JPS6078595A - ２７−デスアミドセクレチンの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、２７−デスアミドセクレチン（以下ＤＡＳと
いう）の精製に関する。

さらに具体的には、本発明は、低蛋白質との融合蛋白質
として発現されたＤＡＳの抽出・精製に関するものであ
る。

先行技術 セクレチンは、１９０２年ベイリスとスターリングによ
り発見された２７個のアミノ酸より成る分子１４ｉ３０
５５の塩基性ポリペプチドホルモンである（　Ｊ　、　
Ｐｈｙｓｉｏｌ、玄、３２５　（１９０２）　）。

セクレチンは、その有する生理活性として、＃外分泌促
進作用、胃酸分泌抑制作用、肝胆汁分泌促進作用等が知
られており（化学の領域、盃。

Ｎｏ５．４０３〜４１２（１９８３））、現在これらの
活性に基づいて十二指腸潰瘍治療架、Ｗｔ外分泌機能診
断薬およびＺｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ症候゛
群の診症候管群して用いられている（上記「化学の領域
」参照）。

ところで、これら臨床に応用されているセクレチンは、
ブタ小腸より抽出、精製されたものであるが、この方法
は極めて収率が悪くて１万頭のブタ小腸より３５ｍｇ程
度の標品しか得ることができず、その応用範囲が著しく
制限されていた。

一方１本発明者らは、最近、遺伝子工学的手法を用い天
然のセクレチンのカルゼキゾ末端バリン残基が了ミド化
されていないこと以外は天然ブタ・セクレチ／と全く同
じ構造を持つ２７−デスアミドセクレチンを大腸菌内で
大量に生産させる方法を開発し、しかもＤＡＳがブタセ
クレチンと同様の生理活性（胛外分泌促進作用）乞もつ
ことも確認した（特開昭５７−２００３４３号、同関−
１３４９９８号各公報参照）。しかしながら、これらＤ
ＡＳは遺伝子工学的手法により大腸菌内で低蛋白質との
融合蛋白質として発現させたため１等電点１分子量。

各種容媒に対する溶解度、立体構造等の化学的性質の相
違や、その生体内条件の違いによる夾雑蛋白やペプチド
成分の相違１よどから、天然ブタ・セクレチンの抽出、
精製法を応用することができなかった。従って、　ＤＡ
Ｓを臨床用に供給するのに十分量を得るにはその精製法
の確立が必要であった。

発明の植１要 要旨 本発明は、遺伝子工学的手法によって菌体内で産生させ
た融合蛋白質からＤＡＳを分離したのち。

カラムクロマトグラフィーに供することによりＤＡＳな
精製する方法を提供するものである。従って１本発明に
よる菌体内で他の蛋白質との融合蛋白質として発現させ
たＤＡＳ　Ｏ）精製法は、下記の工４呈からンよること
を″ト哲徴とするものである。

（イ）■体から融合蛋白質を回収すること。

（ロ）この融合蛋白質から、ＤＡＳを完全なま〜切出す
こと。

（ハ）　切出しによって得られたＤＡＳと低置白質由来
のペプチドとの混合物を、陰イオン交換樹脂カラムクロ
マトグラフィーに供して、　ＤＡＳを該カラムに吸着さ
れない累通り画分とし゛〔得ること。

に）　この素通り画分を陽イオン交換樹脂カラムクロマ
トグラフィーに供して、ＤＡＳを吸着された両分の少な
くとも一つとして得ること。

（ホ）これらの自分について生物検定を行なって。

ＤＡＳの生物活性を有する両分を得ること。

（へ）得られた両分を高速液体クロマトグラフィーに供
して、　ＤＡＳを吸着された両分の少なくとも一つとし
て得ること。

（ト）これらの両分について生物検定を行なって、ＤＡ
Ｓの生物活性を有する両分を回収してＤＡＳを得ること
。

効果 本発明は、遺伝子工学的手法によって菌体内で産生させ
た融合蛋白質より所望の蛋白質を完全なままで分離し精
製する方法を確立するためになされたものである。従っ
て１本発明は融合蛋白質（たとえばβ−ガラクトシダー
ゼ・ＤＡＳ　）より所望蛋白質（ＤＡＳ　）を効率よく
しかも高純度で得る方法を提供するものである。

