KR101036524B1 - 수식 펩티드의 제조 방법 - Google Patents

수식 펩티드의 제조 방법 Download PDF

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간가와 겐지
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Abstract

본 발명은 측쇄가 수식된 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 단편을 약산성 이탈 수지를 이용하여 화학적으로 제조하고, 측쇄가 수식된 아미노산 잔기를 포함하지 않는 펩티드 단편을 유전자 재조합법 또는/및 발효법을 이용하여 제조하고, 이어서, 얻어진 2종의 펩티드 단편을 축합하는 것을 특징으로 하는, 측쇄가 수식된 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 또는 단백질을 제조하는 방법으로서, 본 발명에 의하면, 아실화, 당화, 인산화 등의 수식을 포함하는 펩티드 또는 단백질을 효율적이고도 고품질로 얻을 수 있다.
수식 펩티드 단편, 아미노산 잔기, 그렐린, 약산성 이탈 수지, 링커 서열

Description

수식 펩티드의 제조 방법{PROCESS FOR PRODUCING MODIFIED PEPTIDE}
본 발명은, 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법, 및 상기 제조 방법에 적합하게 이용되는 수식을 받은 아미노산 또는 비(非)아미노산을 하나 이상 포함하는 보호된 펩티드 단편의 제조 방법에 관한 것이다.
오르판 리셉터(orphan receptor)의 하나인 성장호르몬 분비촉진 인자 리셉터(GHS-R)에 대한 내인성 성장호르몬 분비촉진 인자(GHS)가 1999년 래트의 위(胃)로부터 정제 단리되어, 그렐린(Ghrelin)이라 명명되었다(Kojima 등, Nature, 402권, p.656-660, 1999년). 이 펩티드는, 세린 잔기의 수산기가 지방산으로 아실화된 특징적인 구조를 가지는 것으로 알려진다. 또 래트 이외의 척추 동물, 예를 들면 인간, 마우스, 돼지, 닭, 뱀장어, 소, 말, 양, 개구리, 무지개송어(rainbow trout) 또는 개로부터도 3위치의 세린 잔기 또는 트레오닌 잔기가 지방산 수식 부위를 가지는 그렐린이 단리, 또는 cDNA로부터 추정되었다(표 1). 예를 들면 인간 그렐린은 아미노산 28개로 이루어지고, 3위치의 세린 측쇄가 지방산(n-옥탄산)으로 아실화되어 있다. 이 신규 펩티드는 강력한 성장호르몬 분비촉진 활성을 가지며, 3위치 세린 또는 트레오닌의 지방산 수식은 그의 활성 발현에 필수인 것이 알려져 있다(Kojima 등, Nature, 402권, p.656-660, 1999년). 또, 위에서 분비된 그렐린 은, 혈중호르몬으로서 성장호르몬 분비의 조절에 기능한다는 것이 해명되어, 그렐린의 생리적 역할과 의약품에의 적용에 관해서 흥미를 끌고 있다.
[표 1]
인간(Human) : GSS(n-옥타노일)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
: GSS(n-옥타노일)FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR
래트(Rat) : GSS(n-옥타노일)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR
: GSS(n-옥타노일)FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR
마우스(Mouse) : GSS(n-옥타노일)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR
돼지(Porcine) : GSS(n-옥타노일)FLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR
소(Bovine) : GSS(n-옥타노일)FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR
양(Ovine) : GSS(n-옥타노일)FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR
개(Canine) : GSS(n-옥타노일)FLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR
뱀장어(Eel) : GSS(n-옥타노일)FLSPSQRPQGKDKKPPRV-NH 2
무지개송어(Trout) : GSS(n-옥타노일)FLSPSQKPQVRQGKGKPPRV-NH 2
: GSS(n-옥타노일)FLSPSQKPQGKGKPPRV-NH 2
닭(Chicken) : GSS(n-옥타노일)FLSPTYKNIQQQKGTRKPTAR
: GSS(n-옥타노일)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTAR
: GSS(n-옥타노일)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLH
황소개구리(Bullfrog): GLT(n-옥타노일)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM
: GLT(n-데카노일)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM
: GLT(n-옥타노일)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN
틸라피아(Tilapia) : GSS(n-옥타노일)FLSPSQKPQNKVKSSRI-NH 2
메기(Catfish) : GSS(n-옥타노일)FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-NH 2
: GSS(n-옥타노일)FLSPTQKPQNRGDRKPPRVG
말(Equine) : GSS(n-부타노일)FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR
옥타노일기(C8) 이외에도, 부타노일기(C4), 헥사노일기(C6), 데카노일기 (C10), 도데카노일기(C12) 수식체가 존재한다. 또, 불포화 지방산에 의한 수식체도 존재한다.
그렐린이나 콜레스토키닌과 같이, 펩티드 또는 단백질 중에는, 아미노산 서열 중 어느 특이적인 아미노산 잔기가 아실화나 술폰화, 당(糖) 부가 또는 인산화 등의 수식을 받음으로써, 그의 생리학적 역할을 발현하는 것이 있다. 이들 수식은 생체 내에서의 정치(精緻)한 효소계에 의해 실시된다고 생각되고, 수식을 갖는 펩티드 또는 단백질을, 고품질이고도 효율적으로 대량 제조하는 일반적인 방법은 지금까지 보고된 바 없다. 예를 들면, 그렐린은 장쇄 지방산에 의해 특정한 아미노산 측쇄가 수식을 받음으로써 성장호르몬 분비촉진 작용을 나타내는 점에서, 지방산 수식은 필수적인 구조적 요소이지만, 생체가 어떠한 효소계를 구사하여, 지방산을 특정한 아미노산 측쇄의 수산기 상에 에스테르 결합시키는 것인지, 또는 지방산이 신장되어 가는 것인지 현시점에서는 밝혀져 있지 않다. 특히 그렐린은, 아미노산 측쇄의 수산기가 지방산으로 수식된 구조를 가지는 것이 처음으로 밝혀진 생리활성 펩티드이기 때문에, 본 펩티드가 섭식장애 치료약, 성장호르몬 분비촉진약 등의 의약품으로서 기대되는 유용한 펩티드성 호르몬임에도 불구하고, 특정한 수산기 함유 아미노산 측쇄에 지방산 수식을 가지는 펩티드의 제조는 일반화되어 있지 않다, 즉, 대량으로 제조하는 데 유리한 공업적 제조 방법이 확립되어 있지 않은 것이 현재 상황이다.
현재, 인슐린, 성장호르몬, 칼시토닌, 심방성 나트륨 이뇨(利尿) 펩티드, LH-RH 유도체, 부신피질 자극호르몬 유도체 등 여러 가지 펩티드 또는 단백질 제제가 의약품으로서 사용되고 있다. 이들 펩티드 또는 단백질의 제조 방법으로는, 화학 합성법, 효소법, 유전자 재조합법에 의한 제조 방법이 알려져 있다. 어느 방법을 선택할지는 적절히 결정되지만, 일반적으로 잔기수가 적은 경우에는 화학 합성법이, 잔기수가 많은 경우에는 효소법 또는 유전자 재조합법이 선택된다.
예를 들면, 화학 합성법은 가장 확실하게 그렐린 등의 수식을 갖는 생리활성 펩티드 또는 단백질을 제조할 수 있는 방법이다. 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법으로서, 화학 합성법에 의한 제조 방법은 이미 다수 보고되어 있다. 그렐린의 예로서는, Bednarek 등(J. Med. Chem., 43권, p.4370-4376, 20O0년), Matsumoto 등(Biochem. Biophys. Res. Commun., 284권, p.655-659, 2001년)에 의해 보고되어 있다. 또, 국제공개번호: W0 01/07475에, 그렐린 및 그렐린 유도체인 펩티드 또는 그 염의 제조 방법으로서, 화학 합성법에 의한 방법이 기재되어 있다. 그러나, 화학 합성법에 의한 제조 방법에서는, 일정한 품질(순도)를 유지하여 합성할 수 있 는 펩티드의 사슬 길이에 통상 제한이 있다. 액상(液相) 화학 합성법은 고순도의 펩티드를 합성하는 것은 가능하지만, 장쇄 펩티드의 합성에는, 용해도, 긴 제조 공정, 반응 처리에 요구되는 특별한 기술 등의 점에서 일반적이 아니다. 즉, 효율적으로 대량 제조하는 것은, 액상 화학 합성법을 이용하는 제조 방법으로는 어렵다. 한편, 수지 상에서 펩티드 사슬을 연장하는 고상(固相) 화학 합성은, 공정이 단순화되어 있고, 대량 생산에는 보다 유리하지만, 이 방법도 일정 품질의 목적물을 얻기 위해서는 당연히 구축 가능한 사슬 길이에 제한이 있다. 이에 가하고, 시약을 과잉으로 사용하기 때문에, 특히 장쇄 펩티드의 제조에 있어서 경제성에서 뒤떨어지는 문제도 있다.
또, 효소법과 같이 펩티드 단편을 효소적으로 결합시키는 방법은, 아미노산 측쇄의 보호를 최소로 할 수 있는 점에서 우수하지만, 이 방법에서는 통상 가수분해의 역반응을 이용하기 때문에, 원리적으로 조건의 설정이 어려워 실용적이 아니다.
한편, 유전자 재조합법에 의한 생리활성 펩티드 또는 단백질의 제조는, 대량 생산에 알맞은 유용한 제조 방법이다. 그러나, 생산성이 높은 대장균 등의 원핵 생물을 이용하는 방법은, 원핵 생물이 번역 후 수식의 시스템을 갖지 않기 때문에, 수식 부위를 가진 펩티드의 직접적인 제조는 어렵다. 효모나 각종 난(卵)세포와 같은 진핵 세포를 이용하는 유전자 재조합법에서는, 당 수식, 아실화, 술폰화, 인산화 등의 수식은 가능하지만, 예를 들면 지방산에 관해서, 일정 길이의 지방산만을 도입하는 것은 어렵다. 단리된 그렐린 중에는, 옥탄산(C8)뿐 아니라, 부탄산(C4), 데칸산(C10), 또는 이들 불포화 지방산을 가지는 것이 발견되어 있는 점에서도, 특정 사슬 길이의 지방산 도입을 제어하는 것이 곤란함은 명백하다. 이에 가하고, 진핵 세포에 의한 생산성은 일반적으로 낮은 점에서도, 수식의 시스템을 가진 효모나 각종 난세포의 생산계는 그렐린 등의 수식을 받은 펩티드 또는 단백질의 대량 생산이라는 관점에서는, 많은 개량의 여지가 있다.
이상 설명한 바와 같이, 수식 펩티드 또는 단백질을 합성하는 방법으로서 화학 합성법이 있고, 이미 여러 가지 보고가 이루어져 있지만, 대량으로 제조하기 위해서는, 수율, 비용의 점에서 개량의 여지가 있다. 대장균 등의 원핵 세포를 이용한 유전자 재조합법으로 직접 번역 수식을 받은 펩티드 또는 단백질을 제조하는 것은 어렵다. 또, 효모 등의 진핵 세포를 이용한 유전자 재조합법에 의한 제조도, 단일성 또는 생산성의 점에서 문제가 있고, 이를 극복하기 위해서 개량의 여지가 있다. 가수분해 반응의 역반응을 사용하는 효소법은, 각각의 축합 조건의 설정이 곤란하고, 대량 생산에 유리한 방법이라고는 말할 수 없다.
이와 같이, 종래 알려져 있는 화학 합성법, 효소법, 유전자 재조합법을 단독으로 적용하여, 당 수식, 아실화, 술폰화, 인산화 등의 수식을 가지는 펩티드 또는 단백질을, 품질과 양적인 요소를 만족시키고, 또한 효율적으로 제조하는 것에 관해서는 더욱 개량의 여지가 있었다.
따라서, 상기 방법의 장점을 살리고, 결점을 보충하는 방법의 하나로, 화학 합성법과 유전자 재조합법을 조합한 반합성법을 들 수 있다. 이 제조 방법이 중요한 점은, 축합에 알맞은 형태의 펩티드 단편을 효율적으로 제조하는 것이다. 수식 된 아미노산 잔기를 가진 펩티드 단편(이하, 수식 성분이라고도 함) 및 수식된 아미노산 잔기를 갖지 않은 펩티드 단편(이하, 비수식 성분이라고도 함)은, N 말단측 또는 C 말단측 어느 쪽일 수도 있고, 또, 수식 성분이 복수일 수도 있다. 적절하게, 목적으로 하는 펩티드 또는 단백질에 맞추어 제조 방법을 설계할 수 있다. 일례로서, 수식 성분이 N 말단측에 존재하고, 상기 펩티드 단편(수식 성분)과 축합되는 다른 쪽의 펩티드 단편이 비수식 성분인 경우에 대해 상세하게 언급한다.
근래 주목되고 있는 Native chemical ligation법(Dawson 등, Science, 266권, p.776-779, 1994년)은, Ligation 부위에 CyS 잔기가 남는 결점이 있었지만, 최근, 이 방법을 개량한 티오에스테르법이 제안되었다. 예를 들면, Kawakami 등에 의해, 티오에스테르를 이용한 방법으로 인산화 펩티드를 합성한 것이 보고되어 있다(Tetrahedron Letter, 41권, p. 2625-2628, 2000년).
상기 티오에스테르법의 구체적인 예를 이하에 나타낸다. 인산화된 p21Max 단백질의 합성예에 있어서(Kawakami 등, Tetrahedron Lett., 39권, p. 7901-7904, 1998년), 고체상 화학 합성법으로 인산 수식 부위를 포함하는 펩티드 단편(수식 성분)(13mer)을 티오에스테르로서 제조한다. 한편, 비수식 성분의 N 말단에 1아미노산 잔기를 부가시킨 서열을 가지는 펩티드 단편을 대장균으로 제조하여, 이것에 2가 구리 또는 니켈 이온 존재 하에서, 글리옥실산을 작용시키고, N 말단에 부가된 아미노산 잔기를 α 케토아실기로 변환한 후, 측쇄 아미노기를 Boc기로 보호한다. 다음에, 페닐렌디아민으로 α 케토아실기를 제거함으로써, N 말단 아미노산 잔기의 아미노기만이 유리된 펩티드 단편(비수식 성분)을 조제한다. 마지막으로 이들 양단편을 은염(銀鹽), 과잉의 H0OBt 등의 활성 에스테르화제를 가하여 축합한다.
상기 방법에 있어서도, 아직 하기와 같은 과제가 남는다. 펩티드 단편(수식 성분)의 제조에 있어서, 그의 티오에스테르의 안정성 측면의 과제가 있고, 수율은 11%로 기재되어 있다. 또, 펩티드 단편(비수식 성분)의 제조에 있어서, α 케토아실기를 이용하는 본 방법은 N 말단 아미노기를 유리시키는 화학적 방법으로서 선택성이 높지만, α 케토아실기가 불안정하다는 점, 및 본 기의 탈리에 페닐렌디아민 등의 변이 원성 물질을 사용하는 점에서, 의약품용 생리활성 펩티드 또는 단백질을 제조하는 경우, 안전성의 과제가 남는다. 또, 양단편의 축합 반응에 있어서, 은염, 과잉의 HOOBt 등의 활성 에스테르화제를 사용하고 있어, 라세미화, 독성, 비용면에서도 과제가 있다.
화학 합성법과 유전자 재조합법을 조합한 반합성법은, 국제공개번호: WO 01/07475에도, 그렐린 및 그렐린 유도체인 펩티드 또는 그 염의 제조 방법으로서 기재되어 있다. 보다 구체적으로는, 화학 합성법에 의해 조제한 래트 그렐린(1-5)과 유전자 재조합법에 의해 조제한 래트 그렐린(6-28)을 축합하여 래트 그렐린(1-28)을 조제하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 이러한 방법에 있어서도 아직 하기와 같은 과제를 가지는 점에서, 효율적인 공업적 제조에 유리한 제조 방법으로 하기 위해서는, 개량의 여지가 많다. 즉, TFA에 의해 펩티드 사슬을 수지로부터 이탈시켜 래트 그렐린(1-5)을 얻을 때에, 동시에 Boc기, t-Bu 기가 제거되기 때문에, 다시 Boc기를 N 말단에 도입해야 하는 점, 또한, Ser 측쇄가 무보호로 되기 때문에, 래트 그렐린(6-28)과의 축합에서, 강한 활성화제를 사용할 수 없는 점 등에서, 생산성을 향상시킬 여지가 있다. 또, 보호 래트 그렐린(1-5) 및 보호 래트 그렐린(6-28)을 축합하는 과정에서, 아실펩티드 단편부의 C 말단 아미노산이 라세미화될 수 있기 때문에, 이것을 억제하기 위해서 개량의 여지가 있었다. 또한, 그렐린(m-n)은, 그렐린의 N 말단에서 m 번째∼n 번째의 아미노산 서열을 가진 펩티드를 의미한다. 이하도 동일하다.
또, 보호 펩티드 단편(비수식 성분)을 조제할 때에도 몇 가지 과제가 있다. 국제공개번호: W0 01/07475에 기재된 보호 래트 그렐린(6-28)의 제법은, 기본적으로는 2단계 효소 처리법(국제공개번호 WO 99/38984)를 채용하고 있고, 그 프로세싱 효소로서 재조합 V8 프로테아제 유도체(rV8D5)(일본 특개평9-47291)과 Kex2 프로테아제(일본 특개평10-229884)의 두 가지의 효소를 사용한다. 그러나 보호 래트 그렐린(6-28)을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 플라스미드(pG97s rGR)는 대장균 β-갈락토시다아제 유도체와 인간 부갑상선호르몬(1-34)의 융합 단백질을 고발현하는 플라스미드(일본 특개평9-296000)을 바탕으로 구축된 것이기 때문에, 보호 펩티드 단편(비수식 성분)을 조제할 때는, 그의 아미노산 서열에 알맞은 링커 서열(linker sequence)을 선택할 필요가 생기는 경우가 있다.
또한, 보호 래트 그렐린(6-28)은 수용액 중에서 보호기가 이탈되는 현상이 있고, 정제에서의 회수율은 10%로 매우 낮아 그렐린을 대량으로 안정 공급한다고 하는 측면에 있어서 또한 과제를 가진다.
이상, 화학 합성법과 유전자 재조합법의 조합에 의해서도, 효율이 좋고 또한 얻어진 제품을 의약품으로서 사용할 수 있는, 안정성이 높은 수식된 생리활성 펩티 드 또는 단백질의 제조 방법의 실현에는 과제가 있다.
본 발명은, 수식을 받은 펩티드 또는 단백질이 간편하고 효율이 좋은 공업적 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로 본 발명은, 수식 부위를 포함하는 펩티드 단편(수식 성분)을 화학 합성법에 의해 제조하고, 수식 부위를 포함하지 않는 펩티드 단편(비수식 성분)을 유전자 재조합법에 의해 제조하여, 양자를 축합함으로써 효율적으로 고품질의 수식을 받은 생리활성 펩티드 또는 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 전술한 바와 같이, 이들 각 펩티드 단편(수식 성분 및 비수식 성분)은, N 말단측 단편 또는 C 말단측 단편의 어느 쪽일 수도 있고, 또, 수식 성분이 복수일 수도 있다. 적절히, 목적으로 하는 펩티드 또는 단백질에 맞추어 제조 방법을 설계할 수 있다. 또, 본 발명은, 축합 반응에 알맞은, 보호되어 있는 펩티드 단편(수식 성분)을 수식 부위의 구조에 영향을 미치지 않는 온화한 조건으로 제조하는 방법, 및 보호되어 있는 펩티드 단편(비수식 성분)과의 축합에 알맞은 보호되어 있는 펩티드 단편(수식 성분)의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, 얻어진 제품을 의약품으로서 사용할 수 있는 안정성이 높은, 수식된 생리활성 펩티드 또는 단백질의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히 본 발명은, 그렐린 및 그렐린 유도체의 간편하고 효율이 좋은 공업적 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 그렐린을 소재로, 그렐린 또는 그 유도체 중의 아실기에 의해 수식된 아미노산을 포함하는 펩티드 단편(수식 성분)의 합성 방법을 개량하고, 펩티드 단편(수식 성분)의 제조 공정을 대폭 간략화 또한 효율화할 수 있는 방법을 확립했다. 즉, 2-클로로트리틸 수지 등의 약산성 이탈 수지 상에서 펩티드 단편(수식 성분)의 펩티드 주쇄(主鎖) 서열을 구축하고, 계속해서, 잔기 선택적 수식을 실시한 후, 아세트산 등의 약산 처리에 의해 고체상 수지 상에서 보호 수식 펩티드를 잘라낼 수 있는 것을 발견했다. 종래의 기술로서, 트리플루오로아세트산 등으로 수지에서 잘라낼 수 있는 Wang 수지 등의 수지 상에서 수식기를 도입한 후, 수지로부터의 잘라냄과 동시에 보호기도 탈리시키는 방법이 알려져 있었다. 그러나, 본 법에서는, 잘라낸 펩티드 단편(수식 성분)은, 이어서, 다른 한 쪽의 펩티드 단편(비수식 성분)과의 축합 반응에 제공하기 위해, 수지로부터의 잘라냄과 동시에 보호기도 탈리되는 종래 기술에 의한 방법은, 다시 보호기를 도입하지 않으면 안되기 때문에, 간편하고 효율적인 제조라는 관점에서는 바람직하지 않다. 따라서, 본 발명자들은, 펩티드 단편(수식 성분)의 수지로부터 잘라냄에는, 아미노산 측쇄의 보호기를 탈리시키기 어려운 약산(희석된 강산을 포함함)을 이용하고, 한편 펩티드가 수지로부터 이탈하지 않고, 수지 상에서 특정한 아미노산 측쇄의 보호기를 탈리시켜 잔기 선택적 수식을 실시하는 방법으로서, 불화 4급 암모늄을 이용하는 방법이 유효하다는 것을 예의 검토한 결과 발견했다. 종래, 플루오르화 4급 암모늄 중에서도, 테트라부틸암모늄플루오라이드(TBAF)는 고체상 수지로부터 펩티드를 이탈시키는 시약으로서 이용되었으나(J. Chem. Soc., Chem. Commun., p.414-415, 1988년, Tetrahedron Letters, 34권, p.7599-7602, 1993년), 본 발명자들은 약산성 이탈 수지 상에 구축한 펩티드는 TBAF 처리에 의해 수지로부터 이탈되지 않는 것을 발견했다. 그 결과, TBAF를 이용하면 펩티드가 수지로부터 이탈되지 않고, 그에 따라, 수지 상에서 특정한 아미노산 측쇄의 보호기를 탈리시켜 잔기 선택적 수식을 실시할 수 있고, 이어서 아미노산 측쇄의 보호기를 탈리시키기 어려운 약산(희석된 강산을 포함함)을 이용하여 펩티드 단편(수식 성분)을 수지로부터 잘라냄으로써, 다음 공정의 펩티드 단편(비수식 성분)과의 축합 반응 시에, 사전에 펩티드 단편(수식 성분)을 보호하는 공정이 필요하지 않게 되어, 수식을 받은 생리활성 펩티드 또는 단백질의 제조 공정을 대폭 간략화하면서 효율화할 수 있었다.
