ES2285754T3 - Purificacion de factor von willebrand mediante cromatografia de intercambio cationico. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la obtención de vWF, caracterizado porque se une el vWF con una concentración de sal <= 250 mM a un cambiador de cationes y, mediante elución fraccionada con una concentración de sal > 300 mM, se obtiene un vWF con una alta actividad específica que comprende especialmente multímeros de vWF de alto peso molecular.
Description
Purificación de factor von Willebrand mediante
cromatografía de intercambio catiónico.
La invención se refiere a un procedimiento para
la obtención de un factor von Willebrand (vWF) purificado mediante
cromatografía de intercambio catiónico.
En el plasma, el vWF circula en una
concentración de 5 a 10 mg/l, en parte en forma de un complejo no
covalente con el factor VIII. El vWF es una glucoproteína que se
forma en distintas células del cuerpo humano y posteriormente se
libera a la circulación. Partiendo de una cadena polipeptídica con
un peso molecular aproximado de 225.000 Da (vWF monómero) y
mediante la formación de varios puentes sulfuro, en las células se
sintetiza un dímero de vWF (dímero de vWF primario) con un peso
molecular de aprox. 450.000 Da. A partir de los dímeros de vWF se
producen, de nuevo mediante unión por puentes sulfuro, otros
polímeros de vWF de pesos moleculares cada vez mayores, de hasta
aproximadamente 20.000.000 Da.
Un criterio importante para la caracterización
del vWF es el análisis de la estructura multimérica mediante
electroforesis en agarosa. Se supone que en especial los polímeros
de vWF de alto peso molecular tienen una importancia esencial en la
coagulación sanguínea. La actividad funcional del vWF se determina
habitualmente mediante la actividad del cofactor de ristocetina
(vWF:RistCoF). Como característica de la pureza y la actividad
específica del vWF se determina la relación entre la actividad y la
concentración de antígeno de vWF (vWF:Ag). La actividad específica
de un preparado aumenta con el aumento de la relación entre
vWF:RistCoF y vWF:Ag.
El vWF cumple importantes funciones en el marco
de la hemostasia. Circula en el plasma en parte en forma de
complejo con el factor VIII, que favorece la coagulación sanguínea
como cofactor. Mediante la formación de complejos con el vWF, el
factor VIII se estabiliza y queda protegido de la degradación
proteolítica. Otra función del vWF es su participación en la
agregación plaquetaria, que contribuye de forma importante a la
hemostasia primaria. El vWF se liga a las glucoproteínas Ib y
IIb/IIIa de los receptores de la superficie de los trombocitos y,
con ello, reticula los trombocitos formando un agregado plaquetario.
También importante para la hemostasia primaria es la afinidad del
vWF por el colágeno, un componente de la matriz extracelular que en
los vasos intactos no tiene contacto directo con la sangre, ya que
está protegido de la corriente sanguínea por una monocapa de
células endoteliales. Sin embargo, si se produce una lesión en los
vasos sanguíneos, en el lugar de la lesión se produce una
exposición directa de los componentes de la matriz extracelular a la
sangre debido a un desprendimiento local de la capa de células
endoteliales. Gracias a su afinidad por el colágeno, el vWF es
capaz de fijar al subendotelio expuesto el agregado plaquetario que
se forma en la zona del vaso dañado. De este modo se realiza un
primer cierre lábil de la herida, que se consolida mediante
coagulación sanguínea posterior.
El síndrome de von Willebrand está caracterizado
por un déficit de factor von Willebrand funcional o por un espectro
anómalo en la composición multimérica del factor von Willebrand. En
pacientes con el síndrome de von Willebrand puede ocurrir que, a
pesar de que la velocidad de síntesis del factor VIII sea normal en
general, se produzca un déficit de factor VIII debido a una falta
de estabilización del factor VIII y a la muy reducida vida media en
el plasma de este factor de coagulación. Por tanto, los pacientes
con el síndrome de von Willebrand pueden presentar síntomas
similares a los pacientes de hemofilia A (hemofilia fenotípica). En
los pacientes con síndrome de von Willebrand pueden darse también
trastornos funcionales en la agregación y adhesión plaquetaria
debidos a la falta de vWF funcionalmente activo, con lo que pueden
aparecer defectos en la hemostasia primaria. Como consecuencia de
la perturbación de estos procesos mediados por el vWF, los pacientes
con el síndrome de von Willebrand presentan tiempos de hemorragia
más largos.
Por tanto, para el tratamiento del síndrome de
von Willebrand han de administrarse preparados de vWF que compensen
la falta de vWF funcionalmente activo. Para ello pueden emplearse
los preparados también utilizados para la terapia de la hemofilia A
tales como crioprecipitados o los concentrados de factor VIII
preparados a partir del mismo que contienen complejos de factor
VIII y vWF. Sin embargo, para el tratamiento de la hemofilia A se
emplean concentrados de factor VIII:C cada vez más purificados, los
cuales no contienen vWF o sólo contienen trazas del mismo. Dado que
los pacientes con síndrome de von Willebrand no requieren un
suplemento de factor VIII y la administración de factor VIII
encierra el peligro de una inducción de anticuerpos inhibidores del
factor VIII en el paciente, sería deseable para el tratamiento del
síndrome de von Willebrand un preparado que estuviese libre en lo
posible de factor VIII contaminante. Por tanto, existe la necesidad
de preparaciones de factor von Willebrand puras y a prueba de virus
con una gran actividad específica.
