ES2221926T3 - Fracciones del factor von willebrand de elevado y bajo pesos moleculares. - Google Patents
Fracciones del factor von willebrand de elevado y bajo pesos moleculares.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCESO PARA LA SEPARACION DE VWF EN VWF DE ALTO PESO MOLECULAR Y VWF DE BAJO PESO MOLECULAR, QUE SE CARACTERIZA DE TAL MODO, QUE SE LIGA EL VWF EN UN PORTADOR DE AFINIDAD Y SE ELUYE ENTONCES MEDIANTE CONCENTRACIONES DE SALES DIFERENTES.
Description
Fracciones del factor von Willebrand de elevado y
bajo pesos moleculares.
La invención se refiere a un procedimiento para
la separación del factor von Willebrand en una fracción de alto
peso molecular y otra de bajo peso molecular.
La invención se refiere además a compuestos para
su uso médico, conteniendo una fracción de bajo peso molecular de
moléculas de factor von Willebrand (FvW), una fracción de alto peso
molecular de moléculas de factor von Willebrand y una mezcla de
moléculas de FvW de las fracciones de bajo peso molecular y de alto
peso molecular.
Al factor von Willebrand le corresponden
funciones directas e indirectas en la coagulación normal de la
sangre. Se combina en un complejo con el factor VIII. Este complejo
sirve para la estabilización del factor VIII. Este factor VIII
estabilizado tiene una función de cofactor ensencial en la
activación del factor X. El factor von Willebrand interviene
también directamente en la coagulación de la sangre, mediando en la
agregación de plaquetas en vasos sanguíneos lesionados.
En el plasma el FvW circula en una concentración
de 5-10 mg/l en forma de un complejo no covalente
con el factor VIII. El FvW es una glucoproteína, sintetizada en
diferentes células del cuerpo humano y posteriormente liberada en
la circulación. En las células, a partir de una cadena de
polipéptidos con un peso molecular de aprox. 220.000 (monómero de
FvW), se forma, mediante la creación de varios puentes de azufre,
un dímero de FvW (dímero primario de FvW), con un peso molecular de
aprox. 550.000. A partir de los dímeros de FvW se forman mediante
enlace otros polímeros del FvW, con pesos moleculares cada vez
mayores hasta alcanzar los 20 millones aproximadamente.
Se conocen varios cuadros patológicos cuya causa
se explica por una producción insuficiente o excesiva del factor von
Willebrand. Así, por ejemplo, una sobreproducción de FvW produce
una mayor tendencia a la trombosis, mientras que un suministro
insuficiente de FvW tiene como consecuencia una mayor tendencia a la
hemorragia o un tiempo de hemorragia mayor.
La enfermedad de von Willebrand puede
manifestarse en varios cuadros sintomáticos. Todos los cuadros se
caracterizan por un tiempo de coagulación prolongado, que se
justifica por la carencia absoluta de un FvW o por un espectro
anormal en la composición de los multímeros del FvW. En este sentido
se han diagnosticado formas de la enfermedad de von Willebrand en
las cuales las síntesis de multímeros se encuentra reducida, como
también formas en las cuales apenas aparecen moléculas de FvW de
bajo peso molecular. Por su parte otras formas muestran moléculas
de FvW de alto peso molecular y de bajo peso molecular, pero su
concentración, esto es, su relación mutua está drásticamente
reducida o modificada en relación con una persona sana.
La carencia de FvW puede también provocar una
hemofilia A, pues el FvW, como hemos mencionado anteriormente, es un
componente esencial del factor VIII funcional. En estos casos la
vida media del factor VIII se reduce de tal manera que no puede
cumplir sus funciones específicas en la cascada de la
coagulación.
Todas las formas de manifestación de la
enfermedad de von Willebrand, como también la forma de la hemofilia
A que se explica por la carencia de FvW, se han tratado hasta ahora
compensando la carencia de FvW mediante infusiones intravenosas con
concentrados de plasma sanguíneo que contienen o bien el complejo
FvW - factor VIII o bien FvW enriquecido. En ninguno de los dos
casos de enfermedad se hace necesaria la administración de factor
VIII, pero la separación del FvW del factor VIII para preparados
resulta técnicamente muy difícil o imposible.
Para averiguar la función exacta de las moléculas
de FvW de alto peso molecular por una parte y de bajo peso
molecular por otra se han buscado formas de obtener estas
fracciones en forma enriquecida. Wagner D. D. et al. (J.
Cell Biol. 101:112, 1985) impiden la síntesis de multímeros mediante
la administración de monensina in vitro, y a partir de
diversos experimentos concluyen que la forma de bajo peso molecular
del FvW no es funcional. Por el contrario Senogles S. E. et al.
(J. Biol. Chem. 258:12327, 1983) no encuentran diferencias
funcionales en la agregación de plaquetas con ristocetina como
agente en formas del FvW de alto peso molecular y de bajo peso
molecular. Obtienen las formas de bajo peso molecular mediante
reducción de los puentes de azufre de moléculas de FvW de alto peso
molecular. Aihara, M. et al. (Tohoku J. exp. Med. 153:169,
1985) observan una escasa capacidad de enlace de las moléculas de
FvW de pacientes con enfermedad de von Willebrand del tipo IIa en
colágeno en una cromatografía de afinidad. Este tipo de enfermedad
de von Willebrand se caracteriza por la ausencia de moléculas de
alto peso molecular del FvW.