또 본 발명자들은, 그렐린의 보호 펩티드 단편(비수식 성분)의 조제 방법을 개량하고, 보호 그렐린(8-28) 단편을 2단계 효소 처리법으로 대량 조제하기 위해서 최적의 링커 서열을 발견했다. 또 본 발명자들은, 보호기가 이탈되지 않는 pH 조건에서 정제함으로써 보호 펩티드 단편(비수식 성분)의 제조 공정을 대폭 간략화하면서 효율화할 수 있는 방법을 확립했다. 즉, 보호 펩티드의 조제 시에 보호기가 이탈되는 현상은 수용액의 pH 및 온도에 의존하므로, 수용액의 pH를 4∼8로 함으로써 보호기의 이탈을 저지할 수 있고, 양호한 수율로 보호 펩티드(비수식 성분)를 조제할 수 있는 것을 발견했다.
또, 각 펩티드 단편의 축합 방법을 개량하고, 아미노산의 활성화 시, 및 축합 시의 라세미화를 억제하여, 그렐린 또는 그렐린 유도체를 보다 고품질이고 또한 고수율로 얻을 수 있는 제조 방법을 발견했다. 특히, 약산성 이탈 수지를 이용한 그렐린의 제조 방법은, 부반응에 의해 생기는 디케토피페라진의 형성을 억제할 수 있는 이점이 있다. 즉, C 말단 아미노산 잔기가 7위치의 프롤린이기 때문에, 디펩 티드(-Ser-Pro-)에 3개 째의 아미노산(Leu)을 축합할 때, 디케토피페라진을 감아 수지로부터 이탈하는 부반응을 적어도으로 억제할 수 있다.
이 지견에 기초하여, 또한, 알킬기는 물론이고, 아실기, 인산기 또는 황산기를 글루코사이드 결합, 디설파이드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합 또는 아미드 결합 등을 통하여 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄에 결합한 여러 가지 수식 구조를 가지는 생리활성 펩티드 또는 단백질의 제조에도 용이하게 적용할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은,
(1) 약산성 이탈 수지를 이용하는 것을 특징으로 하는, 식 1; -A(R)-(식 중에서, A는 아미노산 또는 비아미노산을 나타내고, R은 A의 측쇄에 결합되어 있는 치환기를 나타냄)로 나타내어지는 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호된 펩티드 단편의 제조 방법,
(2) (a) 약산성 이탈 수지 상에, 측쇄가 보호되어 있는 아미노산 또는/및 비아미노산의 원하는 서열을 가지는 펩티드 단편을 제작하고, (b) 상기 펩티드 단편을 약산성 이탈 수지 상에서 탈리시키지 않고, 치환기 R에 의해 수식을 받는 아미노산 또는 비아미노산 A의 측쇄의 보호기를 탈보호하고, (c) 상기 탈보호된 측쇄를 치환기 R로 수식하고, (d) 약산성 이탈 수지로부터 펩티드 단편을 잘라내는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 기재의 펩티드 단편의 제조 방법,
(3) 아미노산 또는 비아미노산 A의 측쇄의 보호기가, 실릴계 보호기이며, 상기 보호기의 탈보호에 플루오르화 4급 암모늄을 이용하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 또는 (2) 기재의 펩티드 단편의 제조 방법,
(4) 실릴계 보호기가, t-부틸디메틸실릴(TBDMS), t-부틸디페닐실릴(TBDPS), 트리이소프로필실릴(TIPS), 트리이소부틸실릴(TIBS), t-헥실디메틸실릴(ThxDMS) 또는 트리페닐실릴(TPS)이며, 플루오르화 4급 암모늄이 테트라부틸암모늄플루오라이드(TBAF), 테트라에틸암모늄플루오라이드(TEF) 또는 암모늄플루오라이드인 것을 특징으로 하는 상기 (3) 기재의 펩티드 단편의 제조 방법,
(5) A가 세린, 트레오닌, 시스테인, 호모시스테인, 리신, 오르니틴, 글루탐산, 2-아미노아디프산, 디아미노아세트산, 2-아미노말론산, 아스파라긴산, 티로신 또는 아스파라긴이며, R이 에스테르 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 디설파이드 결합, 아미드 결합, O-글루코사이드 결합 또는 N-글루코사이드 결합 등을 통하여 A의 측쇄에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 (1)∼(4) 기재의 펩티드 단편의 제조 방법,
(6) A가 세린 또는 트레오닌이며, R이 에스테르 결합을 통하여 A의 측쇄에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 (5) 기재의 펩티드 단편의 제조 방법,
(7) 펩티드 단편이, 그렐린 또는 그 유도체, 또는 상기 그렐린 또는 그 유도체 중의 수식을 받은 아미노산을 포함하는 부분인 것을 특징으로 하는 상기 (6) 기재의 펩티드 단편의 제조 방법,
(8) (a) 식 1; -A(R)-(식 중에서, A는 아미노산 또는 비아미노산을 나타내고, R은 A의 측쇄에 결합되어 있는 치환기를 나타냄)로 나타내어지는 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호되어 있는 펩티드 단편을, 약 산성 이탈 수지를 이용하여 제조하고, 상기 (a)의 펩티드 단편과는 별도로, (b) 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 보호되어 있는 펩티드 단편을 제조하고, 상기 (a) 및 (b)에서 제조된 펩티드 단편을 축합하는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(9) 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호되어 있는 펩티드 단편을, 상기 (2)∼(4) 기재의 방법으로 제조하는 것을 특징으로 하는 상기 (8) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(10) A가 세린, 트레오닌, 시스테인, 호모시스테인, 리신, 오르니틴, 글루탐산, 2-아미노아디프산, 디아미노아세트산, 2-아미노말론산, 아스파라긴산, 티로신 또는 아스파라긴이며, R이 에스테르 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 디설파이드 결합, 아미드 결합, O-글루코사이드 결합 또는 N-글루코사이드 결합에 의해 A의 측쇄에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 (8) 또는 (9) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(11) A가 세린 또는 트레오닌이며, R이 에스테르 결합을 통하여 A의 측쇄에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 (10) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(12) 수식 펩티드 또는 단백질이, 그렐린 또는 그 유도체인 것을 특징으로 하는 상기 (11) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(13) 펩티드 단편의 축합이, 축합제를 이용하여 행해지는 것을 특징으로 하는 상기 (8)∼(12) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(14) 축합제가, 2-(1-하이드로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), 2-(1-하이드로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU), 디페닐포스포릴아지드(DPPA), 디페닐포스포로시아니데이트(DEPC), 디이소프로필카르보디이미드(DIPC), 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)인 것을 특징으로 하는 상기 (13) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(15) 축합제가, 디이소프로필카르보디이미드(DIPC), 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)이며, 상기 축합제를 이용하는 펩티드 단편의 축합이, 1-하이드록시벤조트리아졸(H0Bt), 1-하이드록시숙신이미드(H0Su) 또는 3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥소-벤조트리아진 (HOOBt)의 존재 하에 행해지는 것을 특징으로 하는 상기 (13) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로 본 발명은, 수식을 받은 펩티드 또는 단백질을 단편 축합에 의해 제조하는 과정에서, (a) 수식기를 포함하는 펩티드 단편을 제조할 때, 2-클로로트리틸 수지 등의 약산성 이탈 수지를 이용하여 합성하는 것을 특징으로 하는, 수식을 받은 생리활성 펩티드 또는 단백질의 제조 방법, (b) 산으로 탈리되기 쉬운 아실기, 황산기 등을 포함하는 펩티드 단편을 합성할 때, 2-클로로트리틸 수지 등의 약산성 이탈 수지를 이용하여 제조하는 것을 특징으로 하는, 수식을 가진 생리활성 펩티드 또는 단백질, 특히 그렐린 또는 그렐린 유도체의 제조 방법, (c) 수식을 포함하는 펩티드 단편(수식 성분)과 수식을 포함하지 않는 펩티드 단편(비수식 성분)과의 축합을 행할 때, 활성화시키는 N 말단측 단편의 C 말단 잔기에 프롤린을 경유함으로써, 구성 아미노산의 라세미화를 억제한 것을 특징으로 하는 그렐린 또는 그렐린 유도체의 제조 방법, (d) 그렐린 또는 그렐린 유도체의 제조에 현저히 양호한 축합제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은,
(1) 아미노산 또는/및 비아미노산으로 이루어지는 원하는 서열을 가지며, 그 중 적어도 하나의 아미노산 또는 비아미노산이 식 1; -A(R)-(식 중에서, A는 아미노산 또는 비아미노산을 나타내고, R은 A의 측쇄에 결합되어 있는 수식을 위해 도입된 치환기를 나타냄)로 나타내어지는 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산이며, 또한 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄에서의 수산기, 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 메르캅토기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의, 펩티드 단편 제작에 있어서 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가진 반응성 치환기가 보호기에 의해 보호되어 있는 펩티드 단편을 약산성 이탈 수지 상에서 제작하고, 이어서, 약산성 조건에서 상기 펩티드 단편에서의 보호기를 탈리시키지 않고 상기 펩티드 단편을 약산성 이탈 수지로부터 이탈하는 것을 특징으로 하는, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호된 펩티드 단편의 제조 방법,
(2) (a) 아미노산 또는/및 비아미노산으로 이루어지는 원하는 서열을 가지며, 또한 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄에서의 수산기, 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 메르캅토기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의, 펩티드 단편 제작에 있어서 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가진 반응성 치환기가 보호기에 의해 보호되어 있는 펩티드 단편을 약산성 이탈 수지 상에서 제작하고, (b) 상기 펩티드 단편을 약산성 이탈 수지 상에서 이탈시키지 않고, 치환기 R에 의해 수식을 받는 아미노산 또는 비아미노산 A의 측쇄에서의 반응성 작용기에 보호기가 도입되어 있는 경우는, 상기 보호기를 탈보호하고, (c) 상기 탈보호된 측쇄를 치환기 R로 수식하고, (d) 약산성 조건에서 상기 펩티드 단편에서의 보호기를 탈리시키지 않고 상기 펩티드 단편을 약산성 이탈 수지로부터 이탈시키는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 기재의 펩티드 단편의 제조 방법,
(3) (a) 약산성 이탈 수지 상에서, 아미노산 또는/및 비아미노산의 원하는 서열을 가지고, 또한 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄인 수산기, 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 메르캅토기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 반응성 치환기가 보호기에 의해 보호되어 있는 펩티드 단편을 제작하고, 이어서, (b) 약산성 조건에서 상기 펩티드 단편에서의 보호기를 탈리시키지 않고 상기 펩티드 단편을 약산성 이탈 수지로부터 이탈시키고, (c) 이탈시킨 펩티드 단편 중 적어도 하나의 아미노산 또는 비아미노산 A의 측쇄에서의 반응성 치환기의 보호기를 탈보호하고, (d) 상기 탈보호된 측쇄를 치환기 R로 수식하는 것을 특징으로 하는 식 1; -A(R)-(식 중에서, A는 아미노산 또는 비아미노산을 나타내고, R은 A의 측쇄에 결합되어 있는 치환기를 나타냄)로 나타내어지는 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호된 펩티드 단편의 제조 방법,
(4) 치환기 R에 의해 수식을 받는 아미노산 또는 비아미노산 A의 측쇄에서의 반응성 치환기의 보호기가, 실릴계 보호기이며, 상기 보호기의 탈보호에 플루오르화 4급 암모늄을 이용하는 것으로 이루어지는 상기 (2) 또는 (3) 기재의 펩티드 단편의 제조 방법,
(5) 실릴계 보호기가, t-부틸디메틸실릴(TBDMS), t-부틸디페닐실릴(TBDPS), 트리이소프로필실릴(TIPS), 트리이소부틸실릴(TIBS), t-헥실디메틸실릴(ThxDMS) 또는 트리페닐실릴(TPS)이며, 플루오르화 4급 암모늄이 테트라부틸암모늄플루오라이드(TBAF), 테트라에틸암모늄플루오라이드(TEF) 또는 암모늄플루오라이드인 상기 (4) 기재의 펩티드 단편의 제조여행,
(6) A가 세린, 트레오닌, 시스테인, 호모시스테인, 리신, 오르니틴, 글루탐산, 2-아미노아디프산, 디아미노아세트산, 2-아미노말론산, 아스파라긴산, 티로신 또는 아스파라긴이며, R이 에스테르 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 디설파이드 결합, 아미드 결합, O-글루코사이드 결합 또는 N-글루코사이드 결합을 통하여 A의 측쇄의 반응성 작용기에 결합되어 있는 것으로 이루어지는 상기 (1)∼(5) 기재의 펩티드 단편의 제조 방법,
(7) A가 세린 또는 트레오닌이며, R이 에스테르 결합을 통하여 A의 측쇄의 수산기에 결합되어 있는 것으로 이루어지는 상기 (6) 기재의 펩티드 단편의 제조 방법,
(8) 펩티드 단편이, 그렐린 또는 그 유도체, 또는 상기 그렐린 또는 그 유도체의 중의 수식을 받은 아미노산을 포함하는 펩티드 단편인 상기 (7) 기재의 펩티 드 단편의 제조 방법,
(9) (a) 상기 (1)∼(8) 기재의 방법에 의해서 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호되어 있는 펩티드 단편을 제조하고, 상기 (a)의 펩티드 단편과는 별도로, (b) 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않고, 또한, 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄에서의 수산기, 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 메르캅토기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의, 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가진 반응성 작용기가 보호되어 있는 펩티드 단편을 제조하고, 상기 (a) 및 (b)에서 제조된 펩티드 단편을 축합하는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(10) 펩티드 단편의 축합이, 축합제를 이용하여 행해지는 것으로 이루어지는 상기 (9) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(11) 축합제가, 2-(1-하이드로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), 2-(1-하이드로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU), 디페닐포스포릴아지드(DPPA), 디페닐포스포로시아니데이트(DEPC), 디이소프로필카르보디이미드(DIPC), 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)인 상기 (10) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(12) 축합제가, 디이소프로필카르보디이미드(DIPC), 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)이며, 상기 축합제를 이용하는 펩티드 단편 (a)와 (b)의 축합이, 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt), 1-하이드록시숙신이미드(H0Su) 또는 3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥소-벤조트리아진(HO0Bt)의 존재 하에서 행해지는 것으로 이루어지는 상기 (10) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(13) 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 보호되어 있는 펩티드 단편을, 효소법 또는/및 유전자 재조합법에 의해 제조하는 것으로 이루어지는 상기 (9)∼(12) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(14) 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 보호되어 있는 펩티드 단편을, 하기 방법;
공정 (1); 상기 펩티드 단편의 아미노산 서열을 가지는 펩티드(이하, 본 항에 있어서 목적 펩티드라고 함)를 코딩하는 염기 서열, 또는 목적 펩티드에 원하는 바에 따라 링커 서열을 통하여 보호 펩티드가 부가되어 있는 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열 중 어느 하나를 가지는 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포를 배양하여, 상기 배양물로부터 목적 펩티드 또는 상기 융합 단백질을 채취하는 공정;
공정 (2); 공정 (1)에 있어서 융합 단백질을 채취한 경우, 얻어진 융합 단백질로부터 보호 펩티드 및 원하는 바에 따라 링커 서열과 목적 펩티드를 절단 분리하여, 원하는 바에 따라 목적 펩티드를 추가로 정제하는 공정;
공정 (3); 공정 (1) 또는 (2)에서 얻어진 목적 펩티드의 측쇄에서의 수산기, 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 메르캅토기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의, 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가진 반응성 치환기를 보호기에 의해 보호하는 공정;
을 포함하는 방법에 의해 제조하는 것으로 이루어지는 상기 (13) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(15) 공정 (2)에서의 보호 펩티드 및 원하는 바에 따라 링커 서열과 목적 펩티드의 절단 분리가, OmpT 프로테아제 또는 그 유도체 및 Kex2 프로테아제 또는 그 유도체를 이용하여 2단계로 행해지는 것으로 이루어지는 상기 (14) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(16) 링커 서열이, 서열 번호 27에 기재된 서열인 상기 (14) 또는 (15) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(17) 펩티드 단편이, 그렐린 또는 그 유도체 중의 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노기를 포함하지 않는 펩티드 단편인 것을 특징으로 하는 상기 (13)∼(16) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(18) 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 보호되어 있는 펩티드 단편을, pH 4∼8의 용액 중에서 정제 및 보존하는 것을 특징으로 하는 상기 (13)∼(17) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(19) 보호기가 Boc기인 상기 (13)∼(18) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법,
(20) 공정 (1); 원하는 아미노산 서열을 가지는 펩티드(이하, 본 항에 있어서 목적 펩티드라고 함)를 코딩하는 염기 서열 또는 목적 펩티드에, 원하는 바에 따라 링커 서열을 통하여 보호 펩티드가 부가되어 있는 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열 중 어느 하나를 가지는 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포를 배양하여, 상기 배양물로부터 목적 펩티드 또는 상기 융합 단백질을 채취하는 공정;
공정 (2); 공정 (l)에 있어서 융합 단백질을 채취한 경우, 얻어진 융합 단백질로부터, 보호 펩티드 및 원하는 바에 따라 링커 서열과 목적 펩티드를 절단 분리하여, 원하는 바에 따라 추가로 정제하는 공정;
공정 (3); 공정 (1) 또는 (2)에서 얻어진 목적 펩티드의 측쇄에서의 수산기, 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 메르캅토기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의, 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가진 반응성 치환기를 보호기에 의해 보호하는 공정;
공정 (4); 공정 (3)에서 얻어진 보호되어 있는 목적 펩티드를, pH 4∼8의 용액 중에서 정제 및 보존하는 공정;
을 포함하는 방법에 의해 제조하는 것을 특징으로 하는 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 보호되어 있는 펩티드 단편을 제조하는 방법,
(21) 보호기가 Boc기인 상기 (20) 기재의 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 보호되어 있는 펩티드 단편을 제조하는 방법,
(22) 공정 (2)에서의 보호 펩티드 및 원하는 바에 따라 링커 서열과 목적 펩티드의 절단 분리가, OmpT 프로테아제 또는 그 유도체 및 Kex2 프로테아제 또는 그 유도체를 이용하여 2단계로 행해지는 것으로 이루어지는 상기 (20) 또는 (21) 기재의 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 보호되어 있는 펩티드 단편을 제조하는 방법,
(23) 링커 서열이, 서열 번호 27에 기재된 서열인 상기 (20)∼(22) 기재의 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 보호되어 있는 펩티드 단편을 제조하는 방법,
(24) 펩티드 단편이, 그렐린 또는 그 유도체의 중의 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노기를 포함하지 않는 펩티드 단편인 것을 특징으로 하는 상기 (20)∼(23) 기재의 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
도 1(A)는 hGhrelin(8-28)의 전합성 올리고 DNA 및 아미노산 서열을 나타낸다. 도 1(B)는 p117 8-28oRR에 의해 발현되는 hGhre1in(8-28) 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 정제한 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)의 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 피크 가)는, [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)의 피크를 나타낸다.
도 3은 단편의 축합 반응을 나타낸다. 피크 A는 [Nα-Boc, Ser2,6(tBu)]hGhrelin(1-7)의 피크를, 피크 B는 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)의 피크를, 피크 C는 [Nα-Boc, Ser2,6(tBu), Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin의 피크를, 피크 D는 hGhrelin의 피크를 나타낸다.
도 4는 정제한 hGhrelin의 HPLC 측정 결과를 나타낸다.
도 5는 Kex2 프로테아제의 절단 인식 부위가 다른 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 6은 도 5에서 작성한 각 융합 단백질의 Kex2 절단 효율을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸다. 도 6(A)는 PR-hGhrelin(8-28)의 Kex2 효소 반응 후의 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 도 6(B)는 RR-hGhrelin(8-28)의 Kex2 효소 반응 후의 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 도 6(C)는 KR-hGhrelin(8-28)의 Kex2 효소 반응 후의 HPLC 분석 결과를 나타낸다. 피크 가)는 링커 서열을 포함하는 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)의 피크를 나타낸다. 피크 나)는 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)의 피크를 나타낸다. 피크 다)는 [Lys16,19,20,24(BOc)]hGhrelin(10-28)의 피크를 나타낸다.
도 7은 배양에 최적인 융합 단백질을 결정하기 위해서 작성한 각 hGhrelin(8-28) 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 8(A)는 융합 단백질의 차이에 의한 배양 결과의 차이를 나타내고, 도 8(B)는 각 융합 단백질에서의 배양액의 균체 파쇄(破碎) 전의 탁도(濁度)에 대한 균체 파쇄 후의 탁도(융합 단백질에 의한 차이)를 나타낸다.
도 9는 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)의 안정성 평가 결과를 나타낸다.
도 10은 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)의 안정성 평가 결과를 나타낸다.
본 발명을 설명할 때, 하기 용어를 아래와 같이 정의한다.
"아미노산"이란, 동일 분자 내에 아미노기와 카르복시기를 가지는 화합물로 서, 예를 들면, L-아미노산, D-아미노산, α-아미노산, β-아미노산, γ-아미노산, 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 합성 아미노산 등 모든 아미노산을 포함한다.
"천연 아미노산"이란, 유전자에 의해 코딩되는 20 종류의 아미노산을 말한다.
"비천연 아미노산"이란, α-아미노산에서의 α 탄소가 천연 아미노산 또는 그것에 대응하는 D-아미노산에 존재하지 않는 임의의 치환기로 수식되어 있는 화합물을 말한다. 즉, α-아미노산을 하기 식;
Figure 112004028641313-pct00001
으로 나타내었을 때, R', R"로 표시되는 치환기로서, 천연 아미노산 또는 그것에 대응하는 D-아미노산에 존재하지 않는 임의의 치환기 또는 수소 원자(단, R'과 R"이 모두 수소 원자인 경우를 제외함)를 가지는 화합물을 들 수 있다.
"비아미노산"이란, C, H, O, N 및 S로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 원자로 이루어지는 아미노산의 유사체로서, 천연 아미노산 및 비천연 아미노산에 포함되지 않는 화합물을 말한다. 그 중에서도, 분자 사슬 길이가 펩티드 상당 길이 또는 디펩티드 상당 길이인 화합물이 바람직하다. 예를 들면, NH2-CH(CH2OH)-CH3, CH3-CH(Rl1)-COOH, CH3-CH(R11)-CH3 (어느 것이나 분자 사슬 길이가 펩티드 상당 길이), 또는 NH2-(CH2)3CH(CH2OH)-COOH, NH2-(CH 2)4-COOH, NH2-C(CH3)2-(CH2) 3-COOH, NH2-CH(CH3)-(CH2)2-CH(CH3)-COOH, NH2 -(CH2)3CH(CH2OH)-CH3, NH2-(CH2 )3CH(R11)-CH3(어느 것이나 분자 사슬 길이가 디펩티드 상당 길이) 등이 본 발명에서 말하는 "비아미노산"에 포함된다. 여기에서, R11은 천연 아미노산의 측쇄를 나타낸다. 펩티드에서의 "비아미노산 잔기"로는, 예를 들면, -NH-CH(CH2OH)-CH2-, -CH 2-CH(R11)-CO-, -CH2-CH(R11)-CH2-(어느 것이나 분자 사슬 길이가 펩티드 상당 길이), 또는 -NH-(CH2)3CH(CH2OH)-CO-, -NH-(CH2)4-CO-, -NH-C(CH 3)2-(CH2)3-CO-, -NH-CH(CH3)-(CH2) 2-CH(CH3)-CO-, -NH-(CH2)3CH(CH2OH)-CH2-, -NH-(CH 2)3CH(R11)-CH2-(어느 것이나 분자 사슬 길이가 디펩티드 상당 길이) 등을 들 수 있고, 인접하는 아미노산과의 결합은 펩티드 결합이 아닌 경우가 있을 수 있다.
