ES2285758T3

ES2285758T3 - Procedimiento para obtener un factor von willebrand (vwf) o un complejo factor viii/vwf de alta pureza.

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Publication number: ES2285758T3
Application number: ES98903938T
Authority: ES
Inventors: Artur Mitterer; Christian Fiedler; Bernhard Fischer; Friedrich Dorner; Johann Eibl
Original assignee: Baxter AG
Current assignee: Baxter AG
Priority date: 1997-02-27
Filing date: 1998-02-18
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2018-02-18
Also published as: ATE359302T1; NO994084D0; CA2282842C; DK1012191T3; AU6199898A; JP4250769B2; JP2001513762A; SI1012191T1; DE59813968D1; EP1012191A1; CA2282842A1; NO994084L; AR010120A1; EP1012191B1; AR010122A1; US6579723B1; WO1998038218A1; NO323861B1; AU734277B2; ATA33997A

Abstract

Procedimiento para la obtención de vWF o complejo factor VIII/vWF de alta pureza mediante cromatografía de inmunoafinidad, en el que un vWF o un complejo FVIII/vWF ligado a un inmunoadsorbente se eluye con un eluyente que contiene como componente activo esencial un ion anfótero, conservando la integridad molecular del vWF o del complejo factor VIII/vWF, caracterizado porque el ion anfótero es un aminoácido o un análogo de aminoácido con un punto isoeléctrico entre 3, 2 y 9, 6 y porque el vWF o el complejo factor VIII/vWF ligado al inmunoadsorbente se disocia sin la utilización de agentes caotrópicos.

Description

Procedimiento para obtener un factor von Willebrand (vWF) o un complejo factor VIII/vWF de alta pureza.

La invención se refiere a un procedimiento para la obtención de vWF o de un complejo factor VIII/vWF de alta pureza a partir de un material biológico mediante cromatografía de inmunoafinidad, así como a una preparación estable que contiene el vWF o el complejo factor VIII/vWF de alta pureza.

La coagulación sanguínea es un proceso complejo que incluye la interacción secuencial de diversos componentes, en particular de fibrinógeno, factor II, factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI y factor XII. La pérdida de uno de estos componentes o la inhibición de su funcionalidad provoca una mayor tendencia de la coagulación sanguínea, que en algunos casos puede llegar a poner en peligro la vida del paciente.

El factor von Willebrand (vWF) circula en el plasma formando un complejo con el factor VIII, donde el factor VIII favorece la coagulación sanguínea y el complejo de vWF y factor VIII estabiliza y protege de la degradación proteolítica. Debido a su función en la agregación plaquetaria, el vWF también interviene directamente en la coagulación sanguínea. El vWF aparece en el plasma de diversas formas multiméricas, con un peso molecular de entre 1 x 10^{6} y 20 x 10^{6} dalton. El vWF es una glucoproteína que se forma principalmente en las células endoteliales de mamíferos y, a continuación, se libera a la circulación. Partiendo de una cadena polipeptídica con un peso molecular aproximado de 220 kD y mediante la formación de varios puentes de sulfuro, en las células se forma un dímero de vWF con un peso molecular de 550 kD. Entonces, a partir de los dímeros de vWF se producen, mediante enlaces, otros polímeros de vWF con pesos moleculares cada vez mayores, de hasta 20 millones de dalton. Se supone que especialmente los multímeros de vWF de alto peso molecular tienen una importancia esencial en la coagulación sanguínea.

En la hemofilia, la coagulación sanguínea se ve perturbada por la falta de determinados factores plasmáticos de coagulación sanguínea. En el caso de la hemofilia A, la tendencia a la hemorragia se debe a una carencia de factor VIII o de vWF, que es un componente esencial del factor VIII. El tratamiento de la hemofilia A se lleva a cabo, en primer lugar, sustituyendo el factor de coagulación ausente por concentrados de factores, por ejemplo por infusión de factor VIII, complejo de factor VIII o vWF.

El síndrome del vWF presenta varios cuadros clínicos atribuibles a una producción deficitaria o excesiva de vWF. Una producción excesiva de vWF aumenta la tendencia a la trombosis. Un suministro deficitario debido a la ausencia o a la reducción de formas de alto peso molecular de vWF se manifiesta en una mayor tendencia a la hemorragia y una mayor duración de ésta a causa de la inhibición de la agregación plaquetaria y del cierre de la herida.

La falta de vWF también puede provocar una hemofilia A fenotípica, ya que el vWF es un componente esencial del factor VIII funcional. En estos casos, la vida media del factor VIII se reduce de tal modo que se ve mermada su función en la cascada de coagulación sanguínea. Por tanto, los pacientes con síndrome de von Willebrand (vWD) con frecuencia presentan una deficiencia de factor VIII. En estos pacientes, la actividad reducida del factor VIII no es consecuencia de un defecto en el gen del cromosoma X, sino que es consecuencia indirecta de la alteración cuantitativa y cualitativa del vWF en el plasma. Normalmente se diferencia la hemofilia A y el vWD midiendo el antígeno de vWF o determinando la actividad del cofactor de ristocetina. Tanto el nivel de antígeno de vWF como la actividad del cofactor de ristocetina aparecen reducidos en la mayoría de los pacientes de vWD, mientras que en los pacientes de hemofilia A son normales.

Los métodos convencionales para la terapia del síndrome de von Willebrand se realizan con vWF obtenido de plasma, existiendo una serie de fórmulas para el tratamiento de pacientes de vWD con vWF o con complejo de factor VIII/vWF purificado. El desarrollo de anticuerpos monoclonales y policlonales contra factores sanguíneos, en particular contra el vWF, permitió mejorar el aislamiento y la purificación del vWF o del complejo factor VIII/vWF procedente del plasma o de otras fuentes biológicas.

La purificación del factor VIII o del complejo factor VIII/vWF del plasma es especialmente difícil porque el factor VIII sólo se presenta en el plasma en una pequeña cantidad, es sumamente lábil y la asociación del factor VIII con el vWF es reversible bajo condiciones específicas.

Mediante la expresión del factor VIII en células recombinantes (Wood y col., Nature 312: 330-337, 1984) fue posible producir el factor VIII por ingeniería genética, pero hasta la adición o coexpresión del vWF no fue posible lograr un rendimiento de factor VIII recombinante que pudiera emplearse comercialmente. También se obtuvo el vWF mediante técnicas de ingeniería genética y se expresó en células recombinantes (Fischer y col., 1994, FEBS Letters 351: 345-348).

También se ha descrito ya la obtención de factor VIII, de vWF o de complejo factor VIII/vWF purificado a partir de plasma, o de factor VIII o de vWF a partir de células recombinantes, mediante distintos procedimientos de purificación.

