JPH0327294A - 融合ポリペプチド - Google Patents
融合ポリペプチドInfo
- Publication number
- JPH0327294A JPH0327294A JP1162020A JP16202089A JPH0327294A JP H0327294 A JPH0327294 A JP H0327294A JP 1162020 A JP1162020 A JP 1162020A JP 16202089 A JP16202089 A JP 16202089A JP H0327294 A JPH0327294 A JP H0327294A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- motilin
- fusion polypeptide
- dna
- derivative
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 78
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 64
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 60
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 33
- 241000277329 Oncorhynchus keta Species 0.000 claims abstract description 8
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims abstract description 6
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 claims abstract description 4
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract 3
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims abstract 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims abstract 3
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 claims abstract 3
- LVRVABPNVHYXRT-BQWXUCBYSA-N 52906-92-0 Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 LVRVABPNVHYXRT-BQWXUCBYSA-N 0.000 claims description 76
- 101800002372 Motilin Proteins 0.000 claims description 70
- 102000002419 Motilin Human genes 0.000 claims description 68
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 28
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 9
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 25
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 abstract description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 72
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 70
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 60
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 30
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 9
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 8
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 8
- 102100033072 DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Human genes 0.000 description 7
- 101000927313 Homo sapiens DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Proteins 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 4
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 230000008991 intestinal motility Effects 0.000 description 3
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- RMVRSNDYEFQCLF-UHFFFAOYSA-N thiophenol Chemical compound SC1=CC=CC=C1 RMVRSNDYEFQCLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 239000012741 Laemmli sample buffer Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100293261 Mus musculus Naa15 gene Proteins 0.000 description 2
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150082943 NAT1 gene Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- -1 etc. Chemical compound 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- 229910001369 Brass Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100459439 Caenorhabditis elegans nac-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101500028621 Homo sapiens Motilin Proteins 0.000 description 1
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical compound CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000746981 Phleum Species 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical group OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 1
- 108091006629 SLC13A2 Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 244000223014 Syzygium aromaticum Species 0.000 description 1
- 235000016639 Syzygium aromaticum Nutrition 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 239000010951 brass Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000010904 focused beam reflectance measurement Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910000042 hydrogen bromide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- MTHMVLLKCNMJQL-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile hydrobromide Chemical compound Br.N#CC#N MTHMVLLKCNMJQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、モチリンまたはその誘導体とべブヂドとが融
合した融合ポリペブヂドおよびその製造法に関する。本
発明はまた、該融合ポリペプチドを用いるモチリンまた
はその誘導体の製造法に関する。
合した融合ポリペブヂドおよびその製造法に関する。本
発明はまた、該融合ポリペプチドを用いるモチリンまた
はその誘導体の製造法に関する。
やチリンまたはその誘導体は腸管運動冗進作用を有し、
医薬品として用いることができる。
医薬品として用いることができる。
従来の技術
モチリンは噛乳類の血中に存在する生理活性ペプチドで
腸管運動を活発にする作用を持つことが知られている［
：Ｎ， Ｙ， Ｃｈｅｙ ａｒ＋ｄκ，Ｙ， Ｌｅｅ
クリニタス・イン・ガストロエンテロロジイ（Ｃｌｉ
ｎｉｃｓ ｉｎＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）
３ ． ６４５ （１９８５） ：ｌ。
腸管運動を活発にする作用を持つことが知られている［
：Ｎ， Ｙ， Ｃｈｅｙ ａｒ＋ｄκ，Ｙ， Ｌｅｅ
クリニタス・イン・ガストロエンテロロジイ（Ｃｌｉ
ｎｉｃｓ ｉｎＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）
３ ． ６４５ （１９８５） ：ｌ。
開腹手術を受けた患者の血中モチリン濃度は低下する。
手術後のモチリン濃度の正常値への復帰は患者の腸管の
蝙勤運動の回復と相関関係があり、手術後にモチリンを
投与すると嬬動運勅が回復することが知られている（谷
充、日本平滑筋学会誌、ｌ９、６５ （１９８３））
。
蝙勤運動の回復と相関関係があり、手術後にモチリンを
投与すると嬬動運勅が回復することが知られている（谷
充、日本平滑筋学会誌、ｌ９、６５ （１９８３））
。
天然のモチリンは動物ＩＩＩ器から抽出する方法で得る
ことができるが、この方法では大量に得ることが困難で
ある。モチリンの製造法Ｌしては、この他にベブチド化
学合或法が知られているが、該方法で製造したモチリン
は高価である。
ことができるが、この方法では大量に得ることが困難で
ある。モチリンの製造法Ｌしては、この他にベブチド化
学合或法が知られているが、該方法で製造したモチリン
は高価である。
遺伝子組換え法は、ベブチドを大量に供給できる有効な
手段であるが、この方法を用いて小分子のペプチドを大
量生産することは一般に困難とされている。その理由は
、微生物などの宿主細胞中で作られた小分子のペプチド
は細胞中の酵素により容易に分解されてしまうためと考
えられている。
手段であるが、この方法を用いて小分子のペプチドを大
量生産することは一般に困難とされている。その理由は
、微生物などの宿主細胞中で作られた小分子のペプチド
は細胞中の酵素により容易に分解されてしまうためと考
えられている。
この分解を防ぐために、他の蛋白質と目的ベブチドとを
融合させて高分子量の融合ポリペプチドとして生産し、
ついでこの融合ポリペプチドを化学的あるいは酵素的方
法で分解して目的のペプチドを得る方法が知られている
（特公平１−２３１１８など）。
融合させて高分子量の融合ポリペプチドとして生産し、
ついでこの融合ポリペプチドを化学的あるいは酵素的方
法で分解して目的のペプチドを得る方法が知られている
（特公平１−２３１１８など）。
融合ポリペプチドの化学的分解には臭化シアンがよく用
いられ（特公平１−２３１１８）、この臭化シアアンを
用いて融合ポリペプチドを分解し、モチリンの１３位の
メチオニンを他のアミノ酸に置換した誘導体の製造方法
が知られている（特開平１−１０２０９６）。
いられ（特公平１−２３１１８）、この臭化シアアンを
用いて融合ポリペプチドを分解し、モチリンの１３位の
メチオニンを他のアミノ酸に置換した誘導体の製造方法
が知られている（特開平１−１０２０９６）。
特開昭６３−７１１９５には、目的ポリペプチドの重合
体を臭化シアンを用も１て分解する方法を用い、１３位
のメチオニンを口イシンに置換した誘導体をｒＩＩ：造
する方法が知られている。酵素的分解法としてはトリブ
シンを用いる方法〈特開昭６３−２６３０８７）、リジ
ルエンドベブチダーゼを用いる方法（特開昭６２２５９
５９５）などが知られている。しかし、これらの分解方
法は、アミノ酸配列中にメチ才ニンを含む天然型モチリ
ンまたはその誘導体に適用した場合、目的の天然型モチ
リンまたはその誘導体自体を切断してしまうため、これ
らの天然型母チリンまたはその誘導体の製造には用いる
ことができない。
体を臭化シアンを用も１て分解する方法を用い、１３位
のメチオニンを口イシンに置換した誘導体をｒＩＩ：造
する方法が知られている。酵素的分解法としてはトリブ
シンを用いる方法〈特開昭６３−２６３０８７）、リジ
ルエンドベブチダーゼを用いる方法（特開昭６２２５９
５９５）などが知られている。しかし、これらの分解方
法は、アミノ酸配列中にメチ才ニンを含む天然型モチリ
ンまたはその誘導体に適用した場合、目的の天然型モチ
リンまたはその誘導体自体を切断してしまうため、これ
らの天然型母チリンまたはその誘導体の製造には用いる
ことができない。
ヒトモチリン前駆体遺伝子を組み込んだブラスミドが特
