CZ286889B6 - Parathormone derivatives and pharmaceutical preparations in which they are comprised - Google Patents

Parathormone derivatives and pharmaceutical preparations in which they are comprised Download PDF

Info

Publication number
CZ286889B6
CZ286889B6 CZ199588A CZ8895A CZ286889B6 CZ 286889 B6 CZ286889 B6 CZ 286889B6 CZ 199588 A CZ199588 A CZ 199588A CZ 8895 A CZ8895 A CZ 8895A CZ 286889 B6 CZ286889 B6 CZ 286889B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
hpth
ala
leu
mass spectrometry
lys
Prior art date
Application number
CZ199588A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ8895A3 (en
Inventor
Wilfried Bauer
Robin Dr Breckenridge
Francois Dr Cardinaux
Frank Dr Gombert
Hermann Dr Gram
Paul Dr Ramage
Helmut Dr Schneider
Rudolf Dr Waelchli
Rainer Dr Albert
Ian Dr Lewis
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB929215009A external-priority patent/GB9215009D0/en
Priority claimed from GB929226415A external-priority patent/GB9226415D0/en
Priority claimed from GB929226859A external-priority patent/GB9226859D0/en
Priority claimed from GB929226861A external-priority patent/GB9226861D0/en
Priority claimed from GB939301692A external-priority patent/GB9301692D0/en
Priority claimed from GB939301691A external-priority patent/GB9301691D0/en
Priority claimed from GB939307673A external-priority patent/GB9307673D0/en
Priority claimed from GB939308033A external-priority patent/GB9308033D0/en
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of CZ8895A3 publication Critical patent/CZ8895A3/cs
Publication of CZ286889B6 publication Critical patent/CZ286889B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10211—Podoviridae
    • C12N2795/10222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Deriváty parathormonu a farmaceutické prostředky, které je obsahují
Oblast techniky
Vynález se týká variant parathormonu (parathyroidního hormonu, PTH) a farmaceutických prostředků, které je obsahují.
Dosavadní stav techniky
Je známo, že za vhodných podmínek má parathyroidní hormon (PTH) anabolický účinek na tvorbu kostí. V literatuře byl zveřejněn vysoký počet studií na zvířatech, dokládajících, že periodické podávání PTH vyvolává čisté zvýšení hmoty kostí a v důsledku toho bylo navrženo vyvinout PTH a fragmenty PTH jako činidla pro tvorbu kosti. Zájem se soustředil na N-koncové fragmenty přírodního PTH, například PTH(l-34), PTH(l-36) a PTH(l-38), u nichž se zdá, že vykazují relevantní aktivitu na kosti jako přírodní PTH o plné délce.
Nicméně N-koncové fragmenty přírodního PTH jsou chemicky nestabilní, v důsledku čehož nejsou zcela vhodné pro použití jako farmaceutické produkty.
Podstata vynálezu
Pro překonání výše uvedeného problému bylo zkoušeno eliminovat určitá místa chemické nestability ve fragmentech PTH prováděním příslušných substitucí konkrétních aminokyselinových zbytků. Tak bylo navrženo nahradit methioninové zbytky přítomné v PTH v polohách 8 a 18 zbytky neobsahujícími síru, pro odstranění míst potenciálně citlivých vůči oxidaci. Přihlašovatel dále zkoumal stabilitu N-koncových fragmentů PTH v roztoku a zjistil, že mezi další místa potenciální chemické nestability patří asparaginové zbytky v polohách 16 a 33. Bylo nicméně zjištěno, že analogy PTH, ve kterých byly přirozené aminokyselinové zbytky v těchto polohách potenciální chemické nestability vyměněny za „stabilní“ aminokyseliny, měly výrazně sníženou aktivitu ve srovnání s přírodním PTH a jeho N-koncovými fragmenty. V souladu s vynálezem přihlašovatel identifikoval další specifické aminokyselinové substituce v konkrétních polohách, jimiž byly získány produkty, které jsou nejen chemicky stabilní, ale rovněž vykazují účinnost dosahující nebo dokonce přesahující účinnost přírodního PTH a jeho N-koncových fragmentů.
V souladu s tím vynález popisuje sloučeniny vybrané ze skupiny zahrnující [Leu8, Gin18, Thr33, Ala34]hPTH(l-34)OH, [Leu8, Ala16, Gin18, Ala19, Thr33, Ala34]hPTH(l-34)OH, [Leu8, Ala16, Gin18, Thr33, Ala34]hPTH(l-34)OH, [Leu8, Asp10, Lys“, Gln18]hPTH(l-36)OH, [Leu8, Asp10, Lys11, Gin18, Thr33, Ala34]hPTH(l-34)OH, [Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gin18, Ala19]hPTH(l-36)OH, [Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gin18, Thr33, Ala34]hPTH(l-34)OH, [Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gln18]hPTH(l-36)OH, a [Leu8, Ala16, Gin18, Ala19]hPTH(l-36)OH, ve volné formě nebo ve formě soli nebo komplexu.
Termín „hPTH“ označuje lidský parathormon.
-1 CZ 286889 B6
Sloučeniny podle vynálezu jsou složeny z přirozených aminokyselin. „Přirozené aminokyseliny“ jsou v oboru dobře známé. Jsou uvedeny spolu se standardními zkratkami v publikaci U.S.P.T.O., Trademark Ofícial Gazette, publikované 15. května 1990, str. 33 až 46.
Přirozené aminokyseliny jsou uvedeny níže:
A Ala alanin
D Asp kyselina asparagová
E Glu kyselina glutamová
F Phe fenylalanin
G Gly glycin
H His histidin
I Ile isoleucin
K Lys lysin
L Leu leucin
M Met methionin
N Asn asparagin
Q Gin glutamin
R Arg arginin
S Ser serin
T Thr threonin
V Val valin
W Trp tryptofan
Y Tyr tyrosin
Sloučeniny podle vynálezu mohou být například ve volné formě, ve formě soli nebo ve formě jejich komplexů. Mohou vytvářet adiční soli s kyselinami například s organickými kyselinami, polymemími kyselinami a anorganickými kyselinami. Takové adiční soli s kyselinami zahrnují například hydrochloridy a acetáty. Komplexy se například vytvářejí ze sloučeniny podle vynálezu přidáním anorganických látek, například anorganických solí nebo hydroxidů, jako jsou soli vápníku a zinku, nebo/a přidáním polymemích organických látek.
Sloučeniny podle vynálezu lze připravit postupným způsobem buďto v roztoku nebo za použití postupu syntézy na pevné fázi nebo pomocí genového inženýrství.
Sloučeniny podle vynálezu lze vyrobit například následujícím způsobem, tak, že:
a) se odstraní alespoň jedna chránící skupina která je přítomná ve sloučenině podle vynálezu v chráněné formě, nebo
b) se navzájem spojí amidickou vazbou dva peptidové fragmenty, přičemž tyto peptidové fragmenty jsou takové, že se získá žádaná sloučenina se žádanou sekvencí aminokyselin, a poté se popřípadě provede bod a) postupu, a takto získané sloučeniny se izolují ve volné formě, ve formě soli nebo ve formě komplexu.
Body a) a b) lze provádět analogicky se známými způsoby, například jak jsou známé v oboru chemie peptidů, nebo jak jsou popsány v následujících příkladech. Pokud je to žádoucí, mohou být v těchto reakcích pro funkční skupiny, které se neúčastní reakce, použity chránící skupiny, které jsou vhodné pro použití v peptidech. Termín chránící skupina může zahrnovat též polymerní pryskyřici, která má funkční skupiny.
Sloučeniny podle vynálezu nebo jejich fragmenty lze rovněž připravit za použití genového inženýrství.
- 2 CZ 286889 B6
Sloučeniny podle vynálezu tak lze připravit například způsobem, při kterém je v bakteriálních buňkách exprimován fuzní protein obsahující N-koncový polypeptid genu 55 bakteriofága T4, který má na svůj C-konec navázaný žádaný polypeptid, kterým je sloučenina podle vynálezu nebo její fragment.
Polypeptid genu 55 může obsahovat úplný protein gp55 bakteriofága T4 (188 aminokyselinových zbytků), který popsali Gram, H. a Riiger, R., 1985, The EMBO Joumal, 4, (1), str. 257 264. Alternativně lze použít fragment, výhodně N-koncový fragment, proteinu gp55. Například lze použít fragment proteinu gp55 obsahující prvních 122 N-koncových aminokyselinových zbytků proteinu. Typicky však polypeptid genu 55 obsahuje alespoň prvních 25 N-koncových zbytků proteinu gp55.
Účelně fuzní protein gen 55-PTH též obsahuje štěpitelný spojovník mezi polypeptidem genu 55 a žádaným polypeptidem. Výhodně je štěpitelný spojovník chemicky štěpitelný a ještě výhodněji obsahuje sekvence aminokyselin Asp-Pro-Pro nebo Asn-Gly-Pro.
Výše uvedený fuzní protein obsahující N-koncový polypeptid genu 55 bakteriofága T4 a žádaný polypeptid navázaný na jeho C-konec, kóduje nukleotidová sekvence, kterou je výhodně DNAsekvence vhodná pro expresi v bakteriích. Sekvence typicky obsahuje mezi kódujícími sekvencemi genu 55 a žádaného polypeptidu nukleotidy kódující štěpitelný spojovník.
Tuto DNA-sekvenci kódující fuzní protein lze začlenit do bakteriálního expresivního vektoru.
Expresivní vektor typicky obsahuje, kromě kódující sekvence fúzního proteinu, příslušné sekvence kontrolující expresi, včetně vhodného promotoru, operátoru a místa vázajícího se na ribozom, a další vhodné regulační sekvence. Obvykle expresivní vektor obsahuje též jeden nebo několik selektabilních markérů.
Může být použit libovolný vhodný promotor, jako je promotor TrpE, λΡΙ, ÁPr, lac nebo Tac. Výhodně je promotorem promotor bakteriofága T7 a expresivním vektorem je plazmid. Pro expresi v Escherichia coli lze použít vektor odvozený od plazmidu R1 nebo Col-El. Například lze použít expresivní vektor pET 17B, který lze získat od firmy Novagen, nebo podobné expresivní vektory.
Kódující sekvenci fúzního proteinu nebo expresivní vektor, jak jsou popsány výše, lze použít k transformaci bakteriální hostitelské buňky. Lze použít libovolného vhodného bakteriálního hostitele, i když výhodným hostitelem je Eschirichia coli. Například lze použít kmen Escherichia coli BL21 (DE3) Lys E a podobné kmeny.
Výhodně se fůzní protein akumuluje v hostitelských buňkách ve formě nerozpustných inkluzních tělísek, a tím usnadňuje izolaci fúzního proteinového produktu z buněk. Pro izolaci žádaného polypeptidového produktu z fúzního proteinu se protein inkluzních tělísek solubilizuje a žádaný polypeptidový produkt se odštěpí od fúzního proteinu. Lze použít libovolný vhodný postup solubilizace, včetně ošetření kyselinou, například při přibližně pH 2 až 4, výhodně kyselinou při přibližně pH 2,5, nebo ošetření denaturačním činidlem, například mírným denaturačním činidlem jako je guanidin-hydrochlorid. Kromě toho může být nutné odstranit z produktu, který zbude po štěpení, jeden nebo několik nežádoucích N-koncových aminokyselinových zbytků.
Způsob výroby žádaného polypeptidu v bakteriálním hostiteli tak výhodně zahrnuje:
vyvolání toho, že transformované bakteriální hostitelské buňky, jak jsou definovány výše, exprimují fuzní protein ve formě inkluzních tělísek,
-3CZ 286889 B6 izolaci inkluzních tělísek, solubilizaci inkluzních tělísek, a odštěpení žádaného polypeptidu od fúzního proteinu.
V případě derivátů PTH není normálně nutné provádět pečlivě řízené postupy denaturace a renaturace pro získání derivátů PTH v aktivní formě, například vykazujících aktivitu podobnou 10 PTH. Tyto produkty lze získat v aktivní formě pouhou neutralizací kyselých podmínek použitých pro solubilizaci. Solubilizaci a štěpení fuzního proteinu lze provádět v jediném kroku.
Za použití způsobů a vektorů uvedených výše bylo zjištěno, že je možné dosáhnout vysokých koncentrací derivátů PTH. U Escherichia coli bylo zjištěno, že až přibližně 50 % celkového 15 exprimovaného proteinu je žádaným fúzním proteinem. Fúzní protein též tvoří inkluzní tělíska, která lze snadno oddělit od jiného materiálu buněk. Navíc jsou inkluzní tělíska často tvořena alespoň přibližně 90 % žádaného fuzního proteinu, což může výrazně snížit nutný rozsah purifikace. Dále exprese derivátu PTH ve formě fúzního proteinu může podstatně snížit endogenní úpravu (processing) polypeptidu v bakteriálních buňkách, což umožňuje získání homogenních 20 produktů.
Výhodně štěpitelný spojovník obsahuje chemicky štěpitelné aminokyseliny sousedící sNkoncem žádaného polypeptidu, aby bylo možno odštěpit žádaný polypeptid od fúzního proteinu jednoduchými chemickými způsoby. Výhodně žádaný polypeptid neobsahuje chemicky štěpitel25 né skupiny.
Výhodné chemicky štěpitelné spojovníky obsahují aminokyseliny Asp-Pro-Pro nebo Asn-GlyPro. Vazby Asp-Pro nebo Asn-Gly mohou být chemicky štěpeny za použití kyselých podmínek, například kyseliny mravenčí (normálně přibližně pH 2,5), respektive hydroxylaminu. Dipeptidy 30 Pro-Pro nebo Gly-Pro, které zůstávají na N-konci žádaného polypeptidu lze poté odstranit za použití vhodně dipeptidyl-peptidázy. Lze například použít dipeptidyl-peptidázu EC 3.4.14.5 z L. lactis X-Pro. Tuto peptidázu popsali Nardi a kol., 1991, Applied and Environmental Microbiology, 57, str. 45 až 50.
Žádaný polypeptid lze po odštěpení z fúzního proteinu purifikovat. Lze použít techniky purifikace pomocí vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Purifikaci lze provádět před odstraněním jakýchkoli nežádoucích N-koncových aminokyselinových zbytků.
Přípravu sloučenin podobných sloučeninám podle vynálezu výše uvedeným způsobem dále 40 ilustrují příklady 306 až 312, které odkazují na sekvence uvedené dále v části Zobrazení sekvencí, ve které SEQ ID č. 1 představuje aminokyselinovou sekvenci a odpovídající DNAsekvenci zkráceného fúzního proteinu gp55-Asp-Pro-Pro-hPTH(l-38)OH, jak je klonován do plazmidu pET17B, a SEQ ID č. 3 znázorňuje aminokyselinovou sekvenci a odpovídající DNAsekvenci fúzního proteinu gp55-Asn-Gly-Pro-hPTH(l-38)OH o plné délce, jak je klonován do 45 plazmidu pET17B.
Následující příklady blíže ilustrují vynález, přičemž se týkají sloučenin podle vynálezu a sloučenin jim podobných.
V některých sloučeninách podobných sloučeninám podle vynálezu, které jsou uvedeny v příkladech, mohou být přítomny rovněž nepřirozené aminokyselinové jednotky. Termín „nepřirozená aminokyselinová jednotka“ označuje aminokyselinovou jednotku, která není geneticky kódována. Mezi příklady nepřirozených aminokyselinových jednotek patří například D-izomery
-4pos1 ipným způsobem na nosiči představovaném pryskyřicí na bázi ní i-aminoskupiny se použije terc.butyloxykarbonylová skupina iníc řetězců se chrání následujícími skupinami uvedenými vzávoroxyl arbonyl), Ser(benzyl), Thr(benzyl), Glu(benzyl), Asp(benzyl), přirozených α-aminokyselř Ar^tosyl), a Trp(HCO). Ostatní zbytky se nechají nechráněné, aminoisomáselná kyselina) ri aminoadipová kyselina), /M>o(l«>lysfy«n-<livinylbenzen) (- MBHA-pryskyřice)
Acp (6-aminokaprová cyklu zpracován,, sestavujícím. z kroku (1) az (7):
Ala), alle (alloisoleucin), hi ti lová kyselina), Dpr (2,3—di n , .... .
, , J , octe/a v dichlormethanu hydroxyprolin, Sar (sarcos i aminokyselinové jednotky, dimethyIformamidt.
(N -ethylasparagin).
V dále uvedených příklad terc.butyloxykarbonyl, Fm = 2,2,5,7,8-pentamethylchror -< pentan-l-karboxylová kys ia cyklohexylalanin, tBu = ter t
SEQ ID č. 11 znázorňuje aminokyselinovou sekvenc hPTH(l-38). Příklady 1, 2.
61, 76-80, 82, 179, 185,
ID č. 11, přičemž jsou zrně závorkách. Příklady 12, 13 ir
I 6 CZ 286889 B6 é
- 85, 165- 178, 180 - l[jn, j Kk jsou uvedeny výše, Aib (aminoisomáselná kyselina), bAib (3257-266, 268-279, 282 -χ (η0Γν3|{ηχ β-Ala, Aad (2-aminoadipová kyselina), bAad (3τι-'νι změně”é amm°^yse’Abu^(2-aminomáselná kyselina), Gaba (λ-aminomáselná kyselina), ςριΆη “ i(2,4-diaminomáselná kyselina), TMSA (trimethylsilylh aorleucill)> terc.Leu, Cit (citrulin), Om, Dpm (2,2'-diaminopimeranatýc závor ac . nopropionová kyselina), a- nebo β-Nal, Cha (cyklohexyl-Ala), sin) i podobně, cyklické aminokyselinové jednotky a Na-alkylované Příklady provedení vynález’ nal říklad MeG1Y (N“-methylglycin), EtGly (N“-ethylglycin), EtAsn
