PL179733B1 - Z wiazek majacy aktywnosc PTH-podobna, sposób wytwarzania zwiazku majacego aktywnosc PTH-podobna, sekwencja nukleotydowa kodujaca bialko fuzyjne, bakteryjny wektor ekspresyjny, bakteryjne komórki gospodarzastransformowane sekwencja DNA kodujaca bialko fuzyjne, bialko fuzyjne oraz kompozycja farmaceutyczna zawierajaca zwiazek majacy aktywnosc PTH-podobna PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1 . Zwiazek majacy aktywnosc PTH-podobna o wzorze 1 Ser-Val-Ser-G lu-Ile-G ln-Leu-R1 -His-R2-R3-Gly-R4-His-Leu-R5-R6-R7-R8-Arg-V al-Glu-Trp-Leu-A rg-R9-Lys-Le- u-Gln-Asp-Val-His-R1 0 -R 11(R 1 2)n-X, w którym R 1 jest Met lub Leu, R 2 jest Asn, Asp, Gly, G ln, Glu, His, Ser, Thr lub Tyr, R3 jest Leu lub Lys, R4 jest Lys lub D- lub L-Ala, -Cys, -Gln, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu lub -Gly, Rs jest Asn, Gln, D-Gln lub D- lub L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala lub -Gly, R6 jest Ser, Asp, Ala, Glu, G ln, Phe, His, Ile lub Lys, R 7 jest Gln, R8 jest Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn lub Ile, R9 jest Lys, Gln lub Arg, R 10 jest Asn, Thr, D-Thr lub D- lub L-Ser, -Leu, -Gly, -Gln, -Arg, -Pro, -Asp, -Ile lub -Lys, R11 jest Phe lub Ala, R 12 jest Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu lub Val-Ala-Leu-Gly oraz n oznacza 0 lub 1, X oznacza OH, ORa, NH2 lub NRbRc, przy czym R ajest C 1-4alkilem, jeden z Rb i Rc jest H, a drugi z nich jest C 1-6 alkilem, a ponadto zwiazek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z L- lub D-a-aminokwasów, C2 -6 alkoksykarbonyli, C 1-8alkili, C 2-8 alkenyh, C2-8 alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C3- 6 cykloalkilo-C1-4alkili, który jest dolaczony do koncowej grupy aminowej zwiazku i/lub zwiazek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C2-6alkoksykarbonyh, C 1-8alkih, C 2 -8alkenyli, C2 -8 alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C3 -6Cykloalkilo-C1-4alkili, który jest dolaczony do grup aminowychjednego lub wiecej lancuchów bocznych, przy czym zwiazek ten wystepuje w postaci wolnej, w postaci soli lub kompleksu PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest związek mający aktywność PTH-podobną, sposób wytwarzania związku mającego aktywność PTH-podobną, sekwencja nukleotydowa kodująca białko fuzyjne, bakteryjny wektor ekspresyjny, bakteryjne komórki gospodarza stransformowane sekwencjąDNA kodującą białko fuzyjne, białko fuzyjne oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek mający aktywność PTH-podobną.

Szereg związków mających aktywność PTH-podobną, określanych jako warianty parathormonu (PTH) są to związki znane.

Z opisu patentowego nr EP 0 477 885 są znane związki PTH(1 -34) zawierające aminokwasy, które nie występująw naturze, albo które zawierają w pozycjach 8 i 18 reszty metioninowe. Obecność tych podstawników powoduje, że nie wykazuj ąone zadowalającej stabilności i/lub odporności na utlenianie i w związku z tym nie sąodpowiednie do zastosowań farmaceutycznych.

Opis WO90/10067 dotyczy związków PTH (1-84) i produktów utworzonych z udziałem tych związków. Wszystkie wytwarzane związki i produkty wykazujądość słabe działanie wobec cyklazy adenylowej lub syntazy DNA i w związku z tym nie mająistotnego znaczenia dlaN-końcowych fragmentów PTH.

Z publikacji „Endocrine Research Comunications” (1975, vol. 29, nr 8 str. 561-570) oraz „Biochemistry” (1999, t. 29, nr 43, str. 10080-10089) znana jest możliwość podstawienia aminokwasu, lub podstawienia na N-końcu, lub podstawienia grupy aminowej Lys w łańcuchu bocznym.

Używany termin „PTH” odnosi się do dowolnej, zakodowanej genetycznie formy parathormonu, włączając w to formę dojrzałą, składającą się z 84 aminokwasów, dowolnego rodzaju PTH pochodzącego z kręgowców, np. ludzkiego, świńskiego, szczurzego, bydlęcego, kurzego i jego fragmenty, jak również analogi i pochodne posiadające aktywność PTH-podobną. Pozycja każdego aminokwasu należącego do sekwencji PTH jest oznaczona cyfrą, zgodnie z przyjętymi międzynarodowymi zasadami. Konsekwentnie, w poniższym opisie ten system numerowania będzie stosowany do aminokwasów tworzących sekwencję PTH, niezależnie od układu podstawień w cząsteczce.

Zgodnie z wynalazkiem, spośród znanych związków mających aktywność PTH-podobną została wyodrębniona grupa związków, która ma nieoczekiwanie korzystne właściwości farmakologiczne. Związki te w pozycji 18 mają grupę aminokwasową Gin i równocześnie mają określonąkombinację reszt dołączonych do końcowej grupy aminowej i do grup aminowych łańcuchów bocznych, a ponadto mają wszystkie występujące w nich aminokwasy takie, jakie występują w naturze.

Zgodnie z wynalazkiem, związki mające aktywność PTH-podobną określone są wzorem 1

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₁-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-R₉-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-R₁₀-R₁₁-(R₁₂)_n-X, w którym

Rj jest Met lub Leu,

R₂ jest Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr lub Tyr,

R₃ jest Leu lub Lys,

R₄ jest Lys lub D- lub L-Ala, -Cys, -Gin, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu lub -Gly,

R₅ jest Asn, Gin, D-Gln lub D- lub L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala lub -Gly,

179 733

R₆ jest Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, Ile lub Lys,

R₇ jest Gin,

R₈ jest Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn lub Ile,

Rę jest Lys, Gin lub Arg,

R₁₀jest Asn, Thr, D-Thr lub D- lub L-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, -Arg, -Pro, -Asp, -Ile lub -Lys, Rh jest Phe lub Ala,

R₁₂ jest Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu lub Val-Ala-Leu-Gly oraz n oznacza 0 lub 1, X oznacza OH, OR^, NH₂ lub NR_bR_c, przy czym R_a jest C_Malkilem, jeden z R_b i R_c oznacza H, a drugi z nich jest C, .₆alkilem, a ponadto związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik -wybrany z L- lub D-a-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli, Cj.₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do końcowej grupy aminowej związku i/lub związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, C!_₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃^cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych, przy czym związek ten występuje w postaci wolnej, w postaci soli lub kompleksu.

Korzystnie w związku według wynalazku podstawnik R₁₀ oznacza Thr, a podstawnik R_n oznacza Ala. Związki według wynalazku są korzystnie związkami wybranymi spośród następującej grupy związków:

[Leu⁸, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH,

[Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH,

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH,

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸]hPTH,

[Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH,

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]hPTH,

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH,

[Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH oraz

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH, z których każdy związek zawiera ewentualnie co najmniej jeden rodnik wybrany spośród L- lub D-a-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli, C ,_₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, i jest dołączony do końcowej grupy aminowej związku PTH, i/lub zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, C j_₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, i jest dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych związku PTH, przy czym związek ten występuje w postaci wolnej, w postaci soli lub związku kompleksowego.

Korzystnie związki według wynalazku są wybrane spośród:

[Leu⁸, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH,

[Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH,

[Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH,

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]hPTH(l-36)OH,

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹,Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH,

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹ ]hPTH(l-36)OH„

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH,

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸]hPTH(l-36)OH oraz

[Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH i występują w postaci wolnej, w postaci soli lub kompleksu.

Według wynalazku, sposób wytwarzania związku mającego aktywność PTH-podobnąo wzorze 1

179 733

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₁-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-R₉-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-R₁₀-R₁₁-(R₁₂)_n-X, w którym

Rj jest Met lub Leu,

R₂ jest Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr lub Tyr,

R₃ jest Leu lub Lys,

R₄jest Lys lubD- lub L-Ala, -Cys, -Gin, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu lub -Gly,

R₅ jest Asn, Gin, D-Gln lub D- lub L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala lub -Gly,

R_ó jest Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, Ile lub Lys,

R₇ jest Gin,

R_g jest Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn lub Ile,

Rę jest Lys, Gin lub Arg,

R₁₀ jest Asn, Thr, D-Thr lub D- lub L-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, - Arg, -Pro, - Asp, -Ile lub -Lys, R_u jest Phe lub Ala,

R₁₂ jest Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu lub Val-Ala-Leu-Gly oraz n oznacza 0 lub 1, X oznacza OH, OR^ NH₂ lub NR_bR_c, przy czym R_a jest C_Malkilem, jeden z Rh i R,. oznacza H, a drugi z nichjest CMalkilem, a ponadto związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z L- lub D-<x-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli, C^alkili, C₂._galkenyli, C₂._galkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do końcowej grupy aminowej związku i/lub związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, C^alkili, C₂._galkenyli, C₂._galkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych, przy czym związek ten występuje w postaci wolnej, w postaci soli lub kompleksu, charakteryzuje się tym, że w komórkach bakteryjnych eksprymuje się białko fuzyjne, obejmujące N-końcowy fragment polipeptydu genu 55 bakteriofaga T4 i przyłączony do jego C-końca wymieniony związek, z wprowadzoną do niego w razie potrzeby grupą C₂.₆alkoksykarbonylową lub C ^alkilową, C₂.₈alkenylową, C₂._galkinylową, aralkilową, aralkenylową lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkilową, które są przyłączone do końcowej grupy aminowej tego związku i/lub do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych tego związku w postaci zabezpieczonej lub niezabezpieczonej i ewentualnie usuwa się grupę zabezpieczającą obecną w postaci zabezpieczonej.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku, do białka fuzyjnego, pomiędzy polipeptydem genu 55 a związkiem PTH, wprowadza się łącznik, który daje się przecinać chemicznie i który zawiera sekwencję aminokwasową Asp-Pro-Pro lub Asn-Gly-Pro.

Zgodnie z wynalazkiem sekwencja nukleotydowa, która koduje białko fuzyjne, obejmuje N-końcowy fragment polipeptydu genu 55 bateriofaga T4 i przyłączony do jego C-końca związek mający aktywność PTH-podobnąo wzorze 1

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₁-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Vał-Glu-Trp-Leu-Arg-R^-Lys-Leu-Gln-Asp-Yal-His-Rjo-Rn-CR^jn-K, w którym

Rj jest Met lub Leu,

R₂ jest Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr lub Tyr,

R₃ jest Leu lub Lys,

R₄ jest Lys lub D- lub L-Ala, -Cys, -Gin, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu lub -Gly,

R₅ jest Asn, Gin, D-Gln lub D- lub L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala lub -Gly,

R₆ jest Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, Ile lub Lys,

R₇ jest Gin,

179 733

R₈ jest Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn lub Ile,

Rp jest Lys, Gin lub Arg,

R₁₀ jest Asn, Thr, D-Thr lub D- lub L-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, -Arg, -Pro, -Asp, -Ile lub -Lys,

R] i jest Phe lub Ala,

Rj2 jest Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu lub Val-Ala-Leu-Gly oraz n oznacza 0 lub 1, X oznacza OH, ORa, NH₂ lub NR_bR_c, przy czym R_a jest C_Malkilem, jeden z R_b i R_c oznacza H, a drugi z nich jest C ^alkilem, a ponadto związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z L- lub D-a-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli, Cpgalkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do końcowej grupy aminowej związku i/lub związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, C^galkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C₁_₄alkili, który jest dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych, przy czym związek ten występuje w postaci wolnej, w postaci soli lub kompleksu.

Bakteryjny wektor ekspresyjny, według wynalazku, zawiera sekwencję nukleotydową DNA, która koduje białko fuzyjne, obejmujące N-końcowy fragment polipeptydu genu 55 bakteriofaga T4 i przyłączony do jego C-końca związek mający aktywność PTH-podobnąo wzorze 1

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₁-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Val-Glu-Trp-Leu- Arg-R₉-Lys-Leu-Głn-Asp-V al-His-R] ₀-R ₍ j -(Rj ₂)_n-X, w którym

R, jest Met lub Leu,

R₂ jest Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr lub Tyr,

R₃ jest Leu lub Lys,

R₄ jest Lys lub D- lub L-Ala, -Cys, -Gin, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu lub -Gly,

R₅ jest Asn, Gin, D-Gln lub D- lub L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala lub -Gly,

R^ jest Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, Ile lub Lys,

R₇ jest Gin,

R₈ jest Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn lub Ile,

Rg jest Lys, Gin lub Arg,

R₁₀ jest Asn, Thr, D-Thr lub D- lub L-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, -Arg, -Pro, -Asp, -Ile lub -Lys, R_n jest Phe lub Ala,

R_J2 jest Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu lub Val-Ala-Leu-Gly oraz n oznacza 0 lub 1, X oznacza OH, 01^, NH₂ lub NR_bR_c, przy czym R_ajest C_Malkilem, jeden z 1^ i Re oznacza H, a drugi z nich jest C₁.₆alkilem, aponadto związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z L- lub D-a-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli, C^alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do końcowej grupy aminowej związku i/lub związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, C^alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych, przy czym związek ten występuje w postaci wolnej, w postaci soli lub kompleksu.

