DE4393381B4

DE4393381B4 - PTH-Verbindungen mit PTH-ähnlicher Aktivität, Verfahren zu deren Herstellung, diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen und deren Verwendungen

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Publication number: DE4393381B4
Application number: DE4393381A
Authority: DE
Inventors: Wilfried Bauer; Robin Dr. Breckenridge; Francois Dr. Cardinaux; Frank Dr. Gombert; Hermann Dr. Gram; Paul Dr. Ramage; Helmut Dr. Schneider; Rudolf Dr. Waelchli; Rainer Dr. Albert; Ian Dr. Lewis
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1992-07-15
Filing date: 1993-07-06
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2013-07-07
Also published as: FI950171A0; SK283485B6; PT672057E; KR940005670A; US20050009147A1; CH688195A5; HK1004896A1; WO1994002510A2; CA2100423C; KR100321651B1; FI950171A; NO950123D0; CN1099801A; JP3164463B2; ES2150948T3; HU211856A9; FI113872B; WO1994002510A3; EP0672057A1; AU672790B2

Abstract

Verbindung der Formel I Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₁-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-R₉-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-R₁₀-R₁₁-(R₁₂)_n-X, worin
R₁ für Met oder Leu steht;
R₂ für Asn, Asp, Gly, Gln, Glu, His, Ser, Thr oder Tyr steht;
R₃ für Leu oder Lys steht;
R₄ für Lys oder D- oder L-Ala, -Cys, -Gln, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu oder -Gly steht;
R₅ für Asn, Gln, D-Gln oder D- oder L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala oder -Gly steht;
R₆ für Ser, Asp, Ala, Glu, Gln, Phe, His, Ile oder Lys steht;
R₇ für Gln steht;
R₈ für Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn oder Ile steht;
R₉ für Lys, Gln oder Arg steht;
R₁₀ für Asn, Thr, D-Thr oder D- oder L-Ser, -Leu, -Gly, -Gln, -Arg, -Pro, -Asp, -Ile oder -Lys steht;
R₁₁ für Phe oder Ala steht;
R₁₂ für Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Varianten des Parathormons (PTH), ein Verfahren zu deren Herstellung, pharmazeutische Zusammensetzungen, die sie enthalten, und ihre Verwendung als Pharmazeutikum.
Die EP 0 477 885 A2 offenbart Varianten von PTH(1-34), die entweder unnatürliche Aminosäurereste oder natürliche Methioninreste an den Positionen 8 und 18 umfassen.
Der Ausdruck "PTH" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf jede genetisch kodierte Form eines Parathormons, einschließlich der reifen 84 Aminosäuren enthaltenden Form einer gegebenen PTH Art eines Vertebraten, beispielsweise Mensch, Schwein, Ratte, Rind, Huhn und Fragmente hiervon, wie auch Analoga und Derivate hiervon mit PTH-ähnlicher Aktivität. Die Position jeder in der PTH Sequenz beteiligten Aminosäure wird gemäß der international anerkannten Weise nummeriert. In Übereinstimmung und wie es üblich ist, wird in der folgenden Beschreibung das gleiche Nummerierungssystem auf die Aminosäuren der PTH Sequenz unabhängig vom Substitutionsmuster im Molekül angewendet.
Genauer gesagt liefert die vorliegende Erfindung eine PTH Verbindung nach Anspruch 1, die eine PTH-ähnliche Aktivität aufweist und zumindest eine Modifikation umfasst, wobei diese Modifikation zumindest ein Rest ist, der aus einer L- oder D-α-Aminosäure, C_2-6Alkoxycarbonyl und wahlweise substituiertem C_1-8Alkyl, C_2-8Alkenyl, C_2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C_3-6Cycloalkyl-C_1-4alkyl ausgewählt ist und der an die endständige Aminogruppe der PTH Verbindung gebunden ist und/oder zumindest ein Rest, der aus C_2-6Alkoxycarbonyl und wahlweise substituiertem C_1-8Alkyl, C_2-8Alkenyl, C_2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C_3-6Cycloalkyl-C_1-4alkyl ausgewählt ist und der an eine oder mehrere Seitenkettenaminogruppen der PTH Verbindung gebunden ist, in freier Form oder in Salz- oder Komplexform.
Die WO 90/10067 A1 und J. Biol. Chem., 1988, 263, 1307–1313 offenbaren Varianten von PTH(1-84). Endocrine Research Comm., 1975, 2, 561–570 offenbart hPTH Analoga mit Substituenten an dem N-terminalen Ende oder an der Aminogruppe einer Lys-Seitenkette.
Wenn die PTH Sequenz von einem PTH Fragment stammt, ist es ein PTH Fragment, das PTH-ähnliche Aktivität aufweist und zumindest die ersten 27 N-terminalen Aminosäureeinheiten von PTH enthält, vorzugsweise bis zu den ersten 38 N-terminalen Aminosäureeinheiten von PTH, beispielsweise 1-34 bis 1-38, beispielsweise 1-34, 1-36, 1-37 oder 1-38 PTH, und zumindest eine der α-Aminosäuren gemäß der Erfindung ersetzt ist. Eine oder mehrere α-Aminosäureeinheiten, die normalerweise in der natürlich vorkommenden PTH Sequenz vorkommen, können auch weggelassen werden. hPTH Fragmente, insbesondere hPTH(1-34) und hPTH(1-36) sind bevorzugt.
Der C-Terminus der PTH Verbindungen kann sein -COOH, verestertes -COOH, beispielsweise -COOR_a, worin R_a für ein niederes Alkyl steht, beispielsweise C_1-4Alkyl, -CONH₂ oder ein einfach oder zweifach substituiertes Amid, beispielsweise -CONR_bR_c, worin eines von R_b und R_c für Wasserstoff steht und das andere für einen aliphatischen Rest steht, beispielsweise C_1-6Alkyl, oder beide für einen aliphatischen Rest stehen, oder R_b und R_c zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen heterocyclischen Rest bilden, beispielsweise Pyrrolidinyl oder Piperidinyl.
Später werden diese Verbindungen als erfindungsgemäße Verbindungen bezeichnet.
"Natürliche Aminosäuren" beziehen sich auf jene, die im Fachgebiet gut bekannt sind. In der U.S.P.T.O Veröffentlichung, Trademark Official Gazette, herausgegeben am 15. Mai 1990, Seiten 33 bis 46 werden sie und die Standardabkürzungen aufgelistet. Diese Aminosäuren und Abkürzungen werden hiermit eingeführt.

Die natürlichen Aminosäuren sind im folgenden angegeben:

A	Ala	Alanin
D	Asp	Asparaginsäure
E	Glu	Glutaminsäure
F	Phe	Phenylalanin
G	Gly	Glycin
H	His	Histidin
I	Ile	Isoleucin
K	Lys	Lysin
L	Leu	Leucin
M	Met	Methionin
N	Asn	Asparagin
Q	Gln	Glutamin
R	Arg	Arginin
S	Ser	Serin
T	Thr	Threonin
V	Val	Valin
W	Trp	Tryptophan
Y	Tyr	Tyrosin

Der Ausdruck "unnatürliche Aminosäure" Einheit meint eine Aminosäureeinheit, die nicht genetisch kodiert ist. Beispiele von unnatürlichen Aminosäureeinheiten umfassen beispielsweise die D-Isomere der natürlichen α-Aminosäuren, wie sie oben angegeben sind, Aib (Aminoisobuttersäure), bAib (3-Aminoisobuttersäure), Nva (Norvalin), β-Ala, Aad (2-Aminoadipinsäure), bAad (3-Aminoadipinsäure), Abu (2-Aminobuttersäure), Gaba (gamma-Aminobuttersäure), Acp (6-Aminocapronsäure), Dbu (2,4-Diaminobuttersäure), TMSA (Trimethylsilyl-Ala), aIle (allo-Isoleucin), Nle (Norleucin), tert. Leu, Cit (Citrullin), Orn, Dpm (2,2'-Diaminopimelinsäure), Dpr (2,3-Diaminopropionsäure), α- oder β-Nal, Cha (Cyclohexyl-Ala), Hydroxyprolin, Sar (Sarcosin) usw., cyclische Aminosäureeinheiten und N^α-alkylierte Aminosäureeinheiten, beispielsweise MeGly (N^α-Methylglycin), EtGly (N^α-Ethylglycin), EtAsn (N^α-Ethylaspara gin).
Mit Aminosäuren in geschützter Form sind natürliche oder unnatürliche Aminosäuren gemeint, die beispielsweise eine Seitenkette enthalten, die ein Heteroatom, wie O, S oder N enthält, das mit einer O-, S- oder N-Schutzgruppe geschützt sein kann. Der N-Terminus der erfindungsgemäßen PTH Verbindungen kann ebenfalls in geschützter Form vorliegen.
N-Schutzgruppen, wie sie am N-Terminus oder an Seitenkettenaminogruppen von Aminosäureeinheiten vorkommen können, umfassen solche Gruppen, wie sie beispielsweise in "Protective Groups in Organic Synthesis", T.W. Greene, J. Wiley & Sons NY (1981), 219–287 beschrieben sind, beispielsweise Acyl, wie Formyl, Acetyl, Trifluoracetyl, Methoxysuccinyl, Hydroxysuccinyl oder Benzoyl wahlweise am Phenylring mit beispielsweise p-Methoxycarbonyl, p-Methoxy, p-Nitro oder p-Phenylsulfonamidcarbonyl substituiert, Alkoxycarbonyl, wie t-Butyloxycarbonyl, Isobutyloxycarbonyl oder Methoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, Trityl, 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl, Arylmethoxycarbonyl, wie 9-Fluorenylmethoxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl wahlweise am Phenylring mit p-Methoxy, p-Nitro, o- oder p-Chlor, m-Phenyl oder 3,4-Dimethyl substituiert, Arylmethyl, wie Benzyl wahlweise ringsubstituiert mit p-Methoxy, p-Nitro oder p-Chlor, oder Arylsulfonyl, wie Phenylsulfonyl wahlweise ringsubstituiert mit p-Methyl oder p-Methoxy, oder Naphthylsulfonyl wahlweise ringsubstituiert mit beispielsweise Amino oder Di(C_1-4Alkyl)amino.
O-Schutzgruppen von O-enthaltenden Seitenketten sind beispielsweise die, wie sie in der obigen Literaturstelle "The Peptides", 3, (1981), E. Gross und J. Meienhofer (Herausgeber) beschrieben sind. Für funktionelle aliphatische Hydroxygruppen sind geeignete O-Schutzgruppen die, wie sie beispielsweise in "Protection of the Hydroxy Group", J.M. Stewart, 169–201 beschrieben sind, und beinhalten die Benzyl-, t-Butyl- und Methylgruppen. Für funktionelle aromatische Hydroxygruppen beinhalten geeignete O-Schutzgruppen die Benzyl-, t-Butyl-, Methyl-, Tosyl- und Benzyloxycarbonylgruppen. O-Schutzgruppen für funktionelle Carboxygruppen an Aminosäureseitenketten sind gut bekannte Estergruppen und sind beispielsweise in "The Peptides", 3, 101–135 ("Carboxyl Protecting Groups" von R.W. Roeske) beschrieben und beinhalten die Methyl-, Ethyl-, t-Butyl- und Benzylgruppen. S- Schutzgruppen für funktionelle Thiolgruppen an Aminosäureseitenketten sind gut bekannt und beispielsweise in "The Peptides", 3, 137–167 ("Sulfhydryl Group Protection" von R.G. Hiskey) beschrieben. Beispiele beinhalten die Methyl-, t-Butyl-, Benzyl-, p-Methoxyphenylmethyl-, Ethylaminocarbonyl- und Benzyloxycarbonylgruppen.
Gemäß der Erfindung können die PTH Verbindungen an ihren endständigen Aminogruppen zumindest einen Rest tragen, der aus einer L- oder D-α-Aminosäure, C_2-6Alkoxycarbonyl und wahlweise substituiertem C_1-8Alkyl, C_2-8Alkenyl, C_2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C_3-6Cycloalkyl-C_1-4alkyl ausgewählt ist und/oder an einer oder mehreren Seitenkettenaminogruppe(n) zumindest einen Rest tragen, der aus C_2-6Alkoxycarbonyl und wahlweise substituiertem C_1-8Alkyl, C_2-8Alkenyl, C_2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C_3-6Cycloalkyl-C_1-4alkyl ausgewählt ist. Falls eine solche Gruppe an eine Seitenkettenaminogruppe gebunden ist, ist es vorzugsweise die ε-Aminogruppe einer Lys Einheit. Bevorzugte Substituenten für die Alkyl, Alkenyl, Aralkyl, Aralkenyl oder Cycloalkylgruppe sind Hydroxy, Amino und für den Arylteil auch Halogen und/oder C_1-4Alkoxy. Die Alkylgruppe oder der Alkylteil kann linear oder verzweigt und wahlweise durch O, S oder N unterbrochen sein. Vorzugsweise ist jedes C_1-8Alkyl, C_2-8Alkenyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C_3-6Cycloalkyl-C_1-4alkyl an der Aminogruppe einer PTH Verbindung nicht substituiert. Beispiele für C_1-8Alkyl sind C_1-6Alkyl, vorzugsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, t-Butyl, für C_2-8Alkenyl sind es C_2-4Alkenyl, vorzugsweise Allyl, für C_2-8Alkinyl sind es C_2-4Alkinyl, vorzugsweise Prop-2-inyl, für Aralkyl sind es Phenyl oder Benzyl, für Aralkenyl ist es Styryl, für C_3-6Cycloalkyl-C_1-4alkyl ist es Cyclohexylmethyl. C_2-6Alkoxycarbonyl ist vorzugsweise Formyl oder Acetyl. Geeignete Beispiele für D- oder L-α-Aminosäuren, die an den N-Terminus gebunden sind, beinhalten beispielsweise D- oder L- Pro und Ala. Bevorzugte Substituenten, wenn sie vorkommen, sind Alkyl, Alkinyl, Alcoxycarbonyl oder eine an den N-Terminus der PTH Verbindung gebundene D- oder L-α-Aminosäure und/oder zumindest ein Alkyl oder Alkoxycarbonyl, das an eine oder mehrere Seitenkettenaminogruppen gebunden ist.
Bevorzugte erfindungsgemäße PTH Verbindungen sind jene, die zumindest eine Aminosäureeinheit in einer der folgenden Positionen der PTH Sequenz ausgetauscht enthalten: 1, 2, 3, 8–11, 13 bis 19, 21, 22, 29 bis 34, insbesondere 8–11, 16–19, 33 und/oder 34. Ferner sind erfindungsgemäß bevorzugte PTH Verbindungen jene, die mehr als eine Aminosäureeinheit ersetzt enthalten, insbesondere mehr als zwei Aminosäureeinheiten, noch bevorzugter mehr als drei Aminosäureeinheiten, vor allem 5 bis 7 ersetzte Aminosäureeinheiten, vorzugsweise in jeder Kombination der oben angegebenen Positionen der PTH Sequenz.
In einer Reihe an bestimmten oder alternativen Ausführungsformen liefert die vorliegende Erfindung eine wie oben beschriebene PTH Verbindung, worin insbesondere die α-Aminosäuren in den Positionen 1 und 2 am Aminoterminus der PTH Sequenz durch ein Pseudodipeptid ersetzt sind.
Der Ausdruck "Pseudodipeptid", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Dipetidisoster, worin die Peptidbindung zwischen den entweder natürlichen oder unnatürlichen 2 Aminosäureresten durch jede isostere Gruppe ersetzt ist, beispielsweise -CH₂-NH-, -C(Halogen)=CH- oder -C(Alkyl)=CH-.
Beispiele für erfindungsgemäße Verbindungen, worin die α-Aminosäuren in den Positionen 1 und 2 durch ein Pseudodipeptid ersetzt sind, beinhalten beispielsweise die Verbindungen der Formel I X-P₁ Iworin
X ein Rest der Formel (a)
oder (b) ist
worin jeweils Z und Z' unabhängig für H, wahlweise substituiertes C_1-8Alkyl, C_2-8Alkenyl, C_2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C_3-6Cycloalkyl-C_1-4alkyl oder eine Schutzgruppe steht, höchstens eines von Z und Z' für eine Schutzgruppe steht,
Z'' für H, C_1-8Alkyl oder eine Schutzgruppe steht jeweils Y und Y' unabhängig für eine wahlweise geschützte Seitenkette einer natürlichen oder unnatürlichen α-Aminosäure stehen, eines von Y_a und Y_b für Wasserstoff steht und das andere für eine wahlweise geschützte Seitenkette einer natürlichen oder unnatürlichen α-Aminosäure steht oder Y_a und Y_b zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, eine C_3-6Cycloalkylgruppe bilden, und
W für ein Halogen oder C_1-4Alkyl steht, oder
W und Y' zusammen mit der Gruppe
an die sie gebunden sind, einen wahlweise substituierten aromatisch-cyclischen oder heterocyclischen Rest bilden, und
P1 eine wie oben definierte PTH Sequenz ist, worin die Aminosäureeinheiten in den Positionen 1 und 2 des N-Terminus weggelassen sind, in freier Form oder Salzform oder Komplexform.
In Verbindungen der Formel I kann P₁ ein Fragment (3-z) von PTH sein, worin z für 84 oder eine Zahl von 27 bis 38, vorzugsweise von 34 bis 38, insbesondere 34, 36, 37 oder 38, vor allem 34 oder 36 steht. Die durch P₁ dargestellte PTH Sequenz kann entweder einer natürlich auftretenden PTH Sequenz oder einer natürlichen PTH Sequenz entsprechen, in der zumindest eine α-Aminosäureeinheit durch eine natürliche oder unnatürliche Aminosäure wahlweise in geschützter Form ersetzt ist und/oder ein oder mehrere α-Aminosäureeinheiten auch weggelassen sind. P₁ kann auch zumindest eine wie oben beschrieben substituierte Seitenkettenaminogruppe enthalten.
Halogen ist vorzugsweise Fluor oder Chlor.
Im Rest der Formel (a) weist die Doppelbindung vorzugsweise die Konfiguration trans (E) auf.
Als an das α-Kohlenstoffatom einer natürlichen α-Aminosäure gebundener Rest kann Y, Y', Y_a oder Y_b die Seitenkette in einer wie oben angegebenen natürlichen α-Aminosäure sein, wie sie beispielsweise in Gly (das heißt H), Ala, Val, Ser, Leu, Ile, Phe, Trp vorkommt. Y, Y', Y_a oder Y_b kann auch der an das α-Kohlenstoffatom einer wie oben erwähnten unnatürlichen α-Aminosäure gebundene Rest sein, wie er beispielsweise in Nva, Orn, Abu, Aib, Nle vorkommt. Falls die Seitenkette der natürlichen oder unnatürlichen Aminosäuren, wie Y, Y', Y_a oder Y_b, Heteroatome enthält, wie O, S oder N, können die Heteroatome in der Seitenkette wahlweise mit einer O-, S- oder N-Schutzgruppe geschützt sein, wie dies beispielsweise oben erwähnt ist.
Schutzgruppen, wie Z oder Z' oder Z'' können die oben beschriebenen sein.
C_1-8Alkyl, wie Z oder Z' oder Z'', kann das wie oben beschriebene sein.
Vorzugsweise steht Z oder Z' für Wasserstoff oder C_1-4Alkyl, insbesondere Wasserstoff oder Methyl.
Vorzugsweise steht Y für H oder CH₃.
Wenn W für C_1-4Alkyl steht, steht es vorzugsweise für CH₃.
Wenn W und Y' zusammen mit der Gruppe, an die sie gebunden sind, einen wahlweise substituierten aromatisch-cyclischen oder heterocyclischen Rest bilden, kann dies ein aromatischer 5- oder 6-gliedriger cyclischer Rest sein, der wahlweise 1 oder 2 aus N, S und O ausgewählte Herteroatome enthält, beispielsweise Phenyl, Imidazolyl, Pyridyl, Oxazolyl oder Thiazolyl. Ein bevorzugter Substituent ist Hydroxy oder Methoxy, insbesondere für den Phenylring.
Y' steht bevorzugt für H, CH₃, Isopropyl oder Benzyl.
Wenn Z'' für C_1-8Alkyl steht, steht es bevorzugt für CH₃, C₂H₅ oder Isopropyl.
C_3-6Cycloalkyl, wie Y_a und Y_b zusammen, steht vorzugsweise für Cyclopropyl oder Cyclopentyl.
Wenn Z'' eine Schutzgruppe ist, ist dies vorzugsweise Acyl, insbesondere Acetyl.
In einer Reihe an bestimmten oder alternativen Ausführungsformen liefert die vorliegende Erfindung eine PTH Verbindung, wie sie oben beschrieben ist, in der die α-Aminosäureein heit in der Position 1 und/oder die α-Aminosäureeinheit in der Position 2 des N-Terminus der PTH Sequenz durch einen wahlweise geschützten natürlichen oder unnatürlichen Aminosäurerest ersetzt ist, vorausgesetzt, daß
wenn die PTH Verbindung frei ist von D- oder L-α-Aminosäuren, die an den N-Terminus gebunden sind, oder von C_2-6Alkoxycarbonyl oder wahlweise substituiertem C_1-8Alkyl, C_2-8Alkenyl, C_2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C_3-6Cycloalkyl-C_1-4alkyl, sie anders als eine PTH Verbindung ist, die eine natürlich auftretende α-Aminosäuresequenz aufweist,
oder die PTH Verbindung anders als PTH(1-34) ist, worin

