JPS6069098A - セクレチンの調製法 - Google Patents
セクレチンの調製法Info
- Publication number
- JPS6069098A JPS6069098A JP59165761A JP16576184A JPS6069098A JP S6069098 A JPS6069098 A JP S6069098A JP 59165761 A JP59165761 A JP 59165761A JP 16576184 A JP16576184 A JP 16576184A JP S6069098 A JPS6069098 A JP S6069098A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- secretin
- formula
- polypeptide
- gene
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/645—Secretins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Blow-Moulding Or Thermoforming Of Plastics Or The Like (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Control Of Vending Devices And Auxiliary Devices For Vending Devices (AREA)
- Tires In General (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
西ドイツ特許出願Ｐ３３２７００７．４号（未公開）明
細書には式Ｉ Ｙ−Ｒ−ＮＨ２（Ｉ） （式中Ｙはメチオニン残基またはメチオニンを介して結
合した細菌蛋白質残基でありそしてＲは遺伝的にコード
化されうるアミノ酸のペプチド配列を意味する）を有す
るポリペプチドを調製するに当り、式ＩＩ Ｙ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ（ＩＩ）を有するポリ
ペプチドを遺伝子工学的に産生させそしてこの生成物を
酵素的に式Ｉのポリペプチドに変換することを特徴とす
る方法が提案されている。この方法の好ましい態様にお
いては遺伝子工学的に式ＩＩ（式中Ｒは何らメチオニン
残基を含有しない）のペプチドを産生させ、そして次に
ブロムシアン分解により残基Ｙを除去する。
細書には式Ｉ Ｙ−Ｒ−ＮＨ２（Ｉ） （式中Ｙはメチオニン残基またはメチオニンを介して結
合した細菌蛋白質残基でありそしてＲは遺伝的にコード
化されうるアミノ酸のペプチド配列を意味する）を有す
るポリペプチドを調製するに当り、式ＩＩ Ｙ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ（ＩＩ）を有するポリ
ペプチドを遺伝子工学的に産生させそしてこの生成物を
酵素的に式Ｉのポリペプチドに変換することを特徴とす
る方法が提案されている。この方法の好ましい態様にお
いては遺伝子工学的に式ＩＩ（式中Ｒは何らメチオニン
残基を含有しない）のペプチドを産生させ、そして次に
ブロムシアン分解により残基Ｙを除去する。
今、この方法によりセクレチンを調製されうろことが見
出された。
出された。
十二指腸からのホルモンであるセクレチンは式
を有するペプタコシペプチドである〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｌ
ｏｃｈｅｍ、第１５巻第５１３〜５１９頁（１９７０年
）参照〕。
ｏｃｈｅｍ、第１５巻第５１３〜５１９頁（１９７０年
）参照〕。
このものは膵臓の重炭酸塩分泌を刺激しそしてガストリ
ンにより刺激された胃酸分泌を抑制する。これらの理由
からセクレチンは例えば胃腸管における損傷のような胃
腸疾患において良好な医薬であるととを約束するもので
ある。
ンにより刺激された胃酸分泌を抑制する。これらの理由
からセクレチンは例えば胃腸管における損傷のような胃
腸疾患において良好な医薬であるととを約束するもので
ある。
しかしながらセクレチンを用いる治療は、小腸の粘膜中
に非常に少量にのみ存在する天然のセクレチンの単離物
生産原価が高いのでうまくゆかなかった。この理由で、
セクレチンを比較的大嵐に調製する多截のセクレチン合
成が既に記載されてきたが、しかしながら大へんな労力
およびそれと結びついた高い価格ゆえに満足できるもの
ではなかった。従ってセクレチンは段階的にｐ−ニトロ
フェニルエステル法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第
８９巻第６７５３〜６７５７頁（１９６７年）参照）、
「Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｅｘｃｅｓｓ Ｍｉｘｅｄ
Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ」（ＲＥＭＡ）法（Ｈｏ１ｙ．Ｃｈ
ｌｍ．Ａｃｔａ第５９巻第１１１２〜１１２６頁（１９
７６年）およびＩｎｔ．Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅ
ｉｎ Ｒｅｓ．第１８巻第２７６〜２８３頁（１９８１
年）または固相（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｒｅｓ．第９巻第６６〜７０頁を（１９７７
年）参照）を用いて合成された。セクレチンの合成にセ
グメントを使用するにはできるだけラセミ化のない結合
法を必要とする。従ってアジド法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ
．Ｓｅｃ．第９０巻第４７１１〜４７１５頁（１９６８
年））およびジシクロへキシルカルボジイミド／Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド法（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．第１０
５巻第２５０８〜２５１４頁（１９７２年））を用いて
既にセクレチンが合成できた。ＤＣＣ−結合のもう一つ
の方法は１−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび３−
ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，
３−ベンゾトリアジンをラセミ化低下および溶解補助の
ために使用することにある（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．第１０
７巻第２１５〜２３１頁（１９７４年）およびＧｕｔ
Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，Ｓ．Ｒ．Ｂｌｏｏｍ編第１６５〜１
６８頁（１９７８年）参照）。
に非常に少量にのみ存在する天然のセクレチンの単離物
生産原価が高いのでうまくゆかなかった。この理由で、
セクレチンを比較的大嵐に調製する多截のセクレチン合
成が既に記載されてきたが、しかしながら大へんな労力
およびそれと結びついた高い価格ゆえに満足できるもの
ではなかった。従ってセクレチンは段階的にｐ−ニトロ
フェニルエステル法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第
８９巻第６７５３〜６７５７頁（１９６７年）参照）、
「Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ Ｅｘｃｅｓｓ Ｍｉｘｅｄ
Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ」（ＲＥＭＡ）法（Ｈｏ１ｙ．Ｃｈ
ｌｍ．Ａｃｔａ第５９巻第１１１２〜１１２６頁（１９
７６年）およびＩｎｔ．Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅ
ｉｎ Ｒｅｓ．第１８巻第２７６〜２８３頁（１９８１
年）または固相（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｒｅｓ．第９巻第６６〜７０頁を（１９７７
年）参照）を用いて合成された。セクレチンの合成にセ
グメントを使用するにはできるだけラセミ化のない結合
法を必要とする。従ってアジド法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ
．Ｓｅｃ．第９０巻第４７１１〜４７１５頁（１９６８
年））およびジシクロへキシルカルボジイミド／Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド法（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．第１０
