NL8602950A

NL8602950A - Calcitonine-derivaten en werkwijzen voor het bereiden van deze derivaten en van farmaceutische preparaten die ze bevatten.

Info

Publication number: NL8602950A
Application number: NL8602950A
Authority: NL
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1985-12-04
Filing date: 1986-11-20
Publication date: 1987-07-01
Also published as: DK580186D0; GR862836B; AU600242B2; ES2012510A6; JPS62132898A; IL80846A0; GB8628739D0; IT8648701A0; FI864939A; HUT44794A; KR880006263A; GB2184729A; DK580186A; GB2184729B; CH671229A5; AU6606186A; BE905849A; FR2590902B1; PT83835A; PT83835B

Description

* - 1 -

Calcitonine-derivaten en werkwijzen voor het bereiden van deze derivaten en van farmaceutische preparaten die ze bevatten.

Deze uitvinding heeft betrekking op calcitonine-derivaten, op werkwijzen voor het bereiden van deze derivaten en op farmaceutische preparaten die ze bevatten.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking 5 op verbindingen met formule 1, waarin R een waterstofatoom of een R'CO groep voorstelt, waarin R'CO een acylgroep van een carbonzuur is, de groep is die aan een alfa koolstof-atoom van een alfa-aminozuur is gebonden, 10 de groep die eveneens aan een alfa koolstofatoom van een alfa-aminozuur is gebonden,

-CH -S-S-CH -CH-COOH

6 ^ | nh2 -CH.-S-S-CH -CH -COOH, -(CH.) -C00H of i 2 2 2 p 15 -C^-S-Y^ weergeeft, Y3 een alkylgroep met 1-4 koolstofatomen of een benzylgroep die desgewenst door methyl of methoxy is gesubstitueerd, of een CH^CO-NH-C^·* groep is, n = 1-4, 20 Ag een Thr of D-Thr groep voorstslt, p = 3-5, A. de aminoacylgroep van een neutraal,

O

lipofiel L-a-aminozuur weergeeft, A. de aminoacylgroep van een neutraal, y 25 lipofiel, L- of D-a-aminozuur weergeeft, Z een polypeptidegroep die overeenkomt met de polypeptidegroep op de plaatsen 10-31 van een natuurlijk calcitonine of een derivaat of analogon daarvan met een hypo-calcemische werking is, waarin, indien er meer dan één Y^-30 groep aanwezig is, deze al of niet gelijk zijn en, met uitzondering van de A -groep, alle aminozuurgroepen, onafhankelijk van 3 8602950 * Η - 2 - elkaar, de L- of D-configuratie kunnen bezitten, onder de voorwaarde dat indien Y£ is -CH^SH en n is 4, de N eindstandige amino-acylgroep een andere groep dan H-CyS is.

De verbindingen kunnen in de vrije vorm, 5 in een zoutvorm of in een complex-vorm voorkomen. In elk van deze vormen kunnen ze gehydrateerd zijn. Zoals reeds werd opgemerkt stelt Z in formule 1 diepeptidegroepen voor die op de plaatsen 10-31 in de verschillende, bekende calcitoninen, bijvoorbeeld in menselijk-, zalm-, aal-, runder-, schaap-, kip-, ratten- of var-10 kenscalcitonine, aanwezig zijn., evenals in de derivaten en analo-ga van deze calcitoninen met een hypocalcemische werking, zoals bijvoorbeeld in de hierna volgende proeven is beschreven of met een calcitonine-achtige werking. De derivaten en analoga van deze calcitoninen zijn in het bijzonder de in de natuur 15 voorkomende calcitoninen, waarin één of een aantal aminozuurgroe-pen vervangen zijn door één of een aantal andere aminozuurgroepen, of waarin de S-S-brug vervangen is door een alkyleenbrug, of waarin één of een aantal aminozuren zijn weggelaten. De peptide-groep Z heeft geschikt een lengte van 22 aminozuren, doch door 20 het weglaten van één of een aantal aminozuurresten (desaminoacyl-derivaten) kunnen ze minder aminozuurgroepen bevatten.

Aanbevolen verbindingen met formule 1 zijn

die waarin Z

a) Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr- 25 Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala b) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr 30 c) Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr, voorstelt,.

In het bijzonder worden aanbevolen verbindingen met formule 1, waarin Z de hiervoor onder b) of c), in het 35 bijzonder c), gegeven definitie heeft, R'CO geschikt een acylgroep van een alifa- 8602950 V 4 - 3 - tisch, cycloalifatisch, aromatisch of heterocyclisch carbonzuur is en R' bij voorkeur a) een alkylgroep met 1-17 koolstofatomen, in het bijzonder een alkylgroep met 3-9 koolstofatomen, bij voor-5 keur verzadigd, b') een cycloalkylgroep met 5-7 koolstof-atomen of een (C<-_7) cycloalkyl (C^ alkylgroep r c’) een adamantyl-, adamantylmethyl- of adamantylethyl-groep of 10 d') een fenyl-, benzyl- of fenylethylgroep voorstelt.

De alkyl-, cycloalkyl- of fenylgroepen kunnen bijvoorbeeld door halogeen (bijvoorbeeld met een volgnummer van 9-35), nitro, hydroxyl, alkoxy enz., zijn gesubstitueerd.

15 Het verdient aanbeveling dat slechts één substituent aanwezig is.

R'CO kan bijvoorbeeld een desaminogroep van een in de natuur voorkomend α-aminozuur zijn.

Voor R' verdienen de definities a1), b’) en c') aanbeveling.

20 Het α-aminozuur dat overeenkomt met Y^ en is bij voorkeur een in de natuur voorkomend aminozuur. Het is ook mogelijk dat het α-aminozuur bijvoorbeeld 3-cyclohexylalanine of o-aminoisoboterzuur is.

Indien n = 4, 25 a") stelt de N eindstandige acylaminogroep (overeenkomende met de tweede aminozuurgroep in het in de natuur voorkomende calcitonine) bij voorkeur Ser, Gly of Ala, voor, b") is de tweede aminoacylgroep (overeenkomende met de derde aminozuurgroep van het in de natuur voor- 30 komende calcitonine) bij voorkeur Asn of Ser, c") geeft de derde aminoacylgroep (overeenkomende met de vierde aminozuurgroep in het in de natuur voorkomende calcitonine), bij voorkeur Leu, Asn, Ser, Phe, D-Leu of de groep van cyclohexylalanine weer, en 35 d”) stelt de vierde aminoacylgroep (over eenkomend met de vijfde aminozuurgroep in het in de natuur voor 8602950 «* * - 4 - komende calcitonine) bij voorkeur Ser of Ala voor.

