FI106721B - Menetelmä ihmisen standardisoidun, korkean puhtauden omaavan von Willebrand -tekijän konsentraatin valmistamiseksi - Google Patents

Description

106721

Menetelmä ihmisen standardisoidun, korkean puhtauden omaavan von Willebrand -tekijän konsentraatin valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää erikoisesti terapeutti-5 seen tarkoitukseen tarkoitetun, erittäin korkean puhtauden, erittäin korkean spesifisen aktiivisuuden sisältävän ihmisen standardoidun von Willebrand -tekijän konsentraatin, joka sisältää suuren määrän korkean molekyylipainon sisältäviä multimeerejä, teollisuusmittakaavaiseksi valio mistamiseksi.

Von Willebrand -tekijä (vWF) on suurin tunnettu plasmassa kiertävä molekyyli. Se on suurten disulfidi-si-doksilla toisissaan kiinni olevien multimeerien ryhmä, jonka emäksisen alayksikön molekyylipaino on noin 260 ki-15 lodaltonia (kDa). Pienin vWF:n muoto plasmassa on noin 440 - 500 kDa:n kokoinen dimeeri ja suurimmat muodot ovat dimeerin multimeerejä, joiden molekyylipainot saavuttavat jopa 20 miljoonan daltonin koon. Yhteen liittyneiden alayksiköiden kokoaminen saattaa olla soluspesifistä niin, 20 että vWF syntetisoidaan ja polymerisoidaan megakaryosyy- teissä ja endoteelisoluissa.

. , Tällä tekijällä on keskeinen rooli verenvuodon ty- • · ’· '· rehdyttämisessä kahden eri toiminnan välityksellä: se kul- • « · V ’ jettaa ja stabiloi tekijä VIII :aa verenkierrossa ja kiin- « « « *.· : 25 nittävänä proteiinina se sallii verihiutaleitten leviämi- * · · sen, kiinnittymisen ja aggregaation verisuonen endoteelin alle näin ottaen osaa vahingoittuneiden verisuonien nope-:1·1; aan paranemiseen.

Täydellinen vWF:n puutos tai tämän tekijän raken-30 nevika muodostaa von Willebrand -taudin, jonka alkuoireita • · - ... ovat verenvuodot, erikoisesti ihon ja limakalvon membraa- Ύ neilla. Tämän taudin kliiniset muodot ovat hyvin hetero- geenisiä ja aiheuttavat suuria ongelmia leikkaustapahtu- massa. Von Willebrand -taudin hoitaminen on elintärkeätä .···, 35 primaaristen verenvuodon tyrehdyttämis- (verenvuotoaika) • · · • · • · • · · 2 106721 ja veren hyytyrnisvikojen (aktivoitu kefaliiniaika ja tekijän VIII aktiivisuus) korjaamiseksi.

Tautia hoidetaan substituutioterapialla vWF:n suhteen rikkailla ihmisen plasmajohdannaisilla (esimerkiksi 5 kylmäsaostettu plasmafraktio tai tekijän VIII konsentraa-tit, jotka sisältävät riittävän määrän vWF:ia). Näitä tuotteita ei kuitenkaan ole standardoitu von Willebrand -taudin hoitoa varten. Lisäksi, veriplasman huonosti puhdistetut fraktiot, erikoisesti kylmäsaoste, eivät ole va-10 paita viruskontaminaatioriskistä, koska niitä ei usein altisteta millekään tehokkaalle viruksia inaktivoivalle vaiheelle. Lisäksi niissä on ylimäärä kontaminoivia proteiineja, joita potilas ei tarvitse ja jotka voivat aiheuttaa immuunireaktioita useiden injektioiden jälkeen.

15 Puhdistettu tekijä VIII toisaalta voidaan altistaa tehokkaalle viruksia inaktivoivalle vaiheelle, mutta tämä menetelmä on optimoitu hemofilia A:ta sairastaville potilaille eikä vWF:n puutoksen omaaville potilaille. Tosiasiassa tekijä VIII:n tuottamiseksi käytettävät äskettäin 20 kehitetyt ja paljon tehokkaammat menetelmät, kuten immu-noaffiniteetti- tai ioninvaihtokromatografia, tuottavat . , konsentraatteja, jotka eivät enää sisällä riittävästi « · ’· ’·' vWF: ia ollakseen tehokkaita von Willebrand -taudin hoita- • « « • · · V ’ misessa.

