CH671229A5

CH671229A5 -

Info

Publication number: CH671229A5
Application number: CH4717/86A
Authority: CH
Inventors: Francois Dr Cardinaux; Janos Dr Pless; Robert Helmut Dr Buck
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1985-12-04
Filing date: 1986-11-25
Publication date: 1989-08-15
Also published as: FR2590902B1; IT8648701A0; JPS62132898A; GB2184729B; FI864939A0; PT83835B; IL80846A0; JPH085916B2; GB8628739D0; NZ218473A; HUT44794A; DK580186D0; AU600242B2; SE8605189D0; AU6606186A; GR862836B; US4758550A; FR2590902A1; IT1214754B; LU86697A1

Description

BESCHREIBUNG Die vorliegende Erfindung betrifft neue Calcitoninderi-vate und pharmazeutische Präparate, welche sie enthalten. Insbesondere betrifft die Erfindung neue Polypeptide der Formel I

« r

R-(NH-CH-CO) -A -NH-CH-CO-A-A -Z-ProNH n 6 8 9 2

i worin R für H oder R'CO

R'CO für den Acylrest einer Carbonsäure,

Y ! für den am a-C-Atom einer a-Aminosäure befindlichen Rest,

Y2 für i) -CH2-S-S-CH2-CH-COOH,

I

NH2

-ch2-s-s-ch2-ch2-cooh,

-(CH2)p-COOH oder -CH2-S-Y3 oder ii) einen anderen als unter i) angegebenen, am a-C-Atom einer a-Aminosäure befindlichen Rest

Y3 für Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen, gegebenenfalls durch Methyl oder Methoxy substituiertes Benzyl oder CH3CONH-CH2-,

n für 1 bis 4 A6 für Thr oder D-Thr p für 3 bis 5

Ag für den Aminoacylrest einer neutralen, lipophilen L-a-Aminosäure

A9 für den Aminoacylrest einer neutralen, lipophilen L-oder D-a-Aminosäure, und

Z für den Polypeptidrest, der sich in den Stellungen 10 bis 31 eines natürlichen Calcitonins oder eines Calcitonin-analogons mit hypocalcämischer Wirkung befindet, stehen, wobei die 1 bis 4 YrReste in der Formel I unabhängig voneinander die gleichen oder verschiedenartige Bedeutungen haben können und mit Ausnahme des Aminoacylrestes A8 alle Aminosäurereste in der Formel I die L- oder D-Konfi-guration haben können, mit der Massgabe, dass falls Y2 für CH2SH steht und n 4 bedeutet, der N-terminale Aminoacylrest nicht H-Cys sein darf, sowie die Salze und Komplexe dieser Verbindungen.

Unter Z in der Formel I sind solche Peptidreste zu verstehen, welche in den verschiedenen bekannten Calcitoninen, z.B. in Human-, Salm-, Aal-, Huhn-, Rind-, Schaf-, Ratteoder Schwein-Calcitonin, sowie in den Derivaten und Analoga dieser Calcitonine mit ähnlicher Wirkung, in den Stellungen 10 bis 31 vorkommen. Unter Derivaten und Analoga dieser Calcitonine sind besonders natürliche Calcitonine, worin ein oder mehrere Aminosäurereste durch einen oder mehrere andere Aminosäurereste oder die S-S-Brücke durch eine Alkylen-Brücke ersetzt sind, oder worin ein oder mehrere Aminosäurereste weggelassen wurden, zu verstehen. Diese Peptidreste Z sind normalerweise aus 22 Aminosäuren zusammengesetzt, können jedoch bei Weglassen eines oder mehrerer Aminosäurereste (des-Aminoacylderivate) auch entsprechend weniger Aminosäurereste enthalten.

Z steht bevorzugt für a) Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala

2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

671 229

b) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr c) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr

Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formel I, 5 worin Z die unter b) oder c) angegebenen Bedeutungen hat, ganz besonders solche, worin Z die Bedeutung c) hat.

R'CO ist vorzugsweise der Acylrest einer aliphatischen, cycloaliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen Carbonsäure. io R' steht bevorzugt a') für gesättigtes oder ungesättigtes, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 17 C-Atomen, besonders für gesättigtes Alkyl mit 3 bis 9 C-Atomen,

b') für Cycloalkyl mit 5 bis 7 C-Atomen oder für Cycloal-15 kylalkyl, worin die Cycloalkylgruppe 5 bis 7 C-Atome und der Alkylrest 1 oder 2 C-Atome enthält,

c') für Adamantyl, Adamantylmethyl oder Adamantyl-äthyl, oder d') für Phenyl, Benzyl oder Phenäthyl. 20

In den oben erwähnten Bedeutungen für R' können die Alkyl-, Cycloalkyl- oder Phenylreste durch übliche Substitu-enten substituiert sein, z.B. durch Halogen, N02, OH, Alk-oxy u.s.w. Der Rest R'CO kann z.B. der a-Desaminorest einer natürlichen a-Aminosäure sein. Für R' sind besonders die 25 Bedeutungen a'), b') und c') bevorzugt.

Yj und Y2 als sich am a-C-Atom einer a-Aminosäure befindlichen Reste stehen besonders für die am a-C-Atom einer natürlichen a-Aminosäure gebundenen Reste, jedoch kommen auch Reste anderer a-Aminosäuren, z.B. des 3-Cyclohe- 30 xylalanins oder der a-Aminoisobuttersäure, in Betracht.

Falls n in der Formel 14 bedeutet, steht,

a) der N-terminale Aminoacylrest (übereinstimmend mit dem zweiten Aminosäurerest in der Sequenz der natürlichen Calcitonine) bevorzugt für Ser, Gly oder Ala 35

b) der zweite Aminoacylrest (übereinstimmend mit dem dritten Aminosäurerest in der Sequenz der natürlichen Calcitonine) bevorzugt für Asn oder Ser c) der dritte Aminoacylrest (übereinstimmend mit dem vierten Aminosäurerest in der Sequenz der natürlichen Calci- 40 tonine) bevorzugt für Leu, Asn, Ser, Phe, D-Leu oder den Rest des Cyclohexylalanins d) der vierte Aminoacylrest (übereinstimmend mit dem fünften Aminosäurerest in der Sequenz der natürlichen Calcitonine) bevorzugt für Ser oder Ala. 45

Falls n in der Formel I für 3 steht, haben der N-termina-le, der zweite und der dritte Aminoacylrest die gleichen bevorzugten Bedeutungen wie oben für den Fall, dass n=4 unter b) bzw. c), bzw. d) angegeben.

