JPH0745516B2 - ヒトγ―インターフェロン活性を有するポリペプチドおよびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトγ−インターフェロン活性を有するポリ
ペプチドおよびその遺伝子工学的製造法に関する。γ−
インターフエロンに比べこれらのポリペプチドは安定性
または溶解性が高くまた抗ビールス活性の特異性の点で
は様々であるが、それらは抗ビールス、抗腫瘍、抗新生
物または免疫調節剤として利用可能であるという点では
すべてγ−インターフエロンに類似している。本発明の
ポリペプチドはγ−インターフェロンに比較して110％
の抗ビールス活性を有している。

γ−インターフエロン（以前は免疫インターフエロンと
かタイプIIインターフエロンと呼ばれていた。本明細書
ではIFN−γと略記される）は1965年にエフ・ホイーロ
ツク（F.Wheelock）〔ホイーロツク（Wheelock）；サイ
エンス（Science）149（1965）,310参照〕により発見さ
れ、彼によつてIFN−γがある種の細胞をビールス感染
から保護しうることが示された。ヒトIFN−γ（基礎的
な情報については、ダブリュー・イー・スチュアート
（W.E.Stewart）、II、ザ・インターフエロン・システ
ム〔The Interferon System）、スプリンガー（Springe
r）発行（第２版、1981年）参照〕は天然的にグリコシ
ル化されている146個のアミノ酸から構成されるポリペ
プチドである〔グレイ（Gray）ほか、ネイチヤー（Natu
re）295（1982）、503参照〕。この糖タンパクは約63,0
00〜73,000の分子量を有し〔ペストカ（Pestka）ほか、
ジエイ・バイオル・ケム（J.Biol.Chem.）258（198
3）、9706参照〕またその機能型は四量体であろうと思
われる。

IFN−γのグリコシル化はその機能に必要ではなく、し
たがつてIFN−γをグリコシダーゼを処理してもヒト繊
維芽細胞の細胞培養においてその抗ビールス活性が低下
することはない〔ケルカー（Kelker）ほか、ジエイ・バ
イオル・ケム（（J.Biol.Chem.）258（1983）、8010参
照〕。

更にまた、α−インターフエロン類およびβ−インター
フエロンとは対照的に、IFN−γはpH2で不安定でありま
た熱（60℃）により不働化される。セルラインの細胞培
養からの、あるいは白血球（血液銀行貯蔵血液）からの
ヒトIFN−γの単離は可能ではあるが収率はほんのわず
かであり、また生成物の純度も低い。本発明はγ−イン
ターフエロンに類似の性質を有するポリペプチドの遺伝
子工学的方法による製造に関する。ヒトIFN−γは次の
ペプチド配列を有する〔デボス（Devos）ほか、ニユク
ル・アシツズ・リサーチ（Nucl.Acids Research 10（19
82）、2487参照）： Cys¹−Tyr−Cys−Gln−Asp−Pro−Tyr−Val−Lys−Glu
¹⁰−Ala−Glu−Asn−Leu−Lys−Lys−Tyr−Phe−Asn−A
la²⁰−Gly−His−Ser−Asp−Val−Ala−Asp−Asn−Gly
−Thr³⁰−Leu−Phe−Leu−Gly−Ile−Leu−Lys−Asn−T
rp−Lys⁴⁰−Glu−Glu−Ser−Asp−Arg−Lys−Ile−Met
−Gln−Ser⁵⁰−Gln−Ile−Val−Ser−Phe−Tyr−Phe−L
ys−Leu−Phe⁶⁰−Lys−Asn−Phe−Lys−Asp−Asp−Gln
−Ser−Ile−Gln⁷⁰−Lys−Ser−Val−Glu−Thr−Ile−L
ys−Glu−Asp−Met⁸⁰−Asn−Val−Lys−Phe−Phe−Asn
−Ser−Asn−Lys−Lys⁹⁰−Lys−Arg−Asp−Asp−Phe−G
lu−Lys−Leu−Thr−Asn¹⁰⁰−Tyr−Ser−Val−Thr−Asp
−Leu−Asn−Val−Gln−Arg¹¹⁰−Lys−Ala−Ile−His−
Glu−Leu−Ile−Gln−Val−Met¹²⁰−Ala−Glu−Leu−Se
r−Pro−Ala−Ala−Lys−Thr−Gly¹³⁰−Lys−Arg−Lys
−Arg−Ser−Gln−Met−Leu−Phe−Arg¹⁴⁰−Gly−Arg−
Arg−Ala−Ser−Gln¹⁴⁶。

