JP2887063B2 - グリセンチンの製造方法 - Google Patents
グリセンチンの製造方法Info
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- JP2887063B2 JP2887063B2 JP5349030A JP34903093A JP2887063B2 JP 2887063 B2 JP2887063 B2 JP 2887063B2 JP 5349030 A JP5349030 A JP 5349030A JP 34903093 A JP34903093 A JP 34903093A JP 2887063 B2 JP2887063 B2 JP 2887063B2
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- fusion protein
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- human glicentin
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトグリセンチンにペ
プチドを連結した融合蛋白質を組換え遺伝子技術により
生産し、次いで不用のペプチド部分を切断または分解す
る天然型（成熟型）グリセンチンの製造の際における、
ペプチド部分の切断または分解と副生成物の除去を容易
化するヒトグリセンチンの製造方法に関する。
プチドを連結した融合蛋白質を組換え遺伝子技術により
生産し、次いで不用のペプチド部分を切断または分解す
る天然型（成熟型）グリセンチンの製造の際における、
ペプチド部分の切断または分解と副生成物の除去を容易
化するヒトグリセンチンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び問題点】グリセンチンは６９個のアミ
ノ酸よりなる消化管ペプチドホルモンであり消化管の生
理作用に重要な役割を演じており、たとえば特願平４−
１８５０６６号に示される様に糖尿病治療薬などの医薬
品として期待されている。これまでに、有用蛋白質、例
えばヒトグリセンチンなどを大量に生産したい場合、目
的とする有用蛋白質を、これとペプチドまたは蛋白質と
を連結した融合蛋白質として組換えＤＮＡ技術により生
産し、得られた融合蛋白質を精製の後不用の部分を切断
するか、または分解させて得る方法が広く用いられる。
これは直接に有用蛋白質を発現させた場合に比べ、融合
蛋白質として発現させることにより発現量の増加、精製
の容易さ、生産過程の安定性向上、細胞外への分泌効率
増大などの理由で生産量の増大を計れることができる為
である。
ノ酸よりなる消化管ペプチドホルモンであり消化管の生
理作用に重要な役割を演じており、たとえば特願平４−
１８５０６６号に示される様に糖尿病治療薬などの医薬
品として期待されている。これまでに、有用蛋白質、例
えばヒトグリセンチンなどを大量に生産したい場合、目
的とする有用蛋白質を、これとペプチドまたは蛋白質と
を連結した融合蛋白質として組換えＤＮＡ技術により生
産し、得られた融合蛋白質を精製の後不用の部分を切断
するか、または分解させて得る方法が広く用いられる。
これは直接に有用蛋白質を発現させた場合に比べ、融合
蛋白質として発現させることにより発現量の増加、精製
の容易さ、生産過程の安定性向上、細胞外への分泌効率
増大などの理由で生産量の増大を計れることができる為
である。
【０００３】ところが組換えＤＮＡ技術により製造した
有用蛋白質を、医薬品、又は食品等として使用する場合
には、遺伝子翻訳開始コドンに対応するアミノ末端メチ
オニン残基の付加した有用蛋白質は、抗原性をもたらす
可能性があるためできる限り除去しておく必要がある。
そして有用蛋白質を直接に発現させる方法を用いて生産
した場合、アミノ末端メチオニンは除去されない事があ
り、そこで本来の形での有用蛋白質を生産しようとする
場合に、この融合蛋白質を用い不用の部分の切断または
分解を行ってメチオニンを除去した有用蛋白質を得る方
法がしばしば用いられている。
有用蛋白質を、医薬品、又は食品等として使用する場合
には、遺伝子翻訳開始コドンに対応するアミノ末端メチ
オニン残基の付加した有用蛋白質は、抗原性をもたらす
可能性があるためできる限り除去しておく必要がある。
そして有用蛋白質を直接に発現させる方法を用いて生産
した場合、アミノ末端メチオニンは除去されない事があ
り、そこで本来の形での有用蛋白質を生産しようとする
場合に、この融合蛋白質を用い不用の部分の切断または
分解を行ってメチオニンを除去した有用蛋白質を得る方
法がしばしば用いられている。
【０００４】しかしながらこの方法により有用蛋白質を
生産する場合、融合蛋白質の精製過程において融合蛋白
質の一部が分解し目的物に分解産物が混在するかまたは
融合蛋白質から不用部分を除去する操作が完全に進行せ
ず、目的物に融合蛋白質、または不完全分解物が混在す
る可能性がある。そしてこれらの混在物は目的物と性質
が一般的に類似しているため除去は困難である。さらに
これらの混在物はアミノ末端メチオニンの付加物の場合
と同様に、目的物を医薬品または食品等として用いる場
合には抗原性をもたらす可能性があり、これらを除去す
ることの必要性がきわめて高い。この観点から混在物の
有効な除去法が望まれていた。
生産する場合、融合蛋白質の精製過程において融合蛋白
質の一部が分解し目的物に分解産物が混在するかまたは
融合蛋白質から不用部分を除去する操作が完全に進行せ
ず、目的物に融合蛋白質、または不完全分解物が混在す
る可能性がある。そしてこれらの混在物は目的物と性質
が一般的に類似しているため除去は困難である。さらに
これらの混在物はアミノ末端メチオニンの付加物の場合
と同様に、目的物を医薬品または食品等として用いる場
合には抗原性をもたらす可能性があり、これらを除去す
ることの必要性がきわめて高い。この観点から混在物の
有効な除去法が望まれていた。
【０００５】ヒトグリセンチンの生産に関しても例外で
はなく、例えばアミノ末端にメチオニンの付加したヒト
グリセンチンの生産法（特願平５−１９２８４３号参
照）、ヒトグリセンチンの生産方法（特願平５−１６０
９７８号参照）の方法等により大量生産を試みた場合に
も微量の混在物の存在が想定しうるところで、医薬品と
して用いるには更なる精製が考慮されなければならな
い。
はなく、例えばアミノ末端にメチオニンの付加したヒト
グリセンチンの生産法（特願平５−１９２８４３号参
照）、ヒトグリセンチンの生産方法（特願平５−１６０
９７８号参照）の方法等により大量生産を試みた場合に
も微量の混在物の存在が想定しうるところで、医薬品と
して用いるには更なる精製が考慮されなければならな
い。
【０００６】さらには、遺伝子組換えの技術により大腸
菌で蛋白質を生産すると、しばしば大腸菌内で大腸菌の
プロテアーゼにより蛋白質の一部が分解を受け、生産物
に分解物が混在する結果となる。この混在物は前記融合
蛋白質の精製過程におこる分解物、あるいは融合蛋白質
から目的蛋白質を切り出す過程に生じる混在物と同様除
去の必要性が高い。しかしこの場合も目的蛋白質と混在
物は類似しており除去は困難である。そしてヒトグリセ
ンチンの場合も例外ではなく有効な精製法の確立が望ま
れていた。
菌で蛋白質を生産すると、しばしば大腸菌内で大腸菌の
プロテアーゼにより蛋白質の一部が分解を受け、生産物
に分解物が混在する結果となる。この混在物は前記融合
蛋白質の精製過程におこる分解物、あるいは融合蛋白質
から目的蛋白質を切り出す過程に生じる混在物と同様除
去の必要性が高い。しかしこの場合も目的蛋白質と混在
物は類似しており除去は困難である。そしてヒトグリセ
ンチンの場合も例外ではなく有効な精製法の確立が望ま
れていた。
【０００７】一方、システイン残基をペプチドに導入し
目的ペプチドを精製しようとする試みは、化学合成によ
るペプチド合成に際して行なわれており、この場合目的
ペプチドのアミノ末端にシステイン−メチオニンの配列
を付加しておき、目的ペプチドに到達することなく合成
が終わってしまったペプチドを除去するものである。し
かし長鎖のペプチドを工業生産レベルで生産する目的に
おいては、このペプチド合成の手法はコストの点から実
用不可能であり、またヒトグリセンチンの合成にこの手
法を適用してもヒトグリセンチンには内部にメチオニン