Bakteryjne komórki gospodarza według wynalazku sąto komórki stransformowane sekwencją DNA kodującą białko fuzyjne, które obejmuje N-końcowy fragment polipeptydu genu 55 bakteriofaga T4 i przyłączony do jego C-końca związek mający aktywność PTH-podobnąo wzorze 1

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₁-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Rg-Lys-Leu-Gln-Asp-Yal-His-R^-Rn-fRjJn^,

179 733 w którym

Rj jest Met lub Leu,

R₂ jest Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr lub Tyr,

R₃ jest Leu lub Lys,

R₄ jest Lys lub D- lub L-Ala, -Cys, -Gin, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu lub -Gly,

R₅ jest Asn, Gin, D-Gln lub D- lub L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala lub -Gly,

R₆ jest Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His. Ile lub Lys,

R₇ jest Gin,

R₈ jest Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn lub Ile,

R₉ jest Lys, Gin lub Arg,

R₁₀ jest Asn, Thr, D-Thr lub D- lubL-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, - Arg, -Pro, - Asp, -Ile lub -Lys, R_n jest Phe lub Ala,

Ri₂ jest Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu lub Val-Ala-Leu-Gly oraz n oznacza 0 lub 1, X oznacza OH, OR^, NH₂ lub NR_bR_c, przy czym R_a jest C_Malkilem, jeden z Rj, i Rę oznacza H, a drugi z nich jest C_t.₆alkilem, a ponadto związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z L- lub D-a-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli, Cj^alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do końcowej grupy aminowej związku i/lub związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, C,_₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃_₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych, przy czym związek ten występuje w postaci wolnej, w postaci soli lub kompleksu.

Zgodnie z wynalazkiem, białko fuzyjne obejmuje N-końcowy fragment polipeptydu genu 55 bakteriofaga T4 i przyłączony do jego C-końca związek mający aktywność PTH-podobnąo wzorze 1

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₁-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Rg-Lys-Leu-Gln-Asp-Yal-His-RKj-Rn-fRpj^R, w którym

R] jest Met lub Leu,

R₂ jest Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr lub Tyr,

R₃ jest Leu lub Lys,

R₄ jest Lys lub D- lub L-Ala, -Cys, -Gin, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu lub -Gly,

R₅ jest Asn, Gin, D-Gln lub D- lub L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala lub -Gly,

Rg jest Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, Ile lub Lys,

R₇ jest Gin,

R₈ jest Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn lub Ile,

Rę jest Lys, Gin lub Arg,

R₁₀jest Asn, Thr, D-Thr lub D- lub L-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, -Arg, -Pro, -Asp, -Ile lub -Lys, R_n jest Phe lub Ala,

R₁₂ jest Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu lub Val-Ala-Leu-Gly oraz n oznacza 0 lub 1, X oznacza OH, OR^ NH₂ lub NR^, przy czym Ra jest C_Malkilem, jeden zR_b i Rę oznaczaH, a drugi znichjest CMalkilem, aponadto związekten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z L- lub D-a-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli, C^galkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do końcowej grupy aminowej związku i/lub związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, C j_₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralki

179 733 li, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych, przy czym związek ten występuje w postaci wolnej, w postaci soli lub kompleksu.

Zgodnie z wynalazkiem, kompozycja farmaceutyczna zawiera związek mający aktywność PTH-podobnąwraz z jego farmaceutycznie akceptowalnym rozpuszczalnikiem lub nośnikiem i charakteryzuje się tym, że zawiera związek mający aktywność PTH-podobną o wzorze 1

Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₁-His-R₂-R₃-Gly-R4-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Rg-Lys-Leu-Gln-Asp-Yal-His-R^-Ru-łR^jn-K, w którym

R] jest Met lub Leu,

R₂ jest Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr lub Tyr,

R₃ jest Leu lub Lys,

R₄ jest Lys lub D- lub L-Ala, -Cys, -Gin, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu lub -Gly,

R₅ jest Asn, Gin, D-Gln lub D- lub L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala lub -Gly,

R₆ jest Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, Ile lub Lys,

R₇ jest Gin,

R_g jest Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn lub Ile,

Rę jest Lys, Gin lub Arg,

R₁₀ jest Asn, Thr, D-Thr lub D- lub L-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, -Arg, -Pro, - Asp, -Ile lub -Lys,

R] _t jest Phe lub Ala,

R₁₂ jest Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu lub Val-Ala-Leu-Gly oraz n oznacza 0 lub 1, X oznacza OH, ORa, NH₂ lub NR_bR_c, przy czym R_ajest Cj^alkilem, jeden z R_b i Rc oznacza H, a drugi z nich jest C ^alkilem, a ponadto związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z L- lub D-a-aminokwasów, C₂^alkoksykarbonyli, Cpgalkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do końcowej grupy aminowej związku i/lub związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, C].₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂._galkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C₁.₄alkili, który jest dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych, przy czym związek ten występuje w postaci wolnej lub w postaci soli akceptowalnej farmakologicznie.

Stosowany w opisie termin „naturalne aminokwasy” odnosi się do aminokwasów znanych dobrze specjalistom. Są one wymienione i określone standardowymi skrótami w publikacji U.S.P.T.O. „Trademark Official Gazette”, opublikowanej 15 maja 1990, str. 33-46. Aminokwasy te i skróty ich nazw wymienione są poniżej:

A Ala alanina

D Asp kwas asparaginowy

E Glu kwas glutaminowy

F Phe fenyloalanina

G Gly glicyna

H His histydyna

I Ile izoleucyna

K Lys lizyna

L Leu leucyna

M Met metionina

N Asn asparagina

Q Gin glutamina

R Arg arginina

S Ser seryna

179 733

T Thr treonina

V Val walina

W Trp tryptofan

Y Tyr tyrozyna

Termin „aminokwasy w formie zabezpieczonej” oznacza naturalne lub nienaturalne aminokwasy mające, np. łańcuch boczny zawierający heteroatom taki jak O, S lub N, który może być zabezpieczony grupami zabezpieczającymi 0-, S- lub N-. N-koniec związku według wynalazku może również mieć postać zabezpieczoną.

Grupy N-zabezpieczające mogą być również obecne na N-końcu lub na grupach aminowych łańcuchów bocznych jednostek aminokwasowych, włączając w to takie-grupy, jak np. przedstawione w „Protective Groups in Organie Synthesis”, T.W. Greene, J. Wiley & Sons NY (1981), 219-287, na przykład grupy acylowe, tj. formyl, acetyl, trójfluoroacetyl, metoksysukcynil, hydroksysukcynil lub benzoil, ewentualnie podstawione w pierścieniu fenylowym, np. p-metoksykarbonylem, p-metoksy, p-nitro lub p-fenylosulfonamidokarbonylem; alkoksykarbonyl, taki jak t-butyloksykarbonyl, izobutyloksykarbonyl lub metoksykarbonyl; alliloksykarbonyl; trityl; 2,2,5,7,8-pentametylo-chromano-6-sulfonyl; arylometoksykarbonyl, taki jak 9-fluorenylometoksykarbonyl lub benzyloksy karbonyl, ewentualnie podstawiony w pierścieniu fenylowym p-metoksy, p-nitro, o- lub p-chloro, m-fenylo lub 3,4-dimetylem; arylometyl, taki jak benzyl ewentualnie podstawiony w pierścieniu p-metoksy, p-nitro lub p-chloro; lub arylosulfonyl, taki jak fenylosulfonyl ewentualnie podstawiony w pierścieniu p-metylo lub p-metoksy lub naftylosulfonyl ewentualnie podstawiony w pierścieniu, np. amino lub dwu(C₁-C₄alkilo)aminokwasem.

Grupy O-zabezpieczające w łańcuchach bocznych zawierających tlen są takie, jak np. przedstawiono w „The Peptides”, 3, (1981), E. Gross i J. Meienhofer (Wyd.). Dla grup hydroksyalifatycznych odpowiednimi grupami O-zabezpieczającymi są, jak podano np. w „Protection of the Hydroxy Groups”, J. M. Stewart, 169-201, następujące grupy: benzyl, t.-butyl i metyl. Dla aromatycznych grup funkcyjnych, odpowiednie O-zabezpieczające grupy obejmują grupy: benzylową, t.-butylową, metylową, tosylowąi benzyloksykarbonylową. Grupy O-zabezpieczające karboksylowe grupy funkcyjne w łańcuchach bocznych aminokwasów to dobrze znane grupy estrowe, przedstawione np. w „The Pepties”, 3,101-135 („Carboxyl Protecting Groups”, R. W. Roeske) i obejmujące grupy metylową, etylową, t.-butylową i benzylową. Grupy S-zabezpieczające dla tiolowych reszt funkcyjnych w aminokwasowych łańcuchach bocznych znane są i przedstawione np. w „The Peptides”, 3,137-167 („Sulfhydryl Group Protection”, R.G. Hiskey). Przykłady obejmują grupy: metylową, t.-butylową, benzylową, p-metoksy feny Iową, etyloamino-karbonylową i benzyloksykarbonylową.

Według wynalazku, związki PTH mogą nieść na swych końcowych grupach aminowych co najmniej jeden rodnik wybrany z L- lub D-a-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli i ewentualnie podstawionych C^alkili, C₂._galkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C ₁_₄alkili, i/lub na jednej lub więcej grupach aminowych łańcuchów bocznych co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli i ewentualnie podstawionych C _x __galkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C₁.₄alkili. Gdy grupy takie sąprzyłączane do grupy aminowej łańcucha bocznego, to ma to miejsce preferencyjnie na ε-grupie aminowej jednostki Lys. Preferowane podstawniki dla alkili, alkenyli, aralkili, aralkenyli lub cykloalkiloalkili to hydroksy, amino, a dla części arylowej również halogen i/lub C_Malkoksy. Grupa alkilowa lub część alkilowa mogą być liniowe lub rozgałęzione i ewentualnie przerywane atomami O, S lub N. Preferencyjnie dowolny C].₈alkil, C₂.₈alkenyl, aralkil, aralkenyl lub C₃.₆cykloalkilo-Cj^alkil związany z grupą aminową związku PTH nie jest podstawiony. Przykłady dla C]._galkili to C^alkile, preferencyjnie metyl, etyl, propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, t.-butyl; dla C₂.₈al

179 733 kenyli, C^alkenyle, preferencyjnie allil; dla C₂.₈alkinyli, C₂₄alkinyle, preferencyjnie prop-2-ynyl; dla aralkili, fenyl lub benzyl; dla aralkenyli, styryl; dla C₃.₆cykloalkilo-C₁.₄alkili, cykloheksylometyl. C₂.₆alkoksykarbonylem jest preferencyjnie formyl lub acetyl. Odpowiednie przykłady D- lub L-α-aminokwasów przyłączonych do N-końca obejmują, np. D- lub L-Pro, Ala. Preferowane podstawniki (gdy sąobecne) to: alkil, alkinyl, alkoksykarbonyl lub D- lubL-a-aminokwas przyłączone do N-końca związku PTH i/lub co najmniej jeden alkil lub alkoksykarbonyl przyłączony do jednej lub więcej grup aminowych łańcuchów bocznych.

Przykładami preferowanych związku PTH według wynalazku są:

[Leu⁸, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]PTH(l-x),

[Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]PTH(l-x),

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]PTH(l-x),

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸]PTH(l-x),

[Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]PTH(l-x),

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]PTH(l-x),

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]PTH(l-x),

[Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]PTH(l-x), oraz

[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]PTH(l-x), gdzie x jest liczbą całkowitą od 34 do 38, zwłaszcza 34,36,37 albo 38. Szczególnie korzystnie PTH(l-x) stanowi hPTH(l-x).

Związki według wynalazku mogą występować w postaci wolnej, w postaci soli lub w postaci skompleksowanej. Sole addycyjne kwasów mogą być utworzone z np. kwasami organicznymi, kwasami polimerycznymi lub kwasami nieorganicznymi. Takie sole addycyjne kwasów zawierają, np. chlorowodorki lub octany. Kompleksy są przykładowo tworzone przez związki według wynalazku z przyłączeniem substancji nieorganicznych, np. soli nieorganicznych lub wodorotlenków, takich jak soli Ca- lub Zn- i/lub przyłączeniem organicznych polimerów.

Związki według wynalazku mogą być wytwarzane przez stopniową syntezę chemiczną, w roztworach albo w fazie stałej. Mogą być wytwarzane w sposób następujący:

a) przez usunięcie co najmniej jednej grupy zabezpieczającej obecnej w związku w formie zabezpieczonej według wynalazku lub

b) przez połączenie wiązaniem amidowym dwóch fragmentów peptydowych tak, że powstaje pożądana sekwencja i następnie ewentualne przejście do etapu a) procesu,

c) w przypadku wytwarzania związku PTH, zawierającego co najmniej jeden rodnik wybrany z D- lub L-oc-aminokwasu, przyłączony do N-końca i C₂.₆alkoksykarbonyl oraz ewentualnie podstawiony C_b8alkil, C₂.₈alkenyl, C₂.₈alkinyl, aralkil, aralkenyl lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkil przyłączony do końcowej grupy aminowej i/lub do grupy aminowej łańcucha bocznego, wprowadza się rodnik w postaci zabezpieczonej lub niezabezpieczonej do związku PTH nie zawierającego takiego rodnika, przy czym jeżeli jest to konieczne, przeprowadzenie przez etap a) oraz odzyskanie związków otrzymanych w ten sposób w postaci wolnej, w postaci soli lub postaci skompleksowanej.

Etapy sposobu a), b) i c) przebiegają analogicznie jak w sposobach znanych, stosowanych w chemii peptydów lub tak jak to przedstawiono w przykładach. Gdy jest to pożądane w reakcjach tych, grupy zabezpieczające użyteczne w przypadku peptydów, mogąbyć wykorzystywane dla zabezpieczania grup funkcyjnych nie biorących udziału w reakcji. Termin grupa zabezpieczająca obejmować może również żywicę polimerową, mającą grupy funkcyjne.

