ES2331909T3 - Factor viii estabilizado con enlaces disulfuro modificados geneticamente. - Google Patents
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Abstract
Un factor VIII mutante que comprende al menos un par de cisteínas localizadas en restos seleccionados del grupo que consiste en Met662-Asp1828 y Tyr664-Thr1826.
Description
Factor VIII estabilizado con enlaces disulfuro
modificados genéticamente.
La presente invención se refiere a métodos para
introducir uno o más restos cisteína en un polipéptido que permite
la estabilización del polipéptido mediante la formación de al menos
un enlace, preferiblemente un enlace disulfuro, entre diferentes
dominio del polipéptido. La invención también se refiere a un
polipéptido que contiene dicho resto o restos cisteínas
introducidos, a ácido nucleicos que codifican dichos polipéptidos,
y a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos polipéptidos o
ácidos nucleicos. La invención también se refiere a vectores,
partículas víricas y células hospedantes que contienen dichos ácidos
nucleicos, y a métodos que los utilizan para producir los
polipéptidos de la invención.
Se conocen muchos polipéptidos que son el
producto de la expresión de un único gen. Una serie de estos
polipéptidos se han sintetizado en un principio como una única
cadena polipeptídica, pero contienen múltiples dominios plegados de
forma independiente que se someten a una proteolisis limitada (o a
una o varias rupturas proteolíticas) in vivo que puede dar
como resultado la separación de los dominios debido a la disociación
de los productos de ruptura. Se ha demostrado que la proteolisis
que produce la separación de los dominios altera la estabilidad y/o
las actividades enzimáticas o funcionales de una diversidad de estas
proteínas. Los ejemplos de estas proteínas incluyen proteínas
plasmáticas, como las implicadas en la coagulación sanguínea.
Tal como se conoce en la técnica, la coagulación
sanguínea comienza cuando las plaquetas se adhieren a la pared de
un vaso sanguíneo dañado en un sitio de lesión. Posteriormente, en
una cascada de reacciones reguladas enzimáticamente, las moléculas
de fibrinógeno solubles son convertidas por la enzima trombina en
cadenas insolubles de fibrina que mantienen juntas a las plaquetas
en un trombo. En cada etapa de la cascada, un precursor de proteasa
se convierte en una proteasa que rompe el siguiente precursor de
proteína en la serie. Se requieren cofactores en la mayoría de las
etapas. En su forma activa, la proteína del factor VIII es un
cofactor que es necesario para la activación del factor X por la
proteasa, el factor activado IX.
El factor VIII puede ser activado para formar el
factor VIIIa (en el que "a" indica "activado") de manera
proteolítica por la trombina o el factor Xa. En combinación con el
calcio y fosfolípidos, el factor VIIIa hace que el factor IXa sea
un activador más eficaz del factor X mediante un mecanismo que aún
no se comprende por completo.
Las personas deficientes en el factor VIII o que
tienen anticuerpos contra el factor VIII que no son tratadas con el
factor VIII sufren sangrados internos incontrolados que pueden
provocar una gama de síntomas graves, desde reacciones
inflamatorias en las articulaciones a una muerte temprana. Los
hemofílicos graves, que en EEUU son aproximadamente 10.000, pueden
tratarse con una infusión del factor VIII, que restablece la
capacidad de coagulación normal de la sangre si se administra con la
frecuencia y la concentración suficientes.
Varias preparaciones de factor VIII derivado de
plasma humano o recombinante de diversos grados de pureza están
disponibles en el mercado para el tratamiento de la hemofilia A.
Éstas incluyen un factor VIII parcialmente purificado derivado de
sangre reunida de muchos donantes que está tratada con detergentes y
con calor para destruir los virus pero que contiene un nivel
significativo de proteínas antigénicas; un factor VIII purificado
con anticuerpos monoclonales que tiene unos niveles menores de
impurezas antigénicas y contaminación vírica; y el factor VIII
humano recombinante.
Los hemofílicos requieren la reposición diaria
del factor VIII para evitar la artropatía hemofílica deformante que
se produce después de muchos años de hemorragias recurrentes en las
articulaciones. Sin embargo, los suministros de concentrados del
factor VIII nunca han sido suficientes para tratar a los hemofílicos
de forma adecuada, debido a los problemas en la producción
comercial y el uso terapéutico. Por ejemplo, el factor VIII derivado
de plasma que se utiliza habitualmente es difícil de aislar y
purificar, es inmunogénico, y requiere un tratamiento para eliminar
el riesgo de infectividad por el virus del SIDA y de la hepatitis.
El factor VIII porcino también puede ser una alternativa, pero una
limitación en el factor VIII porcino es el desarrollo de anticuerpos
inhibidores contra éste después de una o más infusiones.
El factor VIII activado (FVIIIa) es
termodinámicamente inestable bajo condiciones fisiológicas debido a
la tendencia del dominio A2 a disociarse del resto del complejo. En
otras palabras, el FVIII activado se inactiva espontáneamente. Si
esta disociación pudiese evitarse en las preparaciones
farmacológicas de FVIII o FVIIIa, podría realizarse una
administración menos frecuente y/o a menor concentración. Esto
podría producir una serie de beneficios, como ahorro de costes, un
menor uso de personal médico, y una mejor calidad de vida para los
hemofílicos.
Otra proteína plasmática, además del factor
VIII, es la protrombina. Como parte de la cascada de la coagulación,
la protrombina se convierte en trombina por la acción del complejo
de protrombinasa (FXa, FVa y Ca^{2+}). En la protrombina humana,
esta conversión implica la ruptura en Arg271 y Arg284, entre el
dominio F2 y la cadena A de trombina, y en Arg320, entre las
cadenas A y B (sistema de numeración humano). In vivo, la
protrombinasa rompe primero la protrombina en Arg320, produciendo la
meizotrombina. La meizotrombina libre es un intermedio inestable, y
la autolisis en el enlace Arg155-Ser156 elimina
rápidamente el dominio F1 para generar meizotrombina (des F1), que
lentamente se convierte en trombina mediante las rupturas en Arg271
y Arg284. En presencia de trombomodulina y vesículas de
fosfolípidos de fosfatidilserina/fosfatidilcolina (PCPS), la
meizotrombina y la meizotrombina (des F1) son mejores activadores de
la proteína C que la trombina (41, 42).
Otra proteína plasmática es el factor V. El
factor V de la coagulación humano (FV) es una proteína de PM
330.000, que está compuesta por seis dominios de tres tipos en el
orden
A1-A2-B-A3-C1-C2
(4). La trombina rompe el FV para eliminar la mayor parte del
dominio B y producir FV activado (FVa). El FVa humano está compuesto
por una cadena pesada (A1-A2, restos
1-709) y una cadena ligera
(A3-C1-C2, restos
1546-2196), que forma un complejo no covalente (5).
El FVa es un cofactor no enzimático para el factor Xa (FXa) en el
complejo de protrombinasa, que convierte la protrombina en
trombina, en presencia de fosfolípidos cargados negativamente (6).
La inactivación del FVa es un proceso complejo que implica rupturas
por APC (proteína C activada) del FVa en Arg506, Arg306 y Arg679.
La ruptura en Arg506 es más rápida que la ruptura en Arg306 e
inactiva sólo parcialmente el FVa, mientras que la ruptura en
Arg306 inactiva completamente el FVa y provoca la disociación de los
fragmentos del dominio A2 (7-10). El FVa totalmente
inactivado pierde su capacidad para unirse a FXa (11).
Otra proteína plasmática es el factor XII. El
FXII humano es una proteína monocatenaria con un PM de 76.000 y 596
aminoácidos. Contiene, en orden desde el N-terminal
al C-terminal, un dominio fibronectina de tipo II,
un dominio EGF, un dominio fibronectina de tipo I, un dominio EGF,
un dominio Kringle, un dominio serina-proteasa de
tipo tripsina. Existen al menos dos formas del factor XII activado
(FXIIa). El \alphaFXIIa está formado por la ruptura del enlace
tras Arg353, generando una molécula bicatenaria formada por una
cadena pesada (353 restos) y una cadena ligera (243 restos)
mantenidas juntas por un enlace disulfuro. Una posterior ruptura
produce FXIIa (fragmento de FXIIa). Esto es el resultado de la
ruptura en Arg334 y Arg343, que produce dos cadenas polipeptídicas
(9 y 243 restos) que se mantienen juntas mediante un enlace
disulfuro (43, 44). La mayor parte del fragmento de cadena pesada
N-terminal ya no está asociado. La unión negativa a
superficies/membranas es mediada a través de esta cadena pesada, de
forma que el fragmento FXIIa resultante ya no se une a superficies
pero aún es catalíticamente
activo.
activo.
La proteína HGFA (activador del factor del
crecimiento de hepatocitos) tiene la misma estructura de dominios
que el FXII (45) y también es activada por la ruptura proteolítica,
pero en este caso sólo la trombina la rompe sólo en Arg407 (46),
homóloga a la Arg353 en FXII. Pero la posterior ruptura por
calicreína en Arg372 también produce la liberación de la cadena
pesada N-terminal que, al igual que en FXII, está
implicada en la unión a superficies (47). Como se sabe en la
técnica, la HGFA activa el factor del crecimiento de hepatocitos
(HGF) dentro de tejidos lesionados en los que el HGF desempeña un
papel en la reparación de tejidos a través de una actividad mitógena
hacia una diversidad de tipos celulares.
Se conoce otro polipéptido de tipo FXII con dos
nombres: PHBP (proteína de unión de hialuronina plasmática) (48) y
proteasa activadora de FVII (49). La PHBP es una
serina-protesa y es homóloga a HGFA aunque la
estructura de dominios no es exactamente la misma (49, 50). Esta
proteína activa FVII, uPA y tPA en sistemas experimentales, pero el
papel fisiológico no se ha establecido (49, 50).
La patente de la invención describe cómo se
puede introducir en un polipéptido uno o más restos cisteína para
permitir la formación de un enlace, como un enlace disulfuro, entre
dos o más dominios del polipéptido. La colocación de cada enlace o
enlaces disulfuro permite conseguir resultados, como la
estabilización del polipéptido. Esta estabilización pueden dar como
resultado el mantenimiento prolongado de actividades deseadas del
polipéptido no disociado o puede evitar actividades no deseadas del
polipéptido disociado.
Los polipéptidos útiles en la invención son
aquellos que son sintetizados en la naturaleza como una única
cadena polipeptídica, en general como el producto de la expresión de
un sólo gen, y que contienen múltiples dominios plegados de forma
independiente que se someten a una proteolisis limitada que puede
dar como resultado la separación de los dominios debido a la
disociación. Los ejemplos de dichos polipéptidos incluyen proteínas
plasmáticas, incluyendo el activador del factor del crecimiento de
hepatocitos y la proteína de unión de hialuronina plasmática, así
como factores de la coagulación sanguínea, como el factor VIII, el
factor V, el factor XII y la protrombina.
Los polipéptidos mutantes de la invención (es
decir, aquellos polipéptidos en los cuales se ha introducido una o
más cisteínas) incluyen no sólo aquellos en que los dominios que
están unidos se sintetizan a partir de una única secuencia de ácido
nucleico (por ejemplo, a partir de un único gen, ADNc o secuencia
codificadora sintética o semisintética), sino también aquellos en
que los dominios que están unidos se sintetizan a partir de
secuencias de ácidos nucleicos diferenciadas (o separadas) (por
ejemplo, a partir de secuencias que codifican polipéptidos que
comprenden cada uno de los dominios unidos, cuyas secuencias pueden
o no estar presentes en una molécula de ácido nucleico contigua).
En este último caso, los dominios pueden unirse entre sí después de
la síntesis, tanto in vivo como in vitro.
Los polipéptidos mutantes preferidos de la
invención son aquellos que tengan una mayor estabilidad y/o
mantienen unas actividades enzimáticas o funcionales deseables
durante un periodo de tiempo mayor, comparados con el
correspondiente polipéptido no mutado. En un aspecto de la
invención, se proporciona un factor VIII mutante que comprende al
menos un par de cisteínas colocadas en restos seleccionados del
grupo que consiste en Met662-Asp1828 y
Tyr664-Thr1826.
