DE69334003T2 - Hybrider Faktor VIII aus Sequenzen von Mensch und Schwein - Google Patents

Hybrider Faktor VIII aus Sequenzen von Mensch und Schwein Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen einen Schwein-Faktor VIII.
  • Blutgerinnung beginnt, wenn Plättchen an die verwundete Wand eines verletzten Blutgefäßes an einer Läsionsstelle anhaften. Anschließend werden in einer Kaskade von enzymatisch regulierten Reaktionen lösliche Fibrinogenmoleküle durch das Enzym Thrombin in unlösliche Stränge von Fibrin umgewandelt, das die Plättchen in einem Thrombus zusammenhält. In jedem Schritt der Kaskade wird ein Proteinvorläufer in eine Protease umgewandelt, die den nächsten Proteinvorläufer in der Reihe spaltet. In den meisten Schritten werden Cofaktoren benötigt. In seiner aktiven Form ist der Proteinfaktor VIII ein Cofaktor, der für die Aktivierung von Faktor X durch die Protease, aktiviertem Faktor IX, benötigt wird.
  • Faktor VIII oder antihämophiler Faktor wurde im Plasma bemerkt und in den 30er Jahren des 20. Jahrhunderts benannt. In den 40er Jahren des 20. Jahrhunderts wurde ein Mangel in Faktor VIII mit der Gerinnungsstörung Hämophilie A assoziiert. Es wurde gefunden, dass Faktor VIII X-verbunden war, und es wurde angenommen, dass er ein Protein ist. Arbeiten, die Plasma vom Rind, Mensch und Schwein einschlossen, identifizierten Faktor VIII als ein Protein in den 80er Jahren des 20. Jahrhunderts, obwohl seine definitive zelluläre Quelle ungewiss bleibt.
  • Wie Faktor VIII genau in der Blutkoagulation funktioniert, ist unbekannt. Es ist bekannt, dass Faktor VIII zu Faktor VIIIa proteolytisch durch Thrombin oder Faktor Xa aktiviert wird. In Kombination mit Calcium und Phopholipid macht Faktor VIIIa Faktor IXa durch einen unbekannten Mechanismus zu einem effizienteren Aktivator von Faktor X.
  • Menschen, denen Faktor VIII fehlt oder die Antikörper gegen Faktor VIII aufweisen, die nicht mit Faktor VIII behandelt werden, leiden an unkontrollierter innerer Blutung, die eine Reihe von ernsten Symptomen verursachen kann, von Entzündungsreaktionen in Gelenken bis zu frühem Tod. Schwere Bluter, deren Zahl ungefähr 10.000 in den Vereinigten Staaten erreicht, können mit einer Infusion von Faktor VIII behandelt werden, welche die normale Gerinnungsfähigkeit des Blutes wiederherstellen wird, wenn sie mit ausreichender Frequenz und Konzentration verabreicht wird. Tatsächlich ist die klassische Definition von Faktor VIII jene Substanz, die in normalem Blutplasma anwesend ist, die den Gerinnungsdefekt in Plasma, das von Individuen mit Hämophilie A stammt, korrigiert.
  • Einige Präparationen von Faktor VIII aus Plasma vom Mensch mit unterschiedlichen Reinheitsgraden sind kommerziell für die Behandlung von Hämophilie A erhältlich. Diese schließen einen teilweise gereinigten Faktor VIII, der aus vereinigtem Blut von vielen Donoren stammt, das gegen Viren hitze- und detergensbehandelt ist, aber eine signifikante Menge an antigenen Proteinen enthält; einen mit monoklonalem Antikörper gereinigten Faktor VIII, der niedrigere Mengen an antigenen Verunreinigungen und viraler Kontamination aufweist; und einen rekombinanten Faktor VIII vom Mensch, für den klinische Versuche auf dem Weg sind, ein. Zusätzlich steht eine Präparation von teilweise gereinigtem Faktor VIII vom Schwein zur Verfügung, um Patienten mit Inhibitoren gegenüber Faktor VIII vom Mensch zu behandeln, d.h. jene, die zirkulierende Antikörpermoleküle aufweisen, die Faktor VIII vom Mensch binden und neutralisieren.
