JP2518732B2

JP2518732B2 - α―サルシン遺伝子

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Publication number: JP2518732B2
Application number: JP2244181A
Authority: JP
Inventors: 靖郎名取; 達三岡; 弥重太遠藤
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-02-22
Filing date: 1990-09-14
Publication date: 1996-07-31
Anticipated expiration: 2011-07-31
Also published as: JPH03266986A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はα−サルシンを発現する遺伝子、より詳しく
はα−サルシンを遺伝子工学的手法により製造するため
の、α−サルシンをコードする遺伝子（cDNA）とその発
現のためのシグナルペプチドをコードする遺伝子との組
合せ（以下これを「α−サルシン遺伝子」又は「本発明
遺伝子」という）に関する。

従来技術とその課題 α−サルシンとは、1965年にオルソンらによって、か
びの一種であるアスペルギルス・ギガンテウス（Asperg
illus giganteus、以下「Asp.G.」と記す）から抗肉腫
因子として分離された分子量約17000の蛋白質である［A
pp.Microbiol.,13,314（1965）;App.Microbiol.,13,322
（1965）］。該α−サルシンのアミノ酸一次配列は、サ
ッコーらによって下記式（１）に示される通り、150個
のアミノ酸から構成されるものであることが解明されて
いる［J.Biol.Chem.,2585811（1983）］。

式（１）： Ala−Val−Thr−Trp−Thr−Cys−Leu−Asn−Asp−Gln− Lys−Asn−Pro−Lys−Thr−Asn−Lys−Tyr−Glu−Thr− Lys−Arg−Leu−Leu−Tyr−Asn−Gln−Asn−Lys−Ala− Glu−Ser−Asn−Ser−His−His−Ala−Pro−Leu−Ser− Asp−Gly−Lys−Thr−Gly−Ser−Ser−Tyr−Pro−His−
Trp−Phe−Thr−Asn−Gly−Tyr−Asp−Gly−Asp−Gly− Lys−Leu−Pro−Lys−Gly−Arg−Thr−Pro−Ile−Lys− Phe−Gly−Lys−Ser−Asp−Cys−Asp−Arg−Pro−Pro− Lys−His−Ser−Lys−Asp−Gly−Asn−Gly−Lys−Thr− Asp−His−Tyr−Leu−Leu−Glu−Phe−Pro−Thr−Phe− Pro−Asp−Gly−His−Asp−Tyr−Lys−Phe−Asp−Ser− Lys−Lys−Pro−Lys−Glu−Asn−Pro−Gly−Pro−Ala− Arg−Val−Ile−Tyr−Thr−Tyr−Pro−Asn−Lys−Val− Phe−Cys−Gly−Ile−Ala−His−Thr−Lys−Glu− Asn−Gln−Gly−Glu−Leu−Lys−Leu−Cys−Ser−His その後の研究の結果、上記α−サルシンは独特なRNA
分解酵素であり、有核細胞リボソーム大亜粒子を構成す
る28SrRNAのG4325とA4326間のリン酸ジエステル結合を
加水分解することにより、リボソームを不活性化するこ
とが明らかにされた［J.Biol.Chem.,257,9054（1982）;
J.Biol.Chem.,258,2662（1983）］。

更に、α−サルシンはウイルス感染細胞の蛋白質合成
を特異的に抑制する作用を有することも報告されている
［Cell,20,769（1980）］。

之等の報告からも判るように、上記α−サルシンは抗
癌剤、抗ウィルス剤等の幅広い用途を持つ極めて有望な
物質とされ、その医薬品としての開発が待ち望まれてい
る。

しかして、上記α−サルシンは、従来よりその起源生
物であるAsp.G.の培養液より抽出する方法［例えば米国
特許第3104204号明細書;App.Microbiol.,13,114（196
5）］により専ら製造されている。しかるに、この製造
法では（１）起源生物の目的物質分泌が微弱である、（２）培養液からの目的物質の単離作業が非常に複雑で
手間がかかる、（３）純度の高いものが得られにくい等の種々の問題があり、せいぜい実験用試料程度の微量
しか目的物質を収得できず、その工業レベルへの応用は
極めてコストの高いものとならざるを得ない欠点があ
る。

上記抽出法に代わって、遺伝子組換え技術を利用して
上記α−サルシンを製造しようとする試みも一部研究さ
れつつあるが、起源生物のα−サルシン遺伝子自体、い
まだ解明されていない現状にあり、上記遺伝子工学的手
法による製造技術は実質的に進んでおらず、まず上記天
然のα−サルシン遺伝子の塩基配列、殊にそのcDNA配列
の解明が急務とされている。