"펩티드" 또는 "펩티드 단편"이란, 복수의 아미노산이 펩티드 결합으로 이어진 화합물인 것을 말한다. 여기에서, 비아미노산을 포함하는 경우는, 상기 비아미노산과 인접하는 아미노산과의 결합은 펩티드 결합이 아닌 경우가 있지만, 이 경우의 화합물도 펩티드 또는 펩티드 단편으로 총칭한다.
"보호되어 있는 펩티드 단편"이란, 펩티드 단편의 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄의, 수산기, 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 메르캅토기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인, 펩티드 단편 제작에 있어서 또는 펩티드 단편의 축합 반응에 있어서, 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가진 반응성 치환기가 보호에 의해 보호되어 있는 펩티드의 단편을 말한 다. 이하, 본 명세서에서는 "보호 펩티드 단편"이라고 약칭한다.
"수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산"은, 식 1; -A(R)-(식 중에서, A는 아미노산 또는 비아미노산을 나타내고, R은 A의 측쇄에 결합되어 있는 수식을 위해 도입된 치환기를 나타냄)로 나타내여진다.
상기 치환기 R은, 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄에서의 수산기, 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 메르캅토기 또는 카르복시기로부터 수소 원자를 제거하여 형성되는 기에 결합되어 있는 경우도 있고, 아미노산 또는 비아미노산의 α 탄소에 직접 결합되어 있는 경우도 있다. 치환기 R은 아미노산 또는 비아미노산의 수식된 측쇄일 수도 있다.
상기 치환기 R로서는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, R로서는, 식 2; -(CH2)n-P-Q(식 중에서, n은 1∼10의 정수를 나타내고, P는, -CO-, -SO2 -, -CO-O-, -O-CO-, -O-, -CO-S-, -S-CO-, -CS-S-, -S-CS-, -S-, -CO-NH-, -NH-CO-, -CO-NH-CO-, -CS-NH-CS-, -S-S-, -CS-NH- 또는 -NH-CS-를 나타내고, Q는, 수소 원자, 또는 Cl-35, 바람직하게는 C1-20의 알킬기, C6-20의 아릴기 또는 C7-16 의 아랄킬기를 나타냄)로 나타내어지는 기, 식 3; -P-Q(식 중에서, P 및 Q는 상기와 동일 의미)로 나타내어지는 기, 또는 식 4; -Q(식 중에서, Q는 상기와 동일 의미)로 나타내어지는 기 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 상기 R로서는, 아미노산 또는 비아미노산의 α 탄소에 직접 결합되어 있는 경우, 탄소수 1 이상의 알킬기를 통하여 또는 통하지 않고, 에스테르, 에테르, 티오에스테르, 티오에테르, 아미드 또는 카르바미드로 이루 어지는 군에서 선택되는 결합에 의해, C1-35, 바람직하게는 C1-20의 알킬기, C 6-20의 아릴기 또는 C7-16의 아랄킬기가 결합되어 있는 기가 바람직하다. 치환기 R이 아미노산 또는 비아미노산의 α 탄소에 직접 결합되어 있는 경우, 치환기 R은 천연 아미노산에 있어서 α 탄소에 결합되어 있는 치환기를 포함하지 않는다. 치환기 R이 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄에서의 반응성 치환기에 결합되어 있는 경우, 상기 치환기 R은 식 4; -Q(식 중에서, Q는 상기와 동일 의미)로 나타내어지는 기인 것이 바람직하다.
여기에서, 상기 "알킬기"란, 환형, 직쇄 또는 분지쇄 알킬기를 나타내고, 예를 들면 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 사이클로프로필기, 부틸기, sec-부틸기, 이소부틸기, tert-부틸기, 사이클로부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기, tert-펜틸기, 네오펜틸기, 사이클로펜틸기, 헥실기, 이소헥실기, 사이클로헥실기, 3,3-디메틸부틸기, 헵틸기, 1-프로필부틸기, 옥틸기, 노닐기, 데실기, 운데실기, 도데실기, 트리데실기, 테트라데실기 또는 펜타데실기 등을 들 수 있고, 이들은 부분적으로 불포화 탄소 결합을 포함하고 있어도 되고, 탄소수는 1 내지 35, 더욱 바람직하게는 1 내지 20, 더욱 바람직하게는 1 내지 10이다.
상기 "아릴기"란, 예로서, 페닐기, 1- 또는 2-나프틸기, 비페닐기, 1-, 2- 또는 9-앤트릴기, 1-, 2-, 3-, 4- 또는 9-페난트릴기, 아세나프틸기, 안트라세닐기, 아즈레닐기 등을 들 수 있다. 탄소수는 6 내지 20, 더욱 바람직하게는 6 내지 15이다.
상기 "아랄킬기"로서는, 벤질기, p-메톡시벤질기, 3,4-디메톡시벤질기, o-니트로벤질기, p-니트로벤질기, 벤즈하이드릴기, 트리틸기 등을 들 수 있다. 탄소수는, 바람직하게, 7 내지 16이다.
또한, 이들 알킬기, 아릴기 및 아랄킬기는, 당 기술분야에서 통상 이용되는 치환기를 화학적으로 허용되는 위치 및 개수로 가지고 있을 수도 있다.
"수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산"으로서는, 아미노산 또는 비아미노산 A가 세린, 트레오닌, 시스테인, 호모시스테인, 리신, 오르니틴, 글루탐산, 2-아미노아디프산, 디아미노아세트산, 2-아미노말론산, 아스파라긴산, 티로신 또는 아스파라긴이며, 치환기 R이 식 5; -(CH2)n-P1-Ql(식 중에서, n은 상기와 동일한 의미임. P1은 에스테르 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 디설파이드 결합, 아미드 결합, O-글루코사이드 결합 또는 N-글루코사이드 결합을 나타내고, Q1은 상기 Q와 동일 의미임)로 나타내어지는 기인 경우가 바람직하다.
구체적으로는, 예를 들면, 아미노산 A가 세린, 트레오닌, 티로신 또는 옥시프롤린인 경우, 그 아미노산은 측쇄에 수산기를 가지므로, "수식을 받은 아미노산"으로서는, 측쇄의 수산기가 에테르화 또는 에스테르화되어 있는 세린, 트레오닌, 티로신 또는 옥시프롤린을 들 수 있다. 아미노산 A가 시스테인인 경우는, 그 아미노산은 측쇄에 메르캅토기를 가지므로, "수식을 받은 아미노산"으로서는, 측쇄의 메르캅토기가 티오에테르화, 티오에스테르화 또는 디설파이드화되어 있는 시스테인을 들 수 있다. 아미노산 A가 리신, 아르기닌 또는 2,3-디아미노프로피온산인 경우는, 측쇄에 아미노기를 가지므로, "수식을 받은 아미노산"으로서는, 측쇄의 아미노기가 아미드화, 티오아미드화, 카르바미드화, 티오카르바미드화 또는 알킬화되어 있는 리신, 아르기닌 또는 2,3-디아미노프로피온산을 들 수 있다. 아미노산 A가 히스티딘, 트립토판, 프롤린 또는 옥시프롤린인 경우는, 측쇄에 아미노기를 가지므로, "수식을 받은 아미노산"으로서는, 측쇄의 아미노기가 아미드화, 티오아미드화, 이미노에테르화, 이미노티오에테르화, 알킬화되어 있는 히스티딘, 트립토판, 프롤린 또는 옥시프롤린을 들 수 있다.
그 중에서도, "수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산"으로는, 측쇄의 수산기가 에스테르화되어 있는 세린 또는 트레오닌이 바람직하다.
또한, 상기 치환기 R로서는, 아미노산 또는 비아미노산 A의 측쇄에 -0H, -SH, -NH- 또는 -NH2를 포함하는 경우, 이들을 아실화하여 형성되는 기를 더욱 바람직한 예로서 들 수 있다. 이를 위한 아실기로는, 예를 들면 유기 카르복시산, 유기 술폰산, 유기 인산 화합물로부터 수산기를 제거하여 형성되는 기를 들 수 있다. 상기 유기 카르복시산으로는 보다 구체적으로는, 지방산을 들 수 있고, 그 탄소수는 바람직하게는 2∼35, 더욱 바람직하게는 6∼18, 가장 바람직하게는 8∼16이다. 그와 같은 지방산으로는, 예를 들면 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 부티르산, 카프론산, 운데실산, 팔미트산, 데칸산, 노나데칸산, 베헤닉산, 몬탄산 또는 락센산 등의 포화 지방산, 예를 들면 아크릴산, 올레산, 리놀산, 리놀렌산 또는 아아테아 롤산 등의 불포화 지방산을 들 수 있다. 불포화 지방산은 모노엔일 수도 있고, 폴리엔일 수도 있다. 그 중에서도, 옥탄산(바람직하게는, 카프릴산), 데칸산(바람직하게는, 카프르산), 도데칸산(바람직하게는, 라우릴산) 등을 바람직한 예로서 들 수 있다. 상기 유기 술폰산 또는 유기 인산 화합물에 관해서도, 그 탄소수는 2∼35인 것이 바람직하다.
"수식 펩티드 또는 단백질"이란, 펩티드 또는 단백질 중에, 전술한 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 펩티드 또는 단백질을 말한다.
"그렐린"이란, 내인성 성장호르몬 분비촉진 인자(GHS)를 말하며, 세포 내의 칼슘 이온 농도를 상승시키는 활성 및 성장호르몬의 분비를 유도하는 활성을 가진다. 그 중에서도, 인간, 래트, 마우스, 돼지, 닭, 뱀장어, 소, 말, 양, 개구리, 무지개송어 또는 개 유래의 그렐린이 바람직하다. 보다 구체적으로, "그렐린"으로서는, 서열 번호 1∼21중 어느 한 항에 기재된 아미노산 서열을 가지고, 3위치 세린 또는 트레오닌의 측쇄 수산기의 수소 원자가, n-옥타노일기, 부타노일기, 헥사노일기, 데카노일기 또는 도데카노일기 중 어느 하나로 치환되어 있는 단백질, 또는 서열 번호 1∼21 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서, N 말단의 첫번째로부터 4번째까지의 아미노산 서열 이외의 부분에서, 1∼l0개, 바람직하게는 1∼수개 정도의 아미노산이 치환, 부가 또는 결실하고 있는 아미노산 서열을 가지고, 3위치 세린 또는 트레오닌의 측쇄 수산기의 수소 원자가 n-옥타노일기, 부타노일기, 헥사노일기, 데카노일기 또는 도데카노일기 중 어느 하나로 치환되어 있고, 또한 세포 내의 칼슘 이온 농도를 상승시키는 활성을 가지는 단백질을 들 수 있다.
"그렐린 유도체"로서는, 세포 내의 칼슘 이온 농도를 상승시키는 활성을 가지고, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 들 수 있다. 그 중에서도, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 아미노 말단에서 4번째까지의 아미노산 서열, 바람직하게는 아미노 말단에서 5번째까지의 아미노산 서열, 바람직하게는 아미노 말단에서 6번째까지의 아미노산 서열, 바람직하게는 아미노 말단에서 7번째까지의 아미노산 서열, 바람직하게는 아미노 말단에서 8번째까지의 아미노산 서열, 바람직하게는 아미노 말단에서 9번째까지의 아미노산 서열, 바람직하게는 아미노 말단에서 10번째까지의 아미노산 서열을 적어도 가지는 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이 바람직하다. 또한, 서열 번호 1∼21에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 아미노 말단에서 4번째까지의 아미노산 서열, 바람직하게는 아미노 말단에서 5번째까지의 아미노산 서열, 바람직하게는 아미노 말단에서 6번째까지의 아미노산 서열, 바람직하게는 아미노 말단에서 7번째까지의 아미노산 서열, 바람직하게는 아미노 말단에서 8번째까지의 아미노산 서열, 바람직하게는 아미노 말단에서 9번째까지의 아미노산 서열, 바람직하게는 아미노 말단에서 10번째까지의 아미노산 서열 이외의 부분에서, 적어도 한 개의 아미노산, 바람직하게는 1∼10개 정도의 아미노산, 더욱 바람직하게는 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이 바람직하다. 그 중에서도, 상기 양태의 모든 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용되는 염에서는, 아미노 말단에서 2번째 또는 3번째의 아미노산, 더욱 바람직하게는 아미노 말단에서 3번째의 아미노산이, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산인 것이 특히 바람직하다.
또, 서열 번호 1∼21에 기재된 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열의 적어도 하나의 아미노산, 바람직하게는 1∼10개 정도의 아미노산, 더욱 바람직하게는 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 서열에 있어서, 아미노 말단에서 4번째까지의 아미노산 서열이, 식 6; A-B-C-D-(식 중 A는 아미노산, 비아미노산, 또는 없음을 나타내고, B는 아미노산, 비아미노산, 또는 없음을 나타낸다. 단, A+B의 분자 사슬 길이가 디펩티드 상당 길이이다. C 또는 D는 동일할 수도 있고 다를 수도 있으며, (a) 수식된 아미노산, (b) 소수성 측쇄를 가지는 아미노산, 또는 (c) 염기성 측쇄를 가지는 아미노산을 나타냄)로 나타내어지는 펩티드 단편에 치환되어 있는 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용되는 염도 바람직한 양태로서 들 수 있다. 상기 "소수성 측쇄를 가지는 아미노산"으로는, 류신, 발린, 노르로이신, 호모류신, 호모이소류신, 나프틸알라닌류, 트립토판, 페닐알라닌, 사이클로헥실알라닌 등, 또는 이들 N-메틸아미노산 또는 D-체 등을 들 수 있다. 상기 "염기성 측쇄를 가지는 아미노산"으로는, 리신, 아르기닌 또는 히스티딘 또는 이들 D-체 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 상기 식 6에서, C가 상기 수식을 받은 아미노산이며, D가 소수성 측쇄를 가지는 아미노산인 것이 더욱 바람직하다.
상기 식 6; A-B-C-D-로 나타내어지는 펩티드 단편 대신, 다음 식 7; A1-B1- C1-D1-(식 중에서, A1는 아미노산 또는 비아미노산, 바람직하게는 천연 아미노산 또는 그의 D-체를 나타낸다. B1 또는 C1은, 적어도 한 쪽이 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산이며, B1 또는 C1 중 한 쪽만이 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산인 경우, 다른 쪽은 수식을 받고 있지 않은 아미노산 또는 비아미노산, 바람직하게는 천연 아미노산 또는 그의 D-체이다. 또, A1+B1의 분자 사슬 길이가 디펩티드 상당 길이이다. D1는, 소수성 측쇄를 가지는 아미노산 또는 염기성 측쇄를 가지는 아미노산을 나타냄)로 나타내어지는 펩티드 단편을 사용할 수도 있다.
또, 상기 식 6; A-B-C-D-으로 나타내어지는 펩티드 단편 대신, 다음 식 8; B2-C2-D2-(식 중에서, B2는, 디펩티드 상당 길이의 분자 사슬 길이을 가지는 비아미노산이며, C2는 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산이며, D2는, 소수성 측쇄를 가지는 아미노산 또는 염기성 측쇄를 가지는 아미노산을 나타냄)로 나타내어지는 펩티드 단편을 사용할 수도 있다.
또한, "그렐린 유도체"으로는, 상술한 바와 같은 양태의 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 아미노 말단이나 카르복시 말단에 수식이 실행되어 있을 수도 있다. 구체적으로는, 상술한 바와 같은 양태의 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 카르복시 말단에 추가로 염기성 아미노산이 결합되어 있는 것이 바람직하다. 또, 상술한 바와 같은 양태의 펩티드 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 아미노 말단이 탄소수 1 이상의 포화 또는 불포화 알킬기 또는 아실기에 의해 수식되고 및/또는 카르복시 말단의 카르복시기의 OH가 OZ 또는 NR2R3(Z는 약학적으로 허용할 수 있는 양이온 또는 저급의 분지쇄 또는 비분지쇄 알킬기, R2 및 R3는, 수소 원자 및 저급(C1-6)의 분지쇄 또는 직쇄 알킬기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서로 동일하거나 또는 다른 기를 나타냄)으로 변환되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 이들 수식이 조합되어 있을 수도 있다.
본 발명에 따른 수식 펩티드 또는 단백질을 제조하는 방법은, (a) 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호 펩티드 단편을, 약산성 이탈 수지를 이용하여 제조하고, 또한 (b) 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 보호 펩티드 단편을 상기 (a)의 보호 펩티드 단편과는 별도로 제조하여, 상기 (a) 및 (b)에서 제조된 보호 펩티드 단편을 축합하는 3 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
이하에, 수식 펩티드 또는 단백질의 제조에서의 각 공정에 대해 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명의 제조 방법에 의해서 얻어지는 수식 펩티드 또는 단백질, 또는 그들의 단편은 펩티드성인 것이기 때문에, 자체 공지된 펩티드 합성법에 의해서 합성할 수 있다. 여기에서, 수식 펩티드 또는 단백질, 또는 그들의 단편이란, 이들 반응성 작용기가 보호기로 보호된 화합물도 포함한다. 펩티드의 합성 방법으로는, 예를 들면, 고체상 합성법, 액상 합성법 어느 쪽일 수도 있다. 즉, 초벌(粗) 수식 펩티드 또는 단백질, 또는 그들의 단편을 구성할 수 있는 부분 펩티드 또는 아미노산과 나머지 부분을 축합시키고, 생성물이 보호기를 가지는 경우는 보호기를 탈리함으로써 목적으로 하는 펩티드를 제조할 수 있다. 공지된 축합 방법이나 보호기의 탈리 방법으로는, 예를 들면, 이하의 문헌 1∼3에 기재된 방법을 들 수 있다.
1. 泉屋信夫 외 "펩티드 합성의 기초와 실험" 마루젠가부시키가이샤 발행(1985년)
2. 矢島治明 및 神原俊平 "생화학실험 강좌 1, 단백질의 화학 IV" 일본생화학회편, 東京化學同人 발행(1977년)
3. 矢島治明 監修 "속의약품의 개발, 제14권, 펩티드 합성" 廣川書店 발행
수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호 펩티드 단편을 제조하는 공정은, 약산성 이탈 수지 상에서 펩티드 사슬을 연장하는 고체상 화학 합성을 이용하는 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로는, 약산성 이탈 수지를 이용하여, α-아미노기와 측쇄에서의 펩티드 단편 제작에 있어서 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가진 반응성 작용기를 적당히 보호한 아미노산 또는 비아미노산을, 목적으로 하는 펩티드 단편의 서열대로, 자체 공지된 각종 축합 방법에 따라서, 약산성 이탈 수지 상에서 축합시키고, 제작된 보호 펩티드 단편을 보호기를 탈리시키지 않고 약산성 이탈 수지로부터 이탈시킴으로써, 목적으로 하는 보호 펩티드 단편을 얻을 수 있다.
상기 약산성 이탈 수지란, 펩티드 합성에 이용되는 수지로서, 수지 상에 제작된 펩티드 단편을 약산성 조건에서 수지로부터 이탈시킬 수 있는 수지를 말한다. 예를 들면, 약산성 이탈 수지로는, 아세트산, 트리플루오로아세트산 또는 포름산 등의 카르복시산류, 및 트리플루오로에탄올 또는 헥사플루오로이소프로판올 등의 플루오르화 알코올류로 이루어지는 군으로 이루어지는 하나 이상의 화합물을 포함하는 용액 중에서 수지 상에 제작된 펩티드 단편을 수지로부터 이탈시킬 수 있는 수지가 바람직하다. 보다 구체적으로는, 약산성 이탈 수지로서, 예를 들면, 2-클로로트리틸 수지, 트리틸 수지, 4-메틸트리틸 수지, 4-메톡시트리틸 수지, Rink Amide Barlos 수지 등의 트리틸계 수지나, Sieber Amide 수지 등을 들 수 있다.
α-아미노기와 측쇄에서의 반응성 작용기(이하 단순히, 측쇄 작용기라 함)의 보호기로서는, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, α-아미노기의 보호기로는, t-부톡시카보닐(Boc), 트리클로로에틸옥시카보닐, t-아밀옥시카보닐, 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), 메틸설포닐에톡시카보닐, 트리클로로에톡시카보닐, 2-(트리메틸실릴)에톡시카보닐 또는 피리딘-4-메톡시카보닐 등의 치환기를 가지고 있을 수도 있는 알콕시카르보닐기; 사이클로펩틸옥시카보닐 또는 사이클로헥실옥시카보닐 등의 치환기를 가지고 있을 수도 있는 사이클로알킬옥시카르보닐기; 벤질옥시카보닐 (Z), p-메톡시벤질옥시카보닐(pMZ), p-클로로벤질옥시카보닐(C1-Z), p-브로모벤질옥시카보닐(Br-Z), p-니트로벤질옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐, 2-페닐이소프로필옥시카보닐, p-메틸페닐이소프로필옥시카보닐, p-비페닐이소프로필옥시카보닐, 3,5-디메톡시-α,α-디메틸벤질옥시카보닐 등의 치환기를 가지고 있을 수도 있는 아랄킬옥시카르보닐기; 벤질(Bz1), 벤즈하이드릴, 트리틸 등의 치환기를 가지고 있을 수도 있는 아랄킬기; 트리플루오로아세틸, 프탈로일, 포르밀, 벤젠설포닐, p-톨 루엔설포닐(Ts), o-니트로페닐설페닐, 2,4-디니트로페닐설페닐, 3-니트로-2-피리딜설페닐 등의 치환기를 가지고 있을 수도 있는 아실기; 디티아숙시노일, 2-니트로페닐티오, 디페닐포스피닐, 디페닐포스피노티오일, 디메틸포스피노티오일 등을 들 수 있다.
세린 등의 수산기는, 예를 들면, 아세틸기 등의 저급(C1-6) 알카노일기, 벤조일기 등의 아로일기, 벤질옥시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 등의 탄산으로부터 유도되는 기 등으로 보호할 수 있다.
아르기닌의 구아니디노기는, 예를 들면, 니트로기, Z기, Ts기, p-메톡시벤젠설포닐기(Mbs), 4-메톡시-2,6-디메틸벤젠설포닐기(Mds), 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐기(Mtr), 메시틸렌-2-설포닐기(Mts), 2,3,4,5,6-펜타메틸벤젠설포닐기 (Pme), 2,4,6-트리메톡시벤젠설포닐기(Mtb), 2,2,5,7,8-펜타메틸클로만-6-설포닐기 (Pmc), 2,2,4,6,7-펜타메틸-디하이드로벤조퓨란-5-설포닐기(Pbf) 등으로 보호할 수 있다.
또, 시스테인의 메르캅토기는, 예를 들면, 트리틸기, 아세트아미도메틸(Acm)기, tert-부틸기, 벤질기, p-메틸벤질기, p-메톡시벤질기, 3-니트로-2-피리딘설페닐기, 부틸티오기 등으로 보호할 수 있다.