La invención describe un método para estabilizar
un polipéptido, que es el producto de un único gen en la
naturaleza, mediante la introducción de una o más cisteínas que
comprende las etapas de: (a) obtener o crear una estructura
tridimensional del polipéptido; (b) predecir uno o más sitios para
la introducción de una o más cisteínas basándose en la estructura
tridimensional; y (c) crear uno o más mutantes de dicho polipéptido
mediante la introducción de una o más cisteínas en uno o más de los
sitios predichos; en el que la introducción de dicha una o más
cisteínas permite la formación de al menos un puente disulfuro
intramolecular, intradominio, que aumenta la estabilidad del
polipéptido mutante, comparada con la del polipéptido que no
contiene dicha uno o más cisteínas introducidas.
La invención también describe un polipéptido que
es el producto de un único gen en la naturaleza que se ha mutado
mediante la introducción de al menos una cisteína; en el que la
introducción de dicha cisteína permite la formación de al menos un
puente disulfuro intramolecular, intradominio, con otra cisteína que
aumenta la estabilidad del polipéptido mutante, comparada con la
del polipéptido que no contiene dicha cisteína introducida.
Otro aspecto de la invención se refiere a
composiciones que comprenden los polipéptidos de la invención,
incluyendo las composiciones farmacéuticas que comprenden los
polipéptidos de la invención y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
La invención también se refiere a ácidos
nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención, incluyendo
los vectores que contienen dichos ácidos nucleicos. La invención
también se refiere a partículas víricas que contienen dichos ácidos
nucleicos y/o vectores. La invención también se refiere a células
hospedantes que contienen dichos ácidos nucleicos, vectores y
partículas víricas. La invención también se refiere a composiciones
(incluyendo composiciones farmacéuticas) que contienen los ácidos
nucleicos, los vectores, las partículas víricas y/o las células
hospedantes de la invención.
La invención también se refiere a composiciones
farmacéuticas o medicamentos para tratar individuos con los
polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores, partículas víricas o
células hospedantes de la invención y/o sus composiciones
farmacéuticas.
La figura 1 es una representación esquemática de
moléculas FV con el dominio B recombinante delecionado. La figura 1A
es una representación esquemática de la secuencia primaria de
FV\DeltaB (factor V humano con el dominio B delecionado),
indicándose las localizaciones de los diferentes dominios. La figura
1B es una representación esquemática que muestra el FV\DeltaB
activado (FVa), un heterodímero de la cadena pesada
N-terminal y la cadena ligera
C-terminal asociado en presencia de iones de
Ca^{2+}. Las flechas indican los sitios de ruptura en FVa por APC.
La figura 1C es una representación esquemática que muestra los
fragmentos de ruptura producidos tras la inactivación de FVa (FVaI)
por APC, y también muestra los sitios de las mutaciones de cisteína
que producen (His609-Glu1691) y no producen
(Leu238-Gln590) la formación de enlaces
disulfuro.
La figura 2 son inmunotransferencias de diversos
mutantes de FVa y FVai. (A) Inmunotransferencias reveladas con un
anticuerpo monoclonal anti-cadena ligera de FV. Las
muestras en los carriles 1 a 6 no fueron reducidas, y las de los
carriles 7 a 12 fueron reducidas. Carriles 1 y 7,
2183A-FVa; carriles 2 y 8,
2183A-FVai; carriles 3 y 9,
A2-SS-A3-FVa;
carriles 4 y 10,
A2-SS-A3-FVai;
carriles 5 y 11,
Q506-A2-SS-A3-FVa;
carriles 6 y 12,
Q506-A2-SS-A3-FVai.
(B) Inmunotransferencias reveladas con anticuerpos policlonales
anti-cadena pesada de FV. Carril 1,
A2-SS-A3-FVa no
reducido; carril 2,
A2-SS-A3-FVai no
reducido; carril 3,
A2-SS-A3-FVa
reducido; carril 4,
A2-SS-A3-FVai
reducido; carril 5,
Q506-A2-SS-A3-FVa
no reducido; carril 6,
Q506-A2-SS-A3-FVai
no reducido; carril 7,
Q506-A2-SS-A3-FVa
reducido; carril 8,
Q506-A2-SS-A3-FVai
reducido. Las posiciones de las bandas para los fragmentos
entrecruzados y no entrecruzados se indican a la derecha de cada
transferencia. LC = cadena ligera, HC = cadena pesada, A1 = dominio
A1, A2 = dominio A2, A2c = fragmento C-terminal del
dominio A2 (restos 507-679). Las posiciones de los
marcadores de peso molecular (kDa, patrones Novex SeeBlue) se
indican a la izquierda.
La figura 3 es una representación esquemática
que ilustra la prevención de la disociación del dominio A2 del
factor VIIIa heterotrimérico mediante la introducción de un enlace
disulfuro entre los dominios A2 y A3, o los dominios A2 y A1, de
FVIIIa.
La figura 4 es una representación esquemática
que muestra la acción esperada de APC sobre el FVIIIa mutante que
contiene un enlace disulfuro entre restos cisteínas introducidos en
las posiciones que corresponden a Met662-Asp1828 en
un mutante, o Tyr664-Thr1826 en otro mutante, y que
muestra los sitio de ruptura de APC en los restos Arg336 y
Arg562.
La figura 5 muestra la estabilidad de mutantes
de doble cisteína del factor VIIIa. Se ensayaron mutantes de tipo
salvaje recombinantes y mutantes de doble cisteína de FVIIIa a lo
largo del tiempo para la actividad en un ensayo APTT. Las especies
FVIIIa se indican: tipo salvaje (+), C662-C1828
(\Delta), C664-C1826 (\circ). En el momento del
inicio aproximadamente 500 mU/ml de FVIII se trataron con trombina
5,4 nM y después, tras un minuto, se añadió hirudina a 1 U/ml para
inactivar la trombina. Entonces se retiraron muestras a los tiempos
indicados y se ensayaron para el resto de actividad FVIIIa en el
ensayo APTT.
La figura 6 es una representación esquemática
que ilustra la introducción de un enlace disulfuro en la protrombina
humana para estabilizar su forma de meizotrombina o meizotrombina
(des F1), evitando la conversión de la meizotrombina o meizotrombina
(des F1) en alfa-trombina
(\alpha-IIa). Leyendas: GLA, dominio Gla; Kr.1,
dominio Kringle 1; Kr.2, dominio Kringle 2;
Meizo-IIa, meizotrombina. La protrombina y la
Meizo-IIa se muestran con un enlace disulfuro
introducido entre el dominio Kringle 2 y el dominio proteasa formado
por la introducción de una cisteína en un resto
N-terminal a su sitio de ruptura en el resto 271 del
dominio Kringle 2, y la introducción de una cisteína en un resto
C-terminal al sitio de ruptura en el resto 320 en el
dominio proteasa. El enlace disulfuro entre los restos cisteína 293
y 439 está presente en la proteína natural.
La figura 7 es una descripción de los números de
registro y las referencias bibliográficas relacionadas utilizadas
como fuente para las secuencias de aminoácidos, con notas que
conciernen al sistema de numeración para los mutantes del factor
VIII, factor V, protrombina, factor XII, HGFA y PHBP descritos en
los ejemplos en la presente.
La figura 8 son páginas web de SwissProt nº de
registro P00451 que contienen la secuencia de aminoácidos del factor
VIII humano e información relacionada.
La figura 9 son páginas web de SwissProt nº de
registro P12259 que contienen la secuencia de aminoácidos del factor
V humano e información relacionada.
La figura 10 son páginas web de SwissProt nº de
registro P00734 que contienen la secuencia de aminoácidos de la
protrombina humana e información relacionada.
La figura 11 son páginas web de SwissProt nº de
registro P00748 que contienen la secuencia de aminoácidos del factor
XII humano e información relacionada.
La figura 12 son páginas web de SwissProt nº de
registro Q04756 que contienen la secuencia de aminoácidos de la HGFA
humana e información relacionada.
La figura 13 son páginas web de PIR nº de
registro JC4795 que contienen la secuencia de aminoácidos de la PHBP
humana e información relacionada.
Debe entenderse que tanto la anterior
descripción general como la siguiente descripción detallada son
ejemplos y sólo son explicativas, y no son restrictivas de la
invención, según se reivindica. Los dibujos adjuntos, que se
incorporan en la memoria descriptiva y constituyen una parte de
ésta, ilustran una realización de la invención y, junto con la
descripción, sirven para explicar los principios de la
invención.
Según las realizaciones de la presente
invención, se puede introducir en un polipéptido, tal como el
producto polipeptídico de un único gen, uno o más restos cisteína
que permiten la formación de un enlace disulfuro entre dos o más
dominios del polipéptido. La colocación de dicha o dichas cisteínas,
con sus enlaces disulfuro resultantes, permite lograr resultados,
como la estabilización del polipéptido. Se hace notar que, en
algunas realizaciones, la presente invención puede utilizarse
también para colocar un enlace disulfuro dentro de un único dominio
de un polipéptido, entre dos polipéptidos diferentes y
similares.
Como primera etapa, se obtiene o se crea una
estructura del polipéptido de interés. Ésta puede ser una estructura
cristalina de rayos X, una estructura derivada de NMR, una
estructura tridimensional basada en la formación de modelos de
homología, difracción de neutrones o similares.
Después puede aplicarse a una estructura del
polipéptido de interés un algoritmo que predice los sitios para la
introducción de los puentes disulfuro mediante la colocación de las
cisteínas. Esto puede realizarse, por ejemplo, utilizando el
programa informático MODIP que emplea el algoritmo de Sowdhamini
(19). El MODIP predice los sitios para la introducción de los
puentes disulfuro y proporciona grados (A, B, C) para cada
predicción. Los sitios de grado A son los que se predicen como más
óptimos para el establecimiento de enlaces disulfuro, mientras que
los sitios de grado B y C son progresivamente menos ideales. Dicho
de otro modo, los puentes disulfuro de grado A satisfacen criterios
estereoquímicos definidos, mientras que los puentes disulfuro de
grado C satisfacen menos criterios estereoquímicos. Se hace notar
específicamente que pueden utilizarse otros algoritmos y/o
programas informáticos, como el algoritmo de Pabo (18) o Hazes (56).
En otras realizaciones, las predicciones para la introducción de
cisteínas para establecer enlaces disulfuro pueden realizarse
mediante otros métodos, como mediante inspección visual.
De los sitios predichos se puede escoger una
serie de los sitios más ideales para la posterior investigación.
La inspección visual de los sitios elegidos
puede realizarse utilizando análisis de gráficos informáticos.
Basándose en esta inspección visual pueden eliminarse ciertos sitios
de posterior consideración. Para cada uno de los sitios elegidos
que quedan en consideración después de la inspección visual puede
crearse un modelo estructural modificado que incluya un enlace
disulfuro en el sitio elegido. Esto puede realizarse utilizando
programas informáticos, como el programa informático Xfit, por
ejemplo, pudiendo obtenerse un mayor refinamiento con otro programa
informático, por ejemplo el programa informático
X-PLOR utilizando el campo de fuerza de todos los
átomos Charm22.
Después del refinamiento, los modelos de enlaces
disulfuro pueden analizarse para la geometría de disulfuros óptima.
Aquellos sitios con la mejor geometría para la formación de enlaces
disulfuro y, quizás, las menores energías de fase gaseosa de Van
Der Waals, pueden elegirse para intentar introducir uno o más restos
cisteína que permitan la formación de uno o más enlaces disulfuro.
Los restos cisteína pueden introducirse en un polipéptido
utilizando técnicas muy conocidas en la técnica como, por ejemplo,
técnicas recombinantes como la mutagénesis dirigida específica de
sitio de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés.
Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención
también pueden fabricarse mediante métodos sintéticos o
semisintéticos. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica el
polipéptido de la invención puede sintetizarse directamente
utilizando desoxinucleótidos sintéticos solapantes (véase, por
ejemplo, Edge et al., Nature, 292:756 (1981); Nambair
et al., Science, 223:1299 (1984); Jay et al.,
J. Biol. Chem., 259:6311 (1984)); o utilizando una
combinación de ADN o ADNc generados mediante una reacción en cadena
con polimerasa y oligonucleótidos sintetizados. Los ácidos
nucleicos de la invención pueden estar presentes en un vector de
expresión, o pueden insertarse en un vector de expresión, que
contenga una región promotora apropiada unida operablemente a la
secuencia que codifica el polipéptido de la invención y una señal
de terminación apropiada. Después puede realizarse la purificación
del vector y procedimientos de transfección conocidos en la técnica.