本発明はヒトγ−インターフェロンの上記のアミノ酸配
列５〜146よりなるポリペプチドおよびその遺伝子工学
的製造法に関する。

遺伝暗号が「縮退」していること、すなわち単一のヌク
レオチド配列によつて暗号化されているのは２種類のア
ミノ酸に過ぎず、残りの18種類の遺伝暗号化しうるアミ
ノ酸には２〜６個のトリプレツトが対応しうることは知
られている。更に、異なる生物種の宿主細胞がこれによ
り生じる可能なバリエーシヨンを常に同じ様に用いると
は限らない。このように、遺伝子合成には、極めて広範
にわたる様々なコドン可能性が存在する。今般、アミノ
酸１〜146全体をコードするDNA配列Ｉ（本文末に付した
配列の記載を参照されたい）およびそれより導かれるDN
A配列IA、IBおよびICがIFN−γ活性を有するポリペプチ
ドの遺伝子工学的方法による合成に特に有利であること
を見出した。DNA配列Ｉの暗号鎖５′末端においてはメ
チオニンに対するコドン（「トリプレツトNo.0」）およ
び上流方向に例えば制限エンドヌクレアーゼEco RIに相
当する「突出」DNA配列が続き、一方、その暗号鎖の
３′末端には１個の停止コドン、または好ましくは２個
の停止コドンおよび−その直後にまたはあるDNA配列を
隔てて−制限酵素に特有の配列、例えば制限酵素Sal I
に相当する一本鎖突出配列が続く。異なる認識配列は所
望の配列方向でのDNAのプラスミドへの挿入を確保す
る。

暗号鎖の５末端におけるアミノ酸メチオニンに対するコ
ドンは細胞質からの所望のポリペプチドの分泌を生起さ
せ、またこの排泄過程で宿主細胞中に天然に存するシグ
ナルペプチダーゼにより除去される細菌タンパクまたは
宿主に固有の他のタンパクのプレ配列（シグナルまたは
リーダー配列とも呼ばれる）により置換することができ
る〔総括論文：パールマン（Perlman）およびハルボル
ソン（Halvorson）；ジエイ・モル・バイオル（J.Mol.B
iol.167（1983）、391参照〕。

制限酵素Bam HIおよびHind IIIに対する２つの内部の独
特な制限部位（それぞれ暗号鎖のコドン34および97、お
よび非暗号鎖のコドン35および98）は十分に研究されて
いるクローニング・ベクター例えばpBR322またはpUC8な
どに取込むことができる３つの遺伝子断片IFN−Ｉ、IFN
−IIおよびIFN−III（DNA配列II参照）のサブクローニ
ングを可能にする。更に、制限酵素に対する多くの他の
特有認識配列が構造遺伝子内に取込まれるが、これらは
一方ではIFN−γの部分配列へのアクセスを提供し、他
方では次のバリエーシヨンの導入を可能にする。すなわ
ち、 次のヌクレオチドNo.の後で切断制限酵素 暗号鎖 Ava IIa） 20 Alu Ib） 39 Hinf Ia） 134 Dde Ic） 159 Aha IIIc） 199 Taq Ic） 294 Aha IIId） 327 Sst Ia） 357 Bst NId） 362 Pst Ia） 388 Bbv Ia） 398 Sst IIa） 430 Dde Id） 444 ａ）全DNA配列Ｉに特有 ｂ）部分配列IFN−Ｉに特有 ｃ）部分配列IFN−IIに特有 ｄ）部分配列IFN−IIIに特有 その末端を含めたDNA配列Ｉは18〜33個のヌクレオチド
長を有する34個のオリゴヌクレオチド（DNA配列II参
照）（後者をまず化学合成し次いでそれらを４〜６個の
ヌクレオチドの「粘着末端」を介して酵素的に連結する
ことによる）から構築することができる。

更に、DNA配列Ｉにおいて、いくつかのコドンが対応し
うるアミノ酸に対し、それらコドンが等価ではなく逆に
個々の宿主細胞、例えば大腸菌（E.coli）において異な
る優先性を示すように注意を払つた。更にまた、回文配
列は最小限にとどめた。

このように、DNA配列Ｉの遺伝子構造は比較的小さな構
造単位から容易に製造でき、またそれは３つの遺伝子断
片の周知ベクターへのサブクローニングを可能にし、そ
してそれはそれら断片を結合して全遺伝子とすることを
可能にすると共にその全遺伝子の改変を可能にする。す
なわち配列Ｉの遺伝子をクローニング後、それよりDNA
部分配列、特にアミノ酸１〜127、５〜146および５〜12
7に相当するインターフエロン部分配列をコードする部
分配列IA、IBおよびICをある種の制限酵素により切断す
ることにより得ることができる。

部分配列の１例はIFN−γの最初の127個のアミノ酸を有
するポリペプチドを導くDNA配列IAによつて与えられ、D
NA配列Ｉは１個の停止トリプレツトまたは好ましくは２
個の停止トリプレツトおよび制限酵素に特有の配列、例
えば制限酵素Sal Iに対する突出末端がトリプレツトNo.
127に直接に接続されるように改変される。