開昭６３−２７６４８９に開示されているが、このプラ
スミドを用いてモヂリンを製造するためには、該ブラス
ミドを動物細胞に入れて前駆体蚤由質を生産させ、その
後、酵素分解によるプロセシングによりモチリンに変換
させる工程が必要であり、効率的な製造法ではない。
開昭６３−２７６４８９に開示されているが、このプラ
スミドを用いてモヂリンを製造するためには、該ブラス
ミドを動物細胞に入れて前駆体蚤由質を生産させ、その
後、酵素分解によるプロセシングによりモチリンに変換
させる工程が必要であり、効率的な製造法ではない。
発明が解決しようとする課題
モチリンおよびそ誘導体を安価にかつ大量に供給する製
造法が求められている。
造法が求められている。
課題を解決するための手段
本発明者らはモチリンがトリプトファンを含まないこど
ならびに、ペプチド中トリプトファンのカルボキシル側
のペプチド結合が酸化条件下に切断されること（続・生
化学実験化掌！４座２、タンパク質の化学《上） 、２
７２頁、１９８７年、東京化学同人刊）に着目し、モチ
リンの”ｒミノ末端と分子量７，０００以上のペプチド
とをトリプトファンを介して結合させた融合ポリペプチ
ドを組換えＤＮＡ技術を用いて製造し、これを酸化条件
下で処理し、トリプトファンのカルボキシル基側のベブ
チド結合を切断することにより効率よくモチリンを！ｌ
ｌ造できることを見い出し、本発明を完戊した。
ならびに、ペプチド中トリプトファンのカルボキシル側
のペプチド結合が酸化条件下に切断されること（続・生
化学実験化掌！４座２、タンパク質の化学《上） 、２
７２頁、１９８７年、東京化学同人刊）に着目し、モチ
リンの”ｒミノ末端と分子量７，０００以上のペプチド
とをトリプトファンを介して結合させた融合ポリペプチ
ドを組換えＤＮＡ技術を用いて製造し、これを酸化条件
下で処理し、トリプトファンのカルボキシル基側のベブ
チド結合を切断することにより効率よくモチリンを！ｌ
ｌ造できることを見い出し、本発明を完戊した。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、モチリンまたはその誘導体と分子量７． ０
００以上のペプチドとからなる融合ポリ（ヘ）ブチドを
提供ずる。
００以上のペプチドとからなる融合ポリ（ヘ）ブチドを
提供ずる。
本発明で用いられるモチリンのアミノ酸配列は下記式ｌ
で示される。
で示される。
（式中、記号は下記アミノ酸残基を示す。
１’ｈｅ：フ凰ニルアラニン、Ｖａｌ：バリン、Ｐｒｏ
：フｒｙ’）ン、ｌｉｅ： イソロイシン、Ｔｈｒ
：スレ才ニン、Ｔｙｒ：チロシン、Ｇｌｙ：グリシン、
Ｇｌｕ：グルタミン酸、］、ｅｕ：ｒｌイシン、Ｇｉｎ
：グルタミン、Ａｒｇ：アルギニン、Ｍｅｔ：メチオニ
ン、Ｌｙｓ：リジン、＾ｓｎ：アスパラギン。
：フｒｙ’）ン、ｌｉｅ： イソロイシン、Ｔｈｒ
：スレ才ニン、Ｔｙｒ：チロシン、Ｇｌｙ：グリシン、
Ｇｌｕ：グルタミン酸、］、ｅｕ：ｒｌイシン、Ｇｉｎ
：グルタミン、Ａｒｇ：アルギニン、Ｍｅｔ：メチオニ
ン、Ｌｙｓ：リジン、＾ｓｎ：アスパラギン。
以下同じ）
本発明で用いられるモチリン誘導体は、上記式ｌで示き
れるアミノ酸配列中で少なくとも１個のアミノ酸が欠失
するかあるいは、トリブトフＴン以外のアミノ酸に置換
されたポリペプチドであればいずれでもよい。アミノ酸
配列中にメチオニンを含む誘導体でも用いられる。
れるアミノ酸配列中で少なくとも１個のアミノ酸が欠失
するかあるいは、トリブトフＴン以外のアミノ酸に置換
されたポリペプチドであればいずれでもよい。アミノ酸
配列中にメチオニンを含む誘導体でも用いられる。
具体的には、ｌ５位のグルタミン酸がグルタミンに置換
されたモチリンである［Ｇ ｌ ｎ ”）モチリン〔生
化学４９ ． ２１３ （１９７？）：Ｉ 、１１位の
グルタミンがグルタミン酸に置換されたモチリンである
ＣＧ１ｕ”’Ｊモチリン（特公１１６１−２６５５９＞
、１６８目以降のアミノ酸が欠失したモチリン（特公
昭６１−２６５５９＞ 、１７番目以降のアミノ酸が欠
失したモチリン（特公昭５３−２３２８７）などがあげ
られる。
されたモチリンである［Ｇ ｌ ｎ ”）モチリン〔生
化学４９ ． ２１３ （１９７？）：Ｉ 、１１位の
グルタミンがグルタミン酸に置換されたモチリンである
ＣＧ１ｕ”’Ｊモチリン（特公１１６１−２６５５９＞
、１６８目以降のアミノ酸が欠失したモチリン（特公
昭６１−２６５５９＞ 、１７番目以降のアミノ酸が欠
失したモチリン（特公昭５３−２３２８７）などがあげ
られる。
本発明の融合ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術を用い
て微生物で生産することができる。以下、組換えＤＮＡ
技術を用いた融合ポリペプチドの製造法について説明す
る。
て微生物で生産することができる。以下、組換えＤＮＡ
技術を用いた融合ポリペプチドの製造法について説明す
る。
モチリンおよびその誘導体を結合させるベブチドは、分
子量が７． ０００以上であればいずれでもよいが、組
換えＤＮＡ技術を用いて高い生産量をあげているペプチ
ドが好ましい。例えば、シロザケ成長ホルモン（以下、
ｓＧＨと略記する。）、ｒインターフェロン、β−ガラ
クトシダーゼなどがあげられる。
子量が７． ０００以上であればいずれでもよいが、組
換えＤＮＡ技術を用いて高い生産量をあげているペプチ
ドが好ましい。例えば、シロザケ成長ホルモン（以下、
ｓＧＨと略記する。）、ｒインターフェロン、β−ガラ
クトシダーゼなどがあげられる。
融合ポリペプチドは、モチリンまたはその誘導体がトリ
プトファンを介して、分子量 ７．０００以上のペプチ
ドに結合した融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを組
換えＤＮＡ技術によりベクターＤＮＡに組み込むことに
より組換え体ブラスミドを造成し、これを用いて微生物
を形質転換させ、この形質転換微生物を培養し、培養物
中に該融合ポリペプチドを生成蓄積きせ、該培養物から
該融合ポリペプチドを採取することにより得られる。
プトファンを介して、分子量 ７．０００以上のペプチ
ドに結合した融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを組
換えＤＮＡ技術によりベクターＤＮＡに組み込むことに
より組換え体ブラスミドを造成し、これを用いて微生物
を形質転換させ、この形質転換微生物を培養し、培養物
中に該融合ポリペプチドを生成蓄積きせ、該培養物から
該融合ポリペプチドを採取することにより得られる。
ベクターＤＮＡとしては挿入したＤＮＡが微生物中で発
現できるものならいずれでも用いることができる。好ま
しくは、適当なプロモーター、例えばトリプトファン（
ｔｒｐ系》、ラクトース（ｌａｃ系）のブロそ一ターを
持ち、その下流に目的ＤＮＡを挿入でき、しかもシャイ
ンダルガーノ配列と翻訳開始コドンとの間を適当な距離
、例えば６〜ｌ８塩基数に調節したブラスミドを用いる
ことができる。
現できるものならいずれでも用いることができる。好ま
しくは、適当なプロモーター、例えばトリプトファン（
ｔｒｐ系》、ラクトース（ｌａｃ系）のブロそ一ターを
持ち、その下流に目的ＤＮＡを挿入でき、しかもシャイ
ンダルガーノ配列と翻訳開始コドンとの間を適当な距離
、例えば６〜ｌ８塩基数に調節したブラスミドを用いる
ことができる。
具体的に好適なベクターＤＮＡとしては、ｐＧＥ Ｌ
１ （Ｆｆ！ＲＭ ＢＰ−６２９． 特開昭６１−９
３１９７） 、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６０
０＞、ｐ Ｇ Ｈ Ａ ２ （ＦＥＲＭロＰ−４００、
特開昭６０−２２１０９１）などが挙げられる。
１ （Ｆｆ！ＲＭ ＢＰ−６２９． 特開昭６１−９
３１９７） 、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６０
０＞、ｐ Ｇ Ｈ Ａ ２ （ＦＥＲＭロＰ−４００、
特開昭６０−２２１０９１）などが挙げられる。
以下、シロずケ或長ホルモンとモチリンとを結合させた
融合ポリペプチドの製造法について具体的に説明する。
融合ポリペプチドの製造法について具体的に説明する。
シロザケ戊長ホルモンと七チリンとを結合させた融合ポ
リペプチドは以下の工程に従って製造される。
リペプチドは以下の工程に従って製造される。
〔工程１〕 モチリン遺伝子の合成
まず、下記式２． ３． ４および５で示されるＤ
ＮＡを化学合成する。
ＮＡを化学合成する。
５’ ＣＴＧＧＴＴＣＧＴＴ［：ＣＧＡＴＴＴＴＣＡＣ
ＴＴＡ［ＧＧＴＧＡＧＣＴＣ ３’（式２） ５′ 八ＣＧＴＴＧＧＡＧ（：ＴＣＡＣＣＧＴＡＡＧＴ
ＧＡＡＡＡＴＩＴＧＧＡＡＣＧ＾＾（：［：ＡＧＣＡＴ
Ｇ ３’（式３） ５’ ＣＡＡＣＧＴＡＴＧＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡ
ＣＧＴＡＡＩ’：ＡＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＡＧ ３’
（式４） ５’ ＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＴＴＡ
ＣＧＴＴ［：ＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＴ ３’（式５
） 《式中、Ａ．Ｇ．Ｃ．Ｔはそれぞれアデニン、グアニン
、シトシン、チミン塩基を有するデオキシオリゴヌクレ
オチドを表す。以下同じ》これらのＤＮＡの合成はリン
酸アミダイト法による固相合成法を用いて、ＤＮＡ自動
合成機により行う。
ＴＴＡ［ＧＧＴＧＡＧＣＴＣ ３’（式２） ５′ 八ＣＧＴＴＧＧＡＧ（：ＴＣＡＣＣＧＴＡＡＧＴ
ＧＡＡＡＡＴＩＴＧＧＡＡＣＧ＾＾（：［：ＡＧＣＡＴ
Ｇ ３’（式３） ５’ ＣＡＡＣＧＴＡＴＧＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡ
ＣＧＴＡＡＩ’：ＡＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＡＧ ３’
（式４） ５’ ＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＴＴＡ
ＣＧＴＴ［：ＴＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＴ ３’（式５
） 《式中、Ａ．Ｇ．Ｃ．Ｔはそれぞれアデニン、グアニン
、シトシン、チミン塩基を有するデオキシオリゴヌクレ
オチドを表す。以下同じ》これらのＤＮＡの合成はリン
酸アミダイト法による固相合成法を用いて、ＤＮＡ自動
合成機により行う。
式２で表されるＤＮＡ （以下ＤＮＡ２という）と式３
で表されるＤＮＡ （以下ＤＮΔ３という）から形成さ
れる二重鎮ＤＮＡと、式４で表されるＤＮＡ （以下Ｄ
ＮＡ４という〉と式５で表されるＤＮＡ （以下ＤＮＡ
５という）から形成される二重ｍＤＮＡをリガーゼで結
合して、下記式６で表される二重鎖Ｄ Ｎ Ａ断片（以
下遺伝子６という）を持ったブラスミドを造或する。
で表されるＤＮＡ （以下ＤＮΔ３という）から形成さ
れる二重鎮ＤＮＡと、式４で表されるＤＮＡ （以下Ｄ
ＮＡ４という〉と式５で表されるＤＮＡ （以下ＤＮＡ
５という）から形成される二重ｍＤＮＡをリガーゼで結
合して、下記式６で表される二重鎖Ｄ Ｎ Ａ断片（以
下遺伝子６という）を持ったブラスミドを造或する。
１０ ２０ ３０ ４０Ｓｐ
ｈｌ ５０ ６０ ７０
８０（式６） （式中、Ｓｐｈ Ｉ 、ＢａｍＨ目こ向かう引出し線は
、これらの酵素による切断部位を示す。以下同じ）この
遺伝子６はモヂリンのアミノ末端側にトリプトファン（
Ｔｒｐ｝が結合した２３個のアミノ酸からなるベブチド
をコードする塊基配列を有している。
ｈｌ ５０ ６０ ７０
８０（式６） （式中、Ｓｐｈ Ｉ 、ＢａｍＨ目こ向かう引出し線は
、これらの酵素による切断部位を示す。以下同じ）この
遺伝子６はモヂリンのアミノ末端側にトリプトファン（
Ｔｒｐ｝が結合した２３個のアミノ酸からなるベブチド
をコードする塊基配列を有している。
遺伝子６のコドンは大ＩＩｉ１１ｌで大量に生産させる
ポリペプチドの遺伝子に高頻度で出現するコドンＣＭ．
Ｇｏｕｙらヌクレイック・アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．） １０ ． ７０５５
（１９ｇ２） ”Ｊを主として用いてある。また遺伝子
６はＤＮＡ２とＤＮＡ３との二重鎖ＤＮ八断片と、ＤＮ
Ａ４とＤＮＡ５との二重鎖Ｄ Ｎ Ａ断片とをＤＮＡＩ
Ｊガーゼで結合して合成するが、この結合反応が効率よ
く進行ずるように遣伝子６の塩基配列中に７塩基以上の
同一の配列が存在しないように設３１シてある。
ポリペプチドの遺伝子に高頻度で出現するコドンＣＭ．
Ｇｏｕｙらヌクレイック・アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．） １０ ． ７０５５
（１９ｇ２） ”Ｊを主として用いてある。また遺伝子
６はＤＮＡ２とＤＮＡ３との二重鎖ＤＮ八断片と、ＤＮ
Ａ４とＤＮＡ５との二重鎖Ｄ Ｎ Ａ断片とをＤＮＡＩ
Ｊガーゼで結合して合成するが、この結合反応が効率よ
く進行ずるように遣伝子６の塩基配列中に７塩基以上の
同一の配列が存在しないように設３１シてある。
〔工程２〕 モチリン遺伝子の発現ブラスミドヘの組込
み 特開昭６１−９３１９７に記載された方法に従って製造
したｓ Ｇ Ｈ遺伝子の発現に用いるプラスミドｐｓＧ
ＨＩＭＩを制限酵素ｓｐｈ ｌとＢａｍＨＩで切断し、
約３． ２ ｋｂ （キロベース）のＤＮＡ断片（以下
ＤＮＡ７という）を単離する。このＤＮＡ７とＤＮＡ２
、ＤＮ八３、ＤＮＡ４、Ｄ Ｎ Ａ ５とを混会し、Ｄ
ＮＡＩＪガーゼで二重鎮ＤＮＡ間を結合し、アミノ末端
のメチオニンとｓＧＨの１＃目から１６１番目のアミノ
酸とからなるベブチドにトリプトファンを介してモチリ
ンが結合した融合ポリペプチドをコードする遺伝子を有
するブラスミドｐＭＭＴＦＷ１を造成する〈第１図参照
）。
み 特開昭６１−９３１９７に記載された方法に従って製造
したｓ Ｇ Ｈ遺伝子の発現に用いるプラスミドｐｓＧ
ＨＩＭＩを制限酵素ｓｐｈ ｌとＢａｍＨＩで切断し、
約３． ２ ｋｂ （キロベース）のＤＮＡ断片（以下
ＤＮＡ７という）を単離する。このＤＮＡ７とＤＮＡ２
、ＤＮ八３、ＤＮＡ４、Ｄ Ｎ Ａ ５とを混会し、Ｄ
ＮＡＩＪガーゼで二重鎮ＤＮＡ間を結合し、アミノ末端