i. die α-Aminosäure in der Position 1 Aib, Gly, D-Ser, D-Ala oder Tyr ist, oder
ii. die α-Aminosäure in der Position 2 Ala, D-Val, Lys, Cit oder Arg ist und die α-Aminosäure in der Position 34 Tyr ist, oder die α-Aminosäure in der Position 2 D-Val ist und die α-Aminosäure in der Position 34 D-Tyr ist und wahlweise die α-Aminosäuren in den Positionen 8 und 18 jeweils Nle sind, oder
iii. die α-Aminosäure in der Position 1 Aib ist und zumindest eine weitere α-Aminosäureeinheit folgendermaßen ersetzt ist: die α-Aminosäure in der Position 8 und/oder 18 Leu, Ile, Val, Phe oder Trp ist und/oder die α-Aminosäure in der Position 11 Ser, Lys, Phe, β-Nal, Trp oder Tyr ist und/oder die α-Aminosäure in der Position 12 D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ser, D-Ser(Butyl), D-Abu, D-Thr, D-Nva, D-Met, D-β-Nal, D-Trp, D-Lys, D-Tyr, D-Lys(Fmoc), D-Phe oder D-Asn ist und/oder die α-Aminosäure in der Position 13 Leu ist und/oder die α-Aminosäure in der Position 19 und/oder in der Position 21 Arg, Lys, Asn oder His ist und/oder die α-Aminosäure in der Position 23 2-(1,3-Dithiolan-2-yl)Trp ist und/oder die α-Aminosäure in der Position 25 und/oder in der Position 26 His ist und/oder die α-Aminosäure in der Position 27 Gln oder Leu ist, oder die PTH Verbindung anders als PTH(1-84) ist, worin
i. die α-Aminosäure in der Position 1 Tyr, Val, Pro, Asp oder Cys ist, oder
ii. die α-Aminosäure in der Position 2 Ala, Glu, Leu, Ser oder Arg ist.

Beispiele der erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen die α-Aminosäuren in der Position 1 und/oder in der Position 2 wie oben erwähnt ersetzt sind, beinhalten beispielsweise Verbindungen der Formel II X_1a-Y_2a-P₂ IIworin X_1a ein Rest einer wahlweise geschützten natürlichen α-Aminosäure oder ein Rest der Formel (IIa) ist
worin
jeweils Z_a und Z'_a unabhängig für H, C_1-6Alkyl oder eine Schutzgruppe stehen, höchstens eines von Z_a und Z'_a für eine Schutzgruppe steht, und entweder n für 1 steht und

i. jeweils R₁ und R₂ unabhängig für C_1-6Alkyl stehen, oder
ii. eines von R₁ und R₂ für Methyl oder Ethyl steht und das andere ein an das α-Kohlenstoffatom einer anderen natürlichen α-Aminosäure, als Ala, Leu, Ile oder Val gebundener wahlweise geschützter Rest ist, oder
iii. eines von R₁ und R₂ für Wasserstoff, Methyl oder Ethyl steht und das andere für einen an das α-Kohlenstoffatom einer unnatürlichen α-Aminosäure gebundener wahlweise geschützter Rest ist, oder
iv. R₁ und R₂ zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, eine C_3-6Cycloalkylgruppe bilden, oder
v. der Rest
einen heterocyclischen Rest darstellt, der wahlweise zu einem Benzolring kondensiert ist, oder n für 2, 3, 4 oder 5 steht und jeweils R₁ und R₂ für H oder CH₃ stehen, Y_2a ein Rest einer wahlweise geschützten natürlichen α-Aminosäure oder ein Rest der Formel (IIb) ist
worin Z_b für H oder C_1-6Alkyl steht und entweder m für 1 steht und
i. jeweils R₃ und R₄ unabhängig für C_1-6Alkyl stehen, oder
ii. eines von R₃ und R₄ für Methyl oder Ethyl steht und das andere eine an das α-Kohlenstoffatom einer anderen natürlichen α-Aminosäure, als Ala, Leu, Ile oder Val gebundener wahlweise geschützter Rest ist, oder
iii. eines von R₃ und R₄ für Wasserstoff, Methyl oder Ethyl steht und das andere für einen an das α-Kohlenstoffatom einer unnatürlichen α-Aminosäure gebundener wahlweise geschützter Rest ist, oder m für 2, 3, 4 oder 5 steht und jeweils R₃ und R₄ für H oder CH₃ stehen und P₂ eine wie oben definierte PTH Sequenz ist, in der die Aminosäureeinheiten in den Positionen 1 und/oder 2 des N-Terminus weggelassen sind.

Wenn der Rest
einen heterocyclischen Rest darstellt, der wahlweise zu einem Benzolring kondensiert ist, kann dies ein Rest sein, der von einem gesättigten oder ungesättigten 5- oder 6-gliedrigen Heterocyclus abstammt, welcher ein oder mehrere aus N, O und S ausgewählte Heteroatome enthält. Beispiele für solche heterocyclischen Reste sind unter anderem 2-Pyridyl, 3-Morpholinyl, Hexahydropyridazinyl, 2- oder 3-Indolyl.
Wenn n oder m > 1 ist, kann die Gruppe CR₁R₂ oder CR₃R₄ für -CH(CH₃)-CH₂-, Propyl, Butyl oder Pentyl stehen.
C_3-6Cycloalkyl für R₁ und R₂ zusammen ist vorzugsweise Cyclopropyl oder Cyclopentyl.
Als Rest, der an das α-Kohlenstoffatom einer natürlichen α-Aminosäure gebunden ist, kann R₁, R₂, R₃ oder R₄ die Seitenkette sein, die in einer wie oben angegebenen natürlichen α-Aminosäure vorkommt, wie sie beispielsweise in Gly, Ser oder Thr vorkommt. Eines von R₁ und R₂ und eines von R₃ und R₄ kann für Methyl oder Ethyl stehen und das andere kann für CH₃, Isopropyl, Isobutyl oder CH₃-CH₂-CH(CH₃)- stehen. R₁, R₂, R₃ oder R₄ kann auch der Rest sein, der an das α-Kohlenstoffatom einer wie oben erwähnten unnatürlichen α-Aminosäure gebunden ist, wie er beispielsweise in Abu, Gaba, Nva, Aib, TMSA oder Nle vorkommt. Wenn die Seitenkette der natürlichen oder unnatürlichen Aminosäuren, wie R₁, R₂, R₃ oder R₄, Heteroatome enthält, wie O, S oder N, können die Heteroatome der Seitenkette wahlweise mit einer O-, S- oder N-Schutzgruppe geschützt sein, wie sie beispielsweise oben erwähnt sind. Schutzgruppen, wie Z_a oder Z'_a können die sein, die oben beschrieben sind. C_1-6Alkyl als Z_b ist vorzugsweise Methyl oder Ethyl. Vorzugsweise steht Z_b für H. C_1-6Alkyl als Z_a oder Z'_a ist vorzugsweise geradkettiges oder verzweigtes C_1-4Alkyl. Vorzugsweise steht eines von Z_a und Z'_a für H und das andere für H, C_1-4Alkyl oder eine Schutzgruppe, insbesondere für H.
In einer weiteren oder alternativen Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung auch eine wie oben beschriebene PTH Verbindung, in der die α-Aminosäureeinheit in der Position 8 und/oder die α-Aminosäureeinheit in der Position 18 durch einen wahlweise geschützten natürlichen oder unnatürlichen Aminosäurerest ersetzt ist, vorausgesetzt, daß
wenn die PTH Verbindung frei ist von D- oder L-α-Aminosäuren, die an den N-Terminus gebunden sind, oder von C_2-6Alkoxycarbonyl oder wahlweise substituiertem C_1-8Alkyl, C_2-8Alkenyl, C_2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C_3-6Cycloalkyl-C_1-4alkyl ist, sie anders als eine PTH Verbindung ist, die eine natürlich auftretende α-Aminosäuresequenz aufweist,
oder die PTH Verbindung anders als PTH(1-34) ist, worin

i. die α-Aminosäuren in den Positionen 8 und 18 jeweils Nle oder jeweils Met(O) sind und wahlweise die α-Aminosäure in der Position 34 Tyr ist, oder die α-Aminosäuren in den Positionen 8 und 18 jeweils Nle sind und die α-Aminosäure in der Position 34 Tyr ist und entweder die α-Aminosäure in der Position 12 L- oder D-Pro, L- oder D-Ala, Aib oder NMe-Gly ist, oder die α-Aminosäure in der Position 23 Phe, Leu, Nle, Val, Tyr, α-Nal oder β-Nal ist, oder die Aminosäuren in den Positionen 8 und 18 jeweils Nle sind und die α-Aminosäure in der Position 2 D-Val ist und die α-Aminosäure in der Position 34 D-Tyr ist, oder
ii. die α-Aminosäure in der Position 8 und/oder 18 Leu, Ile, Val, Phe oder Trp ist und wahlweise zumindest eine weitere α-Aminosäureeinheit folgendermaßen ersetzt ist: Die α-Aminosäure in der Position 1 Aib ist und/oder die α-Aminosäure in der Position 11 Ser, Lys, Phe, β-Nal, Trp oder Tyr ist, und/oder die α-Aminosäure in der Position 12 D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Ser, D-Ser(Butyl), D-Abu, D-Thr, D-Nva, D-Met, D-β-Nal, D-Trp, D-Lys, D-Tyr, D-Lys(Fmoc), D-Phe oder D-Asn ist und/oder die α-Aminosäure in der Position 13 Leu ist und/oder die α-Aminosäure in der Position 19 und/oder in der Position 21 Arg, Lys, Asn oder His ist und/oder die α-Aminosäure in der Position 23 2-(1,3-Dithiolan-2-yl)Trp ist und/oder die α-Aminosäure in der Position 25 und/oder in der Position 26 His ist und/oder die α-Aminosäure in der Position 27 Gln oder Leu ist, oder
iii. die α-Aminosäure in der Position 8 und/oder 18 Ala oder Ser ist, oder die α-Aminosäure in der Position 8 und/oder 18 Leu ist und die α-Aminosäure in der Position 34 Tyr ist, oder die PTH Verbindung anders als PTH(1-84) ist, worin die α-Aminosäure in der Position 8 Met, Met(O), Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Trp, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, Tyr oder Gly ist und die α-Aminosäure in der Position 18 Leu ist, oder die α-Aminosäuren in der Position 8 und in der Position 18 jeweils Met(O) sind, oder die α-Aminosäure in der Position 8 Leu ist und die α-Aminosäure in der Position 18 Met(O) ist, oder die PTH Verbindung anders ist als [Leu¹⁸, Tyr³⁴]hPTH(1-84), [Leu⁸, Tyr³⁴]hPTH(1-84), [Ile⁸, Leu¹⁸, Tyr³⁴]hPTH(1-84) oder [Leu⁸, Leu¹⁸, Tyr³⁴]hPTH(1-84).