Etap procesu c) może być przeprowadzany przez analogię ze znanymi metodami, np. metodami alkilacji. W preferowanym zastosowaniu, alkilacja jest prowadzona w warunkach redukcyjnych, np. z wykorzystaniem odpowiednich aldehydów lub ketonów. Reakcja ta może być prowadzona, na przykład w obecności NaBH₃CN, preferencyjnie w kwaśnym pH, np. od 5 do 7. Temperatura reakcji może wynosić np. od -20°C do 100°C. Może być korzystne przeprowadza

179 733 nie reakcji w roztworze obojętnym, np. wodzie, alkoholu, dioksanie lub DMF lub mieszaninie wyżej wymienionych związków. D- lub L-a-aminokwasy mogą również być przyłączone do N-końca zgodnie ze znanymi procedurami.

Fragment peptydowy, wykorzystywany iako substrat w etapie b), może zawierać jeden lub więcej nienaturalnych aminokwasów; może być również podstawiony na N-końcu i/lub na grupie aminowej łańcucha bocznego rodnikiem wybranym z C₂.₆alkoksykarbonyli, ewentualnie podstawionych C ^alkilem, C₂.₈alkenylem, C₂.₈alkinylem, aralkilem, aralkenylem lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkilem lub może nieść D- lub L-a-aminokwas na N-końcu.

Związki lub ich fragmenty zawierające naturalne jednostki α-aminokwasowe, według wynalazku, mogąbyć wytwarzane z wykorzystaniem technologii rekombinacyjnej (inżynierii genetycznej) przez eksprymowanie w komórkach bakteryjnych białka fuzyjnego obejmującego N-końcowy fragment genu kodującego polipeptyd 55 faga T4, z przyłączonym do jego C-końca dowolnym polipeptydem.

Gen kodujący polipeptyd 55 może obejmować również całe białko gp55 bakteriofaga T4 (188 reszt aminokwasowych) scharakteryzowane w: Gram H., Ruger R., 1985, EMBO J. 4, (1), 257-264. Alternatywnie może być wykorzystywany tylko fragment (preferencyjnie fragment N-końcowy) białka gp55. Przykładowo może to być fragment białka gp55 obejmujący pierwszych 112 reszt aminokwasowychN-końca białka. Jednak zwykle wykorzystuje się polipeptyd kodowany przez gen 55, obejmujący co najmniej pierwszych 25 reszt z N-końca białka gp55.

Dla wygody białko fuzyjne genu 55 PTH obejmuje dający się przecinać łącznik pomiędzy polipeptydem genu 55 i pożądanym polipeptydem. Preferowany jest łącznik dający się przecinać chemicznie, a zwłaszcza łącznik zawierający sekwencję aminokwasową Asp-Pro-Pro lub AsnGly-Pro.

Sekwencja nukleotydowa, według wynalazku, koduje białko fuzyjne, składające się z N-końcowego polipeptydu genu 55 bakteriofaga T4 oraz przyłączonego do jego C-końca polipeptydu o wzorze 1 ijestsekwencjąDNAodpowiedniądo ekspresji w systemie bakteryjnym. Sekwencja ta zawiera nukleotydy kodujące dający się przecinać łącznik między genem 55, a sekwencją kodującą pożądany polipeptyd.

Wektor ekspresyjny, według wynalazku, obejmujący sekwencję kodującą DNA dla białka fuzyjnego zawiera ponadto odpowiednie sekwencje kontrolujące ekspresję, włączając w to odpowiedni promotor, operator oraz miejsce wiązania rybosomów, jak również inne odpowiednie sekwencje regulacyjne. Zwykle, wektor ekspresyjny zawiera również jeden lub więcej markerów selekcyjnych.

Dowolny, odpowiedni promotor może być wykorzystany do konstrukcji wektora, takiego jak TrpE, λΡΙ, λΡ2, lac lub Tac. Preferencyjnie promotorem jest promotor faga T7, a wektorem ekspresyjnym jest plazmid. W przypadku ekspresji w komórkach E. coli może być wykorzystany plazmid pochodny R1 lub Col-El. na przykład może być wykorzystany wektor ekspresyjny pET 17B, otrzymany z firmy Novagen, lub podobny wektor ekspresyjny.

Zgodnie z wynalazkiem, bakteryjnymi komórkami gospodarza, stransformowanymi sekwencją kodującą białko fuzyjne lub wektorem ekspresyjnym mogą być komórki dowolnego szczepu bakteryjnego jako gospodarza, ale preferowanym gospodarzemjest E. coli. Może to być na przykład szczep BL21 (DE3) Lys E E. coli lub podobny szczep.

Korzystnym jest by białko fuzyjne gromadziło się wewnątrz komórki gospodarza w postaci nierozpuszczalnych inkluzji, ułatwiając tym samym odzyskiwanie wytworzonego białka fuzyjnego z komórek. W celu odzyskania pożądanego produktu polipeptydowego z białka fuzyjnego, białko inkluzji jest upłynniane, a pożądany produkt polipeptydowy wycinany z białka fuzyjnego. Można stosować dowolną metodę upłynniania białek, np. w pH ok. 2 do 4, preferencyjnie kwasem do pH ok. 2,5 lub traktując białko czynnikiem denaturującym, np. łagodnym czynnikiem de

179 733 naturującym, takim jak chlorowodorkiem guanidyny. Oprócz tego może być konieczne usunięcie jednej lub więcej niepożądanych N-końcowych reszt aminokwasowych z produktu, które pozostały po przecięciu białka.

Wytwarzanie polipeptydu w komórkach bakteryjnego gospodarza obejmuje: transformację komórek bakteryjnego gospodarza dla uzyskania ekspresji białka fuzyjnego w postaci nierozpuszczalnych inkluzji, wyodrębnienie tych inkluzji i ich upłynnienie oraz wycięcie pożądanego polipeptydu z białka fuzyjnego.

W przypadku związków PTH, nie jest zwykle konieczne przeprowadzanie dokładnie kontrolowanych procedur denaturacji i renaturacji, w celu otrzymania produktów PTH w formie aktywnej, np. posiadających aktywność PTH-podobną. Produkty polipeptydowe o średniej wielkości można otrzymywać w formie aktywnej poprzez prostą neutralizację środowiska kwasowego, wykorzystywanego podczas upłynniania. Upłynnianie i przecinanie białka fuzyjnego może być przeprowadzane w jednoetapowym procesie.

Stosuj ąc sposób i wektor według wynalazku możliwe j est produkowanie dużych ilości produktów PTH. Wykazano, że w komórkach E. coli 50% eksprymowanych białek stanowi białko fuzyjne. Ponadto białko fuzyjne tworzy inkluzję, dające się łatwo oddzielić od innych materiałów komórkowych. Inkluzje te składają się co najmniej w 90% z białka fuzyjnego, a wiec w sposób znaczący ograniczona jest konieczność oczyszczania. Ponadto, ekspresja produktów PTH w postaci białka fuzyjnego znacząco zmniejsza endogenną obróbkę polipeptydu w komórkach bakteryjnych, umożliwiając otrzymywanie homogennego produktu.

Preferencyjnie, dający się przecinać łącznik zawiera dające się przecinać chemicznie aminokwasy, położone blisko N-końca pożądanego polipeptydu, ułatwiając wycinanie pożądanego polipeptydu z białka fuzyjnego prostą metodą chemiczną. Natomiast pożądany polipeptyd preferencyjnie nie zawiera grup dających się przecinać chemicznie.

Dający się przecinać chemicznie łącznik preferencyjnie zawiera aminokwasy Asp-Pro-Pro lub Asn-Gly-Pro. Wiązania Asp-Pro lub Asn-Gly mogą być przecinane chemicznie, np. odpowiednio kwasem mrówkowym (pH normalnie ok. 2.5) lub hydroksylaminą. Dwupeptydy Pro-Pro lub Gly-Pro pozostające na N-końcu pożądanego polipeptydu mogą być usuwane odpowiednią dwupeptydazą. Na przykład X-Pro dwupeptydylopeptydaząEC 3.4.14.5 z L.lactis. Peptydaza ta została przedstawiona w Nardi et al. 1991; Applied and Enyironmental Microbiology, 57, 45-50.

Pożądany polipeptyd może być oczyszczany po wycięciu z białka fuzyjnego. Do oczyszczania można wykorzystywać technikę HPLC. Oczyszczanie może być przeprowadzone przed usunięciem niepożądanych reszt aminokwasowych z N-końca.

Szczegółowymi przykładami związków według wynalazku sąprzykłady 1-6,8 oraz 10-19. Opisane w nich związki wykazują nieoczekiwanie korzystne własności. Przede wszystkim, związki te charakteryzują się mniejszym prawdopodobieństwem spowodowania niepożądanej łub niekorzystnej reakcji immunologicznej u pacjentów niż odpowiadające im peptydy zawierające reszty aminokwasowe nie występujące w naturze. W szczególności, wszystkie te związki mogą być przygotowywane przy zastosowaniu technik rekombinacji DNA przez ekspresję sekwencji DNA, które kodują reszty naturalnych aminokwasów. Peptydy zawierające reszty nienaturalnych aminokwasów muszą być syntetyzowane chemicznie, co jest wysoce niewygodne, ponieważ jest związane z powstawaniem niepożądanych produktów ubocznych i w konsekwencji z koniecznością bardzo uciążliwego oczyszczania.

W teście przeprowadzanym wobec cyklazy adenylowej na komórkach szczurzej osteosarkomy, związki według wynalazku wykazują działanie około 0,3 do około 10 razy większe (lub nawet większe) niż działanie odpowiadającego im naturalnego peptydu PTH(l-34) lub PTH(l-36). Przykładowo w tabeli 1, poniżej, przedstawiono wyniki badań, tzn. EC₅₀s, pD2 oraz działanie względne dla szeregu związków opisanych w przykładach wykonania (pD2 = 1/stężenie potrzebne do 50% maksymalnego wyprodukowania cAMP w oznaczaniu wobec cyklazy

179 733 adenylowej; działanie względne podano w odniesieniu do odpowiedniej naturalnej sekwencji PTH(l-34) lub fragmentu (1-36)).

Tabela 1

Przykład nr	Związek	EC50nM	pD2	Działanie względne
20	[L8, Q18, T33, A34]hPTH(l-34)OH	7,2	8,14	0,45
21	[L8, A16’19’34, Q18, T33]hPTH(l-34)OH	2,42	8,62	L47
29	[L8, A16,34, Q18, T33]hPTH(l-34)OH	1,10	8,96	1,42
31	[L8, D*°, K11, Q18]hPTH(l-36)OH	8,27	8,08	0,34
37	[L8, D10, K11, Q18, T33, A34]hPTH(l-34)OH	1,05	8,98	1,65
42	[L8, DW, K11, Alb’iy, Ql8]hPTH(l-36)OH	0,88	9,06	3,5
49	[L8, D10, K1!, A16’34, Q18, T33]hPTH(l-34)OH	1,38	8,86	1,49
50	[L8, D10, K11, A16, Q18]hPTH(l-36)OH	1,63	8,79	1,08
66	[L8, A16’ '9, Q18]hPTH(l-36)OH	3,38	8,47	0,88

Związki według wynalazku mają bardzo wysoką stabilność, mierzoną zarówno w odniesieniu do ich hydrolizy w roztworze wodnym jak i wobec utleniania. Poniżej opisano dwa doświadczenia dla związku [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala^{16, 34}, Gin¹⁸, Thr³³]hPTH(l-34)OH, dalej nazywanym związkiem SDZ PTS 893.

Doświadczenie I

Porównanie stabilności SDZ PTS 893 w roztworze wodnym ze stabilnością naturalnego związku hPTH (1-38).

SDZ PTS 893 oraz hPTH-(l-38) rozpuszczono w wodzie (dej onizowanej w systemie oczyszczania wody Milli-RO, Millipore) w stężeniu wynoszącym 0,5 mg/ml. Jeden zestaw próbek przechowywano w temperaturze pokojowej i zanalizowano przy użyciu RP-HPLC po 2 i po 4 tygodniach. Drugi zestaw próbek przechowywano w temperaturze 60°C i zanalizowano w dniu 2 i 7. Stabilność obliczono jako obszar związku pozostałego w stosunku do obszaru związku początkowego.

Tabela 2

Stabilność chemiczna SDZ PTS 893 w roztworze w porównaniu z hPTH-(l-38).

Wartości podano w % związku pozostałego (wierzchołek HPLC), (t.p. = temperatura pokojowa).

Substancja	Roztwór	tp, 2tyg.	t. p„ 4tyg.	60°C 2 dni	60°C 7 dni
SDZ PTS 893	woda pH 7,0	99%	98%	99%	99%
hPTH-(l-38)	woda pH 7,0	22%	3%	24%	0%

Doświadczenie II

Odporność na utlenianie.

Do roztworów SDZ PTS 893 oraz hPTH-(l-34), 1 ml, 4 mg/mL w wodzie dodano 20 ml H₂O₂ (30%), na 30 min., przy 37°C. Po dodaniu 1 ml wody roztwory były natychmiast liofilizowane. Roztwory testowano na działanie biologiczne w oznaczaniu cAMP w komórkach UMR 106-06. H₂O₂ odpowiadające najwyższemu stężeniu obecnemu w roztworze SDZ PTS 893 dodano do krzywej: stężenie-reakcja standardowego SDZ PTS 893, by wykluczyć efekt reakcji komórek. Po inkubacji z H₂O₂ próbki testowano 2-3 razy, dodając środki ± SEM.

179 733

Tabela 3

Wpływ inkubacji z utleniaczem H2O2 na działanie biologiczne SDZ PTS 893 (wzrost cAMP w szczurzych komórkach osteosarkoma UMR 106-06).

Wartości podano w środkach ± SEM, n=2-3.

	inkubacja	SDZ PTS 893	hPTH-(l-34)
EC50 (nM)	bez H2O2 zH2O2	2,20 ± 0,76 2,89 ± 1,38	4,40 ± 1,17 2420±115
% pozostałości		86,1	002

Związki według wynalazku zostały przetestowane in vivo i stwierdzono, że mająznakomite właściwości wspomagające wzrost kości, lepsze niż odpowiednich naturalnych fragmentów PTH. Związek z przykładu 14 został przetestowany na myszach i szczurach, w wyniku czego stwierdzono, że jest on co najmniej 4 razy bardziej skuteczny niż hPTH(l-38) w zwiększaniu syntezy tkanki kostnej i składnika mineralnego kości oraz ma bardziej korzystne tzw. „okno bezpieczeństwa” (stosunek formowania kości do wchłaniania kości) niż naturalne fragmenty PTH.