  • Bluter benötigen den täglichen Austausch von Faktor VIII, um die deformierende hämophile Arthropathie zu verhindern, die nach vielen Jahren von wiederkehrenden Blutungen in den Gelenken auftritt. Jedoch waren die Vorräte von Faktor VIII-Konzentraten aufgrund von Problemen in der kommerziellen Herstellung und der therapeutischen Verwendung nie ausreichend genug, um Bluter angemessen zu behandeln. Zum Beispiel ist der für gewöhnlich verwendete, von Plasma stammende, schwierig zu isolieren und zu reinigen, er ist immunogen und benötigt Behandlung, um das Infektionsrisiko von AIDS und Hepatitis Viren zu entfernen. Rekombinanter Faktor VIII vom Mensch kann die zwei letztgenannten Probleme verringern. Faktor VIII vom Schwein kann auch eine Alternative darstellen, weil Faktor VIII vom Mensch bei physiologischen Konzentrationen und pH instabil ist, im Blut in einer extrem niedrigen Konzentration (0,02 μg/ml Plasma) vorliegt, und seine spezifische Gerinnungsaktivität ist niedrig im Vergleich mit Faktor VIII vom Schwein.
  • Weil viele Inhibitoren von Faktor VIII vom Mensch weniger stark mit Faktor VIII vom Schwein reagieren, wird Faktor VIII vom Schwein gegenwärtig verwendet, um Faktor VIII-Mangel in Patienten unter Bedingungen zu korrigieren, in denen sie nicht auf Infusionen mit Faktor VIII vom Mensch ansprechen. Eine Beschränkung des Faktor VIII vom Schwein ist die Entwicklung von gegen ihn gerichteten inhibitorischen Antikörpern nach einer oder mehreren Infusionen.
  • Die Probleme, die mit dem gegenwärtig verwendeten, kommerziell erhältlichen Faktor VIII, der aus Plasma stammt, assoziiert sind, haben ein signifikantes Interesse an der Entwicklung eines besseren Faktor VIII-Produkts stimuliert. Es besteht eine Notwendigkeit für ein wirksameres Faktor VIII-Molekül, so dass mehrere Einheiten von Gerinnungsaktivität pro Molekül transportiert werden können; einem Faktor VIII-Molekül, das bei einem gewählten pH und physiologischen Konzentrationen stabil ist; einem Faktor VIII-Molekül, das weniger dazu neigt, inhibitorische Antikörper zu bilden; und einem Faktor VIII-Molekül, das der Immundetektion in Patienten ausweicht, die bereits Antikörper gegenüber Faktor VIII vom Mensch erworben haben.
  • Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Faktor VIII bereitzustellen, der Hämophilie in einem Patienten korrigiert, der einen Mangel an Faktor VIII aufweist oder der Inhibitoren gegenüber Faktor VIII vom Mensch besitzt.
  • Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Faktor VIII mit einer gesteigerten Wirksamkeit in Faktor VIII-Gerinnungsassays bereitzustellen.
  • Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Faktor VIII bereitzustellen, der bei einem gewählten pH und physiologischer Konzentration stabil ist.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Verfahren zur Herstellung von hochgereinigtem hybridem Schwein-Faktor VIII werden beschrieben mit dem Schritt: (b) Konstruktion von Domänen von Faktor VIII vom Schwein durch rekombinante DNA-Technologie.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 (Stand der Technik) ist eine schematische Darstellung des Faktor VIII-Moleküls, welche die Untereinheiten (schwere und leichte Kette) und die Domänen zeigt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • -Definitionen
  • "Spezifische Aktivität", wie hier verwendet, betrifft die Aktivität, die den Koagulationsdefekt von Faktor VIII-defizientem Plasma vom Mensch korrigiert. Spezifische Aktivität wird in Einheiten von Gerinnungsaktivität pro Milligramm Gesamt Faktor VIII-Protein in einem Standardassay gemessen, in dem die Gerinnungszeit von Faktor VIII-defizientem Plasma vom Mensch mit der von normalem Plasma vom Mensch verglichen wird. Eine Einheit von Faktor VIII-Aktivität ist die Aktivität, die in einem Milliliter normalem Plasma vom Mensch anwesend ist. Je kürzer die Zeit für Gerinnungsbildung in dem Assay ist, desto größer ist die Aktivität des untersuchten Faktor VIII.