５巻第２５０８〜２５１４頁（１９７２年））を用いて
既にセクレチンが合成できた。ＤＣＣ−結合のもう一つ
の方法は１−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび３−
ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，
３−ベンゾトリアジンをラセミ化低下および溶解補助の
ために使用することにある（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．第１０
７巻第２１５〜２３１頁（１９７４年）およびＧｕｔ
Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，Ｓ．Ｒ．Ｂｌｏｏｍ編第１６５〜１
６８頁（１９７８年）参照）。
これに対し本発明による方法はセクレチンを高純度に調
製する効率のよい方法である。
製する効率のよい方法である。
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｌ）における
デスアミド−セクレチンの遺伝子工学的調製は既に知ら
れている（Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．−Ｉ．Ｓｕｍｉ，Ａ
．Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｔ．Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｋ．−
Ｉ．Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｓ．Ｗａｋｉｓａｋａ，Ｔ．Ｍｉ
ｙａｋｅｕｎｄ Ｆ．Ｍｉｓｏｋａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第７９巻第２４７５〜２
４７９頁（１９８２年）参照）。合成セクレチン遺伝子
はそこではＲ−末端でβ−ラクタマーゼ遺伝子にメチオ
ニンを介して結合された。発現後、修飾されたβ−ラク
タマーゼを単離しそれをペノチドがブロムシアン分解に
より蛋白質から単離された。
デスアミド−セクレチンの遺伝子工学的調製は既に知ら
れている（Ｍ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．−Ｉ．Ｓｕｍｉ，Ａ
．Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｔ．Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，Ｋ．−
Ｉ．Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｓ．Ｗａｋｉｓａｋａ，Ｔ．Ｍｉ
ｙａｋｅｕｎｄ Ｆ．Ｍｉｓｏｋａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第７９巻第２４７５〜２
４７９頁（１９８２年）参照）。合成セクレチン遺伝子
はそこではＲ−末端でβ−ラクタマーゼ遺伝子にメチオ
ニンを介して結合された。発現後、修飾されたβ−ラク
タマーゼを単離しそれをペノチドがブロムシアン分解に
より蛋白質から単離された。
これに対し本発明によればセクレチルグリシンを遺伝子
工学的に産生させ、これを酵素的にセクレチンに変換す
る。本発明の好ましい態様を以下に詳細に説明する。
工学的に産生させ、これを酵素的にセクレチンに変換す
る。本発明の好ましい態様を以下に詳細に説明する。
遺伝コードを知られているように「崩壊」させる、すな
わち２個のアミノ酸に対してのみ１個のヌクレオチド配
列がコード化され、一方残りの１８個の遺伝的にコード
化されうるアミノ酸には２〜６個の三連文字が割り当て
られる。
わち２個のアミノ酸に対してのみ１個のヌクレオチド配
列がコード化され、一方残りの１８個の遺伝的にコード
化されうるアミノ酸には２〜６個の三連文字が割り当て
られる。
従って遺伝子の合成には莫大な多種のコドン可能性が存
在する。本発明は今やスキーム１スキーム１： に示されそして以下ＤＮＡ配列Ｉとしても示される特に
好ましいＤＮＡ配列に関するものである。
在する。本発明は今やスキーム１スキーム１： に示されそして以下ＤＮＡ配列Ｉとしても示される特に
好ましいＤＮＡ配列に関するものである。
コード化される鎖の５′−末端には制限エンドヌクレア
ーゼＥｃｏＲＩに対応する「突き出た」ＤＮＡ配列が存
在し、一方これに対してコード化される鎖の３′−末端
には制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩに対応して一本鎖の突き出
た配列が存在する。これら２種の異なる認識配列が所望
の方向におけるプラスミド中へのＤＮＡの挿入を、保証
する。
ーゼＥｃｏＲＩに対応する「突き出た」ＤＮＡ配列が存
在し、一方これに対してコード化される鎖の３′−末端
には制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩに対応して一本鎖の突き出
た配列が存在する。これら２種の異なる認識配列が所望
の方向におけるプラスミド中へのＤＮＡの挿入を、保証
する。
これら認識配列とアミノ酸順列に対するコドンとの間に
はコード化される鎖の５′−末端にアミノ酸メチオニン
に対するコドンが存在する。
はコード化される鎖の５′−末端にアミノ酸メチオニン
に対するコドンが存在する。
この鎖の末端にはバリンに対してコード化される三連文
字に続きグリシンに対するコドンおよび好ましくは２個
の終末三連文字が来る。
字に続きグリシンに対するコドンおよび好ましくは２個
の終末三連文字が来る。
構造遺伝子内には制限エンドヌクレアーゼに対する一連
の単一認識配列がとり込まれ、これらは一方ではセクレ
チンの部分配列への接近を生じそしてもう一方ては変異
が行われるのを許容する。これら切断点はスキーム１の
ＤＮＡ配列中に記入されている。
の単一認識配列がとり込まれ、これらは一方ではセクレ
チンの部分配列への接近を生じそしてもう一方ては変異
が行われるのを許容する。これら切断点はスキーム１の
ＤＮＡ配列中に記入されている。
ＤＮＡ配列配列異なる長さのヌクレオチドを有する８個
のオリゴヌクレオチドから、これらを初め化学的に合成
しそして後に６個のヌクレオチドの「粘性末端」を介し
て酵素的に結合させることにより合成されうる。
のオリゴヌクレオチドから、これらを初め化学的に合成
しそして後に６個のヌクレオチドの「粘性末端」を介し
て酵素的に結合させることにより合成されうる。
ＤＮＡ配列Ｉにおいて社さらに、数個のコドンが割り当
てられるアミノ酸においてはこれらが等価ではなくて、
むしろ大腸菌のようなそれぞれの宿主細胞において異な
る選択を示すことが考慮された。さらに回帰性配列は最
小限に抑えられた。
てられるアミノ酸においてはこれらが等価ではなくて、
むしろ大腸菌のようなそれぞれの宿主細胞において異な
る選択を示すことが考慮された。さらに回帰性配列は最
小限に抑えられた。
従ってＤＮＡ配列Ｉの遺伝子構造は比較的小さな単位か
ら容易に入手でき、良く知られたベクター中における遺
伝子断片のサブクローニングを可能にしそして高収量で
のその発現を許容するものである。
ら容易に入手でき、良く知られたベクター中における遺
伝子断片のサブクローニングを可能にしそして高収量で
のその発現を許容するものである。
スキーム２はスキーム１のヌクレオチ配列を示すもので
あるが、しかしその際遺伝子の合成に役立てられる遺伝
子単位Ｉａ〜Ｉｈが強調される。
あるが、しかしその際遺伝子の合成に役立てられる遺伝
子単位Ｉａ〜Ｉｈが強調される。
スキーム２：
これらオリゴヌクレオチド単位は既知の合成技術により
調製されうる（Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ第３９巻第３頁（１９８３年）、およびＳ．Ｊ
．ＢｅａｕｃａｇｅおよびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ
，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ第２２巻第１８５
９頁（１９８１年）参照）。
調製されうる（Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ第３９巻第３頁（１９８３年）、およびＳ．Ｊ
．ＢｅａｕｃａｇｅおよびＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ
，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ第２２巻第１８５
９頁（１９８１年）参照）。
ホスハイト法が用いられる場合は、複素環の保護基とし
てシトシンおよびアデニンにはベンゾイル、ならびにグ
アニンにはイソブチロイル、デオキシリボースの５′−
ＯＨ基にはジメトキシトリチルそして燐酸のエステル保
護基としてメチルが用いられた。ホスハイトの活性化は