Falls n in der Formel I für 2 steht, haben der N-terminale so und der zweite Aminoacylrest bevorzugt die gleichen bevorzugten Bedeutungen wie oben für den Fall, dass n=4 unter c) bzw. d) angegeben.

Falls n in der Formel I für 1 steht, steht der N-terminale Aminoacylrest bevorzugt für Ser oder Ala. 55

A6 steht bevorzugt für Thr

Y2 I

-NH-CH-CO steht bevorzugt für Cys, ein wie oben für Y2 angegebenes Derivat des Cysteins oder einen neutralen Ii- 60 pophilen a-Aminoacylrest, besonders für Ala oder einen anderen neutralen lipophilen a-Aminoacylrest, ganz besonders für Ala

Ag steht für den Aminoacylrest einer neutralen, lipophilen L-a-Aminosäure, besonders für Val oder Gly

A9 steht ebenfalls für den Aminoacylrest einer neutralen, lipophilen a-Aminosäure, besonders für Leu oder Phe In den Verbindungen der Formel I steht n bevorzugt für

2, wobei R H oder R'CO bedeutet oder ganz besonders steht n für 1 und R für R'CO. Alle Aminosäurereste haben vorzugsweise die L-Konfiguration.

Eine Gruppe von Verbindungen hat die nachstehende Formel

1

CH -Y-COOH

I

H-X'-Asn-Leu-Ser-Thr-NH-CH-CO-Z'-Pro-NH

ip worin X' für Gly oder Ser

Y' für (CH2)4 oder -S-S-CH2

■ch-,

I

nh2

wobei der letzte Rest über das endständige S-Atom an der benachbarten CH2-Gruppe in der Formel Ip gebunden ist und

Z' für den aus 24 Aminosäuren zusammengesetzten Polypeptidrest, der sich in den Stellungen 8 bis 31 eines natürlichen Calcitonins oder eines Analogons davon mit hypocalcämischer Calcitonin-ähnlicher Wirkung befindet, stehen, wobei alle Aminosäurereste, inklusive diese in den Stellungen 1 und 7, die L-Konfiguration aufweisen.

In dieser Gruppe steht X' vorzugsweise für Ser,

Y' für -S-S-CH2-CH-,

I

nh2

Z' für Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr.

Eine zweite Gruppe von Verbindungen entspricht der Formel Iq

S

?

65

H-X"- (CH-CO)-.(NH-CH-CO) -Thr-NH-CH-CO-Z"-Pro-NH m n« Z

worin X" für NH oder eine Bindung, jedoch falls m'=0 nur für eine Bindung,

Y1" für den am a-C-Atom einer natürlichen Aminosäure befindlichen Rest,

Y2" für den am a-C-Atom einer natürlichen a-Aminosäure befindlichen Rest, für -CH2-S-S-CH2-CH-COOH, -CH2-

I

NH2

S-S-CH2-CH2-COOH, -(CH2)p, -COOH oder -CH2-S-Y'3, Y'3 für Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen,

m' für 0 oder 1,

n' für 0 bis 3,

p' für 3 bis 5, und

Z" für den aus 24 Aminosäuren zusammengesetzten Polypeptidrest, der sich in den Stellungen 8 bis 31 eines natürlichen Calcitonins oder eines Analogons davon mit hypocalcämischer Calcitonin-ähnlicher Wirkung befindet, stehen, wobei die 1 bis 4 Y"rReste in der Formel I unabhängig voneinander die gleichen oder verschiedenartige Bedeutungen haben können und mit Ausnahme des Aminoacylrestes A8 alle Aminosäuren in der Formel I die L- oder D-Konfiguration haben können.

Bevorzugt sind die Verbindungen der Formel Iq, worin a) Z" = Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala b)Z" = Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr c)Z" = Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr

671 229

4

In der Formel Iq steht der Rest

S

"i

H-X-CH-CO»-(NH-CH-CO) -ra' r»

bevorzugt für worin n" für 0 bis 2 steht

N

Y.

H-X-(CH-CO) r(NH-CH-CO) rSer m n worin R] eine Gruppe ist, welche die Ausbildung einer S-S-Brücke mit dem S-Atom der CH2SH-Gruppe im Polypeptid der Formel II erleichtert,

R2 Wasserstoff oder eine Amino-Schutzgruppe s R3 OH oder eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe und

X NH oder eine Bindung bedeuten oder eine Verbindung der Formel IV

10

ïi

?H2-SR1

R-(NH-CH-CO) -A -NH-CH-CO-A -A-Z-ProNH_ n 6 8 9 2

y:

IV

oder H-X-(CH-CO) -(NH-CH-CO) -Leu-Ser m' n

15 in geschützter oder ungeschützter Form, worin R, oben erwähnte Bedeutung hat, mit einer Verbindung der Formel V

worin n'" für 0 oder 1 steht, und die Reste Y'\ bevorzugt für CH2OH, (CH3)2-CH-CH2 oder CH2-CONH2 stehen.

Die Verbindungen der Formel I können als Salze oder Komplexe vorhegen. Als Säureadditionssalze kommen solche mit organischen Säuren, polymeren Säuren oder anorganischen Säuren in Frage. Solche Säureadditionssalze sind z.B. die Hydrochloride und Acetate. Unter Komplexen sind solche Verbindungen zu verstehen, die bei Zusatz anorganischer Salze oder Hydroxide (z.B. Ca- oder Zn-Salze) und/ oder beim Zusatz polymerer organischer Stoffe entstehen.