Wenn die α-Aminosäureeinheit in der Position 8 durch eine unnatürliche Aminosäure ersetzt wird, kann dies eine unnatürliche Aminosäure sein, wie sie oben beschrieben ist, beispielsweise Nva, Nle oder Cha. Vorzugsweise ist es eine unnatürliche lipophile Aminosäure, vorzugsweise eine solche, die einen geradkettigen Alkylrest enthält.
Nva (Norvalin) und dessen Homologe sind besonders bevorzugt. Die unnatürliche Aminosäure in der Position 8 der PTH Sequenz kann auch eine Cα-methylierte oder Cα-ethylierte natürliche α-Aminosäure sein.
Beispiele für erfindungsgemäße PTH Verbindungen, in denen die α-Aminosäureeinheit in der Position 18 ersetzt ist sind beispielsweise PTH Verbindungen, in denen der α-Aminosäurerest in der Position 18 durch einen natürlichen Aminosäurerest ersetzt ist, wie Gln, Tyr oder Lys, beispielsweise [Gln¹⁸]-PTH, [Lys¹⁸]PTH und [Tyr¹⁸]-PTH, insbesondere [Gln¹⁸ oder Lys¹⁸ oder Tyr¹⁸]-hPTH-(1-x), worin x für 84 steht oder eine Zahl von 27 bis 38, insbesondere von 34 bis 38 ist. Ala in der Position 18 ist ebenfalls bevorzugt, insbesondere wenn die PTH Sequenz ein (1-36) PTH Fragment ist. In diesen Verbindungen kann die Aminosäure in der Position 8 Met sein, oder sie kann durch eine aus Leu, Ile, Val, Phe, Gln, Trp, Ser und Ala ausgewählte Aminosäure ersetzt sein, oder sie kann ein unnatürlicher lipophiler Aminosäurerest sein, beispielsweise Nva oder Nle.
Eine andere Gruppe solcher erfindungsgemäßer PTH Verbindungen umfaßt beispielsweise PTH Verbindungen, in denen der Aminosäurerest in der Position 8 durch einen unnatürlichen lipophilen Aminosäurerest ersetzt ist, beispielsweise Nle oder noch bevorzugter Nva. In diesen Verbindungen kann die Aminosäure in der Position 18 Met sein oder sie kann durch eine Aminosäure ersetzt sein, die aus Leu, Ile, Val, Phe, Trp, Ser, Ala, Gln, Lys oder Tyr, vorzugsweise Leu, Gln, Ala oder Tyr ausgewählt ist.
Eine weitere Gruppe solcher erfindungsgemäßer PTH Verbindungen sind jene, in denen eine oder mehrere Aminosäureeinheiten in den verbleibenden Positionen, beispielsweise 1 bis 7, 9 bis 17 und/oder 19 bis 38 entweder weggelassen oder zusätzlich zu dem Austausch der α-Aminosäureeinheit in der Position 8 und/oder 18 ersetzt sind. In einem solchen Fall wird die α-Aminosäure in der Position 8 vorzugsweise durch Leu ersetzt und die α-Aminosäure in der Position 18 durch Gln, Leu, Ala oder Tyr.
In einer weiteren oder alternativen Ausführungsform liefert die vorliegende Erfindung eine wie oben beschriebene PTH Verbindung, in der zumindest eine α-Aminosäureeinheit in der PTH Sequenz durch eine α-Aminosäureeinheit ersetzt ist, die in der entsprechenden Position in PTHrP vorkommt, vorausgesetzt, daß
wenn die PTH Verbindung frei ist von D- oder L-α-Aminosäuren, die an den N-Terminus gebunden sind, oder von C_2-6Alkoxycarbonyl oder wahlweise substituiertem C_1-8Alkyl, C_2-8Alkenyl, C_2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C_3-6Cycloalkyl-C_1-4alkyl, sie anders als eine PTH Verbindung ist, die eine natürlich auftretende α-Aminosäuresequenz aufweist,
oder die PTH Verbindung anders als PTH(1-34) ist, worin

i. die α-Aminosäure in der Position 8 und/oder 18 Leu ist, und/oder die α-Aminosäure in der Position 11 Lys ist, und/oder die α-Aminosäure in der Position 19 und/oder 21 Arg ist, und/oder die α-Aminosäure in der Position 25 und/oder 26 His ist, und/oder die α-Aminosäure in der Position 27 Leu ist, oder
ii. die α-Aminosäure in der Position 25 Gln ist, und/oder die α-Aminosäure in der Position 26 Asn ist, die α-Aminosäure in der Position 27 wahlweise Leu ist, oder die PTH Verbindung anders als [Leu⁸, Leu¹⁸]PTH(1-84) ist,

Der Ausdruck "PTHrP" bezieht sich auf jede genetisch kodierte Form von PTHrP, beispielsweise Mensch-, Huhn-, Ratte- oder Maus-PTHrP. In Übereinstimmung und wie es üblich ist, wird in der folgenden Beschreibung das gleiche Nummerierungssystem auf die Aminosäuren der PTHrP Sequenz angewendet, die mit Ala in der Position 1 beginnt und beispielsweise Ala in der Position 38 enthält.
Diese Gruppe an erfindungsgemäßen Verbindungen sind Hybride zwischen PTH und den homologen PTHrP Sequenzen (hierin als PTH-rP Hybride bezeichnet). Die Aminosäuresequenz, in der die erfindungsgemäße Substitution stattfindet, reicht von der Position 1 bis zur Position 38, insbesondere von 1 bis 36, vor allem von 1 bis 34.
Bevorzugte erfindungsgemäße PTH Verbindungen sind PTH-rP Hybride, in denen mehr als eine α-Aminosäureeinheit der PTH Sequenz, beispielsweise zumindest 2, vorzugsweise 3 bis 5 α-Aminosäureeinheiten erfindungsgemäß ersetzt sind.
Eine bevorzugte Gruppe der erfindungsgemäßen PTH-rP Hybride umfaßt PTH Verbindungen, in denen zumindest eine α-Aminosäureeinheit der PTH α-Aminosäuresequenz in den Positionen 8 bis 11, das heißt Met⁸, His⁹, Asn¹⁰ oder Leu¹¹ durch die entsprechende α-Aminosäureeinheit der entsprechenden Sequenz von PTHrP, das heißt Leu⁸, His⁹, Asp¹⁰ oder Lys¹¹ ersetzt ist. Der Austausch an den Positionen 8 und/oder 10 ist bevorzugt, insbesondere an den Positionen 8 und 10. Noch bevorzugter werden die α-Aminosäuren an den Positionen 8, 10 und 11 dieser PTH Sequenz jeweils durch Leu⁸, Asp¹⁰ und Lys¹¹ ersetzt.
Eine weitere bevorzugte Gruppe der erfindungsgemäßen PTH-rP Hybride umfaßt PTH Verbindungen, in denen zumindest eine α-Aminosäureeinheit der PTH α-Aminosäuresequenz in den Positionen 16 bis 19 durch die entsprechende α-Aminosäureeinheit der entsprechenden PTHrP Sequenz ersetzt ist, das heißt Gln¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹. Vorzugsweise werden 3 oder alle 4 α-Aminosäuren dieser Sequenz ersetzt. Insbesondere bevorzugt sind erfindungsgemäße PTH Verbindungen, in denen die α-Aminosäure in der Position 16 Gln ist, die α-Aminosäure in der Position 18 Leu ist und die α-Aminosäure in der Position 19 Arg ist.
Eine weitere bevorzugte Gruppe der erfindungsgemäßen PTH-rP Hybride umfaßt PTH Verbindungen, in denen zumindest eine α-Aminosäureeinheit der PTH α-Aminosäuresequenz in den Positionen 33 und 34 durch die entsprechende α-Aminosäureeinheit der entsprechenden PTHrP Sequenz ersetzt ist, das heißt Thr³³, Ala³⁴ Vorzugsweise werden beide Aminosäuren ersetzt.
Ferner sind bevorzugte Gruppe der erfindungsgemäßen PTH-rP Hybride PTH Verbindungen, die jede Kombination der oben erwähnten α-Aminosäuresubstitutionen (8–11, 16–19, 33–34) umfassen, noch bevorzugter eine Kombination der Substitutionen, die aus den oben erwähnten 8–11 und 33–34 Sequenzen ausgewählt werden.
Wie man erkennt, können in den erfindungsgemäßen PTH-rP Hybriden eine oder mehrere α-Aminosäuren in den Positionen 1 bis 38 ferner durch eine oben erwähnte natürliche oder unnatürliche Aminosäureeinheit ersetzt werden oder weggelassen werden. In der Position 10 kann eine α-Aminosäure sein, die aus Gly, Gln, Glu, His, Ser, Thr oder Tyr ausgewählt ist. In der Position 13 kann eine andere D- oder L-α-Aminosäure sein als Arg, beispielsweise Ala, Cys, Gln, Ile, Asn, Trp, Asp, Val, Ser, Thr, Tyr, Met, Leu oder Gly, in der Position 16 kann eine D- oder L-α-Aminosäure sein, beispielsweise Lys, Ser, Leu, Ala, Gln oder Gly, in der Position 17 Ala oder Ser oder vorzugsweise eine Aminosäure mit einer größeren Seitenkette als Ala oder Ser, beispielsweise Glu, Gln, Phe, His, Ile oder Lys, in der Position 18 Gln oder Tyr, in der Position 19 Ala, Arg, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn oder Ile, in der Position 26 Gln oder Arg, und/oder in der Position 33 eine D- oder L-α-Aminosäure, beispielsweise Ser, Thr, Leu, Gly, Gln, Arg, Pro, Asp, Ile, Lys oder Thr. Sie können auch am N-Terminus oder an einer Seitenkettenaminogruppe substituiert sein, wie dies oben erwähnt ist. Falls gewünscht, können die S- oder O-enthaltenden Seitenketten der erfindungsgemäßen PTH-rP Hybride auch wie oben beschrieben geschützt sein.
Beispiele von erfindungsgemäßen PTH-rP Hybriden sind
[Leu⁸, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]PTH,
[Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]PTH,
[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]PTH,
[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸]PTH,
[Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹]PTH,
[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]PTH,
[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹]PTH,
[Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]PTH und
[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]PTH,
Bevorzugte erfindungsgemäße PTH-rP Hybride sind PTH(1-x') Verbindungen, worin x' eine Zahl von 34 bis 38 ist, insbesondere 34, 36, 37 oder 38, vor allem hPTH(1-x'), worin eine oder mehrere α-Aminosäuren durch die α-Aminosäure(n) ersetzt sind, die an der entsprechenden Position in PTHrP vorkommen, vorzugsweise wie dies oben erwähnt ist. Wenn die Positionen 33 und 34 durch die entsprechende α-Aminosäuresequenz von PTHrP ersetzt sind, ist die PTH Verbindung vorzugsweise ein hPTH Fragment, das 34 α-Aminosäureeinheiten enthält. Die PTH-rP Hybride mit Carboxyterminus sind bevorzugt.
Vorzugsweise ist PTHrp hPTHrP.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können beispielsweise in freier Form, Salzform oder in Form von Komplexen hiervon vorkommen. Säureadditionssalze können beispielsweise mit organischen Säuren, Polymersäuren und anorganischen Säuren gebildet werden. Solche Säureadditionssalzformen beinhalten beispielsweise die Hydrochloride und die Acetate. Komplexe werden beispielsweise aus der erfindungsgemäßen Verbindung durch die Zugabe von anorganischen Substanzen, beispielsweise anorganischen Salzen oder Hydroxiden, wie Ca- und Zn-Salzen, und/oder durch die Zugabe von polymeren organischen Substanzen gebildet.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen. Sie können schrittweise entweder in Lösung oder mittels Festphasensyntheseverfahren oder Gentechnologie hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können beispielsweise folgendermaßen hergestellt werden:

a) Entfernung von zumindest einer Schutzgruppe, die in einer geschützten erfindungsgemäßen Verbindung vorkommt, oder
b) Zusammenfügung von zwei Ppetidfragmenten durch eine Amidbindung, wobei die Peptidfragmente so beschaffen sind, daß die gewünschte Aminosäuresequenz der gewünschten Verbindung erhalten wird, und dann die Ausführung des wahlweisen Schritts a) des Verfahrens,
c) zur Herstellung einer PTH Verbindung, in der die α-Aminosäureeinheiten in den Positionen 1 und 2 am Aminoterminus durch ein Pseudodipeptid ersetzt werden, Umsetzung eines Pseudodipeptids in geschützter oder ungeschützter Form mit einem PTH Peptid in geschützter oder ungeschützter Form, worin die Aminosäure reste in den Positionen 1 und 2 weggelassen werden und falls erforderlich, Ausführung von Schritt a), oder
d) zur Herstellung einer PTH Verbindung, die zumindest einen Rest enthält, die aus einer an den N-Terminus gebundenen L- oder D-α-Aminosäure und C_2-6Alkoxycarbonyl und wahlweise substituitertem C_1-8Alkyl, C_2-8Alkenyl, C_2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C_3-6Cycloalkyl-C_1-4alkyl ausgewählt ist und der an die endständige Aminogruppe und/oder eine Seitenkettenaminogruppe gebunden ist, Einführung eines solchen Rests in eine PTH Verbindung, die in geschützter oder ungeschützter Form vorliegt und keinen solchen Rest enthält, und falls erforderlich Ausführung von Schritt a), und Gewinnung der so erhaltenen Verbindungen in freier Form, Salzform oder in Komplexform.