のメチオニンとｓＧＨの１＃目から１６１番目のアミノ
酸とからなるベブチドにトリプトファンを介してモチリ
ンが結合した融合ポリペプチドをコードする遺伝子を有
するブラスミドｐＭＭＴＦＷ１を造成する〈第１図参照
）。
式８にｐＭＭＴＦＷ１が発現する融合ポリペプチド（以
下、量由買８と称する。）のアミノ酸配列とそれをコー
ドするＤＮＡ配列を示す。式中下線は量チリン領域を示
す。
下、量由買８と称する。）のアミノ酸配列とそれをコー
ドするＤＮＡ配列を示す。式中下線は量チリン領域を示
す。
＾ｒｇＡｓｎＬｙｓＧＩｙＧｌｎ
ＧＩｙＧＩｎ
ｐＭＭＴＦＷ１を制限酵ＪＩＳａＩｌＩで切断後、ＤＮ
ＡポリメラーゼκｌｅｎｏＷ断片（以下、単にκＩｅｎ
ｏｗ断片という）で切断末端の一本鎮領域の相補鎖を合
成し平滑末端く旧ｕｎｔ ｅｎｄ）とする。ついで制限
酵素ＢａｍＨＩで切断し、約２． ９ ｋｂのＤＮＡ断
片（以下ＤＮＡ９という）を単離する。ｐＭＭＴＦＷｌ
を制限酵ｔＡＢｇｌ．Ｕで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ断片を
用いて切断末端の一本鎖領域の相補鎖を合成し平滑末端
とする。ついで制限酵！ＢａｍＨＩで切断し、約０．２
５ＫｂのＤＮＡ断片《以下ＤＮＡｌ Ｏという〉を単離
する。ＤＮＡ９とＤＮＡ １ ０をＤＮＡ Ｕガーゼで
結合するε、ブラスミドｐＭＭＴＦＷ４が得られる《第
２図参照》。ｐＭＭＴＦＷ４はｐＭＭＴＦＷｌのｓＧＨ
をコードする遭伝子を一部欠損した構造を持っている。
ＡポリメラーゼκｌｅｎｏＷ断片（以下、単にκＩｅｎ
ｏｗ断片という）で切断末端の一本鎮領域の相補鎖を合
成し平滑末端く旧ｕｎｔ ｅｎｄ）とする。ついで制限
酵素ＢａｍＨＩで切断し、約２． ９ ｋｂのＤＮＡ断
片（以下ＤＮＡ９という）を単離する。ｐＭＭＴＦＷｌ
を制限酵ｔＡＢｇｌ．Ｕで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ断片を
用いて切断末端の一本鎖領域の相補鎖を合成し平滑末端
とする。ついで制限酵！ＢａｍＨＩで切断し、約０．２
５ＫｂのＤＮＡ断片《以下ＤＮＡｌ Ｏという〉を単離
する。ＤＮＡ９とＤＮＡ １ ０をＤＮＡ Ｕガーゼで
結合するε、ブラスミドｐＭＭＴＦＷ４が得られる《第
２図参照》。ｐＭＭＴＦＷ４はｐＭＭＴＦＷｌのｓＧＨ
をコードする遭伝子を一部欠損した構造を持っている。
式ｌ１にｐＭＭＴＦＷ４が発現する融合ポリペプチド（
以下、蛋白質１１と称する。）のアミノ酸配列とそれを
コードす６ＤＮＡ配列を示す。式中下線はモチリン領域
を示す。
以下、蛋白質１１と称する。）のアミノ酸配列とそれを
コードす６ＤＮＡ配列を示す。式中下線はモチリン領域
を示す。
ｐＭＭＴＦＷ１を制限酵Ｊ！Ａｓｐ７１８で切断後、κ
ｌｅｎｏｗ断片を用いて切断末端の一本鎮領域の相？ｌ
鎮を合成し、平滑末端とする。ついで制限酵素Ｂａｒｎ
ＨＩで切断し、約２． ８ ｋｂのＤＮＡ断片（以下Ｄ
ＮＡｌ２という）を単離する。ｐ Ｍ Ｍ ＴＦＷＩを
制限酵素Ｂｇｉ■で切断後、κｌｅｎｏ一断片で切断末
端の一本鎖領域の相補鎮を合或し、平滑末端とし、つい
で制限酵ｍＢａｍＨＩで切断し、・約０．２５ｋｂのＤ
ＮＡ断片（以下ＤＮＡ ｌ ３という）をｗＬ離ス６．
，ＤＮＡ １ ２ トＤＮＡ １ ３ヲＤＮＡ ＩＪガ
ーゼで結合すると、プラスミドｐＭＭＴＦＷ５が得られ
る（第３図参照）。ｐＭＭＴＦＷ５はｐＭＭＴＦＷ１の
ｓ Ｇ Ｈをコードする遺伝子を一部欠損した構造を持
っている。式ｌ４にｐ ＭＭＴＦＷ５が発現する融合ポ
リペプチド（以下、蛋白質ｌ４と称する。》のアミノ酸
配列とそれをコードするＤＮＡ配列を示す。式中下線は
モチリン領域を示す。
ｌｅｎｏｗ断片を用いて切断末端の一本鎮領域の相？ｌ
鎮を合成し、平滑末端とする。ついで制限酵素Ｂａｒｎ
ＨＩで切断し、約２． ８ ｋｂのＤＮＡ断片（以下Ｄ
ＮＡｌ２という）を単離する。ｐ Ｍ Ｍ ＴＦＷＩを
制限酵素Ｂｇｉ■で切断後、κｌｅｎｏ一断片で切断末
端の一本鎖領域の相補鎮を合或し、平滑末端とし、つい
で制限酵ｍＢａｍＨＩで切断し、・約０．２５ｋｂのＤ
ＮＡ断片（以下ＤＮＡ ｌ ３という）をｗＬ離ス６．
，ＤＮＡ １ ２ トＤＮＡ １ ３ヲＤＮＡ ＩＪガ
ーゼで結合すると、プラスミドｐＭＭＴＦＷ５が得られ
る（第３図参照）。ｐＭＭＴＦＷ５はｐＭＭＴＦＷ１の
ｓ Ｇ Ｈをコードする遺伝子を一部欠損した構造を持
っている。式ｌ４にｐ ＭＭＴＦＷ５が発現する融合ポ
リペプチド（以下、蛋白質ｌ４と称する。》のアミノ酸
配列とそれをコードするＤＮＡ配列を示す。式中下線は
モチリン領域を示す。
（式１４）
ｐＭＭＴＦＷ１を制限酵素Ｓａｊ！［で切断後、κＩｅ
ｎｏｗ断片で切断末端の一本鎖領域の相補鎮を合威して
、平滑末端とし、ついで制限酵ｓＢ ａ ｍ Ｈ■で切
断し、約２．９ｋｂのＤＮＡ断片〈以下ＤＮＡｌ５とい
う〉を単離する。
ｎｏｗ断片で切断末端の一本鎖領域の相補鎮を合威して
、平滑末端とし、ついで制限酵ｓＢ ａ ｍ Ｈ■で切
断し、約２．９ｋｂのＤＮＡ断片〈以下ＤＮＡｌ５とい
う〉を単離する。
ｐＭＭＴＦＷ１を制限酵素ＢｇＲＩで切断後、κＩｅｎ
ｏｗ断片を用いて、切断末端の一本鎖部分を除去し平滑
末端にする。ついで制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、約０
． ２ ｋｂのＤＮＡ断片《以下Ｄ Ｎ Ａ １６とい
う》を単離する。ＤＮＡ１ ５とＤＮＡ１ ６をＤＮＡ
リガーゼで結合すると、ブラスミドｐＭＭＴＦＷ６が得
られる（第４図参照）。ｐ ＭＭＴ ＦＷ６はｐＭＭＴ
ＦＷ１のｓＧＨをコードする遺伝子を一部欠損した構造
を有する。式ｌ７にｒ＋ＭＭＴＦＷ６が発現する融合ポ
リペプチド《以下、黒白質ｌ７と称する。）のアミノ酸
配列とそれをコードするＤＮＡ配列を示す。式中下線は
モチリン領域を示す。
ｏｗ断片を用いて、切断末端の一本鎖部分を除去し平滑
末端にする。ついで制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、約０
． ２ ｋｂのＤＮＡ断片《以下Ｄ Ｎ Ａ １６とい
う》を単離する。ＤＮＡ１ ５とＤＮＡ１ ６をＤＮＡ
リガーゼで結合すると、ブラスミドｐＭＭＴＦＷ６が得
られる（第４図参照）。ｐ ＭＭＴ ＦＷ６はｐＭＭＴ
ＦＷ１のｓＧＨをコードする遺伝子を一部欠損した構造
を有する。式ｌ７にｒ＋ＭＭＴＦＷ６が発現する融合ポ
リペプチド《以下、黒白質ｌ７と称する。）のアミノ酸
配列とそれをコードするＤＮＡ配列を示す。式中下線は
モチリン領域を示す。
Ｌｅｕ＾１ａＧＩｎＬｙｓＭｅｔＰｈｅＡｓｎＡｓｐＰ
ｈｅＡｓｐＧｌｙＴｈｒ１、ｅｕＬｅｕＰｒｏ＾ｓｐＧ
ｌｕ＾ｒｇ＾ｒｇＧｌｎＧＩｙＶａｌＬｅｕＳｃｒＬｅ
ｕＡｓｐ＾ｓｐＡｓｎＡｓｐＳｅｒＧＩｎＧＩｎＬｅｕ
Ｐｒｏｌ’ｒｏＴｙｒＧ１ｙＡｓｒ＋ＴｙｒＴｙｒ（式
１７） 〔工程３〕 シロザケ或長ホルモンとモヂリンが結合（
７た融合ポリペプチドの生産と単離工程２で製造したブ
ラスミドｐＭＭＴＦＷ１，ｐＭＭＴＦＷ４、ｒｉＭＭＴ
ＦＷ５またはｐＭＭＴＦＷ６を大腸菌に導入し、得られ
た形質転換大腸菌を培地に培養して該培養物よりシロザ
ケ成長ホルモンとモチリンとが結合した融合ポリペプチ
ドを採取する。大腸菌体内に生産された目的の融合ポリ
ペプチドは非水溶性の穎粒として存在する。
ｈｅＡｓｐＧｌｙＴｈｒ１、ｅｕＬｅｕＰｒｏ＾ｓｐＧ
ｌｕ＾ｒｇ＾ｒｇＧｌｎＧＩｙＶａｌＬｅｕＳｃｒＬｅ
ｕＡｓｐ＾ｓｐＡｓｎＡｓｐＳｅｒＧＩｎＧＩｎＬｅｕ
Ｐｒｏｌ’ｒｏＴｙｒＧ１ｙＡｓｒ＋ＴｙｒＴｙｒ（式
１７） 〔工程３〕 シロザケ或長ホルモンとモヂリンが結合（
７た融合ポリペプチドの生産と単離工程２で製造したブ
ラスミドｐＭＭＴＦＷ１，ｐＭＭＴＦＷ４、ｒｉＭＭＴ
ＦＷ５またはｐＭＭＴＦＷ６を大腸菌に導入し、得られ
た形質転換大腸菌を培地に培養して該培養物よりシロザ
ケ成長ホルモンとモチリンとが結合した融合ポリペプチ
ドを採取する。大腸菌体内に生産された目的の融合ポリ
ペプチドは非水溶性の穎粒として存在する。
培養終了後、菌体を集め、これを破砕し、破砕液を遠心
分離し、シロザケ成長ホルモンとモチリンとが結合した
融合ポリペプチドを含有する穎粒を分離する。
分離し、シロザケ成長ホルモンとモチリンとが結合した
融合ポリペプチドを含有する穎粒を分離する。
融合ポリペプチドを含有する穎粒から融合ポリペプチド
を単離、精製するには、プロテイン・エンジニアリング
（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ） ２ ．
４８１（１９８９）に記載の方法に従い、ゲルρ過カラ
ムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィ
− （ＨＰＬＣ）を用いて行う。
を単離、精製するには、プロテイン・エンジニアリング
（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ） ２ ．
４８１（１９８９）に記載の方法に従い、ゲルρ過カラ
ムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィ
− （ＨＰＬＣ）を用いて行う。
上記組換えＤＮＡ技術における反応の条件は、一般的に
下記のとおりである。
下記のとおりである。
ＤＮＡの制限酵素による消化反応は、通常０． １〜２
０ｇのＤＮＡを２〜２００ｍＭ（好ましくは１０〜４０
ｍＭ）のトリスーＨＣＩ （ｐ｝１６．０〜９．５好
ましくはｐＨ７．０〜ｇ．Ｏ） ， ０−２ ０ ０ｍ
Ｍ ＮａＣ１またはＫＣＡ、２〜３ｆ）ｍＭ（好まし《
は５〜１０ｍＭ＞のＭｇＣｊ？ａ 、０−２ ０ｍＭの
２−メルカブトエタノールを含む反応液中で、制限酵素
０．ｌ〜ｌ００単位（好ましくは１塊のＤＮＡに対して
１〜３単位）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる
制限酵素により異なる》において、１５分間〜２４時間
行う。
０ｇのＤＮＡを２〜２００ｍＭ（好ましくは１０〜４０
ｍＭ）のトリスーＨＣＩ （ｐ｝１６．０〜９．５好
ましくはｐＨ７．０〜ｇ．Ｏ） ， ０−２ ０ ０ｍ
Ｍ ＮａＣ１またはＫＣＡ、２〜３ｆ）ｍＭ（好まし《
は５〜１０ｍＭ＞のＭｇＣｊ？ａ 、０−２ ０ｍＭの
２−メルカブトエタノールを含む反応液中で、制限酵素
０．ｌ〜ｌ００単位（好ましくは１塊のＤＮＡに対して
１〜３単位）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる
制限酵素により異なる》において、１５分間〜２４時間
行う。
制限酵素消化によって生じたＤＮＡＩｆｉ片のｍｕは、
Ｌ Ｇ Ｔ法やポリアクリルアミドゲル電気泳勤法など
によって行う。
Ｌ Ｇ Ｔ法やポリアクリルアミドゲル電気泳勤法など
によって行う。
ＤＮＡ断片の結合反応は、２〜２００ｍＭ（好ましくは
ｌＯ〜４０姉》のトリスーＨＣＩ （ｐＨ６．１〜９．
５、好ましくはｐＨ７．０〜８．０）、２〜２０ｍＭ（
好ましくは５〜ｌＯｍＭ＞のＭ ｇ Ｃ １ ｘ、０、
１−１０ｍｌｌ（好ましくは０、５ 〜２． ０ ｍＭ
）のＡＴＰ，１〜５ ０ｄ （好ましくは５〜１０ｍＭ
）のジチオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ０．３〜１０単位を用い、ｌ〜３７℃（好まし
くは３〜２０℃）でｌ５分間情７２時間（好ましくは２
〜２０時間）行う。
ｌＯ〜４０姉》のトリスーＨＣＩ （ｐＨ６．１〜９．
５、好ましくはｐＨ７．０〜８．０）、２〜２０ｍＭ（
好ましくは５〜ｌＯｍＭ＞のＭ ｇ Ｃ １ ｘ、０、
１−１０ｍｌｌ（好ましくは０、５ 〜２． ０ ｍＭ
）のＡＴＰ，１〜５ ０ｄ （好ましくは５〜１０ｍＭ
）のジチオスレイトールを含む反応液中で、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ０．３〜１０単位を用い、ｌ〜３７℃（好まし
くは３〜２０℃）でｌ５分間情７２時間（好ましくは２
〜２０時間）行う。
結合反応によって生じた組換え体ブラスミドＤＮＡは、
必要によりコーエンらの形質転換法〔エス・エヌ・コー
エン（Ｓ， Ｎ．Ｃｏｈｅｎ）ら：プ口シーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ， Ｎａｔ１、 Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＞
．ＵＳＡ、６９． ２１１０ （１９７２） ：ｌによ
って、大腸菌に導入する。
必要によりコーエンらの形質転換法〔エス・エヌ・コー
エン（Ｓ， Ｎ．Ｃｏｈｅｎ）ら：プ口シーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
（Ｐｒｏｃ， Ｎａｔ１、 Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＞
．ＵＳＡ、６９． ２１１０ （１９７２） ：ｌによ
って、大腸菌に導入する。
組換え体ブラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの
単離は、セシウム・クロライド−エチジウム・ブロミド
密度勿配超還心法〔ディー・ビー・クレウェル（Ｄ．Ｂ
。Ｃｌｅｗｅｌｌ）ら：プロシーディング・才ブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・才ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
， Ｎａｔ １、＾ｃａｄ，Ｓｃｉ．） ． ＩＩｓＡ
， ６２．１１５９（１９６９））あるいはバーンボ
イム（ロｉｒｎｂｏｉｍ）らの方法〔エイチ・シー・バ
ーンボイム（Ｈ． Ｃ． Ｂ ｉ ｒｒ＋ｂｏ ｉｍ）
ら：ヌクレイック・アンド・リサーチ（Ｎｕｃ［ｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．） ７ ． １５１３ （１９
７９））などを用いて行う。
単離は、セシウム・クロライド−エチジウム・ブロミド
密度勿配超還心法〔ディー・ビー・クレウェル（Ｄ．Ｂ
。Ｃｌｅｗｅｌｌ）ら：プロシーディング・才ブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・才ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
， Ｎａｔ １、＾ｃａｄ，Ｓｃｉ．） ． ＩＩｓＡ