Die erfindungsgemässen Verbindungen der obigen Formel können nach für die Synthese von Polypeptiden dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden. Beispielsweise können die Polypeptide der obigen Formel hergestellt werden, indem man a) mindestens eine Schutzgruppe, die in einem geschützten Polypeptid mit der in Formel I angegebenen Sequenz vorhanden ist, entfernt, oder b) zwei Peptideinheiten, von denen jede mindestens eine Aminosäure oder Derivat davon, wie für die Formel I beschrieben, in geschützter oder ungeschützter Form enthält, durch eine Amidbindung miteinander verknüpft, wobei die Peptidbindung in der Weise erfolgen soll, dass die in der Formel I enthaltene Aminosäuresequenz hergestellt wird und anschliessend gegebenenfalls die Verfahrensstufe a) ausgeführt wird, oder c) eine Verbindung der Formel I, worin R für Wasserstoff steht, in geschützter oder ungeschützter Form, mit einer Säure der Formel R'COOH oder einem reaktiven Derivat einer solchen Säure, umsetzt und gegebenenfalls die Verfahrensstufe a) ausführt, oder d) zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin Y2 für CH2-S-S-CH2-CH-COOH oder CH2-S-S-CH2-

I

nh2

CH2-COOH steht, entweder eine Verbindung der Formel II

Y CH -SH

1 .2

20

25

30

35

40

45

50

CH -SH i 1

R2-X-CH-COR3

v umsetzt und anschliessend gegebenenfalls die Verfahrensstufe a) ausgeführt wird.

Es handelt sich hierbei um in der Peptidchemie an sich bekannte Verfahren. Sie können z.B. analog zu den in den Beispielen beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.

Falls die Herstellung der Ausgangsprodukte nicht spezifisch beschrieben ist, sind diese Verbindungen bekannt oder können nach üblichen Methoden hergestellt und gereinigt werden. Die Endprodukte der Formel I können ebenfalls in üblicher Weise gereinigt werden, so dass sie weniger als 5% Polypeptid-Nebenprodukte enthalten. Die für die Verfahren a) und b) als Ausgangsprodukte verwendeten Polypeptide können ebenfalls auf an sich bekannte Weise in Lösung oder nach dem Solid Phase-Verfahren hergestellt werden.

Die Herstellung von Peptideinheiten, welche als Y2-Rest eine -CH2-S-S-CH2-CH2-COOH oder CH2-S-S-CH-CH2(NH2)-COOH-Gruppe enthalten, erfolgt analog zu dem oben erwähnten Verfahren d).

Bei diesem Verfahren d) werden Verbindungen der Formel III bzw. IV verwendet, worin R] für solche an sich bekannte Reste steht, welche mit Merkaptanen unter Ausbildung einer S-S-Bindung reagieren. R, steht besonders für S-/7^V-N02

Alkyl, -S-COOAlkyl, S~(Cd oder S-SO-3. In diesen

Resten steht Alkyl besonders für niederes Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen. Die Einführung dieser Reste in die Verbindungen mit freien SH-Gruppen geschieht analog zu in der Schwefelchemie bekannten Methoden.

In den nachfolgenden Beispielen erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden und sind die [a] 2q-Werte un-korrigiert. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:

55

R-(NH-CH-CO) -A -NH-CH-CO-A -A-Z-ProNH n 6 8 9 2

II 60

in geschützter oder ungeschützter Form, umsetzt mit einer Verbindung der Formel III

CH--S-R

I

R -X-CH-COR,

2 3

Acm

Aib

Boc Bul

Cha

,CO-

\

NH-

= Acetamidomethyl

= a-Aminoisobuttersäurerest (CH3)2-C

= tert. Butyloxycarbonyl = tert. Butyl

= 3-Cyclohexylalaninrest = ^H^ -CH2-CH

■NH CO-

65 DCM = Dichloromethan III DMF = Dimethylformamid

5

671 229

Fmoc = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Sem = Methoxycarbonylsulfenyl Trt = Trityl Asu = a-Aminosuberinsäure Cys(Me) = S-Methylcystein

Alle Peptide werden als Polyacetate-polyhydrate erhalten mit einem Peptidgehalt von 70 bis 90%.

Die HPLC-Analyse ergibt, dass die Polypeptide weniger als 5% an anderen Peptiden enthalten.

Der in den nachfolgenden Beispielen angeführte Faktor «F» gibt den Peptidgehalt in den erhaltenen Produkten an (F=1 kommt mit einem 100%igen Peptidgehalt überein). Die Differenz zu 100% [(1-F) x 100] besteht aus Essigsäure und Wasser.

| Beispiel 1

H-Leu-Ser-Thr-Cys( H-Cys-OH)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln- Thr- Tyr-Pro-Arg- Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly- Thr-Pro-NH2

a) Fmoc-Leu-Ser(Bu')-Thr(Bu')-Cys( SBu')-Val-Leu-OCH2-phenyl-(p ) O CH2-co (polystyrol- 1%-divinylbenzol)

1 g p-Hydroxymethyl-phenoxymethyl-co(polystyrol-l%-dinylbenzol) wird in Dimethylformamid/Methylenchlorid 1:4 (v/v) quellengelassen, abgenutscht und mit einer Lösung von 0,74 g Fmoc-Leucin und 0,19 g 1-Hydroxybenzotriazol in 5 ml des oben erwähnten Lösungsmittelgemisches versetzt. Unter Rühren werden noch 0,43 g Dicyclohexylcarbo-diimid und 85 mg 4-Dimethylaminopyridin, je in 5 ml desselben Lösungsmittelgemisches hinzugefügt. Man rührt 16 Stunden bei 20°, nutscht ab und wäscht mit dem Lösungsmittelgemisch, dann mit Dimethylformamid. Man erhält Fmoc-Leu-OCH2-phenyl-(p)-OCH2-co(polystyrol-1 % -divi-nylbenzol). Nach Abspaltung der Fmoc-Gruppe durch Behandlung (10 Minuten) mit Piperidin/Dimethylformamid (1:4, v/v), Waschen mit Dimethylformamid, gibt man nacheinander die folgenden Reagenzien zu, je in 5 ml Dimethylformamid: 0,71 g Fmoc-Valin, 0,28 g 1-Hydroxybenzotriazol und 0,32 ml Diisopropylcarbodiimid und rührt 3/4 Stunden. Dieselben Reaktionen (Abspaltung der Fmoc-Gruppe, Kupplung der nächsten Fmoc-Aminosäure) werden in der Reihenfolge: Fmoc-Cys(SBut)-OH (0,9 g), Fmoc-Thr(Bu1)-OH (0,83 g), Fmoc-Ser(But)-OH (0,8 g) und Fmoc-Leu-OH (0,74 g) durchgeführt. Nach jeder Kupplung wird mit einem Ninhydrin-Test kontrolliert, dass die Kupplung vollständig war. Man erhält die Titelverbindung.

