DE2830489A1

DE2830489A1 - Psychopharmakologisch wirksame peptide

Info

Publication number: DE2830489A1
Application number: DE19782830489
Authority: DE
Inventors: Hendrik Marie Greven
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Akzo NV
Priority date: 1977-07-13
Filing date: 1978-07-11
Publication date: 1979-01-25
Also published as: SE443789B; NL7707781A; BE868953A; FI67367C; GB2001076A; FI67367B; FR2397395A1; JPS5419934A; GB2001076B; JPS6220200B2; DK149454B; FR2397395B1; LU79960A1; ZA783713B; AU519567B2; CA1108123A; IE47547B1; DK314978A; ES471672A1; US4203975A

Description

UH. ΊΝΟ. Τ·\Λ\ΠΠίΚΤΙΙΟ1·Κ I)Ii-Ii. ν. J¹KCJIM ANN I)K. IN«.'I). 15141IHHNS DIPI,.IN<J. K. (JOKTZ

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1A-51

Patentanmeldung

Anmelder: AKZO N.V.

IJssellaan 82, Arnhem, Niederlande

Titel:

Psychopharmakologisch wirksame Peptide

6292 809884/10 1.5

I)H. INC;. V. Λ\ΜΓKSTirC)FK

I)K-Ii. ν. IMCCMIMANX I)R. INC;. 1). HKIIIt ICNS

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IMIOTEOTIMXENT

1A-51 124 Anmelder: AKZO

Be Schreibung

D ie Erfindung betrifft neue psychopharmakologisch wirksame Peptide der Formel

L-Cys-L-Tyr-L-Phe-L-GluCX.)-Asp(X₀)-t ' *-

SO,H D

in der X₁ und X„ jeweils eine Hydroxy- oder Aminogruppe bedeuten und B 1, eine Hydroxygruppe oder 2. einen Aminosäurerest aus der Gruppe von L-Asp-OH, L-Asn-OH, L-GIu-OH, L-GIn-OH, L-Ser-OH^roder HN-A-COOH bedeutet, wobei A eine Alkylidengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist,oder ein funktionelles Derivat davon sowie Arzneimittel, enthaltend eine pharmakologisch v/irksame Menge dieser Peptide.

Diese Peptide besitzen psychopharmakologische Eigenschaften. Sie sind geeignet zur Behandlung bestimmter geistiger Störungen, bei denen eine Stimulierung der Hirnfunktion erwünscht ist, wie zur Behandlung von Senilität oder Amnesie.

Die Erfindung bezieht sich auf psychopharmakologisch wirksame Peptide, Verfahren zu deren Herstellung und Arzneimittel in einer Form, die zur therapeutischen Verabreichung geeignet ist, enthaltend diese Peptide und auf solche Peptide, die zur Behandlung von geistigen Störungen geeignet sind, bei denen eine Stimulierung der Hirnfunktion erwünscht ist, z. B. bei der Be-

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- - ο- - 1A-51 124

handlung von Seniiitätserscheinungen und/oder Amnesie.

Aus 157 Neuropharmacol 4 (1965) ist es bekannt, daß das Nonapeptidderivat (Lys)-Vasopressin, Zinktanat, bestimmte p.sychopharmakologische Eigenschaften besitzt, wenn es an Ratten verabreicht wird, denen die Hypophyse oder Hypophysen-Hinterlappen entfernt worden ist. Speziell wurde angenommen, daß dieses Nonapeptid imstande ist, die Auslöschung der konditionierten Luftreaktion zu hemmen. Es ist bekannt, daß die außerordentlich wirksame Pressoraktivität von Vasopressin und seinen funktioneilen Derivaten jedoch eine höchst unerwünschte Nebenwirkung darstellt.

Aus der US-PS 3 835 110 ist ferner bekannt, daß ein Pentapeptid der Formel

H-L-Cys-L-Tyr-L-Phe-L-Glu(X)-L-Asp(X)-OH

oder dessen Dimeres, das über eine Disulfidbrücke (S-S) gebildet wird, die Auslöschung der erworbenen Vermeidungsreaktion zumindest in gleichem Ausmaß hemmt, wie das oben angegebene Nonapeptid (speziell bei subkutaner Verabreichung) aber keine Pressoraktivität aufweist. Ein Nachteil der meisten Peptide dieser Gruppe ist jedoch die außerordentlich geringe Löslichkeit in den meisten Lösungsmitteln, wodurch eine Reinigung, die übliche Durchführung von Analysen und die pharmazeutische Verarbeitung dieser Peptide außerordentlich erschwert und mühsam wird.

Vasopressin Polypeptidderivate werden ferner hergestellt gemäß den US-PS 3 299 Ο36, 3 422 083 und 3 743 726. Die in der US-PS 3 299 036 angegebenen Peptide sind besonders geeignet zur Prophylaxe und Therapie von parenchymatösen Blutungen. Ferner sind die Polypeptide der US-PS 3 422 083, die mindestens eine i*(-Methylideri)-Gruppe durch ein Stickstoffatom ersetzt haben

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- r- ΙΑ-si

und die Verbindung der US-PS 3 743 726,0ctapeptide, die die Erlangung der konditionierten (erworbenen) Ausweichreaktion stimulieren und ihre Auslöschung hemmen. In den US-PS 3 579 494 und 3 705 140 sind sulfonierte/sulfatisierte Peptide angegeben.