Die Verfahrensschritte a), b) und c) können in Analogie zu bekannten Verfahren bewirkt werden, wie es beispielsweise im Fachgebiet der Peptidchemie bekannt ist oder in den folgenden Beispielen beschrieben wird. Falls gewünscht können in diesen Reaktionen zur Verwendung bei Peptiden geeignete Schutzgruppen für funktionelle Gruppen verwendet werden, die nicht an der Reaktion beteiligt sind. Der Ausdruck Schutzgruppe kann auch ein Polymerharz beinhalten, das funktionelle Gruppen aufweist.
In Verfahrenschritt b) zur Herstellung einer PTH Verbindung, in der die α-Aminosäureeinheiten in den Positionen 1 und 2 am Aminoterminus durch ein Pseudodipeptid ersetzt sind, kann ein als Ausgangsmaterial verwendetes Peptidfragment das Pseudodipeptid an seinem N-Terminus enthalten. Dieses Ausgangsmaterial kann gemäß dem Verfahrensschritt c) hergestellt werden.
In Verfahrensschritt c) kann das als Ausgangsmaterial verwendete Pseudodipeptid eine Verbindung der Formel IIaa oder IIbb sein ZZ'N-CHY-CW=CH-CHY'-COOH (IIaa) ZZ'N-Cy_aY_b-CH₂-NZ''-CHY'-COOH (IIbb)worin Y, Y', Y_a, Y_b, Z, Z', Z'' und W wie oben definiert sind oder ein funktionelles Derivat hiervon, beispielsweise ein Ester, ein saures Halogenid oder ein symmetrisches oder asymmetrisches Anhydrid. Verbindungen der Formel IIaa, in der W und Y' zusammen mit der Gruppe
an die sie gebunden sind, einen wahlweise substituierten aromatisch-cyclischen oder heterocyclischen Rest bilden, und Verbindungen der Formel IIbb, worin Z'' für Alkyl oder eine Schutzgruppe steht, beispielsweise Acetyl, oder worin -CY_aY_b für C_3-6Cycloalkyl steht und Z'' für H steht, sind neu und Teil der Erfindung.
Der Verfahrensschritt d) kann in Analogie zu bekannten Verfahren, beispielsweise Alkylierungsverfahren, ausgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Alkylierung unter reduktiven Bedingungen ausgeführt, beispielsweise mittels eines entsprechenden Aldehyds oder Ketons. Sie kann beispielsweise in Gegenwart von NaBH₃CN ausgeführt werden, vorzugsweise bei einem sauren pH, beispielsweise von 5 bis 7. Die Temperatur der Reaktion kann von beispielsweise –20°C bis 100°C betragen. Es kann vorteilhaft sein, die Reaktion in einem inerten Lösemittel auszuführen, beispielsweise Wasser, einem Alkohol, Dioxan oder DMF oder einem Gemisch hiervon. Eine D- oder L-α-Aminosäure kann gemäß dem bekannten Verfahren auch an den N-Terminus gebunden werden.
Das in Verfahrensschritt b) als Ausgangsmaterial verwendete Peptidfragment kann eine oder mehrere unnatürliche Aminosäureeinheiten umfassen, es kann auch am N-Terminus und/oder an den Seitenkettenaminogruppen durch einen Rest substituiert sein, die aus C_2-6Alkoxycarbonyl und wahlweise substituitertem C_1-8Alkyl, C_2-8Alkenyl, C_2-8Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C_3-6Cycloalkyl-C_1-4alkyl ausgewählt ist, oder es kann eine D- oder L-α-Aminosäure am N-Terminus tragen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen oder Fragmente hiervon, die natürliche α-Aminosäureeinheiten enthalten, können auch mittels rekombinanter Technologie hergestellt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines mittelgroßen Polypeptids geliefert, in dem ein Fusionsprotein in Bakterienzellen exprimiert wird, das ein N-terminales Bakteriophagen T4 Gen 55 Polypeptid enthält, das das gewünschte Polypeptid an den C-Terminus hiervon gebunden aufweist.
Das Gen 55 Polypeptid kann das gesamte gp55 Protein des Bakteriophagen T4 (188 Aminosäurereste) umfassen, das in H. Gram und R. Rüger, 1985, The EMBO Journal, 4, (1), Seiten 257–264 beschrieben ist. Alternativ dazu kann ein Fragment verwendet werden, vorzugsweise ein N-terminales Fragment des gp55 Proteins. Beispielsweise kann ein gp55 Proteinfragment verwendet werden, das die ersten 112 N-terminalen Aminosäurereste des Proteins umfaßt. Typischerweise umfaßt das Gen 55 Polypeptid jedoch mindestens die ersten 25 N-terminalen Reste des gp55 Proteins.
Das mittelgroße Polypeptid kann etwa 20 bis 100, beispielsweise 150, vorzugsweise etwa 20 bis etwa 50 Aminosäuren lang sein. Beispiele für mittelgroße Polypeptide beinhalten Calcitonine, Endorphine, gastroinhibitorische Peptid(e), Glucagon, Neuropeptid Y, Wachtumshormon-Freisetzungsfaktor (GHRF), amyloide β-Proteinfragmente, Hirudin, Insulin, Somatostatin, epidermalen Wachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor und PTH oder Fragmente hiervon. Besonders bevorzugte mittelgroße Polypeptide, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, sind die erfindungsgemäßen Verbindungen oder Fragmente hiervon, die natürliche Aminosäuresubstitutionen aufweisen.
Bequemerweise enthält das Gen 55-PTH Fusionsprotein auch einen spaltbaren Linker zwischen dem Gen 55 Polypeptid und dem gewünschten Polypeptid. Vorzugsweise ist der spaltbare Linker chemisch spaltbar und noch bevorzugter enthält er die Aminosäuresequenzen Asp-Pro-Pro oder Asn-Gly-Pro.
In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung eine Nukleotidsequenz, die für ein Fusionsprotein kodiert, das ein N-terminales Bakteriophagen T4 Gen 55 Polypeptid und ein gewünschtes mittelgroßes Polypeptid an den C-Terminus hiervon gebunden enthält.
Die Nukleotidsequenz ist vorzugsweise eine DNA Sequenz, die zur Expression in Bakterien geeignet ist. Diese Sequenz enthält typischerweise Nukleotide zwischen den für das Gen 55 und den das gewünschte Polypeptid kodierenden Sequenzen, die für einen spaltbaren Linker kodieren.
Die Erfindung liefert auch einen bakteriellen Expressionsvektor, der eine für das Fusionsprotein kodierende DNA Sequenz enthält.
Der Expressionsvektor enthält typischerweise zusätzlich zur kodierenden Sequenz des Fusionsproteins geeignete Expressionskontrollsequenzen, einschließlich eines geeigneten Promotors, eines Operators und einer Ribosomenbindungsstelle und anderen geeigneten regulatorischen Sequenzen. Gewöhnlich enthält der Expressionvektor auch einen oder mehrere Selektionsmarker.
Jeder geeignete Promotor kann verwendet werden, wie der TrpE, Lambda Pl, Lambda Pr, lac oder Tac Promotor. Vorzugsweise ist der Promotor der Bakteriophagen T7 Promotor und der Expressionsvektor ein Plasmid. Zur E. coli Expression kann ein Vektor verwendet werden, der vom R1 oder Col-E1 Plasmid abstammt. Beispielsweise können der von Novagen erhältliche Expressionsvektor pET 17B oder ähnliche Vektoren verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung bakterielle Wirtszellen, die mit einer ein Fusionprotein kodierenden Sequenz oder einem wie oben beschriebenen Expressionsvektor transformiert sind. Jede geeignete bakterielle Wirtszelle kann verwendet werden, obwohl der Wirt vorzugsweise E. coli ist. Beispielsweise können der E. coli Stamm BL21 (DE3) Lys E und ähnliche Stämme verwendet werden.
Vorteilhafterweise reichert sich das Protein innerhalb der Wirtszellen in Form von unlöslichen Einschlußkörpern an und erleichtert daher die Gewinnung des Fusionsproteinprodukts aus den Zellen. Um das gewünschte Polypeptidprodukt aus dem Fusionsprotein zu gewinnen, wird das Protein der Einschlußkörper gelöst, und das gewünschte Polypeptidprodukt vom Fusionsprotein abgespalten. Jede geeignete Lösungsbehandlung kann verwendet werden, einschließlich Säurebehandlung beispielsweise bei etwa pH 2 bis 4, vorzugsweise mit Säure bei etwa pH 2,5, oder die Behandlung mit einem denatuirierenden Mittel, beispielsweise einem milden Denaturierungsmittel, wie Guanidinhydrochlorid. Zusätzlich kann es notwendig sein, eine oder mehrere ungewünschte N-terminale Aminosäurereste vom Produkt zu entfernen, die nach der Spaltung verblieben sind.
Daher liefert die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten mittelgroßen Polypeptids in einem bakteriellen Wirt, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch:
Veranlassung der wie oben definierten transformierten bakteriellen Wirtszellen, das Fusionsprotein in Form von Einschlußkörpern zu exprimieren,
Isolierung der Einschlußkörper,
Auflösen der Einschlußkörper, und
Abspaltung des gewünschten Polypeptids vom Fusionsprotein.
Im Fall von einigen mittelgroßen Polypeptiden, wie den PTH Verbindungen, ist es normalerweise nicht notwendig, sorgfältig kontrollierte Denaturierungs- und Renaturierungsverfahren zur Bildung von PTH Produkten in aktiver Form, beispielsweise mit PTH-ähnlicher Aktivität, auszuführen. Die mittelgroßen Polypeptidprodukte können in aktiver Form meistens durch Neutralisierung der zur Auflösung verwendeten sauren Bedingungen erhalten werden. Die Lösung und Spaltung des Fusionsproteins kann in einem einzigen Schritt ausgeführt werden.
Die Erfindung beinhaltet auch ein Fusionsprotein, das ein N-terminales Bakteriophagen T4 Gen 55 Polypeptid und an den C-Terminus hiervon gebunden ein gewünschtes mittelgroßes Polypeptid umfaßt.
Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Vektoren wurde festgestellt, daß es möglich ist, große Mengen an mittelgroßen Polypeptiden zu produzieren, insbesondere an PTH Produkten. In E. coli wurde festgestellt, daß bis zu etwa 50% des exprimierten Gesamtproteins das gewünschte Fusionsprotein ist. Ebenfalls, daß das Fusionsprotein Einschlußkörper bildet, die leicht vom anderen Zellmaterial zu trennen sind. Darüberhinaus bestehen die Einschlußkörper oft aus zumindest etwa 90% des gewünschten Fusionsproteins, was den erforderlichen Reinigungsaufwand deutlich reduzieren kann. Ferner kann die Expression des PTH Produkts in der Form des Fusionsproteins das endogene Prozessieren des Polypeptids in der Bakterienzelle wesentlich reduzieren, was die Erhaltung von homogenen Produkten erlaubt.
Vorzugsweise enthält der spaltbare Linker chemisch spaltbare Aminosäuren benachbart zum N-Terminus des gewünschten Polypeptids, um die Abspaltung des gewünschten Polypeptids vom Fusionsprotein durch einfache chemische Mittel zu erlauben. Vorzugsweise enthält das gewünschte Polypeptid die chemisch spaltbaren Gruppen nicht.
Bevorzugte chemisch spaltbare Linker enthalten die Aminosäuren Asp-Pro-Pro oder Asn-Gly-Pro. Die Asp-Pro oder Asn-Gly Bindungen können chemisch mittels saurer Bedingungen gespalten werden, beispielsweise jeweils Ameisensäure (normalerweise etwa pH 2,5) oder Hydroxylamin. Die Dipeptide Pro-Pro oder Gly-Pro, die am N-Terminus des gewünschten Polypeptids verbleiben, können dann durch eine geeignete Dipeptidylpeptidase entfernt werden. Beispielsweeise kann die L. lactis X-Pro-Dipeptidylpeptidase EC 3.4.14.5 verwendet werden. Diese Peptidase ist in Nardi et al, 1991, Applied and Environmental Microbiology, 57, Seiten 45 bis 50 beschrieben.
Das gewünschte Polypeptid kann nach der Abspaltung vom Fusionsprotein gereinigt werden. Hier können HPLC Reinigungstechniken verwendet werden. Die Reinigung kann vor der Entfernung von allen unerwünschten N-terminalen Aminosäureresten ausgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird ferner in den Beispielen 306 bis 312 geschildert, die sich auf Sequenzen beziehen, welche in den begleitenden Sequenzlisten angegeben sind, worin die SEQ ID Nr. 1 die Aminosäuresequenz und die entsprechende DNA Sequenz eines verkürzten gp55-Asp-Pro-Pro-hPTH(1-38)OH Fusionsproteins zeigt, wie sie in das Plasmid pET17B kloniert ist, und die SEQ ID Nr. 3 zeigt die Aminosäuresequenz und die entsprechende DNA Sequenz eines Vollängen gp55-Asn-Gly-Pro-hPTH(1-38)OH Fusionsproteins, wie es in das Plasmid pET17B kloniert ist.
In den folgenden Beispielen sind alle Temperaturen in °C angegeben. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:

BOC: = tert. Butyloxycarbonyl
DMF: = Dimethylformamid
DCM: = Dichlormethan
Fmoc: = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt: = 1-Hydroxybenztriazol
TFA: = Trifluoressigsäure
Trt: = Trityl = Triphenylmethyl
RP-HPLC: = Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie
RT: = Raumtemperatur
DNP: = Dinitrophenyl
Tos: = Tosyl
DIPC: = Diisopropylcarbodiimid
Pmc: = 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl
Ip: = Isopropyl
For: = Formyl
Cpe: = 1-Aminocyclopentan-1-carbonsäure
Cpp: = 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure
Cha: = Cyclohexylalanin
tBu: = tert. Butyl

Die SEQ ID Nr. 11 zeigt die Aminosäuresequenz von hPTH(1-34), die SEQ ID Nr. 12 zeigt die Aminosäuresequenz von hPTH(1-36), die SEQ ID Nr. 13 zeigt die Aminosäuresequenz von hPTH(1-38). Die Beispiele 1, 2, 5, 6, 11, 20–24, 27–30, 36, 37, 40, 41, 47, 49, 51, 53, 54, 57, 58, 61, 76–80, 82, 179, 185, 187, 191–193, 226, 230, 237, 239, 256 und 289 basieren auf der SEQ ID Nr. 11, die ausgetauschten Aminosäureeinheiten und ihre Position wird in den eckigen Klammern angegeben. Die Beispiele 12, 13, 18, 19, 31–35, 38, 39, 42–46, 48, 50, 52, 55, 59, 60, 62–71, 81, 83–85, 165–178, 180–184, 186, 188–190, 194–225, 227–229, 231–236, 238, 240–255, 257–266, 268–279, 282–288, 290–300 und 302–304 basieren auf der SEQ ID Nr. 12, die ausgetauschten Aminosäureeinheiten und ihre Position wird in den eckigen Klammern angegeben. Die Beispiele 3, 4, 7–10, 14–17, 25, 26, 56, 72–75, 81, 86–164, 267, 280 und 281 basieren auf der SEQ ID Nr. 13, die ausgetauschten Aminosäureeinheiten und ihre Position wird in den eckigen Klammern angegeben.
BEISPIEL 1: N^α-Isopropyl hPTH(1-34)NH₂
Dieses Peptid wird schrittweise auf einem auf Polystyrol basierenden Harzträger zusammengefügt. Die Boc-Gruppe wird zum Schutz der alpha-Aminogruppe verwendet und die funktionellen Gruppen der Seitenketten werden folgendermaßen geschützt: Lys(2-chlorbenzyloxycarbonyl), Ser(benzyl), Thr(benzyl), Glu(benzyl) Asp(benzyl), Met(O), His(DNP), Arg(Tos) und Trp(HCO). Die andereren Reste bleiben ungeschützt.
Amino-4-methylphenyl-methyl-co(polystyrol-divinylbenzol = MBHA-Harz) (0,7 mmol/g) wird dem folgenden Behandlungszyklus der Schritte (1) bis (7) unterzogen:

(1) DCM
(2) Trifluoressigsäure (50%) in DCM
(3) DCM
(4) Diisopropylethylamin (10%) in DMF
(5) DMF
(6) vorgebildetes symmetrisches Anhydrid (1,4 mmol pro g Ausgangsharz) der Boc-Aminosäure in DMF
(7) DMF