， ６２．１１５９（１９６９））あるいはバーンボ
イム（ロｉｒｎｂｏｉｍ）らの方法〔エイチ・シー・バ
ーンボイム（Ｈ． Ｃ． Ｂ ｉ ｒｒ＋ｂｏ ｉｍ）
ら：ヌクレイック・アンド・リサーチ（Ｎｕｃ［ｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．） ７ ． １５１３ （１９
７９））などを用いて行う。
プラスミドＤＮＡを制限酵素で消化後アガロースゲル電
気泳勤あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動により
切断部位を調べる。さらにＤＮＡの塩基配列を決定する
必姿があるときはマキサム・ギルバート法〔プロシーデ
ィング・オプ・ず・ナショナル・Ｔｈデミイ・オブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ， Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ， Ｓｃｉ
． ）． ＩＩＳ＾、７４ ．５６０ （１９７７）］
またはＭ１３ファージを用いたサンガー（Ｓａｎｇｅｒ
）法〔サンガー （Ｓａｎｇｅｒ）ら：ブロシーディン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ
ンス（Ｐｒｏｃ， Ｎａｔ１、＾ｅａｄ，Ｓｃｉ，），
ＩＩＳＡ， ７４ ．５４６３（ｉ９７７） ：アマ
ーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社 Ｍ１３クロニング・
アンド・シークエンシング・ハンドブック（ａｔｏｎｉ
ｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉａｎｄｂｏｏ
ｋ）］によって決定する。
気泳勤あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動により
切断部位を調べる。さらにＤＮＡの塩基配列を決定する
必姿があるときはマキサム・ギルバート法〔プロシーデ
ィング・オプ・ず・ナショナル・Ｔｈデミイ・オブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ， Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ， Ｓｃｉ
． ）． ＩＩＳ＾、７４ ．５６０ （１９７７）］
またはＭ１３ファージを用いたサンガー（Ｓａｎｇｅｒ
）法〔サンガー （Ｓａｎｇｅｒ）ら：ブロシーディン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ
ンス（Ｐｒｏｃ， Ｎａｔ１、＾ｅａｄ，Ｓｃｉ，），
ＩＩＳＡ， ７４ ．５４６３（ｉ９７７） ：アマ
ーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社 Ｍ１３クロニング・
アンド・シークエンシング・ハンドブック（ａｔｏｎｉ
ｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉａｎｄｂｏｏ
ｋ）］によって決定する。
本発明の融合ポリベブヂドは以下のとおりに製造できる
。
。
すなわち、ブラスミドを用いて大ＩＩ！菌Ｋ−１２Ｃ６
００やＨＢ１０１を形質転換させ、アンビシリン耐性の
コロニーの中からブラスミドを有する大腸菌を選び出す
。ブラスミドを有する大Ｉｌ！菌を培地に培養すること
により培養物中に融合ポリペプチドを生成させることが
できる。
００やＨＢ１０１を形質転換させ、アンビシリン耐性の
コロニーの中からブラスミドを有する大腸菌を選び出す
。ブラスミドを有する大Ｉｌ！菌を培地に培養すること
により培養物中に融合ポリペプチドを生成させることが
できる。
ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびに融合ポ
リペプチドの生産に好適なものならば合或培地、天然培
地のいずれも使用できる。
リペプチドの生産に好適なものならば合或培地、天然培
地のいずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、グルセロース、マンニトール、ソルビトールなどが
、窒素源としては、ＮＨ．ＣＪ！，（ＮＨ４）ｉｓＯａ
、力ずミノ酸、酵母エキス、ポリベブトン、肉エキス
、バクトトリブトン、コーン・スティープ・リカ一など
が、その他の栄養源としては、Ｋ２ＨＰＯ． 、ＫＨ２
ＰＯ． 、ＮａＣ１、ＭｇＳＯｓ、ビタミン１３＋ Ｓ
Ｍｇ Ｃ １ ２などが使用できる。
ス、グルセロース、マンニトール、ソルビトールなどが
、窒素源としては、ＮＨ．ＣＪ！，（ＮＨ４）ｉｓＯａ
、力ずミノ酸、酵母エキス、ポリベブトン、肉エキス
、バクトトリブトン、コーン・スティープ・リカ一など
が、その他の栄養源としては、Ｋ２ＨＰＯ． 、ＫＨ２
ＰＯ． 、ＮａＣ１、ＭｇＳＯｓ、ビタミン１３＋ Ｓ
Ｍｇ Ｃ １ ２などが使用できる。
培養はｐ Ｈ ５． ５〜８．５、温度ｌ８〜４０℃で
通気攪拌培養により行われる。
通気攪拌培養により行われる。
培養５〜９０時間で培ＩＩｌｌｌＩＩ体中に該融合ポリ
ペプチドが非水溶性の顧粒として蓄積するので、培養物
から薗体を集菌し７、菌体を破砕し、破砕液を遠心分離
して得られる沈殿物よりゲルｐ過カラムクロマトグラフ
ィー、厘ＨＰＬＣ等を用いて該融合ポリペプチドを採取
する。
ペプチドが非水溶性の顧粒として蓄積するので、培養物
から薗体を集菌し７、菌体を破砕し、破砕液を遠心分離
して得られる沈殿物よりゲルｐ過カラムクロマトグラフ
ィー、厘ＨＰＬＣ等を用いて該融合ポリペプチドを採取
する。
また該融合ポリペプチドの検出は培養菌体を直接レムリ
（Ｌａｅｍｍｌｉ）のサンプルノずツファ一〔レムリ
（Ｌａｅａ＋ｍｌｉ） ｓネイチャ− （Ｎａｔｕｒｅ
） ２２７ ， ６８０（１９７０））に加熱、溶解後
、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル〔レムリ（Ｌａｅｍ
ｍｌｉ）の方法二同上文献〕にかけ、クマシーブリリア
ントブルー（Ｃｏｏａｉａｓｓ ｉｅＢｒｉｌｌｉａｎ
ｔ Ｂｌｕｅ）色素〔バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
）社製〕を用いて染色１，て行う。
（Ｌａｅｍｍｌｉ）のサンプルノずツファ一〔レムリ
（Ｌａｅａ＋ｍｌｉ） ｓネイチャ− （Ｎａｔｕｒｅ
） ２２７ ， ６８０（１９７０））に加熱、溶解後
、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル〔レムリ（Ｌａｅｍ
ｍｌｉ）の方法二同上文献〕にかけ、クマシーブリリア
ントブルー（Ｃｏｏａｉａｓｓ ｉｅＢｒｉｌｌｉａｎ
ｔ Ｂｌｕｅ）色素〔バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ
）社製〕を用いて染色１，て行う。
本発明は、また上記融合ポリペプチドを用いるモチリン
およびモチリン誘導体の製造方法を提供する。
およびモチリン誘導体の製造方法を提供する。
以下、融合ポリペプチドからモチリンおよびモチリン誘
導体を製造する方法について説明する。
導体を製造する方法について説明する。
上記工程３で得た融合ポリペプチドを酸化剤で処理する
こｋによりトリプトファン残基のカルボキシル基側のベ
ブチド結合が切断され、メチオニン残基がスルホキサイ
ドに酸化された［Ｍｅｔ（０）Ｉ３］モチリンまたはそ
の誘導体を得る。酸化剤としてはＮ−ブロモコハク酸イ
ミド、０−ヨードソ安息ｔＦ酸、２−（２−ニトロフェ
ニル》−３−メチループロモインドール、ジメチルスル
ホキシド（以下ＤＭＳＯと略記する。）一臭化水素、Ｄ
ＭＳＯ臭化水素一塩酸、Ｄ Ｍ Ｓ Ｏ−塩酸一臭化シ
アンなどがあげられる（続・実験化学講座２、蛋白質の
化学（上） 、２７１頁、１９８７年、東京化学同人刊
）。
こｋによりトリプトファン残基のカルボキシル基側のベ
ブチド結合が切断され、メチオニン残基がスルホキサイ
ドに酸化された［Ｍｅｔ（０）Ｉ３］モチリンまたはそ
の誘導体を得る。酸化剤としてはＮ−ブロモコハク酸イ
ミド、０−ヨードソ安息ｔＦ酸、２−（２−ニトロフェ
ニル》−３−メチループロモインドール、ジメチルスル
ホキシド（以下ＤＭＳＯと略記する。）一臭化水素、Ｄ
ＭＳＯ臭化水素一塩酸、Ｄ Ｍ Ｓ Ｏ−塩酸一臭化シ
アンなどがあげられる（続・実験化学講座２、蛋白質の
化学（上） 、２７１頁、１９８７年、東京化学同人刊
）。
例えば、ＤＭＳＯ一塩酸一臭化シアンを酸化剤として用
いる場合の酸化は以下の通りである。
いる場合の酸化は以下の通りである。
融合ポリペプチドを酢酸に溶解し、ＤＭＳＯと塩酸を加
え攪拌する。反応液のｐｎを約２〜４に調整後、臭化シ
アンを加え攪拌すると（：Ｎｅｔ（０）１″：］モチリ
ンまたはその誘導体が得られる。
え攪拌する。反応液のｐｎを約２〜４に調整後、臭化シ
アンを加え攪拌すると（：Ｎｅｔ（０）１″：］モチリ
ンまたはその誘導体が得られる。
Ｃ Ｍｅｔ （０） ” ］モチリンおよびその誘導体
をジチオスレイトール、チオグリコール酸などの還元剤
を用いて還元することによりモヂリンおよびその誘導体
を生成きせるこεができる。
をジチオスレイトール、チオグリコール酸などの還元剤
を用いて還元することによりモヂリンおよびその誘導体
を生成きせるこεができる。
モチリンおよびモチリン誘導体はバイオテクノロジー・
レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ） １０ ．７６３ （１９８８）に記載の方法に従
いＨＰＬＣを用いて単離、精製する。
レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ） １０ ．７６３ （１９８８）に記載の方法に従
いＨＰＬＣを用いて単離、精製する。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例Ｉ ＤＮＡ２〜５、ｌ９および２０の製造ＤＮ
Ａ２〜５、１９および２０の合或はリン酸アミダイト法
による固相合成法〔Ｓ．シ、Ｂｅａｕｃａｇｅら、テト
ラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ）２２ ． １８５９ （１９８１）、１
、．Ｊ−ＭｃＢｒｉｅら、同ｆｉ ． ２４５（１９８
３）］に従い、アプライドバイオシステム社のＤＮＡ自
動合成機３ＢＯＡを用いて下記のとおり行った。
Ａ２〜５、１９および２０の合或はリン酸アミダイト法
による固相合成法〔Ｓ．シ、Ｂｅａｕｃａｇｅら、テト
ラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ）２２ ． １８５９ （１９８１）、１
、．Ｊ−ＭｃＢｒｉｅら、同ｆｉ ． ２４５（１９８
３）］に従い、アプライドバイオシステム社のＤＮＡ自
動合成機３ＢＯＡを用いて下記のとおり行った。
シリカゲルを固相担体とし、これに３′水酸基を介して
結合したヌクレオチドの５′水酸基に（１）ヌクレオチ
ドをリン酸アミダイト法により縮合し、伐｝縮合したヌ
クレ才チドの亜リン酸結合を沃素で酸化してリン酸結合
にし、（３）縮合したヌクレオチドの５′水酸基上の保
護基をトリフルオロ酢酸で除去した。次に（１）の工程
に戻って次のヌクレオチドを同碌に縮合した。こうして
（１）〜（３）の工程が繰り返されてＤＮＡが担体上に
合威された。合或終了後、ＤＮＡの結合した担体をチオ
フェノール溶液中に室温で１時間放置してリン酸の保護
基を除去した後、漬アンモニア水中に室温で１時間放置
してＤＮＡを担体からａｔｉさせた。ＤＮＡを含む濃ア
ンモニア水を密封容器中６０℃にて１２時間加熱して塩
基上の保護基を除去した。
結合したヌクレオチドの５′水酸基に（１）ヌクレオチ
ドをリン酸アミダイト法により縮合し、伐｝縮合したヌ
クレ才チドの亜リン酸結合を沃素で酸化してリン酸結合
にし、（３）縮合したヌクレオチドの５′水酸基上の保
護基をトリフルオロ酢酸で除去した。次に（１）の工程
に戻って次のヌクレオチドを同碌に縮合した。こうして
（１）〜（３）の工程が繰り返されてＤＮＡが担体上に
合威された。合或終了後、ＤＮＡの結合した担体をチオ
フェノール溶液中に室温で１時間放置してリン酸の保護
基を除去した後、漬アンモニア水中に室温で１時間放置
してＤＮＡを担体からａｔｉさせた。ＤＮＡを含む濃ア
ンモニア水を密封容器中６０℃にて１２時間加熱して塩
基上の保護基を除去した。
ＤＮＡ２を例にとると、Ｑ． ２μｎｏｌｅのヌクレオ
チドの結合した担体を用いて合或を行い、次いで保護基
の除去と固和からの遊離反応を行ってＤＮＡ２の粗生成
物２ｌロ』．単位（２６０ｎｎ＋で測定》を得た。この
粗生成物の５ ０， Ｄ，単位を７Ｍ尿素を含むトリス
ー硼酸ｔ！ｉ衝液（ｐＨ８）を用いて！０％ポリアクリ
ルＴミドゲル（２關厚、１３（ＪＸ１３ｅｓ）の電気泳
動で精製し、ＤＮΔ２を含むゲルの領域をとり、０．２
Ｍ炭酸トリエヂルアミン緩衝液（ｐＨ８）（以下ＴＥＡ
Ｂという） １−でＤＮＡ２を１８時間かけて抽出し、
ついでその抽出液をセフＴデックスＤＥ５２のカラム（
径６開、長さ５ｍｍ＞に通してＤＮＡ２を吸着させた。
チドの結合した担体を用いて合或を行い、次いで保護基
の除去と固和からの遊離反応を行ってＤＮＡ２の粗生成
物２ｌロ』．単位（２６０ｎｎ＋で測定》を得た。この
粗生成物の５ ０， Ｄ，単位を７Ｍ尿素を含むトリス
ー硼酸ｔ！ｉ衝液（ｐＨ８）を用いて！０％ポリアクリ
ルＴミドゲル（２關厚、１３（ＪＸ１３ｅｓ）の電気泳
動で精製し、ＤＮΔ２を含むゲルの領域をとり、０．２
Ｍ炭酸トリエヂルアミン緩衝液（ｐＨ８）（以下ＴＥＡ
Ｂという） １−でＤＮＡ２を１８時間かけて抽出し、
ついでその抽出液をセフＴデックスＤＥ５２のカラム（
径６開、長さ５ｍｍ＞に通してＤＮＡ２を吸着させた。
２ＭＴＥＡＢ ２ｎＮで溶出して１．４ロ．０．単位
のＤＮＡ２の純品を得た。
のＤＮＡ２の純品を得た。
ＤＮＡ２以外のＤＮＡｂ同程度の収率で合威された。
これらＤＮＡの５′水酸基をファージＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼと〔γ一ゝ”Ｐ）ＡＴＰを用いる常法〔＾
』』ａｘａｍら、メソヴヅ・イン・エンザイモロジイ（