En la literatura se describen distintos
procedimientos para la purificación y obtención del vWF.
El documento EP 0 503 991 describe la
purificación de vWF a partir de crioprecipitado humano mediante tres
procesos cromatográficos consecutivos: 1. cromatografía de
intercambio aniónico en Fractogel TSK-DEAE y
elución del vWF con NaCl 0,15M; 2. nueva cromatografía de
intercambio aniónico en Fractogel TSK-DEAE y elución
del vWF con NaCl 0,17M y 3. cromatografía de afinidad en
Gelatin-Sepharose para la separación del fibrinógeno
contaminante. Para ello se utilizan tampones que contenían
aminoácidos e iones calcio.
El documento WO 89/12065 describe la separación
del vWF plasmático del factor VIII y de otras proteínas mediante la
unión de las proteínas a un cambiador aniónico y elución gradual por
medio un gradiente creciente de la concentración de sal. La
fracción que contiene el vWF se cromatografía una segunda vez con un
cambiador de aniones y se obtiene en forma de concentrado.
El documento EP 0 469 985 da a conocer un
procedimiento para la purificación del vWF plasmático a partir de
crioprecipitado, en el que, en un primer paso, se une el factor VIII
a un cambiador de aniones de forma selectiva con una concentración
de sal 250 mM, mientras que el vWF se queda en el sobrenadante.
Después de reducir la concentración de sal del sobrenadante que
contiene el vWF a una concentración de sal entre 100 mM y 150 mM,
el vWF se une a un segundo cambiador de aniones y se eluye a un pH
6,6 con NaCl 300-350 mM. Con ello se obtiene un vWF
con una actividad de como mínimo 50 U/mg, que contiene una
proporción de factor VIII < 2%.
El documento DE 39 04 354 describe la obtención
de vWF plasmático a partir de crioprecipitado y la separación del
vWF del factor VIII mediante una adsorción selectiva del factor VIII
en un cambiador de aniones, mientras que el vWF permanece en
solución. Con ello se obtiene una solución que contiene 160 U/ml de
vWF.
El documento 5,006,642 describe la obtención de
vWF a partir de una solución de vWF y un agente caotrópico,
producido como subproducto según el documento US 4,361,509, mediante
diálisis contra un tampón adecuado o por desalación de la solución
en una etapa cromatográfica adicional.
El documento EP 0 383 234 describe un
procedimiento para la preparación de un concentrado de vWF mediante
cromatografía de intercambio aniónico, donde se disocia un complejo
factor VIII/vWF contenido en una solución por adición de un tampón
que contiene calcio y aminoácidos, obteniéndose un concentrado de
vWF.
El documento WO 96/10584 describe un
procedimiento para la obtención de vWF recombinante purísimo
mediante cromatografía combinada de intercambio aniónico/afinidad
con heparina y el documento EP 0 705 846 la separación de
fracciones de alto y bajo peso molecular del vWF recombinante
mediante cromatografía de afinidad con heparina.
El documento WO 93/15199 describe la utilización
de albúmina para la preparación de proteínas de fusión de albúmina
como sustratos para diversas proteínas. Como componente opcional de
una proteína de fusión de este tipo se mencionan pequeños
fragmentos de vWF para la inhibición de la adhesión a vWF y a
plaquetas.
Hasta la fecha, para obtener una preparación de
vWF purificada con una gran actividad específica era necesario
combinar varios procesos cromatográficos. En particular la
producción de preparados que contuvieran especialmente multímeros
de vWF de alto peso molecular era posible hasta ahora sólo mediante
cromatografía de afinidad con heparina. Sin embargo, la heparina es
un material cromatográfico relativamente caro.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento adecuado que pueda aplicarse a escala
industrial para la obtención de un vWF purificado con una actividad
específica mejorada. El procedimiento debería poder emplearse para
la purificación tanto de vWF recombinante como de vWF
plasmático.
Según la invención, este objetivo se logra con
un procedimiento para la obtención de vWF en el que se une el vWF a
un cambiador de cationes con una (baja) concentración de sal \leq
250 mM y, mediante elución fraccionada gradual con una
concentración de sal > 300 mM, se obtiene un vWF compuesto
especialmente por multímeros de vWF de alto peso molecular de alta
actividad específica. La obtención y el enriquecimiento del vWF con
una actividad y estabilidad mejoradas se lleva a cabo, en
particular, de la siguiente manera: mediante un aumento gradual de
la concentración de sal se separan primero, con una concentración
media de sal, fracciones que contienen los multímeros de vWF de
bajo peso molecular, productos de degradación inactivos y proteínas
acompañantes no específicas y, con una mayor concentración de sal,
se obtienen fracciones que contienen multímeros de vWF de alto peso
molecular de alta actividad específica.
El vWF se purifica como habitualmente mediante
cambiadores de aniones con carga positiva debido a su punto
isoeléctrico ácido (PIE = 5,5 a 6) y la carga neta negativa
resultante de ello, en un medio entre ligeramente ácido y básico.
Por tanto, de acuerdo con los procedimientos descritos hasta la
fecha para la purificación de vWF mediante cambiadores de aniones
con carga positiva, no era de esperar que, con un valor pH por
encima del PIE del vWF y una baja concentración de sal, el vWF se
uniese a una matriz de gel con carga negativa de un cambiador de
cationes y pudiera eluirse de forma selectiva de este último por
aumento de la concentración de sal. Tampoco era de esperar que
mediante una elución gradual, con una concentración de sal > 300
mM, se obtuviera un vWF compuesto especialmente de multímeros de
vWF de alto peso molecular.
