JPS63304987A - アンギオゲニン類の遺伝子工学産生方法 - Google Patents

アンギオゲニン類の遺伝子工学産生方法

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JPS63304987A
JPS63304987A JP63122997A JP12299788A JPS63304987A JP S63304987 A JPS63304987 A JP S63304987A JP 63122997 A JP63122997 A JP 63122997A JP 12299788 A JP12299788 A JP 12299788A JP S63304987 A JPS63304987 A JP S63304987A
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galactosidase
gene
angiogenin
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codon
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ペーター、クラウゼ
フリードリッヒ・ハイン
ハンス、ウィリ、ヤンセン
オイゲン、ウールマン
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Hoechst AG
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血管新生が大半の充実性腫瘍の増殖のための必須条件で
あるという観察結果は、培養ＨＴ２９腺癌細胞の上澄か
らアンギオゲニンと称される血管形成因子を単離しかつ
特徴付けることにむすびついた〔フェットら、バイオケ
ミストリー、第２４巻、１９８５年、第５４８０−５４
８６頁（Ｐｏｔｔａｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　２４（１９８５）　５４８０−５４８６）　；
ストリダム（Ｓｔｒｙｄｏｓ）ら、バイオケミストリー
、第２４巻、１９８５年、第５４８６−５４９４頁〕。
アンギオゲニンは、分子量１４，２００Ｄで等電点〉９
．５の非グリコジル化ポリペプチド鎖である。タンパク
質配列決定に基づきかつ特異的プローブの使用によって
、アンギオゲニンｃＤＮＡ及びゲノムアンギオゲニンク
ローンを単離することができた〔クラチ（Ｋｕｒａｃｈ
ｌ　）ら、バイオケミストリー、第２４巻、１９８５年
、第５４９４−５４９９頁〕。アンギオゲニンはリボヌ
クレアーゼＡ　（ＲＮアーゼＡ）と３５％相同的であっ
て、ＲＮアーゼＡの４つのジスルフィド架橋結合のうち
３つは、ＲＮアーゼＡの触媒活性にとって必須のアミノ
酸残基Ｈｉｓ−１２、Ｌｙｓ−４１及びＨｉｓ−１１９
と正確に同一の位置に留まっている。更にその後の研究
によって、アンギオゲニンもＲＮアーゼ活性を有するこ
とが示され、だが、この活性はＲＮアーゼＡの場合より
も特異的である〔シャピロ（Ｓｈａｐｌｒｏ）ら、バイ
オケミストリー。
第２５巻、１９８６年、第３５２７−２５３２頁〕。
アンギオゲニンの可能な治療用途は局所的血流障害の排
除であり、考慮中の用途は冠動脈血流障害用、特に骨及
び靭帯損傷の創傷治癒用、並びに皮膚移植用である。第
二の治療原理は、例えばアンギオゲニンに対する抗体に
よる血管形成の阻害である。アンギオゲニンとＲＮアー
ゼＡとの相同性を考えた場合、合成低分子量インヒビタ
ーについて考慮することも可能であろう。この原理は、
充実性腫瘍及びそれらの転移（化学療法との併用）、並
びにリウマチ様関節炎、糖尿病（網膜症）の続発症及び
他の症状に関する診断及び治療に際して利用されるであ
ろう。
しかしながら、これらすべての治療可能性を実現させる
ためには、更に研究を進める上で有利な方法でかつ十分
な量で生物活性アンギオゲニンを単離することが、すべ
ての中でまず第一に必要となる。
細菌中でのポリペプチドの遺伝子工学産生において、望
ましいポリペプチドに関する構造遺伝子。
は細菌に内在するポリペプチドβ−ガラクトシダーゼの
遺伝子に読取枠内でしばしば結合せしめられる。かかる
場合に、細菌は、望ましいポリペプチドがアミノ末端に
おいてβ−ガラクトシダーゼのカルボキシル末端と結合
している融合タンパク質を産生ずる。この方法において
は、完全β−ガラクトシダーゼの遺伝子を用いないこと
も知られている（ＥＰ−Ａ第０．００１，９３０号及び
第０．０１２，４９４号明細書）。しかしながら、β−
ガラクトシダーゼの極端に短い断片又は実質上完全な配
列のみがこのために用いられていた。
遺伝的にコード可能なポリペプチドの産生方法は既に提
案済であって（未公開西独特許出願節Ｐ３．８０５，１
５０．８号明細書、このポリペプチドに関する構造遺伝
子は正しい読取枠でβ−ガラクトシダーゼ又はβ−ガラ
クトシダーゼ断片に関する遺伝子を介してし竹′ニレー
ター領域に結合せしめられており、この遺伝子構造は細
菌中に導入され、不溶性融合タンパク質はその中で発現
され、後者が細胞破壊後に単離され、かつ望ましいポリ
ペプチドが化学的又は酵素的切断によって得られるが、
但しその方法にあっては、β−ガラクトシダーゼ又はβ
−ガラクトシダーゼ断片の遺伝子におけるメチオニン及
び／又はアンギニン及び／又はシスティンに関するコド
ンが他のアミノ酸に関するコドンによって全部又は一部