一方、DNA配列Ｉを制限エンドヌクレアーゼAva IIで切
断しそしてこのようにして得られる大断片をアダプター
配列と連結するとIFN−γの最初の４個のアミノ酸に対
するコドンが欠失した。すなわちメチオニンがアミノ酸
No.5（アスパラギン酸）のすぐ上流に位置しているDNA
配列IBが得られる。IFN−γのアミノ酸５〜127を有する
ポリペプチドをコードするDNA配列ICはこのDNA配列IBか
らPst I制限部位を介して生成させることができる。

合成遺伝子または遺伝子断片のクローニングベクター中
への、例えば商業的に入手しうるプラスミドpUC8および
pBR322中への、あるいは他の一般的に入手しうるプラス
ミド、例えばptac11およびpkk177.3中への取込みは自体
既知の方法で行われる。予め化学合成遺伝子にタンパク
の発現を可能にする適当な化学合成調節領域を付与する
ことも可能である。これに関連してマニアチス（Maniat
is）によるテキストブツク〔モレキユラー・クローニン
グ（Molecular Cloning）、マニアチスほか、コールド
・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）1982〕
を参照しうる。このようにして得られたハイブリツドプ
ラスミドの適当な宿主生物、有利には大腸菌への形質転
換も同様にして自体知られており、また前述のテキスト
ブツクに詳述されている。発現タンパクの単離およびそ
の精製も同様に記載されている〔ジエイ・エイ・ジヨー
ジエイズ（J.A.Georgiades）、テキサス・レポーツ・イ
ン・バイオロジー・アンド・メデイスン（Texas Report
s in Biology and Medicine）41（1981）179;ケイム（C
ame）およびカーター（Carter）（編者）、「インター
フエロンズ・アンド・ゼア・アプリケーシヨンズ（Inte
rferons and Their Applications）」、スプリンガー
（Springer）発行、1984年参照〕。

本発明により得られまたDNA配列IA、IBおよびIC従つて
γ−インターフエロン活性を有するポリペプチドは新規
であり、そして本発明はそれらに関する。同様のことが
新規DNA配列Ｉから改変されたDNA配列、これらの配列か
ら得られるγ−インターフエロンアナログ、遺伝子断片
IFN−Ｉ、IFN−IIおよびIFN−IIIおよびそれらの改変
物、それらを用いて得られたハイブリツドプラスミドお
よび形質転換宿主生物にもあてはまる。本発明のヒトγ
−インターフェロンの前記のアミノ酸配列５〜146より
なるポリペプチドは、式 Pr−Ｒ−Ｚ （式中、Prは宿主細菌内で脱離されるポリペプチドまた
はMetをコードするヌクレオチド配列を表し、Ｒはヒト
γ−インターフェロンの前記アミノ酸配列５〜146をコ
ードするヌクレオチド配列を表し、そしてＺは１個また
は２個の停止コドンである）のDNAを有する遺伝子の宿
主細菌内での発現を誘起することにより遺伝子工学的に
製造される。

本発明の更に他の態様は特許請求の範囲に述べられてい
る。

本発明のいくつかの態様を以下の実施例に詳述するが、
これより多くの改変および組合せが可能であることは当
業者にとつて明白である。これらの実施例において％デ
ータは特に断らなければ重量に関するものである。

実施例 1.一本鎖オリゴヌクレオチドの化学合成遺伝子の構造単
位の合成を、暗号鎖のヌクレオチド１〜23よりなる遺伝
子の構造単位Iaの例を用いて説明する。既知の方法〔エ
ム・ジエイ・ゲイト（M.J.Gait）ほか、ニユクレイツク
・アシズ・リス（Nucleic Acids Res.）８（1980）1081
〜1096参照〕、３′末端に位置するヌクレオシド、すな
わち、この場合にはシチジン（ヌクレオチドNo.23）を
３′−ヒドロキシル基を介してシリカゲル（FRACTOSIL
、メルク社製）に共有結合する。このためには、シリ
カゲルをまず３−（トリエトキシシリル）プロピルアミ
ンと反応させてエタノールを脱離させSi−Ｏ−Si結合を
生成させる。そのシチジンをN⁴−ベンゾイル−３′−Ｏ
−スクシノイル−５′−ジメトキシトリチルエーテルの
形でｐ−ニトロフエノールとN,N′−ジシクロヘキシル
カルボジイミドの存在下にその変性キヤリアーと反応さ
せるとスクシノイル基の遊離カルボキシル基はプロピル
アミノ基のアミノ基をアシル化する。

以後の合成段階において、塩基成分は５′−Ｏ−ジメト
キシトリチルヌクレオシド−３′−亜りん酸のモノメチ
ルエステルのジアルキルアミドまたはクロライドとして
用いられ、アデニンはN⁶−ベンゾイル化合物の形とし、
シトシンはN⁴−ベンゾイル化合物の形とし、グアニンは
N²−イソブチリル化合物の形としそしてチミンはアミノ
基を含まず、保護基はない。