Příklad 1 deci provedení vynálezu se používají následující zkratky: Boc = noc - 9-fluorenylmethoxykarbonyl, Trt - trityl, Tos = tosyl, Pmc N“-isopropylhPTH(l-34)’mar,-6-sulfonyl, Ip = isopropyl, For=formyl, Cpe = 1-aminocyklo'self a, Cpp = 1-aminocyklopropan-l-karboxylová kyselina, Cha = Tento peptid se vytvoří [Γε·^ΐ|^’ ~ methyl.
polystyrenu. Pro chráněr t-, , , .
a funkční skupiny postra„r- an mokysebnovou sekvenc, hPTH(l-34), SEQ ID c. 12 zobrazuje kách· T v^O-chlorhenTvIn“1 hl TH(l-36), SEQ ID č. 13 představuje aminokyselinovou sekvenci mJ>,' *0-5 Vň
187 191 - 193, 226, 230, 237, 239, 256 a 289 jsou založeny na SEQ (0 7 mmol/e) se podrobí na’ V 19, 31 - 35, 38, 39, 42 46, 48, 50, 52, 55, 59, 60, 62 - 71, 81, S) P 184 186,188- 190, 194-225,227-229, 231 -236, 238, 240-255, (1) dichlormethan _ 2 8, 290 - 300 a 302 - 304 jsou založeny na SEQ ID č. 12, přičemž ςηο/, r ♦ ·η -line yé jednotky a jejich polohy uvedeny v hranatých závorkách, rn íi 3 triflUOrC 17,^5, 26, 56, 72 - 75, 81, 86 - 164, 267, 280 a 281 jsou založeny na (3) dichlormethan . . . , . . ,. ---1.1, Ϊ (4) 10°/ diisopropylethyl'jS°i zmenene aminokyselinové jednotky a jejich polohy uvedeny (5) dimethylformamid zu )NI 2 (6) předem připravený symetrický anhydrid (1,4 mmol na g výchozí pryskyřice) terc.butyloxykarbonylaminokyseliny v dimethylformamidu (7) dimethylformamid
Objemy promývacích kapalin a činidel činí od 5 do 20 ml na gram výchozí pryskyřice. Každý krok se opakuje třikrát, kolikrát je to nutné, aby se dosáhlo buďto úplné reakce pryskyřice (kroky 2, 4, 6) nebo úplného odstranění předchozího činidla z pryskyřice (kroky 1, 3, 5, 7). Po každém cyklu se odeberou vzorky pryskyřice a zkontroluje se u nich dokončení kondenzační reakce kolorimetrickým testem pro stanovení zbytkových aminoskupin za použití ninhydrinu.
Symetrické anhydridy terc.butyloxykarbonylaminokyselin se připraví bezprostředně před použitím reakcí 2,8 mmol terc.butyloxykarbonylaminokyseliny na g pryskyřice a 1,4 mmol dicyklohexylkarbodiimidu na g pryskyřice v dichlormethanu, obsahujícím dimethylformamid v množstvích dostatečných pro úplné rozpuštění terc.butyloxykarbonylaminokyseliny. Směs se zfiltruje, k filtrátu, který se zahustí odpařením těkavých složek při teplotě nepřekračující 15 °C, se přidá další dimethylformamid a výsledný roztok se použije v kroku (6).
Cyklus reakcí (1) až (7) se opakuje pro každý aminokyselinový zbytek kvůli získání sekvence sloučeniny uvedené v názvu, s výjimkou v případě Boc-Gln-OH a Boc-Arg(tosyl)-OH, které se kondenzují v kroku (6) jako jejich předem připravené estery s 1-hydroxybenzotriazolem v dimethylformamidu.
Na pryskyřici s navázaným úplně vytvořeným peptidem se nechá dvakrát působit po dobu 1 hodiny 20 ml 5% thiofenolu v dimethylformamidu při teplotě místnosti a poté se promyje dimethylformamidem, methanolem a dichlormethanem. Pryskyřice s navázaným peptidem se poté znovu podrobí krokům (1) až (5), následně se přidá 0,5ml acetonu, 84 mg natriumkyanborohydridu a 0,2 ml kyseliny octové ve 20 ml dimethylformamidu na gram pryskyřice. Po 16 hodinách při teplotě místnosti se pryskyřice promyje dimethylformamidem a dichlormethanem a vysuší.
Pryskyřice s navázaným peptidem se ošetří kapalným chlorovodíkem, dimethylsulfidem, pkresolem a ethan-l,2-dithiolem podle tzv. „low-high“ postupu, který je popsán například v Intemational Joumal of Peptide and Protein Research, svazek 26, str. 262-273 (1985). Po odstranění těkavých složek a promytí ethylacetátem se zbytek extrahuje několika dávkami 1% kyseliny octové, zfiltruje a filtrát lyofilizuje. Lyofilizovaný produkt se purifikuje opakovanou chromatografií s obrácenými fázemi na sloupci C18-silikagelu za použití gradientově eluce s gradientem acetonitrilu ve 2% kyselině fosforečné nebo ve 20mM tetramethylamoniumfosfátu. Frakce obsahující čistou sloučeninu se smíchají, zfiltrují přes slabě bazický iontoměnič v acetátovém cyklu a filtrát se pro získání sloučeniny uvedené v názvu lyofilizuje.
Hmotová spektrometrie (iontový spray); 4160
Příklad 2 [Lys (NE-isopropyl)2W7]hPTH(l-34) NH?
Peptid se vytvoří jak je popsáno v příkladu 1 s tím, že se použije Lys(9-fluorenylmethoxykarbonyl) pro začlenění v poloze 13 a 9-fluorenylmethoxykarbonyl-Ser(terc.butyl) v koncové poloze 1.
-6CZ 286889 B6
Na pryskyřici s navázaným úplně vytvořeným peptidem se nechá dvakrát působit po dobu 1 hodiny 20 ml 5% thiofenolu v dimethylformamidu při teplotě místnosti a poté se promyje dimethylformamidem, methanolem a dichlormethanem. Suchá pryskyřice se ošetří kapalným fluorovodíkem, jak je popsáno v příkladu 1. Odštěpený produkt (350 mg) se suspenduje ve směsi 5 ml methanolu, 5 ml fosfátového pufru o pH = 5,0, 48 mg natriumkyanborohydridu a 0,28 ml acetonu. Po 16 hodinách při teplotě místnosti se reakční směs zfiltruje a filtrát se odpaří. Odparek se suspenduje ve 20% piperidinu v dimethylformamidu po dobu 15 minut, směs se naředí dvacetinásobným objemem etheru a zfiltruje. Zbytek se rozpustí ve 100 ml vody, přidáním kyseliny octové se upraví pH na hodnotu 3, směs se zfiltruje a filtrát lyofilizuje. Lyofilizát se purifikuje chromatograflí s obrácenými fázemi na sloupci C18-silikagelu za použití gradientově eluce s gradientem acetonitrilu ve 2% kyselině fosforečné. Frakce obsahující čistou sloučeninu se smíchají, zfiltrují přes slabě bazický iontoměnič v acetátovém cyklu a filtrát se pro získání sloučeniny uvedené v názvu lyofilizuje.
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4205,6
Příklad 3
Na-isopropyl [Lys (NMsopropyl)1 W7]hPTH(l-38)-OH
a) Syntéza peptidu na pevné fázi
Peptid se vytvoří postupným způsobem na nosiči představovaným pryskyřicí na bázi polystyrenu. Pro chránění α-aminoskupiny se použije 9-fluorenylmethoxykarbonylová skupina a funkční skupiny postranních řetězců se chrání následujícími skupinami uvedenými v závorkách: Asp(Oterc.butyl), Glu(O-terc.butyl), His(trityl), Lys(terc.butyloxykarbonyl), Asn(trityl), Gln(trityl), Arg(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl) a Ser(terc.butyl). Ostatní aminokyseliny se nechají nechráněné.
9-fluorenylmethoxykarbonyl-Gly esterifikovaný na 4-hydroxymethylfenoxymethyl-ko(polystyren-divinylbenzen) (s obsahem 1 % divinylbenzenu) (0,5 mmol / g) se použije jako výchozí materiál pro postupnou syntézu na pevné fázi, která sestává z opakovaných cyklů odstranění chránící skupiny z alfa-aminoskupiny, promytí, kondenzace (navázání nové aminokyseliny) a promytí. Ke kondenzaci se použije tří- až pětinásobný nadbytek 9-fluorenylmethoxykarbonylaminokyselin jako předem připravených esterů s 1-hydroxybenzotriazolem za použití diisopropylkarbodiimidu, 9-fluorenylmethoxykarbonyl-Arg(2,2,5,7,8-pentamethyl-chroman-6sulfonyl), 9-fluorenylmethoxykarbonyl-Asn(trityl) a 9-fluorenylmethoxykarbonyl-Gln(trityl) se kondenzují jako symetrické anhydridy za použití diisopropylkarbodiimidu. Po úplném vytvoření peptidového řetězce se chránící skupina Ser1, kterou je 9-fluorenylmethoxykarbonylová skupina, odstraní pomocí 20% piperidinu v dimethylformamidu. Odštěpení peptidu z polystyrénové pryskyřice, a odstranění všech chránících skupin postranních řetězců se provede tak, že se na pryskyřici s navázaným peptidem nechá po dobu tří hodin při teplotě místnosti působit směs 10% ethandithiolu, thioanisolu, thiokresolu a vody v 90% kyselině trifluoroctové. Částice pryskyřice se odfiltrují a promyjí kyselinou trifluoroctovou. Ze smíchaných filtrátů se vysráží produkt přidáním etheru, odfiltruje se a vysuší. Produkt se purifikuje chromatograficky na sloupci C18— silikagelu za použití gradientově eluce s gradientem acetonitrilu ve 2% kyselině fosforečné ve vodě. Frakce obsahující čistý produkt se oddělí, zfiltrují přes anex (Biorad, AG 4-X4, 100— 200 mesh, v acetátovém cyklu) a pro získání hPTH(l-38)-OH se provede lyofílizace.
-7CZ 286889 B6
b) Alkylace
V 1,2 ml methanolu, 1,2 ml fosfátového pufru (Měrek, č. 9887 upravený na pH 5,0), 45 mg (716 mmol) natriumkyanborohydridu (s molámí hmotností 62,84 g / mol) a 0,8 ml (11 mmol) acetonu (s molámím objemem 73,52 ml / mol) se rozpustí 40 mg (9 pmol) hPTH(l-38)-OH (s molámí hmotností 4458,2 g / mol). Reakce se sleduje pomocí vysoceúčinné kapalinové chromatografíe s obrácenými fázemi (RP-HPLC) na sloupci C18-silikagelu a skončí po 15 hodinách při teplotě místnosti. Reakční směs se naředí vodou a chromatografuje na sloupci C18-silikagelu za použití gradientově eluce s gradientem acetonitrilu ve 2% kyselině fosforečné ve vodě. Frakce obsahující čistou sloučeninu se oddělí, zfíltrují přes anex (v acetátovém cyklu) a lyofilizují, čímž se získá sloučenina uvedená v názvu ve formě polyacetátu a polyhydrátu.
[oc]d2° = -5,7° (c = 0,317 v 95% kyselině octové)
Hmotové spektrometrie (iontový spray): 4626
Příklad 4
N“-methyl [Ala’]PTH(l-38}-OH
Peptidový řetězec se vytvoří stejným způsobem jako v příkladu 3a. V poloze 1 je k pryskyřici s navázaným peptidem místo 9-fluorenylmethoxykarbonyl-Ser(terc.butyI)-OH kondenzována nepřirozená aminokyselina 9-fluorenylmethoxykarbonyl-N“-methyl-Ala-OH. Odštěpení, odstranění chránících skupin a purifíkace se provádí jako v příkladu 3a.
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4455,91
Příklad 5 [Ala',Ala3,Leu8,Gln13,Ala16,Gln18,AIal9,Phe23,His25,His26,Leu27,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Tento peptid se připraví analogicky s postupem uvedeným v příkladu 3a. Místo 9-fluorenylmethoxykarbonyl-Gly esterifíkovaného na 4-hydroxymethylfenoxymethyl-ko(polystyrendivinylbenzen) se použije příslušná 9-fluorenylmethoxykarbonylaminokyselina, například 9fluorenylmethoxykarbonyl-Ala, 9-fluorenylmethoxykarbonyl-Phe, 9-fluorenylmethoxykarbonyl-D-AIa, 9-fluorenylmethoxykarbonyl-D-Phe, atd. Chrání se též další funkční skupiny postranních řetězců, a to zbytky uvedenými v závorkách: Thr(terc.butyl), Trp(terc.butyloxykarbonyl) a Tyr(terc.butyl).
Opakováním postupu popsaného v příkladech 3 a 5, avšak za použití příslušných výchozích materiálů, se získají následující sloučeniny:
Příklad 6 [Leu8,Asp‘°,Ala16,Gln18,Thr33]hPTH(l-34)OH
-8CZ 286889 B6
Příklad 7 [Ile']hPTH(l-38)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4484
Příklad 8 [Ala’,Abu2]hPTH( 1-3 8)OH
Hmotové spektrometrie (iontový spray): 4428
Příklad 9 [Ala1 ,Nva2]hPTH( 1-3 8)OH
Hmotové spektrometrie (iontový spray): 4442
Příklad 10 [Ala^Ile^hPTHa-SSjOH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4456
Příklad 11 [Ala1,Ala3,Leu8,Gln13,Ala’6,Gln18,AlaI9,His26,Leu27,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 12 [N-MeAla']hPTH(l-36)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4286
Příklad 13 [Ala’,ala3,Leu8,Gln18]hPTH(l-36)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4235
Příklad 14 [Thr^hPTHíl-SSjOH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4472
-9CZ 286889 B6
Příklad 15 [Leu‘]hPTH(l-38)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4484
Příklad 16 [Abu']hPTH(l-38)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4456
Příklad 17 [Gaba^hPTHÍl-SSjOH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4456
Příklad 18 [Leu',Lysll,Glnl8]hPTH(l-36)OH
Příklad 19 [Leu8,Gln16,Aspl7,Leul8,Arg19,Arg22]hPTH(l-36)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4347
Příklad 20 [Leu8,Glnl8,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4007
Příklad 21 [Leu8,Alal6,Gln18,AlaI9,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 3906
Příklad 22 [Leu8,Ala13,Gln18,Gln26,Phe27,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 23 isopropyl-[Leu8,Lys(isopropyl)13,GIn18,Lys(isopropyl)26’27,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4175
-10CZ 286889 B6
Příklad 24 isopropyl[Leu8,Alal3,Gln18,Gln26,Phe27,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 25 [Gln16]hPTH(l-38)OH
Příklad 26 [Ser14]hPTH(l-38)OH
Příklad 27 [Ala*,Ala3,Leu8,Gln13,Alal6,Gln18,Ala19,His25,His26,Leu27,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 28 [Ala1,Ala3,Leu8,Gln13,Alal6,Gln18,Ala19,Gln26,Phe27,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 29 [Leu8,AlaI6,Gln18,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 3965
Příklad 30 [Leu8,Gln18,Ala29,Glu30,Ile31]hPTH(l-34)OH
Příklad 31 [Leu8,Asp10,Lys,Gln18]hPTH(l-36)OH
Příklad 32 [Leu8,Asp10,Lys11,SerI4,Ile15,Gln16,Asp17,Leu18,Arg19]hPTH(l-36)OH
Příklad 33 [Leu8Asp10,LysnLeuI8]hPTH(l-36)OH
Příklad 34 [Leu8,Gln16,Asp17,Leu18,Argl9]hPTH(l-36)OH
-11CZ 286889 B6
Příklad 35 [Leu8,Asp’°,Lysll,Ala17,Leu18]hPTH(l-36)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4252
Příklad 36 [Leu8,Gln16,Asp17,Leu18,ArgI9,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 37 [Leu8,Asp10,Lysn,Glnl8,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4022
Příklad 38 [Leu8,A!a16,Asp17,Leu18,Ala19]hPTH(l-36)OH
Příklad 39 [Leu8,Asp10,Ala16,Asp17,LeuI8,Alal9]hPTH(l-36)OH
Příklad 40 [Leu8,Glnl8,Arg22,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 41 [Leu8,Asp10,Lys,Glnl6,Asp17,Leu18,Arg19,Thr33,AIa34]hPTH(l-34)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4077
Příklad 42 [Leu8,Asp'°,Lys11,Ala16,Glnl8,Ala19]hPTH(l-36)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4181
Příklad 43 [Leu8,Ala16,Asp17,Gln18,AlaI9]hPTH(l-36)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4193
-12CZ 286889 B6
Příklad 44 [Leu8,Ala16,Ala17,Gln18,AlaI9]hPTH(l-36)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4149
Příklad 45 [Leu8,Ala17,Gln18,Ala19]hPTH(l-36)OH
Příklad 46 [Leu8,Ala17,Gln18,Ala19,Arg22]hPTH(l-36)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4219
Příklad 47 [Leu8,Ala17,Gln18,AlaI9,Arg22,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 3960
Příklad 48 [Leu8,Gin18]hPTH( 1 -3 6)OH
Příklad 49 [Leu8,AspI0,Lysll,Alal6,Gln18,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 3980
Příklad 50 [Leu8,Aspl0,Lysll,Alal6,Gln18]hPTH(l-36)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4240
Příklad 51 [Leu8,Asp10,LysI1,AlaI6,Gln18,Ala19,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 3923
Příklad 52 [Leu8,Asp10,Ala16,Gln18]hPTH(l-36)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4225
-13CZ 286889 B6
Příklad 53 [Leu8,Asp10,Lys11,Ala16,Gln18,Ala19,Thr33]hPTH(l-34)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 3999
Příklad 54 [Leu8,Gln13,Ala16,Gln18,Ala19,His26,Leu27,Thr33]hPTH(l-34)OH
Příklad 55 [Leu8,Ala16,Gln18,Ala19,Arg22]hPTH(l-36)OH
Příklad 56 [Ile,5]hPTH(l-38)OH
Příklad 57 [Leu8,Gln13,Ala16,Gln18,Ala19,Arg22,His26,Leu27,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 58 [Leu8,GlnI3,Ala16,Gln18,Argl9,His26,Leu27,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 59 [Leu8,Ser13,Ala16,Gln'8,Ala’9,Arg22]hPTH(l-36)OH
Příklad 60 [Leu8,Ala13,Ala16,Gln’8,Ala19,Arg26,Arg27]hPTH(l-36)OH
Příklad 61 [Leu8,Glnl3,Ala16,Glnl8,Ala19,His26,Leu27,Arg33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 62 [Leu8,Alal6171819]hPTH(l-36)OH
Příklad 63 [Leu8,Ala13,Ala16,Glnl8,Ala19,Gln26,Phe27]hPTH(l-36)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4127
-14CZ 286889 B6
Příklad 64 isopropyl-[Leu8,AlaI3,Ala16,Gln18,Ala19,Gln26,Phe27]hPTH(l-36)OH
Příklad 65 isopropyl-[Leu8,Lys(isopropyl)13,Ala16,Gln18,Ala19,Lys(isopropyl)26’27]hPTH(l-36)OH
Příklad 66 [Leu8,Ala16,GlnI8,Ala19]hPTH(l-36)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4166