置換されていることを特徴とする。
アンギオゲニン及びその誘導体はこの方法によって特に
有利に得られることが見出された。本発明の有利な態様
は以下において詳細に説明されている。
まず最初に、融合タンパク質の産生に関する西独特許出
願節Ｐ３，８０５，１５０．８号の方法の詳細が説明さ
れる： 融合タンパク質におけるβ−ガラクトシダーゼ部分は、
アミノ酸２５０個以上を有するが完全β−ガラクトシダ
ーゼ配列よりもかなり短かい。好都合にはβ−ガラクト
シダーゼのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端部分
を有する約３００〜約８００個、好ましくは約３２０〜
約６５０個のアミノ酸のβ−ガラクトシダーゼ断片が有
用であることが証明された。このβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子断片は、正しい読取枠でレギュレーター領域に、
必要であればアダプターを介してアンギオゲニンに関す
る構造遺伝子に融合せしめられる。
適切であれば省略しうろこのアダプターは、アンギオゲ
ニンのアミノ末端の前に位置しかつそれを容易にβ−ガ
ラクトシダーゼ断片から化学的又は酵素的に分離させつ
る１以上のアミノ酸についてコードしていることが有利
である。例えば、所望のアンギオゲニン誘導体がメチオ
ニンを有していないか又はそれがメチオニンを有しない
ような方法で遺伝子工学により修飾された場合には、所
望のポリペプチドのアミノ末端の前にアミノ酸としてメ
チオニンを選択することが有利であって、しかる後に塩
化シアン又は臭化シアンでの切断によりβ−ガラクトシ
ダーゼから所望のポリペプチドを分離することが可能と
なる。
本発明で用いられる方法は、形成される融合タンパク質
が不溶性であってそのため細胞破壊後容易に単離されう
るという利点を有している。他方、好ましい態様におい
ては、比較的小さなβ−ガラクトシダーゼ部分であるが
故に、融合タンパク質は細菌中で比較的大量に蓄積され
ることになる。
しかも細菌に内在するタンパク質部分であることから、
融合タンパク質は細菌により著しい程度までは分解され
ず、その結果これに対応して更に長い誘導期間とひいて
は高収率とが可能になる。
以上のように、アンギオゲニンは本発明に従い、正しい
読取枠でこのポリペプチドに関する構造遺伝子を、必要
であればアダプターを介して、β−ガラクトシダーゼ又
は好ましくはアミノ酸２５０個以上であるが完全β−ガ
ラクトシダーゼ断片よりもかなり短いβ−ガラクトシダ
ーゼ断片に関する遺伝子と共にレギュレーター領域に結
合させ、この遺伝子構造を細菌中に導入し、その中で不
溶性融合タンパク質を発現させ、細胞破壊後に後者を単
離し、かつ望ましいポリペプチドを化学的又は酵素的切
断で得ることにより入手することができる。
レギュレーター系域は天然、特に細菌に固有であるか、
化学的に合成されるか、又はハイブリッド領域、例えば
融合プロモーターｔａｃである。
レギュレーター領域は、オペレーター、例えばｌａｃオ
ペレーター、及びβ−ガラクトシダーゼ断片のメチオン
コドンの前においてヌクレオチド６〜１４個のリポソー
ム結合部位を更に含んでいる。
β−ガラクトシダーゼ断片は、アミノ末端及びカルボキ
シル末端部分配列の融合体であることが好ましい。この
場合には、心合タンパク質内のβ−ガラクトシダーゼ部
分をかなり減少させることになる。しかも、この構造で
は特別な苦労もなしに様々なレギュレーター系の代用を
可能にする。
しかしながら、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端配列
を独占的に又はカルボキシル末端配列を優勢的に用いる
ことも可能である。これらの末端切除β−ガラクトシダ
ーゼ構造のために天然制限酵素切断部位を用いることが
できる。しかしながら、停止コドンのない正しい読取枠
を確保し、適切であればＡＴＧ開始コドンを有する化学
的合成リンカ−又はアダプターと共にその構造を用いる
ことも可能である。第１Ａ図は天然制限酵素切断部位を
用いたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子断片を示しており、
第１Ｂ図はリンカ−が用いられた例について示している
。
特別の場合には、β−ガラクトシダーゼ断片において更
に単独又は組合せの修飾が有利であると証明されよう。
塩化シアン又は臭化シアンでの切断によりβ−ガラクト
シダーゼ断片から分離されるべきポリペプチドの精製は
、標的インビトロ突然変異誘発が余計なメチオニン残基
に関するコドンの一部又は有利には全部を他のアミノ酸
、好ましくはロイシン又はイソロイシンに関するコドン
で置換するために行なわれた場合には、容易化される。
所望のポリペプチド以外にも、この方法で修飾された融
合タンパク質の切断によってより少数のβ−ガラクトシ
ダーゼ切断断片が得られるが、それらはその大きさ及び
／又は電荷に基づき所望のポリペプチドから容易に分離
されうるように選択することができる。
アスパラギン酸及びプロリン間のペプチド結合の酸開裂
によってβ−ガラクトシダーゼ断片から分離されるべき
ポリペプチドの場合には、酸開裂がこれらの部位でもは
や不可能となるような方法の標的インビトロ突然変異誘
発により、好ましくはアスパラギン酸に関するコドンを
