaCl_{2} 5 mM, Tween-80 al 0,01% a pH 5,0, más
NaCl 0,1 M. Se eluyó el factor VIIIa sin lavado de columna con 20 ml
de un gradiente de NaCl 0,1 M a NaCl 1,0 M en el mismo tampón a 1
ml/min. Esto dio como resultado la recuperación de la actividad
coagulante en un pico que contenía cantidades detectables del
fragmento A2, como se muestra por SDS-PAGE y tinción
con plata. La actividad específica de la fracción de pico era diez
veces mayor que la recuperada a pH 6,0 (75.000 U/A_{280}) frente a
7.500 U/A_{280}). Sin embargo, en contraposición con el factor
VIIIa porcino aislado a pH 6,0, que es indefinidamente estable a
4ºC, la actividad del factor VIIIa humano se redujo constantemente
durante un periodo de varias horas después de la elución de Mono S™.
Adicionalmente, la actividad específica del factor VIIIa purificado
a pH 5,0 y ensayado inmediatamente es sólo un 5% de la del factor
VIIIa porcino, indicando que ocurrió una disociación sustancial
antes del ensayo.
Estos resultados demuestran que tanto el factor
VIIIa humano como porcino están compuestos por tres subunidades (A1,
A2 y A3-C1-C2). La disociación de la
subunidad A2 es responsable de la pérdida de actividad tanto del
factor VIIIa humano como porcino en ciertas condiciones, tales como
fuerza iónica, pH y concentración fisiológicos. La estabilidad
relativa del factor VIIIa porcino en ciertas condiciones es debida a
la mayor asociación de la subunidad A2.
Se aislaron cadenas ligeras de factor VIII
porcino y cadenas pesadas de factor VIII humano de la siguiente
manera. Se añadió una solución de EDTA 0,5 M a pH 7,4 a factor VIII
porcino purificado con Mono Q™ a una concentración final de 0,05 M,
y se dejó reposar a temperatura ambiente durante
18-24 h. Se añadió un volumen igual de
histidina-Cl 10 mM, EDTA 10 mM, Tween 80 al 0,02%
v/v a pH 6,0 (tampón B), y se aplicó la solución a 1 ml/min a una
columna Mono S™ HR 5/5 previamente equilibrada con tampón A más NaCl
0,25 M. Las cadenas pesadas del factor VIII no se unieron a la
resina, a juzgar por la SDS-PAGE. La cadena ligera
del factor VIII se eluyó con un gradiente lineal de 20 ml de NaCl
0,1-0,7 M en tampón A a 1 ml/min, y era homogénea
según SDS-PAGE. Se aislaron cadenas pesadas del
factor VIII mediante HPLC en Mono Q™ del modo siguiente. Las cadenas
pesadas del factor VIII no se adsorben en Mono S™ durante la
purificación de cadenas ligeras del factor VIII. Se ajustó el
material total que contenía cadenas pesadas del factor VIII a pH 7,2
mediante la adición de tampón Hepes 0,5 M, pH 7,4, y se aplicó a una
columna de HPLC Mono Q™ HR 5/5 equilibrada con NaCl 0,1 M, Hepes
0,02 M, Tween-80 al 0,01%, pH 7,4. Se lavó la
columna con 10 ml de este tampón, y se eluyeron las cadenas pesadas
del factor VIII con un gradiente de 20 ml de NaCl
0,1-1,0 M en este tampón. Se aislaron las cadenas
ligeras y cadenas pesadas humanas de la misma manera.
