ES2224245T3 - Purificacion del complejo factor viii mediante cromatografia de inmunoafinidad. - Google Patents
Purificacion del complejo factor viii mediante cromatografia de inmunoafinidad.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN COMPLEJO MUY PURO QUE SE COMPONE DE LOS COMPONENTES DEL FACTOR VIII Y DE VWF, CON UNA ACTIVIDAD ESPECIFICA DE AL MENOS 70, PREFERIBLEMENTE 100 A 300 E DEL FACTOR VIII:C/MG, UN PREPARADO FARMACEUTICO ESTABLE QUE CONTIENE ESTE COMPLEJO, ASI COMO UN PROCEDIMIENTO POR CROMATOGRAFIA DE INMUNOAFINIDAD PARA SU OBTENCION.
Description
Purificación del complejo factor VIII mediante
cromatografía de inmunoafinidad.
La presente invención se refiere a un complejo
altamente purificado formado por los componentes factor VIII
(factor VIII: C o FVIII) y factor von Willebrand (FvW), a una
preparación farmacéutica estable que contiene el complejo altamente
puro, así como a un procedimiento para la preparación de un
complejo factor VIII: C / FvW altamente purificado.
El factor von Willebrand es una glucoproteína
multimérica que está codificada por un gen en el cromosoma 12 y
circula en el plasma en concentraciones de 5 a 10 \mug/ml,
libremente y como complejo no covalente con el factor de
coagulación VIII, proteína que está codificada por un gen en el
cromosoma 10 y está ausente o falta en la hemofilia A.
Las dos funciones principales del FvW en la
hemostasis son:
- 1.
- La adhesión de los trombocitos al endotelio lesionado, para lo cual el FvW se liga al subendotelio herido y hace posible la formación de un puente entre esta superficie y las plaquetas, así como una agregación de estas últimas entre sí. La primera interacción entre los trombocitos y el subendotelio se realiza mediante la glucoproteína Ib de la membrana de los trombocitos y las fibras de colágeno del endotelio lesionado. El FvW se liga a estas dos proteínas y hace de mediador para la formación de una primera capa de trombocitos, interviniendo en la posterior reticulación de las plaquetas entre sí mediante el enlace al complejo glucoproteína IIb/IIIa. Los responsables de estas tareas en la hemostasis primaria son principalmente multímeros de gran tamaño (Eller; Lab. Med. (1994); 18: 168-176).
- 2.
- Debido a su sitio de unión para FVIII, el FvW influye también en la coagulación plasmática. El FVIII se halla en el plasma casi exclusivamente en forma de complejo no covalente con FvW, llevando aproximadamente una de cada diez moléculas de FvW una molécula de FVIII. Como portadores actúan sobre todo dímeros y multímeros de pequeño tamaño. Gracias a este complejo con FvW, el FVIII está protegido contra una inactivación proteolítica intensificada (por ejemplo por una proteína C activada).
Además, el complejo potencia el FVIII en lo que
se refiere a su actividad como cofactor en la coagulación
intrínseca (Eller; Lab. Med. (1994); 18:
168-176).
El FvW se forma en las células del endotelio
vascular, que constituyen la fuente principal de esta proteína
plasmática, mediante una liberación constitutiva o estimulada, pero
también se sintetiza, aunque en menor proporción, en los
megacariocitos (PNAS 92 (1995), 2428-2432).
El producto primario de la traducción se compone
de 2.813 aminoácidos. Una vez disociado el péptido señal (22
aminoácidos), se realiza la dimerización. El proceso posterior se
realiza en el aparato de Golgi, donde los dímeros se polimerizan
bajo disociación de los propéptidos (741 aminoácidos). El propéptido
desempeña un importante papel en la posterior ligadura de los
dímeros, catalizando la formación de enlaces disulfuro en el
extremo aminoterminal. De este modo se generan oligómeros de
distintos tamaños, que oscilan entre dímeros de 500.000 dalton y
multímeros de gran tamaño de hasta 20 millones de dalton.
Adicionalmente a los procesos proteolíticos, el FvW está sometido a
otras modificaciones postraduccionales, incluidas la glicosilación y
la sulfatación (Mancuso y col.: Hämostaseologie (1989); 9:
122-129).