グルタミン酸に関するコドンに変換することによって、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片における対応コドンを
修飾することが有利であろう。
ジスルフィド架橋結合の形成がそれらの活性のために重
要であるポリペプチドの場合には、β−ガラクトシダー
ゼ断片及びポリペプチド間の不正確なジスルフィド架橋
結合の形成を避けるために、標的インビトロ突然変異誘
発によって、β−ガラクトシダーゼ断片中に存在するシ
スティンのコドンを他のアミノ酸、好ましくはセリンに
関するコドンに変換することが一般に有益である。
好ましい場合には省略可能な、β−ガラクトシダーゼ断
片及び所望のポリペプチドの構造遺伝子間のアダプター
は、所望のポリペプチドのアミノ末端のすぐ直前におい
て、β−ガラクトシダーゼ部分から所望のポリペプチド
を容易に分離させうるアミノ酸又はアミノ酸配列につい
てコードしている。既に記載したように、このアミノ酸
は、所望のポリペプチドがメチオニンを含んでいないか
又は対応コドンが遺伝子工学修飾をうけている限り、簡
単な臭化シアン切断を可能にするメチオニンである。こ
のタイプのアダプターの例は下記ヌクレオチド配列を有
している： ５’　　　　　ＡＡＴ　　ＴＡＴ　　ＧＡＡ　　ＴＴＣ
ＧＣＡ　　ＡＴＧ（Ｅｃｏ　　ＲＩ）　　　　　ＴＡ　
　ＣＴＴ　　ＡＡＧ　　ＣＧＴ　　ＴＡＣ化学的又は酵
素的な様々な切断方式は、β−ガラクトシダーゼ部分か
らの所望のポリペプチドの立体的分離によって更に容易
化しうる。このためには、ポリ（アミノ酸）に関するコ
ドンが特別な化学的合成アダプターを介してβ−ガラク
トシダーゼ部分及びポリペプチド間に挿入される。一般
に、このポリ（アミノ酸）アーム（ａｒｍ）の構造を変
えるという観点から、アミノ酸としてすべて遺伝的コー
ド可能なアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、セリン
もしくはプロリンのような小非電荷アミノ酸あるいは一
方ではアスパラギン酸及びグルタミン酸、又は他方では
リジン及びアルギニンのような電荷アミノ酸を用いるこ
とができる。
ポリ（アミノ酸）鎖は５〜３０、好ましくは１０〜２４
、特に１５〜２０個のアミノ酸をＨする。
ポリ（アミノ酸）の選択に従い、β−ガラクトシダーゼ
部分と共に所望の遺伝子産物の直接的折り重なりを達成
することができる。
この所望のアンギオゲニンに関する構造遺伝子は、それ
自体公知の方法で化学的に合成することができる。宿主
細胞中での特別なコドン用法に合致した化学的合成遺伝
子、例えば西独特許公開第３．３２７．００７号（成長
ホルモン放出因子の誘導体）、第３，３２８，７９３号
（セクレチンの誘導体）、第３，４０９，９６６号（ヒ
トｒ−インターフェロン）、第３．４１４，８３１号（
ヒトｒ−インターフェロンの誘導体）、第３．４１９，
９９５号（インターロイキン−２及び誘導体）及び第３
，４２９，４３０号（ヒルジン誘導体）明細書に記載さ
れたか又は西独特許出願第Ｐ３，６３２，０３７．４号
（カルシトニン）明細書に記載されたような遺伝子が有
利である。
この目的のためには、いくつかの利点をもつアンギオゲ
ニンの遺伝子が化学的合成経路で製造される。大腸菌（
Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｌａ　ｃｏｌｉ）の優先性が合成遺
伝子に関して考慮される（第１表）。制限エンドヌクレ
アーゼについてのいくつかの独特な認識配列は構造遺伝
子中に組込まれるが、これらがアンギオゲニンの部分配
列への到達を可能にし、かつ突然変異による遺伝子の修
飾を容易化する。
しかも、天然アンギオゲニン中に含まれるメチオニンの
みのコドンが、生物活性の損失なしに、励合タンパク質
のβ−ガラクトシダーゼ断片から臭化シアンでの切断に
よるアンギオゲニンの有利な分離を可能にするロイシン
、イソロイシン又はバリンコドンに変換された。
適切なベクターのレギュレーター領域、β−ガラクトシ
ダーゼ断片、適切であればアダプター及び構造遺伝子か
らなる遺伝子構造の組込み、この方法で得られるハイブ
リッドベクターの適切な宿主細胞中への導入、宿主細胞
の培養、細胞破壊、融合タンパク質の単離及び切断、並
びに所望のポリペプチドの単離については、一般に公知
である。
このことに関しては、広く用いられるテキスト及びハン
ドブックを参照することができる。
好ましいベクターはプラスミドであり、特にｐＢＲ３２
２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ８及びｐＵＣ９のような大腸
菌と和合性のあるプラスミド類、並び他の市販又は通常
人手ｎＪ能なプラスミドである。好ましい細菌宿主は大
腸菌である。
本発明は下記例で詳細に説明される。
例　　１ 市販プラスミドｐＵＣ９（例えば、ビエラら。
ジーン、第１９巻、１９８２年、第２５９−２６８頁（
Ｖｌｃｌｒａ　ａｔ　ａｔ、、　Ｇｅｎｅ、　１９　（
１９８２）　２５９−２８８）　　；分子生物学カタロ
グ、ファルマシアＰ−Ｌバイオケミカルズ、１９８４年
、補巻、第４０頁（Ｍｏｌｅｃｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ　ＣａＬａｌｏｇｕｅ、　Ｐｈａｒａ＋ａｃｉａ
Ｐ−Ｌ　Ｂｌｏｃｈｅｓｌｃａｌｓ、　１９８４．＾ｐ
ｐｅｎｄｌｘ、　ｐａｇｅ　４０）３２０μｇを制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＰｖｕ　Ｉでの二重消