テトラゾールを用いて行われた（Ｊ．Ｌ．Ｆｏｕｒｒｅ
ｙおよびＤ．Ｊ．Ｓｈｉｒｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ，１９８１年第７２９頁参照）。この反応は
重合体担体としてのシリカゲルで実施され単量体ヌクレ
オシドホスハイドが添加された。後処理は燐酸のメチル
エステル基を脱アルキル化し（Ｇ．Ｗ．Ｄａｕｂおよび
Ｅ．Ｅ．ｖａｎＴａｍｅｌｅｎ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．第９９巻第３５２６頁（１９７７年））、
担体からオリゴヌクレオチドをとり出しそして濃アンモ
ニア水を用いてアミド保護基を除去することにより遂行
された。オリゴヌクレオチドの精製は逆相カラムまたは
イオン変換体カラム上ＨＰＬＣによるかまたはアクリル
アミドゲル電気泳動により遂行された（Ｃｈｅ−ｍｉｃ
ａｌ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｈ．Ｇ．Ｇ
ａｓｓｅｎおよびＡ．Ｌａｎｇ氏編、Ｖｅｒｌａｇ Ｃ
ｈｅｍｉｅ出版、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ１９８２年第１７７
頁参照）。
てシトシンおよびアデニンにはベンゾイル、ならびにグ
アニンにはイソブチロイル、デオキシリボースの５′−
ＯＨ基にはジメトキシトリチルそして燐酸のエステル保
護基としてメチルが用いられた。ホスハイトの活性化は
テトラゾールを用いて行われた（Ｊ．Ｌ．Ｆｏｕｒｒｅ
ｙおよびＤ．Ｊ．Ｓｈｉｒｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ，１９８１年第７２９頁参照）。この反応は
重合体担体としてのシリカゲルで実施され単量体ヌクレ
オシドホスハイドが添加された。後処理は燐酸のメチル
エステル基を脱アルキル化し（Ｇ．Ｗ．Ｄａｕｂおよび
Ｅ．Ｅ．ｖａｎＴａｍｅｌｅｎ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．第９９巻第３５２６頁（１９７７年））、
担体からオリゴヌクレオチドをとり出しそして濃アンモ
ニア水を用いてアミド保護基を除去することにより遂行
された。オリゴヌクレオチドの精製は逆相カラムまたは
イオン変換体カラム上ＨＰＬＣによるかまたはアクリル
アミドゲル電気泳動により遂行された（Ｃｈｅ−ｍｉｃ
ａｌ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｈ．Ｇ．Ｇ
ａｓｓｅｎおよびＡ．Ｌａｎｇ氏編、Ｖｅｒｌａｇ Ｃ
ｈｅｍｉｅ出版、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ１９８２年第１７７
頁参照）。
かくして得られたオリゴヌクレオチドを次に５′−末端
でポリヌクレオチドキナーゼを用いてホスホリル化しそ
して既知方法でＴ−４−ＤＮＡリガーゼを用いて酵素的
に結合させる（Ｖ．Ｓｇａｒａ−ｍｅｌｌａおよびＨ．
Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ１．第７２巻
第４２７頁（１９７２年）参照）。
でポリヌクレオチドキナーゼを用いてホスホリル化しそ
して既知方法でＴ−４−ＤＮＡリガーゼを用いて酵素的
に結合させる（Ｖ．Ｓｇａｒａ−ｍｅｌｌａおよびＨ．
Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ１．第７２巻
第４２７頁（１９７２年）参照）。
本発明は同様にかくして得られた合成遺伝子ならびにそ
の合成に使用される単位にも関する。
の合成に使用される単位にも関する。
セクレチルグリシンに対する得られた遺伝子のクローニ
ングは既知方法に従いｐＢＲ３２２のようなプラスミド
中で実施された（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈおよび
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ氏、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ，１９８２年第２１１頁）。大腸菌中におけ
るセクレチルグリシンの直接発現の可能性と並んで、構
造遺伝子は例えばｐＢＲ３２２中においてβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子の末端で融合ペプチドとしてβ−ガラク
トシダーゼ産生性プラスミド中に連結される。これには
構造遺伝子をプラスミド中に挿入するためにリンカ−と
してさらに２個のオリゴヌクレオチドを必要とする。
ングは既知方法に従いｐＢＲ３２２のようなプラスミド
中で実施された（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈおよび
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ氏、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ，１９８２年第２１１頁）。大腸菌中におけ
るセクレチルグリシンの直接発現の可能性と並んで、構
造遺伝子は例えばｐＢＲ３２２中においてβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子の末端で融合ペプチドとしてβ−ガラク
トシダーゼ産生性プラスミド中に連結される。これには
構造遺伝子をプラスミド中に挿入するためにリンカ−と
してさらに２個のオリゴヌクレオチドを必要とする。
その際β−ガラクトシダーゼの１００５個のＮ−末端ア
ミノ酸に対するヌクレオチド配列およびメチオニルーセ
クレチルグリシンに対するヌクレオチド配列を含有する
遺伝子が生成する。
ミノ酸に対するヌクレオチド配列およびメチオニルーセ
クレチルグリシンに対するヌクレオチド配列を含有する
遺伝子が生成する。
前記プラスミドの形質転換のための宿主細胞としては大
腸菌が使用される。Ｎ−末端にβ−ガラクトシダーゼ（
１−１００５）のアミノ酸配列をそしてＣ−末端にメチ
オニル−セクレチルーグリシンのための配列を含有する
蛋白質が発現される。ゾロムシアン分解によりこの蛋白
質からセクレチルグリシンが遊離される。
腸菌が使用される。Ｎ−末端にβ−ガラクトシダーゼ（
１−１００５）のアミノ酸配列をそしてＣ−末端にメチ
オニル−セクレチルーグリシンのための配列を含有する
蛋白質が発現される。ゾロムシアン分解によりこの蛋白
質からセクレチルグリシンが遊離される。
本発明は同様に合成遺伝子を含有するハイブリッドプラ
スミド、それにより形質転換された宿主細菌、発現され
たメチオニル−セクレチル−グリシンおよび相当する融
合蛋白質ならびにそれから調製されたセクレチル−グリ
シンにも関する。
スミド、それにより形質転換された宿主細菌、発現され
たメチオニル−セクレチル−グリシンおよび相当する融
合蛋白質ならびにそれから調製されたセクレチル−グリ
シンにも関する。
セクレチルグリシンはクロマトグラフィー挙動において
はセクレチンよりも親水性である。
はセクレチンよりも親水性である。
セクレチルグリシンの生物学的活性は約８００ＫＵ／ｍ
ｇでセクレチンのそれより明らかに弱い。
ｇでセクレチンのそれより明らかに弱い。
生物学的作用についての試験としては犬での膵臓分泌刺
激が用いられる。
激が用いられる。
アミド形成性酵素を用いて（Ｎａｔｕｒｅ第２９８巻第
６８６〜６８８頁（１９８２年）参照）セクレチルグリ
シンからもう一回クロマトグラフイー精製することによ
り蛋白１ｍｇ当り約４０００ＫＵを有する完全に活性な
セクレチンが取得できた。
６８６〜６８８頁（１９８２年）参照）セクレチルグリ
シンからもう一回クロマトグラフイー精製することによ
り蛋白１ｍｇ当り約４０００ＫＵを有する完全に活性な
セクレチンが取得できた。
下記の例において百分率は別に断わりなければ重量に基
づくものとする。
づくものとする。
実施例１
スキーム２に記載されたオリゴヌクレオチドの合成
完全に保護されたヌクレオチドの合成は以下のスキーム
により実施された。
により実施された。
商業上入手しうるＦＲＡＣＴＯＳＩＬ（登録商標）（Ｄ
ａｒｍａｔａｄｔのメルク社製品）を既知方法でプロピ
ルアミノ−シリカゲルに変換する（Ｃｈｅｍｉｃａｌａ
ｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ
Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｈ．Ｇ．Ｇａｓｓｅ
ｎおよびＡ．Ｌａｎｇ氏編、Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｒｍ
ｉｅ出版１９８２年、第７１頁参照）。５′−０−ジメ
トキシトリチル−ヌクレオシド−、３′−０−スクシネ
ートをジシクロへキシルカルボジイミドを用いてアミド