Por tanto, la complejidad de la biosíntesis hace
que existan numerosas moléculas de FvW distintas con las más
diversas funciones y propiedades.
Como consecuencia, el factor von Willebrand puede
presentar actividades de enlace muy diferentes con respecto a sus
compañeros de enlace naturales. En particular, se ha comprobado que
la fuerza de enlace de diversas moléculas de FvW con la
glucoproteína Ib, con el colágeno, con la heparina, con el complejo
de glucoproteína IIb/IIIa, con el factor VIII y con el subendotelio
puede ser distinta.
Por tanto, esto implica que todas las
preparaciones de FvW consisten en una mezcla de las citadas
diversas proteínas de FvW o bien grupos de FvW y, consecuentemente,
son heterogéneas en lo que se refiere a sus propiedades, tales como
la fuerza de enlace esencial con respecto al factor VIII.
La presencia de diversas formas de FvW es también
el motivo de los complejos y distintos fenotipos en la
fisiopatología de la enfermedad de von Willebrand, que en ciertos
casos puede atribuirse a un déficit de producción del factor de von
Willebrand y en otros casos a un exceso de producción del mismo.
Por ejemplo, un exceso de producción de FvW conduce a una mayor
tendencia a las trombosis, mientras que un déficit en el suministro
de FvW tiene como consecuencia una mayor tendencia a las
hemorragias o mayor tiempo de coagulación, pero esto no puede
aplicarse en ningún caso de modo general, ya que también es
decisiva la forma en que se produce, en déficit o en exceso, el
factor de von Willebrand.
Para distinguir y caracterizar las propiedades
del FvW y el síndrome de FvW se emplean diversos métodos de
análisis.
Así pues, para el diagnóstico es imprescindible
determinar la actividad del cofactor ristocetina. Para ello se
estudia la agregación plaquetaria en presencia del antibiótico
ristocetina, que en los pacientes con síndrome de FvW se halla
reducida o es totalmente inexistente (Macfarlane y col.: Thrombosis
et Diathesis Haemorehagica 1775; 34: 306-308).
Además, la actividad de formación de colágeno del
FvW puede aprovecharse para la diferenciación del síndrome de FvW
(Thomas y col.: Hämastaselogie (1994); 14:
133-139).
La constante de disociación de enlace entre el
FvW y el FVIII puede determinarse según el método de Vlot y col.
(Blood 83 (11) (1995); 3150-3157).
La estructura molecular del FvW se determina
mediante el análisis de la estructura multimérica por medio de
electroforesis SDS en geles de agarosa al 1,2% (Ruggeri y col.:
Blood (1981); 57: 1140-1143).
Para determinar la cantidad total de antígeno FvW
se utilizan los más diversos kits de ensayo ELISA disponibles en el
mercado.
La preparación de un complejo FVIII/FvW óptimo
debería tener como objetivo la obtención de un producto estable,
pero sobre todo libre de proteínas acompañantes no deseadas, ya que
toda carga de proteínas innecesaria implica un riesgo de efectos
secundarios no deseados.
Por tanto, toda concentración de FvW no necesaria
para la estabilización de FVIII constituye una carga para el
hemofílico.
Hasta la fecha, en el curso de los procesos de
producción de preparaciones de factor von Willebrand, especialmente
a partir de pools plasmáticos, no ha sido posible excluir
totalmente el riesgo de heterogeneidad de la composición debido a
la presencia de distintas formas del factor von Willebrand, ni ha
sido posible, en el estado actual de la técnica, obtener una
preparación de FvW con propiedades uniformes, por ejemplo en lo que
se refiere a su actividad de enlace con un determinado ligando.
Ya se sabía cómo depurar el complejo factor VIII
mediante diversos anticuerpos monoclonales
anti-FvW, tanto a partir de plasma como a partir de
crioprecipitados (Thromb. Haemostas. 57 (1987),
102-105). También se ha ensayado la estabilidad del
complejo FVIII/FvW en distintos tampones con un pH 6,5, entre los
cuales se incluyen aquellos que contienen glicoles, aminoácidos,
agentes caotrópicos, aminas, otras sales o disolventes orgánicos
y/o detergentes. La adición de lisina a soluciones tampón junto con
sustancias caotrópicas en altas concentraciones, como por ejemplo
urea 3M, proporcionaba una protección del factor VIII: C/FvW:Ag
contra los efectos de desnaturalización. Las actividades de los
factores VIII:C y FvW R.cof. eran, tras una incubación con
etilenglicol al 20% en volumen + KI 1M por ejemplo, de un 72% o un
48%, y, en caso de tratamiento con urea 3M, de un 88% o un 77%.