が含まれていて、臭化シアンによる開裂法等を用いると
ヒトグリセンチンは分解されてしまい、ヒトグリセンチ
ン製造の目的を達成しえない。
目的ペプチドを精製しようとする試みは、化学合成によ
るペプチド合成に際して行なわれており、この場合目的
ペプチドのアミノ末端にシステイン−メチオニンの配列
を付加しておき、目的ペプチドに到達することなく合成
が終わってしまったペプチドを除去するものである。し
かし長鎖のペプチドを工業生産レベルで生産する目的に
おいては、このペプチド合成の手法はコストの点から実
用不可能であり、またヒトグリセンチンの合成にこの手
法を適用してもヒトグリセンチンには内部にメチオニン
が含まれていて、臭化シアンによる開裂法等を用いると
ヒトグリセンチンは分解されてしまい、ヒトグリセンチ
ン製造の目的を達成しえない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は遺伝子組換え
技術を用いてヒトグリセンチンを生産するに際し、ヒト
グリセンチンのアミノ末端側に特徴的なアミノ酸残基を
含んだペプチドを連結した融合蛋白質を生産し、その融
合蛋白質の精製を容易にする事を目的とする。更にその
融合蛋白質からアミノペプチダーゼ、カテプシンＣによ
り付加ペプチド部分を消化した後ヒトグリセンチンを精
製する際に、未消化融合蛋白質を容易に分離除去できる
様にする事を目的とするものである。
技術を用いてヒトグリセンチンを生産するに際し、ヒト
グリセンチンのアミノ末端側に特徴的なアミノ酸残基を
含んだペプチドを連結した融合蛋白質を生産し、その融
合蛋白質の精製を容易にする事を目的とする。更にその
融合蛋白質からアミノペプチダーゼ、カテプシンＣによ
り付加ペプチド部分を消化した後ヒトグリセンチンを精
製する際に、未消化融合蛋白質を容易に分離除去できる
様にする事を目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決する為の手段】上記の目的は以下の本発明
により達成される。すなわち組換え遺伝子技術によりグ
リセンチンの融合蛋白質を生産する際に、その付加する
ペプチドの部分にシステインを導入する。これにより、
システイン残基の特性を利用した精製方法を用いて宿主
由来の不純物、融合蛋白質の分解物等の混在する抽出物
から、融合蛋白質を純化精製する。しかる後融合蛋白質
の不用部分をカテプシンＣにより消化する。この処理物
に混在する融合蛋白質の未消化物はシステイン残基を有
しているが、目的とするヒトグリセンチンはシステイン
残基を有していない。システイン残基の有無でヒトグリ
センチンから融合蛋白質の未消化物を分離除去すること
は、上記システイン残基の特性を利用した精製法により
容易に達成される。
により達成される。すなわち組換え遺伝子技術によりグ
リセンチンの融合蛋白質を生産する際に、その付加する
ペプチドの部分にシステインを導入する。これにより、
システイン残基の特性を利用した精製方法を用いて宿主
由来の不純物、融合蛋白質の分解物等の混在する抽出物
から、融合蛋白質を純化精製する。しかる後融合蛋白質
の不用部分をカテプシンＣにより消化する。この処理物
に混在する融合蛋白質の未消化物はシステイン残基を有
しているが、目的とするヒトグリセンチンはシステイン
残基を有していない。システイン残基の有無でヒトグリ
センチンから融合蛋白質の未消化物を分離除去すること
は、上記システイン残基の特性を利用した精製法により
容易に達成される。
【００１０】システイン残基の特性はチオール基を酸化
することによりジスルフィド結合を作り、還元条件にす
れば再びジスルフィド結合は容易に開裂するところにあ
る。この様な可逆的な共有結合を作れる性質はシステイ
ンに独特なもので、タンパク質を構成する他のアミノ酸
にはこの様な性質はない。この様な特徴ある性質によ
り、例えばチオプロピルセファロース６Ｂ（ファルマシ
アバイオテク株式会社商標）などのコバレントクロマト
グラフィー法を用い、固相への選択的なタンパク質の吸
着及び溶出がもたらされる。
することによりジスルフィド結合を作り、還元条件にす
れば再びジスルフィド結合は容易に開裂するところにあ
る。この様な可逆的な共有結合を作れる性質はシステイ
ンに独特なもので、タンパク質を構成する他のアミノ酸
にはこの様な性質はない。この様な特徴ある性質によ
り、例えばチオプロピルセファロース６Ｂ（ファルマシ
アバイオテク株式会社商標）などのコバレントクロマト
グラフィー法を用い、固相への選択的なタンパク質の吸
着及び溶出がもたらされる。
【００１１】この性質を利用した他の精製法として、例
えば２,２′−ジピリジルジスルフィド、エルマン試薬
などのチオール反応性試薬をシステイン残基に導入し融
合蛋白の性質を変化させ、既存のクロマトグラフィーに
より精製する方法も挙げられる。上記チオール反応性試
薬は導入した融合蛋白質に疎水性の上昇をもたらし、ク
ロマトグラフィーによる分離性を高めるが、さらに極端
に融合蛋白質の性質を変化させたい場合はチオール反応
性試薬にヘテロ２架橋性試薬であるＳＰＤＰ（Ｎ−サク
シニイミジル３（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト）を任意の蛋白質、アミノ基を含む化学物質に反応さ
せた物質を用いても良い。例えばイムノグロブリン特異
的結合物質であるプロテインＡにＳＰＤＰを導入し、こ
れを目的融合蛋白質のシステイン残基に結合させれば、
イムノグロブリン固定化カラムによりアフィニティーク
ロマトを行うことができ、これによってシステイン残基
を有する融合蛋白質を分離除去することができる。
えば２,２′−ジピリジルジスルフィド、エルマン試薬
などのチオール反応性試薬をシステイン残基に導入し融
合蛋白の性質を変化させ、既存のクロマトグラフィーに
より精製する方法も挙げられる。上記チオール反応性試
薬は導入した融合蛋白質に疎水性の上昇をもたらし、ク
ロマトグラフィーによる分離性を高めるが、さらに極端
に融合蛋白質の性質を変化させたい場合はチオール反応
性試薬にヘテロ２架橋性試薬であるＳＰＤＰ（Ｎ−サク
シニイミジル３（２−ピリジルジチオ）プロピオネー
ト）を任意の蛋白質、アミノ基を含む化学物質に反応さ
せた物質を用いても良い。例えばイムノグロブリン特異
的結合物質であるプロテインＡにＳＰＤＰを導入し、こ
れを目的融合蛋白質のシステイン残基に結合させれば、
イムノグロブリン固定化カラムによりアフィニティーク
ロマトを行うことができ、これによってシステイン残基
を有する融合蛋白質を分離除去することができる。
【００１２】本発明において融合蛋白質の付加ペプチド
部分はシステインの他にアルギニンおよび／またはリジ
ンを含む。アルギニンおよび／またはリジンを導入する
目的の一つは、融合蛋白質の精製過程で混在する分解物
の除去を容易に行うためである。これは融合蛋白質は導
入したアルギニンおよび／またはリジンにより、ヒトグ
リセンチンより等電点が高くなり、混在する分解物はヒ
トグリセンチンよりも等電点が低いか同等であるために
イオン交換クロマト等の方法により分離が可能となるた
めである。
部分はシステインの他にアルギニンおよび／またはリジ
ンを含む。アルギニンおよび／またはリジンを導入する
目的の一つは、融合蛋白質の精製過程で混在する分解物
の除去を容易に行うためである。これは融合蛋白質は導
入したアルギニンおよび／またはリジンにより、ヒトグ
リセンチンより等電点が高くなり、混在する分解物はヒ
トグリセンチンよりも等電点が低いか同等であるために
イオン交換クロマト等の方法により分離が可能となるた
めである。
【００１３】アルギニンおよび／またはリジンを導入す
る目的の他の一つは更に次の事実に基づくものである。
すなわち融合蛋白質を大腸菌で生産するに際し、翻訳開
始アミノ酸であるメチオニンが菌体内で完全に除去され
なかった場合、あるいは融合蛋白質のアミノ末端アラニ
ンから奇数個のアミノ酸が欠けた分解物が存在する場
合、カテブシンＣ消化によりこれらの混在物は導入した
アルギニンの直前で切断が停止され、アルギニンおよび
／またはリジンを導入しなかった場合に混在するヒトグ
リセンチンよりも小さい分子の分解物が混在することは
ないということである。そして導入したアルギニンおよ
び／またはリジンの直前で分解が停止された不純物はシ
ステインを含んでいるため２回目のシステインの特性を