Después pueden seleccionar y recogerse los clones estables
utilizando métodos conocidos en la técnica. Los polipéptidos
producidos después pueden cuantificarse mediante actividad y
mediante inmunotransferencias para confirmar la colocación apropiada
del o de los enlaces disulfuro en el polipéptido de interés y sus
rendimientos.
Los ácidos nucleicos que codifican los
polipéptidos de la invención pueden expresarse en la célula
hospedante u organismo nativos o en una célula u organismo
diferente. Los ácidos nucleicos pueden introducirse en un vector,
como un plásmido, un cósmido, un fago, un virus o un minicromosoma,
e insertarse en una célula hospedante u organismo mediante métodos
muy conocidos en la técnica. En general, los ácidos nucleicos o
vectores que contienen estos ácidos nucleicos pueden utilizarse en
cualquier célula, tanto eucariota como procariota, incluyendo
células de mamífero (por ejemplo, células humanas (por ejemplo K293,
HeLa), de mono (por ejemplo COS), de conejo (por ejemplo
reticulocitos de conejo), de rata, de hámster (por ejemplo CHO y
células renales de cría de hámster) o de ratón (por ejemplo células
L), células vegetales, células de levadura, células de insecto o
células bacterianas (por ejemplo E. coli). Los vectores que
pueden utilizarse para clonar y/o expresar estos ácidos nucleicos
que codifican el polipéptido son los vectores que son capaces de
replicar y/o expresar los ácidos nucleicos en la célula hospedante
en la que se desee que los ácidos nucleicos se repliquen y/o se
expresen. Véase, por ejemplo, F. Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates
and Wiley-Interscience (1992), y Sambrook et
al. (1989) para ejemplos de vectores apropiados para diversos
tipos de células hospedantes. Los promotores nativos para estos
genes pueden ser sustituidos por promotores fuertes compatibles con
el hospedante en el que cual se inserta el ácido nucleico que
codifica el polipéptido de la invención. Estos promotores pueden
ser inducibles. Las células hospedantes que contienen estos ácidos
nucleicos pueden utilizarse para expresar cantidades grandes de los
polipéptidos de la invención útiles en preparaciones enzimáticas,
productos farmacéuticos, reactivos de diagnóstico y productos
terapéuticos. Los polipéptidos de la invención también pueden
fabricarse en plantas o animales transgénicos utilizando métodos
conocidos en la técnica.
Si los genes que, en la naturaleza, codifican
los polipéptidos de la invención contienen regiones inhibidoras/de
inestabilidad (veáse, por ejemplo, el documento WO 93/20212), los
codones menos preferidos pueden alterarse para conseguir codones
más preferidos. Sin embargo, si se desea, por ejemplo, hacer que una
región rica en AT sea más rica en GC, los codones más preferidos
pueden alterarse para conseguir codones menos preferidos.
Opcionalmente, sólo los codones que se utilizan muy raramente
(identificados a partir de las tablas de utilización de codones
publicadas, como en T. Maruyama et al., Nucl. Acids Res.,
14(supl.):r151-197 (1986)) pueden ser
sustituidos por codones preferidos o, como alternativa, la mayoría o
todos los codones raros pueden sustituirse por codones preferidos.
En general, la elección de los codones preferidos para usar
dependerá de la utilización de codones de la célula hospedante en
que se va a expresar el gen alterado. Nótese, sin embargo, que la
sustitución de los codones más preferidos por codones menos
preferidos también es funcional.
Como se indicó anteriormente, las secuencias
codificadoras se eligen basándose en el código genético y,
preferiblemente, en la utilización de codones preferida en la
célula hospedante u organismo en que se va a expresar el ácido
nucleico que codifica el polipéptido de esta invención. En una serie
de casos, la utilización de codones preferidos de un hospedante o
sistema de expresión concretos puede determinarse a partir de
referencias disponibles (véase, por ejemplo, T. Maruyama et
al., Nucl. Acids Res., 14(supl.):r151-197
(1986), en que el número de veces que aparece el codón en los genes
por 1000 codones se lista en paréntesis junto al codón), o puede
determinarse mediante otros métodos (véase, por ejemplo, la patente
de EEUU nº 5.082.767, titulada "Codon Pair Utilization"
(utilización de pares de codones), otorgada a G.W. Hatfield et
al., el 21 de enero, 1992). Preferiblemente, las secuencias se
elegirán para optimizar la transcripción y la traducción, así como
la estabilidad del ARNm, para aumentar, en último término, la
cantidad de polipéptido producido. Por tanto, la selección de
codones será guiada, por ejemplo, por el uso preferido de codones
por la célula hospedante y/o la necesidad de proporcionar sitios de
endonucleasas de restricción deseados, y también puede ser guiada
por el deseo de evitar potenciales restricciones de estructura
secundaria en la transcripción del ARNm codificado. Las potenciales
restricciones de estructura secundaria pueden identificarse
mediante el uso de programas informáticos, como el descrito en M.
Zucker et al., Nucl. Acids Res., 9:133 (1981). Puede
elegirse más de una secuencia codificadora en situaciones en que la
preferencia de codones es desconocida o ambigua para la utilización
de codones óptima en la célula hospedante u organismo elegido. Sin
embargo, cualquier conjunto correcto de codones codificará la
proteína deseada, incluso si se traduce con una eficacia menor que
la óptima. El ejemplo III de Seed et al., patente de EEUU nº
6.114.148, describe un gen del factor VIII sintético (que codifica
el factor VIII con el dominio B delecionado), con una utilización de
codones alterada que aumenta la expresión del polipéptido del factor
VIII codificado.
También se anticipa que las secuencias
inhibidoras/de inestabilidad puedan mutarse, de forma que los
aminoácidos codificados cambian para contener uno o más aminoácidos
conservativos o no conservativos y aún producir una proteína
funcionalmente equivalente. Por ejemplo, uno o más restos
aminoácidos dentro de la secuencia pueden sustituirse por otro
aminoácido de polaridad similar que actúe como un equivalente
funcional, dando como resultado una sustitución neutra en la
secuencia de aminoácidos. Los sustitutos para un aminoácido dentro
de una secuencia pueden seleccionarse de otros miembros de la clase
a la cual pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no
polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina,
prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos
neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína,
tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados
positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los
aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido
aspártico y ácido glutámico.
Los ácidos nucleicos para los genes alterados
mediante los métodos de la invención o las construcciones que
contengan dichos ácidos nucleicos también pueden utilizarse para la
sustitución de genes in vivo o in vitro. Por ejemplo,
un ácido nucleico que produzca un polipéptido sin el resto o restos
cisteína introducidos puede reemplazarse in situ por un
ácido nucleico que se ha modificado mediante el método de la
invención in situ para producir, en último término, un
polipéptido con una mayor estabilidad, comparada con la del
polipéptido codificado originariamente. Esta sustitución de genes
puede ser útil, por ejemplo, para el desarrollo de una terapia
genética.
Los vectores incluyen vectores retrovíricos y
también incluyen la inyección directa de ADN en células musculares
u otras células receptoras, dando como resultado la expresión eficaz
del polipéptido de la invención, utilizando la tecnología descrita,
por ejemplo, en Wolff et al., Science,
247:1465-1468 (1990), Wolff et al., Human
Molecular Genetics, 1(6):363-369 (1992),
y Ulmer et al., Science, 259:1745-1749
(1993). Véanse también, por ejemplo, los documentos WO 96/36366 y WO
98/34640.
Los polipéptidos, los ácidos nucleicos, los
vectores, las partículas víricas y/o las células hospedantes de la
invención pueden aislarse y purificarse mediante métodos conocidos
en la técnica, y pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas
y/o terapias, como se describe más a fondo a continuación.
Las composiciones farmacéuticas de esta
invención contienen una cantidad farmacéutica y/o terapéuticamente
aceptable de la menos un polipéptido, o un ácido nucleico que
codifica un polipéptido, de esta invención. En una realización de
la invención, la cantidad eficaz de polipéptido por dosis unitaria
es una cantidad suficiente para prevenir, tratar o proteger contra
los efectos de una deficiencia, o una deficiencia prevista, en el
polipéptido natural correspondiente. La cantidad eficaz del
polipéptido por dosis unitaria depende, entre otras cosas, de la
especie de mamífero tratada, el peso corporal del mamífero, y el
régimen de inoculación elegido, como se sabe en la técnica.
Preferiblemente, la vía de inoculación del
péptido será subcutánea o intravenosa. La dosis se administra al
menos una vez.
La expresión "dosis unitaria" se refiere a
unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones
unitarias para mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad
predeterminada de material activo (por ejemplo, polipéptido o ácido
nucleico) calculada para producir el efecto deseado en asociación
con cualquier diluyente acompañante.
Los polipéptidos o ácidos nucleicos de la
invención se administran, en general, con un portador o vehículo
fisiológicamente aceptable para ellos. Un vehículo fisiológicamente
aceptable es aquel que no provoca una reacción física adversa tras
su administración, y aquel en que los polipéptidos o ácidos
nucleicos son suficientemente solubles y mantienen su actividad
para administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto.
La cantidad terapéuticamente eficaz y el método de administración
de un polipéptido o ácido nucleico de la invención puede variar
basándose en el paciente individual, la indicación que se está
tratando y otros criterios evidentes para los expertos en la
técnica. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido o
ácido nucleico de la invención es aquella suficiente para atenuar
la disfunción sin provocar efectos secundarios adversos
significativos. La vía o vías de administración útiles en una
aplicación concreta serán evidentes para los expertos en la
técnica.
Las vías de administración de los polipéptidos y
ácidos nucleicos de la invención incluyen, pero no se limitan a la
inyección parenteral y directa en un sitio afectado. Las vías de
administración parenterales incluyen, pero no se limitan a la vía
intravenosa, intramuscular, intraperitoneal y subcutánea. La vía de
administración de los polipéptidos de la invención es, de forma
típica, parenteral.
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La presente invención incluyen composiciones de
los polipéptidos y ácidos nucleicos descritos anteriormente,
adecuadas para la administración parenteral, que incluyen, pero no
se limitan a disoluciones isotónicas estériles farmacéuticamente
aceptables. Estas disoluciones incluyen, pero no se limitan a
disolución salina y disolución salina tamponada con fosfato para la
administración nasal, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal,
subcutánea o mediante inyección directa en una articulación u otra
área.
También puede utilizarse un sistema para la
administración sostenida del polipéptido o ácido nucleico de la
invención. Por ejemplo, puede emplearse un sistema de administración
basado en contener un polipéptido en una matriz polimérica de
microesferas biodegradables (57). Una de estas matrices poliméricas
incluye el polímero
poli(lactida-co-glicólido)
(PLG). El PLG es biocompatible y puede administrarse por vía
intravenosa u oral. Tras la inyección de las microesferas en el
cuerpo, el polipéptido encapsulado es liberado mediante un proceso
complejo que implica la hidratación de las partículas y la
disolución del fármaco. La duración de la liberación es dirigida,
principalmente, por el tipo de polímero PLG utilizado y la
liberación de los excipientes modificadores (44).
Se pretende que los polipéptidos y los ácidos
nucleicos de la presente invención se proporcionen al sujeto
receptor en una cantidad suficiente para prevenir o atenuar la
gravedad, el grado o la duración de los efectos perjudiciales de
una deficiencia, o una deficiencia prevista, en el polipéptido
natural correspondiente.
La administración de los agentes, incluyendo las
composiciones de polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención,
puede tener un objetivo "profiláctico" o "terapéutico".
Cuando se proporcionan de manera profiláctica, los agentes se
proporcionan por anticipado a cualquier síntoma. La administración
profiláctica del agente actúa para prevenir o mejorar cualquier
efecto perjudicial posterior de la deficiencia, o la deficiencia
prevista, en el polipéptido natural correspondiente. Cuando se
proporciona de forma terapéutica, el agente se proporciona cuando
aparece el síntoma (o poco tiempo después) de la deficiencia o de la
deficiencia prevista. Por tanto, el agente de la presente invención
puede proporcionarse antes de la deficiencia prevista (para atenuar
la gravedad, duración o grado previstos de los síntomas de la
enfermedad) o después de la deficiencia, habiéndose manifestado sus
síntomas resultantes.
También se preven terapias basadas en vectores y
partículas víricas, como vectores víricos y partículas víricas que
contienen secuencias de ácidos nucleicos que codifican los
polipéptidos descritos en la presente. Estas molecular,
desarrolladas de modo que no provoquen un efecto patológico,
producirán los polipéptidos codificados de la invención.