化に付し、長さ１２３塩基対（Ｂ　ｐ）のＤＮＡ断片を
ゲル電気泳動により分離する。この断片はβ−ガラクト
シダーゼのアミノ末端コード配列部分を含んでいる。
天然ＥｃｏＲＩ切断部位までのβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子のカルボキシル末端部分を単離するために、プラス
ミドｐＵＲ２７０（リュザー及びミュラー−ヒル、エン
ボΦジャーナル、第２巻。
１９８３年、第１７９１−１７９４年（Ｒｕｔｈｅｒａ
ｎｄ　Ｍｉｉｌｌｃｒ−Ｈｌｌｌ、　ＥＭＢＯＪｏｕｒ
ｎａｌ、　２　（１９８３）１７９１−１７９４　）　
）　２０μｇを最初にＥｃｏＲＩで消化し、しかる後Ｐ
ｖｕｌ酵素による部分的消化に付す。
２８９５ＢｐのＤＮＡ断片を分離し、５％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により単離する。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子のアミノ末端及びカルボキ
シル末端ＤＮＡ断片を１６℃で６時間かけて互いに結合
させ、結合生成物をエタノールで沈降させる。沈降しか
つ再懸濁されたＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、再度５％
ポリアクリルアミドゲル上で分別する。長さ３０１８Ｂ
ｐのＤＮＡ断片を電気溶離によりゲルから単離し、プラ
スミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ切断部位に結合させる
。この方法で得られるハイブリッドプラスミドはｐｗｚ
　　Ｒ１と称される。
上記反応工程は第２図に示されている。個々の測定は公
知の方法で行なわれた〔マニアナイスら。
分子クローニング、コールド・スプリング・ハーバ−，
１９８２年（Ｍａｎｌａｔｌｓ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｏ
ｌｅｃｕｌｅｒＣｌｏｎｉｎｇ、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ、　　１９８２　　）　　）
　　。
プラスミドｐｗｚ　　ＲＩを大腸菌に組込んで形質転換
し、そこで増幅させ、再単離する。短鎖化されたβ−ガ
ラクトシダーゼアミノ及びカルボキシル末端遺伝子断片
を取出して、かつそれを予備的に単離することは、Ｅｃ
ｏＲＩでの消化によれば可能である。公知の制限酵素切
断部位は更に短い構造とするために用いることができ、
これらは適切な発現プラスミドに挿入しうる。第１Ａ図
は短鎖化された例を示している。
第１Ｂ図は化学的合成リンカ−を用いた構造について示
している。
第１Ａ図の構造及び第１Ｂ図の構造の双方は、短鎖化β
−ガラクトシダーゼの読取枠が所望のカルボキシル末端
ポリペプチドの読取枠と連続するように選択される。第
１Ｂ図の化学的合成リンカ−はいかなる所望の構造であ
ってもよいが、但し停止コドンのない読取枠を保証する
ものでなければならず、しかも適切であればＡＴＧ開始
コドンを保証しかつ所望の制限酵素切断部位を有してい
なければならない。
例２ ＥｃｏＲＩ切断によりｐＷＺＲＩから入手可能なβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子断片において有利な短鎖化及び修
飾は、以下のようにして行なうことができるニ プラスミドｐＷＺＲＩ（第２図）１０ｕｇを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ及びＰｖｕｌで切断し、７．５％ポリアクリル
アミドゲルによる分別を行なう。
長さが１２３及び１２２２ＢｐのＤＮＡ断片をｊ、ｌｉ
離する。次いで等モル量の２つのＤＮＡ断片を１０℃で
６時間かけて互いに結合させ、しかる後ＥｃｏＲＩで消
化する。この方法で得られる結合混合物を７．５％ポリ
アクリルアミドゲル上で分別し、長さ１３４５ＢｐのＤ
ＮＡバンドを予備的に単離する。このＤＮＡ断片を、Ｅ
ｃｏＲＩで開環されしかる後脱リン酸化されたベクター
ｐＢＲ３２２に結合させる。この方法で得られるプラス
ミドはｐＷＺＰＲＩと称される。
ｐＷＺＰＲＩ中に含まれるメチオニン（Ｍｌ−Ｍ８）の
８コドン及びこのプラスミド中に存在するシスティン（
Ｃ１−Ｃ６）の６コドンを取除くために、ｐＷＺＰＲ１
由来ＤＮＡ　　１μｇをＥｃｏＲＩで切断する。大きさ
１３４５Ｂｐの断片を、ＥｃｏＲｌで開環されしがる後
脱リン酸化されたファージベクターＭ１３ｍｐ１９ａｍ
（パチンスキーら、ジャーナル・オブ・パイロロジー。
第５９巻、１９８６年、第３４１−３５３頁（Ｐａｔｓ
ｃｈｌｎｓｋｙ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
（’　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５９（１１８６）　３４１−
３５３）　］に結合させる。大腸菌ＪＭ１０１のトラン
スフェクション後に得られるファージはＭＷＺＰａｍと
称される。メチオニンのコドンの除去に関する最初の工
程として、標的インビトロ突然変異誘発をギャップ二重
化法（ｇａｐｐｅｄｄｕｐｄｌｅｘ　ｌ１ｅｔｈｏｄ）
　　（クラマーら、ヌクレイツク中アシッズーリサーチ
、第１２巻、１９８４年、第９４４１−９４５６頁（Ｋ