« « « ·.’ · 25 Tämän von Willebrand -taudin tehokkaan hoitotarpeen « t « tyydyttämiseksi patentinhakijat ovat kehittäneet uuden J*.: teollisen menetelmän vWF:n puhdistamiseksi niin, että sa- :*·*· maila yhä saadaan paras mahdollinen hyöty plasman eri pro- teiinien eristämisestä. Erikoisesti, se sallii yhdessä 30 vaiheessa tekijä VIII :n konsentraatin valmistuksen (sen • · m·"' menetelmän mukaisesti, joka on kuvattu Eurooppalaisessa '1' patenttihakemuksessa 0 359 593) ja erillisen vWF:n frak- '·*'· tion talteen ottamisen samasta kylmäsaostetusta erästä näin sallien ihmisen plasman optimaalisen hyväksikäytön. 35 Näin saatu vWF:n fraktio puhdistetaan kahdella lisäkroma- • · · • · • · · 106721 3 tografiavaiheella, jotka muodostavat erittäin korkean puhtauden sisältävän vWF-konsentraatin.

vWF-molekyylin monimutkaisuus tekee sen puhdistamisen erittäin vaikeaksi. Pienimittakaavaiset menetelmät, 5 se tarkoittaa 5 - 2000 ml määrät analyyttiseen tutkimukseen, on jo kuvattu (Thorell et ai., Thromb. Res. 1984, 35: 431 - 450), mutta näitä menetelmiä ei ole ollut mahdollista soveltaa vWF:n valmistamiseksi teollisuusmitta-kaavassa. Lisäksi, suunnitelmaa kylmäsaosteen parhaaksi 10 mahdolliseksi käyttämiseksi tuottamalla tekijä VIII:n lisäksi vWF:ia, ei harkittu.

vWF on puhdistettu perustuen erilaiseen liukoisuuteen sulfonoituihin yhdisteisiin glysiinin läsnäollessa (Berntorp et ai., Vox Sang. 1989, 56: 212), sulfonoitujen 15 yhdisteiden läsnäollessa (Winkelman et ai., Vox Sang. 1989, 57: 97) ja käyttäen erilaisia kromatografiaerotus- menetelmiä, kuten molekyylin kokoon perustuvaa erotusta (Perret et ai., Haemostasis 1984, 14: 289) ja ioninvaihtoa (Austen et ai., Thromb. Haemostas. 1982, 48: 295). Nämä 20 menetelmät antavat kuitenkin joko alhaiset vWF:n saannot tai niillä on alhainen geelikapasiteetti tai ne eivät tee . , tekijä VIII:n ja vWF:n samanaikaista erottamista mahdol- • t

* · I

*,.* liseksi, jotka seikat tekevät nämä menetelmät vähemmän « « « *·* ’ mukaviksi teollisuussovellutukseen.

« t · ' 25 Lisäksi, Berntorp et ai. (Vox Sang. 198 9, 56: 212)

I I I

saavat alhaisen puhtauden sisältävää vWF:ia, 45 yksikköä • «

Ag/mg proteiinia (sivu 213) , kun taas patentinhakijat saa-vat 205 yksikköä Ag/mg proteiinia. Winkelman et ai. (Vox Sang. 1989, 57: 97) saavat samoin 10 yksikköä Ag/mg prote-30 iinia (sivu 101) .

• · • .···, Perret et ai. (Haemostasis 1984, 14: 289) suorit- ’·* tavat def ibrinaatiovaiheen (f ibriinimolekyyleinä olevan ' * fibrinogeenin poistamiseksi) käyttäen kalsiumia kuin myös • « · käärmeen myrkystä peräisin olevia entsyymejä. Tämä tekee ..*·. 35 valmisteesta selvästikin sopimattoman terapeuttisiin tar- • · ·

Ml 4 106721 koituksiin. Lisäksi geelisuodatussysteemit, kuten heidän käyttämänsä, tuskin sopivat teollisuusmittakaavaan, koska ne sallivat virtausnopeuden, joka on ainoastaan 10 cm/-tunti tai vähemmän ja niillä on korkea riski tukkeutua 5 erikoisesti fibrinogeenin ja fibronektiinin läsnäollessa. Myöskin puhdistusasteen tiedetään olevan tavallisesti alhainen johtuen proteiinien huonosta erottumisesta tässä kromatografiasysteemissä.

Austen et ai. (Thromb. Haemostas. 1982, 48: 46) 10 saavat myös alhaisen puhtauden sisältävän konsentraatin (8 yksikköä Ag/mg proteiinia) ja suhteellisen alhaisen saannon johtuen todennäköisesti heidän drastisista kromatograf iaolosuhteistaan (pH 5,5).