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｈｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） Ｖｏ
ｌ．６５ ．Ｐａｒｔｒ．Ｐ。４９９，＾ｅａｉｌｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８０＞］でリン酸化して放射
性ラベルをつけた。ラベルをつけたＤＮＡを７Ｍ尿素を
含むトリスー硼酸緩衝液でｌ２％ポリ了クリルアミドゲ
ル電気泳動を行い、ＤＮＡの純度と鎖長を確認した。
チドキナーゼと〔γ一ゝ”Ｐ）ＡＴＰを用いる常法〔＾
』』ａｘａｍら、メソヴヅ・イン・エンザイモロジイ（
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｈｎｚｙｍｏｌｏｇｙ） Ｖｏ
ｌ．６５ ．Ｐａｒｔｒ．Ｐ。４９９，＾ｅａｉｌｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８０＞］でリン酸化して放射
性ラベルをつけた。ラベルをつけたＤＮＡを７Ｍ尿素を
含むトリスー硼酸緩衝液でｌ２％ポリ了クリルアミドゲ
ル電気泳動を行い、ＤＮＡの純度と鎖長を確認した。
実施例２ ブラスミドｐＭＭＴＦＩＡ／ｌの作製特開昭
６１−９３１９７に記載の方法で製造したブラスミドｐ
ｓＧＨＩＭ１ ２Ｊ＆ｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（室酒
造社製＞１０単位、ＳｐｈＩ （ニブボンジーン社等
） ＩＯ単位を含む溶液［：１０ｍＭ｝ＩＪスＨＣｊ！
（ｐＨ７．５） 、７ｍＭ ＭｇＣＩ．２、６ｍ
Ｍ２−メルカブトエタノール、１００ｍＭ ＮａＣ１
〕３０パに溶解し、３７℃、２時間消化反応を行った。
６１−９３１９７に記載の方法で製造したブラスミドｐ
ｓＧＨＩＭ１ ２Ｊ＆ｇを制限酵素ＢａｍＨＩ（室酒
造社製＞１０単位、ＳｐｈＩ （ニブボンジーン社等
） ＩＯ単位を含む溶液［：１０ｍＭ｝ＩＪスＨＣｊ！
（ｐＨ７．５） 、７ｍＭ ＭｇＣＩ．２、６ｍ
Ｍ２−メルカブトエタノール、１００ｍＭ ＮａＣ１
〕３０パに溶解し、３７℃、２時間消化反応を行った。
この反応液をエチジウムブロミドを含むアガｎ−スゲル
電気泳勤にかけ、紫外線（波長３０２ｎｍ）で検出して
約３．２ｋｂのＤＮＡ７を含むゲル片を切り出した。ゲ
ル片１ごフ五ノール０．５−を加えて凍結・溶解し、水
層をクロロホルムで洗浄後、エタノール沈殿によりＤＮ
Ａ７を回収した。
電気泳勤にかけ、紫外線（波長３０２ｎｍ）で検出して
約３．２ｋｂのＤＮＡ７を含むゲル片を切り出した。ゲ
ル片１ごフ五ノール０．５−を加えて凍結・溶解し、水
層をクロロホルムで洗浄後、エタノール沈殿によりＤＮ
Ａ７を回収した。
ＤＮＡ２〜５各１ ０ ｐｍｏ＋６を各々Ｔ４ボリヌク
レオチドキナーゼ反応用緩衝液［５０ｍＭ｝リスＨＣｊ
！（ｐＨ７。５） 、１ ０ｍＭ ＭｇＣＩ！．ｘ
、５ｍＭジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）
、１ｍＭ ＡＴＰ％Ｏ．Ｌ＋ｎＭスペルミジン、０．
１ｍＭＥＤＴＡ３３０ｄずつに溶解し、Ｔ４ボリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造社製）３単位を加え、３７℃、
４０分間リン酸化反応を行った後、６５℃で１５分間加
熱して酵素を失活させた。この反応液を４−ずつ混合し
、上記で得たＤＮＡ７ ０．０８ρｍｏｌｅを加え、
Ｔ４リガーゼ反応用緩衝液〔２８ｌＴＩＭトリスー１４
Ｃｊ！（ｐＨ７．５）、９ ｍＭ Ｍ ｇ Ｃ １
！、１ ０ｄ ＤＴＴ，０．０ ３ｍＭ ＥＤＴＡ
，０．７ｄＡＴＰ％０．０３ｍＭスペルミシン〕の組或
になるよう調整し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社ＶＳ
＞１７５単位を加え、３０〃とした。４℃で１６時間結
合反応を行った。
レオチドキナーゼ反応用緩衝液［５０ｍＭ｝リスＨＣｊ
！（ｐＨ７。５） 、１ ０ｍＭ ＭｇＣＩ！．ｘ
、５ｍＭジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）
、１ｍＭ ＡＴＰ％Ｏ．Ｌ＋ｎＭスペルミジン、０．
１ｍＭＥＤＴＡ３３０ｄずつに溶解し、Ｔ４ボリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造社製）３単位を加え、３７℃、
４０分間リン酸化反応を行った後、６５℃で１５分間加
熱して酵素を失活させた。この反応液を４−ずつ混合し
、上記で得たＤＮＡ７ ０．０８ρｍｏｌｅを加え、
Ｔ４リガーゼ反応用緩衝液〔２８ｌＴＩＭトリスー１４
Ｃｊ！（ｐＨ７．５）、９ ｍＭ Ｍ ｇ Ｃ １
！、１ ０ｄ ＤＴＴ，０．０ ３ｍＭ ＥＤＴＡ
，０．７ｄＡＴＰ％０．０３ｍＭスペルミシン〕の組或
になるよう調整し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社ＶＳ
＞１７５単位を加え、３０〃とした。４℃で１６時間結
合反応を行った。
この反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株〔ボリバー（Ｂ
ａｔ ｉｖａｒ）ら；ジーン（Ｇｅｎｅ）、２ ． ７
５（１９７７） ）ヲＣａｈｅｎ ラの方法〔エス・エ
ヌ・コーエン（Ｓ． Ｎ，Ｃｏｈｅｎ）ら；プロシーデ
ィング・オブ・ず・ナショナル・アカデミイ・才ブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ Ｉ．＾ｃａｄ， Ｓｃｉ
， ＞＋ロＳＡ， ６９ ． ２１１０ （１９７
２）］により形質転換し、アンビシリン耐性（Ａｐ’
）のコロニを得た。このコロニーよりアルカリ処理法〔
マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら楊：モレキュラー
・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、９． ３６Ｂ． コールド・スプリングハーバー
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）社刊〕によ
ってプラスミドＤＮＡを回収し、ｐＭＭＴＦＷｌを得た
。ｐＭＭＴＦＷｌの構込は、Ｂｇｊ２■、Ｐｓ ｔ Ｉ
，Ｈｉ ｎｄ［，Ｓａｃ Ｉ、ＢａｍＨＩ、Ｓ ｐ．
ｈ ｆで切断してアガロースゲル電気泳動により確認し
た。制限酵素の切断反応はｌＯｍＭ｝！Ｊス−ＨＣＩ
（ｐＨ７．５） 、？ｍＭ ＭｇＣＡ２，６ｄ２−メ
ルカプトエタノールの組筬の溶液に各酵素の至適濃度に
なるよう（０〜２００ｍＭ）ＮａＣｉ！を加えて反応液
（制限酵素用反応液、以下ＮａＣＲの濃度だけを示す。
ａｔ ｉｖａｒ）ら；ジーン（Ｇｅｎｅ）、２ ． ７
５（１９７７） ）ヲＣａｈｅｎ ラの方法〔エス・エ
ヌ・コーエン（Ｓ． Ｎ，Ｃｏｈｅｎ）ら；プロシーデ
ィング・オブ・ず・ナショナル・アカデミイ・才ブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ Ｉ．＾ｃａｄ， Ｓｃｉ
， ＞＋ロＳＡ， ６９ ． ２１１０ （１９７
２）］により形質転換し、アンビシリン耐性（Ａｐ’
）のコロニを得た。このコロニーよりアルカリ処理法〔
マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら楊：モレキュラー
・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、９． ３６Ｂ． コールド・スプリングハーバー
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）社刊〕によ
ってプラスミドＤＮＡを回収し、ｐＭＭＴＦＷｌを得た
。ｐＭＭＴＦＷｌの構込は、Ｂｇｊ２■、Ｐｓ ｔ Ｉ
，Ｈｉ ｎｄ［，Ｓａｃ Ｉ、ＢａｍＨＩ、Ｓ ｐ．
ｈ ｆで切断してアガロースゲル電気泳動により確認し
た。制限酵素の切断反応はｌＯｍＭ｝！Ｊス−ＨＣＩ
（ｐＨ７．５） 、？ｍＭ ＭｇＣＡ２，６ｄ２−メ
ルカプトエタノールの組筬の溶液に各酵素の至適濃度に
なるよう（０〜２００ｍＭ）ＮａＣｉ！を加えて反応液
（制限酵素用反応液、以下ＮａＣＲの濃度だけを示す。
）とした。
ｐＭＭＴＦＷ１を含む大腸菌菌株はεｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐ關ＴＦＩＩＩＩ Ｆ！ｉ
ＲＭ ＯＰ−２３８３としてブダペスト条約の条件で工
業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に平或元年４
月ｌ２日付で寄託してある。
ｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐ關ＴＦＩＩＩＩ Ｆ！ｉ
ＲＭ ＯＰ−２３８３としてブダペスト条約の条件で工
業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に平或元年４
月ｌ２日付で寄託してある。
実施例３ ブラスミドｐＭＭＴＦＷ４の作製実施例２で
得たブラスミドｐＭＭＴＦＷ１の２塊を実施例２に示し
た制限酵素用反応液（１５０ｍＭ ＮａＣｊ’＞３０
ｍｌご溶解し、Ｓａｉ！Ｉ （宝酒造社製）８単位を
加え３７℃で２時間消化反応を行った。次にこの反応液
にｄＡＴＰ％ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ＴＴＰをそれぞれ３
ｎｍｏｌｅ ％Ｋｌｅｎｏｗ断片（宝酒造社製）３単
位を加え、ｌ６℃で９０分間反応を行った。反応終了後
、６５℃で２０分間加熱し丁酵素を失活させた。５；の
反応液に、ＢａｍＨＩ （宝酒造社製）８１１１位を
加え３７℃で２時間消化反応を行った。この反応液をア
ガロースゲル電気泳動にかけ、約２． ９ ｋｂのＤＮ
Ａ９を含むゲル片を切り出し、実施例２に示した方法に
よりＤＮＡ９を回収した．，ｐＭＭＴＦＷ１の４ｊｊｇ
を制限酵素用反応液（１ ０ ０ｄ ＮａＣｊ！＞
３ ０ｉｄｌに溶解し、Ｂｇβ■（室酒造社製）８単位
を加え３７℃で２時間消化反応を行った。次にこの反応
液にｄＡＴＰ％ｄＣＴＰ．％ｄＧＴＰ，ＴＴＰをそれぞ
れ３ ｎｍｏｌｅ ．．Ｋｌｅｎｏ一断片３単位を加え
、！６℃で９０分間反応を行った。反応終了後、６５℃
で２０分間加熱して酵素を失活させた。この反応液に、
ＢａｍＨ［の８単位を加え３７℃で２時間消化反応を行
った。この反応液をアガロースゲル電気泳勅にかけ、約
０． ２ ５ ｂｂのＤＮＡ １ ０を含むゲル片を切
り出し、ＤＮＡ Ｉ Ｏを回収した。
得たブラスミドｐＭＭＴＦＷ１の２塊を実施例２に示し
た制限酵素用反応液（１５０ｍＭ ＮａＣｊ’＞３０
ｍｌご溶解し、Ｓａｉ！Ｉ （宝酒造社製）８単位を
加え３７℃で２時間消化反応を行った。次にこの反応液
にｄＡＴＰ％ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ＴＴＰをそれぞれ３
ｎｍｏｌｅ ％Ｋｌｅｎｏｗ断片（宝酒造社製）３単
位を加え、ｌ６℃で９０分間反応を行った。反応終了後
、６５℃で２０分間加熱し丁酵素を失活させた。５；の
反応液に、ＢａｍＨＩ （宝酒造社製）８１１１位を
加え３７℃で２時間消化反応を行った。この反応液をア
ガロースゲル電気泳動にかけ、約２． ９ ｋｂのＤＮ
Ａ９を含むゲル片を切り出し、実施例２に示した方法に
よりＤＮＡ９を回収した．，ｐＭＭＴＦＷ１の４ｊｊｇ
を制限酵素用反応液（１ ０ ０ｄ ＮａＣｊ！＞
３ ０ｉｄｌに溶解し、Ｂｇβ■（室酒造社製）８単位
を加え３７℃で２時間消化反応を行った。次にこの反応
液にｄＡＴＰ％ｄＣＴＰ．％ｄＧＴＰ，ＴＴＰをそれぞ
れ３ ｎｍｏｌｅ ．．Ｋｌｅｎｏ一断片３単位を加え
、！６℃で９０分間反応を行った。反応終了後、６５℃
で２０分間加熱して酵素を失活させた。この反応液に、
ＢａｍＨ［の８単位を加え３７℃で２時間消化反応を行
った。この反応液をアガロースゲル電気泳勅にかけ、約
０． ２ ５ ｂｂのＤＮＡ １ ０を含むゲル片を切
り出し、ＤＮＡ Ｉ Ｏを回収した。
ＤＮＡ９のＯ．ｌμｇとＤＮＡＩＯの０．２犀を混合し
、実施例２に示したＴ ４ ＤＮＡ ！ｌガーゼ用反応
液の組或になるように調整し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７
５単位を加え３０ノψとした１３４℃で１６時間結合反
応を行い、得られた反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株
を形質転換した。得られたＡｐ’のコロニーより、実施
例２に示したアルカリ処理法によってブラスミドＤＮＡ
を回収し、ｐＭＭＴＦＷ４を得た。ｐＭＭＴＦＷ４の構
造は、制限酵素用反応液（１００ｄ ＮａＣｊ！）を
用いてＢｇｎ■、Ｈ ｉ ｎｄｌｌｌ、ＢａｍＨＩで切
断ずることにより確認した。
、実施例２に示したＴ ４ ＤＮＡ ！ｌガーゼ用反応
液の組或になるように調整し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１７
５単位を加え３０ノψとした１３４℃で１６時間結合反
応を行い、得られた反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１株
を形質転換した。得られたＡｐ’のコロニーより、実施
例２に示したアルカリ処理法によってブラスミドＤＮＡ
を回収し、ｐＭＭＴＦＷ４を得た。ｐＭＭＴＦＷ４の構
造は、制限酵素用反応液（１００ｄ ＮａＣｊ！）を
用いてＢｇｎ■、Ｈ ｉ ｎｄｌｌｌ、ＢａｍＨＩで切
断ずることにより確認した。
ｐＭＭＴＦＶｌ／４を含む大腸閑閑株はＢｓｃｈｅｒ
ｉｃｈ ｉａｃｏｌｉｌｌ旧０１／ｐＭＭＴＩＪ４ Ｆ
Ｆ！ＲＭ ＢＰ−２４６０としてブダペスト条約の条件
で微工研に平或元年６月１２日付で寄託してある。
ｉｃｈ ｉａｃｏｌｉｌｌ旧０１／ｐＭＭＴＩＪ４ Ｆ
Ｆ！ＲＭ ＢＰ−２４６０としてブダペスト条約の条件
で微工研に平或元年６月１２日付で寄託してある。
実施例４ ブラスミドｐ Ｍ Ｍ Ｔ Ｆ Ｗ ５の作
製実施例２で得られたブラスミドｐＭＭＴＦＷ１の２Ａ
ｇを実施例２に示した制限酵素用反応液（ｌ００ｍＭ
ＮａＣｌ＞ ３０−に溶解し、Ａｓｐ７１８（ベーリ
ンガー・マンハイム社製） ８単位を加え３７℃で２時
間消化反応を行った。次にこの反応液にｄＡＴＰ，ｄＣ
ＴＰＳｄＧＴＰ，ＴＴＰをそれぞれ３ ｎｍｏｌｅ ，