課題を解決するための手段本発明者らは、上記現状に鑑み鋭意研究を重ねた結
果、ある種の手法を利用して、Asp.G.よりα−サルシン
遺伝子のmRNAを単離するに成功し、引き続き上記mRNAに
対応する所望のcDNA塩基配列の決定に成功した。更に、
本発明者らは、上記α−サルシンが起源細胞内では特定
のシグナルペプチドを有する前駆体の形で発現すること
を見出だし、このシグナルペプチドのアミノ酸配列及び
その対応塩基配列の決定にも成功し、ここに本発明を完
成するに至った。

即ち、本発明によれば下記式（1A）の塩基配列で示さ
れるα−サルシンの構造遺伝子（cDNA）と共に、下記式
（２）のアミノ酸配列で示されるシグナルペプチドをコ
ードする塩基配列を含むことを特徴とするα−サルシン
遺伝子が提供される。

式（1A）： GCG GTG ACC TGG ACC TGC TTG AAC GAC CAG AAG AAC CCC AAG ACC AAC AAG TAT GAG ACC AAA CGC CTC CTC TAC AAC CAG AAC AAG GCC GAG AGC AAC TCG CAC CAT GCG CCT CTC TCC GAC GGC AAG ACC GGG AGC AGC TAT CCT CAC TGG TTC ACC AAC GGT TAT GAT GGC GAT GGA AAG CTC CCC AAG GGC CGC ACG CCC ATC AAG TTC GGA AAA TCC GAC TGT GAC CGT CCT CCC AAG CAC AGC AAG GAC GGA AAC GGC AAG ACT GAT CAC TAC CTG CTG GAG TTC CCA ACC TTC CCT GAT GGC CAT GAC TAC AAG TTT GAT TCG AAG AAG CCC AAG GAA AAT CCT GGC CCG GCG CGG GTC ATC TAC ACC TAT CCT AAC AAG GTG TTC TGT GGT ATC ATT GCT CAT ACT AAG GAG AAC CAG GGC GAA CTT AAG CTC TGC TCT CAT TAG 式（２）： Met−Val−Ala−Ile−Lys−Asn−Leu−Val−Leu−Val− Ala−Leu−Thr−Ala−Val−Thr−Ala−Leu−Ala−Val− Pro−Ser−Pro−Leu−Glu−Ala−Arg− 本発明のα−サルシン遺伝子の好ましい一具体例とし
ては、下記式（1B）に示される塩基配列を有するものを
例示できる。尚、式（1B）には対応するアミノ酸配列を
も併記する。

式（1B）：上記各式及びその他の本明細書におけるアミノ酸一次
配列及びアミノ酸残基の略号による表示並びに塩基配列
及び核酸塩基、その他の略号による表示は、いずれもIU
PAC−IUBの規定乃至当該分野における慣用記号に従うも
のとし、その例を次に挙げる。

Ala…アラニン Arg…アルギニン Asn…アスパラギン Asp…アスパラギン酸 Cys…システイン Gln…グルタミン Glu…グルタミン酸 Gly…グリシン His…ヒスチジン Ile…イソロイシン Leu…ロイシン Lys…リジン Met…メチオニン Phe…フェニルアラニン Pro…プロリン Ser…セリン Thr…スレオニン Trp…トリプトファン Tyr…チロシン Val…バリン A …アデニン T …チミン G …グアニン C …シトシン以下、本発明α−サルシン遺伝子のクローン化とその
塩基配列決定法につき概略を述べる。

1.mRNAの単離約−80℃に冷却したAsp.G.の過物をグアニジウムチ
オシアネート等と共に手早くホモジナイズし、その遠心
上澄みより全RNAを抽出し、オリゴ（DT）セルロースカ
ラムを通してポリＡを有するmRNA画分を分取する。

2.cDNAの調製上記1.で得られたmRNAに、市販の逆転写酵素及びDNA
合成酵素（DNAポリメラーゼＩ、T4DNAポリメラーゼ等、
アマーシャム社、宝酒造社等）を作用させて二重鎖cDNA
を得る。次に、EcoRIリンカー、Hind IIIリンカー等の
適当なリンカーを、該二重鎖cDNAの両端に付加して、組
み込み可能な形とする。

