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Die vorliegende Erfindung betrifft Varianten des Parathormons (PTH), ein Verfahren zu deren Herstellung, pharmazeutische Zusammensetzungen, die sie enthalten, und ihre Verwendung als Pharmazeutikum Verbindungen dieses Typs sind z. B. aus WO 92 11286 bekannt.
Der Ausdruck "PTH", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf jede genetisch kodierte Form eines Parathormons, einschliesslich der reifen 84 Aminosäuren enthaltenden Form einer gegebenen PTH Art eines Vertebraten, beispielsweise Mensch, Schwein, Ratte, Rind, Huhn und Fragmente hiervon, wie auch Analoga und Derivate hiervon mit PTH-ähnlicher Aktivität. Die Position jeder in der PTH Sequenz beteiligten Aminosäure wird gemäss der international anerkannten Weise numeriert. In Übereinstimmung und wie es üblich ist, wird in der folgenden Beschreibung das gleiche Numenerungssystem auf die Aminosäuren der PTH Sequenz unabhängig vom Substitutionsmuster im Molekül angewendet.
Genauer gesagt liefert die vorliegende Erfindung eine PTH Verbindung, die eine PTH-ähnliche Aktivität aufweist, der Formel
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worin R1 Met oder Leu ist, R2 Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr oder Tyr ist; R3 Leu oder Lys ist; R4 Lys oder D- oder L-Ala, -Cys, -Gin, -lle, -Asn,-Trp, -Asp, -Val, -Thr,-Ser, -Tyr,-Met, -Leu ode Gly ist ; R5 Asn, Gin, D-Gln oder D- oder L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala oder -Gly ist ; R6 Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, Ile oder Lys ist; R7 Gin ist ; R8 Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn oder Ile ist, R9 Lys, Gin oder Arg ist; R10 Asn, Thr, D-Thr oder D- oder L-Ser,-Leu, -Gly, -Gin, -Arg, -Pro,-Asp, -Ile oder-Lys ist; vorzugsweise Thr;
R11 Phe oder Ala ist ; vorzugsweise Ala, R12 Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu oder Val-Ala-Leu-Gly ist, n 0 oder 1 ist ;
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und das andere für einen C1-6alkyl steht, vorausgesetzt, dass R7 Gin oder Tyr ist und/oder R10 Thr ist und/oder R11 Ala ist, die Verbindung
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gewählt ist und der an die endständige Aminogruppe der PTH Verbindung gebunden ist, und/oder
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und der an eine oder mehrere Seitenkettenaminogruppen der PTH Verbindung gebunden ist, in freier Form oder in Salzform oder in Komplexform.
Später werden diese Verbindungen als erfindungsgemässe Verbindungen bezeichnet.
"Natürliche Aminosäuren" beziehen sich auf jene, die im Fachgebiet gut bekannt sind. In der U.S.P.T.O Veröffentlichung, Trademark Official Gazette, herausgegeben am 15. Mai 1990, Seiten 33 bis 46 werden sie und die Standardabkürzungen aufgelistet. Diese Aminosäuren und Abkürzungen werden hiermit eingeführt.
Die natürlichen Aminosäuren sind im folgenden angegeben:
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<tb>
<tb> A <SEP> Ala <SEP> Aianin
<tb> D <SEP> Asp <SEP> Asparaginsaure
<tb> E <SEP> Glu <SEP> Glutaminsäure
<tb> F <SEP> Phe <SEP> Phenylalanin
<tb> G <SEP> Gly <SEP> Glycin
<tb> H <SEP> His <SEP> Histidin
<tb>
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<tb>
<tb> I <SEP> Ile <SEP> Isoleucin
<tb> K <SEP> Lys <SEP> Lysin
<tb> L <SEP> Leu <SEP> Leucin
<tb> M <SEP> Met <SEP> Methionin
<tb> N <SEP> Asn <SEP> Asparagin
<tb> Q <SEP> Gin <SEP> Glutamin
<tb> R <SEP> Arg <SEP> Arginin
<tb> S <SEP> Ser <SEP> Serin
<tb> T <SEP> Thr <SEP> Threonin
<tb> V <SEP> Val <SEP> Valin
<tb> W <SEP> Trp <SEP> Tryptophan
<tb> Y <SEP> Tyr <SEP> Tyrosin
<tb>
Mit Aminosäuren in geschutzter Form sind natürliche oder unnatürliche Aminosäuren gemeint, die beispielsweise eine Seitenkette enthalten, die ein Heteroatom, wie 0,
S oder N enthält, das mit einer O-, S- oder N-Schutzgruppe geschützt sein kann. Der N-Terminus der erfindungsgemässen PTH Verbindungen kann ebenfalls in geschützter Form vorliegen.
N-Schutzgruppen, wie sie am N-Terminus oder an Seitenkettenaminogruppen von Aminosäureeinheiten vorkommen können, umfassen solche Gruppen, wie sie beispielsweise in "Protective Groups in Organic Synthesis", T. W. Greene, J. Wiley & Sons NY (1981),219-287 beschrieben sind, beispielsweise Acyl, wie Formyl, Acetyl, Trifluoracetyl, Methoxysuccinyl, Hydroxysuccinyl oder Benzoyl wahlweise am Phenylring mit beispielsweise p-Methoxycarbonyl, p-Methoxy, p-Nitro oder p-Phenylsulfonamidcarbonyl substituiert, Alkoxycarbonyl, wie t-Butyloxycarbonyl, Isobutyloxycarbonyl oder Methoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, Trityl, 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl, Arylmethoxycarbonyl, wie 9-Fluorenylmethoxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl wahlweise am Phenylring mit p-Methoxy, p-Nitro, o- oder p-Chlor, m-Phenyl oder 3,4-Dimethyl substituiert, Arylmethyl,
wie Benzyl wahlweise ringsubstituiert mit p-Methoxy, p-Nitro oder p-Chlor, oder Arylsulfonyl, wie Phenylsulfonyl wahlweise ringsubstituiert mit p-Methyl oder p-Methoxy, oder Naphthylsulfonyl wahl-
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O-Schutzgruppen von O-enthaltenden Seitenketten sind beispielsweise die, wie sie in der obigen Literaturstelle "The Peptides", 3, (1981), E. Gross und J Meienhofer (Herausgeber) beschrieben sind. Für funktionelle aliphatische Hydroxygruppen sind geeignete O-Schutzgruppen die, wie sie beispielsweise in "Protection of the Hydroxy Group", J. M. Stewart, 169-201 beschrieben sind, und beinhalten die Benzyl-, t-Butyl- und Methylgruppen. Für funktionelle aromatische Hydroxygruppen beinhalten geeignete O-Schutzgruppen die Benzyl-, t-Butyl-, Methyl-, Tosyl- und Benzyloxycarbonylgruppen. O-Schutzgruppen für funktionelle Carboxygruppen an Aminosäureseitenketten sind gut bekannte Estergruppen und sind beispielsweise in "The Peptides", 3,101-135 ("Carboxyl Protecting Groups" von R. W. Roeske) beschrieben und beinhalten die Methyl-, Ethyl-, t-Butyl- und Benzylgruppen.
S-Schutzgruppen für funktionelle Thiolgruppen an Aminosäureseitenketten sind gut bekannt und beispielsweise in "The Peptides", 3,137-167 ("Sulfhydryl Group Protection" von R. G. Hiskey) beschrieben. Beispiele beinhalten die Methyl-, t-Butyl-, Benzyl-, p-Methoxyphenylmethyl-, Ethylaminocarbonyl- und Benzyloxycarbonylgruppen.
Gemäss der Erfindung können die PTH Verbindungen an ihren endständigen Aminogruppen zu-
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an eine Seitenkettenaminogruppe gebunden ist, ist es vorzugsweise die e-Ammogruppe einer Lys Einheit. Bevorzugte Substituenten für die Alkyl, Alkenyl, Aralkyl, Aralkenyl oder Cycloalkylgruppe
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zugsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, t-Butyl, für C2AIkenyl sind es C2-4Alke-
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L-a-Aminosäuren, die an den N-Terminus gebunden sind, beinhalten beispielsweise D- oder L- Pro und Ala. Bevorzugte Substituenten, wenn sie vorkommen, sind Alkyl, Alkinyl, Alcoxycarbonyl oder eine an den N-Terminus der PTH Verbindung gebundene D- oder L-a-Aminosäure und/oder zumindest ein Alkyl oder Alkoxycarbonyl, das an eine oder mehrere Seitenkettenaminogruppen gebunden ist.
Bevorzugte erfindungsgemässe PTH Verbindungen sind jene, die ausgewählt sind aus
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worin x' eine Zahl von 34 bis 38 bedeutet, insbesonders 34,36, 37 oder 38, und umfassen z.B PTH Verbindungen die ausgewählt sind aus
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kyl-C1-4alkyl ausgewählt ist und der an die endständige Aminogruppe der PTH Verbindung gebunden ist, und/oder
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und der an eine oder mehrere Seitenkettenaminogruppen der PTH Verbindung gebunden ist, in freier Form oder in Salzform oder in Komplexform und [Leu8, Gln18, Thr33, Ala34]hPTH(1-34)OH;
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in freier Form oder m Salzform oder in Komplexform.
Vorzugsweise ist PTH(1-x') hPTH(1-x').