Die Erfindung betrifft nun neue Peptide der Formel

H-

-L-Cys-L-Tyr-L-Phe-L-Glu(X₁)-L-Asp(X₂)-B SO₃H

'in der X^ und Xp eine Hydroxy- oder Aminogruppe bedeuten und B 1. eine Hydroxygruppe oder 2. einen Aminosäurerest aus der Gruppe L-Asp-OH, L-Asn-OH, L-GIu-OH, L-GIn-OH, L-Ser-OH oder HN-A-COOH bedeutet, wobei A eine Alkylidengruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist sowie deren geeignete funktioneile Derivate. Diese neuen Peptide hemmen die Auslöschung der erworbenen Vermeidungsreaktion bei Ratten. Sie sind ferner wirksam bei dem Amnesietest bei Ratten, aus dem hervorgeht, daß die erfindungsgemäßen Peptide einen Erinnerungsverlust aufheben und/oder verhindern können. Die Peptide dieser neuen Gruppe sind in den meisten Lösungsmitteln besser löslich als die in der US-PS 3 835 110 beschriebenen. Besonders bevorzugt sind die Peptide (und Mittel, die eine wirksame Menge davon enthalten), bei denen B den Aminosäurerest L-Asp-OH bedeutet. Es hat sich gezeigt, daß diese Peptide besonders geeignet sind zur oralen Verabreichung und eine deutlich bessere orale Wirksamkeit besitzen. Unter "Alkylidengruppe¹¹ bei der Definition von A in Formel I ist eine gerad- oder verzweigtkettige Alkylidenkohlenwasserstoffkette zu verstehen, die sonst nicht substituiert ist.

Die erfindungsgeraäßen Peptide der Formel I werden in an sich bekannter Weise hergestellt. Die am häufigsten angewandten Verfahren zur Herstellung der Verbindungen können in den folgenden drei alternativen Verfahren zusammengefaßt v/erden:

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- J+- 1A-51 124

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a) Kondensation in Gegenwart eines Kondensationsmittels von 1. einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien Carboxylgruppe (bei dem andere reaktionsfähige Gruppen geschützt sind) mit 2. einer Verbindung (Aminosäure, föptid), enthaltend eine freie Aminogruppe (bei der sonstige reaktionsfähige Gruppen ebenfalls geschützt sind) oder

b) Kondensation einer Aminosäure oder eines Peptids, enthaltend eine aktivierte Carboxylgruppe, in dem andere reaktionsfähige Gruppen gegebenenfalls geschützt sind mit 2. einer Verbindung (AminosäurePeptid), enthaltend eine freie NEL-Gruppe (in der sonstige reaktionsfähige Gruppen geschützt sind) oder

c) Kondensation einer Aminosäure oder eines Peptids, enthaltend eine freie Carboxylgruppe (in der sonstige reaktionsfähige Gruppen geschützt sind) mit 2. einer Verbindung (Aminosäure, Peptid), enthaltend eine aktivierte Aminogruppe (in der sonstige reaktionsfähige Gruppen gegebenenfalls geschützt sind),

woraufhin eine S-Schutzgruppe, soweit vorhanden, und gegebenenfalls die anderen Schutzgruppen entfernt werden und, wenn nötig, die S-SuIfogruppe eingeführt wird. Noch vorhandene Schutzgruppen werden dann entfernt.

Verfahren zur Aktivierung der Carboxylgruppe sind bekannt und umfassen die Umwandlung dieser Gruppe in ein Säurehalogenid, ein Acid, Anhydrid, Imidazolid oder einen aktivierten Ester, wie den N-Hydroxysuccinimidester oder den p-Nitrophenylester.

Die Aminosäure kann nach an sich bekannten Verfahren aktiviert werden, z. B. durch Umwandlung der Aminogruppe in ein Phosphitamid oder unter Anwendung des "Phosphor-Azo"-Verfahrens (für beide Aktivierungsverfahren: Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, 4. Aufl., Bd. XV/2 (Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974)).

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- & - 1A-51 124

DiG üblichsten Verfahren für die oben angegebenen Kondensationsreaktionen sind: das Carbodiimid-Verfahren, das Azidverfahren, die Verfahren mit gemischten Anhydriden rand aktivierten Estern (E. Schröder und K. Lubke, "The Peptides", Bd. I, I965 (Academic Press)). Das sogenannte"7Phasen"-Verfahren nach Merrifield (85 J. Amer.Chem.Soc. 2149 (1963)) kann ebenfalls angewandt werden zur Herstellung der Peptide und Peptidderivate nach der Erfindung.