En la literatura especializada existen numerosos
procedimientos que describen una separación analítica de formas de
alto y de bajo peso molecular del factor de von Willebrand, para
informarse con seguridad sobre la relación cuantitativa de las dos
formas. Como ejemplo podemos mencionar aquí una publicación de
Baillod et al. en Thrombosis Res. 66:745, 1992. Por otra
parte Burnouf-Radosevich describe en Vox Sang
62:1-11, 1992 la limpieza del FvW por medio de
cromatografía de intercambio iónico y de afinidad a partir de
crioprecipitado. Las fracciones obtenidas mostraron un
enriquecimiento de las formas multímeras mayores en comparación con
el plasma normal, lo que se explicó por la cromatografía de
intercambio iónico. La actividad del concentrado obtenido de FvW en
el enlace de plaquetas se situó en un 86% respecto a la del FvW del
plasma. No obstante, un procedimiento para la separación en un
preparado de formas de bajo peso molecular y de alto peso molecular
no se ha descrito hasta ahora.
El objetivo de la presente invención es
desarrollar un procedimiento para la separación en un preparado de
factor von Willebrand (FvW) en una fracción de factor von
Willebrand de alto peso molecular y de bajo peso molecular.
Este objetivo se resuelve mediante un
procedimiento para la separación de FvW, en particular de factor
von Willebrand recombinante, en FvW de alto peso molecular y FvW de
bajo peso molecular, que se caracteriza porque se enlaza el FvW a
un vehículo de afinidad y se eluye a continuación en diferentes
concentraciones de sal.
En las subreivindicaciones 2 a 13 se describen
formas de realización preferidas.
En una forma de realización especialmente
preferida de la presente invención la separación se efectúa en un
sistema tampón sin Ca^{2+}. De esta manera se pueden conseguir,
con buenos rendimientos, fracciones del FvW de alto peso molecular
o fracciones del FvW-r de alto peso molecular, que
poseen una actividad fisiológica especialmente elevada.
Otro objeto de la presente invención es una
composición para su uso médico que contiene una fracción de bajo
peso molecular de moléculas de FvW, que contiene dímeros y
tetrámeros formados por subunidades idénticas de FvW.
La presente invención se refiere también a una
composición para uso médico que contiene una fracción de alto peso
molecular de moléculas de FvW, que presenta una actividad por
\mug de proteína en la agregación de plaquetas mejorada como
mínimo en un 50%, preferentemente en un 60%, en comparación con la
mezcla fisiológica de moléculas de FvW de alto peso molecular y de
bajo peso molecular. La actividad por \mug de proteína se puede
incrementar aún más de acuerdo con la invención.
En las subreivindicaciones 18 y 19 se describen
formas de realización preferidas.
La invención se refiere también al uso médico de
la composición que contiene la fracción de bajo peso molecular de
moléculas de FvW o la fracción de alto peso molecular de moléculas
de FvW para el tratamiento de la hemofilia A o de diferentes formas
de la enfermedad de von Willebrand.
Con vistas a la situación actual de la técnica no
era previsible que las fracciones obtenibles después de un
procedimiento de separación para preparados, o la mezcla de éstas,
fueran apropiadas para el tratamiento de las mencionadas
enfermedades.
El procedimiento según la invención resulta
apropiado de igual forma para el FvW plasmático como para el FvW
recombinante (FvW-r). El material de partida para
la separación de las fracciones de alto peso molecular y de bajo
peso molecular es una fracción plasmática enriquecida de FvW o bien
un medio de cultivo sin células después de la fermentación de
células animales, a partir del cual se ha aislado y purificado
previamente FvW-r.
El FvW utilizado para la separación se puede
purificar previamente con ayuda de cualquier procedimiento
conocido.
De acuerdo con el proceso según la invención para
la separación de FvW y sobre todo de FvW-r en
fracciones de alto peso molecular y de bajo peso molecular, el FvW
se enlaza con un vehículo de afinidad y se eluye a continuación con
diferentes concentraciones de sal.
Para conseguir rendimientos especialmente
elevados la separación se efectúa en un sistema tampón sin
Ca^{2+}.
Las fracciones del FvW de bajo peso molecular se
pueden eluir con una concentración de sal menor que la de las
fracciones del FvW de alto peso molecular.
Para la elución se pueden utilizar sales solubles
monovalentes y bivalentes. Se utiliza preferentemente NaCl. Las
sales de calcio no son apropiadas para la elución.
En una forma de realización preferida el FvW
enlaza con el vehículo de afinidad con una concentración de sal
inferior a 150 mM. Con una concentración de sal entre 150 y 250 mM,
y sobre todo con 160 mM se eluyen las agregaciones de bajo peso
molecular del FvW, y a continuación con una concentración de sal
superior a los 250 mM, y sobre todo \geq 270 mM, se eluyen las
agregaciones de alto peso molecular.
Como sal se utiliza preferentemente NaCl. Las
sales de calcio no resultan apropiadas.
El procedimiento según la invención se lleva a
cabo preferentemente en una columna de cromatografía de afinidad a
la heparina. Para la cromatografía de afinidad se puede utilizar
cualquier vehículo al que se pueda enlazar heparina. Han demostrado
su idoneidad, por ejemplo,
AF-Heparin-Toyopearl® (un polímero
hidrófilo sintético, de poro grueso basado en el metacrilato
(Tosohaas), Heparin EMD-Fraktogel® (un polímero
hidrófilo sintético basado en glicol etilénico, metacrilato y
dimetacrilato) (Merck) o bien Heparin Sepharose Fast Flow® (que
contiene dextrano natural y derivados de agarosa) (Pharmacia).
La cromatografía de afinidad se efectúa
preferentemente en un intervalo de pH entre 6,0 y 8,5, y en
particular con un valor de pH de 7,4.
En el procedimiento según la invención se utiliza
como sistema tampón una solución tampón compuesta de sustancias
tampón, especialmente un tampón Tris/HCl, tampón de fosfato o
tampón de citrato, y dado el caso sal, preferentemente libre de
estabilizadores, aminoácidos y otros aditivos. Se ha puesto de
manifiesto que con una solución de FvW tratada con ácido
etilendiaminotetracético (EDTA) en un sistema tampón sin Ca^{2+}
se puede conseguir una separación especialmente buena de los
agregados proteínicos del FvW de bajo peso molecular y de alto peso
molecular. De esta manera se pueden conseguir por tanto, con buenos
rendimientos, las fracciones del FvW de alto peso molecular o
fracciones del FvW-r de alto peso molecular que
poseen una actividad fisiológica especialmente
elevada.
elevada.