La actividad específica del factor VIII:C en un
producto final, eluido con KI 1M + lisina 1M + imidazol 20mM +
CaCl_{2} 5mM, pH 6,5, era de 45 I.U./mg de proteína total, la del
FvW de 60 I.U./mg.
También se tiene información sobre la
purificación del complejo factor VIII/FvW por métodos
cromatográficos a partir de crioprecipitados tras su adsorción en
Al(OH)_{3} y sobre la realización de una
inactivación vírica utilizando anticuerpos monoclonales
anti-FvW (Biotechnol. Blood Prot. 227 (1993),
109-114). La elución del complejo adsorbido se
realizaba a un pH 6,5 bajo la adición del agente caotrópico KI
(1M). La relación factor VIII:C/FvW:Ag era 0,8 y la actividad
específica de factor VIII:C 38 i.u./mg.
Por último, por el documento EP-0
295 645-A2 se sabe cómo purificar el complejo
factor VIII mediante cromatografía de afinidad utilizando péptidos
específicos, dirigidos contra FvW, de líquidos biológicos
heterogéneos. Para ello se eluyó el complejo utilizando gradientes
de pH o tampones con una gran fuerza iónica (véase el ejemplo 5 del
documento EP-0 295 645-A2).
En el documento EP 0 416 983 A1 se describe una
preparación con el complejo factor VIII/FvW obtenida mediante
cromatografía de intercambio aniónico. Según el documento WO
86/01718 A1 se obtuvo una preparación de complejo factor VIII/FvW
mediante cromatografía en un anticuerpo monoclonal.
En el documento JP 01/144991 A se describe la
purificación del factor VIII:C o de un complejo factor VIII:C/FvW
mediante la adsorción en un portador con un anticuerpo monoclonal,
para lo cual el factor VIII:C o el complejo factor VIII:C/FvW se
liga con una baja concentración de iones metálicos y se eluye con
una alta concentración de iones metálicos.
Todos estos complejos factor VIII/FvW del estado
actual de la técnica tienen en común el hecho de que, a pesar de
una alta concentración y depuración de los preparados, no han sido
capaces de proporcionar un preparado homogéneo en lo que se refiere
al FvW, en lo que respecta a su enlace en relación con el factor
VIII:C, y por lo tanto no existía ningún complejo factor VIII/FvW
nativo con una alta actividad específica.
Por consiguiente, la presente invención se
plantea el problema de poner a disposición una preparación de factor
VIII/FvW que contenga un complejo factor VIII/FvW y que, en lo que
se refiere a las propiedades de enlace del FvW con respecto al
factor VIII, presente una estructura uniforme y gracias a ello sea
particularmente compatible o estable.
Según la invención, este problema se resuelve
mediante una preparación que contiene un complejo altamente
purificado, formado por los componentes factor VIII y factor von
Willebrand, con una actividad específica de como mínimo 70, y
preferentemente entre 100 y 300, U de factor VIII:C/mg, que puede
obtenerse purificando un material de partida que contiene los
factores VIII:C y FvW mediante cromatografía de afinidad,
eluyéndose de modo fraccionado el complejo factor VIII:C y FvW, así
como el factor VIII:C o el FvW no en complejo. En este proceso, el
factor VIII:C o el factor von Willebrand en no complejo, o sea
excedente, se separa mediante cromatografía de inmunoafinidad,
especialmente mediante elución fraccionada, lo que permite obtener
el factor en forma de complejo y de no complejo en fracciones
separadas.
Mediante la etapa de separación según la
invención del factor VIII:C o del factor von Willebrand no
complejo, se separan de forma selectiva especialmente moléculas de
factor von Willebrand con afinidad mermada con respecto al factor
VIII y, por primera vez, se obtiene un complejo factor VIII/FvW
nativo y homogéneo que contiene una fracción de FvW definida en lo
que se refiere a su afinidad con respecto al factor VIII.