Zimmerman y col. (US 4,361,509) describen un procedimiento para la purificación de factor VIII en el que se une el complejo factor VIII/vWF a un anticuerpo anti-vWF monoclonal y se disocia el factor VIII del complejo mediante iones de CaCl_{2}. A continuación, el factor VIII así obtenido se obtiene en forma pura gracias a una etapa cromatográfica adicional. El sustrato de inmunoafinidad en el que aún está adsorbido el vWF se regenera mediante un agente caotrópico, en particular NaSCN, con lo que se obtiene como subproducto una solución de vWF/NaSCN, que se desecha.

El documento US 5,006,642 describe la obtención de vWF a partir de una solución de vWF y un agente caotrópico, producida como subproducto según el documento US 4,361,509, mediante diálisis contra un tampón adecuado o por desalificación de la solución mediante una etapa cromatográfica adicional.

El documento EP 0 383 234 describe un procedimiento para la preparación de un concentrado de vWF mediante cromatografía de intercambio aniónico, donde se disocia un complejo factor VIII/vWF contenido en una solución mediante la adición de un tampón que contiene calcio y un aminoácido, obteniéndose un concentrado de vWF.

El documento EP 0 469 985 describe un procedimiento para preparar vWF a partir de un crioprecipitado plasmático libre en gran parte de factor VIII, donde, en una primera etapa de purificación, se separa el vWF del factor VIII, uniéndose el factor VIII a un intercambiador aniónico, mientras que el vWF no se une. En una segunda etapa se reduce la concentración de sal del eluato que contiene el vWF, con lo que éste puede unirse a un segundo intercambiador aniónico. A continuación el vWF se eluye gracias a un aumento de la fuerza iónica.

Para ser empleado en la terapia de pacientes con síndrome de von Willebrand, pero también de pacientes con hemofilia A fenotípica, es deseable un vWF purificado, en caso dado formando un complejo con el factor VIII. Además, gracias al efecto estabilizador del vWF se logra una mayor inalterabilidad de almacenamiento de los preparados de factor VIII.

Para la purificación del complejo factor VIII/vWF se propuso precipitar proteínas contaminantes, por ejemplo fibrinógeno, con altas concentraciones de aminoácidos, en particular de glicina (WO 82/04395, EP 0 383 234).

El documento EP 0 600 480 describe la purificación del complejo factor VIII/vWF de plasma mediante una combinación de cromatografía de intercambio aniónico/catiónico, estabilizándose el complejo de factor VIII/vWF con heparina y, en caso dado, añadiéndose lisina como antiproteasa.

El documento EP 0 295 645 describe un procedimiento para la purificación del complejo factor VIII/vWF en una matriz de afinidad, donde como sustratos de afinidad se emplean péptidos específicos capaces de ligarse al vWF y a los cuales se liga el complejo, el cual, a continuación, se eluye con un gradiente de pH.

El documento WO 96/10584 describe un procedimiento para la obtención de vWF recombinante de alta pureza mediante una combinación de cromatografía de intercambio aniónico y de afinidad con heparina y el documento EP 0 705 846 describe la separación de fracciones de alto y bajo peso molecular de vWF.

Mejan y col. (1988, Thromb. Haemost. 59: 364-371) propusieron purificar el complejo factor VIII/vWF de plasma mediante inmunoafinidad. Utilizando un anticuerpo específico para el vWF acoplado a un sustrato, se liga complejo factor VIII/vWF al sustrato bajo condiciones fisiológicas y se eluye el complejo en condiciones alcalinas a un pH de 10,2. El eluato se mezcla inmediatamente con ácido acético 2M para neutralizar el medio alcalino, se estabiliza con seroalbúmina humana y, a continuación, se liofiliza. Se eligió el medio de elución ligeramente alcalino para, en particular, impedir una disociación del complejo factor VIII/vWF y una inactivación del factor VIII.

No obstante, se insiste una y otra vez en que, en la purificación del complejo, resulta particularmente difícil conservar la asociación de las proteínas, ya que el complejo de los dos componentes es inestable. Con su procedimiento, Mejan y col. (1988, Thromb. Haemost. 59: 364-371) lograron recuperar un 50% del complejo factor VIII/vWF con una actividad específica de factor VIII \geq 20 U/mg y de vWF \geq 20 U/mg. Sin embargo, bajo las condiciones de elución descritas se observó una liberación parcial de los anticuerpos de la columna, lo que causó una contaminación del eluato con aproximadamente 90 ng/ml de eluato en IgG de ratón. Por tanto, los anticuerpos tenían que eliminarse mediante una etapa cromatográfica adicional.

Hornsey y col. (1987, Thromb. Haemost. 57: 102-105) estudiaron la influencia de distintos eluyentes en la purificación por inmunoafinidad del complejo factor VIII/vWF y comprobaron que agentes caotrópicos como el yoduro de potasio y el diyodosalicilato de litio resultan muy eficaces como eluyentes. El eluyente utilizado contenía además iones de cloruro de calcio y, para la estabilización de la actividad del factor VIII y de vWF, lisina 1M. Se observó que tal alta concentración de aminoácido protege las proteínas contra el efecto desnaturalizante del agente caotrópico. Bajo las condiciones de elución utilizadas se descubrió que el producto final estaba contaminado con el inmunoadsorbente, en este caso anticuerpo de vWF monoclonal de ratón, hasta 30 ng/ml (aproximadamente 300 ng/mg de proteína). El agente caotrópico de desorción también hubo de eliminarse del producto mediante una etapa de purificación adicional debido a su gran toxicidad. Hornsey y col. (1987, Thromb. Haemost. 57: 102-105) lograron, mediante cromatografía de inmunoafinidad, un rendimiento de un 57% de factor VIII:C y un 44% de vWF y una actividad específica de 45 U para el factor VIII y de 60 U de actividad de ristocetina/mg de proteína.

Aunque la inmunoafinidad es uno de los métodos preferidos para la purificación de vWF o de complejo factor VIII/vWF, la mayor desventaja presente en la utilización de la cromatografía de inmunoafinidad es la posible contaminación del producto final con el inmunoadsorbente, así como la necesidad de regenerar la matriz de afinidad utilizada. La fuerte unión entre los anticuerpos y el vWF o el complejo factor VIII/vWF a menudo hace que sea necesario utilizar un agente de desorción fuerte, por ejemplo un agente caotrópico. Esto no sólo perjudica la actividad y la estructura molecular del vWF o del complejo factor VIII/vWF, sino que también tiene como consecuencia una lixiviación ("leakage") del inmunosustrato debido a la continua liberación de anticuerpos del sustrato. La vida media del sustrato de afinidad se ve fuertemente reducida y su capacidad para múltiples utilizaciones se ve mermada. Por consiguiente, dado que especialmente para la preparación comercial de vWF o de complejo factor VIII/vWF la utilización de columnas de inmunoafinidad resulta muy costosa, sería deseable poner a disposición un procedimiento que no presente estas desventajas.