Příklad 67 isopropyl-[Leu8,Lys(isopropyl)13,Alal6,AlaI7,Alal8,Ala19,Lys(isopropyl)26’27]hPTH(l-36)OH
Příklad 68 [Aib3,Gln18[hPTH(l-36)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4283
Příklad 69 isopropyl-[Leu8,Asp10,Lys(isopropyl)III3’26’27,Gln18]hPTH(l-36)OH
Příklad 70 isopropyl-[Leu8,Serl3,Ala16,Glnl8,Alal9,Arg22,Lys(isopropyl)26’27]hPTH(l-36)OH
Příklad 71 [Leu8,Tyr18[hPTH(l-36)OH
Příklad 72 [Ser33]hPTH(l-38)OH
Příklad 73 [Thr33]hPTH(l-38)OH
Příklad 74 [Leu33]hPTH(l-38)OH
-15CZ 286889 B6
Příklad 75 [Gly33]hPTH(l-38)OH
Příklad 76 [Leu8,His10,Gln18,Arg22,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 77 [Leu8,Gly10,Gln18,Arg22,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 78 [Leu8,Glu10,Gln18,Arg22,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 79 [Leu8,Thr10,Gln18,Arg22,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 80 [Leu8,Gln10,Gln18,Arg22,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 81 [Gln33]hPTH(l-38)OH
Příklad 82 [Leu8,Tyr10,Gln18,Arg22,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)OH
Příklad 83 [1-aminocyklopentan-l-karboxylová kyselina1, Leu8, Ala16, Gin18, Ala19]hPTH(l-36)OH
Příklad 84 [1-aminocyklopentan-l-karboxylová kyselina1, Leu8, Ala13-16, Gin18, Ala19, Arg26,27]hPTH( 1
36)OH
Příklad 85 [ 1 -am inocyklopentan-1 -karboxy lo vá kyselina3,Gin18]hPTH( 1 -3 6)OH
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4309
-16CZ 286889 B6
Příklad 86 [Arg12]hPTH(l-38)OH
Příklad 87 [Ser12]hPTH(l-38)OH
Příklad 88 [Cys13]hPTH(l-38)OH
Příklad 89 [Ile13]hPTH(l-38)OH
Příklad 90 [Asn13]hPTH(l-38)OH
Příklad 91 [Trp13]hPTH(l-38)OH
Příklad 92 [Asp13]hPTH(l-38)OH
Příklad 93 [Val13]hPTH(l-38)OH
Příklad 94 [Thr13]hPTH(l-38)OH
Příklad 95 [Ser13]hPTH(l-38)OH
Příklad 96 [Tyr,3]hPTH(l-38)OH
Příklad 97 [Met13]hPTH(l-38)OH
-17CZ 286889 B6
Příklad 98 [Gln13]hPTH(l-38)OH
Příklad 99 [LeuI3]hPTH(l-38)OH
Příklad 100 [Ala13]hPTH(l-38)OH
Příklad 101 [Gly13]hPTH(l-38)OH
Příklad 102 [Val14]hPTH(l-38)OH
Příklad 103 [Ala14]hPTH(l-38)OH
Příklad 104 [Lys14]hPTH(l-38)OH
Příklad 105 [Arg,4]hPTH(l-38)OH
Příklad 106 [Thr14]hPTH(l-38)OH
Příklad 107 [Ilel4]hPTH(l-38)OH
Příklad 108 [Tyrl4]hPTH(l-38)OH
Příklad 109 [Tyr15]hPTH(l-38)OH
-18CZ 286889 B6
Příklad 110 [Arg15]hPTH(l-38)OH
Příklad 111 [Val,5]hPTH(l-38)OH
Příklad 112 [Lys16]hPTH(l-38)OH
Příklad 113 [Ser16]hPTH(l-38)OH
Příklad 114 [Leu16]hPTH(l-38)OH
Příklad 115 [Ala,6]hPTH(l-38)OH
Příklad 116 [Gly16]hPTH(l-38)OH
Příklad 117 [Ala17]hPTH(l-38)OH
Příklad 118 [Metl7]hPTH(l-38)OH
Příklad 119 [Ile17]hPTH(l-38)OH
Příklad 120 [Ser19]hPTH(l-38)OH
Příklad 121 [Lys19]hPTH(l-38)OH
-19CZ 286889 B6
Příklad 122 [Leu”]hPTH(l-38)OH
Příklad 123 [AlaI9]hPTH(l-38)OH
Příklad 124 [TyrI9]hPTH(l-38)OH
Příklad 125 [Met19]hPTH(l-38)OH
Příklad 126 [His19]hPTH(l-38)OH
Příklad 127 [ValI9]hPTH(l-38)OH
Příklad 128 [Gly19]hPTH(l-38)OH
Příklad 129 [Pro19]hPTH(l-38)OH
Příklad 130 [Aspl9]hPTH(l-38)OH
Příklad 131 [Ile19]hPTH(l-38)OH
Příklad 132 [Vall9,Gln24]hPTH(l-38)OH
Příklad 133 [Arg19]hPTH(l-38)OH
-20CZ 286889 B6
Příklad 134 [Phe20]hPTH(l-38)OH
Příklad 135 [Ala21]hPTH(l-38)OH
Příklad 136 [Gly21]hPTH(l-38)OH
Příklad 137 [Phe2l]hPTH(l-38)OH
Příklad 138 [Leu21]hPTH(l-38)OH
Příklad 139 [Asn21]hPTH(l-38)OH
Příklad 140 [Gln2l]hPTH(l-38)OH
Příklad 141 [Ser21]hPTH(l-38)OH
Příklad 142 [Gly22]hPTH(l-38)OH
Příklad 143 [Leu22]hPTH(l-38)OH
Příklad 144 [His22]hPTH(l-38)OH
Příklad 145 [Ala22]hPTH(l-38)OH
-21CZ 286889 B6
Příklad 146 [Ile22]hPTH(l-38)OH
Příklad 147 [Val22]hPTH(l-38)OH
Příklad 148 [Ser22]hPTH(l-38)OH
Příklad 149 [Arg22]hPTH(l-38)OH
Příklad 150 [Arg26]hPTH(l-38)OH
Příklad 151 [Val27]hPTH(l-38)OH
Příklad 152 [Ile27]hPTH(l-38)OH
Příklad 153 [Leu27]hPTH(l-38)OH
Příklad 154 [Arg27]hPTH(l-38)OH
Příklad 155 [Ala27]hPTH(l-38)OH
Příklad 156 [Val28]hPTH(l-38)OH
Příklad 157 [Ile28]hPTH(l-38)OH
-22CZ 286889 B6
Příklad 158 [Pro1 2 3 4 5,Thr33]hPTH( 1-3 8)OH
Příklad 159 [Arg33]hPTH(l-38)OH
Příklad 160 [Pro33]hPTH(l-38)OH
Příklad 161 [Asp33]hPTH(l-38)OH
Příklad 162 [Ile33]hPTH(l-38)OH
Příklad 163 [Lys33]hPTH(l-38)OH
Příklad 164 [11 e3', Arg33] hPTH( 1-3 8)OH
Příklad 165 [1-aminocyklopentan-l-karboxylová kyselina1]hPTH(l-36)NH2
Peptid se vytvoří postupným způsobem na nosiči představovaném pryskyřicí na bázi polystyrenu. Pro chránění α-aminoskupin se použije 9-fluorenylmethoxykarboxylová skupina.
Funkční skupiny postranních řetězců se chrání následujícími skupinami uvedenými v závorkách: Arg(2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl), Asn(trityl), Asp(O-terc.butyl), Gln(trityl), Glu(O-terc.butyl), His(trityl), Lys(terc.butyloxykarbonyl), Ser(terc.butyl), Thr(terc.butyl), Trp(terc.butyloxykarbonyl) a Tyr(terc.butyl). Ostatní aminokyseliny se nechají nechráněné.
4-(2',4'-dimethoxyfenyl-9-fluorenylmethoxykarbonylaminokarbonyl)fenoxy-ko(polystyrendivinylbenzen), (0,4 mmol / g), které lze připravit například jak je popsáno v Tetrah. Letters, 28, 3787 - 3790 (1987) se podrobí následujícímu cyklu zpracování, sestávajícímu z kroků (1) až (5):
(1) dimethylformamid (2) 20% piperidin v dimethylformamidu (3) dimethylformamid (4) směs 1-hydroxybenzotriazolu, diisopropylkarbodiimidu a 9-fluorenylmethoxykarbonylalaninu (každý v množství 0,8 mmol na gram výchozí pryskyřice) (5) dimethylformamid
-23CZ 286889 B6
Objemy promývacích kapalin a činidel činí od 5 do 20 ml na gram výchozí pryskyřice.
V následujícím cyklu zpracování (1) až (5) je 9-fluorenylmethoxykarbonylalanin nahrazen 9fluorenylmethoxykarbonylvalinem, a takto se postupuje v každém cyklu, aby se na pryskyřici vytvořila správná sekvence aminokyselin sloučeniny uvedené v názvu.
Každý krok se opakuje tolikrát, kolikrát je to nutné, aby se dosáhlo buďto úplné reakce pryskyřice (kroky 2, 4) nebo úplného odstranění předchozího činidla nebo činidel z pryskyřice (kroky 3, 5). Po každém cyklu se odeberou vzorky pryskyřice a zkontroluje se u nich dokončení kondenzační reakce kolorimetrickým testem pro stanovení zbytkových aminoskupin za použití ninhydrinu.
Na konci syntézy se provede koncový cyklus obsahující pouze kroky (1) až (3) a pryskyřice s navázaným peptidem se promyje 2-propanolem, poté směsi methanolu a methylenchoridu v poměru 1 : 1 (objem / objem) a důkladně vysuší ve vakuovém exsikátoru.
g pryskyřice s navázaným peptidem se suspenduje ve 20 ml směsi trifluoroctové kyseliny, vody a 1,2-ethandithiolu v poměru 90 : 5 : 5 (objem / objem) po dobu 2 hodin při teplotě místnosti, částice pryskyřice se odfiltrují a promyjí malým objemem kyseliny trifluoroctové. Produkt se vysráží ze smíchaných filtrátů přidáním dvacetinásobného objemu etheru, odfiltruje se, promyje dalším etherem a vysuší. Zbytek se rozpustí ve 2% kyselině octové, roztok se nechá stát při teplotě místnosti po dobu 8 hodin a poté se provede lyofilizace. Lyofilizát se chromatografuje na sloupci C18-silikagelu za použití gradientově eluce s gradientem acetonitrilu ve 2% kyselině fosforečné. Frakce se kontrolují analytickou vysoceúčinnou kapalinovou chromatografií a ty z nich, které obsahují čistou sloučeninu se odeberou, zfiltrují přes anex vacetátovém cyklu a provede se lyofilizace, čímž se získá sloučenina uvedená v názvu jako polyacetát a polyhydrát.
9-fluorfenylmethoxykarbonyl-l-aminocykIopentan-l-karboxylovou kyselinu používanou při přípravě intermediální pryskyřice s navázaným peptidem lze připravit například jak popsali G. Valle a kol., 1988, v Can. J. Chem. 66: 2575 - 2582.
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4312
Příklad 166 [ 1—( 1-aminocyklopropan-l-karboxylová kyseliny)]hPTH( 1-36)NH2
Tento peptid se připraví analogicky s postupem popsaným v příkladu 165. 9-fluorenylmethoxykarbonyl-l-aminocyklopropan-l-karboxylovou kyselinu používanou při přípravě intermediální pryskyřice s navázaným peptidem lze připravit například jak popsali M. Crisma a kol. (1989) v Int. J. Biol. Macromol. 11: 345 - 352.
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4283
Opakováním postupu popsaného v příkladu 165, ale za použiti příslušných výchozích materiálů, se získají následující sloučeniny:
Příklad 167 [D-Pro']hPTH(l-36)NH2
-24CZ 286889 B6
Příklad 168 [Nva‘]hPTH(l-36)NH2
Příklad 169 [NMeSer']hPTH(l-36)NH2
Příklad 170 [indol-2-karboxylová kyselina’]hPTH(l-36)NH2
Příklad 171 [indol-3-karboxylová kyselina’]hPTH( 1-36)NH2
Příklad 172 [pyridin-3-karboxylová kyselina']hPTH( 1-36)NH2
Příklad 173 [pyridin-2-karboxylová kyselina']hPTH( 1 -36)NH2
Příklad 174 [hexahydropyridazin-3-karboxylová kyselina']hPTH(l-36)NH2
Příklad 175 [morfolin-2-karboxylová kyselina’]hPTH( 1-36)NH2
Příklad 176 [Pro']hPTH(l-36)NH2
Příklad 177 [Leu’]hPTH(l-36)NH2
Příklad 178 [Ile’]hPTH(l-36)NH2
Příklad 179 [Thrn,Ala34]hPTH( 1-34)NH2
-25CZ 286889 B6
Příklad 180 [Nva8]hPTH(l-36)NH2
Příklad 181 [Gln18]hPTH(l-36)NH2
Příklad 182 [Tyr18]hPTH(l-36)NH2
Příklad 183 [Lys18]hPTH(l-36)NH2
Příklad 184 [Alal8]hPTH(l-36)NH2
Příklad 185 [Phe23,His25,His26,Leu27]hPTH(l-34)NH2
Příklad 186 [Phe23]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4247
Příklad 187 [Phe23,His25,His26,Leu27,Ile28,Ala29,Glu30,Ile31,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 3934
Příklad 188 [Ala29]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4248
Příklad 189 [Ala34]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4210
-26CZ 286889 B6
Příklad 190 [Gln25]hPTH(l-36)NH2
Příklad 191 [Leu8,Asp10,Lysll,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)NH2
Příklad 192 [AlaI,His5,Leu8,Asp10,Lys11,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)NH2
Příklad 193 [Ser14,Ile15,Gln16,Asp17,Leu18,Arg19,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)NH2
Příklad 194 [D-Phe34,D-Ala36]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4290
Příklad 195 [Ala3]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4271
Příklad 196 [D-Ser3]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4290
Příklad 197 [D-Glu4]hPTH(l-36)NH2)
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4290
Příklad 198 [D-His9]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4286
-27CZ 286889 B6
Příklad 199 [Ala'°]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4243
Příklad 200 [D-Asn10]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 201 [Ala12]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4299
Příklad 202 [Gln13]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4287
Příklad 203 [His13]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4296
Příklad 204 [Leu,3]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4371 Příklad 205 [Ala13]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4228
Příklad 206 [AlaI3,Gln26,Phe27,D-Phe34,D-Ala36]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4249
-28CZ 286889 B6
Příklad 207 [Ala14]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4219
Příklad 208 [D-His14]hPTH( 1-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 209 [D-Asn16]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4284
Příklad 210 [Ala17]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4270
Příklad 211 [D-Ser17]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 212 [Ala19]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4228
Příklad 213 [D-Glul9]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 214 [Ala2l]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4257
-29CZ 286889 B6
Příklad 215 [Ala22]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4227
Příklad 216 [Gln26]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4287
Příklad 217 [Nle26]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4271
Příklad 218 [D-Lys26]hPTH( 1-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 219 [Nle8,I8,27]hPTH(l-36)NH2
Příklad 220 [His27]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4294
Příklad 221 [Phe27]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4304
Příklad 222 [Nle27]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4271
-30CZ 286889 B6
Příklad 223 [Asn27]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4271
Příklad 224 [Ala27]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4228
Příklad 225 [D-Gln29]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4289
Příklad 226 [D-Asp30]hPTH( 1 -34)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4118
Příklad 227 [Ala30]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4241
Příklad 228 [D-Val31]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4290
Příklad 229 [Ala31]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4258
Příklad 230 [Lys32]hPTH(l-34)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 3832
-31CZ 286889 B6
Příklad 231 [D-His32]hPTH( 1-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 232 [Ala32]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4219
Příklad 233 [S-Asn33]hPTH( 1-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 234 [Ala33]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4210
Příklad 235 [NMePhe34]hPTH( 1-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4301
Příklad 236 [D-Asp30]hPTH( I-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4290
Příklad 237 isopropyl-[Nle818Lys(isopropyl)13’26’27,D-Asn33,D-Phe34]hPTH(l-34)NH2
Příklad 238 isopropyl-[Nle8’18’27,Lys(isopropyl)13’26]hPTH(l-36)NH2
Příklad 239 [Nle8,18,D-Asn33,D-Phe34]hPTH(l-34)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4080
-32CZ 286889 B6
Příklad 240 [Lys(isopropyl)13]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4331
Příklad 241 propargyl-[A']hPTH( 1-36)NH2
Příklad 242 [Ala°]hPTH(l-36)NH2
Příklad 243 [Pro°]hPTH(l-36)NH2
Příklad 244 acetyl-hPTH(l-36)NH2
Příklad 245 [HyPro']hPTH(l-36)NH2
Příklad 246
N-dimethy l-[ Ala1 ]hPTH( 1 -3 6)NH2
Příklad 247 [D-Ser']hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 248 [Lys(For)']hPTH( 1-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4356
Příklad 249 [D-glycerová kyselina1 ]hPTH( 1-36)NH2
Příklad 250 [Asn‘]hPTH(l-36)NH2
-33CZ 286889 B6
Příklad 251 [4-aminobenzoová kyselina’]hPTH( 1-36)NH2
Příklad 252 [4-aminosalicylová kyselina^hPTHřl-SójNH?
Příklad 253 [TMSA’]hPTH( 1-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4343
Příklad 254 [Phe’]hPTH(l-36)NH2
Příklad 255 [propargylglycin’]hPTH( 1-36)NH2
Příklad 256 [Ala',His5,Leu8,Asp1(),LysI1,Glnl8,Phe22,Phe23,His25,His26,Leu27,Thr33,Ala34]hPTH(l-34)NH2
Příklad 257 [Abu2]hPTH(l-36)NH2
Příklad 258 [D-Val2]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 259 [Terc.Leu2]hPTH( 1-36)NH2
Příklad 260 [Ala']hPTH(l-36)NH2
-34CZ 286889 B6
Příklad 261 [D-Ile5]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 262 [D-Gln6]hPTH( 1-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 263 [D-Leu7]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 264 [Nle8]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4268
Příklad 265 [Phe8]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4303
Příklad 266 [Cha8]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4309
Příklad 267 [Leu8]hPTH(l-38)NH2
Příklad 268 [D-Leu1 ']hPTH( 1-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4287
-35CZ 286889 B6
Příklad 269 [Alan]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4244
Příklad 270 [D-Lys13]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 271 [D-Leu15]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 272 [Ala'5]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4243