En el procedimiento según la invención se utiliza
preferentemente un concentrado de FvW recombinante procedente de
restos de cultivo, libres de células, de células transformadas.
De acuerdo con el procedimiento según la
invención para la separación de FvW en fracciones de alto peso
molecular y de bajo peso molecular, se puede conseguir FvW de bajo
peso molecular y de alto peso molecular de una forma eficaz y
sencilla. Así pues, según este procedimiento de separación se puede
fabricar, con buenos rendimientos, la fracción de FvW de alto peso
molecular o de bajo peso molecular especialmente activa desde el
punto de vista fisiológico, y por tanto sumamente apropiada para el
tratamiento de la hemofilia A y de diferentes formas de la
enfermedad de von Willebrand.
En una forma de realización preferida según la
presente invención se separa FvW purificado en FvW de alto peso
molecular y en FvW de bajo peso molecular.
El FvW utilizado para la separación se puede
purificar previamente con ayuda de cualquier procedimiento
conocido.
El factor von Willebrand purificado se puede
conseguir, de una forma especialmente preferente, según un
procedimiento que incluye las siguientes etapas: se purifica
cromatográficamente el factor von Willebrand plasmático mediante
una cromatografía de intercambio aniónico en un intercambiador
aniónico del tipo de amino cuaternario y mediante una cromatografía
de afinidad a la heparina inmovilizada en una solución tampón,
compuesta por sustancias tampón y dado el caso sal.
En otra forma de realización preferida el factor
von Willebrand purificado se puede conseguir según un procedimiento
que incluye las siguientes etapas: se purifica cromatográficamente
el factor von Willebrand recombinante mediante una cromatografía de
intercambio aniónico en un intercambiador aniónico del tipo de
amino cuaternario y mediante una cromatografía de afinidad a la
heparina inmovilizada en una solución tampón, compuesta por
sustancias tampón y dado el caso sal.
El factor von Willebrand purificado se puede
obtener, de una forma especialmente preferente, según un
procedimiento en el cual el concentrado de FvW-r se
purifica a partir de restos de cultivo, libres de células, de
células transformadas.
En la purificación de FvW se utiliza
preferentemente como solución tampón un sistema tampón libre de
estabilizadores, aminoácidos y otros aditivos.
La cromatografía de intercambio aniónico y/o la
cromatografía de afinidad se efectúa preferentemente en un
intervalo de pH entre 6,0 y 8,5, y con preferencia con un valor de
pH de 7,4.
El factor von Willebrand que en la cromatografía
de intercambio aniónico forma enlace con el intercambiador aniónico
y, en la cromatografía de afinidad forma enlace con la heparina
inmovilizada, se puede eluir aumentando la concentración de
sal.
El intercambiador aniónico cuaternario es
preferentemente un fractogel con estructura de tentáculos,
especialmente un fractogel EMD-TMAE.
En el procedimiento de purificación el FvW enlaza
sobre todo con el intercambiador aniónico en una concentración
salina de NaCl de \leq 270 mM, y se eluye en una concentración
salina de NaCl superior a 270 mM, y preferentemente de NaCl
superior a 280 mM.
En la purificación del FvW la cromatografía de
afinidad se efectúa preferentemente en un vehículo con heparina
enlazada en él, para lo cual resultan igualmente apropiadas
AF-Heparin-Toyopearl® (Tosohaas),
Heparin EMD- Fraktogel® (Merck) y Heparin Sepharose Fast Flow®
(Pharmacia).
En una forma de realización especial el factor
von Willebrand purificado se puede obtener según un procedimiento
en el cual el FvW purificado previamente en la cromatografía de
intercambio aniónico enlaza con la heparina inmovilizada en una
concentración salina inferior a NaCl de 150 mM y se eluye en una
concentración salina superior a NaCl de 150 mM, preferentemente
entre NaCl de 200 y 300 mM y de forma óptima de NaCl entre 160
y
270 mM.
270 mM.
Resulta ventajoso recurrir, como material de
partida para la separación de FvW de alto peso molecular y de bajo
peso molecular, a concentrados ya purificados. El procedimiento de
separación cromatográfico provoca adicionalmente otro efecto de
purificación.
Las fracciones de alto peso molecular y de bajo
peso molecular obtenidas según el procedimiento de separación de
acuerdo con la invención, así como las mezclas de ambas fracciones
en cualquier proporción de mezcla, son fisiológicamente activas y
se pueden utilizar con fines terapéuticos.
La fracción de bajo peso molecular de moléculas
de FvW se caracteriza por contener principalmente dímeros y
tetrámeros, compuestos de subunidades idénticas de FvW.
En la fracción de bajo peso molecular el
porcentaje de dímeros y tetrámeros es mayor que en la composición
fisiológica del FvW.
Se encontró, de forma sorprendente, que las
fracciones de bajo peso molecular están formadas de FvW
recombinante compuesto de subunidades idénticas, mientras que las
fracciones del FvW plasmático están compuestas de una mezcla de
dímeros o tetrámeros con diferentes subunidades.
La fracción de bajo peso molecular de moléculas
de FvW se puede obtener según un procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 13.
La fracción de bajo peso molecular de moléculas
de FvW contiene como mínimo un 83% de dímeros, como máximo un 16%
de tetrámeros y como máximo un 1% de polímeros superiores. La
fracción de bajo peso molecular está libre de efecto de agregación
de plaquetas, enlaza el factor VIII, contribuye a la estabilización
del factor VIII e influye positivamente sobre la estabilidad de
almacenamiento del factor VIII.