Por tanto, el objetivo de la presente invención es poner a disposición un procedimiento mejorado para la obtención de vWF o de complejo factor VIII/vWF mediante cromatografía de inmunoafinidad que no presente las desventajas arriba descritas.

El objetivo se logra según la invención mediante la puesta a disposición de un procedimiento en el que se purifica el vWF o el complejo factor VIII/vWF mediante cromatografía de inmunoafinidad, eluyéndose un vWF o un complejo factor VIII/vWF ligado a un inmunoadsorbente con un eluyente que contiene, como componente activo esencial, un ion anfótero y disociándose el vWF o el complejo factor VIII/vWF ligado al inmunoadsorbente sin utilizar reactivos caotrópicos.

Como iones anfóteros eluyentes según la presente invención se utilizan aminoácidos o análogos de aminoácidos cuyo rango isoeléctrico se halla entre 3,2 y 9,6 y que se presentan como iones anfóteros en un rango de pH neutro. Los iones anfóteros preferentes para ello se eligen de entre el grupo formado por aminoácidos neutros o análogos, preferentemente alanina, \beta-alanina, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, asparagina, citrulina, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, sarcosina, serina, taurina, treonina, triptófano y tirosina, o betaínas o análogos de las mismas, en particular sulfobetaínas.

Para la realización del procedimiento son especialmente preferentes los aminoácidos alanina, \beta-alanina, glicina, histidina, fenilalanina o betaína. Según el presente procedimiento, los iones anfóteros pueden presentarse en solución acuosa a una concentración entre 0,01 y 0,5M, preferentemente entre 0,08 y 0,2M y en especial entre 0,1 y 0,15M. Al mismo tiempo, las soluciones acuosas pueden estar compuestas exclusivamente por agua sin contener aditivos.

Según el presente procedimiento, el eluyente que contiene el ion anfótero puede tener un pH fisiológico, preferentemente un pH entre 6,5 y 8,0 y en especial entre 7,0 y 7,8, siendo especialmente preferente un pH de 7,4. En este rango de pH, todos los aminoácidos o análogos de aminoácidos arriba mencionados se comportan de un modo eléctricamente neutro y se presentan en forma de ion anfótero.

El eluyente puede prepararse por simple disolución en agua del aminoácido o del análogo de aminoácido de la molaridad deseada. Dado que, por la carga neutra del ion anfótero, el valor pH y la fuerza iónica no varían o lo hacen de forma insignificante, no es absolutamente necesario ajustar el pH o la fuerza iónica. Ya que, en algunos casos, por ejemplo cuando se realizan una o varias etapas de inactivación viral, es deseable una estabilización adicional del eluato que contiene el vWF o el complejo de vWF, en caso dado pueden añadirse como estabilizantes otras sustancias tales como azúcares, por ejemplo sacarosa o maltosa. Dado que estos azúcares también se comportan de un modo química/físicamente neutro, con la adición no se altera el pH del eluyente.

Por ejemplo, en los documentos EP 0 383 234 ó EP 0 600 480 se describe la utilización de aminoácidos como glicina, histidina o arginina como precipitantes, antiproteasas o estabilizantes, o para facilitar la reconstitución de las soluciones de factor VIII, donde la concentración de los aminoácidos empleados se hallaba entre 0,5 y 3M. Además, se conocen aminoácidos como componentes de eluyentes o tampones para procesos cromatográficos. Tsang y col. (1991, J. Immunol. Methods 138: 291-299) estudiaron las distintas condiciones de disociación de los antígenos ligados a las matrices de inmunoafinidad y descubrieron que los agentes caotrópicos son los reactivos de disociación más eficaces para disolver las uniones antígeno-anticuerpo. Sin embargo, debido al efecto desnaturalizante de los agentes caotrópicos, la actividad específica de las proteínas eluidas era pequeña. La utilización de glicina 0,5M, pH 2,0, como reactivo de elución dio como resultado una capacidad de disociación comparativamente pequeña y una actividad específica relativamente pequeña de la proteína obtenida. Además, el bajo valor del pH del eluyente hacía necesario neutralizar el eluato rápidamente para evitar una pérdida adicional de actividad de la proteína. También se descubrió que, en estas condiciones, se desprendían anticuerpos del sustrato, los cuales llegaban al eluato.

Por consiguiente, de acuerdo con las observaciones de Tsang y col. (1991, J. Immunol. Methods 138: 291-299) era tanto más sorprendente que en el marco de la presente invención se descubriese que un eluyente que contiene como reactivo de elución activo esencial un ion anfótero sea capaz de disociar eficazmente un complejo anticuerpo/antígeno bajo condiciones suaves y en un rango de pH neutro sin utilizar agentes caotrópicos. Bajo condiciones de elución suaves no sólo es posible obtener eficazmente el antígeno deseado en forma purificada y, debido a la gran especificidad con respecto al anticuerpo, libre de componentes contaminantes sino también, en esencia, libre de inmunoadsorbente, ya que, aunque se produce una disociación del complejo anticuerpo-antígeno, la unión del anticuerpo al sustrato no se ve afectada y el anticuerpo permanece asociado al sustrato de forma estable.

Para la realización del procedimiento según la invención puede utilizarse como ligando todo inmunoadsorbente que presente especificidad de unión con el vWF y que, como ligando, pueda inmovilizarse en un sustrato sólido.

Según una forma de realización del procedimiento según la invención, como inmunoadsorbente se utiliza un anticuerpo anti-vWF. El anticuerpo empleado puede ser policlonal o monoclonal. Sin embargo, son especialmente preferentes los anticuerpos monoclonales. Para llevar a cabo el procedimiento según la invención pueden emplearse todos los anticuerpos anti-vWF conocidos, por ejemplo los descritos por Goodall y col. (Thromb. Haemost. 54: 878-891, 1985). Preferentemente se emplea un anticuerpo de vWF monoclonal de un hibridoma seleccionado de la línea híbrida celular de mieloma de ratón X63 y de esplenocitos de ratón BALB/C inmunizada con complejo factor VIII/vWF, según se describe por ejemplo en el documento EP 0 179 006.