Die reaktionsfähigen Gruppen, die nicht an der Kondensationsreaktion teilnehmen, werden wirksam geschützt durch geeignete sogenannte Schutzgruppen, die wieder leicht durch Hydrolyse oder Reduktion entfernt werden können. Eine Carboxylgruppe kann z. B. wirksam geschützt werden durch Veresterung mit mindestens einer stöchiometrisch wirksamen Menge Methanol, Äthanol, tert,-Butanol, Benzylalkohol oder p-Nitrobenzylalkohol oder wahlweise durch Umwandlung in ein Amid nach bekannten Verfahren (z. B. Houben Yfeyl; Methoden der Organischen Chemie, 4. Aufl., Bd. XV/1, S. 315 ff). Diese zuletzt genannte Schutzgruppe kann jedoch sehr schwer entfernt werden, so daß es günstig ist, daß diese Gruppe nur angewandt wird, um die Carboxylgruppe der C-terminalen Aminosäure in dem entstehenden Peptid zu schützen. In diesem Fall führt die Peptidsynthese direkt zu dem Amid des Peptids der allgemeinen Formel Γ.

Gruppen, die eine Aminogruppe wirksam schützen können, sind allgemein Säuregruppen, z. B. eine Säuregruppe, die abgeleitet ist von einer geeigneten aliphatischen aromatischen, araliphatischen oder heterocyclischen Carbonsäure (wie Essigsäure, Benzoesäure, Pyridincarbonsäure) oder eine Säuregruppe, die abgeleitet ist von Kohlensäure (wie eine Äthoxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, tert.-Butyloxycarbonyl oder p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe) oder eine Säuregruppe, die abgeleitet wird von einer Sulfonsaure (wie die Benzolsulfonyl- oder p-Toluolsulfonylgruppe). Andere Gruppen können ebenfalls angewandt werden, wie

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- Jer- 1A-51 124

substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Aralkylgruppen, z. B. eine Benzyl- oder Triphenylmethylgruppe oder Gruppen, wie o-Nitrophenylsulphenyl- oder 2-Benzoyl-i-methyl-vinyl-Gruppe (s. Houben Weyl, Methoden der Organischen Chemie, 4. Aufl., Bd. XV/1, S. 46 ff).

Die Mercaptogruppe von Cystein kann beispielsweise wirksam geschützt werden durch Acylierung oder (Ar)-Alkylierung. Geeignete Acylgruppen sind die Acetyl- oder Benzoylgruppe; übliche (Ar)-Alkylgruppen sind tert.-Butyl-, Benzyl-, p-Nitrobenzyl-, Trityl- oder Acetamidomethylgruppe (s. Houben-Weyl a.a.O., Bd. XV/1, S. 736 ff). Diese Mercaptogruppe kann jedoch auch "geschützt" werden durch die SOJrl-Gruppe. Offensichtlich sollte die zuletzt genannte Gruppe nach der Peptidsynthese beibehalten werden. Obwohl es nicht unbedingt notwendig ist, ist es manchmal bevorzugt und zu empfehlen, daß die Hydroxylgruppe von Tyrosin ebenfalls geschützt wird. Diese Gruppe wird vorzugsweise durch eine tert.-Butylgruppe geschützt.

Die Schutzgruppen können durch verschiedene übliche Verfahren entfernt werden, je nach der Art der Schutzgruppe, z. B. durch Hydrolyse mit Hilfe von Trifluoressigsäure, Jodwasserstoff oder Bromwasserstoff in Eisessig oder durch Reduktion, z. B. durch katalytische Hydrierung oder mit Natrium in flüssigem Ammoniak, (siehe die oben angegebenen Literaturstellen)

Die Entfernung der Schutzgruppe von der Mercaptogruppe von Cystein führt im allgemeinen zu einer vollständigen oder teilweisen Diraerisierung des Peptids, wenn nicht spezielle Maßnahmen ergriffen werden, um das zu vermeiden, z. B. wenn die Reaktion zur Entfernung der Schutzgruppe unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt wird und unter Verwendung von Reagentien und Lösungsmitteln, die vollständig frei sind von Sauerstoff. Die Verhütung einer möglichen Dirnerisierung ist jedoch nicht unmittelbar notwendig, da die Sulfonierung des Cysteinylrestes (die noch durchgeführt v/erden muß) sowohl mit dem Monomer als auch mit dem Dimer durchgeführt werden kann. Es kann sogar vorteilhaft sein,

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die wesentliche Einführung der S-Sulfogruppe ausschließlich an dem Dimer vorzunehmen.