としてのプロピルアミノ−シリカゲルと結合させた（上
記文献参照）。
ａｒｍａｔａｄｔのメルク社製品）を既知方法でプロピ
ルアミノ−シリカゲルに変換する（Ｃｈｅｍｉｃａｌａ
ｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ
Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｈ．Ｇ．Ｇａｓｓｅ
ｎおよびＡ．Ｌａｎｇ氏編、Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｒｍ
ｉｅ出版１９８２年、第７１頁参照）。５′−０−ジメ
トキシトリチル−ヌクレオシド−、３′−０−スクシネ
ートをジシクロへキシルカルボジイミドを用いてアミド
としてのプロピルアミノ−シリカゲルと結合させた（上
記文献参照）。
オリゴヌクレオチドは下記のサイクルで調製された。
前記調製された重合体１００ｍｇ（ヌクレオシド２〜４
μモル）をフリット中以下のようにして逐次処理した。
μモル）をフリット中以下のようにして逐次処理した。
１．１％の水を含有するニトロメタンで２回洗浄、
２．ニトロメタン／水１％中の飽和臭化亜鉛溶液と３〜
５回それぞれ２分間放置しそして次に吸引濾過する、 ３．メタノールで２回洗浄、 ４．テトラヒドロフランで２回洗浄、 ５．アセトニトリルで２回洗浄、 ６．無水アセトニトリル１ｍｌ中のヌクレオシドホスバ
イト６０〜７０ｍｇおよびテトラゾール４０ｍｇと５分
間放置しそして吸引濾過する、７．テドラヒドロンラン
／ルチジン／ジメチルアミノピリジン（容量比５：４：
１）中の２０％無水酢酸からなる混合物と２分間放置し
そして吸引濾過する、 ８．テトラヒドロフランと２回洗浄、 ９．テトラヒドロンラン／水／ルチジン（容量比２：１
：２）からなる混合物と２分間放置しそして吸引濾過す
る、 １０．テトラヒドロフラン／水／コリジン（容量比１：
４：５）中の３％沃素からなる混合物と２分間放置しそ
して吸引濾過する、 １１．テトラヒドロフランで２回洗浄、１２．メタノー
ルで２回洗浄、 １３．１項に戻る。
５回それぞれ２分間放置しそして次に吸引濾過する、 ３．メタノールで２回洗浄、 ４．テトラヒドロフランで２回洗浄、 ５．アセトニトリルで２回洗浄、 ６．無水アセトニトリル１ｍｌ中のヌクレオシドホスバ
イト６０〜７０ｍｇおよびテトラゾール４０ｍｇと５分
間放置しそして吸引濾過する、７．テドラヒドロンラン
／ルチジン／ジメチルアミノピリジン（容量比５：４：
１）中の２０％無水酢酸からなる混合物と２分間放置し
そして吸引濾過する、 ８．テトラヒドロフランと２回洗浄、 ９．テトラヒドロンラン／水／ルチジン（容量比２：１
：２）からなる混合物と２分間放置しそして吸引濾過す
る、 １０．テトラヒドロフラン／水／コリジン（容量比１：
４：５）中の３％沃素からなる混合物と２分間放置しそ
して吸引濾過する、 １１．テトラヒドロフランで２回洗浄、１２．メタノー
ルで２回洗浄、 １３．１項に戻る。
この合成サイクルを鎖が完成されるまでそれぞれのヌク
レオシドホスハイトを用いて反復する。
レオシドホスハイトを用いて反復する。
各結合段階の効率は臭化亜鉛溶液を用いる保護基の除去
に際して生成するジメトキシトリチル陽イオンの４９４
ｎｍにおける吸収に基づき分光測定される。
に際して生成するジメトキシトリチル陽イオンの４９４
ｎｍにおける吸収に基づき分光測定される。
合成完了後完全に保護されたオリゴヌクレオチドを２，
４，６−トリメチルチオフェノール／トリエチルアミン
（容量比１：１）で１時間処理すると燐酸メチルエスデ
ルが脱アルキル化される。次に飽和アンモニア水溶液を
用い３時間以内でまだ部分的に保護されているヌクレオ
チドをシリカゲルから除去する。アンモニア性溶液を濾
過しそしてオリゴヌクレオチドから残存する保護基を完
全に除去するために室温でさらに５０〜６０時間放置す
る。
４，６−トリメチルチオフェノール／トリエチルアミン
（容量比１：１）で１時間処理すると燐酸メチルエスデ
ルが脱アルキル化される。次に飽和アンモニア水溶液を
用い３時間以内でまだ部分的に保護されているヌクレオ
チドをシリカゲルから除去する。アンモニア性溶液を濾
過しそしてオリゴヌクレオチドから残存する保護基を完
全に除去するために室温でさらに５０〜６０時間放置す
る。
脱保護されたヌクレオチドは逆相カラムでのＨＰＬＣ（
溶媒：アセトニトリル勾配に対し水中の０．１Ｍ酢酸ト
リエチルアンモニウム、Ｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ Ｅｎ
ｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｏｎｅ
Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｈ．Ｇ．ＧａｓｓｅｎおよびＡ
．Ｌａｎｇ氏編、Ｖａｒｌａｙ Ｃｈｅｍｉｅ出版、Ｗ
ｅｉｎｈｅｉｍ，１９８２年第１７７頁参照）によるか
またはｐＨ８．３の０．１Ｍトリスポレート緩衝液を用
い７Ｍ尿素を含有する２０％アクリルアミトゲルでのゲ
ル電気泳動により（上記文献３７頁参照）精製する。
溶媒：アセトニトリル勾配に対し水中の０．１Ｍ酢酸ト
リエチルアンモニウム、Ｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ Ｅｎ
ｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｏｎｅ
Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｈ．Ｇ．ＧａｓｓｅｎおよびＡ
．Ｌａｎｇ氏編、Ｖａｒｌａｙ Ｃｈｅｍｉｅ出版、Ｗ
ｅｉｎｈｅｉｍ，１９８２年第１７７頁参照）によるか
またはｐＨ８．３の０．１Ｍトリスポレート緩衝液を用
い７Ｍ尿素を含有する２０％アクリルアミトゲルでのゲ
ル電気泳動により（上記文献３７頁参照）精製する。
この方法によりスキーム２に掲げられるオリゴヌクレオ
チドＩａ−Ｉｈならびに下記ヌクレオチドＩＩａおよび
ＩＩｂが調製された。
チドＩａ−Ｉｈならびに下記ヌクレオチドＩＩａおよび
ＩＩｂが調製された。
ＩＩａ：５′ＡＧＣＴＴＧＡＣＧＣＧ
ＩＩｂ：３′ ＡＣＴＧＣＧＣＴＴＡＡ実施例２
オリゴヌクレオチドブロツクのホスホリル化二本鎖とし
てのメチオニル−セクレチルグリシン遺伝子の構成はス
キーム２に示される。
てのメチオニル−セクレチルグリシン遺伝子の構成はス
キーム２に示される。
オリゴヌクレオチド３μＧにＭｇＣｌ２１０ｍＭ、トリ
ス緩衝液５０ｍＭ、ＡＴＰ０．２ｍＭおよびジチオトレ
イトール（ＤＴＴ）２０ｍＭおよび５単位（Ｐｒｏｇｒ
ｅｓｓｉｎ Ｎｕｅｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓｅａｒ
ｅｈ第２巻第８１５頁（１９７２年）参照のＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼを含有する溶液０．０３ｍｌを加え
る。反応経過はジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−紙
またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）セルロースでのク
ロマトグラフィーにより判定された。得られた溶液は精
製することなく直接さらに処理する。
ス緩衝液５０ｍＭ、ＡＴＰ０．２ｍＭおよびジチオトレ
イトール（ＤＴＴ）２０ｍＭおよび５単位（Ｐｒｏｇｒ
ｅｓｓｉｎ Ｎｕｅｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓｅａｒ
ｅｈ第２巻第８１５頁（１９７２年）参照のＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼを含有する溶液０．０３ｍｌを加え
る。反応経過はジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−紙
またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）セルロースでのク
ロマトグラフィーにより判定された。得られた溶液は精
製することなく直接さらに処理する。
実施例３
ヌクレオチドブロツクＩａ〜ｈの連結
それぞれ５００〜８００μモルの５′−ホスホリル化Ｉ
ｂ−Ｉｇならびに１．２当量の５−ＯＨ−Ｉａおよび−
Ｉｈを別々にＩａ／ｂ、Ｉｃ／ｄ、Ｉｅ／ｆおよびｌｇ
／ｈとして９５℃で２分間水中で加熱しそしてゆつくり
と室温まで冷却する。
ｂ−Ｉｇならびに１．２当量の５−ＯＨ−Ｉａおよび−
Ｉｈを別々にＩａ／ｂ、Ｉｃ／ｄ、Ｉｅ／ｆおよびｌｇ
／ｈとして９５℃で２分間水中で加熱しそしてゆつくり
と室温まで冷却する。
次に試料を全て合し、凍結乾燥しそして０．０２ＭＨＥ
ＰＥＳ（２−（４−（ヒドロキシエチル）−１−ピペラ
ジニル〕エタンスルホン酸）−緩衝液（ｐＨ７．６）０