Según una forma de realización preferente, para llevar a cabo el procedimiento según la invención, como ligando se emplea un fragmento de un anticuerpo anti-vWF capaz de unirse al vWF o al complejo factor VIII/vWF. Es especialmente preferente el fragmento F'ab de anticuerpos de vWF. La utilización de un fragmento de anticuerpo específico tiene la ventaja de que permite producir fácilmente una matriz sustrato de afinidad con el fragmento de anticuerpo como ligando, aumentando la capacidad de unión del antígeno y la eficacia de la unión al sustrato gracias al menor tamaño molecular del ligando. También se reduce en gran medida, tanto que puede despreciarse, el riesgo de que el producto se contamine con un anticuerpo completo que pudiese llegar al eluato.

Preferentemente, el inmunoadsorbente está inmovilizado en un sustrato, pudiendo ser utilizados como sustrato todos los polímeros insolubles naturales o sintéticos conocidos adecuados para la cromatografía de afinidad.

El procedimiento según la invención constituye un método sencillo y eficaz para obtener vWF o complejo factor VIII/vWF con una gran actividad específica y un gran rendimiento a partir de una solución de proteínas, en caso dado no sometida a purificación previa. Como material de partida que contiene vWF o complejo factor VIII/vWF puede emplearse toda solución biológica, por ejemplo plasma, un pool plasmático, una fracción plasmática, un crioprecipitado, el sobrenadante de un cultivo celular, que exprese el factor VIII o vWF recombinante o coexprese factor VIII y vWF, o una solución de proteínas previamente purifida. Sin embargo, el presente procedimiento es particularmente adecuado para obtener vWF o complejo factor VIII/vWF a partir de soluciones de proteínas no sometidas a purificación previa, por ejemplo directamente a partir de plasma o del sobrenadante de un cultivo de células recombinantes. Según el presente procedimiento, el vWF o el complejo factor VIII/vWF contenidos en un material de partida se unen al inmunoadsorbente preferentemente bajo condiciones fisiológicas. Para ello, la solución de partida se ajusta a un pH entre 6,5 y 7,8, a una temperatura entre 4ºC y 20ºC y se pone en contacto con el inmunoadsorbente, con lo que, debido a la capacidad de unión específica del anticuerpo con respecto al vWF, se une el vWF o el factor VIII complejado con vWF, mientras que otras proteínas contenidas en la solución no se unen, separándose éstas así fácilmente del vWF o del complejo factor VIII/vWF.

Mediante el procedimiento y la elución según la invención con un tampón en un rango de pH neutro, el cual contiene como agente eluyente esencial un ion anfótero, es posible obtener el vWF o el complejo factor VIII/vWF del inmunoadsorbente con una gran eficacia. Debido a la interacción específica del vWF y del factor VIII complejado, también se une el complejo de factor VIII y vWF, mientras que el factor VIII libre, no complejado, no puede ligarse al inmunoadsorbente. Por tanto, con ayuda del procedimiento según la invención se obtiene un vWF puro o un factor VIII exclusivamente complejado con vWF. Se comprobó en particular que era posible recuperar aproximadamente el 85% del vWF o del complejo factor VIII/vWF presente en el material de partida. Por consiguiente, mediante el procedimiento según la invención se recupera el vWF o el complejo factor VIII/vWF con una pureza de más de un 90%, preferentemente de más de un 95%. Esta alta proporción de recuperación y pureza no se consiguen en una única etapa con los procedimientos cromatográficos descritos hasta la fecha. La utilización del eluyente y las condiciones de elución suaves descritas tienen también la ventaja de que se conserva la asociación del factor VIII con el vWF y, con ello, la estructura fisiológica y molecular del complejo.

Además, el procedimiento según la invención tiene la ventaja particular adicional de que antes de y durante la elución no ha de llevarse a cabo ninguna modificación del pH en la solución que contiene las proteínas y la actividad biológica de la proteína por purificar no se ve mermada debida a una variación del pH.

Mediante la utilización del eluyente arriba descrito, el vWF o el complejo de vWF se desorbe eficazmente del inmunoadsorbente sin perjudicar la integridad estructural del vWF o la actividad del vWF o del factor VIII. En particular, se demostró la integridad estructural del vWF mediante un análisis de los multímeros de vWF tal como se describe, por ejemplo, en el documento EP 0 705 846, antes de la adsorción y tras la elución del inmunosustrato. También se ha comprobado que, en esencia, no se ven afectadas ni la actividad de unión del colágeno ni la actividad de aglutinación plaquetaria específica del vWF.

Una comparación entre la actividad del factor VIII:Ag y la del factor VIII:C en el material de partida y tras la elución del sustrato demostró que la relación no varía. La actividad específica es preferentemente > 80 U/mg.

El vWF o el complejo factor VIII/vWF de alta pureza obtenido con el procedimiento según la invención puede purificarse, si es el caso, mediante los métodos cromatográficos ya conocidos del estado actual de la técnica, por ejemplo por cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o cromatografía de filtración en gel. El complejo factor VIII/vWF purificado puede adsorberse por ejemplo en un sustrato de afinidad que se ligue específicamente al vWF o bien al factor VIII y se pueden obtener las proteínas por separado unas de otras y en forma libre con un tampón que disocie el complejo, por ejemplo con un tampón de pH bajo y alta fuerza iónica que contenga CaCl_{2} o NaCl. Este procedimiento permite obtener selectivamente factor VIII no complejado con vWF o vWF no complejado con factor VIII. Las proteínas o los antígenos así aislados se distinguen particularmente porque no están afectados en lo que se refiere a la unión del vWF o del factor VIII. De este modo puede obtenerse de forma selectiva un factor VIII purísimo con una gran especificidad de unión a vWF o vWF purísimo con una gran especificidad de unión a factor VIII en relación con el contenido en antígeno.

Por tanto, la presente invención comprende también un vWF de alta pureza con una capacidad de unión al factor VIII de más de un 90%, preferentemente de más de un 95%, o un factor VIII con una afinidad de unión al vWF de como mínimo un 90%. Un vWF o un complejo factor VIII/vWF así purificado puede continuar purificándose mediante cromatografía de afinidad con heparina, por ejemplo tal como se describe en el documento EP 0 705 846, con lo que se enriquecen los multímeros de vWF de alto peso molecular. El vWF o el complejo factor VIII/vWF así obtenido, que contiene especialmente multímeros de vWF de alto peso molecular, se distingue por una gran agregación plaquetaria específica de como mínimo 60 U/mg de proteína.

En particular, con el procedimiento según la invención se obtiene vWF o complejo factor VIII/vWF purificado a partir de una solución acuosa que contiene un ion anfótero en una concentración entre 0,08M y 0,2M y con un pH entre 7,3 y 7,8, donde el ion anfótero se selecciona de entre el grupo de los aminoácidos glicina, alanina, \beta-alanina, fenilalanina e histidina, o de las betaínas. Este vWF o complejo factor VIII/vWF purificado puede entonces, en caso dado, someterse a una etapa adicional de empobrecimiento viral y/o de inactivación viral, ya conocidas en el estado actual de la técnica.

