DD256704A1 - Verfahren zur herstellung von x hoch 2-d-s-ethyl-penicillamin hoch 6-lh-rh-analoga - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines LH-RH-Analogons der allgemeinen Formel pGlu-X-Trp-Ser-Tyr-D-S-Et-Pen-Leu-Arg-Pro-GlyNH212345678910worinX:- D-Phenylalanin- D-Tryptophan- D-TyrosinD-S-Et-Pen:- D-S-Ethyl-Penicillaminbedeuten oder ein nichttoxisches, pharmazeutisch verwendbares Salz hiervon, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Aufbau entweder schrittweise am polymeren Traeger vorgenommen wird oder dass synthetisierte Fragmente miteinander verbunden werden, wobei vorzugsweise die Fragmente 1 bis 3 und 4 bis 10 am polymeren Traeger synthetisiert werden, das Fragment 1 bis 3 vom Traeger abgeloest und mit der am Traeger gebundenen Sequenz 4 bis 10 gekuppelt wird. Die Herstellung des Fragmentes 1 bis 3 kann auch nach der konventionellen Methodik erfolgen. Das neue LH-RH-Analogon findet auf Grund seines antagonistischen Charakters und als Inhibitor des LH-RHs Anwendung in der Human- und Veterinaermedizin.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von X²-D-S-Ethyl-penicillamin⁶-LH-RH-Analoga, bei denen X verschiedene D-Aminosäuren, vorzugsweise D-Phenylalanin, bedeutet. Die erfindungsgemäß hergestellten LH-RH-Analoga besitzen antagonistischen Charakter und stellen als Inhibitoren des LH-RH's auf Grund ihrer antiovuiatorischen Aktivität die Grundlage für Kontrazeptiva dar. Auch ein therapeutischer Einsatz (z. B. bei Endometriose, frühzeitiger Pubertät, Symptome der Postmenopause wie auch bei der Tumorbehandlung) ist gegeben.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, daß LH-RH und seine Analoga sowohl konventionell als auch am polymeren Träger nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden können. Entsprechende Angaben sind im DD 135078 enthalten.

Ziel der Erfindung

Auf Grund der zunehmenden Bedeutung, die Verbindungen mit antiovulatorischer und kontrazeptiver Aktivität erlangen, besteht ein beträchtliches Interesse an der Herstellung neuer Verbindungen mit im Vergleich zu bisher bekannten Produkten verbesserten Eigenschaften hinsichtlich Wirkung und möglichen Nebenwirkungen. Eine Annäherung an dieses Ziel konnte durch Entfernung des Histidins in Position 2 oder durch die selektive Modifikation bzw. selektiven Ersatz von Aminosäurerestern des LH-RH durch andere Aminosäuren erreicht werden.

Wenn sich auch in den meisten Fällen modifizierte Peptide als weniger aktiv erwiesen haben, so ergab jedoch die Substitution desHistidinrestesinder2-Stellung von LH-RH durch D-Aminosäuren-Analoga mit antagonistischer Wirkung. Bei zusätzlicher Substitution des Glycinrestes in Position 6 durch D-Aminosäuren entstehen Verbindungen mit einer weiter verstärkten antiovuiatorischen und kontrazeptiven Aktivität.

CY. Bowers und K.Folkers: Biochem. Biophys. Res. Commun.72,1003 (1976). J.Rivieret al: „Peptides 1976", A. Loffet Ed., Editions del' Universite de Bruxelles, Brussels 1977,427.

D.H.Coy und A.V. Schally: Annals Clinical Res. 10,139 (1978).

D.H.Coy und N.Branyas: Int. J. Peptide Protein Res. 14,339(1979)

Das Ziel der Erfindung ist es, ein LH-RH-Analogon zu finden, das eine starke antagonistische Wirksamkeit aufweist und die Grundlage für einen Einsatz in der Human- und Veterinärmedizin darstellt.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein LH-RH-Analogon herzustellen, das antagonistischen Charakter besitzt und als Inhibitor des LH-RH's antiovulatorische Aktivität aufweist. Derartige Eigenschaften besitzen eine sehr große praktische Bedeutung, da ein Einsatz solcher Verbindungen als Kontrazeptiva sich als sehr wirksam erweisen. Außerdem besitzen sie Vorteile gegenüber den bisher verwendeten Kontrazeptiva auf Steroidbasis, da sie auf Grund ihrer peptidischen Natur als körpereigen anzusehen sind

Die Auswahl der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgte aus Verbindungen folgender Formel:

pGlu-X-Trp-Ser-Tyr-D-S-Et-Pen-Leti-Arg-Pro-GlyNHz X 2 J_ "> 4 5 6 1_._.8 9 10

X= D-Phenylalanin -

X = D-Tryptophan

X= D-Ty rosin

D-S-Et-Pen = D-S-Ethyl-penicillamin

bedeutet oder einem nichttoxischen, pharmazeutisch verwendbaren Salz davon.