また、本発明によって精製されたＤＡＳは、天然ブタ・
セクレチンと同様の活性（弊外分泌促進作用）を有する
ので、臨床用に供給することが可能である。

本発明の方法は発酵法によるＤＡＳ生産の工業システム
の樹立にも多大な貢献をなすものであり、該システムが
確立されれば医療用をはじめその他の研究用等に大量に
供給することが可能であろう。

ＤＡＳは、遺伝子工学的手法によって生産することがで
きる。例えば、本発明者らによって既に提案された、β
−ラクタマーゼとの融合蛋白質（特開昭５７−２００３
４３号公報参照）としであるいはβ−ガラクト７ダーゼ
との融合蛋白質（特開昭５８−１３４９９８号公報参照
）として大腸菌内で産生させることができる。すなわち
、セクレチンのＣ−末端のアミノ酸がバリンであるポリ
ペプチドに相当するデス了ミドセクレチンの構造遺伝子
を化学的に合成し、これを必要に応じてり／カーＤＮＡ
を介して装置白質の構造遺伝子内またはそのＣ−末端に
直接または間接的に結合して、宿主菌内で増殖可能なキ
メラプラスミド乞つくる。ついで、このプラスミドを用
いて宿主菌を形質転換したのち、得られる形質転換体を
通気培養することにより装置白質との融合蛋白質として
ＤＡＳを産生させることができる。

ＤＡＳが融合蛋白質として発現されるのは、キメラプラ
スミドのＤＡＳ遺伝子の転写、翻訳を可能とするための
制御領域が必要であるところ、この制御領域のＤＮＡ　
（デオキ７リヂ核酸）が蛋白質として発現されるからで
あるが、宿主が大腸菌である場合の制御領域はβ−ラク
タマーゼあるいはβ−ガラクトシダーゼの遺伝子等が知
られており、これらの場合は融合蛋白質中のＤＡＳと結
合している蛋白質はβ−ラクタマーゼあるいはβ−ガラ
クトシダーゼとなる。そして、制御領域はＤＡＳ遺伝子
の翻訳の際に所定コドンが読取られるようにするため読
枠を合せるべく必四に応じてリンカ−ＤＮＡを介してＤ
ＡＳ遺伝子と結合されているから、融合蛋白質もこのり
／カーＤＮＡが指定するアミノ酸をβ−ラクタマーゼま
たはβ−ガラクトシダーゼのＣ−末７Ａ　Ｉｎ！ｌ　ｖ
ｃ有することがある。なお、ＤＡＳのＣ−末端ＵｔＵに
は余分な蛋白質が結合しないことが望ましく、従って遺
伝子設計の際にＤＡＳ遺伝子の下流側末端に停止コドン
を配することが望ましい。

融合蛋白質は、そこからＤＡＳを完全なま〜切出さなけ
ればならないのであるから、そのための配慮がなされて
いなければならない。そのような配慮の代表的なものの
一つは、蛋白質の切断に慣用されている基質アミノ酸特
異的化学試薬の攻撃点を与えるアミノ酸を所定部位に配
しておくことであって、具体的罠は臭化シアンによって
特異的に分解されるメチオニンをＤＡＳ　（１）　Ｎ−
末端側に接して結合させるよう遺伝子の設計を行なう。