La solución purificada puede someterse directamente, por ejemplo, a una filtración esterilizante mediante un filtro con un tamaño de poro entre 100 nm y 0,45 \mum y liofilizarse sin añadir un estabilizante, en particular un estabilizante de alto peso molecular.

El procedimiento según la invención puede emplearse para purificar y obtener vWF o complejo factor VIII/vWF recombinante o plasmático.

Según la presente invención, la preparación estable contiene el vWF con una pureza de como mínimo un 95% y una actividad de antígeno específica de como mínimo 95 U/mg de proteína, preferentemente de 100 U/mg de proteína. Una preparación estable con contenido en complejo factor VIII/vWF producida según la invención presenta una pureza de como mínimo un 95%, preferentemente de un 99%, siendo la actividad específica de factor VIII:C al menos de 95 U/mg de proteína y la de vWF como mínimo de 95 U/mg de proteína, con lo que la relación de actividad específica en el complejo es 1:1.

Según una forma de realización especial, el complejo factor VIII/vWF se compone de factor VIII recombinante y vWF recombinante, siendo la relación entre el factor VIII y el vWF de entre 0,01 y 100, preferentemente de entre 1:30 y 1:70 y de forma especialmente preferente siendo igual a aproximadamente 1:50. En el marco de la invención se descubrió que es posible mezclar los sobrenadantes de cultivos celulares que expresan vWF o factor VIII recombinantes con una concentración definida de antígeno y en una relación arbitraria determinada y, una vez realizado el procedimiento según la invención, recuperar el complejo purificado compuesto de proteínas recombinantes también en la relación deseada.

Al purificarse a partir de plasma o de crioprecipitado, el vWF se degrada de forma conocida debido a las proteasas dado el caso presentes, para formar fragmentos de vWF de bajo peso molecular, que entonces pueden identificarse como fracciones de bajo peso molecular como bandas satélite en gel de SDS (Furlan y col., 1993, PNAS. 90: 7503-7507). También el factor VIII se activa parcialmente por las proteasas presentes, con lo que se reduce la actividad específica del complejo factor VIII/vWF.

La preparación estable producida según la invención, que contiene vWF o complejo factor VIII/vWF de alta pureza, se distingue en particular porque se conserva en esencia la integridad molecular y estructural del vWF o del complejo factor VIII/vWF y porque no contiene productos de degradación proteolítica del vWF o del factor VIII activado.

La preparación producida según la invención está en esencia libre de contaminación producida por el inmunoadsorbente, siendo la cantidad de inmunoadsorbente en caso dado presente, especialmente de anticuerpos, inferior a 15 ng/mg de proteína, preferentemente inferior a 10 ng/mg de proteína y en particular inferior a 7 ng/mg de proteína. Además, la preparación según la invención se distingue porque contiene menos de un 3%, preferentemente menos de un 1%, de fibrinógeno y menos de un 1%, preferentemente menos de un 0,5%, de fibronectina, determinado mediante ELISA según el estado actual de la técnica.

En el marco de la presente invención se comprueba que, especialmente utilizando un eluyente que contiene como agentes eluyentes esenciales en el tampón un aminoácido como glicina, histidina o alanina, empleados hasta la fecha también para estabilizar soluciones de proteínas, el vWF o el complejo factor VIII/vWF eluido puede mantenerse durante todo el proceso de purificación en un medio estabilizante y, por tanto, la preparación obtenida es muy estable.

La preparación obtenida según la invención es estable en solución a 4ºC durante un período de como mínimo 2 semanas, congelada a -20ºC durante como mínimo 6 meses y en forma de liofilizado durante como mínimo 1 año a una temperatura de -20ºC a 4ºC. Gracias a la presencia de por ejemplo histidina en el eluyente, se impide además la precipitación del vWF o del complejo factor VIII/vWF durante el proceso de liofilización. Por tanto, la preparación según la invención puede transformarse directamente, en caso dado sin más aditivos, en un producto liofilizado. Para mejorar la reconstitución del preparado liofilizado también puede añadirse arginina, por ejemplo tal como se describe en el documento WO 93/22336. La preparación estable puede formularse adecuadamente para su administración a humanos en forma de preparación farmacéutica estable y puede contener tampones adecuados o sustratos aceptables desde el punto de vista fisiológico. Como ya se ha indicado más arriba, gracias a la particularmente alta estabilidad de la preparación es posible prescindir de la adición de un estabilizante, si este es el caso. Como ya se sabe, con la adición de un estabilizante, en particular de HSA, se reduce la actividad específica de una preparación antigénica, con lo que la composición farmacéutica administrable presenta una menor actividad específica que la preparación de proteínas obtenida inmediatamente después de la purificación.

Por tanto, según la presente invención se pone a disposición una composición farmacéutica que contiene vWF o complejo factor VIII/vWF con una pureza de como mínimo un 95%, preferentemente un 99%, y una actividad específica de vWF de como mínimo 95 U/mg y de factor VIII de como mínimo 95 U/mg, y está en esencia libre de estabilizantes, en particular de HSA, y de sustancias de alto peso molecular. La preparación farmacéutica según la invención se diferencia con ello de las composiciones farmacéuticas conocidas hasta la fecha, que contienen sustancias como albúmina o heparina para su estabilización.

Sin embargo, en principio no se requiere ninguna costosa reformulación adicional de la preparación purificada para su administración a humanos, dado que el producto purificado puede obtenerse a partir del sustrato de afinidad ya en forma de una composición compatible desde el punto de vista fisiológico. En el eluato aparece ya también como una forma estable y estabilizada.

Por consiguiente, el procedimiento según la invención constituye un procedimiento sencillo para la obtención cuidadosa de un vWF o de un complejo factor VIII/vWF de alta pureza y para la producción sencilla de un preparado farmacéutico estable que, en caso dado, puede utilizarse directamente para una aplicación terapéutica.

Antes de elaborar el vWF o el complejo de vWF de alta pureza para obtener una preparación farmacéutica, resulta ventajoso llevar a cabo una inactivación o un empobrecimiento viral. Éste(a) puede realizarse mediante los tratamientos químicos y/o físicos ya conocidos en el estado actual de la técnica. Dado que, debido a la presencia de aminoácidos como glicina, alanina o histidina, contenidos en la preparación estable según la invención, el vWF o el complejo factor VIII/vWF se encuentra en un medio fisiológico y estabilizante, el producto purificado puede someterse directamente a una etapa de inactivación viral, si es el caso, sin necesidad de añadir más estabilizantes.