Příklad 273 [Alal6]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4243
Příklad 274 [Met(O2)I8]PTH( 1-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4320
Příklad 275 [Nle18]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4268
Příklad 276 [D-Metl8]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
-36CZ 286889 B6
Příklad 277 [Lys20]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4259
Příklad 278 [D-Ard20]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 279 [D-Val21]hPTH( 1-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 280 [Trp(SO2Pmc)23]hPTH(l-38)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4723
Příklad 281 [Trp(Pmc)23]hPTH( 1-38)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4660
Příklad 282 [D-Trp23]hPTH( 1-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 283 [Ala23]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4171
Příklad 284 [D-Leu24]hPTH( 1-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
-37CZ 286889 B6
Příklad 285 [Phe25]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4277
Příklad 286 [Lys25]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4258
Příklad 287 [Ala25]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4201
Příklad 288 [Ala26]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4229
Příklad 289 [Lys26/27(For)]hPTH( 1-34)NH2
Příklad 290 [D-Lys27]hPTH( 1-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 291 [D-Leu28]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 292 [D-Phe34]hPTH(l-36)NH2
Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4288
Příklad 293 [D-Val35]hPTH(l-36)NH2
-38CZ 286889 B6
Příklad 294 [Ala35]hPTH(l-36)NH2
Příklad 295 [Pro35]hPTH(l-36)NH2
Příklad 296 [NMeVal35]hPTH( 1-36)NH2
Příklad 297 [Thr35,Ala36]hPTH( 1-36)NH2
Příklad 298 [D-Ala36]hPTH( 1-36)NH2
Příklad 299 [NMeAla36]hPTH( 1-36)NH2
Příklad 300 (5-amino-4-fluor-2-isopropyl)-3-hexanoyl-hPTH(3-36)NH2
a) Příprava hPTH(3-36)-NH-pryskyřice
Tento meziprodukt se připraví analogicky s postupem podle příkladu 165.
b) [(5-amino-4-fluor-2-isopropyl)-3-hexenoyl]hPTH(3-36)amid
Na 204,6 g 9-fluorenylmethoxykarbonyl-hPTH(3-36)-NH-pryskyřice získané v bodě a) výše se nechá působit po dobu 5 minut dimethylformamid, a poté se několikrát promyje isopropanolem a dimethylformámidem. Chrániči 9-fluorenylmethoxykarbonylová skupina se odstraní působením směsi dimethylformamidu a piperidinu v poměru 8 : 2 po dobu 10 minut. PTH-fragment zbavený chránících skupin, 38,1 mg 4-fluor-2-isopropyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3hexenové kyseliny, 68,7 mg l-benzotriazolyloxytris(pynolidino)fosfonium-hexafluorfosfátu (PyBOP) a 26,6 mg 4-methylmorfolinu se třepe po dobu 80 minut v 0,7 ml dimethylformamidu. Po několika promytích isopropanolem a dimethylformamidem se na pevný zbytek nechá působit po dobu 55 minut směs 4,5 ml trifluoroctové kyseliny, 0,25 ml vody a 0,25 ml ethandithiolu. Tato směs se poté zfiltruje a přidáním diethyletheru se sloučenina uvedená v názvu vysráží ze zbývajícího roztoku. Sloučenina uvedená v názvu se purifíkuje pomocí preparativní vysoceúčinné kapalinové chromatografie na koloně Vydac za použití gradientově eluce (A = voda, B = směs acetonitrilu, vody a kyseliny fosforečné v poměru 7:3: 0,2).
Hmotová spektrometrie (iontový spray): nalezená hmotnost 4272
-39CZ 286889 B6 [a]Hg365nm = -66,80 (c = 0,25 v 95% kyselině octové)
Příklad 301
4-fluor-2-isopropyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3-hexanoát
a) (S)-3-(l-oxo(4-fluor-3-hydroxy-2-isopropyl)-4-hexenyl)-4-fenylmethyl-2-oxazolidinon
Sloučenina uvedená v názvu se připraví analogicky s postupem, který popsali D. A. Evans a kol., Org. Synth. 68, 1990, za použití (S)-3-(l-oxoisobutyl)-4-fenylmethyl-2-oxazolidinonu a 2fluor-2-butenalu jako výchozích látek.
Hmotová spektrometrie (FAB - ionizace rychlými neutrálními částicemi): MH* 350
b) (S)-3-(l-oxo(4-fluor-3-O-(2,2,2-trichlorethanimino)-2-isopropyl)-4-hexenyl)-4-fenylmethyl-2-oxazolidinon
1,5 g sloučeniny z příkladu 301a) se rozpustí v 6 ml dichlormethanu. Při teplotě 0 °C se přidá 0,0958 ml l,8-diazabicyklo(5,4,0)-7-undecenu (DBU). K tomuto roztoku se při teplotě 0 °C po kapkách přidá 0,475 ml trichloracetonitrilu ve 2 ml dichlormethanu. Po 1 hodině se reakční směs odpaří a odparek se purifikuje sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití směsi hexanu a diethyletheru v poměru 2 : 1 jako elučního činidla.
Hmotová spektrometrie (FAB - ionizace rychlými neutrálními částicemi): MH+ 493
c) (S)-3-(l-oxo(4-fluor-5-N-2,2,2-trichloracetyIamino)-2-isopropyl)-3-hexenyl)-4-fenyImethyl-2-oxazolidinon g sloučeniny z příkladu 301b) se rozpustí ve 150 ml o-xylenu a směs se míchá za zahřívání na teplotu 160 °C pod zpětným chladičem po dobu 3 hodin. Poté se o-xylen odstraní a zbytek se purifikuje sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití směsi toluenu a ethylacetátu v poměru 98 : 2 jako elučního činidla.
Hmotová spektrometrie (FAB - ionizace rychlými neutrálními částicemi): MÍT 493
d) 4-fluor-5-N-2,2,2-trichloracetylamino-2-isopropyl-3-hexenová kyselina
Sloučenina uvedená v názvu se připraví analogicky s postupem, který popsali D. A. Evans a kol., Org. Synth. 68, 1990, ale za použití jako výchozího materiálu sloučeniny z příkladu 301c).
Hmotová spektrometrie (FAB - ionizace rychlými neutrálními částicemi): MH+ 335
e) 5-amino-4-fluor-2-isopropyl-3-hexenová kyselina
899 mg sloučeniny z příkladu 30ld) se rozpustí ve 20 ml ethanolu a přidá se 13,5 ml 6N roztoku hydroxidu sodného. Tato směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 20 hodin. Poté se ethanol odstraní, zbývající vodná frakce se okyselí 2N kyselinou chlorovodíkovou na pH = 2 a směs se extrahuje n-butanolem. Extrakt se odpaří a odparek se zfiltruje přes silikagel za použití směsi dichlormethanu a methanolu v poměru 1 : 1 jako elučního činidla, čímž se získá čistá sloučenina uvedená v názvu.
-40CZ 286889 B6
Hmotová spektrometrie (FAB - ionizace rychlými neutrálními částicemi): MFT 190
f) 4-fluor-2-isopropyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3-hexenová kyselina
0,56 g sloučeniny z příkladu 301e) se rozpustí ve 12 ml vody a přidá se 1,5 g uhličitanu sodného. K tomuto roztoku se přidá 0,4 g diterc.butylkarbonátu rozpuštěného ve 12 ml tetrahydrofuranu. Směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 18 hodin. Poté se přidá 50 ml n-butanolu a 50 ml vody a za intenzivního míchání se přidává 1N kyselina chlorovodíková, až se dosáhne pH = 2. Organická frakce se odpaří a odparek se purifikuje sloupcovou chromatografií na silikagelu za použití směsi hexanu a acetonu v poměru 1 : 2 jako elučního činidla.
Hmotová spektrometrie (FAB - ionizace rychlými neutrálními částicemi): MlT 290 [a]o = -61,3 ° (1 % v methanolu)
Opakováním výše uvedených postupů se za použití příslušných výchozích materiálů připraví následující sloučeniny:
4-fluor-2-methyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3-hexenová kyselina
4-chlor-2-methyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3-hexenová kyselina
4—fluor-2-benzyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3-hexenová kyselina
4-chlor-2-isopropyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3-hexenová kyselina
4-methyl-2-isopropyl-5-terc.butoxykarbonylamino-3-hexenová kyselina
Příklad 302
Podle postupu z příkladu 300 výše, ale za použití příslušných výchozích materiálů, se připraví následující sloučeniny:
(5-amino-4-fluor-2-methyl)-3-hexenoyl-hPTH(3-36)-amid
Hmotová spektrometrie (iontový spray): nalezená hmotnost 4245 (5-amino-4-chlor-2-methyl)-3-hexenoyl-hPTH(3-36)-amid
Hmotová spektrometrie (iontový spray): nalezená hmotnost 4260 (5-amino-4-fluor-2-benzyl)-3-hexenoyl-hPTH(3-36)-amid
Hmotová spektrometrie (iontový spray): nalezená hmotnost 4320 (5-amino-4-chlor-2-isopropyl)-3-hexenoyl-hPTH(3-36)-amid
Hmotová spektrometrie (iontový spray): nalezená hmotnost 4289 (5-amino—4-methyl-2-isopropyl)-3-hexenoyl)-hPTH(3-36)-amid
Hmotová spektrometrie (iontový spray): nalezená hmotnost 4269
-41CZ 286889 B6
Příklad 303
Podle postupu z příkladu 300 výše, ale za použití příslušných výchozích materiálů, se připraví následující sloučeniny:
a) 5-amino-3-aza-2-isopropyl)hexanoyl-hPTH(3-36)-amid (Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4257), za použití jako výchozího materiálu (4— aza-2-terc.butoxykarbonylamino-5-isopropyl)hexanové kyseliny
b) 5-amino-3-aza-3-N-acetyl-2-isopropyl)hexanoyl-hPTH(3-36)-amid (hmotová spektrometrie (iontový spray): 4299), za použití jako výchozího materiálu (4-aza-4-N-acetyl-2terc.butoxykarbonylamino-5-isopropyl)hexanové kyseliny
c) 5-amino-3-aza-3-N-acetyl)hexanoyl-PTH(3-36)-amid (Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4257), za použití jako výchozího materiálu (4-aza-4-N-acetyl-2-terc.butoxykarbonylamino)hexanové kyseliny
d) 5-methylamino-3-aza-2-isopropyl)hexanoyl-hPTH(3-36)-amid (Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4271), za použití jako výchozího materiálu [4-aza-2-(N-terc.butoxykarbonyl-N-methylamino)-5-isopropyl]hexanové kyseliny
e) 5-methylamino-3-aza-3-N-methyl-2-isopropyl)hexanoyl-hPTH(3-36)-amid (Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4285), za použití jako výchozího materiálu [4-aza-4-Nmethyl-2-(N-terc.butoxykarbonylamino)-5-isopropyl]hexanové kyseliny
f) 5-amino-3-aza-3-N-methyl-2-isopropyl)hexanoyl-hPTH(3-36)-amid (Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4271), za použití jako výchozího materiálu (4-aza—4-N-methyl-2terc.butoxykarbonylamino-5-isopropyl)hexanové kyseliny
g) 5-amino-3-aza-3-N-isopropyl)hexanoyl-hPTH(3-36)-amid (Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4257), za použití jako výchozího materiálu (4-aza-4-N-isopropyl-2terc.butoxy-karbonylamino-5-isopropyl)hexanové kyseliny
h) [1-cyklopentan-l-amino-l-karboxylová kyselina(psi CH2-NH)-Val2]hPTH(l-36)-amid přičemž se jako výchozí materiál použije 1-cyklopentan-l-terc.butoxykarbonylamino-lkarboxylová kyselina(psi CH2-NH)-Val-OH.
Příklad 304
Podle postupu z příkladu 3a) výše, ale za použití příslušných výchozích materiálů, se připraví následující sloučenina:
(5-amino-3-aza-2-isopropyl)hexanoyl-[Leu8,Ala16,Gln18,Ala19]-hPTH(3-36)OH (Hmotová spektrometrie (iontový spray): 4135) za použití jako výchozího materiálu (4-aza-2-terc.butoxykarbonylamino)hexanové kyseliny.
Příklad 305 (4-aza-4-N-acetyl-2-terc.butoxykarbonylamino-5-isopropyl)hexanová kyselina
a) methyl(4-aza-2-terc.butoxykarbonylamino-5-isopropyl)hexanová kyselina
-42CZ 286889 B6
Boc-Ala-Val-OMe se ošetří Lawessonovým činidlem (S. O. Lawesson a kol., Tetrahedron, 1981, 37, 3635). Výsledný endothiopeptid se poté redukuje podle postupu, který popsali F. S. Guziec a kol., THL, 1990, 23 - 26.
Hmotová spektrometrie (ionizace nárazem elektronů): ΜΗ1 289
b) methyl(4-aza-4-N-acetyl-2-terc.butoxykarbonylamino-5-isopropyl)hexanoát
264 mg sloučeniny z příkladu 305a) se rozpustí v 5 ml dichlormethanu a poté se přidá 0,14 ml triethylaminu a 0,072 ml acetylchloridu. Tato směs se míchá při teplotě 40 °C po dobu 24 hodin. Po přidání 50 ml dichlormethanu se roztok dvakrát promyje vodou. Organická frakce se vysuší a odpaří. Takto získaná sloučenina uvedená v názvu se purifíkuje sloupcovou chromatografií za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 4 : 1 jako elučního činidla.
Hmotová spektrometrie (ionizace nárazem elektronů): M+ 330
c) (4-aza-4-N-acetyl-2-terc.butoxykarbonylamino-5-isopropyl)hexanová kyselina
356 mg sloučeniny z příkladu 305b) se rozpustí ve 4 ml směsi methanolu a vody v poměru 3 : 1 a přidá se 53 mg hydroxidu lithného. Tato směs se míchá při teplotě 60 °C po dobu dvou hodin. Poté se přidá 25 ml dichlormethanu a za intenzivního míchání se přidává 1N kyselina chlorovodíková, až se dosáhne pH = 2. Organická frakce se oddělí, vysuší a odpaří, čímž se získá sloučenina uvedená v názvu v čisté formě.
Hmotová spektrometrie (ionizace rychlými neutrálními částicemi): MH+ 317
Opakováním tohoto postupu, ale za použití příslušných výchozích materiálů, se získají následující sloučeniny:
(4-aza-4-N-acetyl-2-terc.butoxykarbonylamino)hexanová kyselina (4-aza-2-terc.butoxykarbonylamino-5-isopropyl)hexanová kyselina [4-aza-2-(N-terc.butoxykarbonyl-N-methylamino)-5-isopropyl]hexanová kyselina (4-aza-4-N-methyl-2-terc.butoxykarbonylamino-5-isopropyl)hexanová kyselina (4-aza—4-N-isopropyl-2-terc.butoxykarbonylamino-5-isopropyl)hexanová kyselina (4-aza-2-terc.butoxykarbonylamino)hexanová kyselina.
Sloučeniny z příkladů 1 až 300 a 302 až 304 vykazují při kvantitativní aminokyselinové analýze správné poměry aminokyselin.
V následujících příkladech ilustrujících rekombinantní způsob podle vynálezu jsou, pokud není uvedeno jinak, používány standardní postupy, které popsali Ausubel a kol., 1991, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York.
Příklad 306
Klonování genu 55 bakteriofága T4
Dva DNA-fragmenty, z nichž jeden obsahuje celou kódující sekvenci genu 55 bakteriofága T4, a druhý fragment kóduje části tohoto genu, se amplifikují pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR) za použití purifikované T4-DNA jako matrice. Jako primery se použijí oligonukleotidy,
-43CZ 286889 B6 které obsahují rozpoznávací místa pro endonukleasu Ndel nebo BamHI. Reakce PCR (25 cyklů, z nichž každý sestává z 30 s při teplotě 94 °C, 30 s při 50 0 a 30 s při 72 °C) se provádí s 1 ng matrice a 100 pM upstream-primeru (znázorněného jako SEQ ID č. 5, přičemž rozpoznávací místo pro Ndel je tvořeno jeho nukleotidy 7 - 12) a 100 pM downstream-primeru (znázorněného jako SEQ ID č. 6, přičemž rozpoznávací místo pro BamHI je tvořeno jeho nukleotidy 5 - 10) ve 100 μΙ reakčního pufru, který obsahuje lOmM Tris-HCl, 50mM chlorid draselný, l,5mM chlorid hořečnatý, 0,2mM každého z dATP, dCTP, dGTP a dTTP, a 0,1% Triton X 100, pH 9,0. Získá se fragment o velikosti 0,6 kb.
Zkrácená forma genu 55 se připraví pomocí polymerasové řetězové reakce, jak je popsána pro celý gen, stím rozdílem, že se použije jiný oligonukleotid jako downstream-primer (znázorněný jako SEQ ID č. 7, přičemž rozpoznávací místo pro BamHI je tvořeno jeho nukleotidy 5-10). Získá se fragment o velikosti 0,35 kb.
Tyto DNA-fragmenty o velikosti 0,6 kb a 0,35 kb se rozštěpí restrikčními endonukleásami Ndel a BamHI a klonují se do expresivního vektoru pET17B (získaného od firmy Novagen), rozštěpeného Ndel a BamHI. DNA-fragment o velikosti 0,6 kb kóduje celý protein gp55 (188 aminokyselinových zbytků - viz SEQ ID č. 1), zatímco fragment o velikosti 0,35 kb kóduje N-koncový fragment gp55 o hmotnosti 12 kD (112 aminokyselinových zbytků - viz SEQ ID č. 3).
Příklad 307
Příprava a klonování DNA kódující hPTH(l-38)OH
DNA-fragmenty kódující a) spojovníkový peptid odpovídající aminokyselinovým zbytkům 110 - 115 v SEQ ID č. 1 a hPTH(l-38) nebo b) spojovníkový peptid odpovídající aminokyselinovým zbytkům 186- 191 v SEQ ID č. 3 a hPTH(l-38) se vytvoří pomocí polymerasové řetězové reakce za použití klonované syntetické kódující sekvence PTH( 1-38) jako matrice. Jako upstream-primery se použijí oligonukleotidy kódující spojovník a) (SEQ ID č. 8) nebo spojovník b) (SEQ IDč. 9). Downstream-primer je znázorněn jako SEQ ID č. 10. Každý zupstreamprimerů obsahuje klonovací místo BamHI a downstream-primer obsahuje rozpoznávací místo pro Xhol (nukleotidy 5-10 každé ze sekvencí). Polymerasová řetězová reakce se provádí za stejných podmínek jako jsou popsány v příkladu 306.