２μモルの結合シトシンを含有する50mgの重合体キヤリ
アーを次の試剤で順次処理する： ａ）ニトロメタン、 ｂ）１％の水を含有するニトロメタン中の臭化亜鉛飽和
溶液、 ｃ）メタノール、 ｄ）テトラヒドロフラン、 ｅ）アセトニトリル、 ｆ）0.5mlの無水アセトニトリル中の40μモルの適当な
ヌクレオシドホスフアイトおよび200μモルのテトラゾ
ール（５分間）、 ｇ）40％ルチジンおよび10％ジメチルアミノピリジンを
含有するテトラヒドロフラン中の20％酢酸無水物（２
分）、 ｈ）テトラヒドロフラン、 ｉ）20％水および40％ルチジンを含有するテトラヒドロ
フラン、 ｊ）コリジン／水／テトラヒドロフラン（容量比5:4:
1）中の３％沃素、 ｋ）テトラヒドロフラン、および ｌ）メタノール。

この場合において「ホスフアイト」の用語は、デオキシ
リボース−３′−モノ亜りん酸のモノメチルエステルで
あつて第３原子価が塩素または第３級アミノ基、例えば
モルホリノ基により飽和されているものを意味するもの
と理解されるべきである。この合成における個々の段階
の収率は各場合について脱トリチル化反応ｂ）後に分光
光度測定法によりジメトキシトリチル陽イオンの496nm
の波長における吸収を測定することにより測定すること
ができる。

オリゴヌクレオチドの合成の完了後、オリゴマーのメチ
ルホスフエート保護基をｐ−チオクレゾールおよびトリ
エチルアミンを用いて脱離する。

次に、オリゴヌクレオチドを３時間アンモニア処理する
ことにより固体キヤリアーから除去する。それらオリゴ
マーを２〜３日間濃アンモニア処理すると塩基のアミノ
保護基が定量的に脱離する。このようにして得られた粗
製生成物を高速液体クロマトグラフイ（HPLC）またはポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により精製する。遺伝子
の他の構造単位Ib〜IIIlもまた全く相応に合成され、そ
れらのヌクレオチド配列はDNA配列IIから導かれる。

2.一本鎖オリゴヌクレオチド類の酵素的連結による遺伝
子断片IFN−Ｉ、IFN−IIおよびIFN−IIIの生成 ５′末端のオリゴヌクレオチドのホスホリル化のため
に、オリゴヌクレオチドIaおよびIbの各々1nモルおよび
5nモルのアデノシン三りん酸を、20μｌの50mM tris HC
l緩衝液（pH7.6）、10mMの塩化マグネシウムおよび10mM
のジチオスレイトール（DTT）中の４単位のT4−ポリヌ
クレオチドキナーゼで30分間37℃で処理する〔シー・シ
ー・リチヤードソン（C.C.Richardson）、プログレス・
イン・ニユークル・アシズ・リス（Progress in Nucl.A
cids Res.）２（1972）825参照〕。その酵素を95℃で５
分間加熱することにより失活させる。次いでオリゴヌク
レオチドIaおよびIbを、それらを水性溶液中で95℃で２
分間加熱し次に５℃に徐冷することにより相互にハイプ
リツド化する。

同様にして、オリゴヌクレオチドIcとId、IeとIfまたは
IgとIh、およびIiとIjをホスホリル化し対合させる。オ
リゴヌクレオチドIIaとIIb…IIkとIIlのホスホリル化お
よび対合をサブフラグメントIFN−IIに対して行い、そ
してオリゴマーIIIaとIIIb…IIIkとIIIlのホスホリル化
および対合をサブフラグメントIFN−IIIに対して行う。

このようにして得られる５対のオリゴヌクレオチド（遺
伝子断片IFN−Ｉについて）および６対のオリゴヌクレ
オチド（遺伝子断片IFN−IIおよびIFN−IIIについて）
を各々について次のようにして連結する。

二本鎖ヌクレオチドを組合せそして各々、40μｌの50mM
tris HCl緩衝液、20mM塩化マグネシウムおよび10mM DT
T中で100単位のR4−DNAリガーゼを用いて15℃で16時間
かけて連結する。

遺伝子断片IFN−Ｉ〜IFN−IIIの精製は10％ポリアクリ
ルアミドゲル（尿素無添加、20×40cm1mm厚）でのゲル
電器泳動により行う。用いたマーカー物質はHinf Iで切
断されたφ×174DNA（BRL製）またはHae IIIで切断され
たpBR322である。