Przedstawione wyżej wyniki badań potwierdzają iż związki o aktywności PTH, według wynalazku posiadają nieoczekiwanie korzystne własności, a stosowanie ich przynosi nieoczekiwanie korzystne efekty.

Sposób według wynalazku jest dalej zilustrowany przykładami 25 do 31, które odnoszą się do hormonów stanowiących białka fiizyjne zawierające (1 -3 8)PTH. SEQ ID Nr 1 w zestawieniu sekwencji, obrazuje sekwencję aminokwasowąi odpowiadającą]ej sekwencję DNA kadłubowego białka fuzyjnego gp55-Asp-Pro-Pro-hPTH(l-38)OH sklonowanego w plazmidzie pET17B, oraz Sekw. Id. Nr 3, która obrazuje sekwencję aminokwasowąi odpowiadającą jej sekwencję DNA białka fuzyjnego o pełnej długości gp55-Asn-Gly-Pro-hPTH(l-38)OH, sklonowanego w plazmidzie pETl 7B.

W poniższych przykładach wszystkie temperatury oznaczają 0°C. Zastosowano następujące skróty:

BOC = tert.butyloksykarbonyl

DMF = dwumetyloformamid

DCM = dwuchlorometan

Fmoc - 9-fluorenylometoksykarbonyl

HOBt = 1-hydroksybenzotriazol

TFA = kwas trójfluorooctowy

Trt = trytyMrój feny lornety 1

RP-HPLC = wysoko wydajna chromatografia o odwróconej fazie

r.t. = temp, pokojowa

DNP dwunitrofenyl

Tos = tosyl

DIPC = dwuizopropylo-karbodwuimid

Pmc = 2,2,5,7,8-pentametylochromano-6-sulfonyl

Ip = izopropyl

For = formy 1

Cpe = kwas 1-amino-cyklopentano-l -karboksylowy

Cpp = kwas 1-amino-cyklopropano-l-karboksylowy

Cha = cykloheksyloalanina tBu = t.butyl

179 733

Porównawczy przykład 1: N“-izopropylo hPTH(l-34) NH₂

Peptyd ten został zsyntezowany w sposób stopniowy na żywicy opartej na złożu polistyrenowym. Grupa Boc wykorzystywana jest do zabezpieczania grup a aminowych i grupy funkcyjne łańcuchów bocznych zabezpieczane sąjak następuje: Lys(2-chlorobenzylokarbonyl), Ser(benzyl), Thr(benzyl), Glu(benzyl), Asp(benzyl), Met(0), His(DNP), Arg(Tos) oraz Trp(HCO). Inne reszty nie są zabezpieczane.

Amino-4-metylofenylo-metylo-ko-(polistyreno-dwuwinylobenzen = żywica MBHA) (0,7 mmol/g) poddawana jest następującym cyklicznym reakcjom, etapy od (1) do (7), poprzez traktowanie następującymi odczynnikami:

(1) DCM (2) kwas trifluorooctowy (50%) w DCM (3) DCM (4) dwuizopropyloetyloamina (10%) w DMF (5) DMF (6) preformowany symetryczny bezwodnik (1,4 mmol na g żywicy w punkcie wyjścia) Boc aminokwasu w DMF (7) DMF

Objętości roztworów używanych do przemywań i odczynników wynosiły od 5 do 20 ml na gram żywicy w punkcie wyj ścia. Każdy etap powtarzany był tyle razy, ile było to konieczne bądź do zakończenia reakcji zachodzącej na żywicy (etapy 2,4, 5) lub całkowitego usunięcia poprzedniego odczynnika z żywicy (etapy 1,3,5,7). Po każdym cyklu pobierano próbki żywicy i sprawdzano stopień zamknięcia cyklu, poprzez reakcję z barwnikiem, w teście kolorymetrycznym, dla grup aminowych (reakcja z ninhydryną).

Symetryczne cząsteczki bezwodnika aminokwasów Boc przygotowywano tuż przed reakcj ą, mieszaj ąc aminokwas Boc (2,8 mmola na gram żywicy) i DCCI (1,4 mmola na gram żywicy) w DCM, zawierającym DMF w ilościach wystarczających do całkowitego rozpuszczenia aminokwasu Boc. Mieszanina zostaje filtrowana, do filtratu dodawane jest więcej DMF, który jest następnie zagęszczany przez ewaporację lotnych składników w temp, nie przekraczającej 15°C i otrzymany roztwór wykorzystywany jest w etapie (6).

Cykl reakcji od (1) do (7) etapu powtarzane są dla każdej reszty aminokwasowej, tak by powstała zamierzona sekwencja aminokwasowa, za wyjątkiem Boc-Gln-OH i Boc-Arg(Tos)-OH, które przyłączane są w etapie (6) jako ich preformowane 1-hydroksybenzo-triazolowe estry w DMF.

Całkowicie zsyntetyzowany peptyd związany z żywicą (żywica peptydowa) traktowany jest dwa razy 20 ml 5% tiofenolu w DMF w temp, pokojowej przez 1 godzinę i przemywany DMF, metanolem i dwuchlorometanem. Żywica ze związanym peptydem poddawana jest następnie reakcji etapu od (1) do (5), dodawane jest następnie 0,5 ml acetonu, 84 mg NaBH₃CN i 0,2 ml kwasu octowego w 20 ml DMF na gram żywicy. Po 16 godzinach w temp, pokojowej żywica jest przemywana DMF i dwuchlorometanem, a następnie suszona.

Żywica peptydowa traktowana jest płynnym HF, siarczkiem dwumetylu, p-krezolem i 1,2-dwumerkaptoetanolem zgodnie z procedurą „low-high” przedstawioną np. w: International Journal of Peptides and Protein Research, vol. 26,262-273 (1985). Po usunięciu lotnych składników i przemyciu octanem etylu, reszta jest ekstrahowana kilkunastoma porcjami 1 % kwasu octowego, filtrowana, a filtrat jest liofilizowany. Liofilizowany produkt jest oczyszczany powtarzaną metodą chromatografii z odwróconą fazą na kolumnie z oktadecylo-krzemionki gradientem acetonitrylu w 2% kwasie fosforowym lub w 2 mM fosforanie czterometyloamonowym. Frakcje zawierające czysty związek zbierano, łączono, filtrowano przez słabo zasadowy j ono wymieniacz (w formie octanu), a filtrat liofilizowano, otrzymując wymieniony w tytule przykładu związek.

MS (lon-Spray): 4160.

179 733

Porównawczy przykład 2: [Lys(N^E-izopropylo)^26,27]hPTH(l-34)NH₂.

Peptyd jest syntetyzowany tak, jak przedstawiono to w porównawczym przykładzie 1 z tym, że używa się Lys(Fmoc) do wstawiania w pozycji 13 i Fmoc-Ser(tBu) w końcowej pozycji 1.

Całkowicie zsyntezowany peptyd związany z żywicą traktowany jest dwukrotnie 20 ml 5 tiofenolu w DMF w temp, pokojowej przez 1 godzinę i przemywany DMF, metanolem i dwuchlorometanem. Sucha żywica traktowana jest płynnym HF, jak przedstawiono w porównawczym przykładzie 1. Produkt przecinania (350 mg) jest zawieszany w mieszaninie metanolu (5 ml), buforu fosforanowego pH 5.0(5 ml), NaBH₃CN (48 mg) i acetonu (0.28 ml). Po 16 godzinach w temp, pokojowej mieszanina reakcyjna jest filtrowana, a filtrat odparowywany. Pozostałość jest zawieszana w 20% piperydynie w DMF przez 15 minut, rozcieńczana 20 objętościami eteru i filtrowana. Pozostałość jest zawieszana w 100 ml wody i kwasu octowego (dodawanego do pH = 3), filtrowana i następnie liofilizowana. Liofilizat oczyszczany jest metodą chromatografii o odwróconej fazie na kolumnie z oktadecylo-krzemionki i wymywany gradientem acetonitrylu w 2% kwasie fosforowym. Frakcje zawierające czysty związek zbierano, łączono, filtrowano przez słabo zasadowy j ono wymieniacz (w formie octanu), a filtrat liofilizowano, otrzymując wymieniony w tytule przykładu związek. MS (lon-Spray): 4205.6.

Porównawczyprzykład3: N“-Izopropylo [Ly sfNF-izopropylo)^13,26’²⁷]hPTH-( 1 -3 8)-OH a) Synteza peptydu na stałym nośniku

Peptyd ten został zsyntezowany w sposób stopniowy na żywicy opartej na złożu polistyrenowym. Grupy alfa-aminowe chronione sąprzez Fmoc, a grupy funkcyjne łańcuchów bocznych, jak następuje: Asp(OtBu), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Asn(Trt), Gln(Trt), Arg(Pmc) oraz Ser(tBu). Inne aminokwasy nie są chronione.

Fmoc-Gly zestyfikowany do 4-hydroksymetylo-fenoksymetyloco(polistyreno-l%-dwuwinylobenzenu), 0,5 mmol/g, jest stosowany jako substrat do stopniowej syntezy na podłożu stałym, polegającej na powtarzających się cyklach: usuwania zabezpieczających grup z grup alfaaminowych, przemywania, sprzęgania (przyłączania nowych aminokwasów) i przemywania. Trzy do pięciokrotny nadmiar Fmoc-aminokwasów przyłączony jest jako preformowane estry-HOBt, z wykorzystaniem DIPC. Fmoc-Arg(Pmc), Fmoc-Asn(Trt) i Fmoc-Gln(Trt) są przyłączane jako symetryczne bezwodniki, z wykorzystaniem DIPC. Po całkowitym zsyntezowaniu wszystkich wiązań peptydowych grupa chroniąca Fmoc z Ser¹ usuwana jest 20% piperydyną/DMF. Uwalnianie peptydu z żywicy polistyrenowej i usuwanie wszystkich grup chroniących łańcuchy boczne polega na traktowaniu żywicy peptydowej mieszaniną 10% dwumerkaptoetanolu, tioanizolu, tiokrezolu i wody w 90% TFA przez 3 godziny w temp, pokojowej. Cząstki żywicy są odfiltrowywane i przemywane niewielką objętością TFA. Produkt jest wytrącany ze zbieranych razem filtratów przez dodanie eteru, odfiltrowywany i suszony. Produkt oczyszczany jest metodą chromatografii na kolumnie z C-l 8 krzemionki, gradientem acetonitrylu w 2% H₃PO₄/H₂O. Frakcje zawierające czysty związek są zbierane, łączone, filtrowane przez anionową żywicę jonowymienną (Biorad, AG 4-Χ4,100-200 mesh, forma octanowa) i liofilizowane otrzymując hPTH-(l-38)-OH.

b) Alkilacja mg (9 pmoli) hPTH-(l -38)-OH (4458,2 g/mol) rozpuszczono w 1,2 ml metanolu, 1,2 ml buforu fosforanowego (Merck nr 9887, doprowadzonego do pH 5,9), 45 mg (716 mmoli) NaBH₃CH (62,84 g/mol) i 0,8 ml (11 mmoli) acetonu (73,52 ml/mol). Reakcjajest kontrolowana metodąRP-HPLC na kolumnie z krzemionki C-18 i przebiega 15 godzin w temp, pokojowej. Mieszanina reakcyjna jest rozcieńczana wodą i poddawana chromatografii na kolumnie z krzemionki C-18, gradientem acetonitrylu w 2% H₃PO₄/H₂O. Frakcje zawierające czysty związek są zbierane, łączone, filtrowane przez anionową żywicę jonowymienną (forma octanowa) i liofilizowane, dając związek jak w tytule przykładu, w formie uwodnionego polioctanu.

179 733

[a]²⁰ _D = -5,7° (c = 0,317 w 95% AcOH)

MS (lon-Spray): 4626

Porównawczy przykład 4: Na-metylo[Ala¹-]PTH-(l-38)-OH.

Łańcuch peptydowy jest syntezowany w taki sam sposób, jak w porównawczym przykładzie 3a. W pozycji 1 zamiast Fmoc-Ser(tBu)OH przyłączony jest (do żywicy peptydowej) nienaturalny aminokwas Fmoc-N^a-metylo-Ala-OH. Przecinanie, usuwanie grup zabezpieczających i oczyszczanie przeprowadzane jest tak, jak przedstawiono w porównawczym przykładzie 3a.

MS (lon-Spray) = 4455.91

Porównawczyprzykład 5: [Ala¹, Ala³, Leu⁸, Gin¹³, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Phe²³, His²⁵, His²⁶, Leu²⁷, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH.

Peptyd ten przygotowywany jest w analogiczny sposób j ak przedstawiono to w porównawczym przykładzie 3a. Zamiast Fmoc-Gly zestryfikowanego do 4-hydroksymetylo-fenoksymetyło-co(polistyreno-dwuwinylobenzenu) wykorzystuje się odpowiedni Fmoc-aminokwas np. Fmoc-Ala, Fmoc-Phe, Fmoc-D-Ala, Fmoc-D-Phe itd. Ponadto funkcyjne grupy łańcuchów bocznych zabezpieczane sąjak następuje: Thr(t.-butyl), Trp(Boc) oraz Tyr(t.-butyl).