Is n = 3, dan hebben de N-eindstandige, tweede en derde aminoacylgroepen bij voorkeur de respectievelijke betekenissen b"), c") en d").

5 Stelt n = 2 voor, dan hebben de N-eind standige en tweede aminoacylgroepen bij voorkeur de respectievelijke betekenissen c") en d").

Is n = 1 dan is de N-eindstandige amino-acylgroep bij voorkeur Ser of Ala.

10 Ar is bij voorkeur Thr.

O

?2 -NH-CH-CO- is bij voorkeur Cys, een derivaat van cysteine zoals hiervoor gedefinieerd voor of een neutrale, lipofiele, α-aminoacylgroep, in het bijzonder Ala, 15 in het bijzonder een neutrale, lipofiele α-aminoacylgroep, vooral Ala.

A0 is bij voorkeur een aminoacylgroep van

O

een neutraal, lipofiel, α-aminozuur, in het bijzonder Val of Gly.

Αή stelt bij voorkeur een aminoacylgroep 20 van een neutraal, lipofiel, α-aminozuur, in het bijzonder Leu of Phe, voor.

•n is bij voorkeur 2-, R een waterstofatoom of een R'CO-groep en in het bijzonder is n = 1 en R een R'CO-groep.

25 Het verdient aanbeveling dat alle amino- zuurgroepen de L-configuratie bezitten.

Een groep verbindingen heeft formule lp, waarin een Gly of Ser groep voorstelt, 30 Y1 (CH^.)^ of -S-S-CH^-CH- weergeeft, waarin nh2 de laatste groep via het eindstandige S-atoom aan de aangrenzende -CHj-groep in formule lp is gehecht, en een polypeptidegroep die samengesteld is 35 uit 24 aminozuren en die overeenkomt met de groep op de plaatsen 8-31 van een in de natuur voorkomend calcitonine of van een deri- 8602950 #- 'i - 5 - vaat of analogon daarvan met een hypocalcemische werking voorstelt en waarin alle aminozuurgroepen, waaronder die op de plaatsen die met * zijn gemerkt, de L-configuratie bezitten.

Bij voorkeur is X^ Ser, of stelt Y een 5 -S-S-CBL-CH- groep voor of geeft een Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-

Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr groep weer.

10 Eveneens aanbevolen worden a) X = Gly Z = Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala b) X = Ser 15 Z = Val-Leu-Gly~Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-

Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr.

Een andere groep verbindingen bezit formule 1 , waarin pa X" de NH groep of een binding voorstelt, 20 doch, indien m" = 0, slechts een binding is, Y^,f een groep voorstelt die met het ot-koolstof atoom van een in de natuur voorkomend aminozuur is gebonden, Y2" een groep weergeeft die met het ct-kool-stofatoom van een in de natuur voorkomend α-aminozuur is gebonden, 25 of -ch2-s-s-ch2-ch-cooh, -CH^S-S-CÏ^-CH^COOH, m2 -(CH2)p„-COOH of -CH2-S-Y3" weergeeft, Y3” een alkylgroep met 1-4 koolstofatomen is, m" = 0 of 1, 30 n" = 0-3, p" = 3-5, en Z" de polypeptidegroep voorstelt die is samengesteld uit 21 aminozuren en die overeenkomt met de plaatsen 8-31 van een in de natuur voorkomend calcitonine of van een deri- 35 vaat of analogon daarvan met een hypocalcemische werking, waarbij de 1-4 Y "-groepen in formule 1 dezelfde of verschillende bete-1 pa 8602950 - 6 - . « kenissen hebben en alle aminozuren in formule 1, onafhankelijk van elkaar, de L- of D-configuratie bezitten.

In een groep verbindingen is Z" a) Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His- 5 Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala b) Val-Leu-Gly-Lys-Leu-S er-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr, of 10 c) Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-

Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr.

In formule 1 stelt de v 'I v " Pa 1 1 r i H-X"- (CH-CO) „ - (NH-CH-CO) ^groep bij voorkeur 15 Y." Y." I «·* H-X"-(CH-CO) ,-(NH-CH-CO) ,,,-Ser- voor, waarin n' " = 0-2, of Y." Y." 11 11 een H-X-(CH-CO) (NH-CH-CO)^„„-Leu-Ser- groep, waarin n,,M = 0 of 1 en de Y"^-groepen bij voorkeur CH^OH, (CH^)^CH-CH^ of CH2*-CONH2 20 zijn.

De vrije vorm van de verbinding met formule 1 kan een vrije basevorm, of, bijvoorbèeld indien een zure groep aanwezig is, een vrije zure vorm zijn.

De polypeptiden volgens de uitvinding kun-25 nen in de zoutvorm of in de vorm van complexen daarvan voorkomen. Zuuradditiezouten kunnen worden gevormd met bijvoorbeeld organische zuren, waaronder polymere zuren en anorganische zuren.

Onder dergelijke zuuradditiezoutvormen vallen bijvoorbeeld de hydro-chloridenen acetaten. Met complexen worden verbindingen van een 30 bekend type bedoeld, gevormd uit verbindingen met formule 1 bij additie van anorganische materialen, bijvoorbeeld anorganische zouten of -hydroxyden, zoals calcium- en zink-zouten, en/of bij additie van polymere, organische materialen.

De onderhavige uitvinding verschaft even-35 eens een werkwijze voor het bereiden van de verbindingen met formule 1. Deze verbindingen kunnen bijvoorbeeld worden bereid vol- 8602950 r - 7 - gens methoden die bekend zijn uit de stand der techniek van de peptidechemie of volgens voor de hand liggende, chemische equivalenten daarvan, bijvoorbeeld volgens een werkwijze die omvat: 5 a) het verwijderen van ten minste één beschermende groep van een beschermd polypeptide met de in formule 1 aangegeven volgorde , b) het samen verbinden via een amide-binding van twee peptide-eenheden, waarvan elk ten minste één aminozuur zoals ge-10 definieerd in formule 1 of een derivaat daarvan in een al of niet beschermde vorm bevat, waarbij de peptide-eenheden zodanig zijn^dat een beschermd of onbeschermd polypeptide met de in formule 1 aangegeven volgorde wordt verkregen en, indien nodig, de werkwijze van stap a) uit te voeren, 15 c) ter bereiding van een verbinding met formule 1 met een eindstandige R^CO-groep, reactie van een al of niet beschermd peptide met de in formule 1 aangegeven volgorde met een zuur met formule R'COOH of een reactief zuurderivaat daarvan, en indien nodig, uitvoering van de werkwijze van stap a), 20 d) ter bereiding van verbindingen met formule 1, waarin Yeen -CH2-S-S-CH2-CH-COOH of -CH2-S-S-CH2-CH2-COOH groep vooral stelt, hetzij reactie van een verbinding met formule 2 in een al of 25 niet beschermde vorm met een verbinding met formule 3, waarin een groep voorstelt die de vorming van een -S-S-brug met het S-atoom van CH2SH- in het polypeptide met formule 2 vergemakkelijkt, R2 een waterstofatoom, een aminogroep of een beschermde aminogroep voorstelt en 30 R^ een hydroxylgroep of een beschermende groep voor de car-boxylgroep weergeeft, hetzij reactie van een verbinding met de formule 4 in een al of niet beschermde vorm, waarin R^ een hiervoor gedefinieerde betekenis heeft, met een verbinding met de formule 5 en ten-35 slotte het desgewenst uitvoeren van stap a) van de werkwijze en indien 8602950