Po rozštěpení BamHI a Xhol se produkty polymerasové řetězové reakce o velikosti 0,23 kb inzertují do plazmidů gp55-pET17B získaných v příkladu 306, rozštěpených BamHI a Xhol.
Pro expresi fúzních proteinů se výsledné zkonstruované plazmidy transformuje do Escherichia coli BL21 (DE3) LysE, a jednotlivé bakteriální kolonie se dále rozmnožují. Exprese fúzních proteinů se dosáhne inkubací přípravné kultury při teplotě 37 °C na rotační třepačce přes noc v růstovém médiu circle growth médium Bio 101. Hlavní kultura se inokuluje přípravnou kulturou tvořící 1 až 5 % objemu hlavní kultury. Hlavní kultura se poté fermentuje při teplotě 37 °C a při pH 6,9 až 7,1, přičemž se provzdušňuje 10 1 za minutu a míchá se rychlostí 200 až 400 otáček za minutu. Exprese se indukuje přidáním lmM isopropyl-beta-thiogalaktosidu (IPTG), jakmile kultura dosáhne optické density ΟΟ550 přibližně 1,0 až 5,0. Po indukci se ve fermentaci pokračuje po dobu pěti hodin a poté se z fermentační směsi izolují buňky Escherichia coli bez jejich usmrcení. Izolované buňky se centrifígují na tubulámí odstředivce, resuspendují v pufru a exprese se testuje pomocí elektroforesy v SDS-polyakrylamidovém gelu. Poté se zmrazí buněčná peleta až do purifikace. Použité postupy a hostitelské buňky jsou plně popsány v práci, kterou publikovali Studier a kol., 1990, „(Jse of T7 RNA Polymerase to direct expression of Cloned Genes“, Methods in Enzymology, Academie Press, str. 60 až 89.
-44CZ 286889 B6
Příklad 308
Preparace inkluzních tělísek
Zmražené pelety Escherichia coli získané v příkladu 307 se resuspendují v koncentraci 25% (hmotnost / objem) vpufru A (50mM Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethan) o pH 8,0, obsahující 2mM dithiothreitol, 5mM benzamidin-hydrochlorid, l,5mM chlorid hořečnatý, l,0mM chlorid manganatý, 10 pg / ml DNAsy 1 a 2 mg / ml Lysozymu) a směs se míchá po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Resuspendované buňky se lyžují dvojím prolisováním tlakem 120 MPa na Manton-Gaulinově homogenizéru a výsledný lyzát se chladí na ledu. Lyzát se dvojnásobně naředí pufrem B (50mM Tris o pH 8,0, obsahující 2mM dithiothreitol, 5mM benzamidin-hydrochlorid a 4mM kyselinu ethylendiamintetraoctovou) o teplotě ledu a směs se centrifuguje po dobu 30 minut při 27 500 g.
Supematant z centrifugy se opatrně odstraní. Peleta se resuspenduje na koncentraci 25 % (hmotnost / objem) v pufru B, ještě jednou se prolisuje na Manton-Gaulinově homogenizéru a centrifuguje jak je uvedeno drive. Tento postup se opakuje jednou za použití pufru B a jednou za použití vody. Výsledné pelety inkluzních tělísek se zváží a udržují se až do okamžiku potřeby zmrazené na -20 °C.
Příklad 309
Solubilizace a štěpení inkluzních tělísek gp55-Asp-Pro-Pro-(l-38)hPTH-OH
Zmrazená inkluzní tělíska obsahující gp55-Asp-Pro-Pro-(l-38)hPTH, jak jsou získána v příkladu 308, se suspendují v lOmM roztoku kyseliny chlorovodíkové (analyticky čistém) na konečné koncentraci 6 % (hmotnost / objem). Roztok se inkubuje po dobu 24 hodin při teplotě 50 °C a reakce se ukončí přidáním stejného objemu vodného lOOmM roztoku octanu sodného. Naředěný supematant se vyčistí centrifugací při 27 500 g po dobu 30 minut a zfiltruje přes filtr se skleněnou vatou.
Příklad 310
Solubilizace a štěpení inkluzních tělísek gp55-Asn-Gly-Pro-(l-38)hPTH
Zmrazená inkluzní tělíska obsahující gp55-Asn-Gly-Pro-(l-38)hPTH, jak jsou získána v příkladu 308, se rozpustí v 6M guanidin-hydrochloridu (obsahujícím 2M hydroxylaminhydrochlorid a s pH upraveným na hodnotu 9,0 přidáním 4,5M hydroxidu lithného), pro dosažení odhadované koncentrace 5 mg proteinu / ml. pH se znovu upraví na pH 9 dalším přidáním hydroxidu lithného a roztok se inkubuje po dobu 4 hodin při teplotě 45 °C. Reakce se ukončí přidáním kyseliny mravenčí na pH 4 a roztok se centrifuguje a filtruje jak je popsáno v příkladu 309.
Příklad 311
Preparativní vysoceúčinná kapalinová chromatografie Gly-Pro- a Pro-Pro-(l-38)hPTH
Zfíltrované supematanty vzniklé po štěpení se analyzují pomocí analytické vysoceůčinné kapalinové chromatografie (HPLC) s obrácenými fázemi (na koloně Orpogen HD-Gel-RP-7s300 o rozměrech 4x150 mm) a porovnají se se standardem (l-38)hPTH (Bachem), pro
-45CZ 286889 B6 stanovení koncentrace PTH, Kolona se ekvilibruje s 85 % pufru A pro HPLC (90 % vody, 10 % acetonitrilu, s obsahem 0,1 % (objem / objem) kyseliny trifluoroctové) a 15% pufru B pro HPLC (10 % vody, 90 % acetonitrilu, s obsahem 0,1 % kyseliny trifluoroctové) a promývá se po dobu 15 minut při průtoku 0,75 ml / min za použití gradientově eluce s gradientem 15 % pufru B pro HPLC až 100 % pufru B pro HPLC.
V závislosti na rozsahu přípravy se supematanty nanesou buďto na kolonu C4 Vydac o rozměrech 1,0 x 25 cm nebo C4 Vydac 2,2 x 25cm. Kolony se ekvilibrují 85 % pufru A pro HPLC a 15 % pufru B pro HPLC při průtoku 4 ml / min, respektive 10 ml / min. Kolony se promývají za použití gradientově eluce s gradientem 15 % pufru B až 85 % pufru B za použití objemu 80 ml, respektive 15 % pufru B až 55 % pufru B za použití objemu 300 ml.
Píky Gly-Pro-hPTH(l-38) nebo Pro-Pro-hPTH(l-38) se manuálně izolují a poté se ve vakuu odstraní acetonitril. Pro stanovení koncentrace peptidu jak po štěpení tak v izolovaných frakcích se použije analytická vysoceůčinná kapalinová chromatografie.
Roztoky peptidů bez rozpouštědla se naředí stejným objemem lOOmM octanu sodného a pH se upraví, pokud je to nutné, na pH 5,4. Po filtraci (0,2 pm) se roztok nanese na katexovou kolonu (buďto Mono S nebo SP-Sepharose High Performance, naplněný v koloně HRlO/10 nebo XK16/10), ekvilibrovanou s 50mM octanem sodným o pH 5,4 (pufr C). Kolona se promývá za použití gradientově eluce s gradientem 0 až 500mM chloridu sodného v pufru C objemem tvořícím 7,5-násobek objemu kolony. Izolují se frakce o objemu 10 ml a frakce tvořící pík X-X(l-38)hPTH se spojí. Koncentrace peptidu se stanoví jak je popsáno výše za použití vysoceúčinné kapalinové chromatografie.
Tato kolona slouží jednak k převedení peptidů do více fyziologického pufru a jednak k odstranění dalších peptidů vytvořených chemickým štěpením samotného fúzního proteinu.
Příklad 312
Enzymatické odstranění X-X z X-X-(l-38)hPTH-OH pH spojených frakcí peptidů, jak se získají v příkladu 311 (koncentrace se pohybuje v rozmezí 1,5 až 2,0 mg / ml) se upraví na pH 8,0 přidáním pevného Tris. Přidá se purifíkovaná X-prolyldipeptidáza (o koncentraci 0,5 mg / ml v PBS (fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem) o pH 7,2) (Nardi a kol., 1991, App. Env. Microbiol. 57, č. 1, 45 - 50) v poměru 1 : 1000 a roztok se inkubuje po dobu 24 hodin při teplotě 37 °C. Reakce se zastaví přidáním kyseliny trifluoroctové v množství 0,2 % (pH = 5,0) a výsledný (1-38)PTH se izoluje pomocí preparativní vysoceúčinné kapalinové chromatografie (za použití stejných podmínek jako jsou popsány v příkladu 6). Rozpouštědlo se odstraní a produkt se po odebrání vzorků pro N-koncovou sekvenční analýzu a analýzu pomocí hmotové spektrometrie lyofilizuje. Příklady výtěžků, kterých se dosáhne za použití postupů se dvěma fůzními proteiny popsanými výše jsou následující:
Gen55-Asp-Pro-Pro-hPTH(l-38)OH (za použití „zkrácené“ formy genu 55)
Za částečně optimalizovaných fermentačních podmínek se z 10 litrů fermentované směsi získá peleta mokrých buněk o hmotnosti 215 g. Procentická úroveň exprese fuzního proteinu činí přibližně 37 %. Z této pelety se izoluje 31 g inkluzních tělísek. Čistota proteinu (s ohledem na fúzní protein) těchto tělísek je 61 %. Po solubilizaci, štěpení a centrifugaci a filtraci se zjistí přibližně 620 mg Pro-Pro-PTH. Z tohoto materiálu se po následující vysoceúčinné kapalinové chromatografii na koloně C4—Vydac získá 580 mg Pro-Pro-PTH. Po naředění, kationtové výměně na Mono S, štěpení X-prolyldipeptidypeptidázou (při koncentraci Pro-Pro-PTH
-46CZ 286889 B6 mg/ml), vysoceúčinné kapalinové chromatografn a lyofilizaci se získá 440 mg lyofílizovaného čistého produktu s plnou biologickou aktivitou. To znamená výtěžek 71 % finálního produktu ve srovnání s dobou ukončení štěpení.
Gen55-Asn-Gly-Pro-hPTH(l-38)OH (za použití „dlouhé“ formy genu 55)
Z 20 litrů neoptimalizované fermentační směsi se izoluje peleta 78 g mokrých buněk s 50% expresí fúzního proteinu. Po lyžování a centrifugaci se získá 18 g „90% čistých“ inkluzních tělísek. Po zastavení reakce kyselinou a centrifugaci a filtraci se detekuje zhruba 470 mg GlyPro-PTH. Po vysoceúčinné kapalinové chromatografn na koloně C4-Vydac se zjistí 355 mg peptidu, kteréžto množství se po kationtové výměně na SP-Sepharose sníží na 321 mg. Enzymatické odstranění zbytků Gly a Pro se provádí při koncentraci 2 mg / ml. Po závěrečné vysoceúčinné kapalinové chromatografii a lyofilizaci se izoluje 244 mg čistého, plně biologicky aktivního hPTH(l-38)OH, což představuje výtěžek 52 % ve srovnání se stavem v době zastavení štěpící reakce.
Sloučeniny podle příkladů 25, 26, 56 a 86 - 164 se též připraví za použití postupu podle příkladů 306 až 312.
Sloučeniny podle vynálezu ve volné formě nebo ve formě farmaceuticky přijatelných solí a komplexů vykazují cenné farmakologické vlastnosti, jak o tom svědčí testy na zvířatech, a jsou tudíž vhodné pro terapii.
Biologická aktivita sloučenin podle vynálezu se stanoví in vitro měřením jejich schopnosti stimulovat syntézu cyklického AMP v osteosarkomatických buňkách krysy UMR 106-06 a člověka SaOS-2 podle způsobu, který popsali Marcus a Aurbach v Endocrinology, 85, 801 810 (1969). Krysí osteosarkomatické buňky UMR 106 se nechají růst do konfluence v Eaglově minimálním esenciálním médiu (Eagle's Minimum Essential Médium) s 10% FCS (sérum z telecího plodu) na destičkách s 12 jamkami, lidské osteosarkomatické buňky SaOS-2 se pěstují v McCoyově 5A médiu s 10% FCS. Médium se poté změní na médium s 2% FCS a přidá se [3H]-adenin v množství 1 až 5 pCi na jamku. Dvě hodiny poté se buňky promyjí dvakrát médiem neobsahujícím sérum a inkubují se v DMEM (Dulbeccem modifikované Eaglovo médium) s 1% BSA (albumin hovězího séra) obsahujícím lmM 3-isobutyl-l-methylxanthin, aby se zabránilo působení fosfodiesteras. Testované látky se přidají o 20 minut později. Reakce se zastaví a cAMP se extrahuje po 15 minutách přidáním 5% kyseliny trichloroctové. V množství 0,5 ml na jamku se přidá roztok nosiče obsahující 5 mM neznačeného adeninu, adenoxinu, AMP, ADP, ATP a cAMP, jakož i [14C]-adenosinu v množství 0,4 pC i pro stanovení regenerace. [3H]-cAMP se oddělí za použití chromatografie na sériové koloně Dowex 50W-X4 (200400 mesh) a chromatografie na oxidu hlinitém a provede se měření radioaktivity. Výsledky se vypočítají v % ve srovnání s kontrolním rozpouštědlem a hodnoty EC50 se stanoví z regresních křivek DRC. Sloučeniny podle vynálezu stimulují produkci cAMP v osteosarkomatických buňkách krys UMR 106-06 a člověka SaOS-2 v koncentraci 10“11 až 10“6 M.
Sloučeniny podle vynálezu vykazují ve výše uvedeném testu účinnost v rozmezí od zhruba 0,3násobku do zhruba 1,5-násobku účinnosti odpovídajících nativních peptidů PTH(l-34) nebo PTH(l-36). Většina sloučenin podle vynálezu vykazuje v tomto testu vyšší účinnost než odpovídající přírodní peptid. V tabulce 1 jsou uvedeny hodnoty EC50, pD2 a relativní účinnosti sloučenin podle vynálezu dosažené v tomto testu (pD2 ξξ 1/koncentrace nutná k 50% maximální produkci cAMP ve výše uvedeném adenylát-cyklasovém testu; relativní účinnosti jsou vypočítány vzhledem k účinnostem odpovídajících přírodních sekvencí PTH(l-34) respektive PTH(l-36)).
-47CZ 286889 B6
Tabulka 1
příklad č. sloučenina EC50 (nM) pD2 relativní účinnost
20 [L8,Q18,T33,A34]hPTH(l-34)OH 7,2 8,14 0,45
21 [L8,A16’’9’34,QI8,Ti3]hPTH(l-34)OH 2,42 8,62 1,47
29 [L8,A16>34,Ql8,T33]hPTH( 1-34)OH 1,10 8,96 1,42
31 [L8,D,0,Kn,QI8]hPTH(l-36)OH 8,27 8,08 0,34
37 [L8,D10,K“,Q18,T33,A34]hPTH(l-36)OH 1,05 8,98 1,65
42 [L^^K^A^^Q^hPTHU^ÓjOH 0,88 9,06 3,5
49 [L8,DI0,KH,A16’34,Q18,T33]hPTH(l-34)OH 1,38 8,86 1,49
50 [L8,Dl0,K1I,A16,Q18]hPTH(l-36)OH 1,63 8,79 1,08
66 [L8,A1618,Q18]hPTH(l-36)OH 3,38 8,47 0,88
Sloučeniny podle vynálezu rovněž vykazují vazebnou afinitu na receptory PTH, například jak se 5 stanoví následovně:
Kuřecí [Tyr36]PTHrP(l-36)amid se joduje na specifickou aktivitu 2200 Ci / mmol za použití laktoperoxidasového postupu (Anawa Lab. AG, Wangen. Ledvinové buňky vačice v jediné vrstvě se promyjí 200 μΐ DMEM a F12 (HAM) v poměru 1 : 1 s obsahem 1 % BSA, a inkubují 10 se při teplotě 16 °C s [125I-Tyr36]chPTHrP(l-36)amidu v dávce odpovídající 50000 pulzů za minutu na jamku, za přítomnosti nebo nepřítomnosti 1 μΜ [Tyr36]chPTHrP(l-36)amidu.
Po inkubaci se buňky promyjí 0,5 ml média o teplotě 4 °C, lyžují účinkem 0,5 ml 1N hydroxidu sodného a změří se radioaktivita. Specifická vazba se stanoví jako celková vazba minus nespecifická vazba. Kompetitivní křivky se analyzují za použití počítačového programu pro 15 nelineární regresi SCTFIT (Feyen a kol., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 8- 13) a údaje se uvádějí jako průměrné hodnoty pKD (n = 2 až 3). Sloučeniny podle vynálezu vykazují v tomto testu vazebnou afinitu vyjádřenou jako průměrná hodnota pKD od 7 do 10.
Dále sloučeniny podle vynálezu zvyšují hladinu vápníku v plazmě po kontinuální subkutánní 20 infuzi, například jak se stanoví u samců thyroparathyroidektomizovaných krys Wistar o hmotnosti 140 až 170 g. 5 dnů po thyroparathyroidektomii se krysám do krku implantují minipumpy Alzet a u krys se provádí infuze testovaných sloučenin v množstvích od 0,3 do 30 pg / den na krysu. Retroorbitální punkcí se ráno 1, 2, 3 a 6 dnů poté odebere krev a koncentrace vápníku v plazmě se stanoví fotometricky. V tomto testu sloučeniny podle vynálezu zvyšují množství 25 vápníku v plazmě.
Kromě toho vykazují sloučeniny podle vynálezu zlepšené vlastnosti z hlediska stability jak proti hydrolýze ve vodném roztoku tak proti oxidaci, například jak je popsáno níže pro sloučeninu z příkladu 49, tedy [Leu8, Asp10, Lys11, AlaI6,34,Gln18,Thr33]hPTH(l-34)OH (dále označovanou 30 SDZ PTS 893).
Srovnání stability SDZ PTS 893 (sloučeniny z příkladu 49) a hPTH(l-38) ve vodném roztoku
SDZ PTS 893 a hPTH(l-38) se rozpustí ve vodě, deionizované na purifikačním systému Milli35 RO (Millipore), v koncentraci 0,5 mg/ml. Jedna sada vzorků se skladuje při teplotě místnosti a analyzuje pomocí RP-HPL (vysoce účinné kapalinové chromatografie s obrácenými fázemi) po 2 a 4 týdnech. Druhá sada vzorků se skladuje při teplotě 60 °C a analyzuje se za 2 dny a 7 dnů.
-48CZ 286889 B6
Stabilita se vypočítá jako plocha zbývající sloučeniny ve srovnání s původní plochou. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.
Tabulka 2
Chemická stabilizace SDZ PTS 893 v roztoku ve srovnání shPTH(l-38). Uváděna jsou % zbývající sloučeniny (HPLC pík)
látka roztok 2 týdny při teplotě místnosti 4 týdny při teplotě místnosti 2 dny při 60 °C 7 dnů při 60 °C
SDZ PTS 893 voda, pH 7,0 99% 98% 99% 99%
hPTH(l-38) voda, pH 7,0 22% 3 % 24% 0%