ｒａａ＋ｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ
ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１２　（１９８４）　９４
４１−９４５６　）　）により行なうが、但しこの方法
の高効率性（平均７０％）の故に４つのオリゴヌクレオ
チドｄＭ５−ｄＭ８　（第２表）を変異原性ブライマー
（ＩＩｌｕｔａｇｃ−ｎｌｃ　ｐｒｉＩＩｅｒ）として
用いる。得られる１２のファージの５ｓＤＮＡを配列決
定するが、その際にｄＭ７及びｄＣ５（第２表）を正常
な１７瓜体ブライマー以外の配列決定のためのプライマ
ーとして用いる。１２のＤＮＡのうちの２つは４つすべ
ての望ましい突然変異を有しており、即ちＭＳ−ＭＳに
関するコドンはイソロイシンに関するコドンに変換され
ていた。これらのファージはＭＷＺＰ　　ｄＭ５．８と
称される。残存メチオニンコドンを除去するために、Ｍ
ＷＺＰ　　ｄＭ５゜８のＲＦ　　ＤＮＡをＥｃｏＲＩで
切断し、大きさ１３４５ＢｐのＤＮＡ断片を脱リン酸化
Ｍ１３ｍｐ１９ａｍに組込んでクローニングする。
この方法で得られるファージは、ＭＷＺＰ　　ｄＭ５．
８ａｍと称される。このファージの５ｓＤＮＡを変異原
性ブライマーとしてのｄＭｌ−ｄＭ４で更にインビトロ
突然変異に付す。得られる１２のファージの５ｓＤＮＡ
を配列決定すると、ファージ１２のうち３つはすべて望
ましい突然変異を有しており、即ちＭｌ−Ｍ３のコドン
がロイシンのコドンに変換されかつＭ４のコドンがイソ
ロイシンのコドンに変換されていた。これらのファージ
はＭＷＺＰｄＭと称される。これらファージのＲＦ型か
らの１３４５Ｂｐ　　ＥｃｏＲＩ断片を脱リン酸化ベク
ターｐＢＲ３２２に組込むクローニングにより、プラス
ミドｐｗｚｐ　　ｄＭを得る。システィンに関するコド
ンをセリンに関するコドンで更に変換するために、ｐＷ
Ｚ　ｐｄＭからの１３４５Ｂｐ　　ＥｃｏＲＩ断片を単
離し、脱リン酸化ファージベクターＭ１３ｍｐ１９ａｍ
に組込んでクローニングする。この方法で得られるファ
ージＭＷＺＰ　　ｄＭａｍの５ｓＤＮＡを変異原性ブラ
イマーとしてのｄｃｌ−ｄＣ６によるインビトロ突然変
異に付す。得られる２４のファージの５ｓＤＮＡを配列
決定すると、ＭＷＺＰ　　ｄＭｄＣと称される４つのフ
ァージクローンは正確であることが判明し、それらにお
いてシスティンに関するすべてのコドンはセリンに関す
るコドンに変換されていた。これらファージのＲＦ　　
ＤＮＡをＥｃｏＲ１切断し、１３４５Ｂｐ　　ＥｃｏＲ
Ｔ断片を脱リン酸化ベクターｐＢＲ３２２に組込んでク
ローニングすると、プラスミドｐｗｚｐ　　ｄＭｄＣが
得られる。
例３ β−ガラクトシダーゼ遺伝子の短鎖及び／又は修飾体が
組込まれて有利にクローニングされうるプラスミドｐＬ
ＺΔは、以下のように得ることができる（第３図）ニ プラスミドｐＢＲ３２２１０μｇを制限エンドヌクレア
ーゼＥｃｏＲＩ及びＰｖｕ■で切断し、１％アガロース
ゲル上で分別を行なう。大きさ２２９３ＢｐのＤＮＡ断
片を精製し、ＨａｅＩｌで部分的に切断し、１％アガロ
ースゲル上で電気泳動を繰返す。大きさ２０１７Ｂｐの
ＤＮＡ断片を単離し、大きさ２２５ＢｐのＤＮＡ断片と
１２℃で一夜かけて結合させるが、後者の断片はＥｃ。
Ｒ１及びＨａｅＩＩによるｐＵＲ２（リユーザー。
モレキュラー・アンド・ゼネラル・ゲネティクス。
第１７８巻、１９８０年、第４７５−４７７頁（Ｒｕｃ
ｈｅｒ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａ
ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　１７８（１９８０）　４７５
−４７７）　）の切断後に得られたものであってかつｌ
ａｃオペロンのプロモーター／オペレーター、リポソー
ム結合部位及びＩａｃ　　Ｚ遺伝子の最初の５コドン（
開始コドンを含む）を有している。コンピテント（ＣＯ
■ｐｅｔｅｎＬ　）大腸菌細胞の形質転換により、プラ
スミドｐＬＺΔを得る。
例４ 短鎖化β−ガラクトシダーゼをもつ融合タンパク質とし
てのポリペプチド発現用としては複数のクローニング部
位が存在する故に適切、であるプラスミドを、下記のよ
うにして得る（第４図）ニブラスミドｐＬＺΔ（第３図
）　１ａｇをＥｃ。
Ｒ１で開環し、脱リン酸化し、ｐＷＺＰｄＭｄＣ（例２
）からの大きさ１３４５Ｂｐの修飾Ｅｃ。
Ｒ１断片と１２℃で一夜かけて結合させる。コンピテン
ト大腸菌細胞の形質転換、β−ガラクトシダーゼ発現用
としての選択及び様々な制限エンドヌクレアーゼ用の切
断部位の正確な配置の結果、プラスミドｐＬＺＰ　　Ｒ
１ｄＭｄＣを得る（第４図）。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子の３′末端におけるＥｃｏ
Ｒ１部位に組込む複数クローニング部位のクローニング
のためには、標的インビトロ突然変異誘発により５′末
端でＥｃｏＲＩ部位を削除することが有利である。この
場合に、大きさ１７６７ＢｐのＰｓｔｌ−Ｓａｃｌ断片
がＭ１３ｍｐ　１９ａｍに組込まれてクローニングされ
、かつ変異原性プライマｍ： ５’　−ＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ
Ｇ−３’を用いるギャップ二重化法によるインビトロ突
然変異誘発に付すことを要する。配列決定及び制限分析