La preparación estable puesta a disposición según la presente invención puede utilizarse para la producción de un medicamento para el tratamiento de la hemofilia A o la vWD.

La invención se explica más detalladamente en base a los ejemplos siguientes y la Figura, aunque no está limitada a estas formas de realización en particular.

La Figura 1 muestra un análisis por filtración en gel del complejo factor VIII/vWF.

El Ejemplo 1 describe la determinación de la interacción de distintos anticuerpos anti-vWF y vWF por medio de una "Surface Plasmon Resonance" (resonancia de plasmón superficial) y desorción del antígeno del complejo con distintos tampones; el Ejemplo 2 describe el comportamiento de desorción del antígeno de vWF del complejo antígeno-anticuerpo bajo distintas condiciones del tampón; el Ejemplo 3 describe la purificación del vWF recombinante a partir de sobrenadantes de cultivos celulares mediante inmunoafinidad; el Ejemplo 4 describe la purificación de complejo factor VIII/vWF plasmático; el Ejemplo 5 describe la utilización de un fragmento de anticuerpo para la purificación por inmunoafinidad de vWF; el Ejemplo 6 describe la purificación posterior de vWF purificado por inmunoafinidad mediante cromatografía de afinidad con heparina; el Ejemplo 7 describe la influencia del eluyente en la actividad del factor VIII:C; el Ejemplo 8 describe la purificación de un complejo compuesto por factor VIII recombinante y vWF recombinante; el Ejemplo 9 describe la comprobación del eluato en cuanto a IgG de ratón y fragmentos F'ab; y el Ejemplo 10 muestra la integridad del complejo factor VIII/vWF en el medio de elución según la invención.

Ejemplo

Descripción de método general para el sistema de ensayo de determinación de la interacción de macromoléculas

Desde hace poco tiempo puede observarse directamente la interacción de macromoléculas, en la que se incluye también la reacción de proteínas, con anticuerpos específicos con ayuda de una nueva tecnología - la Surface Plasmon Resonance (Resonancia de plasmón superficial) (Karlsson, 1994, Analyt. Biochem. 221: 142-151; Malmqvist, 1993, Nature 361: 186-187).

En un sistema óptico que se halla en contacto directo con la muestra a estudiar se mide un parámetro dependiente de la concentración molecular y se reproduce en las llamadas "Response-Units (RU)" (unidades de respuesta). Valores de RU altos corresponden a una concentración alta de macromoléculas adsorbidas en la superficie de medida (chip sensor).

Las ventajas del método consisten en que consume poca sustancia, la rapidez con que se realiza y la posibilidad de efectuar una evaluación cinética de los datos.

Con ayuda de este sistema de medida se estudiaron las características de unión fundamentales de anticuerpos específicos de vWF.

Ejemplo 1

Determinación de la interacción de distintos anticuerpos anti-vWF y vWF mediante "Surface Plasmon Resonance" y desorción del antígeno del complejo con distintos tampones

Se unieron anticuerpos anti-vWF monoclonales (Immunotech, Marseille) a la capa activa de un chip sensor CM según el método estándar indicado por Pharmacia. Como control negativo, se revistió una pista del chip sensor con un anticuerpo monoclonal contra Pseudomonas flagellin (PAM 24). La eficacia del acoplamiento puede reconocerse en el aumento de la señal. Tras el acoplamiento, se lavaron las pistas del chip sensor con NaSCN 3M con el fin de eliminar de la superficie del chip anticuerpos adsorbidos de forma no específica. A continuación, se condujo el vWF (sometido a purificación previa por cromatografía de intercambio aniónico) a la superficie del chip (fase de adsorción). Después de lavado con un tampón Tris, pH 7,4, se condujeron sobre el chip distintos tampones que contenían glicina 100 mM y a valores pH crecientes, desde pH 6,0 hasta pH 9,0 (fase de elución). La Tabla 1 muestra la determinación de la interacción de distintos anticuerpos anti-vWF y vWF mediante "Surface Plasmon Resonance" y la desorción del antígeno del complejo con tampón de glicina a distintos pHs.

TABLA 1

1

Según demostraron Mejan y col. (1988, Thromb. Haemost. 59: 364-371), la afinidad máxima entre anticuerpo y antígeno se encuentra a un pH entre 5 y 7. Por tanto, no era de esperar que ya a partir de un pH 6,0 se produjese un claro desprendimiento del r-vWF adsorbido. La variación en el comportamiento de desorción del complejo antígeno-anticuerpo se atribuyó a la presencia de glicina en el tampón. Además, se comprobó que los dos anticuerpos anti-vWF distintos AvW8-1 y AvW8-2 mostraban el mismo comportamiento con relación a la glicina.

Para excluir la posibilidad de que el efecto observado fuera debido a una característica especial del vWF recombinante, el experimento se repitió con vWF plasmático (pdvWF), con el mismo resultado.

Ejemplo 2

Comportamiento de desorción del antígeno de vWF del complejo antígeno-anticuerpo bajo distintas condiciones tampón

Para estudiar con mayor detalle la naturaleza de la interacción antígeno de vWF/anticuerpo anti-vWF, se realizaron ensayos de elución con otros tampones/eluyentes. Se estudió sobre todo la actividad de tampones que contenían distintos aminoácidos o sus derivados a un pH 7,4.

Las sustancias estudiadas incluían, entre otras, alanina, \beta-alanina, fenilalanina, histidina, arginina, lisina, ácido glutámico, ácido aspártico, betaína y acetato.

La Tabla 2 muestra la determinación de la interacción de anticuerpos anti-vWF y antígeno de vWF mediante "Surface Plasmon Resonance" y desorción del antígeno del complejo con tampones que contienen distintos aminoácidos como reactivos de elución.

TABLA 2

2

Se descubrió que, en especial los aminoácidos con grupos homopolares como glicina, alanina, \beta-alanina o fenilalanina, o derivados de los mismos, o los aminoácidos que se presentan en forma de iones anfóteros en el rango neutro como histidina, son capaces de eluir eficazmente el vWF ligado al anticuerpo (Tabla 2).

Se ensayaron los tampones correspondientes que contenían estos aminoácidos o derivados de los mismos para la purificación de vWF o complejo de vWF/factor VIII mediante cromatografía de inmunoafinidad.

Ejemplo 3

Purificación de vWF recombinante a partir de sobrenadantes de cultivos celulares mediante inmunoafinidad

(Actualmente, en opinión de la solicitante, el mejor modo de realización de la invención)

El anticuerpo anti-vWF monoclonal AvW8-2 se acopló de forma covalente a Sepharose activada con CNBr (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante. El recubrimiento de la resina con el anticuerpo era de 1 mg/ml de gel empaquetado.