利用した精製法により除去されるのである。
る目的の他の一つは更に次の事実に基づくものである。
すなわち融合蛋白質を大腸菌で生産するに際し、翻訳開
始アミノ酸であるメチオニンが菌体内で完全に除去され
なかった場合、あるいは融合蛋白質のアミノ末端アラニ
ンから奇数個のアミノ酸が欠けた分解物が存在する場
合、カテブシンＣ消化によりこれらの混在物は導入した
アルギニンの直前で切断が停止され、アルギニンおよび
／またはリジンを導入しなかった場合に混在するヒトグ
リセンチンよりも小さい分子の分解物が混在することは
ないということである。そして導入したアルギニンおよ
び／またはリジンの直前で分解が停止された不純物はシ
ステインを含んでいるため２回目のシステインの特性を
利用した精製法により除去されるのである。
【００１４】上記の理論を成立させるために、アルギニ
ンおよび／またはリジンの位置は、付加ペプチド部分の
アミノ末端アミノ酸からみて偶数番目に存在するように
する。これは付加ペプチドをカテプシンＣで消化するに
際し、消化が導入したアルギニンまたはリジンの位置で
止まらず、ヒトグリセンチンの１位のアルギニンで止ま
るようにするためである。これはカテプシンＣは基質で
ある蛋白質のアミノ末端からアミノ酸２個ずつ消化し
て、末端にアルギニンまたはリジンが現れるとそこで消
化は停止する〔文献（Paul D. Boyer編「The Enzymes」
第105頁〜第111頁IV Dipeptidyl-transferase, Academi
c Press社参照〕、というカテプシンＣの基質特異性を
利用したものである。アミノ末端から２番目にアルギニ
ンまたはリジンがあらわれても消化は停止しない。シス
テイン残基の導入位置はヒトグリセンチンのアミノ末端
アルギニンから融合蛋白質のアミノ末端方向に１残基
目、及び／または２残基目が好ましい。これは融合蛋白
質よりカテプシンＣでヒトグリセンチンを切り出す際
に、混在する事が予想される最小単位の不完全分解物に
システイン残基を含ませるためである。
ンおよび／またはリジンの位置は、付加ペプチド部分の
アミノ末端アミノ酸からみて偶数番目に存在するように
する。これは付加ペプチドをカテプシンＣで消化するに
際し、消化が導入したアルギニンまたはリジンの位置で
止まらず、ヒトグリセンチンの１位のアルギニンで止ま
るようにするためである。これはカテプシンＣは基質で
ある蛋白質のアミノ末端からアミノ酸２個ずつ消化し
て、末端にアルギニンまたはリジンが現れるとそこで消
化は停止する〔文献（Paul D. Boyer編「The Enzymes」
第105頁〜第111頁IV Dipeptidyl-transferase, Academi
c Press社参照〕、というカテプシンＣの基質特異性を
利用したものである。アミノ末端から２番目にアルギニ
ンまたはリジンがあらわれても消化は停止しない。シス
テイン残基の導入位置はヒトグリセンチンのアミノ末端
アルギニンから融合蛋白質のアミノ末端方向に１残基
目、及び／または２残基目が好ましい。これは融合蛋白
質よりカテプシンＣでヒトグリセンチンを切り出す際
に、混在する事が予想される最小単位の不完全分解物に
システイン残基を含ませるためである。
【００１５】アルギニンまたはリジンの導入位置はヒト
グリセンチンのＮ末端アルギニンから融合蛋白質のアミ
ノ末端方向１残基目が本来好ましい。これは融合蛋白質
のＮ末端が奇数個欠けた分子、あるいは翻訳開始アミノ
酸メチオニンが除去されない分子が混在した場合カテプ
シンＣ処理後に混在する不純物にシステイン残基を含ま
せるためである。
グリセンチンのＮ末端アルギニンから融合蛋白質のアミ
ノ末端方向１残基目が本来好ましい。これは融合蛋白質
のＮ末端が奇数個欠けた分子、あるいは翻訳開始アミノ
酸メチオニンが除去されない分子が混在した場合カテプ
シンＣ処理後に混在する不純物にシステイン残基を含ま
せるためである。
【００１６】しかし本発明ではアルギニンまたはリジン
をアミノ末端方向の５残基目に位置するように導入する
ことが最も好ましいことを見出した。これはシステイン
をヒトグリセンチンＮ末端アルギニンから融合蛋白質の
アミノ末端方向１残基目に位置するように配置した場合
に比較して、システインの反応性が向上する為である。
この理由はシステイン残基の前後にアルギニンまたはリ
ジンの様な塩基性のアミノ酸が位置するとシステインの
ｐＫａが低下し、システインの反応性が低下するものと
考えられるところによるものである。
をアミノ末端方向の５残基目に位置するように導入する
ことが最も好ましいことを見出した。これはシステイン
をヒトグリセンチンＮ末端アルギニンから融合蛋白質の
アミノ末端方向１残基目に位置するように配置した場合
に比較して、システインの反応性が向上する為である。
この理由はシステイン残基の前後にアルギニンまたはリ
ジンの様な塩基性のアミノ酸が位置するとシステインの
ｐＫａが低下し、システインの反応性が低下するものと
考えられるところによるものである。
【００１７】
【発明の効果】本発明は従来の精製操作にアフィニティ
ークロマトを用いても効率的ではなかったヒトグリセン
チンに対して、アフィニティークロマト法を適用するこ
とによって、飛躍的な精製効果をもたらす。また従来達
成し得なかった、或いは達成するためには多大な労力を
要する非特異分解物の除去という精製工程を２工程で済
まし得る。更に遺伝子組換えによる融合蛋白質法で有用
蛋白質を切り出した時に混在する、非分解物の除去にも
容易な精製手段を与えるという優れた効果を有する。以
下実施例をあげて説明するが本発明はこれに限定される
ものではない。
ークロマトを用いても効率的ではなかったヒトグリセン
チンに対して、アフィニティークロマト法を適用するこ
とによって、飛躍的な精製効果をもたらす。また従来達
成し得なかった、或いは達成するためには多大な労力を
要する非特異分解物の除去という精製工程を２工程で済
まし得る。更に遺伝子組換えによる融合蛋白質法で有用
蛋白質を切り出した時に混在する、非分解物の除去にも
容易な精製手段を与えるという優れた効果を有する。以
下実施例をあげて説明するが本発明はこれに限定される
ものではない。
【００１８】
ヒトグリセンチン融合蛋白質を生産する組換え大腸菌か
らのヒトグリセンチンの精製法 以下の実施例で用いたＭ９ＺＢ培地、ＧＡＥバッファ
ー、ＡＥＳバッファー及びＴＥＳバッファーは、次に示
す組成を有する。 Ｍ９ＺＢ培地：１リットルあたり ＮＺアミン１０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、ＮＨ4Ｃｌ １ｇ、
ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4 ６ｇ、グルコース４
ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２６４mg、アンピシリン５０m
g ＧＡＥバッファー：４Ｍグアニディン塩酸、０.１Ｍ酢
酸ナトリウム、pH４.５、１mM ＥＤＴＡ ＡＥＳバッファー：０.１Ｍ酢酸ナトリウム、pH４.５、
１mM ＥＤＴＡ、０.５Ｍ ＮａＣｌ ＴＥＳバッファー：０.１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、pH７.
５、１mM ＥＤＴＡ、０.５Ｍ ＮａＣｌ
らのヒトグリセンチンの精製法 以下の実施例で用いたＭ９ＺＢ培地、ＧＡＥバッファ
ー、ＡＥＳバッファー及びＴＥＳバッファーは、次に示
す組成を有する。 Ｍ９ＺＢ培地：１リットルあたり ＮＺアミン１０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ、ＮＨ4Ｃｌ １ｇ、
ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4 ６ｇ、グルコース４
ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２６４mg、アンピシリン５０m
g ＧＡＥバッファー：４Ｍグアニディン塩酸、０.１Ｍ酢
酸ナトリウム、pH４.５、１mM ＥＤＴＡ ＡＥＳバッファー：０.１Ｍ酢酸ナトリウム、pH４.５、
１mM ＥＤＴＡ、０.５Ｍ ＮａＣｌ ＴＥＳバッファー：０.１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、pH７.