히스티딘의 이미다졸릴기의 보호기로는, 예를 들면, Boc기, 트리틸(Trt)기, Ts기, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐기, 2,4-디니트로페놀(DNP)기, 벤질옥시메틸(Bom)기, t-부톡시메틸(Bum)기, Fmoc기 등이 이용된다.
또, 트립토판의 인돌릴기는, 예를 들면, 포르밀기, Z기, 2,4-디클로로벤질옥시카르보닐기, 트리클로로에틸옥시카르보닐기, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐기, 2,4,6-트리메톡시벤젠설포닐기 등으로 보호할 수 있다.
고체상 합성법에 의한 축합 반응은, 전술한 약산성 이탈 수지에 아미노산을 1개씩 순차 축합시키는 축차연장(逐次延長)법, 2개 이상의 아미노산으로 구성된 펩티드 단편을 축합시키는 단편 축합법 또는 이들 방법을 조합한 방법 중 어느 하나의 방법으로 행할 수도 있다. 상기 2개 이상의 아미노산으로 구성된 펩티드 단편은, 각 아미노산으로부터 관용의 액상법, 고체상법 등에 의하여 제조할 수 있다.
먼저, 상기와 같은 α-아미노기와 측쇄 작용기를 적당히 보호한 아미노산 또는 비아미노산(이하, 특별히 단서가 없는 한, 보호 아미노산이라 약칭함)을 활성화하여, 약산성 이탈 수지에 활성화된 보호 아미노산을 축합한다. 그 때, 보호 아미노산의 활성화나 수지와의 축합에 이용되는 용매로는, 펩티드 축합 반응에 사용할 수 있다고 알려져 있는 용매로부터 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 산아미드류; 염화메틸렌, 클로로포름 등의 할로겐화 탄화수소류; 트리플루오로에탄올, 페놀 등의 알코올류; 디메틸설폭사이드 등의 설폭사이드류; 피리딘, 디옥산, 테트라하이드로퓨란 등의 에테르류; 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴류; 아세트산메틸, 아세트산에틸 등의 에스테르류 또는 이들의 적절한 혼합물 등이 이용된다. 반응 온도는 펩티드 결합 형성 반응의 반응 온도와 동일할 수도 있고, 통상 약 -20℃∼50℃ 범위에서 적절하게 선택된다. 활성화된 보호 아미노산은 통상 1∼4배 과잉으로 사용된다. 닌히드린 반응을 이용한 테스트의 결과, 축합이 불충분한 경우에는 보호기의 탈리를 행하지 않고 축합 반응을 반복함으로써 충분한 축합을 행할 수 있다. 반응을 반복하더라도 충분한 축합이 얻어질 때에는, 무수 아세트산 또는 아세틸이미다졸을 이용하여 미반응 보호 아미노산을 아세틸화함으로써, 후의 반응에 영향을 미치지 않도록 할 수 있다.
이어서, 약산성 이탈 수지에 축합된 보호 아미노산에, 원하는 서열에 따라, 보호 아미노산을 축합시킨다. 각 보호 아미노산의 축합 반응은, 관용의 방법, 예를 들면, C 말단 활성화법, 커플링 시약을 이용하는 커플링법 등에 의하여 행할 수 있다. C 말단 활성화법에는, 활성 에스테르법, 대칭 산무수물법 등이 포함된다. 상기 활성 에스테르법에서 사용하는 활성 에스테르로는, 예를 들면, 시아노메틸에스테르 등의 알킬에스테르; 티오페닐에스테르, p-니트로티오페닐에스테르, p-메탄설포닐페닐에스테르, p-니트로페닐에스테르, 2,4-디니트로페닐에스테르, 2,4,6-트리클로로페닐에스테르, 펜타클로로페닐에스테르 등의 페닐에스테르; 1-하이드록시숙신이미드(HOSu), N-하이드록시프탈산이미드에스테르, N-하이드록시-5-노르보르넨 -2,3-디카르복시산이미드(HONB) 등의 디카르복시산이미드에스테르; 8-하이드로퀴놀린에스테르, N-하이드록시피페리딘에스테르, 2-하이드록시피리딘에스테르 등의 하이드록실아민 유도체 등을 들 수 있다.
상기 커플링 시약을 이용하는 커플링법으로는, 예를 들면, 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC), 수용성 카르보디이미드(WSC) 등을 이용하는 카르보디이미드법; DCC-첨가제법(Additive process); 카보닐디이미다졸(CDI)법; 우드워드(Woodward) 반응제(N-에틸-5-페닐이속사졸륨-3'-술폰산염) 또는 N-에틸-2'-하이드록시벤즈이속사졸륨트리플루오로 붕산염 등의 이속사졸륨염, 1-에톡시카보닐-2-에톡시-1,2-디하이드록시퀴놀린(EEDQ), 1-에톡시카보닐-2-이소부톡시-1,2-디하이드록시퀴놀린 (IIDQ), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)-포스포늄헥사플루오로포스페이트(BOP), O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸-우로늄-헥사플루오로포스페이트 (HBTU), O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸-우로늄-테트라플루오로보레이트 (TBTU), 디페닐포스포릴아지드(DPPA)를 이용하는 방법 등이 예시된다.
상기 카르보디이미드법에서 사용되는 수용성카르보디이미드(WSC)에는, 예를 들면, EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드), N-사이클로헥실-N'-모르폴리노에틸카르보디이미드, N-사이클로헥실-N'-(N,N-디에틸아미노)사이클로헥실카르보디이미드 등이 포함된다. 수용성 카르보디이미드는 염산염 등의 염일 수도 있다.
또, 상기 DCC-첨가제법에는, 예를 들면, DCC-HOSu법, DCC-HOBt(1-하이드록시벤조트리아졸)법, DCC-HONB법, DCC-2-하이드록시이미노-2-시아노아세트산에틸에스테르법, WSC-HOSu법, WSC-HOBt 법 등이 포함된다.
바람직한 축합 반응에는, 카르보디이미드법, 활성에스테르법, DCC-첨가제법이 포함된다. 더욱 바람직한 축합 반응에는, 라세미화를 억제하는 방법, 예를 들면, 활성에스테르법, DCC-첨가제법(예를 들면, DCC-HOBt법, DCC-HOSu법, WSC-HOSu법, WSC-HOBt법 등) 등이 포함된다.
목적으로 하는 보호 펩티드 단편에는, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노 산이 하나 이상 포함된다. 펩티드 사슬에 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 삽입하는 방법으로는, 하기 두 가지의 방법을 들 수 있다.
제1의 방법으로는, 원하는 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄를 특이적으로 미리 수식하여 두고, 이러한 아미노산 또는 비아미노산(이하, 잔기 특이적으로 수식된 아미노산 또는 비아미노산이라고 함)을 펩티드 사슬의 신장 단계에서 도입하는 방법을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 잔기 특이적으로 수식된 아미노산 또는 비아미노산(이들 α 아미노기에 보호기를 붙인 화합물을 포함함)은, 자체 공지된 합성 방법에 의해서 합성할 수 있다. 예를 들면, 에스테르화 반응, 아미드화 반응, 에테르화 반응, 아실화 반응, 알킬화 반응 등을 들 수 있고, 이들은 당업자에 이미 알려진 방법에 의해 행하여질 수 있다. 또한, 이것을 전술한 축합 반응 중 어느 하나에 의해 펩티드 사슬에 도입할 수 있다. 이 경우, 그의 약산성 이탈 수지로부터의 보호 펩티드 단편의 탈리는 후술하는 조건으로부터 적절히 선택되지만, 바람직하게는 목적으로 하는 잔기 특이적으로 수식된 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄의 치환기 R를 탈리시키지 않는 조건으로부터 적절히 선택되는 것이 바람직하다.
제2의 방법으로는, 아미노산 또는/및 비아미노산으로 이루어지는 원하는 서열을 가지는 펩티드 단편을 상기 방법에 의해 제작하고, 그 후, 원하는 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄를 특이적으로 수식한다(이하, 잔기 특이적 수식이라고 함)는 방법을 들 수 있다. 상기의 잔기 특이적 수식의 방법은 특별히 한정되지 않고, 공지된 방법을 이용할 수도 있다. 예를 들면, 에스테르화 반응, 아미드화 반응, 에테르화 반응, 아실화 반응, 알킬화 반응 등을 들 수 있고, 이들은 당업자에 공지된 방법에 의해 행해질 수 있다. 또한, 인산화 수식하는 방법으로는, Tetrahedron Letter, 41권, p.4457-4461,2000년, Biopolymers, 60권, p.3-31,2001년 등을 들 수 있다. 또, 당(糖) 수식 방법으로는 Int. J. Peptide Protein Res., 42권, p.165-170, 1993년, Science, 291권, p.2344-2350, 2001년, Science, 291권, p.2357-2364, 2001년 등을 들 수 있다.
이러한 방법은, 하기 두 가지의 경우로 나누어진다. 즉, 잔기 특이적 수식을 실시하는 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄의 작용기가 보호기에 의해 보호되어 있는 경우, 이러한 보호기의 탈보호 시, 동시에 보호 펩티드 단편이 수지로부터 이탈되는 경우와, 이러한 보호기의 탈보호 시에는 보호 펩티드 단편은 수지로부터 이탈되지 않는 경우로 대별된다. 전자의 경우, C 말단의 카르복시기를 보호기에 의해 보호한 후, 자체 공지된 합성 방법에 의해 잔기 특이적 수식을 실시하고, 그 후, C 말단의 카르복시기를 후술하는 방법으로 적절하게 선택하여 탈보호함으로써 목적의 펩티드 단편을 얻을 수 있다. 또, 후자의 경우, 수지 상에서 자체 공지된 합성법에 의해 잔기 특이적 수식을 실시할 수 있고, 그 후, 목적의 펩티드 단편을 후술하는 방법으로 적절하게 선택하여 수지로부터 이탈하면 된다.
본 발명에서는, 아미노산 또는/및 비아미노산으로 이루어지는 원하는 서열을 가지는 펩티드 단편을 상기 방법에 의해 제작하고, 그 후, 잔기 특이적 수식을 실시하는 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄의 반응성 작용기가 보호기에 의해 보호되어 있는 경우는, 그 보호기를 탈보호하여, 수지 상에서 자체 공지된 합성법에 의해 잔기 특이적 수식을 실시하고, 이어서, 후술하는 약산성 이탈 수지로부터의 보호 펩티드 단편의 이탈, 및 원하는 바에 따라 각 보호기의 탈보호를 행하는 방법이 가장 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 잔기 특이적 수식을 실시하는 아미노산 또는 비아미노산의 보호기로는, 이러한 보호기를 탈보호할 때에 보호 펩티드 단편이 수지로부터 이탈하지 않은 것이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 t-부틸디메틸실릴기, t-부틸디페닐실릴기 등의 실릴기 등을 들 수 있다. 이러한 보호기를 탈보호할 때는, 보호 펩티드 단편이 수지로부터 이탈되지 않고, 또한, 잔기 특이적 수식을 실시하는 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄 작용기의 보호기를 특이적으로 탈보호할 수 있는 시약을 이용한다. 이러한 시약은 약산성 이탈 수지 및 상기 보호기의 종류에 따라서 적절하게 선택되지만, 상기 보호기가 실릴기인 경우는, 플루오르화 4급 암모늄을 이용하는 것이 바람직하고, 테트라부틸암모늄플루오라이드(TBAF)를 이용하는 것이 더욱 바람직하다.
상기와 같이 보호기를 선택하면, 펩티드 신장의 축합을 위해 N 말단 아미노기를 탈보호할 때에, 각 보호 아미노산의 측쇄 작용기의 보호기 및 약산성 이탈 수지로부터 보호 펩티드 단편이 탈리되지 않고, 또, 얻어진 펩티드-수지 결합체로부터 약산성 이탈 수지를 탈리할 때에, 각 아미노산 잔기의 측쇄 작용기의 보호기가 탈리되지 않는다. 또한, 이것에 기인하여, 부반응물의 생성을 억제할 수 있다. 이로 인해, 측쇄 작용기가 보호기에 의해 보호된 펩티드 단편을, 높은 순도로 수율 양호하고도 용이하게 얻을 수 있다. 이 펩티드 단편은, 측쇄 작용기가 보호되어 있기 때문에, 새로 보호기를 도입할 필요가 없고, 다음 공정에서, 액상법에 의해 목적으로 하는 수식 펩티드 또는 단백질을 제조할 때의 원료로서 적합하게 사용할 수 있다.
마지막으로, 제작된 보호 펩티드 단편을 약산성 이탈 수지로부터 이탈시킨다. 이 때, 보호 펩티드 단편에서의 보호기, 즉, 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄 작용기의 보호기가 탈보호되지 않는 약산성 조건에서 행한다. 약산성 조건이란, 예를 들면, 아세트산, 트리플루오로아세트산 또는 포름산 등의 카르복시산류, 및/또는 트리플루오로에탄올 또는 헥사플루오로이소프로판올 등의 플루오르화 알코올류를 포함하는 용액 중에, 약산성 이탈 수지를 현탁시킨 조건을 들 수 있다. 구체적으로는, 상기 용액 중에서 원하는 시간, 바람직하게는 5분∼4시간 정도, 더욱 바람직하게는 10분∼2시간 정도 교반함으로써, 제작된 보호 펩티드 단편을 약산성 이탈 수지로부터 이탈시킬 수 있다.
보다 구체적으로는, 예를 들면, Barlos 등의 방법(Tetrahedron Lett., Vo1.30, p.3947, 1989) 등에 기재되어 있는 공지된 방법, 예를 들면, 0.5% 트리플루오로아세트산/디클로로메탄, 또는 아세트산/트리플루오로에탄올/디클로로메탄 = 1/2/7, 또는 아세트산/트리플루오로에탄올/디클로로메탄 = 2/2/6 등의 용매에 현탁시키는 방법에 따르면 된다.
본 발명에서는, 펩티드 사슬에 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 삽입하지 않고, 보호 펩티드 단편을 약산성 이탈 수지로부터 이탈시키고, 이어서 원하는 아미노산 잔기에 잔기 특이적 수식을 실시하여도, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하는 펩티드 단편을 제조할 수 있다. 잔기 특이적 수식의 방법은 상기와 동일하다.
이상 설명한 제조 방법은, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호 펩티드 단편이면, 특별히 제한없이 적용될 수 있다. 그 중에서도, 하기 식 9로 나타내어지는, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호 펩티드 단편 또는 그 염의 제작에 상기 방법을 이용하는 것이 바람직하다.
즉, 식 9; (Rl)n-G1y-Ser(X1)-A(R)-Phe-Leu-Ser(X2)-Pro-OR2
(식 중에서, -A(R)-은 상기 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노 화합물이다. 그 중에서도, A는 세린, 트레오닌, 시스테인, 호모시스테인, 리신, 오르니틴, 글루탐산, 2-아미노아디프산, 디아미노아세트산, 2-아미노말론산, 아스파라긴산, 티로신, 아스파라긴이 바람직하고, R은 아실기, 당, 인산기, 황산기, 알킬기, 아랄킬기, 아로일기 등의 수식기가 바람직하고, R이 A의 측쇄의 반응성 치환기에 에스테르 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 디설파이드 결합, 아미드 결합, O-글루코사이드 결합 또는 N-글루코사이드 결합을 통하여 결합되어 있는 것이 바람직하다.
R1는, t-부톡시카보닐(Boc), 트리클로로에틸옥시카보닐, t-아밀옥시카보닐, 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), 메틸설포닐에톡시카보닐, 트리클로로에톡시카보닐, 2-(트리메틸실릴)에톡시카보닐 또는 피리딘-4-메톡시카보닐 등의 치환기를 가 지고 있을 수도 있는 알콕시카르보닐기; 사이클로펩틸옥시카보닐, 사이클로헥실옥시카보닐 등의 치환기를 가지고 있을 수도 있는 사이클로알킬옥시카르보닐기; 벤질옥시카보닐(Z), p-메톡시벤질옥시카보닐(pMZ), p-클로로벤질옥시카보닐(C1-Z), p-브로모벤질옥시카보닐(Br-Z), p-니트로벤질옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐, 2-페닐이소프로필옥시카보닐, p-메틸페닐이소프로필옥시카보닐, p-비페닐이소프로필옥시카보닐, 3,5-디메톡시-α,α-디메틸벤질옥시카보닐 등의 치환기를 가지고 있을 수도 있는 아랄킬옥시카르보닐기; 벤질(Bz1), 벤즈히드릴, 트리틸 등의 치환기를 가지고 있을 수도 있는 아랄킬기; 트리플루오로아세틸, 프탈로킬, 포르밀, 벤젠설포닐, p-톨루엔설포닐(Ts), o-니트로페닐설페닐, 2,4-디니트로페닐설페닐, 3-니트로-2-피리딜설페닐 등의 치환기를 가지고 있을 수도 있는 아실기; 디티아숙시노일, 2-니트로페닐티오, 디페닐포스피닐, 디페닐포스피노티오일, 디메틸포스피노티오일을 나타내고,
n은, 1 또는 2이며,
X1 및 X2는, 세린 측쇄의 수산기의 보호기를 나타내고, 아세틸기 등의 저급(C1-6) 알카노일기; 벤조일기 등의 아로일기; 벤질옥시카르보닐기 또는 에톡시카르보닐기 등의 탄산으로부터 유도되는 기를 나타내거나, 또는, 측쇄에 전술한 치환기 R를 에테르 결합을 통하여 결합시키는 에테르화에 알맞는 기로서, 예를 들면, t-부틸기, 벤질기, 테트라하이드로피라닐기, 트리틸기, t-부틸디메틸실릴기 등의 실릴기를 나타내고,
R2는, 보호기 또는 보호기가 없는 것을 나타내고, 보호기가 있는 경우는, 알킬에스테르기(예를 들면, 메틸에스테르, 에틸에스테르, 프로필에스테르, 부틸에스테르, t-부틸에스테르, 사이클로펜틸에스테르, 사이클로헥실에스테르, 사이클로헵틸에스테르, 사이클로옥틸에스테르, 2-아다만틸에스테르 등의 직쇄상, 분지상 또는 환형 알킬에스테르기), 아랄킬에스테르기(예를 들면 벤질에스테르, 4-니트로벤질에스테르, 4-메톡시벤질에스테르, 4-클로로벤질에스테르, 벤즈하이드릴에스테르기), 페나실에스테르기, 벤질옥시카보닐히드라지드기, t-부톡시카보닐히드라지드기, 트리틸히드라지드기를 나타낸다)
로 나타내어지는 펩티드 또는 그의 염 등이다.
식 9 중, R1는 Boc기, Z기, pMZ기 또는 Fmoc기가 바람직하고, X1 및 X2로 나타내어지는 보호기로는, 바람직하게는 t-부틸기 또는 34 벤질기, 더욱 바람직하게는 t-부틸기를 들 수 있다. R2는 수소 또는 티오에스테르기가 바람직하다.
또한, 이상 설명한 제조 방법은, 그렐린, 바람직하게는 인간, 래트, 마우스, 돼지, 닭, 뱀장어, 소, 말, 양, 개구리, 무지개송어 또는 개의 그렐린, 또는 그렐린 유도체를 제조할 때에 적합하게 이용된다. 또, 상기 그렐린 또는 그렐린 유도체의 중의 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하는 부분을 제조할 때에도 적합하게 이용된다. 상기 각 생물의 그렐린의 구조는 표 1에 기재되어 있다.
보다 구체적으로는, (a) 서열 번호 1∼21 중 어느 한 항에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 적어도 N 말단의 첫번째로부터 4번째의 아미노산 서열을 가지고, 바람직하게는 상기 아미노산 서열에 있어서 N 말단의 첫번째로부터 5번째의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 N 말단의 첫번째로부터 7번째의 아미노산 서열으로 이루어지고, (b) N 말단에서 3번째의 세린 또는 트레오닌의 측쇄의 수산기가, 아실화, 바람직하게는 포화 또는 불포화의 탄소수 2∼35, 바람직하게는 6∼18의 알킬기에 의해 아실화되어 있고, (c) 아미노산의 측쇄에서의 수산기, 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 메르캅토기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의, 펩티드 단편 제작에 있어서 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가진 반응성 작용기, 바람직하게는 수산기 및 아미노기가 보호기에 의해 보호되어 있는 펩티드 단편의 제조에, 이상 설명해 온 제조 방법은 유용하다.
본 발명에서는, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 보호 펩티드 단편을, 상기 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하는 보호 펩티드 단편과는 별개로 제조한다.
본 발명에서의 펩티드 또는 단백질의, 아실화, 당화, 인산화 등의 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 펩티드 단편은, 자체 공지된 유전자 재조합법 또는 효소법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드 단편의 아미노산 서열을 가지는 펩티드(이하, 목적 펩티드라고 함)를 코딩하는 염기 서열을 가지는 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포를 배양하여, 상기 배양물로부터 목적 펩티드를 채취하는 공정, 및 상기 공정에서 얻어진 목적 펩티드의 측쇄 작용기 중, 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가진 작용기를 보호기에 의해 보호하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 발현 벡터의 제작 방법은, 당 기술분야에서의 통상의 방법에 따라 행할 수 있다. 발현 벡터 제작 시에는, 목적 펩티드의 높은 발현에 필요한 그 밖의 요소, 예를 들면 프로모터, 터미네이터, 스플라이스(splice) 부위 등에 관해서도 종래의 방법에 이미 알려져 있는 것을 적절하게 이용할 수 있다. 상기 발현 벡터에 의해 형질전환되는 숙주세포도 특별히 한정되지 않고, 종래의 방법에서 이미 이용되고 있는 원핵 세포 또는 진핵 세포, 예를 들면 대장균 등의 미생물 세포, 효모 또는 동물 세포 등으로부터, 목적 펩티드를 코딩하는 염기 서열이 적합하게 발현될 수 있는 것을 적절하게 선택하여 이용할 수 있다. 목적 펩티드의 측쇄 작용기의 보호도 전술한 바와 동일한 방법으로 행하면 된다.
수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 펩티드 단편은,
공정 (1); (a) 목적 펩티드에 원하는 바에 따라 링커 서열을 통하여 보호 펩티드가 부가되어 있는 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열을 가지는 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포를 배양하여, 상기 배양물로부터 상기 융합 단백질을 채취하는 공정;
공정 (2); 공정 (1)에서 얻어진 융합 단백질로부터, 보호 펩티드 및 원하는 바에 따라 링커 서열과 목적 펩티드와 절단 분리하여, 원하는 바에 따라 추가로 정제하는 공정;
공정 (3); 공정 (2)에서 얻어진 목적 펩티드의 측쇄 작용기 중, 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가진 작용기를 보호기에 의해 보호하는 공정;
을 포함하는 방법에 의해 제조할 수도 있다.
보호 펩티드는, 목적 펩티드가 숙주 세포 내에서 효소에 의해 분해되는 것을 억제할 목적에서 사용되는 것이며, 상기 목적을 달성할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 대장균 유래의 β-갈락토시다아제에 따른 아미노산 서열을 가지는 단편을 이용할 수 있다. 상기 효소에 관한 아미노산 서열은 당업자에게 공지된 것이며, β-갈락토시다아제 유래의 펩티드 단편은 널리 당업자에 의해 융합 단백법에서의 보호 펩티드로서 이용되고 있다.