  • "Faktor VIII-Mangel", wie hier verwendet, schließt den Mangel in Gerinnungsaktivität ein, der durch Bildung eines defekten Faktor VIII, durch unangemessene oder keine Bildung von Faktor VIII oder durch teilweise oder vollständige Inhibition von Faktor VIII durch Inhibitoren verursacht wird. Hämophilie A ist eine Art von Faktor VIII-Mangel, die aus einem Defekt in einem X-gekoppelten Gen und der Abwesenheit oder dem Mangel des Faktor VIII-Proteins, den es kodiert, resultiert.
  • "Untereinheiten" von Faktor VIII vom Mensch oder Schwein, wie hier verwendet, sind die schweren und leichten Ketten des Proteins. Die schwere Kette von Faktor VIII enthält drei "Domänen", A1, A2 und B. Die leichte Kette von Faktor VIII enthält auch drei "Domänen", A3, C1 und C2.
  • Figure 00060001
  • Der Faktor VIII vom Schwein wurde isoliert und aus Plasma gereinigt (Fass, D.N., et al., 59 Blood 594 (1982)). Die Aminosäuresequenz der B- und eines Teils der A2-Domänen des Faktor VIII vom Schwein, wie durch Toole, J.J., et al., 83 Proc. Nat'I. Acad. Sci. USA 5939-5942 (1986) berichtet, deren Lehren hier eingeschlossen sind, und die korrespondierende genomische DNA-Sequenz sind unten gezeigt. Die kodierende Region in der Nukleotidsequenz beginnt an Position 675 (GGT CTC TGG ...), die den Aminosäuren (Gly-Leu-Tyr), den NH2 terminalen Aminosäuren entspricht.
    Figure 00080001
  • Figure 00090001
  • Figure 00100001
  • Figure 00110001
  • Figure 00120001
  • Figure 00130001
  • Figure 00140001
  • Figure 00150001
  • Beide Faktor VIII vom Schwein und Mensch werden aus Plasma als ein Protein mit zwei Untereinheiten isoliert. 1 (Stand der Technik) illustriert als Diagramm die Untereinheitstruktur des Moleküls. Die Untereinheiten, die als die schwere Kette und leichte Kette bekannt sind, werden durch eine nicht kovalente Bindung zusammengehalten, die Calcium oder andere divalente Metallionen benötigt. Die schwere Kette von Faktor VIII enthält drei Domänen, A1, A2 und B, die kovalent verknüpft sind. Die leichte Kette von Faktor VIII enthält auch drei Domänen, die als A3, C1 und C2 bezeichnet werden. Die B-Domäne weist keine bekannte Funktion auf und kann von dem Molekül proteolytisch oder durch rekombinante DNA-Technologieverfahren ohne signifikante Veränderung in irgendeinem messbaren Parameter von Faktor VIII entfernt werden. Der rekombinante Faktor VIII vom Mensch weist eine ähnliche Struktur und Funktion wie der von Plasma stammende Faktor VIII auf, obwohl er nicht glykosyliert ist, es sei denn er wird in Säugetierzellen exprimiert.
  • Beide aktivierte Faktor VIII (Faktor VIIIa) vom Mensch und Schwein weisen drei Untereinheiten aufgrund der Spaltung der schweren Kette zwischen den A1- und A2-Domänen auf. Diese Struktur wird als A1/A2/A3-C1-C2 bezeichnet. Faktor VIIIa vom Mensch ist nicht stabil unter den Bedingungen, die Faktor VIIIa vom Schwein stabilisieren. Dies liegt an der schwächeren Assoziation der A2-Untereinheit des Faktor VIIIa vom Mensch. Die Dissoziation der A2-Untereinheit des Faktor VIIIa vom Mensch und Schwein ist mit Aktivitätsverlust assoziiert.
  • Weil die Nukleotidsequenz der B-Domäne vom Schwein bekannt ist, können Gesamtlängenhybride konstruiert werden. Einzelne Domänen der Faktor VIII-cDNA vom Schwein können kloniert und durch die entsprechenden Domänen vom Mensch durch etablierte Mutagenesetechniken substituiert werden. Diese Faktor VIII-cDNA-Moleküle können in Expressionsvektoren für anschließende Expression von aktiven Hybriden Mensch/Schwein-Faktor VIII-Proteinmolekülen kloniert werden.
  • Die vollständige A2-Domäne des Faktor VIII vom Schwein, die homolog ist zu den Resten 372–740 im reifen Faktor VIII vom Mensch wurde sequenziert, und die Aminosäuresequenz wurde vorhergesagt. Diese Sequenzen sind unten gezeigt.