3.目的cDNAの選別上記2.で得られたcDNAをバクテリオファージλ、pBR3
22プラスミド等の適当なベクターに組み込んだ後、大腸
菌y1090（r^-）株等の適当な菌株に形質転換させる。目
的とするcDNAを含むコロニーの選別は、α−サルシン抗
体との免疫反応を利用して行なわれるが、これに限定さ
れるハイブリダイゼーション法等も適用できる。

4.塩基配列の決定上記により得られる目的のcDNAは、サンガー法、マク
サム−ギルバート法等の公知の手段により、その塩基配
列を決定できる。

かくして、本発明のα−サルシン遺伝子を収得でき
る。

本発明のα−サルシン遺伝子は、これに更にプロモー
ター等の核遺伝子の発現に必要な各種の調節因子を連結
させる処理等を行なうことにより、α−サルシン発現ベ
クターとすることができ、該ベクターの利用によれば適
当な宿主細胞を形質転換させて該宿主細胞によるα−サ
ルシンの生産を行なうことができ、かくして、遺伝子工
学的手法によるα−サルシンの大量生産技術が確立され
る。殊に前記式（1B）に記載のDNA配列を有する本発明
遺伝子の利用によれば、非活性形の前駆体でα−サルシ
ンを発現させることが可能であり、これによれば、α−
サルシンが細胞毒として働くような宿主の利用によって
も、所望のα−サルシンの発現が可能であり、この場合
得られる前駆体を適当な方法で処理してシグナルペプチ
ド部分を加水分解することにより、目的とするα−サル
シンを効率よく且つ大量に製造できる。

かくして得られる組換え型α−サルシンは、天然型α
−サルシンと同様に、抗癌剤、抗ウイルス剤等の医薬品
として巾広い用途に有効利用できる。

本発明遺伝子を導入してなる上記α−サルシン発現ベ
クターの構築に際しては、遺伝子組換え技術における通
常の操作、方法等を採用できる。これには各種制限酵
素、S1ヌクレアーゼ等によるDNAの切断処理、T4DNAリガ
ーゼ等を用いたDNAの連結処理、アガロースゲル電気泳
動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等によるDNA
の単離、精製処理、フェノール抽出法等によるDNAの回
収、精製処理等が包含される。またプラスミドベクター
が宿主細胞中に存在することの確認は、アルカリ−SDS
抽出法〔H.C.Birnboim,and J.Doly,Nucleic Acids Re
s.,７,1513（1979）〕等に従いプラスミドDNAを分取
後、種々の制限酵素で処理し、之等制限酵素認識部位の
存在の有無乃至生成DNA断片の長さを検討することによ
り行ない得る。更に例えば遺伝子の塩基配列を直接ダイ
デオキシ法〔F.Sanger,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.
S.A.,74,5463（1977）〕等で解析することによっても上
記確認を行ない得る。尚、組換え体の構築のために利用
される起源ベクターとしては、pBR322やこれに由来する
各種プラスミドベクターが好適であるが、特に之等に限
定されず従来公知の各種のもの、例えばバクテリオファ
ージ及び動植物ウィルスを含む各種ウィルスベクター、
各種プラスミド、コスミド等であってもよい。

本発明遺伝子を保有するベクターは、これを導入して
得られる形質転換体が目的のα−サルシンを発現するた
めに、本発明遺伝子の他に、その発現に必要な各種の調
節因子、例えばプロモーター、転写終結信号、ポリＡ鎖
付加信号（真核細胞を宿主細胞とする場合）等の転写の
ための因子やリボゾーム結合部位等の翻訳のための因子
等を有する必要がある。かかる調節因子は宿主細胞に応
じてそれぞれよく知られており、例えばプロモーターと
しては、大腸菌においてtrpプロモーター、lacプロモー
ター、recＡプロモーター、λP_L プロモーター、lppプロ
モーター、tacプロモーター等、枯草菌においてはSP01
プロモーター、SP02プロモーター、penプロモーター
等、酵母その他の真核細胞においてはPH05プロモーター
PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHIプロモータ
ー、SV40由来プロモーター等を例示できる。之等調節因
子は、発現ベクターの構築に当り、之等を含むプラスミ
ドを選択して起源ベクターとすることにより、又は之等
を含むプラスミドから常法に従い単離するか化学合成し
た後、適当なベクターに組込むことにより、それぞれベ
クターに存在さえ得、かくして所望のαーサルシン発現
ベクターを収得できる。大腸菌を宿主細胞とする場合、
上記発現系ベクターには、目的とするα−サルシンを菌
体内に直接発現させる系及びペリプラズム層に分泌発現
させる系の両者が包含される。