５、１mM ＥＤＴＡ、０.５Ｍ ＮａＣｌ
【００１９】実施例１ 発現ベクタープラスミドｐＧＬ１４７の構築 Ｔ７φ１０プロモーターの下流に融合グリセンチン遺伝
子を結合した発現ベクターの構築を行った。一連の実験
操作は一般的な遺伝子組換えの実験法（T. Maniatis,
E. F. Fritsch, J. Sambrook編Molecular Cloning A La
boratory Manual等参照）により行った。グリセンチン
遺伝子ＤＮＡを連結するためNovagen社より入手したベ
クタープラスミドｐＥＴ−３ａのＢａｍ ＨＩ認識配列
の下流にＳｔｕ Ｉ認識配列を挿入した。
子を結合した発現ベクターの構築を行った。一連の実験
操作は一般的な遺伝子組換えの実験法（T. Maniatis,
E. F. Fritsch, J. Sambrook編Molecular Cloning A La
boratory Manual等参照）により行った。グリセンチン
遺伝子ＤＮＡを連結するためNovagen社より入手したベ
クタープラスミドｐＥＴ−３ａのＢａｍ ＨＩ認識配列
の下流にＳｔｕ Ｉ認識配列を挿入した。
【００２０】5′-GATCCTTAGCGTAGGCCTT-3′（配列表・
配列番号１）および 5′-GATCAAGGCCTACGCTAAG-3′（配列表・配列番号２） の配列の２種のオリゴヌクレオチドをMilligen／Biosea
rch社製Cyclone Plus ＤＮＡ合成機で及び同社から供給
される合成試薬を用いて、付属の操作説明書により合成
した。オリゴヌクレオチドの精製はMilligen／Biosearc
h社製のＯｌｉｇｏ−Ｐａｋ(R)と付属のオリゴヌクレオ
チド精製マニュアルに従い精製した。これ以下の実験に
用いるオリゴヌクレオチドの合成及び精製も全てのこの
方法によって行った。各々のオリゴヌクレオチド５μｇ
を宝酒造製Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで同社の反応
条件によりリン酸化した。次いで両反応液を合わせて９
０℃で５分間保温した後３時間かけて３０℃まで温度を
下げてオリゴヌクレオチドのアニーリングを行った。プ
ラスミドｐＥＴ−３ａ（F. W. Studier, A. H. Rosenbe
rg, J. J. Dunn, J. W. Dubendorff, Methods in Enzym
ology, 185巻, 60〜89ページ（1990）参照）をＢａｍ
ＨＩで加水分解し、次いで宝酒造製E. coliアルカリフ
ォスターゼで同社の示す反応条件で脱リン酸化した。得
られた直鎖状プラスミドとアニーリングしたオリゴヌク
レオチドを宝酒造製ＤＮＡライゲーションキットを用い
て同社のプロトコールに従ってライゲーションした。こ
のライゲーションしたＤＮＡを用いて塩化カルシウム法
によりE. coli JM109の形質転換を行い、アンピシリン
を５０μｇ／mlの濃度で含むＬＢ寒天培地で生育するコ
ロニーを選択した。得られた形質転換株を５０μｇ／ml
のアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養を行い培養菌
体よりプラスミドを抽出精製した。得られたプラスミド
をＳｔｕ Ｉで加水分解してアガロースゲル電気泳動を
行うことにより本酵素による切断部位が存在するプラス
ミドを選択した。これらのプラスミドの塩基配列をUnit
ed States Biochemical Corporation社製Sequenase ver
sion ２.０キットを用いて同社のプロトコールに従って
ダイデオキシ法によって確認した。新たに得られたプラ
スミドをｐＥＴ１１０と命名した。ｐＥＴ１１０はＢａ
ｍ ＨＩ認識配列の下流に新たにＳｔｕ Ｉ認識配列が存
在することを確認した。ｐＥＴ１１０のＢａｍ ＨＩ及
びＳｔｕ Ｉ認識配列間の塩基配列は次の通りである。 5′-GGATCCTTAG CGTAGGCCT-3′（配列表・配列番号３）
配列番号１）および 5′-GATCAAGGCCTACGCTAAG-3′（配列表・配列番号２） の配列の２種のオリゴヌクレオチドをMilligen／Biosea
rch社製Cyclone Plus ＤＮＡ合成機で及び同社から供給
される合成試薬を用いて、付属の操作説明書により合成
した。オリゴヌクレオチドの精製はMilligen／Biosearc
h社製のＯｌｉｇｏ−Ｐａｋ(R)と付属のオリゴヌクレオ
チド精製マニュアルに従い精製した。これ以下の実験に
用いるオリゴヌクレオチドの合成及び精製も全てのこの
方法によって行った。各々のオリゴヌクレオチド５μｇ
を宝酒造製Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで同社の反応
条件によりリン酸化した。次いで両反応液を合わせて９
０℃で５分間保温した後３時間かけて３０℃まで温度を
下げてオリゴヌクレオチドのアニーリングを行った。プ
ラスミドｐＥＴ−３ａ（F. W. Studier, A. H. Rosenbe
rg, J. J. Dunn, J. W. Dubendorff, Methods in Enzym
ology, 185巻, 60〜89ページ（1990）参照）をＢａｍ
ＨＩで加水分解し、次いで宝酒造製E. coliアルカリフ
ォスターゼで同社の示す反応条件で脱リン酸化した。得
られた直鎖状プラスミドとアニーリングしたオリゴヌク
レオチドを宝酒造製ＤＮＡライゲーションキットを用い
て同社のプロトコールに従ってライゲーションした。こ
のライゲーションしたＤＮＡを用いて塩化カルシウム法
によりE. coli JM109の形質転換を行い、アンピシリン
を５０μｇ／mlの濃度で含むＬＢ寒天培地で生育するコ
ロニーを選択した。得られた形質転換株を５０μｇ／ml
のアンピシリンを含むＬＢ培地で終夜培養を行い培養菌
体よりプラスミドを抽出精製した。得られたプラスミド
をＳｔｕ Ｉで加水分解してアガロースゲル電気泳動を
行うことにより本酵素による切断部位が存在するプラス
ミドを選択した。これらのプラスミドの塩基配列をUnit
ed States Biochemical Corporation社製Sequenase ver
sion ２.０キットを用いて同社のプロトコールに従って
ダイデオキシ法によって確認した。新たに得られたプラ
スミドをｐＥＴ１１０と命名した。ｐＥＴ１１０はＢａ
ｍ ＨＩ認識配列の下流に新たにＳｔｕ Ｉ認識配列が存
在することを確認した。ｐＥＴ１１０のＢａｍ ＨＩ及
びＳｔｕ Ｉ認識配列間の塩基配列は次の通りである。 5′-GGATCCTTAG CGTAGGCCT-3′（配列表・配列番号３）
【００２１】ｐＧＬ５（消化管ホルモン研究会編集、消
化管ホルモンXI３９４ページ〜４０１ページ（１９９
２）参照）のグリセンチン遺伝子下流のＰｓｔＩ認識配
列をＳｍａＩ認識配列に変換した。 5′-CATGGCCCGGGACAGCACA-3′（配列表・配列番号４）
及び 5′-AGCTTGTGCTGTCCCGGGC-3′（配列表・配列番号５） の配列の２種の配列のオリゴヌクレオチドを合成し上記
と同様の方法で精製、リン酸化、及びアニーリングを行
った。ｐＧＬ５をＮｃｏＩ及びＨｉｎｄ IIIで切断し、
反応物をアガロースゲル電気泳動で展開し、約４kbのバ
ンドをゲルより抽出することにより目的断片を精製し
た。次いでアニーリングしたオリゴヌクレオチドと精製
した直鎖状プラスミドをライゲーションした。ライゲー
ションしたＤＮＡを用いてｐＥＴ１１０作製の際と同様
にE. coli JM109を形質転換した。ｐＥＴ１１０の際と
同様に形質転換株よりプラスミドを抽出し精製した。得
られたプラスミドをＳｍａＩで加水分解し、本酵素によ
る切断部位が存在するプラスミドを選択した。これらの
プラスミドの塩基配列の決定を行い、目的の配列の存在
するプラスミドを選択しｐＧＬ４４と命名した。新たに
得られたプラスミドｐＧＬ４４はグリセンチン遺伝子下
流のＰｓｔＩの認識配列が失われ新たにＳｍａＩ認識配
列サイトが付加されていた。ｐＧＬ４４のグリセンチン
遺伝子下流の新たなＳｍａＩサイトを含むＮｃｏＩ−Ｈ
ｉｎｄ III間の塩基配列は次の通りである。 5′-CCATGGCCCG GGACAGCAAG CTT-3′（配列表・配列番
号６）
化管ホルモンXI３９４ページ〜４０１ページ（１９９
２）参照）のグリセンチン遺伝子下流のＰｓｔＩ認識配
列をＳｍａＩ認識配列に変換した。 5′-CATGGCCCGGGACAGCACA-3′（配列表・配列番号４）
及び 5′-AGCTTGTGCTGTCCCGGGC-3′（配列表・配列番号５） の配列の２種の配列のオリゴヌクレオチドを合成し上記
と同様の方法で精製、リン酸化、及びアニーリングを行
った。ｐＧＬ５をＮｃｏＩ及びＨｉｎｄ IIIで切断し、
反応物をアガロースゲル電気泳動で展開し、約４kbのバ
ンドをゲルより抽出することにより目的断片を精製し
た。次いでアニーリングしたオリゴヌクレオチドと精製
した直鎖状プラスミドをライゲーションした。ライゲー
ションしたＤＮＡを用いてｐＥＴ１１０作製の際と同様
にE. coli JM109を形質転換した。ｐＥＴ１１０の際と
同様に形質転換株よりプラスミドを抽出し精製した。得
られたプラスミドをＳｍａＩで加水分解し、本酵素によ
る切断部位が存在するプラスミドを選択した。これらの
プラスミドの塩基配列の決定を行い、目的の配列の存在
するプラスミドを選択しｐＧＬ４４と命名した。新たに
得られたプラスミドｐＧＬ４４はグリセンチン遺伝子下
流のＰｓｔＩの認識配列が失われ新たにＳｍａＩ認識配
列サイトが付加されていた。ｐＧＬ４４のグリセンチン
遺伝子下流の新たなＳｍａＩサイトを含むＮｃｏＩ−Ｈ