* V

- 8 - nodig het omzetten van het aldus verkregen polypeptide in een vrije vorm, zuuradditiezout vorm of complexe vorm.

De hiervoor beschreven werkwijze kan bijvoorbeeld analoog aan de werkwijzen beschreven in de hierna vol-5 gende voorbeelden worden uitgevoerd. Voor zover het bereiden van de uitgangsmaterialen niet in het bijzonder is beschreven, zijn de verbindingen bekend of kunnen volgens in de stand der techniek beschreven methoden worden bereid en gezuiverd.

De eindprodukten met formule 1 kunnai even-10 eens op een gebruikelijke wijze worden gezuiverd, zodat ze minder dan 5 % of nog minder andere polypeptide,bijprodukten bevatten .

De als uitgangsmateriaal bij de werkwijzen a) en b) toegepaste polypeptiden kunnen eveneens op een bekende 15 wijze volgens een in oplossing of in de vaste fase uitgevoerde werkwijze worden verkregen.

Het bereiden van peptide-eenheden die een -CH2-S-S-CH2-CH2-COOH of CH2-S-S-CH2-CH(NH2)-COOH groep als de Y2~groep bevatten, kan analoog aan de hiervoor beschreven werk-20 wijze d) worden uitgevoerd.

Bij deze werkwijze d) kunnen verbindingen met formule 3 of 4 worden toegepast, waarin R^ de bekende groepen voorstellen die met mercaptanen onder vorming van een S-S-bin- ding reageren, in het bijzonder een S-alkyl- of S-COOalkyl- 25 groep, een groep met formule 5a of een -S-SO^-groep voorstelt. In deze groepen geeft alkyl in het bijzonder een alkylgroep met 1-4 koolstofatomen weer. Het invoeren van deze groepen in de verbindingen met vrije SH-groepen vindt analoog aan methoden die bekend zijn uit de zwavelchemie plaats.

30 In de volgende voorbeelden zijn alle tem- - -20 peraturen opgegeven in °C en zijn de / α / - waarden niet-ge- corrigeerd. De volgende afkortingen werden toegepast: /C°-

Aib = de α-aminoisoboterzuurrest (CH_)„ - C 35 VnH-

Boe = tert.-butoxycarbonyl 8602950 * -¾ - 9 -

Bufc = tert.-butyl

Fmoc = 9-fluorenylmethoxycarbonyl

Scm = methoxycarbonylsulfenyl

Trt = trityl 5 Asu = a-amino suberinezuur

Cys (Me) = S-methylcysteine

Acm = acetoamidomethyl ^ C0-

Cha = de 3-cyclohexylalaninerest C_H..-CH0-CH

oil Δ -y X NH- 10 DMF = dimethylformamide DCM = dichloormethaan

Alle peptiden worden verkregen als poly-acetaat.polyhydraat, tenzij anders is aangegeven, met een peptide-gehalte tussen 70 en 90 %. De polypeptiden bevatten minder dan 15 5 % andere peptiden bepaald volgens HPLC-analyse.

"F", zoals hierin toegepast, duidt op de verhouding van polypeptiden (= het peptide-gehalte) in de verkregen preparaten (F = 1 komt overeen met 100 %), het verschil met 100 % wordt uitgemaakt door azijnzuur en water.

20 I-]

Voorbeeld I: H-Leu-Ser-Thr-Cys(H-Cys-OH)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 a) Fmoc-Leu-Ser(But)-Thr(But)-cys(SBut)-Val-Leu-OCH2-fenyl-25 (p)0CH2-co(polystyreen-l%-divinyl-benzeen)

Men liet 1 g p-hydroxymethyl-fenoxymethyΙσο (polystyreen-1%-vinylbenzeen) opzwellen in een mengsel van dimethylformamide en methyleenchloride (1:4, vol./vol.), filtreerde en mengde met een oplossing van 0,74 g Fmoc-Leucine en 0,19 g 30 1-hydroxybenzotriazool in 5ml van het hiervoor genoemde oplosmid-delmengsel. Daarna voegde men 0,43 g dicyclohexylcarbodiimide en 85 mg 4-dimethylaminopyridine, elk in 5 ml van hetzelfde oplos-middelmengsel, toe. Het mengsel werd 16 uren geroerd bij 20°C, gefiltreerd en gewassen met het oplosmiddelmengsel en daarna met 35 dimethylformamide. Aldus werd Fmoc-Leu-OCH2~fenyl-(p)-0CH2-co-(polystyreen-l%-divinylbenzeen) verkregen. Na afsplitsen van de 8602950

* V

- 10 -

Fmoc door behandeling (10 minuten) met een mengsel van piperidine en dimethylformamide (1:4, vol./vol.) en wassen met dimethyl-formamide werden de volgende reagentia, elk in 5 ml dimethylformamide, toegevoegd: 0,71 g Fmoc-valine, 0,28 g 1-hydroxy-5 benzotriazool en 0,32 ml diisopropylcarbodiimide, waarna het mengsel 45 minuten werd geroerd. Dezelfde reacties (afsplitsen van de

Fmoc groep, koppeling van het volgende Fmoc-aminozuur worden t t achtereenvolgens uitgevoerd: Fmoc-Cys(SBu )-OH (0,9 g), Fmoc-Thr(Bu )-OH (0,83 g) , Fmoc-Ser(Bu*”)-OH (0,8 g) en Fmoc-Leu-OH (0,74 g) . Na 10 elke koppelingswerkwijze werd onder toepassing van een ninhydrien-proef een controle uitgevoerd om na te gaan of de koppeling volledig was.

De in de titel genoemde verbinding werd verkregen .