Die Volumina der Waschschritte und Reagenzien reichen von 5 bis 20 ml pro Gramm Ausgangsharz. Jeder Schritt wird so oft wie nötig wiederholt, um entweder die Reaktion des Harzes zu vervollständigen (Schritte 2, 4, 6) oder die Entfernung des vorherigen Reagenzes vom Harz (Schritte 1, 3, 5, 7) zu vervollständigen. Harzproben werden nach jedem Zyklus entnommen und auf Vollständigkeit der Kupplungsreaktion durch einen colorimetrischen Test auf verbleibende Aminogruppen mittels Ninhydrin getestet.
Kurz vor der Verwendung werden symmetrische Anhydride der Boc-Aminosäuren durch Umsetzung der Boc-Aminosäure (2,8 mmol pro g Harz) und DCCI (1,4 mmol pro g Harz) in DCM, das zur vollständigen Auflösung der Boc-Aminosäure in ausreichenden Mengen DMF enthält, hergestellt. Das Gemisch wird filtriert, mehr DMF wird zum Filtrat gegeben, das durch Verdampfen der flüchtigen Bestandteile bei einer Temperatur nicht über 15°C konzentriert wird, und die entstehde Lösung wird in Schritt (6) verwendet.
Der Reaktionszyklus (1) bis (7) wird für jede Aminosäure außer Boc-Gln-OH und Boc-Arg(Tos)-OH wiederholt, die in Schritt (6) als vorgefertigte 1-Hydroxybenztriazolester in DMF angekuppelt werden, um so die Sequenz der Titelverbindung herzustellen.
Das komplett zusammengesetzte Peptidharz wird zweimal mit 20 ml 5% Thiophenol in DMF bei Raumtemperatur für eine Stunde behandelt und mit DMF, Methanol und Dichlormethan gewaschen. Das Peptidharz wird erneut den Schritten (1) bis (5) unterzogen, gefolgt von der Zugabe von 0,5 ml Aceton, 84 mg Natriumcyanborhydrid und 0,2 ml Essigsäure in 20 ml DMF pro Gramm Harz. Nach 16 Stunden bei Raumtemperatur wird das Harz mit DMF und Dichlormethan gewaschen und getrocknet.
Das Peptidharz wird mit flüssigem HF, Dimethylsulfid, p-Kresol und Ethan-1,2-dithiol gemäß dem "niedrig-hoch" Verfahren behandelt, das beispielsweise in International Journal of Peptide and Protein Research, Band 26, Seiten 262–273 (1985) beschrieben ist. Nach Entfernung der flüchtigen Bestandteile und Waschen mit Ethyacetat wird der Rückstand mit einigen Portionen 1%iger Essigsäure extrahiert, filtriert und das Filtrat lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt wird durch wiederholte Umkehrphasenchromatographie auf einer Octadecyl-Kieselgelsäule mittels eines Gradienten aus Acetonitril in 2% Phosphorsäure oder in 20 mM Tetramethylammoniumphosphat gereinigt. Die die reine Verbindung enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, durch ein schwaches Ionenaustauscherharz in Acetatform filtiert und das Filtrat wird unter Erhaltung der Titelverbindung lyophilisiert.
MS (Ionenspray): 4160.
BEISPIEL 2: [Lys(N^∊-Isopropyl)^26,27]hPTH(1-34)NH₂
Das Peptid wird wie für Beispiel 1 beschrieben zusammengefügt, aber man verwendet Lys(Fmoc) zum Einbau in die Position 13 und Fmoc-Ser(tBu) in die endständigen Position 1.
Das vollständig zusammengefügte Peptidharz wird zweimal mit 20 ml 5% Thiophenol in DMF bei Raumtemperatur für 1 Stunde behandelt und mit DMF, Methanol und Dichlormethan gewaschen. Das trockene Harz wird mit flüssigem HF behandelt, wie dies für Beispiel 1 beschrieben ist. Das Spaltprodukt (350 mg) wird in einem Gemisch aus Methanol (5 ml), Phosphatpuffer pH = 5,0 (5 ml), Natriumcyanborhydrid (48 mg) und Aceton (0,28 ml) suspendiert. Nach 16 Stunden bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in 20%igem Piperidin in DMF für 15 Minuten suspendiert, mit 20 Volumina Ether verdünnt und filteriert. Der Rückstand wird in 100 ml Wasser und bis auf pH = 3 zugegebener Essigsäure gelöst, filtriert und das Filtrat wird lyophilisiert. Das Lyophilisat wird durch Umkehrphasenchromatographie auf einer Octadecyl-Kieselgelsäule gereinigt, indem man einen Gradienten von Acetonitril in 2% Phosphorsäure verwendet. Fraktionen, die die reine Verbindung enthalten, werden vereinigt, durch ein schwach basisches Ionenaustauscherharz in Acetatform filtriert und das Filtrat unter Erhaltung der Titelverbindung lyophilisiert.
MS (Ionenspray): 4205,6
BEISPIEL 3: N^α-Isopropyl[Lys(N^∊-Isopropyl)^13,26,27]hPTH(1-38)-OH
a) Festphasenpeptidsynthese
Das Peptid wird schrittweise auf einem Harzträger auf Polystyrolbasis synthetisiert. Die alpha-Aminogruppe wird durch Fmoc geschützt und die funktionellen Gruppen der Seitenkette sind folgende: Asp(OtBu), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Asn(Trt), Gln(Trt), Arg(Pmc) und Ser(tBu). Die anderen Aminosäuren bleiben ungeschützt. Zu 4-Hydroxymethylphenoxymethyl-co(polystyrol 1%-divinylbenzol) verestertes Fmoc-Gly, 0,5 mmol/g, wird als Ausgangsmaterial für die schrittweise Festphasensynthese verwendet, die aus repetitiven Zyklen mit Abspaltung der Schutzgruppen der alpha-Aminosäure, Waschen, Kuppeln (Anhängen der neuen Aminosäure) und Waschen bestehen. Ein drei bis fünffacher Überschuß an Fmoc-Aminosäuren in Form von vorgefertigten HOBt-Estern wird mittels DIPC gekuppelt. Fmoc-Arg(Pmc), Fmoc-Asn(Trt) und Fmoc-Gln(Trt) werden als symmetrische Anhydride mittels DIPC gekuppelt. Nach dem vollständigen Zusammensetzen der Peptidkette wird die Fmoc-Schutzgruppe von Ser¹ durch 20% Piperidin/DMF entfernt. Die Abspaltung des Peptids vom Polystyrolharz und die Entfernung aller Schutzgruppen der Seitenketten wird durch die Behandlung des Peptidharzes mit einem Gemisch aus 10% Ethandithiol, Thioanisol, Thiokresol und Wasser in 90% TFA für drei Stunden bei Raumtemperatur erreicht. Die Harzpartikel werden wegfiltriert und mit etwas TFA gewaschen. Das Produkt wird aus den vereinigten Filtraten durch die Zugabe von Ether ausgefällt, filtriert und getrocknet. Das Produkt wird dann durch Chromatographie auf einer C-18 Kieselgelsäule mittels eines Gradienten von Acetonitril in 2% H₃PO₄/Wasser gereinigt. Die die reine Verbindung enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, durch ein Anionenaustauscherharz (Biorad, AG 4-X4, 100–200 Mesh in Acetatform) filtriert und unter Erhaltung von hPTH-(1-38)-OH lyophilisiert.
b) Alkylierung
40 mg (9 μmol) hPTH-(1-38)-OH (4458,2 g/mol) werden in 1,2 ml Methanol, 1,2 ml Phosphatpuffer (Merck Nr. 9887, der auf pH 5,0 eingestellt ist), 45 mg (716 mmol) NaBH₃CN (62,84 g/mol) und 0,8 ml (11 mmol) Aceton (73,52 ml/mol) gelöst. Die Reaktion wird mittels RP-HPLC auf einer C-18 Kieselgelsäule verfolgt und ist nach 15 Stunden bei Raumtemperatur beendet. Das Reaktionsgemisch wird mit Wasser verdünnt und auf einer C-18 Kieselgelsäule mittels eines Gradienten von Acetonitril in 2% H₃PO₄/Wasser chromatographiert. Die die reine Verbindungen enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, durch ein Anionenaustauscherharz (Acetatform) filtriert und unter Erhaltung der Titelverbindung als Polyacetat, Polyhydrat lyophilisiert.
[α] 20 / D = –5,7° (c = 0,317 in 95% AcOH)
MS (Ionenspray): 4626
BEISPIEL 4: N^α-Methyl[Ala¹]PTH-(1-38)-OH
Die Peptidkette wird auf dieselbe Weise zusammengesetzt, wie in Beispiel 3a. An der Position 1 wird anstatt Fmoc-Ser(tBu)-OH die unnatürliche Aminosäure Fmoc-N^α-Methyl-Ala-OH an das Peptidharz gekuppelt. Abspaltung, Abspalten von Schutzgruppen und Reinigung werden wie in Beispiel 3a durchgeführt.
MS (Ionenspray) = 4455,91
BEISPIEL 5: [Ala¹, Ala³, Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Phe²³, His²⁵, His²⁶, Leu²⁷, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
Dieses Peptid wird in Analogie mit dem Verfahren von Beispiel 3a hergestellt. Anstatt zu 4-Hydroxymethylphenoxymethylco(polystyroldivinylbenzol) verestertes Fmoc-Gly wird die geeignete Fmoc Aminosäure, beispielsweise Fmoc-Ala, Fmoc-Phe, Fmoc-D-Ala, Fmoc-D-Phe usw. verwendet. Zusätzlich werden die funktionellen Gruppen der Seitenketten folgendermaßen geschützt: Thr(t-Butyl), Trp(Boc) und Tyr(t.-Butyl).
Durch Wiederholen des in den Beispielen 3 und 5 beschriebenen Verfahrens aber unter Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien können die folgenden Verbindungen erhalten werden.
BEISPIEL 6: [Leu⁸, Asp¹⁰, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 7: [Ile¹]hPTH(1-38)OH (IS-MS: 4484)
BEISPIEL 8: [Ala¹, Abu²]hPTH(1-38)OH (IS-MS: 4428)
BEISPIEL 9: [Ala¹, Nva²]hPTH(1-38)OH (IS-MS: 4442)
BEISPIEL 10: [Ala¹, Ile²]hPTH(1-38)OH (IS-MS: 4456)
BEISPIEL 11: [Ala¹, Ala³, Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸,Ala¹⁹, His²⁶, Leu²⁷, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 12: [N-MeAla¹]hPTH(1-36)OH (IS-MS: 4286)
BEISPIEL 13: [Ala¹, Ala³, Leu⁸, Gln¹⁸]hPTH(1-36)OH (IS-MS: 4235)
BEISPIEL 14: [Thr¹]-hPTH-(1-38)OH (IS-MS: 4472)
BEISPIEL 15: [Leu¹]-hPTH-(1-38)OH (IS-MS: 4484)
BEISPIEL 16: [Abu¹]-hPTH-(1-38)OH (IS-MS: 4456)
BEISPIEL 17: [Gaba¹]-hPTH-(1-38)OH (IS-MS: 4456)
BEISPIEL 18: [Leu⁸, Lys¹¹, Gln¹⁸]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 19: [Leu⁸, Gln¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹, Arg²²]hPTH(1-36)OH (IS-MS: 4347)
BEISPIEL 20: [Leu⁸, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]-hPTH(1-34)OH (IS-MS: 4007)
BEISPIEL 21: [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH (IS-MS: 3906)
BEISPIEL 22: [Leu⁸, Ala¹³, Gln¹⁸, Gln²⁶, Phe²⁷, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 23: Ip-[Leu⁸, Lys(Ip)¹³, Gln¹⁸, Lys(Ip)^26,27, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH (IS-MS: 4175)
BEISPIEL 24: Ip-[Leu⁸, Ala¹³, Gln¹⁸, Gln²⁶, Phe²⁷, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 25 [Gln¹⁶]hPTH(1-38)OH
BEISPIEL 26: [Ser¹⁴]hPTH(1-38)OH
BEISPIEL 27: [Ala¹, Ala³, Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, His²⁵, His²⁶, Leu²⁷, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 28: [Ala¹, Ala³, Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Gln²⁶, Phe²⁷, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 29: [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH (IS-MS: 3965)
BEISPIEL 30: [Leu⁸, Gln¹⁸, Ala²⁹, Glu³⁰, Ile³¹]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 31: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 32: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ser¹⁴, Ile¹⁵, Gln¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 33: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Leu¹⁸]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 34: [Leu⁸, Gln¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 35: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁷, Leu¹⁸]hPTH(1-36)OH (IS-MS: 4252)
BEISPIEL 36: [Leu⁸, Gln¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹, Thr³³, Ala³⁴] hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 37: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH (IS-MS: 4022)
BEISPIEL 38: [Leu⁸, Ala¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 39: [Leu⁸, Asp¹⁰, Ala¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 40: [Leu⁸, Gln¹⁸, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 41: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH (IS-MS: 4077)
BEISPIEL 42: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(1-36)OH (IS-MS: 4181)
BEISPIEL 43: [Leu⁸, Ala¹⁶, Asp¹⁷, Gln¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(1-36)OH (IS-MS: 4193)
BEISPIEL 44: [Leu⁸, Ala¹⁶, Ala¹⁷, Gln¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(1-36)OH (IS-MS: 4149)
BEISPIEL 45: [Leu⁸, Ala¹⁷, Gln¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 46: [Leu⁸, Ala¹⁷, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg²²]hPTH(1-36)OH (IS-MS: 4219)
BEISPIEL 47: [Leu⁸, Ala¹⁷, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg²², Thr³³, Ala³⁴] hPTH(1-34)OH (IS-MS: 3960)
BEISPIEL 48: [Leu⁸, Gln¹⁸]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 49: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴] hPTH(1-34)OH (IS-MS: 3980)
BEISPIEL 50: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸]hPTH(1-36)OH (IS-MS: 4240)
BEISPIEL 51: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴] hPTH(1-34)OH (IS-MS: 3923)
BEISPIEL 52: [Leu⁸, Asp¹⁰, Ala¹⁶, Gln¹⁸]hPTH(1-36)OH (IS-MS: 4225)
BEISPIEL 53: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³] hPTH(1-34)OH (IS-MS: 3999)
BEISPIEL 54: [Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, His²⁶, Leu²⁷, Thr³³] hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 55: [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg²²]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 56: [Ile¹⁵]hPTh(1-38)OH
BEISPIEL 57: [Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg²², His²⁶, Leu²⁷, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 58: [Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Arg¹⁹, His²⁶, Leu²⁷, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 59: [Leu⁸, Ser¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg²²]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 60: [Leu⁸, Ala¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg²⁶, Arg²⁷] hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 61: [Leu⁸, Gln¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, His²⁶, Leu²⁷, Arg³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 62: [Leu⁸, Ala^16,17,18,19]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 63: [Leu⁸, Ala¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Gln²⁶, Phe²⁷] hPTH(1-36)OH (IS-MS: 4127)
BEISPIEL 64: Ip-[Leu⁸, Ala¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Gln²⁶, Phe²⁷] hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 65: Ip-[Leu⁸, Lys(Ip)¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Lys(Ip)^26,27]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 66: [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(1-36)OH (IS-MS: 4166)
BEISPIEL 67: Ip-[Leu⁸, Lys(Ip)¹³, Ala¹⁶, Ala¹⁷, Ala¹⁸, Ala¹⁹, Lys(Ip)^26,27]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 68: [Aib³, Gln¹⁸]hPTH(1-36)OH (IS-MS: 4283)
BEISPIEL 69: Ip-[Leu⁸, Asp¹⁰, Lys(Ip)^11,13,26,27, Gln¹⁸] hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 70: Ip-[Leu⁸, Ser¹³, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg²², Lys(Ip)^26,27]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 71: [Leu⁸, Tyr¹⁸]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 72: [Ser³³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 73: [Thr³³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 74: [Leu³³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 75: [Gly³³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 76: [Leu⁸, His¹⁰, Gln¹⁸, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 77: [Leu⁸, Gly¹⁰, Gln¹⁸, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 78: [Leu⁸, Glu¹⁰, Gln¹⁸, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 79: [Leu⁸, Thr¹⁰, Gln¹⁸, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 80: [Leu⁸, Gln¹⁰, Gln¹⁸, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 81: [Gln³³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 82: [Leu⁸, Tyr¹⁰, Gln¹⁸, Arg²², Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH
BEISPIEL 83: [1-Aminocyclopentan-1-carbonsäure¹, Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 84: [1-Aminocyclopentan-1-carbonsäure¹, Leu⁸, Ala^13,16, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Arg^26,27]hPTH(1-36)OH
BEISPIEL 85: [1-Aminocyclopentan-1-carbonsäure³, Gln¹⁸]hPTH (1-36)OH (IS-MS: 4309)
BEISPIEL 86: [Arg¹²]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 87: [Ser¹²]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 88: [Cys¹³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 89: [Ile¹³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 90: [Asn¹³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 91: [Trp¹³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 92: [Asp¹³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 93: [Val¹³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 94: [Thr¹³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 95: [Ser¹³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 96: [Tyr¹³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 97: [Met¹³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 98: [Gln¹³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 99: [Leu¹³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 100: [Ala¹³)-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 101: [Gly¹³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 102: [Val¹⁴]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 103: [Ala¹⁴]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 104: [Lys¹⁴]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 105: [Arg¹⁴]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 106: [Thr¹⁴]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 107: [Ile¹⁴]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 108: [Tyr¹⁴]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 109: [Tyr¹⁵]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 110: [Arg¹⁵]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 111: [Val¹⁵]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 112: [Lys¹⁶]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 113: [Ser¹⁶] hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 114: [Leu¹⁶]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 115: [Ala¹⁶]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 116: [Gly¹⁶]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 117: [Ala¹⁷]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 118: [Met¹⁷]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 119: [Ile¹⁷]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 120: [Ser¹⁹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 121: [Lys¹⁹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 122: [Leu¹⁹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 123: [Ala¹⁹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 124: [Tyr¹⁹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 125: [Met¹⁹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 126: [His¹⁹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 127: [Val¹⁹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 128: [Gly¹⁹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 129: [Pro¹⁹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 130: [Asp¹⁹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 131: [Ile¹⁹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 132: [Val¹⁹, Gln²⁴]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 133: [Arg¹⁹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 134: [Phe²⁰]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 135: [Ala²¹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 136: [Gly²¹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 137: [Phe²¹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 138: [Leu²¹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 139: [Asn²¹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 140: [Gln²¹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 141: [Ser²¹]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 142: [Gly²²]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 143: [Leu²²]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 144: [His²²]-hPTH-(1-39)-OH
BEISPIEL 145: [Ala²²]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 146: [Ile²²]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 147: [Val²²]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 148: [Ser²²]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 149: [Arg²²]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 150: [Arg²⁶]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 151: [Val²⁷]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 152: [Ile²⁷]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 153: [Leu²⁷]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 154: [Arg²⁷]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 155: [Ala²⁷]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 156: [Val²⁸]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 157: [Ile²⁸]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 158: [Pro³, Thr³³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 159: [Arg³³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 160: [Pro³³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 161: [Asp³³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 162: [Ile³³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 163: [Lys³³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 164: [Ile³¹, Arg³³]-hPTH-(1-38)-OH
BEISPIEL 165: [1-Aminocyclopentan-1-carbonsäure¹]hPTH-(1-36)NH₂
Das Peptid wird schrittweise an einem auf Polystyrol basierenden Harzträger zusammengefügt. Die Fmoc-Gruppe wird zum Schutz der alpha-Aminogruppen verwendet.
Die funktionellen Gruppen der Seitenketten werden als Arg(Pmc), Asn(Trt), Asp(OtBu), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc) und Tyr(tBu) geschützt. Andere Aminosäuren bleiben ungeschützt.
4-(2'‚4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyco(polystyrol-divinylbenzol), 0,4 mmol/g, das beispielsweise wie in Tetrah. Letters, 28, 3787–3790 (1987) beschrieben hergestellt werden kann, wird dem folgenden Behandlungszyklus der Schritte (1) bis (5) unterzogen:

(1) DMF
(2) Piperidin (20%) in DMF
(3) DMF
(4) Mischung von HOBt, Diisopropylcarbodiimid und Fmoc-Alanin (jeweils 0,8 mmol pro Gramm Ausgangsharz)
(5) DMF