Powtarzając procedurę przedstawioną w porównawczych przykładach 3 i 5 z wykorzystaniem odpowiednich substratów, można otrzymać następujące związki:

Przykład 1: [Leu⁸, Asp¹⁰, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr^JhPTHO -34)OH

P r z y k ł a d 2: [Leu⁸, Lys¹¹, Gln¹⁸]hPTH(l-36)OH

Przykład 3: [Leu⁸, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴ ]-hPTH(l-34)OH (IS-MS: 4007)

P r z y k ł a d 4: [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴ ]hPTH(l-34)OH

Przykład 5: [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³Ala³⁴ ]hPTH(l-34)OH (IS-MS: 3965)

Przykład 6: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]hPTH(l-36)OH

Przykład 7(porównawczy): [Leu⁸, Gin¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹, Thr³³,

Ala³⁴]hPTH(l-34)OH

Przykład 8: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH (IS-MS: 4022)

Przykład 9(porównawczy): [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gin¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH (IS-MS: 4077)

Przykład 10: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH (IS-MS:4181)

Przykład 11: [Leu⁸, Ala¹⁶, Asp¹⁷, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH (IS-MS: 4193)

Przykład 12: [Leu⁸, Ala¹⁶, Ala¹⁷, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH (IS-MS: 4149)

Przykład 13: [Leu⁸, Ala¹⁷, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH

Przykład 14: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH (IS-MS:

3980)

Przykład 15: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸]hPTH(l-36)OH (IS-MS: 4240)

Przykład 16: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH (IS-MS: 3923)

Przykład 17: [Leu⁸, Asp¹⁰, Ala¹⁶, Gln¹⁸]hPTH(l-36)OH (IS-MS: 4225)

Przykład 18: [Leu⁸,Asp¹⁰,Lys¹¹,Ala¹⁶, Gin¹⁸,Ala¹⁹, Thr³³]hPTH(l-34)OH(IS-MS:

3999)

Przykład 19: [Leu⁸, Ala¹³, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH (IS-MS: 4166)

Przykład 20 (porównawczy): [Thr³³]-hPTH-(l-38)OH

179 733

Porównawczy przykład 6: [kwas 1-aminocyklopentano-1-karboksy Iowy ³]1ιΡΊΉ-( 1-3 6)NH₂

Peptyd jest syntezowany w sposób stopniowy na żywicy opartej na polistyrenie. Grupa Fmoc wykorzystywana jest do zabezpieczania grup α aminowych.

Grupy funkcyjne łańcuchów bocznych zabezpieczane są jak następuje: Arg(Pmc), Asn(Trt), Asp(OtBu), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc) oraz Tyr(tBu). Inne aminokwasy pozostają niezabezpieczone.

4-(2',4'-dwumetoksyfenylo-Fmoc-amino-metylo)-fenoksy-ko(polistyreno-dwuwinylobenzen), 0,4 mmol/g, który może być przygotowany np. jak przedstawiono w Tetrah. Letters, 28,3787-3790 (1987), poddawany jest następującym cyklicznym reakcjom etapy od (1) do (5) - z odczynnikami:

(1) DMF (2) piperydyna (20%) w DMF (3) DMF (4) mieszanina HOBt dwuizopropylokarbodwuimidu oraz Fmoc-alaniny (0,8 mmola na gram żywicy w momencie początkowym) (5) DMF

Objętości przemywań i odczynników wahały się od 5 do 20 ml na gram żywicy w momencie startu.

W następnym cyklu reakcji od (1) do (5), Fmoc-Val zastępuje Fmoc-Ala i tak dalej, dla każdego następnego cyklu, tak by zsyntetyzować na podłożu żywicy, polipeptyd o podanej w tytule przykładu sekwencji.

Każdy etap powtarzany jest tak wiele razy, jak to jest konieczne albo do zakończenia reakcji przebiegającej w żywicy (etapy 2,4) albo do całkowitego zastąpienia poprzedniego odczynnika nowym w złożu żywicy (etapy 3, 5). Po każdym etapie pobierano próbki żywicy i sprawdzano stopień zakończenia reakcji w teście kolorymetrycznym z ninhydryną, oddziałującą z grupami aminowymi reszt aminokwasowych.

Na zakończenie syntezy przeprowadzano ostatni cykl składający się tylko z etapów (1) do (3), po czym żywicę pepty do wą przemywano 2-propanolem, a następnie mieszaniną metanolu oraz dwuchlorometanu (1:1 v/v) i suszono w eksykatorze próżniowym.

Żywicę peptydową(l g) zawieszano w mieszaninie (20 ml) TFA, wody i 1,2-dwumerkaptoetanolu (90:5:5 v/v) przez 2 godziny w temp, pokojowej, cząsteczki żywicy odfiltrowywano i przemywano małą objętością TFA. Produkt wytrącano z połączonych filtratów przez dodanie eteru (20 v), filtrowano, przemywano eterem i suszono. Pozostałość rozpuszczano w 2% kwasie octowym, odstawiano na 8 godzin w temp, pokojowej do czasu liofilizacji. Liofilizat poddawano chromatografii na kolumnie z krzemionki C-l 8, gradientem acetonitrylu w H₃PO₄. Frakcje sprawdzano metodą analitycznej HPLC i łączono te, które zawierały czysty związek, następnie filtrowano przez anionowe złoże jonowymienne (w formie octanowej) oraz liofilizowano, otrzymując związek określony w tytule przykładu (w formie wielouwodnionego wielooctanu).

Fmoc-1-aminocyclopentano-l-kwas karboksylowy wykorzystywany do przygotowania żywicy peptydowej może być przygotowany, na przykładjak podano przez G. Valleetal., 1988, w Can. J. Chem. 66: 2575-2582). MS (lon-Spray): 4312

Przykład 21 (porównawczy): [Thr³³,Ala³⁴]hPTH(l-34)NH₂

Przykład 22: [Gln¹⁸]hPTH(l-36)NH₂

Przykład 23 (porównawczy): [Ała³⁴]-hPTH(l-36)NH₂ (IS-MS: 4210)

Przykład 24 (porównawczy): [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Thr³³,

Ala³⁴]hPTH(l-34)NH₂

179 733

Związki wymienione w przykładach od 1 do 24 obrazują właściwe stosunki aminokwasowe w ilościowej analizie aminokwasowej.

Następujące poniżej przykłady obrazują techniki rekombinacyjne stosowane w sposobie według wynalazku. Jeżeli nie jest to w inny sposób zaznaczone, stosowano standardowe procedury przedstawione w Ausubel et al.; 1991; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nowy Jork. Białka fuzyjne stosowane w tych procedurach obejmują(l-38)PTH, które nie są przedmiotem wynalazku.

Porównawczy przykład 25: Klonowanie genu 55 bakteriofaga T4.

Dwa fragmenty DNA, jeden zawierający pełną sekwencję kodującągenu 55 faga T4, i drugi kodujący część tego genu, zostały zamplifikowane metodąPCR (łańcuchowej reakcji polimerazy), wykorzystując oczyszczony DNA faga T4. Jako primery wykorzystano oligonukleotydy zawierające miejsca rozpoznawane przez endonukleazy restrykcyjne BamHI lub Ndeł. Reakcja PCR (25 cykli, każdy 30 94°C, 30 50°C, 30 72°C) przeprowadzono z 1 ng matrycy i 100 pM primera do 5'końca matrycy (Sek.Id. Nr 5, miejsce rozpoznawane przezNdel obejmuje nukleotydy od 7 do 12) i 100 pM primera do 3' końca matrycy (Sek. Id. Nr 6, miej sce rozpoznawane przez BamHI obejmuje od 5 do 10) w 100 pl buforu do reakcji zawierającego 10 mM TRIS-HC1, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM każdego z czterech dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) oraz 1% TRITON X 100, pH 9,0. Otrzymano w wyniku reakcji PCR fragment o długości 0,6 kb.

Kadłubową wersję genu 55 otrzymano metodą PCR tak, jak przedstawiono dla całego genu, za wyj ątkiem innego primera od strony 3' sekwencj i matrycy (Sek. Id. Nr 7, miej sce rozpoznawane przez BamHI obejmuje od 5 do 10 nukleotydu). Otrzymano fragment o wielkości 0,3 5 kb.

Otrzymane fragmenty (0,6 i 0,35 kb) strawiono restryktazami Ndel/BamHI i wklonowano do wektora ekspresyjnego pET17B (firmy Novagen). Fragment 0,6 kb koduje pełne białko 55 faga T4 (188 reszt aminokwasowych - patrz Sek. Id. Nr 1), podczas gdy fragment 0,35 kb koduje 12 kD N-końcowy fragment gp55 (112 reszt aminokwasowych - patrz Sek. Id. Nr 3).

Porównawczy przykład 26: Przygotowanie i klonowanie DNA kodującego hPTH(l-38)

Fragment DNA kodujący a) peptyd łącznikowy odpowiadający resztom aminokwasowym 110-115 z Sek. Id. Nr 1 i hPTH(l-38) lub b) peptyd łącznikowy odpowiadający resztom aminokwasowym 186-191 z Sek. Id. Nr 3 i hPTH(l -38) otrzymano metodąPCR wykorzystując jako matrycę syntetyczną sekwencję kodującą PTH( 1-38). Oligonukleotydy kodujące łącznik a) (Sek. Id. Nr 8) lub kodujące łącznik b) (Sek. Id. Nr 9) wykorzystano jako primery od 5' końca sekwencji. Primery od 3' końca sekwencji przedstawiono w Sek. Id. Nr 10. Każdy primer od 5' końca wprowadza miejsce BamHI, a każdy primer od 3' końca wprowadza miejsce Xhol (nukleotydy od5 do 10 wkażdej z w/w sekwencji). Reakcję PCR przeprowadzano w warunkach takich, jakie przedstawiono w porównawczym przykładzie 25.

Po przecięciu BamHI i Xhol, wprowadzono otrzymany fragment 0,14 kb do strawionego BamHI-XhoI plazmidu gp55-pET17B, otrzymanego w porównawczym przykładzie 25.

W celu ekspresji białka fuzyjnego, otrzymany konstrukt plazmidowy wprowadzono do komórek E. coli BL21 (DE3) LysE i dalej namnażano pojedyncze otrzymane kolonie. Ekspresję białka fuzyjnego otrzymywano inkubując w 37°C, przez noc, w wytrząsarce obrotowej, pożywkę (Bio 101) zaszczepioną kulturą pierwotną. Kultura główna zaszczepiona została od 1 - 5% swej objętości kulturąpierwotną. Kultura główna była następnie hodowana w temperaturze 37°C i w pH od 6,9 do 7,1, przy napowietrzaniu 101/min. i wytrząsaniu z szybkością200-400 obr./min. Ekspresję indukowano dodaniem 1 mM IPTG, gdy kultura osiągnęła ODj₅₅₀ od około 1,0 do około 5.0. Po indukcji kontynuowano hodowlę przez 5 godzin, i zbierano zawiesinę komórek E. coli (nie zabijając komórek E. coli). Zebrane komórki żwirowano i zawieszono ponownie w buforze do próbek, anastępnie sprawdzano ekspresję białka metodąPAGE SDS. Pelet komórkowy

179 733 zamrożono do czasu oczyszczania. Wykorzystywane procedury oraz komórki gospodarza są dokładnie przedstawione w Studier et al., 1990, Use of T7 RN A polymerase to direct expression of cloned genes, Methods in Enzymology, Ac. Press, 60-89.

Porównawczy przykład 27: Otrzymywanie inkluzji

Zamrożone komórki E. coli otrzymane w porównawczym przykładzie 26 zawieszano do 25% w/v w buforze A (50 mM TRIS-HCł pH 8,0, zawierającym 2 mM DTT, 5 mM benzamidyno-HCl, 1,5 mM MgCl₂, 1,0 mM MnCl₂,10 pg/ml DNazy 1 i 2 mg/ml lizozymu i mieszano na mieszadle magnetycznym przez 1 godzinę w temp, pokoj owej. Zawieszone komórki lizowano w homogenizatorze Manton-Gaulin'a (2 razy, przy 12x10⁵ Pa), otrzymany lizat trzymano na lodzie. Lizat rozcieńczono 2 razy buforem B o temperaturze lodu (50 mM TRIS-HC1 pH 8,0, zawierający 2 mM DTT, 5 mM benzamidyno-HCl, 4 mM RDTA) i wirowano przy 27 500 g przez 30 minut.

Supematant ostrożnie zebrano i odrzucono. Pelet zawieszono w buforze B do 25% w/v, homogenizowano 1 raz w homogenizatorze Manton-Gaulin'a i żwirowano jak poprzednio. Proces ten powtórzono raz jeszcze z buforem B iraz z wodą. Otrzymany pelet inkluzji zważono i w razie potrzeby zamrożono w -20°C.

Porównawczy przykład 28: Upłynnianie i przecinanie inkluzji gp55-Asp-ProPro-(l-38)hPTH

Zamrożone inkluzje zawierające gp55-Asp-Pro-Pro-(l-38)hPTH, otrzy manę jak przedstawiono w porównawczym przykładzie 27, zawieszono w 10 mM roztworze HC1 (stopniując analitycznie) do końcowego stężenia 6% w/v. Roztwór inkubowano przez 24 godziny w 50°C i reakcję kończono dodaniem 1 objętości wodnego roztworu 100 mMNaOAc. Rozpuszczony supematant klarowano przez wirowanie przy 27 500 g przez 30 minut i filtrowano przez filtr z włókna szklanego.

Porównawczy przykład 29: Upłynnianie i przecinanie inkluzji gp55-Asn-GlyPro-(l-38)hPTH.

Zamrożone inkluzje zawierające gp55-Asn-Gly-Pro-(l-38)hPTH, otrzymane w porównawczym przykładzie 27, rozpuszczano w 6 M guanidyno-HCl (zawierającym 2M chlorowodorek hydroksylaminy, doprowadzony do pH 9,0 przez dodanie 4,5 M LiOH), do stężenia około 5 mg/ml białka. PH doprowadzano ponownie do pH 9 przez dodanie LiOH i roztwór inkubowano w 45°C przez 4 godziny. Reakcję kończono dodaniem kwasu mrówkowego do pH 4, a roztwór wirowano i filtrowano tak, jak przedstawiono powyżej w porównawczym przykładzie 28.