La fracción de bajo peso molecular de moléculas
de FvW está formada preferentemente por FvW recombinante.
La fracción de alto peso molecular de moléculas
de FvW presenta una actividad por \mug de proteína en la
agregación de plaquetas mejorada como mínimo en un 50%,
preferentemente en un 60%, en comparación con la mezcla fisiológica
de moléculas de FvW de alto peso molecular y de bajo peso
molecular.
La fracción de alto peso molecular de moléculas
de FvW se puede obtener según un procedimiento conforme a una de
las reivindicaciones 1 a 13.
Se encontró, de forma sorprendente, que la
fracción de alto peso molecular de FvW recombinante contiene
múltimeros formados por subunidades idénticas de FvW, mientras que
las fracciones del FvW plasmático están compuestas de una mezcla de
multímeros con diferentes subunidades.
La fracción de alto peso molecular de moléculas
de FvW está formada preferentemente por FvW recombinante.
De forma sorprendente se encontró que tanto la
fracción de bajo peso molecular como la de alto peso molecular de
FvW recombinante poseen una capacidad de enlace de factor VIII
potencialmente superior en comparación con las fracciones
correspondientes del FvW plasmático. Las fracciones del FvW
recombinante enlazan, por tanto, factor VIII con mayor eficacia que
las fracciones plasmáticas.
La diferente utilización de las fracciones de
alto y de bajo peso molecular se deduce de su actividad
fisiológica. La posibilidad de fabricar mezclas selectivas de ambas
fracciones permite el tratamiento de indicaciones médicas
especiales.
Otro objeto de la presente invención es, por
tanto, la utilización de la fracción de bajo peso molecular de
moléculas de FvW o de la fracción de alto peso molecular de
moléculas de FvW para el tratamiento de la hemofilia A o de
diferentes formas de la enfermedad de von Willebrand.
Hemos de señalar especialmente que, con la
utilización de un FvW recombinante en el procedimiento de
separación conforme a la invención, los productos finales
(fracciones de alto peso molecular y de bajo peso molecular, así
como mezclas de ambas fracciones en cualquier proporción de mezcla)
están libres de proteínas plasmáticas, de factor VIII y de virus
patógenos. Esto puede ser sumamente ventajoso en la fabricación de
productos farmacéuticos, como los arriba mencionados, para
determinadas indicaciones médicas.
Es también objeto de la presente invención una
composición médica que contiene la fracción de bajo peso molecular
de moléculas de FvW o la fracción de alto peso molecular de
moléculas de FvW en un vehículo tolerable fisiológicamente.
La composición farmacéutica contiene
preferentemente factor VIII o uno o varios mutantes por deleción
funcionales del factor VIII, con lo cual las moléculas de FvW de la
fracción de alto peso molecular, de la fracción de bajo peso
molecular o de la mezcla de ambas estabilizan el factor VIII o el
(los) mutante(s) por deleción del factor VIII.
Para la fabricación de preparaciones
farmacéuticas se concentran preferentemente las respectivas
fracciones o sus mezclas y el concentrado se procesa
posteriormente.
La fabricación de los compuestos farmacéuticos
puede tener lugar en las formas conocidas y habituales. Los
productos (fracciones de bajo peso molecular y de alto peso
molecular), o los concentrados que los contienen, se mezclan con un
vehículo apropiado, fisiológicamente tolerable. Como vehículo sirve
preferentemente una solución fisiológica de sal común.
Los compuestos farmacéuticos pueden presentarse
en una forma de administración habitual para el tratamiento de la
hemofilia A y de diferentes formas de la enfermedad de von
Willebrand; preferentemente se presentan en la forma de un
preparado apropiado para la infusión. En los siguientes ejemplos la
invención se explica con más detalle, sin que esto suponga limitar
sus posibilidades.
En el ejemplo 1 se muestra la separación según la
invención de polímeros de FvW de alto peso molecular y de bajo peso
molecular por medio de la cromatografía de afinidad a la
heparina.
Se aplicó factor von Willebrand recombinante
(FvW-r) en tampón de Tris - HCl de 20 mM (tampón de
Tris), pH 7, 4, a una columna de cristal que se había llenado de AF
Heparin Toyopearl® (firma Tosohaas), con un desplazamiento
volumétrico de 1 ml/min/cm^{2}. La columna se limpió primero con
un tampón de Tris, para eliminar proteínas enlazadas no
específicas. A continuación se eluyó la columna con 160 mM de NaCl
en tampón de Tris y después con 270 mM de NaCl en tampón de Tris.
Durante la cromatografía se siguió la absorción de proteínas en la
forma habitual a 280 nm. Después de la cromatografía se determinó la
concentración de proteínas mediante el método Bradford (M.
Bradford, Anal. Biochem. 72:248-254, 1976).
El contenido de FvW-r se determinó mediante un
sistema ELISA (Boehringer Mannheim) habitual en el comercio. La
distribución de las estructuras multiméricas del factor von
Willebrand recombinante en las diferentes fracciones de la
purificación se exploró de la forma habitual mediante
electroforesis de SDS-agarosa y se evaluó
cuantitativamente mediante densitometría. La capacidad de agregación
plaquetaria inducida por ristocetina se exploró por medio de un
sistema de prueba habitual en el comercio (reactivo de von
Willebrand, Behring Werke).
La figura 1 muestra el espectro de multímeros de
cada una de las fracciones obtenidas. En una concentración salina
de 160 mM de NaCl se eluyó FvW-r de bajo peso
molecular, principalmente del tipo dímero primario. Por otro lado
se eluyó FvW-r de alto peso molecular en una
concentración salina de 270 mM de NaCl.
La figura 2 muestra una evaluación densitométrica
de la distribución de los multímeros del factor von Willegrand
recombinante obtenido con 160 mM de NaCl. Esta evaluación dio como
resultado que la mezcla de polímeros de FvW-r así
obtenida consta en un 84,4% del dímero primario (peso molecular
440.000 aprox.) y en un 14,9% del tetrámero (peso molecular 880.000
aprox.).