Die antagonistische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch pharmakologische Standard-Untersuchungen bestimmt werden, wie es beispielsweise folgende Autoren angegeben haben: N. Ling und W. VaIe: Biochem. Biophys. Res. Commun. 63,801 (1975)

W. VaIe und G. Grant: Methods in Enzymology, Hormones and Cyclic Nucleotides, Vol. 37, New York, Academic Press E.S.France: Neuroendocrinology6,77-89(1970)

Überraschenderweise zeigt bereits die D-S-Ethyl-penicillamin⁶-LH-RH-Verbindung eine inhibierende Wirkung, die durch die zusätzliche Einführung einer der genannten D-Aminosäuren in 2-Stellung noch wesentlich verstärkt wird. Auch die antiovulatorische Aktivität erhöht sich in gleichem Maße.

Die Synthese des erfindungsgemäßen Peptides erfolgt unter Verwendung bekannter Kupplungsmethoden an polymeren Trägern, wie es beispielsweise im DD 135078 beschrieben wurde.

Der Aufbau des Peptides erfolgt an polymeren Trägern bekannter Art, deren Grundgerüst aus vernetzten Polyvinyl-Kohlenwasserstoffen besteht. Mittels geeigneter Methoden werden aktive Zentren in das Polymerisat eingeführt, an die die C-terminale geschützte Aminosäure oder ein entsprechendes Di- oder Tripeptid gebunden wird, das dann die Basis für den weiteren Peptidaufbau darstellt. Als reaktives Zentrum wird vorzugsweise die Benzhydrylamingruppe verwendet. An einem Benzhydrylaminharz wird die Aminosäure Glycin in geeigneter geschützter Form unter Verwendung bekannter Kupplungsmethoden, vorzugsweise der DCC oder der symmetrischen Anhydridmethode verankert, und nacheinander werden die Aminosäuren L-Prolin, L-Arginin, L-Leucin, D-S-Ethyl-penicillamin, L-Tyrosin, L-Serin, L-Tryptophan, X, L-Pyroglutaminsäure, worin X = D-Phenylalanin, D-Tryptophan, D-Tyrosin bedeutet, oder entsprechende Peptidfragmente in geeigneter, geschützter Form nach gleichen Methoden verknüpft.

So kann die Herstellung des Tripeptides pGlu-X-Trp einmal durch Verwendung eines geeigneten Trägermaterials nach der Festphasen- oder zum anderen nach der konventionellen Methode erfolgen. Das am Träger aufgebaute und gebundene Heptapeptid Ser-Tyr-D-S-Et-Pen-Leu-Arg-Pro-Gly- P wird mit vom Träger abgelösten bzw. konventionell synthetisiertem pGlu-X-Trpzum geschützten, am Träger verbundenen LH-RH-Analogon gekuppelt. Nach Abspaltung der Schutzgruppen und Ablösung des gebildeten Peptides vom Träger durch Behandlung mit verflüssigtem Fluorwasserstoff liegt ein relativ reines Produkt in hoher Ausbeute vor.

Die Herstellung des Tripeptides pGIu-X-Trp nach der Festphasenmethode erfolgt an einem Chlormethylharz, wobei Tryptophan in geeignet geschützter Form als Cäsiumsalz o. ä. mit dem Chlormethylpolymer verknüpft wird. Die Aminosäuren X und Pyroglutaminsäure werden in geschützter Form unter Verwendung oben angeführter Kondensationsmethoden nacheinander angekuppelt.Das Tripeptid wird vom Träger abgelöst und mit dem sich am Benzhydrylaminharz befindenden geschützten Heptapeptid gekuppelt. Die LH-RH-Analoga werden unter gleichzeitiger Abspaltung der Schutzgruppen vom Polymer mittels verflüssigten Fluorwasserstoffs freigesetzt.