Porównawczy przykład 30: Preparatywna HPLC białka Gly-Pro i Pro-Pro (l-38)hPTH

Przefiltrowane i przecięte białko zawarte w supematancie analizowano metodą analitycznej HPLC o odwróconej fazie (Orpogen HD-Gel-RP-7s-300; kolumna 4 x 150 mm) i porównywano ze znanymi standardami (1-3 8)PTH (Bachem), w celu oznaczenia stężenia PTH. Kolumnę zrównoważono 85% buforem A do HPLC (90% woda, 10% acetonitryl; zawierający 0,1% v/v TFA) i 15% buforem B do HPLC (90% woda 10% acetonitryl; zawierający 0,1 % v/v TFA) i eluowano gradientem od 15% buforu B do 100% bufom B przez 15 minut, przy szybkości przepływu 0,75 ml/min.

W zależności od skali preparatyki, supematant nakładano na kolumnę 1,0 x 25 cm C4 Vydac lub 2,2 x 25 cm C4 Vydac. Kolumny równoważono 85% buforem A do HPLC i 15% buforem B do HPLC, przy szybkości przepływu odpowiednio 4 ml/min i 10 ml/min. Kolumny eluowano odpowiednio gradientem od 15% B do 85% B (80 ml) i 15% B do 55% B (300 ml).

Piki elucyjne Gly-Pro-hPTH(l-38) lub Pro-Pro-hPTH(l-38) zbierano ręcznie i usuwano następnie acetonitryl pod próżnią. Stosowano metodę analitycznej HPLC do określenia stężenia peptydów po przecięciu i w zebranych frakcjach.

179 733

Roztwór peptydów nie zawierający rozpuszczalnika rozcieńczano jednakową objętością 100 mM octanu sodu i pH (jeżeli to było konieczne) doprowadzano do 5,4. Po przefiltrowaniu (0,2 pm) roztwór nakładano na kolumnę zawierającą jonowymienne złoże kationowe (albo: Mono S albo SP-Sepharose High Performance, ułożone odpowiednio w kolumnach HR10/10 albo ΧΚ16/10) zrównoważone 50 mM octanem sodupH 5,4 (bufor C). Kolumnę eluowano gradientem NaCl od 0 do 500 mM w buforze C ponad 7,5 objętościami kolumnowymi. Zbierano frakcje po 10 ml, a frakcje zawierające X-X-(l-38)hPTH połączono. Stężenie peptydu oznaczano jak wyżej, metodąHPLC.

Przedstawiona powyżej metoda chromatografii jonowymiennej służyła zarówno do przeprowadzenia peptydów w bardziej odpowiednią fizjologicznie formę oraz do usunięcia dodatkowych peptydów, powstałych w wyniku przecinania chemicznego białka fuzyjnego.

Porównawczy przykład 31: Enzymatyczne usuwanie Χ-Χ z X-X-(l-3 8)hPTH

Zebrane frakcje peptydowe, otrzymane w porównawczym przykładzie 30, (stężenie w zakresie 1,5-2,0 mg/ml) doprowadzono do pH 8,0, dodając stały TRIS. Dodano następnie do stężenia 1:1000 oczyszczoną dwupeptydazę X-Prolyl (0,5 mg/ml w PBS pH 7,2) (Nardi et al., 1991, App.Env.Microbiol. 57, no. 1,45-50), a roztwór inkubowano przez 24 godziny w 37°C. Reakcję zatrzymywano dodaniem TFA do 0,2% (pH 5,0). Otrzymany (1-38)PTH izolowano metodąpreparatywnej HPLC (wykorzystując warunki takie, jakie przedstawiono w porównawczym przykładzie 30). Rozpuszczalnik usuwano, a produkt liofilizowano po odebraniu porcji potrzebnej do sekwencjonowania N-końcowego i analizy metodą spektroskopii masowej.

Przykłady wydajności uzyskiwanych dla dwóch białek fuzyjnych przedstawionych powyżej, są jak następuje:

Gen55-Asp-Pro-Pro-hPTH(l-38) (z wykorzystaniem „kadłubowej” wersji genu 55)

W warunkach optymalnego wzrostu otrzymywano 215 g peletu z 101 kultury płynnej. Procentowy poziom ekspresji białka fuzyjnego wynosił około 37%. Z peletu tego izolowano 31 g inkluzji. Czystość białka inkluzji (w porównaniu z białkiem fuzyjnym) wynosiła 61%. Po upłynnieniu, przecięciu i odwirowaniu/filtracji wykrywano około 620 mg Pro-Pro-PTH. Z materiału tego po następnym etapie oczyszczania (kolumna C4-Vydac HPLC) otrzymywano 580 mg Pro-Pro-PTH. Po rozcieńczeniu, chromatografii kationo-wymiennej (Mono S), trawieniuX-Proly dwupeptydazą(przy stężeniu Pro-Pro-PTH równym 2 mg/ml), HPLC i liofilizacji otrzymywano 440 mg czystego produktu, o pełnej aktywności biologicznej. Oznacza to poziom 71% wydajności między etapem przecinania a produktem końcowym.

Gen55-Asn-Gly-Pro-hPTH(l-38) (z wykorzystaniem „długiej” wersji genu55)

W warunkach nieoptymalnych, z płynnej kultury o objętości 20 litrów otrzymano 78 g mokrego peletu, o procentowym poziomie ekspresji 50% dla białka fuzyjnego. Po lizie i wirowaniu otrzymano 18 g, „czystej w 90%” inkluzji. Po zakończeniu reakcji przez dodanie kwasu, wirowaniu/filtracji wykrywano około 470 mg Gly-Pro-PTH. Po etapie HPLC na C4-Vydac wykrywano 355 mg peptydu. Po chromatografii jonowymiennej na SP-Sepharose - wykrywano 321 mg. Enzymatyczne usuwanie Gly i Pro przeprowadzano w roztworze peptydu o stężeniu 2 mg/ml. Po ostatecznej HPLC i liofilizacji otrzymano 244 mg czystego peptydu hPTH( 1-38),0 pełnej aktywności biologicznej, co oznacza wydajność 52%, licząc od etapu terminacji reakcji przecinania.

Testy przeprowadzone na zwierzętach wykazały, że związki według wynalazku w postaci wolnej lub w postaci dopuszczalnej farmaceutycznie soli lub kompleksów wykazują znaczące własności farmaceutyczne i w związku z tym są zalecane w postępowaniu terapeutycznym.

Aktywność biologiczna związków według wynalazku oceniana jest metodami in vitro, poprzez pomiar ich zdolności do stymulowania syntezy cyklicznego AMP w komórkach szczurzych linii UMR 106-06 i ludzkich SaOS-2, zgodnie z metodą przedstawioną przez Marcusa i Aurbacha (Endocrinology, 85, 801-810 (1969)). Komórki szczurzej osteosarkomy (linia UMR

179 733

106) hodowano do wytworzenia warstewki, w Eagle's Minimum Essential Medium, uzupełnionym 10% FCS, w 12 studzienkowych płytkach; ludzkie komórki osteosarkomy SaSO-2 hodowano w pożywce McCo/a 5A, uzupełnionej 10% FCS. Pożywki zmieniano następnie na pożywki uzupełnione 2% FCS i dodawano 1-5 pCi/studzienkę [3H]-adeniny. Dwie godziny później studzienki przemywano dwa razy pożywką bez zawartości FCS i inkubowano w pożywce DMEM, uzupełnionej 1% BSC z zawartością 1 mM 3-izoputylo-l-metyloksantyny (w celu wyeliminowania aktywności fosfodiesteraz). Testowaną substancję dodawano 20 minut później. Reakcję przerywano i ekstrahowano cAMP po 15 minutach, dodając zimnego 5% TCA. Dodawano roztworu nośnika (po 0,5 ml/studzienkę), zawierającego 5 mM nieznakowanych: adeniny, adenozyny, AMP, ADP, ATP i cAMP, jak również 0,4 pCi [14C]-adenozyny, w celu oznaczenia stopnia odzysku. [M]-cAMP oddzielano wykorzystując serię sączeń chromatograficznych przez złoża: Dowex 50W-X4 (200-400 mesh) i żel glinowy, a następnie zliczano radioaktywność izolatów. Wyniki przedstawiono w % dla kontrolnego rozpuszczalnika i wartościach EC₅₀ wyznaczonych z krzywych DRC. Związki według wynalazku stymulowały syntezę cAMP w szczurzych komórkach UMR106-06 i ludzkich komórkach osteosarkomy SaSO - 2 w stężeniu od 10¹¹ do 10’⁶ M.

Związki według wynalazku wykazywały również własności wiązania się do receptorów PTH, np. jak następuje:

Kurzy [Tyr³⁶]PTHrP(l-36)amidjodynowano, do aktywności specyficznej 2,200 Ci/mmol, metodąlaktoperoksydazową(Anawa Lab. AG, Wangen). Monowarstewki komórek nerki oposa przemywano 200 pl pożywek DMEM i HAH F12 (1:1), zawierających 1% BSA i inkubowano następnie w temperaturze 16°C z 50 000 cpm [¹²⁵I-Tyr³⁶]chPTHrP(l-36)amidu na studzienkę w obecności lub przy braku 1 μΜ [Tyr³⁶]chPTHrP(l-36)amidu. Po inkubacji studzienki przemyto 0,5 ml pożywki (4°C), lizowano 0,5 ml 1 NNaOH i oznaczono radioaktywność. Wiązanie specyficzne oznaczono jako całkowite wiązanie pomniejszone o wiązanie niespecyficzne. Krzywe współzawodniczenia analizowano wykorzystując SCTFIT, program badania regresji nieliniowej (Feyeni inni, 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 8-13) i uzyskane dane przedstawiono jako średnie wartości pK_D (n=2 do 3). Związki według wynalazku wykazywały w tym teście powinowactwo wiązania, wyrażone jako średnie wartości pK_D od 7 do 10.

Ponadto związki według wynalazku podwyższały osoczowy poziom wapnia po stałym wlewie podskórnym np. tak, jak to wykazano dla szczurów rasy Wistar, płci męskiej, z wyciętą tarczycą i przytarczycami, o masie od 140 do 170 g. W 5 dni po wycięciu tarczycy i przytarczyc szczurom implantowano minipompy Alzeta i związki badane podawano w wartościach 0,3 - 30 pg/dzień/szczura. Krew pobierano z żyły skroniowej każdego rana dnia 1,2,3 i 6, a następnie oznaczano fotometrycznie poziom wapnia w osoczu. W teście tym związki według wynalazku powodowały wzrost poziomu wapnia w osoczu.

Związki według wynalazku wskazane są do zapobiegania lub leczenia wszystkich stanów chorobowych związanych ze zwiększoną utratą wapnia lub resorpcją lub stanów, w których pożądane jest zatrzymanie wapnia w kościach np. w osteoporozach różnego pochodzenia (np. młodocianej, menopauzalnej, po-menopauzalnej, po-urazowej, spowodowanej wiekiem, terapią sterydową lub bezczynnością ruchową), przy złamaniach, osteopatii, włączając w to ostre lub chroniczne przypadki związane z demineralizacją szkieletu, osteomalacji, w około-zębowej utracie kości, lub utracie tkanki kostnej wynikającej z zapalenia stawów lub zapalenia kości i stawów lub przy leczeniu niedostatecznego wydzielania parathormonu.

Szczególnie, związki według wynalazku są wskazane dla zapobiegania i leczenia osteoporozy o różnym pochodzeniu.

Dla wszystkich wyżej wymienionych zastosowań, wskazane dawki dzienne wahają się w zakresie od około 0,003 do około 10 mg, preferencyjnie od 0,003 do 3, a szczególnie od 0,01 do

179 733 mg związku według wynalazku. Związki według wynalazku mogą być podawane: od raz dziennie do dwa razy w tygodniu.

Związki według wynalazku mogą być podawane w postaci wolnej lub w postaci dopuszczalnej farmaceutycznie soli lub związku kompleksowego. Takie sole lub kompleksy są sporządzane znanymi, powszechnie stosowanymi sposobami i wykazują tę samą aktywność co związki wolne.

Związki według wynalazku, w postaci wolnej zasady lub farmaceutycznie dopuszczalnej soli lub kompleksu, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym rozpuszczalnikiem lub nośnikiem są stosowane w kompozycjach farmaceutycznych. Do organizmu pacjenta lek jest wprowadzany w dowolny przyjęty sposób, np. parenteralnie, korzystnie w postaci roztworów lub zawiesin nadających się do wstrzyknięć, dojelitowo, korzystnie doustnie, w postaci tabletek lub kapsułek, lub w postaci przezskómej, donosowej lub w postaci czopków.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku, analogicznie jak związki według wynalazku, jest stosowana dla poprawiania procesu kształtowania się tkanki kostnej, np. zapobiegania lub leczenia wszystkich stanów chorobowych kości, związanych ze zwiększoną utratą wapnia lub resorpcją albo też stanów, w których pożądane jest zatrzymanie wapnia w kościach, np. w osteoporozach różnego pochodzenia (np. młodocianej, menopauzalnej, po-menopauzalnej, po-urazowej, spowodowanej wiekiem, terapią sterydową lub bezczynnościąruchową), a także przy złamaniach, osteopatii, włączając w to ostre lub chroniczne przypadki związane z demineralizacją szkieletu, osteomalacji, w okołozębowej utracie kości, lub utracie tkanki kostnej wynikającej z zapalenia stawów lub zapalenia stawów i kości lub przy leczeniu niedostatecznego wydzielania parathormonu u osób, którego takiego leczenia potrzebują.

Poza wymienionymi wyżej zastosowaniami związki i kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być stosowane jako dodatki lub adjuwanty także w innych terapiach, np. terapii wykorzystującej inhibitory resorpcji tkanki kostnej, zwłaszcza w terapii osteoporozy, w terapii wykorzystującej wapń, kalcytoninę lub jej analogi i pochodne, np. kalcytoninę z łososia, węgorza lub kalcytoninę ludzką, hormony steroidowe, np. estrogeny, a w szczególności agonisty estrogenu lub kombinację estrogen-gestagen, dwufosfonian, witaminę D lub jej analogi lub dowolne kombinacje wymienionych powyżej związków.