ＤＡＳはその構成アミノ酸としてメチオニンな含まない
ので、臭化ノアン処理によってＤＡＳは完全なま〜切出
される。

ＤＡＳの嘔得 融合蛋白質として菌体内に発現した融合蛋白質は、これ
を菌体外に回収してから、ＤＡＳの切出しおよび分離を
行なうことによって、ＤＡＳとなる。

融合蛋白質の回収およびＤＡＳの切出し菌体からの融合
蛋白質の回収は、菌体を破壊したのち、遠心することに
より行なうのが通例である。菌体の破壊の方法としては
、浸透圧処理、凍結融解処理、超音波処理、化学的・酵
素的処理。

高圧下での破砕やアルミナ、ガラス粉などによる摩砕等
物理的処理およびこれらを適当に組み合わせた方法があ
る。具体的には、たとえば、抽出効率の面から酵素的処
理と超音波処理とを組み合わせた方法、すなわちリゾチ
ーム処理を行なって菌体をスフェロプラスト化したのち
超音波処理に付するという操作がある。超音波処理の前
にリゾチーム処理を行なうと、菌体細胞質が除かれるの
で超音波処理が容易となる利点がある。

ＤＡＳを弛張白質との融合蛋白質より完全なまま分離す
る方法としては、該融合蛋白質ｔギ酸中で臭化シアンに
よって加水分解する方法が適当である。

ＤＡＳの分離回収 上記のような加水分解後のギ酸中では、　ＤＡＳは信号
白質由来のベゾチドが混在した状態にある。

この混合液からＤＡＳの分離回収は、カラムクロマトグ
ラフィーを適宜実施することによって行なうことができ
る。カラムクロマトグラフィーそのものは、当業界にお
いて公知のものである。

このようなりＡ８の分離回収の一具体例を示せば。

下記の通りである。

すなわち、該混合液を凍結乾燥したのち、塩基性条件下
（例えばｐ）（３，４）で１姦イオン父挨樹脂（ＤＥＡ
Ｆセルロア了イ／ＡＨ（チッソ社）、ＤＥｉセルロース
ＤＥ５２　（ワットマン社）等が市販されている）に供
して、夾雑ペゾチド成分なカラムに吸着させる。この場
合、　ＤＡ８分子は累通り画分に存在する。ついで、こ
の素通り画分を弱酸性条件下（例えばｐＨ５，１）で陽
イオン文換樹脂（市販されているものとして、ＣＭ−セ
ルロファインＣＨ（チッソ社１．ＣＭ−セルロースＣＭ
５２（ワットマン社）等がある）に供して、ＤＡＳ分子
をカラムに吸着させる。ＤＡＳ分子の溶出は、溶出液の
ｐＨあるいはイオン強度をしだいＫｍ加さだていくこと
により行なうことができる。なお、酊出画分は、各画分
ごとに０Ｄ２８０および蛋白駿を徂」定するのがよい。

そして、得られた数個のピーク両分の＃液分泌促進効果
（後記実験例参照）を調べ、その活性があるものを部分
的精製ＤＡＳ画分とする。ここで得られた部分的Ｍ製Ｄ
ＡＳ画分を脱塩、濃縮したのち、逆相カラム（μゼンダ
ノぞツクＣ−１８カラム（ウォーターズ社）　、ＹＭＣ
Ａ３１３　（ＣＯＤ８）カラム（山村化学研究所）等が
市販されている）に供することによって、精Ｍ　ＤＡＳ
を得ることができる。

なお、高速液体クロマトグラフィーでの溶出要件として
は、移動相の極性を徐りに減少させることにより所望物
質を溶出させる方法が好ましし１（実験操作の詳細は、
後記実験例を参照されたい）。

上記の各カラムクロマトグラフィーにおいてＤＡＳを吸
着画分として得る場合には、吸着画分（ま複数個生成す
ることがふつうであって、ＤＡＳ＆まそのような複数の
吸着画分の少なくとも一つに含まれている。どの両分が
ＤＡＳを含むものであるか屯これらの吸着画分の各々に
ついて生物検定を行なって、　ＤＡＳの生物活性たとえ
ば脛外分泌促進作用の有無を調べることによればよい。