によると、：Ａ査された４つのファージクローンのうち
２つのＤＮＡが望みどうりにＥｃｏＲＩ用切断部位を欠
いていることを示している。これらファージクローンの
ＲＦ　　ＤＮＡから大きさ１７６７ＢｐのＰｓｔｌ−５
ａｃｌ断片を単離し、ｐＬＺＰ　　Ｒ１ｄＭｄＣからの
大きさ１８２０ＢｐのＰｓｔｌ−ＳａｃＩ断片と１６℃
で４時間かけて結合させる。コンピテント大腸菌細胞の
形質転換によりプラスミドｐＬＥＰ　　ｄＭｄＣを得る
（第５図）。
複数クローニング部位の組込みのために、ｐＬＺＰ　　
ｄＭｄＣ２ｕ、をＥｃｏＲＩで開環し、脱リン酸化し、
多数の制限酵素切断部位をもつ下記の化学的合成りＮＡ
配列（ＭＣ５）と結合させる： ｓ’、　、　　　　ａ　ＣＴＣＧＡＧ　ＣＧＧ　ＧＣＣ
ｃａｒ　ｂａａ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ｃｘａＰｓ
ｔ　　Ｉ　　　　　　　　　　Ｈｌｎｄ　　ＸＩＸ　　
　　Ｎｒｕ　　Ｉ　　　　　Ａｖａ　　１１１　　　　
８ｇｌ　　１１−一二一一一一一一− ｃ’ｒｃ　　　ＣｋＧ　　　ＣＣＣλ＾Ｇ　　　Ｃｒ’
！　　　ＣＧＣＣＡＴ　　　（、ＣＡ　　　ＴＣ入　　
ＣＡＴ　　ＣＴＡＧＡＣ（ＴＣＧＧＧ　ＴｒＣＧ豐（５
ＣＴＡ　ＣＧＴ　ＡＧＴ　ＣＴＡ　ＣＡＴこの方法で、
かつコンピテント大腸菌細胞の形質転換後に、ＭＣ５配
列の向きに関して互いに異なるプラスミドｐＬＺＰＷＢ
１　　ｃｌｉｄｃ及びｐＬＺＰＷＢ２　　ｄＭｄＣを得
る（第５図）。
例５ 特にロイシン、イソロイシン又はバリンのコドンによる
Ｍｅｔ−３０のコドンの置換によって正常ヒトアンギオ
ゲニン遺伝子とは異なる合成アンギオゲニン遺伝子（第
１表）を、以下のように前記ベクターｐＬＺＰＷＢ２　
　ｄＭｄＣに組込んでクローニングする： アンギオゲニンの合成遺伝子は、１２のオリゴヌクレオ
チド組立てブロックから構成されている（第３表参照）
。
遺伝子組立てブロックの合成は、ヌクレオチド１−４９
のコード鎖を含む遺伝子構造ユニットＩａの例によって
説明される。同相合成のために、３′末端に位置するヌ
クレオシド、即ち本ケースではアデノシン（ヌクレオチ
ドＮα４９）を３′　〜ヒドロキシル基を介して担体に
共有結合させる。
担体物質は、長鎖アミノアルキル基で官能化されたＣＰ
Ｇ　（制御された多孔質ガラス）である。
次の合成工程では、基本成分を５′　−〇−ジメトキシ
トリチルヌクレオシド−３′　−リン酸のジアルキルア
ミドのβ−シアノエチルエステルとして用いるが、その
場合においてアデニンはＮ６−ベンゾイル化合物の形で
あり、シトシンはＮ４−ベンゾイル化合物の形であり、
グアニンはＮ２−イソブチリル化合物の形であり、チミ
ンは保護基をもっていない。
Ｎ６−ペンゾイルアデノシン０．２μｍｏｌを含む重合
担体２５ｍｇを下記試薬で連続処理する：Ａ）　アセト
ニトリル Ｂ）　ジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸溶液 Ｃ）　アセトニトリル Ｄ）　無水アセトニトリル０．１５ｍ１中の適切なヌク
レオシド−３′　−〇−ホスファイト５ｍｏｌ及びテト
ラゾール２５μｍｏｌ Ｅ）　アセトニトリル Ｆ）　４０％ルチジン及び１０％ジメチルアミノピリジ
ン含有のテトラヒドロフラン中の２０％無水酢酸 Ｇ）　アセトニトリ Ｈ）　容量比１０：１：４０のルチジン／水／テトラヒ
ドロフラン中の３％ヨウ素 これに関して、“ホスファイト”とは２′　−デオキシ
リボース−３′　−亜リン酸のモノ−β−シアノエチル
エステルと解されるべきであり、第三の結合価はジイソ
プロピルアミノ基で飽和されている。各合成工程におけ
る収率は、分光測定器における波長４９６ｎｍでのジメ
トキシトリチルカチオンの吸光度測定によって各々の脱
トリチル化反応Ｂ）後に調べることができる。
合成終了後、ジメトキシトリチル基をＡ）〜Ｃ）で記載
のように切除する。オリゴヌクレオチドをアンモニア処
理により担体から切断し、同時にβ−シアノエチル基を
除去する。５０℃で１６時間にわたる濃アンモニアによ
りオリゴマー処理で、塩基からアミノ保護基を定量的に
切除する。この方法で得られる粗生成物をポリアクリル
アミドゲル電気泳動で精製する。
５′末端におけるオリゴヌクレオチドのホスホリル化の
ために、各々のオリゴヌクレオチド１ｂ〜５ａ　　ｌｎ
ｍｏｌを３７℃で３０分間にわたり５０ｍＭ）リスＨＣ
Ｉ緩衝液（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ塩化マグネシウム及
び１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）の２０μｇ中
のアデノシン三リン酸５ｎｍｏ　１及びＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ４単位で処理する。酵素を９５℃で５分
間加熱することにより不活性化させる。ＤＮＡ配列ｌに
おいて“突出“一本鎖配列を形成しているオリゴヌクレ
オチド１ａ及び６ｂはホスホリン化されない。これによ
り、次の結合において、ＤＮＡ配列配列対応するよりも
長い遺伝子断片の形成を阻止する。
オリゴヌクレオチド１８〜６ｂ（第３表参照）を以下の
ように結合させて、完全遺伝子を得る（第６図）： オリゴヌクレオチド１ａ及び１ｂ〜６ａ及び６ｂ各１ｎ
ｍｏｌを、それらの各々を５０ｍＭトリスＨＣＩ緩衝液
（ｐＨ７，６）　、１０ｍＭ塩化マグネシウム及び１０