El aislamiento y la purificación del factor VIII
derivado de plasma porcino y humano y del factor VIII recombinante
humano se ha descrito en la bibliografía. Véase, por ejemplo,
Flucher, C.A., y T.S. Zimmerman, 79, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA,
1648-1652 (1982); Toole, J.J., et al., 312,
Nature, 342-347 (1984) (Genetics Institute);
Gitschier, J., et al., 312, Nature, 326-330
(1984) (Genentech); Wood, W.I., et al., 312, Nature,
330-337 (1984) (Genentech); Vehar, G.A., et
al., 312, Nature, 337-342 (1984) (Genentech);
Fass, D.N., et al., 59, Blood, 594 (1982); Toole, J.J.,
et al., 83, Proc. Nat'l. Acad, Sci. USA,
5939-5942 (1986); Boedeker, B.G., Semin. Thromb.
Hemost., 27(4):385-394 (agosto 2001). Dos
preparaciones del factor VIII recombinante de longitud completa que
han obtenido licencia para su uso en seres humanos a principios de
los años 90 se describen, por ejemplo, en Schwartz, R.S., et
al., N. Engl. J. Med., 323:1800-1805 (1990);
Lusher, J.M., et al., N. Engl. J. Med.,
328:453-459 (1993); Bray, G.L., et al.,
Blood, 83:2428-2435 (1994); y White, G.C. II, et
al., Thromb. Haemost., 77:660-667 (1997).
El factor VIII con el dominio B delecionado, que
carece del dominio B de la proteína de longitud completa pero
mantiene la actividad coagulante, y que ha obtenido licencia para su
uso en seres humanos se describe, por ejemplo, en Osterbert, T.,
et al., Pharm. Res., 14:892-898 (1997);
Lusher, J.M., et al., Blood, 96:266a (2000) (resumen); y
Almstedt, et al., patente de EEUU nº 5.661.008.
El factor VIII humano/porcino híbrido también se
ha descrito en la bibliografía. Véase, por ejemplo, la patente de
EEUU 6.180.371.
La definición clásica del factor VIII es una
sustancia presente en el plasma sanguíneo normal que corrige el
defecto de coagulación en plasma procedente de individuos con
hemofilia A. Tal como se emplea en la presente, el factor VIII se
refiere a una molécula que tiene las propiedades procoagulantes del
factor VIII derivado del plasma o el factor VIII activado. Por
tanto, la expresión factor VIII, tal como se emplea en la presente,
incluye una forma modificada o truncada del factor VIII natural o
recombinante que mantiene las propiedades procoagulantes del factor
VIII o del factor VIII activado. Por tanto, el factor VIII, tal como
se emplea en la presente, incluye la molécula del precursor del
factor VIII sin romper, así como el factor VIII en diversas formas
proteolíticamente procesadas o truncadas de otra manera conocidas
por los expertos en la técnica, en las que las diversas formas del
factor VIII poseen actividad procoagulante. Los ejemplos de
polipéptidos del factor VIII son aquellos fragmentos del factor
VIII activo y derivados del factor VIII descritos en Andersson
et al., patente de EEUU nº 4.749.780; Andersson et
al., patente de EEUU nº 4.877.614; Toole et al., patente
de EEUU nº 4.757.006; Toole, patente de EEUU nº 4.868.112; Almstedt
et al., patente de EEUU nº 5.661.008. El factor VIII
descrito en Almstedt et al. está formado por los aminoácidos
1 a 743 y 1649 a 2332 del factor VIII humano. Esta secuencia
polipeptídica se conoce en el mercado como rFVIII-SQ
o REFACTO [r]. Véase, también, Lind et al., Euro. J.
Biochem., 232:19-27 (1995). También pueden
construirse otras formas del FVIII truncado en las que el dominio B
está en general delecionado. En el factor VIII de Almstedt et
al., los aminoácidos de la cadena pesada, que contiene los
aminoácidos 1 a 740 del factor VIII humano y que tiene un peso
molecular de aproximadamente 90 kD, se conectan a los aminoácidos
de la cadena ligera, que contiene los aminoácidos 1649 a 2332 del
factor VIII humano y que tiene un peso molecular de aproximadamente
80 kD. Las cadenas pesada y ligera están conectadas por un péptido
conector de 2 a 15 aminoácidos, por ejemplo un conector que
comprende restos lisina o arginina o, como alternativa, están
conectadas mediante un enlace iónico metálico. Pueden utilizarse
estos otros conectores y otros conectores con diferente tamaño.
Véase, también, Pipe y Kaufmann (109) para otro variante del factor
VIII que fue modificado mediante la deleción de los restos
794-1689, de forma que el dominio A2 está unido
covalentemente a la cadena ligera. Mutaciones de aminoácido en los
sitios de ruptura de inactivación de la trombina y la proteína C
activada proporcionan resistencia a la proteolisis, dando como
resultado una proteína monocatenaria que tiene una actividad máxima
después de una única ruptura después de la
arginina-372.
En la patente de EEUU nº 6.180.371 se muestran
nucleótidos de ADNc del factor VIII humano y las secuencias de
aminoácidos predichas. El factor VIII se sintetiza como una proteína
monocatenaria de aproximadamente 300 kDa con una homología de
secuencia interna que define la secuencia del "dominio"
NH_{2}-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH.
En la patente de EEUU nº 6.180.371, los dominios del factor VIII
incluyen los siguientes restos aminoácidos, cuyas secuencias se
alinean con la secuencia de aminoácidos indicada en la patente: A1,
restos Ala1-Arg372; A2, restos
Ser373-Arg740; B, restos
Ser741-Arg1648; A3, restos
Ser1690-Ile2032; C1, restos
Arg2033-Asn2172; C2, restos
Ser2173-Tyr2332. La secuencia
A3-C1-C2 incluye los restos
Ser1690-Tyr2332. El resto de la secuencia, los
restos Glu1649-Arg1689, normalmente se denomina
péptido de activación de cadena ligera del factor VIII. El factor
VIII es activado proteolíticamente por la trombina o el factor Xa,
que lo disocia del factor de von Willebrand, formando el factor
VIIIa, que tiene función procoagulante. La función biológica del
factor VIIIa es aumentar la eficacia catalítica del factor IXa
hacia la activación del factor X en varios órdenes de magnitud. El
factor VIIIa activado por trombina es un heterotrímero
A1/A2/A3-C1-C2 de 160 kDa que forma
un complejo con el factor IXa y el factor X sobre la superficie de
plaquetas o monocitos o sobre otras superficies.
La cadena pesada del factor VIII contiene los
dominios A1 y A2 y también puede contener parte o todo el dominio B
(la cadena pesada del factor VIII con el dominio B delecionado
contiene dos dominios, A1 y A2, y puede contener una pequeña parte
del dominio B). La cadena ligera del factor VIII contiene tres
dominios, A3, C1 y C2.
Las composiciones farmacéuticas que contienen el
factor VIII estabilizado con disulfuro, solo o en combinación con
compuestos de estabilización farmacéuticos apropiados, vehículos de
transporte y/o vehículos portadores, pueden prepararse según
métodos conocidos, como los descritos en Remington's Pharmaceutical
Sciences, por E.W. Martín, incorporado en la presente como
referencia. Las composiciones farmacéuticas pueden contener el
polipéptido del factor VIII, ácidos nucleicos que codifiquen el
factor VIII, o similares.
En una realización preferida, los vehículos de
transporte o portadores preferidos para la infusión intravenosa son
disolución salina fisiológica o disolución salina tamponada con
fosfato que puede incluir azúcares.
En otra realización preferida, los compuestos de
estabilización, los vehículos de transporte y los vehículos
portadores adecuados incluyen, pero no se limitan a otras proteínas
humanas o animales, como albúmina.
También se prefieren vesículas de fosfolípidos o
suspensiones liposómicas como vehículos de transporte o portadores
farmacéuticamente aceptables. Pueden prepararse según métodos
conocidos por los expertos en la técnica y pueden contener, por
ejemplo, fosfatidilserina/fosfatidilcolina u otras composiciones de
fosfolípidos o detergentes que juntos impartan una carga negativa a
la superficie, puesto que el factor VIII se une a membranas de
fosfolípidos cargadas negativamente. Los liposomas pueden
prepararse disolviendo el o los lípidos apropiados (como
estearoilfosfatidiletanolamina, estearoilfosfatidilcolina,
aracadoilfosfatidilcolina y colesterol) en una disolvente inorgánico
que después se evapora, dejando una película fina de lípidos secos
sobre la superficie del recipiente. Entonces se introduce en el
recipiente una disolución acuosa del factor VIII. La disolución se
mezcla para liberar el material lipídico de los lados del
recipiente y para dispersar los agregados lipídicos, formando, con
ello, la suspensión liposómica.
El factor VIII puede combinarse con otros
compuestos de estabilización adecuados, vehículos de transporte y/o
vehículos portadores, incluyendo factores de coagulación
dependientes de la vitamina K, factor tisular, factor de von
Willebrand (vWf) o un fragmento de vWF que contenga el sitio de
unión del factor VIII, y polisacáridos como la sacarosa.
El factor VIII puede conservarse unido a vWf
para aumentar la semivida y la caducidad de la molécula. Además, la
liofilización del factor VIII puede mejorar los rendimientos de las
moléculas activas en presencia de vWf. Los métodos para conservar
el factor VIII incluyen la liofilización del factor VIII en un
estado parcialmente purificado (como un "concentrado" del
factor VIII que se infusiona sin más purificación), y una
purificación mediante inmunoafinidad del factor VIII y una
liofilización en presencia de albúmina, que estabiliza el factor
VIII. El factor VIII también puede prepararse mediante un proceso
que emplea la sacarosa como estabilizante en el recipiente final,
en lugar de albúmina. Se prefiere que el factor VIII se prepare
mediante un proceso que no incluya plasma ni proteínas plasmáticas
(véase, por ejemplo, Boedeker (111) y Cho et al., patente de
EEUU nº 6.358.703 B1).
Además, el factor VIII ha resultado ser
indefinidamente estable a 40ºC en NaCl 0,6 M, MES 20 mM, y
CaCl_{2} 5 mM a pH 6,0, y también puede conservarse congelado en
estos tampones y descongelarse con una pérdida mínima de
actividad.
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El factor VIII se utiliza para prevenir, tratar
o mejorar el sangrado incontrolado debido a una deficiencia en el
factor VIII (por ejemplo, una hemorragia intraarticular,
intracraneal o gastrointestinal) en sujetos, como hemofílicos, con
y sin anticuerpos inhibidores, y en pacientes con una deficiencia
adquirida en el factor VIII debido al desarrollo de anticuerpos
inhibidores (51). Los sujetos preferidos son mamíferos, más
preferiblemente seres humanos. Los materiales activos se
administran preferiblemente por vía intravenosa.
Una "deficiencia en el factor VIII", tal
como se emplea en la presente, incluye una deficiencia en la
actividad de coagulación provocada por la producción de un factor
VIII defectuoso, por una producción inadecuada o no producción del
factor VIII, o por la inhibición parcial o total del factor VIII por
inhibidores. La hemofilia A es un tipo de deficiencia del factor
VIII que se produce como resultado de un defecto en un gen ligado al
cromosoma X y la ausencia o deficiencia de la proteína del factor
VIII que codifica.
Además, el factor VIII puede administrarse
mediante el transplante de células genéticamente modificadas para
producir el factor VIII, o mediante el implante de un dispositivo
que contenga dichas células, como se describió anteriormente.
En una realización preferida, las composiciones
farmacéuticas del factor VIII sólo o en combinación con
estabilizantes, vehículos de transporte y/o portadores se infusiona
en pacientes por vía intravenosa.
Las dosificaciones de tratamiento de la
composición del factor VIII que deben administrarse a un paciente
que necesite dicho tratamiento varían dependiendo de la gravedad de
la deficiencia en el factor VIII. En general, el nivel de
dosificación se ajusta en frecuencia, duración y unidades con
respecto a la gravedad y la duración de cada episodio de sangrado
del paciente. Por consiguiente, el factor VIII se incluye en el
vehículo de transporte, portador o estabilizante farmacéuticamente
aceptables en una cantidad suficiente para administrar al paciente
una cantidad terapéuticamente eficaz del factor VIII para detener el
sangrado, según se mide mediante ensayos de coagulación
convencionales.