En el marco de la presente invención se comprobó
que con el procedimiento según la invención, partiendo de un
material biológico impuro, se obtienen fracciones en esencia libres
de ácidos nucleicos contaminantes. Así, además de las proteínas
acompañantes no específicas, el procedimiento permite eliminar
ácidos nucleicos de las preparaciones de proteínas. Este efecto no
puede conseguirse con los procedimientos usuales, que utilizan
cambiadores de aniones, ya que los ácidos nucleicos se unen al
cambiador de aniones debido a su carga negativa, se desprenden
nuevamente del cambiador de aniones al aumentar la concentración de
sal y llegan al eluato.
En la purificación del vWF se ha de tener
especialmente en cuenta que, debido al tamaño del vWF entre 500.000
y varios millones, sólo permiten una buena purificación y un alto
rendimiento aquellos sustratos que no dificultan la difusión y
distribución de la molécula de vWF en los sustratos utilizados. Para
la realización del procedimiento según la invención de purificación
de un vWF con gran actividad específica mediante cambiadores de
cationes se utiliza una matriz de gel que no sólo tiene una gran
capacidad de carga, es robusta a la hora de su manipulación y
muestra un perfil de elución preciso, sino que también es económica
a escala industrial. Con ello, el procedimiento según la invención
se hace especialmente interesante para la obtención de un vWF puro a
escala industrial.
Para la realización del procedimiento pueden
emplearse todos los cambiadores de cationes conocidos, siendo
preferentes los cambiadores de cationes con un sustrato conjugado
con grupos sulfopropilo o carboximetilo. Resultan muy adecuados,
por ejemplo, SP-Sepharose® Fast Flow y
CM-Sepharose® Fast Flow (Pharmacia), Fractogel®
EMD-SO3 y Fractogel® EMD COOH (Merck), Poros® 10 SP
y Poros® 10 S (Perseptive Biosystems) y Toyopearl^{TM} SP 550 C y
Toyopearl^{TM} CM-650 (M) (TosoHaas).
Para la obtención de vWF purificado resulta
particularmente adecuado un gel de poros grandes con estructura
tentacular del tipo Fractogel® EMD-SO3 y Fractogel®
EMD COOH (Merck).
La adsorción del vWF en el cambiador de cationes
se realiza preferentemente a una concentración de sal en el tampón
\leq 250 mM. Por tanto, los tampones de adsorción preferentes
presentan una concentración de sal entre 50 y 250 mM, en especial
dentro de un rango de 150 mM - 250 mM (por ejemplo 150 mM).
Aumentando gradualmente la concentración de sal en el tampón puede
eluirse de forma selectiva el vWF compuesto esencialmente de
multímeros de vWF de alto peso molecular con una concentración de
sal > 300 mM. Los multímeros de vWF de bajo peso molecular y los
productos de degradación proteolítica del vWF contenidos en la
solución que contiene el vWF y presentan poca actividad específica
en lo que se refiere a la actividad de vWF, en particular a la
actividad del cofactor de ristocetina, la actividad de ligadura de
colágeno y la actividad de aglutinación plaquetaria específica, se
eluyen y separan del cambiador de cationes con una concentración de
sal entre > 250 mM y \leq 300 mM, preferentemente de 300
mM.
La adsorción y desorción del vWF puede
realizarse en un tampón que contenga como sal un ion metálico mono
o bivalente, utilizándose como sal preferente NaCl.
En el procedimiento según la invención, como
sistema tampón para la elución de las proteínas ligadas al cambiador
de cationes se utiliza preferentemente una solución tampón
compuesta por sustancias tampón, en particular glicina, tampón
fosfato o tampón citrato, y una sal. Preferentemente el tampón
empleado no contiene iones de Ca.
El tampón de elución puede presentar un valor pH
dentro de un rango entre 5,0 y 8,5, preferentemente entre 6,0 y
8,0.
El procedimiento según la invención puede
llevarse a cabo de forma discontinua (por lotes) o por cromatografía
en columna.
Sin embargo, los parámetros óptimos para la
realización del procedimiento según la invención, como la
concentración de sal, el valor pH y la temperatura, dependen en
cada caso del material cambiador de cationes utilizado. No
obstante, entra dentro de los conocimientos generales de un técnico
en la materia el optimizar, para el tipo de cambiador de cationes
empleado en cada caso, las condiciones para llevar a cabo el
procedimiento dadas a conocer en el marco de la presente
invención.
Mediante el procedimiento según la invención se
obtiene y se enriquece en particular un vWF que está compuesto
especialmente de multímeros de vWF de alto peso molecular. Los
multímeros de vWF de bajo peso molecular y los fragmentos de vWF
con poca actividad de aglutinación plaquetaria específica se separan
de forma selectiva, de modo que se obtienen fracciones que
contienen especialmente multímeros de vWF de alto peso molecular de
alta actividad y especificidad.
La o las fracciones obtenidas están
esencialmente libres de multímeros de vWF de bajo peso molecular, de
fragmentos de vWF con poca actividad específica, de complejo de
factor VIII, factor VIII:C, de proteínas acompañantes no
específicas y de ácidos nucleicos contaminantes.
Como material de partida para la obtención del
vWF purificado por el procedimiento según la invención puede
emplearse cualquier solución que contenga vWF. En particular, son
materiales de partida materiales biológicos tales como plasma,
fracciones plasmáticas, crioprecipitados o sobrenadantes o extractos
de un cultivo celular recombinante.