b) Fmoc-Leu-Ser-Thr-Cys( SBu')-Val-Leu-OH

1,2 g Fmoc-Leu-Ser(But)-Thr(But)-Cys(SBut)-Val-Leu-OCH2-phenyl-OCH2-co(poIystyrol-l %-divinylbenzol) (ca. 0,4 mmol Peptid/g) werden in 10 ml Trifluoressigsäure/Me-thylenchlorid 1:1 (v/v) 1 Stunde gerührt. Man filtriert,

wäscht mit Trifluoressigsäure/Methylenchlorid 1:1, dann mit Methylenchlorid, engt im Vakuum ein und fällt mit 25 ml Äther. Der Niederschlag wird mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält die Titelverbindung.

c) Fmoc-Leu-Ser-Thr-Cys( SBu')-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu( OBu' )-Leu-His-Lys( Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg- Thr-Asn- Thr-Gly-Ser-Gly- Thr-Pro-NH2

Man löst 1,0 g des Endproduktes der Stufe b in 15 ml Dimethylformamid, gibt 2,3 g H-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OBut)-Leu-His-Lys(Bod)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2, 0,33 g 3,4-Dihy-dro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-benzotriazin und 0,31 g Dicyclo-hexylcarbodiimid zu und- rührt 16 Stunden bei 25°. Man filtriert, dampft das Filtrat zur Trockene ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform, Aceton und erhält die Titelverbindung.

d) H-Leu-Ser-Thr-Cys( SBu')-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-

Leu-Ser-Gln-Glu( OBu')-Leu-His-Lys( Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2, acetat

0,8 g des geschützten Peptids der Stufe c) werden in 8 ml Piperidin/Dimethylformamid 1:4 (v/v) gelöst und während 10 Minuten gerührt. Nach Abdampfen im Hochvacuum bei 25° wird der Rückstand in 4 ml Dimethylformamid gelöst. Man gibt 50 (il Eisessig zu und giesst die Lösung in 80 ml Äther. Das ausgefallene Produkt wird abgenutscht, mit Äther gewaschen und im Vacuum bei 20° getrocknet. Man erhält die Titelverbindung.

e) H-Leu-Ser-Thr-Cys(H)-Val-Leu-Gly-Lys( Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu( OBu' )-Leu-His-Lys( Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2-acetat

0,46 g des Peptids der Stufe d) werden in 2,5 ml Triflu-oräthanol gelöst und unter Argon mit 0,69 ml Tributylphos-phin versetzt. Man rührt 30 Minuten bei 20°, giesst, immer unter Argon, in 50 ml Äthylacetat, zentrifugiert. Der Niederschlag wird im Äthylacetat aufgeschlämmt und nochmals zentrifugiert. Der feuchte Rückstand (Titelverbindung) wird sofort bei der nächsten Reaktion eingesetzt.

f) Boc-Cys (Sem)-OH, Dicyclohexylammonium-Salz

Eine auf —5° abgekühlte Lösung von 1,39 g Boc-

Cys(Trt)-OH in 15 ml Chloroform/Methanol 2:1 (v/v) wird mit 0,5 ml Methoxycarbonylsulfenylchlorid und 0,31 ml Di-äthylamin versetzt und 1 Stunde bei derselben Temperatur gerührt. Man gibt noch 0,33 ml Diäthylamin zu und rührt weitere 5 Minuten bei 0°, verdünnt mit 50 ml Chloroform, wäscht mit 10%iger Phosphorsäure, Wasser und trocknet über Magnesiumsulfat. Nach Eindampfen des Lösungsmittels wird das gelbe Öl in 3 ml Äther gelöst und mit 0,6 ml Dicyclohexylamin bei +4° versetzt. Die kristallinische Masse wird abgenutscht, mit Äther gewaschen und am Hochvakuum bei 30° getrocknet. Man erhält die Titelverbindung.

Smp. 142-143 °C.

[a] d = — 31° (c= 1 in Dimethylformamid).

g) H-Leu-Ser-Thr- Cys( Boc-Cys- OH)- Val-Leu-Gly-Lys-( Boc ) -Leu-Ser-Gln-Glu ( OBu,') -Leu-His-Lys (Boc) -Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2, acetat

Unter Argon wird das Peptid der Stufe e) in 6 ml Triflu-oräthanol gelöst und mit einer Lösung von 0,16 g Boc-Cys(Scm)-OH.dicyclohexylammonium-Salz in 65 ml Triflu-oräthanol versetzt. Man rührt 2 Stunden unter Argon, engt im Vacuum auf ca. 7 ml und giesst in 50 ml Äther. Der Niederschlag wird abgenutscht, mit Äther gewaschen und im Vacuum bei 25° getrocknet. Man erhält die Titelverbindung.

h) H-Leu-Ser-Thr-C'ys(H-Cys-OH) - Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Ans-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2

Man löst 3,0 g des geschützten Peptids der Stufe g) unter Stickstoffatmosphäre in 100 ml Trifluoressigsäure, lässt 15 Minuten bei 20° stehen und dampft zur Trockene ein.

Das Produkt wird durch «reversed-phase» Chromatographie (Gradient von Acetonitril in Wasser/Trifluoressigsäure) gereinigt. Die die erwartete Substanz enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Man filtriert über einem basischen Ionenaustauscher in der Ace-tat-Form und lyophilisiert das Filtrat. Man erhält die Titelverbindung als Polyacetat, Polyhydrat.