Se reconstituyeron las cadenas ligeras y pesadas
humanas y porcinas según las siguientes etapas. Se mezclaron 10
\mul de cadena ligera del factor VIII humano o porcino 100
\mug/ml en NaCl 1 M, Hepes 0,02 M, CaCl_{2} 5 mM,
Tween-80 al 0,01%, pH 7,4 con (1) 25 \mul de
cadena pesada heteróloga, 60 \mug/ml, en el mismo tampón; (2) 10
\mul de Hepes 0,02 M, Tween-80 al 0,01%, pH 7,4;
(3) 5 \mul de CaCl_{2} 0,6 M durante 14 h a temperatura
ambiente. Se diluyó la mezcla 1/4 con MES 0,02 M,
Tween-80 al 0,01%, CaCl_{2} 5 mM, pH 6, y se
aplicó a Mono S™ HR 5/5 equilibrada con NaCl 0,1 M, MES 0,02 M,
Tween-80 al 0,01%, CaCl_{2} 5 mM, pH 6,0. Se
corrió un gradiente de 20 ml de NaCl 0,1-1,0 M en el
mismo tampón a 1 ml/min, y se recogieron fracciones de 0,5 ml. Se
leyó la absorbancia a 280 nm de las fracciones, y se ensayó con la
absorbancia de las fracciones la actividad del factor VIII mediante
el ensayo de coagulación de una etapa. Las cadenas pesadas estaban
presentes en exceso debido a que la cadena ligera (no asociada a la
cadena pesada) se une también a Mono S™; el exceso de cadenas
pesadas asegura que las cadenas ligeras libres no son parte de la
preparación. Se realizaron los experimentos de reconstitución
seguidos de purificación mediante HPLC en Mono S™ con las cuatro
combinaciones posibles de cadenas: cadena ligera humana/cadena
pesada humana, cadena ligera humana/cadena pesada porcina, cadena
ligera porcina/cadena pesada porcina, cadena ligera porcina/cadena
pesada humana. La Tabla II muestra que el factor VIII de cadena
ligera humana/cadena pesada porcina tiene una actividad comparable
al factor VIII porcino nativo (Tabla I), indicando que los elementos
estructurales en la cadena pesada porcina son responsables de la
actividad coagulante aumentada del factor VIII porcino comparado con
el factor VIII humano.
| Actividad (U/A_{280}) | |
| Cadena ligera porcina/cadena pesada porcina | 30.600 |
| Cadena ligera humana/cadena pesada porcina | 44.100 |
| Cadena ligera porcina/cadena pesada humana | 1.100 |
| Cadena ligera humana/cadena pesada humana | 1.000 |
Se han secuenciado sólo el dominio B y parte del
dominio A2 del factor VIII porcino (Toole, J.J., et al., 83
Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 5939-5942
(1986)), SEC Nº ID 5. La secuencia de ADN genómico del dominio B del
factor VIII porcino y la secuencia de ADNc del dominio A2 completo
del factor VIII porcino se dan a conocer en la presente memoria, SEC
Nº ID 2 y SEC Nº ID 1, respectivamente.
Se clonó el dominio A2 del factor VIII porcino
mediante transcripción inversa de ARN total de bazo porcino y
amplificación por PCR; se utilizaron cebadores degenerados basados
en la secuencia de ADNc conocida del factor VIII humano y un cebador
porcino exacto basado en una parte de la secuencia del factor VIII
porcino. Se aisló un producto de PCR de 1 kb y se amplificó mediante
inserción en un vector fagémido Bluescript™ (Stratagene).
Se secuenció completamente el dominio A2 porcino
mediante secuenciación didesoxi. La secuencia es como se describe en
la SEC Nº ID 1.
Se ha descrito la secuencia del factor VIII
humano en la bibliografía (Toole, J.J., et al., 312
Nature 342-347 (1984) (Genetics Institute);
Gitschier, J., et al., 312 Nature
326-330 (1984) (Genetech); Wood, W.I., et
al., 312 Nature 330-337 (1984)
(Genentech); Vehar, G.A., et al., 312 Nature
337-342 (1984) (Genentech)). La secuencia es como se
describe en la SEC Nº ID 3.
Preparar factor VIII recombinante híbrido
humano/porcino requiere eliminar una región del ADNc de factor VIII
humano (Biogen Corp.) e insertar la secuencia de ADNc porcino
homóloga. Posteriormente, se expresa el ADNc híbrido en un sistema
de expresión apropiado. En estos experimentos, se elimina por
ejemplo la secuencia de ADNc completa correspondiente al dominio A2
del factor VIII humano mediante mutagénesis mediada por
oligonucleótidos, un procedimiento conocido habitualmente por los
expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, J., E.F.
Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, capítulo 15, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring
Harbor, 1989).
Las etapas fueron las siguientes: se
transformaron células CJ236 de E. coli con el fago
Bluescript™ que contiene el inserto de ADNc de factor VIII humano.
Se produjo Bluescript™/ADN circular de factor VIII humano
monocatenario con el fago auxiliar M13K07 y después se purificó
mediante procedimientos estándar (Sambrook, J., E.F. Fritsch, y T.
Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, capítulo 4,
Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1989). Se sintetizó un
oligonucleótido mutagénico correspondiente al extremo 3' del dominio
A1 y al extremo 5' del dominio A3:
5' CCTTCCTTTATCCAAATACGTAGATCAAGAGGAAATTGAC
3'.
