JPH04108799A

JPH04108799A - 血液凝固第８因子結合性ペプチド及びその使用

Info

Publication number: JPH04108799A
Application number: JP22656590A
Authority: JP
Inventors: Masashi Kato; 誠志加藤; Junko Fujisawa; 藤沢　順子; Nobuko Ito; 伊藤　宣子; Sei Kondo; 近藤　聖
Original assignee: Nippon Mining Co Ltd; Sagami Chemical Research Institute; Tosoh Corp; Nikko Kyodo Co Ltd
Current assignee: Sagami Chemical Research Institute; Tosoh Corp; Eneos Corp
Priority date: 1990-08-30
Filing date: 1990-08-30
Publication date: 1992-04-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、血友病の治療薬として用いられる血液凝固第
■因子（以下■因子と略す）に特異的に結合する新規な
ペプチドに関し、さらにこの新規なペプチドを用いた■
因子の精製方法に関する。

〔従来の技術〕

血液凝固第■因子は、血液凝固を促進し■因子としての
作用を発揮する活性蛋白質（■因子−ｐｒｏｃｏａｇｕ
ｌａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ、以下■：Ｃと略す）と、血
小板の凝集、粘着を促すフォンビルプラント因子（以下
ｖＷＦと略す）との複合体として、血漿中を低濃度（約
２００ｎｇ／ｍｌ’）で循環する。このうち■：Ｃは血
液凝固の内因系経路に関与する血漿蛋白質で、血漿凝固
第Ｘ因子（以下Ｘ因子と略す）の活性化において血漿凝
固第Ｘ因子（以下、■因子とする）の補酵素として作用
する。

体性の遺伝的疾患である血友病Ａは、血漿中にある生理
活性を有する■：Ｃの遺伝的欠損または障害に起因する
ものであることが知られている。

またフォノビルプラント病患者においてはｖ　Ｗ　Ｆの
活性が低下しており、この二つの疾患の治療には現在、
■二〇およびｖＷＦの濃縮製剤の投与による補充療法が
行われている。しかし、■因子は血漿中の濃度が極めて
低く、また非常に不安定であるために、高純度の精製は
困難であり、一般に用いられている製剤は相当量の他の
蛋白が混在してあり、さらに肝炎や後天性免疫不全症候
群（ＡＩＤＳ）などに関与する夾雑ウィルス伝播の危険
性がある。

また最近組換えＤＮＡ技術を用いた■因子の生産も試み
られているが、この場合にも組換え体を宿主等に由来す
る他の夾雑蛋白質から分離精製する必要がある。

従来、■因子の高純度の精製のために■因子のモノクロ
ーナル抗体を用いたイムノアフィニティクロマトグラフ
ィーの使用が開発されている（米国特許Ｎｏ４．３６１
．５０９．　（１９８２）、特開昭６４−１３０９９、
特開平１−１４４９９１等）。これらの方法により、■
因子は高純度に精製される。しかし七ツクローナル抗体
を大量調製することは容易でなし）。またその強い吸着
性のために、強力な脱着剤が必要であり、さらにそのよ
うな脱着剤はヒトに対し毒性となるものが多いため、使
用後に除去する必要性がある。

特異的な結合ペプチドを用いた■因子の精製法に関して
はグリコプロティン１ｂの一部のペプチドを担体に結合
した固定化ペプチドを用いた方法が報告されている（特
開平１−１００１９６）。しかし記載された固定化ペプ
チドと■因子の結合は不完全であり、流出液にかなりの
活性が漏出している。

またその記載からは正確な精製度が明らかでない。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明は、■因子と特異的に結合することができ
る新規ペプチド及びそれを用いて■因子を精製す、る方
法を提供する。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は■因子と■因子との相互作用に着目し、■因
子中の■因子と結合する領域を検索した結果、その領域
が■因子の第２９０位〜第３０４位のアミノ酸配列中に
存在することを見出した。

従って、本発明は、■因子の第２９０位から第３０４位
のアミノ酸配列に対応する次のアミノ酸配列：Ｉｌｅ−
Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａ
ｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌ
ｙ−Ｓｅｒを含んで成り■因子に特異的に結合すること
ができるペプチド；並びに前記アミノ酸配列の内、連続
する４個以上のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有し、
■因子に特異的に結合するペプチドを提供するものであ
る。

本発明はさらに、前記ペプチドが不溶性担体に結合した
固定化ペプチドを提供する。

本発明はまた、前記ペプチドを結合した不溶性担体に■
因子を含む溶液を接触させ、結合した■因子または■−
ｖＷＦ　複合体を溶出することを含んで成る■因子又は
■−ｖＷＦ複合体の精製方法を提供する。