ｉｎｄ III間の塩基配列は次の通りである。 5′-CCATGGCCCG GGACAGCAAG CTT-3′（配列表・配列番
号６）
【００２２】ｐＧＬ４４のグリセンチン遺伝子５′末端
領域の改変を行った。 5′-AATTCAGATCTATCGAAGGTCGACGTTCTCTGCA-3′（配列表
・配列番号７） および 5′-GAGAACGTCGACCTTCGATAGACTG-3′（配列表・配列番
号８） の２種の配列のオリゴヌクレオチドを合成し上記と同様
な方法で精製、リン酸化およびアニーリングした。ｐＧ
Ｌ４４をＥｃｏ ＲＩおよびＰｓｔ Ｉで加水分解した後
上記と同様に脱リン酸化し、アニーリングしたオリゴヌ
クレオチドとライゲーションした。アニーリングしたＤ
ＮＡを用いてE. coli JM109を形質転換した。形質転換
株よりプラスミドを抽出しＢｇｌ IIで処理し新たに本
酵素により切断されるプラスミドを選択した。これらの
プラスミドの塩基配列の決定を行い、目的の塩基配列を
持つプラスミドをｐＧＬ１２２と命名した。ｐＧＬ１２
２はｐＧＬ４４のＥｃｏ ＲＩ〜Ｐｓｔ Ｉサイトに合成
オリゴヌクレオチドが挿入されたものであることを確認
した。ｐＧＬ１２２の改変された部位の塩基配列を次に
示す。 5′-GAATTCAGAT CTATCGAAGG TCGACGTTCT CTGCAG-3′
（配列表・配列番号９）
領域の改変を行った。 5′-AATTCAGATCTATCGAAGGTCGACGTTCTCTGCA-3′（配列表
・配列番号７） および 5′-GAGAACGTCGACCTTCGATAGACTG-3′（配列表・配列番
号８） の２種の配列のオリゴヌクレオチドを合成し上記と同様
な方法で精製、リン酸化およびアニーリングした。ｐＧ
Ｌ４４をＥｃｏ ＲＩおよびＰｓｔ Ｉで加水分解した後
上記と同様に脱リン酸化し、アニーリングしたオリゴヌ
クレオチドとライゲーションした。アニーリングしたＤ
ＮＡを用いてE. coli JM109を形質転換した。形質転換
株よりプラスミドを抽出しＢｇｌ IIで処理し新たに本
酵素により切断されるプラスミドを選択した。これらの
プラスミドの塩基配列の決定を行い、目的の塩基配列を
持つプラスミドをｐＧＬ１２２と命名した。ｐＧＬ１２
２はｐＧＬ４４のＥｃｏ ＲＩ〜Ｐｓｔ Ｉサイトに合成
オリゴヌクレオチドが挿入されたものであることを確認
した。ｐＧＬ１２２の改変された部位の塩基配列を次に
示す。 5′-GAATTCAGAT CTATCGAAGG TCGACGTTCT CTGCAG-3′
（配列表・配列番号９）
【００２３】ｐＧＬ１２２をＢｇｌ IIおよびＳｍａ Ｉ
で加水分解し、グリセンチン遺伝子を含むＤＮＡ断片の
精製を行った。ｐＥＴ１１０をＢａｍ ＨＩおよびＳｔ
ｕ Ｉで加水分解した後脱リン酸化した。これをグリセ
ンチン遺伝子を含むＤＮＡ断片と混合しＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼでライゲーションした。反応物をE. coli JM109
と混合し形質転換を行い新たにプラスミドｐＧＬ１２５
を得た。ｐＧＬ１２５はＴ７φ１０プロモーターの下流
にＴ７ ｓ１０ペプチド、挿入アミノ酸配列およびグリ
センチンの融合ペプチド遺伝子が連結した発現ベクター
である。ｐＧＬ１２５構築の過程を簡単に図１に示し
た。
で加水分解し、グリセンチン遺伝子を含むＤＮＡ断片の
精製を行った。ｐＥＴ１１０をＢａｍ ＨＩおよびＳｔ
ｕ Ｉで加水分解した後脱リン酸化した。これをグリセ
ンチン遺伝子を含むＤＮＡ断片と混合しＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼでライゲーションした。反応物をE. coli JM109
と混合し形質転換を行い新たにプラスミドｐＧＬ１２５
を得た。ｐＧＬ１２５はＴ７φ１０プロモーターの下流
にＴ７ ｓ１０ペプチド、挿入アミノ酸配列およびグリ
センチンの融合ペプチド遺伝子が連結した発現ベクター
である。ｐＧＬ１２５構築の過程を簡単に図１に示し
た。
【００２４】Ａ） ｐＧＬ１４４の構築 ｐＵＣ１８を制限酵素Ｄｒａ Ｉで切断しアガロース電
気泳動を行って、アンピシリン耐性遺伝子を含む断片を
精製した。ｐＧＬ１２５を制限酵素Ｄｒａ Ｉで切断
し、アガロースゲル電気泳動を行ってアンピシリン耐性
遺伝子を含まない断片を精製した。それぞれの断片を、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション反応を行
った。反応産物を大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセ
ルに導入し、アンピシリンを含む選択培地上で形質転換
体を選択した。
気泳動を行って、アンピシリン耐性遺伝子を含む断片を
精製した。ｐＧＬ１２５を制限酵素Ｄｒａ Ｉで切断
し、アガロースゲル電気泳動を行ってアンピシリン耐性
遺伝子を含まない断片を精製した。それぞれの断片を、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション反応を行
った。反応産物を大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセ
ルに導入し、アンピシリンを含む選択培地上で形質転換
体を選択した。
【００２５】得られた形質転換体より定法に従ってプラ
スミドを抽出し、制限酵素切断地図を作成し目的のプラ
スミドが構築されていることを確認し、このプラスミド
をｐＧＬ１４４とした。ｐＧＬ１４４構築過程を簡単に
図２に示した。
スミドを抽出し、制限酵素切断地図を作成し目的のプラ
スミドが構築されていることを確認し、このプラスミド
をｐＧＬ１４４とした。ｐＧＬ１４４構築過程を簡単に
図２に示した。
【００２６】このようにして構築されたＴ７φ１０プロ
モータ下流にヒトグリセンチン遺伝子を含むプラスミド
ｐＧＬ１４４を、制限酵素ＮｄｅＩ、ＰｓｔＩで切断
し、ここに合成リンカーを挿入した。合成リンカーは次
のＤＮＡ配列を有する。 5′-TATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGTGTCGTTCCCTGCA-
3′（配列表・配列番号１０）及びその相補鎖である 5′-GGGAACGACACATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCA-3′(配
列表・配列番号１１)
モータ下流にヒトグリセンチン遺伝子を含むプラスミド
ｐＧＬ１４４を、制限酵素ＮｄｅＩ、ＰｓｔＩで切断
し、ここに合成リンカーを挿入した。合成リンカーは次
のＤＮＡ配列を有する。 5′-TATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGTGTCGTTCCCTGCA-
3′（配列表・配列番号１０）及びその相補鎖である 5′-GGGAACGACACATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCA-3′(配
列表・配列番号１１)
【００２７】すなわち、これらの合成ＤＮＡ ２μｇを
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。次いで
両反応液を合わせて９５℃で５分間加熱した後、１時間
で室温まで下げてアニーリングを行った。この様にして
作成した合成リンカーと制限酵素ＮｄｅＩとＰｓｔＩで
切断し、アガロースゲル電気泳動により精製した直鎖状
のｐＧＬ１４４を宝酒造のＤＮＡライゲーションキット
を用いて結合した。この結合したＤＮＡを大腸菌ＪＭ１
０９株のコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含
む選択培地上で形質転換体を選択した。得られた形質転
換体より常法に従ってプラスミドを抽出し、サンガーら
のダイデオキシ法により目的の塩基配列を有している事
を確認し、このプラスミドをｐＧＬ１４７とした。ｐＧ
Ｌ１４７の構築過程を図３に示す。
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。次いで
両反応液を合わせて９５℃で５分間加熱した後、１時間
で室温まで下げてアニーリングを行った。この様にして
作成した合成リンカーと制限酵素ＮｄｅＩとＰｓｔＩで
切断し、アガロースゲル電気泳動により精製した直鎖状
のｐＧＬ１４４を宝酒造のＤＮＡライゲーションキット
を用いて結合した。この結合したＤＮＡを大腸菌ＪＭ１
０９株のコンピテントセルに導入し、アンピシリンを含
む選択培地上で形質転換体を選択した。得られた形質転
換体より常法に従ってプラスミドを抽出し、サンガーら
のダイデオキシ法により目的の塩基配列を有している事
を確認し、このプラスミドをｐＧＬ１４７とした。ｐＧ
Ｌ１４７の構築過程を図３に示す。
【００２８】実施例２ ｐＧＬ１４９の構築 実施例１で示した制限酵素ＮｄｅＩ、ＰｓｔＩで切断し
精製した直鎖状ｐＧＬ１４４に、以下に示す合成ＤＮＡ
リンカーを結合した。 5′-TATGGCTAGCATGACTGGTCGTCAGCAATGTGGTCGTTCCCTGCA-
3′（配列表・配列番号１２）およびその相補鎖である 5′-GGGAACGACCACATTGCTGACGACCAGTCATGCTAGCCA-3′
（配列表・配列番号１３）
精製した直鎖状ｐＧＬ１４４に、以下に示す合成ＤＮＡ
リンカーを結合した。 5′-TATGGCTAGCATGACTGGTCGTCAGCAATGTGGTCGTTCCCTGCA-
3′（配列表・配列番号１２）およびその相補鎖である 5′-GGGAACGACCACATTGCTGACGACCAGTCATGCTAGCCA-3′