15

b) Fmoc-Leu-Ser-Thr-Cys(SBu )-Val-Leu-0H

Men roerde 1,2 g Fmoc-Leu-Ser(Bu*")-Thr(Bu^)-t

Cys (SBu ) -Val-Leu-OCH^-feny l-OC^-co (polystyreen-1%-divinyl-benzeen (ca 0,4 mmol peptide/g) 1 uur in 10 ml van een mengsel van 20 trifluorazijnzuur en methylèenchloride (1:1, vol./vol.). Het mengsel werd gefiltreerd en de overblijvende hars werd gewassen met een mengsel van gelijke delen trifluorazijnzuur en methyleenchlo-ride en daarna met methyleenchloride, het filtraat werd onder verminderde druk geconcentreerd en men sloeg neer met 25 ml ether.

25 Het afgezette produkt werd gewassen met ether en onder verminderde druk gedroogd. Men verkreeg de in de titel genoemde verbinding.

4- c) Fmoc-Leu-Ser-Thr-Cys(SBu )-Val-Leu-Gly-Lys(Boe)-Leu-Ser-Gln-Glu(OBu^)-Leu-His-Lys(Boe)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg- 3 0 Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-N^

Men loste 1,0 g van het produkt van stap b) op in 15 ml dimethylformamide, voegde daarna 2,3 g jr H-Gly-Lys(Boe)-Leu-Ser-Gln-Glu(OBu )-Leu-His-Lys(Boe)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2, 0,33 g 35 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-benzotriazine en 0,31 g di- 8602950 - 11 - cyclohexylcarbodiimide toe en roerde het mengsel daarna 16 uren bij 25°C. Vervolgens filtreerde men het mengsel, dampte het fil-traat droog, waste het residu met diethylether, chloroform en aceton, droogde onder verminderde druk, en, verkreeg aldus de 5 in de titel genoemde verbinding.

d) H-Leu-Ser-Thr-Cys(SBuS-Val-Leu-Gly-Lys(Boe)-Leu-Ser-Gln-GluiOBu*1)-Leu-His-Lys(Boe)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH^, acetaat 10

Men loste 0,8 g van het beschermde peptide van stap c) op in 8 ml van een mengsel van piperidine en dimethyl-formamide (1:4, vol./vol.) en roerde geduurde 10 minuten. Na indampen onder verminderde druk bij 25 °C loste men het verkregen 15 residu op in 4 ml dime thyIf ormamide. Men voegde 50 ƒ11 ijsazijn toe en goot de oplossing uit in 80 ml ether. Het neergeslagen pro-dukt werd onder afzuigen afgefiltreerd, gewassen met ether en onder verminderde druk bij 20°C gedroogd. Aldus verkreeg men de in de titel genoemde verbinding.

20 e) H-Leu-Ser-Thr-Op (H)-Val-Leu-Gly-Lys(Boe)-Leu-Ser-Gln-Glu-(OBu**) -Leu-His-Lys (Boe) -Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-ira^, acetaat.

Men loste 0,46 g van het peptide van stap 25 d) op in 2,5 ml trifluorethanol en mengde deze oplossing in een argonatmosfeer met 0,69 ml tributylfosfine. Men roerde de oplossing 30 minuten bij 20°C en goot het daarna uit, nog in argonatmosfeer, in 50 ml ethylacetaat en centrifugeerde. Het neergeslagen produkt werd gesuspendeerd in ethylacetaat en weer ge-30 centrifugeerd. Het vochtige residu (de in de titel genoemde verbinding) werd als zodanig onmiddelijk bij de volgende reactie toegepast.

f) Boc-Cys(Scm)-OH, dicyclohexylammoniumzout 35 Men mengde een tot -5°C afgekoelde oplossing 8602950 — 12 — van 1,39 g Boc-Cys(Trt)-OH in 15 ml van een mengsel van chloroform en methanol (2:1, vol./vol.) met 0,5 ml methoxycarbonylsulfënyl- chloride en 0,31 ml diethylamine en roerde het aldus verkregen mengsel 1 uur bij dezelfde temperatuur. Daarna voegde men 0,33 ml 5 diethylamine toe en roerde de oplossing nog eens 5 minuten bij 0°C, verdunde met 50 ml chloroform, waste met 10 %-ige fosforzuur en water en droogde boven magnesiumsulfaat. Na verdampen van het oplosmiddel loste men de verkregen, gele olie op in 3 ml ether en mengde bij +4°C met 0,6 ml dicyclohexylamine. De kristallijne massa 10 werd onder afzuigen afgefiltreerd, gewassen met ether en onder hoog vacuum bij 30°C gedroogd. Aldus verkreeg men de in de titel genoemde verbinding.

- -20

Smpt.: 142-143°C. / a / = -31° (c = 1 in dimethylformamide) .

15 g) H-Leu-Ser-Thr-Cys(Boc-Cys-OH)-Val-Leu-Gly-Lys(Boe)-Leu-Ser-Gln-Glu(OBut)-Leu-His-Lys(Boe)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-N^/ acetaat

Men loste het peptide van stap e) in een 20 argonatmosfeer op in 6 ml trifluorethanol en mengde met een oplossing van 0,16 g Boc-Cys(Scm)-OH.dicyclohexylammoniumzout in 65 ml trifluorethanol. Daarna roerde men de oplossing 2 uren in een argonatmosfeer, concentreerde onder verminderde druk tot ongeveer 7 ml en goot haar uit in 50 ml ether. Het neergeslagen 25 produkt werd afgezogen, gewassen met ether en onder verminderde druk bij 25°C gedroogd.

Aldus verkreeg men de in de titel genoemde verbinding.

i-1 30 h) H-Leu-Ser-Thr-Cys(H-Cys-OH)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-N^

Men loste in een stikstofatmosfeer 3,0 g 35 van het beschermde peptide van stap g) op in 100 ml trifluor- azijnzuur, liet deze oplossing 15 minuten staan bij 20°C en dampte droog. Het produkt werd gezuiverd door een in de omgekeerde fase 8602950 - 13 - uitgevoerde chromatografie (gradiënt van acetonitril in een mengsel van water en trifluorazijnzuur) over octadecylsiliciumdioxyde. De fracties die het zuivere produkt bevatten werden samengevoegd en drooggedampt. Het produkt werd over een basische ionenuitwisse-5 laar in acetaatvorm gefiltreerd en het filtraat werd gelyofili-seerd. Men verkreeg de in de titel genoemde verbinding als poly- acetaat.polyhydraat.

- -20 / α_/β = “42° (in 95 % azijnzuur, c = 0,3). P = 0,36.