Sin embargo, también pueden ser soluciones que
contienen vWF aquellas soluciones de proteínas enriquecidas
sometidas a una etapa de purificación previa, por ejemplo mediante
filtración en gel, cromatografía de intercambio aniónico,
cromatografía de afinidad o una combinación de las mismas. Con estos
procesos previos se logra en particular enriquecer el vWF y separar
de forma selectiva las proteínas acompañantes no específicas, en
particular factor VIII o complejo de factor VIII.
Según una forma de realización especial del
procedimiento según la invención, como solución de partida se
emplea una fracción que contiene vWF enriquecida con un cambiador de
aniones.
Mediante cromatografía de intercambio aniónico
es posible, dependiendo del modo en que se realice esta
cromatografía de intercambio aniónico, hacer que el vWF pase
libremente por el cambiador de aniones como material no ligado o
bien adsorberlo en el mismo. Así, por ejemplo, se obtiene y
enriquece vWF a partir de una fracción plasmática uniendo tanto el
vWF como complejo factor VIII/vWF a un cambiador de aniones de
fuerza iónica pequeña y baja concentración de sal, en un medio
ligeramente ácido. A continuación se eluye el vWF del cambiador de
aniones de forma selectiva con una concentración media de sal de
entre 150 mM y 250 mM, mientras que el complejo de factor VIII y el
factor VIII libre no complejado se desorben a partir de una
concentración superior de sal > 300 mM.
También puede obtenerse una fracción de vWF
enriquecida tratando una solución que contenga el vWF con un
cambiador de aniones, con una concentración media de sal de entre
100 mM y 200 mM, con lo que el complejo de factor VIII se liga al
cambiador de aniones mientras que el vWF permanece en solución.
Aumentando entonces la concentración de sal puede obtenerse a
partir del cambiador de aniones el complejo de factor VIII
ligado.
Según una forma de realización especial, el vWF
presente en una solución enriquecida con una concentración de sal
\leq 250 mM se obtiene directamente de la circulación o del eluato
o bien como sobrenadante (en el procedimiento por lotes) y, en caso
dado, se liga al cambiador de cationes sin modificar la fuerza
iónica o la concentración de sal. Sin embargo, si es necesario, la
concentración de sal puede también disminuirse por dilución.
Esta forma de realización tiene la ventaja
particular de permitir una fácil combinación de la cromatografía de
intercambio aniónico/intercambio catiónico sin necesidad de realizar
un costoso cambio de tampón, una costosa diálisis o similar, de las
proteínas enriquecidas.
Así, es posible, mediante una primera etapa
cromatográfica, obtener una fracción enriquecida de vWF y, mediante
subsiguiente cromatografía de intercambio catiónico, lograr una
purificación y separación de las fracciones de vWF de alto peso
molecular y de bajo peso molecular. Sin embargo, también existen
otras combinaciones posibles, por ejemplo cromatografía de
afinidad/intercambio catiónico, cromatografía de intercambio
aniónico/afinidad/intercambio catiónico, para lograr un mayor
enriquecimiento y la obtención selectiva del vWF con una gran
actividad específica.
Con el procedimiento según la invención arriba
descrito es posible, partiendo de un material que contiene un vWF
impuro, enriquecer el vWF de alta actividad específica como mínimo
en un factor de 80.
Dado que, en principio, todo material biológico
puede estar contaminado con gérmenes infecciosos, para producir un
preparado a prueba de virus, la fracción que contiene el vWF
obtenida se somete a un tratamiento para la inactivación o el
empobrecimiento viral. Para ello pueden emplearse todos los
procedimientos ya conocidos en el estado actual de la técnica,
tales como métodos químico/físicos, inactivación mediante una
combinación de sustancia fotoactiva y luz o empobrecimiento
mediante filtración. Para la inactivación viral resulta
especialmente adecuado un tratamiento térmico en solución o en
estado sólido, que puede inactivar de forma fiable tanto los virus
con revestimiento lipídico como los virus sin revestimiento
lipídico. El empobrecimiento viral se realiza preferentemente
mediante filtración a través de nanofiltros.
Según otro aspecto, la presente invención
proporciona una preparación que contiene un vWF purificado de alta
actividad específica compuesto especialmente de multímeros de vWF de
alto peso molecular, obtenible a partir de una solución que
contiene vWF, mediante cromatografía de intercambio catiónico, según
la presente invención. El vWF de alta actividad específica se
enriquece a partir de un material de partida que contiene, entre
otros, vWF de baja pureza y poca actividad específica y las
proteínas acompañantes, en particular factor VIII o complejo de
factor VIII, que contienen multímeros de vWF de bajo peso molecular
se separan de forma selectiva. De este modo se obtiene, en
particular, una preparación que contiene un vWF purificado compuesto
especialmente de multímeros de vWF de alto peso molecular y que, en
esencia, no contiene multímeros de vWF de bajo peso molecular ni
productos de degradación del vWF.
En particular, la preparación según la invención
presenta una actividad de aglutinación plaquetaria específica de
vWF de como mínimo 65 U/mg de proteína y una actividad de unión al
colágeno específica de como mínimo 65 U/mg de proteína. La
preparación se distingue también porque en esencia está libre de
factor VIII, presentando un contenido en factor VIII < 0,1%, con
respecto a la relación entre la actividad del vWF y del factor
VIII.