Una evaluación densitométrica, que se puede ver
en la figura 3, de la fracción de FvW-r, obtenida
mediante elución con 270 mM de NaCl dio como resultado que la
mezcla de polímeros de FvW-r así obtenida estaba
formada por una cascada de polímeros de peso molecular cada vez
mayor.
En la tabla 1 se resumen los resultados de la
cromatografía y los primeros análisis funcionales de las fracciones
de FvW-r. De los resultados se deduce que casi
todo el FvW-r enlazó con el vehículo. La mezcla de
polímeros (de bajo peso molecular) de FvW-r eluida
con 160 mM de NaCl no mostraba capacidad alguna de agregación de
plaquetas. La fracción (de alto peso molecular) obtenida con 270 mM
de NaCl poseía una elevada actividad en relación con la agregación
plaquetaria. En comparación con el material de partida, con la
separación de las formas de FvW-r de bajo peso
molecular, no agregantes, la actividad específica se incrementó en
un 69% en relación con la aglutinación.
Con la cromatografía del FvW-r
descrita en el ejemplo 1 en el vehículo de afinidad se aumentó
sustancialmente al mismo tiempo la pureza del FvW-r.
El FvW-r de la fracción de 160 mM de NaCl mostró una
pureza doble, y el FvW-r de la fracción de 270 mM
de NaCl una pureza seis veces superior en comparación con el
material de partida.
Las siguientes pruebas se efectuaron en placas de
microtitración de ELISA revestidas con inmunoglobulina anti FvW
(Asserachrom FvW, Boehringer Mannheim). Mediante incubación de 1
hora a temperatura ambiente, con 200 \mul de HCl de Tris de 50
mM, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,5% albúmina, 0,1% de Tween 20 (tampón
TBS), que contenía 100 ng/ml FvW:AG, se acoplaron cada vez 5 ng de
FvW a las vasijas de reacción. Se efectuaron los siguientes ensayos
de FvW: FvW humano (Diagnostica Stago), FvW-r
(material de partida del ejemplo 1), FvW-r de bajo
peso molecular (fracción de elución de 160 mM de NaCl del ejemplo
1), FvW-r de alto peso molecular (fracción de
elución de 270 mM de NaCl del ejemplo 1). A continuación se lavaron
las placas de microtitración 3 veces durante 3 minutos con TBS, y
después se recubrió cada vasija de reacción con 25 \mul de factor
VIII recombinante (Miles) en TBS y se incubó 1 hora a temperatura
ambiente. La concentración del factor VIII se varió en el intervalo
entre 100 mU/ml y 7,12 mU/ml. Posteriormente se lavaron las vasijas
de reacción 3 veces durante 3 minutos con 200 \mul de TBS cada
una. A continuación se determinó la cantidad de factor VIII
enlazado por el FvW inmovilizado por medio de un sistema de prueba
obtenido en el comercio (Chromogenix Coatest VIII:C/4).
La figura 4 muestra el enlace del factor VIII al
factor von Willebrand dependiendo de la cantidad suministrada de
factor VIII. Los resultados muestran que todas las fracciones del
FvW estudiadas enlazan el factor VIII de una manera dependiente de
la concentración, con lo cual el FvW-r mostró, en
comparación con el FvW humano, un enlace casi idéntico de factor
VIII. El FvW-r de la fracción de 270 mM de NaCl en
el ejemplo 1 mostró un mayor enlace de factor VIII y el
FvW-r de la fracción de 160 mM de NaCl un enlace
escasamente inferior.
En el cuerpo humano el factor VIII se enlaza
fisiológicamente mediante el factor von Willebrand, y es estable en
esta forma. Por el contrario, el factor VIII no enlazado se
inactiva mediante proteólisis en pocos minutos.
Diferentes fracciones de factor von Willebrand
recombinante, obtenidas según el método del ejemplo 1, se agregaron
en cultivo celular a células SK-Hep transformadas,
que segregan factor VIII. Al cabo de 24 horas se determinaron, en
los restos de cultivo celular, las actividades del factor VIII
recombinante por medio de un sistema de prueba obtenido en el
comercio (Chromogenix Coatest VIII:C/4). La tabla 2 reúne los
resultados.
Por los resultados se puede observar que la
adición de FvW-r a las células originaba después de
24 horas una concentración de factor VIII sustancialmente mayor.
Tanto la fracción de FvW de alto peso molecular como la fracción de
FvW de bajo peso molecular enlazan y estabilizan el factor VIII, si
bien la fracción de alto peso molecular tiene una mayor capacidad
de estabilización del factor VIII que la fracción de bajo peso
molecular.
Estos datos muestran además que con la adición de
factor von Willebrand se puede estabilizar también el factor VIII
obtenido en la forma recombinante.
| Muestra 15 \mug/ml | Actividad del factor VIII después de 24 horas U/ml |
| Control | 0,5 |
| FvW-r de partida | 1,8 |
| Eluato de FvW-r de 160 mM de NaCl | 0,8 |
| Eluato de FvW-r de 270 mM de NaCl | 2,4 |
Se congelaron a -20ºC mezclas de factor VIII y
factor von Willebrand recombinante procedentes de restos de cultivos
celulares, tal como se obtuvieron en el ejemplo 3 y se conservaron
a -20ºC durante 6 días. Posteriormente se determinó nuevamente la
actividad del factor VIII. La tabla 3 reúne los resultados.