（配列表・配列番号１３）
【００２９】それぞれの合成ＤＮＡ ２μｇをＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。次いで両反応液
を合わせて９４℃で５分間加熱した後１時間で室温まで
下げてアニーリングを行った。このようにして作成した
合成ＤＮＡリンカーと、制限酵素ＮｄｅＩとＰｓｔＩで
切断しアガロースゲル電気泳動により精製した直鎖状の
ｐＧＬ１４４を宝酒造（株）のＤＮＡライゲーションキ
ットを用いて結合した。この結合したＤＮＡを大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株のコンピテントセルに導入し、アンピシリン
を含む選択培地上で形質転換体を選択した。得られた形
質転換体より常法に従ってプラスミドを抽出し、サンガ
ーらのダイデオキシ法により目的の塩基配列を有してい
ることを確認し、このプラスミドをｐＧＬ１４９とし
た。ｐＧＬ１４９の構築過程を図４に示す。
ヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。次いで両反応液
を合わせて９４℃で５分間加熱した後１時間で室温まで
下げてアニーリングを行った。このようにして作成した
合成ＤＮＡリンカーと、制限酵素ＮｄｅＩとＰｓｔＩで
切断しアガロースゲル電気泳動により精製した直鎖状の
ｐＧＬ１４４を宝酒造（株）のＤＮＡライゲーションキ
ットを用いて結合した。この結合したＤＮＡを大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株のコンピテントセルに導入し、アンピシリン
を含む選択培地上で形質転換体を選択した。得られた形
質転換体より常法に従ってプラスミドを抽出し、サンガ
ーらのダイデオキシ法により目的の塩基配列を有してい
ることを確認し、このプラスミドをｐＧＬ１４９とし
た。ｐＧＬ１４９の構築過程を図４に示す。
【００３０】実施例３ ヒトグリセンチン融合蛋白質の生産 実施例１で示したｐＧＬ１４７及び実施例２で示したｐ
ＧＬ１４９で大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を形質転換
し、ヒトグリセンチン融合蛋白質生産能を有する形質転
換体を得た。ｐＧＬ１４７を保持する形質転換体をＧ６
４７と、ｐＧＬ１４９を保持する形質転換体をＧ６６２
と命名した。この形質転換体を用いて以下のようにヒト
グリセンチン融合蛋白質を生産した。
ＧＬ１４９で大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を形質転換
し、ヒトグリセンチン融合蛋白質生産能を有する形質転
換体を得た。ｐＧＬ１４７を保持する形質転換体をＧ６
４７と、ｐＧＬ１４９を保持する形質転換体をＧ６６２
と命名した。この形質転換体を用いて以下のようにヒト
グリセンチン融合蛋白質を生産した。
【００３１】培 養 上記形質転換体Ｇ６４７及びＧ６６２を１リットルのＭ
９ＺＢ培地で３７℃で培養する。吸光度Ａ550が０.８に
なった時点で終濃度が０.５mMになるようＩＰＴＧ（イ
ソプロピルチオガラクトシド）を添加してその後２.５
時間培養することでヒトグリセンチン融合蛋白質を生産
した。Ｇ６４７、Ｇ６６２の培養菌体は１リットルの培
養で湿潤重量でそれぞれ５ｇであった。
９ＺＢ培地で３７℃で培養する。吸光度Ａ550が０.８に
なった時点で終濃度が０.５mMになるようＩＰＴＧ（イ
ソプロピルチオガラクトシド）を添加してその後２.５
時間培養することでヒトグリセンチン融合蛋白質を生産
した。Ｇ６４７、Ｇ６６２の培養菌体は１リットルの培
養で湿潤重量でそれぞれ５ｇであった。
【００３２】実施例４ Ｇ６４７由来ヒトグリセンチン融合蛋白質の精製 湿潤重量で５ｇの上記Ｇ６４７培養菌体を３０mlのＧＡ
Ｅバッファーで懸濁し、超音波破砕した。遠心分離（２
５０００×Ｇ，１０分間）により上清を取り、この上清
を予めＧＡＥバッファーで洗浄しておいたチオプロピル
セファロース６Ｂカラム（１cmφ×６.４cm）に３ml／h
rの流速で負荷した。カラムはＧＡＥバッファー１００m
l、ＡＥＳバッファー１００ml、ＴＥＳバッファー１０
０mlで順次洗浄し、５０mMジチオスレイトールを含むＴ
ＥＳバッファーで１０ml／hrの流速で溶出した。溶出画
分は５０％飽和硫酸アンモニウムを添加し、ヒトグリセ
ンチン融合蛋白質を沈殿せしめた。沈殿は１０mM塩酸２
０mlで溶解し、２０mM酢酸ナトリウムバッファーpH５.
６に対し透析した。この溶液を予め２０mM酢酸ナトリウ
ムバッファーpH５.６で洗浄したワットマン社製陽イオ
ン交換体ＣＭ５２カラム（１.６cmφ×１０cm）に吸着
させ、２０mM酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５.６で洗
浄後、流速０.５ml／minで同液から１Ｍ食塩を含む同バ
ッファーへの１００分間の直線グラディエントにより溶
出した。以上の操作で得られたヒトグリセンチン融合蛋
白質のＨＰＬＣのクロマトグラムを図５に示す。図５中
の１５.５２分に現れているピークがヒトグリセンチン
融合蛋白質である。１２.０７分に出現しているピーク
は、融合蛋白質のカラムへの非特異な吸着を抑えるため
にサンプル中に添加したβメルカプトエタノールのピー
クである。ＨＰＬＣの分析条件は次の通りである。カラ
ム：ジーエルサイエンス社製イナートシルＯＤＳ１０mm
φ×２５０mm、溶出条件：２０％アセトニトリル１０mM
塩酸から４０％アセトニトリル１０mM塩酸へ２０分間の
グラディエント溶出、流速：２ml／min、検出：紫外吸
収２２０nm。また精製標品のＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分析結果を図６に示す、図６中のレ
ーン１は抽出液そのものを負荷した。レーン３は上記方
法により精製した融合蛋白質を負荷した。
Ｅバッファーで懸濁し、超音波破砕した。遠心分離（２
５０００×Ｇ，１０分間）により上清を取り、この上清
を予めＧＡＥバッファーで洗浄しておいたチオプロピル
セファロース６Ｂカラム（１cmφ×６.４cm）に３ml／h
rの流速で負荷した。カラムはＧＡＥバッファー１００m
l、ＡＥＳバッファー１００ml、ＴＥＳバッファー１０
０mlで順次洗浄し、５０mMジチオスレイトールを含むＴ
ＥＳバッファーで１０ml／hrの流速で溶出した。溶出画
分は５０％飽和硫酸アンモニウムを添加し、ヒトグリセ
ンチン融合蛋白質を沈殿せしめた。沈殿は１０mM塩酸２
０mlで溶解し、２０mM酢酸ナトリウムバッファーpH５.
６に対し透析した。この溶液を予め２０mM酢酸ナトリウ
ムバッファーpH５.６で洗浄したワットマン社製陽イオ
ン交換体ＣＭ５２カラム（１.６cmφ×１０cm）に吸着
させ、２０mM酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５.６で洗
浄後、流速０.５ml／minで同液から１Ｍ食塩を含む同バ
ッファーへの１００分間の直線グラディエントにより溶
出した。以上の操作で得られたヒトグリセンチン融合蛋
白質のＨＰＬＣのクロマトグラムを図５に示す。図５中
の１５.５２分に現れているピークがヒトグリセンチン
融合蛋白質である。１２.０７分に出現しているピーク
は、融合蛋白質のカラムへの非特異な吸着を抑えるため
にサンプル中に添加したβメルカプトエタノールのピー
クである。ＨＰＬＣの分析条件は次の通りである。カラ
ム：ジーエルサイエンス社製イナートシルＯＤＳ１０mm
φ×２５０mm、溶出条件：２０％アセトニトリル１０mM
塩酸から４０％アセトニトリル１０mM塩酸へ２０分間の
グラディエント溶出、流速：２ml／min、検出：紫外吸
収２２０nm。また精製標品のＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分析結果を図６に示す、図６中のレ
ーン１は抽出液そのものを負荷した。レーン３は上記方
法により精製した融合蛋白質を負荷した。
【００３３】精製標品をペプチドシーケンサーにかけて
アミノ末端側の１３アミノ酸残基の配列を調べたとこ
ろ、配列はＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｓ
ｅｒ−Ｌｅｕ−・・・・・・であり、天然型グリセンチンのア
ミノ末端に目的とする１０残基のアミノ酸配列が付加し
た融合型グリセンチンであった。
アミノ末端側の１３アミノ酸残基の配列を調べたとこ
ろ、配列はＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｓ
ｅｒ−Ｌｅｕ−・・・・・・であり、天然型グリセンチンのア
ミノ末端に目的とする１０残基のアミノ酸配列が付加し
た融合型グリセンチンであった。
【００３４】実施例５ Ｇ６６２由来ヒトグリセンチン融合蛋白質の精製 湿潤重量で５ｇの上記Ｇ６４７培養菌体を３０mlのＧＡ
Ｅバッファーで懸濁し、超音波破砕した。遠心分離（２
５０００×Ｇ，１０分間）により上清を取り、この上清
を予めＧＡＥバッファーで洗浄しておいたチオプロピル
セファロース６Ｂカラム（１cmφ×６.４cm）に３ml／h
rの流速で負荷した。カラムはＧＡＥバッファー１００m
l、ＡＥＳバッファー１００ml、ＴＥＳバッファー１０
０mlで順次洗浄し、５０mMジチオスレイトールを含むＴ
ＥＳバッファーで１０ml／hrの流速で溶出した。溶出画
分は５０％飽和硫酸アンモニウムを添加し、ヒトグリセ
ンチン融合蛋白質を沈殿せしめた。沈殿は１０mM塩酸２
０mlで溶解し、２０mM酢酸ナトリウムバッファーpH６.