링커 서열은, 공정 (2)에 있어서 보호 펩티드와 목적 펩티드와의 절단 분리에 알맞은 효소가 없는 등, 보호 펩티드와 목적 펩티드의 절단 분리가 잘 이루어지지 않는 경우, 보호 펩티드와 목적 펩티드 사이에 삽입되는 서열이다. 따라서, 공정 (2)에 있어서 링커 서열과 목적 펩티드의 절단 분리가 잘 이루어지도록 그 서열을 적절히 선택할 수 있다.
보호 펩티드 및 원하는 바에 따라링커 서열과 목적 펩티드와 절단 분리는, 효소적 또는/및 화학적인 방법으로 행할 수 있다.
효소적 및 화학적인 절단 방법으로는 Methods in ENZYMOLOGY, 185권, Gene Expression Technology(David V. Goeddel 편집, 출판사 ACADEMIC PRESS, INC)에 기재되어 있는 방법도 이용할 수 있다.
화학적 절단 방법으로는, 메티오닌의 C 말단측을 브롬시안으로 절단하는 방법(D.V. Goeddel et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vo1.76, p 106-110, 1979), -Asp-Pro- 서열의 사이를 포름산으로 절단하는 방법(Biochem. Biophys. Res. Commun., Vo1.40, p1173, 1970), -Asn-Gly- 서열의 사이를 하이드록실아민으로 절단하는 방법 및 트립신의 C 말단측을 BNPS-스카톨 또는 N-클로로숙신이미드로 절단하는 방법 등을 들 수 있다. 예를 들면, 목적 펩티드에 관한 아미노산 서열 중에 메티오닌이 포함되지 않는 경우는 목적 펩티드에 인접하는 절단 부위 영역의 말단에 메티오닌을 도입하고, 브롬시안 처리에 의해 화학적으로 절단 부위 영역에서의 절단을 행할 수 있다.
또, 효소적 절단 방법으로는, 절단 처리에 이용하는 효소가 기질로서 특이적으로 인식할 수 있는 절단 부위 영역을 설정하면 되고, 그러한 예로서는, 아르기닌-아르기닌, 리신-리신, 아르기닌-리신 및 리신-아르기닌의 염기성 아미노산 쌍 중앙의 펩티드 결합, 또는 아르기닌-메티오닌, 아르기닌-알라닌 또는 아르기닌-발린의 아미노산 쌍 중앙의 펩티드 결합을 대장균 OmpT 프로테아제(Sugimura, K. and Nishihara, T.J. Bacteriol. 170: 5625-5632, 1988)로 X-Gly 또는 PrO-X-Gly-Pro 서열의 -X-Gly- 서열의 사이를 콜라게나아제(Collagenase)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.81, p.4692-4696, 1984)로 -Asp-Asp-Asp-Lys- 서열(서열 번호: 22)의 LYs의 C 말단측을 엔테로키나아제(Enterokinase)로 -Ile-Glu-Gly-Arg- 서열(서열 번호: 23)의 Arg의 C 말단측을 혈액응고인자 Xa(blood coagulation Factor Xa)(일본 특개소61-135591)로, -Gly-Pro-Arg- 서열의 Arg의 C 말단측을 트롬빈(Thrombin)(일본 특개소62-135500)로,-Arg-의 C 말단측을 트립신(Trypsin) 또는 크로스트리파인(C1ostripain)으로, Arg 또는 Lys의 C 말단측을 엔드프로테아제(endoprotease) Arg-C(Nature, Vo1.285, p 456-461, 1980)로, Lys-Arg, Arg-Arg 또는 Pro-Arg 서열의 C 말단측을 사카로마이세스·세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) Kex2 프로테아제 및 그 유도체(Biochem. Biophys. Res. Commun., Vo1.144, p 807-814, 1987, 일본 특개평1-199578, 일본 특개평10-229884)로, LYS의 C 말단측을 리실엔도펩티다아제(lyslendopeptidase) 또는 엔도펩티다아제(endopeptidase) Lys-C(일본 특개소61-275222)로, Asp 또는 Glu의 C 말단측을 스타필로코쿠스·아우레우스(S.aureus) V8 프로테아제(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vo1.69, p 3506-3509, 1972)로, -Phe-Arg- 서열의 C 말단측을 칼리크레인(Kallikrein)(일본 특개소62-248489)로, -Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr- 서열(서열 번호: 24)의 Leu-Leu의 사이를 레닌(renin)으로(일본 특개소60-262595), -Glu-Gly-Arg- 서열의 C 말단측을 우로키나아제(Urokinase)(일본 특개평2-I00685)로, Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 서열(서열 번호: 25)의 C 말단측을 엔테로펩티다아제 (entero-peptidase)(Biotechno1ogy, Vo1.6, p 1204-1210, 1988)로, poly-Gly의 C 말단측을 리소스타핀(lysostaphin)(일본 특개평1-160496)로, Lys-Arg, Arg-Arg 또는 Pro-Arg 등의 C 말단측을 클루베로미세스·락티스(Kluverromyces lactis)(일본 특개평1-124390)로 절단하는 방법 등을 들 수 있다.
본 방법에서의 발현 벡터, 숙주 세포 및 목적 펩티드의 측쇄 작용기의 보호에 관해서는, 상기 방법과 동일하다.
또한, 유전자 재조합법 또는 효소법을 이용한 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 펩티드 단편의 제조 방법은, 국제공개번호: W099/38984에 기재되어 있는 방법을 이용할 수도 있다.
수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 펩티드 단편이, 그 렐린 및 그렐린 유도체의 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 펩티드 단편(이하, 그렐린단편(비수식 성분)이라고 함)인 경우, 국제공개번호: W001/07475에, 유전자 재조합법 및 효소법에 의한 제조 방법이 기재되어 있다.
또한, 국제공개번호: WO 00/52193에 기재되어 있는 Glucagon like peptide-1의 생산에서 사용하고 있는 보호 단백질 및 링커 서열을 적응시켜, OmpT 프로테아제 또는 그 유도체, 및 Kex2 프로테아제 또는 그 유도체에 의한 2단계 효소법을 이용하여도 그렐린 단편(비수식 성분)을 제조할 수 있다. 이 방법에서는 숙주인 대장균의 내재성 OmpT 프로테아제를 활용하는 것이 가능한 때문에, 효소를 별도 조제할 필요가 없다. 상기 OmpT 프로테아제 또는 Kex2 프로테아제의 유도체로는, OmpT 프로테아제 또는 Kex2 프로테아제와 동일한 활성을 가지는 것이면 특별히 한정되지 않는다. OmpT 프로테아제 유도체로는 대장균의 OmpP 프로테아제, 살모넬라의 pgtE 프로테아제로 대표되는 0mptin 패밀리에 속하는 효소나 OmpT 프로테아제의 활성 부위를 포함하는 부분 펩티드 등을 들 수 있고, Kex2 프로테아제 유도체로는, 일본 특개평 10-229884 기재의 유도체 및 Furin, PC1/3으로 대표되는 Kex2 패밀리에 속하는 효소 등을 들 수 있다.
본 방법에서는, 실시예 13에 도시한 바와 같이, 국제공개번호: W0 00/52193에 기재되어 있는 링커 서열 EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR(서열 번호; 26) 대신, 상기 서열에서의 35번째 프롤린 잔기를 아르기닌 잔기로 치환한 서열 EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHRR(서열 번호; 27)을 링커 서열로서 이용함으로써, OmpT 프로테아제 및 Kex2 프로테아제를 사용한 2단계 효소 처리법으로, 그렐린 단편(비수식 성분), 그 중에서도 그렐린(8-28) 단편, 특히 인간 그렐린(8-28) 단편을 효율적으로 얻을 수 있다. 새로 발견된 서열 번호 27 기재의 링커 서열 내에는 OmpT 프로테아제의 절단 인식 부위 이외에도 별개로 절단 인식 부위가 생김 에도 불구하고, 목적의 부위에서만 정상으로 절단이 일어난다 (실시예 3 참조).
또한, 보호 펩티드 단편(비수식 성분)을 정제 및 보존할 때에, 정제 또는 보존에 이용하는 용액의 pH를 4-8로 조정함으로써 보호기의 이탈을 방지할 수 있다. 그리고, 보호기의 탈리를 억제함으로써, 높은 회수율로 고순도의 수식 펩티드 또는 단백질을 조제할 수 있다. 상기 정제 또는 보존에 이용하는 용액으로는, 수용액이 바람직하다. 구체적으로는, 물, 바람직하게는 한외(限外)여과수, 아세트산나트륨 용액 등을 들 수 있다. 수용액 중에서의 보호 인간 그렐린(8-28) 단편의 안정성을 조사한 실시예 15로부터 명확히 나타난 바와 같이, Boc기에 의해 보호된 펩티드 단편은 수용액 상태에 따라서 그 안정성이 다르며, 특히 pH 2 이하의 수용액 상태에서는 명확한 본 보호기의 이탈이 인지되었기 때문에, 보호기로서 Boc기를 이용한 경우는, 특히 정제·보존 시의 용액의 pH를 4-8 사이로 설정하는 것이 바람직하다.
이어서, 본 발명에서는, 이상과 같이 하여 얻어진, (a) 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호 펩티드 단편과, (b) 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 보호 펩티드 단편을 축합하여, 원하는 바에 따라, 아미/산 또는 비아미노산의 측쇄 작용기의 보호기를 탈보호한다.
상기 축합 반응은 액상법에 의해 행해지는 것이 바람직하다. 또, 상기 (a) 및 (b)의 펩티드 단편을 액상법에 의해 축합하는 반응에 있어서, 상기 펩티드 단편 의 각 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄 작용기는 통상, 보호기로 보호되어 있다. 상기 보호기로는, 각 작용기의 보호기로서 앞에서 예시한 보호기를 들 수 있다. 바람직한 보호기로는, 상기 (a) 및 (b)의 보호 펩티드 단편의 보호기를, 동일한 탈리 조건 하에서 탈리할 수 있는 보호기를 들 수 있다. 또, 이 경우에는, 약산성 이탈 수지가 이미 탈리되어 있기 때문에 약산성 이탈 수지의 탈리 조건을 고려할 필요는 없고, 또, 이 경우의 측쇄 작용기의 보호기로는, N 말단 아미노기의 탈리 조건으로 탈리하는 보호기가 더욱 바람직하다.
상기 (a) 및 (b)의 보호 펩티드 단편을 액상법에 의해 축합하는 반응에 있어서, 축합에 이용하는 시약이나 조건 등은 전술한 아미노산 축합 반응에서 기재된 것으로부터 적절하게 선택된다. 바람직하게는, 펩티드 또는 단백질의 라세미화 이성체 등의 불순물이 보다 부생되기 어려운 방법으로부터 선택된다. 특히, 축합에 이용하는 시약(축합제)으로는, 예를 들면, 2-(l-하이드로벤조트리아졸-1-일)-1,l,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU), 2-(1-하이드로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트(TBTU), 디페닐포스포릴아지드(DPPA), 디페닐포스포로시아니데이트(DEPC), 디이소프로필카르보디이미드 (DIPC), 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 등을 바람직한 예로서 들 수 있다. 그 중에서도, 축합제가 디이소프로필카르보디이미드(DIPC), 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)이며, 상기 축합제를 이용하는 펩티드 단편의 축합이 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt), 1-하이드록시숙신이미 드(HOSu) 또는 3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥소-벤조트리아진(HOOBt)의 존재 하에 행해지는 것이 더욱 바람직하다.
축합한 반응 생성물에 있어서, 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄의 보호기는 적절하게 탈보호할 수 있다. 이 경우에서의 탈보호 시약이나 조건 등은, 바람직하게는, 펩티드 또는 단백질의 라세미화 이성체 등의 불순물이 보다 부생되기 어려운 방법으로부터 선택된다.
각 보호기의 탈리 조건은, 예를 들면, 상기 "펩티드 합성의 기초와 실험" 등에 기재되어 있는 공지된 방법에 따르면 된다. 보호기의 탈리 방법에는, 강산, 약산, 염기, 환원 시약(접촉 환원, 금속, 티올 등), 산화 시약, 친핵 시약, 친전자 시약, 이온, 전자, 광, 용매, 효소 등을 각각 이용하는 방법이 있고, 상기 보호기의 선택에는, 이들 탈리 방법의 탈리 조건을 고려하여 행할 수 있다.
보호기의 제거 방법(탈보호 반응)으로는, 예를 들면, 트리플루오로아세트산, 아세트산, 무수 불화수소, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 또는 이들 혼합액 등(바람직하게는 트리플루오로아세트산, 아세트산 등)에 의한 산 처리; 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 피페리딘, 피페라진 등에 의한 염기 처리; Pd-탄소 등의 촉매 존재 하에서의 수소 기류 중에서의 접촉 환원; 아세트산 중 아연분말 처리(Zn/AcOH); 또는, 테트라부틸암모늄플루오라이드(TBAF) 처리 등도 이용된다. 상기의 탈보호 반응은 일반적으로 약 40℃ 이하의 온도에서 행해지지만, 바람직하게는 약 25℃ 이하에서 행함으로써, 보호 펩티드 단편의 라세미화 이성체의 부생을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기의 탈보호 반응의 반응 시간은 통상 약 0.5∼약 5시간이다.
상기 산 처리에서는, 예를 들면, 물, 트리이소프로필실란(TIPS), 페놀, 아니솔, 티오아니솔, 메타크레졸, 파라크레졸, 디메틸설파이드, 1,4-부탄디티올, 1,2-에탄디티올 등(바람직하게는 페놀 등)과 같은 양이온 포착제를 첨가하는 것이 바람직하다. 또, 히스티딘의 이미다졸 보호기로서 이용되는 2,4-디니트로페닐기는 티오페놀 처리에 의해 제거되어, 트립토판의 인돌 보호기로서 이용되는 포르밀기는 상기의 1,2-에탄디티올, 1,4-부탄디올 등의 존재 하의 산 처리에 의한 탈보호 이외에, 묽은 수산화나트륨 용액, 묽은 암모니아 등에 의한 알칼리 처리에 의해서도 제거된다.
본 발명에 의해 얻어진 반응 생성물은, 예를 들면, 겔여과법, 이온교환 크로마토그래피, 분배 크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피, 역상(逆相) 고속액체 크로마토그래피, 전기영동법 등의 관용의 분리 정제 수단에 의해, 단리 정제할 수 있다. 또, 정제하는 생성물은, 최종 목적으로 하는 수식된 펩티드 또는 단백질에 한정되지 않고, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호 펩티드 단편, 또는 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 보호 펩티드 단편, 또는 이들 제조 공정에서의 중간체로서 얻어진 생성물을, 전술한 분리 정제 수단에 의해 적절하게 정제할 수 있는 것은 물론이다.
이상과 같이 하여, 수식 펩티드 또는 단백질을 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 제조 방법은, 수식 펩티드 또는 단백질이면, 특별히 제한 없이 적용될 수 있다. 그 중에서도, 그렐린, 바람직하게는 인간, 래트, 마우스, 돼지, 닭, 뱀 장어, 소, 말, 양, 개구리, 무지개송어, 또는 개의 그렐린, 또는 그렐린 유도체를 제조할 때에 적합하게 이용된다. 또, 상기 각 생물의 그렐린의 구조는 표 1에 기재되어 있다. 본 발명에 의해 얻어지는 그렐린 또는 그렐린 유도체는, 종래 기술에 의해 얻어지는 그렐린 또는 그렐린 유도체에 비하여, 불순물(특히 그렐린 또는 그렐린 유도체의 라세미화 이성체)의 양이 대폭 적은 매우 고품질의 그렐린 또는 그렐린 유도체이다. 그 결과, 보다 간편한 정제 방법에 의해 충분한 정제를 효과적으로 행할 수 있고, 작업 시간을 단축하고 고수율로 그렐린 또는 그렐린 유도체를 제조할 수 있다. 이 점으로 볼 때에도 종래 기술에 비해, 본 발명의 제조 방법은 그렐린 또는 그렐린 유도체의 공업적 제조 방법으로서 매우 유리한 방법이다.
상기 "고품질의 그렐린 또는 그렐린 유도체"로서 보다 구체적으로는, 예를 들면, 총 유연(類緣) 물질의 함량이 약 1% 이하(바람직하게는 약 0.9% 이하, 더욱 바람직하게는 약 0.8% 이하, 더욱 바람직하게는 약 0.7% 이하)인 정제 그렐린 또는 그렐린 유도체 또는 그의 염 등을 들 수 있다. 여기에서, 총 유연 물질이란, 고속액체 크로마토그래피 등에 의하여 검출되는, 모든 불순물의 합계를 의미하여, 불순물로는, 그렐린 또는 그렐린 유도체의 라세미화 이성체, 고극성 유연 물질, 기타 불순물을 들 수 있다.
본 발명에 따른 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법의 특히 바람직한 양태은, 이하와 같다. 즉,
공정 1; (a) 서열 번호 1∼21 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 적어도 N 말단의 첫번째로부터 4번째의 아미노산 서열을 가지고, 바람직하게는 상기 아미노산 서열에 있어서 N 말단의 첫번째로부터 5번째의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 N 말단의 첫번째로부터 7번째의 아미노산 서열으로 이루어지고, (b) N 말단에서 3번째의 세린 또는 트레오닌의 측쇄의 수산기가, 아실화, 바람직하게는 포화 또는 불포화의 탄소수 2∼35, 바람직하게는 6∼18의 알킬기에 의해 아실화되어 있고, (c) 아미노산의 측쇄에서의 수산기, 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 메르캅토기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의, 펩티드 단편 제작 및 하기 공정 (4)에서의 펩티드 단편의 축합 반응에 있어서 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가진 반응성 작용기, 바람직하게는 수산기 및 아미노기가 보호기에 의해 보호되어 있는 펩티드 단편을 약산성 이탈 수지 상에서 제조하는 공정,
공정 (2); 약산성 조건에서 상기 펩티드 단편에서의 보호기를 탈리시키지 않고 상기 펩티드 단편을 약산성 이탈 수지로부터 이탈시키는 공정,
공정 (3); 서열 번호 1∼21 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 공정 (1) 및 (2)에서 제작된 펩티드 단편이 가지는 아미노산 서열 이외의 아미노산 서열, 바람직하게는 상기 아미노산 서열에 있어서 N 말단의 6번째로부터 28번째의 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 N 말단의 8번째로부터 28번째의 아미노산 서열으로 이루어지고, 또한, 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄에서의 수산기, 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 메르캅토기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의, 펩티드 단편 제작 및 하기 공정 (4)에서의 펩티드 단편의 축합 반응에 있어서 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가진 반응성 작용기, 바람직하게는 수산기 및 아미노기가 보호기에 의해 보호되어 있는 펩티드 단편을 제조하는 공정,
공정 (4); 상기 공정 (2)에서 제조된 펩티드 단편과 공정 (3)에서 제조된 펩티드 단편을 축합하고, 이어서, 원하는 바에 따라 반응성 작용기의 보호기를 탈보호하는 공정
을 포함하는 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법이다.
본 발명에 따른 방법에 의해 얻어지는 수식 펩티드 또는 단백질은, 반응 조건에 의해, 유리된 펩티드 또는 그의 염 형태로 얻어진다. 유리된 펩티드와 그 염은, 관용의 방법에 의해 서로 변환 가능하다. 유리된 펩티드를 약리적으로 허용할 수 있는 염으로 하는 경우에는, 예를 들면, 다음 예시되는 무기산, 유기산 등과 반응시키면 된다. 상기 펩티드 또는 단백질의 염으로는, 약리학적으로 허용되는 염이 바람직하고, 이러한 염으로는, 상기 펩티드 또는 단백질이 아미노기 등의 염기성기를 가지는 경우, 무기산(무기의 유리산(遊離酸)이라고도 함)(예, 탄산, 중탄산, 염산, 황산, 질산, 붕산 등), 유기산(유기의 유리산이라고도 함)(예, 숙신산, 아세트산, 프로피온산, 트리플루오로아세트산 등) 등과의 염을 들 수 있다. 상기 펩티드 또는 단백질이 카르복시기 등의 산성기를 가지는 경우, 무기 염기(무기의 유리염기라고도 함)(예, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 칼슘, 마그네슘 등의 알칼리토류 금속 등)이나 유기 염기(유기의 유리염기라고도 함)(예, 트리에틸아민 등의 유기 아민류, 아르기닌 등의 염기성 아미노산류 등) 등과의 염을 들 수 있다. 또, 상기 펩티드 또는 단백질은 금속착체 화합물(예, 구리 착물, 아연 착물 등)을 형성하고 있을 수도 있다.
본 발명에 따른 방법으로 제조되는 수식 펩티드 또는 단백질은, 여러 가지 용도에 이용할 수 있다. 예를 들면, 상기의 정제 그렐린 또는 그렐린 유도체는, 저독성이며, 포유동물(예, 인간, 원숭이, 개, 래트, 마우스)에 대하여, 섭식장애 치료약, 성장호르몬 분비촉진약, 심장 질환 치료약, 위기능성 질환 치료제, 장관점막 보호제 또는 경정맥(經靜脈) 영양 시의 소장점막장애 예방제, 골다공증 치료제, 만성질환에 의한 악액질의 감소제, 폐기능부전 치료제 등의 의약품으로서, 투여할 수 있다. 또, 상기의 정제 그렐린 또는 그렐린 유도체는, 필요에 따라 당의를 실시한 정제, 캡슐제, 엘릭시르제, 서방성 제제 등으로 경구적, 또는 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제, 서방성 제제 등의 주사제: 용액, 현탁액제 등의 경비투여 제제; 분무제 또는 흡입제 등의 경폐투여 제제; 좌제형으로 비경구적으로 투여할 수 있다. 상기의 정제 그렐린 또는 그렐린 유도체를 생리학적으로 인지되는 공지된 담체, 향미제, 부형제, 비클(vehicle), 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인지된 제제 실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼화함으로써 상기 제제를 제조할 수 있다.
[실시예]
본 발명을 이하의 실시예에서 더 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다. 본 실시예에 있어서 이용한 시험법과 기기는, 특별히 기재하지 않는 한 이하에 기재된 것을 사용했다.
〔주요 약호〕
HBTU; 2-(lH-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(2-(1H-benzotriazo1e-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate)
DCC; 디사이클로헥실카르보디이미드(dicyc1ohexylcarbodiimide),
H0Bt; 1-하이드록시벤조트리아졸(1-hydroxybezotriazole),
H00Bt; 3-하이드록시-3,4-디하이드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(3-hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benzotriazine),
TFA; 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid),
TIPS; 트리이소프로필실란(triisopropylsilane),
DIPEA; 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine),
TBAF; 테트라부틸암모늄플루오라이드(tetrabutylammoniumfluoride),
TFE; 트리플루오로에탄올(trifluoroethano1),
Fmoc; 플루오레닐메톡시카보닐(fluorenylmethoxycarbonyl),
Boc; t-부틸옥시카보닐 C-butyloxycarbonyl),
tBu; t-부틸(t-butyl),
TBDMS; t-부틸디메틸실릴(t-butyldimethylSilyl),
Trt; 트리틸(trityl),
Pac; 페나실(phenacyl),
DMF; N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide),
DCM; 디클로로메탄(dichloromethane),
NMP; N-메틸피롤리돈(N-methylpyrrolidone),
Et2O; 디에틸에테르(diethylether),
DMAP; 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine),
EDC; 1-에틸-3(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-ehtyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide)
〔합성에 사용한 보호 아미노산과 수지〕
Boc-Gly, Fmoc-Ser(TBDMS), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Leu, Fmoc-Ser, Fmoc-Pro(이상, 와타나베 가가쿠고교사제 또는 어플라이드 바이오 시스템사제), 프롤릴-2-클로로트리틸 수지(노바바이오켐사제).