Odolnost vůči oxidaci
K 1 ml roztoků SDZ PTS 893 a hPTH(l-34) v koncentraci 4 mg/ml ve vodě se přidá 20 ml 30% peroxidu vodíku na 30 minut při teplotě 37 °C. Poté se přidá 1 ml vody a roztoky se okamžitě lyofilizují. Testuje se biologická aktivita roztoků ve výše uvedeném adenylát-cyklasovém testu na buňkách UMR 106-06. Peroxid vodíku odpovídající nejvyšší koncentraci přítomné v roztoku SDZ PTS 893 se přidá ke křivce koncentrace-odpověď standardního SDZ PTS 893 pro vyloučení účinků na odpověď buněk. Inkubace s peroxidem vodíku byla prováděna jednou, vzorky byly testovány dva- až třikrát a byla vypočítána standardní odchylka měření (± SEM). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
Tabulka 3
Účinek inkubace s peroxidem vodíku (oxidačním činidlem) na biologickou aktivitu SDZ PTS 893 (zvýšení cAMP v osteosarkomatických buňkách krysy UMR 106-06). Uváděny jsou průměrné hodnoty ± standardní odchylka, n = 2 až 3
inkubace SDZ PTS 893 hPTH(l-34)
EC50 (nM) bez H2O2 sH2O2 2,20 ± 0,76 2,89 ± 1,38 4,40 ±1,17 1420± 115
% zbývající 86,1 2
Aktivita in vivo
Sloučeniny podle vynálezu byly dále testovány in vivo a bylo zjištěno, že vykazují výborné vlastnosti z hlediska tvorby kostí, typicky lepší než odpovídající fragmenty přírodního PTH. Tak byla sloučenina z příkladu 49 testována na myších a krysách a bylo zjištěno, že je alespoň čtyřikrát účinnější než hPTH(l-38) při zvyšování syntézy kostní matrix a obsahu minerálů v kostech, a vykazuje výhodnější poměr tvorby kostí k resorpci kostí (safety window) než fragmenty přírodního PTH.
Sloučeniny podle vynálezu jsou v souladu s tím vhodné pro prevenci nebo léčení všech chorob kostí, které jsou spojeny se zvýšeným vyčerpáním nebo resorpci vápníku, nebo u kterých je žádoucí fixace vápníku v kostech, například osteoporózy různého původu (například juvenilní, menopauzální, postmenopauzální, posttraumatické, způsobené vysokým věkem nebo kortikosteroidní terapií nebo nečinností), zlomenin, osteopatie, včetně akutních a chronických stavů
-49CZ 286889 B6 spojených s kosterní demineralizací, měknutí kostí, periodontálního úbytku kostní tkáně nebo úbytku kostní tkáně způsobeného arthritidou nebo osteoarthritidou nebo pro léčení hypoparathyroidismu.
Sloučeniny podle vynálezu jsou zejména vhodné pro prevenci nebo léčení osteoporózy různého původu.
Pro všechna výše uvedená použití se doporučená denní dávka pohybuje v rozmezí od přibližně 0,003 do 10 mg, výhodně 0,003 až 3 mg, ještě výhodněji 0,01 až 1 mg sloučeniny podle vynálezu. Sloučeniny podle vynálezu lze podávat jednou denně nebo až dvakrát týdně.
Sloučeniny podle vynálezu lze podávat ve volné formě nebo ve formě farmaceuticky přijatelné soli nebo komplexů. Takové soli a komplexy lze připravit běžným způsobem a vykazují stejný druh aktivity jako volné sloučeniny. Vynález též zahrnuje farmaceutický prostředek obsahující sloučeninu podle vynálezu ve volné formě nebo ve formě fyziologicky přijatelné soli nebo komplexu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem. Takové prostředky lze vytvořit běžným způsobem. Sloučeniny podle vynálezu lze podávat libovolným vhodným způsobem, například parenterálně například ve formě injikovatelných roztoků nebo suspenzí, enterálně, například orálně, jako ve formě tablet nebo kapslí nebo ve transdermální nebo nasální formě nebo ve formě čípků.
Sloučeniny podle vynálezu lze rovněž použít jako přídavnou nebo pomocnou látku kjiné terapii, například terapii za použití inhibitorů kostní resorpce, například jako je tomu u léčení osteoporózy, zejména k terapii používající kalcium, kalcitonin nebo jeho analog nebo derivát, například kalcitonin lososa, úhoře nebo člověka, steroidní hormon, jako je estrogen, částečný agonista estrogenu nebo kombinace estrogen - gestagen, bifosfonát, vitamin D nebo jeho analog, nebo jejich libovolnou kombinaci.
Pokud jsou sloučeniny podle vynálezu podávány, například jako pomocná látka, v kombinaci s terapií inhibující kostní resorpci, liší se samozřejmě dávky takovéhoto společně podávaného inhibitoru v závislosti na typu použitého inhibičního léku, například v závislosti na tom, zda se jedná o steroid nebo kalcitonin, na ošetřované chorobě, na tom, zda se jedná o kurativní nebo preventivní terapii, na režimu atd.
V souladu s tím lze sloučeniny podle vynálezu využít při způsobu pro zlepšení tvorby kostí, například prevenci nebo léčení vyčerpání vápníku, například pro prevenci nebo léčení libovolné z konkrétních poruch nebo chorob uvedených výše, u pacienta, který potřebuje takové ošetření, kterýžto způsob zahrnuje podání účinného množství a) sloučeniny podle vynálezu a b) druhé léčivé látky, přičemž tato druhá léčivá látka je inhibitorem kostní resorpce, například jak jsou uvedeny výše, tomuto pacientovi.
Výhodné jsou sloučeniny podle příkladů 20, 29, 37,49, a 50.
Zobrazení sekvencí
Informace o sekvenci SEQ ID č. 1:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 717 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická
-50CZ 286889 B6 (iii) není anti-sense (v) typ fragmentu: vnitřní (vi) původní zdroj:
(A) organismus: bakteriofág T4 / Homo sapiens 5 (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 101..559 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 1:
AGATCTCGAT cccgcgaaat taatacgact cactataggg
CCTr
Ol
AGAAACAAC tttgtttaac tttaagaagg agatatacat ATG CCA saAA ACT AAG
Mez Ser Thx LyS
• «τ · · x * * —» · w ** r*“· λ * ** x »«· η. * —.»»»m * Λ-'-Ι-.-ν ΛΛ. \3-Λ AAV Λλ. λλΛ kJ.-.XJ w-Λ Á «.*1 CAA US,. ATT ATT
-z Lys Tyr As.*. Tyr Val Asn Asr. Lys Glu Leu Leu Gin Ala -le Tle
* Λ · £ 20
.5p .’»j·^ λαλ Trp Lys Λχ,Λ Tnr 25 xJ—U TTA Leu GCA Ala Αλ. Asn AaΑ3Π 30 λΑλ Lys Asp Aa. Asn ΛΛΛ G « A G - · 21
Lvs 35 Val Val
__ “ * ·· 5 v _ _ _ __ — ~ __ ___ * <*/· r-· — ___
wAC ΛΛ. sJU.h . -A Λ- _ řx. o Λ. - ksAA 2r
Are Glr. Asn 40 Asp T· W. lle Gly Leu 45 Ala lle Mez Leu lle 50 Ala Glu Gly
TTA » X- * AAA CGT TTC AAC TTT TCA G\jA TAC ACC CAG TCT TGG AAA CAA 307
Leu Ser Lys Ar? Phe Asn Phe Ser Giv Tvr Thr Gin Ser Trp Lys Gin
5Ξ 60 65
GAA A TG ATT GCA GAT GGT ATA GAA □CT TCT ATT AAG CTT CAC AAT 355
Gin Me — 1 le Ala Asp Gly ile Z ’ · Ala Ser lle Lys Gly Leu Hus Asn
80 85
TTT Lir*. - GAA AC\j AAA TAT AAA AAC CCA CA. Gk.k2 TAT ATA ACT CAA GCT 403
?r.e Asp Glu Tlzr Lvs Tvr Lys Asn ?Σ3 Hus Ala Tyr lle Thr Gin Ala
$C 95 100
TGT TTT AAT GCA TTC GTC CAA. CGT C-GA TCC ACC GAT CCA CCA TCC GTA 451
Tys ?r.e Asr. A' a Ό Ag Val Glr. Arp Gly Ser lle Asp Pro Pro Ser Val
12 5 1 * V 115
- >-Λ cjAA ALA CAA CTA ATG CA? AAT CTG GuT AAA CAT CTG AAT TCA ATG 499
Ser kJ—U lle <· · _ Leu Mez His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Mez
120 125 130
GAA GTA GAA TGG CTG CGT AAA AAA CTG CAG GAT GTA CAT AAT TTT 547
Arz Val Gin Trp Leu Arg Lys Lys Leu Glr. As o Val His Asn Phe
135 140 145
STA GCT CTG GGT TAACTCGAGC AGATCCxjvjCT <jCTAACAAAG CCCGAAAGGA
Val Ala Leu Gly “ C Λ
AaAACxAijv-A TAACCCCTTG GGuCCCTTGG •jkjCCTCTAAA wvjwvTCTTGA GGGGTTTTTT
GGTGAAAGGA GGAACTATAT CCCGATAA
65$
Informace o sekvenci SEQ ID č. 2:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 153 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární
-51CZ 286889 B6 (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 2:
Χβτ Se: l Thr τ y « ς Lys Tyr Asn Tvr 10 Val Asr. Asn Lys Glu Le·^
Leu Gin Ala lie Ile Asp Trp Lys Thr Glu Leu Ala Asn Asn Lys Asp
20 25 30
Pro Asn Lys Val Val Arg Gin Asn Asp Thr Ile Gly Leu Ala Ile Mez
35 40 45
Leu Ile Ala Glu Glv Leu Ser Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr
50 55 60
Ser Trp Lys Gin Glu Met Ile Ala Asp Gly Ile Glu Ala Ser Ile
65 70 75 80
Lys Gly Leu Eis Asn Phe Asp Glu Thr Lvs Ty^ Lys Asn Pro His Ala
85 90 95
Tyr Ile Thr Gin Ala Cys Phe Asn Ala Phe Val Glr. Arg Gly Ser Ile
100 105 110
Asp Pro Pro Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Glv Lys
115 120 125
His Leu Asr. Ser Met Glu Arg Val Glu Trn Leu Arg Lys Lys Leu Glr.
13C 135 140
As □ Val His Asr. Phe Val Ala Leu Glv
145 150
Informace o sekvenci SEQ ID č. 3:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 945 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (v) typ fragmentu: vnitřní (vi) původní zdroj:
(A) organismus: bakteriofág T4 / Homo sapiens (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 101.787 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 3:
-52CZ 286889 B6
AGATCTCGAT cccgcg ΑλΑΤ
TAATACsjA^T CACTrt*A\^rj
AGACCACAAC ggtttccctg
TAGAAATí AAT TTTG' ITTAAC TTTAA jAAGG AksAGAC ACAT ATG TCA GAA ACT AAG * 4 -
Met 1 Ser Glu Thr Lys 5
CCT AAA TA 7 AAT TAC o * A A/^v- ΛΛ« AAA TTA CAA GCT ATT ATT !£
? z c tys Tvr ASP. tv* Val Asr. Asr. Lys Glv Leu Leu Glr. Ala Tle Ile
10 - = 20
GAT TGG AAA AGA GAA tta GCA AAT AAT AAA 'jri— CCA AAT AAA GTA GTT 211
Asp Trp Lys Glu Leu Ala Asr. Asn Lvs Asp ?ro Asn Lvs Val Val
25 30 35
CGT CAG AAT GAT ACT ATC GGA TTA GCC ATT ATG CTT ATT GCA GAA GGC 22-9
Azg C-lr. Asn Asp Thr Ile Gly Leu Ala Tle Hec Leu Ile Ala Glu Gly
40 45 50
TTA TCT AAA CGT 4. *<- AAC TTT TCA GGA TAC ACC CAG TGG AAA CAA 307
Leu Ser Lys Arg O Mg Asr. Ser Glv Tyr Thr Gin Ser Trp Lys Glr.
55 οΰ 65
GAA ATG ATT GCA GA. GGT ΑΤΑ GAA GCT TCT r*.T « AAG GGG CTT CAC AAT Ί s;
Glu Her Ile Ala As r Glv Zle Glv Ala Ser Zle Lvs Glv Leu His Asn
70 75 80 85
TTT GAT GAA ACG AAA TAT AAA AAC CCA CA GCG TAT ATA ACT CAA GCT 403
Dra Asp Glu Thr Lvs Tyr Lvs Asn ?rr His Ala Tvr Zle Ί·Μ» - Glr. Ala
90 95 10C
ToT TTT AA é GCA TTC G“C CAA CGT ATT AAA AAA GAA CGT AAG GAA GTT 451
Cy5 ?ne Asn Ala ?he Val Gin Arg Tle Lys LV5 Glu Arg Lvs Glu Val
10; 113 115
GCA AAG AAA TAT AGT TAC TTC GTT CAC AAT uTC TAT GAC AkjC CGT GAC 4 93
A—2 Lys LVS Tyr Ser Tvz Pr.e Val His Asn Val Tyr As o Ser Arg Asp
120 * π e 130
GAT ATG GC<a TTA GTA GAT GAA ACT TTT ATT CAA GAC Λ- s» TAT 547
As o Asr Her Val Ala Leu Val Asp Glu Thr Phe Tle Glr. Asr Γ - a *77
135 140 145
GAT AA ATG A^\j CAT TAC GAA GAA TCA ACC T.AT AGA ACA CCG GGG GCT 5 95
AS= Lys y.et Thr His Glv Glu Ser Thr Tvr Arg Thr Pro Gly Ala
150 155 160 165
•·μ?λλ AAG AAA AGT GTT GTA r» * /** UA- GAT TCT CCT AGT TTG GAT TTA TAT Ó43
O.-U Lys Lys Ser Val Val Asp Asp Ser Pro Ser Leu Asp Phe Leu Tyr
170 175 180
Ala AAs» Asn GAT Asn 185 G\jA Gly TCT GTT AAC GGT Asn Gly 190 CCA Pro TCC GTA TCA GAA ATA CAA Gin 691
Ser Val Ser Val Ser Glu 195 Ile
CTA ATG CAT AAT CTG GC-T AAA CAT CTG AAT TCA ATG GAA CGT GTA GAA 739
Leu Mez Eis 2C0 Asn Leu Gly Lys His 205 Leu Asn Ser Mec Glu 210 Arg Val Glu
» s_<J « AAA AAA C .<7 CAG GAT GTA CAT AAT TTT GTA GCT CTG GGT 787
Leu 2Ζς Arg Lys Lys Leu Glr. 220 Asp Val His Asr. Phe 225 Val Ala Leu Gly
AG.-.TCCGG'—T GCTAACAAAG
CCCGAAAGGA
AGCTGAGTTG GCTGCTGCCA
847
ATAACTAGCA TAACCCCTTG
GGGCCCTTGG
GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA
907
GGAACTATAT
CCGGATAA
945
-53CZ 286889 B6
Informace o sekvenci SEQ ID č. 4:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 229 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 4:
Met Ser Glu Thr 1 Lvs 5 Pro Lys Tyr Asr. ío Val Asn Asn Lys Glu Leu 15
Leu Gin Ala Zle Zle Asp A * Γ* Lys Thr Glu Leu Ala Asn Asn Lys Asp
20 25 30
Asn Lys Val Val Arg Gin As.-. Asp 'Γ’η - Zle Gly Leu Ala Zle Met
35 40 45
Leu Zle Ala Glu Gly Leu Ser Lys Arg Asn Phe Ser Gly Tyx Thr
*> -a 55 60
Gin Ser Trp Lys Gin Glu Met • 15 Ala Asp Gly Zle Glu Ala Ser Ile
ž: 70 7 5 80
Lys Gly Leu Hus Asr. Phe Asp Glu TP.r Lys Tyr Lys Asn Pro His Ala
85 90 95
Tyr Ile Thr Gl- Λ ' 3 Cys Phe Asn Ala □ £ Val Gin Arg Zle Lys Lys
100 • ,Λ X « w -w 110
Glu Arg Lys Glu Val Ala Lys Lvs Tyr Ser Tyr Phe Val His Asn Val
115 120 125
Tyr Asn Ser Arg Asp Asp Asn Met Val Ala Leu Val Asp Glu Thr Phe
130 135 14G
Ile Gin Asp Ile Tyr Asp Lys Met Thr His Tvr Glu Glu Ser Thr T vjt
145 150 135 160
Arg Thr Pro Gly Ala Glu Lys Lys Ser Val Val Asp Asp Ser Pro Ser
165 170 175
Leu Asp Phe Leu Tyr Glu Ala Asn ASD Gly Ser Val Asn Glv Pro Ser
180 185 L9Ó
Val Ser Glu Ile Gin Leu Met Hrs Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser
195 200 205
Met Glu Arg Val Glu Tr? Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn
210 215 220
Phe Val Ala Leu Glv
225
Informace o sekvenci SEQ ID č. 5:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 27 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická
-54CZ 286889 B6 (iii) není anti-sense (v) typ fragmentu: vnitřní (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 5:
GAGGTGCATA TGTCAGAAAC TAAGCCT 27
Informace o sekvenci SEQ ID č. 6:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 40 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (v) typ fragmentu: vnitřní (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 6:
GGTCGGATCC ATCGTTAGCG TTAGCCTCAT ATAAAAAATC 40
Informace o sekvenci SEQ ID č. 7:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 28 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (v) typ fragmentu: vnitřní (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 7:
GGTCGGATCC TACGTTGGAC GAATGCAT 28
Informace o sekvenci SEQ ID č. 8:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 42 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (v) typ fragmentu: vnitřní (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 8:
GAGTGGATCC ATCGATCCAC CATCCGTATC AGAAATACAA CT 42
Informace o sekvenci SEQ ID č. 9:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 42 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární
-55CZ 286889 B6 (ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (v) typ fragmentu: vnitřní (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 9:
GAGTGGATCC GTTAACGGTC CATCCGTATC AGAAATACAA CT 42
Informace o sekvenci SEQ ID č. 10:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 34 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (v) typ fragmentu: vnitřní (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 10:
TCTACTCGAG TTAACCAGA GCTACAAAAT TATG 34
Informace o sekvenci SEQ ID č. 11:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 34 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: protein (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Homo sapiens (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 11:
Ser Val Ser Glu Zle Gin Leu Mec 5 His Asn 10 Leu Gly Lys His Leu As 15
Ser Me: kjLu AlTG Val Glu Trp Leu Ar? Lys Lys Leu Gin As o Val Hi
20 25 30
Asr. ?he
Informace o sekvenci SEQ ID č. 12:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 36 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: protein (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Homo sapiens (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 12:
-56CZ 286889 B6
Ser Val Ser G_u Ile 5 Gin Leu Met His Asn 10 Leu Gly Lys His Leu 15 Asn
Ser Met G-u Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin As© Val His
20 25 30
As n V 3 1 ? - Λ-2
5
Informace o sekvenci SEQ ID č. 13:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 36 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: neznámá (ii) typ molekuly: protein (iii) není hypotetická (iii) není anti-sense (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Homo sapiens (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 13:
Ser Val Ser Glu Zle 5 Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys 10 His Leu Asn 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Ast> Val His
20 25 30*
Asn ?he Val Ala Leu Gly
c