５に対し透析した。この溶液を予め２０mM酢酸ナトリウ
ムバッファーpH６.５で洗浄したワットマン社製陽イオ
ン交換体ＣＭ５２カラム（１.６cmφ×１０cm）に吸着
させ、２０mMリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６.５で
洗浄後、流速０.５ml／minで同液から１Ｍ食塩を含む同
バッファーへの１００分間の直線グラディエントにより
溶出した。以上の操作で得られたヒトグリセンチン融合
蛋白質のＨＰＬＣのクロマトグラムを図７に示す。図７
中の１５.５５分に現れているピークがヒトグリセンチ
ン融合蛋白質である。１２.１４分に出現しているピー
クは、融合蛋白質のカラムへの非特異な吸着を抑えるた
めにサンプル中に添加したβメルカプトエタノールのピ
ークである。ＨＰＬＣの分析条件は実施例４に示した方
法を用いた。精製標品のＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動による分析結果を図６に示す。図６中のレーン
２は抽出液を負荷した。
Ｅバッファーで懸濁し、超音波破砕した。遠心分離（２
５０００×Ｇ，１０分間）により上清を取り、この上清
を予めＧＡＥバッファーで洗浄しておいたチオプロピル
セファロース６Ｂカラム（１cmφ×６.４cm）に３ml／h
rの流速で負荷した。カラムはＧＡＥバッファー１００m
l、ＡＥＳバッファー１００ml、ＴＥＳバッファー１０
０mlで順次洗浄し、５０mMジチオスレイトールを含むＴ
ＥＳバッファーで１０ml／hrの流速で溶出した。溶出画
分は５０％飽和硫酸アンモニウムを添加し、ヒトグリセ
ンチン融合蛋白質を沈殿せしめた。沈殿は１０mM塩酸２
０mlで溶解し、２０mM酢酸ナトリウムバッファーpH６.
５に対し透析した。この溶液を予め２０mM酢酸ナトリウ
ムバッファーpH６.５で洗浄したワットマン社製陽イオ
ン交換体ＣＭ５２カラム（１.６cmφ×１０cm）に吸着
させ、２０mMリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６.５で
洗浄後、流速０.５ml／minで同液から１Ｍ食塩を含む同
バッファーへの１００分間の直線グラディエントにより
溶出した。以上の操作で得られたヒトグリセンチン融合
蛋白質のＨＰＬＣのクロマトグラムを図７に示す。図７
中の１５.５５分に現れているピークがヒトグリセンチ
ン融合蛋白質である。１２.１４分に出現しているピー
クは、融合蛋白質のカラムへの非特異な吸着を抑えるた
めにサンプル中に添加したβメルカプトエタノールのピ
ークである。ＨＰＬＣの分析条件は実施例４に示した方
法を用いた。精製標品のＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動による分析結果を図６に示す。図６中のレーン
２は抽出液を負荷した。
【００３５】レーン４は上記方法により精製した融合蛋
白質を負荷した。図６に示したように抽出液よりわずか
２工程でほとんど純化されたことがわかる。実施例４で
示した方法で精製した融合蛋白質と比較するとＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動での結果はあまり変わら
ないがＨＰＬＣでの結果はヒトグリセンチン融合蛋白質
の後に現れる不純物のピークが実施例５の方法では殆ど
確認されないが、実施例４の方法では少量確認される。
白質を負荷した。図６に示したように抽出液よりわずか
２工程でほとんど純化されたことがわかる。実施例４で
示した方法で精製した融合蛋白質と比較するとＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動での結果はあまり変わら
ないがＨＰＬＣでの結果はヒトグリセンチン融合蛋白質
の後に現れる不純物のピークが実施例５の方法では殆ど
確認されないが、実施例４の方法では少量確認される。
【００３６】精製標品をペプチドシーケンサーにかけて
アミノ末端側の１３アミノ酸残基の配列を調べたとこ
ろ、配列はＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓ
ｅｒ−Ｌｅｕ−・・・・・・であり、天然型グリセンチンのア
ミノ末端に目的とする１０残基のアミノ酸配列が付加し
た融合型グリセンチンであった。
アミノ末端側の１３アミノ酸残基の配列を調べたとこ
ろ、配列はＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓ
ｅｒ−Ｌｅｕ−・・・・・・であり、天然型グリセンチンのア
ミノ末端に目的とする１０残基のアミノ酸配列が付加し
た融合型グリセンチンであった。
【００３７】実施例６ ヒトグリセンチン融合蛋白質の不用部分の除去 実施例４および５で示したヒトグリセンチン融合蛋白質
を次のカテプシンＣ反応条件で酵素消化した。酵素消化
後の低分子物質を除去するために、５０％飽和硫酸アン
モニウムを添加し、蛋白質を沈殿せしめた。
を次のカテプシンＣ反応条件で酵素消化した。酵素消化
後の低分子物質を除去するために、５０％飽和硫酸アン
モニウムを添加し、蛋白質を沈殿せしめた。
【００３８】 カテプシンＣ反応条件 組成 基質 ヒトグリセンチン融合蛋白質５mg ５ml インヒビター ２５mMロイペプチン ０.０１ml 還元剤 １Ｍシステイン ０.０６ml バッファー ０.５Ｍ ＮａＡｃｏ pH５.０ ０.０５Ｍ ＮａＣｌ １.０ml 酵素 ウシカテプシンＣ ０.５Unit ０.０２５ml 蒸留水 ３.９０５ml 反応 温度 ２５℃ 時間 ３時間 ロイペプチン、ウシカテプシンＣはベーリンガーマンハ
イム山之内社製の物を使用した。
イム山之内社製の物を使用した。
【００３９】実施例７ ヒトグリセンチンの精製 実施例６に示した沈殿物をＡＥＳバッファー５０ｍｌに
溶解し、チオプロピルセファロース６Ｂカラム（１cmφ
×３cm）に付加した。通過画分とＡＥＳバッファー洗浄
画分を合わせ、Ｃ１８逆相系ＨＰＬＣ（クロマト条件は
実施例４と同）に負荷し、ヒトグリセンチン画分を分取
し混在する不純物を除去した。ヒトグリセンチン画分は
凍結乾燥して精製標品とした。精製標品のＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動による分析結果を図６に示
す。レーン５が実施例４の融合蛋白質を消化して得た精
製標品である。レーン６が実施例５の融合蛋白質を消化
して得た精製標品である。また精製標品のＨＰＬＣによ
る分析結果を図８および９に示す。分析条件は実施例４
に示したものと同一である。図８は実施例４由来の、ま
た図９は実施例５由来のヒトグリセンチンを精製したも
ののクロマトグラムである。かくしてＨＰＬＣによる分
析も電気泳動による分析もヒトグリセンチンは完全に純
化されたことを示している。
溶解し、チオプロピルセファロース６Ｂカラム（１cmφ
×３cm）に付加した。通過画分とＡＥＳバッファー洗浄
画分を合わせ、Ｃ１８逆相系ＨＰＬＣ（クロマト条件は
実施例４と同）に負荷し、ヒトグリセンチン画分を分取
し混在する不純物を除去した。ヒトグリセンチン画分は
凍結乾燥して精製標品とした。精製標品のＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動による分析結果を図６に示
す。レーン５が実施例４の融合蛋白質を消化して得た精
製標品である。レーン６が実施例５の融合蛋白質を消化
して得た精製標品である。また精製標品のＨＰＬＣによ
る分析結果を図８および９に示す。分析条件は実施例４
に示したものと同一である。図８は実施例４由来の、ま
た図９は実施例５由来のヒトグリセンチンを精製したも
ののクロマトグラムである。かくしてＨＰＬＣによる分
析も電気泳動による分析もヒトグリセンチンは完全に純
化されたことを示している。
【００４０】精製したヒトグリセンチンが目的どおりの
アミノ酸配列を保持しているかどうかを確認した。実施
例７で示した方法により精製したヒトグリセンチンをリ
シルエンドペプチダーゼで切断し、逆相系ＨＰＬＣで５
本のフラグメントピークを分取した。各フラグメントの
アミノ酸配列をペプチドシーケンサーを用い解析したと
ころ、天然型ヒトグリセンチンの全構造を保持している
ことが確認された。切断、分取、解析の方法は文献（消
化管ホルモン研究会編集、消化管ホルモンXI、３９４頁
〜４０１頁（１９９２））記載の方法に従った。
アミノ酸配列を保持しているかどうかを確認した。実施
例７で示した方法により精製したヒトグリセンチンをリ
シルエンドペプチダーゼで切断し、逆相系ＨＰＬＣで５
本のフラグメントピークを分取した。各フラグメントの
アミノ酸配列をペプチドシーケンサーを用い解析したと
ころ、天然型ヒトグリセンチンの全構造を保持している
ことが確認された。切断、分取、解析の方法は文献（消
化管ホルモン研究会編集、消化管ホルモンXI、３９４頁
〜４０１頁（１９９２））記載の方法に従った。
【００４１】実施例８ Ｇ６４７由来ヒトグリセンチン融合蛋白質とＧ６６２融
合ヒトグリセンチン融合蛋白質のシステイン残基の反応
性の比較 実施例４および５で示した方法により精製したＧ６４７
由来ヒトグリセンチン融合蛋白質、Ｇ６６２由来ヒトグ
リセンチン融合蛋白質をそれぞれ、ＧＡＥバッファー中
で１mlのチオプロピルセファロース６Ｂに飽和するまで
吸着させ、１mlの担体に最大で何mgの融合蛋白質が吸着
できるかを比較した。吸着した融合蛋白質は実施例４に
記載した方法で溶出し、ＨＰＬＣの積分値から融合蛋白
質の量を算出した。結果はＧ６４７由来の融合蛋白質が
４.８mg／mlゲル、Ｇ６６２由来の融合蛋白質が１１.０
mg／mlゲルの吸着量を示し、システイン残基の前後に塩
基性のアミノ酸のない、Ｇ６６２の場合の方がシステイ
ンの反応性が高いことが示された。
合ヒトグリセンチン融合蛋白質のシステイン残基の反応
性の比較 実施例４および５で示した方法により精製したＧ６４７
由来ヒトグリセンチン融合蛋白質、Ｇ６６２由来ヒトグ
リセンチン融合蛋白質をそれぞれ、ＧＡＥバッファー中
で１mlのチオプロピルセファロース６Ｂに飽和するまで
吸着させ、１mlの担体に最大で何mgの融合蛋白質が吸着
できるかを比較した。吸着した融合蛋白質は実施例４に
記載した方法で溶出し、ＨＰＬＣの積分値から融合蛋白
質の量を算出した。結果はＧ６４７由来の融合蛋白質が
４.８mg／mlゲル、Ｇ６６２由来の融合蛋白質が１１.０
mg／mlゲルの吸着量を示し、システイン残基の前後に塩
基性のアミノ酸のない、Ｇ６６２の場合の方がシステイ
ンの反応性が高いことが示された。
【００４２】
配列番号：１ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GATCCTTAGC GTAGGCCTT
【００４３】配列番号：２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GATCAAGGCC TACGCTAAG
【００４４】配列番号：３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GGATCCTTAG CGTAGGCCT
【００４５】配列番号：４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CATGGCCCGG GACAGCACA
【００４６】配列番号：５ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： AGCTTGTGCT GTCCCGGGC