Eine vollständige Dimerisierung des von der S-Schutzgruppe befreiten Peptids wird erreicht durch Oxidation der Mercaptogruppen, von zwei monomeren Peptidmolekülen unter Bildung eines Disulfide. Diese Oxidation wird in bekannter V/eise durchgeführt, z. B. durch Oxidation mit Kaliumferricyanid, Jod oder Äthyljodid oder mit Hilfe einer Oxidation mit Luft oder Sauerstoff in Wasser oder flüssigem Ammoniak. Wenn eine geeignete Schutzgruppe ausgewählt worden ist, ist es auch möglich, die Oxidation an dem noch geschützten Peptid durchzuführen, z. B. auf bekannte Weise, wie durch Behandlung eines S-Trityl geschützten Peptids mit Jod in einem geeigneten Lösungsmittel, v/ie Methanol. Die Tritylgruppe spaltet sich dann unter gleichzeitiger Oxidation der entstehenden SH-Gruppe zu einem Disulfid ab. ( s. Houben Weyl: Bd. XV/1, S. 800 ff)

Das Dirnere sowie das/ SuIfopeptid kann auch direkt über die übliche Peptidsynthese hergestellt werden. Anstelle des geschützten Proteins werden bei dieser Synthese die Aminosäuren Cystein und Cys(S0,H) angewandt. Diese^dl.^rf^kteRoute besitzt natürlich den Vorteil, daß keine S-Schutzgruppe eingeführt werden muß, und keine Dimerisierung des Monomers eintritt.

Wenn die S-Sulfogruppe nicht schon vorhanden ist, besteht die letzte Stufe bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide der allgemeinen Formel I in der Einführung der S-Sulfogruppe in ein Peptid der allgemeinen Formel:

H-L-Cys-L-Tyr,L-Phe-L-Glu(X₁)-L-Asp (X₂)-B oder das entsprechende Dimere der allgemeinen Formel: (H-L-Cys-L-Tyr-L-PlIe-L-GIu(X₁ )-L- Asp (X₂)-B)₂

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oder ein funktionelles Derivat, wobei B, X₁ und X₂ die oben angegebene Bedeutung haben und die Arainogruppe von Cys, die OH-Gruppe von Tyr und/oder Carboxylgruppe(n) gegebenenfalls Schutzgruppen enthalten.

Die Sulfonierung oder Einführung der S-Sulfogruppe v/ird vorzugsweise mit Hilfe eines geeigneten Alkalisulfits oder Alkalihydrogensulfits, besonders von Natriumsulfit (NapSO,) oder Natriumhydrogensulfit (NaHSO-,) in einem geeigneten inerten Lösungsmittel, vorzugsweise Wasser, erreicht. Die Sulfonierung wird üblicherweise bei Raumtemperatur oder etwas niedrigerer Temperatur (oberhalb ungefähr O⁰C bis ungefähr 25⁰C) durchgeführt. Das Verhältnis Peptid zu Sulfid bei dieser Sulfonierung beträgt vorzugsweise ungefähr ein Äquivalent Peptid zu ungefähr zwei Äquivalent Sulfit.

Wenn das Dimere sulfoniert wird oder das Monomere sulfoniert wird ohne vollständigen Ausschluß von Sauerstoff, ist es empfehlenswert, daß ein Oxidationsmittel, wie eine wirksame Menge Na₂S-Og ebenfalls zu dem Reaktionsgemisch zugegeben wird. Dieses Oxidationsmittel trägt mit dazu bei, sicherzustellen, daß das nichtsulfonierte Monomer unmittelbar in das Dimer umgewandelt wird.

Unter dem Ausdruck "geeignete funktionelle Derivate" der erfindungsgemäßen Peptide der Formel I sind zu verstehen:

a) Salze, die gebildet worden sind durch Umsetzung des Peptids mit einer Base, vorzugsweise einer Base, die abgeleitet wird von einem Alkalimetall, z. B. NaOH, Na₂CO₃ oder NaHCO₃;

b) Ester, vorzugsweise solche, die abgeleitet sind von aliphatischen Alkoholen mit ein bis ungefähr 18 Kohlenstoffatomen, insbesondere von Alkano.len mit 1 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Amylalkohol und Isoamylalkohol;

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c) Amide oder Alkyl-substituierte Amide, wobei die Alkylgruppe(n) 1 bis 4 Kohlenstoffatome besitzt und

d) Metallkomplexe, die gebildet sind durch Zusammenbringen der hier angegebenen Peptide mit einem schwerlöslichen Salz, Efydroxid oder Oxid eines Metalls, vorzugsweise von Zink.

Salze können direkt aus dem Reaktionsgemisch erhalten werden, indem die Peptide hergestellt worden sind oder sie können später hergestellt werden durch Umsetzung des Peptids mit einer Base. Die Natriumsalze sind bevorzugt»

Ester der hier angegebenen Peptide können erhalten werden durch Veresterung der Peptidsäure auf übliche Weise. Es ist jedoch bevorzugt, daß die Estergruppe während der Peptidsynthese eingeführt wird, und zwar durch Verwendung des gewünschten Esters der betreffenden Aminosäure als Ausgangsmaterial anstelle der freien Aminosäure. Dieses zuletzt genannte Verfahren ist vorteilhaft, da die Estergruppe auch gleichzeitig als Schutzgruppe wirkt.