El factor VIII se define de forma clásica como
la sustancia presente en el plasma sanguíneo normal que corrige el
defecto de coagulación en plasma procedente de individuos con
hemofilia A. La actividad coagulante in vitro de las formas
purificadas y parcialmente purificadas del factor VIII se emplea
para calcular la dosis del factor VIII para infusiones en pacientes
humanos y es un indicador fiable de la actividad recuperada de
plasma de pacientes y de la corrección del defecto de sangrado in
vivo. Véase, por ejemplo, Lusher, J.M., et al., New
Engl. J. Med., 328:453-459 (1993);
Pittman, D.D., et al., Blood, 79:389-397 (1992), y Brinkhous et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8752-8755 (1985).
Pittman, D.D., et al., Blood, 79:389-397 (1992), y Brinkhous et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8752-8755 (1985).
Normalmente, el nivel plasmático deseado del
factor VIII que se quiere lograr en el paciente mediante la
administración del factor VIII híbrido o un equivalente a un
híbrido está en el intervalo de 30-100% del nivel
plasmático normal. Las dosificaciones típicas para el tratamiento
de las hemorragias de la hemofilia A con el factor VIII son de
25-50 unidades/kg de peso corporal. Una unidad = la
cantidad normal de VIII en 1 ml de plasma humano normal citrado.
Véase, por ejemplo, Roberts, H.R. y Hoffman, M., Hemophilia A and
Hemophilia B, en Williams Hematology, 6ª edición, eds. E. Beutler,
M.A. Lichtman, B.S. Coller, T.J. Kipps y U. Seligson,
McGraw-Hill, NY, 2001. En un modo de administración
preferido del factor VIII de la invención, que se espera que tenga
una mayor estabilidad debido a la introducción de uno o más restos
cisteína, la composición se administra por vía intravenosa a una
dosificiación preferida en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 80
unidades/kg de peso corporal, más preferiblemente en un intervalo
de 0,5 a 50 unidades/kg de peso corporal, más preferiblemente en un
intervalo de 1,0-50 unidades/kg de peso corporal, y
lo más preferiblemente a una dosificación de 2,0-40
unidades/kg de peso corporal; la frecuencia de intervalo está en un
intervalo de aproximadamente 8 a 24 horas (en hemofílicos
gravemente afectados); y la duración del tratamiento en días está en
el intervalo de 1 a 10 días o hasta que el episodio de sangrado se
resuelva. Véase, por ejemplo, Roberts, H.R. y M.R. Jones,
"Hemophilia and Related Conditions-Congenital
-Deficiencies of Prothrombin (Factor II, Factor V, and Factors VII
to XII)", cap. 153, 1453-1474,
1459-1460, en Hematology, Williams W.J. et
al., ed. (1990). Los pacientes con inhibidores pueden requerir
más factor VIII de la invención, o los pacientes pueden requerir
menos factor VIII de la invención por su mayor estabilidad frente
al factor VIII humano. En un tratamiento con el factor VIII, la
cantidad del factor VIII infusionada es definida mediante un ensayo
de coagulación de factor VIII en una etapa y, en casos
seleccionados, la recuperación in vivo se determina midiendo
el factor VIII en el plasma del paciente después de la infusión.
Debe entenderse que, para cualquier sujeto concreto, los regímenes
de dosificación específicos deben ajustarse a lo largo del tiempo
según las necesidades del individuo y la consideración profesional
de la persona que administra o supervisa la administración de las
composiciones, y que la concentración y otros intervalos que se
indican en la presente son sólo ejemplos y no pretenden limitar el
alcance o la práctica de la invención reivindicada.
El tratamiento puede tomar la forma de una única
administración intravenosa de la composición o la administración
periódica o continua a lo largo de un periodo de tiempo extendido,
según se requiera. Como alternativa, el factor VIII puede
administrarse por vía subcutánea u oral con liposomas en una o
varias dosis en intervalos de tiempo variables.
El factor VIII híbrido animal/humano de la
invención puede utilizarse para tratar el sangrado incontrolado
debido a una deficiencia en el factor VIII en hemofílicos que han
desarrollado anticuerpos contra el factor VIII humano. En este
caso, no es necesaria una actividad coagulante superior a las del
factor VIII humano o animal natural solo. Una actividad coagulante
que sea inferior a la del factor VIII humano natural (es decir,
menor que 3.000 unidades/mg) será útil si la actividad no es
neutralizada por anticuerpos en el plasma del paciente.
El factor VIII también puede administrarse
mediante terapia génica. Los principios generales para este tipo de
terapia son conocidos por los expertos en la técnica y se han
publicado en la bibliografía (por ejemplo 52, 53, 57). Se han
utilizado diversas estrategias para administrar los factores VIII y
IX mediante terapia génica y muchas de éstas pueden resultar
apropiadas para la administración del factor VIII que está
modificado mediante la adición de enlaces disulfuros introducidos.
A continuación se presenta un resumen de diversas estrategias que
pueden utilizarse.
Con mucho, la mayor parte de la experiencia se
ha realizado con vectores retrovíricos. Un ejemplo de los datos
preclínicos publicados y revisados por iguales existentes que
utilizan vectores retrovíricos para tratar la hemofilia provienen
de Kay et al. (58), que han preparado un vector retrovírico
que expresa el FIX canino y lo infusiona en la vena porta de perros
hemofílicos que se han sometido a una hepactectomía parcial. Fueron
capaces de demostrar la expresión a largo plazo de FIX canino (>2
años) pero a niveles que fueron demasiado bajos para ser
terapéuticos en seres humanos.
Otra estrategia, también para la hemofilia B,
utiliza un vector AAV. Los vectores AAV en el uso presente se
modifican a partir de un parvovirus, AAV de serotipo 2, con un
pequeño genoma de ADN monocatenario (4,7 kb). Muchos individuos se
infectan con el virus de tipo salvaje siendo niños, pero la
infección no está asociada con ninguna enfermedad conocida. El
virus tiene una replicación defectuosa natural, y el vector
modificado está completamente exento de secuencias codificadoras
víricas. Los estudios preclínicos realizados por varios grupos han
demostrados que los vectores AAV pueden dirigir una expresión
sostenida de un transgén introducido en el músculo esquelético, el
hígado o el sistema nervioso central (62-64). En el
caso del FIX, experimentos con ratones han producido unos niveles
de expresión de 250 a 350 ng/ml (5% al 7% de los niveles en
circulación normales), mientras que experimentos similares en
perros hemofílicos han producido unos niveles de 70 a 80 ng/ml
(aproximadamente 1,5% de los niveles normales (65, 66)).
También están en marcha esfuerzos para extender
el uso de una estrategia de AAV dirigida al hígado para el FVIII,
pero el tamaño del transgén presenta un problema en este caso,
porque los vectores AAV no alojan insertos por encima de 5 kb, y el
ADNc de FVIII con el dominio B delecionado (sin promotor, intrón, o
repeticiones terminales invertidas con virus) es 4,4 kb. Debido a
estas restricciones de tamaño se han diseñado varias estrategias
nuevas para permitir la expresión de FVIII desde un vector AAV (76,
77, 78).
Una estrategia diferente que se está evaluando
en la actualidad para el tratamiento de la hemofilia A es la
introducción ex vivo de un plásmido que exprese el FVIII con
el dominio B delecionado (BDD) en fibroblastos autólogos, que
entonces se reimplantan en el epiplón. En esta estrategia, una
biopsia de la piel del paciente actúa como fuente de fibroblastos
autólogos, que entonces se transfectan mediante electroporación con
un plásmido que expresa FVIII BDD y un marcador seleccionable.
Después de la transfección, las células que expresan FVIII se
seleccionan, se expanden y se reimplantan en el epiplón con un
procedimiento laparoscópico (utilizando del orden de 10^{8} a
10^{9} células) (107).
Los vectores adenovíricos tienen varias
características atractivas como vehículos de transporte de gene,
incluyendo la facilidad de preparación y la transducción eficaz al
hígado después de la introducción del vector en la circulación
periférica. Estas características fueron aprovechadas por Kay et
al. (80) para obtener un alto nivel de expresión de FIX canino
en perros hemofílicos como una prueba de principio temprana de esta
estrategia. Se han comprendido mejor varias cosas importantes
acerca de los vectores adenovíricos a través del trabajo de
Connelly y colegas (83-87), que han explorado el uso
de vectores adenovíricos de una generación más temprana como una
estrategia para tratar la hemofilia A. Utilizando un vector
adenovírico que expresa el FVIII con el dominio B deleccionado,
estos investigadores han sido capaces de demostrar la corrección
fenotíica de la diátesis del sangrado en ratones con hemofilia A
(87). Los niveles de expresión fueron inicialmente de >2000 mU/ml
y, según se esperaba, disminuyeron gradualmente a lo largo de 9
meses a aproximadamente 100 mU/ml.
Los vectores lentivíricos (101), un vehículo de
transporte de genes más nuevo basado en el VIH, también han
demostrado transducirse al hígado, músculo y células hematopoyéticas
y, por tanto, podrían utilizarse potencialmente para la terapia
génica de la hemofilia. El trabajo publicado por Kafri et al.
(102) ha demostrado una expresión estable (22 semanas) de un GFP
humanizado después de una inyección intraparenquimática directa al
hígado de un vector lentivírico.
Okoli et al. (106) han presentando un
informe preliminar en que un ADN plasmídico de FIX contenido dentro
de una nanosfera de ADN de quitosano se sumerge en cubos de gelatina
y se alimenta a ratones a una dosis de 25 g de plásmido en un único
tratamiento. Los ratones tratados mostraron unos niveles de 45 ng/ml
(aproximadamente 1% de los niveles plasmáticos normales), aunque
los niveles descendieron gradualmente hasta ser indetectables a lo
largo de un periodo de 14 días.
Están en marcha ensayos clínicos de fase I en
seres humanos o en etapas de planificación tardías para vectores
retrovíricos, vectores AAV, plásmidos transfectados y vectores
adenovíricos.
Como será obvio para los expertos en la técnica,
pueden utilizarse métodos similares para la administración de
entidades diferentes del factor VIII, como el factor V, la
protrombina, el factor XII, el HGFA (activador del factor de
crecimiento de hepatocitos) y la PHBP (proteína de unión a
hialuronina plasmática).
\newpage
Los siguientes ejemplos ilustran ciertas
realizaciones de la presente invención, pero no deben considerarse
limitantes de su alcance de ninguna manera. Ciertas modificaciones y
variaciones serán evidentes para los expertos en la técnica a
partir de las indicaciones de la anterior descripción y los
siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
1
En una realización de la presente invención, se
puede introducir en mutantes FV recombinantes un enlace disulfuro
entre los dominios A2 y A1 o A3, de forma que se evita la
disociación del dominio A2. No se conoce la estructura cristalina
de rayos X ni la estructura de RMN del FVa. Sin embargo, como se
indicó anteriormente, la presente invención no se limita al uso con
dichas estructuras y puede aplicarse a modelos homólogos.
Por consiguiente, el programa informático MODIP
(19), que emplea el algoritmo de Sowdhamini, se aplicó al modelo de
homología de Pellequer de FVa (20). Como se indicó anteriormente, el
MODIP predice los sitios para la introducción de puentes disulfuro
y proporciona grados (A, B, C) para cada predicción. Los sitios de
grado A son aquellos predichos como más óptimos para el
establecimiento de puentes disulfuro, mientras que los sitios de
grado B y grado C son progresivamente menos ideales.
Para el modelo de FVa de Pellequer no se
predijeron sitios de grado A en las interfases A1-A2
ni A2-A3, se predijo un único sitio de grado B, y se
predijeron varios sitios de grado C. De los sitios de grado C
predichos, el MODIP indicó que cinco sitios eran los más
ideales:
- His609-Glu1691
- (A2-A3)
- Leu238-Gln590
- (A1-A2)
- His253-Asp469
- (A1-A2)
- Ala257-Met618
- (A1-A2)
- Leu283-Met618
- (A1-A2)
\vskip1.000000\baselineskip
Se advierte que, de éstos, el par
609-1691 se alinea con los restos
Tyr664-Thr1826 en el factor VIII.
La inspección visual de los sitios de grado B y
C predichos utilizando un análisis gráfico informático mostró que
el sitio de grado B no podía utilizarse. Después se construyó una
versión del modelo de homología de FVa que incluía además un puente
disulfuro para cada uno de los cinco mejores sitios de grado C. Esto
se realizó utilizando el programa informático Xfit, proporcionando
el programa informático X-PLOR un refinamiento
utilizando el campo de fuerza de todos los átomos Charm22.