Die erfindungsgemässen Verbindungen können beispielsweise in freier Form, Salzform oder in Form von Komplexen hiervon vorkommen. Säureadditionssalze können beispielsweise mit organischen Säuren, Polymersäuren und anorganischen Säuren gebildet werden. Solche Säureadditionssalzformen beinhalten beispielsweise die Hydrochloride und die Acetate. Komplexe werden beispielsweise aus der erfindungsgemässen Verbindung durch die Zugabe von anorganischen Sub-
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stanzen, beispielsweise anorganischen Salzen oder Hydroxiden, wie Ca- und Zn-Salzen, und/oder durch die Zugabe von polymeren organischen Substanzen gebildet.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen. Sie können schrittweise entweder in Lösung oder mittels Festphasensyntheseverfahren oder Gentechnologie hergestellt werden.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können beispielsweise folgendermassen hergestellt werden : a) Entfernung von zumindest einer Schutzgruppe, die in einer geschützten erfindungsgemässen Verbindung vorkommt, oder b) Zusammenfügung von zwei Peptidfragmenten durch eine Amidbindung, wobei die Peptidfragmente so beschaffen sind, dass die gewünschte Aminosäuresequenz der gewünschten Verbindung erhalten wird, und dann die Ausführung des wahlweisen Schritts a) des Verfahrens, c) zur Herstellung einer PTH Verbindung, die zumindest einen Rest enthält, die aus einer an den
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ist und der an die endständige Aminogruppe und/oder eine Seitenkettenaminogruppe gebunden ist, Einführung eines solchen Rests in eine PTH Verbindung, die in geschützter oder ungeschützter Form vorliegt und keinen solchen Rest enthält, und falls erforderlich Ausführung von Schritt a),
und Gewinnung der so erhaltenen Verbindungen in freier Form, Salzform oder in Komplexform.
Die Verfahrensschritte a), b) und c) können in Analogie zu bekannten Verfahren bewirkt werden, wie es beispielsweise im Fachgebiet der Peptidchemie bekannt ist oder in den folgenden Beispielen beschrieben wird. Falls gewünscht können in diesen Reaktionen zur Verwendung bei Peptiden geeignete Schutzgruppen für funktionelle Gruppen verwendet werden, die nicht an der Reaktion beteiligt sind. Der Ausdruck Schutzgruppe kann auch ein Polymerharz beinhalten, das funktionelle Gruppen aufweist.
Der Verfahrensschritt c) kann in Analogie zu bekannten Verfahren, beispielsweise Alkylierungsverfahren, ausgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Alkylierung unter reduktiven Bedingungen ausgeführt, beispielsweise mittels eines entsprechenden Aldehyds oder Ketons. Sie kann beispielsweise in Gegenwart von NaBH3CN ausgeführt werden, vorzugsweise bei einem sauren pH, beispielsweise von 5 bis 7. Die Temperatur der Reaktion kann von beispielsweise -20 C bis 100 C betragen. Es kann vorteilhaft sein, die Reaktion in einem inerten Lösemittel auszuführen, beispielsweise Wasser, einem Alkohol, Dioxan oder DMF oder einem Gemisch hiervon. Eine D- oder L-a-Aminosäure kann gemäss dem bekannten Verfahren auch an den N-Terminus gebunden werden.
Das in Verfahrensschritt b) als Ausgangsmaterial verwendete Peptidfragment kann eine oder mehrere unnatürliche Aminosäureeinheiten umfassen, es kann auch am N-Terminus und/oder an
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C1-4alkyl ausgewählt ist, oder es kann eine D- oder L-a-Aminosäure am N-Terminus tragen.
Die erfindungsgemässen Verbindungen oder Fragmente hiervon, die natürliche a-Aminosäureeinheiten enthalten, können auch mittels rekombinanter Technologie hergestellt werden
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines PTH Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in dem ein Fusionsprotein in Bakterienzellen exprimiert wird, das ein N-terminales Bakteriophagen T4 Gen 55 enthält, das das gewünschte PTH Polypeptid an der C-Terminus hiervon gebunden aufweist, und wenn nötig, ein
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nyl, oder C3-6Cycloalkyl-C1-4alkyl Rest an die endständige Aminogruppe und/oder Seitenkettenaminogruppe der PTH Verbindung in geschützter oder ungeschützter Form eingeführt wird, und erforderlichenfalls die in der geschützten Form vorkommende Schutzgruppe entfernt wird, zur Verfügung gestellt.
Das Gen 55 Polypeptid kann das gesamte gp55 Protein des Bakteriophagen T4 (188 Aminosäurereste) umfassen, das in H. Gram und R. Rüger, 1985, The EMBO Journal, 4, (1), Seiten 257- 264 beschrieben ist. Alternativ dazu kann ein Fragment verwendet werden, vorzugsweise ein N-terminales Fragment des gp55 Proteins. Beispielsweise kann ein gp55 Proteinfragment verwendet werden, das die ersten 112 N-terminalen Aminosäurereste des Proteins umfasst. Typischer-
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weise umfasst das Gen 55 Polypeptid jedoch mindestens die ersten 25 N-terminalen Reste des gp55 Proteins.
Bequemerweise enthält das Gen 55-PTH Fusionsprotein auch einen spaltbaren Linker zwi- schen dem Gen 55 Polypeptid und dem gewünschten Polypeptid. Vorzugsweise ist der spaltbare
Linker chemisch spaltbar und noch bevorzugter enthält er die Aminosäuresequenzen Asp-Pro-Pro oder Asn-Gly-Pro
In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung eine Nukleotidsequenz, die für ein Fusionspro- tein kodiert, das ein N-terminales Baktenophagen T4 Gen 55 Polypeptid und eine gewünschte PTH
Verbindung gemäss vorliegender Erfindung, an den C-Terminus hiervon gebunden enthält.
Die Nukleotidsequenz ist vorzugsweise eine DNA Sequenz, die zur Expression in Bakterien geeignet ist. Diese Sequenz enthält typischerweise Nukleotide zwischen den für das Gen 55 und den das gewünschte Polypeptid kodierenden Sequenzen, die für einen spaltbaren Linker kodieren.
Die Erfindung liefert auch einen bakteriellen Expressionsvektor, der eine für das Fusionsprotein kodierende DNA Sequenz enthält.
Der Expressionsvektor enthält typischerweise zusätzlich zur kodierenden Sequenz des Fusi- onsprotems geeignete Expressionskontrollsequenzen, einschliesslich eines geeigneten Promotors, eines Operators und einer Ribosomenbindungsstelle und anderen geeigneten regulatorischen Sequenzen. Gewöhnlich enthält der Expressionvektor auch einen oder mehrere Selektionsmarker.
Jeder geeignete Promotor kann verwendet werden, wie der TrpE, Lambda Pl, Lambda Pr, lac oder Tac Promotor. Vorzugsweise ist der Promotor der Bakteriophagen T7 Promotor und der Ex- pressionsvektor ein Plasmid. Zur E. coli Expression kann ein Vektor verwendet werden, der vom
R1 oder Col-E1 Plasmid abstammt. Beispielsweise können der von Novagen erhältliche Expressionsvektor pET 17B oder ähnliche Vektoren verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung bakterielle Wirtszellen, die mit einer ein Fusionprotein kodierenden Sequenz oder einem wie oben beschriebenen Expressionsvektor transformiert sind. Jede geeignete bakterielle Wirtszelle kann verwendet werden, obwohl der Wirt vorzugsweise E. coli ist. Beispielsweise können der E. coli Stamm BL21 (DE3) Lys E und ähnliche Stämme verwendet werden.
Vorteilhafterweise reichert sich das Fusionsprotein innerhalb der Wirtszellen in Form von unlöslichen Einschlusskörpern an und erleichtert daher die Gewinnung des Fusionsproteinprodukts aus den Zellen. Um das gewünschte Polypeptidprodukt aus dem Fusionsprotein zu gewinnen, wird das Protein der Einschlusskörper gelöst, und das gewünschte Polypeptidprodukt vom Fusionsprotein abgespalten. Jede geeignete Losungsbehandlung kann verwendet werden, einschliesslich Säurebehandlung beispielsweise bei etwa pH 2 bis 4, vorzugsweise mit Säure bei etwa pH 2,5, oder die Behandlung mit einem denaturierenden Mittel, beispielsweise einem milden Denaturierungsmittel, wie Guanidinhydrochlorid. Zusätzlich kann es notwendig sein, eine oder mehrere gewünschte N-terminale Aminosäurereste vom Produkt zu entfernen, die nach der Spaltung verblieben sind.
Daher liefert die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäss vorliegender Erfindung in einem bakteriellen Wirt, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch: Veranlassung der wie oben definierten transformierten bakteriellen Wirtszellen, das Fusionsprotein in Form von Einschlusskörpern zu exprimieren, Isolierung der Einschlusskorper, Auflösen der Einschlusskörper, und Abspaltung des gewünschten Polypeptids vom Fusionsprotein
Im Fall von PTH Verbindungen, ist es normalerweise nicht notwendig, sorgfältig kontrollierte Denatunerungs- und Renaturierungsverfahren zur Bildung von PTH Produkten in aktiver Form, beispielsweise mit PTH-ähnlicher Aktivität, auszuführen. Die mittelgrossen Polypeptidprodukte können in aktiver Form meistens durch Neutralisierung des zur Auflösung verwendeten sauren Bedingungen erhalten werden.
Die Lösung und Spaltung des Fusionsproteins kann in einem einzigen Schritt ausgeführt werden.
Die Erfindung beinhaltet auch ein Fusionsprotein, das ein N-terminales Bakteriophagen T4 Gen 55 Polypeptid und an den C-Terminus hiervon gebunden eine PTH Verbindung gemäss vorliegender Erfindung umfasst.