Adicionalmente, este oligonucleótido proporciona
un sitio de restricción SnaB1 que puede utilizarse para insertar el
dominio A2 porcino. Con la hibridación de este oligonucleótido con
Bluescript™/factor VIII humano monocatenario, se "eliminó por
bucle" la región entre los dominios A1 y A3, concretamente el
dominio A2. El heterodúplex resultante se extendió a ADN circular
bicatenario mediante el uso de polimerasa T7, se ligó y se utilizó
para transformar células XL1-blue™ de E. coli
(Stratagene). Se examinaron los transformantes mediante el
aislamiento de ADN de fagémido de varias colonias, digestión con
Xhol y examen del tamaño del ADN de fagémido mediante electroforesis
en gel de agarosa. Se identificaron tres clones que eran más cortos
que el factor VIII humano/Bluescript™ por 1 kb, como se esperaba por
la deleción del dominio A2 de 1 kb. Se confirmaron los resultados
secuenciando por los límites de los dominios A1 y A3.
Se ha insertado el dominio A2 porcino entre los
dominios A1 y A3 de ADNc del factor VIII humano mediante (1)
amplificación por PCR del dominio A2 porcino; (2) purificación en
gel del producto de PCR (electroforesis en gel de agarosa del
producto de PCR, produciendo una banda visualizada mediante tinción
con bromuro de etidio, seguido de escisión de la banda y
purificación del ADN para eliminar la agarosa y otros
contaminantes); y (3) ligamiento utilizando ADN ligasa T4 de ADNc de
A2 porcino con el ADNc sin dominio A2 humano linealizado utilizando
el sitio de restricción SnaB1. Los cebadores utilizados para
amplificación por PCR del A2 porcino fueron los siguientes:
Cebador 5': 5' GTAGCGTTGCCAAGAAGCACCCTAAGACG
3'
Cebador 3': 5'
GAAGAGTAGTACGAGTTATTTCTCTGGGTTCAATGAC 3'
El cebador 3' contiene nucleótidos
correspondientes a los restos 736-740 de la
secuencia proteica del factor VIII porcino (en la terminación C del
dominio A2 (SEC Nº ID 2), y a los restos 1649-1656
de la secuencia del factor VIII humano (en la terminación N del
dominio A3) (SEC Nº ID 4). Se incluyeron los restos de la secuencia
de A3 porque el procedimiento de eliminación por bucle eliminó estos
residuos. Se utilizó el producto ligado para transformar células
XL1-Blue, produciendo varias colonias que contenían
el inserto de A2 porcino deseado cuando se analizaba mediante PCR.
El producto contiene una timina indeseada en la unión
A1-A2 como resultado de la amplificación por PCR del
dominio A2 porcino. Esta base individual puede eliminarse por bucle
utilizando el oligonucleótido mutagénico
5' CCTTTATCCAAATACGTAGCGTTTGCCAAGAAG 3'
y el producto puede clonarse
exactamente como se describe anteriormente (en el ejemplo 6, párrafo
3) para la producción de ADNc deficiente en A2
humano.
La clonación de los dominios A1, A3, C1 y C2
porcinos es factible con la misma estrategia que se utilizó para
clonar el dominio A2 porcino. Pueden clonarse fragmentos de estos
dominios mediante la técnica de mutagénesis con eliminación por
bucle. La escisión de los dominios correspondientes en el factor
VIII humano y cualquier fragmento del mismo, incluyendo
eliminaciones aminoacídicas individuales, es factible mediante
mutagénesis con eliminación por bucle como se describe
anteriormente. Todas las posibles sustituciones de dominio,
sustituciones de fragmentos de dominio o sustituciones de restos
aminoacídicos individuales son posibles mediante este enfoque.