ｍＭ　　ＤＴＴの２０μｇに溶解し、この溶液を９５℃
で５分間加熱し、かつそれを２時間以内に室温まで冷却
することによって、ベアでハイブリッド形成させる。オ
リゴヌクレオチド１ｂ〜６ａは、この場合に５′　−リ
ン酸の形で使用する。形成される二重らせんＤＮＡ断片
の次の結合のために、その溶液を互いに結合させ、第６
図に示されているような完全遺伝子を得る。
遺伝子を、マーカーとしてＨｉｎｆｌで切断された物質
φＸ１７４ＤＮＡ　（ＢＲＬ由来）又はＨａ　ｅｍで切
断されたｐＢＲ３２２を用いる６％ポリアクリルアミド
ゲル上でのゲル電気泳動（尿素非添加、４０Ｘ２０ＸＯ
，１（Ｊ）により精製する。
この方法で得られる５ｐｈｌ−ＥｃｏＲＩ断片を、Ｅｃ
ｏＲＩ及び５ｐｈＩで切断されたベクターｐＬＺＰＷＢ
２　　ｄＭｄＣと１６℃で一夜かけて結合させる。コン
ピテント大腸菌細胞の形質転換によりアンピシリン耐性
コロニーを得るが、これは期待された大きさの融合タン
パク質の発現に関して調べられる。４つの陽性クローン
がアンギオゲニン部分の配列分析をうけたところ、４つ
のクローンのうち２つの配列が正確であると判断した。
これらのプラスミドはｐ　Ｌ　Ｚ　ＰＷＢ　２ｄＭｄＣ
Ａｎｇと称される。
アンギオゲニン１ｉｅ−３０及びＶｏ　ｌ　−３０に関
する遺伝子は、それぞれオリゴヌクレオチド２Ｃと２ｄ
及び２ｅと２ｆとの結合によって同一方法で得られる（
第４表）。
例６ 望ましい光学濃度まで培養される細菌株を、適切な時間
、例えば２時間にわたり、インデューサーとしてのＩ　
ＰＴＧで誘導する。次いで細胞を０．１％クレゾール及
び０．１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ペ
ンジルスルホニルフルオリド）で殺す。遠心分離又は濾
過後、多量の細胞を適切な装置〔フレンチ・プレス（Ｆ
ｒｅｎｃｈｐｒｅｓｓ）又はダイハミューレ（■Ｄｙｎ
ｏ−Ｍｊｈｌｅ）　）においてｐＨ３，０の酸化水溶液
中で破壊し、しかる後不溶性成分を回転沈降させる。タ
ンパク質を標準的方法で上澄から単離する〔グローら、
アンゲワンテ・ケミ−１第９８巻、１９８６年、第５３
０頁（Ｇｒａｕ　ｅＬ　ａｌ、、　Ａｎｇｅｖａｎｄｔ
ｅ　Ｃｈｅａ＋ｌｅ、　９ｇ（１９８Ｇ）　５３０）　
）。生成物の豊富度及び純度はＨＰＬＣ分析により調べ
る。
融合タンパク質からアンギオゲニンを遊離させるだめに
、乾燥残渣を７０％ギ酸に溶解し、室温（ＲＴ）で４時
間臭化シアン２０重量％（使用される乾燥重量として）
とインキュベートする。メチルｔ−ブチルエーテル５倍
容量で沈降させて臭化シアン切断生成物を得るが、そこ
から還元アンギオゲニンの高濃度バッチが還元条件下（
例えば、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール等
の添加）での適切な陽イオン交換剤（例えば、ｐＨ８の
６〜８Ｍ尿素添加Ｓ−セファロース（Ｓ−８ｃｐｈａｒ
ｏｓｃ■））によるクロマトグラフィーによって単離す
ることができる。酸化及び還元グルタチオンの適切な混
合物を用いる還元タジバク質の古典的再生方法〔例えば
、カリム・アーメドら。
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第
２５０巻、１９７５年、第８４７７−８４８２頁（Ｋａ
ｒｉｓ　Ａｔｖｅｄ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｌ’ｒ３１ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、　２５０　（１９７５）８４７７−８４８２））を、
アンギオゲニンを屈曲させて３本のジスルフィド架橋結
合が形成された天然三次構造とするために用いる。高純
度アンギオゲニンを、ゲル濾過としかる後イオン交換ク
ロマトグラフィーによって、折り曲げられた生成物から
単離する。
最終生成物の純度は、逆相ＨＰＬＣ及びＳＤＳゲル電気
泳動により調べる。血管形成活性は、ＣＡＭアッセイ及
びウサギ角膜アッセイ〔フエット（Ｆｃｔｔ）ら、バイ
オケミストリー、第２４巻。
１９８５年、第５４８０−５４８６頁〕で検出される。
第２表 メチオニンのコドンをロイシン又はイソロイシンのコド
ンに変え、システィンのコドンをセリンのコドンに変え
るための変異原性プライマー：ｄＭｌ　５’−ＡＧ　Ａ
ＣＣＧＴＴ　ＣＡＧ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＣＴＣＧｄＭ２
５’−ＡＧ　ＣＧＣＣＡＣＣＡＯＣＣＡ　ＧＴＧ　ＣＡ
Ｇ　ＧｄＭ３　Ｓ’−ＣＣＡ　ＡＡＡ　ＡＴＣＣＡＣＴ
ＴＣＧＣＴ　Ｃ；Ｃ；Ｔ　ＧｄＭ４５’−ＣＧＣＣＡＡ
Ｔ　ＣＣＡ　ＴＡＴ　ＣＴＧ　ＴＧＡ　ＡＡｄＭ５５’
−ＣＧＧＴ　ＡＡτα；ＣＡＡＴ　’１７ｒＧ　ＡＣＣ
ＡＣｄＭ６　Ｓ’−Ａ　Ｃ（：Ｇ　ＣＧＴ　ＡＴＡ　Ｃ
ＡＴ　にＴＣＴにＡ　ＣＡｄＭ７５’−Ｇ　ＣＣＴ　Ｇ
ＧＴＴｒＣＡＡＴ　ＣＡＧＴＴＧ　ＣＴｄＭ８　５’−
ＣＡＣＣＡＡＴ　　ＣＣＣＴＡＴ　　八τＣ；　　ＧＡ
Ａ　　ＡＣＣｄｃｌ　　５’−に　　ＡＣＣＧＴＴ　　
ＣＡに　　ＡにＡ　　ＧＡＡ　　ＣＴＧ　　にＣにｄＣ
２５’−ＣＡＣＣＴＣにＡＴ　Ｃ：ＩｃＡ　ＡＡＡ　Ａ
’ｒＣＣＡＧ　ＴＴＣｄＣ３５’−ＡＴＣＴＧＣＣにＴ
　ＧＧＡ　ＣＴに　ＣＡＡ　ＣＡＡｄＣ４５’−ＣＣ；
ＣＣＡに　ＣＴＧ　ＧＧｋ　ＧＴＴ　ＣＡＧ　ＧＣＣｄ