Amide können hergestellt werden durch Aminolyse eines Peptidesters. Es ist auch in diesem Falle vorzuziehen, daß die gewünschte Amidgruppe bereits in dem Ausgangsmaterial enthalten ist. \Ienn das z. B. für ein Peptid der Formel I, in der B den Aminosäurerest-Ser-OH bedeutet, erwünscht ist,, dann ist es bei v/ei tem bevorzugt, daß das Amid, der Aminosäure Serin als Ausgangsmaterial anstelle der freien Aminosäure verwendet v/ird.

Die Peptide, Peptidderivate und Mittel mit pharmazeutisch geeignetem Träger, wie sie hier angegeben sind, besitzen wertvolle ρsychopharmakologisehe Eigenschaften. Speziell hemmen sie die Auslöschung der erworbenen Vermeidungsreaktion und sind wirksam in dem oben beschriebenen Amnesietest, so daß sie außerordentlich geeignet sind zur Behandlung bestimmter geistiger Störungen, bei denen eine Stimulierung der Hirnfunktion er-

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wünscht ist, wie bei Senilität oder Amnesie.

Die Peptide werden in wirksamen Mengen zusammen mit bekannten Trägern angewandt und vorzugsweise in einer Dosis von 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht und Tag, je nach der Form, in der sie verabreicht werden.

Die erfindungsgemäßen Peptide können entweder oral oder parenteral verabreicht v/erden mit Hilfe geeigneter pharmazeutischer Träger, wie sie bekannt sind. Für Injektionszwecke v/erden sie in einer geeigneten Flüssigkeit gelöst, suspendiert oder emulgiert, sterilisiert und dann in Ampullen unter aseptischen Bedingungen eingefüllt. Im Gemisch mib geeigneten Excipientien und Füllstoffen können die angegebenen Peptide ferner in eine geeignete Form zur oralen Verabreichung gebracht werden, z. B. in Form, von Pillen, Tabletten, Dragees oder Kapseln. Die erfindungsgemäßen Peptide können ferner als Suppositorien oder Sprays verabreicht werden.

Die orale Verabreichung ist bevorzugt.

Besonders günstige Mittel werden erhalten, wenn die erfindungsgemäßen Peptide in einer Form zur Verfügung gestellt werden, die eine längere Aktivität ermöglicht. Vorzugsweise werden die Metallkomplexe angewandt. Diese Metallkomplexe können erhalten werden durch Zusammenbringen der Peptide mit schwerlöslichen Metallsalzen, Metallhydroxiden oder Oxiden, wie sie bekannt sind. Die Metallphosphate, Metallpyrophosphate und Metallpolyphosphate werden im allgemeinen als schwerlösliche Metallsalze angewandt.

Metalle, die hierfür angewandt werden können, sind· vor allem solche, die zu den b-Gruppen des Periodensystems gehören, z. B. Kobalt, Nickel, Kupfer, Eisen und vorzugsweise Zink sowie Metalle aus den Hauptgruppen des Periodensystems, die Komplexe bilden können, wie Magnesium und Aluminium. Die Herstellung dieser Me-

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tallkomplexe findet auf übliche Weise statt.

Die Metallkomplexe können erhalten werden durch Zugabe des Peptids und eines schwerlöslichen Metallsalzes, Metallhydroxids oder Metalloxide zu einem wäßrigen Medium. Die Metallkomplexe können auch erhalten v/erden durch Zugabe eines alkalischen Mediums zu einer wäßrigen. Lösung des Peptids und eines löslichen Metallsalzes, wobei der unlösliche Peptid-Metallhydroxid-Komplex gebildet wird.

Der Metallkomplex kann ferner erhalten werden durch Zugabe des Peptide, eines löslichen Metallsalzes und eines löslichen Salzes zu einem wäßrigen, vorzugsweise alkalischen Medium, wobei der unlösliche Peptid-Metallsalz—Komplex in situ entsteht.

Die Metallkomplexe können direkt als Suspensionen angewandt v/erden oder sie können z. B. gefriergetrocknet und zu einem späteren Zeitpunkt erneut suspendiert werden, wie das für Arzneimittel üblich ist.

Bevorzugte erfindungsgemäße Peptide und Peptidderivate der allgemeinen Formel I sind solche, bei denen B den Aminosäurerest L-Asp-ÜH bedeutet. Diese zuletzt genannten Peptide unterscheiden sich von.den bekannten oben erwähnten Pentapeptiden nach der US-PS 3 835 110 nicht nur durch eine wesentlich verbesserte Löslichkeit, sondern vor allem durch eine deutlich bessere orale Wirksamkeit. Diese Verbesserung der oralen Wirksamkeit hängt nicht mit der erhöhten Löslichkeit zusammen,' Die erfindungsgemäßen Peptide der allgemeinen B'ormel I, bei denen B eine Hydroxygruppe bedeutet, sind ebenfalls leicht löslich, aber zeigen keine deutliche Verbesserung der oralen Wirksamkeit, verglichen mit den bekannten Pentapeptiden nach der US-PS 3 835 110.