  • Figure 00180001
  • Figure 00190001
  • Beispiel 1: Assay für Faktor VIII vom Schwein
  • Faktor VIII vom Schwein besitzt mehr koagulierende Aktivität als Faktor VIII vom Mensch, was auf der spezifischen Aktivität des Moleküls beruht. Diese Ergebnisse sind in Tabelle II in Beispiel 4 gezeigt. Diese Schlussfolgerung beruht auf der Verwendung von geeigneten Standardkurven, die es erlauben, den Faktor VIII vom Mensch und Schwein gerecht zu vergleichen. Koagulierungsassays beruhen auf der Fähigkeit von Faktor VIII die Gerinnungszeit vom Plasma, das von einem Patienten mit Hämophilie A stammt, zu verkürzen. Zwei Arten von Assays wurden verwendet: der einstufige und der zweistufige Assay.
  • In dem einstufigen Assay wurde 0,1 ml Hämophilie A Plasma (George King Biomedical, Inc.) mit 0,1 ml aktiviertem teilweisem Thromboplastin Reagens (APTT) (Organon Teknika) und 0,01 ml Probe oder Standard, bestehend aus verdünntem normalem Zitratplasma vom Mensch für 5 min bei 37°C in einem Wasserbad inkubiert. Die Inkubation wurde gefolgt von Hinzufügen von 0,1 ml 20 mM CaCl2, und die Zeit für die Entwicklung einer Fibringerinnung wurde durch visuelle Beobachtung bestimmt.
  • Eine Einheit von Faktor VIII ist definiert als die Menge, die in 1 ml normalem Zitratplasma vom Mensch anwesend ist. Mit Plasma vom Mensch als dem Standard wurde Faktor VIII-Aktivität vom Schwein und Mensch direkt verglichen. Es wurden Verdünnungen des Plasmastandards oder der gereinigten Proteine in 0,15 M NaCl, 0,02 M HEPES, pH 7,4 hergestellt. Die Standardkurve wurde beruhend auf 3 oder 4 Verdünnungen von Plasma hergestellt, die höchste Verdünnung ist 1/50, und eine log10 Gerinnungszeit wurde gegen die log10 Plasmakonzentration aufgetragen, was zu einem linearen Plot führte. Die Einheiten von Faktor VIII in einer unbekannten Probe wurden durch Interpolation von der Standardkurve bestimmt.
  • Der einstufige Assay beruht auf endogener Aktivierung von Faktor VIII durch Aktivatoren, die in dem Hämophilie A Plasma gebildet werden, wohingegen der zweistufige Assay die prokoagulierende Aktivität von präaktiviertem Faktor VIII misst.
  • In dem zweistufigen Assay wurden Proben mit Faktor VIII, der mit Thrombin umgesetzt worden waren, zu einer Mischung von aktiviertem teilweisem Thromboplastin und Hämophilie A Plasma vom Mensch, das für 5 min bei 37°C präinkubiert worden war, hinzugefügt. Die resultierenden Gerinnungszeiten wurden anschließend in Einheiten/ml, beruhend auf derselben Standardkurve vom Mensch, die oben beschrieben ist, umgewandelt. Die relative Aktivität in dem zweistufgen Assay war höher als die in dem einstufigen Assay, weil der Faktor VIII präaktiviert worden war.
  • Beispiel 2 Charakterisierung des funktionalen Unterschieds zwischen Faktor VIII vom Mensch und Schwein
  • Die Isolierung von Faktor VIII, der von Plasma stammt, vom Schwein und Mensch und rekombinanter Faktor VIII vom Mensch wurden in der Literatur beschrieben. Fulcher, C. A. und T. S. Zimmerman, 79 Proc. Natl'I. Acad. Sci. USA 1648-1652 (1982); Toole, J.J., et al., 312 Nature 342–347 (1984) (Genetics Institute); Gitschier, J., et al., 312 Nature 326–330 (1984) (Genentech); Wood, W.I., et al., 312 Nature 330–337 (1984) (Genentech); Vehar, G.A., et al., 312 Nature 337–342 (1984) (Genentech); Fass, D.N., et al., 59 Blood 594 (1982); Toole, J.J. et al., 83 Proc. Nat'I. Acad. Sci. USA 5939–5942 (1986). Dies kann über verschiedene Wege erreicht werden. Alle diese Präparationen sind ähnlich in der Untereinheitzusammensetzung, obwohl dies die erste Beschreibung von funktionalen Unterschieden zwischen Faktor VIII vom Mensch und Schwein ist, die zuvor nicht bemerkt wurde, teilweise weil die Verwendung eines gemeinsamen Standards, durch den sie verglichen werden können, bei der Verwendung fehlte.