Claims (3)

1. Derivát parathormonu vybraný ze skupiny zahrnující [Leu8, Gin18, Thr33, Ala34]hPTH(l-34)OH, [Leu8, Ala16, Gin18, Ala19, Thr33, Ala34]hPTH( 1-34)OH,
10 [Leu8, Ala16, Gin18, Thr33, Ala34]hPTH( 1-34)OH, [Leu8, Asp10, Lys11, Gln18]hPTH(l-36)OH, [Leu8, Asp10, Lys11, Gin18, Thr33, Ala34]hPTH(l-34)OH, [Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gin18, Ala19]hPTH(l-36)OH, [Leu8, Asp10, Lys11, Ala16, Gin18, Thr33, Ala34]hPTH(l-34)OH,
15 [Leu8, Asp10, Lys, Ala16, Gln18]hPTH(l-36)OH, a [Leu8, Ala16, Gin18, Ala19]hPTH(l-36)OH, ve volné formě nebo ve formě soli nebo komplexu.
2. Farmaceutický prostředek k prevenci nebo léčení všech chorob kostí, které jsou spojeny se zvýšeným vyčerpáním nebo resorpcí vápníku, nebo u kterých je žádoucí fixace vápníku v kostech, vyznačující se tím, že obsahuje derivát parathormonu podle nároku 1, ve volné formě nebo ve formě fyziologicky přijatelné soli, společně s farmaceuticky přijatelným
25 ředidlem nebo nosičem.
3. Farmaceutický prostředek podle nároku 2 k prevenci nebo léčení osteoporózy různého původu, vyznačující se tím, že obsahuje derivát parathormonu podle nároku 1, ve volné formě nebo ve formě fyziologicky přijatelné soli, společně s farmaceuticky přijatelným
30 ředidlem nebo nosičem.
CZ199588A 1992-07-15 1993-07-06 Parathormone derivatives and pharmaceutical preparations in which they are comprised CZ286889B6 (en)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB929215009A GB9215009D0 (en) 1992-07-15 1992-07-15 Organic compounds
GB929226415A GB9226415D0 (en) 1992-12-18 1992-12-18 Organic compounds
GB929226859A GB9226859D0 (en) 1992-12-23 1992-12-23 Organic compounds
GB929226861A GB9226861D0 (en) 1992-12-23 1992-12-23 Organic compounds
GB939301692A GB9301692D0 (en) 1993-01-28 1993-01-28 Organic compounds
GB939301691A GB9301691D0 (en) 1993-01-28 1993-01-28 Organic compounds
GB939307673A GB9307673D0 (en) 1993-04-14 1993-04-14 Organic compounds
GB939308033A GB9308033D0 (en) 1993-04-19 1993-04-19 Organic compounds