Sorprendentemente, el complejo según la invención
es estable en cromatografía de inmunoafinidad en un medio
caotrópico. Ni siquiera en un medio con una conductividad de hasta
30 mS, preferentemente de hasta 40 mS, puede detectarse disociación
alguna del complejo. Así pues, el complejo estable factor VIII y
FvW puede eluirse y obtenerse de la columna anti-FvW
incluso con una fuerza iónica relativamente alta correspondiente a
una solución doble o triplemente isotónica.
En el complejo según la invención, el FvW
presenta preferentemente una actividad de enlace de colágeno en un
rango de 0,2 a 0,6, en relación con el antígeno de FvW (unidad de
plasma/unidad de plasma).
El complejo según la invención puede obtenerse
preferentemente mediante la purificación de un material de partida
que contenga los dos componentes, eluyéndose de forma fraccionada
el complejo y el factor VIII:C o FvW del portador de
inmunoafinidad.
Los eluyentes pueden contener también
concentraciones relativamente altas de agentes caotrópicos o sales
de acción caotrópica, ya que la cromatografía de inmumoafinidad se
realiza preferentemente en anticuerpos que conservan su afinidad o
avidez con relación al factor VIII o al FvW incluso en condiciones
estrictas y el complejo factor VIII/FvW obtenido permanece estable
también bajo dichas condiciones.
Por ejemplo, se eligen anticuerpos que liguen el
antígeno sin perjudicar las propiedades de enlace hasta una
concentración de NaSCN 1M o clorhidrato de guanidina 0,5M, o
incluso de sulfato amónico saturado al 100%. En cada caso un 50%
del antígeno se liga hasta una concentración de NaSCN 1,5M ó de
clorhidrato de guanidina 0,75M, de etilenglicol al 80% o de urea
0,75M. Los anticuerpos utilizados para la cromatografía de
inmunoafinidad son preferentemente anticuerpos fuertes que, en un
ensayo de enlace, se ligan al antígeno inmovilizado también en
disoluciones diluidas a un máximo de 30 ng/ml, preferentemente un
máximo de 15 ng/ml, lo que corresponde a una relación
anticuerpo/antígeno de 1:5 a 1:20.
Debido a las excelentes propiedades del complejo
según la invención en lo que se refiere a su homogeneidad,
especialmente en lo que respecta a las propiedades de enlace factor
VIII del FvW obtenido, dicho complejo es especialmente adecuado
para la obtención de preparaciones farmacéuticas para la
administración de factor VIII y/o FvW. Se ha comprobado que es
posible obtener el complejo según la invención en una concentración
como mínimo 5.000 veces mayor, preferentemente entre 7.100 y 21.400
veces mayor, que en el plasma. Por lo tanto, una forma de
realización especial de la presente invención es una preparación
farmacéutica estable que contiene el complejo altamente purificado
según la invención en una concentración como mínimo 5.000 veces
mayor, preferentemente entre 7.100 y 21.400 veces mayor, que en el
plasma, en la que el complejo presenta una gran fuerza de enlace de
complejo y está esencialmente libre de FvW o factor VIII:C no
complejo. De este modo se garantiza que no se perjudica al paciente
debido a FvW excedente y a otras proteínas, conservándose la
actividad fisiológica del complejo factor VIII/FvW. Así pues, el
preparado según la invención se distingue por su extraordinaria
aceptación fisiológica.
La ausencia de FvW y/o factor VIII:C no complejo
significa que la preparación farmacéutica presenta menos de un 5%,
preferentemente menos de un 1%, de FvW o factor VIII:C libre, con
respecto al contenido total de proteína. Se prefieren especialmente
las preparaciones en las que no es posible detectar FvW:Ag o factor
VIII:C no complejo.
La detección de FvW o factor VIII no complejo se
realiza mediante recromatografía del complejo según la invención en
material de inmunoafinidad, para lo cual se carga dicho material
con una determinada cantidad de FvW o factor VIII libre, se adsorbe
de nuevo el complejo y se eluye en la forma arriba indicada. El
material obtenido tras la recromatografía contiene la misma
relación factor VIII:C y FvW:Ag que el material de partida y, por lo
tanto, no presenta pérdidas relativas. Otro ensayo para la
detección de factor VIII y FvW no ligado en complejo es el enlace
del complejo a anticuerpos de factor VIII:C o anticuerpos de FvW
inmovilizados, no pudiendo detectarse tras la adsorción ninguna
proporción esencial, es decir menos de un 5%, de FvW o factor VIII:C
no enlazado en el residuo.