3.遺伝子断片IFN−Ｉ、IFN−IIおよびIFN−IIIを含有す
るハイブリツドプラスミドの調製 ａ）遺伝子断片IFN−ＩのpBR322への取込み 商業的に入手しうるプラスミドpBR322を既知の方法によ
り制限エンドヌクレアーゼEco RIおよびBam HIを製造元
のデータに従つて用いて開裂する。切断混合物を既知の
方法により５％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に
より分画し、そしてそれら断片を臭化エチジウム染色ま
たは放射能標識（マニアチスの「ニツクトランスレーシ
ヨン」法、前掲）により可視化する。次にプラスミド帯
をアクリルアミドゲルから切り出しそして電気泳動によ
りポリアクリルアミドから分離する。切断混合物の分画
はまた（実施例6a）に記載の如く）２％低融点アガロー
スゲルで行うこともできる。

次に１μｇのプラスミドを16℃で一夜10ngの遺伝子断片
IFN−Ｉと連結する。第１図に示されたハイブリツドプ
ラスミドが得られる。

ｂ）遺伝子断片IFN−IIのpUC8への取込み ａ）と同様にして、商業的に入手しうるプラスミドpUC8
をBam HIおよびHind IIIを用いて開裂しそして遺伝子断
片IFN−IIと連結する。第２図に示されるハイブリツド
プラスミドが得られる。

ｃ）遺伝子断片IFN−IIIのpUCへの取込み ａ）と同様にして、プラスミドpUC8をHind IIIおよびSa
lIを用いて開裂しそして遺伝子断片IFN−IIIと連結す
る。第３図に示されるハイブリツドプラスミドが得られ
る。

4.完全遺伝子の合成 ａ）形質転換および増幅 このようにして得られるハイブリツドプラスミドを大腸
菌に形質転換する。このために大腸菌K12株を70mM塩化
カルシウム溶液処理によりコンピテントにしそして、塩
化カルシウム濃度が70mMの10mM tris HCl緩衝液（pH7.
5）中のハイブリツドプラスミドの懸濁液を添加する。
形質転換株は常法により、プラスミドにより与えられる
抗生物質に対する抵抗性または感受性を利用して選別
し、そしてハイブリツドベクターを増幅する。菌株を殺
した後にハイブリツドプラスミドを端離し、最初に用い
た制限酵素を用いて開裂させ、そして遺伝子断片IFN−
Ｉ、IFN−IIおよびIFN−IIIをゲル電気泳動により単離
する。

ｂ）遺伝子断片の連結 増幅により得られるサブフラグメントIFN−Ｉ、IFN−II
およびIFN−IIIを実施例２に記載されている如くに酵素
的に連結し、そしてこのようにして得られそしてDNA配
列Ｉを有する合成遺伝子をクローニングベクターpUC8に
導入する。第４図に示されるようなハイブリツドプラス
ミドが得られる。

5.DNA配列IA、IBおよびICを含有するハイブリツドプラ
スミドの合成 ａ）挿入IB含有ハイブリツドプラスミド DNA配列Ｉを含有する第４図に示されるようなハイブリ
ツドプラスミドを制限酵素Eco RIおよびSalIを用いて既
知の方法により開裂し、Eco RIおよびSalI小断片をポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により除去し、次に酵素Av
a IIを用いて切断する。次のアダプター、すなわち を用い、そして既に作られた大DNA断片と連結した後にD
NA配列IB挿入部を含むハイブリツドプラスミドが得られ
る（第５図参照）。

ｂ）挿入IA含有ハイブリツドプラスミド 制限酵素Pst Iを製造元のデータに従つて用いてDNA配列
Ｉを切断し、そしてEco RI−PstI断片を単離する。更
に、商業的に入手しうるプラスミドpUC8を制限酵素Eco
RIおよびSma Iを用いて開裂させ、そして既に単離され
た断片を次のアダプター、すなわち、 を用いて挿入すると第６図に示されるようなハイブリツ
ドプラスミドが得られる。

ｃ）挿入IC含有ハイブリツドプラスミド 実施例5aから得られるハイブリツドプラスミドをEco RI
およびPst Iで切断する。単離された（Eco RI−Pst I）
断片を5b）と同様にして連結して今度はDNA配列Ｉの挿
入部を含有する新しいハイブリツドプラスミドを得る
（第７図参照）。

6.DNA配列1A、1BおよびICの発現用ハイブリツドプラス
ミドの構築 ａ）Pkk177.3への取込み 発現プラスミドPkk177.3〔プラスミドptac II（アマン
（Amman）ほか、ジーン（Gene）25（1983）167のEco RI
認識部位にSalI制限部位を含む配列を合成的に取込ませ
たもの）を制限酵素Eco RIおよびSalIを用いて開裂す
る。制限酵素Eco RIおよびSalIを用いて第５図に相当す
るプラスミドから挿入IBを切り出す。（やや長目の）挿
入部IA^★およびIC^★もまた同様に単離される。何故なら
ばpUC8において、制限酵素Sma Iの制限部位により特徴
付けられる２つの遺伝子断片の実際の末端のわずか数ヌ
クレオチド下流にSalI制限部位が位置しているからであ
る（第６図および第７図参照）。