Harrisson et ai. (Thromb. Res. 1988, 50: 295) käyt-15 tävät dekstraanisulfaattisepharoosia kromatografiamatrik-sina; tällä materiaalilla on alhainen retentiokapasiteetti vWF:lle. Tämän tuloksena he saavat alhaisen spesifisen aktiivisuuden sisältävän vWF-valmisteen, 2-4 yksikköä/mg proteiinia (sivu 301).

20 Lopuksi, useimmat näistä tuotteista sisältävät mel ko suuren määrän vWF:n denaturoitunutta tai inaktiivista . . muotoa, joka havaitaan sillä, että ristosetiinikotekijän • « *;/ aktiivisuus (RCo)/antigeeni -suhde vaihtelee välillä 0,08 - • « · ’·' 0,8 (Lawrie et ai., Br. J. Haematol. 1989, 73: 100). Tämä

III

\* ' 25 tekee ne vähemmän tehokkaiksi terapeuttiseen käyttöön von

• I I

Willebrand -taudissa. Patentinhakijoiden menetelmä sallii • · päinvastaisesti sellaisen vWF:n talteen saamisen, jonka RCo/antigeeni -suhde on korkeampi kuin yksikkö, joka on verrattavissa normaalin yhdistetyn plasman luonnollisen 30 vWF:n vastaavaan.

• ·

Esillä oleva keksintö koskee teollista menetelmää ’!* terapeuttiseen käyttöön tarkoitetun vWF-konsentraatin vai- **“ mistamiseksi sivutuotteena korkean puhtauden sisältävän tekijä VIII :n tuotantomenetelmässä, joka menetelmä mahdol- * 35 listaa standardoitujen erien, joille on ominaista suurimo- • « c 1 « • «

f I I

, 106721 b lekyylipainoisten multimeerien suuri määrä, tuottamisen erittäin suurista plasmatilavuuksista (4000 litraa tai suuremmat), ja joka menetelmä sallii kylmäsaosteen optimaalisen käytön.

5 Erikoisemmin, esillä oleva keksintö koskee menetel mää vWF-konsentraatin valmistamiseksi, joka menetelmä sisältää kolmen peräkkäisen kromatografiavaiheen yhdistelmän, joka sallii korkean molekyylipainon sisältävien multimeerien rikastamisen, jotka multimeerit ottavat osaa 10 vWF:n biologiseen aktiivisuuteen. Lähtömateriaali on ihmisen plasman kylmäsaostettu fraktio, joka on altistettu tavanomaiselle esipuhdistusvaiheelle, joka sisältää adsorption alumiinihydroksidiin. Sitten tälle materiaalille tehdään virusinaktivaatio esimerkiksi käyttäen liuotin-15 detergentti -käsittelyä ennen sen puhdistusta.

Esillä olevan keksinnön mukainen puhdistusmenetelmä sisältää kolmen peräkkäisen kromatograf iavaiheen yhdistelmän tekijä VIII:n tuotantomenetelmän sivutuotefraktiolle niin, että kaksi ensimmäistä sisältävät ioninvaihtokroma-20 tografian ja kolmas affiniteettikromatografiän.

Kaksi ioninvaihtokromatografiavaihetta suoritetaan . , samalla vinyylipolymeeriresiinillä, johon on kiinnitetty f « dietyyliaminoetyyliryhmiä (DEAE) , erikoisemmin DEAE-Frac- i < c V ‘ togelR TSK 650 -pylväissä (Merck), jotka tasapainotetaan t < i ' 25 puskuriliuoksella, joka sisältää 0,01 M trinatriumsitraat- ({f :...ί tia, 0,11 M natriumkloridia, 0,001 M kalsiumkloridia, 0,12 it*.[ M glysiiniä ja 0,016 M lysiiniä, pH 7.

DEAE-Fractogel TSKR 650 on synteettinen hydrofiili-nen geelialusta. Kantaja on oligoetyleeniglykolin, glysi-3 0 diinimetakrylaatin ja pentaerytritolidimetakrylaatin kopo- • · - ..... lymeeri, johon kiinnitetään dietyyliaminoetyyliryhmät, se *!* tarkoittaa -0-CH2-CH2N+(C2HS) 2HC1 -ryhmiä, joka muodostaa

- ‘‘“ί heikosti emäksisen anioninvaihtajan. DEAE-FractogelR TSK

< < < •'<(<! 650 on saatavissa kahtena partikkelikokomuotona (kun kos-

35 tutettu vedellä): Type S (0,025 - 0,050 mm) ja Type M

f * <r

I I

I 4 <44 s 106721 6 (0,045 - 0,090 mm). Molemmat tyypit ovat käyttökelpoisia esillä olevan keksinnön suorittamiseksi.