．０５ｍｌ中にとる。これに２００単位（Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．第２４３巻第４５４３頁（１９６８年）参
照）のＴ４−ＤＮＡリガーゼを加える。１４℃で１６時
間培養後８０℃に加熱することにより反応を終了させる
。次に１０％ポリアクリルアミドゲル（尿素なし）上に
生成物を１０２個の塩基対を有する二本鎖として（ｐＢ
Ｒ３２２のＨａｅＩＩＩ消化により比較）単離しそして
精製する。後処理はＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ第１７３頁参照。
ＰＥＳ（２−（４−（ヒドロキシエチル）−１−ピペラ
ジニル〕エタンスルホン酸）−緩衝液（ｐＨ７．６）０
．０５ｍｌ中にとる。これに２００単位（Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．第２４３巻第４５４３頁（１９６８年）参
照）のＴ４−ＤＮＡリガーゼを加える。１４℃で１６時
間培養後８０℃に加熱することにより反応を終了させる
。次に１０％ポリアクリルアミドゲル（尿素なし）上に
生成物を１０２個の塩基対を有する二本鎖として（ｐＢ
Ｒ３２２のＨａｅＩＩＩ消化により比較）単離しそして
精製する。後処理はＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ第１７３頁参照。
実施例４
メチオニルセクレチルグリシン遺伝子のｐＵＣ８中にお
けるクローニング ｐＵＣ８（Ｐ．Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｇｍｂ
Ｈ社製）を制限エンドヌクレアーゼＥｅｏＲＩおよびＢ
ｉｎｄＩＩＩを用い標準的条件（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，Ｍ
Ｄ，ＵＳＡ）に従い切断しそして大きい断片を０．１Ｍ
トリス−ポレート（２．５ｍＭＥＤＴＡ）中のアガロー
ス−ゲル電気泳動（１％低融点アガロース、Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒａｂｅｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ
）により精製する。アガロースの融解により大きいバン
ドを６５℃で単離する。フェノール／クロロホルム（容
量比１：１）で抽出する。水相にエタノールを加える。
けるクローニング ｐＵＣ８（Ｐ．Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｇｍｂ
Ｈ社製）を制限エンドヌクレアーゼＥｅｏＲＩおよびＢ
ｉｎｄＩＩＩを用い標準的条件（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，Ｍ
Ｄ，ＵＳＡ）に従い切断しそして大きい断片を０．１Ｍ
トリス−ポレート（２．５ｍＭＥＤＴＡ）中のアガロー
ス−ゲル電気泳動（１％低融点アガロース、Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒａｂｅｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ
）により精製する。アガロースの融解により大きいバン
ドを６５℃で単離する。フェノール／クロロホルム（容
量比１：１）で抽出する。水相にエタノールを加える。
沈澱を遠心分離する。実施例３で合成されたメチオニル
セリレチルグリシン遺伝子（１０μｇ）を５ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ７．６、ＭｇＣｌ２１０ｍＭ、ＡＴＰ１ｍ
Ｍ、ＤＴＴ２０ｍＭおよび２００単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ）０．０２ｍｌ中のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断
片２０μｇと１４℃で１２時間培養する。
セリレチルグリシン遺伝子（１０μｇ）を５ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ７．６、ＭｇＣｌ２１０ｍＭ、ＡＴＰ１ｍ
Ｍ、ＤＴＴ２０ｍＭおよび２００単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ）０．０２ｍｌ中のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断
片２０μｇと１４℃で１２時間培養する。
大腸菌Ｋ１２株中における形質転換は既知方法により実
施され（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ第６９巻第２１１０〜２１１４頁（１９７２年）参照
）そして２５μｇ／ｍｌのアンピシリンに対して抵抗性
である形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）を単離
する。
施され（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ第６９巻第２１１０〜２１１４頁（１９７２年）参照
）そして２５μｇ／ｍｌのアンピシリンに対して抵抗性
である形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）を単離
する。
選択的な形質転換体のもう一つの分析は制限酵素での処
理により実施される。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
を用いる消化後で１０２の塩基対（Ｂｐ）の領域に挿入
を受けた３種のクローンが単離された。さらにＫｐｎＩ
およびＰｓｔＩに対する切断部位も存在した。
理により実施される。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
を用いる消化後で１０２の塩基対（Ｂｐ）の領域に挿入
を受けた３種のクローンが単離された。さらにＫｐｎＩ
およびＰｓｔＩに対する切断部位も存在した。
Ａ．Ｍ．ＭａｘａｍおよびＷ．Ｇｉｌｂｅｒｔ氏による
配列調査（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ第６５巻第４９９頁（１９８０年）参照）により合成
されたメチオニル−セクレチルグリシン遺伝子の配列が
確認された。
配列調査（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ第６５巻第４９９頁（１９８０年）参照）により合成
されたメチオニル−セクレチルグリシン遺伝子の配列が
確認された。
実施例５
メチオニル−セクレチルグリシン遺伝子と大腸菌のβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子との融合発現のために前記メチ
オニル−セクレチルグリシン遺伝子をプラスミドｐＷＨ
１０中でクローニングさせた。このプラスミドベクター
は慣用法（Ｋ．Ｉｔａｋｕｒａ，Ｔ．Ｈｉｒｏａｓｅ，
Ｒ．Ｃｒｅａ，Ａ．Ｄ．Ｒｉｇｇｓ，Ｈ．Ｌ．Ｈｅｙｎ
ｅｋｅｒ，Ｆ．Ｂｏｌｉｖａｒ，Ｈ．Ｗ．Ｂｏｙｅｒ氏
らのＳｃｉｅｎｃｅ１９７７年第１０５６頁参照）に従
い一部分は大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２からそして他
の部分はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子プラス調節単位か
ら構成される。ｐＢＲ３２２１０μｇを制限エンドヌク
レアーゼＥｅｏＲＩおよびＰｖｕＩＩで消化しそして５
％ポリアクリルアミドゲル上標準的条件に従い分離する
。エチジウムブロマイドを用いて可視化されたバンド（
２２９２Ｂｐ）をゲルから切断しそして電気溶離（ｅｌ
ｅｃｔｒｏｅｌｕａｔｉｏｎ）する。
ガラクトシダーゼ遺伝子との融合発現のために前記メチ
オニル−セクレチルグリシン遺伝子をプラスミドｐＷＨ
１０中でクローニングさせた。このプラスミドベクター
は慣用法（Ｋ．Ｉｔａｋｕｒａ，Ｔ．Ｈｉｒｏａｓｅ，
Ｒ．Ｃｒｅａ，Ａ．Ｄ．Ｒｉｇｇｓ，Ｈ．Ｌ．Ｈｅｙｎ
ｅｋｅｒ，Ｆ．Ｂｏｌｉｖａｒ，Ｈ．Ｗ．Ｂｏｙｅｒ氏
らのＳｃｉｅｎｃｅ１９７７年第１０５６頁参照）に従
い一部分は大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２からそして他
の部分はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子プラス調節単位か
ら構成される。ｐＢＲ３２２１０μｇを制限エンドヌク
レアーゼＥｅｏＲＩおよびＰｖｕＩＩで消化しそして５
％ポリアクリルアミドゲル上標準的条件に従い分離する
。エチジウムブロマイドを用いて可視化されたバンド（
２２９２Ｂｐ）をゲルから切断しそして電気溶離（ｅｌ
ｅｃｔｒｏｅｌｕａｔｉｏｎ）する。
トランスダクションフアージφ８０ｄｌａｃからはエン
ドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩによる部分
消化を用いてβ−ガラクトシダーゼの遺伝子およびその
調節単位を切断した（３１８５Ｂｐ）。
ドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩによる部分
消化を用いてβ−ガラクトシダーゼの遺伝子およびその
調節単位を切断した（３１８５Ｂｐ）。
この断片はラクターゼ調節領域およびアミノ酸１〜１０
０５のβ−ガラクトシダーゼに対する遺伝子を担持する
。このＬａｃ−ＤＮＡ断片はｐＢＲ３２２のＤＮＡ断片
と連結しうる。Ｌａｃ−オペロンの調節単位、β−ガラ
クトシダーゼ１〜１００５に対する構造遺伝子、ｐＢＲ
３２２のアンピシリン抵抗性およびその複製領域を有す
るプラスミドを生ずる。このＬａｃ−オペロンは例えば
ｔａｃのような任意の他の調節領域により置換されうる
。このプラスミドｐＷＨ１０はガラクトシダーゼのアミ
ノ酸１００４においてクローニング部位として利用され
る１個のＥｃｏＲＩ切断点を包含する。
０５のβ−ガラクトシダーゼに対する遺伝子を担持する
。このＬａｃ−ＤＮＡ断片はｐＢＲ３２２のＤＮＡ断片
と連結しうる。Ｌａｃ−オペロンの調節単位、β−ガラ
クトシダーゼ１〜１００５に対する構造遺伝子、ｐＢＲ
３２２のアンピシリン抵抗性およびその複製領域を有す
るプラスミドを生ずる。このＬａｃ−オペロンは例えば
ｔａｃのような任意の他の調節領域により置換されうる
。このプラスミドｐＷＨ１０はガラクトシダーゼのアミ
ノ酸１００４においてクローニング部位として利用され
る１個のＥｃｏＲＩ切断点を包含する。
９７個の塩基対からなるメチオニルーセクレチル−グリ
シンの構造遺伝子は３′−位にＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ−アダプターである ＩＩａ５′ＡＧＣＴＴＧＡＣＧＣＧ ＩＩｂ３′ ＡＣＴＧＣＧＣＴＴＡＡ ＨｉｎｄＩＩＩＥｃｏＲＩ を備えておルそしてプラスミドｐＷＨ１０中への統合（
Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）に使用される。これはＥｃｏ
ＲＩで切断されそして次にメチオニル−セクレチルグリ
シンに対する遺伝子を有するＤＮＡ片が上記のように連
結される。
シンの構造遺伝子は３′−位にＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ−アダプターである ＩＩａ５′ＡＧＣＴＴＧＡＣＧＣＧ ＩＩｂ３′ ＡＣＴＧＣＧＣＴＴＡＡ ＨｉｎｄＩＩＩＥｃｏＲＩ を備えておルそしてプラスミドｐＷＨ１０中への統合（
Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）に使用される。これはＥｃｏ
ＲＩで切断されそして次にメチオニル−セクレチルグリ
シンに対する遺伝子を有するＤＮＡ片が上記のように連
結される。
メチオニル−セクレチルグリシン遺伝子のヌクレオチド
配列はβ−ガラクトシダーゼの読みとり枠が連続的にメ
チオニル−セクレチルグリシンの遺伝子中に移行するよ
うに計画されている。かかる構成から得られる遺伝子生
成物はβ−ガラクトシダーゼの１００５アミン末端アミ
ノ酸（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
第７４巻第１５０７頁（１９７７年）参照）とメチオニ
ルセクレチルグリシンのＣ−末端遺伝子との融合物であ
る。
配列はβ−ガラクトシダーゼの読みとり枠が連続的にメ
チオニル−セクレチルグリシンの遺伝子中に移行するよ
うに計画されている。かかる構成から得られる遺伝子生
成物はβ−ガラクトシダーゼの１００５アミン末端アミ
ノ酸（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
第７４巻第１５０７頁（１９７７年）参照）とメチオニ
ルセクレチルグリシンのＣ−末端遺伝子との融合物であ
る。
メチオニル−セクレチルグリシン遺伝子がプラスミドｐ
ＷＨ１０中に挿入された方向は制限酵素消化により確認
できた。
ＷＨ１０中に挿入された方向は制限酵素消化により確認
できた。
実施例６
前記プラスミドｐＷＨ１０の形質転換のための宿主細胞
として大腸菌Ｋ１２株が用いられる。
として大腸菌Ｋ１２株が用いられる。
形質転換は慣用の分子生物学的方法により実施される（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２１１頁参照
）。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２１１頁参照
）。
実施例７
β−ガラクトシダーゼ−セクレチルグリシンの単離
細菌を３０ｌの発酵器中標準条件下に完全培地中または
合成培地および補充物中所望の光学濃度となる迄生育さ
せそして適当なインダクター例えばイソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトシドを用いて２時間誘導（ｉｎｄｕｃ
ｅ）する。次に細胞全０．１ｍＭベンジルスルホニルフ
ルオライドおよび０．１％クレゾールで殺す。細胞を遠
心分離または濾過したのちこれを水性酸性媒体中ｐＨ３
．０でＦＲＥＮＣＨ−ＰｒｅｓｓまたはＤＹＮＯ−Ｍｕ
ｈｌｅ（ＢａａｌｅのＷｉｌｌｙ Ｂａｃｈｏｆｅｎ）
を用いて可溶化しそしてすべての不溶の成分を遠心分離
する。上澄み液を捨てる。残留物を７Ｍグアニジン塩酸
塩中にとりそして１５０００ｇで遠心分離する。上澄み
液をデカンテーションしそして５倍量の水で希釈する。
合成培地および補充物中所望の光学濃度となる迄生育さ
せそして適当なインダクター例えばイソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトシドを用いて２時間誘導（ｉｎｄｕｃ
ｅ）する。次に細胞全０．１ｍＭベンジルスルホニルフ
ルオライドおよび０．１％クレゾールで殺す。細胞を遠
心分離または濾過したのちこれを水性酸性媒体中ｐＨ３
．０でＦＲＥＮＣＨ−ＰｒｅｓｓまたはＤＹＮＯ−Ｍｕ
ｈｌｅ（ＢａａｌｅのＷｉｌｌｙ Ｂａｃｈｏｆｅｎ）
を用いて可溶化しそしてすべての不溶の成分を遠心分離
する。上澄み液を捨てる。残留物を７Ｍグアニジン塩酸
塩中にとりそして１５０００ｇで遠心分離する。上澄み
液をデカンテーションしそして５倍量の水で希釈する。
０℃に調整し生ずる沈澱を遠心分離する。
これを７Ｍグアニジン塩酸塩溶液中に溶解させそして７
Ｍグアニジン塩素塩中Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ
−２００でクロマトグラフィーする。β−ガラクトシダ
ーゼ−セクレチルグリシンを含有するフラクションを５
倍量の水で希釈しそして残留物を遠心分離する。収量１
０ｇ。
Ｍグアニジン塩素塩中Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ
−２００でクロマトグラフィーする。β−ガラクトシダ
ーゼ−セクレチルグリシンを含有するフラクションを５
倍量の水で希釈しそして残留物を遠心分離する。収量１
０ｇ。
実施例８
セクレチルグリシン
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第７９
巻第２４７５〜２４９７貞（１９８２年）の記載と同様
にして上記で得られたβ−ガラクトシダーゼ−セクレチ
ルグリシンからブロムシアン分解によりセクレチングリ
シンが得られそして次にモル濃度上昇を伴う（０．０５
Ｍ〜０．１Ｍ）酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．８）
を用いＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５でクロマトグラ
フィーすることにより精製した。酢酸アンモニウムは３
回凍結乾燥することにより除去された。
巻第２４７５〜２４９７貞（１９８２年）の記載と同様
にして上記で得られたβ−ガラクトシダーゼ−セクレチ
ルグリシンからブロムシアン分解によりセクレチングリ
シンが得られそして次にモル濃度上昇を伴う（０．０５
Ｍ〜０．１Ｍ）酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．８）
を用いＳＰ−ＳｅｐｈａｄｅｘＣ−２５でクロマトグラ
フィーすることにより精製した。酢酸アンモニウムは３
回凍結乾燥することにより除去された。
収量：５０ｍｇ（アミノ酸分析による蛋白質含量８１％
） アミノ酸分析（６ＮＨＣｌ中１２０℃で２４時間加水分
解）： Ａｓｐ（２．０１）、Ｔｈｒ（２．０３）、Ｓｅｒ（３
．４３）、Ｇｌｕ（２．７６）、Ｇｌｙ（３．０７）、
Ａｌａ（１．００）、Ｖａｌ（０．８９）、Ｌｅｕ（５
．５７）、Ｐｈｅ（１．１２）、Ｈｉｓ（０．８９）、
Ａｒｇ（３．８９）。
） アミノ酸分析（６ＮＨＣｌ中１２０℃で２４時間加水分
解）： Ａｓｐ（２．０１）、Ｔｈｒ（２．０３）、Ｓｅｒ（３