〔사용 기기〕
(a) 펩티드 자동 합성기
어플라이드 바이오 시스템사제: 433A 합성기
(b) 분석용 HPLC 시스템
기기: 시마즈 LC-10A 시스템
컬럼: YMC-Pack PROTEIN-RP 또는 YMC-Pack ODS AP-302 또는 YMC-Pack PROTEIN-C8(모두 4.6mmφ×150mm)
컬럼 온도: 40℃
용출액: 0.l% 트리플루오로아세트산 중, 아세토니트릴 농도를 최고 100%까지 직선적으로 변화시켰다.
유속: 1 ㎖/분
검출: UV(210nm 또는 214nm)
주입량: 0∼50㎕
(c) 분취용 크로마토그래피 시스템
기기 1: AKTA explorer 10S(아마시암 파마시아사제 크로마토그래피 시스템)
컬럼: SP-sepharose big beads(XK26/30)(아마시암 파마시아사제 수지)
내경 261mm×길이 300mm
YMC-ODS 120 s50 (HR26/15)(YMC사제 수지)
내경 26mm×길이 15mm
Vydac C4 (HR10/30) (Vydac 사)
내경 10mm×길이 300mm
Source 30RPC (HR10/30) 23mL(아마시암 파마시아사제 수지)
내경 10mm×길이 30mm
유속, 용출액 등의 조건은 별도 실시예에 기재했다.
기기2: Applied Biosystem BioCAD perfusion Chromatography workstation
컬럼 SP-Toyopearl 550-c(내경 16mm×280mm TOSOH사제)
YMC-ODS AM(입경 20㎛, 내경 21.5mm×300mm, YMC사제)
역상 크로마토그래피 컬럼 0DS-80Ts
(내경 21.5mm×300mm 컬럼(108mL) 입경 20um, TOSOH사제)
유속, 용출액 등의 조건은 별도 실시예에 나타내었다.
(d) 분취용 HPLC 시스템
기기: Waters 600 Multisolvent Delivery System
컬럼: YMC-Pack ODS-A(5㎛, 20mm×250mm) 또는 YMC-Pack PROTEIN-RP
(5㎛, C4, 20mm×250mm)
용출액: 0.1% 트리플루오로아세트산 중 적절히 아세토니트릴 농도를 최고 100%까지 직선적으로 변화시켰다.
유속: 10mL/분
검출: 210nm 및 260nm
주입: 10∼2000㎕, 2000㎕ 이상은 펌프에 의해 주입
(e) 질량분석기
기기 1: 피니건 MAT TSQ700
이온 소스: ESI
검출이온 모드: positive
스프레이 전압: 4.5kV
캐필러리 온도: 250℃
이동상: 0.2% 아세트산·메탄올 혼합액(1:1)
유속: 0.2mL/분
스캔 범위: m/z 300∼1,500
기기 2: API30O0(다카라 주조)
검출이온 모드: positive mode
스캔 타입: Qlscan
유속: 0.3mL/분
1 count/0.1msec during 5min chase
Molecular range 500∼300OMass
(f) 아미노산 서열 분석
기기: 퍼킨엘머사제 어플라이드 바이오 시스템 477A 형 시퀀서
(g) 아미노산 조성 분석
기기: 히타치세이샤쿠쇼제 L-8500형 아미노산 분석기계
시료: 밀봉관 중, 0.1% 페놀을 포함하는 6M 염산으로 110℃, 24시간 가수분해했다.
〔[Lys16,19,20,24(BOC)] 인간 유래 그렐린(8-28)의 제조 스케일과 개요〕
이하, 실시예 2 내지 실시예 8은 최종 정제품으로서 O.6g 정도의[Lys16,19,20,24 (Boc)]hGhrelin(8-28)(hGhrelin은 인간 유래 그렐린을 나타낸다. 이하도 동일하다)를 얻는 것을 목적으로 한 배양 및 정제 결과이다. 대장균에 실시예 1에 나타내는 발현 벡터를 형질전환하여, 이 실시예에 나타내는 아미노산 서열을 가지는 융합 단백질을 발현시켰다. 배양은 2L 배양조를 이용한 고밀도 배양으로 행하고, 봉입체를 회수했다. 회수한 봉입체의 절반량을 이용하여 정제를 개시했다. OmpT 반응[0.9L 스케일], 양이온 교환 SP-sepharose big beads[160mL 스케일], Boc화 반응[0.5L 스케일], 역상컬럼 YMC ODS-120 s50[80mL 스케일], Kex2 반응 [0.3L 스케일]은 각각 일회씩 행하여, 최종 정제의 역상컬럼 Vydac C4[25mL 스케일]은 2회 실시했다. 최종 정제 공정만 직선 농도 구배에 의한 용출로 분획분석을 실시했다. 또, 탈용매에는 증발기를, 여과에는 유리 섬유 여과지(왓트만사)를 사용한 감압여과를 실시했다.
실시예 1 hChrelin(8-28) 유도체 발현 벡터 p117 8-28oRR의 구축
hGhrelin의 cDNA 유전자서열(Kojima 등, Nature, 402권, p.656-660, 1999년)에 기초하여, 전합성 올리고 DNA(파마시아 바이오 테크니컬 센터사)를 이용하여 어닐링법에 의해 hGhrelin(8-28)의 DNA 단편을 얻었다. 어닐링에 이용한 전합성 올리고 DNA 및 아미노산 서열을 도 1(A)에 나타낸다.
이 DNA 단편을 대장균 β-갈락토시다아제 유도체와 인간 Glucagon like peptide-1과의 융합 단백질 유전자를 도입한 플라스미드 pGPI17ompPR(국제공개번호: WO 00/52193)에 삽입하기 위해, pGP117ompPR를 제한효소 SalI 및 SacII로 처리하고, 인간 Glucagon like peptide-1 유전자를 결실시킨 DNA 단편을 한천겔 전기영동에 의해 조제했다. 추가로 알칼리인산 가수분해 효소 처리 후, 사전에 SacII 처리, T4 DNA 키나제 처리를 실시한 hGhrelin(8-28) 유도체 유전자 단편과 T4 DNA 리가아제에 의해 연결시켰다. 연결한 플라스미드를 대장균 DH5 α주로 형질전환하여, 플라스미드 p117 8-28oPR를 얻었다. 상기 플라스미드는 hGhrelin(8-28)의 아미노산 서열과 β갈락토시다아제의 부분 단편 117 아미노산 잔기를 EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR(서열 번호 26)라는 아미노산 서열을 가지는 링커 서열로 연결한 융합 단백질을 발현한다.
또한, 이 플라스미드 p117 8-28oPR를 주형으로 하여, 효소로서 KOD plus 폴리머라아제(東洋紡), 프라이머에는 이하의 2종의 프라이머
0RI-RR: GGTTCCGGATCCCCTTCTCGACATCGCCGGGAACAC(서열 번호 28)
SAL*R: ATAAGTCGACTTATCGTGGCTGCAG(서열 번호 29)
를 이용하여 PCR을 행하여 증폭 단편을 전기영동 겔로부터 잘라내었다. 또한, 이것을 제한효소 SalI, BamHI로 처리했다. 먼저 p117 8-28oPR를 동일하게 제한효소 SalI, BamHI 처리하여 정제한 것과 이 단편을 T4 DNA 리가아제로 연결시키고, 연결한 플라스미드를 대장균 DH5 α주로 형질전환하여, 플라스미드 p117 8-28oRR를 얻었다. 상기 플라스미드는 hGhrelin(8-28)의 아미노산 서열과 β-갈락토시다아제의 부분 단편 117 아미노산 잔기를 EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHRR (서열 번호 27)라는 아미노산 서열을 가지는 링커 서열로 연결한 융합 단백질을 발현한다. 발현한는 융합 단백질을 이하 도 1(B)에 나타낸다.
실시예 2 대장균에서의 재조합 hGhrelin(8-28) 융합 단백질의 발현과 봉입체 회수
실시예 1에서 작성한 플라스미드 p117 8-28oRR를 대장균 W3110주로 형질전환한 대장균을 이용하여 3L 배양조로 2L의 배양을 실시했다. 또 이 발현 플라스미드는 pBR322 유래의 플라스미드로 lac promoter에서 발현 유도된다. 또한 약제 내성유전자로서 테트라사이클린 내성 유전자를 유지한다. 전 배양은 LB broth로 32℃에서 14시간 진탕 배양했다. 본 배양에는 이하 조성의 배지를 사용했다. 배지 조 성은 4g/L 효모 추출물, 4g/L K2HP04, 4g/L KH2PO4, 2.7g/L Na2HPO4, 0.2g/L NH4C1, 1.2g/L (NH4)2S04, 2g/L MgSO4·7H20, 40mg/L CaC1 2, 40mg/L FeSO4·7H2O, 1Omg/L MnSO4·nH20, 1Omg/L AlC13·6H2O, 4mg/L CoCl2 ·6H2O, 2mg/L ZnS04·7H20, 2mg/L Na2MoO4·2H20, 1mg/L CuC12·2H20, 0.5mg/L H 3BO4이다. 탄소원으로는 글루코스를 최초 배지 중에 1% 첨가하여, 37℃에서 배양을 개시했다. 글루코스가 고갈된 후, 글리세롤을 첨가하여 배양을 행했다. 그 후 배양액을 가압식 균체파쇄기(맨톤 고린)으로 균체를 파쇄하고, 또 원심기로써 약 80g의 봉입체를 회수했다. 또한, 이 봉입체를 탈이온수 2L로 재현탁한 후, 원심분리기로 회수함으로써 봉입체를 세정했다. 최종적으로 OD660 값이 530인 봉입체 현탁액 20OmL를 얻었다.
이하의 실시예는 이 봉입체 현탁액의 절반량인 100mL를 사용하여 행했다.
실시예 3 hGhrelin(8-28) 융합 단백질의 내재성 0mpT 프로테아제에 의한 처리
실시예 2에서 얻어진 봉입체 현탁액을 OD660의 값이 100.0이 되도록 하기의 반응 조건에 나타내는 첨가물과 탈이온수로 희석하여, 이하의 반응 조건으로 OmpT 반응을 실시했다.
반응 조건:
4M 요소, 20mM Tris-HC1 pH 7.4, 50mM NaC1, 반응용량: 800mL, 반응 온도: 32℃, 반응 시간: 40분
봉입체를 100OD660/mL이 되도록 8M 요소 400mL에서 용해 희석하고, Tris-HC1, NaCl를 상기의 농도가 되도록 첨가하여, 탈이온수로 80OmL로 되도록 질량을 증가시킨다. 또 pH를 7.4에 조정하여 반응을 시작시켰다. 반응개시 0분, 20분, 40분에서 샘플링하여 HPLC로 분석을 하여 절단율이 80%를 넘은 40분에서 반응을 정지시켰다. 반응 정지는 5N NaOH로 pH l1까지 상승시켜 행했다. 반응 정지 후, 저속 원심분리에 의해 잔사를 제거하여, 상청을 얻었다.
[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28) 농도: 2.23mg/mL
용액량: 80OmL
펩티드 함량: 1.7g
HPLC 측정 결과, 및 질량분석의 결과, 정상으로 프로세싱이 이루어지고, [RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)가 유리되어 있는 것이 나타났다. 피니건 MAT사의 질량분석계(TSQ-700)로 행한 ESI-MS에서의 측정값은 4078(이론치; 4077)였다.
실시예 4 [RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)의 정제(양이온 교환에 의한 정제)
실시예 3에서 얻어진 OmpT 프로테아제 반응액 상청을 양이온 크로마토그래피에 의해 정제를 행했다.
방법:
사용 컬럼: SP-sepharose big beads(XK26/30)(160mL)
(아마시암 파마시아사제 수지) 내경 26mm×길이 300mm
평형화, 세정액: 1.5M 요소, 50mM NaHC03 pH l1
용출액: 1.5M 요소, 0.5M NaC1, 50mM NaHC03 pH l1
초기화, 재생액: 0.4M Na0H
유속: 1O mL/min(2.5cm/min)
조작:
초기화, 평형화: 0.4M Na0H2 컬럼 볼륨 → 탈이온수 2컬럼 볼륨 → 평형화액: 100% 3컬럼 볼륨
샘플 부하: 샘플을 부하하여, 평형화, 세정액으로 UV가 내려올 때까지 세정한다(약 4컬럼 볼륨 정도)
용출: 용출액 100%의 단계적으로 실시했다.
결과: 용출액에서 얻어진 펩티드의 순도는 9O%이며 공정 회수율은 91.6%였다.
[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28) 농도: 4.75mg/mL
용액량: 30OmL
펩티드 함량: 1.43g
실시예 5 [RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)의 Boc화
정제한 [RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)에 Boc기의 부가 반응을 행하고, N 말단의 α아미노기 및 서열 중에 포함되는 Lys 잔기 측쇄의 아미노기를 Boc기에 의해 보호한다.
방법: 양이온 크로마토그래피 용출액 300mL 전량을 유리 비이커에 옮기고, 50% 아세토니트릴이 되도록 등량(300mL)의 아세토니트릴을 가했다. 또 교반하면서, 1M의 (Boc)2O를 [RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28) 내에 존재 하는 α 아미노기와 리신 잔기 측쇄의 ε 아미노기수(합계 5개소)의 5배 몰량에 대응하는 8.8mL(최종 농도 20mM, 25 당량) 가했다. 또 pH가 9 밑으로 내려가지 않도록 5N NaOH로 조정하여, 교반기로 교반하면서 실온에서 60분간 반응시켰다. 반응 효율의 측정은 HPLC 분석 및 분자량의 측정에 의해 모니터했다.
반응 종료 후 곧 증발기에 의해 탈용매를 실시했다. 탈용매 후, 아세트산으로써 pH를 5.5에 맞추고 침전을 유리 섬유 여과지(왓트만사)로 감압여과를 행했다. 이 공정에 의해 [Nα-Boc, Lys16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)을 1740mg 포함하는 용액, 580mL를 얻었다.
공정 회수율: 116%(공정 회수율이 100%보다 큰 것은, Boc기 부가에 의해 HPLC에서의 흡광도가 상승하여, 겉보기 회수율이 증가했기 때문으로 생각된다.)
질량 분석은 피니건 MAT사의 질량분석계(TSQ-700)를 사용했다. 행한 ESI-MS 에서의 측정값은 4578(이론치; 4577)였다.
Boc화 이전(측정 분자량 = 4077, 이론상 분자량 = 4077)에 비해 반응 후에는 분자량이 500 증가된 것(측정 분자량 = 4578, 이론상 분자량 = 4577)이 주로 나타났다. 이 피크는 hGhrelin(8-28) 서열 내의 리신 잔기 측쇄에 존재하는 4개소의 ε아미노기 및 N 말단의 α아미노기가 Boc화된 [Nα-Boc, Lys16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)인 것으로 추정되었다.
실시예 6 [Nα-Boc, Lys16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)의 역상 컬럼에 의한 정제
실시예 5에서 얻어진 [Nα-Boc, Lys16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin (8-28)을 역상 컬럼으로 정제했다.
방법:
사용 컬럼: YMC-ODS 120 s50(HR26/15) 80mL(YMC사제 수지) 내경 26mm×길이 15mm
평형화, 세정액: 10% 아세토니트릴, 30mM 아세트산나트륨 pH 5.5
용출액: 50% 아세토니트릴, 30mm 아세트산나트륨 pH 5.5
재생액: 80% 아세토니트릴
유속: 7mL/분(2cm/분)
평형화액으로 3컬럼 볼륨 평형화한 후, 샘플을 부하하여, 평형화액으로써 3컬럼 볼륨(UV가 내려갈 때까지) 컬럼을 세정한다. 용출은 용출액 100%의 단계적 용출로 행했다. 용출 후 재생액으로 컬럼을 세정했다.
용출액은 1770mg의 [Nα-Boc, Lys16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)을 포함하는 150mL의 용액으로 얻어졌다. 이것에 한외여과수를 75mL 첨가함으로써 1.5배 희석하고, 증발기로 용액 중에 포함되어 있는 아세토니트릴을 제거했다.
공정 회수율: 98%
실시예 7 Kex2 프로테아제에 의한 [Lys16,19,20,24(Boc)]-hGhrelin(8-28)의 제조
실시예 6에서 얻어진 펩티드 용액을 이하에 나타내는 조건으로 조제하여 Kex2 반응을 실시했다. 즉, ODS 용출액을 한외여과수로 8mg/mL로 희석한 후, IM Tris-HCl pH 8.3를 50mM이 되도록 첨가했다. 또 0.25M CaC12를 5mM이 되도록 첨가하고, 30℃ 10분간 예비 배양 후, Kex2 프로테아제(일본 특개평 lO-229884) 용액(1x107unit/mL)을 2.5x104unit이 되도록 가하여, 교반기로 교반하면서, 30℃의 항온조에서 120분간 반응시켰다. 반응 후, 아세트산을 사용하여 pH 5.5로 조정하여 반응을 정지시켰다. HPLC, 질량분석 및 아미노산 분석으로부터, 절단 전후에서 원료인 [Nα-Boc, Lys16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhre1in(8-28)는 소실되고 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)이 출현 증가되어 있는 것을 알 수 있고, 정상으로 프로세싱되어 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 8 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)체의 정제
실시예 7에서 얻어진 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)을 포함하는 반응 후 용액을 역상 컬럼으로써 이하의 조건으로 정제했다.
방법:
사용 역상 컬럼 Vydac C4(HRl0/30) 23mL 컬럼(Vydac사) 내경 10mm x 길이 300mm
조건:
평형화, 세정액 10% 아세토니트릴, 0.1% TFA pH 3
용출액: 50% 아세토니트릴, 0.1% TFA pH 3
유속: 2mL/분(선유속 3cm/분)
3컬럼 볼륨 평형화액을 흘린 후, Kex2 반응 후 용액을 2회로 나눠 부하(20mg/mL 수지)하고, 용출액 10%으로 2컬럼 볼륨 세정한 후, 용출액 10%∼80%의 직선 농도구배를 8컬럼 볼륨으로 종료하는 프로그램으로 용출시키고, 계속해서 용출액 100%으로 2컬럼 볼륨 세정하여, 이 동안의 용출액을 6mL씩 분취했다. 분획을 HPLC 분석하여, 링커[Nα-Boc]-[RHHGSGSPSRHRR] 및 미절단체 [Nα-Boc, Lys16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)을 포함하지 않는 분획을 풀링했다.
결과:
수율: 84.4% 순도 97.5%
[Lys16,19,20,24(BoC)]hGhrelin(8-28) 농도: 5.62mg/mL
용액량: 120mL
펩티드 함량: 600mg
용출된 용액을 증발기로 탈용매를 행한 후, 동결 건조를 실시하여, OmpT 프로테아제 유도체에 의한 프로세싱에서 얻어진 1700mg의 전구체(실시예 3)로부터 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)을 600mg 얻었다(도 2).
실시예 9 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)체의 정제 회수율, 순도표
이하에, 실시예 3 내지 실시예 8에서 나타난 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)의 제조 수율 일람표를 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure 112004028641313-pct00002
실시예 10
(10-1) N 말단측 단편([Nα-Boc, Ser2,6(tBu)]hGhrelin(1-7))의 합성(방법 1)
프롤릴-2-클로로트리틸 수지(노바바이오켐사제, 1.39g, 1.0mmol)를 유리 필터가 부착된 반응 용기에 넣고, 순차 HBTU에 의한 Fmoc-아미노산의 도입과 피페리딘에 의한 탈Fmoc을 반복하고, N 말단 잔기에 Boc-Gly를 도입하여, Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-2-클로로트리틸 수지를 구축했다. 얻 어진 보호 펩티드 수지를 0.1M TBAF/DMF 용액(50mL)으로 30분간 처리했다. 펩티드 수지를 여과하여 DMF(30mL)로 여러 번 세정한 후, 이소프로필알코올, 이어서 DCM(30mL)로 세정했다. 다음에, 얻어진 탈TBDMS 펩티드 수지를 NMP(5mL)에 팽윤시키고, DMAP(374mg, 3.1mmo1) 존재 하, 옥탄산(588mg, 4.1mmol), EDC·HC1(848mg, 4.4mmol)을 가하여 16시간 반응시켰다. 수지를 여과하고, NMP, 이소프로필알코올, DCM로 순차 세정하여, 감압 건조하여, 3위치 세린 측쇄가 옥타노일화된 보호 펩티드 수지를 얻었다. 이것에, 0.5% TFA/DCM 용액 30mL를 가하고, 실온에서 30분간 교반하여, 보호 펩티드를 수지로부터 이탈시켰다. 수지를 여과 제거하고, 여과액을 농축 후, 잔사에 물을 첨가하여 침전으로 했다. 침전을 여과한 후, 추가로 헥산 중에서 교반하여 세정하고, 다시 여과했다. 이것을 철야, 감압하여 건조하여, 목적물 742mg(수율 72%)을 얻었다. HPLC에 의해 이것의 순도를 조사한 바, 94%였다.
(10-2) N 말단측 단편([Nα-Boc, Ser2,6(tBu)]hGhrelin(1-7))의 합성(방법 2)
프롤릴-2-클로로트리틸 수지(노바바이오켐사제, 1.95g, 1.0mmo1)를 유리 필터가 부착된 반응 용기에 넣고, 순차 HBTU에 의한 Fmoc-아미노산의 도입과 피페리딘에 의한 탈Fmoc을 반복하고, Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-2-클로로트리틸 수지를 구축했다. 다음에 H0OBt/DCC에 의해 Fmoc-Ser-OH를 도입하고, 계속해서 탈Fmoc와 HOOBt/DCC에 의한 축합을 반복하고, N 말단 잔기에 Boc-Gly를 도입하여, Boc-GLy-Ser(tBu)-Ser-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-2-클로로트리틸 수지를 구축했다. 얻어진 펩 티드 수지를 NMP(5mL)에 팽윤시키고, DMAP(374mg, 3.1mmo1) 존재 하에 옥탄산(579mg, 4.0mmo1), EDC·HC1(847mg, 4.4mmo1)을 가하고 16시간 반응시켰다. 수지를 여과하여, MP, 이소프로필알코올, DCM로 순차 세정하고, 감압 건조하여, 3위치 세린 측쇄가 옥타노일화된 보호 펩티드 수지를 얻었다. 이것에, 0.5% TFA/DCM 용액 30mL를 가하고, 실온에서 30분간 교반하여, 보호 펩티드를 수지로부터 이탈시켰다. 수지를 여과제거하여, 잔사를 농축 후, 잔사에 물을 첨가하여 침전시켰다. 침전을 여과한 후, 또 헥산 속에서 교반하여 세정하고, 다시 여과했다. 이것을 철야, 감압하여 건조하여, 목적물 715mg(수율 69%)을 얻었다. HPLC에 의해 이것의 순도를 조사한 바, 74%였다.