断片IA^★、IBおよびIC^★を２％低融点アガロースにか
け、プラスミドDNAから分離し、そして挿入部は、その
ゲルを（製造元の説明に従つて）高められた温度で溶解
することにより回収する。各場合について発現または調
節領域が挿入部の上流に組込まれたハイブリツドプラス
ミドは開裂したプラスミドPKK177.3を断片IA^★およびIB
またはIC^★と連結することにより得られる。適当な誘導
物質例えばイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド
（IPTG）の添加後、mRNAが形成され、そしてこの結果DN
A配列IAおよびIBまたはICに相当するメチオニルポリペ
プチドが発現する。

ｂ）pMX2への取込み 発現プラスミドpMX2は21ヌクレオチド分短縮されそして
次のようにして調製されるpUC8プラスミドよりなる pUC8を制限エンドヌクレアーゼEco RIを用いて開裂し次
いでEco RI制限部位の両側で約20ヌクレオチドの脱離を
可能にする条件下にエキソヌクレアーゼBal31で処理す
る（Maniatis、前掲）。次に、このように処理されたプ
ラスミドのすべての突出末端をクレノウ（Klenow）DNA
ポリメラーゼを用いて埋め、次のそのプラスミドを制限
エンドヌクレアーゼHind IIIを用いて切断しそして製造
元の説明に従つて１％低融点アガロースゲルで精製す
る。もともとpUC8に存在しそしてEco RIおよびHind III
制限酵素切断部位により制限されまた前述の操作により
破壊されたポリリンカーをヌラスミドに再挿入する。そ
のために、pUC8を制限酵素Eco RIを用いて開裂しそして
突出末端をクレノウポリメラーゼおよび³²P−標識ヌク
レオシドトリホスフエートを用いて埋める。次にそのポ
リリンカーを制限酵素Hind IIIを用いてプラスミドから
切り出しそして10％アクリルアミドゲルでの電気泳動に
よりプラスミドから除去する。オートラジオグラフイを
用いてポリリンカー帯を確認後、アクリルアミド残留物
を電気溶出（eletroelution）によつてポリリンカーか
ら除き、そしてそれを短縮されたpUC8プラスミドに連結
する。このように構築したプラスミドpMX2を次に制限酵
素Eco RIおよびSalIを用いて開裂しそして末端がEco RI
およびSalI認識配列を有するγ−インターフエロン遺伝
子断片IA^★およびIBまたはIC^★と連結して発現プラスミ
ドpMX2を得る（第８図〜第10図）。次に高力価のインタ
ーフエロンを示すクローンを生物活性の測定により確認
する。

7.ハイブリツドプラスミドの形質転換 コンピテント大腸菌細胞をIAまたはIBまたはICの配列を
含む0.1〜１μｇのハイブリツドプラスミドを用いて形
質転換しそしてアンピシリン含有寒天平板に置床する。
次いでDNA迅速後処理により適宜のプラスミド中に正し
く組込まれたγ−インターフエロン遺伝子配列を含有す
るクローンを確認できる（Maniatis、前掲）。

8.γ−インターフエロン活性を示すポリペプチドの発現 前述のハイブリツドプラスミドを大腸菌に形質転換後発
現されるポリペプチドは適切なγ−インターフエロンア
ミノ酸配列のほかにアミノ末端に付加的なメチオニル基
を有するもの、すなわちIAの構成にあつてはMet−（IFN
−γ、アミノ酸１−127）、IBの構成にあつてはMet−
（IFN−γ、アミノ酸５−146）およびICの構成にあつて
はMet−（IFN−γ、アミノ酸５−127）である。

9.後処理および精製 所望の最適な密度となるまで培養された菌株を適当な誘
導物質、例えばIPTGと共に十分な時間、例えば２時間イ
ンキユベートする。次いで菌体を0.1％クレゾールおよ
び0.1mMベンジルスルホニルフルオライドを用いて殺菌
する。遠心分離または過後その生物塊を緩衝溶液（50
mM tris、50mM EDTA、pH7.5）にとりそして例えばフレ
ンチ（French）プレスまたはダイノ（DYNO、商標名）ミ
ル〔ウイリー・バツコフアー（Willy Bachofer）社、バ
ーゼル（Basel）〕を用いて機械的に破壊し、次いで遠
心分離により不溶性成分を除去する。γ−インターフエ
ロン活性を含むタンパクを常法により上清から精製す
る。イオン交換、吸着およびゲル過カラムまたは抗体
に基づくアフイニテイクロマトグラフイカラムが適して
いる。生成物の濃縮度および純度をドデシル硫酸ナトリ
ウム／アクリルアミドゲルまたはHPLCを用いた分析によ
りチエツクする。