I-1 10 Voorbeeld II; H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(H-Cys-OH)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tvr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 a) Boc-Cys(Acm)-Val-Leu-OMe 15 Men loste 28,1 g HCl.H-Val-Leu-OMe, 29,2 g

Boc-Cys(Acm)-OH en 13,6 g 1-hydroxybenzotriazool op in 200 ml methyleenchloride, koelde af tot 5°c, voegde vervolgens 21,0 g dicyclohexylcarbodiimide en 10,1 ml N-methylmorfoiine toe en roerde de oplossing 2 uren, gedurende welke tijd men de temperatuur 20 op liet lopen tot 20°C. Het mengsel werd gefiltreerd, het filtraat werd drooggedampt, het residu werd opgenomen in ethylacetaat en gewassen met 10 %-ige fosforzuur, water, een iN-NaHCO^-oplossing en water. De organische fase werd boven natriumsulfaat gedroogd, waarna door indampen de in de titel genoemde verbinding werd 25 verkregen.

b) H-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-OH

Men loste 20,8 g Boc-Cys(Acm)-Val-Leu-OMe op in 120 ml trifluorazijnzuur. Na 40 minuten dampte men de oplos-30 sing droog, loste het residu op in methanol en filtreerde de oplossing over een weinig basische ionenuitwisselende hars. Het filtraat werd drooggedampt. Het residu werd opgelost in tetrahydro-furan, gemengd met 8,8 g Boc-Thr-OH en 5,4 g 1-hydroxybenztria-zool en na afkoelen tot 0°C met 8,4 g dicyclohexylcarbodiimide.

35 Het produkt werd 2 uren geroerd bij 20°C, gefiltreerd, droogge- 8602950 - 14 - dampt en het verkregen residu werd opgelost in ethylacetaat, gewassen met 10 %-ige fosforzuur, water, een lN-NaHCO^ oplossing en water, gedroogd boven natriumsulfaat en ingedampt. Het residu werd opgelost in 150 ml trifluorazijnzuur en na 40 minuten werd onder 5 verminderde druk ingedampt, behandeld met ether en gedroogd. Het residu werd opgelost in 200 ml methanol en de verkregen oplossing werd behandeld met 45 ml van een lN-natriumhydroxydeoplossing. Na 1 uur werden 100 ml water toegevoegd, de methanol onder verminderde druk verwijderd en de waterige oplossing gefiltreerd over een 10 zwakzure ionenuitwisselende hars. Het filtraat werd drooggedampt en aldus werd de in de titel genoemde verbinding verkregen.

c) Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNHj

Men loste 17 g Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe op 15 in 200 ml hydrazinehydraat, roerde 2 uren bij 20°C en dampte het mengsel bij 25°C droog. Het residu werd gewassen met diethylether en gedroogd en aldus verkreeg men de in de titel genoemde verbinding.

20 d) Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-OH

Men loste 13,6 g Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 op 150 ml dimethylformamide, koelde de verkregen oplossing af tot -20°C, voegde daarna 40 ml van een watervrije oplossing van HC1 (2N) in dioxan, gevolgd door 3,6 ml tert.-butylnitriet, toe. Nadat 25 men het mengsel 10 minuten op -20°C had gehouden, voegde men. 16 ml triethylamine en 13,0 g H-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-OH toe en roerde de verkregen oplossing 16 uren bij 25°C. Daarna werd het mengsel gefiltreerd, het filtraat drooggedampt en het verkregen residu herhaalde malen gesuspendeerd in IN azijnzuur en in water, ge-30 filtreerd en gedroogd, waardoor de in de titel genoemde verbinding werd verkregen.

e) Boc-ServAsn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(Boe)-Leu-t

Ser-Gln-Glu(OBu )-Leu-His-Lys(Boe)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-35 Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Glv-Thr-Pro-NH^ 8602950 - 15 -

Men loste 1,0 g van het produkt van stap d) op in 15 ml dimethyIformamide, waaraan 2,3 g H-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu-(OBuS-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH^, 0,33 g 3,4-dihydro-3-hydroxy-5 4-oxo-1t2.3-benzotriazine en 0,31 g dicyclohexylcarbodiimide wer den toegevoegd en roerde dit mengsel 16 uren bij 25°C. Daarna werd het mengsel gefiltreerd, het filtraat drooggedampt, het residu gewassen met diethylether, chloroform en aceton en de in de titel genoemde verbinding verkregen.

10 \-1 f) Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Boc-Cys-OH)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu(0Bufc)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 __ _ ___

Men loste het produkt van stap e) op in 15 100 ml van een mengsel van gelijke delen chloroform en methanol.

Daarna voegde men bij 0°C 0,18 ml methoxycarbonylsulfenylchloride toe en roerde het mengsel 1 uur en 30 minuten bij deze temperatuur. Vervolgens voegde men 0,20 ml diethylamine toe. Nadat men het mengsel 5 minuten op 0°C had gehouden voegde men 0,3 g 20 Boc-cysteine toe en roerde nog 2 uren bij kamertemperatuur. De oplossing werd onder verminderde druk geconcentreerd en het produkt werd met diethylether neergeslagen, afgezogen en gedroogd. Aldus verkreeg men de in de titel genoemde verbinding.

»-ί 25 g) H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(H-Cys-OH)Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2

Men loste 3,0 g van het produkt van stap 30 f) in een stikstofatmosfeer op in 100 ml trifluorazijnzuur, waarna men het 15 minuten bij 20°C liet staan en droogdampte.

Het produkt werd gezuiverd door een in omgekeerde fase uitgevoerde chromatografie (gradiënt van aceto-nitril in een mengsel van water en trifluorazijnzuur). De frac-35 ties die het ziivere produkt bevatten werden samengevoegd en drooggedampt. Het produkt werd gefiltreerd over een basische ionen- 8602950 + s.

- 16 - uitwisselaar in acetaatvorm en het filtraat werd gelyofiliseerd.

Men verkreeg de in de titel genoemde verbinding als polyacetaat.po-- -20 lyhydraat. / a / = -62° (in 50 %-ige azijnzuur, c = 0,19),

- -20 ~ D

of / a / = -64,2 (in 50 %-ige azijnzuur; c = 0,31) . F = 0,80.

ct 5 Voorbeeld III; N -Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-

Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-

Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH^

Ct t t a) N -Isocaproyl-Ser(Bu )-Thr(Bu )-Ala-Val-Leu-OCH^-fenyl- (p)0CH2-co-(polystyreen-l%-divinylbenzeen) iQ __

De N -Fmoc beschermende groep werd verwijderd

van Fmoc-Leu-OCH2-fenyl-(p)OCH2-co(polystyreen-1%-divinylbenzeen) (1,56 g overeenkomend met 0,7 mMol) door 10 minuten te behandelen met piperidine (20 %, vol./vol.) in dimethylformamide en de hars 15 te wassen met dimethylformamide. Aan de hars werd, in 5 ml dimethylformamide, 0,71 Fmoc-Val-OH, 0,28 g 1-hydroxybenzotriazool en 0,32 ml diisopropylcarbodiimide toegevoegd. Na 45 minuten werd het mengsel gefiltreerd en de hars met dimethylformamide gewassen. Deze cyclus van verwijdering van de Fmoc-groep en koppeling van 20 het aminozuur werd achtereenvolgens herhaald met: Fmoc-Ala-OH

(0,65 g) , Fmoc-Thr (Bu*") -OH (0,38 g) en Fmoc-Ser (Bu^)-OH (0,8 g) .