Durch die Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren und Vektoren wurde festgestellt,
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dass es möglich ist, grosse Mengen an PTH Produkten zu produzieren. In E. coli wurde festgestellt, dass bis zu etwa 50 % des exprimierten Gesamtproteins das gewünschte Fusionsprotein ist. Ebenfalls, dass das Fusionsprotein Einschlusskörper bildet, die leicht vom anderen Zellmaterial zu tren- nen sind. Darüberhinaus bestehen die Einschlusskörper oft aus zumindest etwa 90 % des gewünschten Fusionsproteins, was den erforderlichen Reinigungsaufwand deutlich reduzieren kann.
Ferner kann die Expression des PTH Produkts in der Form des Fusionsproteins das endogene
Prozessieren des Polypeptids in der Bakterienzelle wesentlich reduzieren, was die Erhaltung von homogenen Produkten erlaubt.
Vorzugsweise enthält der spaltbare Linker chemisch spaltbare Aminosäuren benachbart zum
N-Terminus des gewünschten Polypeptids, um die Abspaltung des gewünschten Polypeptids vom
Fusionsprotein durch einfache chemische Mittel zu erlauben. Vorzugsweise enthält das gewünschte Polypeptid die chemisch spaltbaren Gruppen nicht.
Bevorzugte chemisch spaltbare Linker enthalten die Aminosäuren Asp-Pro-Pro oder Asn-GlyPro. Die Asp-Pro oder Asn-Gly Bindungen können chemisch mittels saurer Bedingungen gespalten werden, beispielsweise jeweils Ameisensäure (normalerweise etwa pH 2,5) oder Hydroxylamin.
Die Dipeptide Pro-Pro oder Gly-Pro, die am N-Terminus des gewünschten Polypeptids verbleiben, können dann durch eine geeignete Dipeptidylpeptidase entfernt werden. Beispielsweise kann die L. lactis X-Pro-Dipeptidylpeptidase EC 3. 4.14.5 verwendet werden. Diese Peptidase ist in Nardi et al, 1991, Applied and Environmental Microbiology, 57, Seiten 45 bis 50 beschrieben.
Das gewünschte Polypeptid kann nach der Abspaltung vom Fusionsprotein gereinigt werden.
Hier können HPLC Reinigungstechniken verwendet werden. Die Reinigung kann vor der Entfernung von allen unerwünschten N-terminalen Aminosäureresten ausgeführt werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird ferner in den Vergleichsbeispielen 25 bis 31 geschildert, welche sich aber nur auf Fusionsproteine beziehen, umfassend (1-38) PTH, die von der vorliegenden Erfindung nicht umfasst sind. Die SEQ ID Nr. 1 zeigt die Aminosäuresequenz und die entsprechende DNA Sequenz eines verkürzten gp55-Asp-Pro-Pro-hPTH(1-38)OH Fusionsproteins, wie sie in das Plasmid pET17B kloniert ist, und die SEQ ID Nr. 3 zeigt die Aminosäuresequenz und die entsprechende DNA Sequenz eines Vollängen gp55-Asn-Gly-Pro-hPTH(1-38)OH Fusionsproteins, wie es in das Plasmid pET17B kloniert ist.
In den folgenden Beispielen sind alle Temperaturen in C angegeben. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:
BOC = tert. Butyloxycarbonyl
DMF = Dimethylformamid
DCM = Dichlormethan
Fmoc = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt = 1-Hydroxybenztriazol
TFA = Trifluoressigsäure
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
RP-HPLC = Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie
RT = Raumtemperatur
DNP = Dinitrophenyl
Tos = Tosyl
DIPC = Diisopropylcarbodiimid
Pmc = 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl
Ip = Isopropyl
For = Formyl
Cpe = 1-Aminocyclopentan-1-carbonsäure
Cpp = 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure
Cha = Cyclohexylalanin tBu = tert.
Butyl "PTH" in der vorliegenden Anmeldung mit oder ohne weiterer Angabe, schliesst sowohl den Carboxy Terminus, als auch den Carboxamid Terminus mit ein.
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Dieses Peptid wird schrittweise auf einem auf Polystyroi basierenden Harzträger zusammenge- fügt. Die Boc-Gruppe wird zum Schutz der alpha-Aminogruppe verwendet und die funktionellen
Gruppen der Seitenketten werden folgendermassen geschützt : Lys(2-chlorbenzyloxycarbonyl), Ser (benzyl), Thr(benzyl), Glu(benzyl) Asp(benzyl), Met(O), His(DNP), Arg (Tos) und Trp (HCO). andereren Reste bleiben ungeschützt.
Amino-4-methylphenyl-methyl-co(polystyroldivinylbenzol = MBHA-Harz) (0,7 mmollg) wird dem folgenden Behandlungszyklus der Schritte (1) bis (7) unterzogen: (1) DCM (2) Trifluoressigsäure (50 %) in DCM (3) DCM (4) Diisopropylethylamin (10 %) in DMF (5) DMF (6) vorgebildetes symmetrisches Anhydrid (1,4 mmol pro g Ausgangsharz) der Boc-Amino- säure in DMF (7) DMF
Die Volumina der Waschschritte und Reagenzien reichen von 5 bis 20 ml pro Gramm Aus- gangsharz. Jeder Schritt wird so oft wie nötig wiederholt, um entweder die Reaktion des Harzes zu vervollständigen (Schritte 2,4, 6) oder die Entfernung des vorherigen Reagenzes vom Harz (Schritte 1,3, 5, 7) zu vervollständigen.
Harzproben werden nach jedem Zyklus entnommen und auf Vollständigkeit der Kupplungsreaktion durch einen colorimetrischen Test auf verbleibende Ami- nogruppen mittels Ninhydrin getestet.
Kurz vor der Verwendung werden symmetrische Anhydride der Boc-Aminosäuren durch Um- setzung der Boc-Aminosäure (2,8 mmol pro g Harz) und DCCI (1,4 mmol pro g Harz) in DCM, das zur vollständigen Auflösung der Boc-Aminosäure in ausreichenden Mengen DMF enthält, hergestellt. Das Gemisch wird filtriert, mehr DMF wird zum Filtrat gegeben, das durch Verdampfen der flüchtigen Bestandteile bei einer Temperatur nicht über 15 C konzentriert wird, und die entstehende Lösung wird in Schritt (6) verwendet.
Der Reaktionszyklus (1) bis (7) wird für jede Aminosäure ausser Boc-Gln-OH und Boc-Arg(Tos)OH wiederholt, die in Schritt (6) als vorgefertigte 1-Hydroxybenztriazolester in DMF angekuppelt werden, um so die Sequenz der Titelverbindung herzustellen.
Das komplett zusammengesetzte Peptidharz wird zweimal mit 20 ml 5 % Thiophenol in DMF bei Raumtemperatur für eine Stunde behandelt und mit DMF, Methanol und Dichlormethan gewaschen. Das Peptidharz wird erneut den Schritten (1) bis (5) unterzogen, gefolgt von der Zugabe von 0,5 ml Aceton, 84 mg Natriumcyanborhydrid und 0,2 ml Essigsäure in 20 ml DMF pro Gramm Harz. Nach 16 Stunden bei Raumtemperatur wird das Harz mit DMF und Dichlormethan gewaschen und getrocknet.
Das Peptidharz wird mit flüssigem HF, Dimethylsulfid, p-Kresol und Ethan-1,2-dithiol gemäss dem "niedrig-hoch" Verfahren behandelt, das beispielsweise in International Journal of Peptide and Protein Research, Band 26, Seiten 262-273 (1985) beschrieben ist. Nach Entfernung der flüchtigen Bestandteile und Waschen mit Ethylacetat wird der Rückstand mit einigen Portionen 1 %iger Essigsäure extrahiert, filtriert und das Filtrat lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt wird durch wiederholte Umkehrphasenchromatographie auf einer Octadecyl-Kieselgelsäule mittels eines Gradienten aus Acetonitril in 2 % Phosphorsäure oder in 20 mM Tetramethylammoniumphosphat gereinigt.
Die die reine Verbindung enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, durch ein schwaches lonenaustauscherharz in Acetatform filtiert und das Filtrat wird unter Erhaltung der Titelverbindung lyophilisiert MS (lonenspray) 4160.
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Das Peptid wird wie für Vergleichsbeispiel 1 beschrieben zusammengefügt, aber man verwen- det Lys (Fmoc) zumEinbau in die Position 13 und Fmoc-Ser (tBu) die endständigen Position 1.
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Das vollständig zusammengefügte Peptidharz wird zweimal mit 20 ml 5 % Thiophenol in DMF bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt und mit DMF, Methanol und Dichlormethan gewaschen. Das trockene Harz wird mit flüssigem HF behandelt, wie dies für Beispiel 1 beschrieben ist. Das Spaltprodukt (350 mg) wird in einem Gemisch aus Methanol (5 ml), Phosphatpuffer pH = 5,0 (5 ml), Natriumcyanborhydrid (48 mg) und Aceton (0,28 ml) suspendiert. Nach 16 Stunden bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in 20 %igem Piperidin in DMF für 15 Minuten suspendiert, mit 20 Volumina Ether verdünnt und filtriert. Der Rückstand wird in 100 ml Wasser und bis auf pH = 3 zugegebener Essigsäure gelöst, filtriert und das Filtrat wird lyophilisiert.
Das Lyophilisat wird durch Umkehrphasenchromatographie auf einer Octadecyl-Kieselgelsäule gereinigt, indem man einen Gradienten von Acetonitril in 2 % Phosphorsäure verwendet. Fraktionen, die die reine Verbindung enthalten, werden vereinigt, durch ein schwach basisches Ionenaustauscherharz in Acetatform filtriert und das Filtrat unter Erhaltung der Titelverbindung lyophilisiert.