κｌｅｎｏｗ断片《宝酒造社製）３単位を加え、１６℃
で２時開反応を行った。反応終了後、６５℃で２０分間
加熱して酵素を失活させた。この反応液に、ＢａｒｎＨ
Ｉ（宝酒造社製）８単位を加え３７℃で２時間消化反応
を行った。この反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ
、約２． ８ ｋｂのＤＮＡ．１２を含むゲル片を切り
出ｊ，、実施例２と同様の方法を用いてＤＮＡ１２を回
収した，ｐＭＭＴＦＷ１の４雌を制限酵素用反応液（１
０ ０ｍＭ ＮａＣｎ） ３ ０１）に溶解し、
ＢｇＲ■（宝酒造社製）８単位を加え３７℃で２時間消
化反応を行った。次にこの反応液にｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ
，ｄＧＴＰ，ＴＴＰをそれぞれ３ ｎｍｏｌｅ ，Ｋｌ
ｅｎｏｗ断片３単位を加え、１６℃で２時間反応を行っ
た。反応終了後、６５℃で２０分間加熱１，て酵素を失
活させた。この反応液に、［３ａｍＨ［の８単位を加え
３７℃で２時間消化反応を行った，，この反応液をアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、約０． ２ ５ ｋｂのＤ
ＮＡ１３を含むゲル片を切り出ｊ一、ＤＮＡ１ ３を回
収した。ＤＮＡ１２の０、１ ｔｔｇとＤＮＡ１３の０
．２鴻を混合し、実施例２に示したＴ ４ ＤＮＡ ！
Ｊガーゼ用反応液の組成になるように調整し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ１７５単位を加え３０〃とじた。４℃で１６
時間結合反応を行い、得られた反応液を用いて大腸閑Ｈ
Ｂ１０１株を形質転換した。得られたＡｐ１のコロニー
より、実施例２に示したアルカリ処理法によってブラス
ミドＤＮＡを回収し、ｐＭＭＴＦＷ５を得た。
製実施例２で得られたブラスミドｐＭＭＴＦＷ１の２Ａ
ｇを実施例２に示した制限酵素用反応液（ｌ００ｍＭ
ＮａＣｌ＞ ３０−に溶解し、Ａｓｐ７１８（ベーリ
ンガー・マンハイム社製） ８単位を加え３７℃で２時
間消化反応を行った。次にこの反応液にｄＡＴＰ，ｄＣ
ＴＰＳｄＧＴＰ，ＴＴＰをそれぞれ３ ｎｍｏｌｅ ，
κｌｅｎｏｗ断片《宝酒造社製）３単位を加え、１６℃
で２時開反応を行った。反応終了後、６５℃で２０分間
加熱して酵素を失活させた。この反応液に、ＢａｒｎＨ
Ｉ（宝酒造社製）８単位を加え３７℃で２時間消化反応
を行った。この反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ
、約２． ８ ｋｂのＤＮＡ．１２を含むゲル片を切り
出ｊ，、実施例２と同様の方法を用いてＤＮＡ１２を回
収した，ｐＭＭＴＦＷ１の４雌を制限酵素用反応液（１
０ ０ｍＭ ＮａＣｎ） ３ ０１）に溶解し、
ＢｇＲ■（宝酒造社製）８単位を加え３７℃で２時間消
化反応を行った。次にこの反応液にｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ
，ｄＧＴＰ，ＴＴＰをそれぞれ３ ｎｍｏｌｅ ，Ｋｌ
ｅｎｏｗ断片３単位を加え、１６℃で２時間反応を行っ
た。反応終了後、６５℃で２０分間加熱１，て酵素を失
活させた。この反応液に、［３ａｍＨ［の８単位を加え
３７℃で２時間消化反応を行った，，この反応液をアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、約０． ２ ５ ｋｂのＤ
ＮＡ１３を含むゲル片を切り出ｊ一、ＤＮＡ１ ３を回
収した。ＤＮＡ１２の０、１ ｔｔｇとＤＮＡ１３の０
．２鴻を混合し、実施例２に示したＴ ４ ＤＮＡ ！
Ｊガーゼ用反応液の組成になるように調整し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ１７５単位を加え３０〃とじた。４℃で１６
時間結合反応を行い、得られた反応液を用いて大腸閑Ｈ
Ｂ１０１株を形質転換した。得られたＡｐ１のコロニー
より、実施例２に示したアルカリ処理法によってブラス
ミドＤＮＡを回収し、ｐＭＭＴＦＷ５を得た。
ｐＭＭＴＦＷ５の構造は、制限酵素用反応液（ＩＯＯＴ
ＩＩＭ ＮａＣｊ！）を用いてＨ ｉ ｎｄｌＩＩ、
ＢａｍＨ［で切断することにより確認した。
ＩＩＭ ＮａＣｊ！）を用いてＨ ｉ ｎｄｌＩＩ、
ＢａｍＨ［で切断することにより確認した。
ｒ＋ＭＭＴＦＷ５を含む大腸閑閑株はＢｓｃｈｅｒｉｃ
ｂｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１ ／ｐＭＭＴＦ１１５ Ｆ
ＯＲＭ Ｏｒ’−２４６１としてブダペスト条約の条件
で微工研に平或元年６月１２日付で寄託してある。
ｂｉａｃｏｌｉ ＨＢ１０１ ／ｐＭＭＴＦ１１５ Ｆ
ＯＲＭ Ｏｒ’−２４６１としてブダペスト条約の条件
で微工研に平或元年６月１２日付で寄託してある。
実施例５ ブラスミドｒｙＭＭＴＦＷ６の作製実施例２
で得たブラスミドｐＭＭＴＦＷｌの２鳩を実施例２に示
した制限酵素用反応液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ！）３
０ｍに溶解し、Ｓａｉｌ（宝酒造社製》８単位を加え３
７℃で２時間消化反応を行った。次にこの反応液にｄＡ
ＴＰ％ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ％ＴＴＰをそれぞれ３ ｎｍ
ｏｌｅ ％ＨｅｎｏｉＬＩ断片（室酒造社製）３４１位
を加え、１６℃Ｔ！９０分間反応を行った。反応終了後
、６５℃で２０分間加熱１，て酵素を失活さぜた。この
反応液に、ＢａｍＨＩ （宝酒造社製）８単位を加え
３７℃で２時間消化反応を行った。この反応液をアガロ
ースゲル電気泳動にかけ、約２． ９ ｋｂのＤＮＡ１
５を含むゲル片を切り出し、実施例２と同様の方法を用
いてＤＮＡ１５を回収した。ｐＭＭＴＦＷ１の４■を制
限酵素用反応液（１００浦 ＮａＣ１）３０ｄに溶解ｌ
２、Ｂｇｆ！［（宝酒造社製）８単位を加え３７℃で２
時間消化反応を行った。次にこの反応液に、κＩｅｎｏ
ｉｖ断片３単位を加え、１６℃で９０−分間反応を行っ
た。反応終了後、６５℃で２０分間加熱して酵素を失活
させた。この反応液に、ＢａｍＨＩの８単位を加え３７
℃で２時間消化反応を行った。この反応液をアガロース
ゲル電気泳動にかけ、約０． ２ ｋｂのＤＮＡｌ ６
を含むゲル片を切り出し、ＤＮＡ １ ６を同収した。
で得たブラスミドｐＭＭＴＦＷｌの２鳩を実施例２に示
した制限酵素用反応液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ！）３
０ｍに溶解し、Ｓａｉｌ（宝酒造社製》８単位を加え３
７℃で２時間消化反応を行った。次にこの反応液にｄＡ
ＴＰ％ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ％ＴＴＰをそれぞれ３ ｎｍ
ｏｌｅ ％ＨｅｎｏｉＬＩ断片（室酒造社製）３４１位
を加え、１６℃Ｔ！９０分間反応を行った。反応終了後
、６５℃で２０分間加熱１，て酵素を失活さぜた。この
反応液に、ＢａｍＨＩ （宝酒造社製）８単位を加え
３７℃で２時間消化反応を行った。この反応液をアガロ
ースゲル電気泳動にかけ、約２． ９ ｋｂのＤＮＡ１
５を含むゲル片を切り出し、実施例２と同様の方法を用
いてＤＮＡ１５を回収した。ｐＭＭＴＦＷ１の４■を制
限酵素用反応液（１００浦 ＮａＣ１）３０ｄに溶解ｌ
２、Ｂｇｆ！［（宝酒造社製）８単位を加え３７℃で２
時間消化反応を行った。次にこの反応液に、κＩｅｎｏ
ｉｖ断片３単位を加え、１６℃で９０−分間反応を行っ
た。反応終了後、６５℃で２０分間加熱して酵素を失活
させた。この反応液に、ＢａｍＨＩの８単位を加え３７
℃で２時間消化反応を行った。この反応液をアガロース
ゲル電気泳動にかけ、約０． ２ ｋｂのＤＮＡｌ ６
を含むゲル片を切り出し、ＤＮＡ １ ６を同収した。
Ｄ Ｎ Ａ １５の０．１■とＤＮＡ１６の０．２ａを
混合し、実施例２に示したＴ４ＤＮＡリガーゼ用反応液
の組成になるように調整し、Ｔ ４ ＤＮＡ ！Ｊガー
ゼ２単位を加え３０μβとｊ７た。４℃で１６時間結合
反応を行い、得られた反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１
株を形質転換した。得られたΔｒｖ’のコロニーより、
実施例２に示Ｌ，たアルカリ処理法によってブラスミド
ＤＮＡを回収し、ｒｉＭＭＴＦＷ６を得た。
混合し、実施例２に示したＴ４ＤＮＡリガーゼ用反応液
の組成になるように調整し、Ｔ ４ ＤＮＡ ！Ｊガー
ゼ２単位を加え３０μβとｊ７た。４℃で１６時間結合
反応を行い、得られた反応液を用いて大腸菌ＨＢ１０１
株を形質転換した。得られたΔｒｖ’のコロニーより、
実施例２に示Ｌ，たアルカリ処理法によってブラスミド
ＤＮＡを回収し、ｒｉＭＭＴＦＷ６を得た。
ｐＭＭＴＦＷ６の構造は、制限酵素用反応液（１００ｍ
Ｍ ＮａＣｉ？）を用いてＨｉｎｄｌｌＩ、ＢａｍＨ
Ｉ’？？切断することにより確認した。
Ｍ ＮａＣｉ？）を用いてＨｉｎｄｌｌＩ、ＢａｍＨ
Ｉ’？？切断することにより確認した。
ｐＭＭＴＦＷ６を含む大腸菌菌株はＢｓｃｈｅｒ ｉｃ
ｈ ｉ ａｃｏｌｉ Ｈロ１０１ ／ｐＭＭＴＦｌ１６
ＦＥＲＭ ＯＰ−２４６２としてブダペスト条約の条
件で微工研に平成元年６月１２８付で寄託してある。
ｈ ｉ ａｃｏｌｉ Ｈロ１０１ ／ｐＭＭＴＦｌ１６
ＦＥＲＭ ＯＰ−２４６２としてブダペスト条約の条
件で微工研に平成元年６月１２８付で寄託してある。
実施例６ ブラスミドｐＭＭＴＦＷ１を導入した大腸菌
による蚤白質８の生産 実施例２で得られたｐＭＭＴＦＷＩを用いて実施例２に
示した方法下大腸閑ＭＭ２９４株（ＦＥ關ＢＰ−５２６
）を形質転換した。得られたＡｐｒのコロニーを８ｒ！
ｔｌのＬＧ培地（ｌ％バタトトリブトン、０．５％酵母
エキス、０．５％ＮａＣｌ Ｏ．１％グルコース、５
０■／ｄアンビシリン、ｐ Ｈ ７． ４ ）に接種し
、３０℃、１６時間培養した。この培養液２００〃を１
０ｍｌのＭＣＧ培地《Ｏｏ６％ＮａＪＰＯｓ、０．３％
κＨ．ＰＯ．、０．０５％Ｎａ（１！，０．１％Ｎｌｌ
．Ｃｊ！、０．５％グルコース、０．５％カザミノ酸、
ｌｄ ＭｇＳＯ＜、０． Ｉ．ｍＭ ＣａＣＩｌ ａ
， ４ ｕｇ／−ビタミンロ，、ｐｌｌ７． ４）に５
０ｑ／ｍのアンビシリンを添加した培地に接種し、３０
℃、２４時間培養した。培養液を７． ００Ｏｒｐｍで
５分間逮心分離して菌体を集め、この菌体をレムリ（Ｌ
ａｅｍｌｉ）のサンプルバッファーに溶解し、加熱後、
レムリの方法に従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳勤を行い、クマシーブリリアントブルーを用いて
染色した結果、分子量約２１．０００の部位にボＩＪベ
ブチドバンドを検出した（第５図Ａ参照）。ｐＭＭＴＦ
Ｗｌを含まない大腸菌ＭＭ２９４株には相当するバンド
は存在らなかった。このことはｐＭＭＴＦＷＩを保有す
る大腸菌ＭＭ２９４株が蛍白質８を生産していることを
示している。
による蚤白質８の生産 実施例２で得られたｐＭＭＴＦＷＩを用いて実施例２に
示した方法下大腸閑ＭＭ２９４株（ＦＥ關ＢＰ−５２６
）を形質転換した。得られたＡｐｒのコロニーを８ｒ！
ｔｌのＬＧ培地（ｌ％バタトトリブトン、０．５％酵母
エキス、０．５％ＮａＣｌ Ｏ．１％グルコース、５
０■／ｄアンビシリン、ｐ Ｈ ７． ４ ）に接種し
、３０℃、１６時間培養した。この培養液２００〃を１
０ｍｌのＭＣＧ培地《Ｏｏ６％ＮａＪＰＯｓ、０．３％
κＨ．ＰＯ．、０．０５％Ｎａ（１！，０．１％Ｎｌｌ
．Ｃｊ！、０．５％グルコース、０．５％カザミノ酸、
ｌｄ ＭｇＳＯ＜、０． Ｉ．ｍＭ ＣａＣＩｌ ａ
， ４ ｕｇ／−ビタミンロ，、ｐｌｌ７． ４）に５
０ｑ／ｍのアンビシリンを添加した培地に接種し、３０
℃、２４時間培養した。培養液を７． ００Ｏｒｐｍで
５分間逮心分離して菌体を集め、この菌体をレムリ（Ｌ
ａｅｍｌｉ）のサンプルバッファーに溶解し、加熱後、
レムリの方法に従ってＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳勤を行い、クマシーブリリアントブルーを用いて
染色した結果、分子量約２１．０００の部位にボＩＪベ
ブチドバンドを検出した（第５図Ａ参照）。ｐＭＭＴＦ
Ｗｌを含まない大腸菌ＭＭ２９４株には相当するバンド
は存在らなかった。このことはｐＭＭＴＦＷＩを保有す
る大腸菌ＭＭ２９４株が蛍白質８を生産していることを
示している。
実施例７ プラスミドｐＭＭＴＦＷ４を導入した大腸菌
による蛋由質１１の生産 実施例３で得られたｐＭＭＴＰＷ４を用いて実施例２に
示した方法で大腸菌ＭＭ２９４株（ＦＢＲＭ１１Ｐ−５
２６）を形質転換した。得られたＡｐ゛のコロニーを実
施例６色同様にＬＧ培地に接種し、３０℃、■６時間培
養した。この培養液２００〃を１０−のＭＣＧｊｌ！地
に５０，＋４／ｍＦのアンビシリンを添加した培地に接
種し、３０℃、２４時間培養した。培養液を７． ００
０ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を集め、この菌体を
レムリのサンプルバッファーに溶解し、加熱後、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳勤を行い、クマシーブ
リリアントブルーを用いて染色した結果、分子量約１６
， ０００の部位にポリペプチドバンドを検出した（第
５図Ｂ参照）。ｒｉＭＭＴＦＷ４を含まない大腸菌ＭＭ
２９４株には相当するバンドは存在しなかった。このこ
とは、ｐＭＭＴＦＷ４を保有する大腸菌Ｍ Ｍ ２９４
株が黒白質１１を生産していることを示［７てｔｌ′１
る。
による蛋由質１１の生産 実施例３で得られたｐＭＭＴＰＷ４を用いて実施例２に
示した方法で大腸菌ＭＭ２９４株（ＦＢＲＭ１１Ｐ−５
２６）を形質転換した。得られたＡｐ゛のコロニーを実
施例６色同様にＬＧ培地に接種し、３０℃、■６時間培
養した。この培養液２００〃を１０−のＭＣＧｊｌ！地
に５０，＋４／ｍＦのアンビシリンを添加した培地に接
種し、３０℃、２４時間培養した。培養液を７． ００
０ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を集め、この菌体を
レムリのサンプルバッファーに溶解し、加熱後、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳勤を行い、クマシーブ