上記において用いられる宿主細胞としては、特に限定
はなく、例えば大腸菌等のグラム陰性細菌、枯草菌等の
グラム陽性細菌、放線菌、酵母、動植物細胞等のいずれ
でもよいが、特に大腸菌が好ましく、その中でもK12株
由来のHB101株〔H.W.Boyer and D.Roulland−Dussoix.,
J.Mol.Biol.,41459（1969）〕及びJM103株〔J.Messing
et al.,Nucleic Acids Res.,９,309（1981）〕は好まし
い。

上記宿主細胞への発現ベクターの導入、これによる形
質転換法としては、一般に用いられている方法、例えば
宿主細胞を低温で塩化カルシウムを含む水溶液中で処理
し、該溶液中たベクターを添加する方法〔E.Lederberg
and S.Cohen,J.Bacteriol.,119,1072（1974）〕等を例
示できる。

上記形質転換体は、通常の細胞培養用培地を用いて培
養できる。該培養に利用できる培地としては、例えばＬ
−broth培地、Ｅ培地、Ｍ−９倍等を例示できる。ま之
等の培地には更に通常知られている各種の炭素源、窒素
源、無機塩、ビタミン類、天然物抽出物、生理活性物質
等を添加することもできる。培養は宿主細胞の生育に適
したpH、温度、通気、撹拌等の条件を採用した各種方法
により実施できる。例えば大腸菌の場合、pH約５〜８の
範囲、特にpH7が適当であり、約20〜43℃の温度で、通
気撹拌条件で培養するのが望ましい。尚、目的とする蛋
白質の発現量を高めるためや目的蛋白質の分泌を促進乃
至抑制するため等に応じて、上記培地組成や培養条件等
は適宜変更可能である。

かくして、生産、蓄積されるα−サルシンは、これを
常法に従い分離、精製できる。この分離、精製操作に
は、例えば浸透圧ショック法により調製したペリプラズ
ム層につき、ゲル過、吸着クロマトグラフイー、イオ
ン交換クロマトグラフイー、高速液体クロマトグラフイ
ー等を単独で又は適宜組合せて実施できる。特にペリプ
ラズム層中乃至培養上澄に分泌されるものは上記分離、
精製が比較的容易な利点がある。

本発明遺伝子の利用によれば、遺伝子組換え技術によ
り、α−サルシンを効率よく大量に製造でき、得られる
α−サルシンは例えば高速液体クロマトグラフィー（HP
LC）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE）等に
より確認でき、通常のポリペプチド乃至蛋白質の構造解
析と同様の手段、例えばSDS−PAGEによる分子量分析、
等電点電気泳動による等電点測定、アミノ酸分析機によ
るアミノ酸組成の測定、アミノ酸シークエンサーによる
アミノ酸配列の解析等によりその同定を行ない得る。

実施例以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げ
る。

実施例１ mRNAの調製グアニジウムチオシアネート・ホットフェノール法
［マニアティス（T.Maniatis）ら編、モレキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）、p194オールドスプ
リングハーバー（Cold Spring Harbor）刊、（1982）］
を改良し、mRNAを下記のごとく調製した。

即ち、50時間培養したAsp.G.を過して集めたマット
をすぐ液体窒素で凍結させ使用時まで−80℃に保存し
た。上記マット10gを4Mグアニジウムチオシアネート、5
0mMトリスHCl（pH7.6）、10mMエチレンジアミン四酢酸
（以下EDATAという、pH8.0）、２％ザルコシル及び20mM
β−メルカプトエタノールからなる溶液50ml中で素早く
破砕し可溶化させた。このホモジネートを5000×ｇ、４
℃で５分間遠心分離し、細胞破砕残渣を除去した。