【００４７】配列番号：６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CCATGGCCCG GGACAGCAAG CTT
【００４８】配列番号：７ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： AATTCAGATC TATCGAAGGT CGACGTTCTC TGCA
【００４９】配列番号：８ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GAGAACGTCG ACCTTCGATA GACTG
【００５０】配列番号：９ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GAATTCAGAT CTATCGAAGG TCGACGTTCT CTGCAG
【００５１】配列番号：１０ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： TATGGCTAGC ATGACTGGTG GACAGCAAAT GTGTCGTTCC CTGCA
【００５２】配列番号：１１ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GGGAACGACA CATTTGCTGT CCACCAGTCA TGCTAGCCA
【００５３】配列番号：１２ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： TATGGCTAGC ATGACTGGTC GTCAGCAATG TGGTCGTTCC CTGCA
【００５４】配列番号：１３ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GGGAACGACC ACATTGCTGA CGACCAGTCA TGCTAGCCA
【図１】プラスミドｐＧＬ１２５の構築過程を示す図。
【図２】プラスミドｐＧＬ１４４の構築過程を示す図。
【図３】プラスミドｐＧＬ１４７の構築過程を示す図。
【図４】プラスミドｐＧＬ１４９の構築過程を示す図。
【図５】Ｇ６４７由来のヒトグリセンチン融合蛋白質の
ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図６】ヒトグリセンチン融合蛋白質などを含む試料の
電気泳動パターンを示す写真。
電気泳動パターンを示す写真。
【図７】Ｇ６６２由来のヒトグリセンチン融合蛋白質の
ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図８】実施例４由来の精製ヒトグリセンチンのＨＰＬ
Ｃクロマトグラムを示す。
Ｃクロマトグラムを示す。
【図９】実施例５由来の精製ヒトグリセンチンのＨＰＬ
Ｃクロマトグラムを示す。
Ｃクロマトグラムを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (3)
- 【請求項１】 ヒトグリセンチンのＮ末端に付加ペプチ
ドが結合した融合蛋白質を組換え遺伝子技術により生産
し、得られた融合蛋白質から付加ペプチドをカテプシン
Ｃを用いて切断または分解して天然型ヒトグリセンチン
を製造するに当たり、前記付加ペプチドのアミノ酸数が
偶数であり、ヒトグリセンチンのＮ末端から融合蛋白質
のＮ末端へ数えて１番目および／または２番目にシステ
インが含まれる融合蛋白質を用い、前記融合蛋白質およ
びヒトグリセンチンの精製を該システイン残基とジスル
フィド結合を形成し得るクロマトグラフィーを利用して
行うことを特徴とするヒトグリセンチンの製造方法。 - 【請求項２】 前記付加ペプチドのアミノ酸がヒトグリ
センチンのＮ末端から融合蛋白質のＮ末端へ数えて奇数
番目に１個または複数個のアルギニンおよび／またはリ
ジンが含まれる融合蛋白質を用いる請求項１に記載のヒ
トグリセンチンの製造方法。 - 【請求項３】 前記付加ペプチドのアミノ酸がヒトグリ
センチンのＮ末端から融合蛋白質のＮ末端へ数えて５番
目にアルギニンまたはリジンが含まれる融合蛋白質を用
いる請求項１に記載のヒトグリセンチンの製造方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5349030A JP2887063B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | グリセンチンの製造方法 |
| EP94309675A EP0662482B1 (en) | 1993-12-28 | 1994-12-22 | Process for preparation of human glicentin |
| DE69416663T DE69416663T2 (de) | 1993-12-28 | 1994-12-22 | Verfahren zur Herstellung von menschlichem Glicentin |
| KR1019940037122A KR950018050A (ko) | 1993-12-28 | 1994-12-27 | 사람 글리센틴의 제조방법 |
| US08/365,109 US5641646A (en) | 1993-12-28 | 1994-12-28 | Process for preparation of human glicentin |
| CA002139155A CA2139155A1 (en) | 1993-12-28 | 1994-12-28 | Process for preparation of human glicentin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5349030A JP2887063B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | グリセンチンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07184682A JPH07184682A (ja) | 1995-07-25 |
| JP2887063B2 true JP2887063B2 (ja) | 1999-04-26 |
Family
ID=18401020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5349030A Expired - Fee Related JP2887063B2 (ja) | 1993-12-28 | 1993-12-28 | グリセンチンの製造方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0662482B1 (ja) |
| JP (1) | JP2887063B2 (ja) |
| KR (1) | KR950018050A (ja) |
| CA (1) | CA2139155A1 (ja) |
| DE (1) | DE69416663T2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5702922A (en) * | 1994-11-29 | 1997-12-30 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Method for the extraction of glicentin or glicentin analogous substances |
| US7666627B2 (en) * | 2002-08-08 | 2010-02-23 | Targetex Kft. | Folded recombinant catalytic fragments of multidomain serine proteases, preparation and uses thereof |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5126249A (en) * | 1989-05-09 | 1992-06-30 | Eli Lilly And Company | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence |
| DE4002636A1 (de) * | 1990-01-30 | 1991-08-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Expression von hiv1- und 2-polypeptiden und deren verwendung |
| JPH04364199A (ja) * | 1990-08-15 | 1992-12-16 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | ヒト型グリセンチンの合成遺伝子 |
| JPH05160977A (ja) * | 1991-12-06 | 1993-06-25 | Brother Ind Ltd | 変調装置 |
| CA2099476A1 (en) * | 1992-07-13 | 1994-01-14 | Akira Ohneda | Medicaments comprising glicentin as active ingredient |
| JP2961045B2 (ja) * | 1993-02-24 | 1999-10-12 | 日清製粉株式会社 | 腸管粘膜増強促進剤 |
-
1993
- 1993-12-28 JP JP5349030A patent/JP2887063B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-12-22 DE DE69416663T patent/DE69416663T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-22 EP EP94309675A patent/EP0662482B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-27 KR KR1019940037122A patent/KR950018050A/ko not_active Application Discontinuation
- 1994-12-28 CA CA002139155A patent/CA2139155A1/en not_active Abandoned
- 1994-12-28 US US08/365,109 patent/US5641646A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5641646A (en) | 1997-06-24 |
| DE69416663D1 (de) | 1999-04-01 |
| EP0662482B1 (en) | 1999-02-24 |
| KR950018050A (ko) | 1995-07-22 |
| JPH07184682A (ja) | 1995-07-25 |
| DE69416663T2 (de) | 1999-07-29 |
| CA2139155A1 (en) | 1995-06-29 |
| EP0662482A1 (en) | 1995-07-12 |
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|---|---|---|---|
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