Kylmäsaostettu plasmatraktio, joka on esipuhdistet-tu ja jolle on suoritettu virusinaktivaatiokäsittely ta-5 vanomaisten menetelmien mukaisesti, laitetaan ensimmäiseen kromatografiapylvääseen, johon suuri osa vWF:ia jää. vWF eluoidaan sitten kohottamalla puskuriliuoksen natriumklo-ridikonsentraatio 0,14 - 0,15 M:ksi.

Näin eluoitu fraktio, joka on rikastunut vWF:n suh-10 teen, laitetaan toiseen kromatografiapylvääseen samoissa olosuhteissa kuin ensimmäinen. Koska monet proteiinit (erikoisesti tekijä VIII ja fibronektiini), jotka kilpailevat adsorptiokohdista, on jo poistettu tästä fraktiosta ensimmäisessä kromatografiavaiheessa, toisen pylvään kapa-15 siteetti vWF:n adsorboimiseksi on edullisesti suurempi. Kun suodos on poistettu ja pylväs on huuhdeltu tasapaino-tuspuskuriliuoksella, adsorboitunut vWF eluoidaan kohottamalla puskuriliuoksen natriumkloridikonsentraatio 0,15 -0,17 M:ksi . Johtuen DEAE-FractogelR -resiinin erinomaisesta 20 kapasiteetista ja tehokkuudesta vWF:ia kohtaan, vWF voidaan eluoida pylväästä erittäin vahvana (> 150 yksikköä •4 . RCo/ml). Näin ollen ultrasuodatuksen mekaaninen rasitus, • · · joka suodatus tarvittaisiin tuotteen konsentroimiseksi, • « ( * 1 voidaan välttää.

> · · * Ί « ’·1 ' 25 Näin eluoitu fraktio altistetaan af f initeettikro- • · « « · matografiälle gelatiinista peräisin olevassa geelissä sa- • · *.2: massa tasapainotuspuskuriliuoksessa näin välttäen kaikki «·· l suolakoostumuksen modifioimiseen tarvittavat dialyysi- tai ultrasuodatusvaiheet; tämä pylväs on elintärkeä poistamaan ····· 30 vWF:ia edelleen kontaminoivat fibronektiinimolekyylijään- .2·. teet. Gelatiinista peräisin olevan geelin valinta ei ole ··1 * t kriittistä, kuitenkin Gelatin-Sepharose, Gelatin-Ultrogel ,

Gelatin-SpherodexR ja Gelatin-FractogelR ovat kaikki sopi- <i« • · ’...· via tähän tarkoitukseen. Gelatin-Sepharose voi olla paras • « 1 • « « «

I I

• « • t 2 m 106721 valinta, koska se sitoo 5 - 10 mg fibronektiiniä/ml esillä olevassa menetelmässä käytetyissä olosuhteissa.

Käytetyissä olosuhteissa erittäin puhdistettu vWF ei sitoudu geeliin ja näin eluoituu suodatteessa; koska 5 gelatiiniaffiniteettivaihe ei aiheuta vWF-fraktion suurta laimentumista, tuote voidaan suoraan jakaa osiin ilman konsentrointivaihetta, kuten esimerkiksi ultrasuodatus. Proteolyyttisten entsyymien poissaolo lopputuotteesta tekee sen erittäin stabiiliksi steriilisuodatus- ja jäädy-10 tyskuivausvaiheissa ilman, että tarvitsee lisätä stabiloivia aineita.

Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä saadulla von Willebrand -tekijän konsentraatilla on poikkeuksellisen korkea puhdistusaste, joka on > 10 000 -ker-15 täinen verrattuna alkuperäiseen plasmaan, ja sen spesifinen aktiivisuus on 345 yksikköä CBA/mg proteiinia (kollageenin sitoutumisaktiivisuuden mittausyksiköt) ja > 100 yksikköä RCo/mg proteiinia (ristosetiinikotekijä-aktiivi-suuden yksiköt). Kunkin kromatografiavaiheen vaikutukset 20 vWF:n puhdistukseen on esitetty kuviossa 1.

Mikä on melko tärkeätä, tuotteen laadun paranemista peräkkäisten puhdistusvaiheiden aikana tarkkailtiin korkean molekyylipainon sisältävien multimeerien (vWF.-n ne • · •t\: molekyylimuodot, joilla on korkea biologinen aktiivisuus) :1!1: 25 määrän suhteen, jotka tunnistettiin elektroforeesianalyy- « sillä.