[a] d = -42° (in 95% Essigsäure, c=0,3) F=0,86

Beispiel 2

H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(H-Cys-OH)-Val-Leu-Gly-Lys-

Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-

Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2

a) Boc-Cys (Acm)-Val-Leu-O Me

Man löst 28,1 g HCl.H-Val-Leu-OMe, 29,2 g Boc-Cys (Acm)-OH, 13,6 g 1-Hydroxybenzotriazol in 200 ml Methy5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

671 229

6

lenchlorid, kühlt auf 5°, gibt 21,0 g Dicyclohexylcarbodiimid und 10,1 ml N-Methylmorpholin zu und rührt 2 Stunden, indem man die Temperatur auf 20° steigen lässt. Nach Filtration vom Unlöslichen wird das Filtrat zur Trockene abgedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit 10%iger Phosphorsäure, Wasser, IN NaHC03 und Wasser gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat und Abdampfen des Filtrats erhält man die Titelverbindung.

b) H-Thr-Cys(Acmj-Val-Leu-OH

Man löst 20,8 g Boc-Cys(Acm)-Val-Leu-OMe in 120 ml Trifluoressigsäure. Nach 40 Minuten wird zur Trockene abgedampft, der Rückstand in Methanol gelöst und die Lösung über einen schwach basischen Ionenaustauscherharz filtriert. Das Filtrat wird zur Trockene abgedampft. Der Rückstand wird in Tetrahydrofuran gelöst, mit 8,8 g Boc-Thr-OH und 5,4 g 1-Hydroxybenzotriazol und nach Abkühlen auf 0° mit 8,4 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Man rührt 2 Stunden bei 20°, filtriert vom Unlöslichen, dampft zur Trok-kene ab, löst den Rückstand in Essigester, wäscht mit 10%iger Phosphorsäure, Wasser, IN NaHC03 und Wasser, trocknet über Na2S04 und dampft ab. Das Produkt, gelöst in 150 ml Trifluoressigsäure, wird 40 Minuten stehen gelassen, das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft, der Rückstand in Äther zerrieben, dann getrocknet. Das Produkt wird in 200 ml Methanol gelöst und mit 45 ml IN Natronlauge behandelt. Nach einer Stunde werden 100 ml Wasser zugegeben, der Methanol im Vakuum entfernt, und die wässrige Lösung über einen schwach sauren Ionenaustauscher filtriert. Das Filtrat wird zur Trockene abgedampft.

c) Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2

Man löst 17 g Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe in 200 ml Hy-drazinhydrat, rührt 2 Stunden bei 20°, dampft zur Trockene im Hochvakuum bei 25° ab, wäscht den Rückstand mit Di-äthyläther, trocknet und erhält die Titelverbindung.

d) Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-OH

Man löst 13,6 g Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 in 150 ml

Dimethylformamid, kühlt auf —20°, gibt 40 ml einer wasserfreien Lösung von HCl (2N) in Dioxan zu, gefolgt von 3,6 ml tert.-Butylnitrit. Nach 10 Minuten bei —20° gibt man noch 16 ml Triäthylamin und 13,0 g H-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-OH zu und rührt 16 Stunden bei 25°. Man filtriert vom Unlöslichen ab, dampft das Filtrat zur Trockene ein, suspendiert wiederholt in IN Essigsäure und in Wasser, filtriert das Produkt ab, trocknet im Vakuum und erhält die Titelverbindung.

e) Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys( Boc) -Leu-Ser-Gln-Glu ( OBu') -Leu-His-Lys (Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-

NH2

Man löst 1,0 g des Endproduktes der Stufe d) in 15 ml Dimethylformamid, gibt 2,3 g H-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OBut)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2, 0,33 g 3,4-Di-hydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-benzotriazinund 0,31 g Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt 16 Stunden bei 25°. Man filtriert, dampft das Filtrat zur Trockene ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform, Aceton und erhält die Titelverbindung.

f) Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys (Boc-Cys-OH) - Val-Leu-Gly-Lys (Boc) -Leu-Ser-Gln-Glu ( OBu') -Leu-His-Lys (Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2

Die Endverbindung der Stufe e) wird in 100 ml Chloroform/Methanol 1:1 gelöst. Bei 0° gibt man 0,18 ml Methoxy-carbonylsulfenylchlorid zu und rührt l'/2 Stunde bei dieser Temperatur. Dann gibt man 0,20 ml Diäthylamin zu. Nach 5 Minuten bei 0° fügt man 0,3 Boc-Cystein hinzu und rührt noch 2 Stunden bei Raumtemperatur. Die Lösung wird eingeengt, und das Produkt mit Diäthyläther ausgefällt, abgenutscht und getrocknet. Man erhält die Titelverbindung, die bei der nächsten Reaktion eingesetzt wird.

g) H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys (H-Cys-OH) Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2

Man löst 3,0 g des geschützten Peptids der Stufe f) unter Stickstoffatmosphäre in 100 ml Trifluoressigsäure, lässt 15 Minuten bei 20° stehen und dampft zur Trockene ein. Das Produkt wird durch «reversed-phase» Chromatographie (Gradient von Acetonitril in Wasser/Trifluoressigsäure) gereinigt. Die die erwartete Substanz enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Man filtriert über einem basischen Ionenaustauscher in der Acetat-Form und lyophilisiert das Filtrat. Man erhält die Titelverbindung als Polyacetat, Polvhydrat.

[<x] 2g = -62° (in 50% Essigsäure, c=0,19) F=0,80.

Beispiel 3

Na-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg. Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly- Thr-Pro-NH2

a) Na-Isocarproyl-Ser( Bu')-Thr( Bu')-Ala- Val-Leu-OCH2-phenyl- (p) OCH2-co-(polystyrol-1 %-divinylbenzol)

V on Fmoc-Leu-OCH2-phenyl-(p)OCH2-co(polystyrol-1 %-divinylbenzol) (1,56 g entsprechend 0,7 mMol) spaltet man die Na-Fmoc-Gruppe ab durch Behandeln mit Piper-idin (20% v/v) in DMF während 10 Minuten. Man wäscht gut mit DMF und fügt dazu, in je 5 ml DMF gelöst, 0,71 g Fmoc-Val-OH, 0,28 g 1-Hydroxybenzotriazol und 0,32 ml Diisopropylcarbodiimid. Nach 45 Minuten nutscht man ab und wäscht das Peptidharz gut mit DMF. Man wiederholt die Abspaltung der Na-Fmoc-Gruppe und die Ankupplung mit der in der Sequenz folgenden Aminosäure in der Reihenfolge:

Fmoc-Ala-OH (0,65 g) Fmoc-Thr(But)-OH (0,83 g) und Fmoc-Ser(Bu')-OH (0,80 g). Im letzten Reaktionszyklus (Abspalten der Fmoc-Schutzgruppe, Acylierung mit geschützter Aminosäure) ersetzt man das Aminosäurederivat durch Isocapronsäure (0, 41 g), erhöht die Mengen von 1-Hydroxybenzotriazol auf 0,53 g und von Diisopropylcarbodiimid auf 0,54 g und kuppelt während 15 Stunden. Man wäscht das geschützte Peptidharz gut mit DMF und Methylenchlorid, trocknet im Vakuum bei 40 °C während 15 Stunden und erhält das geschützte Peptidharz als farbloses Pulver.

b) Na-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala- Val-Leu-OH

Na-Isocaproyl-Ser(But)-Thr(But)Ala-Val-Leu-OCH2-phe-

nyl-(p)OCH2-co-(polystyrol-l %-divinylbenzol) (1,0 g) rührt man in einem Gemisch von Trifluoressigsäure (5 ml) und Methylenchlorid (5 ml). Man filtriert, wäscht mit demselben Gemisch (5 ml), dann mit Methylenchlorid, engt im Vakuum stark ein und fallt durch Zugabe von Äther vollständig aus. Man wäscht den Niederschlag gut mit Äther, trocknet im Vakuum über festem Kaliumhydroxid und erhält die Titelverbindung als farbloses, amorphes Pulver.

c) Na-Isocaproyl-Ser- Thr-Ala- Val-Leu-Gly-Lys (Boc) -Leu-Ser-Gln-Glu ( OBu') -Leu-His-Lys (Boc) -Leu-Gin- Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2

Zu einer Lösung von Na-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-OH (0,165 g) in DMF (7 ml) fügt man H-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OBut)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2hy-drochlorid (0,59 g), 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-ben-zotriazin (0,017 g), Dicyclohexylcarbodiimid (0,065 g) und soviel N-Äthyl-N,N-diisopropylamin, bis eine Probe des Reaktionsgemisches auf angefeuchtetem pH-Papier eine Reak5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

671 229

tion von pH ca. 6 anzeigt. Nach 16 Stunden fallt man durch Zugabe von Äther aus, trocknet und erhält die Titelverbindung.

d) Na-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala- Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly- Thr-Pro-NH2

Man löst 0,50 g des teilgeschützten Peptids der Stufe c) in einem Gemisch von Trifluoressigsäure (50% v/v) und Methylenchlorid. Nach 1 Stunde gibt man dazu 50 ml Äther, welcher 0,6 mMol HCl enthält. Man filtriert, wäscht mit Äther und trocknet im Vakuum, das Produkt wird durch «reversed-phase»-Chromatographie in einem Gradient Ace-

Bsp. A A7

tonitril in H3P04 (2%) gereinigt. Die die reine Substanz enthaltenden, vereinigten Fraktionen filtriert man über einen basischen Ionenaustauscher in der Acetat-Form. Man lyophilisiert und erhält die Titelverbindung als Polyacetat, 5 Polyhydrat.

[a] 2g = -32,2° (c=0,3 in AcOH 95%) F = 0,87

Analog zu den Beispielen 1, 2 und 3 wurden die nachfolgenden Verbindungen hergestellt.

io a) der Formel A-Leu-Ser-Thr-A7-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Ans-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-ProNH2

F [a] 2d

4

H-Ser-Asn-

Cys

0,79

-40,0° (c = 0,32 in AcOH 50%)

5

H-Ser-Asn-

Cys(-S-CH2-CH2-COOH)

0,77

52,8° (c = 0,4 in AcOH 50%)

6

H-Ser-Asn-

Asu

0,78

-20° (c=0,4 in AcOH 95%)

7

H-Asn-

Cys(H-Cys-OH)

0,77

-15° (c=0,4 in AcOH 100%)

8

H-Ser-Asn

Glu

0,70

-21,5° (c=0,4 in AcOH 95%)

9

H-Ser-Asn-

Ala

0,81

-25,2° (c=0,23 in AcOH 95%)

10

H-Ser-Asn-

Ser

0,77

-26,3° (c=0,4 in AcOH 95%)

11

H-Gly-Asn-

Cys(H-Cys-OH)

0,83

-41,8° (c=0,28 in AcOH 95%)

12

H-Ser-Asn-

Cys(Me)

0,80

-21,T (c=0,26 in AcOH 95%)

13

H-Ser-

Cys(H-Cys-OH)

0,85

-31,6° (c = 0,38 in AcOH 85%)

14

H-

Ala

0,91

-30,4° (c = 0,44 in AcOH 95%)

15

H-Ser-Asn-

Cys(Acm)

0,78

-21° (c=0,16 in AcOH 95%)

16

H-Ser-Asn-

Lys

0,78

-21,7° (c = 0,41 in AcOH 95%)

17

H-Ser-Asn-

Arg

0,86

-24,2° (c=0,33 in AcOH 95%)

18

H-

D-Ala

0,90

-26,5° (c=0,62 in AcOH 95%)

19

ch3co-

Ala

0,90

-34,7° (c=0,34 in AcOH 95%)

20

H-

Phe

0,83

-30,0° (c=0,43 in AcOH 95%)

b) der Formel A-Thr-ArVal-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr- Gly-Ser-Gly-Thr-ProNH2

Bsp. A A7 F [a] 2ß (c in AcOH 95%)

I "

21

H-Ser-Asn-Ser

Cys(H-Cys-OH)

0,79

-36,8° (0,47)

22

H-Ser

Cys(H-Cys-OH)

0,85

-44,2° (0,59

23

H-Ser-Asn-Leu

Cys(H-Cys-OH)

0,82

-34,9° (0,3)

24

H-Ser-Leu

Cys(H-Cys-OH)

0,85

-34,4° (0,27)

25

H-Leu-DAla

Ala

0,90

-21,T (0,53)