Die Volumina der Waschschritte und Reagenzien reichen von 5 bis 20 ml pro Gramm Ausgangsharz.
Im nächsten Behandlungszyklus (1) bis (5) wird Fmoc-Alanin durch Fmoc-Valin und so weiter bei jedem Zyklus ersetzt, um am Harz die korrekte Aminosäuresequenz der Titelverbindung zusammenzufügen.
Jeder Schritt wird so oft wie nötig wiederholt, um entweder die Reaktion des Harzes zu vervollständigen (Schritte 2, 4) oder die Entfernung des vorherigen Reagenzes vom Harz (Schritte 3, 5) zu vervollständigen. Harzproben werden nach jedem Zyklus entnommen und auf Vollständigkeit der Kupplungsreaktion durch einen colorimetrischen Test auf verbleibende Aminogruppen mittels Ninhydrin getestet.
Am Ende der Synthese wird ein letzter Zyklus durchgeführt, der nur die Schritte (1) bis (3) enthält, und das Peptidharz wird mit 2-Propanol gewaschen, dann mit einem Gemisch von Methanol und Methylenchlorid (1:1 V/V) gewaschen und sorgfältig in einem Vakuumexsikkator getrocknet.
Das Peptidharz (1 g) wird in einem Gemisch (20 ml) aus Trifluoressigsäure, Wasser und 1,2-Ethandithiol (90:5:5 V/V) für 2 Stunden bei Raumtemperatur suspendiert, die Harzpartikel werden abfiltriert und mit einem kleinen Volumen TFA gewaschen. Das Produkt wird aus den vereinigten Filtraten durch die Zugabe von Ether (20 Volumina) ausgefällt, filtriert, mit mehr Ether gewaschen und getrocknet. Der Rest wird in 2% Essigsäure gelöst, und die Lösung wird bei RT für 8 Stunden vor der Lyophilisierung stehengelassen. Das Lyophilisat wird auf einer C-18 Kieselgelsäule mittels eines Gradienten aus Acetonitril in 2% H₃PO₄ chromatographiert. Die Fraktionen werden durch analytische HPLC überprüft, und die, die die reine Verbindung enthalten, werden gesammelt, durch ein Anionenaustauscherharz in der Acetatform filtriert und unter Erhaltung der Titelverbindung als Polyacetat, Polyhydrat lyophilisiert.
Fmoc-1-aminocyclopentan-1-carbonsäure, die zur Herstellung des Peptidharzzwischenprodukts verwendet wird, kann hergestellt werden, wie dies beispielsweise durch G. Valle et al., 1988, in Can. J. Chem. 66: 2575–2582 beschrieben worden ist.
MS (Ionenspray): 4312
BEISPIEL 166: [1-(1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure)]hPTH-(1-36)NH₂
Dieses Peptid wird in Analogie zu dem Verfahren von Beispiel 165 hergestellt. Zur Herstellung des Ppetidharzzwischenprodukts verwendete Fmoc-1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure kann beispielsweise wie von M. Crisma et al. (1989) in Int. J. Biol. Macromol. 11: 345–352 beschrieben hergestellt werden.
MS (Ionenspray): 4283
Durch Wiederholung des in Beispiel 165 beschriebenen Verfahrens aber unter Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien können folgende Verbindungen erhalten werden:
BEISPIEL 167: [D-Pro¹]hPTH-(1-36)NH₂
BEISPIEL 168: [Nva¹]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 169: [N-Me-Ser¹]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 170: [Indol-2-carbonsäure¹]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 171: [Indol-3-carbonsäure¹]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 172: [Pyridin-3-carbonsäure¹]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 173: [Pyridin-2-carbonsäure¹]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 174: [Hexahydropyridazin-3-carbonsäure¹]hPTH (1-36)NH₂
BEISPIEL 175: [Morpholin-2-carbonsäure¹]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 176: [Pro¹]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 177: [Leu¹]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 178: [Ile¹]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 179: [Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)NH₂
BEISPIEL 180: [Nva⁸]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 181: [Gln¹⁸]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 182: [Tyr¹⁸]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 183: [Lys¹⁸]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 184: [Ala¹⁸]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 185: [Phe²³, His²⁵, His²⁶, Leu²⁷]-hPTH(1-34)NH₂
BEISPIEL 186: [Phe²³]-hPTH(1-36)NH₂ (IS-MS: 4247)
BEISPIEL 187: [Phe²³, His²⁵, His²⁶, Leu²⁷, Ile²⁶, Ala²⁹, Glu³⁰, Ile³¹, Thr³³, Ala³⁴]-hPTH(1-34)NH₂ (IS-MS: 3934)
BEISPIEL 188: [Ala²⁹]-hPTH(1-36)NH₂ (IS-MS: 4248)
BEISPIEL 189: [Ala³⁴]-hPTH(1-36)NH₂ (IS-MS: 4210)
BEISPIEL 190: [Gln²⁵]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 191: [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)NH₂
BEISPIEL 192: [Ala¹, His⁵, Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)NH₂
BEISPIEL 193: [Ser¹⁴, Ile¹⁵, Gln¹⁶, Asp¹⁷, Leu¹⁸, Arg¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)NH₂
BEISPIEL 194: [D-Phe³⁴, D-Ala³⁶]hPTH(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4290]
BEISPIEL 195: [Ala³]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4271]
BEISPIEL 196: [D-Ser³]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4290]
BEISPIEL 197: [D-Glu⁴]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4290]
BEISPIEL 198: [D-His⁹]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4286]
BEISPIEL 199: [Ala¹⁰]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4243]
BEISPIEL 200: [D-Asn¹⁰]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 201: [Ala¹²]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4299]
BEISPIEL 202: [Gln¹³]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4287]
BEISPIEL 203: [His¹³]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4296]
BEISPIEL 204: [Leu¹³]hPTM(1-36)NH₂ [MS(IS): 4371]
BEISPIEL 205: [Ala¹³]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4228]
BEISPIEL 206: [Ala¹³, Gln²⁶, Phe²⁷, D-Phe³⁴, D-Ala³⁶]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4249]
BEISPIEL 207: [Ala¹⁴]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4219]
BEISPIEL 208: [D-His¹⁴]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 209: [D-Asn¹⁶]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4284]
BEISPIEL 210: [Ala¹⁷hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4270]
BEISPIEL 211: [D-Ser¹⁷]hPTM(1-36)NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 212: [Ala¹⁹]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4228]
BEISPIEL 213: [D-Glu¹⁹]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 214: [Ala²¹]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4257]
BEISPIEL 215: [Ala²²]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4227]
BEISPIEL 216: [Gln²⁶]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4287]
BEISPIEL 217: [Nle²⁶]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4271]
BEISPIEL 218: [D-Lys²⁶]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 219: [Nle^8,18,27]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 220: [His²⁷]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4294]
BEISPIEL 221: [Phe²⁷]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4304]
BEISPIEL 222: [Nle²⁷]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4271]
BEISPIEL 223: [Asn²⁷]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4271]
BEISPIEL 224: [Ala²⁷]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4228]
BEISPIEL 225: [D-Gln²⁹]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4289]
BEISPIEL 226: [D-Asp³⁰]hPTH(1-34)NH₂ [MS(IS): 4118]
BEISPIEL 227: [Ala³⁰]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4241]
BEISPIEL 228: [D-Val³¹]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4290]
BEISPIEL 229: [Ala³¹]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4258]
BEISPIEL 230: [Lys³²]hPTH(1-34)NH₂ [MS(IS): 3832]
BEISPIEL 231: [D-His³²]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 232: [Ala³²]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4219]
BEISPIEL 233: [D-Asn³³]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 234: [Ala³³]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4210]
BEISPIEL 235: [NMePhe³⁴]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4301]
BEISPIEL 236: [D-Asp³⁰]hPTH(1-36)NH₂[MS(IS): 4290]
BEISPIEL 237: Ip-[Nle^8,18, Lys(Ip)^13,26,27, D-Asn³³, D-Phe³⁴] hPTH(1-34)NH₂
BEISPIEL 238: Ip-[Nle^8,18,27, Lys(Ip)^13,26]hPTH(1-36)NH₂
BEISPIEL 239: [Nle^8,18, D-Asn³³, D-Phe³⁴]hPTH(1-34)NH₂ [MS(IS): 4080]
BEISPIEL 240 [Lys(Ip)¹³]hPTH(1-36)NH₂ [MS(IS): 4331]
BEISPIEL 241: Propargyl-[A¹]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 242: [Ala⁰]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 243: [Pro⁰]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 244: Acetyl-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 245: [HyPro¹]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 246: N-Dimethyl-[Ala¹]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 247: [D-Ser¹]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 248: [Lys(For)¹]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4356]
BEISPIEL 249: [D-Glycerinsäure¹]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 250: [Asn¹]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 251: [4-Aminobenzoesäure¹]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 252: [4-Aminosalicylsäure¹]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 253: [TMSA¹]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4343]
BEISPIEL 254: [Phe¹]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 255: [Propargylglycin¹]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 256: [Ala¹, His⁵, Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸, Phe²², Phe²³, His²⁵, His²⁶, Leu²⁷, Thr³³, Ala³⁴]-hPTH-(1-34)-NH₂
BEISPIEL 257: [Abu²]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 258: [D-Val²]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 259: [tert.Leu²]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 260: [Ala¹]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 261: [D-Ile⁵]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 262: [D-Gln⁶]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 263: [D-Leu⁷]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 264: [Nle⁸]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4268]
BEISPIEL 265: [Phe⁸]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4303]
BEISPIEL 266: [Cha⁸]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4309]
BEISPIEL 267: [Leu⁸]-hPTH-(1-38)-NH₂
BEISPIEL 268: [D-Leu¹¹]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4287]
BEISPIEL 269: [Ala¹¹]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4244]
BEISPIEL 270: [3-Lys¹³]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 271: [D-Leu¹⁵]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 272: [Ala¹⁵]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4243]
BEISPIEL 273: [Ala¹⁶]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4243]
BEISPIEL 274: [Met(O₂)¹⁸]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4320]
BEISPIEL 275: [Nle¹⁸]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4268]
BEISPIEL 276: [D-Met¹⁸]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 277: [Lys²⁰]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4259]
BEISPIEL 278: [D-Arg²⁰]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 279: [D-Val²¹]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 280: [Trp(SO₂Pmc)²³]-hPTH-(1-38)-NH₂ [MS(IS): 4723]
BEISPIEL 281: [Trp(Pmc)²³]-hPTH-(1-38)-NH₂ [MS(IS): 4660]
BEISPIEL 282: [D-Trp²³]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 283: [Ala²³]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4171]
BEISPIEL 284: [D-Leu²⁴]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 285: [Phe²⁵]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4277]
BEISPIEL 286: [Lys²⁵]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4258]
BEISPIEL 287: [Ala²⁵]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4201]
BEISPIEL 288: [Ala²⁶]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4229]
BEISPIEL 289: [Lys^26/27(For)]-hPTH-(1-34)-NH₂
BEISPIEL 290: [D-Lys²⁷]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 291: [D-Leu²⁰]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 292: [D-Phe³⁴]-hPTH-(1-36)-NH₂ [MS(IS): 4288]
BEISPIEL 293: [D-Val³⁵]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 294: [Ala³⁵]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 295: [Pro³⁵]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 296: [NMeVal³⁵]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 297: [Thr³⁵, Ala³⁶]-hPTH(1-36)-NH₂
BEISPIEL 298: [D-Ala³⁶]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 299: [NMeAla³⁶]-hPTH-(1-36)-NH₂
BEISPIEL 300: (5-Amino-4-fluor-2-isopropyl)-hex-3-enoyl-hPTH-(3-36)NH₂
a) Herstellung von hPTH-(3-36)-NH-Harz
Dieses Zwischenprodukt wird in Analogie zum Verfahren von Beispiel 165 hergestellt.
b) [(5-Amino-4-fluor-2-isopropyl)-hex-3-enoyl]hPTH(3-36)-amid
204,6 mg Fmoc-hPTH(3-36)-NH-Harz, die wie in a) oben beschrieben erhalten wurden, werden für 5 Minuten mit DMF behandelt und dann einige Male mit Isopropanol und DMF gewaschen. Die Fmoc-Schutzgruppe wird durch die Behandlung mit DMF/Piperidin 8:2 für 10 Minuten entfernt. Das ungeschützte PTH-Fragment, 38,1 mg 4-Fluor-2-isopropyl-5-t.-butoxycarbonylamino-hex-3-ensäure, 68,7 mg Benztriazol-1-yloxytris(pyrrolidin)phosphoniumhexafluorphosphat (PyBOP) und 26,6 mg 4-Methylmorpholin werden für 80 Minuten in 0,7 ml DMF geschüttelt. Nach einigen Waschschritten mit Isopropanol und DMF wird der feste Rückstand mit 4,5 ml TFA/0,25 ml Wasser/0,25 ml Ethandithiol für 55 Minuten behandelt. Dieses Gemisch wird dann filtriert, und durch die Zugabe von Diethylether wird die Titelverbindung aus der verbleibenden Lösung ausgefällt. Die Titelverbindung wird durch präparative HPLC (Vydac Säule, Gradient A = Wasser, B = 7 Acetonitril/3 Wasser/0,2 Phosphorsäure) gereinigt.
MS (Ionenspray): Masse 4272
[α] Hg / 365nm = –66,8° (c = 0,25 in 95% AcOH)
BEISPIEL 301: 4-Fluor-2-isopropyl-5-tert.-butoxycarbonylamino-hex-3-enoat
a) (S)-3-(1-Oxo(4-fluor-3-hydroxy-2-isopropyl)hex-4-enyl)-4-phenylmethyl-2-oxazolidinon
Die Titelverbindung wird analog zu dem von D. A. Evans et al. in Org. Synth. 68, 1990 beschriebenen Verfahren hergestellt, indem man von (S)-3-(1-Oxoisobutyl)-4-phenylmethyl-2-oxazolidinon und 2-Fluor-but-2-enal ausgeht.
MS (FAB): MH⁺ 350
b) (S)-3-(1-Oxo(4-fluor-3-O-(2,2,2-trichlorethanimino)-2-isopropyl)-hex-4-enyl)-4-phenylmethyl-2-oxazolidinon
1,5 g der Verbindung von Beispiel 301a) werden in 6 ml DCM gelöst. Bei 0°C werden 0,0958 ml 1,8-Diazabicyclo(5,4,0)undec-7-en (DBU) zugegeben. Zu dieser Lösung werden 0,475 ml Trichloracetonitril in 2 ml DCM tropfenweise bei 0°C gegeben. Nach 1 Stunde wird das Reaktionsgemisch eingedampft und der Rückstand wird durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (Hexan/Diethylether 2:1) gereingt.
MS (FAB): MH⁺ 493
c) (S)-3-(1-Oxo(4-fluor-5-N-(2,2,2-trichloracetylamino)-2-isopropyl)-hex-3-enyl)-4-phenylmethyl-2-oxazolidinon
2 g der Verbindung von 301b) werden in 150 ml o-Xylol gelöst und unter Rückfluß bei 160°C für 3 Stunden gerührt. Dann wird o-Xylol entfernt und der Rückstand wird durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (Toluol/Ethylacetat 982) gereinigt.
MS (FAB): MH⁺ 493
d) 4-Fluor-5-N-2,2,2-trichloracetylamino-2-isopropyl-hex-3-ensäure
Die Titelverbindung wird analog dem Verfahren hergestellt, das von D.A. Evans et al., Org. Synth. 68 1990 bschrieben wurde, aber unter Verwendung der Verbindung von 301c) als Ausgangsmaterial.
MS (FAB): MH⁺ 335
e) 5-Amino-4-fluor-2-isopropyl-hex-3-ensäure
899 mg der Verbindung 301d) werden in 20 ml Ethanol gelöst und 13,5 ml 6 N Natriumhydroxidlösung werden zugegeben. Dieses Gemisch wird für 20 Stunden bei RT gerührt. Dann wird das Ethanol entfernt und die verbleibende wäßrige Fraktion wird mit 2 N HCl auf pH = 2 angesäuert und mit n-Butanol extrahiert. Der Extrakt wird eingedampft und der Rückstand wird durch Kieselgel (DCM/Methanol 1:1) unter Erhaltung der reinen Titelverbindung filtriert.
MS (FAB): MH⁺ 190
f) 4-Fluor-2-isopropyl-5-tert.-butoxycarbonylamino-hex-3-ensäure
0,56 g der Verbindung von 301e) werden in 12 ml Wasser gelöst, und 1,5 g Natriumcarbonat werden zugegeben. Zu dieser Lösung werden 0,4 g Di-tert. Butylcarbonat gegeben, die in 12 ml Tetrahydrofuran gelöst sind. Dieses Gemisch wird bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt. Dann werden 50 ml n-Butanol und 50 ml Wasser zugegeben und unter starkem Rühren wird 1 N HCl bis pH = 2 zugegeben. Die organische Fraktion wird eingedampft und der Rückstand durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (Hexan/Aceton 1:2) gereinigt.
MS (FAB): MH⁺ 290
[α]_D = –61,3° (1% in Methanol)
Durch Wiederholung der obigen Verfahren aber unter Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien werden die folgenden Verbindungen hergestellt:
4-Fluor-2-methyl-5-tert.-butoxycarbonylamino-hex-3-ensäure
4-Chlor-2-methyl-5-tert.-butoxycarbonylamino-hex-3-ensäure
4-Fluor-2-benzyl-5-tert.-butoxycarbonylamino-hex-3-ensäure
4-Chlor-2-isopropyl-5-tert.-butoxycarbonylamino-hex-3-ensäure
4-Methyl-2-isopropyl-5-tert.-butoxycarbonylamino-hex-3-ensäure
BEISPIEL 302:
Gemäß dem Verfahren des obigen Beispiels 300, aber unter Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien, können die folgenden Verbindungen hergestellt werden:

– (5-Amino-4-fluor-2-methyl)-hex-3-enoyl-hPTH(3-36)-amid MS (Ionenspray): Masse 4245
– (5-Amino-4-chlor-2-methyl)-hex-3-enoyl-hPTH(3-36)-amid MS ((Ionenspray): Masse 4260
– (5-Amino-4-fluor-2-benzyl)-hex-3-enoyl-hPTH(3-36)-amid MS (Ionenspray): Masse 4320
– (5-Amino-4-chlor-2-isopropyl)-hex-3-enoyl-hPTH(3-36)-amid MS (Ionenspray): Masse 4289
– (5-Amino-4-methyl-2-isopropyl)-hex-3-enoyl-hPTH(3-36)-amid MS (Ionenspray): Masse 4269

BEISPIEL 303:
Gemäß dem Verfahren des obigen Beispiels 300, aber unter Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien, können die folgenden Verbindungen hergestellt werden:

a) (5-Amino-3-aza-2-isopropyl)-hexanoyl-hPTH(3-36)-amid [MS (Ionenspray): 4257) unter Verwendung von (4-Aza-2-t.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)hexansäure als Ausgangsmaterial.
b) (5-Amino-3-aza-3-N-acetyl-2-isopropyl)-hexanoyl-hPTH(3-36)-amid [MS (Ionenspray): 4299] unter Verwendung von (4-Aza-4-N-acetyl-2-t.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)hexansäure als Ausgangsmaterial.
c) (5-Amino-3-aza-3-N-acetyl)-hexanoyl-hPTH(3-36)-amid [MS (Ionenspray): 4257] unter Verwendung von (4-Aza-4-N-acetyl-2-t.-butoxycarbonylamino)hexansäure als Ausgangsmaterial.
d) (5-Methylamino-3-aza-2-isopropyl)-hexanoyl-hPTH(3-36)-amid [MS (Ionenspray): 4271] unter Verwendung von [4-Aza-2-(N-t.-butoxycarbonyl,N-methylamino)-5-isopropyl]-hexansäure als Ausgangsmaterial.
e) (5-Methylamino-3-aza-3-N-methyl-2-isopropyl)-hexanoyl-hPTH -(3-36)-amid [MS (Ionenspray): 4285] unter Verwendung von [4-Aza-4-N-methyl-2-(N-t.-butoxycarbonylamino,N-methylamino)-5-isopropyl]hexansäure als Ausgangsmaterial.
f) (5-Amino-3-aza-3-N-methyl-2-isopropyl)-hexanoyl-hPTH(3-36)-amid [MS (Ionenspray): 4271] unter Verwendung von (4-Aza-4-N-methyl-2-t.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)hexansäure als Ausgangsmaterial.
g) (5-Amino-3-aza-3-N-isopropyl)-hexanoyl-hPTH(3-36)-amid [MS (Ionenspray): 4257] unter Verwendung von (4-Aza-4-N-isopropyl-2-t.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)hexansäure als Ausgangsmaterial.
h) [1-Cyclopentan-1-amino-1-carbonsäure (psi CH₂-NH)-Val²]-hPTH(1-36)-amid unter Verwendung von 1-Cyclopentan-1-t.butoxycarbonylamino-1-carbonsäure (psi CH₂-NH)-Val-OH als Ausgangsmaterial.