Por los resultados se puede observar que todas
las fracciones examinadas de FvW multiplican la estabilidad de
almacenamiento del factor VIII por más de 2,5. Esto permite
deducir, también con la fracción de bajo peso molecular, un fuerte
enlace del complejo FvW - factor VIII.
| Muestra 15 \mug/ml | Actividad del factor VIII (mU/ml) | ||
| t = 0 | t = 6 días | Pérdida en % | |
| Control | 500 | 150 | 70 |
| FvW-r de partida | 1800 | 1300 | 28 |
| Eluato de FvW-r de 160 mM de NaCl | 800 | 600 | 25 |
| Eluato de FvW-r de 270 mM de NaCl | 2400 | 1800 | 25 |
Se obtuvo FvW recombinante según el procedimiento
habitual tras la infección de células vero (células renales de
mono) con virus vaccinia en técnica de cultivo celular.
Los sistemas de expresión vero/vaccinia y las
condiciones del cultivo celular se describen exhaustivamente en F.
G. Falkner et al., Thrombosis and Haemostasis 68
(1992) 119-124, N. Barrett et al., AIDS
Res. 5 (1989) 159-171 y F. Dorner et
al., AIDS Vaccine Research and Clinical Trials, Marcel
Dekker, Inc., Nueva York (1990). La expresión del
FvW-r tuvo lugar en un medio estándar DMEM
sintético (Dulbeccos minimal essential medium).
Después de la fermentación de las células
transformadas el medio de cultivo se separó, y las células y
fragmentos celulares se retiraron mediante centrifugado. Otros
componentes menores, como fragmentos de membrana o bacterias, se
retiraron mediante filtración a través de un filtro con los poros
de un tamaño de 0,4 \mum.
Se filtraron 770 ml de restos de cultivo sin
células, con un desplazamiento volumétrico de 2 ml/cm2/min a través
de una columna (1,6 cm \times 5 cm, rellena con 10 ml de
intercambiador aniónico EMDTMAE-Fractogel (Merck)).
El gel se equilibró previamente con tampón Tris-HCl
de 20 mM (pH 7, 4). A continuación la columna se lavó con tampón
Tris-HCl de 20 mM (pH 7, 4). Las sustancias
extrañas se retiraron lavando la columna con un tampón que contiene
200 mM de NaCl. El FvW-r se eluyó después del
vehículo con 280 mM de NaCl en tampón Tris-HCl de
20 mM (pH 7, 4). Finalmente se eluyó de la columna el material
restante que pudiera encontrarse, con 1 M de NaCl. Durante la
cromatografía se siguió la absorción de proteínas en la forma
habitual a 280 nm. Después de la cromatografía se determinó la
concentración de proteínas según el método Bradford (M. Bradford,
Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254). El
contenido de FvW-r se determinó mediante un sistema
ELISA (Boehringer Mannheim) habitual en el comercio.
Se encontró que casi todo el
FvW-r se había enlazado al vehículo. El FvW se
eluyó con NaCl de 0,28 M del intercambiador aniónico. Los resultados
de la purificación de FvW-r en el intercambiador
aniónico se resumen en la tabla 4.
Con la purificación descrita en este ejemplo el
FvW-r se enriqueció en el séxtuplo.
| Muestra | Volumen (ml) | Proteína total (\mug/ml) | FvW-r (\mug/ml) | FvW-r/Proteína total |
| Resto de cultivo libre de células | 770 | 113 | 7,9 | 0,069 |
| Elución con 200 mM de NaCl | 95 | 147 | 0,0016 | 0,00001 |
| Elución con 280 mM de NaCl | 75 | 168 | 61 | 0,36 |
| Elución con 1 M de NaCl | 50 | 196 | 6 | 0,03 |
Se diluyó FvW-r obtenido según el
ejemplo 5 para reducir la concentración de sal (160 mM de NaCl)
con un tampón Tris-HCl de 20 mM (pH 7, 4). A
continuación se filtró la solución a través de una columna (1,6 cm
\times 5 cm, rellena con 10 ml de AF Heparin Toyopearl 650
(Tosohaas)) con un desplazamiento volumétrico de 1 ml/cm2/min. La
columna se había equilibrado previamente con tampón
Tris-HCl de 20 mM (pH 7, 4). En un primer momento
las proteínas no específicas enlazadas se retiraron mediante lavado
con tampón Tris-HCl de 20 mM (pH 7, 4). El
FvW-r se eluyó después del vehículo con 270 mM de
NaCl en tampón Tris-HCl de 20 mM (pH 7, 4).
Finalmente se eluyó de la columna el material restante con 1 M de
NaCl. Durante la cromatografía se siguió la absorción de proteínas
en la forma habitual a 280 nm. Después de la cromatografía se
determinó la concentración de proteínas mediante el método Bradford
(M. Bradford, loc. cit.). El contenido de FvW-r se
determinó mediante un sistema ELISA (Boehringer Mannheim) habitual
en el comercio.
Se encontró que casi todo el
FvW-r había enlazado con el vehículo. En la elución
con 270 mM de NaCl se eluyó de la columna la mayor parte del
FvW-r, mientras que el lavado con 1 M de NaCl
contenía tan sólo rastros de FvW-r. Los resultados
de esta etapa de la purificación se resumen en la tabla 5. Con esta
etapa de la purificación se elevó el porcentaje de proteína de
FvW-r a más de un 86% en relación con la proteína
total.
La fracción de 270 mM de NaCl se examinó en más
detalle con una electroforesis desnaturalizante de gel de proteínas
con SDS (U. K. Laemmli, Nature 227 (1970)
680-685) y a continuación con una prueba
Western-Blot.