실시예 11 단편 축합과 탈보호
각각 실시예 10-1과 실시예 8에서 얻어진 [Nα-Boc, Ser2,6(tBu)]hGhrelin(1-7) 및 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)을, 미리 아미노산 분석계를 이용하여 정량한 후, 축합 반응에 제공했다. [Nα-Boc, Ser2,6(tBu)]hGhrelin(1-7), HBTU, DIPEA 각각 0.19mmol을 DMF 1mL에 용해하여, 30분간 실온에서 교반했다. 그 후, [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)을 0.16mmo1 및 DIPEA 0.48mmo1을 DNF 1.5mL에 용해하여, 교반 하에 전술한 활성화 N 말단측 단편 용액을 적하했다. 1시간 후, 반응 용매를 감압 제거하고, 잔사에 Et20를 가하여 석출시키고, 세정 후, 건조했다. 얻어진 분말에 TFA 6mL를 가하고, 30분간 실온에서 완만히 교반했다. TFA를 감압 제거하여, 잔사에 Et2O를 가하여 석출시키고, 세정, 건조를 거쳐 백색 분말상의 조펩티드 0.70g를 얻었다. 이것을 분석용 HPLC로 분석한 결과, 차트상의 목적물 순도는 80%이며,
또한 전화학 합성품과 유지 시간이 일치했다. 또 반합성품 및 전화학 합성품을 코인젝션(co-injection)한 바 크로마토그래피상 피크가 일치했다. 축합 전후의 HPLC 차트를 도 3에 나타낸다.
실시예 12 hGhrelin의 정제
실시예 11에서 얻어진 백색 분말상의 조펩티드 0.70g를 5% 아세트산으로 7mg/mL에 용해하여, 이하의 조건으로 정제를 실시했다.
방법, 조건;
사용 컬럼: Source 30RPC (HR10/30) 23mL 컬럼
(아마시암 파마시아사제 수지) 내경 10mm x 길이 30mm
평형화, 세정액: 10% 아세토니트릴, 50mM 아세트산
용출액: 60% 아세토니트릴, 50mM 아세트산
재생액: 80% 아세토니트릴
유속: 2.5mL/분(2cm/분)
평형화액으로 3컬럼 볼륨 평형화한 후, hGhrelin 용해액을 둘로 나누어, 절반량씩을 부하하여, 평형화액으로써 3컬럼 볼륨(UV가 내려갈 때까지) 컬럼을 세정한다. 용출은 용출액 O%로부터 lOO%까지의 직선 농도 구배를 6컬럼 볼륨으로 종료 하는 프로그램으로 용출시켰다. 용출액은 5mL씩 프랙션 분획하여, 적시 HPLC로 분석하여 hGhrelin을 포함하는 프랙션을 풀링했다. 풀링은 증발기로 탈용매한 후, 동결 건조를 실시했다. 결과, 순도 98%의 hGhrelin을 512mg(회수율 73%) 얻었다. 정제 hGhrelin의 HPLC에서의 분석 결과를 도 4에 나타낸다.
이하의 실시예 13에서 15까지는, 상기의 실시예 1에서 12까지에 나타낸 조건의 최적화에 관한 것이다. 따라서, 본 발명이 하기 조건에 한정되지 않음은 물론이다.
실시예 13 융합 단백질의 서열의 차이에 의한 Kex2의 절단 효율의 차이
Kex2의 절단 효율은 그 기질의 인식 서열에 따라 크게 상이하다. 그 절단 효율은 생체 내에서 Kex2 절단 서열 KR(10)>>RR(5)>>TR(1.2)>PR(1.0)[괄호안은 PR를 1로 했을 때의 절단 효율]의 순으로 절단되기 어려워진다(Proc. Natl. Acad. Sci 95 p10384-10389, 1998)고 보고되어 있다.
이하 도 5에 실시예 1에서 작성한 p117s 8-28oPR, p117 8-28oRR, 또한, p117 8-28oPR를 주형으로 하여 PCR로 작성한 플라스미드 p117 8-28oKR이 발현되는 단백질을 나타낸다.
이들 3종류의 단백질을 발현하는 플라스미드를 유지하는 대장균 W3110를 이용하여 각각 배양을 실시하고, 실시예 2 내지 6에 나타낸 방법의 약 10분의 1의 규모로 정제를 행하고, 각각 [Nα-Boc, Lys16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHPR]-hGhrelin(8-28)(이하 PR-hGhrelin(8-28)), [Nα-Boc, Lys16,19,20,24(Boc)]- [RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28)(이하 RR-hGhre1in(8-28)), [Nα-Boc, Lys16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHKR]-hGhrelin(8-28)(이하 KR-hGhrelin(8-28))의 3종류의 펩티드를 조제했다.
조제한 펩티드에 대해, 실시예 7에서 나타낸 방법을 이용하여 Kex2 프로테아제 처리를 실시했다. 반응개시 60분의 HPLC의 분석 프로파일을 도 6에 나타낸다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 절단율의 순서에서는 RR-hGhrelin(8-28)＞PR-hGhrelin(8-28)＞KR-hGhrelin(8-28)이고 RR-hGhrelin(8-28)가 가장 절단율이 높았다. 또한 KR-hGhrelin(8-28)에 관해서는 Boc기가 KR의 리신 잔기를 보호하여, 리신의 전하를 소실시키게 되기 때문에, 절단이 전혀 일어나지 않았다. 또한 PR-hGhrelin(8-28)은 절단 효율이 낮고, hGhrelin(8-28) 내에서 절단이 생겼다. 이 hGhrelin(8-28) 내에서의 분해는 hGhrelin의 아미노산 번호 15의 아르기닌과 16의 리신 사이에서 절단이 생겼다.
실시예 14 대장균의 배양에 알맞은 융합 단백질의 구축
배양에 알맞은 융합 단백질을 얻기 위해서, 실시예 13, 도 5에 나타낸 융합 단백질 이외에도 이하 도 7에 도시한 바와 같은 융합 단백질을 발현하는 플라스미드를 작성했다. 도 7에 나타내는 어느 융합 단백질과도 p117 8-28oPR를 주형으로 하여 각각 다른 프라이머로부터 PCR로 작성했다. Dl17 8-28oRR에 대하여, 단백질의 등전점의 저하를 목적으로서 변이체를 구축했다.
작성한 융합 단백질 플라스미드를 각각 대장균 W3110주로 형질전환한 대장균 을 이용하여 3L 배양조로 2L의 배양을 실시했다. 전 배양은 LB broth에서 32℃에서 14시간 진탕 배양했다. 본 배양의 배지 조성은 실시예 2에서 제시한 것과 동일하다. 탄소원으로는 글루코스를 최초 배지 중에 1% 첨가하여, 32℃에서 배양을 개시했다. 글루코스의 고갈 후, 글리세롤을 첨가하여 배양을 행했다. 또한 글루코스 고갈 시의 배양 온도를 37℃로 상승시키고, 배양 후는 가압식 균체파쇄기(맨톤 고린)로 균체를 파쇄했다. 배양의 성과에 관해서는 최종 탁도와 균체 파쇄 시의 탁도로 판단했다. 균체의 탁도 및, 균체 파쇄 전후의 탁도의 비가 높을수록 봉입체의 생산성이 높은 균이라고 판단했다. 결과를 도 8의 그래프 A, B에 나타낸다.
그래프 A, B로부터 알 수 있는 바와 같이, 최종 탁도, 균체 파쇄 후의 탁도 비율로부터, 구축한 융합 단백질 중 117 8-28oRR 융합 단백질이 가장 높은 생산성을 나타내었다. 실시예 13, 14의 결과로부터 실시예 2에서는 상기 단백질을 발현하는 플라스미드 p117 8-28oRR이 배양에도 적합하다고 생각되었다.
실시예 15 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)의 안정성
실시예 6, 7, 8에 있어서, [Nα-B0C, Lys16,19,20,24(Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-hGhrelin(8-28) 및 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhreIin(8-28)에 있어서 1∼10% 정도 Boc기가 탈리하는 현상이 인지되었다. [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)은 부가한 Boc기가 1개소에서도 탈리하면, 그 후의 축합 공정에서 대폭적인 축합율 저하로 이어지기 때문에, Boc기의 탈리를 방지할 목적에서 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)의 안정성을 조사했다.
분해에 영향을 미치는 파라미터로는 보존 중의 pH와 보존 온도가 고려되었다. 그래서 다음과 같은 조건에서의 안정성을 HPLC에 의해 분석하여 평가했다.
방법: 새로 정제한 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)을 30mM 아세트산나트륨 용액에 용해하여, pH 2, 3, 4는 TFA를 사용하고, pH 6, 7, 8는 5N Na0H를 사용하여 pH를 조정하고, 또한, 4℃, 20℃, 37℃, 42℃의 항온조로 일주일 방치했다. 방치 개시 후, 0시간, 2시간, 6시간, 9시간, 24시간, 48시간, 96시간, 168시간에 샘플링을 행하고, HPLC에서 분석을 실시했다. 해석 방법으로는 HPLC에서의 분석 결과의 총피크 면적에 대한 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)의 피크 면적의 비율(%)을 경시적으로 평가함으로써 행했다.
결과: 이하, 도 9 및 도 10에 보존 온도마다 종합한 그래프를 4종류 나타낸다. pH가 낮을수록(pH 3 이하), 온도가 높을수록, 분해물이 증가하는 것을 알았다. 또한 pH 4 이상이면, 42℃에서도 안정한 것을 알았다. 따라서 pH를 컨트롤하는 것이 상기 분해물 생성의 억제에 중요한 것으로 밝혀졌다.
실시예 l6 hGhrelin(1-28)의 제조(방법 2)
(1) hGhrelin(8-28) 유도체 발현 벡터 p117-8-28ok의 구축
실시예 1과 동일한 방법으로, 플라스미드 pl17-8-28ok를 얻었다. 실시예 1에서 작성한 플라스미드 p117 8-28oPR와 플라스미드 p117-8-28ok의 차이는, 전자의 링커 서열이 EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR(서열 번호 26)임에 대하여, 후자의 링커 서열은 RRHHGSGSPSRHPR(서열 번호 35)인 점뿐이다.
(2) 대장균에서의 재조합 hGhrelin(8-28) 융합 단백질의 발현
hGhre1in(8-28) 융합 단백질 발현 플라스미드 p 117-8-28ok를 대장균 W3110주로 형질전환하여, 형질전환주를 얻었다. 이 주를 글루코스 및 글리세롤을 탄소원으로 하는 20L의 배지로 배양을 행하고, 최종0D660 값이 54인 배양액을 얻었다.
(3) hGhrelin(8-28) 융합 단백질의 내재성 0mpT 프로테아제에 의한 프로세싱
상기 (2)에서 얻어진 배양액으로부터 균체(약 680g)을 TE(10mM Tris-HC1, 1mM EDTA pH 8.0) 버퍼 20L에 현탁 후, 고압 호모지나아저를 이용하여 균체의 파쇄 처리를 2회 행했다. 그 후, 원심분리로 봉입체를 회수하여, 탈이온수로 다시 현탁하고, 원심분리함으로써 봉입체를 세정했다. 다음에 원심분리에 의해 얻어진 봉입체 펠릿(습윤 중량 약 170g)을 소량의 탈이온수로 현탁하여, OD660 값이 826인 봉입체 농축액 550mL를 얻었다. 550mL의 봉입체 농축액에서 50mL를 채위 후, OD660의 값이 50.0이 되도록 탈이온수로 희석하고, Tris-HC1(pH 8.2), EDTA(pH 8.0)를 각각 최종 농도 50mM, 1mM이 되도록 가하고, 요소(최종 농도 4.0M)에 의해 봉입체를 용해시켰다. 요소에 의해 봉입체를 용해하는 것으로, 내재성의 OmpT 프로테아제에 의해 융합 단백질의 링커 서열 RRHHGSGSPSRHPR(서열 번호 35)의 Arg-Arg 사이를 절단시켰다. 즉, 반응 용액을 30℃에서 5분간 보온 후, 30℃에서 15분 0mpT 프로테아제 처리를 행했다. 그 후 3% AcOH를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 본 처리에 의해, RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)을 1.3g 얻었다. ESI-MS 4019(이론치; 4018) hGhrelin(8-28) 융합 단백질의 내재성 0mDT 프로테아제에 의한 프로세싱 공정의 고속액체 크로마토그래피에 의한 해석의 결과, RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)이 유리되어 있는 것이 나타났다.
(4) RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)의 정제(양이온 교환에 의한 정제)
상기 (3)에서 얻어진 0mpT 프로테아제 반응액(900mL)을, 평형화액(1.5M Urea, 20mM NaC1, 10mM Tris-HC1 pH 8.3)로써 평형화시킨 양이온교환 컬럼 SP-Toyopear1 550-c(bed volume 55mL, 16mm ID x 280mm TOSOH사제)에 4회로 나눠 부하했다. 각 회, 평형화액으로 충분히 컬럼을 세정 후, 평형화액 75%, 용출액(1.5M Urea, 1.5 MNaC1, 10mM Tris-HC1 pH 8.3) 25%로부터 용출액 100%의 농도 구배를 1.5컬럼 볼륨에서 완료하는 프로그램으로 용출을 행했다. 5mL마다 샘플링을 행하고, 각 분획을 고속 액체 크로마토그래피로 분석하여, 대장균 β-갈락토시다아제 유도체가 포함되지 않은 피크를 분취했다. 4회분의 합계 회수량은 약 950mg였다.
상기 정제 용출액(660mL)을 2 등분하고, 2% 아세토니트릴, 0.1% TFA로 평형화한 YMC-ODS AM(입경20㎛, YMC사제) 21.5mm ID x 30Omm 컬럼에 2회 부하했다. 평형화액으로 충분히 세척한 후, 용출액[50% 아세토니트릴, 0.095% TFA]로 용출을 행했다. 용출 피크를 분취 후, 용출액 중에 포함되어 있는 아세토니트릴은 로터리 증발기로 제거하여, RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)을 720mg 포함하는 용액 220mL를 얻었다. (3), (4)에서 사용한 고속 액체 크로마토그래피의 조건을 이하에 나타낸다.
컬럼; YMC ODS AP-302, 검출기; Hitachi 고속 액체 크로마토그래피 시스템(D7000), 유속; lmL/분, 용출; 버퍼 A[1.0% 아세토니트릴, 0.1% TFA] 100%부터 버퍼 B[50.0% 아세토니트릴, O.I% TFA] 100%의 20분간 직선 농도 구배.
(5) RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)의 t-부톡시카보닐(Boc)화
상기 (4)에서 얻어진 시료 220mL(RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)을 720mg 포함)을 유리 삼각플라스크에 옮겨, 등량의 아세토니트릴(220mL)을 가했다. 이것에 1M의 2탄산디-t-부틸을 RHHGSGSPSRHPR-hGhre1in(8-28) 내에 존재하는 α아미노기와 Lys ε아미노기의 수(합계 5개소)의 5배 몰량에 대응하는 4.4mL(최종 농도 10mM, 25 당량) 가했다. 또 트리에틸아민으로 pH 9로 조정하고, 교반기로 교반하면서 실온에서 60분 반응시켰다. 반응의 정지는 아세트산을 최종 농도 0.5%가 되도록 첨가하여, pH를 중성 부근으로 한 후, 빠르게 로터리 증발기에 의해 아세토니트릴을 제거하여, Boc-RHHGSGSPSRHPR-[Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)을 530mg 포함하는 용액, 30OmL를 얻었다. ESI-MS; 4519(이론치; 4518).
Boc화 전후의 RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)의 용출 프로파일, 및 질량 분광 측정 결과로부터, Boc-RHHGSGSPSRHPR-[Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)의 생성을 확인했다. 본 반응의 모니터에는 이하의 크로마토그래피 시스템을 사용했다. 컬럼; YMC-C8, 검출기; Hitachi 고속 액체 크로마토그래피 시스템(D7000), 유속; lmL/min, 용출; 버퍼 A[1.0% 아세토니트릴, 0.1% TFA] 100%로부터 버퍼 B[60.0% 아세토니트릴, 0.095% TFA] 100%의 20분간의 직선 농도 구배.
(6) Kex2 프로테아제에 의한[Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)의 제조
상기 (5)에서 얻어진 Boc-RHHGSGSPSRllPR-[Lys16,19,20,24(Boc)]hGhre1in(8-28)을 역상 컬럼으로 정제했다. 2% 아세토니트릴, 0.1% TFA, 10mm 아세트산나트륨, pH 4.5으로 평형화한 YMC-ODS AM(입경 20㎛, TOSOH사제) 21.5mm ID x 300mm 컬럼에 상기 Boc 유도체(약 500mg)을 부하했다. 평형화액으로 충분히 세척한 후, 용출액[70% 아세토니트릴, 0.095% TFA, 10mM 아세트산나트륨, pH 4.5]으로 용출했다. Boc-RHHGSGSPSRHPR-[Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)(420mg)를 포함하는 용출피크를 분취 후, 아세토니트릴을 증발기로 제거했다. 본 용액에 250mM 염화칼슘 용액, 1M Tris-HCl pH 8.2을 각각 최종 농도 5mM, 50mM이 되도록 첨가했다. 30℃, 5분간 보온 후, Kex2 프로테아제(일본 특개평10-229884) 용액(1x107unit/mL)를 3x104unit/mL이 되도록 첨가하고, 30℃, 45분간 반응했다.
본 공정의 고속 액체 크로마토그래피에 의한 해석의 결과, 링커 서열 RHHGSGSPSRHPR과 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)이 절단되어 있는 것이 나타났다.
(7) [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)체의 정제
상기 (6)에서 얻어진 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)(320mg)를 포함하는 반응 후 용액(300mL)을 아세트산으로 pH 3.5으로 조정 후, 10% 아세토니트릴, 0.095% TFA로 평형화한 역상 크로마토그래피 컬럼 0DS-80Ts(21.5mm ID x 30Omm 컬 럼(108mL) 입경20㎛, TOSOH사제)에 부하했다. 평형화액으로 2컬럼 볼륨 세정 후, 버퍼 A[10% 아세토니트릴, 0.095% TFA] 70%, 버퍼 B[65% 아세토니트릴, 0.1% TFA] 30%로부터 버퍼 B l00%의 농도 구배를 5컬럼 볼륨으로써 완료하는 프로그램을 행하여, [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)체를 용출시켰다. 프랙션(5mL씩)을 분취하여, 고속 액체 크로마토그래피(조건은 (6)과 동일)로 분석했다. [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)의 용출 획분을 모은다. 농축 후, 동결 건조하여 136mg의 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)체를 얻었다. OmpT 프로테아제 유도체에 의한 프로세싱에서 얻어진 1300mg의 전구체(상기 (3))로부터 136mg의 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)체 최종품을 얻었다.
(8-1) N 말단측 단편([Nα-Boc, Ser2,6(tBu)]Ghrelin(1-7)의 합성)(방법 1)
프롤릴-2-클로로트리틸 수지(노바바이오켐사제, 548mg, 0.25mmo1) 상에, 펩티드 자동 합성기를 이용하여, 순차 HBTU에 의한 Fmoc-아미노산의 도입과 피페리딘에 의한 탈Fmoc을 반복하고, N 말단 잔기에 Boc-Gly를 도입하여, Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-2-클로로트리틸 수지를 구축했다. 얻어진 보호 펩티드 수지(757mg)을 0.lM TBAF/DMF 용액(5mL)으로 1시간 처리했다. 펩티드 수지를 여과하여, DMF(1OmL)로 수회 세정한 후, 이소프로필알코올, 이어서 염화메틸렌(10mL)으로 세정했다. 다음에, 얻어진 탈TBDMS 펩티드 수지를 DMF(1OmL)에 팽윤시키고, DMAP(31mg, 0.25mmo1) 존재 하, 옥탄산(144.2mg, 1.0mmol), EDC·HC1(21lmg, 1.1mmol)을 가하고 16시간 반응시켰다. 수지를 여과하여, DMF, 이소프로필알코올, 염화메틸렌으로 순차 세정하고, 감압 건조하여, 3위치 세린 측쇄가 옥타노일화된 보호 펩티드 수지를 얻었다. 이것에 아세트산 2mL/TFE 2mL/염화메틸렌 6mL의 혼합 용액을 가하고, 실온에서 1시간 교반하여 보호 펩티드를 수지로부터 이탈시켰다. 수지를 여과 제거하여, 여과액을 농축 후, 잔사에 에테르를 가하고 침전시켰다. 침전을 여과, 건조하여, 조펩티드 248mg(수율 96%)을 얻었다. 본 품을 아세트산 수용액 및 아세토니트릴의 혼액 약 mL에 용해하여, YMC-Pack ODS-A(20mm x 250mm)에 첨가하고, 0.1% 트리플루오로아세트산 중, 아세토니트릴 40%에서 80%까지의 60분간 직선 구배(유속: 1O mL/분)로 용출시켰다. 목적획분을 분취 후, 동결 건조하여, 210mg의 목적물을 얻었다.
(8-2) N 말단측 단편([Nα-Boc, Ser2,6(tBu)]Ghrelin(1-7)의 합성)(방법 2)
프롤릴-2-클로로트리틸 수지(노바비오켐사제, 466mg, 0.25mm01) 상에, 펩티드 자동 합성기를 이용하여, 차례로 HBTU에 의한 Fmoc-아미노산의 도입과 피페리딘에 의한 탈Fmoc을 반복하고, N 말단 잔기에 Boc-Gly를 도입하여, Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(Trt)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-2-클로로트리틸 수지를 구축했다. 이 수지를 1% TFA, 5% TIPS/디클로로메탄으로 30분간 처리함으로써, Trt기의 제거 및 수지로부터의 절단을 동시에 행했다. 수지를 여과 제거한 후, 디클로로메탄을 감압제거하여 농축하고, 이것에 Et2O를 가하여 석출시켜 건조한 바, 백색 침전으로서 Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-OH를 165mg 얻었다. 다음에, 브롬화 페나실(Phenacyl Bromide, 40mg, 1.1 당량), 트리에틸아민(20mg, 1.1 당량)을 가하고, DMF 약 3mL 중에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 반응 용액을 약 5배량의 아세트산에틸 중에 넣어, 물과 포화 식염수로 세정하고, 황산나트륨을 가하여 건조시키고, 이것을 여과 제거한 후 농축하여, Et2O에서 석출시켜 건조한 바, 백색 침전으로서 Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-OPac를 얻었다. 다음에, 옥탄산(18.2mg, 1.1 당량), EDC·HC1(26.4mg, 1.2 당량), DMAP(1.4mg, 0.1 당량)을 가하고, DMF 약 2mL 중에서 철야 반응시켰다. 반응 용액을 약 5배량의 아세트산에틸 중에 넣어, 물과 포화 식염수로 세정하고, 황산나트륨을 가하여 건조시키고, 이것을 여과 제거한 후 농축, Et2O에서 석출시켜 건조하여, 백색 침전으로서 Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(옥타노일)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-OPac를 144mg 얻었다. 다음에, 아세트산 1.5mL, 아연분말(Zinc Powder, 163mg, 20 당량)을 가하고 1시간 반응시킨 후, 여과하고 냉수를 가하여 석출시키고, Et2O로 세정하여 건조했다. 백색 침전으로서 Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(옥타노일)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-0H를 65mg 얻었다. 본 품을 아세트산 수용액 및 아세토니트릴의 혼액 약 2mL에 용해하여, YMC-Pack ODS-A(20mm x 250mm)에 첨가하고, 0.1% 트리플루오로아세트산 중, 아세토니트릴 40%에서 80%까지의 60분간 직선 구배(유속: 10mL/분)으로 용출시켰다. 목적 획분을 분취 후, 동결 건조하여 목적물 50mg을 얻었다.