上記遠心分離で得た上澄を60℃になるまでインキュベ
ート後、これに60℃まで熱したフェノール50mlを加え
た。更に22.5mlの２％酢酸カリウム（pH5.3）、22mMト
リスHCl（pH7.5）及び2.2mM EDTAを加え、これに150ml
のクロロホルム：イソアミルアルコール（24:1）を加え
て、60℃で15分間激しく攪拌した。氷冷後、10000×
ｇ、４℃で10分間遠心分離し、水層を回収した。再度フ
ェノール・クロロホルム抽出後、更にクロロホルムで１
回抽出し、水層を回収し、２倍量のエタノールを加えて
−20℃で２時間放置して、全RNAを沈殿させた。全RNAを
75％エタノールにて洗浄後、沈殿を乾燥した。次に20ml
の0.2％SDS、10mM EDTA、50mMNaCl及び100mMトリスHCl
（pH7.4）に溶解し、8mgのプロテイナーゼＫ（400μg/m
l）（ベーリンガーマンハイム社製）を加えて、37℃で
１時間インキュベート後、前述のフェノール・クロロホ
ルム抽出及びエタノール沈殿操作を繰り返した。全RNA
沈殿を10mlの蒸留水に溶解し、65℃で10分間インキュベ
ート後、これに140mMトリスHCl（pH7.6）、1M NaCl及び
2mM EDTAからなる溶液10mlを加えた。混合物を1mM EDT
A、20mMトリスHCl（pH7.6）及び0.5M NaClからなる溶液
（以下展開液という）で平衡化させたオリゴ（dT）セル
ロースカラム（ファルマシア社製）クロマトグラフィー
にかけ、ポリＡを有するmRNAを吸着させた。次にカラム
を展開液で充分洗浄後、蒸留水を用いて吸着したmRNAを
溶出させた。

上記により回収したポリＡを有するmRNA量は100μｇ
であった。

実施例２二重鎖cDNAの合成二重鎖cDNAを、アマーシャム社のcDNA合成システム・
プラスキットを用いて以下の通り合成した。

即ち、容量1.5mlの微量反応管にファーストストラン
ド合成反応用溶液４μｌ、ピロリン酸ナトリウム溶液１
μｌ、ヒト胎盤リボヌクレアーゼシンヒビター１μｌ、
デオキシヌクレオシド三リン酸混液２μｌ及びランダム
ヘキサヌクレオチドプライマー１μｌを順次加え、実施
例１で調製したmRNA1μｇ及び蒸留水を加えて全量を19
μｌとした。そこへ逆転写酵素20単位（１μｌ）を加
え、40℃で60分間インキュベートしてファーストストラ
ンドを合成した。

次に上記反応液にセカンドストランド合成用溶液37.5
μｌを加え、大腸菌リボヌクレアーゼH0.8単位、DNAポ
リメラーゼI23単位及び蒸留水を順次加えて全量を100μ
ｌとして12℃で60分間、22℃で60分間それぞれインキュ
ベートし、更にT4DNAポリメラーゼ２単位を加え、37℃
で10分間インキュベートして、セカンドストランドを合
成した。

反応溶液に0.25M EDTA（pH8.0）溶液４μｌを添加し
て合成反応を停止させた後、順次フェノール・クロロホ
ルム抽出及びエタノール沈殿を行なってDNAを回収し
た。

実施例３ cDNAのクローニング（１）二重鎖cDNAへのリンカーの付加実施例２で作成した二重鎖cDNAを80μMS−アデノシル
メチオニンからなる溶液19μｌに溶解し、EcoRIメチラ
ーゼ（宝酒造社製）20単位（１μｌ）を加えて37℃で１
時間反応させ、制限酵素EcoRI切断部位をメチル化して
保護した。

反応液を65℃で10分間インキュベートして酵素を失活
させた後、66mM MgCl₂、40mM DTT及び1mM ATPからなる
溶液３μｌを加え、更にEcoRIリンカー１μｇ、T4DNAリ
ガーゼ（宝酒造社製）５単位及び蒸留水を順次加えて全
量を30μｌとし、15℃で16時間ライゲーション（ligati
on）を行ない、二重鎖cDNAの両端にEcoRIリンカーを付
加した。

反応液を再び65℃で10分間インキュベートして酵素を
失活させた後、0.8MトリスHCl（pH7.5）、50mM MgCl₂、
0.5M NaCl及び0.1％BSAからなる溶液10μｌを添加し、
蒸留水及び制限酵素EcoRI（宝酒造社製）100単位を加え
て全量を100μｌとし、37℃で６時間EcoRI消化を行なっ
た。

得られた消化物を65℃で10分間インキュベートして酵
素を失活させた後、アガロースゲル（ハイオゲルＡ−50
m、100−200メッシュ、バイオラッド社製）カラムにか
けて未付加のリンカーを除去し、cDNAを回収した。

（２）cDNAライブラリーの作成バクテリオファージλDNAをクローニングベクターと
して用い、イン・ビトロ・パッケージング（in vitro p
ackaging）［コリンズ（J.Collins）ら、プロシィーデ
ィング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.），71,4242（1
978）；ホーン（B.Hohn）ら、メソズ・イン・エンザイ
モロジー（Methods in Enzymology），68,p299,アカデ
ミック・プレス（Academic Press）刊（1979）］により
cDNAライブラリーを以下の通り作成した。