MS (lonenspray): 4205,6
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a) Festphasenpeptidsynthese
Das Peptid wird schrittweise auf einem Harzträger auf Polystyrolbasis synthetisiert. Die alphaAminogruppe wird durch Fmoc geschützt und die funktionellen Gruppen der Seitenkette sind fol- gende : Asp(OtBu), Glu(OtBu), His(Trt), Lys (Boc), Asn(Trt), Gln(Trt), Arg (Pmc) und Ser (tBu). anderen Aminosäuren bleiben ungeschützt. Zu 4-Hydroxymethylphenoxymethyl-co(polystyrol 1 % -divinylbenzol) verestertes Fmoc-Gly, 0,5 mmol/g, wird als Ausgangsmaterial für die schrittweise
Festphasensynthese verwendet, die aus repetitiven Zyklen mit Abspaltung der Schutzgruppen der alpha-Aminosäure, Waschen, Kuppeln (Anhängen der neuen Aminosäure) und Waschen bestehen. Ein drei bis fünffacher Überschuss an Fmoc-Aminosäuren in Form von vorgefertigten HOBt-
Estern wird mittels DIPC gekuppelt.
Fmoc-Arg(Pmc), Fmoc-Asn(Trt) und Fmoc-Gln(Trt) werden als symmetrische Anhydride mittels DIPC gekuppelt. Nach dem vollständigen Zusammensetzen der
Peptidkette wird die Fmoc-Schutzgruppe von Ser1 durch 20 % Piperidin/DMF entfernt. Die Abspaltung des Peptids vom Polystyrolharz und die Entfernung aller Schutzgruppen der Seitenketten wird durch die Behandlung des Peptidharzes mit einem Gemisch aus 10 % Ethandithiol, Thioanisol, Thiokresol und Wasser in 90 % TFA für drei Stunden bei Raumtemperatur erreicht. Die Harzpartikel werden wegfiltriert und mit etwas TFA gewaschen. Das Produkt wird aus den vereinigten Filtraten durch die Zugabe von Ether ausgefällt, filtriert und getrocknet. Das Produkt wird dann durch Chromatographie auf einer C-18 Kieselgelsäule mittels eines Gradienten von Acetonitril in 2 % H3P04 / Wasser gereinigt.
Die die reine Verbindung enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, durch ein Anionenaustauscherharz (Biorad, AG 4-X4,100-200 Mesh in Acetatform) filtriert und unter Erhaltung von hPTH-(1-38)-OH lyophilisiert. b) Alkylierung
40 mg (9 mol) hPTH- (1-38)-OH (4458,2 g/mol) werden in 1,2 ml Methanol, 1,2 ml Phosphatpuffer (Merck Nr. 9887, der auf pH 5,0 eingestellt ist), 45 mg (716 mmol) NaBH3CN (62,84 g/mol) und 0,8 ml (11 mmol) Aceton (73,52 ml/mol) gelöst. Die Reaktion wird mittels RP-HPLC auf einer C-18 Kieselgelsäule verfolgt und ist nach 15 Stunden bei Raumtemperatur beendet Das Reaktionsgemisch wird mit Wasser verdünnt und auf einer C-18 Kieselgelsäule mittels eines Gradienten von Acetonitril in 2 % H3P04 / Wasser chromatographiert.
Die die reine Verbindungen enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, durch ein Anionenaustauscherharz (Acetatform) filtriert und unter Erhaltung der Titelverbindung als Polyacetat, Polyhydrat lyophilisiert.
[α]D20 = -5,7 (c = 0,317 in 95 % AcOH) MS (lonenspray): 4626
EMI8.2
Die Peptidkette wird auf dieselbe Weise zusammengesetzt, wie in Vergleichsbeispiel 3a An der Position 1 wird anstatt Fmoc-Ser (tBu)-OH dieunnatürliche Aminosäure Fmoc-N"-Methyl-Ala-
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OH an das Peptidharz gekuppelt. Abspaltung, Abspalten von Schutzgruppen und Reinigung werden wie in Vergleichsbeispiel 3a durchgeführt. MS (lonenspray) = 4455,91
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nete Fmoc Aminosäure, beispielsweise Fmoc-Ala, Fmoc-Phe, Fmoc-D-Ala, Fmoc-D-Phe usw. verwendet. Zusätzlich werden die funktionellen Gruppen der Seitenketten folgendermassen geschützt: Thr(t-Butyl), Trp (Boc) und Tyr(t.-Butyl).
Durch Wiederholen des in den Vergleichsbeispielen 3 und 5 beschriebenen Verfahrens aber unter Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien können die folgenden Verbindungen erhalten werden.
EMI9.2
Das Peptid wird schrittweise an einem auf Polystyrol basierenden Harzträger zusammengefügt.
Die Fmoc-Gruppe wird zum Schutz der alpha-Aminogruppen verwendet.
Die funktionellen Gruppen der Seitenketten werden als Arg (Pmc), Asn(Trt), Asp (OtBu), Gin (Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys (Boc), Ser(tBu), Thr(tBu), Trp (Boc) und Tyr (tBu) Andere Aminosäuren bleiben ungeschützt.
4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxy-co(polystyrol-divinylbenzol),0,4 mmol/g, das beispielsweise wie in Tetrah. Letters, 28,3787-3790 (1987) beschrieben hergestellt werden kann, wird dem folgenden Behandlungszyklus der Schritte (1) bis (5) unterzogen: (1) DMF (2) Piperidin (20 %) in DMF (3) DMF (4) Mischung von HOBt, Diisopropylcarbodiimid und Fmoc-Alanin (jeweils 0,8 mmol pro
Gramm Ausgangsharz) (5) DMF
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Die Volumina der Waschschritte und Reagenzien reichen von 5 bis 20 ml pro Gramm Ausgangsharz.
Im nächsten Behandlungszyklus (1) bis (5) wird Fmoc-Alanin durch Fmoc-Valin und so weiter bei jedem Zyklus ersetzt, um am Harz die korrekte Aminosäuresequenz der Titelverbindung zusammenzufügen.
Jeder Schritt wird so oft wie nötig wiederholt, um entweder die Reaktion des Harzes zu vervollständigen (Schritte 2,4) oder die Entfernung des vorherigen Reagenzes vom Harz (Schritte 3, 5) zu vervollständigen. Harzproben werden nach jedem Zyklus entnommen und auf Vollständigkeit der Kupplungsreaktion durch einen colorimetrischen Test auf verbleibende Aminogruppen mittels Ninhydrin getestet
Am Ende der Synthese wird ein letzter Zyklus durchgeführt, der nur die Schritte (1) bis (3) enthält, und das Peptidharz wird mit 2-Propanol gewaschen, dann mit einem Gemisch von Methanol und Methylenchlorid (1: 1 V/V) gewaschen und sorgfältig in einem Vakuumexsikkator getrocknet.
Das Peptidharz (1 g) wird in einem Gemisch (20 mi) aus Trifluoressigsäure, Wasser und 1,2Ethandithiol (90: 5:5 V/V) für 2 Stunden bei Raumtemperatur suspendiert, die Harzpartikel werden abfiltriert und mit einem kleinen Volumen TFA gewaschen. Das Produkt wird aus den vereinigten Filtraten durch die Zugabe von Ether (20 Volumina) ausgefällt, filtriert, mit mehr Ether gewaschen und getrocknet. Der Rest wird in 2 % Essigsäure gelöst, und die Lösung wird bei RT für 8 Stunden vor der Lyophilisierung stehengelassen. Das Lyophilisat wird auf einer C-18 Kieselgelsäule mittels eines Gradienten aus Acetonitril in 2 % H3P04 chromatographiert.
Die Fraktionen werden durch analytische HPLC überprüft, und die, die die reine Verbindung enthalten, werden gesammelt, durch ein Anionenaustauscherharz in der Acetatform filtriert und unter Erhaltung der Titelverbindung als Polyacetat, Polyhydrat lyophilisiert.
Fmoc-1-aminocyclopentan-1-carbonsäure, die zur Herstellung des Peptidharzzwischenprodukts verwendet wird, kann hergestellt werden, wie dies beispielsweise durch G. Valle et al., 1988, in Can. J. Chem. 66 :2575-2582 worden ist.
MS (lonenspray): 4312
Durch Wiederholung des im Vergleichsbeispiel 6 beschriebenen Verfahrens, aber unter Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien, können folgende Verbindungen erhalten werden.
EMI10.1
Die Verbindungen der (Vergleichs-)Beispiele 1 bis 24 zeigen korrekte Aminosaureverhältnisse in quantitativer Aminosäureanalyse.
In den folgenden Beispielen, die das rekombinante Verfahren der Erfindung beschreiben, werden, falls nichts anderes angegeben ist, die in Ausubel et al., 1991, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York beschriebenen Standardverfahren verwendet. Die in diesem Verfahren erhaltenen Fusionsproteine (1-38) PTH sind von dieser Erfindung nicht umfasst
EMI10.2
Zwei DNA Fragmente, eines, das die gesamte kodierende Sequenz des Bakteriophagen T4 Gen 55 enthält, und das andere Fragment, das nur einen Teil davon kodiert, werden durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mittels gereinigter T4 DNA als Template amplifiziert. Oligonukleotide, die Ndel oder BamHI Restriktionsschnittstellen enthalten, werden als Primer verwendet.