Die so erhaltenen LH-RH-Analoga haben bereits einen Gehalt von etwa 60% bis 70% an gewünschtem Peptid. Die durchzuführenden Reinigungsoperationen erfolgen in Form einer Fällung als schwerlösliches Säureadditionssalz mit anschließender Freisetzung mittels Ionenaustauschers und säulenchromatographischer Verfahren. Nachfolgendes Formelschema soll der näheren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens anhand der Synthese der LH-RH-Analoga-Sequenz dienen:

GIy-NH- P

+ Boc-L-Pro

+ Boc-L-Arg(N0₂)

+ Boc-L-Leu

+ Boc-D-S-Et-Pen

+ Boc-L-Tyr

+ Boc-L-Ser(OBzl)

+ Boc-L-Trp

+ Boc-X

+ L-pGlu

pGlu-X-Tpp-Ser(0Bzl)-Tyr-D-S-Bt-Pen-Leu-Apg(N0₈)-Ppo-Gly-NH-

+ HP

LH-RH-Analogon

GIy-NH- P

+ Boc-L-Pro

+ Boo-L-Arg(N0₂)

+ Boc-L-Leu

+ Boc-D-S-Et-Pen

+ Boc-L-Tyr

+ Boc-L-Ser(OBzl)

pGlu-X-Trp + Ser(0Bzl)-Tyr-D-S-Et-Pen-Leu-Arg(N0₂)-Pro-GlyNH- P

pGlu-X-Trp-Ser(0Bzl)-Tyr-D-S-Et-Pen-Leu-Arg(N0₂)-Pro-Gly-NH- P

+ HP

LH-RH-Analogon

D-Phenylalanin

D-Tryptophan

D-Tyrosin

Bei der Synthese werden an der Reaktion nichtbeteiligte, freie funktionell Gruppen zweckmäßigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion oder flüssigen Fluorwasserstoff leicht abspaltbare Reste, wobei die für die Peptidsynthese bekannten Gruppen verwendet werden, z. B. die Benzyl-, p-Chlorbenzyl-, 2,6-Dichlorbenzyl-, p-Nitrobenzyl-, p-Methoxybenzyl-, Benzhydryl-, tertiär-Butyl-, Tosyl-, Dinitrophenyl- und die Nitro-Gruppe. Als Aminoschutzgruppen sind beispielsweise zu nennen: Aliphatische Oxycarbonylgruppen wie z. B. Cyclohexyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl- und in erster Linie tertiär-Butyloxycarbonyl-(Boc-), oder sich von der Kohlensäure bzw. Thiokohlensäure ableitende Gruppen, wie gegebenenfalls im aromatischen Rest substituierte Carbobenzoxygruppen (z. B. Carbobenzoxy-, p-Brom- oder p-Chlorcarbobenzoxy-, p-Methoxycarbobenzoxy-), ferner o-Nitrophenylsulfenyl- und gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppen (z. B. Diphenylmethyl- oder Triphenylmethylgruppen). Zur Abspaltung der a-Amino-Schutzgruppen während der Synthese finden Trifluoressigsäure/Dichlormethan, Trifluoressigsäure, HCI in Eisessig oder Dioxan bevorzugt Anwendung. Andere Spaltungsreagentien und deren Abspaltungsbedingungen zur Entfernung spezifischer Amino-Schutzgruppen sind in E.Schröder und K. Lübke, The Peptides I, Academic Press, 1965 S.72-75, beschrieben.

Nachdem der gewünschte Peptid aufgebaut wurde, kann die Bindung mit dem polymeren Trägermaterial auf bekannte Weise, wie mit Bromwasserstoff/Trifluoressigsäure, Trifluormethansulfonsäure oder mit Hilfe von verflüssigtem Fluorwasserstoff bei O⁰C bis Raumtemperatur, gegebenenfalls unter Zusatz von z. B. Anisol oder/und Mercaptoäthanol o.a. aufgespalten werden.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1

10g"Benzhydrylaminharz, hergestellt nach I.Rivier et al., J. med. Chem. 16,545 (1973) bzw. P.Pietta et al., J. Org. Chem. 39,44 (1974) wurden mit 5,3g Boc-Gly in Methylenchlorid unter Zusatzvon 6,2g Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt. Der Gehalt an Boc-Gly betrug 0,96mMol/g Harz. Die folgenden Aminosäuren oder deren Anhydride wurden in 3facher Menge eingesetzt: Boc-L-Pro, Boc-L-Arg(NO₂), Boc-L-Leu, Boc-D-S-Et-Pen, Boc-L-Tyr, Boc-L-Ser(OBzl), Boc-L-Trp, Boc-X, p-Glu. Nach der Kondensation mit Boc-Gly kam folgender Waschzyklus zur Anwendung:

1.	3 x 80 ml	Methylenchlorid	(je 3')
2.	3 χ 80 ml	Dioxan	(je 3')
3.	1 χ 80 ml	4NHCI/Dioxan	(10')
4.	1 χ 80 ml	4NHCI/Dioxan	(25')
5.	3 χ 80 ml	Dioxan	(je 3')
6.	3 χ 80 ml	Methylenchlorid	(je 3')
7.	3 χ 80 ml	Chloroform-Methanol (2:1)	(je 3')
8.	3 χ 80 ml	Chloroform oder Methylenchlorid	(je 3')
9.	2 χ 80 ml	Triäthylamin-Chloroform oder Methylenchlorid (1:9)	(je 5')
10.	3 χ 80 ml	Chloroform oder Methylenchlorid	(je 3')
11.	3 x 80 ml	Methylenchlorid	(je 3')