バクテリオファージλgt11DNA［ヤング（R.A.Young）
ら、プロシィーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc,Natl.Acad.Sci.,U.S.
A.），80,1194（1983）］10μｇを、100mMトリスHCl（p
H7.5）、7mM MgCl²、50mM NaCl、7mMβ−メルカプトエ
タノール及び0.01％BSAからなる溶液100μｌに溶解し、
制限酵素EcoRI（宝酒造社製）30単位を加え、37℃で３
時間反応させ、λgt11DNA中のEcoRI部位で切断した。フ
ェノール・クロロホルム抽出後、エタノール沈殿により
DNAを回収し、50mMトリスHCl（pH8.0）溶液100μｌに溶
かし、アルカリホスファターゼ（宝酒造社製）１単位を
加え、37℃で１時間反応させてEcoRI切断部位の脱リン
化を行なった。脱リン化したλgt11DNAのEcoRI消化物
（以下「λgt11アーム」という）を、フェノール・クロ
ロホルム抽出後、エタノール沈殿により回収した。

前記（１）で調製したcDNA及び上記λgt11アーム0.5
μｇを、66mMトリスHCl（pH7.5）、6.6mM MgCl²、10mM
DTT及び0.1mM ATPからなる溶液に溶かし、これにT4DNA
リガーゼ（宝酒造社製）１単位を加えて16℃で16時間ラ
イゲーションを行なった。かくして得られた組換え体λ
DNA及び市販の試薬（インビトロパッケージングキッ
ト、アマーシャム社製）とから組換え体DNAを含むファ
ージを調製した。

実施例４抗体の作成 α−サルシン1.0mgを生理食塩水1mlに溶解し、等量の
アジュバンドと共に、９週齢のウサギ（2kg）に皮下注
射法により投与、免疫した。追加免疫を３週間間隔で２
回行なった。

試験採血を３週間間隔で行ない、オクテルロニー（Ou
chterlony）寒天拡散法［松橋直ら編、免疫学実験入
門、74頁、学会出版センター刊（1981）］により抗体価
を判定し、充分な力価が得られた時点で全血採血を行な
い、血清を分離して抗血清とした。

実施例５ α−サルシンcDNAを含む組換え体の選択ディビス（R.W.Davis）らの方法［グローバー（D.M.G
lover）編、DNAクローニング（DNA Cloningu）,p73,ア
イ・アール・エル・プレス（IRL Press）刊、（198
5）］に準じて、以下のごとく免疫学的スクリーニング
を行なった。

即ち、実施例３で得た組換え体DNAを含むファージ
（４×10³pfu）を、大腸菌y1090（r^-）株に感染させ、
トリプトファン8g/l、酵母エキス5g/l、NaCl5g/l及び寒
天15g/l（pH7.2）からなる寒天培地上で42℃で3.5時間
保温してプラークを形成させた。そこへ、予め10mMイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド溶液を含浸
させ風乾したニトロセルロース膜をのせ、更に37℃で３
時間保温した。

ニトロセルロース膜を寒天プレートから剥がし、0.1M
トリスHCl（pH7.5）、0.15M NaCl及び１％ゼラチンから
なる容器（以下ゼラチン溶液という）に浸漬し、４℃で
30分間ブロッキング処理を行なった。

次に実施例４で作成した抗血清を含むゼラチン溶液に
ニトロセルロール膜を浸漬し、室温で１時間抗原抗体反
応を行なわせた後、ゼラチン溶液で数回洗浄した。

続いて、西洋わさびペルオキシダーゼでラベルされた
抗ウサギIgG（カッペル社製）を含むゼラチン溶液に、
ニトロセルロース膜を浸漬し、室温で１時間反応させた
後、0.1MトリスHCl（pH9.5）、0.1M NaCl及び50mM MgCl
₂からなる溶液［以下「発色用バッファー」という）で
充分洗浄した。

発色反応は、3,3′−ジアミノベンジン四塩酸塩、イ
ミダゾール及び過酸化水素水を含む発色用バッファー
に、ニトロセルロース膜を浸漬し、室温で10〜30分間行
なった。

その結果、15個の赤紫色の発色点が得られた。之等に
それぞれ対応するプラークを分取し、10mMトリスHCl（p
H7.6）、10mM MgSO₄、0.1M NaCl及び0.01％ゼラチンか
らなる溶液中にファージを溶出させて組換え体DNAを含
むファージ液とした。