Bij de volgende reactiecyclus werd het aminozuurderivaat vervangen door 0,41 g isocapronzuur en 0,53g 1-hydroxybenzotriazool en 0,54 g diisopropylcarbodiimide werden 25 gedurende 15 uren toegepast. De hars werd goed gewassen met di- o methylformamide en methyleenchloride, 15 uren gedroogd bij 40 C in vecuum en de beschermde peptidehars werd als een kleurloos poeder verkregen .

30 b) N^-Isocaproy1-Ser-Thr-Ala-Val-Leu~OH

Na-Isocaproyl-Ser (Bu*") -Thr (Bu*") -Ala-Val-Leu-OCH2-fenyl(p)0CH2~co(polystyreen-l%-divinylbenzeen) (1,0 g) werd geroerd in een mengsel van 5 ml trifluorazijnzuur en 5 ml methyleenchloride. Daarna werd het reactiemengsel gefiltreerd, 35 de hars met hetzelfde mengsel (5 ml) en daarna met methyleenchloride gewassen, onder verminderde druk geconcentreerd en het pro- 8602950 - 17 - dukt vrijwel geheel met ether neergeslagen. Het neerslag werd afgefiltreerd, goed gewassen met ether en onder verminderde druk boven vast kaliumhydroxyde gedroogd. De in de titel genoemde verbinding werd als een kleurloos, amorf poeder verkregen.

5 3 c) N -Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys(Boe)-Leu-Ser-Gln-Glu(OBu^j-Leu-His-Lys(Boe)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 ct 10 Aan een oplossing van N -isocaproyl-Ser-

Thr-Ala-Val-Leu-OH (0,165 g) in DMF (7 ml) wordt toegevoegd H-Gly-Lys(Boe)-Leu-Ser-Gln-Glu(OBut)-Leu-His-Lys(Boe)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH^ hydrochloride (0,59 g), 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-benzotriazine 15 (0,017 g), dicyclohexylcarbodiimide (0,065 g) en daarna N-ethyl- Ν,Ν-diisopropylamine totdat het mengsel een reactie van pH 6 op vochtig pH-papier vertoonde. Na 16 uren werd de in de titel genoemde verbinding door toevoegen van ether neergeslagen en gedroogd.

20 α d) N -Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 25 Men loste 0,5 g van het produkt van stap c) op in een mengsel van trifluorazijnzuur (50 %, vol./voL) en methyleenchloride. Na 1 uur voegde men 50 ml ether (die 0,6 mMol HCl bevatte) toe. Het produkt werd afgefiltreerd, gewassen met ether en onder verminderde druk gedroogd. Het produkt werd ge- 30 zuiverd door in de omgekeerde fase uitgevoerde chromatografie in een gradiënt van acetonitril in fosforzuur (2 %). De fracties die de zuivere verbinding ÏB\atten werden samengevoegd en het geheel werd gefiltreerd over een basische ionenuitwisselende kolom in acetaatvorm.

35 De in de titel genoemde verbinding werd gelyofiliseerd en in de vorm van een polyacetaat.polyhydraat ver 8602950 - 18 - kregen.

/"α_7^° = -32,2° (c = 0,3 in AcOH 95 %). F = 0,87).

Op overeenkomstige wijze als beschreven in de voorbeelden I, II of III werden de volgende verbindingen met 5 formule 1 bereid: a) met formule A-Leu-Ser-Thr-Ay-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-

Ser-Gly-Thr-ProNH-.

^ - -20 10 Voor- A A F / a A"

beeld —— " D

IV H-Ser-Asn- Cys 0,79 -40° (c=0,32 in AcOH 50%) V H-Ser-Asn- Cys(-S-CH2-CH2-COOH)-52,8° (c=0,4 in AcOH 50%) VI H-Ser-Asn- Asu 0,78 -20° (c=0,4 in AcOH 95%) 15 VII H-Asn- Cys(H-Cys-OH) 0,77 -15° (c=0,4 in AcOH 100%) VIII H-Ser-Asn Glu 0,70 -21,5° (c=0,4 in AcOH 95%) IX H-Ser-Asn- Ala 0,81 -25,2° (c=0,23 in AcOH 95%) X H-Ser-Asn- Ser 0,77 -26,3° (c=0,4 in AcOH 95%) XI H-Gly-Asn- Cys(H-Cys-OH) 0,83 -41,8° (c=0,28 in AcOH 95%) 20 xii H-Ser-Asn- Cys(Me) 0,80 -27,7° (c=0,26 in AcOH 95%) XIII H-Ser- Cys(H-Cys-OH) 0,85 -31,6° (c=0,38 in AcOH 85%) XIV H- Ala 0,91 -30,4° (c=0,44 in AcOH 95%) XV H-Ser-Asn- Cys(Acm) 0,78 -21° (c=0,16 in AcOH 95%) XVI H-Ser-Asn- Lys 0,78 -21,7° (c=0,41 in AcOH 95%) 25 xvil H-Ser-Asn- Arg 0,86 -24,2° (c=0,33 in AcOH 95%) XVIII H- D-Ala 0,90 -26,5° (c=0,62 in AcOH 95%) XIX CH3CO- Ala 0,90 -34,7° (c=0,34 in AcOH 95%) XX H- Phe 0,83 -30,0° (c=0,43 in AcOH 95%) 30 1) F = 0,77.

b) met formule A-Thr-A_,-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-35 Gly-Ser-Gly-Thr-ProNH2 8802950 - 19 -

Voor- A A_ /a7^° (c. in AcOH 95%) f beeld —— - XXI H-Ser-Asn-Ser Cys(H-Cys-OH) _36,8° (0'47) c,,79 XXII H-Ser Cys(H-Cys-OH) “44'2° (0'59) 0,85 XXIII H-Ser-Asn-Leu Cys(H-C&S-OH) "34'9° (0'3) 0,82 XXIV H-Ser-Leu Cys(H-Cys-OH) "34,4° (0'27) o,85 -27 7° fO ςτι XXV H-Leu-DAla Ala ' 1 ' ' 0,90 7° /Π 47\ XXVI H-DLeu-Ser Ala ' 1 ' ; 0,83