26

H-DLeu-Ser

Ala

0,83

-31,3° (0,47)

27

H-Phe-Ser

Ala

0,90

-33,9° (0,52)

28

H-Leu-DSer

Ala

0,84

-26,4° (0,28)

29

Adamantanacetyl-Ser

Ala

0,83

-30,5° (0,4)

30

H-Leu-Ala

Ala

0,90

-31,7° (0,32)

31

H-Leu

Ala

0,86

-35,4° (0,35)

32

H-Cha-Ser

Ala

0,85

-26,2° (0,45)

33

CH3CO-Ser

Ala

0,92

-33,3° (0,37)

34

H-Ala-Ser

Ala

0,90

-32,0° (0,50)

35

H-Pro-Ser

Ala

0,86

-37,5° (0,44)

36

Cyclohexylpropionyl-Ser

Ala

0,83

-28,3° (0,24)

37

Cyclopentyl-CO-Ser

Ala

0,90

-35,1° (0,37)

37a

Pyroglutamyl-Ser

Ala

0,87

-34,6° (0,3)

37b

Decanoyl-Ser

Ala

0,91

-25,6° (0,25)

671 229

8

c) der Formel H-Leu-Ser-A6-Ala-A8-A9-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2

Bsp. A6 A8

a9

ion

(ein AcOH 95%)

f

38 Thr Gly

Leu

-25,3°

(0,43)

0,85

39 Thr Val

DLeu

-26,9°

(0,51)

0,86

40 DThr Val

Leu

-17,6°

(0,55)

0,85

41 Thr Val

Phe

-28,6°

(0,44)

0,88

42 Thr Aib

Leu

-28,0°

(0,50)

0,88

Beispiel 43

H-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(H-Cys-OH) -Nle-Leu-Gly-Thr-

Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-

Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2

Analog zum Beispiel 2 wurde die Titelverbindung hergestellt.

[a] 2ß = -44° (c=0,ll in AcOH 95%) F=0,75 Beispiel 44

Na-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly- Thr-Pro-NH2

Dieses Peptid wird stufenweise auf einem Polystyrolharz als Träger aufgebaut. Die Boc-Gruppe wird als Schutzgruppe für die a-Aminogruppen verwendet und die funktionellen Gruppen in den Seitenketten wie folgt geschützt: Lys(2-Chlorbenzyloxycarbonyl), Ser (Benzyl), Thr (Benzyl), Arg (Tosyl), His (Tosyl), Tyr (4-Chlorbenzyloxycarbonyl), Lys (4-Methylbenzyl), Glu (Benzyl).

Amino-4-methylphenyl-methyl-Co(polystyrol-divinyl-benzol)-harz (0,7 mmol/g) werden dem nachfolgenden Behandlungszyklus, Stufen 1 bis 7, unterworfen:

1) DCM

2) Trifluoressigsäure (50%) in DCM

3) DCM

4) Diisopropyläthylamin (10%) in DMF

5) DMF

6) vorher hergestelltes symmetrisches Anhydrid

(2,8 mmol per g Ausgangsharz) einer Boc-Aminosäure in DMF

7) DMF

Die Volumen der Waschlösungen und Reagenzien betragen 5 bis 20 ml pro Gramm des Ausgangsharzes. Jede Stufe wird so oft wiederholt als notwendig ist, entweder für die vollständige Reaktion des Harzes (Stufen 2, 4, 6) oder für die vollständige Entfernung des vorhergehenden Reagenzes vom Harz (Stufen 1, 3, 5,7). Nach jedem Zyklus werden Proben des Harzes genommen und auf Vollständigkeit der Reaktion mittels des Ninhydrintestes geprüft.

Die symmetrischen Anhydride der Boc-Aminosäuren werden gerade vor Verwendung hergestellt durch Reaktion der Boc-Aminosäure (2,8 mmol pro g Harz) und DCCI (1,4 mmol pro g Harz) in DCM, welches soviel DMF enthält als notwendig ist für die vollständige Auflösung der Boc-Aminosäure. Das Gemisch wird filtriert, weiteres DMF dem Filtrat zugegeben, das Volumen durch Verdampfen des DCM bei einer Temperatur nicht höher als 15 °C verringert und die erhaltene Lösung in der Stufe 6) verwendet.

Der Zyklus der Reaktionen 1) bis 7) wird für alle Aminosäurereste in der Weise wiederholt, dass die Aminosäuresequenz der Formel I erhalten wird, wobei jedoch Boc-Gln-OH und Boc-Arg(Tos)-OH in der Stufe 6) als vorher hergestellte Ester mit 1-Hydroxybenzotriazol in DMF eingesetzt werden.

Im letzten Zyklus, in der Stufe 6), werden Isocapronsäu-re, Diisopropylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol (für alle 3,5 mmol pro g des Ausgangsharzes) in DMF dem Harz zugegeben. Nach 15 Stunden wird das Harz gewaschen mit DMF und DCM getrocknet. Zu dem Peptidharz (1 g) gibt man p-Kresol (1 g), Dimethylsulfid (1 ml) und HF (10 ml). Nach einer Stunde bei 0 °C werden die flüchtigen Bestandteile bei 0 °C abdestilliert. Der Rückstand wird mit Äthylacetat gewaschen, mit mehreren Portionen Essigsäure (10%) in Wasser extrahiert und der wässrige Extrakt lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt wird gereinigt durch «reversed-phase» Chromatographie auf einer Octadecyl-Silicasäule, welche mit einem Gradient von Acetonitril in Phosphorsäure (2%) eluiert wird. Fraktionen, welche die Verbindung in reiner Form enthalten, werden zusammengefügt, durch ein schwach basisches Ionenaustauscherharz in Acetatform filtriert, lyophilisiert und getrocknet. Die Titelverbindung wird als weisses, flockiges Pulver erhalten.

[<x] 2g = -34° (c=0,53 in AcOH 95%). F=0,93.