Después del refinamiento, los modelos de enlaces
disulfuro se analizaron para la geometría de disulfuros óptima.
Cys609-Cys169 proporcionó la mejor geometría
potencial para un enlace disulfuro en FV con r_{ss} = 2,02
\ring{A}, \chi_{ss} = 80,9º, y la menor energía de fase
gaseosa de Van Der Waals de los cinco sitios. El segundo mejor
sitio era Leu238-Gln590, con r_{ss} = 2,03
\ring{A}, \chi_{ss} = -111,6º. Por tanto, estos dos sitios se
eligieron para los intentos iniciales de crear enlaces disulfuro
utilizando una mutagénesis dirigida específica de sitio.
Después se obtuvo un plásmido
pED-FV que contenía el ADNc de FV de longitud
completa. El ADNc de FV de longitud completa en el plásmido
pED-FV entonces se retiró mediante digestión con
SalI y se insertó en un plásmido pUC119 modificado. Después se creó
un fragmento del ADNc de FV con PCR utilizando un cebador 5' que
crea un sitio BamHI en nt4641 (numeración del ADNc de Fv; nt =
nucleótido) y un cebador 3' que mantiene el sitio BamHI en nt6014
mientras que elimina el sitio BamHI en nt5975. Los cebadores
utilizados se muestran a continuación, en los que el subrayado
indica una mutación y la negrita indica un codón o un sitio de
restricción de interés:
El pUC119-FV se digirió con
BamHI (cortando en nt2601, 5975 y 6014 en la numeración del ADNc de
FV). El nuevo fragmento de PCR se insertó entre los sitios BamHI en
pUC119-FV entre nt2601 y 6014. Estas etapas dan como
resultado la eliminación de nt2602 a 4641 (secuencia codificadora
para los restos 812 a 1491) creando una construcción que codifica un
FV sin dominio B denominado FV\DeltaB.
Esta construcción génica FV\DeltaB se insertó
en el vector de expresión pcDNA3.1+ de Invitrogen (Carslbad, CA).
Después, utilizando el kit de mutagénesis de PCR Stratagene
Quikchange (La Jolla, CA) y FV\DeltaB, se mutó Ser2183 a Ala
(cambiando el codón AGT a GCC) para evitar la glicosilación en
Asn2181, produciendo el mutante 2183A-FV\DeltaB.
Esta mutación se realizó para evitar la heterogeneidad de FV debido
a la glicosilación incompleta en Asn2181 que produce dos especies
de FV que se diferencian en ciertas propiedades funcionales (25,
26). Todas las mutaciones posteriores se realizaron utilizando este
mutante Ser2183A sin dominio B. En ciertas realizaciones, esta etapa
puede eliminarse.
Al mismo tiempo, se empleó el kit de mutagénesis
de PCR Stratagene Quikchange para colocar una codificación para los
restos cisteína mediante la adición de cuatro cebadores mutagénicos.
Se formaron las siguientes parejas: Leu238Cys:Gln590Cys
(Cys238/Cys590), e His609Cys:Glu1691Cys
(A2-SS-A3). También se formaron
variantes con otras mutaciones de Arg506 y Arg679 a Gln (Gln506 o
Gln679) (Q506/Cys238/Cys590,
Q506-A2-SS-A3 y
Q506/Q679-A2-SS-A3).
Los cebadores de mutagenesis utilizados se muestran a continuación,
en los que el subrayado indica una mutación y la negrita indica un
codón o un sitio de restricción de interés:
Los plásmidos que contienen cada mutante se
purificaron con el kit midprep de plásmidos Qiafilter de Qiagen, se
linealizaron y se transfectaron en células COS-1
utilizando el reactivo de transfección Superfect según las
instrucciones del fabricante. De manera más específica, 1 \mug de
ADN se incubó en un volumen de 60 \mul de medio DMEM/F12 con 5
\mul de reactivo Superfect durante diez minutos. Después se
añadieron 350 \mul de DMEM/FBS al 10%/glutamina 1 mM y esta
mezcla se transfirió a células COS-1
(aproximadamente 50% confluentes) en pocillos de una placa de 24
pocillos y se incubó durante 3 horas antes de lavar y reponer medio
fresco. Se seleccionaron los clones estables utilizando Geneticin
0,8 mg/ml (Gibco BRL, Rockville, MD). Se recogió medio condicionado
exento de suero que contenía BSA al 0,05% y CaCl_{2} 5 mM de
células COS-1 que expresaban cada mutante de FV y
se precipitó con PEG 6000 al 16%. Después el sedimento se redisolvió
en HBS (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) que contenía CaCl_{2} 5
mM, benzamidina 2 mM, PPACK 5 nM y PMSF 1 mM, se dializó contra el
mismo tampón y se purificó utilizando una columna de anticuerpos
anti-FV (24). Las fracciones que contenían FV se
recogieron, se concentraron y se conservaron en HBS con BSA al 0,1%
a -80ºC.
El FVa se cuantificó mediante actividad y
mediante ensayo ELISA después de la activación con trombina. Los
ensayos ELISA utilizaron placas Nunc Maxisorb revestidas con
anti-FV de oveja 10 \mug/ml de Affinity Biological
(Hamilton, Ontario, CA) y bloquearon con Superblock de Pierce
(Rockford, IL) detectándose el antígeno con un anticuerpo monocloal
anti-cadena ligera de FV de ratón (V59). El FV (40
nM) se activó con trombina (0,5 nM) en HBS con BSA al 0,1% y
CaCl_{2} 5 mM a 37ºC durante 10 min y la activación se detuvo
mediante la adición de 1,1 equivalente molar de hirudina. Los
ensayos de inactivación de FVa se realizaron utilizando FVa a 4 nM
y APC a 2,5 nM con la determinación del FVa residual mediante
ensayos de protrombinasa según se describe (27). La inactivación de
FVa se midió como sigue. Se preparó una mezcla de FVa 1 nM con
vesículas de fosfolípidos 25 \muM en HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl
100 mM, BSA al 0,5%, CaCl_{2} 5 mM, MnCl_{2} 0,1 mM (denominado
tampón Ptasa). La inactivación se inició mediante la adición de APC.
Se retiraron partes alícuotas de 1 \mul en ciertos momentos y se
añadieron a 40 \mul de factor Xa 1,25 nM con vesículas de
fosfolípidos 25 \muM, seguido de 10 \mul de protrombina 3
\muM (concentraciones finales: FXa 1 nM, FVa 20 pM, vesículas de
fosfolípidos 25 \muM, y protrombina 0,6 \muM). Después de 2,5
min se extinguió una parte alícuota de 15 \muM de esta mezcla
mediante la adición de 55 \mul de TBS que contenía EDTA 10 mM, BSA
al 0,5%, pH 8,2. Se añadió el sustrato cromogénico CBS
34-47 y se evaluó la cantidad de formación de
trombina midiendo el cambio en la absorbancia a 405 nm.
Para algunos estudios, se varió el FXa o la
protrombina. Para valoraciones de Xa, una mezcla de FVa/Fvai 3,34
pM y vesículas de fosfolípidos 41,7 \muM en tampón Ptasa se
dividió en partes alícuotas de 30 \mul en pocillos de placas de
96 pocillos (polipropileno, pocillos en V). Se añadieron 10 \mul
de Xa a cada pocillo en el mismo tampón a diversas concentraciones.
En el momento del tiempo = 0, se añadieron 10 \mul de protrombina
1,5 \muM (FII) a todos los pocillos (concentraciones finales = FVa
2 pM, vesículas de PL 25 \muM, Xa 5-600 pM, FII
0,3 \muM). En el momento del tiempo = 12, la reacción de Ptasa se
detuvo trasladando 15 \mul a una placa de 96 pocillos que
contenía TBS 55 \mul que contenía BSA al 0,5%, EDTA 10 mM a pH
8,2. Después se midió la cantidad de trombina formada, con el
sustrato cromogénico CBS 34-47. Para la protrombina,
se formaron partes alícuotas de 20 \mul de la mezcla que contenía
Xa 125 pM, FVa/FVai 1,25 mM, y vesículas de PL 31,25 \muM en
tampón Ptasa, en pocillos de una placa con pocillos en V de 96
pocillos. En el momento del tiempo = 0, se añadieron 5 \mul de
FII a diversas concentraciones (concentración final Xa 100 pM, FVa 1
nM, PL 25 \muM, FII 25-1500 nM). En el momento
del tiempo = 2:30, la reacción se detuvo trasladando 15 \mul a 55
\mul de tampón EDTA como anteriormente. La trombina se midió como
anteriormente.
Entonces se realizó una SDS-PAGE
con geles de gradiente Bis-Tris al
4-12% Novex con tampón MOPS (Invitrogen, Carlsbad,
CA). Se cargaron 50 ng de proteína por carril. Las proteínas
entonces se trasladaron a membranas de PVDF Millipore y se
revelaron las inmunotransferencias con anticuerpos monoclonales
anti-cadena ligera de FV, AHV-5112
o V59, y anticuerpos policlonales anti-cadena pesada
de FV de conejo (24). De manera más específica, las membranas se
bloquearon con TBS, caseína al 1% y CaCl_{2} 2 mM. Los anticuerpos
se diluyeron con el mismo tampón. El anticuerpo primario era el
respectivo anticuerpo anti-FV, y el anticuerpo
secundario era IgG anti-ratón de cabra biotinilada
o IgG anti-conejo de burro biotinilado de Pierce.
Entonces se realizó la visualización con fosfatasa alcalina
conjugada con estreptavidina y sustrato NBT/BCIP de una etapa
(también de Pierce). Para la especie FV que se produjo y purificó,
los rendimientos del FV puro variaban de 5 a 25 \mug/l de medio
condicionado. Basándose en una SDS-PAGE teñida con
plata, se estimó que la pureza de los mutantes variaba de 70% a
90%.
Como se conoce en la técnica, la cadena ligera
de FVa normalmente produce un doblete en una
SDS-PAGE debido a la heterogeneidad creada por la
glicosilación incompleta en Asn2181. La mutación de Ser2183 a Ala
elimina este sitio de glicosilación (28). Las inmunotransferencias
confirmaron que todas las moléculas de FV recombinante de la
invención tenían un peso molecular aparente de 188 kDa, lo cual
resulta coherente con la deleción de los restos 812 a 1491. Las
inmunotransferencias también confirmaron que el FVa de tipo salvaje
recombinante formaba un doblete de cadena ligera, mientras que
todos los demás mutantes de Fva que portaban la mutación Z183A
presentaban sólo una única banda de cadena ligera.
Para demostrar los enlaces disulfuro
interdominio deseados en las proteínas FV mutantes que contenían dos
restos cisteínas introducidos, se realizaron inmunotransferencias
de FVa y de FVai tratado con APC ("i" indica inactivado''). La
figura 1 muestra esquemas que representan las secuencias primarias
de FV\DeltaB, FVa (formado tras la activación con trombina), y
FVai (inactivado por rupturas con APC).
Las inmunotransferencias que utilizaban un
anticuerpo policlonal anti-cadena pesada de FV
demostraron que la introducción de mutaciones Cys238/Cys590 en FV o
Q506-Fv no unían, de forma detectable, los dominios
A1 y A2, aunque estas especies tenían una actividad FVa normal, lo
cual condujo a los inventores a la conclusión de que no se había
formado ningún enlace disulfuro entre estas cisteínas.
Si los mutantes FV que contenían Cys609 y
Cys1691 generaban un nuevo enlace disulfuro entre los dominios A2 y
A3, según se muestra en la figura 1C, éste conectaría las cadenas
pesada y ligera de FVa. En este caso, en inmunotransferencias de
FVa, la especie unida con disulfuro aparecería a un peso molecular
que correspondería a la suma de pesos moleculares de las cadenas
pesada y ligera y, después de las rupturas con APC en Arg506,
Arg306 y Arg679 que normalmente provocan la inactivación completa de
FVa, la cadena ligera de FVai permanecería entrecruzada al fragmento
C-terminal del dominio A2 (A2c, restos 507 a
679).