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Die folgenden Bemerkungen sind in Beziehung auf die folgenden Beispiele und die Ansprüche zu machen:

1. Wenn keine optische Konfiguration angegeben ist, ist die L-Fopm gemeint.

2. Die folgenden Abkürzungen wurden für die Schutzgruppen oder Akti'vie rungs gruppen angewandt:

Z = Benzyloxycarbonyl

tBu = tert,Butyl

Me = Methyl

BzI = Benzyl

3. Die folgenden Abkürzungen wurden für die angewandten Lösungsmittel und Reagentien angewandt.

Bu = Butanol

Py = Pyridin

Ac = Essigsäure

Wa = Wasser

DMF = Dimethylformamid

DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid

DCCU = Dicyclohexylharnstoff

HOBT = N-Hydroxybenztriazol

4. Die folgenden Abkürzungen wurden für die Aminosäuregruppen angewandt.

Cys = Cysteinyl

Tyr = Tyrosyl

Phe = Phenylalanyl

GIn = Glutaminyl; entsprechend GIu(NH₂)

Asn = Asparaginyl; entsprechend Asp (NH₂)

GIu = Glutamyl

Asp = Aspartyl

Ser = Seryl

die Gruppe -HIi-A-COOH umfaßt unter anderem die Amino säure res te:

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Glycyl, Alanyl, Valyl, Leucyl und Isoleucyl;
der Aminosäurercst -Cys- hat

SO₃II

die Strukturformel: S-S(XH

t j
CH₀ O
t *- 11
-HK-CII -C-

HerStellung von Ausgangssubstanzen A. Herstellung von geschützten Penta- und Hexapeptiden

1. Z-Cys(BzI)-Tyr-Phe-Gln-Asn-OH (s. US-PS 3 835 110)

0,26 ml N-Äthylmorpholin wurden zu 1 g Z-Cys(BzI)-Tyr-OH
in 10 ml THB' gegeben und die Lösung auf -10⁰C gekühlt und anschließend 0,26 ml Isobutylchlorformiat zugegeben. Nach

ungefähr 10 min langein Rühren bei -10°C wurden in ungefähr 10 ml kaltem Di-IB¹ zugegeben. Wach 30 min langem Rühren bei -10⁰C und ungefähr 2 h bei O⁰C und ungefähr 18 h bei 20⁰C wurde das Reaktionsgemisch in V/asser gegossen und der pH-Wert auf 3~ bis 4 eingestellt. Der entstehende Feststoff
wurde abzentrifugiert. Das so erhaltene Produkt wurde aus Äthanol/Wasser (1:1) umkristallisiert. Fp. 219°C (Zers.); Rf in Bu:Py:Ac:Wa (4:0,75:0,25:1) = 0,44 auf SiO₂, Rf in
Bu:Ac:Via (4:1:1) = 0,34 auf SiO₂.

2. Z-Cys(BzI)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Asp-OH

4,54 g des unter 1. erhaltenen Peptids wurden in 400 ml
DMF gelöst und die Lösung auf -5⁰C gekühlt und anschließend 1,25 g H-Asp(0tBu)-0tBu, 0,81 g HOBT und 1,14 g DCCI nacheinander zugegeben. Das Gemisch wurde dann ungefähr 30 min bei -5°C,ungefähr 1 h bei 0⁰C und ungefähr 15 h bei Raumtemperatur gerührt.

*) 0,8 g H-Phe-Gln-Asn-OH und 0,26 ml N-Äthyl-

- 14 -morpholin

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- V* - 1A-51 124

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Das entstehende DGHU wurde abfiltriert und das Filtrat in 15QO ml Ithylacetat, enthaltend 30 ml Äthanol, gegossen. Die so entstehenden Kristalle wurden abfiltriert und getrocknet. Man erhielt 4,05 g tert.-Butylester, Fp. 190⁰G (Zers.). Der tert.-Butylester wurde anschließend in einem Gemisch aus 40 ml 90 $-iger TrifluoressigsaLure und 0,5 ml Anisol bei Raumtemperatur hydrolysiert. Mach 30 min langem Rühren wurde das Gemisch in 300 ml Äther gegossen und die erhaltenen Kristalle anschließend abfiltriert und getrocknet. Ausbeute (Peptidsäure): 3,5 g; Fp. 224-225°C; Rf in Bu:Ac: Wa (4:1:1) = 0,25 auf

Die folgenden Peptide wurden entsprechend 2. erhalten:

a) 2-Cys(Bsi)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Glu-OH, Rf in Bu:Ac:Wa (4:1:1) = 0,30 (SiO₂)

b) Z-Cys(Bzl)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Ser-QH, Rf in Bu:Ac:Wa (4ϊ1ϊ1) = 0,10 (SiO₂)

ο) Z-Cys(B2l)-Tyr-Phe-Gln~Äsn-Ala-OH,

Rf in BusAcsWa (4:1:1) = 0,35 (SiO₂) ei) Z-Gys(B2l)-Tyr-.Phe~Gln-Asn-Val-0H, Rf in Bu:Ac:Wa (4:1:1) = 0,3?