  • Zum Vergleich von rekombinantem Faktor VIII vom Mensch und Faktor VIII vom Schwein wurden Präparationen von hochgereinigtem rekombinantem Faktor VIII vom Mensch (Cutter Laboratories, Berkeley, CA) und Faktor VIII vom Schwein (immunogereinigt wie in Fass, D.N., et al., 59 Blood 594 (1982) beschrieben) einer Hochdruck Flüssigchromatographie (HPLC) über eine Mono QTM (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) Anionenaustauschsäule (Pharmacia, Inc.) unterzogen. Der Zweck des Mono QTM HPLC Schritts war die Eliminierung von kleinen Verunreinigungen und der Austausch von Faktor VIII vom Mensch und Schwein in einem gemeinsamen Puffer für Vergleichszwecke. Die Gefäße, die 1000–2000 Einheiten von Faktor VIII enthielten, wurden mit 5 ml H2O rekonstituiert. Hepes (2 M bei pH 7,4) wurde anschließend in einer Endkonzentration von 0,02 M hinzugefügt. Der Faktor VIII wurde auf eine Mono QTM HR 5/5 Säule aufgetragen, die in 0,15 M NaCl, 0,02 M Hepes, 5 mM CaCl2 bei pH 7,4 (Puffer A plus 0,15 M NaCl) äquilibriert worden war; mit 10 ml Puffer A + 0,15 M NaCl gewaschen; und mit einem 20 ml linearen Gradienten, 0,15 M bis 0,90 M NaCl in Puffer A bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert.
  • Zum Vergleich von Faktor VIII vom Mensch (stammt von Plasma und wurde über Mono QTM HPLC gereinigt) und Faktor VIII vom Schwein, immunoaffinitätsgereinigt, stammt vom Plasma des Schweins, wurde 1:4 mit 0,04 M Hepes, 5 mM CaCl2, 0,01 % Tween-80 bei pH 7,4 verdünnt und einer Mono QTM HPLC unter denselben Bedingungen, die in dem vorherigen Absatz für Faktor VIII vom Mensch beschrieben sind, unterzogen. Diese Verfahren für die Isolierung von Faktor VIII vom Mensch und Schwein sind Standard für den Fachmann.
  • Säulenfraktionen wurden hinsichtlich Faktor VIII-Aktivität durch einen einstufigen Koagulationsassay untersucht. Die durchschnittlichen Ergebnisse der Assays, ausgedrückt in Einheiten von Aktivität pro A280 des Materials, sind in Tabelle 1 angegeben, und sie zeigen, dass Faktor VIII vom Schwein eine mindestens sechsmal größere Aktivität als Faktor VIII vom Mensch aufweist, wenn der einstufige Assay verwendet wird. Tabelle I: VERGLEICH VON KOAGULIERENDER AKTIVITÄT VON FAKTOR VIII VOM MENSCH UND SCHWEIN
    Aktivität (U/A280)
    Schwein 21.300
    Mensch, vom Plasma stammend 3.600
    Mensch rekombinant 2.400
  • Beispiel 3: Vergleich der Stabilität von Faktor VIIIa vom Mensch und Schwein
  • Die Ergebnisse des einstufigen Assays für Faktor VIII reflektieren die Aktivierung von Faktor VIII zu Faktor VIIIa in der Probe und möglicherweise den Verlust der gebildeten Faktor VIIIa-Aktivität. Ein direkter Vergleich der Stabilität von Faktor VIII vom Mensch und Schwein wurde angestellt. Proben von der Mono QTM HPLC wurden auf dieselbe Konzentration und Pufferzusammensetzung verdünnt und mit Thrombin umgesetzt. Zu verschiedenen Zeiten wurden Proben für den zweistufigen Koagulationsassay entnommen. Typischerweise war die Spitzenaktivität (bei 2 min) 10-fach größer für Faktor VIIIa vom Schwein als vom Mensch, und die Aktivitäten für beide Faktor VIIIa vom Schwein und vom Mensch fielen anschließend ab, wobei die Faktor VIIIa-Aktivität vom Mensch schneller abnahm.