Die Polypeptidderivate der Formel I und die physiologisch verträglichen Säureadditionssalze bzw. Komplexe dieser Verbindungen weisen im Tierversuch interessante phar-makodynamische Eigenschaften auf. Sie können daher als Arzneimittel verwendet werden. Insbesondere senken sie den Calciumplasmaspiegel und bewirken als Antagonisten des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen. Die hypocalcämische Wirkung der neuen Verbindungen kann in bekannter Weise z.B. gemäss der Methode von M.Azria et al., berichtet beim Calcitonin 1984 Symposium, 24. Oktober, Mailand, und publiziert als «Short Communication» in der «Current Clinical Practice Series» Nr. 42, Excerpta Medica 1986, p. 104, gemessen werden. Bei dieser Methode wird eine Ca2+-ion selektive Elektrode verwendet, um kontinuierlich das Gehalt an Calcium-ionen im Blut junger Kaninchen zu messen. Die Verbindungen werden i.v. verabreicht in einer Dosis von 0,1 bis 10 Hg/kg, z.B. übereinstimmend mit ca. 1 internationaler Einheit pro kg. Die Messungen werden während 5 Stunden durchgeführt und die «area under the curve» berechnet. Die Verbindungen können auch in anderen Tests, z.B. im hypocalcämischen Standardtest von M. Kumar et al., J. Endocrinology (1965), 33, p. 469, bei Ratten und in gleicher Dosierung geprüft werden. Eine hypocalcämische Aktivität von 300 bis 6000 internationalen Einheiten pro mg wird in diesem Test für die erfindungsgemässen Verbindungen gemessen. Bevorzugt sind die Verbindungen der Beispiele 3, 29 und 36.

Die erfindungsgemässen Verbindungen sind somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plas-macalciumspiegels bzw. Beeinflussung des Knochenstoffwechsels erwünscht ist, z.B. Hypercalcämien infolge Mangels des endogenen Thyreocalcitonins durch Ausfall von Schilddrüsengewebe oder Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen. Sie sind ferner indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z.B. Osteoporose verschiedener Genese (z.B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivi-tät, bei malignen Erkrankungen u.s.w.), Frakturen, Osteo-malacie, Rachitis- und renal bedingte Osteodystrophie, bei Schmerzen, z.B. Knochenschmerzen zusammenhängend mit Osteoporose, neurodystropischen Krankheiten, Krankheit von Paget, sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat.

Die erfindungsgemässen Verbindungen hemmen auch die Pankreassekretion. Diese Hemmung kann in Tierversuchen z.B. mit der Methode beschrieben in Scand. J. Gastroint 6, 423 (1975) durch S.J. Konturek et al. nachgewiesen werden. Die erfindungsgemässen Verbindungen können daher z.B. auch bei akuter Pankreatitis und gastro-intestinalen Störungen, wie Geschwüren, Verwendung finden.

5

10

15

20

25

30

35

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60

65

Für die oben erwähnten Verwendungen beträgt die Tagesdosis etwa 5 bis 1500 internationale Einheiten, die als Einheitsdosis einmal pro Tag oder gewünschtenfalls jeden zweiten oder dritten Tag in Tagesdosen von ca. 5 bis ca. 1500 internationalen Einheiten verabreicht werden können. Die Erfindung umfasst auch pharmazeutische Präparate,

9 671229

welche die erfindungsgemässen Verbindungen enthalten. Diese enthalten die genannten Verbindungen oder ihre pharmakologisch akzeptablen Salze oder Komplexe z.B. in Mischung mit einem flüssigen oder festen Trägermaterial. Diese 5 Präparate können auf übliche Weise hergestellt werden und sollen z.B. für Injektion oder nasale Verabreichung geeignet sein. Es können auch Depotpräparate verwendet werden.

C

Claims

671 229 PATENTANSPRÜCHE

,1 .2

R-(NH-CH-CO) -A6-NH-CH-CO-A8-A9-Z-ProNH2

I

worin

R für H oder R'CO

R'CO für den Acylrest einer Carbonsäure,

Y] für den am a-C-Atom einer a-Aminosäure befindlichen Rest,

Y2 für den am a-C-Atom einer a-Aminosäure befindlichen Rest n für 1 bis 4 A6 für Thr oder D-Thr

As für den Aminoacylrest einer neutralen, lipophilen L-a-Aminosäure

A9 für den Aminoacylrest einer neutralen, lipophilen L-oder D-a-Aminosäure, und

Z für den Polypeptidrest, der sich in der Stellung 10 bis 31 eines natürlichen Calcitonins oder eines Calcitoninanalo-gons mit hypocalcämischer Wirkung befindet, stehen, wobei die 1 bis 4 YrReste in der Formel I unabhängig voneinander die gleichen oder verschiedenartige Bedeutungen haben können und mit Ausnahme des Aminoacylrestes Ag alle Aminosäurereste in der Formel I die L- oder D-Konfiguration haben können, mit der Massgabe, dass falls Y2 für CH2SH steht und n 4 bedeutet, der N-terminale Aminoacylrest nicht H-Cys sein darf, sowie die Salze und Komplexe dieser Verbindungen.

1. Polypeptide der Formel I,

Y Y-
2. Polypeptide gemäss Anspruch 1 der Formel I, worin

Y2 für -CH2-S-S-CH2-CH-COOH I

nh2

-ch2-s-s-ch2-ch2-cooh

-(CH2)p-COOH oder -CH2-S-Y3

Y3 für Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen, gegebenenfalls durch Methyl oder Methoxy substituiertes Benzyl oder CH3CONH-CH2-, und p für 3 bis 5 stehen.
3. Verbindungen gemäss Anspruch 1 oder 2 der Formel I, worin Z für Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr steht.
4. Verbindungen gemäss Anspruch 2 oder 3 der Formel I, worin -NH-CH(Y2)-CO für den Rest einer neutralen lipophilen a-Aminosäure steht.
5. Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 der Formel I, worin n für 2 und R für H oder R'CO stehen.
6. Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 der Formel I, worin n für 1 und R für R'CO stehen.
7. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1 der Formel Na-Isocapropyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2.
8. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1 der Formel Ada-mantanacetyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Axg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2.
9. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1 der Formel Cy-clohexylpropionyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2.
10. Pharmazeutische Präparate, welche eine Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9 in freier Form oder als pharmakologisch verträgliches Salz oder Komplex, zusammen mit einem flüssigen oder festen Träger, enthalten.