ＤＡＳの生物活性を有する両分には、そのような活性を
強く示す両分とこの活性の弱い両分とカ１ありうるカー
、収率よ＜　ＤＡＳを得るには活性の弱Ｉ／）面１分を
も回Ｉスすることが望ましい。なお、生物検定の詳細に
ついては、上記公開公報を参照されたｔ／）。

実　験　例 １、遺伝子工学的手法による２７−ヂス了ミドセクレチ
／の生産 ２７−ジスアミドセクレチンの生産を１特開Ｂ１１（５
７−２００３４３号、　Ｉ’：ｌ５７−２００４００号
および同５８−１３４９９８号公報記載の方法によって
行なうことカーできる。発現効率のよいものＧま特開昭
５８−１３４９９８号公報記載の方法であり、この方法
に従って下ａ己の手順で行なった。

リセクレチ／遺伝子の調製 上式で示されるブタ・セクレチ／のアミノ酸配列に従っ
て構造遺伝子を固相法によるト１）エステル法で化学合
成した（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｓｙｍｐｏｓｉ
ｕｍＳｅｒｉｅｓ　Ｎｏ、　１０．　Ｉｎｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ　Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ
Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ　Ｌｏｎｄｏｎ　（１９８１）　［
）ｐ１９７−２００　’）。

ｌ Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−’
ｌ’ｈｒ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｒｇ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａ、５ｐ−８ｅｒ−Ａｌ　ａ−Ａｒｇ
−Ｌｅｕ−（ＳＹｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ
−５ Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＮＨ２ 式中１番号はアミノ酸配列番号を示し、このＨｉｓ等の
略記法はアミノ酸を示すものとして当業界で慣用されて
いるものである。１よお、Ｈｉｓはヒスチジンを示す。

遺伝子設計は、下記の点に注意して行なった。

（１）大腸菌の中で最もよく使用されているコドンを選
択する。

（１１）転写が構造遺伝子の途中でとまるようなヌクレ
オチド配列を避ける。

（ｌｌ＋１　化学合成遺伝子の構成単位である合成オＩ
Ｊ　７ヌクレオチドがセルフ了ニールするような配列を
避ける。

なお、合成したセクレチン人工遺伝子は、リンカ−をつ
なぎベクターに組込みやすいよ５にした。

２）プラスミド、Ｌ８５８の構築とＤＡＳ遺伝子の発現
上記合成遺伝子を、Ｒｕｍ　ｌ　Ｋ組込み、これで宿主
菌（Ｅｃｏｌｉ　ＸＡ３５　）の形質転換を行なったの
ち、該遺伝子が正しい方向に挿入されたプラスミド（、
Ｌ８５Ｍ）を持つりａ−ｙｘＡ３５（ｐＬ８５８）を得
た。

ＤＡＳ遺伝子の発現は、宿主菌を培養することより行な
った。すなわち、形質転換された宿主菌ＸＡ３５　（、
Ｌ８５Ｂ　）　ｌ　’１等開昭５８−１３４９９８号公
報参照）をアノピシリン（２０μｇ／ｍｌ）、グリセロ
ール（０，４％）を添加したルリア培地（１％バクトド
リプトン、０．５％バクトイ−ストエキストラクト。

０．５％食塩（ｐＨ７））中、３７℃で約５時間通気培
養（対数増殖期まで）することにより、β−ガラクトシ
ダーゼとの融合蛋白質としてＤＡＳを発現させた。なお
、発現の確認は、　ＳＤＳ、ポリアクリル了ミドゲル賀
気泳動で行なった。

２、融合蛋白質の抽出および部分精製 上記培養後、遠心（１２０００ｇ、　１０分）すること
により９５ｇ（湿重量）の菌体を得た。菌体を５％（ｗ
／ｖ　）ショ糖、１ｍＭＥＤＴＡ　？：含む５０ｍＭ）
リス塩酸緩衝液（ｐ）ｌｓ　）　２４０ｍ１に懸濁させ
、リゾチーＡ　（１００ｍｇ　）　処Ｑによってスフ二
ロプラスト化シたのち、超音波処理（久保田［インソネ
ータ−２００ＭＪ　２００Ｗ、　３０分）することによ
り、破壊した。