Die PCR Reaktionen (25 Zyklen, jeweils 30s 94 C, 30s 50 C, 30s 72 C) werden mit 1 ng Template und 100 pM des stromaufwärts liegenden Primers (GAGGTGCATA TGTCAGAAC TAAGCCT 27, wobei die Ndel Restriktionsschnittstelle von 7-12 Nukleotiden hiervon geliefert wird), und 100 pM des stromabwarts liegenden Primers (GGTCGGATCC ATCGTTAGCG TTAGCCTCAT ATAAAAAATC 40, wobei die BamHI Restriktionsschnittstelle von 5-10 Nukleotiden hiervon geliefert wird), in 100 l Reaktionspuffer durchgeführt, der 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 1,5 mM MgCI2, jeweils 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP und 0,1 % Triton X 100 pH 9,0 enthält. Man erhält ein 0,6 kb Fragment.
Die verkürzte Form des Gen 55 wird durch PCR hergestellt, wie dies für das gesamte Gen beschrieben ist, mit dem Unterschied, dass man ein anderes Oligonukleotid als stromabwärts liegen-
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den Primer verwendet (GGTCGGATCC TACGTTGGAC GAATGCAT 28, wobei die BamHl Schnittstelle durch die Nukleotide 5-10 hiervon geliefert wird). Man erhält ein 0,35 kb Fragment.
Die 0,6 kb und 0,35 kb DNA Fragmente werden mit den Restriktionsendonukleasen Ndel/BamHI verdaut und in den Ndel/BamHI verdauten Expressionsvektor pET17B (erhalten von Novagen) kloniert Das 0,6 kb DNA Fragment kodiert das gesamte gp55 Protein (188 Aminosäurereste - siehe SEQ ID Nr. 1), während das 0,35 kb Fragment ein aminoterminales 12 kD Fragment von gp55 kodiert (112 Aminosäurereste - siehe SEQ ID Nr. 3).
EMI11.1
Durch PCR werden DNA Fragmente erzeugt, die a) das den Aminosäureresten 110-115 der
SEQ ID Nr. 1 und hPTH(1-38) entsprechende Linkerpeptid oder b) das den Aminosäureresten 186-
191 der SEQ ID Nr. 3 und hPTH(1-38) entsprechende Linkerpeptid kodieren, indem man eine klo- nierte synthetische für PTH(1-38) kodierende Sequenz als Template verwendet.
Die den Linker a) (GAGTGGATCC ATCGATCCAC CATCCGTATC AGAAATACAA CT 42) oder den Linker b) (GAGTGGATCC GTTAACGGTC CATCCGTATC AGAAATACAA CT 42) kodierenden Oligonukleotide werden als stromaufwärts liegende Primer verwendet. Der stromabwärts liegende Primer ist ais (TCTACTCGAG TTAACCCAGA GCTACAAAAT TATG 34) gezeigt. Die stromaufwärts liegenden Primer enthalten jeweils eine BamHI Klonierungsstelle und die stromabwärts liegenden Primer enthalten eine Xhol Schnittstelle (Nukleotide 5-10 jeder Sequenz). Die PCR Reaktion wird unter denselben Bedingungen durchgeführt, wie sie in Vergleichsbeispiel 25 beschrieben sind.
Nach der Spaltung mit BamHI und Xhol werden die 0,23 kb PCR Produkte in die BamHI-Xhol Verdaus der gp55-pET17B Plasmide inseriert, welche in Vergleichsbeispiel 25 erhalten wurden.
Zur Expression der Fusionsproteine werden die entstehenden Plasmidkonstrukte in E. coli BL21 (DE3) Lys E transformiert, und ferner werden bakterielle Einzelkolonien erzeugt. Die Expression der Fusionsproteine wird durch Inkubation einer Vorkultur bei 37 C auf einem Rundschüttler über Nacht in "Circle" Wachstumsmedium (Bio 101) erhalten. Eine Hauptkultur wird mit 1 bis 5 % des Hauptkulturvolumens mit der Vorkultur angeimpft. Die Hauptkultur wird dann bei einer Temperatur von 37 C und einem pH von 6,9 bis 7,1 fermentiert, während sie mit 10 1/min belüftet wird und bei 200-400 U/min geschüttelt wird. Die Expression wird durch die Zugabe von 1 mM IPTG induziert, sobald die Kultur eine OD550 von etwa 1,0 bis 5,0 erreicht hat.
Nach der Induktion wird die Fermentation für fünf Stunden fortgesetzt, und dann wird die Fermentationsbrühe ohne Abtötung der E. coli Zellen geerntet. Die geernteten Zellen werden mit einer Rohrzentnfuge zentrifugiert, in Probenpuffer resuspendiert und auf Expression durch SDS PAGE getestet. Das Zellpellet wird dann bis zur Reinigung eingefroren. Die verwendeten Verfahren und die Wirtszellen sind vollständig in Studier et al, 1990, "Use of T7 RNA Polymerase to direct Expression of Cloned Genes", Methods in Enzymology, Academic Press, Seiten 60 bis 89 beschrieben.
Vergleichsbeispiel 27' Herstellung von Einschlusskörpern
Eingefrorene E. coli Pellets, die von Vergleichsbeispiel 26 erhalten wurden, werden 25 %ig GN in Puffer A (50 mM Tns pH 8,0, das 2 mM DTT, 5 mM Benzamidin-HCI, 1,5 mM MgCI2, 1,0 mM MnCI2, 10 g/ml DNAse 1 und 2 mg/ml Lysozym enthält) resuspendiert und durch Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur gemischt Die resuspendierten Zellen werden lysiert, indem man sie durch einen Manton-Gaulin Homogenisator (2 Durchläufe bei 1200 bar) durchlaufen lässt und das entstehende Lysat auf Eis hält. Das Lysat wird zweifach mit eiskaltem Puffer B (50 mM Tris pH 8,0, das 2 mM DTT, 5 mM Benzamidin-HCI und 4 mM EDTA enthält) verdünnt und für 30 min bei 27 500 g zentrifugiert.
Der Überstand auf der Zentrifuge wird sorgfältig abgehoben und verworfen. Das Pellet wird in Puffer B 25 %ig GN resuspendiert, einmal mehr durch den Manton-Gaulin durchgelassen und wie vorher zentrifugiert. Dieses Verfahren wird einmal unter Verwendung von Puffer B und einmal mit Wasser wiederholt. Die entstehenden Einschlusskörperpellets werden gewogen und bei -20 C eingefroren, bis sie benötigt werden.
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EMI12.1
schlusskörper
Eingefrorene gp55-Asp-Pro-Pro-(1-38)hPTH enthaltende Einschlusskörper, wie sie in Vergleichsbeispiel 27 erhalten wurden, werden in 10 mM HCI Säurelösung (analytischer Reinheitsgrad) in einer Endkonzentration von 6 % GN suspendiert. Die Lösung wird für 24 Stunden bei 50 C inkubiert und die Reaktion wird durch die Zugabe von 1 Volumen wässriger 100 mm NaOAc Lösung beendet.
Der verdünnte Überstand wird durch Zentrifugation bei 27 500 g für 30 Minuten geklärt und durch einen Glasfiberfilter filtriert.
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körpern
Eingefrorene gp55-Asn-Gly-Pro-(1-38)PTH enthaltende Einschlusskörper, die aus Vergleichs- beispiel 27 erhalten wurden, werden in 6 M Guanidin-HCI (das 2 M Hydroxylamin-HCI enthält und auf pH 9,0 durch Zugabe von 4,5 M LiOH gebracht wurde) unter Bildung von abgeschätzten
5 mg/ml Protein gelöst. Der pH wird erneut auf pH 9 durch weitere Zugabe von LiOH eingestellt und die Lösung wird für 4 Stunden bei 45 C inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von Ameisensäure auf pH4 beendet und die Lösung wird wie in Vergleichsbeispiel 28 beschrieben zentrifugiert und filtriert.
Vergleichsbeispiel 30 : Präparative HPLC von Gly-Pro und Pro-Pro (1-38)hPTH
Filtrierte Überstände aus der Spaltung werden auf einer analytischen Umkehrphasen HPLC (Orpogen HD-Gel-RP-7s-300, 4 x 150 mm Säule) analysiert und mit einem bekannten (1-38)PTH Standard (Bachem) verglichen, um die PTH Konzentration zu bestimmen. Die Säule wird mit 85 % HPLC Puffer A (90 % Wasser, 10 % Acetonitril, worin 0,1 % V/V TFA enthalten sind) und 15 % HPLC Puffer B (10 % Wasser, 90 % Acetonitril, worin 0,1% TFA enthalten sind) äquilibriert und mit einem Gradienten von 15 % HPLC Puffer B bis 100 % HPLC Puffer B über 15 Minuten bei einer Flussrate von 0,75 ml/min eluiert.
In Abhängigkeit von der Grösse der Präparation werden die Überstände entweder auf eine
1,0 x 25 cm C4 Vydac oder eine 2,2 x 25 cm C4 Vydac aufgetragen. Die Säulen werden mit 85 % HPLC Puffer A und 15 % HPLC Puffer B bei Flussraten von jeweils 4 mllmin und 10 ml/min äquilibriert. Die Säulen werden mit Gradienten von jeweils 15 % B bis 85 % B über 80 ml und 15 % B bis 55 % B über 300 ml eluiert.
Die Gly-Pro-hPTH(1-38) oder Pro-Pro-hPTH(1-38) Peaks werden per Hand gesammelt und das Acetonitril wird später unter Vakuum entfernt. Die analytische HPLC wird verwendet, um sowohl die Peptidkonzentration nach der Spaltung als auch in den gesammelten Fraktionen zu bestimmen.