．４３）、Ｇｌｕ（２．７６）、Ｇｌｙ（３．０７）、
Ａｌａ（１．００）、Ｖａｌ（０．８９）、Ｌｅｕ（５
．５７）、Ｐｈｅ（１．１２）、Ｈｉｓ（０．８９）、
Ａｒｇ（３．８９）。
ＤＣ（薄層クロマトグラフィー）（ｎ−ブタノール／水
／ピリジン／氷酢酸（容量比６０：２４：２０：６））
中シリカゲルプレート（６０Ｆ２５４）上：Ｒｆ値＝０
．１３８ 生物学的作用：犬で約８００ＫＵ／ｍｇの膵臓分沁実施
例９ セクレチン Ｃ−末端がグリシンで廷長されたペプチドから相当する
ペプチドアミドを生ずる視床下部の神経性分泌性顆粒フ
ラクション中に存在する酵素をＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ
第１５２巻第２７７〜２７９頁（１９８３年）の記載と
同様にして精製した。この酵素試料はプロリンの後を解
裂させる酵素で汚染されており、このことはセクレチン
の場合は障害とならない。何故ならセクレチンは何らプ
ロリンを含有しないからである。
／ピリジン／氷酢酸（容量比６０：２４：２０：６））
中シリカゲルプレート（６０Ｆ２５４）上：Ｒｆ値＝０
．１３８ 生物学的作用：犬で約８００ＫＵ／ｍｇの膵臓分沁実施
例９ セクレチン Ｃ−末端がグリシンで廷長されたペプチドから相当する
ペプチドアミドを生ずる視床下部の神経性分泌性顆粒フ
ラクション中に存在する酵素をＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ
第１５２巻第２７７〜２７９頁（１９８３年）の記載と
同様にして精製した。この酵素試料はプロリンの後を解
裂させる酵素で汚染されており、このことはセクレチン
の場合は障害とならない。何故ならセクレチンは何らプ
ロリンを含有しないからである。
セクレチングリシン３ｍｇを１０ｍＭ燐酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ７）１０ｍｌ中に溶解させそして空気中３７℃で攪拌
下に精製された酵素フラクションと培養する。５時間反
応させた後溶液を凍結乾燥しそして例８と同様にしてク
ロマトグラフィー精製する。
Ｈ７）１０ｍｌ中に溶解させそして空気中３７℃で攪拌
下に精製された酵素フラクションと培養する。５時間反
応させた後溶液を凍結乾燥しそして例８と同様にしてク
ロマトグラフィー精製する。
収量：１．２ｍｇ（アミノ酸分析による蛋白質含量８２
％）アミノ酸分析（６ＮＨＣｌ中１２０℃で２４時間加
水分解）： Ａｓｐ（１．９９）、Ｔｈｒ（１．９１）、Ｓｅｒ（３
．５２）、Ｇｌｕ（２．９９）、Ｇｌｙ（１．９９）、
Ａｌａ（１．０１）、Ｖａｌ（１．０３）、Ｌｅｕ（５
．８８）、Ｐｈｅ（０．９７）、Ｈｉｓ（０．８９）、
Ａｒｇ（３．９１）。
％）アミノ酸分析（６ＮＨＣｌ中１２０℃で２４時間加
水分解）： Ａｓｐ（１．９９）、Ｔｈｒ（１．９１）、Ｓｅｒ（３
．５２）、Ｇｌｕ（２．９９）、Ｇｌｙ（１．９９）、
Ａｌａ（１．０１）、Ｖａｌ（１．０３）、Ｌｅｕ（５
．８８）、Ｐｈｅ（０．９７）、Ｈｉｓ（０．８９）、
Ａｒｇ（３．９１）。
ＤＣ（ｎ−ブタノール／水／ピリノン／氷酢酸（容量比
６０：２４：２０：６））中シリカゲルプレート（６０
Ｆ２５４）上：Ｒｆ＝０．１８９このＲｆ値は合成セク
レチン（Ｇｕｔ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，Ｈｒａｇ．Ｓ．Ｒ
．Ｂｌｏｏｍ，１９７８年第１６５〜１６８頁）のそれ
と同じである。生物学的作用は蛋白質１ｍｇ当り約４０
００ＫＵに相当しそして合成セクレチンのそれに匹敵す
る。
６０：２４：２０：６））中シリカゲルプレート（６０
Ｆ２５４）上：Ｒｆ＝０．１８９このＲｆ値は合成セク
レチン（Ｇｕｔ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，Ｈｒａｇ．Ｓ．Ｒ
．Ｂｌｏｏｍ，１９７８年第１６５〜１６８頁）のそれ
と同じである。生物学的作用は蛋白質１ｍｇ当り約４０
００ＫＵに相当しそして合成セクレチンのそれに匹敵す
る。
特許出願人ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト第１頁
の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，′識別記号庁内整理番号０発明者オイ
ゲーン・ウールマドイツ連邦共和国デンス、フクスタン
ツシ ＠発明者ヴアルデマル・ヴエテドイツ連邦共和国デカム
ツアイルリング４０／ −−６２４０ケーニヒシユタイン／タウヌユトラーセ１
６ −−６２３９ニブシユタイン／タウヌス。
の続き ■Ｉｎｔ、Ｃ１，′識別記号庁内整理番号０発明者オイ
ゲーン・ウールマドイツ連邦共和国デンス、フクスタン
ツシ ＠発明者ヴアルデマル・ヴエテドイツ連邦共和国デカム
ツアイルリング４０／ −−６２４０ケーニヒシユタイン／タウヌユトラーセ１
６ −−６２３９ニブシユタイン／タウヌス。
イー
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）式ＩＩ Ｙ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ（ＩＩ）（式中Ｙはメ
チオニン基またはメチオニンを介して結合した細菌蛋白
質基でありそしてＲは遺伝的にコード化されうるアミノ
酸のペプチド配列を意味する）を有するポリペプチドを
遺伝子工学的に産生させそしてこの生成物を酵素的に式
Ｉ Ｙ−Ｒ−ＮＨ２（Ｉ） を有するポリペプチドに変換して式Ｉのポリペプチドを
調製するに当り、式ＩＩ（式中Ｒはセクレチンのペプチ
ド配列を意味する）を有するポリペプチドを遺伝子工学
的に産生させそしてその生成物を酵素的に式Ｉのポリペ
プチドに変換することを特徴とする方法。 ２）式Ｉのポリペプチドからブロムシアン分解により基
Ｙを除去するととを特徴とする前記第１項記載の方法。 ３）Ｙがメチオニン残基でありそしてＲがセクレチンの
アミノ酸配列を意味する式ＩＩのポリペプチド。 ４）式ＩＩＩ Ｍｅｔ−Ｒ−ＮＨ２（ＩＩＩ） （式中Ｒはセクレチンのアミノ酸配列を意味する）を有
するポリペプチド。 ５）式ＩＶ Ｈ−Ｒ−Ｇｌｙ（Ｖ） （式中Ｒはセクレチンのアミノ酸配列を意味する）を有
するポリペプチド。 ６）式ＩＩ Ｙ−Ｒ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯＯＨ（ＩＩ）（式中Ｙはメ
チオニンを介して結合した細菌蛋白質残基でありそして
Ｒはセクレチンのアミノ酸配列を意味する）を有する融
合蛋白質。 ７）式Ｖ （式中Ｒはセクレチンのアミノ酸配列に対するコドンを
意味する）を有するＤＮＡ配列。 ８）ＥｃｏＲＩ切断点とＨｉｎｄＩＩＩ切断点との間に
式ＶのＤＮＡ配列を含有するハイブリッドプラスミド。 ９）前記第８項記載のハイブリツドプラスミドを含有す
る宿主細菌。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19833328793 DE3328793A1 (de) | 1983-08-10 | 1983-08-10 | Herstellung von sekretin |
| DE3328793.7 | 1983-08-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6069098A true JPS6069098A (ja) | 1985-04-19 |
Family
ID=6206183
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59165761A Pending JPS6069098A (ja) | 1983-08-10 | 1984-08-09 | セクレチンの調製法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4711847A (ja) |
| EP (1) | EP0136472B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6069098A (ja) |
| AT (1) | ATE40717T1 (ja) |
| CA (1) | CA1224167A (ja) |
| DE (2) | DE3328793A1 (ja) |
| DK (1) | DK383984A (ja) |
| GR (1) | GR80059B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0257192A (ja) * | 1988-08-24 | 1990-02-26 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | モチリン様ポリペプチドの製法並びにそのための組換えｄｎａ及び発現用プラスミド |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5759815A (en) * | 1988-02-11 | 1998-06-02 | Creative Biomolecules, Inc. | Production of platelet derived growth factor (PDGF) an muteins thereof |