リリアントブルーを用いて染色した結果、分子量約１６
， ０００の部位にポリペプチドバンドを検出した（第
５図Ｂ参照）。ｒｉＭＭＴＦＷ４を含まない大腸菌ＭＭ
２９４株には相当するバンドは存在しなかった。このこ
とは、ｐＭＭＴＦＷ４を保有する大腸菌Ｍ Ｍ ２９４
株が黒白質１１を生産していることを示［７てｔｌ′１
る。
実施例８ ブラスミドｐＭＭＴＦＷ５を導入した大腸菌
による蛍白質１４の生産 実施例４で得られたｐＭＭＴＦＷ５を用いて実施例２に
示しｔ；方法で大腸菌Ｃ６００株（ＡＴＣＣ２３７２４
）を形質転換した。得られたＡｐ’のコロニーを実施例
６と同様！．’： Ｌ Ｇ培地に接種東、３０℃、１６
時間培養した。この培養液２００μｐをｌＯ−のＭＣＧ
培地に５０４／−のアンビシリンを添加した培地に接種
し、３０や、２４時間培養１，，た。
による蛍白質１４の生産 実施例４で得られたｐＭＭＴＦＷ５を用いて実施例２に
示しｔ；方法で大腸菌Ｃ６００株（ＡＴＣＣ２３７２４
）を形質転換した。得られたＡｐ’のコロニーを実施例
６と同様！．’： Ｌ Ｇ培地に接種東、３０℃、１６
時間培養した。この培養液２００μｐをｌＯ−のＭＣＧ
培地に５０４／−のアンビシリンを添加した培地に接種
し、３０や、２４時間培養１，，た。
培養液を７． ００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離し″Ｃ菌
体を集め、この閑体を１ノムリのサンプルバッフＴ一に
溶解し、加熱後、Ｓ ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳勅を行し１、クマシーブリリ゛ｒントブルーを用い
τ染免｛７た結果、分子量約１３， ０００の部位にポ
リペプチドバンドを検出ｊ２た（第５図Ｃ参照）。
体を集め、この閑体を１ノムリのサンプルバッフＴ一に
溶解し、加熱後、Ｓ ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳勅を行し１、クマシーブリリ゛ｒントブルーを用い
τ染免｛７た結果、分子量約１３， ０００の部位にポ
リペプチドバンドを検出ｊ２た（第５図Ｃ参照）。
ｐＭ Ｍ Ｔ Ｆ Ｗ ５を含まない大腸菌Ｃ６００株
には相当するバンドは存在しなかった。このことはｐＭ
ＭＴＦＷ５を保有ずゐ大腸閑Ｃ６００株が景白質ｌ４を
生産していることを示している。
には相当するバンドは存在しなかった。このことはｐＭ
ＭＴＦＷ５を保有ずゐ大腸閑Ｃ６００株が景白質ｌ４を
生産していることを示している。
実施例９ ブラス≦ドｐ．ＭＭＴＦＷ６を導入した大腸
閑による蛋白質ｌ７の生産 実施例５で得られたｐ Ｍ Ｍ Ｔ Ｆ Ｗ ６を用い
て実施例２に示した方法で大腸菌ＫＹｌ４２６株を形質
転換した。大腸閑ＫＹｌ４２６株はＢｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｎｌｉＫＹ１４２６ ＦＯＲＭ ＦＩＰ−２４
６３としてブダペスト条約の条件で微』二研に平成元年
６月１２８付で寄託してある。
閑による蛋白質ｌ７の生産 実施例５で得られたｐ Ｍ Ｍ Ｔ Ｆ Ｗ ６を用い
て実施例２に示した方法で大腸菌ＫＹｌ４２６株を形質
転換した。大腸閑ＫＹｌ４２６株はＢｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｎｌｉＫＹ１４２６ ＦＯＲＭ ＦＩＰ−２４
６３としてブダペスト条約の条件で微』二研に平成元年
６月１２８付で寄託してある。
得られたＡｐｒのコロニーを実施例６と同様にＬＧ培地
に接種し、３０℃、１６時間培養した。この培養液２０
０Ｍをｌロ−のＭＣＧ培地１ご５０ｌ場／一のアンビシ
リンを添加した培地に接種し、３０℃、２４時間培養し
た。培養液を７． ００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離（７
て菌体を集め、この菌体をレムリのサンプルバッファー
に溶解し、加熱後、同法に従ってＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブル
ーを用いて染色した結果、分子量約１４． ０００の部
位にポリペプチドバンドを検出（７た《第５図１照）。
に接種し、３０℃、１６時間培養した。この培養液２０
０Ｍをｌロ−のＭＣＧ培地１ご５０ｌ場／一のアンビシ
リンを添加した培地に接種し、３０℃、２４時間培養し
た。培養液を７． ００Ｏｒｐｍで５分間遠心分離（７
て菌体を集め、この菌体をレムリのサンプルバッファー
に溶解し、加熱後、同法に従ってＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブル
ーを用いて染色した結果、分子量約１４． ０００の部
位にポリペプチドバンドを検出（７た《第５図１照）。
ｐＭＭＴＦＷ６を含まない大脇菌ＫＹｌ４２６株には相
当するバンドは存在しなかった。このことはｐＭＭＴＦ
Ｗ６を保有する犬腸菌ＫＹ１４２６株が砥由質ｌ７を生
産している５：．とを示している。
当するバンドは存在しなかった。このことはｐＭＭＴＦ
Ｗ６を保有する犬腸菌ＫＹ１４２６株が砥由質ｌ７を生
産している５：．とを示している。
実施例１０ ブラスミドｐＭＭＴＦＷ１を導入した大腸
菌による蛍白質８の生産と単離 実施例６と同様の方法でｐＭＭＴＦＷＩを用いて大腸菌
ＭＭ２９４株（Ｆｉｌ！ＲＭ ［ｌＰ−５２６）を形質
転換した。得られたＡ ｐ ｒのコロニーを実施例６と
同様の方法でＬＧ培地に接種し、３０℃、１６時間培養
した。この培ＩＩ液３２−をｌ．６１のＭＣＧ培地に５
０ｑ／ｍのアンビシリンを添加した培地に接種し、３０
℃、２４時間培養した。培養液を７． ００Ｏｒｐｍで
５分間遠心分離して菌体を集め、この菌体を食塩を含む
リンＭ緩衝液（０．８％ＮａＣ １、０．２％ＫＣＩＳ
Ｏ，１２％Ｎａ２Ｈｔ’０＠０．０２％Ｋ｝Ｉ２ＰＯ．
）で洗浄した後、同緩衝液２５ＩＩＩ！２に懸濁して超
音波により菌体を破砕した。この菌体破砕液を１０．
００Ｏｒｐｍ、３０分間遠心分離して上清を除き、得ら
れた沈殿をｌ．ＯｍＭ｝リスー塩酸（ｐＨ８＞２５ｍｌ
＋に懸濁し、再度１０． ００Ｏｒρｍで３０分間遠心
分離して洗浄した。
菌による蛍白質８の生産と単離 実施例６と同様の方法でｐＭＭＴＦＷＩを用いて大腸菌
ＭＭ２９４株（Ｆｉｌ！ＲＭ ［ｌＰ−５２６）を形質
転換した。得られたＡ ｐ ｒのコロニーを実施例６と
同様の方法でＬＧ培地に接種し、３０℃、１６時間培養
した。この培ＩＩ液３２−をｌ．６１のＭＣＧ培地に５
０ｑ／ｍのアンビシリンを添加した培地に接種し、３０
℃、２４時間培養した。培養液を７． ００Ｏｒｐｍで
５分間遠心分離して菌体を集め、この菌体を食塩を含む
リンＭ緩衝液（０．８％ＮａＣ １、０．２％ＫＣＩＳ
Ｏ，１２％Ｎａ２Ｈｔ’０＠０．０２％Ｋ｝Ｉ２ＰＯ．
）で洗浄した後、同緩衝液２５ＩＩＩ！２に懸濁して超
音波により菌体を破砕した。この菌体破砕液を１０．
００Ｏｒｐｍ、３０分間遠心分離して上清を除き、得ら
れた沈殿をｌ．ＯｍＭ｝リスー塩酸（ｐＨ８＞２５ｍｌ
＋に懸濁し、再度１０． ００Ｏｒρｍで３０分間遠心
分離して洗浄した。
得られた蛋由質８を含む沈殿の一部をレムリのサンブル
バッフγ一に溶解し、加熱後、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳勤を行い、クマシーブＩＪ ＩＪアント
ブルーを用いて染色し定量した結果、沈殿に含まれる屓
由質８の割合は３５％であった。
バッフγ一に溶解し、加熱後、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳勤を行い、クマシーブＩＪ ＩＪアント
ブルーを用いて染色し定量した結果、沈殿に含まれる屓
由質８の割合は３５％であった。
屓白質８を含む沈殿の一部を０．５Ｍ酢酸に溶解し、Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５ （ファルマシア社製》の
カラムに通塔し、０．５Ｍ酢酸で溶出した。屋白質８を
含む両分を集め凍結乾燥して白色粉末を得た。この粉末
を逆相カラム（ＹＭＣ社製ＹＭＣ−Ｐａｋ ＡＭ−３６
３−ＯＤＳ， ３Ｘ２５ｃｍ）を用いた高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。０．１％のトリ
プルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水および７０％ア七トニ
トリル溶液を用いた直線濃度勾配法で溶出し、景白質８
を含む画分を得た。この両分を凍結乾燥して白色粉末の
蛋白質８を得た。
ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５ （ファルマシア社製》の
カラムに通塔し、０．５Ｍ酢酸で溶出した。屋白質８を
含む両分を集め凍結乾燥して白色粉末を得た。この粉末
を逆相カラム（ＹＭＣ社製ＹＭＣ−Ｐａｋ ＡＭ−３６
３−ＯＤＳ， ３Ｘ２５ｃｍ）を用いた高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。０．１％のトリ
プルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水および７０％ア七トニ
トリル溶液を用いた直線濃度勾配法で溶出し、景白質８
を含む画分を得た。この両分を凍結乾燥して白色粉末の
蛋白質８を得た。
実施例ｌ１ 蛋白質８から［Ｍｅｔ（０）”’］ モチ
リンの製造 蛋白質８を含む沈殿５ ９． ３ ｍｇを酢酸７０６Ｈ
に溶解し、ＤＭＳＯ ５９．３ｄ、濃塩酸３５３ｍｌ
を加え、室温で１時間攪拌した。反応液にＩＯＮＮ ａ
Ｏ Ｈを加えてｐ Ｈを３、５に調整後、臭化シアン
５． ９ ｍｇを加え、さらに１５時間攪拌した。Ｈ
ＰＬＣを用いて、反応［有］進行を追跡した。このＨＰ
Ｉ４Ｃは逆相カラム（ＹＭＣ社製 ＹＭＣ−Ｐａｋ Ａ
Ｕ−３１２０口Ｓ， ０，６ Ｘ１５ｃｍ）を使用し、
０．１％のＴＦΔを含む水および７０％アセトニ｝ Ｉ
Ｊル溶液を用いた直線濃度勿妃法で溶出し、２２０ｎｒ
ｎで検出する方法で行った。第６図ＩＬｌ′Ｈ Ｐ Ｌ
Ｃの結果を示した。
リンの製造 蛋白質８を含む沈殿５ ９． ３ ｍｇを酢酸７０６Ｈ
に溶解し、ＤＭＳＯ ５９．３ｄ、濃塩酸３５３ｍｌ
を加え、室温で１時間攪拌した。反応液にＩＯＮＮ ａ
Ｏ Ｈを加えてｐ Ｈを３、５に調整後、臭化シアン
５． ９ ｍｇを加え、さらに１５時間攪拌した。Ｈ
ＰＬＣを用いて、反応［有］進行を追跡した。このＨＰ
Ｉ４Ｃは逆相カラム（ＹＭＣ社製 ＹＭＣ−Ｐａｋ Ａ
Ｕ−３１２０口Ｓ， ０，６ Ｘ１５ｃｍ）を使用し、
０．１％のＴＦΔを含む水および７０％アセトニ｝ Ｉ
Ｊル溶液を用いた直線濃度勿妃法で溶出し、２２０ｎｒ
ｎで検出する方法で行った。第６図ＩＬｌ′Ｈ Ｐ Ｌ
Ｃの結果を示した。
矢印を付けたピークがＣ Ｍｅｔ （０） ” ：ｌモ
チリンである。この反応混合物を逆相カラム（ＹＭＣ社
製ＹＭＣ−Ｐａｋ ＡＭ−３６３−ＯＤＳ， ３Ｘ２５
ｃｍ）を用いたＨ Ｐ Ｌ Ｃで精製した。０．１％の
ＴＦΔを含む水および７０％ア七ト二トリル溶液を用い
た直線濃度勿配法で溶出し、２２０ｎｍで分析し２て［
Ｍｅｔ （０） ” ：ｌモチリンを含む両分を集め
、この両分を凍結乾燥して白色粉末の［：＆Ｉｅｔ（口
）＋３〕モチリンを得た。
チリンである。この反応混合物を逆相カラム（ＹＭＣ社
製ＹＭＣ−Ｐａｋ ＡＭ−３６３−ＯＤＳ， ３Ｘ２５
ｃｍ）を用いたＨ Ｐ Ｌ Ｃで精製した。０．１％の
ＴＦΔを含む水および７０％ア七ト二トリル溶液を用い
た直線濃度勿配法で溶出し、２２０ｎｍで分析し２て［
Ｍｅｔ （０） ” ：ｌモチリンを含む両分を集め
、この両分を凍結乾燥して白色粉末の［：＆Ｉｅｔ（口
）＋３〕モチリンを得た。
実施例ｌ２ ブラスミドｐ Ｍ Ｍ Ｔ Ｆ Ｗ ４を
導入した大腸菌による（Ｍｅｔ （０） ’″〕モチリ
ンの製造実施例７と同様の方法でｐＭＭＴＦＷ４を用い
て大腸菌ＭＭ２９４株（ＦＢＲＭ １３１’−５２６）
を形質転換し、た。得られたＡｐｒのコロニーを実施例
７と同様の方法でＬＧ培地に接種し、３０℃、１６時間
ｊ＄ｉ養した。この培養液３２−を１、６ｌのＭＣＧ培
地に５０４／＊のアンビシリンを添加した培地に接種し
、３０℃、２４時間培養した。培養液を７． ００Ｏｒ
ｐｍで５分間遠心分離しＴ菌体を集め、この菌体を食塩
を含むリン酸緩衝液《０．８％ＮａＣ ｉ、０．２％Ｋ
ＣＪ，０．１２％ＮａＪＰＯｓ ０．０２％Ｋ１２ＰＯ
６）で洗浄した後、同緩衝液２５−に懸濁して超音波に
より菌体を破砕した。この菌体破砕液を１０． ００Ｏ
ｒｐｍで３０分間遠心分離して上浦を除き、得られた沈
殿を１０ｍＭ｝リスーＨＣｊ２ （ｐＨ８）２５−に懸
濁しτ再度１０． ＯＯＯｒｐｍで３０分間遠心分離し
た。得られた蛍白質８を含む沈殿の一部をレムリのサン
プルバッファーに溶解し、加熱後、ＳＤＳ−ボリ゜γク
リルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアント
ブルーを用いて染色１〜定量１，た結果、沈殿に含まれ
る缶白質１１の割合は２６％であった。この蛍白質１１
を含む沈殿２ ４． ５ ｇに５％Ｔｒｉｔｏｒ＋ Ｘ
−１００。５ｄ ＥＤＴＡを含む水溶液１６０ｍｌを
加え、室温で２時間攪拌した後、１０． ００Ｏｒｐｍ
で遠心分離した。得られた沈殿をアセトン２００−に懸
濁後、２． ５０ＯｒｐｍでＩＯ分間遠心分離し、得ら
れた沈殿を減圧下乾燥して６．２１ｇの乾燥粉末を得た
。
導入した大腸菌による（Ｍｅｔ （０） ’″〕モチリ
ンの製造実施例７と同様の方法でｐＭＭＴＦＷ４を用い
て大腸菌ＭＭ２９４株（ＦＢＲＭ １３１’−５２６）
を形質転換し、た。得られたＡｐｒのコロニーを実施例
７と同様の方法でＬＧ培地に接種し、３０℃、１６時間
ｊ＄ｉ養した。この培養液３２−を１、６ｌのＭＣＧ培
地に５０４／＊のアンビシリンを添加した培地に接種し
、３０℃、２４時間培養した。培養液を７． ００Ｏｒ
ｐｍで５分間遠心分離しＴ菌体を集め、この菌体を食塩
を含むリン酸緩衝液《０．８％ＮａＣ ｉ、０．２％Ｋ
ＣＪ，０．１２％ＮａＪＰＯｓ ０．０２％Ｋ１２ＰＯ
６）で洗浄した後、同緩衝液２５−に懸濁して超音波に
より菌体を破砕した。この菌体破砕液を１０． ００Ｏ
ｒｐｍで３０分間遠心分離して上浦を除き、得られた沈
殿を１０ｍＭ｝リスーＨＣｊ２ （ｐＨ８）２５−に懸
濁しτ再度１０． ＯＯＯｒｐｍで３０分間遠心分離し