La actividad biológica del factor VIII
recombinante híbrido humano/porcino puede evaluarse inicialmente
mediante el uso de un sistema de expresión transitorio mamífero en
células COS. El ADNc híbrido humano/porcino puede transfectarse a
células COS, y puede analizarse en los sobrenadantes la actividad
del factor VIII mediante el uso de ensayos de coagulación de una
etapa y de dos etapas como se describen anteriormente en el ejemplo
1. Adicionalmente, la actividad del factor VIII puede medirse
mediante el uso de un ensayo de sustrato cromogénico, que es más
sensible y permite el análisis de gran número de muestras. Este
ensayo se ha descrito (Lollar, P., G.J. Knutson y D.N. Fass, 24
Biochemistry 8056-8064, 1985). Ensayos
similares son estándar en el ensayo de la actividad del factor VIII
(Wood, W.I., et al., 312 Nature
330-337, 1984; Toole, J.J., et al., 312
Nature 342-347, 1984). La expresión del
factor VIII recombinante en células COS es un procedimiento estándar
(Toole, J.J., et al., 312 Nature
342-347, 1984; Pittman, D.D. y R.J. Kaufman, 85
Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 2429-2433,
1988). El ADNc de factor VIII humano utilizado como material de
partida para las moléculas recombinantes descritas en la presente
memoria se ha expresado en células COS, proporcionando un producto
con actividad biológica. Este material se utilizará como patrón para
comparar moléculas de factor VIII híbrido humano/porcino. La
actividad en los ensayos se convierte en actividad específica para
comparación apropiada de las moléculas híbridas. Para esto, es
necesaria una medida de la masa del factor VIII producido mediante
las células, y puede realizarse mediante inmunoensayo con factor
VIII humano y/o porcino purificado como patrones. Los inmunoensayos
para el factor VIII son rutinarios para los expertos en la técnica
(véase, por ejemplo, Lollar, P., et al., 71 Blood
137-143, 1988).
Las secuencias de factor VIII humano y porcino
que están más probablemente implicadas como epítopos (concretamente
como sitios de reconocimiento para anticuerpos inhibidores) pueden
determinarse mediante el uso de programas informáticos de predicción
comercialmente disponibles, tales como MacVector (IBI Corp., New
Haven, CT). Se identificarán las secuencias de factor VIII porcino
que no son antigénicas comparadas con las correspondientes
secuencias humanas antigénicas (homólogas), y se harán sustituciones
para insertar secuencias porcinas y eliminar secuencias humanas
según procedimientos estándar de ADN recombinante. Es ya conocido
que el factor VIII porcino reacciona menos que el factor VIII humano
con algunos anticuerpos inhibidores; esto proporciona una base para
la terapia actual de pacientes con inhibidores. Después de preparar
los híbridos recombinantes, se ensayará in vitro la
reactividad con el ensayo de inhibidor Bethesda. Aquellos
constructos que sean menos reactivos que el factor VIII humano
nativo y el factor VIII porcino nativo serán candidatos para la
terapia de sustitución.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Lollar, John S.
\hskip3,9cm Runge, Marschall S.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Factor VIII híbrido humano/porcino
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- REMITENTE: Kilpatrick & Cody
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1100 Peachtree Street, Suite 2800
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUIDAD: Atlanta
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Georgia
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- C. POSTAL: 30309-4530
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con PC de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/864004
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-ABR-1992
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Pabst, Patrea L.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 31.284
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE REFERENCIA/AGENTE: EMU 106PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 404-815-6508
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 404-815-6555
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1130 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SIN SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: porcino
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: sangre
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 367 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SIN SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: porcino
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: bazo
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9009 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SIN SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: hígado
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 5001..7053
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / note="Dominio estructural: equivalente al dominio A3-C1-C2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- RASGO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..2277
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: / note="Dominio estructural: equivalente al dominio A1-A2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2332 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SIN SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: secuencia de ADNc hepático
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1260 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SIN SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: porcino
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC Nº ID 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1090 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SIN SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: porcino
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 6:
Claims (24)
1. Una molécula de factor VIII híbrido purificado
que comprende secuencias aminoacídicas porcinas y humanas, en la que
la molécula tiene actividad procoagulante en un ensayo de
coagulación in vitro, y en la que la molécula se selecciona
del grupo constituido por:
una molécula constituida por un factor VIII
humano en el que el dominio A2 porcino está sustituido por el
dominio A2 del factor VIII humano homólogo;
una molécula constituida por un factor VIII
porcino en el que el dominio A2 humano está sustituido por el
dominio A2 del factor VIII porcino homólogo;
una molécula constituida por una subunidad de
cadena ligera humana del factor VIII y una de subunidad cadena
pesada porcina del factor VIII; y
una molécula constituida por una subunidad de
cadena ligera porcina del factor VIII y una subunidad de cadena
pesada humana del factor VIII.
2. La molécula de la reivindicación 1, en la que
la molécula tiene una actividad específica mayor de 20.000
U/A_{280} de proteína en solución acuosa cuando se utiliza plasma
humano como patrón en un ensayo de coagulación de una etapa.