Die Lösemittel-freien Peptidlösungen werden mit einem gleichen Volumen 100 mM Natriumacetat verdünnt und der pH wird, falls erforderlich, auf pH 5,4 eingestellt. Nach der Filtration (0,2 um) wird die Lösung auf eine Kationenaustauschersäule (entweder Mono S oder SP-Sepharose High Performance, die jeweils in HR10/10 oder XK16/10 Säulen gepackt sind) aufgetragen, die mit 50 mM Natriumacetat pH 5,4 (Puffer C) äquilibriert ist. Die Säule wird mit einem NaCI Gradienten von 0 bis 500 mM in Puffer C über 7,5 Säulenvolumina eluiert. 10 ml Fraktionen werden gesammelt und der X-X- (1-38)hPTH wird vereinigt. Die Peptidkonzentration wird vor der Ver- wendung der HPLC bestimmt.
Diese Säule dient sowohl dem Wechsel der Peptide in einen physiologischeren Puffer als auch der Entfernung der zusätzlichen Peptide, die durch die chemische Spaltung des Fusionsproteins an sich gebildet wurden.
Vergleichsbeispiel 31: Enzymatische Entfernung von X-X aus X-X-(1-38)hPTH-OH
Vereinigte Peptidfraktionen, wie sie in Vergleichbeispiel 30 erhalten wurden (Konzentrationsbereich 1,5 - 2,0 mg/ml), werden auf pH 8,0 durch die Zugabe von festem Tris gebracht. Gereinigte
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X-Prolyl Dipeptidase (0,5 mg/ml in PBS pH 7,2) (Nardi et al. (1991) App. Env. Microbiol. 57, Nr 1, 45-50) wird 1 .1000 zugegeben und die Lösung wird für 24 h bei 37 C inkubiert Die Reaktion wird durch die Zugabe von TFA bis 0,2 % (pH = 5,0) gestoppt und das entstehende (1-38) PTH wird mittels HPLC (unter Verwendung derselben Bedingungen wie in Vergleichsbeispiel 30 beschrieben) isoliert.
Das Lösemittel wird entfernt und das Produkt wird nach der Entfernung von Aliquots für die N-terminale Sequenz- und Massenspektroskopieanalyse lyophilisiert.
Beispiele für Ausbeuten, wie sie mittels der zwei oben beschriebenen Fusionsproteinansätze erhalten werden, sind folgende:
Gen55-Asp-Pro-Pro-(1-38)PTH (mittels der "verkürzten" Form des Gen55)
Unter teilweise optimierten Fermentationsbedingungen wird ein Zellpellet mit 215 g Nassgewicht aus einer 10 Liter Fermentation erhalten. Der prozentuale Anteil der Expression des Fusionspro-
EMI13.1
heit (in Bezug auf das Fusionsprotein) dieser Körper beträgt 61 %. Nach der Auflösung, Spaltung und Zentrifugation/Filtration werden etwa 620 mg Pro-Pro-PTH detektiert. Dieses Material ergibt 580 mg Pro-Pro-PTH nach der anschliessenden C4-Vydac HPLC.
Nach Verdünnung Kationenaustausch auf Mono S, Verdau mit X-Prolyldipeptidylpeptidase (bei einer Pro-Pro-PTH Konzentration von 2 mg/ml), HPLC und Lyophilisierung, werden 440 mg des lyophilisierten reinen Produkts mit voller biologischer Aktivität erhalten. Dies stellt eine Ausbeute von 71 % zwischen dem abgestoppten Spaltungsschritt und dem Endprodukt dar.
Gen55-Asn-Gly-Pro-(1-38)PTH (mittels der "langen" Form des Gen55)
Aus einer nicht-optimierten 20 Liter Fermentation wird ein Zellpellet mit 78 g Nassgewicht mit 50 %iger Expression des Fusionsproteins geerntet. Nach der Lyse und Zentrifugation werden 18 g an "90 % reinen" Einschlusskorpern erhalten. Anschliessend an den sauren Stoppschritt und die Zentrifugation/Filtration werden etwa 470 mg Gly-Pro PTH detektiert. Nach einer HPLC auf C4 Vydac werden etwa 355 mg des Peptids detektiert, die sich auf 321 mg nach dem SP-Sepharose Kationenaustausch reduzieren.
Die enzymatische Entfernung der Gly und Pro Reste wird bei 2 mg/ml ausgeführt Nach dem letzten HPLC Schritt und der Lyophilisierung werden 244 mg reines voll biologisch aktives hPTH(1-38)OH gewonnen, was eine Ausbeute von 52 % vom Reaktionsschritt der abgestoppten Spaltung aus darstellt.
Die erfindungsgemässen Verbindungen in freier Form oder in Form von pharmazeutisch annehmbaren Salzen und Komplexen zeigen wertvolle pharmakologische Eigenschaften, wie sie in Tierversuchen deutlich wurden und sind daher in der Therapie indiziert.
Die biologische Wirkung der erfindungsgemässen Verbindungen wird in vitro durch die Messung ihrer Fähigkeit zur Stimulierung der cyclischen AMP Synthese in Ratten UMR 106-06 und humanen SaOS-2 Osteosarcomzellen gemäss dem Verfahren von Marcus und Aurbach in Endocrinology, 85,801-810 (1969) ermittelt. Ratten UMR 106 Osteosarcomzellen werden in Eagle's Minimum Essential Medium -10 % FCS in 12 Loch Platten bis zum Zellrasen gezogen, und humane SaOS-2 Osteosarcomzellen werden in McCoy's 5A Medium - 10 % FCS gezogen. Das Medium wird dann
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Stunden später werden die Zeiten zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen und in DMEM - 1 % RSA inkubiert, das 1 mM 3-lsobutyl-1-methylxanthin enthielt, um Wirkungen aufgrund von Phosphodiesterasen auszuschliessen. 20 Minuten später werden die Testsubstanzen zugegeben.
Die Reaktion wird gestoppt und das cAMP 15 Minuten durch Zugabe von eiskalter 5 %iger Trichlor-
EMI13.3
kiertes Adenin, Adenosin, AMP, ADP, ATP und cAMP wie auch 0,4 Cl [14C] -Adenosin zur Bestimmung der Ausbeute enthält. [3H]-cAMP wird mittels in Serie geschalteter Dowex 50W-X4 (200- 400 Mesh) und Aluminiumoxid Chromatographie abgetrennt und ausgezählt. Die Ergebnisse werden in % der Lösemittelkontrolle und der aus DRC Kurven bestimmten EC50 Werte errechnet Die erfindungsgemässen Verbindungen stimulieren die cAMP Bildung in Ratten UMR 106-06 und humanen SaOS-2 Osteosarcomzellen bei einer Konzentration von 10-11 bis 10-6 M.
Die erfindungsgemässen Verbindungen weisen auch Bindungsaffinität an PTH Rezeptoren auf, wie es sich aus folgendem Versuch ergibt
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[Tyr36]PTHrP(1-36)amid aus dem Huhn wird mit einer spezifischen Aktivität von 2200 Ci/mmol durch das Lactoperoxidaseverfahren (Anawa Lab. AG, Wangen) iodiert. Einschichtige Zellagen von Opossumnierenzellen werden mit 200 l DMEM und HAM's F12 (1: 1) gewaschen, worin 1 % RSA
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Gegenwart oder Abwesenheit von 1 M [Tyr]chPTHrP(1-36)amid inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen mit 0,5 ml Medium (4 C) gewaschen, mit 0,5 ml 1 N NaOH lysiert und die Radio- aktivität wird bestimmt. Die spezifische Bindung wird als Gesamtbindung abzüglich der unspezifi- schen Bindung definiert.
Die Kompetitionskurven werden durch SCTFIT, einem Computerpro- gramm mit nicht-linearer Regression analysiert (Feyen et al, 1992, Biochem. Biophys. Res. Com- mun. 187 :8-13) die Daten werden als mittlere pKD Werte (n=2 bis 3) dargestellt. Die erfin- dungsgemässen Verbindungen zeigen in diesem Test eine als mittlerer pKd Wert ausgedrückte Bin- dungsaffinität von 7 bis 10.
Ferner erhöhen die erfindungsgemässen Verbindungen Plasmacalciumspiegel nach kontinuier- licher s. c. Infusion, wie dies beispielsweise in männlichen tyreoparathyreoidektomiesierten Wistar
Ratten bestimmt wurde, die 140 bis 170 g wogen. 5 Tage nach der Tyreoparathyreoidectomie im- plantiert man den Ratten im Genick Alzet-Minipumpen und infundiert die Testverbindungen in Men- gen von 0,3 bis 30 g/Tag/Ratte. Durch retroorbitale Punktion am Morgen der Tage 1,2, 3 und 6 wird hiernach Blut entnommen und die Plasmacalciumkonzentrationen werden photometrisch be- stimmt.
In diesem Test erhöhen die erfindungsgemässen Verbindungen das Plasmacalcium
Die erfindungsgemässen Verbindungen sind demnach zur Verhinderung oder zur Behandlung von allen Knochenzustanden indiziert, die mit erhöhtem Calciumverlust oder erhöhte Calciumre- sorption zusammenhängen, oder bei denen eine Calciumfixierung in den Knochen wünschenswert ist, beispielsweise unterschiedlich entstandene Osteoporose (beispielsweise juvenil, menopausal, post-menopausal, post-traumatisch, durch hohes Alter oder Corticosteroidtherapie oder Inaktivität verursacht), Frakturen, Osteopathie, einschliesslich akuten und chronischen Zuständen, die mit
Skelettdemineralisierung zusammenhangen, Osteomalacie, periodontaler Knochenverlust oder
Knochenverlust durch Arthritis oder Osteoarthritis oder zur Behandlung von Hypoparathyreoidis- mus.