En efecto, se obtuvieron estos resultados. En
inmunotransferencias reveladas con anticuerpos
anti-cadena ligera de FV (figura 2A), los carriles
1 y 2 que contienen 2183A-FVa y
2183A-FVai mostraron ambos una cadena ligera normal
en el peso molecular esperado (69 kDa), mientras que el carril 3, el
mutante que contenía Cys609/Cys1691-FVa mostró una
banda predominante predicha para el entrecruzamiento de la cadena
ligera y la cadena pesada (158 kDa). Por tanto, los mutantes de FV
que contenían estos dos restos Cys se denominan justificadamente
"A2-SS-A3".
El carril 4 demuestra que el
A2-SS-A3-FVai
tratado con APC produce una banda predominante que se corresponde
con la movilidad predicha para la cadena ligera entrecruzada con el
fragmento A2c (92 kDa). Una banda más débil ligeramente por encima
de esta banda se correlaciona con una banda predicha para una cadena
pesada rota en Arg506 pero no en Arg679, dando como resultado el
fragmento 507 a 709 (101 kD). Los carriles 5 y 6 (figura 2A)
contenían
Q506-A2-SS-A3-FVa
y
Q506-A2-SS-A3-FVai.
En estas especies la ruptura en Arg506 no puede producirse, de
forma que en
Q506-A2-SS-A3-FVais
(carril 6) la cadena ligera permanece entrecruzada al dominio A2
entero (con o sin su pequeña cola C-terminal de los
restos 680-709). En efecto, la banda de mayor peso
molecular observada (carril 6) se corresponde con la cadena ligera
entrecruzada con el dominio A2 (130 kDa). Los carriles 7 a 12 de la
figura 2A contienen muestras paralelas a las de los carriles 1 a 6,
que se redujeron utilizando DTT. Los carriles 7-12
demuestran que, tras la reducción, las diversas especies
entrecruzadas de mayor peso molecular desaparecen y aparecen bandas
de cadena ligera normal, lo cual prueba que las especies que
contienen las cadenas ligeras de mayor peso molecular que se
observan en los carriles 3-6 (figura 2A) son, en
efecto, el resultado de entrecruzamientos mediante disulfuro entre
las cadenas ligera y pesada.
Otras pruebas para los entrecruzamientos
covalentes entre las cadenas pesada y ligera de FVa en los mutantes
A2-SS-A3 que contienen
Cys609/Cys1691 proceden de análisis de inmunotransferencias que
emplean anticuerpos anti-cadena pesada de FV que
muestran, bajo condiciones no reductoras, las mismas bandas nuevas
visualizadas en inmunotransferencias reveladas utilizando
anticuerpos anti-cadena ligera de FV. Por ejemplo,
en la figura 2B estas inmunotransferencias de
A2-SS-A3-FVa y
A2-SS-A4-FVai, así
como
Q506-A2-SS-A3-FVa
y
Q506-A2-SS-A3-FVai
bajo condiciones no reductoras, produjeron bandas predichas para
representar las mismas especies entrecruzadas visualizadas en
inmunotransferencias reveladas utilizando anticuerpos
anti-cadena ligera de FV de la figura 2B. Los
carriles 1 y 5 (figura 2B) muestran ambos bandas que se corresponden
con una cadena ligera entrecruzada con una cadena pesada que
comigra con la observada en la figura 2B, carril 3 (157 kDA). El
carril 2 en la figura 2B muestra una banda que se corresponde con
la cadena ligera entrecruzada con el fragmento A2c, que comigra con
una banda que se observa en el carril 4 de la figura 2A (102 kDa).
El carril 6 en la figura 2B muestra una banda que se corresponde
con la cadena ligera entrecruzada con el dominio A2, equivalente a
una banda que se observa en la carril 6 de la figura 2A (132
kDa).
Por último, el fragmento
C-terminal de A2 libre (24 kDa) y el fragmento A2
(63 kDa) no fueron visibles en los carriles 2 y 6 no reducidos,
respectivamente, pero fueron visibles en los carriles 4 y 8
reducidos, indicando que estos fragmentos fueron liberados desde las
especies unidas mediante disulfuro tras la reducción.
Los análisis de inmunotransferencias de
Q506-A2-SS-A3-FVa
y
Q506/Q679-A2-SS-A3-FVa
mostraron que existía una pequeña cantidad de cadena ligera libre
que no estaba entrecruzada con la cadena pesada (figura 2),
indicando que el entrecruzamiento con disulfuro en los mutantes
A2-SS-A3-FVa no era
100% completo. Los análisis de densitometría de estas
inmunotransferencias no reducidas mostraron que, de media,
aproximadamente 10% de las moléculas
Q506-A2-SS-A3-FVa
carecían de entrecruzamientos con disulfuro.
Como se aludió anteriormente, la figura 1A es
una representación esquemática de la secuencia primaria de
FV\DeltaB indicándose la localización de los diferentes dominios.
La representación esquemática de la figura 1b muestra el
FV\DeltaB activado (FVa), un heterodímero de la cadena pesada
N-terminal y la cadena ligera
C-terminal asociado en presencia de iones
Ca^{2+}. Las flechas indican los sitios de ruptura en FVa por APC.
La representación esquemática de la figura 1C muestra los
fragmentos de ruptura producidos tras la inactivación del FVa (FVai)
por APC, y también muestra los sitios de las mutaciones de cisteína
que produjeron (His609-Glu1691) y no produjeron
(Leu238-Gln590) la formación de enlaces
disulfuro.
Tal como se conoce en la técnica, existe una
serie de similitudes entre el factor V y el factor VIII. De forma
más específica, los factores V y VIII tienen estructuras génicas
similares, tienen secuencias de aminoácidos y estructuras de
dominios muy homólogas, ambos son activados por rupturas muy
específicas por la trombina, y ambos son inactivados mediante una
proteolisis limitada por la proteína C activada (APC). Por
consiguiente, se pueden introducir en FVIII recombinante enlaces
disulfuro entre el dominio A2 y los dominios A1 o A3 utilizando un
método similar al descrito anteriormente con respecto FV. Tal como
se conoce en la técnica, FVIIIa es termodinámicamente inestable
debido a que el dominio A2 puede disociarse de modo espontáneo. Como
se muestra en la figura 3, la colocación de un enlace disulfuro
entre el dominio A2 y los dominios A1 o A3 de FVIIIa tiene la
ventaja de prevenir esta disociación.
Al igual que FVa, no se conoce ni la estructura
cristalina de rayos X ni la estructura de RMN de FVIIIa. Sin
embargo, como se indicó anteriormente, la presente invención no se
limita al uso de dichas estructuras y puede aplicarse a modelos de
homología.
Como primera etapa para introducir un enlace
disulfuro entre el dominio A2 y los dominios A1 o A3 de FVIIIa, se
aplica el programa informático MODIP, que emplea el algoritmo de
Sowdhamini, al modelo de homología de Pemberton et al. (54)
de los dominios A de FVIIIa. Como se indicó anteriormente, el MODIP
predice sitios para la introducción de puentes disulfuro y
proporciona grados (A, B, C) para cada predicción. Los sitios de
grado A son los predichos como más óptimos para el establecimiento
de puentes disulfuro, mientras que los sitios de grados B y C son
progresivamente menos ideales. Para el modelo de FVIIIa de Pemberton
se predijeron quince sitios:
Grado A:
- Met 662-Asp1828
- (A2-A3)
\vskip1.000000\baselineskip
Grado B:
- Ser268-Phe673
- (A1-A2)
- Ile312-Pro672
- (A1-A2)
- Ser313-Ala644
- (A1-A2)
- Met662-Lys1827
- (A2-A3)
- Tyr664-Thr1826
- (A2-A3)
\vskip1.000000\baselineskip
Grado C:
- Pro264-Gln645
- (A1-A2)
- Arg282-Thr522
- (A1-A2)
- Ser285-Phe673
- (A1-A2)
- His311-Phe673
- (A1-A2)
- Ser314-Ala644
- (A1-A2)
- Ser314-Gln645
- (A1-A2)
- Val663-Glu1829
- (A2-A3)
- Asn694-Pro1980
- (A2-A3)
- Ser695-Glu1844
- (A2-A3)
\vskip1.000000\baselineskip
De éstas, se advirtió que la pareja
Tyr664-Thr1826 estaba en una posición homóloga a la
pareja His609-Glu1691 en Fva. Como se indicó
anteriormente, puede introducirse satisfactoriamente un puente
disulfuro en FV colocando una codificación para los restos cisteínas
en las posiciones 609 y 1691.
Similar al método descrito anteriormente para
FV, la inspección visual de estas parejas se realizó utilizando un
análisis gráfico informático. Como resultado de este análisis, se
eligieron tres de las parejas propuestas para su posterior
investigación: Met662-Asp1828,
Tyr664-Thr1826 y Ser313-Ala644. Para
cada uno de estos tres sitios se construyó una versión del modelo
de FVIIIa que incluía también un puente disulfuro en la localización
apropiada utilizando el programa informático Xfit, proporcionando
el programa informático X-PLOR un refinamiento
utilizando el campo de fuerza de todos los átomos Charm22. Después
del refinamiento, los modelos de enlaces disulfuro se clasificaron
en el orden indicado anteriormente con
Cys662-Cys1828, proporcionando la mejor geometría
potencial para un enlace disulfuro. Se eligió preparar este mutante
y el mutante Cys664-Cys1826 en el factor VIII
recombinante de una manera análoga a la descrita anteriormente con
referencia a FV.
Se obtuvo un plásmido de expresión de FVIII
(p25D) en Bayer Corporation. Este plásmido expresa el FVIII con el
dominio B delecionado, en el que los restos 744 a 1637 del dominio B
están delecionados.
Después se insertaron dos restos cisteína
utilizando mutagénesis de PCR Stratagene Quikchange y el mutante
FVIII, para permitir la creación de un enlace disulfuro mediante la
adición de cuatro cebadores mutagénicos al mismo tiempo. Se
produjeron las siguientes dos parejas: Met662Cys:Asp1828Cys y
Tyr664Cys:Thr1826Cys. Los cebadores de mutagénesis utilizados se
muestran a continuación, en los que el subrayado indica una mutación
y la negrita indica un codón o un sitio de restricción de
interés:
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador inverso Tyr664-Cys
mostrado anteriormente es la secuencia real utilizada pero la
secuencia génica de FVIII real en los nucleótidos 22 y 23 debería
ser CC en lugar de GG, pero el cebador directo tiene la secuencia
correcta, y la secuencia correcta se seleccionó para el mutante C664
final mediante la secuenciación de ADN de los clones
seleccionados.
La figura 4 es una representación esquemátia que
muestra la acción esperada de la APC sobre el FVIII mutante que
contiene un puente disulfuro entre los sitios
Met662-Asp1828 o Tyr664-Thr1826.
En algunas realizaciones, pueden prepararse
variantes que además contengan mutaciones y/o deleciones de los
sitios de ruptura de APC Arg336 y/o Arg562 en FVIII. Estas otras
mutaciones, como se describe en Kaufman y Pipe (109), y en las
patentes de EEUU 5.422.260, 5.250.421, 5.198.349 (incorporadas en la
presente como referencia), añaden más estabilidad al FVIII haciendo
que sea más resistente a la inactivación.
Los ácidos nucleicos que codifican los mutantes
del factor VIII también pueden modificarse para contener un mayor
número de codones preferidos para genes humanos como se describe,
por ejemplo, en Seed et al., patente de EEUU nº
6.114.148.
La expresión transitoria del plásmido p25D de
tipo salvaje y mutante se ensayó en células COS-1,
células K293 y células BHK-21 utilizando el
reactivo Superfect y el reactivo Effectene, ambos de Qiagen. El
reactivo Effectene en células K293 produjo los mejores resultados.
Los rendimientos del FVIII recombinante varían de 10 a 100 mU/ml
del medio condicionado según ensayos de actividad APTT y ELISA
(ELISA de FVIII Immubind, American Diagnostica). El medio
condicionado se recogió de las transfecciones transitorias en placas
de 100 mm en medio DMEM/F12 con FBS al 2% y el medio se concentró
15 veces y se dializó en disolución salina tamponada con
HEPES/CaCl_{2} 5 mM/MnCl_{2} 0,1 mM, pH 7,4. El medio de
transfección falso se trató de la misma manera y se empleó como
control negativo.