ついで、遠心（１５０００ｇ、　３０分）することによ
り、β−ガラクトシダーゼ・ＤＡＳの融合蛋白質を不溶
性画分（沈殿）として得た。この不溶性画分を６００ｍ
１の１０　ｍＭ　ＭｇＣＩ□、　５　ｍＭメルヵゾトエ
タノールを含むｔＯｍＭ）リス塩酸緩衝液（ＰＨ７，５
）で３回洗浄後、　４４０ｍ１の７Ｍ尿素を含む上記緩
衝液（ｐＨ７，５）に懸濁させた。ッｌ／１で、遠心（
１５，０００ｇ。

；（（）分）し不溶物を除去したのち、水に対して透析
して尿素を除くことにより、いちど可溶化させた融合蛋
白質を析出させた。ついで、遠心（３９，０００ｇ、３
０分）を行なって、β−ガラクトシダーゼ・ＤＡＳ融合
蛋白質′４！ｒ：得た。得られた蛋白質は３．７５ｇで
、純度は５ＤＳ−電気泳動の分析によれば約（資）％で
あった。

３、臭化シアン処よるＤＡＳの融合蛋白質がらの切り出
し 融合蛋白（３，７５ｇ）を３００　ｍｌの７０％ギ酸に
懸濁させ、７ｇ（メチオニンのモル数の約１００倍過剰
量に相当）の臭化シアンを加えたのち密封して、室温で
一夜攪拌しながら反応を行１よった（メチオニ／のカル
ゼキシル基側のペプチド結合を切断）。

得られたＤＡＳ分子を含む酸液を３（１℃で濃縮したの
ち、凍結乾燥を行なって、ギ酸、過剰の臭化シアン、副
生成物の臭化メチル、臭化水素などを除去した。ついで
、得られた残量Ｙ１５０ｍｌの１０　ｍＭ炭酸アンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ８，４）に懸濁さぜたのち、遠心（１
３，０００ｇ、　１０分）を行なって不宕物を除去して
、ポリペプチド画分（１，４ｇ）を得た（上記公開公報
参照）。

４、クロマトグラフィーによる＋１７　、ｌＪ上記ポリ
ペプチド両分（１，４ｇ）を１０ｍＭ炭酸アンモニウム
緩衝液（ｐＨ８，４）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロフ
ァインＡＨ（チッソ）カラムに添加し、同じ緩衝液でカ
ラムを洗浄することによって、非吸着ポリペプチド画分
（２２ｍｇ　）を句たつその両分を凍結乾燥したのち、
１０ｍＭリン済ナトリウム緩衝液（ＰＨ６，１）　３６
．５ｍｌ　Ｋ溶解シ、同じ緩衝ｉで平１所化したＣＭ−
セルロファインＣＨ（チッソ）カラムに供した。食塩濃
度を０〜０．２Ｍまで直線的に上げることによりポリペ
プチド成分の分画な行なって、ＣＭＯ〜ＣＭ５画分を得
た（第１図）。図中。

縦軸左は２８０ｎｍにおける吸光度を示し、縦軸右は食
塩濃度を示ｊ。−！た、破線は食塩濃度勾配乞示し、Ｃ
ＭＯ〜ＣＭ５はピークの番号を示すものである。この各
々のピーク画分について生物検定（方法の詳細は、特開
昭５８−１３４９９８号公報参照）を行なった結果、Ｃ
Ｍ２とＣＭ３とに活性を認めたが、主活性はＣＭ　２画
分に存在していたのでこの両分を次の処理に供した。