B. Herstellung von Biiaeren von geschützten Pentä~ und Hexa-

5,0 g des nach Α·1· erhaltenen geschützten Pentapeptids wurden in ungefähr 1000 ml flüssigeia Aeaoniak gelöst. Mach 15 min langen Rühren wurden zwei Äquivalente HaHH₂ ^u der Lösung gegeben.

Anschließend wurde Hatrium zu der Losung gegeben, bis eine blaue Farbe auftrat und Mindestens 30 s bestehen blieb, woraufhin der Aiaattoniak an die Luft verdampfen konnte. Her Rückstand wurde zn ungefähr 500 mal Wasser und einer äquinolaren Menge HGl, bezogen, auf Ma und MalH_?, gegeben. Ber

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pH-Wert des Gemisches wurde auf 6,8 eingestellt und anschließend eine Spur Kupferchlorid zu dem Gemisch gegeben und 24 h Luft hindurchgeleitet. Eine tertiäre Reaktion auf -SH-Gruppen war dann negativ. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend in eine Säule mit einem sauren Ionenaustauscher gegeben und das Gemisch mit einer 2 %—igen Essigsäurelösung eluiert, bis keine Chloridioneri mehr nachgewiesen werden konnten. Das Peptid wurde anschließend mit einer 50 %-igen Essigsäurelösung aus der Säule eluiert. Das JSluat wurde dann gefriergetrocknet und in Wasser suspendiert, wobei der pH-Wert auf 4,1 gehalten wurde. Die so erhaltenen Kristalle wurden abfiltriert und getrocknet. Fp. 240⁰C CZers.); Rf in Bu:Ac:Wa (4:1:5) = 0,44 auf S

2. Die folgenden Dimeren wurden entsprechend B.1. erhalten:

a) (H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Asp-0H)₂;

Fp. 250°C (Zers.); Rf in Bu:Ac:Wa (3:1:1) = 0,10 (SiO,,)

b) (II-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Glu-0H)₂;

Fp. 200⁰C (Zerc); Rf in Bu:Ac:Wa (3:1:1) = 0,14 (SiO₂)

c) (Il-ly3-Tyr-Phs-Gln-Asn-Ser-OH)₂;

Fp. 180⁰C (Zers.); Rf in Bu:Ac:'rfa (3:1:1) = 0,07 (SiO₂J d)(H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Ala-0H)₂;

Fp. 184°C (Zers.): Rf in Bu:Ac:Wa (3:1:1) = 0,15 (SiO₀) e ) (II-Cys-Tyr-Phe-Glii-Asn-VaI-OH)₂;

Fp. 190°C (Zers.); Rf in Bu;Ac:*ia (3:1:1) = 0,17

f) (II-Cys-Tyr-Phe-Glu-Asp-0II)₂;

g) (II-Cys-Tyr-Phe-Glu-Asn-0H)₂;
h) (II-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asp-0H)₂;
j) (HTPlGIAOC ^

Die Dimeren f), g), h) und j) sind in der US-PS 3 835 110 angegeben.

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C. Direkte Synthese der Dimeren

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Statt der Verwendung von S-geschütztem Protein als Ausgangsarainosäure vmrde bei dieser Synthese die Ιί-geschützte Aminosäurecystin verwendet.

1. (H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Asp-0H)₂

Ein Äquivalent (Boc-Cys-OH)p wurde mit ungefähr 2 Äquivalent H-Tyr-Phe-Gln-Asn-Asp(OtBu)-OtBu gekuppelt mit Hilfe des HOBT/DCCI-Verfahrens nach Beispiel A.2. Man erhielt das geschützte Dimere: (Boc-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Asp(OtBu)-OtBu)

2*

Die Boc- und OtBu-Schutzgruppen wurden jetzt gleichzeitig entfernt durch Behandlung mit einem Gemisch von Trifluoressigsäure und Anisol unter den in Beispiel A.2. beschriebenen Bedingungen. Man erhielt 68 % (H-Cyc-Tyr-Phe-Gln-Asn-Asp-OH)p, bezogen auf das als Ausgangsmaterial verwendete Cystin. Rf in Bu:Ac:V/a (3:1:1) = 0,10 auf SiO₂, Fp. 230⁰C (Zers.).

2. Die folgenden Dimeren wurden entsprechend C. 1. hergestellt:

a) (H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Ala-0Me)₂ durch Kupplung von (BoC-CyS-OH)₂ mit H-Tyr-Phe-Gln-Asn-Ala-OMe und anschließende Abspaltung der Boc-Gruppe mit Trifluoressigsäure.

b) (H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Ala-HH₂)₂ durch Kupplung von (Boc-Cys-0H)₂ mit H-Tyr-Phe-Gln~Asn-Ala-NH₂ und anschließende Abspaltung der Boc-Gruppe mit Trifluoressigsäure.