Como se puede ver en la figura 5, el análisis
mediante electroforesis desnaturalizante dio como resultado que con
la purificación descrita en los ejemplos 5 y 6 se había obtenido
FvW-r con una mayor pureza. En el producto así
obtenido no se pudo demostrar la presencia de otros factores de
coagulación, como por ejemplo el factor VIII.
| Muestra | Volumen (ml) | Proteína total (\mug/ml) | FvW-r (\mug/ml) | FvW-r/Proteína total |
| Concentrado de FvW-r | 225 | 50 | 13,9 | 0,27 |
| Elución con 270 mM de NaCl | 43 | 70 | 60 | 0,86 |
| Elución con 1 M de NaCl | 32 | 25 | 2 | 0,08 |
El factor von Willebrand recombinante
(FvW-r), el factor von Willebrand obtenido de plasma
humano (FvW-p) y el factor von Willebrand obtenido
de crioprecipitado (FvW-c) se purificaron mediante
combinación entre cromatografía de intercambio aniónico y
cromatografía de afinidad a la heparina.
En la cromatografía de intercambio aniónico el
material de partida (FvW-r: restos de fermentación
de células CHO recombinantes; FvW-p: plasma humano
con citrato; FvW-c: crioprecipitado de plasma) se
lleva a una columna de Fractogel EMD-TMAE (firma
Merck) y se obtiene FvW por elución con tampón de Tris/HCl de 20
mM, pH 7, 0, y 280 mM de NaCl. A continuación las preparaciones se
diluyeron añadiendo un tampón de Tris/HCl de 20 mM a una
concentración salina de 90 mM y se llevaron a una columna de
Fractogel-EMD-Heparin (firma Merck).
El FvW se eluyó mediante una elución progresiva con concentración
de sal creciente. Aquí la concentración de NaCl en el tampón de
Tris/HCl de 20 mM, pH 7,0, se varió entre 120 mM y 280 mM. De esta
manera se obtuvieron, para el FvW-p,
FvW-c y FvW-r, preparaciones con 120
mM de NaCl, 160 mM de NaCl, 190 mM de NaCl, 230 mM de NaCl y 280 mM
de NaCl, que se diferencian entre sí por la composición de los
multímeros.
El contenido de FvW (antígeno de FvW, FvW:AG) se
determinó mediante una prueba ELISA corriente (Asserachrom vWF,
Boehringer Mannheim).
El enlace de factor de coagulación VIII con el
FvW-p, FvW-c y FvW-r
se determinó por medio de un "real-time
biospecific interaction analysis", basado en mediciones de
la tecnología de resonancia de plasmon superficial (Malmqvist, M.,
Natur 1993; 361: 186-187). Aquí se determinó
la relación estequiométrica de las subunidades de FvW con el factor
VIII enlazado: Un antihumano monoclónico de anticuerpo von
Willebrand (AvW82) se enlazó de forma covalente con el chip sensor
CM5 (Pharmacia Biosensor AB) (O'Shannessy, D. J. et al., 1993
Anal. Biochem. 212: 457-468; Karlsson, R.,
1994, Anal. Biochem. 221: 142-151). La
medición de las unidades de resonancia (RU) corresponde a la línea
básica (RU_{BL}).
Los FvW-p, FvW-c
y FvW-r se disolvieron en HEPES de 10 mM, pH 7,4,
105 mM de NaCl, 1 mM de CaCl_{2}, 0,05% de surfactante P 20
(tampón HBS), hasta llegar a una concentración de 20 \mug/ml.
Para cada experimento se utilizaron 50 \mul de pruebas del FvW
aplicados a través del chip sensor, con un desplazamiento
volumétrico de 5 \mul/min, para permitir el enlace de AvW8/2 al
FvW (fase A). El FvW no enlazado se retira mediante lavado con
tampón HBS (fase B). El FvW-p y el
FvW-c se lavaron adicionalmente con 20 \mul de 250
mM de CaCl_{2}, para retirar restos de factor VIII plasmático. El
enlace de FvW al AvW8/2 se corresponde con la unidad de resonancia
del FvW (RU_{FvW}). Para el análisis del enlace del factor VIII
se inyectaron 60 ml de FVIII recombinante (2,5 \mug/ml en tampón
HBS) a través del chip sensor, con una tasa de flujo constante de 5
\mul/ml, para permitir el enlace del factor VIII al FvW (fase C).
La medición de las unidades de resonancia se corresponde con el
enlace de FVIII (RU_{FVIII}). Mediante el lavado con tampón HBS el
factor VIII se volvió a disociar del FvW (fase D). La relación
estequiométrica del complejo formado por el FVIII y la subunidad de
FvW se deduce de las unidades de resonancia y de los pesos
moleculares: FvW (subunidad): FVIII = (RU_{FvW} - RU_{BL}) /
(RU_{FVIII} - RU_{FvW}) \times 330.000 / 220.000 (O'Shannessy,
D. J. et al., 1993, Anal. Biochem. 212:
457-468; Karlsson, R., 1994, Anal. Biochem.
221: 142-151).
La fig. 6 muestra el sensograma de la adición de
factor VIII-r al FvW-r.
| Ejemplo | Estequiometría subunidad de FvW : FVIII |
| Eluato de 120 mM de FvW-r | 2,25: 1 |
| Eluato de 160 mM de FvW-r | 2,5: 1 |
| Eluato de 190 mM de FvW-r | 2,0: 1 |
| Eluato de 230 mM de FvW-r | 2,0: 1 |
| Eluato de 280 mM de FvW-r | 2,0: 1 |
| Eluato de 280 mM de FvW-c | 2,6: 1 |
| Eluato de 280 mM de FvW-p | 3: 1 |
La tabla 6 muestra la estequiometría de FvW:
factor VIII de fracciones de bajo peso molecular y de alto peso
molecular de FvW plasmático y recombinante. Los datos muestran que
tanto la fracción de bajo peso molecular como la de alto peso
molecular del FvW-r presenta una capacidad de enlace
con el factor VIII mayor que la del FvW-p.
El FvW plasmático (FvW-p), el FvW
procedente de crioprecipitado (FvW-c) y el FvW
recombinante (FvW-r) se purificaron mediante
cromatografía de afinidad a la heparina y las fracciones de bajo
peso molecular y de alto peso molecular se separaron de acuerdo con
el ejemplo 1.