Otro criterio para la pureza y baja infectividad
de un producto es también la ausencia de ácidos nucleicos
contaminantes. Por tanto, la preparación según la invención está en
esencia libre de ácidos nucleicos. "En esencia" significa aquí
que el contenido de ácido nucleico es \leq 0,7 con respecto a la
relación 260/280 nm. Sin embargo, el ácido nucleico también puede
cuantificarse según un procedimiento tal como el descrito, por
ejemplo, en los documentos EP 0 714 987 y EP 0 714 988.
En la obtención y producción de la preparación
según la invención con vWF plasmático como material de partida,
pero también con vWF recombinante, se realiza, en caso dado, según
se explica más arriba, un proceso de empobrecimiento o de
inactivación viral con el fin de eliminar partículas infecciosas,
pudiendo realizarse una inactivación viral y/o un empobrecimiento
viral, en principio, antes o después de cada etapa de purificación
realizada entre la fase del material de partida y la fase del
preparado farmacéutico ya producido. De este modo, la preparación
según la invención será siempre a prueba de virus.
Según una forma de realización preferente, la
preparación según la invención se presenta en una forma inalterable
durante el almacenamiento. La preparación que contiene el vWF
purificado de alta actividad específica puede ofrecerse en forma de
solución final, como liofilizado o congelada. Debido a su pureza, la
preparación es muy estable. Se ha comprobado que la preparación
según la invención es estable a -20ºC durante como mínimo 6 meses,
a 4ºC en solución durante como mínimo 4 semanas y en forma de
liofilizado durante como mínimo 1 año. Se ha comprobado también
que, en el intervalo de tiempo respectivo, la actividad del vWF se
reduce como máximo en un 10% y el patrón de multímeros de vWF no
presenta alteraciones apreciables.
La preparación según la invención puede
formularse en las formas ya conocidas y usuales. El vWF purificado
contenido en la preparación según la invención se mezcla con un
tampón que contiene sales, por ejemplo NaCl, citrato trisódico
dihidratado y/o CaCl_{2}, y aminoácidos, por ejemplo glicina y
lisina, a un pH entre 6 y 8, y se formula como preparado
farmacéutico.
La preparación puede utilizarse para producir un
medicamento para el tratamiento de pacientes con hemofilia
fenotípica y vWD.
La invención se explica más detalladamente en
base a los ejemplos siguientes y las figuras, aunque no está
limitada a estos ejemplos de realización.
Las Figuras muestran:
Figura 1: Análisis de multímeros de rvWF antes y
después de una purificación mediante cromatografía de intercambio
catiónico.
Figura 2: Análisis de multímeros de vWF de
crioprecipitado antes y después de purificación mediante
cromatografía combinada de intercambio aniónico/intercambio
catiónico en condiciones en las que el vWF se une al cambiador de
aniones (Ejemplo 2 A).
Figura 3: Análisis de multímeros de vWF de
crioprecipitado antes y después de purificación mediante
cromatografía combinada de intercambio aniónico/intercambio
catiónico en condiciones en las que el vWF no se une al cambiador
de aniones (Ejemplo 2 B).
El Ejemplo 1 describe la purificación de rvWF a
partir de sobrenadantes de cultivo de células recombinantes por
medio de una cromatografía de intercambio catiónico; el Ejemplo 2
describe la purificación de vWF plasmático mediante cromatografía
de intercambio catiónico y cromatografía de intercambio aniónico
previa; el Ejemplo 3 describe la purificación de vWF recombinante
mediante cromatografía combinada de intercambio aniónico/de
inmunoafinidad y de intercambio catiónico.
Ejemplo
1
Se produjo vWF en células CHO recombinantes en
un medio de cultivo usual. Tras la fermentación de las células
transformadas, se retiró el medio de cultivo y se extrajeron las
células y los fragmentos celulares mediante centrifugación. A
continuación se clarificó la solución mediante filtros de un tamaño
de poro de 0,4 \mum para eliminar componentes de bajo peso
molecular, por ejemplo fragmentos de membrana.
Se llenó una columna cromatográfica (50 ml) con
un cambiador de cationes (Fractogel® EMD-SO3) y se
lavó con un tampón (tampón de glicina-NaCl 30 mM).
A continuación, se cargó la columna de cambiador de cationes con el
sobrenadante de cultivo libre de células, con lo que se obtuvieron
en la circulación aquellas proteínas que no se unían al cambiador
(fracción 1). Las proteínas acompañantes no específicas ligadas se
eliminaron lavando la columna con un tampón que contenía NaCl 0,3M
(fracción 2). A continuación se desorbió el vWF unido del cambiador
con un tampón que contenía NaCl 0,5M, obteniéndose en el eluato
(fracción 3).
Todas las fracciones se analizaron en cuanto a
su contenido en proteínas, en antígeno de vWF (vWF:Ag), su
actividad de vWF (actividad de cofactor de ristocetina, vWF:RistCoF)
y multímeros de vWF. La concentración de proteínas se determinó por
el método de Bradford (M. Bradford (1976), Anal. Biochem., 72:
248-254). El contenido en vWF se determinó mediante
un sistema ELISA comercial (ASSERACHROM®vWF, Boehringer Mannheim).
La actividad de cofactor de ristocetina se determinó mediante un
sistema de ensayo usual
(v-Willebrand-Reagenz®,
Behringwerke). Los resultados de la cromatografía de intercambio
catiónico están resumidos en la Tabla 1. La Figura 1 muestra el
análisis de los multímeros de vWF antes y después de la purificación
por medio del cambiador de cationes.