５、高速液体クロマトグラフィーによる精製ＣＭ２画分
（２，４ｍｇのポリペプチドを含む）をμｍどンダパツ
ク０１８カラムに吸着させ、移動相として０．１％トリ
フルオロ酢酸す用い、アセトニトリル濃度乞１０％（ｖ
／ｖ　）から５０％（ｖ／ｖ）まで直線的に上昇させる
ことにより、吸着したポリペプチド成分を分離・溶出さ
せた（第２図参照）。第２図中矢印が合成セクレチン（
セルパ社）が溶出される位置であり、Ｈｌ−Ｈ３はピー
ク番号である。

これらピーク各々について生物検定（上記公開特許公報
）を行なったところ、Ｈ３に強い活性がみられた。Ｈ３
両分（０，９ｍｇ）の一部をとり、ディスク電気泳動（
１５％酸性ディスクゲル電気泳動ｐＨ４，３（Ｎａｔｕ
ｒｅ、１ｇ５．２８１　（１９６２）　）および逆相高
速液体クロマトグラフィーを行なった結果、単一バンド
単一ピークが得られたので、ＤＡＳは精製されたもので
あるとした（第３図）。第３図Ａにおいて、ａはＤＡＳ
、　ｂは合成セクレチ／の電気泳動の結果を示１もので
ある。

以上の実験結果より、精製過程における比活性。

回収率等を下表に示した。

６、　ＤＡＳの確認 精製されたＤＡＳの確認を、合成セクレチン（セル、２
社）との化学的諸性質（すなわち、アミノ酸分析、カル
イギ７ペプチダーゼＹ（以下ＣＰａ５ｅＹト記ス）によ
るカルイキゾル末９ｆ１０．）アミノ酸分上ｆ）を比較
することにより行１よった。下表にアミノ酸甜成の分析
結果を示すが、合成セクレチンおよび理論値とＤＡＳと
の組成はよく一致してＶすること力１わかる。

Ａｓｐ（Ａｓｎ）　２．１　２．２　２Ｇｌｕ（Ｇｌ＋
）　３−１　３．２　３ｐｒｏ　ｔ”　ｔ　０ Ｑｌｙ　２．１　２．１　２ Ａｌａ　１．１　１．１　１ Ｃｙｓ　ｔ　ｔ　Ｑ Ｖａｌ　１．０　１．（ｌ　１ Ｍｅｔ　ｔ　ｔ　Ｑ ｌｌｅ　ｔ　ｔ　０ Ｌｅｕ　６．０　６．０　６ Ｔｙｒ　ｔ　ｔ　０ Ｐｂｅ　１．０’　１．０　１ Ｌｙｓ　ｔ　ｔ　Ｑ Ｈｉｓ　１．０　１．０　１ Ｔｒｐ　ｔ　ｔ　Ｑ Ａｒｇ　４．１　４．２　４ ＊　ｔニドレース ＣＰ　ａｓｙ　Ｙによって処理したときのアミノ酸分析
の結果、ＤＡＳおよび合成セクレチンをＣＰａ５ｅＹで
消化することにより遊離してくるアミノ酸は。

ＤＡＳの場合にそのＣ末端アミノ酸配列（Ｖａｌ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−）から予想され
ルヨうにＶａｌ、　Ｌｅｕ、　Ｇｌｙ、　Ｇｌｎがｉ４
Ｊ　？Ｐされる（第４図ａ）のに対し、合成セクレチン
ではＬｅｕ、Ｇｌｙ。

Ｇ　Ｉ　ｎ　カ観察されるのみで、？リンアミドに相当
すると推定されるアミノ酸は観察されない（ちなみに。

−ｒミノ酸組成分析では、末端アミドに由来′１−ル・
７１７７残基が検出される）。これは、末端バリンアミ
ドの陽電荷と側鎖の疎水性とのため、ここで行なったア
ミノ酸分析の条件下ではバリンアミド残基は尚出されな
いためである（第４図）。第４図中、ＡはＤＡＳを、Ｂ
は合成セクレチンを各々Ｃｐａｓｅ　Ｙ処１［したとき
の高速液体クロマトグラフィーによる一ｒミノ酸分析の
結果を示す。同図中。