En la fig. 7 se puede observar que las diferentes
fracciones del FvW-p y del FvW-c
presentan bandas sustancialmente menos marcadas que las del
FvW-r. En la fig. 8 esto se observa con una
claridad aún mayor al comparar directamente los multímeros
separados del FvW-p y del FvW-r. Se
pueden ver claramente las bandas marcadas del FvW-r
después de la separación en el gel con SDS, mientras que en la
separación del FvW-p aparecen claramente productos
intermedios con diferentes pesos moleculares. Estas "bandas
intermedias" se explican por la mezcla heterogénea de
subunidades de FvW de diferentes tamaños en las fracciones del
FvW-p que se producen por digestión con la proteasa
que aparece en el plasma. Estos productos intermedios se conocen en
la literatura especializada como estructuras de triplete.
Claims (21)
1. Procedimiento para la separación de FvW en
fracciones de alto peso molecular y de bajo peso molecular,
caracterizado porque el FvW se enlaza con un vehículo de
afinidad y se eluye a continuación con diferentes concentraciones de
sal.
2. Procedimiento para la separación de FvW según
la reivindicación 1, caracterizado porque el FvW que se
pretende separar se encuentra en una fracción de plasma enriquecida
con FvW.
3. Procedimiento para la separación según la
reivindicación 1, caracterizado porque el FvW que se
pretende separar es FvW recombinante que se presenta en un
concentrado de FvW recombinante procedente de restos de cultivo de
células transformadas de los que se han retirado las células.
4. Procedimiento para la separación de FvW según
la reivindicación 1, caracterizado porque se separa FvW
purificado en FvW de alto peso molecular y FvW de bajo peso
molecular.
5. Procedimiento para la separación de FvW en FvW
de alto peso molecular y FvW de bajo peso molecular según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la separación
se efectúa en un sistema tampón libre de Ca^{2+}.
6. Procedimiento para la separación de FvW según
una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el
vehículo de afinidad es un vehículo con heparina enlazada en él,
para lo cual resultan igualmente apropiados
AF-Heparin-Toyopearl® (Tosohaas),
Heparin EMD-Fraktogel® (Merck) y Heparin Sepharose
Fast Flow® (Pharmacia).
7. Procedimiento para la separación de FvW según
una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque como
sistema tampón para la cromatografía de afinidad se utiliza una
solución tampón formada por sustancias tampón y, dado el caso,
sal.
8. Procedimiento para la separación de FvW según
la reivindicación 7, caracterizado porque como sistema tampón
se utiliza una solución tampón formada por tampón de Tris/HCl,
tampón de fosfato o de citrato y, dado el caso, sal común.
9. Procedimiento para la separación de FvW según
una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la
cromatografía de afinidad se efectúa en un intervalo de pH de entre
6,0 y 8,5, preferentemente con un valor de pH de 7,4.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el FvW de bajo
peso molecular se eluye con una concentración de sal menor que en
el caso del FvW de alto peso molecular.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el FvW se
enlaza al vehículo de afinidad con una concentración salina
inferior a 150 mM, porque con una concentración salina entre 150 y
250 mM, preferentemente de 160 mM, se eluye el agregado de bajo peso
molecular, y porque después, con una concentración salina superior
a 259 mM, preferentemente de 270 mM, se eluye la agregación de alto
peso molecular.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque como sales se
utilizan sales solubles univalentes y bivalentes.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque como sal se utiliza NaCl.
14. Composición para su uso médico,
caracterizada porque contiene una preparación de FvW de
moléculas de FvW purificadas de bajo peso molecular con un mínimo de
83% de dímeros de FvW, un máximo de 16% de tetrámeros de FvW y un
máximo de 1% de polímeros superiores, y un vehículo tolerable
fisiológicamente.
15. Composición para su uso médico según la
reivindicación 14, caracterizado porque contiene FvW
recombinante, formado por subunidades de FvW idénticas.
16. Composición para su uso médico según una de
las reivindicaciones 14 ó 15, caracterizada porque la
preparación de FvW está libre de efecto de agregación de
plaquetas, enlaza factor VIII, contribuye a la estabilización del
factor VIII e influye positivamente sobre la estabilidad de
almacenamiento del factor VIII.
17. Composición para su uso médico,
caracterizada porque contiene una preparación de FvW de
moléculas de FvW purificadas de alto peso molecular, donde las
moléculas de FvW de alto peso molecular presentan una actividad por
\mug de proteína en la agregación plaquetaria mejorada en un 50%
como mínimo, preferentemente en un 60% como mínimo, en comparación
con la mezcla fisiológica de moléculas de FvW de alto peso
molecular y de bajo peso molecular, y porque contiene un vehículo
tolerable fisiológicamente.
18. Composición para su uso médico según la
reivindicación 17, caracterizada porque contiene FvW
recombinante, formado por subunidades de FvW idénticas.
19. Composición para su uso médico según una de
las reivindicaciones 14 a 18, caracterizada porque contiene
un factor VIII o uno o varios mutantes por deleción funcionales del
factor VIII.
20. Utilización de una composición médica según
una de las reivindicaciones 14 a 19, para la fabricación de un
medicamento destinado al tratamiento de la hemofilia A o de
diferentes formas de la enfermedad de von Willebrand.
21. Utilización de una fracción de moléculas de
FvW de bajo peso molecular, donde ésta contiene sobre todo dímeros
y tetrámeros, o de una fracción de moléculas de FvW de alto peso
molecular, donde ésta presenta una actividad por \mug de proteína
en la agregación plaquetaria mejorada en un 50% como mínimo,
preferentemente en un 60% como mínimo, en comparación con la mezcla
fisiológica de moléculas de FvW de alto peso molecular y de bajo
peso molecular, para la fabricación de una preparación farmacéutica
para el tratamiento de la hemofilia A o de diferentes formas de la
enfermedad de von Willebrand.
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