La preparación farmacéutica según la invención se
distingue por una gran fiabilidad en lo que se refiere a su
espectro de acción, siendo el riesgo de descomposición o activación
de factor VIII debido a la pequeña proporción de factor VIII:C
libre o factor VIII:C fácilmente disociable considerablemente menor
con relación a las preparaciones de complejo de factor VIII:C/FvW ya
conocidas.
Se sobrentiende que la preparación farmacéutica
que contiene el complejo según la invención puede presentar
principios activos, sustancias tampón, sustancias auxiliares o
aditivos farmacéuticos adecuados, utilizados para preparados factor
VIII/FvW. Sin embargo, gracias a la excelente estabilidad del
complejo factor VIII/FvW, éste permite también elaborar un preparado
farmacéutico estable sin necesidad de utilizar adicionalmente los
estabilizantes usuales, tales como albúmina, azúcares,
especialmente trealosa o sacarosa.
El preparado farmacéutico según la invención
también es lo suficientemente estable en una solución con pH neutro
como para poder proporcionarse en forma de preparado líquido o de
preparado líquido congelado. Tras la reconstitución del preparado
liofilizado correspondiente se observa también una composición del
complejo prácticamente invariable.
El técnico en la materia puede determinar también
fácilmente la dosis a administrar o las concentraciones del
complejo en el preparado de acuerdo con los regímenes de
administración conocidos en el estado actual de la técnica para los
preparados de factor VIII/FvW.
El factor VIII y/o FvW puede estar contenido en
el preparado según la invención en forma de proteína nativa o de un
derivado, por ejemplo en forma de proteína mutada mediante
deleción, sustitución o inserción o en forma de derivado químico o
como fragmento, en tanto se mantenga la gran afinidad de enlace del
factor VIII con respecto al FvW en el complejo.
También es objeto de la presente invención un
procedimiento para la purificación por cromatografía de
inmunoafinidad de un material de partida que contiene factor VIII:C
y FvW, caracterizado por las siguientes etapas:
- -
- puesta en contacto del material de partida con un material de cromatografía de inmunoafinidad,
- -
- elución del complejo factor VIII/FvW con un tampón de elución y
- -
- posterior elución de factor VIII:C o FvW en no complejo con otro tampón de elución que presenta una concentración o conductividad elevada con relación al tampón de elución anterior.
Mediante la elución fraccionada selectiva de los
factores en forma de no complejos del complejo se ha logrado
obtener por vez primera una preparación de factor von Willebrand, o
un complejo de factor VIII/FvW, uniforme en lo que se refiere a una
determinada fuerza de enlace.
Para la cromatografía de inmumoafinidad se
emplean preferentemente anticuerpos dirigidos contra el FvW. De
este modo es posible ajustar aun más el procedimiento de
purificación, cuyo objetivo esencial es el fraccionamiento de
distintas moléculas o unidades de FvW, a la distinta naturaleza de
la molécula de von Willebrand.
De acuerdo con una forma de realización especial
del procedimiento según la invención, se utilizan como anticuerpos
anticuerpos monoclonales.
Éstos son preferibles a un antisuero policlonal
en lo que respecta a su homogeneidad.
Un tampón de elución preferente para el complejo
según la invención en la cromatografía de afinidad es aquel que
contiene un tiocianato y/o una sal de amonio, preferentemente en
una concentración no superior a 2M, y en la mayoría de los casos
preferentemente entre 0,05M y 1,5M. Este primer tampón de elución
contiene preferentemente etilenglicol, glicerina o un
polialquilenglicol.
El factor VIII:C o el FvW en no complejos se
eluyen preferentemente con un tampón que contiene un agente
caotrópico, especialmente tiocianato, y/o sal de amonio, y/o sales
alcalinas y/o etilenglicol, glicerina o un polialquilenglicol y se
obtienen también en forma de preparaciones homogéneas. El tampón
presenta una concentración o conductividad elevada en relación con
el primer tampón de elución, especialmente una concentración o
conductividad más de un 20% mayor, preferentemente más de un 50% a
un 100% mayor.