| US6197746B1 (en) * | 1998-05-19 | 2001-03-06 | Repligen Corporation | Method of using secretin for treating autism |
| CA2290556A1 (en) | 1997-05-19 | 1998-11-26 | Repligen Corporation | Method for assisting in differential diagnosis and treatment of autistic syndromes |
| US20030190740A1 (en) * | 1998-10-13 | 2003-10-09 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc | Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use |
| DE69926009D1 (de) | 1998-10-13 | 2005-08-04 | Univ Georgia Res Found | Stabilisierte bioaktive peptide und methoden zu ihrer identifikation, synthese und verwendung |
| US6967247B2 (en) * | 2002-07-24 | 2005-11-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Deprotection of phosphorus in oligonucleotide synthesis |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH089639B2 (ja) * | 1982-05-20 | 1996-01-31 | サントリー株式会社 | Ｃ末端アミド化ペプチドの前駆体およびその製造法 |
-
1983
- 1983-08-10 DE DE19833328793 patent/DE3328793A1/de not_active Withdrawn
-
1984
- 1984-08-04 DE DE8484109276T patent/DE3476681D1/de not_active Expired
- 1984-08-04 AT AT84109276T patent/ATE40717T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-08-04 EP EP84109276A patent/EP0136472B1/de not_active Expired
- 1984-08-08 GR GR80059A patent/GR80059B/el unknown
- 1984-08-08 US US06/638,789 patent/US4711847A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-08-09 CA CA000460693A patent/CA1224167A/en not_active Expired
- 1984-08-09 JP JP59165761A patent/JPS6069098A/ja active Pending
- 1984-08-09 DK DK383984A patent/DK383984A/da not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0257192A (ja) * | 1988-08-24 | 1990-02-26 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | モチリン様ポリペプチドの製法並びにそのための組換えｄｎａ及び発現用プラスミド |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GR80059B (en) | 1984-12-12 |
| DK383984A (da) | 1985-02-11 |
| DK383984D0 (da) | 1984-08-09 |
| ATE40717T1 (de) | 1989-02-15 |
| EP0136472A1 (de) | 1985-04-10 |
| DE3328793A1 (de) | 1985-02-28 |
| US4711847A (en) | 1987-12-08 |
| CA1224167A (en) | 1987-07-14 |
| EP0136472B1 (de) | 1989-02-08 |
| DE3476681D1 (en) | 1989-03-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4582800A (en) | Novel vectors and method for controlling interferon expression | |
| KR920001377B1 (ko) | 인체 면역 인터페론 단백질의 제조방법 | |
| PL149079B1 (en) | Method of obtaining polypeptides of ifn-beta type | |
| WO1985000831A1 (en) | Microbial expression of insulin-like growth factor | |
| HU196455B (en) | Process for producing transformants giving curative peptides | |
| IE62511B1 (en) | Mini-proinsulin, its preparation and use | |
| JPS59173083A (ja) | 豚成長ホルモンを生産するためのｄｎａ配列，組換ｄｎａ分子および生産方法 | |
| EP0108387B1 (en) | Preparation of recombinant growth releasing factors | |
| JPS6069098A (ja) | セクレチンの調製法 | |
| JP2862870B2 (ja) | 新規ペプチド | |
| JPH07121229B2 (ja) | 酸アミド―カルボキシ末端を有するポリペプチドの調製 | |
| AU617999B2 (en) | A genetic engineering process for the preparation of angiogenins | |
| US4728609A (en) | Recombinant growth hormone releasing factor | |
| EP0095351B1 (en) | A precursor of a c-terminal amidated peptide and production thereof | |
| Cravador et al. | Total DNA synthesis and cloning in Escherichia coli of a gene coding for the human growth hormone releasing factor | |
| JPS61149089A (ja) | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
| HU200939B (en) | Process for stabilizing htnf obtained by recombinant dna technique | |
| US5695952A (en) | Method for producing Leu13 !motilin | |
| JP2515975B2 (ja) | 抗腫瘍作用を有するポリペプチド | |
| US6018037A (en) | DNA coding for (Leu13) motilin | |
| JPH01304895A (ja) | Ｎ‐末端プロリンで始まるタンパク質の製造法 | |
| KR910000457B1 (ko) | 인간성장호르몬 발현 벡터 ptrp322H-HGH | |
| JPS61291598A (ja) | 魚類カルシトニン誘導体及びその製造方法 | |
| DE69123242T2 (de) | Physiologisch aktive Peptide, ihre Verwendung und eine Methode besagte Peptide herzustellen | |
| JPH0327294A (ja) | 融合ポリペプチド |