(9) 단편 축합과 탈보호
각각 상기 (8-1)과 상기 (7)에서 얻어진 [Nα-Boc, Ser(tBu)2,6]-Ghre1in(1-7) 및 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhre1in(8-28)을, 미리 아미노산 분석계를 이용하여 정량한 후, 축합 반응에 제공했다. [Nα-Boc, Ser(tBu)2,6]-Ghrelin(1-7)를 19.3㎛o1, HBTU 20.3㎛o1 및 DIPEA 20.3㎛o1을 DMF5OO ㎕에 용해하여, 1시간 실온에서 교반했다. 그 후, [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)을 18.4㎛o1 및 DIPEA 55.2㎛o1을 DMF lmL에 용해하고 교반 하에 전술한 활성화 N 말딘측 단편 용액을 적하했다. 3시간 후, 반응 용매를 감압 제거하여, 잔사에 Et2O를 가하여 석출시키고, 세정 후 건조했다. 얻어진 분말에 TFA 3mL를 가하고, 30분간 실온에서 완만히 교반했다. TFA를 감압 제거하여, 잔사에 Et2O를 가하여 석출시키고, 세정, 건조를 거쳐 백색 분말상의 조펩티드 77mg를 얻었다. 이것을 분석용 PHLC로 분석한 결과, 차트상의 목적물 순도는 83%이며, 또한 화학 합성품과 유지 시간이 일치했다. 또 반합성품 및 전합성품을 코인젝션한 바 크로마토그래피상 피크가 일치했다.
(10) hGhrelin(1-28)체의 정제
상기 (9)에서 얻어진 백색 분말상의 조 hGhrelin 67mg을 1% 아세트산으로 1mg/mL에 용해하고, 0.1M 아세트산으로 평형화한 역상 크로마토그래피 컬럼 TSK-ODS-80Ts 108mL(ID 21.5mm x 300mm)에 부하했다. 평형화액으로 2컬럼 볼륨 세정 후, 버퍼 A[0.1M 아세트산] 100%로부터 버퍼 B[40% 아세토니트릴, 0.1M 아세트산] 100%의 농도 구배를 5컬럼 볼륨으로써 완료하는 프로그램을 행하고, hGhrelin(1-28)체를 용출시켰다. 고순도의 획분을 모아 동결 건조하고 hGhrelin(1-28) 34.4mg 를 얻었다.
ESI-MS 3371(이론치 3370.86), 6N 염산 가수분해 후의 아미노산 조성비 Ala; 1.01 (1), Arg; 2.97 (3), Glx; 5.95 (6), Gly: 1.02 (1), His; 1.00 (1), Leu; 2 (2), LVs; 4.01 (4), Phe: 1.00 (1), Pro; 4.01 (4), Ser; 3.60 (4), Val; 1.00 (1)(괄호내는 이론치), Ca 이동화(mobilization) 활성 1.3nM(기준 1.5nM)
실시예 17 Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-OH의 탈TBDMS 조건과 옥타노일화 조건의 최적화
실시예 16(8-1)의 방법에 따라서, 3위치 세린 TBDMS기의 제거 반응 및 옥타노일화 반응의 최적 조건에 대해 검토했다. 프롤릴-2-클로로트리틸 수지 상에, 펩티드 자동 합성기(어플라이드 바이오 시스템 저팬(株)제, 433A)를 이용하여, 차례로 HBTU에 의한 Fmoc-아미노산의 도입과 피페리딘에 의한 탈Fmoc을 반복하고, N 말단 잔기는 Boc-Gly를 도입함으로써, Boc-Gly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)-Phe-Leu-Ser(tBu)-Pro-2 클로로트리틸 수지를 구축했다. 다음에, 수지를 0.05mmol(약 150mg)씩으로 나눠, 표 3 및 표 4에 나타내는 조건으로 옥타노일화를 행했다. 수지의 세정, 수지로부터의 펩티드 절단 등의 조건은 실시예 16(8-1)과 같이 행했다.
그 결과, TBDMS기의 제거 반응은 0.lM TBAF 용액을 이용하여 30분 내지 1시간 반응시키는 것이 바람직하고, 또한 옥타노일화 반응은 옥탄산 4 당량, EDC 4.4 당량, DMAP 1 당량을 사용하여 8∼16시간 반응시키는 것이 바람직한 것으로 밝혀졌다.
[표 3]
Figure 112004028641313-pct00003
a; TBDMS기의 제거율은, TBAF 처리한 펩티드 수지를 옥타노일화한 후, 탈보호하여 얻어지는 옥타노일체와 TBDMS 미제거를 나타내는 데스옥타노일체의 비로 구했다. 옥타노일화는, 옥탄산 4 당량, EDC 4.4 당량, DMAP 1 당량을 사용하여, 24시간 반응.
b; 프롤릴-2-클로로트리틸 수지의 치환율을 기준으로 산출.
c; 목적물 순도 및 비율은, 분석용 HPLC에 의해 산출.
d; N.D.검출되지 않음.
[표 4]
Figure 112004028641313-pct00004
a; 모든 샘플은 0.1M TBAF로 1시간 처리하고, TBDMS기를 제거했다.
b; 프롤릴-2-클로로트리틸 수지의 치환율을 기준으로 산출.
c; 목적물 순도 및 비율은, 분석용 HPLC에 의해 산출.
d; N.D.검출되지 않음.
실시예 18 단편 축합 조건의 검토
[Nα-Boc, Ser(tBu)2,6]hGhrelin(1-7)과 [Lys16,19,20,24(Boc)]hGhrelin(8-28)을 이용하여, 여러 가지 축합 시약의 반응 효율을 검토한 바, HBTU가 가장 좋은 결과를 제공했지만, EDC/HOBt, EDC/HOSu, DPPA에서도 반응이 진행되는 것이 밝혀졌다.
[표 5]
Figure 112004028641313-pct00005
본 발명의 제조 방법에 의해, 매우 고품질의 수식 펩티드 또는 단백질을 높은 수율로 얻을 수 있다.
<110> Daiichi Suntory Pharma Co.,Ltd. <110> Kenji KANGAWA <120> A method for producing a modified peptide <130> D05F1044 <150> JP 2002-109761 <151> 2002-04-11 <160> 39 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Amino acid sequence for human endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 1 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 2 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Amino acid sequence for human endogenous peptides (27 amino acids)of growth hormone secretagogue <400> 2 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Arg Lys Glu 1 5 10 15 Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <223> Amino acid sequence for rat endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 3 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <223> Amino acid sequence for rat endogenous peptides (27 amino acids) of growth hormone secretagogue <400> 4 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys Glu 1 5 10 15 Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 5 <211> 28 <212> PRT <213> Mus musculus <223> Amino acid sequence for mouse endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 5 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 6 <211> 28 <212> PRT <213> Sus scrofa (pig) <223> Amino acid sequence for porcine endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 6 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg 20 25 <210> 7 <211> 27 <212> PRT <213> Bos taurus <223> Amino acid sequence for bovine endogenous peptides (27 amino acids) of growth hormone secretagogue <400> 7 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu 1 5 10 15 Ala Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg 20 25 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Ovis aries <223> Amino acid sequence for ovine endogenous peptides (27 amino acids) of growth hormone secretagogue <400> 8 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu 1 5 10 15 Pro Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg 20 25 <210> 9 <211> 28 <212> PRT <213> Canis familiaris <223> Amino acid sequence for dog endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 9 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Anguilla japonica <220> <221> AMIDATION <222> 21 <223> Amino acid sequence for eel endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 10 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Arg Pro Gln Gly Lys Asp Lys 1 5 10 15 Lys Pro Pro Arg Val 20 <210> 11 <211> 23 <212> PRT <213> Oncorhynchus mykiss <220> <221> AMIDATION <222> 23 <223> Amino acid sequence for rainbow trout endogenous peptides (23 amino acids) of growth hormone secretagogue <400> 11 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Val Arg Gln Gly 1 5 10 15 Lys Gly Lys Pro Pro Arg Val 20 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Oncorhynchus mykiss <220> <221> AMIDATION <222> 20 <223> Amino acid sequence for rainbow trout endogenous peptides (20 amino acids) of growth hormone secretagogue <400> 12 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Gly Lys Gly Lys 1 5 10 15 Pro Pro Arg Val 20 <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Gallus domesticus <223> Amino acid sequence for chicken endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 13 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys 1 5 10 15 Gly Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg 20 <210> 14 <211> 24 <212> PRT <213> Gallus domesticus <223> Amino acid sequence for chicken endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 14 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys 1 5 10 15 Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg 20 <210> 15 <211> 26 <212> PRT <213> Gallus domesticus <223> Amino acid sequence for chicken endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 15 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys 1 5 10 15 Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg Leu His 20 25 <210> 16 <211> 27 <212> PRT <213> Rana cafesbeiana <223> Amino acid sequence for frog endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 16 Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg 1 5 10 15 Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met 20 25 <210> 17 <211> 28 <212> PRT <213> Rana cafesbeiana <223> Amino acid sequence for frog endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 17 Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg 1 5 10 15 Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met Asn 20 25 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Tilapia nilotica <220> <221> AMIDATION <222> 20 <223> Amino acid sequence for tilapia endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 18 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Asn Lys Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Arg Ile 20 <210> 19 <211> 22 <212> PRT <213> Silurus asotus <220> <221> AMIDATION <222> 22 <223> Amino acid sequence for catfish endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 19 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gln Asn Arg Gly Asp 1 5 10 15 Arg Lys Pro Pro Arg Val 20 <210> 20 <211> 23 <212> PRT <213> Silurus asotus <223> Amino acid sequence for catfish endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 20 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gln Asn Arg Gly Asp 1 5 10 15 Arg Lys Pro Pro Arg Val Gly 20 <210> 21 <211> 28 <212> PRT <213> Equus caballus <223> Amino acid sequence for equine endogenous peptides of growth hormone secretagogue <400> 21 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His His Lys Val Gln His Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Lys Pro Arg 20 25 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence adjacent to a site cleaved by enterokinase <400> 22 Asp Asp Asp Lys 1 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence adjacent to a site cleaved by blood coagulation Factor Xa <400> 23 Ile Glu Gly Arg 1 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Amino acid sequence containing a site cleaved by renin <400> 24 Pro Phe His Leu Leu Val Tyr 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> <400> 25 Val Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 26 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> linker sequence in the fusion protein p117 8-28oPR <400> 26 Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Gly Tyr Asp 1 5 10 15 Ala Asp Val Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly Ser Gly Ser Pro Ser 20 25 30 Arg His Pro Arg 35 <210> 27 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> linker sequence in the fusion protein p117 8-28oRR <400> 27 Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Gly Tyr Asp 　1 5 10 15 Ala Asp Val Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly Ser Gly Ser Pro Ser 20 25 30 Arg His Arg Arg 35 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer ORI-RR <400> 28 ggttccggat ccccttctcg acatcgccgg gaacac 36 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer SAL*R <400> 29 ataagtcgac ttatcgtggc tgcag 25 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> <400> 30 Arg His His Gly Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Arg Arg 　1 5 10 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> <400> 31 Arg His His Gly Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Pro Arg 　1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> <400> 32 Arg His His Gly Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Lys Arg 　1 5 10 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> <400> 33 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro 　1 5 <210> 34 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> <400> 34 Phe Leu Ser Pro 　1 <210> 35 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> linker sequence <400> 35 Arg Arg His His Gly Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Pro Arg 1 5 10 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> h8-28f1 <400> 36 tccccgcggg aacaccagcg cgtccag 27 <210> 37 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> h8-28r1 <400> 37 acgctgctgg acgcgctggt gttcccgcgg gga 33 <210> 38 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GR2f <400> 38 cagcgtaagg aatccaagaa gccaccagct aaactgcagc cacgatgag 49 <210> 39 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GR2r <400> 39 tcgactcatc gtggctgcag tttagctggc ttcttggatt cctt 44

Claims (23)

  1. 아미노산, 비아미노산, 또는 이들의 조합으로 이루어지는 원하는 서열을 가지는 펩티드 단편으로서, 상기 펩티드 단편은, (i) 그 중 적어도 하나의 아미노산 또는 비아미노산이 식 1; -A(R)-(식 중에서, A는 아미노산 또는 비아미노산을 나타내고, R은 A의 측쇄에 결합되어 있는 수식을 위해 도입된 치환기를 나타냄)로 나타내어지는 수식(修飾)을 받은 아미노산 또는 비아미노산이며, 또한, (ii) 상기 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄에, 수산기(水酸基), 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 메르캅토기 및 카르복실기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 반응성 작용기로서, 펩티드 단편(斷片) 제작에 있어서 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가지는 반응성 작용기인 상기 반응성 작용기가 보호기에 의해 보호되어 있는 것인 상기 펩티드 단편을 수지 상에서 제작하고, 이어서, 카르복시산, 플루오르화 알코올, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 용액 중에서 상기 펩티드 단편에서의 보호기를 탈리시키지 않고 상기 펩티드 단편을 상기 수지로부터 이탈시키는 것을 특징으로 하는, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호되어 있는 펩티드 단편의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 아미노산, 비아미노산, 또는 이들의 조합으로 이루어지는 원하는 서열을 가지며, 또한 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄에, 수산기, 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 메르캅토기 및 카르복실기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 반응성 작용기로서, 펩티드 단편 제작에 있어서 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가지는 반응성 작용기인 상기 반응성 작용기가 보호기에 의해 보호되어 있는 펩티드 단편을 수지 상에서 제작하고,
    (b) 상기 펩티드 단편을 상기 수지 상으로부터 이탈시키지 않고, 치환기 R에 의해 수식을 받는 아미노산 또는 비아미노산 A의 측쇄에서의 반응성 작용기에 보호기가 도입되어 있는 경우에는 상기 보호기를 탈보호하고,
    (c) 상기 탈보호된 측쇄를 치환기 R로 수식하고,
    (d) 카르본산, 불소 알콜, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 용액 중에서 상기 펩티드 단편에서의 보호기를 탈리시키지 않고 상기 펩티드 단편을 상기 수지로부터 이탈시키는 것
    을 특징으로 하는, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호되어 있는 펩티드 단편의 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    치환기 R에 의해 수식을 받는 상기 아미노산 또는 비아미노산 A의 측쇄에서의 반응성 작용기의 보호기가 실릴계 보호기이며, 상기 보호기의 탈보호에 플루오르화 4급 암모늄을 이용하는 것을 특징으로 하는, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호되어 있는 펩티드 단편의 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 실릴계 보호기가, t-부틸디메틸실릴(TBDMS), t-부틸디페닐실릴(TBDPS), 트리이소프로필실릴(TIPS), 트리이소부틸실릴(TIBS), t-헥실디메틸실릴(ThxDMS) 또는 트리페닐실릴(TPS)이며, 플루오르화 4급 암모늄이 테트라부틸암모늄플루오라이드(TBAF), 테트라에틸암모늄플루오라이드(TEF) 또는 암모늄플루오라이드인 것을 특징으로 하는, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호되어 있는 펩티드 단편의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 A가 세린, 트레오닌, 시스테인, 호모시스테인, 리신, 오르니틴, 글루탐산, 2-아미노아디프산, 디아미노아세트산, 2-아미노말론산, 아스파라긴산, 티로신 또는 아스파라긴이며, 상기 R이 에스테르 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 디설파이드 결합, 아미드 결합, O-글루코사이드 결합 또는 N-글루코사이드 결합을 통하여 상기 A의 측쇄의 반응성 작용기에 결합하고 있는 것을 특징으로 하는, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호되어 있는 펩티드 단편의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 A가 세린 또는 트레오닌이며, 상기 R이 에스테르 결합을 통하여 상기 A의 측쇄의 수산기에 결합하고 있는 것을 특징으로 하는, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호되어 있는 펩티드 단편의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 펩티드 단편이 그렐린(Ghrelin) 또는 수식을 받은 아미노산을 포함하는 그렐린의 펩티드 단편인 것을 특징으로 하는, 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호되어 있는 펩티드 단편의 제조 방법.
  8. (a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 하나 이상 포함하는 보호되어 있는 펩티드 단편을 제조하고, 상기 (a)의 펩티드 단편과는 별개로, (b) 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않고, 또한, 아미노산 또는 비아미노산의 측쇄에, 수산기, 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 메르캅토기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 반응성 작용기로서, 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가지는 반응성 작용기인 상기 반응성 작용기가 보호되어 있는 펩티드 단편을 제조하고, 상기 (a) 및 (b)로 제조된 펩티드 단편을 축합하는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 펩티드 단편의 축합이, 축합제를 이용하여 행해지는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 축합제가, 2-(1-하이드로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU), 2-(1-하이드로벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트(TBTU), 디페닐포스포릴아지드(DPPA), 디페닐포스포로시아니데이트(DEPC), 디이소프로필카르보디이미드(DIPC), 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)인 것을 특징으로 하는 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 축합제가, 디이소프로필카르보디이미드(DIPC), 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)이며, 상기 축합제를 이용하는 펩티드 단편 (a)와 (b)의 축합이, 1-하이드록시벤조트리아졸 (H0Bt), 1-하이드록시숙신이미드(H0Su) 또는 3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥소-벤조트리아진(H00Bt)의 존재 하에서 행해지는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 보호되어 있는 펩티드 단편을, 효소법, 유전자 재조합법, 또는 이들의 조합에 의해 제조하는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 보호되어 있는 펩티드 단편을,
    공정 (1); 상기 펩티드 단편의 아미노산 서열을 가지는 펩티드(이하, 본 항에 있어서 목적 펩티드라 함)를 코딩하는 염기 서열, 또는 상기 목적 펩티드에 보호 펩티드가 부가되어 있는 융합 단백질을 코딩하는 염기 서열 중 어느 하나를 가지는 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 상기 목적 펩티드 또는 상기 융합 단백질을 채취하는 공정;
    공정 (2); 공정 (1)에서 상기 융합 단백질을 채취한 경우, 얻어진 융합 단백질로부터 보호 펩티드와 목적 펩티드를 절단 분리하는 공정; 및
    공정 (3); 공정 (1) 또는 (2)에서 얻어진 상기 목적 펩티드의 측쇄에서의 수산기, 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 메르캅토기 및 카르복시기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의, 바람직하지 않은 부반응을 야기할 가능성을 가진 반응성 작용기를 보호기에 의해 보호하는 공정;
    을 포함하는 방법에 의해 제조하는 것을 특징으로 하는 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제13항에 있어서,
    상기 펩티드 단편이, 그렐린 중의 수식을 받은 아미노산 또는 비아미노기를 포함하지 않는 펩티드 단편인 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법.
  17. 제13항 또는 제16항에 있어서,
    수식을 받은 아미노산 또는 비아미노산을 포함하지 않는 보호되어 있는 상기 펩티드 단편을, pH 4∼8의 용액 중에서 정제 및 보존하는 공정을 포함하는, 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법.
  18. 제13항 또는 제16항에 있어서,
    상기 보호기가 Boc 기인 수식 펩티드 또는 단백질의 제조 방법.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7357947B2 (en) * 2001-09-10 2008-04-15 Biomet, Inc. Bone graft material incorporating demineralized bone matrix and lipids
IL162796A0 (en) * 2002-05-21 2005-11-20 Kenji Kangawa Medicinal compositions containing ghrelin
CN1688696A (zh) * 2002-09-18 2005-10-26 蒙特利尔大学医疗中心 Ghrh类似物
USRE46830E1 (en) 2004-10-19 2018-05-08 Polypeptide Laboratories Holding (Ppl) Ab Method for solid phase peptide synthesis
US20070042501A1 (en) * 2005-08-20 2007-02-22 Institute Of Nuclear Energy Research A novel technology for the purity assay of TRODAT-1 raw material
US7763707B2 (en) * 2006-03-13 2010-07-27 Liat Mintz Use of ghrelin splice variant for treating cachexia and/or anorexia and/or anorexia-cachexia and/or malnutrition and/or lipodystrophy and/or muscle wasting and/or appetite-stimulation
KR20200108494A (ko) 2012-10-24 2020-09-18 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 근위축성 측삭 경화증 치료제
SG11201506885UA (en) 2013-03-21 2015-09-29 Sanofi Aventis Deutschland Synthesis of cyclic imide containing peptide products
HUE034308T2 (en) 2013-03-21 2018-02-28 Sanofi Aventis Deutschland Preparation of hydantoin-containing peptide products
RU2694051C2 (ru) * 2014-03-04 2019-07-09 Мотус Терапьютикс, Инк. СПОСОБ ЖИДКОФАЗНОГО СИНТЕЗА H-Inp-(D)Bal-(D)Trp-Phe-Apc-NH2 И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫХ СОЛЕЙ
JP6554180B6 (ja) * 2015-04-14 2019-09-11 成都先導薬物開発股▲フン▼有限公司 Ｄｎａコード化化合物ライブラリーの固相合成方法
EP3986919A1 (en) * 2019-06-18 2022-04-27 Fresenius Kabi iPSUM S.r.l. Process for the manufacture of glucagon

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1076097A1 (en) * 1999-03-04 2001-02-14 Suntory Limited METHOD FOR CONTROLLING CLEAVAGE BY OmpT PROTEASE
EP1197496A1 (en) * 1999-07-23 2002-04-17 Kenji Kangawa Novel peptides

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL118473A0 (en) 1995-06-02 1996-09-12 Suntory Ltd Staphylococcus aureus V8 protease genes coding therefor and a method for the production thereof
CA2198968C (en) 1996-03-04 2010-02-09 Toyofumi Masuda Process for production of secretory kex2 derivatives
CA2198966C (en) 1996-03-04 2011-06-21 Yuji Suzuki Method for cleaving chimeric protein using processing enzyme
EP0978565B1 (en) 1998-01-30 2007-10-10 Asubio Pharma Co., Ltd. Process for producing peptide with the use of accessory peptide
ES2154590B1 (es) * 1999-05-20 2001-11-01 Lipotec Sa Procedimiento de sintesis de peptidos en fase solida
AU2001250683B2 (en) * 2000-04-12 2006-06-29 Ge Healthcare As Peptide-based compounds

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1076097A1 (en) * 1999-03-04 2001-02-14 Suntory Limited METHOD FOR CONTROLLING CLEAVAGE BY OmpT PROTEASE
EP1197496A1 (en) * 1999-07-23 2002-04-17 Kenji Kangawa Novel peptides

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ORTHOGONAL SOLID-PHASE SYNTHESIS OF N-GLYCOPEPTIDES USING BACKBONE PROTECTION TO ELIMINATE ASPARTIMIDE FORMATION" LETTERS IN PEPTIDE SCIENCE, ESCOM SCIENCE PUBLISHERS, NL, vol. 1, 1994, pages 207-212.

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