Otro objeto de la presente invención consiste,
por tanto, en una preparación de von Willebrand que presenta una
capacidad de enlace o de formación de complejo reducida con
respecto al factor VIII:C y se obtiene mediante el presente
procedimiento.
El complejo altamente purificado, pero también
las preparaciones de factor VIII:C o FvW no complejo según la
invención, pueden, en caso dado, purificarse en mayor medida
mediante etapas cromatográficas adicionales, preferentemente
mediante cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de
filtración en gel, cromatografía hidrófoba, cromatografía de
afinidad, especialmente en heparina inmovilizada, o cromatografía
de iones metálicos quelantes, y elaborarse de forma ya conocida y
adecuada para obtener preparados farmacéuticos o de
diagnóstico.
Para la obtención de preparados farmacéuticos es
necesario, por regla general, prever un tratamiento para la
inactivación o desenriquecimiento de virus, preferentemente un
tratamiento térmico y/o un tratamiento físico o químico. En los
documentos EP-0 159 311, EP-0 519
901 y WO 94/13329 se describen procedimientos de tratamiento
adecuados. Dado que el complejo según la invención presenta una
gran estabilidad, dicho tratamiento de inactivación vírica se
realiza preferentemente en el complejo altamente purificado.
Según una forma de realización preferente del
procedimiento según la invención, el material de partida se
selecciona del grupo compuesto por plasma, fracciones plasmáticas,
por ejemplo crioprecipitados o precipitados alcohólicos, residuos
de cultivos celulares o preparados farmacéuticos.
La invención se explica más detalladamente en
base a los ejemplos siguientes, a los que sin embargo no está
limitada.
(Actualmente, según la opinión del
solicitante, el mejor modo de realizar la invención
reivindicada)
Se disuelven 500 gr de crioprecipitado en una
disolución tampón 1 + 4 a 30ºC. Después se clarifica la solución a
través de un filtro de 0,45 \mum (por ejemplo Millipore
Durapore). Una columna llena con 0,5 l de gel
anti-FvW (firma IMMUNOTECH, Francia) se prepara con
aprox. 10 volúmenes de columna (= VC) de equitampón y a
continuación se aplica la solución de crioprecipitado clarificada a
0,5 cm/min. Después se eliminan las impurezas no deseadas mediante
lavado con 5 a 10 VC de equitampón (eventualmente con una
concentración elevada de NaCl > 250mM), a una velocidad de flujo
de 1 cm/min. Acto seguido se eluye el complejo factor VIII/FvW con
el tampón de elución 1 en una relación aproximada 1:1. La elución
con el tampón de elución 2 proporciona FvW casi completamente libre
de factor VIII. La segunda etapa de elución sirve al mismo tiempo
para limpiar la columna, con lo que es posible equilibrarla de
nuevo inmediatamente después.
Disolución tampón: | Tris 7,5 mM | |
NaCl 60 mM | ||
Lisina 100 mM | ||
Acetato de Na 100 mM | pH 6,8 | |
25 U/ml de heparina | ||
Equitampón: | Tris 10 mM | |
NaCl 100 mM | ||
Lisina 100 mM | ||
CaCl_{2} 3,25 mM | pH 6,8 | |
Tampón de elución 1: | Tris 10 mM | |
Glicina 100 mM | ||
NaCl 250 mM | ||
AMS 300 mM | ||
CaCl_{2} 3 mM | ||
Etilenglicol al 40% | pH 6,5 | |
Tampón de elución 2: | Tris 10 mM | |
Glicina 100 mM | ||
NaCl 1,25 M | ||
NaSCN 1,25 M | ||
CaCl_{2} 3 mM | ||
Etilenglicol al 40% | pH 7,0 |
Se descongela 1 l de plasma congelado a una
T>25ºC y después se diluye 1 + 2 con equitampón. La solución se
clarifica a través de un filtro de 0,45 \mum. Una columna llena
con 50 ml de gel anti-FvW (firma IMMUNOTECH) se
prepara con aprox. 5 VC de equitampón y a continuación se aplica la
solución de plasma clarificada con un flujo de 1 cm/min. Las
impurezas no deseadas se eliminan mediante lavado con 10 a 20 VC de
equitampón + NaCl 250 mM. La primera elución proporciona complejo
factor VIII/FvW; la segunda elución FvW libre de actividad de
factor VIII. Inmediatamente después puede equilibrarse la columna de
nuevo.