Beispiel 1

H-Cys( SO-Ji )-Tyr-Phe-Gln-Asn-OH

5,0 g des nach B.1. erhaltenen Dimeren wurden in 50 ml Wasser suspendiert und anschließend 2 Äquivalent Natriumsulfit und

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1 Äquivalent iJatriumtetrathionat (Na-S^O,-) bei Raumtemperatür (25 C) zu der Suspension gegeben« Nach 1 min langem Rühren erhielt man eine Lösung, die auf eine basische Ionenaustauschersäule (DEAIi in Acetatform} gegeben wurde. Anschließend wurde die Säule mit 2 ?o-iger Essigsäurelösung eluiert, bis das Eluat keine Salze mehr enthielt. Das Peptid wurde anschlief3end mit einem linearen Gradienten von O bis 20 % Essigsäurelösung eluiert. Die Fraktionen, die ausschließlich das gewünschte Peptid enthielten, wie durch Dünnschicht— Chromatographie nachgewiesen wurde, wurden zusammengegeben und gefriergetrocknet. Fp. 2OU°C (Zers.); Rf in Bu:Ac:Wa (3:1:1) = 0,30 (SiO₂).

Beispiel 2

Die folgenden Peptide wurden entsprechend Beispiel 1 hergestellt:

(a) H-Cys(SO₃H)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Asp-OH; Kf =0,54

(b) H-Cys(SO₃H)-Tyr-Phe-Gln-Asn-CIu-OH;

Kf = C₇GO

(c) H-Cys( SO₃H)-Tyr-Phe-Oln-.'vsri-fer-OII;

Uf - ι"·,3Ο

(d) I I-Cys(SC₃H)-Tyr-Phe-Gln-Asn-AIa-OH;

Kf -r~ <*_;4O

(e) H-Cyst SO₇H)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Yal-OH;

l'.f = ( ₇43

(f) I I-Cys ( SO₃H) -Tyr-Phe-Gln-AsrW Ia-OHe ;

i'.f - C₇ 65

(g) H-Cys ( SO₃H) -Tyr-Phe-Gln-Asn-/- Ia-NH₂ ;

Kf = O,bb

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ORIGINAL INSPECTED

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(h) Il-Cys (SO₃H) -Tyr-Phe-Glu-Asp-OH;

Rf = O₇45 (j) I[-Cys(SO₃H)-Tyr-Phe-Glu-Asn-OH;

Rf = 0,41 (k) II-Cys(SO₃H)-Tyr-Phe-Gln-Asp-CH;

Rf = 0_;40 (1) ll-Cys ( SO₃H)-TYr-PhB-GIn-ASn-CC₁₁H₂ Kf = O₇55

Die Peptide a) bis e) besitzen Schmelzpunkte über 240°C. Die Rf-Werte vmrden in Bu:Ac:Wa (3:1:1) auf SiO_? gemessen.

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Claims

Patentansprüche

!-L-Cys-L-Tyr-L-Phe-L-GluCX. )-L-Asp (X₀) -B I

in der X₁ und Xp jeweils eine Hydroxy- oder Aminogruppe und B eine Hydroxygruppe oder einen Aminosäurerest aus der Gruppe L-Asp-OH, L-Asn-OH, L-GIu-OH, L-GIn-OH, L-Ser-OH oder -HN-A-COOH bedeutet, wobei A eine Alkylidengruppe mit 1 bis ungefähr 6 Kohlenstoffatomen ist oder deren funktioneile Derivate.
2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß B die Gruppe L-Asp-OH bedeutet.
3. Peptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch zeichnet , daß

gekenn

und X_? beides Aminogruppen sind.
4. Verfahren zur herstellung der Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man die entsprechende Aminosäure oder Peptidreste, die,soweit nötig, geschützt sind, in der entsprechenden Reihenfolge aneinander kuppelt und anschließend eine S-Schutzgruppe, soweit vorhanden, und gegebenenfalls die anderen Schutzgruppen entfernt und anschließend das Peptid sulfoniert, um die S-SuIfogruppe einzuführen und die restlichen Schutzgruppen, soweit vorhanden, entfernt und anschließend das erhaltene Peptid gegebenenfalls in ein funktionelles Derivat überführt.

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5. Verfahren zur Herstellung der Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Peptid der Formel

H-L-CyS-L-I¹Yr-L-PhB-L-GIu(X₁ )-L~Asp(X_£)~B

oder das entsprechende Dimere oder ein funktionelles Derivat des Monomeren oder Dimeren, wobei X., X„ und B die Olsen angegebene Bedeutung haben und wobei die Aminogruppe(n) von Cys, die Hydroxygruppe von Tyr und/oder eine oder mehrere freie Carboxylgruppen gegebenenfalls eine Schutzgruppe enthalten, sulfoniert, anschließend die Schutzgruppe, soweit vorhanden, entfernt und das erhaltene Peptid gegebenenfalls in ein funktioneile s Derivat überführt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß man die Sulfonierung mit Hilfe eines Alkalisulfits oder Alkalihydrogensulfits durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch g e k e η η zeichnet , daß man die Sulfonierung in Gegenwart eines Oxidationsmittels durchführt.

S. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Oxidationsmittel Na₉S^Og verwendet.

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