En la Tabla 1 puede verse que todo el vWF con
actividad de cofactor de ristocetina presente en el material de
partida se une al cambiador de cationes. Lavando la columna del
cambiador de cationes con un tampón que contiene NaCl 0,3M
(fracción 2) se extrae el vWF sin actividad mensurable. Mediante
elución con NaCl 0,5M (fracción 3) se obtiene el vWF con casi toda
la actividad de cofactor de ristocetina. Además se logra un gran
empobrecimiento en ADN del sobrenadante de cultivo: la relación de
absorción 260 nm/280 nm cae de 1,2 a 0,7. Con esta etapa
cromatográfica se consigue un factor de purificación de 10.
La Figura 1 muestra el análisis de los
multímeros de vWF antes y después de purificación por cromatografía
de intercambio catiónico. En la Figura 1, pista "A", se muestra
el rvWF no purificado, en la pista "B" los multímeros de vWF
de la fracción 1 en el paso; en la pista "C" los multímeros de
vWF de la fracción 2 (eluato de NaCl 0,3M) y en la pista "D"
los de la fracción 3 (eluato de NaCl 0,5M). De la Figura 1 se
desprende que, mediante cromatografía de intercambio catiónico y
elución selectiva, se obtiene un vWF que contiene especialmente
estructuras multiméricas de alto peso molecular. Los multímeros de
vWF de bajo peso molecular o los productos de degradación del vWF
no se unen al cambiador de cationes (fracción 1) o bien se separan
de forma selectiva mediante elución con el NaCl 0,3M (fracción
2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se disolvió crioprecipitado de plasma humano en
un tampón compuesto por Tris 7 mM, acetato sódico 100 mM, lisina
100 mM, pH 6,7. Como tratamiento previo se mezcló por agitación
Al(OH)_{3}. A continuación se separó el precipitado
mediante centrifugación.
El crioprecipitado así pretratado se aplicó
sobre una columna de intercambio de aniones Fractogel®
EMD-TMAE. Las proteínas débilmente unidas se
eliminaron mediante lavado de la columna con un tampón que contenía
NaCl 160 mM. Mediante elución con NaCl 250 mM, en el tampón se
eluyó principalmente el vWF del cambiador (fracción 1). A
continuación se eluyó el complejo de FVIII mediante elución con NaCl
400 mM (fracción 2). Partiendo del crioprecipitado, la fracción 1
contenía un 68% de toda la actividad de vWF, pero sólo el 10% de
toda la actividad de FVIII. La actividad de vWF restante y el 80%
de la actividad de FVIII están contenidos en la
fracción 2.
fracción 2.
A continuación se aplicó la fracción 1 con
contenido en vWF sobre una columna de intercambio de cationes
Fractogel® EMD-SO3. Las proteínas débilmente unidas
se eliminaron mediante el lavado de la columna con NaCl 100 mM. A
continuación se eluyó gradualmente con NaCl 200 mM (fracción 1),
NaCl 300 mM (fracción 2) y NaCl 400 mM (fracción 3). Más de un 70%
de toda la actividad de vWF se halló en la fracción de NaCl 400 mM.
No se halló ninguna actividad de FVIII:C. Los resultados se resumen
en la Tabla 3.
Mientras que la actividad específica del vWF en
el crioprecipitado era de 0,6 U/mg de proteína, en el eluato de
NaCl 400 mM tras la cromatografía de intercambio catiónico era de 65
U/ml. La actividad de unión colágeno específica aumentó de 0,7 U/mg
de proteína en el crioprecipitado a 65 U/mg de proteína en el eluato
de NaCl 400 mM tras la cromatografía de intercambio catiónico.
Partiendo del crioprecipitado, la pureza del vWF había aumentado en
un factor de 100.
La Figura 2 muestra el análisis de los
multímeros de vWF durante la cromatografía combinada de intercambio
aniónico/intercambio catiónico. Las pistas "A" a "E"
muestran la purificación mediante el cambiador de aniones y las
pistas "F" a "K" la purificación mediante el cambiador de
cationes. En la Figura 2, la pista "A" muestra el patrón de
los multímeros de vWF en el crioprecipitado, la pista "B" tras
la filtración, la pista "C" en el paso, la pista "D" el
eluato de NaCl 250 mM (fracción 1, Tabla 2), la pista "E" el
eluato de NaCl 400 mM (fracción 2, Tabla 2), la pista "F" el
eluato de NaCl 250 mM (fracción 1, Tabla 2) antes de la
cromatografía de intercambio catiónico, la pista "G" el paso,
la pista "H" el eluato de NaCl 200 mM (fracción 1, Tabla 3),
la pista "I" el eluato de NaCl 300 mM (fracción 2, Tabla 3) y
la pista "K" el eluato de NaCl 400 mM (fracción 3, Tabla 3).
En las pistas "H" e "I" puede verse que, mediante elución
con NaCl 200 mM o NaCl 300 mM, sólo se desprenden del cambiador de
cationes multímeros de vWF de bajo peso molecular. La elución del
cambiador de cationes con NaCl 400 mM, pista "K", dio como
resultado un vWF que contenía especialmente multímeros de vWF de
alto peso molecular.
Se disolvió crioprecipitado de plasma humano en
un tampón compuesto por Tris 7 mM, acetato sódico 100 mM, lisina
100 mM, NaCl 120 mM, pH 6,7. Como tratamiento previo se mezcló por
agitación Al(OH)_{3}. A continuación se separó el
precipitado mediante centrifugación.