W takich terapiach związki według wynalazku podawane są w połączeniach, np. jako adjuwanty. W przypadku terapii hamującej resorpcję tkanki kostnej, dawki podawanego łącznie inhibitora zmieniają się oczywiście w zależności od typu stosowanego inhibitora, np. w zależności czy jest to steroid, czy kalcytonina i w zależności od stanu chorobowego, celu terapii (leczenie, zapobieganie), trybu postępowania i sposobu życia itd. W przypadku terapii służącej do poprawiania tworzenia się tkanki kostnej, np. przy zapobieganiu lub leczeniu utraty wapnia, zapobiegania lub leczenia każdego z wymienionych specyficznych stanów lub chorób u pacjentów wymagających takiego leczenia korzystnie stosuje się kompozycje farmaceutyczne zawierające związek według wynalazku oraz drugą substancję leczniczą, którajest inhibitorem resorpcji kości, zwłaszcza takim jak wskazano wyżej.

Szczególnie korzystnymi w powyższych zastosowaniach są związki wymienione w przykładach 3, 5, 8,14 i 15.

179 733

WYSZCZEGÓLNIENIE SEKWENCJI (1) OGÓLNE INFORMACJE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: SANDOZ LTD (B) ULICA: PO ΒΟΧ (C) MIASTO: BAZYLEA (D) STAN: BS (E) PAŃSTWO: SZWAJCARIA (F) KOD POCZTOWY (ZIP): CH 4002 (G) TELEFON: 061 324 1111 (H) TELEFAX; 061 322 7572 (I) TELEX: 965 050 55 (ii ) TYTUŁ WYNALAZKU: Związki organiczne (ii i) LICZBA SEKWENCJI: 12 (iv ) POSTAĆ CZYTELNA DLA KOMPUTERA:

(A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, wersja #1.25 (EPO) (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 717 zasadowych par (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii ) ANTI-SENSE: NIE (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: bakteriofag T4/Homo sapiens (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) ULOKOWANIE: 101..559 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 1:

179 733

AGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG

AGACCACAAC GGTTTCCCTC

TAGAAATAAT TTTGTTTAAC TTTAAGAAGG AGATATACAT ATG TCA GAA ACT AAG 115 Met Ser Glu Thr Lys 1 5

CCT AAA TAT AAT TAC

GTA AAC AAT AAA GAG CTT TTA CAA GCT ATT ATT

163

Pro

Lys Tyr

Asn Tyr 10

Val

Asn

Asn

Lys Glu Leu Leu Gin Ala Ile

Ile

15

20

GAT

TGG

AAA

ACA

GAA

TTA

GCA

AAT

AAT

AAA

GAC

CCA

AAT

AAA

GTA

GTT

211

Asp

Trp

Lys

Thr 25

Glu

Leu

Ala

Asn

Asn 30

Lys

Asp

Pro

Asn

Lys 35

Val

Val

CGT

CAG

AAT

GAT

ACT

ATC

GGA

TTA

GCC

ATT

ATG

CTT

ATT

GCA

GAA

GGC

259

Arg

Gin

Asn 40

Asp

Thr

Ile

Gly

Leu 45

Ala

Ile

Met

Leu

Ile 50

Ala

Glu

Gly

TTA TCT	AAA CGT TTC AAC ΓΓΓ TCA GGA TAC	ACC CAG TCT	TGG AAA CAA	307
Leu Ser 55	Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr 60	Thr Gin Ser 65	Trp Lys Gin

GAA

ATG

ATT

GCA

GAT

GGT

ATA

GAA

GCT

TCT

ATT

AAG

GGG

CTT

CAC

AAT

355

Glu

Met

Ile

Ala

Asp

Gly

Ile

Glu

Ala

Ser

Ile

Lys

Gly

Leu

His

Asn

70

75

80

85

TTT

GAT

GAA

ACG

AAA

TAT

AAA

AAC

CCA

CAT

GCG

TAT

ATA

ACT

CAA

GCT

403

Phe

Asp

Glu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Asn

Pro

His

Ala

Tyr

Ile

Thr

Gin

Ala

90

95

100

TGT

TTT

AAT

GCA

TTC

GTC

CAA

CGT

GGA

TCC

ATC

GAT

CCA

CCA

TCC

GTA

451

Cys

Phe

Asn

Ala

Phe

Val

Gin

Arg

Gly

Ser

Ile

Asp

Pro

Pro

Ser

Val

105

110

115

TCA Ser

GAA Glu

ATA CAA CTA ATG CAT

AAT CTG GGT AAA CAT CTG AAT TCA ATG

499

Ile Gin 120

Leu Met

His

Asn 125

Leu

Gly

Lys

His

Leu 130

Asn

Ser Met

GAA

CGT

GTA GAA

TGG CTG

CGT

AAA

AAA

CTG

CAG

GAT

GTA

CAT

ATT TTT

547

Glu

Arg

Val Glu

Trp Leu

Arg

Lys

Lys

Leu

Gin

Asp

Val

His

Asn Phe

135

140

145

GTA GCT CTG GGT TAACTCGAGC AGATCCGGCT GCTAACAAAG CCCGAAAGGA 599

Val Ala Leu Gly 150

AGCTGAGTTG GCTGCTGCCA CCGCTGAGCA ATAACTAGCA TAACCCCTTG GGGCCCTTGG 659

GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACTATAT CCGGATAA 717

179 733 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 153 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 2:

Met Ser Glu Thr Lys Pro Lys Tyr Asn Tyr Val Asn Asn Lys Glu Leu 15 1015

Leu Gin Ala Ile Ile Asp Trp Lys Thr Glu Leu Ala Asn Asn Lys Asp 20 2530

Pro Asn Lys Val Val Arg Gin Asn Asp Thr Ile Gly Leu Ala Ile Met 35 4045

Leu Ile Ala Glu Gly Leu Ser Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr Thr 50 5560

Gin Ser Trp Lys Gin Glu Met Ile Ala Asp Gly Ile Glu Ala Ser Ile 65 70 7580

Lys Gly Leu His Asn Phe Asp Glu Thr Lys Tyr Lys Asn Pro His Ala 85 9095

Tyr Ile Thr Gin Ala Cys Phe Asn Ala Phe Val Gin Arg Gly Ser Ile 100 105110

Asp Pro Pro Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys 115 120125

His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin 130 135140

Asp Val His Asn Phe Val Ala Leu Gly

145150 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 945 ZASADOWYCH PAR (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomu) (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii ) ANTI-SENSE: NIE (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: bakteriofag T4/Homo sapiens

179 733 (ix) CECHA: (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) ULOKOWANIE: 101..787 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 3:

AGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG AGACCACAAC GGTTTCCCTC 60

TAGAAATAAT TTTGTTTAAC TTTAAGAAGG AGATATACAT ATG TCA GAA ACT AAG 115 Met Ser Glu Thr Lys 15

CCT AAA TAT AAT TAC GTA AAC AAT AAA GAG CTT TTA CAA GCT ATT ATT 163 Pro Lys Tyr Asn Tyr Val Asn Asn Lys Glu Leu Leu Gin Ala Ile Ile 10 1520

GAT TGG AAA ACA GAA TTA GCA AAT AAT AAA GAC CCA AAT AAA GTA GTT211

Asp Trp Lys Thr Glu Leu Ala Asn Asn Lys Asp Pro Asn Lys ValVal

3035

CGT CAG AAT GAT ACT ATC GGA TTA GCC ATT ATG CTT ATT GCA GAA GGC259

Arg Gin Asn Asp Thr Ile Gly Leu Ala Ile Met Leu Ile Ala GluGly

4550

TTA TCT AAA CGT TTC AAC TTT TCA GGA TAC ACC CAG TCT TGG AAA CAA307

Leu Ser Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr Thr Gin Ser Trp LysGin

6065

GAA ATG ATT GCA GAT GGT ATA GAA GCT TCT ATT AAG GGG CTT CAC AAT355

Glu Met Ile Ala Asp Gly Ile Glu Ala Ser Ile Lys Gly Leu HisAsn

75 8085

TTT GAT GAA ACG AAA TAT AAA AAC CCA CAT GCG TAT ATA ACT CAA GCT403

Phe Asp Glu Thr Lys Tyr Lys Asn Pro His Ala Tyr Ile Thr GinAla

95100

TGT TTT AAT GCA TTC GTC CAA CGT ATT AAA AAA GAA CGT AAG GAA GTT451

Cys Phe Asn Ala Phe Val Gin Arg Ile Lys Lys Glu Arg Lys GluVal

105 110115

GCA AAG AAA TAT AGT TAC TTC GTT CAC AAT GTC TAT GAC AGC CGT GAC499

Ala Lys Lys Tyr Ser Tyr Phe Val His Asn Val Tyr Asp Ser ArgAsp

120 125130

GAC GAT ATG GTT GCG TTA GTA GAT GAA ACT TTT ATT CAA GAC ATC TAT547

Asp Asp Met Val Ala Leu Val Asp Glu Thr Phe Ile Gin Asp IleTyr

135 140145

GAT AAA ATG ACG CAT TAC GAA GAA TCA ACC TAT AGA ACA CCG GGG GCT595

Asp Lys Met Thr His Tyr Glu Glu Ser Thr Tyr Arg Thr Pro GlyAla

150 155 160165

179 733

GAA AAG AAA AGT

Glu Lys Lys Ser

GAG GCT AAC GAT Glu Ala Asn Asp 185

GTT GTA GAT GAT Val Val Asp Asp 170

GGA TCC GTT AAC Gly Ser Val Asn

TCT CCT AGT TTG GAT TTT TTA TAT Ser Pro Ser Leu Asp Phe Leu Tyr 175 180

GGT CCA TCC GTA TCA GAA ATA CAA Gly Pro Ser Val Ser Glu Ile Gin 190 195

CTA ATG CAT AAT

Leu Met His Asn 200

TGG CTG CGT AAA

Trp Leu Arg Lys 215

CTG GGT AAA CAT Leu Gly Lys His 205

AAA CTG CAG GAT Lys Leu Gin Asp 220

CTG AAT TCA ATG GAA CGT GTA GAA Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu 210

GTA CAT AAT TTT GTA GCT CTG GGT

Val His Asn Phe Val Ala Leu Gly 225

TAACTCGAGC AGATCCGGCT GCTAACAAAG CCCGAAAGGA AGCTGAGTTG GCTGCTGGCA

CCGCTGAGCA ATAACTAGCA TAACCCCTTG GGGCCCTTGG GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA

GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACTATAT CCGGATAA

643

691

739

787

847

907

954 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 229 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 4:

Met Ser Glu Thr Lys Pro Lys Tyr Asn Tyr Val Asn Asn Lys Glu Leu 15 1015

Leu Gin Ala Ile Ile Asp Trp Lys Thr Glu Leu Ala Asn Asn Lys Asp 20 2530

Pro Asn Lys Val Val Arg Gin Asn Asp Thr Ile Gly Leu Ala Ile Met 35 4045

Leu Ile Ala Glu Gly Leu Ser Lys Arg Phe Asn Phe Ser Gly Tyr Thr 50 5560

Gin Ser Trp Lys Gin Glu Met Ile Ala Asp Gly Ile Glu Ala SerIle

70 7580

Lys Gly Leu His Asn Phe Asp Glu Thr Lys Tyr Lys Asn Pro HisAla

9095

Tyr Ile Thr Gin Ala Cys Phe Asn Ala Phe Val Gin Arg Ile Lys Lys 100 105110

179 733

Glu Arg Lys Glu Val Ala Lys Lys Tyr Ser Tyr Phe Val His Asn Val 115 120125

Tyr Asp Ser Arg Asp Asp Asp Met Val Ala Leu Val Asp Glu Thr Phe 130 135140

Ile Gin Asp Ile Tyr Asp Lys Met Thr His Tyr Glu Glu Ser ThrTyr

145 150 155160

Arg Thr Pro Gly Ala Glu Lys Lys Ser Val Val Asp Asp Ser ProSer

165 170175

Leu Asp Phe Leu Tyr Glu Ala Asn Asp Gly Ser Val Asn Gly Pro Ser 180 185190

Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser 195 200205

Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn 210 215220

Phe Val Ala Leu Gly

225 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 zasadowych par (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii ) ANTI-SENSE: NIE (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 5:

GAGGTGCATA TGTCAGAAAC TAAGCCT (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 40 zasadowych par (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii ) ANTI-SENSE: NIE (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 6:

GGTCGGATCC ATCGTTAGCG TTAGCCTCAT ATAAAAAATC

179 733 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 28 zasadowych par (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii ) ANTI-SENSE: NIE (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 7:

GGTCGGATCC TACGTTGGAC GAATGCAT (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 zasadowe pary (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii ) ANTI-SENSE: NIE (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 8:

GAGTGGATCC ATCGATCCAC CATCCGTATC AGAAATACAA CT (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 zasadowe pary (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii ) ANTI-SENSE: NIE (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 9:

GAGTGGATCC GTTAACGGTC CATCCGTATC AGAAATACAA CT

179 733 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 34 zasadowe pary (B) TYP: kwas nukleinowy (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii ) ANTI-SENSE: NIE (v) TYP FRAGMENTU: wewnętrzny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 10:

TCTACTCGAG TTAACCCAGA GCTACAAAAT TATG (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii ) ANTI-SENSE: NIE (iv ) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 11:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 20 25 30

Asn Phe (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii ) ANTI-SENSE: NIE

179 733 (iv ) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: Homo sapiens (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR ID: 12:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 15 10 15

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His 20 25 30

Asn Phe Val Ala 35 (2) INFORMACJA DLA SEKW. NR ID: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (C) KONFORMACJA ŁAŃCUCHA: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (iii) HIPOTETYCZNY: NIE (iii ) ANTI-SENSE: NIE (iv ) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