た。得られた蛍白質８を含む沈殿の一部をレムリのサン
プルバッファーに溶解し、加熱後、ＳＤＳ−ボリ゜γク
リルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアント
ブルーを用いて染色１〜定量１，た結果、沈殿に含まれ
る缶白質１１の割合は２６％であった。この蛍白質１１
を含む沈殿２ ４． ５ ｇに５％Ｔｒｉｔｏｒ＋ Ｘ
−１００。５ｄ ＥＤＴＡを含む水溶液１６０ｍｌを
加え、室温で２時間攪拌した後、１０． ００Ｏｒｐｍ
で遠心分離した。得られた沈殿をアセトン２００−に懸
濁後、２． ５０ＯｒｐｍでＩＯ分間遠心分離し、得ら
れた沈殿を減圧下乾燥して６．２１ｇの乾燥粉末を得た
。
この蛋白質ｌ１を含む乾燥粉末１ｇを酢酸２０ｍｌに懸
濁し、ＤＭＳＯ ２００−、濃塩酸２００ｄを加え、
室温で１時間攪拌した。反応液に水２０−を加え、さら
にＩＯＮ ＮａＯＨを加えてｒｉ Ｈを３に調整後、
１０． ００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離シ、蛋白質ｌ
１の酸化体を含む沈殿４． ５ ８ ｇを得た。
濁し、ＤＭＳＯ ２００−、濃塩酸２００ｄを加え、
室温で１時間攪拌した。反応液に水２０−を加え、さら
にＩＯＮ ＮａＯＨを加えてｒｉ Ｈを３に調整後、
１０． ００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離シ、蛋白質ｌ
１の酸化体を含む沈殿４． ５ ８ ｇを得た。
この沈殿１５８＋ａｇに水３ｍｌと臭化シアン３Ｑｍｇ
を加え、２Ｍ 酢酸ナ｝ ＩＪウム水溶液を加えてｒ＋
Ｈを２．６に調整後、２４時間攪拌した。実施例ｌｌと
同じ条件のＨＰＬＣを用いて、反応終了をｍ認Ｌ ｆ．
：。この反応混合物を実施例２と同様の方法でＨ Ｐ
Ｌ Ｃを用いて精製したＯ ｌ：Ｍｅｔ（０）１″］
モチリンを含む両分を集め、この画分を凍結乾燥して０
．９２ｍｇの！：Ｍｅｔ（０） １３：Ｉ モチリンを
得た。
を加え、２Ｍ 酢酸ナ｝ ＩＪウム水溶液を加えてｒ＋
Ｈを２．６に調整後、２４時間攪拌した。実施例ｌｌと
同じ条件のＨＰＬＣを用いて、反応終了をｍ認Ｌ ｆ．
：。この反応混合物を実施例２と同様の方法でＨ Ｐ
Ｌ Ｃを用いて精製したＯ ｌ：Ｍｅｔ（０）１″］
モチリンを含む両分を集め、この画分を凍結乾燥して０
．９２ｍｇの！：Ｍｅｔ（０） １３：Ｉ モチリンを
得た。
実施例１ ３ ［Ｍｅｔ（０）”：ｌモチリンのモチ
リンヘの変換 実施例１２で得られた［Ｍｅｔ（０）”：］モヂリン０
。４ｍｇを０．４−のＩＭ 酢酸緩衝液（ｐ［４４．
５）に溶解し、６２■のＤＴＴを加え室温にて７２時間
攪拌した。反応混合液を実施例１１と同じ条件でＨ Ｐ
Ｌ Ｃを用いて分析した結果、［：Ｍｅｔ（０）１″
］モチリンは消失していることおよび、反応生成物のＨ
ＰＬＣの保持時間が標品のモヂリン（ベブチド研究所製
）と一致することから生成物がモチリンであることをｍ
認した（第７図参照）。モヂリンの収率は９５％であっ
た。
リンヘの変換 実施例１２で得られた［Ｍｅｔ（０）”：］モヂリン０
。４ｍｇを０．４−のＩＭ 酢酸緩衝液（ｐ［４４．
５）に溶解し、６２■のＤＴＴを加え室温にて７２時間
攪拌した。反応混合液を実施例１１と同じ条件でＨ Ｐ
Ｌ Ｃを用いて分析した結果、［：Ｍｅｔ（０）１″
］モチリンは消失していることおよび、反応生成物のＨ
ＰＬＣの保持時間が標品のモヂリン（ベブチド研究所製
）と一致することから生成物がモチリンであることをｍ
認した（第７図参照）。モヂリンの収率は９５％であっ
た。
発明の効果
本発明によりモチリンまたはその誘導体とペプチドとが
融合した融合ポリペプチドを得ることができる。該融合
ポリペプチドは、医薬品として有用なモチリン及びその
誘導体の製造に用いられる。
融合した融合ポリペプチドを得ることができる。該融合
ポリペプチドは、医薬品として有用なモチリン及びその
誘導体の製造に用いられる。
２１〜４図はそれぞれブラスミドｐ Ｍ Ｍ Ｔ Ｆ
Ｗ１、ｐ Ｍ Ｍ Ｔ Ｆ Ｗ ４、ｐＭＭＴＦＷ５、
ｐ Ｍ Ｍ ＴＦＷ６の造戊工程を示す。 第５図Ａ， Ｂ， Ｃ． Ｄはそれぞれブラスミドｐ
ＭＭＴＦＷ１．ｐＭＭＴＦＷ４．［’３ＭＭＴＦＷ５．
ｐＭＭＴＦＷ６を導入した大陽閑が生産する融合ポリペ
プチドのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結
果を示す。それぞれの矢印が目的とする融合ポｑベブチ
ドのバンドを示している。 第６図は、蛋白質１１からのＣ Ｍｅｔ （０） ’
”］モチリン生成反応のＨ Ｐ Ｌ Ｃによる分析の結
果を示す。 矢印が［：Ｎｅｔ（ロ〉１〕モチリンを示している。 第７図は、［Ｍｅｔ （０） ” ］モチリンからのモ
チリン生成反応のＨ Ｐ Ｌ Ｃによる分析の結果を示
す。 矢印がモチリンを示している。
Ｗ１、ｐ Ｍ Ｍ Ｔ Ｆ Ｗ ４、ｐＭＭＴＦＷ５、
ｐ Ｍ Ｍ ＴＦＷ６の造戊工程を示す。 第５図Ａ， Ｂ， Ｃ． Ｄはそれぞれブラスミドｐ
ＭＭＴＦＷ１．ｐＭＭＴＦＷ４．［’３ＭＭＴＦＷ５．
ｐＭＭＴＦＷ６を導入した大陽閑が生産する融合ポリペ
プチドのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結
果を示す。それぞれの矢印が目的とする融合ポｑベブチ
ドのバンドを示している。 第６図は、蛋白質１１からのＣ Ｍｅｔ （０） ’
”］モチリン生成反応のＨ Ｐ Ｌ Ｃによる分析の結
果を示す。 矢印が［：Ｎｅｔ（ロ〉１〕モチリンを示している。 第７図は、［Ｍｅｔ （０） ” ］モチリンからのモ
チリン生成反応のＨ Ｐ Ｌ Ｃによる分析の結果を示
す。 矢印がモチリンを示している。
Claims (13)
- （１）モチリンまたはその誘導体と分子量７，０００以
上のペプチドとからなる融合ポリペプチド。 - （２）分子量７，０００以上のペプチドがシロザケ成長
ホルモン、γ−インターフェロンおよびβ−ガラクトシ
ダーゼから選ばれる請求項１記載の融合ポリペプチド。 - （３）モチリン誘導体が、少なくとも１個のメチオニン
を含むものである請求項１記載の融合ポリペプチド。 - （４）モチリン誘導体が〔Ｇｌｎ＾１５〕モチリン、〔
Ｇｌｕ＾１１〕モチリンから選ばれる請求項１記載の融
合ポリペプチド。 - （５）モチリンまたはその誘導体と分子量７，０００以
上のペプチドとがトリプトファン残基を介して結合され
たものである請求項１記載の融合ポリペプチド。 - （６）モチリンまたはその誘導体と分子量７，０００以
上のペプチドとからなる融合ポリペプチドであって、か
つ両者がトリプトファン残基を介して結合されたものを
酸化反応に処し、トリプトファンのカルボキシル基側の
ペプチド結合を切断し、さらに還元反応に処することに
よって反応物中に遊離のモチリンまたはその誘導体を生
成させ、該反応物よりモチリンまたはその誘導体を採取
することを特徴とするモチリンまたはその誘導体の製造
法。 - （７）分子量７，０００以上のペプチドがシロザケ成長
ホルモン、γ−インターフェロンおよびβ−ガラクトシ
ダーゼから選ばれる請求項６記載の製造法。 - （８）モチリン誘導体が少なくとも１個のメチオニンを
含むものである請求項６記載の製造法。 - （９）モチリン誘導体が〔Ｇｌｎ＾１５〕モチリン、〔
Ｇｌｕ＾１１〕モチリンから選ばれる請求項６記載の製
造法。 - （１０）酸化反応が、ジメチルスルホキシド、塩酸およ
び臭化シアンによる請求項６記載の製造法。 - （１１）融合ポリペプチドが該融合ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡとベクターＤＮＡとからなる組換え体プラ
スミドを含む形質転換微生物を培地に培養し、培養物中
に該融合ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該
融合ポリペプチドを採取することにより得られるもので
ある請求項６記載の製造法。 - （１２）ベクターＤＮＡが、ｐＧＥＬ１、ｐＫＹＰ１０
、ｐＧＨＡ２から選ばれる請求項１１記載の製造法。 - （１３）形質転換細胞がＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉＨＢ１０１／ｐＭＭＴＦＷ１（ＦＥＲＭＢＰ−２３８
３）、ＨＢ１０１／ｐＭＭＴＦＷ４（ＦＥＲＭＢＰ−２
４６０）、ＨＢ１０１／ｐＭＭＴＦＷ５（ＦＥＲＭＢＰ
−２４６１）およびＨＢ１０１／ｐＭＭＴＦＷ６（ＦＥ
ＲＭＢＰ−２４６２）から選ばれる請求項１１記載の製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1162020A JPH0327294A (ja) | 1989-06-23 | 1989-06-23 | 融合ポリペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1162020A JPH0327294A (ja) | 1989-06-23 | 1989-06-23 | 融合ポリペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0327294A true JPH0327294A (ja) | 1991-02-05 |
Family
ID=15746537
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1162020A Pending JPH0327294A (ja) | 1989-06-23 | 1989-06-23 | 融合ポリペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0327294A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0480041A1 (en) * | 1990-03-28 | 1992-04-15 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Fused antigen polypeptide |
| CN102492955A (zh) * | 2011-12-16 | 2012-06-13 | 天津市禾厘油气技术有限公司 | 用于不锈钢管线酸洗钝化的装置及方法 |
-
1989
- 1989-06-23 JP JP1162020A patent/JPH0327294A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0480041A1 (en) * | 1990-03-28 | 1992-04-15 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Fused antigen polypeptide |
| CN102492955A (zh) * | 2011-12-16 | 2012-06-13 | 天津市禾厘油气技术有限公司 | 用于不锈钢管线酸洗钝化的装置及方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5344765A (en) | DNA encoding polypeptides with activity against gram-positive and gram-negative bacteria | |
| AT408100B (de) | Pth-analoga | |
| JP2533470B2 (ja) | 豚成長ホルモンを生産するためのｄｎａ配列，組換ｄｎａ分子および生産方法 | |
| JPH01502638A (ja) | グラム陽性及びグラム陰性菌に対する活性を有するポリペプチド類 | |
| JP2862870B2 (ja) | 新規ペプチド | |
| JPH0327294A (ja) | 融合ポリペプチド | |
| EP0136472B1 (de) | Herstellung von Sekretin | |
| JP2549504B2 (ja) | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
| JPH04502260A (ja) | Ｎ―アセチルムラミダーゼ ｍ１ | |
| US5695952A (en) | Method for producing Leu13 !motilin | |
| US6018037A (en) | DNA coding for (Leu13) motilin | |
| JP2887060B2 (ja) | グリセンチンの生産方法 | |
| KR940011339B1 (ko) | 세린프로테아제억제제의 제조를 위한 dna 재조합 방법 | |
| JPS6322190A (ja) | ヒトリゾチ−ムの遺伝子発現による製法 | |
| JP2632680B2 (ja) | ブリ成長ホルモン構造遺伝子増幅プラスミド | |
| JPH057995B2 (ja) | ||
| FI74732B (fi) | Dna-oeverfoeringsvektor, vilken innehaoller en nukleotidsekvens som kodar foer tillvaexthormon. | |
| JPH051800B2 (ja) | ||
| Honda et al. | Method for producing Leu 13! motilin | |
| JPS6222800A (ja) | 魚類の成長ホルモン遺伝子および該遺伝子のコ−ドするポリペプチド | |
| FI68261B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en rekombinations-dna-molekyl vilken har en humant korionsomatomammotropin kodande nukleotidsekvens | |
| JPS63123397A (ja) | 新規ポリペプチド | |
| JPS63291583A (ja) | Ｌ―フェニルアラニン・アンモニアリアーゼ | |
| JPS6287600A (ja) | 魚類のプロラクチンポリペプチド | |
| JPS61275300A (ja) | ポリペプチド、その製法、形質転換微生物、その製法、複製可能なプラスミド表現ベヒクル、その製法、ｄｎａ配列、ポ−タブル表現ユニツト、ポリペプチド含有抗ウイルス剤 |