  • Im Allgemeinen sind Versuche, stabilen Faktor VIIIa vom Mensch zu isolieren nicht erfolgreich, selbst wenn die Bedingungen verwendet werden, die einen stabilen Faktor VIIIa vom Schwein liefern. Um dies zu zeigen, wurde Mono QTM HPLC gereinigter Faktor VIIIa vom Mensch mit Thrombin aktiviert und einer Mono STM Kationenaustausch (Pharmacia, Inc.) HPLC unter Bedingungen, die stabilen Faktor VIIIa vom Schwein bilden, unterzogen (Lollar, J.S., und Parker, C.G., 28 Biochemistry 666, 1989, deren Lehren hier eingeschlossen sind).
  • Faktor VIII vom Mensch, 43 μg/ml (0,2 μM) in 0,2 M NaCl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCl2 bei pH 7,4, in 10 ml Gesamtvolumen wurde mit Thrombin (0,036 μM) für 10 min umgesetzt, zu dieser Zeit wurde FPR-CH2Cl D-Phenyl-prolyl-arginylchlormethylketon in einer Konzentration von 0,2 μM zur irreversiblen Inaktivierung von Thrombin hinzugefügt. Die Mischung wurde anschließend 1:1 mit 40 mM 2-(N-Morpholin)ethansulfonsäure (MES, 5 mM CaCl2 bei pH 6,0 verdünnt und bei 2 ml/min auf eine Mono STM HR 5/5 HPLC Säule geladen, die in 5 mM MES, 5 mM CaCl2 bei pH 6,0 (Puffer B) plus 0,1 M NaCl äquilibriert worden war. Der Faktor VIIIa wurde ohne die Säule zu waschen mit einem 20 ml Gradient von 0,1 M NaCl bis 0,9 M NaCl in Puffer B bei 1 ml/min eluiert.
  • Die Fraktion mit koagulierender Aktivität in dem zweistufigen Assay eluierte als eine einzelne Spitze unter diesen Bedingungen. Die spezifische Aktivität der Spitzenfraktion war ungefähr 7.500 U/A280. Eine Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) der Mono STM Faktor VIIIa-Spitze, gefolgt durch Silberfärbung des Proteins zeigte zwei Banden, die einem heterodimeren (A3-C1-C2/A1) Derivat von Faktor VIII entsprachen. Obwohl das A2-Fragment durch Silberfärbung unter diesen Bedingungen aufgrund seiner geringen Konzentration nicht identifiziert wurde, wurde es als ein Spurenbestandteil durch 125I-Markierung identifiziert.
  • Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit Faktor VIII vom Mensch wies Faktor VIIIa vom Schwein, der durch Mono STM HPLC unter denselben Bedingungen isoliert wurde, eine spezifische Aktivität von 1,6 × 106 U/A280 auf. Diese Analyse von Faktor VIIIa vom Schwein durch SDS-PAGE zeigte drei Fragmente, die A1, A2 und A3-C1-C2 Untereinheiten entsprachen, was zeigte, dass Faktor VIIIa vom Schwein drei Untereinheiten aufweist.
  • Die Ergebnisse der Mono STM HPLC der Thrombin aktivierten Faktor VIII-Präparation vom Mensch bei pH 6,0 zeigt, dass Faktor VIIIa vom Mensch unter Bedingungen, die zu stabilem Faktor VIIIa vom Schwein führten, labil ist. Obwohl Spurenmengen des A2-Fragments in der Spitzenfraktion identifiziert wurden, ist die Bestimmung ob die koagulierende Aktivität von geringen Mengen des heterotrimeren Faktor VIIIa oder vom heterodimeren Faktor VIIIa, der eine geringe spezifische Aktivität aufweist, stammt, aus diesem Verfahren alleine jedoch nicht möglich.