	(xi)	(A) ORGANIZM: Homo OPIS SEKWENCJI: SEKW.	sapiens NR ID:	13:
Ser	Val Ser	Glu Ile Gin Leu Met His	Asn Leu	Gly Lys His Leu Asn
1		5	10	15
Ser	Met Glu	Arg Val Glu Trp Leu Arg	Lys Lys	Leu Gin Asp Val His
		20 25		30
Asn	Phe Val	Ala Leu Gly

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Związek mający aktywność PTH-podobną o wzorze 1

   Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₁-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Rę-Lys-Leu-Gln-Asp-Yal-His-R^-Rn-fR^jn-K, w którym

   Rj jest Met lub Leu,

   R₂ jest Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr lub Tyr,

   R₃ jest Leu lub Lys,

   R₄ jest Lys lub D- lub L-Ala, -Cys, -Gin, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu lub -Gly,

   R₅ jest Asn, Gin, D-Gln lub D- lub L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala lub -Gly,

   R^ jest Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, Ile lub Lys,

   R₇ jest Gin,

   R₈ jest Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn lub Ile,

   Rg jest Lys, Gin lub Arg,

   R₁₀ jest Asn, Thr, D-Thr lub D- lub L-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, - Arg, -Pro, - Asp, -Ile lub -Lys, R_n jest Phe lub Ala,

   R₁₂ jest Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu lub Val-Ala-Leu-Gly oraz n oznacza 0 lub 1, X oznacza OH, OR_a, NH₂ lub NR_bR_c, przy czym R_ajest C_Malkilem, jeden z Rb i R_c jest H, a drugi z nich jest C|.₆alkilem, a ponadto związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z L- lub D-a-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli, C]_₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C₁.₄alkili, który jest dołączony do końcowej grupy aminowej związku i/lub związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, Cj^alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃^cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych, przy czym związek ten występuje w postaci wolnej, w postaci soli lub kompleksu.
2. 2. Związek według zastrz. I, znamienny tym, że R_]0 jest Thr.
3. 3. Związek według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że R_n jest Ala.
4. 4. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest wybrany spośród [Leu⁸, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸]hPTH, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]hPTH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH, [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH oraz

   179 733 [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH, w których każdy związek zawiera ewentualnie co najmniej jeden rodnik wybrany spośród L- lub D-a-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli, Cj_₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃^cykloalkilo-C_Malkili, dołączony do końcowej grupy aminowej związku PTH, i/lub zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, C^alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych związku PTH, przy czym związek ten występuje w postaci wolnej, w postaci soli lub związku kompleksowego.
5. 5. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest wybrany spośród [Leu⁸, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]hPTH(l-36)OH [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹,Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(l-34)OH [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]hPTH, [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(lr34)OH [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸]hPTH(l-36)OH oraz [Leu⁸, Ala¹⁶, Gin¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(l-36)OH i występuje w postaci wolnej, w postaci soli lub kompleksu.
6. 6. Sposób wytwarzania związku mającego aktywność PTH-podobnąo wzorze 1

   Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Rj-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Val-Glu-Trp-Leu- Arg-Rę-Lys-Leu-Gln-Asp-V al-His-R₁₀-R!, -(R] 2)_n-X, w którym

   R! jest Met lub Leu,

   R₂ jest Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr lub Tyr,

   R₃ jest Leu lub Lys,

   R₄ jest Lys lub D- lub L-Ala, -Cys, -Gin, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu lub -Gly,

   R₅ jest Asn, Gin, D-Gln lub D- lub L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala lub -Gly,

   Rg jest Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, Ile lub Lys,

   R₇ jest Gin,

   R₈ jest Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn lub Ile,

   R^ jest Lys, Gin lub Arg,

   R₁₀ jest Asn, Thr, D-Thr lub D- lub L-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, -Arg, -Pro, -Asp, -Ile lub -Lys, R_n jest Phe lub Ala,

   R₁₂ jest Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu lub Val-Ala-Leu-Gly oraz n oznacza 0 lub 1, X oznacza OH, OR^, NH₂ lub NR_bR_c, przy czym R_a jest C_Malkilem, jeden z Rj, i R_c jest H, a drugi z nich jest C>.₆alkilem, a ponadto związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z L- lub D-a-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli, C₁.₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do końcowej grupy aminowej związku i/lub związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, C_x_₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych, przy czym związek ten występuje w postaci wolnej, w postaci soli lub kompleksu, znamienny tym, że w komórkach bakteryjnych eksprymuje się białko fuzyjne, obejmujące N-końcowy fragment polipeptydu genu 55 bakteriofaga T4 i przyłączony do jego C-końca wymieniony związek, z wprowadzoną do niego w razie potrzeby grupą C₂.₆alkoksy

   179 733 karbonylową lub alkilową, C₂.₈alkenylową C₂._galkinylową, aralkilową, aralkenylową lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkilową, które są przyłączone do końcowej grupy aminowej tego związku i/lub do grup aminowych j ednego lub więcej łańcuchów bocznych tego związku w postaci zabezpieczonej lub niezabezpieczonej i ewentualnie usuwa się grupę zabezpieczającą obecną w postaci zabezpieczonej.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że do białka fuzyjnego, pomiędzy polipeptydem genu 55 a związkiem ΡΊΉ, wprowadza się dający się przecinać chemicznie łącznik.
8. 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, ze wprowadza się łącznik, zawierający sekwencję aminokwasową Asp-Pro-Pro lub Asn-Gly-Pro.
9. 9. Sekwencja nukleotydowa kodująca białko fuzyjne, obejmujące N-końcowy fragment polipeptydu genu 55 bakteriofaga T4 i przyłączony do jego C-końca związek mający aktywność PTH-podobną o wzorze 1

   Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₁-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Rę-Lys-Leu-Gln-Asp-Yal-His-R^-Rn-CR^jn-K, w którym

   Rj jest Met lub Leu,

   R₂ jest Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr lub Tyr,

   R₃ jest Leu lub Lys,

   R₄ jest Lys lub D- lub L-Ala, -Cys, -Gin, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu lub -Gly,

   R₅ jest Asn, Gin, D-Gln lub D- lub L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala lub -Gly,

   R^ jest Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, Ile lub Lys,

   R₇ jest Gin,

   R₈ jest Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn lub Ile,

   Rę jest Lys, Gin lub Arg,

   R₁₀jest Asn, Thr, D-Thr lub D- lub L-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, -Arg, -Pro, -Asp, -Ile lub -Lys, R_n jest Phe lub Ala,

   R₁₂ jest Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu lub Val-Ala-Leu-Gly oraz n oznacza 0 lub 1, X oznacza OH, OR_a, NH₂ lub NR_bRę, przy czym RJest C_t^alkilem, jeden z R_b i R_c jest H, a drugi z nich jest C].₆alkilem, a ponadto związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z L- lub D-a-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli, C].₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do końcowej grupy aminowej związku i/lub związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, Cj.₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C^cyklóalkilo-C^lkili, który jest dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych, przy czym związek ten występuje w postaci wolnej, w postaci soli lub kompleksu.
10. 10. Bakteryjny wektor ekspresyjny, zawierający sekwencję nukleotydowąDNA, która koduje białko fuzyjne, obejmujące N-końcowy fragment polipeptydu genu 55 bakteriofaga T4 i przyłączony do jego C-końca związek mający aktywność PTH-podobną o wzorze 1

    Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₁-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-R₉-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-R₁₀-R₁₁-(R₁₂)_n-X, w którym

    R! jest Met lub Leu,

    R₂ jest Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr lub Tyr,

    R₃ jest Leu lub Lys,

    R₄ jest Lys lub D- lub L-Ala, -Cys, -Gin, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu lub -Gly,

    R₅ jest Asn, Gin, D-Gln lub D- lub L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala lub -Gly,

    179 733

    Rg jest Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, Ile lub Lys,

    R₇ jest Gin,

    R_g jest Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn lub Ile,

    Rg jest Lys, Gin lub Arg,

    R₁₀ jest Asn, Thr, D-Thr lub D- lub L-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, -Arg, -Pro, -Asp, -Ile lub -Lys, Rn jest Phe lub Ala,

    R₁₂ jest Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu lub Val-Ala-Leu-Gly oraz n oznacza 0 lub 1, X oznacza OH, ORg, NH₂ lub NR^, przy czym Rg jest C_Malkilem, jeden z Rt, i R_c jest H, a drugi z nich jest C^alkilem, a ponadto związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z L- lub D-a-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli, C^alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_]^alkili, który jest dołączony do końcowej grupy aminowej związku i/lub związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, C₃ _₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych, przy czym związek ten występuje w postaci wolnej, w postaci soli lub kompleksu.
11. 11. Bakteryjne komórki gospodarza stransformowane sekwencjąDNA kodującąbiałko fuzyjne, obejmujące N-końcowy fragment polipeptydu genu 55 bakteriofaga T4 i przyłączony do jego C-końca związek mający aktywność PTH-podobnąo wzorze 1

    Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₁-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Rg-Lys-Leu-Gln-Asp-V al-His-Rj ₀-R] j-(R₁₂)_n-X, w którym

    Rj jest Met lub Leu,

    R₂ jest Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr lub Tyr,

    R₃ jest Leu lub Lys,

    R₄ jest Lys lub D- lub L-Ala, -Cys, -Gin, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu lub -Gly,

    R₅ jest Asn, Gin, D-Gln lub D- lub L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala lub -Gly,

    R₆ jest Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, Ile lub Lys,

    R₇ jest Gin,

    R₈ jest Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn lub Ile,

    Rg jest Lys, Gin lub Arg,

    R₁₀ jest Asn, Thr, D-Thr lub D- lub L-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, -Arg, -Pro, -Asp, -Ile lub -Lys, R_n jest Phe lub Ala,

    R₁₂ jest Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu lub Val-Ala-Leu-Gly oraz n oznacza 0 lub 1, X oznacza OH, OR^ NH₂ lub NR_bR_c, przy czym R_a jest Cj^alkilem, jeden z R_biRJestH, adrugiznichjestCj-galkilem, aponadto związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z L- lub D-a-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli, C^galkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do końcowej grupy aminowej związku i/lub związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, C₁.₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C^gcykloalkilo-C^alkili, który jest dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych, przy czym związek ten występuje w postaci wolnej, w postaci soli lub kompleksu.
12. 12. Białko fuzyjne, obejmująceN-końcowy fragment polipeptydu genu 55 bakteriofaga T4 i przyłączony do jego C-końca związek mający aktywność PTH-podobnąo wzorze 1

    Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₁-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Rg-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-R₁₀-R_n-(R|₂)_n-X,

    179 733 w którym

    R] jest Met lub Leu,

    R₂ jest Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr lub Tyr,

    R₃ jest Leu lub Lys,

    Rt jest Lys lub D- lub L-Ala, -Cys, -Gin, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu lub -Gly,

    R₅ jest Asn, Gin, D-Gln lub D- lub L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala lub -Gly,

    R₆ jest Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, Ile lub Lys,

    R₇ jest Gin,

    R_g jest Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn lub Ile,

    Rę jest Lys, Gin lub Arg,

    R₁₀ jest Asn, Thr, D-Thr lub D- lub L-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, -Arg, -Pro, -Asp, -Ile lub -Lys, R_n jest Phe lub Ala,

    R₁₂ jest Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu lub Val-Ala-Leu-Gly oraz n oznacza 0 lub 1, X oznacza OH, ORg, NH₂ lub NR_bR_c, przy czym R_a jest C_Malkilem, jeden z Rb i R_c jest H, a drugi z nich jest C ^alkilem, a ponadto związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z L- lub D-a-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli, C].₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do końcowej grupy aminowej związku i/lub związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, C]_₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃_₆cykloalkilo-C_Malkili, który jest dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych, przy czym związek ten występuje w postaci wolnej, w postaci soli lub kompleksu.
13. 13. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek mający aktywność PTH-podobną wraz z jego farmaceutycznie akceptowalnym rozpuszczalnikiem lub nośnikiem, znamienna tym, że zawiera związek mający aktywność PTH-podobną o wzorze 1

    Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Głn-Leu-R₁-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-R₉-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-R₁₀-R_1I-(R_l2)_I1-X, w którym

    R_t jest Met lub Leu,

    R₂ jest Asn, Asp, Gly, Gin, Glu, His, Ser, Thr lub Tyr,

    R₃ jest Leu lub Lys,

    R4 jest Lys lub D- lub L-Ala, -Cys, -Gin, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu lub -Gly,

    R₅ jest Asn, Gin, D-Gln lub D- lub L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala lub -Gly,

    Rg jest Ser, Asp, Ala, Glu, Gin, Phe, His, Ile lub Lys,

    R₇ jest Gin,

    R₈ jest Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn lub Ile,

    Rę jest Lys, Gin lub Arg,

    R₁₀jest Asn, Thr, D-Thr lub D- lub L-Ser, -Leu, -Gly, -Gin, -Arg, -Pro, -Asp, -Ile lub -Lys, R_n jest Phe lub Ala,

    R₁₂ jest Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu lub Val-Ala-Leu-Gly oraz n oznacza 0 lub 1, X oznacza OH, OR^, NH₂ lub NR_bR_c, przy czym R_a jest C].₄alkilem, jeden z Rf, i Re jest H, a drugi z nich jest Cj^alkilem, a ponadto związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z L- lub D-a-aminokwasów, C₂.₆alkoksykarbonyli, Cj_₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli lub C₃.₆cykloalkilo-C_I.₄alkili, który jest dołączony do końcowej grupy aminowej związku i/lub związek ten ewentualnie zawiera co najmniej jeden rodnik wybrany z C₂.₆alkoksykarbonyli, C;.₈alkili, C₂.₈alkenyli, C₂.₈alkinyli, aralkili, aralkenyli

    179 733 lub CJ^cykloalkilo-C^alkili, który jest dołączony do grup aminowych jednego lub więcej łańcuchów bocznych, przy czym związek ten występuj e w postaci wolnej lub w postaci soli akceptowalnej farmakologicznie.

    * * *