Nach Ankondensation der Pyroglutaminsäure resultierten 19,6g pGlu-X-Trp-Ser(OBzl)-Tyr-D-S-Et-Pen-Leu-Arg(NO2)-Pro-Gly-NH-P

Beispiel 2

1 g des unter Beispiel 1 angeführten pGlu-X-Trp-Ser(OBzl)-Tyr-D-S-Et-Pen-Leu-Arg(NO₂)-Pro-GlyNH- P mit einem Gehalt von 0,96mMol/g Harz wurde nach Waschen mit Dimethylformamid, Chloroform-Methanol (2:1), Methanol und Ether nach SAKAKIBARA mit 15ml HF und 1,5ml Anisol (und/oder Mercaptoäthanol o.a.) 1 Stunde bei 0°C umgesetzt. Nacn Abdestillation der HF wurde der Rückstand mit Ether gewaschen und in 1%iger Essigsäure gelöst. Durch Austausch mit WofatitAD41 wurde in das Dekapeptid-acetat überführt und anschließend lyophilisiert. Es wurden 330mg LH-RH-Analogon-acetathydrat erhalten.

Beispiel 3

450 mg rohes Arialogon wurden zur Reinigung in 45 ml Wasser gelöst, mit 1,2 ml Essigsäure versetzt und mit 45 ml gesättigter wäßriger Pikrolonsäurelösung gefällt. Die Fällung wurde mit Pikrolonsäurelösung gewaschen, in Aceton aufgelöst und mit Wasser im Verhältnis 1:1 verdünnt. Mit Wofatit AD41 (Acetatform) wird in das LH-RH-Analogon-acetat rückgeführt. Nach Lyophilisation wurden 325mg gereinigtes Analogon erhalten.

Beispiel 4

1,0g der nach Beispiel 3 erhaltenen Verbindung werden für therapeutische und diagnostische Zwecke durch Gradientenelution mitTriäthylamin-Essigsäure-Puffern (0,01/0,3m, pH 4,0) an carboxymethylcellulose (Säulengröße 2 χ 50cm)

chromatographiert. .

Die Ermittlung der reinen Fraktionen erfolgt durch UV-Messung bei 254nm und Dünnschichtchromatographie an Kieselgelplatten (Laufmittel I: Chloroform-Methanol-33%ige-Essigsäure 60:45:20; Laufmittel Ih'n-Butanol-Essigsäure-Wasser

Das bei einer Triäthylamin-Essigsäure-Pufferkonzentration von 0,15-0,18m abgelöste Produkt wird im Vakuum eingeengt und dann lyophilisiert. Es wird die Monoacetatform des Analogons erhalten. Ausbeute: 0,701 g _ Optische Drehung: [a]gg_{6 nm}: - 56,2°±0,5 (c = 1;5%ige Essigsäure)

RrWerte an Kieselgelplatten: Laufmittel 1:0,63 Laufmittel II: 0,18

Aminosäureanalyse:

	GIu	D-Phe	Trp	Ser	Tyr	Pen	Leu	Arg	Pro	GIy
theoret. Wert:	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
gefunden:	(1,0)	0,98	0,94	0,86	0,96	0,98	1,01	1,02	0,99	1,03

Claims (1)

11. Verfahren zur Herstellung eines LH-RH-Analogons der allgemeinen Formel paiu-X-Trp-Ser-Tyr-D-S-Et-Pen-Leu-Arg-Pro-GlyNHz,

12 3 4 5 6 7 8 9 10

X: —D-Phenylalanin

— D-Tryptophan

— D-Ty rosin
D-S-Et-Pen: —D-S-Ethyl-penicillamin

bedeutet, oder ein nichttoxisches, pharmazeutisch verwendbares Salz davon, gekennzeichnet dadurch, daß die Synthese an einem polymeren Träger durch schrittweise Kupplung der in geeigneter Form geschützten Aminosäuren und bzw. oder Peptidfragmente unter Verwendung bekannter Kondensationsmethoden durchgeführt und das erhaltene LH-RH-Analogon vom polymeren Träger abgelöst wird.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Verfahren der Fragmentkondensation die Fragmente 1 bis 3 und 4 bis 10 am polymeren Träger synthetisiert werden, das Fragment 1 bis 3 vom Träger abgespalten und mit der am Träger gebundenen Sequenz 4 bis 10 gekuppelt wird.