BEISPIEL 304:
Gemäß dem Verfahren des obigen Beispiels 3a) aber unter Verwendung des geeigneten Ausgangsmaterials kann die folgende Verbindung hergestellt werden:
(5-Amino-3-aza-2-isopropyl)-hexanoyl-[Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹]-hPTH (3-36)OH [MS (Ionenspray): 4135] unter Verwendung von (4-Aza-2-t.-butoxycarbonylamino)-hexansäure als Ausgangsmaterial.
BEISPIEL 305: (4-Aza-4-N-acetyl-2-tert.-butoxycarbonylamino)-5-isopropyl)-hexansäure
a) Methyl(4-aza-2-tert.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)-hexansäure
Boc-Ala-Val-OMe wird mit dem Lawesson-Reagenz (S. O. Lawesson, et al. Tetrahedron 1981, 37, 3635) behandelt. Das entstehende Endothiopeptid wird dann gemäß dem von F.S. Guziec et al. THL, 1990, 23–26 beschriebenen Verfahren reduziert.
MS (EI): MH⁺ 289
b) Methyl(4-aza-4-N-acetyl-2-tert.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)-hexanoat
264 mg der Verbindung von 305 a) werden in 5 ml DCM gelöst und dann werden 0,14 ml Triethylamin und 0,072 ml Acetylchlorid zugegeben. Dieses Gemisch wird für 24 Stunden bei 40°C gerührt. Nach der Zugabe von 50 ml DCM wird die Lösung zweimal mit Wasser gewaschen. Die organische Fraktion wird getrocknet und eingedampft. Die so erhaltene Titelverbindung wird durch Säulenchromatographie (Hexan/Ethylacetat 4:1) gereinigt.
MS (EI): M⁺ 330
c) 4-Aza-4-N-acetyl-2-tert.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)-hexansäure
356 mg der Verbindung von 305 b) werden in 4 ml Methanol/Wasser 3:1 gelöst, und 53 mg Lithiumhydroxid werden zugegeben. Dieses Gemisch wird bei 60°C für zwei Stunden gerührt. Dann werden 25 ml DCM zugegeben und 1 N HCl wird tropfenweise unter starkem Rühren bis pH = 2 zugegeben. Die organische Fraktion wird abgetrennt, getrocknet und eingedampft und ergibt so die Titelverbindung in reiner Form.
MS (FAB): MH⁺ 317
Durch Wiederholung des Verfahrens, aber unter Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien, können folgende Verbindungen erhalten werden:
(4-Aza-4-N-acetyl-2-tert.-butoxycarbonylamino)-hexansäure
(4-Aza-2-tert.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)-hexansäure
[4-Aza-2-(N-tert.-butoxycarbonyl,N-methylamino)-5-isopropyl]-hexansäure
(4-Aza-4-N-methyl-2-tert.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)-hexansäure
(4-Aza-4-N-isopropyl-2-tert.-butoxycarbonylamino-5-isopropyl)-hexansäure
(4-Aza-2-tert.-butoxycarbonylamino)-hexansäure
Die Verbindungen der Beispiele 1 bis 300 und 302 bis 304 zeigen die korrekten Aminosäureverhältnisse bei der quantitativen Aminosäureanalyse.
In den folgenden Beispielen, die das rekombinante Verfahren der Erfindung beschreiben, werden, falls nichts anderes angegeben ist, die in Ausubel et al., 1991, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York beschriebenen Standardverfahren verwendet.
BEISPIEL 306: Klonierung des Bakteriophagen T4 Gen 55
Zwei DNA Fragmente, eines, das die gesamte kodierende Sequenz des Bakteriophagen T4 Gen 55 enthält, und das andere Fragement, das nur einen Teil davon kodiert, werden durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mittels gereinigter T4 DNA als Template amplifiziert. Oligonukleotide, die NdeI oder BamHI Restriktionsschnittstellen enthalten, werden als Primer verwendet. Die PCR Reaktionen (25 Zyklen, jeweils 30 s 94°C, 30 s 50°C, 30 s 72°C) werden mit 1 ng Template und 100 pM des stromaufwärts liegenden Primers (SEQ ID Nr. 5, wobei die NdeI Restriktionsschnittstelle von 7–12 Nukleotiden hiervon geliefert wird) und 100 pM des stromabwärts liegenden Primers (SEQ ID Nr. 6, wobei die BamHI Restriktionsschnittstelle von 5–10 Nukleotiden hiervon geliefert wird) in 100 μl Reaktionspuffer durchgeführt, der 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, jeweils 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, und 0,1% Triton X 100 pH 9,0 enthält. Man erhält ein 0,6 kb Fragment.
Die verkürzte Form des Gen 55 wird durch PCR hergestellt, wie dies für das gesamte Gen beschrieben ist, mit dem Unterschied, daß man ein anderes Oligonukleotid als stromabwärts liegenden Primer verwendet (SEQ ID Nr. 7, wobei die BamHI Schnittstelle durch die Nukleotide 5–10 hiervon geliefert wird). Man erhält ein 0,35 kb Fragment.
Die 0,6 kb und 0,35 kb DNA Fragmente werden mit den Restriktionsendonukleasen NdeI/BamHI verdaut und in den NdeI/BamHI verdauten Expressionsvektor pET17B (erhalten von Novagen) kloniert. Das 0,6 kb DNA Fragment kodiert das gesamte gp55 Protein (188 Aminosäurereste – siehe SEQ ID Nr. 1), während das 0,35 kb Fragment ein aminoterminales 12 kD Fragment von gp55 kodiert (112 Aminosäurereste – siehe SEQ ID Nr. 3)
BEISPIEL 307: Herstellung und Klonierung der DNA, die hPTH(1-38)OH kodiert
Durch PCR werden DNA Fragmente erzeugt, die a) das den Aminosäureresten 110–115 der SEQ ID Nr. 1 und hPTH (1-38) entsprechende Linkerpeptid oder b) das den Aminosäureresten 186–191 der SEQ ID Nr. 3 und hPTH (1-38) entsprechende Linkerpeptid kodieren, indem man eine klonierte synthetische für PTH (1-38) kodierende Sequenz als Template verwendet. Die den Linker a) (SEQ ID Nr. 8) oder den Linker b) (SEQ ID Nr. 9) kodierenden Oligonukleotide werden als stromaufwärts liegende Primer verwendet. Der stromabwärts liegende Primer ist als SEQ ID Nr. 10 gezeigt. Die stromaufwärts liegenden Primer enthalten jeweils eine BamHI Klonierungsstelle und die stromabwärts liegenden Primer enthalten eine XhoI Schnittstelle (Nukleotide 5–10 jeder Sequenz). Die PCR Reak tion wird unter denselben Bedingungen durchgeführt, wie sie in Beispiel 306 beschrieben sind.
Nach der Spaltung mit BamHI und XhoI werden die 0,23 kb PCR Produkte in die BamHI-XhoI Verdaus der gp55-pET17B Plasmide inseriert, welche in Beispiel 306 erhalten wurden.
Zur Expression der Fusionsproteine werden die entstehenden Plasmidkonstrukte in E. coli BL21 (DE3) Lys E transformiert, und ferner werden bakterielle Einzelkolonien erzeugt. Die Expression der Fusionsproteine wird durch Inkubation einer Vorkultur bei 37°C auf einem Rundschüttler über Nacht in "Circle" Wachstumsmedium (Bio 101) erhalten. Eine Hauptkultur wird mit 1 bis 5% des Hauptkulturvolumens mit der Vorkultur angeimpft. Die Hauptkultur wird dann bei einer Temperatur von 37°C und einem pH von 6,9 bis 7,1 fermentiert, während sie mit 10 l/min belüftet wird und bei 200–400 U/min geschüttelt wird. Die Expression wird durch die Zugabe von 1 mM IPTG induziert, sobald die Kultur eine OD₅₅₀ von etwa 1,0 bis 5,0 erreicht hat. Nach der Induktion wird die Fermentation für fünf Stunden fortgesetzt, und dann wird die Fermentationsbrühe ohne Abtötung der E. coli Zellen geerntet. Die geernteten Zellen werden mit einer Rohrzentrifuge zentrifugiert, in Probenpuffer resuspendiert und auf Expression durch SDS PAGE getestet. Das Zellpellet wird dann bis zur Reinigung eingefroren. Die verwendeten Verfahren und die Wirtszellen sind vollständig in Studier et al, 1990, "Use of T7 RNA Polymerase to direct Expression of Cloned Genes", Methods in Enzymology, Academic Press, Seiten 60 bis 89 beschrieben.
BEISPIEL 308: Herstellung von Einschlußkörpern
Eingefrorene E. coli Pellets, die von Beispiel 307 erhalten wurden, werden 25%ig G/V in Puffer A (50 mM Tris pH 8,0, das 2 mM DTT, 5 mM Benzamidin-HCl, 1,5 mM MgCl₂, 1,0 mM MnCl₂, 10 μg/ml DNAse 1 und 2 mg/ml Lysozym enthält) resuspendiert und durch Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur gemischt. Die resuspendierten Zellen werden lysiert, indem man sie durch einen Manton-Gaulin Homogenisator (2 Durchläufe bei 1 200 bar) durchlaufen läßt und das entstehende Lysat auf Eis hält. Das Lysat wird zweifach mit eiskaltem Puffer B (50 mM Tris pH 8,0, das 2 mM DTT, 5 mM Benzamidin-HCl und 4 mM EDTA enthält) verdünnt und für 30 min bei 27 500 g zentrifugiert.
Der Überstand aus der Zentrifuge wird sorgfältig abgehoben und verworfen. Das Pellet wird in Puffer B 25%ig G/V resuspendiert, einmal mehr durch den Manton-Gaulin durchgelassen und wie vorher zentrifugiert. Dieses Verfahren wird einmal unter Verwendung von Puffer B und einmal mit Wasser wiederholt. Die entstehenden Einschlußkörperpellets werden gewogen und bei –20°C eingefroren, bis sie benötigt werden.
BEISPIEL 309: Auflösung und Spaltung der gp55-Asp-Pro-Pro-(1-38)hPTH-OH Einschlußkörper
Eingefrorene gp55-Asp-Pro-Pro-(1-38)hPTH enthaltende Einschlußkörper, wie sie in Beispiel 308 erhalten wurden, werden in 10 mM HCl Säurelösung (analytischer Reinheitsgrad) in einer Endkonzentration von 6% G/V suspendiert. Die Lösung wird für 24 Stunden bei 50°C inkubiert und die Reaktion wird durch die Zugabe von 1 Volumen wäßriger 100 mM NaOAc Lösung beendet. Der verdünnte Überstand wird durch Zentrifugation bei 27 500 g für 30 Minuten geklärt und durch einen Glasfiberfilter filtriert.
BEISPIEL 310: Auflösung und Spaltung von gp55-Asn-Gly-Pro-(1-38)hPTH Einschlußkörpern
Eingefrorene gp55-Asn-Gly-Pro-(1-38)PTH enthaltende Einschlußkörper, die aus Beispiel 308 erhalten wurden, werden in 6 M Guanidin-HCl (das 2 M Hydroxylamin-HCl enthält und auf pH 9,0 durch Zugabe von 4,5 M LiOH gebracht wurde) unter Bildung von abgeschätzten 5 mg/ml Protein gelöst. Der pH wird erneut auf pH 9 durch weitere Zugabe von LiOH eingestellt und die Lösung wird für 4 Stunden bei 45°C inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von Ameisensäure auf pH 4 beendet und die Lösung wird wie in Beispiel 309 beschrieben zentrifugiert und filtriert.
BEISPIEL 311: Präparative HPLC von Gly-Pro und Pro-Pro(1-38)hPTH
Filtrierte Überstände aus der Spaltung werden auf einer analytischen Umkehrphasen HPLC (Orpogen HD-Gel-RP-7s-300, 4 × 150 mm Säule) analysiert und mit einem bekannten (1-38)PTH Standard (Bachem) verglichen, um die PTH Konzentration zu bestimmen. Die Säule wird mit 85% HPLC Puffer A (90% Wasser, 10% Acetonitril, worin 0,1% V/V TFA enthalten sind) und 15% HPLC Puffer B (10% Wasser, 90% Acetonitril, worin 0,1% TFA enthalten sind) äquili briert und mit einem Gradienten von 15% HPLC Puffer B bis 100% HPLC Puffer B über 15 Minuten bei einer Flußrate von 0,75 ml/min eluiert.
In Abhängigkeit von der Größe der Präparation werden die Überstände entweder auf eine 1,0 × 25 cm C4 Vydac oder eine 2,2 × 25 cm C4 Vydac aufgetragen. Die Säulen werden mit 85% HPLC Puffer A und 15% HPLC Puffer B bei Flußraten von jeweils 4 ml/min und 10 ml/min äquilibriert. Die Säulen werden mit Gradienten von jeweils 15% B bis 85% B über 80 ml und 15% B bis 55% B über 300 ml eluiert.
Die Gly-Pro-hPTH(1-38) oder Pro-Pro-hPTH(1-38) Peaks werden per Hand gesammelt und das Acetonitril wird später unter Vakuum entfernt. Die analytische HPLC wird verwendet, um sowohl die Peptidkonzentration nach der Spaltung als auch in den gesammelten Fraktionen zu bestimmen.
Die Lösemittel-freien Peptidlösungen werden mit einem gleichen Volumen 100 mM Natriumacetat verdünnt und der pH wird, falls erforderlich, auf pH 5,4 eingestellt. Nach der Filtration (0,2 μm) wird die Lösung auf eine Kationenaustauschersäule (entweder Mono S oder SP-Sepharose High Performance, die jeweils in HR10/10 oder XK16/10 Säulen gepackt sind) aufgetragen, die mit 50 mM Natriumacetat pH 5,4 (Puffer C) äquilibriert ist. Die Säule wird mit einem NaCl Gradienten von 0 bis 500 mM in Puffer C über 7,5 Säulenvolumina eluiert. 10 ml Fraktionen werden gesammelt und der X-X-(1-38)hPTH Peak wird vereinigt. Die Peptidkonzentration wird vor der Verwendung der HPLC bestimmt.
Diese Säule dient sowohl dem Wechsel der Peptide in einen physiologischeren Puffer als auch der Entfernung der zusätzlichen Peptide, die durch die chemische Spaltung des Fusionsproteins an sich gebildet wurden.
BEISPIEL 312: Enzymatische Entfernung von X-X aus X-X-(1-38) hPTH-OH
Vereinigte Peptidfraktionen, wie sie in Beispiel 311 erhalten wurden (Konzentrationsbereich 1,5–2,0 mg/ml), werden auf pH 8,0 durch die Zugabe von festem Tris gebracht. Gereinigte X-Prolyl Dipeptidase (0,5 mg/ml in PBS pH 7,2) (Nardi et al. (1991) App. Env. Microbiol. 57, Nr. 1, 45–50) wird 1:1 000 zugegeben und die Lösung wird für 24 h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von TFA bis 0,2% (pH = 5,0) gestoppt und die entstehende (1-38)PTH wird mittels HPLC (unter Verwendung derselben Bedingungen wie in Beispiel 6 beschrieben) isoliert. Das Lösemittel wird entfernt und das Produkt wird nach der Enfernung von Aliquots für die N-terminale Sequenz- und Massenspektroskopieanalyse lyophilisiert.
Beispiele für Ausbeuten, wie sie mittels der zwei oben beschriebenen Fusionsproteinansätze erhalten werden, sind folgende:
Gen55-Asp-Pro-Pro-hPTH(1-38)OH (mittels der "verkürzten" Form des Gen55)
Unter teilweise optimierten Fermentationsbedingungen wird ein Zellpellet mit 215 g Naßgewicht aus einer 10 Liter Fermentation erhalten. Der prozentuale Anteil der Expression des Fusionsprodukts liegt bei etwa 37%. Aus diesem Pellet werden 31 g Einschlußkörper isoliert. Die Proteinreinheit (in Bezug auf das Fusionsprotein) dieser Körper beträgt 61%. Nach der Auflösung, Spaltung und Zentrifugation/Filtration werden etwa 620 mg Pro-Pro-PTH detektiert. Dieses Material ergibt 580 mg Pro-Pro-PTH nach der anschließenden C4-Vydac HPLC. Nach Verdünnung, Kationenaustausch auf Mono S, Verdau mit X-Prolyldipeptidylpeptidase (bei einer Pro-Pro-PTH Konzentration von 2 mg/ml), HPLC und Lyophilisierung, werden 440 mg des lyophilisierten reinen Produkts mit voller biologischer Aktivität erhalten. Dies stellt eine Ausbeute von 71% zwischen dem abgestoppten Spaltungsschritt und dem Endprodukt dar.
Gen55-Asn-Gly-Pro-hPTH(1-38)OH (mittels der "langen" Form des Gen55)
Aus einer nicht-optimierten 20 Liter Fermentation wird ein Zellpellet mit 78 g Naßgewicht mit 50%iger Expression des Fusionsproteins geerntet. Nach der Lyse und Zentrifugation werden 18 g an "90% reinen" Einschlußkörpern erhalten. Anschließend an den sauren Stoppschritt und die Zentrifugation/Filtration werden etwa 470 mg Gly-Pro PTH detektiert. Nach einer HPLC auf C4 Vydac werden etwa 355 mg des Peptids detektiert, die sich auf 321 mg nach dem SP-Sepharose Kationenaustausch reduzieren. Die enzymatische Entfernung der Gly und Pro Reste wird bei 2 mg/ml ausgeführt. Nach dem letzten HPLC Schritt und der Lyophilisierung werden 244 mg reines voll biologisch aktives HPTH(1-38)OH gewonnen, was eine Ausbeute von 52% vom Reaktionsschritt der abgestoppten Spaltung aus darstellt.
Die Verbindungen der Beispiele 25, 26, 56 und 86 bis 164 werden ebenfalls durch das Verfahren der Beispiele 306 bis 312 hergestellt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen in freier Form oder in Form von pharmazeutisch annehmbaren Salzen und Komplexen zeigen wertvolle pharmakologische Eigenschaften, wie sie in Tierversuchen deutlich wurden und sind daher in der Therapie indiziert.
Die biologische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird in vitro durch die Messung ihrer Fähigkeit zur Stimulierung der cyclischen AMP Synthese in Ratten UMR 106-06 und humanen SaOS-2 Osteosarcomzellen gemäß dem Verfahren von Marcus und Aurbach in Endocrinology, 85, 801–810 (1969) ermittelt. Ratten UMR 106 Osteosarcomzellen werden in Eagle's Minimum Essential Medium – 10% FCS in 12 Loch Platten bis zum Zellrasen gezogen, und humane SaOS-2 Osteosarcomzellen werden in McCoy's 5A Medium – 10% FCS gezogen. Das Medium wird dann durch ein Medium mit 2% FCS ersetzt und 1–5 μCi/Probenloch [3H]-Adenin wird zugegeben. Zwei Stunden später werden die Zellen zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen und in DMEM – 1% RSA inkubiert, das 1 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin enthielt, um Wirkungen aufgrund von Phosphodiesterasen auszuschließen. 20 Minuten später werden die Testsubstanzen zugegeben. Die Reaktion wird gestoppt und das cAMP 15 Minuten durch Zugabe von eiskalter 5%iger Trichloressigsäure extrahiert. Eine Trägerlösung (0,5 ml/Probenloch) wird zugegeben, die 5 mM unmarkiertes Adenin, Adenosin, AMP, ADP, ATP und cAMP wie auch 0,4 μCi [14C]-Adenosin zur Bestimmung der Ausbeute enthält. [3H]-cAMP wird mittels in Serie geschalteter Dowex 50W-X4 (200–400 Mesh) und Aluminiumoxid Chromatographie abgetrennt und ausgezählt. Die Ergebnisse werden in % der Lösemittelkontrolle und der aus DRC Kurven bestimmten EC₅₀ Werte errechnet. Die erfindungsgemäßen Verbindungen stimulieren die cAMP Bildung in Ratten UMR 106-06 und humanen SaOS-2 Osteosarcomzellen bei einer Konzentration von 10^–11 bis 10^–6 M.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen auch Bindungsaf finität an PTH Rezeptoren auf, wie es sich aus folgendem Versuch ergibt:
[Tyr³⁶]PTHrP(1-36)amid aus dem Huhn wird mit einer Spezifischen Aktivität von 2 200 Ci/mmol durch das Lactoperoxidaseverfahren (Anawa Lab. AG, Wangen) iodiert. Einschichtige Zellagen von Opossumnierenzellen werden mit 200 μl DMEM und HAM's F12 (1:1) gewaschen, worin 1% RSA enthalten sind, und bei 16°C mit 50 000 cpm an [¹²⁵I-Tyr³⁶]chPTHrP(1-36)amid pro Probenloch in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 μM [Tyr³⁶]chPTHrP(1-36)amid inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen mit 0,5 ml Medium (4°C) gewaschen, mit 0,5 ml 1 N NaOH lysiert und die Radioaktivität wird bestimmt. Die spezifische Bindung wird als Gesamtbindung abzüglich der unspezifischen Bindung definiert. Die Kompetitionskurven werden durch SCTFIT, einem Computerprogramm mit nicht-linearer Regression analysiert (Feyen et al, 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 8–13) und die Daten werden als mittlere pK_D Werte (n = 2 bis 3) dargestellt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen in diesem Test eine als mittlerer pK_D Wert ausgedrückte Bindungsaffinität von 7 bis 10.
Ferner erhöhen die erfindungsgemäßen Verbindungen Plasmacalciumspiegel nach kontinuierlicher s. c. Infusion, wie dies beispielsweise in männlichen tyreoparathyreoidektomiesierten Wistar Ratten bestimmt wurde, die 140 bis 170 g wogen. 5 Tage nach der Tyreoparathyreoidectomie implantiert man den Ratten im Genick Alzet-Minipumpen und infundiert die Testverbindungen in Mengen von 0,3 bis 30 μg/Tag/Ratte. Durch retroorbitale Punktion am Morgen der Tage 1, 2, 3 und 6 wird hiernach Blut entnommen und die Plasmacalciumkonzentrationen werden photometrisch bestimmt. In diesem Test erhöhen die erfindungsgemäßen Verbindungen das Plasmacalcium.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind demnach zur Verhin derung oder zur Behandlung von allen Knochenzuständen indiziert, die mit erhöhtem Calciumverlust oder erhöhte Calciumresorption zusammenhängen, oder bei denen eine Calciumfixierung in den Knochen wünschenswert ist, beispielsweise unterschiedlich entstandene Osteoporose (beispielsweise juvenil, menopausal, post-menopausal, post-traumatisch, durch hohes Alter oder Corticosteroidtherapie oder Inaktivität verursacht), Frakturen, Osteopathie, einschließlich akuten und chronischen Zuständen, die mit Skelettdemineralisierung zusammenhängen, Osteomalacie, periodontaler Knochenverlust oder Knochenverlust durch Arthritis oder Osteoarthritis oder zur Behandlung von Hypoparathyreoidismus.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen "sind" insbesondere für die Prävention oder Behandlung von unterschiedlich entstandener Osteoporose indiziert.
Für alle obigen Verwendungen liegt eine indizierte tägliche Dosierung im Bereich von etwa 0,003 bis etwa 10 mg, vorzugsweise 0,003 bis 3, noch bevorzugter 0,01 bis 1 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können einmal am Tag oder bis zu zweimal pro Woche verabreicht werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in freier Form oder in pharmazeutisch annehmbarer Salzform oder als Komplexe verabreicht werden. Solche Salze und Komplexe können auf herkömmliche Weise hergestellt werden und entsprechen größenordnungsmäßig der Wirkung der freien Verbindungen. Die vorliegende Erfindung liefert auch eine pharmazeutische Zuammensetzung, die eine erfindungsgemäße Verbindung in freier Basenform oder in pharmazeutisch annehmbarer Salzform oder Komplexform zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungmittel oder Träger enthält. Solche Zusammensetzungen können auf herkömmliche Weise formuliert werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch jeden herkömmlichen Weg verabreicht werden, parenteral, beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen oder Suspensionen, enteral, beispielsweise oral, wie in Form von Tabletten oder Kapseln, oder transdermal, nasal oder in Zäpfchenform.
Gemäß dem Vorangegangenen liefert die vorliegende Erfindung ferner:

a) eine erfindungsgemäße Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmares Salz oder einen Komplex hiervon zur Verwendung als Pharmazeutikum,
b) ein Verfahren zur Verbesserung der Knochenbildung, beispielsweise Prävention oder Behandlung von allen Knochenzuständen, die mit erhöhtem Calciumverlust oder erhöhter Calciumresorption zusammenhängen oder bei denen eine Calciumfixierung in den Knochen wünschenswert ist, beispielsweise bei unterschiedlich entstandener Osteoporose (beispielsweise juvenil, menopausal, post-menopausal, post-traumtisch, durch hohes Alter oder Corticosteroidtherapie oder Inaktivität verursacht), Frakturen, Osteopathie, einschließlich akuten und chronischen Zuständen, die mit Skelettdemineralisierung zusammenhängen, Osteomalacie, periodontalem Knochenverlust oder Knochenverlust durch Arthritis oder Osteoarthritis, oder zur Behandlung eines Hypoparathyreoidioms bei einem behandlungsbedürftigen Patienten, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon an einen solchen Patienten,
c) eine erfindungsgemäße Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder einem Komplex hiervon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die bei dem unter b) genannten Verfahren verwendet werden kann.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemäßen Verbindungen als Zusatz oder Adjuvans bei einer anderen Therapie verwendet werden, beispielsweise einer Therapie, die einen Knochenresorptionshemmstoff verwendet, wie beispielsweise in der Osteoporosetherapie, insbesondere einer Therapie, die Calcium, Calcitonin oder ein Analogon oder Derivat hiervon verwendet, beispielsweise Lachs-, Aal- oder humanes Calcitonin, ein Steroidhormon, beispielsweise ein Östrogen, ein partieller Östrogenagonist oder eine Östrogen-Gestagen Kombination, ein Biphosphonat, Vitamin D oder ein Analogon hiervon, oder jede Kombination hiervon.
Wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kombination verabreicht werden, beispielsweise als Adjuvans bei der Therapie der Knochenresorptionshemmung, werden die Dosierungen für den mitverabreichten Hemmstoff natürlich variieren in Abhängigkeit vom verwendeten Hemmstoffmittel, beispielsweise ob es ein Steroid oder Calcitonin ist, vom zu behandelnden Zustand, ob es eine heilende oder präventive Therapie ist, vom Verabreichungsplan und so weiter.
Gemäß dem Vorangegangenen liefert die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt:

d) ein Verfahren zur Verbesserung der Knochenbildung, beispielsweise Prävention oder Behandlung des Calciumverlustes, wie aller zur Prävention oder Behandlung der vorher angeführten spezifischen Zustände oder Krankheiten, bei einem behandlungsbedürftigen Patienten, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch die Verabreichung einer wirksamen Menge von a) einer erfindungsgemäßen Verbindung und b) einer zweiten Arzneimittelsubstanz an diesen Patienten, wobei diese zweite Arzneimittelsubstanz ein Knochenresorptionshemmstoff ist, wie er beispielsweise oben erwähnt wurde.

Die Verbindungen der Beispiele 20, 29, 37, 49 und 50 sind bevorzugt.

Claims

Verbindung der Formel I Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R₁-His-R₂-R₃-Gly-R₄-His-Leu-R₅-R₆-R₇-R₈-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-R₉-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-R₁₀-R₁₁-(R₁₂)_n-X, worin R₁ für Met oder Leu steht; R₂ für Asn, Asp, Gly, Gln, Glu, His, Ser, Thr oder Tyr steht; R₃ für Leu oder Lys steht; R₄ für Lys oder D- oder L-Ala, -Cys, -Gln, -Ile, -Asn, -Trp, -Asp, -Val, -Thr, -Ser, -Tyr, -Met, -Leu oder -Gly steht; R₅ für Asn, Gln, D-Gln oder D- oder L-Lys, -Ser, -Leu, -Ala oder -Gly steht; R₆ für Ser, Asp, Ala, Glu, Gln, Phe, His, Ile oder Lys steht; R₇ für Gln steht; R₈ für Glu, Arg, Ala, Val, Tyr, Ser, Lys, Met, His, Gly, Pro, Asn oder Ile steht; R₉ für Lys, Gln oder Arg steht; R₁₀ für Asn, Thr, D-Thr oder D- oder L-Ser, -Leu, -Gly, -Gln, -Arg, -Pro, -Asp, -Ile oder -Lys steht; R₁₁ für Phe oder Ala steht; R₁₂ für Val, Val-Ala, Val-Ala-Leu oder Val-Ala-Leu-Gly steht; n für 0 oder 1 steht; und X für OH, OR_a, NH₂ oder NR_bR_c steht, worin R_a für C₁-C₄Alkyl steht, eines von R_b und R_c für H steht und das andere für C₁-C₆Alkyl steht, die Verbindung wahlweise zumindest einen Rest umfasst, der ausgewählt ist aus einer L- oder D-α-Aminosäure, C₂-C₆Alkoxycarbonyl und wahlweise substituiertem C₁-C₈Alkyl, C₂-C₈Alkenyl, C₂-C₈Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C₃-C₆Cycloalkyl-C₁-C₄-alkyl und an die terminale Aminogruppe gebunden ist, und/oder die Verbindung wahlweise zumindest einen Rest ausgewählt aus C₂-C₆Alkoxycarbonyl und wahlweise substituiertem C₁-C₈Alkyl, C₂-C₈Alkenyl, C₂-C₈Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C₃-C₆Cycloalkyl-C₁-C₄-alkyl an eine oder mehrere Seitenkettenaminogruppen der Verbindung gebunden umfasst, in freier Form oder in Salz- oder Komplexform.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R₁₀ für Thr steht.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin R₁₁ für Ala steht.
Verbindung ausgewählt aus [Leu⁸, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴] [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹⁰, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸]hPTH [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹]hPTH [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]hPTH [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶ _, Gln¹⁸, Ala¹⁹]hPTH [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH und [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH worin die Verbindung wahlweise zumindest einen Rest umfasst, der ausgewählt ist aus einer L- oder D-α-Aminosäure, C₂-C₆Alkoxycarbonyl und wahlweise substituiertem C₁-C₈Alkyl, C₂-C₈Alkenyl, C₂-C₈Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C₃-C₆Cycloalkyl-C₁-C₄-alkyl und an die terminale Aminogruppe gebunden ist, und/oder zumindest einen Rest umfasst, der ausgewählt ist aus C₂-C₆Alkoxycarbonyl und wahlweise substituiertem C₁-C₈Alkyl, C₂-C₈Alkenyl, C₂-C₈Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C₃-C₆Cycloalkyl-C₁-C₄-alkyl und an eine oder mehrere Seitenkettenaminogruppen der Verbindung gebunden ist, in freier Form oder in Salz- oder Komplexform.
Verbindung ausgewählt aus [Leu⁸, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]1-hPTH(1-34)OH [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸]hPTH(1-36)OH [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(1-36)OH [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Thr³³, Ala³⁴]hPTH(1-34)OH [Leu⁸, Asp¹⁰, Lys¹¹, Ala¹⁶, Gln¹⁸]hPTH(1-36)OH, and [Leu⁸, Ala¹⁶, Gln¹⁸, Ala¹⁹]hPTH(1-36)OH in freier Form oder in Salz- oder Komplexform.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche in an sich bekannter Weise, worin ein Fusionsprotein, das ein N-terminales T4-Bakteriophagengen-55-Polypeptid mit der gewünschten Verbindung an den C-Terminus hiervon gebunden umfasst, in bakteriellen Zellen exprimiert wird, und erforderlichenfalls ein 2-Alkoxycarbonyl oder wahlweise substituiertes C₁-C₈Alkyl, C₂-C₈Alkenyl, C₂-C₈Alkinyl, Aralkyl, Aralkenyl oder C₃-C₆Cycloalkyl-C₁-C₄-alkyl an die terminale Aminogruppe und/oder eine Seitenkettenaminogruppe der Verbindung in geschützter oder ungeschützter Form eingeführt wird und erforderlichenfalls die in der geschützten Form vorkommende Schutzgruppe entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Fusionsprotein einen chemisch spaltbaren Linker zwischen dem Gen 55 und der gewünschten Verbindung enthält.
Verfahren nach Anspruch 7, worin der spaltbare Linker die Aminosäuresequenzen Asp-Pro-Pro oder Asn-Gly-Pro umfasst.
Nukleotidsequenz, die für ein Fusionsprotein kodiert, das ein N-terminales T4-Bakteriophagengen-55-Polypeptid und eine gewünschte Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 an den C-Terminus hiervon gebunden umfasst.
Bakterieller Expressionsvektor, der eine DNA Sequenz nach Anspruch 9 umfasst.
Bakterielle Wirtszellen, die mit einer DNA Sequenz nach Anspruch 9 oder einem bakteriellen Vektor nach Anspruch 10 transformiert sind.
Fusionsprotein, das ein N-terminales T4-Bakteriophagengen-55-Polypeptid und eine gewünschte Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 an den C-Terminus hiervon gebunden umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in freier Form oder in pharmazeutisch annehmbarer Salzform zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger hierfür enthält.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in freier Form oder in pharmazeutisch annehmbarer Salzform als Pharmazeutikum.
Verwendung nach Anspruch 14 zur Verbesserung der Knochenbildung.
Verwendung nach Anspruch 14 zusammen mit einem Knochenresorptionsinhibitor zur Verbesserung der Knochenbildung.