• · · t .···. Mielenkiintoista on, että tämä analyysi paljastaa • · • · « j progressiivisen rikastumisen h 4 -multimeerien määrässä • · ♦ I..1 (kuvio 2) , jotka edustavat 79 % vWF-polymeereistä, vaikka • ♦ · * 30 kylmäsaostus poistaa niistä puolet. Odottamattomasti DEAE-

Fractogel TSK 650 -kromatografia on se vaihe, joka suosii * 1 tätä selektiivistä hyvin suurten multimeerien retentiota ·»· - 1...· ja poistaa suodatteessa pienen koon, epänormaalin raken- .;..j teen (jotka ovat läpikäyneet osittaisen proteolyysin) ja .···, 35 alhaisen aktiivisuuden sisältävät muodot.

• · • · · * # · · « « * « 106721 8

Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä saatu standardisoitu vWF-konsentraatti, jolla on korkea puhdistusaste, korkea spesifinen aktiivisuus ja korkea suuren molekyylipainon sisältävien multimeerien määrä, 5 sopii näin ollen erikoisen hyvin terapeuttiseen käyttöön von Willebrand -taudin eri muodoissa, kuten preliminääri-set kliiniset tutkimukset vahvistavat.

Preliminääriset kliiniset testit ovat osoittaneet, että tämä konsentraatti johti tehokkaaseen verenvuotoajan 10 lyhenemiseen verenvuotojen aikana.

In vitro testit ovat osoittaneet, että sen biokemialliset ja fysiologiset ominaisuudet ovat samanlaiset kuin luonnollisen molekyylin, erikoisesti sen kyky kiinnittää verihiutaleita perfuusiolaitteessa ja sen kyky si-15 toa in vivo endogeenista tekijä VIII:aa.

Johtuen sen korkeasta puhdistusasteesta, esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä saatua vWF:ia voidaan harkita myös erilaisiin laboratoriosovellutuksiin (hienorakenneanalyysi, toimintatutkimukset, diagnoosit, 20 jne.) ja spesifisten vasta-aineiden tuottamiseen.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettavaa konsentraattia voidaan myös käyttää stabiloijana tekijä Villin tuotannon aikana yhdistelmä-DNA-menetelmillä trans- • · ·/.: formoiduissa soluissa kuin myös näin tuotetun tekijä VII- 25 I:n puhdistuksen aikana.

«

Seuraava esimerkki kuvaa esillä olevan keksinnön • · · .···. yhden suoritustavan ilman, että kuitenkaan rajoitetaan • · • · · • · keksinnön piiriä.

• · · !..* Esimerkki • · · • · * * 3 0 Lähtömateriaali

Kylmäsaoste valmistetaan tuoreesta plasmasta, joka * * on kerätty hyytymistä estävän natriumsitraatti- (4 %) tai • · · CPD-liuoksen (sitraatti, fosfaatti, dekstroosi) läsnäol- ....j lessa ja jäädytetty korkeintaan 6 tunnin ajan ottamisen 35 jälkeen. Plasma syväjäädytetään -60 °C:ssa, sitten säily- • « • < i «

I I I

< ( t « « « « < < «

« I

< I

« < < 9 106721 tetään -35 °C:ssa. Plasmaerät sisältävät 1800 - 2000 litraa, jotka yhdistetään 4000 litran eriksi menetelmän kutakin sovellutusta varten. Sulatusta varten plasma sijoitetaan lämpötilaltaan säädeltävään kammioon 12 tunniksi 5 niin, että varmistetaan hidas, säännöllinen lämpeneminen -7 °C:seen, sitten sulatetaan termostaattisesti säädeltävässä kotelossa 0-2 °C:ssa sekoittaen koko ajan. Kylmä-saoste (jota on noin 9 g/1 plasmaa) otetaan talteen sent-rifugoimalla kylmässä.

10 Sentrifugoinnin jälkeen talteen otettu kylmäsaoste liuotetaan uudelleen ja adsorboidaan alumiinihydroksidille niin, että poistetaan joitain kontaminantteja, se tarkoittaa protrombiinikompleksin komponentteja (erikoisesti tekijä VII) ja tekijä XI:tä. Sitten supernatantti jäähdyte-15 tään 15 °C:seen (joka poistaa osittain fibrinogeenin ja fibronektiinin).

Tämä käsittely sallii tekijä VIII/vWF -seoksen talteenoton 80 - 86 %:isesti kylmäsaosteesta; tekijä VIII:n spesifinen aktiivisuus on 0,7 kansainvälistä yksikköä/mg 20 ja vWF:n spesifinen aktiivisuus on 0,6 yksikköä RCo/mg (ristosetiinikotekijäaktiivisuus) ja 1,2 yksikköä CBA/mg (kollageenin sitoutumisaktiivisuus).