El crioprecipitado así pretratado se aplicó
sobre una columna de Fractogel® EMD-TMAE. Las
proteínas no ligadas se obtuvieron mediante lavado de la columna
con un tampón de disolución (fracción 1). Esta fracción 1 contenía
un 60% de la actividad de vWF y sólo un 10% de la actividad de
FVIII. A continuación se obtuvo el complejo de FVIII mediante
elución de la columna con NaCl 400 mM (fracción 2).
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, se aplicó la fracción 1 con
contenido en vWF sobre una columna de intercambio de cationes
(Fractogel® EMD-SO3). Las proteínas débilmente
unidas se eliminaron mediante lavado de la columna con NaCl 100 mM.
A continuación se eluyó gradualmente con NaCl 200 mM (fracción 1),
NaCl 300 mM (fracción 2) y NaCl 400 mM (fracción 3). Más de un 70%
de toda la actividad de vWF se halló en la fracción de NaCl 400 mM.
No se halló ninguna actividad de antígeno de factor VIII ni de
FVIII:C. Los resultados se resumen en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Mientras que la actividad específica del vWF en
el crioprecipitado era de 0,6 U/mg de proteína, en el eluato de
NaCl 400 mM, tras la cromatografía de intercambio catiónico, era de
47 U/ml. La actividad de unión colágeno específica aumentó de 0,7
U/mg de proteína en el crioprecipitado a 51 U/mg de proteína en el
eluato de NaCl 400 mM tras la cromatografía de intercambio
catiónico. Partiendo del crioprecipitado, la pureza del vWF había
aumentado en un factor de 80.
La Figura 3 muestra el análisis de los
multímeros de vWF durante la cromatografía combinada de intercambio
aniónico/intercambio catiónico. Las pistas "a" a "c"
muestran la purificación mediante intercambio de aniones y las
pistas "d" a "h" la purificación mediante intercambio de
cationes. En la Figura 3, la pista "a" muestra el patrón de
multímeros de vWF en el crioprecipitado, la pista "b" en el
paso, la pista "c" el eluato de NaCl 400 mM (fracción 2, Tabla
4), la pista "d" el paso (fracción 1, Tabla 4) antes de la
cromatografía de intercambio catiónico, la pista "e" el paso
por el cambiador de cationes, la pista "f" el eluato de NaCl
200 mM (fracción 1, Tabla 5), la pista "g" el eluato de NaCl
300 mM (fracción 2, Tabla 5) y la pista "h" el eluato de NaCl
400 mM (fracción 3, Tabla 5). La estructura de los multímeros de vWF
en las fracciones obtenidas con NaCl 200 mM (pista "f") o NaCl
300 mM (pista "g"), así como con NaCl 400 mM (pista "h"),
tras la cromatografía de intercambio catiónico, está representada
de forma correspondiente. El eluato de NaCl 400 mM (pista "h")
muestra un patrón de multímeros de vWF de alto peso molecular y
contiene más de un 70% de la actividad de vWF (actualmente, en
opinión de la solicitante, el mejor modo de realización de la
invención).
\newpage
Ejemplo
3
Se obtuvo vWF de células CHO recombinantes en un
medio de cultivo usual. Tras la fermentación de las células
transformadas, se retiró el medio de cultivo y se extrajeron las
células y los fragmentos celulares mediante centrifugación. A
continuación se filtró la solución mediante filtros con un tamaño de
poro de 0,4 \mum para eliminar los componentes de bajo peso
molecular, por ejemplo fragmentos de membrana.
1.000 ml de sobrenadante del cultivo libre de
células se filtraron con una velocidad de flujo de 0,7 cm/min
mediante una columna (7,1 cm^{2} x 8 cm, llena con 57 ml de
cambiador de aniones Fractogel® EMD-TMAE 650 M
(Merck)). El gel se equilibró previamente con un tampón
Tris-HCl 20 mM (pH 7,0). A continuación, se lavó la
columna con un tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,0) que
contenía NaCl 0,1M. Las sustancias acompañantes y el vWF con baja
actividad de RistCoF se eliminaron lavando la columna con un tampón
que contenía NaCl 200 mM. Después se eluyó el rvWF del sustrato con
NaCl 280 mM en un tampón Tris-HCl 20 mM (pH
7,0).
El eluato de NaCl 280 mM de la etapa de
intercambio de aniones se cargó, con una velocidad de flujo de 0,255
cm/min, sobre una resina de anticuerpos inmovilizada (dimensiones
de la columna: 19,6 cm^{2} x 5,6 cm; volumen del lecho de gel:
110 ml; matriz de resina: Sepharose CL2B; anticuerpos: fragmentos
Fab de anticuerpo monoclonal murino AvW8/2), que se había
equilibrado con acetato sódico 20 mM, NaCl 300 mM (pH 7,0). A
continuación se realizó un lavado con acetato sódico 20 mM, NaCl
300 mM (pH 7,0), al que se le había añadido un 0,5% de Tween 80. El
rvWF se eluyó con un tampón de glicina 20 mM al que se le había
añadido un 10% de sacarosa, a pH 8,0. Tras el 80% del volumen de la
columna, la velocidad de flujo se redujo aproximadamente en un
factor de 20.
Una columna cromatográfica (7,1 cm^{2} x 8 cm,
llena con 57 ml de Fractogel® EMD-SO3) se lavó con
un tampón (tampón de glicina-NaCl 30 mM; pH 5,0). A
continuación, se filtró el eluato de la cromatografía de
inmunoafinidad a través de la columna de intercambio de cationes.