3. La molécula de la reivindicación 1, en la que
la molécula está constituida por un factor VIII humano en el que el
dominio A2 porcino está sustituido por el dominio A2 del factor VIII
humano.
4. La molécula de la reivindicación 1, en la que
la molécula está constituida por un factor VIII porcino en el que el
dominio A2 humano está sustituido por el dominio A2 del factor VIII
porcino homólogo.
5. La molécula de la reivindicación 1, en la que
la molécula está constituida por una subunidad de cadena ligera del
factor VIII humano y una subunidad de cadena pesada del factor VIII
porcino.
6. La molécula de la reivindicación 1, en la que
la molécula está constituida por una subunidad de cadena ligera del
factor VIII porcino y un subunidad de cadena pesada del factor VIII
humano.
7. Una composición farmacéutica que comprende un
factor VIII híbrido humano/porcino según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en combinación con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
8. La composición de la reivindicación 7, en la
que el vehículo se selecciona del grupo constituido por agentes
estabilizantes y vehículos de suministro.
9. La composición de la reivindicación 8, en la
que los agentes estabilizantes se seleccionan del grupo constituido
por proteínas y polisacáridos.
10. La composición de la reivindicación 7, que
comprende adicionalmente factores de coagulación seleccionados del
grupo constituido por factor de von Villebrand, factores de
coagulación dependientes de vitamina K y factor coagulante
tisular.
11. La composición de la reivindicación 8, en la
que los vehículos de suministro son liposomas.
12. Un procedimiento de preparación de un factor
VIII híbrido humano/porcino que comprende
combinar una secuencia aminoacídica primaria
derivada de factor VIII porcino con una secuencia aminoacídica
primaria derivada de factor VIII humano para formar una molécula de
factor VIII híbrido que tiene actividad procoagulante en un ensayo
de coagulación in vitro,
en el que la molécula se selecciona del grupo
constituido por:
una molécula constituida por una subunidad de
cadena ligera de factor VIII humano y una subunidad de cadena pesada
de factor VIII porcino; y
una molécula constituida por una subunidad de
cadena ligera de factor VIII porcino y una subunidad de cadena
pesada de factor VIII humano.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que la molécula de factor VIII híbrido humano/porcino se forma
aislando y purificando subunidades de cadena pesada y ligera de
factor VIII humano y factor VIII porcino, mezclando las subunidades
humanas y porcinas para formar el factor VIII híbrido
humano/porcino.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que las subunidades del factor VIII humano y porcino se aíslan de
plasma humano y porcino.
15. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que la molécula de factor VIIII híbrido humano/porcino se forma
mezclando subunidades de cadena ligera de factor VIII humano y
subunidades de cadena pesada de factor VIII porcino.
16. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que la molécula de factor VIII híbrida humana/porcina se forma
mezclando subunidades de cadena ligera de factor VIII porcino y
subunidades de cadena pesada de factor VIII humano.
17. Un procedimiento de preparación de factor
VIII híbrido humano/porcino purificado que comprende
expresar ADN recombinante que codifica dominios
en las subunidades de cadena ligera y pesada de factor VIII porcino
y humano para formar el factor VIII híbrido humano/porcino
purificado que tiene secuencia aminoacídica primaria derivada del
factor VIII porcino y secuencia aminoacídica primaria derivada del
factor VIII humano, y que tiene actividad procoagulante en un ensayo
de coagulación in vitro.
18. El procedimiento de la reivindicación 17, en
el que la molécula de factor VIII híbrido humano/porcino se forma
sustituyendo el dominio A2 porcino en el factor VIII humano.
19. El procedimiento de la reivindicación 17, en
el que el factor VIII híbrido humano/porcino se forma sustituyendo
el dominio A2 humano en factor VIII porcino.
20. Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica la molécula de factor VIII híbrido humano/porcino según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
21. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 20, en la que la molécula carece del dominio B.
22. El uso de una molécula de factor VIII híbrido
humano/porcino según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en
la fabricación de un medicamento para tratar deficiencia de factor
VIII humano en un sujeto.
23. El uso de la reivindicación 22, en el que el
sujeto tiene anticuerpos contra el factor VIII que inhiben la
actividad coagulante.
24. El uso según la reivindicación 23, en el que
la actividad coagulante de la molécula de factor VIII híbrido
humano/porcino no está inhibida por los anticuerpos contra el factor
VIII.
Applications Claiming Priority (2)
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