500 ml de un sobrenadante de fermentación concentrado que contenía vWF recombinante (rvWF) se aplicaron con una velocidad de flujo lineal de 20 cm/h a una columna que se había llenado con 50 ml de una resina de afinidad. Una vez aplicada la muestra, se lavó la columna con tampón fosfato, pH 7,4, hasta que la absorción UV del efluente de la columna alcanzó el valor de la línea base. El rvWF ligado se eluyó de la columna mediante elución lenta (5 cm/h) con glicina 100 mM, pH 7,4.

En la Tabla 3 se muestran los datos de los análisis de las fracciones correspondientes.

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TABLA 3

3

De estos resultados se desprende que, bajo las condiciones indicadas, es posible obtener sobrenadantes de fermentación y, con un buen rendimiento, vWF recombinante de gran pureza y con una actividad de antígeno específica de como mínimo 100 U/mg de proteína, con una recuperación de como mínimo un 74%.

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Ejemplo 4

Purificación del complejo FVIII/vWF plasmático

50 g de crioprecipitado se disolvieron en 450 ml de tampón de heparina. Los factores del complejo de protrombina se eliminaron mediante la adición de un 0,1% de alhidrogel. La solución de proteínas clarificada se purificó mediante inmunoafinidad como se ha descrito en el Ejemplo 3. En la Tabla 4 se resumen los datos del análisis antes y después de la purificación.

TABLA 4

4

De la Tabla 4 se desprende que cuando se utiliza un crioprecipitado como material de partida es posible obtener un complejo FVIII/vWF con una gran pureza y una actividad específica de vWF de como mínimo 118 U de antígeno/mg de proteína y de factor VIII de como mínimo 94 U/mg. Mediante el procedimiento según la invención se elimina factor VIII libre y se recupera complejo factor VIII/vWF puro en esencia, en una relación de aproximadamente 1:1. La producción del complejo factor VIII/vWF puro está entre aproximadamente un 70% y un 80% y, por ello, por encima de los valores descritos hasta la fecha para la obtención de proteínas mediante cromatografía de inmunoafinidad.

Ejemplo 5

Utilización de un fragmento de anticuerpo para la purificación por inmunoafinidad del vWF

De igual modo que el anticuerpo monoclonal intacto, también puede utilizarse un fragmento F'ab o F'ab2 del anticuerpo monoclonal. Este procedimiento tiene la ventaja de que las trazas del anticuerpo eventualmente presentes en el producto final ya no contienen ninguna parte de proteína inmunológicamente activa (parte Fc).

La fragmentación del anticuerpo puede llevarse a cabo por proteasas selectivas tales como papaína o pepsina (en forma libre o ligada a una sustancia portadora insoluble). A continuación se describe la preparación, purificación y utilización de un fragmento F'ab del anticuerpo monoclonal AvW8-2:

Se mezclaron 100 mg del anticuerpo monoclonal AvW8-2 con cisteína 1 mM. A esta solución se añadieron 0,5 mg de papaína inmovilizada (firma Pierce) y la suspensión se incubó durante 5 horas a 37ºC. La digestión de la proteasa se detuvo mediante separación por filtración de la papaína inmovilizada, la eventual actividad residual se inhibió por la adición de iodoacetamida 10 mM. Se separaron los fragmentos F'ab de los fragmentos Fc, los fragmentos menores y el anticuerpo intacto por medio de cromatografía de intercambio aniónico en Poros Q. Los fragmentos F'ab purificados se acoplaron con una densidad de recubrimiento de 1 mg/ml de gel a Sepharose activada con CNBr. 500 ml del sobrenadante de fermentación concentrado con contenido en r-vWF se purificaron tal como se describe en el Ejemplo 3 con 50 ml de la resina de afinidad así preparada.

La Tabla 5 muestra los resultados de la cromatografía de inmunoafinidad mediante elución con un tampón que contenía glicina 100 mM, pH 7,4.

TABLA 5

5

De los resultados de la Tabla 5 se desprende que un fragmento F'ab del anticuerpo monoclonal puede utilizarse para la purificación de vWF por cromatografía de inmunoafinidad con la misma eficacia que el anticuerpo intacto. Pero además fue posible recuperar vWF con un mayor rendimiento de un 85% a partir del material de partida, y con una actividad específica de como mínimo 93 U de antígeno/mg de proteína.

Ejemplo 6

Purificación posterior mediante cromatografía de afinidad con heparina

Es posible aumentar en una etapa de purificación adicional la calidad del vWF así purificado, bien sea mediante un enriquecimiento de multímeros de vWF consistentes en multímeros de vWF de alto peso molecular, bien sea mediante eliminación de la contaminación residual. Como métodos para ello entran en consideración los procedimientos ya conocidos, como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad con heparina o filtración en gel.

A continuación se describe la combinación de una cromatografía de inmunoafinidad con una cromatografía con heparina subsiguiente.

El eluato de la cromatografía de inmunoafinidad (Ejemplo 5) se cargó sin más tratamiento en una columna de 50 ml llena con Fractogel®-heparina. La elución del rvWF ligado se llevó a cabo aplicando un gradiente escalonado de sal, eluyéndose el rvWF principalmente en un rango de NaCl entre 0,25M y 0,3M.

Todos los tampones cromatográficos contenían glicina 100 mM para garantizar, durante la cromatografía con heparina, la disociación de los fragmentos F'ab de vWF eventualmente sangrados. Los resultados de la cromatografía de afinidad con heparina se resumen en la Tabla 6.

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TABLA 6

6

Como puede verse en la Tabla 6, las etapas de purificación subsiguientes permiten mejorar aun más la actividad de ristocetina del vWF. En particular se descubrió que se obtiene una actividad de aglutinación plaquetaria específica de más de 60 U/mg de proteína. Además, es posible recuperar más de un 85% del material empleado en forma de proteína purificada con una gran actividad específica.

Tras la filtración esterilizante y la formulación farmacéutica, el producto final de la purificación puede cargarse directamente en los recipientes finales correspondientes y liofilizarse. En este caso, la glicina contenida en el tampón actúa de estabilizante durante el proceso de liofilización y disolución.

Ejemplo 7

Influencia del eluyente en la actividad de FVIII:C

Se adsorbió crioglobulina disuelta, tal como se describe en el Ejemplo 4, en una columna cubierta con AvW8-2. El acoplamiento del anticuerpo se realizó en este caso mediante benzoquinona para mejorar la estabilidad del pH. La elución del complejo de FVIII/vWF ligado se llevó a cabo, por una parte, mediante aumento del pH, tal como se describe en Mejan y col. (1988, Thromb. Haemost. 59: 364-371) y, por otra parte, mediante elución con glicina de acuerdo con el procedimiento según la invención.