Ｇｌｎはグルタミンを示し、Ｇｉｎ等のアミノ醒略記法
は当業界で慣用されているものである。以上二つのこと
より、　ＤＡＳ分子はバリンがアミド化されていないこ
とを除けばセクレチンと同一であることが示唆された。

【図面の簡単な説明】

第１図はＣＭ−七ルロファインＣＨカラムクロマトグラ
フィーの酵出Ａターンを示す。 第２図は高速液体クロマトグラフィー〇ｍ出）ｅターン
をホす。 第３図において、Ａはディスク電気泳動の結果を示し、
Ｂは高速液体クロマトグラフィーでの溶出ノｅターンを
示す。ａ・・・ＤＡＩＩＩ、　ｌ）・・・合成セクレチ
ン第４図はＣＰａＳｅ　ｙ消化した際のアミノ酸分析の
結果を示し、ＡはＤＡＳ、Ｅは合成セクレチン（セルパ
社）のものである。 出願人代理人　猪　股　清

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程からなることを特徴とする、菌体内で他
   の蛋白質との融合蛋白質として発現させた２７−ジスア
   ミドセクレチン（以下、　ＤＡＳという）の精製法。 （イ）菌体から融合蛋白質を回収すること。 （ロ）　この融合蛋白質から、ＤＡＳを完全なま〜切出
   すこと。 （ハ）切出しによって得られたＤＡＳと他蛋白質由来の
   ペプチドとの混合物を、陰イオン父換樹脂カラムクロマ
   トグラフィーに供して、ＤＡＳを該カラムに吸着されな
   い素通り画分として得ること。 に）この素通り画分を陽イオン父換樹脂カラムクロマト
   グラフィーに供して、ＤＡＳを吸着された画分の少なく
   とも一つとして得ること。 （ホ）これらの両分について生物検定を行なって、ＤＡ
   Ｓの生物活性を有する両分を得ること。 （へ）得られた両分を高速液体クロマトグラフィーに供
   して、ＤＡＳを吸着された両分の少なくとも一つとして
   得ること。 ＯＪ　これらの両分について生物検定を行なって。 ＤＡＳの生物活性を有する一分を回収してＤＡＳを得る
   こと。 ２融合蛋白質が、ＤＡＳのＮ−末端側に接してメチオニ
   ンを有する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、融合蛋白質の低蛋白質が、ＤＡＳのＮ−末婦側に存
   在する、β−ラクタマーゼの少なくとも一部および必要
   に応じてそのＣ−末端側に結合したリンカ−ＤＮＡ由来
   の蛋白質からなる、特許請求の範囲第１〜２項のいずれ
   かに記載の方法。 ４、融合蛋白質の低蛋白質が、　ＤＡＳのＮ−末端ｔｎ
   ｕに存在する、β−ガラクトシダーゼの少なくとも一部
   および必要に【ムじてそのＣ−末端側に結合したリンカ
   −ＤＮＡ由来の蛋白質からなる、特許請求の範囲第１〜
   ２項のいずれに記載の方法。 ５、菌体からの融合蛋白質の回収を、菌体のり゛！チー
   ム処理および超音波処理忙よって行なう、特許請求の範
   囲第１〜４項のいずれか一項に記載の方法。 ６、融合蛋白質よりのｎ−デスアミドセクレチンの完全
   なままでの切出しを、該蛋白質をギ酸中で臭化シアン処
   理に付すことによってメチオニンのカルゼキシ末端で切
   断すること罠より行なう、特許請求の範囲第１〜５項い
   ずれが一項に記載の方法。 ７、陰イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー用樹脂
   としてジアミノエチルセルロースヲ用いる、′特許請求
   の範囲第１〜６項いずれか一項に記載の方法。