インジケータ・セルライン、例えばベロ（Vero）細胞を
γ−インターフエロン活性についての生成物の生物学的
特徴付けに既知の方法で用い、そしてインターフエロン
含有細菌抽出物の連続希釈物と共にインキユベートす
る。次いでVSV（小水疱性口内炎ビールス）などのビー
ルスで感染させることにより、細菌抽出物によるベロ細
胞の前処理が抗ビールス状態を獲得しうる最高希釈段階
のチエツクを行う。評価は顕微鏡により、またはニユー
トラルレツドの取込みの測定により行うことができる。

更にまたγ−インターフエロン活性は、γ−インターフ
エロンに対するモノクローナル抗体に基づく商業的に入
手しうるラジオイムノアツセイ〔セルテツク・リミテツ
ド（Cellteck Ltd.）社〕を用いて測定することもでき
る。

10.DNA配列の改変 ａ）102位のセリンがグルタミン酸に置換されているγ
−インターフエロンアナログを調製するために、次のヌ
クレオチドを実施例１および２と同様にして合成する。

遺伝子断片IFN−IIIを制限酵素Aha IIIで切断しそして
大きい方の断片を取出して前述のヌクレオチドと連結す
る。pUC8への取込みは実施例3c）と同様にして行う。実
施例4a）と同様にして形質転換および増幅を行つた後、
改変配列IFN−IIIをマキサム−ギルバート配列決定法に
よつて確認する。この改変サブフラグメントを実施例４
と同様にして遺伝子断片IFN−ＩおよびIFN−IIと連結し
そして実施例５〜９と同様の手順を続けることにより、
102位のセリンに代えてグルタミン酸が組み込まれてい
る改変γ−IFNが得られる。この生成物は抗ビールス活
性を示す。

ｂ）アミノ酸配列１〜136に続けてシステインを有する
γ−インターフエロンアナログヌクレオチド を実施例１および２と同様にして合成する。断片IFN−I
IIを制限酵素Pst Iを用いて切断しそして大きい方の断
片を分離する。これを前述のヌクレオチドと連結し、そ
して前記と同様の手順を続ける。アミノ酸１〜136およ
びカルボキシ末端にシステインを含む改変γ−インター
フエロンが得られる。このγ−インターフエロンアナロ
グは内部的に安定化しており、また後処理の際に天然γ
−インターフエロンよりもより容易にクロマトグラフイ
により操作されうる。

DNA配列 Ｉ ここに示されるように、アミノ末端にEco
RIに対する特徴的な配列および「トリプレツトNo.0」
を有し、またカルボキシ末端に２個の停止トリプレケツ
トおよびSal Iに対する特徴的な配列を有する。

DNA配列IA:ここに示されるように、アミノ末端にEco RI
に対し特徴的な配列および「トリプレツトNo.0」を有し
またカルボキシ末端に２個の停止トリプレツトおよびSm
a Iに対し特徴的な配列を有する。

DNA配列IB:ここに示されるように、アミノ末端にEco R
Iに対し特徴的な配列および「トリプレツトNo.0」を有
しまたカルボキシ末端に２個の停止トリプレツトおよび
Bal Iに対し特徴的な配列を有する。

DNA配列IC:ここに示されるようにアミノ末端にEco RIに
対し特徴的な配列および「トリプレツトNo.0」を有しま
たカルボキシ末端にSma Iに対し特徴的な配列を有す
る。

【図面の簡単な説明】

第１図はpBR322中に遺伝子断片IFN−Ｉを含有するハイ
ブリツドプラスミド、 第２図はpUC8中に遺伝子断片IFN−IIを含有するハイブ
リツドプラスミド、 第３図はpUC8中に遺伝子断片IFN−IIIを含有するハイブ
リツドプラスミド、 第４図はpUC8中にDNA配列Ｉを含有するハイブリツドプ
ラスミド、 第５図はpUC8中にDNA配列IBを含有するハイブリツドプ
ラスミド、 第６図はpUC8中にDNA配列IAを含有するハイブリツドプ
ラスミド、 第７図はpUC8中にDNA配列ICを含有するハイブリツドプ
ラスミド、 第８図はpMX2中に遺伝子断片IA^★を含有するハイブリツ
ドプラスミド、 第９図はpMX2中に遺伝子断片IBを含有するハイブリツド
プラスミド、 第10図はpMX2中に遺伝子断片IC^★を含有するハイブリツ
ドプラスミドを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 オイゲーン・ウールマン アメリカ合衆国マサチユーセツツ州 （02178）ベルモント．ワシントンストリ ート287 (72)発明者 ヴオルフガング・ウルマー ドイツ連邦共和国デー‐6230 フランクフ ルト・アム・マイン80．アム・カペレンベ ルク14 (56)参考文献 特開 昭58−90514（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−51792（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−201995（ＪＰ，Ａ) 国際公開83／4053（ＷＯ，Ａ) Ｅ．Ｄ．Ｍａｅｙｅｒ，Ｈ．Ｓｃｈｅｌ ｌｅｋｅｎｓ編「Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｓｙｓｔｅｍ 1983−Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ ｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｉｎｔ ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＴＮＯ Ｍｅｅｔ ｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｓ ｙｓｔｅｍ，ｈｅｌｄ ｉｎ Ｒｏｔｔｅ ｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ ｏｎ 18−22 Ａｐｒｉｌ」（1983) Ｐ．121−128