Equitampón: | 5 gr/l de citrato de Na | |
2 U/ml de heparina | pH 7,0 | |
Tampón de elución 1: | 5 gr/l de citrato de Na | |
30 gr/l de AMS | ||
20 gr/l de NaSCN | ||
75 gr/l de histidina | ||
5 gr/l de NaCl | ||
0,4 gr/l de CaCl_{2} | pH 7,0 | |
Tampón de elución 2: | 5 gr/l de citrato de Na | |
50 gr/l de AMS | ||
50 gr/l de NaSCN | ||
75 gr/l de histidina | ||
25 gr/l de NaCl | ||
0,4 gr/l de CaCl_{2} | pH 7,0 |
Claims (17)
1. Procedimiento para la purificación por
cromatografía de inmunoafinidad de un material de partida que
contiene factor VIII:C y factor von Willebrand (FvW),
caracterizado por las siguientes etapas:
- -
- puesta en contacto del material de partida con un material de cromatografía de inmunoafinidad,
- -
- elución del complejo factor VIII/FvW con un tampón de elución y
- -
- posterior elución de factor VIII:C o FvW no complejo con otro tampón de elución que presenta una concentración o conductividad elevada con relación al tampón de elución anterior.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque para la cromatografía de inmunoafinidad
se emplean anticuerpos dirigidos contra el FvW.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque como anticuerpos se emplean anticuerpos
monoclonales.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se emplean
anticuerpos con una gran afinidad con respecto al FvW, que pueden
ligar el FvW también en un medio con tiocianato 1M.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el complejo
altamente purificado se eluye con un tampón que contiene un
tiocianato y/o una sal de amonio, preferentemente en una
concentración máxima de 2M, especialmente entre 0,05M - 1,5M.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el complejo
altamente purificado se eluye con un tampón que contiene
etilenglicol, glicerina o un polialquilenglicol.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se eluye y
obtiene factor VIII:C o FvW con un tampón que contiene un agente
caotrópico, especialmente tiocianato y/o sal de amonio, y/o sales
alcalinas y/o glicoles, como etilenglicol, glicerina o un
polialquilenglicol, presentando el tampón una concentración o
conductividad elevada con relación al tampón de la reivindicación 5
ó 6.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el complejo
altamente purificado se purifica mediante etapas cromatográficas
adicionales, preferentemente cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía de filtración en gel, cromatografía hidrófoba,
cromatografía de afinidad o cromatografía de iones metálicos
quelantes.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se prevé una
etapa de tratamiento para la inactivación o el desenriquecimiento
de virus, preferentemente un tratamiento térmico, que
preferentemente se realiza en el complejo altamente purificado.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque como material
de partida se utiliza un miembro del grupo compuesto por plasma,
una fracción plasmática, un residuo de cultivo celular y un
preparado farmacéutico.
11. Preparación que contiene un complejo
altamente purificado y está formada por los componentes factor VIII
(factor VIII:C) y factor von Willebrand (FvW), con una actividad
específica de como mínimo 70 y preferentemente entre 100 y 300 U de
factor VIII:C/mg, obtenible mediante un procedimiento según una de
las reivindicaciones 1 a 10.
12. Preparación según la reivindicación 11,
caracterizada porque el FvW presenta una actividad de enlace
de colágeno en un rango de 0,2 a 0,6, en relación con el antígeno
de FvW (unidad de plasma/unidad de plasma).
13. Preparación según la reivindicación 11 ó 12,
caracterizada porque está esencialmente libre de FvW o
factor VIII:C no complejo.
14. Preparación según una de las reivindicaciones
11 a 13, caracterizada porque el complejo se presenta en una
concentración como mínimo 5.000 veces mayor, preferentemente entre
7.100 y 21.400 veces mayor que en el plasma.
15. Preparación según una de las reivindicaciones
11 a 14, caracterizada porque se presenta en forma de
preparación farmacéutica.
16. Preparación que contiene FvW altamente
purificado, obtenible mediante un procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10.
17. Preparación según la reivindicación 16,
caracterizada porque el FvW presenta una actividad de enlace
de colágeno de como mínimo 0,7 por antígeno de FvW (unidad de
plasma/unidad de plasma).
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