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ8895A3 CZ8895A3 (en) 1995-10-18
CZ286889B6 true CZ286889B6 (en) 2000-07-12

Family

ID=27571302

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ199588A CZ286889B6 (en) 1992-07-15 1993-07-06 Parathormone derivatives and pharmaceutical preparations in which they are comprised

Country Status (25)

Country Link
US (2) US20050009147A1 (cs)
EP (1) EP0672057B1 (cs)
JP (1) JP3164463B2 (cs)
KR (1) KR100321651B1 (cs)
CN (1) CN1051769C (cs)
AT (1) AT408100B (cs)
AU (1) AU672790B2 (cs)
CA (1) CA2100423C (cs)
CH (1) CH688195A5 (cs)
CZ (1) CZ286889B6 (cs)
DE (2) DE4393381T1 (cs)
DK (1) DK0672057T3 (cs)
ES (1) ES2150948T3 (cs)
FI (1) FI113872B (cs)
GB (1) GB2269176B (cs)
GR (1) GR3035089T3 (cs)
HK (1) HK1004896A1 (cs)
HU (2) HUT70459A (cs)
IL (1) IL106326A (cs)
NO (1) NO319448B1 (cs)
NZ (1) NZ248137A (cs)
PT (1) PT672057E (cs)
SG (1) SG63625A1 (cs)
SK (1) SK283485B6 (cs)
WO (1) WO1994002510A2 (cs)

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5814603A (en) * 1992-06-12 1998-09-29 Affymax Technologies N.V. Compounds with PTH activity
WO1995011697A1 (fr) * 1993-10-27 1995-05-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Accelerateur de guerison utilise en chondroplastie
US5955425A (en) * 1996-08-02 1999-09-21 National Research Council Of Canada Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis
US6110892A (en) 1994-06-20 2000-08-29 National Research Council Of Canada Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis
US5556940A (en) * 1994-06-20 1996-09-17 National Research Council Of Canada Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis
CO4410206A1 (es) * 1994-07-28 1997-01-09 Sandoz Ag DERIVADOS DE PTH o PTHrP, SU PREPARACION Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LAS COMPRENDEN
US5747456A (en) * 1994-12-19 1998-05-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Continuous low-dose administration of parathyroid hormone or its agonist
CA2178894A1 (en) * 1995-06-15 1996-12-16 Tsunehiko Fukuda Parathyroid hormone derivatives and their use
US5955574A (en) * 1995-07-13 1999-09-21 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques, S.A. Analogs of parathyroid hormone
US5723577A (en) * 1995-07-13 1998-03-03 Biomeasure Inc. Analogs of parathyroid hormone
US5969095A (en) * 1995-07-13 1999-10-19 Biomeasure, Inc. Analogs of parathyroid hormone
US7410948B2 (en) 1995-07-13 2008-08-12 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques, Sas Analogs of parathyroid hormone
US6544949B1 (en) 1995-07-13 2003-04-08 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques, S.A.S. Analogs of parathyroid hormone
GEP20033095B (en) * 1996-08-02 2003-10-27 Nat Res Council Canada Parathyroid Hormone Analogues for the Treatment of Osteoporosis
EP1352912A1 (en) * 1996-08-02 2003-10-15 National Research Council Of Canada Parathyroid hormone analogues for the treatment of osteoporosis
BR9808786A (pt) 1997-05-14 2000-07-11 Rhone Poulenc Rorer Pharma Composto peptìdio cìclico ou um seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitáveis, composição farmacêutica, e, processos para tratar doenças associadas com a regulagem do cálcio em um paciente e para tratar a osteopenia ou a osteoporose em um mamìfero hospedeiro
AU8356198A (en) * 1997-07-22 1999-02-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Dental remedies containing pth
RU2224539C2 (ru) * 1997-09-09 2004-02-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Заживление переломов с помощью аналогов пептида, подобного паратироидному гормону (ртнrр)
DE69938548T2 (de) 1998-05-05 2009-06-18 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc., Boston Pth2 rezeptor selektive verbindungen
JP4486256B2 (ja) 1998-10-22 2010-06-23 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイション 副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）の生物活性ペプチドおよびペプチド誘導体
DE69942035D1 (de) 1998-11-25 2010-04-01 Gen Hospital Corp Menschliches parathyroidhormon, modifikationen, herstellung und verwendung
WO2000040698A1 (en) 1998-12-31 2000-07-13 The General Hospital Corporation Pth receptor and screening assay utilizing the same
AU2486800A (en) * 1998-12-31 2000-07-31 General Hospital Corporation, The Pth functional domain conjugate peptides, derivatives thereof and novel tetheredligand-receptor molecules
US7057012B1 (en) 1998-12-31 2006-06-06 The General Hospital Corporation PTH functional domain conjugate peptides, derivatives thereof and novel tethered ligand-receptor molecules
US20050272652A1 (en) * 1999-03-29 2005-12-08 Gault Victor A Peptide analogues of GIP for treatment of diabetes, insulin resistance and obesity
DE19916419B4 (de) * 1999-04-08 2005-06-16 Schering Ag Kombinationspräparat aus Vitamin-D-Metaboliten oder Vitamin-D-Analoga und einem Östrogenpartialagonisten zur Behandlung von Osteoporose
WO2001023521A2 (en) 1999-09-29 2001-04-05 The General Hospital Corporation Polypeptide derivatives of parathyroid hormone (pth)
WO2003009804A2 (en) 2001-07-23 2003-02-06 The General Hospital Corporation Conformationally constrained parathyroid hormone (pth) analogs
EP1531855A4 (en) 2002-01-10 2009-07-22 Osteotrophin Llc TREATMENT OF BONE DISEASES WITH SKELETTAL ANABOLIKA
GB0205693D0 (en) * 2002-03-09 2002-04-24 Astrazeneca Ab Chemical compounds
AU2003239869A1 (en) 2002-05-23 2003-12-12 Michael Holick Use of a parathyroid hormone peptide analogs for the treatment of vaginal atrophy
AU2002951372A0 (en) * 2002-09-13 2002-09-26 St Vincent's Institute Of Medical Research Parathyroid hormone-like polypeptides
WO2004093902A1 (en) 2003-03-19 2004-11-04 The General Hospital Corporation CONFORMATIONALLY CONSTRAINED PARATHYROID HORMONES WITH α-HELIX STABILIZERS
WO2005009358A2 (en) 2003-07-17 2005-02-03 The General Hospital Corporation Conformationally constrained parathyroid hormone (pth) analogs
US9046537B2 (en) 2003-09-22 2015-06-02 Enzo Biochem, Inc. Method for treating inflammation by administering a compound which binds LDL-receptor-related protein (LRP) ligand binding domain
AU2005244734A1 (en) 2004-05-13 2005-12-01 Alza Corporation Apparatus and method for transdermal delivery of parathyroid hormone agents
US9052324B2 (en) 2004-05-19 2015-06-09 Enzo Biochem, Inc. Compounds and assays for controlling Wnt activity
US8263545B2 (en) * 2005-02-11 2012-09-11 Amylin Pharmaceuticals, Inc. GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
EP2390264A1 (en) 2005-02-11 2011-11-30 Amylin Pharmaceuticals Inc. GIP analog and hybrid polypeptides with selectable propperties
AU2006289259A1 (en) * 2005-09-08 2007-03-15 Uutech Limited Analogs of gastric inhibitory polypeptide as a treatment for age related decreased pancreatic beta cell function
US20090170762A1 (en) * 2005-09-08 2009-07-02 Uutech Limited Treatment of Diabetes Related Obesity
WO2007059470A2 (en) * 2005-11-10 2007-05-24 Board Of Control Of Michigan Technological University Black bear parathyroid hormone and methods of using black bear parathyroid hormone
WO2008019062A2 (en) * 2006-08-04 2008-02-14 The General Hospital Corporation Polypeptide derivatives of parathyroid hormone (pth)
US8497240B2 (en) 2006-08-17 2013-07-30 Amylin Pharmaceuticals, Llc DPP-IV resistant GIP hybrid polypeptides with selectable properties
WO2008048784A1 (en) 2006-10-13 2008-04-24 Eli Lilly And Company Pegylated pth as pth receptor modulators and uses thereof
US8568737B2 (en) 2007-08-01 2013-10-29 The General Hospital Corporation Screening methods using G-protein coupled receptors and related compositions
CN102245625A (zh) 2008-10-17 2011-11-16 威斯康星旧生研究基金会 制备有生物活性的α-β肽的方法
US8563513B2 (en) 2009-03-27 2013-10-22 Van Andel Research Institute Parathyroid hormone peptides and parathyroid hormone-related protein peptides and methods of use
JP2013512688A (ja) 2009-12-07 2013-04-18 ミシガン テクノロジカル ユニバーシティ クロクマの副甲状腺ホルモン及びクロクマの副甲状腺ホルモンを使用する方法
JP5941040B2 (ja) 2010-05-13 2016-06-29 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 副甲状腺ホルモン類似体およびその使用
US8609621B2 (en) 2010-11-15 2013-12-17 E I Du Pont De Nemours And Company Acid-cleavable linkers exhibiting altered rates of acid hydrolysis
US20140228293A1 (en) * 2011-03-01 2014-08-14 The General Hospital Corporation Parathyroid hormone analogs, compositions and uses thereof
US20170037086A1 (en) * 2014-04-09 2017-02-09 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles with pth activity
WO2020132269A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 KSQ Therapeutics, Inc. Substituted pyrazolopyrimidines and substituted purines and their use as ubiquitin-specific-processing protease 1 (usp1) inhibitors
KR20230098186A (ko) 2020-10-30 2023-07-03 케이에스큐 세러퓨틱스 인코포레이티드 치환된 피라졸로피리미딘의 고체 상태 형태 및 이의 용도
WO2023066881A1 (en) 2021-10-18 2023-04-27 Astrazeneca Ab Inhibition of map3k15 for treating and preventing diabetes

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3886132A (en) * 1972-12-21 1975-05-27 Us Health Human parathyroid hormone
US4423037A (en) * 1982-05-13 1983-12-27 The General Hospital Corporation Inhibitors of peptide hormone action
FR2550204B1 (fr) * 1983-08-05 1987-11-13 Toyo Jozo Kk Derives peptidiques de (nle8,nle1b, tyr34)-h-pth
US4752585A (en) * 1985-12-17 1988-06-21 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins
US5420242A (en) * 1986-10-22 1995-05-30 Kaare M. Gautvik Production of human parathyroid hormone from microorganisms
US5001223A (en) * 1987-05-26 1991-03-19 Merck & Co., Inc. Parathyroid hormone antagonists with enhanced metabolic properties
EP0293158A3 (en) * 1987-05-26 1990-05-09 Merck & Co. Inc. Parathyroid hormone antagonists
US4771124A (en) * 1987-05-26 1988-09-13 Merck & Co., Inc. Parathyroid hormone antagonists with simplified synthetic methodology
DE3725320A1 (de) * 1987-07-30 1989-02-09 Biotechnolog Forschung Gmbh Expressionsvektoren und verfahren unter deren verwendung zur gewinnung von cro/ss-galaktosidase/pth-fusionsproteinen und von pth
US4968669A (en) * 1988-05-09 1990-11-06 Merck & Co., Inc. Parathyroid hormone antagonists
JPH03504201A (ja) * 1989-02-23 1991-09-19 ゲゼルシャフト・フュア・ビオテクノロギッシェ・フォルシュンク・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング　（ゲー・ベー・エフ） Ｐｔｈ変種をコードするｄｎａ配列、ｐｔｈ変種、発現ベクター、細菌宿主、利用と治療用組成物
CA2040264A1 (en) * 1990-04-12 1991-10-13 Tatsuhiko Kanmera Parathyroid hormone antagonists
US5093233A (en) * 1990-04-25 1992-03-03 Merck & Co., Inc. Antagonists with position 13 modification
GB9020544D0 (en) * 1990-09-20 1990-10-31 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
JPH0532696A (ja) * 1990-09-28 1993-02-09 Takeda Chem Ind Ltd 副甲状腺ホルモン誘導体
AU9103791A (en) * 1990-12-21 1992-07-22 Allelix Biopharmaceuticals Inc. Oxidation resistant variants of parathyroid hormone
ES2087323T3 (es) * 1991-02-19 1996-07-16 Takeda Chemical Industries Ltd Metodo para producir peptidos exentos de cisteina.
US5317010A (en) * 1991-10-10 1994-05-31 Peter K. T. Pang Parathyroid hormone analogues substituted at AA 25, 26, 27, and use in osteoporosis treatment
US5434246A (en) * 1992-03-19 1995-07-18 Takeda Chemical Industries, Ltd. Parathyroid hormone derivatives
US5382658A (en) * 1992-04-03 1995-01-17 Allelix Biopharmaceuticals Inc. Stability-enhanced variants of parathyroid hormone
US5589452A (en) * 1992-07-14 1996-12-31 Syntex (U.S.A.) Inc. Analogs of parathyroid hormone and parathyroid hormone related peptide: synthesis and use for the treatment of osteoporosis

Also Published As

Publication number Publication date
FI950171A (fi) 1995-03-13
CN1099801A (zh) 1995-03-08
EP0672057A1 (en) 1995-09-20
CA2100423C (en) 2005-06-14
IL106326A (en) 1997-09-30
PT672057E (pt) 2001-02-28
US20080318838A1 (en) 2008-12-25
ES2150948T3 (es) 2000-12-16
NO950123D0 (no) 1995-01-12
NZ248137A (en) 1995-12-21
WO1994002510A2 (en) 1994-02-03
HK1004896A1 (en) 1998-12-11
GB9314384D0 (en) 1993-08-25
WO1994002510A3 (en) 1994-05-26
DK0672057T3 (da) 2000-12-27
ATA903993A (de) 2001-01-15
HUT70459A (en) 1995-10-30
FI113872B (fi) 2004-06-30
SK4395A3 (en) 1995-06-07
CH688195A5 (de) 1997-06-13
GB2269176A (en) 1994-02-02
CZ8895A3 (en) 1995-10-18
DE4393381B4 (de) 2008-07-17
GR3035089T3 (en) 2001-03-30
FI950171A0 (fi) 1995-01-13
CN1051769C (zh) 2000-04-26
AU4156693A (en) 1994-01-20
CA2100423A1 (en) 1994-01-16
EP0672057B1 (en) 2000-09-20
KR940005670A (ko) 1994-03-22
SG63625A1 (en) 1999-03-30
DE4393381T1 (de) 1995-04-27
SK283485B6 (sk) 2003-08-05
HU211856A9 (en) 1995-12-28
NO950123L (no) 1995-03-15
GB2269176B (en) 1997-01-08
HU9500115D0 (en) 1995-03-28
IL106326A0 (en) 1994-04-12
NO319448B1 (no) 2005-08-15
JP3164463B2 (ja) 2001-05-08
AU672790B2 (en) 1996-10-17
AT408100B (de) 2001-08-27
US20050009147A1 (en) 2005-01-13
JPH06184198A (ja) 1994-07-05
KR100321651B1 (ko) 2002-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ286889B6 (en) Parathormone derivatives and pharmaceutical preparations in which they are comprised
EP0477885A2 (en) Parathyroid hormone derivatives
JPH0829097B2 (ja) 線維芽細胞発育因子
SK171492A3 (en) Polypeptide, method of its preparation its use and pharmaceutical agent
EP0748817A2 (en) Parathyroid hormone derivatives and their use
JPH08511167A (ja) ケモカインの生物学的活性の強化法
Wingender et al. Expression of human parathyroid hormone in Escherichia coli
MX2011010968A (es) Peptidos de cadena corta como agonistas de los receptores de la hormona paratiroidea (pth).
WO1996003437A1 (en) PTH OR PTHrP ANTAGONISTS
KR101036524B1 (ko) 수식 펩티드의 제조 방법
JPH05271279A (ja) ヒト副甲状腺ホルモンムテインおよびその製造法
RU2130945C1 (ru) Птг-соединения и способ их получения, содержащая их фармацевтическая композиция, фрагмент днк и слитый белок
JPH09157294A (ja) 副甲状腺ホルモン誘導体
McQueen et al. Preparation of Biologically Active Recombinant Human Progastrin 1–80
JP2004518410A5 (cs)
EP0367463A1 (en) Calcitonin gene related peptide analogues
PL179733B1 (pl) Z wiazek majacy aktywnosc PTH-podobna, sposób wytwarzania zwiazku majacego aktywnosc PTH-podobna, sekwencja nukleotydowa kodujaca bialko fuzyjne, bakteryjny wektor ekspresyjny, bakteryjne komórki gospodarzastransformowane sekwencja DNA kodujaca bialko fuzyjne, bialko fuzyjne oraz kompozycja farmaceutyczna zawierajaca zwiazek majacy aktywnosc PTH-podobna PL PL PL PL PL
NO319848B1 (no) Syntetiske peptidanaloger til PTH og PTHrp, fremgangsmate for fastfasesyntese derav, farmasoytiske preparater som omfatter dem, og anvendelse derav til fremstilling av medikamenter til behandling av reduksjoner i benmasse.
MXPA97000446A (en) Antigonists of parathyroid hormone (pth) and delos peptides related with parathyroid hormone (pth)
JPH05304976A (ja) ペプチドの製造法

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20070706