（具体的な説明）本発明の、■因子に特異的に結合するペプチドとしては
まず、■因子の第２９０位から第３０４位までのアミノ
酸に相当する、次のアミノ酸配列（■）＝Ｉｌｅ−Ａｌ
ａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−＾５ｎ
−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈａ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒを有するペプチドが挙げられる。

しかしながら、本発明のペプチドに、上記ペプチド（Ｉ
）のみならず、上記ペプチド（Ｉ）を含んで成るペプチ
ド、すなわち上記ペプチド（Ｉ）のＮ−末端もしくはＣ
−末端又はその両方にアミノ酸又はペプチドが付加され
たペプチドが包含される。このような延長されたペプチ
ドの例としては、ペプチド（Ｉ）と他のペプチド又は蛋
白質との融合蛋白質、さらには担体と結合させるために
、Ｎ−末端や、Ｃ−末端に、アミノ基、カルボキシル基
、チオール基などを有するアミノ酸残基、例えばグルタ
ミン酸、アスパラギン酸、リジン、アルギニン、システ
ィンなどを付加したもの、が挙げられる。

特定の蛋白質と特異的に結合するペプチドは多くの場合
４個以上のアミノ酸から成るこきが知られている（化学
μ、２０２〜２０３頁、１９８８）。従って本発明のペ
プチドはさらに、前記（１）のアミノ酸配列中の連結す
る４個以上のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有するペ
プチドを包含する。

この様なペプチドとしては、例えばＩｌｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ、　Ａｌａ−Ａｓｐ−
Ｌｙｓ−ＧｌｕＡｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ、　Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−ＴｈｒＧｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ
−Ａｓｒ＋、　Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−ＩｌｅＴｈｒ
−＾５ｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ、　Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ
−Ｌｅｕｌｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌ、ｙｓ、　Ｐｈｅ
−１，ｅｕ−Ｌｙｓ−ＰｈｅＬｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｙ、　Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒｌｉｅ−Ａ
ｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ、　Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌ
ｙｓ−’Ｇｌｕ−Ｔｙｒ。

Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ、　Ｌｙｓ−
Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ。

Ｇｌｕイｙｒイｈｒ−Ａｓｎ−４１ｅ、　Ｔｙｒ−Ｔｈ
ｒ−Ａｓｎ−１ｉｅ−Ｐｈｅ。

Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ。

＾５ｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、　　ｌ１ｅ
−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ。

Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、　Ｌｅｕ−
Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ。

Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ。

Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ。

Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−丁ｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ。

Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ｉｌｅ。

Ｇｉｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｊ　Ｉｅ−Ｐｈｅ。

Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ。

Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ。

＾５ｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ。

Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ。

Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ。

Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｈｒ。

Ａｌａ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａ
ｓｎ。

Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉ
　Ｉｅ。

Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ｉｌｅ−Ｐ
ｈｅ。

Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−４１ｅ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ。

Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ。

Ｔｈｒ−Ａｓｎ−ＩＩｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｈｅ。

＾５ｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇ
ｌｙ。

Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇ　１ｙ
−Ｓｅｒ。

Ｔｉｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｕ−Ｔｙｒ−
Ｔｈｒ−Ａｓｎ。

Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−＾
５ｎ−４１ｅ。

Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉ
ｌｅ−Ｐｈｅ。

Ｌｙｓ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−Ｔ　ｈｒ−ＡｓｎＪ　Ｉｅ
−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ。

Ｇｌｕ−丁ｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ：Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ。

Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｈｅ。

Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｈｅ−Ｇ　ｌｙ。

ＡｓｎＪ　Ｉｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇ
　Ｉｙ−Ｓｅｒ。

Ｉｌｅ−Ａｌａ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−
Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ｉｌｅ。

Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−
Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ。

＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉ
ｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ。

Ｌｙｓ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ｉｌｅ−
Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ。

Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−＾５ｎ−１ｉｅ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ。

Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ。

Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−
Ｐｂｅ−Ｇ　１ｙ−Ｓｅｒ。

Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ。

Ａｌａ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−＾
５ｎ−Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ。

Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−
Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ。

Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ｉ　１ｅ−
Ｐｈｅ−Ｌｅｕ”Ｌｙｓ−Ｐｈｅ。

Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ。

Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ。

Ｉｌｅ−Ａ　］　］ａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ＧＩｕ−Ｔｙ
ｒ−Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ｉｌｅ−ＰｈｅＬｅｕ。

Ａ　Ｉａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ
−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−ＬｅｕＬｙｓ。

＾５ｐ−Ｌｙｓ−ＧＩｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−４
１ｅ−Ｐｈｅ−［、ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｂｅしｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−ｆ　Ｉｅ−
Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＰｈｅＧｌｙ。

Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−ムｙｓ−Ｐｈｅ−ＧＩＹ−８ｅｒ。

Ｉｌｅ−Ａ　１ａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇ　１ｕ−Ｔｙｒ
−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ。

Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−丁ｙｒ−Ｔｈｒ−Ａ
ｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−１，ｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ。

＾５ｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−＾５ｎ−Ｉ
ｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ。

Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ。

Ｉｌｅ−Ａ　１．ａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ
−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−
Ｐｈｅ。

Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ＧＩｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａ
ｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−ＬｅｕＬｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌ
　ｙ。

Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉ
ｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＬｙｓＰｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
。

Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｎ−］　］１ｅ−ＰｈｅＬｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｈｅＧ　ｌｙ、及びＡｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−
Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−ＬｅｕＬｙ
ｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ。

が挙げられる。

さらに、上記の種々のペプチドのＮ−末端もしくはＣ−
末端又はその両方にアミノ酸又はペプチドが付加された
ペプチドも本発明のペプチドであり、この様なペプチド
の例として上記ペプチドと他のペプチド又は蛋白質との
融合蛋白質、さらには、担体と結合させるためＮ−末端
やＣ−末端にアミノ基、カルボキシル基、チオール基な
どを有するアミノ酸、例えばグルタミン酸、アスパラギ
ン酸、リジン、アルギニン、システィンなどを付加した
ものが挙げられる。

これらのペプチドは当業者に良く知られた各種方法によ
って合成できるが、自動ペプチド合成機を用いて容易に
合成出来る。また、該ペプチドをコードする遺伝子を合
成し、遺伝子工学的技法によって生産してもよい。

■因子を精製する場合は、これらのペプチドを不溶性担
体に固定化して用いる。不溶性担体としては、例えば、
ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア）、
ＡＨ−セファロース４Ｂ（ファルマシア）、ＣＨ−セフ
ァロース４Ｂ（ファルマシア）、活性化ＣＨ−セファロ
ース４Ｂ（ファルマシア）、アフィゲル（バイオラッド
）、及びリアクチ−ゲル（ピアス）などが挙げられるが
、ペプチドを固定化できるものであればいかなる担体で
も構わない。ペプチドと担体との結合にはペプチド鎖中
の種々の官能基例えば、アミン基、カルボキシル基、チ
オール基などを利用できる。カップリング反応は、それ
ぞれのゲル及びペプチドに適した方法を選択するとよい
。

■因子を含む溶液としては、血漿、血漿由来■因子濃縮
溶液、組換え■因子を発現した細胞融解物あるいは細胞
の培養上清が使用可能である。■因子を固定化ペプチド
に吸着させるには、ｐＨ５から中性付近の低イオン強度
の緩衝液を用いる。■因子の溶出には、ｐＨ濃度勾配ま
たは高イオン緩衝液などを用いる。■：Ｃの活性測定に
は、テストチームＦ■（カビ）等の市販のキットが使用
可能である。

〔発明の効果〕

本発明によれば、血液凝固第■因子又は■−ｖＷＦ複合
体を、全く新しい方法で効率よく他の夾雑物から分離す
ることができる。

〔実施例〕

実施例１．ペプチドの合成ペプチドは自動ペプチド合成機４３１Ａ型機（アプライ
ドバイオシステムズ製造）を用い付属のプロトコールに
従って合成した。樹脂はそれぞれのＣ末１アミノ酸をつ
けたフェニルアセタミドメチル樹脂を用いた。合成後ト
リフルオロ酢酸及びトルフルオロメタスルホン酸を用い
ペプチドを樹脂から切り出し、バイオゲルＰ−２オープ
ンカラム（バイオラッド）、逆相カラム（［］［］Ｓ８
０Ｔｍ　、東ソー）による）ＩＰＬｃで分取した。得ら
れたペプチドはプロテインシークエンサーシステム４７
７Ａ／１２ＯＡ（アプライドバイオシステムズ製造）に
より、アミノ酸配列分析を行い、目的の配列であること
を確認した。第１表に、合成したペプチドのアミノ酸配
列及び対応する配列を有する■因子の領域を示した。