XXVII H-Phe-Ser Ala -33,9° (Q,o2) 0^g{J

XXVIII H-Leu-DSer Ala -26,4° (0,^:8) Q^4 XXIX Adamantanacetyl-Ser Ala -30,5 (0,4) o,83

XXX H-Leu-Ala Ala -31,7° (0,32) Q^gQ

XXXI Η-Leu Ala -35,4° (0,35) 0^Q6 XXXII H-Cha-Ser Ala -26,2° (0,45) Q/85 XXXIII CH^CO-Ser Ala -33,3° (0,37) 0>92 XXXIV H-Ala-Ser Ala -32,0° (0,50) 0^g0 XXXV H-Pro-Ser Ala -37,5° (0,44) 0^86 XXXVI Cyclohexylpropionyl-Ser Ala -28,3 ( 0,24) q ^33 XXXVII Cyclopentyl-CO-Ser Ala ' v ' ' 0,90 XXXVIIa Pyroglutamoyl-Ser Ala -34,6 (0,3) Qf87 XXXVIlb Decanoyl-Ser Ala -25,6 (0,25) 0f91 c) met formule H-Leu-Ser-Ag-Ala-Ag-Ag-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-

Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-

Gly-Ser-Gly-Thr-ProNH- 420

Voor- A Aq A / a / c in AcOH 95% F

6 o y — — D - beeld - - ----—-- XXXVIII Thr Gly Leu -25,3° (0,43) 0,85 XXXIX Thr Val DLeu -26,9° (0,51) 0,86 XL DThr Val Leu -17,6° (0,55) 0,85 XLI Thr Val Phe -28,6° (0,44) 0,88 XLII Thr Aib Leu -28,0° (0,50) 0,88

Voorbeeld XLIII: H-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(H-Cys-OH)-Nle-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-ra^ ____ β δ 0 2 35 0 - 20 -

Analoog aan voorbeeld II bereid.

- _jn L α_/JJ = -44° (c = 0,11 in AcOH 95 %) . (F = 0,75).

Voorbeeld XLIV

Of 5 N -Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-

Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NHo_

Dit peptide werd stapsgewijze bereid op een harsdrager op polystyreenbasis. De Boc-groep wordt toegepast voor de bescherming van de a-arainogroepen en de functionele groepen 10 van de zijketen worden als Lys(2-chloorbenzyloxycarbonyl),

Ser(benzyl), Thr(benzyl), Arg(tosyl), His(tosyl), Tyr(4-chloor-benzyloxycarbonyl), Cys(4-raethylbenzyl), Glu(benzyl) beschermd.

Amino-4-methylfenyl-methyl-co(polystyreen-divinylbenzeen)hars (0,7 mmol/g) werd onderworpen aan de volgende 15 reeks,, stappen (1) tot (7) , behandelingen:

(1) DCM

(2) trifluorazijnzuur (50 %) in DCM

(3) DCM

20 (4) diisopropylethylamine (10%) in DMF

(5) DMF

(6) van te voren gevormd symmetrisch anhydride (2,8 mmol per g uitgangshars) Boc-aminozuur in DMF

(7) DMF 25

De volumes van de wasvloeistoffen en reagentia zijn 5-20 ml per gram uitgangshars.

Elke stap werd zo vele malen herhaald als nodig is voor hetzij een volledige reactie van de hars (de stap-30 pen 2, 4, 6), hetzij een volledige vervanging van het voorgaande reagens van de hars (de stappen 1, 3, 5 en 7). Na elke cyclus werden monsters van de hars genomen en deze werden onderzocht op de volledigheid van de reactie met behulp van de ninhydrine-proef.

Symmetrische anhydriden van Boc-aminozuren 35 werden gevormd even voor het gebruik door Boc-aminozuur (2,8 mmol per g hars) en DCCI (1,4 mmol per g hars) in DCM, dat voldoende

BSQ295Q

- 21 - DMF bevat om het Boc-aminozuur volledig te doen oplossen, te laten reageren. Het mengsel werd gefiltreerd, men voegde meer DMF aan het filtraat toe en verkleinde het volume door verdamping van DCM bij een lagere temperatuur dan 15°C en gebruikte de verkregen 5 oplossing bij stap (6).

De cyclus van reacties (1)-(7) werd herhaald voor de aminozuurresten teneinde de reeks met formule 1 te verkrijgen, behalve Boc-Gln-OH en Boc-Arg(Tcs)-OH, die in stap (6) als hun van te voren gevormde 1-hydroxybenzotriazoolesters 13 in DMF worden gekoppeld.

In de laatste cyclus, stap (6), worden isocapronzuur, diisopropylcarbodiimide en 11-hydroxybenzotriazool (alle 3,5 mmol per g uitgangshars) in dimethylformamide aan de hars toegevoegd. Na 15 uren werd de hars uitgewassen met DMF 15 en DCM en gedroogd.

Men voegde aan 1 σ van de peptidehars 1 g p-cresol, 1 ml dimethylsulfide en 10ml HF toe. Nadat men het reac-tiemengsel 1 uur op 0°C had gehouden destilleerde men de vluchtige bestanddelen bij 0°C af. Het residu werd gewassen met ethylacetaat 20 en geëxtraheerd met een aantal porties azijnzuur (10 %) in water en het waterige extract werd gelyofiliseerd. Het gelyofiliseerde produkt werd gezuiverd door chromatografie in de omgekeerde fase over een kolom van octadecyl-siliciumdioxyde, welke met een gradiënt van acetonitril in fosforzuur (2 %) werd geëlueerd. Fracties 25 die de verbinding in zuivere vorm bevatten werden samengevoegd, gefiltreerd door een zwakbasische ionenuitwisselende hars in ace-taatvorm, gelyofiliseerd en gedroogd. De in de titel genoemde verbinding werd verkregen als een wit, vlokkig poeder.

De verbindingen met formule 1 evenals hun 30 farmaceutisch aanvaardbare zouten en complexen vertonen waarde- volle farmacologische eigenschappen, zoals uit dierproeven blijkt. Daardoor zijn ze geïndiceerd voor toepassing als farmaceutica.

Ze verlagen in het bijzonder de calcium-plasmaspiegel en antagoniseren het parathormoon ter instelling 35 van een positieve calciumbalans in de beenderen.