Virusinaktivaatiokäsittely • «

Liuos, joka sisältää tekijä VIII/vWF -seoksen, al- 25 tistetaan liuotin-detergentti -käsittelylle, joka tiede- tään tehokkaaksi lipidivaippaisten virusten tuhoamisessa ♦ .***. (Horowitz et ai., Transfusion, 1985, 25: 516} ja joka si- ··» .·. ; sältää inkubaation 8 tunnin ajan 25 °C.-ssa, kun läsnä on • ♦· .•j/ 0,3 % tri-n-butyylifosfaattia (TnBP) ja 1 % Tween-80:aa.

♦ * · 30 Tämän käsittelyn jälkeen saadaan talteen 95 % te kijä VIII:n ja vWF:n edellä olevassa vaiheessa mitatusta aktiivisuudesta. Elektroforeesia voidaan käyttää sen var- »·· - mistamiseksi, että vWF on yhä multimeerisessa muodossa.

c < ( (

« I

« « 4 « 4 I |

< I

« « · 106721 10

Kromatografiaerotusmenetelmä vWF:n puhdistus suoritetaan tekijä VIII:n puhdistusmenetelmästä, jonka patentinhakijat ovat kuvanneet Eurooppalaisessa patenttihekmuksessa, jonka numero on 5 0 359 593.

Ensimmäinen kromatografia suoritetaan DEAE-Fracto-gelR TSK 650 -pylväässä (Type S tai M)(Merck). Tasapaino-tuspuskuriliuos sisältää trinatriumsitraattia (0,01 M), kalsiumkloridia (0,001 M), glysiiniä (0,12 M), L-lysiiniä 10 (0,016 M) ja 0,11 M natriumkloridia. vWF, tekijä VIII ja fibronektiini jäävät pylvääseen; kontaminoivat proteiinit (pääasiassa fibrinogeenia ja joitain IgG:tä), jotka ovat joko löysästi kiinnittyneet tai eivät ole ollenkaan kiinnittyneet pylvääseen ja viruksia sterilisoivat aineet 15 poistetaan useilla peräkkäisillä pesuilla samalla puskuri- liuoksella .

Pylvästä käytetään lineaarisella virtausnopeudella, joka on 100 cm/tunti. Näissä työskentelyolosuhteissa käytetyllä pylväällä on vWF:n suhteen retentiokapasiteetti, 20 joka on noin 75 % lisätystä määrästä (mitattuna antigeeninä, Ag) niin, että loppu menee hukkaan suodatteessa. Tämä sitoutumiskapasiteetti vastaa 45 yksikköä vWF Ag/ml geeliä.

vWF desorboidaan pylväästä kohottamalla puskuriliu- ti ; 25 oksen NaCl-konsentraatio 0,15 M:ksi. Kerätty vWF-fraktio sisältää 3 0 - 35 % alkuperäisestä vWF:stä samalla, kun ;***; 40 % siitä jää yhä adsorboituneeksi tekijä VIII-.n kanssa, • ti : joka eluoituu yhtä aikaa, kun kohotetaan toisen kerran • · puskuriliuoksen NaCl-konsentraatio 0,25 M:ksi, ja sitten • · · 30 puhdistetaan yhdessä.

. Tästä ensimmäisestä pylväästä eluoitu vWF:ia sisäl- \ ‘ tävä fraktio injektoidaan uudestaan toiseen samanlaiseen 9 9 pylvääseen sen jälkeen, kun on hiukan laimennettu tasapai-notuspuskurilla niin, että vWF-fraktion ionivahvuus saa- < t < e C I c < c < c I « « • « C I « 106721 11 daan säädettyä niin, että se on ekvivalentti 0,11 M nat-riumkloridille.

Koska kontaminantit ja tekijä VIII, jotka kilpailivat vWF:n kanssa ensimmäisen pylvään adsorbtiokohdista, 5 lähes kokonaan poistettiin ensimmäisen kromatografiavai-heen aikana, toisen pylvään sitomiskapasiteetti on paljon suurempi: 320 yksikköä vWF Ag/ml geeliä.

vWF desorboidaan kohottamalla puskuriliuoksen NaCl-konsentraatio 0,17 M:ksi.