ｃｓ　Ｓ”−α：に　ＣＴＣＡＡＡ　ＡにＡα；ＣにＣ
ＴＣＡＧτｄｃ６ｓｌ−ａｃＧＣＯＴ　ＣＣＣｃｃＡａ
ｃｃ　ＣＡＧ　ＡＣＣ
【図面の簡単な説明】
図面は下記のように本発明について説明している： 第１図は、リンカ−のない（Ａ１．−５．　）及びある
（Ｂ１．−５．　）短鎖化β−ガラクトシダーゼ配列の
構築について示している。 第２図は、プラスミドｐｗｚ　　Ｒ１（ｐＵｅ９及びｐ
ＵＲ２７０からの、β−ガラクトシダーゼ断片をもつｐ
ＢＲ３２２誘導体）の構築について示している。 第３図はプラスミドｐＬＺΔの構築について示している
。 第４図は、ｐＷＺＩＰ　　ｄＭｄＣからのプラスミドｐ
ＬＺＰ　　Ｒ１ｄＭｄＣの構築について示している。 第５図は、プラスミドｐ　Ｌ　Ｚ　ＰＷＢ　１ｄＭｄＣ
及びｐＬＺＷＰＢ２　　ｄＭｄｃの構築について示して
いる。 第６図は、合成アンギオゲニンを得る結合反応について
図示しており、図中Ｒは精製を表わし、Ｌは結合を表わ
し、丸印は５′　−リン酸基を表わす。 図面は等尺度ではない。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 ５′３・

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、β−ガラクトシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼ断
    片に関する遺伝子を介して正しい読取枠内でアンギオゲ
    ニンに関する構造遺伝子をレギュレーター領域に結合さ
    せ、この遺伝子構造を細菌中に導入し、その中で不溶性
    融合タンパク質を発現させ、細胞破壊後にそれを単離し
    、かつ望ましいアンギオゲニンを化学的又は酵素的に切
    断することによるアンギオゲニンの産生方法であって、
    β−ガラクトシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼ断片に
    関する遺伝子において、メチオニン及び／又はアルギニ
    ン及び／又はシステインに関するコドンを他のアミノ酸
    のコドンで全部又は一部置換することを特徴とする方法
    。 ２、遺伝子構造が、アミノ酸２５０個以上であるものの
    全β−ガラクトシダーゼ配列よりかなり短かいβ−ガラ
    クトシダーゼ断片についてコードしている、請求項１に
    記載の方法。 ３、β−ガラクトシダーゼ断片がアミノ末端及び／又は
    カルボキシル末端部分配列の融合体からなる、請求項２
    に記載の方法。 ４、β−ガラクトシダーゼ断片がアミノ酸約３００〜約
    ８００個を有する、請求項１、２又は３に記載の方法。 ５、β−ガラクトシダーゼ断片がアミノ酸約３２０〜約
    ６５０個を有する、請求項１、２又は３に記載の方法。 ６、β−ガラクトシダーゼ断片に関する遺伝子が第１図
    で示されているＤＮＡ配列に相当する、請求項１〜５の
    いずれか一項に記載の方法。 ７、アンギオゲニンに関する構造遺伝子が修飾β−ガラ
    クトシダーゼ断片に関する遺伝子にアダプターを介して
    結合せしめられている、請求項１〜６のいずれか一項に
    記載の方法。 ８、アダプターがポリ（アミノ酸）配列についてコード
    している、請求項７に記載の方法。 ９、β−ガラクトシダーゼ部分からのアンギオゲニンの
    化学的又は酵素的分離をなしうるアミノ酸に関するコド
    ンが構造遺伝子のアミノ末端のすぐ上流に置かれている
    、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。 １０、アンギオゲニンに関する構造遺伝子が第１表又は
    第４表のＤＮＡ配列を有する、請求項１〜９のいずれか
    一項に記載の方法。 １１、レギュレーター領域、メチオニン及び／又はアル
    ギニン及び／又はシステインに関するコドンが他のアミ
    ノ酸のコドンで全部又は一部置換された修飾β−ガラク
    トシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼ断片に関する遺伝
    子、及びアンギオゲニンに関する構造遺伝子を有する遺
    伝子構造。 １２、アンギオゲニンに関する構造遺伝子が正しい読取
    枠を確保させるアダプターを介して修飾β−ガラクトシ
    ダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼ断片に関する遺伝子に
    結合せしめられている、請求項１１に記載の遺伝子構造
    。 １３、請求項１１又は１２に記載の遺伝子構造を有する
    ベクター。 １４、請求項１３に記載のベクターを有する細菌。 １５、請求項１３に記載のベクターを有する大腸菌。 １６、請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾β−ガ
    ラクトシダーゼ又はβ−ガラクトシダーゼ断片、及びア
    ンギオゲニンを有する融合タンパク質。 １７、アンギオゲニンが第１表又は第４表のアミノ酸配
    列を有する、請求項１６に記載の融合タンパク質。 １８、第１表又は第４表のアミノ酸配列１〜１２３を有
    するアンギオゲニン誘導体。
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