Después de lavar de nuevo la columna con un tampón de
glicina-NaCl 30 mM, se eliminaron las sustancias
acompañantes ligadas al cambiador de cationes y al vWF con baja
actividad específica mediante lavado de la columna con una solución
de NaCl 0,3M tamponada. A continuación, en la fracción 3, se obtuvo
el vWF de la columna de intercambio mediante elución con un tampón
que contenía NaCl 0,5M.
Tras las distintas etapas cromatográficas se
determinó la concentración de proteína, el contenido en antígeno de
rvWF (vWF:Ag) y la actividad de cofactor de ristocetina
(vWF:RistCoF).
Se descubrió que el rvWF se enriquece mediante
la cromatografía de intercambio aniónico en un factor de 2,3. En la
cromatografía de inmunoafinidad subsiguiente se produjo un nuevo
enriquecimiento en un factor de 3,6. Mediante la cromatografía de
intercambio catiónico subsiguiente fue posible enriquecer el vWF de
nuevo en un factor de 5,2. Además, mediante esta etapa fue posible
eliminar prácticamente por completo (< 0,02 mg/1.000 U de
actividad de vWF RistCoF) las trazas de anticuerpo murino presentes
en el eluato de la columna de inmunoafinidad. Mediante posterior
cromatografía de intercambio aniónico se realizó una separación de
los multímeros de vWF de bajo peso molecular y un enriquecimiento
del vWF con estructuras multiméricas de alto peso molecular, con lo
que aumentó la relación entre la actividad de vWF:RistCoF y la
actividad de vWF:Ag en un factor de 4.
Los resultados de la purificación del rvWF en
las distintas etapas de este procedimiento de purificación
secuencial se muestran en la Tabla 6.
Claims (18)
1. Procedimiento para la obtención de vWF,
caracterizado porque se une el vWF con una concentración de
sal \leq 250 mM a un cambiador de cationes y, mediante elución
fraccionada con una concentración de sal > 300 mM, se obtiene un
vWF con una alta actividad específica que comprende especialmente
multímeros de vWF de alto peso molecular.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se eluyen fracciones con contenido en
vWF, que contienen multímeros de vWF de alto peso molecular, en un
tampón con un pH en un rango de entre 5,0 y 8,5, preferentemente de
entre 6,0 y 8,0.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque, con una
concentración de sal > 250 mM y \leq 300 mM, se eliminan los
multímeros de vWF de bajo peso molecular, los productos de
degradación proteolítica del vWF con baja actividad específica y
las proteínas acompañantes no específicas.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el cambiador de
cationes es un sustrato conjugado con grupos sulfopropilo o grupos
carboximetilo.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se
obtiene(n) una o varias fracciones con contenido en vWF, que
contiene(n) especialmente multímeros de vWF de alto peso
molecular, con una actividad de aglutinación plaquetaria específica
de como mínimo 65 U/mg de proteína y una actividad de unión
colágeno específica de como mínimo 65 U/mg de proteína.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la o las
fracciones con contenido en vWF obtenidas está(n) en esencia libres
de multímeros de vWF de bajo peso molecular, de fragmentos de vWF
con poca actividad específica y de ácidos nucleicos
contaminantes.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se obtiene un
vWF con un alta actividad específica a partir de plasma, de una
fracción plasmática, de crioprecipitados, de sobrenadantes o de
extractos de cultivos celulares recombinantes, o de una solución de
proteínas enriquecida.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque la solución de proteínas enriquecida se
obtiene mediante una etapa de purificación previa.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
caracterizado porque la solución de proteínas enriquecida se
obtiene mediante un procedimiento cromatográfico, tal como una
cromatografía de intercambio aniónico o una cromatografía de
afinidad o una combinación de las mismas.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la o las
fracciones con contenido en vWF obtenida(s) se
somete(n) a un tratamiento para la inactivación o el
empobrecimiento viral.
11. Preparación que contiene vWF purificado
especialmente compuesto por multímeros de vWF de alto peso molecular
obtenible a partir de una solución de proteínas con contenido en
vWF mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a
10.
12. Preparación según la reivindicación 11,
caracterizada porque está esencialmente libre de multímeros
de vWF de bajo peso molecular, de productos de degradación de vWF
inactivos y de ácidos nucleicos contaminantes.
13. Preparación según la reivindicación 11 ó 12,
caracterizada porque contiene un vWF con una actividad de
aglutinación plaquetaria específica de como mínimo 65 U/mg de
proteína y una actividad de unión colágeno específica de como
mínimo 65 U/mg de proteína.
14. Preparación según una de las
reivindicaciones 11 a 13, caracterizada porque está
esencialmente libre de factor VIII y presenta un contenido de
factor VIII < 0,1% con respecto a la relación entre la actividad
de vWF y de factor VIII:C.
15. Preparación según una de las
reivindicaciones 11 a 14, caracterizada porque es a prueba de
virus.
16. Preparación según una de las
reivindicaciones 11 a 15, caracterizada porque se presenta en
una forma inalterable en almacenamiento.
17. Preparación según una de las
reivindicaciones 11 a 16, caracterizada porque está formulada
como preparado farmacéutico.
18. Utilización de una preparación con contenido
en vWF según una de las reivindicaciones 11 a 17 para la producción
de un medicamento para el tratamiento de pacientes con hemofilia
fenotípica y vWD.
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