10 Tämä toinen kromatografia sallii konsentraatioas- teen, joka on 8 - 10 -kertainen edelliseen verrattuna, joka poistaa tarpeen suorittaa mitään lisäkonsentraatio-vaiheita esimerkiksi ultrasuodatuksella. Standardisoituja menetelmiä käyttäen eluaatin havaitaan sisältävän seuraa-15 vat vWF-määrät tai aktiivisuudet:

Antigeeni (Ag) 88 ± 9 ky/ml

Ristosetiinikotekijä (RCo) 97 + 19 ky/ml

Kollageenin sitoutumisaktiivisuus (CBA) 149 + 13 ky/ml Korkean molekyylipainon sisältäviä 20 multimeerejä (>: 4 multimeeria) 79 % CBA-yksiköt (kollageenin sitoutumisaktiivisuus) mitataan ELISA-testillä, kuten ovat kuvanneet Brown ja Bosak (Thromb. Res. 1986, 43: 303). Standardia plasmaa, i « joka oli kalibroitu 2. Brittiläistä Standardia (86/717) t t t •‘J 25 vastaan, käytettiin referenssinä, kun ilmoitettiin arvot :1Γ: kansainvälisinä yksiköinä.

CBA/Ag -suhde 1,69 osoittaa, että vWF:n aktiivisuus • · · : on hyvin säilynyt. Tämä on johdonmukaista ottaen huomioon • · korkean molekyylipainon sisältävien multimeerien korkean • · · 30 prosenttimäärän (79 %) ja joka on hyvin verrannollinen plasmasta peräisin olevan luonnollisen vWF:n vastaavaan (70 %) .

• · · ' ' • « «««' Tämän vWF-eluaatin elektroforeettinen analyysi pal- ·;'· jastaa heikon fibronektiinin ja inter-alfa-trypsiini-inhi- 1 t < « 1 * 1 * < 1 iti • « a I f « · * 1 106721 biittorin, joka on seriiniproteaasi-inhibiittori, aiheuttaman kontaminaation.

Sitten toinen vWF-eluaatti altistetaan kolmannelle puhdistusvaiheelle gelatiini-Sepharose CL4B -pylväässä 5 (Pharmacia), joka on tasapainotettu edellä olevan pylvään eluutiopuskuriliuoksella, fibronektiinin poistamiseksi.

Tämän af f initeettikromatograf iageelin retentiokapa-siteetti fibronektiinille on > 5 mg/ml, joka mahdollistaa tämän kontaminantin määrän alentamisen vWF-fraktiossa talo soille, joita ei havaita (< 4 mg/1).

Esillä olevan keksinnön mukaisesti puhdistettu vWF löydetään tämän viimeisen vaiheen suodatteesta ja se voidaan suoraan jakaa osiin ja kylmäkuivata.

Lopputuotteen elektroforeettisessa analyysissä ei 15 voida enää havaita mitään kontaminantteja. vWF-määrä on 205 yksikköä Ag/ml proteiinia ja sen spesifinen aktiivisuus on 345 yksikköä CBA/mg proteiinia ja 186 - 220 yksikköä RCo/mg proteiinia.

Kokonaispuhdistusaste verrattuna alkuperäiseen 20 plasmaan on > 10 000 -kertainen.

Elektroforeettinen analyysi (SDS-agaroosi ja rintamien skandeeraus) osoittaa, että tällä puhdistusmenetelmällä saatu vWF koostuu 65 - 80 % risesti korkean molekyy- < · ·,'·· lipainon sisältävistä multimeereistä, se tarkoittaa osuut- .'Γ: 25 ta, joka on verrattavissa alkuperäisen plasman vastaavaan, :*·*: joka oli 70 %.

• ·***. Konsentraatin stabiilisuutta tutkittiin nestemuo- • · ··· .·. : dossa huoneenlämpötilassa 24 tunnin ajan: mitään merkkiä • · · proteolyyttisestä aktiivisuudesta tai mitään muutosta spe- ♦ · · 30 sifisessä aktiivisuudessa ei voitu havaita.

. Verisuonitukoksia aiheuttavan aktiivisuuden pois saolo konsentraatissa vahvistettiin käyttäen tavanomaisia • » testejä, kuten ei-aktivoitua tromboplastiiniaikaa (NAPTT). Trombiinia, PKA-.ta ja kallikreiiniä ei havaittu.

e t < < « ( ( < ( i < ( « ( « « t « « 106721 13

Sen vuoksi lopulliseen vWF-konsentraattiin ei tarvitse lisätä mitään stabiloivaa ainetta.

Mahdollisuus suunnitella puhdistusmenetelmä, joka on erikoisesti tarkoitettu vWF:n talteen ottamiseksi te-5 kijä VIII:n tuotantomenetelmän sivutuotteena, tekee näin ollen ensimmäisen kerran mahdolliseksi tuottaa korkean puhdistusasteen sisältävä erittäin tehokas terapeuttinen konsentraatti, joka on standardoitu von Willebrand -taudin hoitoon.