実施例６塩基配列の決定（１）プラスミドベクターへの再クローニング実施例５で得られたファージの組換え体DNAを抽出
［マニアティス（T.Maniatis）ら編、モレキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning,p371,Cold Spring Har
bor）刊，（1982）に従う］し、制限酵素EcoRIで消化
し、1.2％アガロースゲル電気泳動によってcDNA断片を
分取した。

一方、プラスミドベクターpUC19［Gene,33,103（198
5）］を実施例３の（２）に記載した方法に準じてEcoRI
消化及びアルカリフォスファターゼによる脱リン化し、
これを前記で分取したcDNA断片とライゲーションさせて
組換え体プラスミド（pUSAR15−５）を得、これを用い
て大腸菌JM109株を形質転換［マニアティス（T.Maniati
s）ら編、モレキュラー・クローニング（Molecular Clo
ning,p252,Cold Spring Harbor）刊，（1982）を従う］
させた。

（２）塩基配列の決定上記（１）で得た組換え体プラスミド及び宝酒造社製
７−DEAZAシークエンシングキットを用いて、サンガー
（Sanger）らのジデオキシシークエンス法［Proc.Natl.
Acad.Sci.,U.S.A.,74,5463（1977）］に従って、α−サ
ルシンポリペプチドをコードするcDNAの翻訳領域の全塩
基配列を決定した。

その結果は前記式（1B）に示した通りであり、塩基配
列の１から81までがシグナルペプチドを示し、同82から
531までが成熟α−サルシンポリペプチドをコードする
ものであった。

尚、上記成熟α−サルシンポリペプチドをコードする
塩基配列は、これまでサッコーらによって報告されたα
−サルシンのアミノ酸配列［J.Biol.Chem.,258,5811（1
983）］と実質的に一致するアミノ酸配列をコードして
おり、このことから該cDNAがα−サルシンをコードとし
ていると判断された。

実施例７大腸菌分泌での発現ベクターの構築とα−サ
ルシンの産生（１）発現ベクターの構築実施例６の（１）で得られα−サルシン遺伝子がクロ
ーニングされたプラスミドpUSAR15−５の３μｇをBst E
IIで37℃、４時間反応させた。エタノール沈殿処理、乾
燥後、全量を滅菌済蒸留水で溶解し、T4DNAポリメラー
ゼ及び3.3mMdNTPを加えて37℃で１時間反応させ、５′
末端側突出一本鎖部分を埋めた。反応終了後、エタノー
ル沈殿処理を行ない乾燥後、全量を滅菌済蒸留水に溶解
し、Sal Iを加え37℃で４時間反応させた。反応液は1.6
％アガロースゲル電気泳動を行なって、目的の大きさの
バンド822bpのDNA断片を単離した。

次に、Tacプロモーター及びblaシグナルペプチドの遺
伝子がクローニングされたプラスミドpKTN2−２［これ
を保有する大腸菌JM−103株は微工研にEscherichia col
i,JM−103,pKTN−２−２として寄託されておりその寄託
番号は微工研条寄託第1398号（FERM BP−1398）であ
る］をNae I処理及びEcoRI処理して得られる456bpのDNA
断片と、pBR322をSal I処理及びEcoRI処理して得られる
3712bpのDNA断片とをそれぞれ1.6％又は0.9％アガロー
スゲル電気泳動により単離した。

之等の３つのDNA断片822bp、456bp及び3712bpのそれ
ぞれ1.5μｇ、１μｇ及び0.4μｇ相当を混合し、T4DNA
リガーゼ、100mMATP（最終濃度1mM）を加えて、12℃で
一晩反応させた。その後、ハナハン（Hanahan）の方法
［J.Mol.Biol.,166,557（1983）］に従い、反応を行な
った反応液で大腸菌JM−109株を形質転換した。50μg/m
lのアンピシリンを含むＬ−ブロス平板寒天培地［バク
トトリプトン（Difco社製）10g、イーストエキストラク
ト（Difco社製）5g及び乾燥粉末寒天15gを１蒸留水に
溶解］に出現したアンピシリン耐性コロニーを培養し、
煮沸法［Holmes and Quiglery,Anal.Biochem.,114,193
（1981）］によりプラスミドDNAを調製し、各種制限酵
素で切断後、アガロースゲル電気泳動で分析し、Tacプ
ロモーター、blaシグナルペプチド及びα−サルシンの
遺伝子を含む断片が正しく挿入されていることを確認し
た。