  • Ein Weg, den Faktor VIIIa vom Mensch zu isolieren, bevor er seine A2-Untereinheit verliert, ist wünschenswert, um diese Frage zu lösen. Deshalb wurde eine Isolierung in einem Verfahren durchgeführt, das Reduktion des pH des Mono STM Puffers auf pH 5 einschließt. Mono QTM gereinigter Faktor VIII vom Mensch (0,5 mg) wurde mit H2O verdünnt, um eine Endzusammensetzung von 0,25 mg/ml (1 μM) Faktor VIII in 0,25 M NaCl, 0,01 M Hepes, 2,5 mM CaCl2, 0,005 % Tween-80 bei pH 7,4 (Gesamtvolumen 7,0 ml) zu ergeben. Thrombin wurde in einer Endkonzentration von 0,072 μM hinzugefügt und für 3 min umgesetzt. Thrombin wurde anschließend mit FPR-CH2Cl (0,2 μM) inaktiviert. Die Mischung wurde anschließend 1:1 mit 40 mM Natriumacetat, 5 mM CaCl2, 0,01 % Tween-80 bei pH 5,0 verdünnt und bei 2 ml/min auf eine Mono STM HR 5/5 HPLC Säule geladen, die in 0,01 M Natriumacetat, 5 mM CaCl2, 0,01 % Tween-80 bei pH 5,0 plus 0,1 M NaCl äquilibriert worden war. Der Faktor VIIIa wurde ohne die Säule zu waschen mit einem 20 ml Gradient von 0,1 M NaCl bis 1,0 M NaCl in demselben Puffer bei 1 ml/min eluiert. Dies führte zu der Gewinnung von koagulierender Aktivität in einer Spitze, die nachweisbare Mengen des A2-Fragments enthielt, wie durch SDS-PAGE und Silberfärbung gezeigt wurde. Die spezifische Aktivität der Spitzenfraktion war zehnfach größer als jene, die bei pH 6,0 (75.000 U/A280 gegenüber 7.500 U/A280) gewonnen wurde. Im Gegensatz zu Faktor VIIIa vom Schwein, der bei pH 6,0 isoliert wurde, der bei 4°C unendlich stabil ist, nahm der Faktor VIIIa vom Mensch jedoch ständig über einen Zeitraum von einigen Stunden nach Elution von der Mono STM ab. Zusätzlich ist die spezifische Aktivität von Faktor VIIIa, der bei pH 5,0 gereinigt und sofort untersucht wurde, nur 5 % von der des Faktor VIIIa vom Schwein, was zeigt, dass substantielle Dissoziation vor dem Assay aufgetreten war.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass beide Faktor VIIIa vom Mensch und Schwein aus drei Untereinheiten (A1, A2 und A3-C1-C2) zusammengesetzt sind. Die Dissoziation der A2-Untereinheit ist verantwortlich für den Verlust von Aktivität von beiden Faktor VIIIa vom Mensch und Schwein unter bestimmten Bedingungen, wie physiologischer Ionenstärke, pH und Konzentration. Die relative Stabilität von Faktor VIIIa vom Schwein unter bestimmten Bedingungen liegt an der stärkeren Assoziation der A2-Untereinheit.
  • Beispiel 4: Isolierung und Sequenzierung der A2-Domäne des Faktor VIII vom Schwein
  • Nur die B-Domäne und Teil der A2-Domäne des Faktor VIII vom Schwein wurden kürzlich sequenziert (Toole, J.J., et al., 83 Proc. Nat'I. Acad. Sci. USA 5939-5942 (1986)). Die genomische DNA-Sequenz der Faktor VIII B-Domäne vom Schwein und die cDNA-Sequenz für die gesamte Faktor VIII A2-Domäne vom Schwein sind hier offenbart.
  • Die Faktor VIII A2-Domäne vom Schwein wurde durch reverse Transkription von Milz Gesamt RNA vom Schwein und PCR Amplifikation kloniert; degenerierte Primer, die auf der bekannten Faktor VIII-cDNA-Sequenz vom Mensch beruhen und ein exakter Primer vom Schwein, der auf einem Teil der Faktor VIIIa-Sequenz vom Schwein beruht, wurden verwendet. Ein 1 kb PCR-Produkt wurde isoliert und durch Insertion in einen BluescriptTM (Stratagene) Phagemid Vektor amplifiziert.
  • Die A2-Domäne vom Schwein wurde vollständig durch Didesoxysequenzierung sequenziert. Die Sequenz lautet wie vorstehend beschrieben.
  • Sequenz-Listing
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Claims (1)

  1. Isolierte Nukleinsäuresequenz, welche die Faktor VIII A2-Domäne von Schwein, umfassend die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR.: 2, kodiert.
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