Die erfindungsgemässen Verbindungen sind insbesondere für die Prävention oder Behandlung von unterschiedlich entstandener Osteoporose indiziert.
Für alle obigen Verwendungen liegt eine indizierte tägliche Dosierung im Bereich von etwa
0,003 bis etwa 10 mg, vorzugsweise 0,003 bis 3, noch bevorzugter 0,01 bis 1 mg einer erfindungsgemässen Verbindung. Die erfindungsgemässen Verbindungen können einmal am Tag oder bis zu zweimal pro Woche verabreicht werden.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können in freier Form oder in pharmazeutisch annehm- barer Salzform oder als Komplexe verabreicht werden. Solche Salze und Komplexe können auf herkömmliche Weise hergestellt werden und entsprechen grössenordnungsmässig der Wirkung der freien Verbindungen. Die vorliegende Erfindung liefert auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine erfindungsgemässe PTH-Verbindung in freier Form oder in einer pharmazeutisch annehmbaren Salzform oder Komplexform zusammen mit einem pharmazeutisch annnehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger hierfür enthält. Solche Zusammensetzungen können auf herkömmliche Weise formuliert werden.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können durch jeden herkömmlichen Weg verabreicht werden, parenteral, beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen oder Suspensionen, enteral, beispielsweise oral, wie in Form von Tabletten oder Kapseln, oder transdermal, nasal oder in Zäpfchenform.
Gemäss dem Vorangegangenen liefert die vorliegende Erfindung ferner: a) eine erfindungsgemässe Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Komplex hiervon zur Verwendung als Pharmazeutikum, b) eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verbesserung der Knochenbildung, beispielsweise Prävention oder Behandlung von allen Knochenzuständen, die mit erhöhtem Calciumverlust oder erhöhter Calciumresorption zusammenhängen oder bei denen eine Caiciumfixierung in den Knochen wünschenswert ist, beispielsweise bei unterschiedlich entstandener Osteoporose (beispielsweise juvenil, menopausal, post-menopausal, post-traumatisch, durch hohes Alter oder Corticosteroidtherapie oder Inaktivität verursacht), Frakturen, Osteopathie, einschliesslich akuten und chronischen Zuständen, die mit Skelettdemineralisierung zusammenhängen,
Osteomalacie perio-
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dontalem Knochenverlust oder Knochenverlust durch Arthritis oder Osteoarthritis, oder zur Behandlung eines Hypoparathyreoidioms bei einem behandlungsbedürftigen Patienten. c) eine erfindungsgemässe Verbindung in freier Form oder in einer pharmazeutisch annehmbaren Salzform oder Komplexform zur Verwendung für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verbesserung der Knochenbildung, z. B. die bei den unter b) genannten Zuständen verwendet werden kann.
Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemässen Verbindungen als Zusatz oder Adjuvans bei einer anderen Therapie verwendet werden, beispielsweise einer Therapie, die einen Knochenresorptionshemmstoff verwendet, wie beispielsweise in der Osteoporosetherapie, insbesondere einer Therapie, die Calcium, Calcitonin oder ein Analogen oder Derivat hiervon verwendet, beispielsweise Lachs-, Aal- oder humanes Calcitonin, ein Steroidhormon, beispielsweise ein Östrogen, ein partieller Ostrogenagonist oder eine Östrogen-Gestagen Kombination, ein Biphosphonat, Vitamin D oder ein Analogen hiervon, oder jede Kombination hiervon.
Wenn die erfindungsgemässen Verbindungen in Kombination verabreicht werden, beispielsweise als Adjuvans bei der Therapie der Knochenresorptionshemmung, werden die Dosierungen für den mitverabreichten Hemmstoff natürlich variieren in Abhängigkeit vom verwendeten Hemmstoffmittel, beispielsweise ob es ein Steroid oder Calcitonin ist, vom zu behandelnden Zustand, ob es eine heilende oder präventive Therapie ist, vom Verabreichungsplan und so weiter.
Gemäss dem Vorangegangenen liefert die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt: d) eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verbesserung der Knochenbildung, beispielsweise Prävention oder Behandlung des Caiciumverlustes, wie aller zur Prävention oder Behandlung der vorher angeführten spezifischen Zustande oder Krankheiten, bei einem behandlungsbedürftigen Patienten, gekennzeichnet durch a) eine erfindungsgemässe Verbindung und b) einer zweiten Arzneimittelsubstanz, wobei diese zweite Arzneimittelsubstanz ein Knochenresorptionshemmstoff ist, wie er beispielsweise oben erwähnt wurde.
Die Verbindungen der Beispiele 3,5, 8, 14 und 15 sind bevorzugt.
SEQUENZE LISTING (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: (A) NAME. SANDOZ LTD ( B) STREET : PO BOX ( C) CITY: BASEL ( D) STATE: BS (E) COUNTRY : SWITZERLAND ( F) POSTAL CODE (ZIP)' CH 4002 (G) TELEPHONE : 061 324 1111 ( H) TELEFAX : 061 322 7572 (I)TELEX. 965 050 55 (ii) TITLE OF INVENTION. Organic Compounds (iii) NUMBER OF SEQUENCES 12 (iv) COMPUTER READABLE FORM (A) MEDIUM TYPE : Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO 1
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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 717 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY linear (ii) MOLECULE TYPE cDNA (iii) HYPOTHETICAL.
NO (iii) ANTI-SENSE: NO (v) FRAGMENT TYPE: internal (vi) ORIGINAL SOURCE : (A) ORGANISM: Batenophage T4/Homo sapiens (ix) FEATURE (A) NAME/KEY. CDS (B) LOCATION' 101.. 559 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: AGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG AGACCACAAC GGTTTCCCTC 60 TAGAAATAAT TTTGTTTAAC TTTAAGAAGG AGATATACAT ATG TCA GAA ACT AAG 115 Met Ser Glu Thr Lys
1 5 CCT AAA TAT AAT TAC GTA AAC AAT AAA GAG CTT TTA CAA GCT ATT ATT 163
EMI16.1
10 15 20 GAT TGG AAA ACA GAA TTA GCA AAT AAT AAA GAC CCA AAT AAA GTA GTT 211 Asp Trp Lys Thr Glu Leu Ala Asn Asn Lys Asp Pro Asn Lys Val Val
25 30 35 CGT CAG AAT GAT ACT ATC GGA TTA GCC ATT ATG CTT ATT GCA GAA GGC 259
EMI16.2
40 45 50 TTA TCT AAA CGT TTC AAC TTT TCA GGA TAC ACC CAG TCT TGG AAA CAA 307 Leu Ser Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr Thr Gin Ser Trp Lys Gin
55 60 65 GAA ATG ATT GCA GAT GGT ATA GAA GCT
TCT ATT AAG GGG CTT CAC AAT 355 Glu Met Ile Ala Asp Gly Ile Glu Ala Ser Ile Lys Gly Leu His Asn
70 75 80 85 TTT GAT GAA ACG AAA TAT AAA AAC CCA CAT GCG TAT ATA ACT CAA GCT 403 Phe Asp Glu Thr Lys Tyr Lys Asn Pro His Ala Tyr Ile Thr Gin Ala
90 95 100
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TGT TTT AAT GCA TTC GTC CAA CGT GGA TCC ATC GAT CCA CCA TCC GTA 451 Cys Phe Asn Ala Phe Val Gin Arg Gly Ser Ile Asp Pro Pro Ser Val
105 110 115 TCA GAA ATA CAA CTA ATG CAT AAT CTG GGT AAA CAT CTG AAT TCA ATG 499 Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met
120 125 130 GAA CGT GTA GAA TGG CTG CGT AAA AAA CTG CAG GAT GTA CAT AAT TTT 547 Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Phe
135 140 145 GTA GCT CTG GGT TAACTCGAGC AGATCCGGCT GCTAACAAAG CCCGAAAGGA 599 Val Ala Leu Gly 150 AGCTGAGTTG GCTGCTGCCA CCGCTGAGCA ATAACTAGCA TAACCCCTTG GGGCCCTTGG 659 GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA
GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACTATAT CCGGATAA 717 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH : 153 amino acids (B) TYPE : amino acid (D) TOPOLOGY : linear (ii) MOLECULE TYPE protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: Met Ser Glu Thr Lys Pro Lys Tyr Asn Tyr Val Asn Asn Lys Glu Leu 1 5 10 15
EMI17.1
20 25 30 Pro Asn Lys Val Val Arg Gin Asn Asp Thr Ile Gly Leu Ala Ile Met
35 40 45 Leu Ile Ala Glu Gly Leu Ser Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr Thr
50 55 60
EMI17.2
65 70 75 80 Lys Gly Leu His Asn Phe Asp Glu Thr Lys Tyr Lys Asn Pro His Ala
85 90 95
EMI17.3
100 105 110
<Desc/Clms Page number 18>
Asp Pro Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys
115 120 125
His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln
130 135 140
Asp Val His Asn Phe Val Ala Leu Gly
145 150 (2)
INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH. 945 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY. linear (ii) MOLECULE TYPE : DNA(genomic) (iii) HYPOTHETICAL. NO (iii) ANTI-SENSE. NO (v) FRAGMENT TYPE internal (vi) ORIGINAL SOURCE (A) ORGANISM: Bacteriophage T4/Homo sapiens (IX) FEATURE : (A) NAME/KEY : (B) LOCATION:101..787 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3:
AGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG AGACCACAAC GGTTTCCCTC 60 TAGAAATAAT TTTGTTTAAC TTTAAGAAGG AGATATACAT ATG TCA GAA ACT AAG 115 Met Ser Glu Thr Lys
1 5 CCT AAA TAT AAT TAC GTA AAC AAT AAA GAG CTT TTA CAA GCT ATT ATT 163 Pro Lys Tyr Asn Tyr Val Asn Asn Lys Glu Leu Leu Gin Ala Ile Ile
10 15 20 GAT TGG AAA ACA GAA TTA GCA AAT AAT AAA GAC CCA AAT AAA GTA GTT 211 Asp Trp Lvs Thr Glu Leu Ala Asn Asn Lys Asp Pro Asn Lys Val Val
25 30 35 CGT CAG AAT GAT ACT ATC GGA TTA GCC ATT ATG CTT ATT GCA GAA GGC 259
EMI18.1
40 45 50
<Desc/Clms Page number 19>
TTA TCT AAA CGT TTC AAC TTT TCA GGA TAC ACC CAG TCT TGG AAA CAA 307
Leu Ser Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr Thr Gln Ser Trp Lys Gin
55 60 65
GAA ATG ATT GCA GAT GGT ATA GAA GCT TCT ATT AAG GGG CTT CAC AAT 355
Glu Met Ile Ala Asp Gly He Glu Ala Ser Ile Lys Gly Leu His Asn
70 75 80 85
TTT GAT GAA ACG AAA TAT AAA AAC CCA CAT
GCG TAT ATA ACT CAA GCT 403
Phe Asp Glu Thr Lys Tyr Lys Asn Pro His Ala Tyr Ile Thr Gln Ala
90 95 100
TGT TTT AAT GCA TTC GTC CAA CGT ATT AAA AAA GAA CGT AAG GAA GTT 451 Cys Phe Asn Ala Phe Val Gln Arg Ile Lvs Lys Glu Arg Lys Glu Val
105 110 115 GCA AAG AAA TAT AGT TAC TTC GTT CAC AAT GTC TAT GAC AGC CGT GAC 499 Ala Lys Lys Tyr Ser Tyr Phe Val His Asn Val Tyr Asp Ser Arg Asp
120 125 130 GAC GAT ATG GTT GCG TTA GTA GAT GAA ACT TTT ATT CAA GAC ATC TAT 547 Asp Asp Met Val Ala Leu Val Asp Glu Thr Phe Ile Gln Asp Ile Tyr
135 140 145 GAT AAA ATG ACG CAT TAC GAA GAA TCA ACC TAT AGA ACA CCG GGG GCT 595 Asp Lys Met Thr His Tyr Glu Glu Ser Thr Tyr Arg Thr Pro Gly Ala 150 155 160 165 GAA AAG AAA AGT GTT GTA GAT GAT TCT CCT AGT TTG GAT TTT TTA TAT 643 Glu Lys Lys Ser Val Val Asp Asp Ser Pro Ser Leu Asp Phe Leu Tyr
170 175 180 GAG GCT AAC GAT GGA TCC GTT AAC GGT CCA TCC GTA TCA GAA ATA CAA 691
Glu Ala Asn Asp Gly Ser Val Asn Gly Pro Ser Val Ser Glu Ile Gln
185 190 195 CTA ATG CAT AAT CTG GGT AAA CAT CTG AAT TCA ATG GAA CGT GTA GAA 739 Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu
200 205 210 TGG CTG CGT AAA AAA CTG CAG GAT GTA CAT AAT TTT GTA GCT CTG GGT 787 Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Phe Val Ala Leu Gly
215 220 225 TAACTCGAGC AGATCCGGCT GCTAACAAAG CCCGAAAGGA AGCTGAGTTG GCTGCTGCCA 847 CCGCTGAGCA ATAACTAGCA TAACCCCTTG GGGCCCTTGG GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA 907 GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACTATAT CCGGATAA 945 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS-
<Desc/Clms Page number 20>
(A) LENGTH : amino acids (B) TYPE amino acid (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION.
SEQ ID NO:4' Met Ser Glu Thr Lys Pro Lys Tyr Asn Tyr Val Asn Asn Lys Glu Leu
1 5 10 15 Leu Gln Ala Ile Ile Asp Trp Lys Thr Glu Leu Ala Asn Asn Lys Asp
20 25 30 Pro Asn Lys Val Val Arg Gin Asn Asp Thr Ile Gly Leu Ala Ile Met
35 40 45 Leu Ile Ala Glu Gly Leu Ser Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr Thr
50 55 60
EMI20.1
65 70 75 80 Lys Gly Leu His Asn Phe Asp Glu Thr Lys Tyr Lys Asn Pro His Ala
85 90 95
EMI20.2
100 105 110 Glu Arg Lys Glu Val Ala Lys Lys Tyr Ser Tyr Phe Val His Asn Val
115 120 125 Tyr Asp Ser Arg Asp Asp Asp Met Val Ala Leu Val Asp Glu Thr Phe
130 135 140 Ile Gin Asp Ile Tyr Asp Lys Met Thr His Tyr Glu Glu Ser Thr Tyr 145 150 155 160 Arg Thr Pro Gly Ala Glu Lys Lys Ser Val Val Asp Asp Ser Pro Ser
165 170 175 Leu Asp Phe Leu Tyr Glu Ala Asn Asp Gly Ser Val Asn Gly Pro Ser
180 185 190 Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu
Asn Ser
195 200 205 Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn
210 215 220 Phe Val Ala Leu Gly 225 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5:
<Desc/Clms Page number 21>
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH : base pairs (B) TYPE nucleic acid (C) STRANDEDNESS single (D) TOPOLOGY. linear (ii) MOLECULE TYPE- cDNA (in) HYPOTHETICAL NO (in) ANTI-SENSE NO (v) FRAGMENT TYPE. internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO:5 GAGGTGCATA TGTCAGAAAC TAAGCCT 27 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO 6 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS- (A) LENGTH 40 base pairs (B) TYPE- nucleic acid (C) STRANDEDNESS. single (D) TOPOLOGY linear (ii) MOLECULE TYPE cDNA (in) HYPOTHETICAL NO (in) ANTI-SENSE: NO (v) FRAGMENT TYPE. internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO:6:
GGTCGGATCC ATCGTTAGCG TTAGCCTCAT ATAAAAAATC 40 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO.7.
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
(A) LENGTH. 28 base pairs (B) TYPE- nucleic acid (C) STRANDEDNESS. single (D) TOPOLOGY linear (ii) M.OLECULE TYPE cDNA (iii) HYPOTHETICAL- NO (iii) ANTI-SENSE. NO (v) FRAGMENT TYPE internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO 7
<Desc/Clms Page number 22>
GGTCGGATCC TACGTTGGAC GAATGCAT 28 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH- 42 base pairs (B) TYPE nucleic acid (C) STRANDEDNESS single (D) TOPOLOGY linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (iii) ANTI-SENSE: NO (v) FRAGMENT TYPE. internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO 8 GAGTGGATCC ATCGATCCAC CATCCGTATC AGAAATACAA CT 42 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH : 42 base pairs (B) TYPE nucleic acid (C) STRANDEDNESS. single (D) TOPOLOGY linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (iii) HYPOTHETICAL: NO (in) ANTI-SENSE. NO (v) FRAGMENT TYPE. internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO:9: GAGTGGATCC GTTAACGGTC CATCCGTATC AGAAATACAA CT 42 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS.
(A) LENGTH : base pairs (B) TYPE. nucleic acid (C) STRANDEDNESS. single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: cDNA (in) HYPOTHETICAL. NO (iii) ANTI-SENSE NO
<Desc/Clms Page number 23>
(v) FRAGMENT TYPE. internal (xi) SEQUENCE DESCRIPTION- SEQ ID NO 10 TCTACTCGAG TTAACCCAGA GCTACAAAAT TATG 34 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:11 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS (A) LENGTH. 34 amino acids (B) TYPE amino acid (C) STRANDEDNESS single (D) TOPOLOGY. unknown (ii) MOLECULE TYPE protein (iii) HYPOTHETICAL NO (iii) ANTI-SENSE.
NO (vi) ORIGINAL SOURCE (A) ORGANISM Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0.11 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His
20 25 30 Asn Phe (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO 12 (i) SEQUENCE .CHARACTERISTICS
EMI23.1
(B) TYPE : aminoacid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY. unknown (ii) MOLECULE TYPE: protein (in) HYPOTHETICAL NO (in) ANTI-SENSE: NO (vi) ORIGINAL SOURCE.
(A) ORGANISM Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION SEQ ID NO:12 Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15
<Desc/Clms Page number 24>
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His
20 25 30 Asn Phe Val Ala
35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH : amino acids (B) TYPE : acid (C) STRANDEDNESS : single (D) TOPOLOGY : unknown (ii) MOLECULE TYPE : protein(iii) HYPOTHETICAL: NO (iii) ANTI-SENSE. NO (vi) ORIGINAL SOURCE.
(A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:13: Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His
20 25 30 Asn Phe Val Ala Leu Gly
35
PATENTANSPR CHE:
1. PTH Verbindung der Formel
EMI24.1
worin R1 Met oder Leu ist; R2 Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr oder Tyr ist; R3 Leu oder Lys ist;
EMI24.2
**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.