得られた組換え体プラスイドをpUSARTB15−５と名付
けた。

以上の構築方法の概略を第１図に示す。

図中、Apはアンピシリン耐性を、Tcはテトラサイクリ
ン耐性を、Oriは複製開始点を、黒塗り矢印部分はTacプ
ロモーターを、斜線網かけ部分はblaシグナルペプチド
を、白抜け部分はα−サルシン構造遺伝子を、点網かけ
部分は非翻訳領域をそれぞれ示す。

尚、上記各反応に用いた各反応液は、使用酵素の指定
組成液を用いた。

かくして構築されたα−サルシン発現ベクターは、そ
の構築の都合より、Bst EIIカット、ポリメラーゼ処理
により、α−サルシン構造蛋白質Ｎ末端が２位（Val）
からコードされた遺伝子［前記式（１）のアミノ酸配列
の２−150アミノ酸配列をコードする］が、Tacプロモー
ター及びblaシグナルペプチドの下流に連結されたもの
となっている。

尚、連結部分の塩基配列はサンガーらのダイデオキシ
法［F.Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,74,
5463（1977）］により解析し、目的通りであることを確
認した。

（２）蛋白の発現と発現蛋白の確認上記（１）で構築した発現ベクターpUSARTB15−５を
保有する大腸菌JM−109株の培養による蛋白質（α−サ
ルシン活性物、前記式（１）で表わされるアミノ酸配列
のＮ末端２位から始まる149個のアミノ酸配列の蛋白
質）の生産と該活性物の同定、分析を以下の通り行なっ
た。

即ち、アンピリシリン添加Ｌ−ブロス液体培地中で上
記JM−109株を37℃下に一晩培養し、得られた培養液0.1
mlを5mlのアンピシリン添加Ｌ−ブロス液体培地に移
し、37℃で更に培養して、吸光度（OD600nm）の値が0.3
に達した時、最終濃度が1mMとなるようにイソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG、シグマ社製）を添
加した。更に培養を続けて上記IPTGの添加４時間後に遠
心分離により菌体を熱め、これを冷蒸留水に懸濁させた
後、超音波処理して菌体を破砕した。更に遠心分離して
得られる上清液を、同定用の検体とした。

発現蛋白の確認は、実施例４で作成した抗α−サルシ
ン抗体を用いたウエスタンブロッティング解析［H.Towb
in,T.Staehelin and J.Gordon,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.
S.A.,76,4350（1979）］にょり行なった。

その結果、予想される分子量約17000の位置に特徴的
な反応を示す単一バンドが確認された。

また、同抗体を用いたイムノアッセイの結果、この発
現量は１〜2mg/lであった。

（３）発現蛋白の生物活性 α−サルシンは、独特なRNA分解酵素であり、28^SrRNA
のG4325−A4326間のリン酸ジエステル結合を特異的に水
解し、リボソームを不活性化することが知られている。

本発明により得られた上記組換え型α−サルシン活性
物が、上記生物活性を有していることを確認するため
に、ラット肝リボソームを該活性物で処理してRNAを抽
出し、ポリアクリルアミド／アガロース混合ゲル電気泳
動法によりrRNAを分離した。

その結果を第２図に示す。

図においてレーンは未処理を、レーンは天然型α
−サルシン処理（100ng/ml）を、レーンは本発明α−
サルシン処理（100ng/ml）を、レーンは本発明α−サ
ルシン処理（50ng/ml）をそれぞれ示す。

該図より明らかな通り、本発明α−サルシン活性物で
処理したものでは、28^SrRNAが切断されて生じる断片
（α−フラグメント、約450塩基数）が確認できた。

この断片の出現は同様にして行なった天然型α−サル
シンを用いて処理した場合と同様であった。

更に両者の比活性を求めた結果、ほぼ同程度であるこ
とが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例７（１）に従うα−サルシン発現ベクタ
ー（組換え体プラスミド）pUSARTB15−５の構築を示す
概略図である。第２図は実施例７（３）に従う発現蛋白の生物活性を調
べるための、ポリアクリルアミド／アガロース混合ゲル
電気泳動法によるrRNAの分離状況を示す図面に代わる写
真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:66）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記アミノ酸配列のシグナルペプチドをコ
ードする塩基配列 Met−Val−Ala−Ile−Lys−Asn−Leu−Val−Leu−Val−
Ala−Leu−Thr−Ala−Val−Thr−Ala−Leu−Ala−Val−
Pro−Ser−Pro−Leu−Glu−Ala−Arg− と共に、下記塩基配列を含むことを特徴とするα−サル
シン遺伝子。
【請求項２】下記塩基配列を有する請求項に記載のα
−サルシン遺伝子。