• « i « • « « • · « « «

> I I <14 I

• · » • · · » · « I»· • · • ·

«M

• · • · · • · Λ • · * · · • · · • · · • · • · · • · * < I « ( f t f I |

I I

< < < 4 «

4 4 I

i

< < I

* I

Claims (1)

106721 Patenttivaatimus Menetelmä ihmisen standardisoidun, korkean puhtauden omaavan von Willebrand -tekijän konsentraatin, joka on 5 rikastunut korkean molekyylipainon omaavien multimeerien suhteen, valmistamiseksi plasman kylmäsaostetusta fraktiosta, tunnettu siitä, että a) lähtömateriaali, joka on plasman kylmäsaostettu fraktio, esipuhdistetaan alumiinihydroksidissa, 10 b) esipuhdistettu, kylmäsaostettu plasmafraktio laitetaan ensimmäiseen ioninvaihtokromatografiapylvääseen, joka on täytetty DEAE-Fractogel® TSK 650:llä ja tasapainotettu puskuriliuoksella, joka sisältää 0,01 M trinatrium-sitraattia, 0,11 M natriumkloridia, 0,001 M kalsiumklori- 15 dia, 0,12 M glysiiniä ja 0,016 M L-lysiiniä, ja ensimmäinen von Willebrand -tekijää sisältävä fraktio eluoidaan kohottamalla puskurin natriumkloridikonsentraatio 0,14 - 0,15 M:ksi; c) ensimmäisen kromatografian von Willebrand 20 tekijää sisältävä eluaatti laitetaan toiseen ioninvaihtokromatograf iapylvääseen, joka on identtinen ensimmäisen kanssa, ja von Willebrand -tekijä eluoidaan kohottamalla puskurin natriumkloridikonsentraatio 0,15 - 0,17 M:ksi; « « ·,**· d) toisen kromatografian eluaatti laitetaan affini- :T: 25 teettikromatografiapylvääseen, joka on täytetty gelatiini- ;1j*; Sepharose® :11a ja tasapainotettu samalla eluutiopuskurilla • .***. kuin edellisissä kromatografiavaiheissa, mikä johtaa jäi- • · · .·. : jellä olevan fibronektiinin selektiiviseen adsorptioon pyi- • · · vääseen ja von Willebrand -tekijän läpivuotoon suodokseen, * 1 1 ' 30 e) gelatiini-Sepharose -pylvään suodoksessa oleva von Willebrand -tekijä kerätään, jaetaan osiin ja kylmäkui-vataan. • « < 4 « I I I • « · • · · • « • 1 »»1 ♦ · · ♦ · · · · ♦ » • · »14 106721 Förfarande för framställning av ett humant standardiserat von Willebrand-faktorskoncentrat med hög 5 renhet, vilket koncentrat är anrikat med avseende pä multimerer med hög molekylvikt, frän en kallutfälld fraktion av plasma, kännetecknat av att a) utgängsmaterialet, som är en kallutfälld fraktion av plasma, förrenas i aluminiumhydroxid, 10 b) den förrenade, kallutfällda plasmafraktionen placeras i en första jonbytarkromatografikolonn, som är fylld med DEAE-Fractogel® TSK 650 ooh balanserad med en buffertlösning innehällande 0,01 M trinatriumcitrat, 0,11 M natriumklorid, 0,001 M kalciumklorid, 0,12 M glycin 15 och 0,016 M L-lysin, och den första fraktionen som innehäller von Willebrand-faktorn elueras genom höjning av buffertens natriumkloridkoncentration tili 0,14 - 0,15 M; c) eluatet som innehäller von Willebrand-faktorn frän den första kromatografin placeras i en andra 20 jonbytarkromatografikolonn, som är identisk med den första, och von Willebrand-faktorn elueras genom höjning av buffertens natriumkloridkoncentration tili 0,15 - 0,17 M; • < d) eluatet frän den andra kromatografin placeras i l : l 25 en affinitetskromatografikolonn, som är fylld med gelatin- ;1·1; Sepharose® och balanserad med samma elueringsbuffert som i • .1·1. föregäende kromatografisteg, vilket resulterar i selektiv • · « .·, : adsorbering av äterstäende fibronektin tili kolonnen och • ·« > von Willebrand-faktorns genomströmning tili filtratet; • · · -’ 30 e) von Willebrand-faktorn i gelatin-Sepharose - kolonnens filtrat uppsamlas, fördelas och kalltorkas. • · • · · « « · • · · ·