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En la Tabla 7 se muestran los resultados de la determinación del rendimiento y la actividad de factor VIII específica mediante cromatografía de inmunoafinidad con distintos métodos de elución.

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TABLA 7

7

De la Tabla 7 se desprende que, cuando se utiliza tampón de glicina como eluyente, el rendimiento aumenta hasta 4 veces con relación al desplazamiento de pH y la actividad específica del factor VIII obtenido mejora al doble. La causa de ello podría ser la exposición o activación del FVIII en un desplazamiento del pH, mientras que en condiciones de elución suaves, con un pH neutro, en presencia de un aminoácido o del ion anfótero, la actividad de factor VIII se ve menos perjudicada.

Ejemplo 8

Purificación de un complejo compuesto por FVIII recombinante y vWF recombinante

Sobrenadantes de cultivos celulares recombinantes sometidos a una transfección con un vector que contenía cDNA que codificaba para los factores VIII o vWF se mezclaron en una relación 3 factor VIII:1 vWF. La mezcla, que contenía complejo rFVIII/rvWF, se purificó bajo las condiciones indicadas en el Ejemplo 3.

En la Tabla 8 se muestran los resultados de esta purificación de los factores rVIII/rvWF.

TABLA 8

8

La Tabla 8 muestra que, bajo las condiciones indicadas, un complejo compuesto de rFVIII y rvWF se comporta igual que un complejo plasmático. También se recuperó, en función de la proporción de mezcla del material de partida, complejo rFVIII/rvWF en una determinada interrelación. Variando la relación FVIII/vWF en el inicio o realizando una etapa cromatográfica subsiguiente puede variarse la relación FVIII/vWF en favor del contenido de FVIII relativo. Así es posible obtener de forma controlada un complejo de factor VIII/vWF con una determinada proporción deseada.

Ejemplo 9

Ensayo en cuanto a la IgG de ratón (fragmentos F'ab)

Se detectaron los fragmentos F'ab contaminantes en el eluato de la columna de inmunoafinidad con ayuda de un procedimiento inmunológico (Immuno Ligand Assay, Molecular Devices).

Se marcó con biotina o fluoresceína IgG anti-ratón de conejo (específico para F'ab). Se mezclaron e incubaron 100 \mul del eluato de la columna con, en cada caso, 2 \mug del anticuerpo marcado con biotina y con fluoresceína. Tras una incubación adicional con 2 \mug de estreptavidina y anticuerpos anti-fluoresceína marcados con ureasa, la mezcla se filtró a través de una membrana biotinilada. Después de lavado de la membrana se pudo detectar con una gran sensibilidad (aprox. 100 pg/ml) el fragmento F'ab ligado.

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En la Tabla 9 se muestran los resultados de los distintos procesos cromatográficos.

TABLA 9

9

En la Tabla 9 puede verse que el procedimiento según la invención permite obtener vWF o complejo factor VIII/vWF con cantidades muy pequeñas de IgG de ratón contaminante (fragmentos F'ab).

Añadiendo una etapa de purificación cromatográfica adicional (cromatografía con heparina o cromatografía de intercambio iónico) es posible reducir esta contaminación residual por debajo del límite de detección.

Ejemplo 10

Integridad del complejo FVIII/vWF purificado

Para demostrar la integridad del complejo purificado, compuesto por FVIII y vWF, se aplicaron 5 ml del eluato de la columna de inmunoafinidad, obtenidos según el Ejemplo 4, a una columna de filtración en gel rellena con 120 ml de Sepharose CL6B. Mediante una elución con tampón de glicina como eluyente se realizó una separación según el tamaño molecular durante el proceso cromatográfico.

Debido a la característica de separación del material de la columna, si hubiera dos especies moleculares distintas (FVIII y vWF) se produciría una separación de las dos proteínas. En la Figura 1 se muestran los resultados de este proceso cromatográfico.

Puede verse claramente que el complejo FVIII y vWF obtenido según el Ejemplo 4 aparece en un pico (-----). Si las dos proteínas no estuvieran asociadas, se eluirían claramente separadas una de otra (véase marcación).

Así, el complejo FVIII/vWF purificado de acuerdo con el procedimiento según la invención se presenta en forma de un complejo de proteínas en el que el vWF tiene la función de estabilizar el FVIII.

Claims

1. Procedimiento para la obtención de vWF o complejo factor VIII/vWF de alta pureza mediante cromatografía de inmunoafinidad, en el que un vWF o un complejo FVIII/vWF ligado a un inmunoadsorbente se eluye con un eluyente que contiene como componente activo esencial un ion anfótero, conservando la integridad molecular del vWF o del complejo factor VIII/vWF, caracterizado porque el ion anfótero es un aminoácido o un análogo de aminoácido con un punto isoeléctrico entre 3,2 y 9,6 y porque el vWF o el complejo factor VIII/vWF ligado al inmunoadsorbente se disocia sin la utilización de agentes caotrópicos.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el ion anfótero se selecciona de entre el grupo de los aminoácidos neutros, en particular de entre glicina, alanina, \beta-alanina, fenilalanina e histidina, o de las betaínas.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el ion anfótero se encuentra en solución en una concentración entre 0,01 y 0,5M, preferentemente entre 0,08 y 0,2M y de forma especialmente preferente entre 0,1 y 0,15M.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el eluyente presenta un valor pH fisiológico, preferentemente entre pH 7,0 y pH 8,0 y con especial preferencia entre pH 7,3 y pH 7,8, siendo particularmente preferente un pH de 7,4.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el inmunoadsorbente es un anticuerpo anti-vWF, preferentemente un anticuerpo monoclonal.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el inmunoadsorbente es un fragmento de un anticuerpo anti-vWF.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se obtiene vWF o complejo de factor VIII/vWF purificado en una solución acuosa que contiene un ion anfótero en una concentración entre 0,08M y 0,2M y con un pH entre 7,3 y 7,8, habiéndose seleccionado el ion anfótero del grupo de los aminoácidos glicina, alanina, \beta-alanina, fenilalanina e histidina, o de las betaínas.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se somete el vWF o el complejo factor VIII/vWF purificado a una etapa cromatográfica adicional, preferentemente a una cromatografía de afinidad con heparina.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque se liofiliza el vWF o el complejo factor VIII/vWF purificado sin la adición de estabilizantes de alto peso molecular.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se somete el vWF o el complejo factor VIII/vWF purificado a una etapa de inactivación y/o empobrecimiento viral.