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトγ−インターフェロンの下記のアミノ
   酸配列５〜146よりなるポリペプチド。 Asp⁵−Pro−Tyr−Val−Lys−Glu¹⁰−Ala−Glu−Asn−Le
   u−Lys−Lys−Tyr−Phe−Asn−Ala²⁰−Gly−His−Ser−
   Asp−Val−Ala−Asp−Asn−Gly−Thr³⁰−Leu−Phe−Leu
   −Gly−Ile−Leu−Lys−Asn−Trp−Lys⁴⁰−Glu−Glu−S
   er−Asp−Arg−Lys−Ile−Met−Gln−Ser⁵⁰−Gln−Ile
   −Val−Ser−Phe−Tyr−Phe−Lys−Leu−Phe⁶⁰−Lys−A
   sn−Phe−Lys−Asp−Asp−Gln−Ser−Ile−Gln⁷⁰−Lys
   −Ser−Val−Glu−Thr−Ile−Lys−Glu−Asp−Met⁸⁰−A
   sn−Val−Lys−Phe−Phe−Asn−Ser−Asn−Lys−Lys⁹⁰
   −Lys−Arg−Asp−Asp−Phe−Glu−Lys−Leu−Thr−Asn
   ¹⁰⁰−Tyr−Ser−Val−Thr−Asp−Leu−Asn−Val−Gln−
   Arg¹¹⁰−Lys−Ala−Ile−His−Glu−Leu−Ile−Gln−Va
   l−Met¹²⁰−Ala−Glu−Leu−Ser−Pro−Ala−Ala−Lys
   −Thr−Gly¹³⁰−Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−Met−
   Leu−Phe−Arg¹⁴⁰−Gly−Arg−Arg−Ala−Ser−Gl
   n¹⁴⁶。
2. 【請求項２】ヒトγ−インターフェロンの下記のアミノ
   酸配列５〜146よりなるポリペプチドを製造するに当た
   り、式 Pr−Ｒ−Ｚ （式中、Prは宿主細菌内で脱離されるポリペプチドまた
   はMetをコードするヌクレオチド配列を表し、Ｒはヒト
   γ−インターフェロンの下記のアミノ酸配列５〜146を
   コードするヌクレオチド配列を表し、そしてＺは１個ま
   たは２個の停止コドンである）のDNAを有する遺伝子の
   宿主細菌中での発現を誘起することよりなる、ヒトγ−
   インターフェロンの下記のアミノ酸配列５〜146よりな
   るポリペプチドの遺伝子工学的製造法。 Asp⁵−Pro−Tyr−Val−Lys−Glu¹⁰−Ala−Glu−Asn−Le
   u−Lys−Lys−Tyr−Phe−Asn−Ala²⁰−Gly−His−Ser−
   Asp−Val−Ala−Asp−Asn−Gly−Thr³⁰−Leu−Phe−Leu
   −Gly−Ile−Leu−Lys−Asn−Trp−Lys⁴⁰−Glu−Glu−S
   er−Asp−Arg−Lys−Ile−Met−Gln−Ser⁵⁰−Gln−Ile
   −Val−Ser−Phe−Tyr−Phe−Lys−Leu−Phe⁶⁰−Lys−A
   sn−Phe−Lys−Asp−Asp−Gln−Ser−Ile−Gln⁷⁰−Lys
   −Ser−Val−Glu−Thr−Ile−Lys−Glu−Asp−Met⁸⁰−A
   sn−Val−Lys−Phe−Phe−Asn−Ser−Asn−Lys−Lys⁹⁰
   −Lys−Arg−Asp−Asp−Phe−Glu−Lys−Leu−Thr−Asn
   ¹⁰⁰−Tyr−Ser−Val−Thr−Asp−Leu−Asn−Val−Gln−
   Arg¹¹⁰−Lys−Ala−Ile−His−Glu−Leu−Ile−Gln−Va
   l−Met¹²⁰−Ala−Glu−Leu−Ser−Pro−Ala−Ala−Lys
   −Thr−Gly¹³⁰−Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−Met−
   Leu−Phe−Arg¹⁴⁰−Gly−Arg−Arg−Ala−Ser−Gl
   n¹⁴⁶。
3. 【請求項３】Ｚが２個の停止コドンを表す特許請求の範
   囲第２項記載の製造法。
4. 【請求項４】宿主細菌が大腸菌である特許請求の範囲第
   ２項記載の製造法。