Se determinó la concentración de antígeno del
FVIII recombinante utilizando el kit de ELISA de FVIII Immubind de
American Diagnostica. La curva patrón utilizada fue un concentrado
de FVIII purificado incluido en el kit (1 unidad = el FVIII
contenido en 1 ml de plasma). Se determinó la actividad con un
ensayo APTT con plasma deficiente en FVIII y el reactivo de APTT
Platelin LS como sigue: se mezclaron 50 \mul de plasma deficiente
en FVIII (FVIIIdP, George King Biomedical) con 50 \mul de Platelin
LS (Organon Teknika) y se incubaron a 37ºC durante tres minutos.
Entonces se añadieron 5 \mul de una muestra de FVIII, seguidos
inmediatamente de 50 \mul de disolución salina tamponada con
HEPES (NaCl 0,15 M) con BSA al 0,5% y CaCl_{2} 25 mM. Se midió el
tiempo de coagulación en un coagulómetro Diagnostica Stago ST4. Se
confeccionó una curva patrón de FVIII utilizando plasma humano
normal reunido (George King Biomedical), el cual se dice que
contiene 1,0 unidades/ml de FVIII. El ensayo APTT es muy sensible a
niveles bajos de FVIII (<0,005 U/ml).
Utilizando estas medidas de antígeno y actividad
se calculó la actividad específica relativa de las tres proteínas
(unidades (U) de actividad/unidades (U) de antígeno). El FVIII de
tipo salvaje (con dominio B delecionado) tiene una actividad
específica relativa de 0,83,
C662-C1828-FVIII tiene una actividad
específica relativa de 3,53, y
C664-C1826-FVIII tiene una actividad
relativa específica de 3,40.
Se siguió la estabilidad del FVIIIa activado con
trombina a lo largo del tiempo utilizando un protocolo descrito por
Pipe et al. (110) con alguna modificación, en el que se
generó FVIIIa a una concentración de aproximadamente 500 mU/ml
mediante la adición de trombina, que entonces se inactivó con un
ligero exceso de hirudina. Posteriormente se retiraron partes
alícuotas de esta mezcla a lo largo del tiempo y se ensayaron
inmediatamente para la actividad FVIIIa en el ensayo APTT como se
describió anteriormente. La figura 5 muestra los resultados de este
ensayo con FVIIIa de tipo salvaje recombinante y dos mutantes
recombinantes. Los dos mutantes de cisteína doble son mucho más
estables a lo largo del tiempo que el FVIIIa de tipo salvaje (como
se refleja por un tiempo de coagulación más corto). El medio
condicionado de control de la transfección falso no mostró
esencialmente actividad de coagulación en este ensayo, y no hubo
cambios en la actividad a lo largo del tiempo (los datos no se
muestran).
El mutante de FVIII producido puede
transfectarse de forma estable a células. Las células puede hacerse
crecer (o cultivarse) para permitir la expresión de los mutantes de
FVIII. El mutante de FVIII producido puede aislarse y purificarse.
Pueden realizarse inmunotransferencias, de la manera descrita
anteriormente con referencia a FV, para confirmar la pérdida de la
mayoría del dominio B (si resulta apropiado) y la presencia de
enlaces disulfuro introducidos.
\vskip1.000000\baselineskip
En la técnica existen moléculas del factor VIII
híbridas cuya secuencia de aminoácidos deriva de las secuencias
codificadoras del factor VIII humano y de un animal no humano ("no
humano"). Pueden encontrarse ejemplos de estas moléculas, por
ejemplo, en la patente de EEUU 6.180.371, incorporada en la presente
como referencia. Según la presente invención, puede crearse un
factor VIII híbrido no humano/humano que contenga un enlace
disulfuro entre los dominios A2 y A1 o A3 del híbrido. Al igual que
en el ejemplo anterior, este enlace disulfuro evita la disociación
del dominio A2.
La creación de estas moléculas híbridas es, en
gran medida, análoga al procedimiento descrito anteriormente para
el FVIII no híbrido. En primer lugar puede obtenerse o crearse un
modelo de homología del híbrido FVIIIa, por ejemplo, uno formado
por un dominio A2 no humano y un heterodímero del factor VIIIa
humano des-A2. Como alternativa, puede obtenerse o
crearse una estructura cristalina de rayos X si esta estructura
existe o se puede crear. Después puede utilizarse el programa
informático MODIP con el modelo o estructura para recibir
sugerencias del programa acerca de los sitios para la formación de
un enlace disulfuro entre los dominios A2 y A1 o A3 del híbrido.
Como alternativa, pueden utilizarse métodos predictivos como se
describió anteriormente.
Después puede realizarse la inspección visual de
uno o más de los sitios sugeridos utilizando un análisis gráfico
informático. Como resultado de este análisis puede elegirse una
serie de sitios propuestos para su posterior investigación. Para
cada uno de estos sitios puede construirse una versión del modelo de
FVIIIa híbrido que también incluya un puente disulfuro en la
localización apropiada, utilizando el programa informático Xfit,
proporcionando el programa informático X-PLOR un
refinamiento utilizando el campo de fuerza de todos los átomos
Charm22. Después del refinamiento, los modelos de enlaces disulfuro
pueden clasificarse basándose en la calidad de la geometría
potencial para un enlace disulfuro. Entonces puede elegirse una
serie de sitios sugeridos para intentar crear un FVIII híbrido
mutante de una manera análoga a la descrita con referencia al FV y
al FVIII no híbrido anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
4
Como se indicó anteriormente, en presencia de
trombomodulina y vesículas de fosfolípidos de
fosfatidilserina/fosfatidilcolina (PCPS), la meizotrombina y la
meizotrombina (des F1) son mejores activadores de la proteína C que
la trombina.
Según la presente invención puede crearse un
mutante de protrombina que incluya un enlace disulfuro para
estabilizar la forma de meizotrombina (des F1) de la protrombina, y
para evitar la conversión de meizotrombina (des F1) en trombina.
Esta meizotrombina (des F1) estable tiene aplicación potencial, por
ejemplo, como anticoagulante. Se decidió lograr esta estabilización
mediante la colocación de un enlace disulfuro entre los dominios
Kringle 2 y proteasa de la protrombina, como se muestra en la figura
5.
En primer lugar se aplicó el programa
informático MODIP a la estructura cristalina de rayos X de un
complejo de trombina humana de alfa-trombina y el
fragmento 2 (55), y la estructura cristalina de rayos X de la
meizotrombina (des F1) bovina (108), dando como resultado los
siguientes sitios predichos en la protrombina humana:
\vskip1.000000\baselineskip
Grado B:
- Asp261-Arg443
- (KR2-proteasa)
- His205-Lys572
- (KR2-proteasa)
\vskip1.000000\baselineskip
Grado C:
- Asp261-Lys567
- (KR2-proteasa)
\vskip1.000000\baselineskip
Después puede realizarse una inspección visual
de uno o más de los sitios sugeridos utilizando un análisis gráfico
informático. Como resultado de este análisis puede elegirse una
serie de sitios para su posterior investigación. Para cada uno de
estos tres sitios puede construirse un modelo de homología de
meizotrombina (des F1) que incluya un puente disulfuro en la
localización apropiada utilizando el programa informático Xfit,
proporcionando el programa informático X-PLOR un
refinamiento utilizando el campo de fuerza de todos los átomos
Charm22. Después del refinamiento, los modelos de enlaces disulfuro
pueden clasificarse basándose en la calidad de la geometría
potencial para un enlace disulfuro. Entonces puede elegirse una
serie de sitios sugeridos, o sitios que aún no se hayan
identificado, para intentar crear una protrombina mutante de una
manera análoga a la descrita con referencia al FV y al FVIII no
híbrido anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
5
Como se indicó anteriormente, existen al menos
dos formas del factor XII activado (FXIIa): \alphaFXIIa y el
fragmento FXIIa. Como también se indicó anteriormente, el fragmento
FXIIa tiene la mayor parte de su fragmento de cadena pesada
N-terminal sin asociar, de forma que ya no se une a
superficies pero aún es catalíticamente activo. Según la presente
invención, puede colocarse un enlace disulfuro que entrecruce este
fragmento de cadena pesada N-terminal al resto de
la molécula, provocando que mantenga sus características de unión a
superficies. Se espera que este FXII estabilizado mutante tenga
aplicaciones farmacéuticas como coagulante.
Un segundo polipéptido de tipo FXII es HGFA. El
HGFA activa el factor del crecimiento de hepatocitos (HGF) en
tejidos lesionados, en los que el HGF desempeña un papel en la
reparación de tejidos. Como se indicó anteriormente, la ruptura del
HGFA por la calicreína en Arg372 produce la liberación de la cadena
pesada N-terminal que, al igual que en FXII, está
implicada en la unión a superficies. Según la presente invención,
puede colocarse un enlace disulfuro para evitar la liberación de la
cadena pesada N-terminal. Se sospecha que un HGFA
mutante estabilizado de esta manera podría utilizarse de modo
farmacéutico para ayudar a la reparación de tejidos.
Un tercer polipéptido de tipo FXII es PHBP. Como
se indicó anteriormente, el PHBP activa el FVII, uPA y tPA, y tiene
una estructura homóloga al HGFA. Según la presente invención, puede
colocarse un enlace disulfuro para evitar la liberación de la
cadena pesada N-terminal en PHBP. Se sospecha que un
PHBP mutante estabilizado de esta manera podría utilizarse de modo
farmacéutico para estimular la coagulación a través de la activación
de FVII, uPA y tPA.
No existen estructuras cristalinas de rayos X ni
estructuras de RMN para el factor XII, HGFA o PHBP. Sin embargo,
pueden crearse u obtenerse modelos de homología para estas
moléculas, como aquellos basados en la estructura cristalina de
rayos X de la uroquinasa. Utilizando estos modelos de homología
pueden crearse mutantes de una manera análoga a la descrita
anteriormente con referencia, por ejemplo, al FV y al FVIII.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
6
Como se conoce en la técnica, varios factores
plasmáticos diferentes de los factores V y VIII son sintetizados
como una única cadena polipeptídica, contienen múltiples dominios
plegados independientemente, y son sometidos a una proteolisis
limitada que puede producir la separación de los dominios debido a
la disociación. Como se indicó anteriormente, los métodos descritos
en la presente pueden utilizarse en todos los casos en que se desee
colocar un enlace disulfuro entre dos dominios de un polipéptido.
Por consiguiente, será evidente para los expertos en la técnica que
los métodos descritos en la presente pueden aplicarse a una multitud
de polipéptidos, incluyendo muchos de los factores de la
coagulación humanos y no humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (12)
1. Un factor VIII mutante que comprende al menos
un par de cisteínas localizadas en restos seleccionados del grupo
que consiste en Met662-Asp1828 y
Tyr664-Thr1826.
2. Un ácido nucleico que codifica el factor VIII
mutante según la reivindicación 1.
3. Un vector, una célula hospedante o una
composición que comprende el ácido nucleico según la reivindicación
2.
4. Una composición que comprende el factor VIII
mutante según la reivindicación 1.
5. Una composición farmacéutica que comprende el
factor VIII mutante según la reivindicación 1, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
6. Una composición farmacéutica que comprende un
ácido nucleico, un vector o un virión que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica el factor VIII mutante según la
reivindicación 1, unida operablemente a elementos de control de la
expresión.
7. Un primer ácido nucleico, vector o virión que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera
del factor VIII mutante según la reivindicación 1, unida
operablemente a elementos de control de la expresión, y un segundo
ácido nucleico, vector o virión que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica la cadena pesada del factor VIII mutante
según la reivindicación 1, unida operablemente a elementos de
control de la expresión, para su uso como medicamento.
8. Una célula hospedante que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica el factor VIII mutante según
la reivindicación 1, unida operablemente a elementos de control de
la expresión, para su uso como medicamento.
9. Una célula hospedante que comprende (i) una
primera secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera del
factor VIII mutante según la reivindicación 1, unida operablemente a
elementos de control de la expresión, y (ii) una segunda secuencia
de nucleótidos que codifica la cadena pesada del factor VIII mutante
según la reivindicación 1, unida operablemente a elementos de
control de la expresión, para su uso como medicamento.
10. Una composición farmacéutica que comprende
el factor VIII mutante según la reivindicación 1, para tratar un
mayor riesgo de sangrado en un sujeto.
11. Una composición farmacéutica que comprende
el factor VIII mutante según la reivindicación 1, para potenciar la
coagulación sanguínea y/o para tratar la hemofilia en un sujeto.
12. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 10 u 11, o un medicamento según las reivindicaciones
7 a 9, para su uso para tratar la deficiencia del factor VIII en un
mamífero.
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