第１表合成したペプチドのアミノ酸配列 ■因子での領域　　　　アミノ酸配列２９０−３０８　　　１ＡＤＫｆ！ＹＴＮＩＦＬＫＦＧ
ＳＧＹＶＳ２９０−３０４　　　１ＡＤＫＢＹＴＮＩＦ
ＬＫＦＧＳ２７１−２８８　　　　　　　　ＡＬＬＦ、
ＬＤＥＰＬＶＬＮＳＹＶＴＰＩ２３７−２６１　　　　
ＮＩＥＥＴＥＨＴＢＱＫＲＮＶＩＲＩＩＰＨＨＮＹＮＡ
１８１−１９８　　　　ＶＶＧＧＥＤＡＫＰＧＱＦＰＷ
ＱＶＶＬ（アミノ酸は一文字表示により示す。）名称ＦＸ−＾Ｆ　Ｘ−Ａ’ 　Ｘ−Ｂ　Ｘ−ＣＸ−Ｄ実施例２．ペプチドの固定化ペプチド２μｍｏｌ　をカップリング緩衝液（０，１Ｍ
　ＮａＨＣＯ３，０，５Ｍ　ＮａＣｌ、　ｐＨ８，０）
中で活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ　　１−と混合し、
室温で一時間撹拌することによりカップリング反応を行
なった。未結合の官能基は、トリス塩酸緩衝液（０，１
Ｍ、　ｐＨ８）中で室温で一時間攪拌することによりブ
ロッキングした。担体に実際に結合したペプチド量は、
固定化ペプチドを６Ｍ塩酸中、１１０℃で２４時間加水
分解を行った後、アミノ酸組成分析装置（イリカ製造）
を用いてアミノ酸組成を求めることにより行った。その
結果、担体に結合したペプチドの量は適用量の約２５か
ら９０％であった。

実施例３．固定化ペプチドによる■因子の吸着市販の濃
縮■因子製剤（ヘモフィル２５０、バクスター製造）を
１０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，３＞に溶解し、
同緩衝液で平衡化したペプチド−活性化ＣＨ−セファロ
ース４Ｂと１対４の割合で混合し、室温で４５分撹拌し
、遠心後上清の■：Ｃの活性をテストチームＦ■（カビ
製造）を用いて測定した。第１図にその結果を示す。元
の■因子濃度を横軸に、上清の■：Ｃの活性の指標とな
る４１５ｎｍでの吸光度を縦軸に示す。ＣＨとはペプチ
ドを固定化していないゲル担体を表す。この結果、ＦＩ
Ｘ−Ａ固定化ＣＨ−セファロース４ＢはＩＯＵ／ｍｊ！
の■因子をほぼ１００％吸着可能であることが判明した
。なお、固定化ＦＩＸ−Ａ’　も、固定化ＦＩＸ−Ａと
同様の挙動を示した。

実施例４．固定化ペプチドを用いた■因子の精製（その
１）以下の操作はすべて室温で行った。ＦＩＸ−Ａ固定化Ｃ
Ｈ−セファロース４Ｂの０．Ｍをカラムに注入し、１０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，３）で平衡化した。５
００／−の市販の濃縮■因子製剤（ヘモフィル２５０、
バクスター製造）を３０４適用し、３０分後同緩衝液で
十分に洗浄した。流出後に■因子の活性は全く認められ
ず、濃縮■因子製剤中の■因子はカラム担体に完全に吸
着されたことが示された。その後１０ｍＭグリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０，０）をカラムに流し
て、■二〇を溶出した。以上のカラムクロマトグラフィ
ーの溶離パターンを第２図に示す。最終的に回収された
■：Ｃの活性量は、元の活性量の約９０％であり、約５
０倍に精製された。

実施例５．固定化ペプチドを用いた■因子の精製（その
２）以下の操作はすべて室温で行った。ＦＩＸ−Ａ固定化Ｃ
Ｈ−セファロース４Ｂの０．９−をカラムに注入し、２
０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）で平衡化し
た。５０Ｕ／−の市販の濃縮■因子製剤（コンコニイト
−ＨＴ、　　ミドリ十字）を３０４適用し、３０分後同
緩衝液で十分に洗浄した。その後１０ｍＭ）リス塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）　１０ｍＩ！を、次いで１０ｍＭグ
リシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０，０）　１０
　’−をカラムに流して、■二〇を溶出した。各段階で
の■：Ｃの比活性及び収量を第２表に示す。

第２表洗浄時の溶出液には■活性は全く検出されず、濃縮■因
子製剤中の■因子はカラム担体に完全に吸着されたこと
が示された。またｐＨ１０で溶出することにより、比活
性は約１０倍上昇した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各ペプチドによる■：Ｃの吸着性を示す。第２図は固定化ペプチドを用いたアフィニティーカラム
クロマトグラフィーによる■因子ノ精製例を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１、下記のアミノ酸配列：Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを含んで成り、血液凝固第VIII因子
と特異的に結合するペプチド。２、下記のアミノ酸配列：Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈ
ｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの内連続する４個以上のアミノ酸か
ら成るアミノ酸配列を有し、血液凝固第VIII因子と特異
的に結合するペプチド。３、請求項１及び２記載のペプチドを不溶性担体に結合
した固定化ペプチド。４、請求項３記載の固定化ペプチドにVIII因子及び／又
はVIII−ｖＷＦ複合体を含む溶液を接触させVIII因子を
吸着させた後、吸着したVIII因子及び／又はVIII−ｖＷ
Ｆ複合体を溶出することによってVIII因子及び／又はV
III−ｖＷＦ複合体の精製方法。