Het hypocalcemische effect van de verbin- 8602950 - 22 - dingen kan op een gebruikelijke wijze worden bepaald, bijvoorbeeld volgens de methode van M. Azria en med. beschreven in Calcitonin 0 1984 Symposium op de 24 oktober, Milaan in 1986 gepubliceerd als Short Communications in the Current Clinical Practice Series 5 No. 42, Excerpta Medica 1986, blz. 104.

Volgens deze methode wordt een voor calcium /2+7 ionen selectieve elektrode voor het continu meten van het gehalte aan calciumionen in het bloed van konijnen toegepast. De verbindingen worden subcutaan in een dosis van 0,1 tot ongeveer 10 10^ig/kg, bijvoorbeeld overeenkomende met 1 I.ü. per kg, toege diend. De metingen werden gedurende 5 uren uitgevoerd en het oppervlak onder de kromme werd gemeten.

De verbindingen kunnen eveneens met behulp van andere proeven worden onderzocht, bijvoorbeeld met behulp 15 van de standaard hypocalcemische proef van M. Kumar en med., J. Endocrinology, (1965), J33y blz. 469 bij ratten in dezelfde doses. De hypocalcemische werking van 300 tot 6000 I.ü. per milligram werd bij deze proef vastgesteld.

De voorbeelden III, XXIX en XXXVI ver-20 melden de aanbevolen verbindingen.

De verbindingen met formule 1 zijn dus geïndiceerd voor alle aandoeningen waarbij het wenselijk is de plasmacalciumspiegel te verlagen of het metabolisme van het been-dergestel te beïnvloeden, bijvoorbeeld hypercalcemie als gevolg 25 van endogene thyrocalcitonine deficiëntie door verlies van thyroide weefsel of hyperfunctioneren van het parathyroide. Ze zijn eveneens geïndiceerd voor alle aandoeningen van het beender-gestel die gepaard gaan met een toegenomen verslechtering of waarbij calciumfixatie in het beendergestel wenselijk is, bijvoor-30 beeld osteoporose van verschillende oorzaken (bijvoorbeeld na het zogen, een ongeval, veroorzaakt door de cortico-sterolden therapie of door inactiviteit, bij kwaadaardige ziekten enz.), fracturen, osteo-malacie, rachitis en door de nieren geïnduceerde osteodystro-fie, pijn, bijvoorbeeld pijn in het beendergestel die gepaard 35 gaat met osteoporose, neurodystrofische ziekten, de ziekte van

Paget, evenals in het bijzonder voor de gecombineerde therapie met 8602950 - 23 - calcium of fosfaat.

De verbindingen volgens de uitvinding remmen eveneens de pancreassecretie. Deze remming blijkt bij dieren, bijvoorbeeld onder toepassing van de methode beschreven in 5 Scand. J. Gastroint. 6_, (1975) door S.J. Konturek en med. in dezelfde doseringen als hiervoor zijn vermeld.

De verbindingen volgens de uitvinding zijn daardoor verder geïndiceerd voor toepassing bij acute pancreatitis en maag-darm-aandoeningen, zoals zweren.

10 Voor alle hiervoor genoemde indicaties is een geïndiceerde, dagelijkse dosis die van ongeveer 5 tot ongeveer 1500 I.E., geschikt in een eenheidsdoseringsvorm, eenmaal daags of desgewenst eenmaal in elke twee of drie dagen, in dagelijkse doses van ongeveer 5 tot ongeveer 1500 I.E. toegediend.

15 De verbindingen kunnen zowel in vrije vorm, als in de vorm van een farmaceutisch aanvaardbaar zout of een complex worden toegediend. Deze vormen hebben een overeenkomstige mate van werking. Een farmaceutisch preparaat bevat een of een aantal verbindingen met formule 1 in vrije vorm, en/of in de vorm 20 van een farmaceutisch aanvaardbaar zout en/of in een complex vorm, desgewenst tezamen met een vloeibare of vaste drager. De farmaceutische preparaten kunnen op een gebruikelijke wijze worden bereid en kunnen bijvoorbeeld door intramusculaire injectie of toediening via de neus worden toegediend. De preparaten kunnen 25 eveneens een depotpreparaat zijn.

Een ander aspect van de onderhavige uitvinding verschaft een verbinding met formule 1 in vrije vorm of in de vorm van een farmaceutisch aanvaardbaar zout of in complex — vorm voor het induceren van een hypocalcemisch effect, voor het 30 behandelen van de ziekte van Paget of osteoporose, pijn in het beendergestel dat daarmee gepaard gaat, een neurodystrofische aandoening of pancreatis (waaronder alle hiervoor genoemde indicaties) .

8602950

Claims

1. Verbindingen met formule 1, waarin R een waterstofatoom of een R'CO groep, 5 waarin R'CO een acylgroep van een carbonzuur is, voorstelt, Y^ een groep weergeeft die aan een alfa-koolstofatoom van een alfa-aminozuur is gebonden, Y2 een groep is die aan een alfa-koolstof-atoom van een a-aminozuur is gebonden., io -ch2-s-s-ch2-ch-cooh nh2 -CEL-S-S-CH„-CH -C00H, -(CH„) -C00H of 2 2 2 2 p -ch2-s-y3,

2. Werkwijze voor het bereiden van een peptide, met het kenmerk, dat men een'peptideverbinding met for- 8 60 2 9.5 0 - 25- mule 1, waarin de substituenten en symbolen de in conclusie 1 gedefinieerde betekenissen hebben, bereidfcdoor a) ten minste één beschermende groep van een beschermd polypeptide met de in formule 1 aangegeven volgorde te 5 verwijderen, b) twee peptide-eenheden via een amide- binding met elkaar te verbinden, waarbij elk van deze eenheden ten minste één aminozuur zoals gedefinieerd in formule 1 of een derivaat daarvan in een beschermde of onbeschermde vorm bevat, waar-10 bij de peptide-eenheden zodanig zijn dat een al of niet beschermd polypeptide met de volgorde aangegeven in formule 1 wordt verkregen en, desgewenst, de werkwijze van stap a) uit te voeren; c) voor de bereiding van een verbinding met formule 1 met een eindstandige R'CQ-groep, een al of niet beschermd 15 peptide met de in formule 1 aangegeven volgorde te laten reageren met een zuur met formule R'COOH of een reactief zuurderivaat daarvan, en desgewenst de werkwijzestap a) uit te voeren, d) voor de bereiding van verbindingen met formule 1, waarin Y2 een -CH^-S-S-C^-CH-COOH of

3. Verbindingen volgens conclusie 1 met for- 3802 950 - iL mule 1 , waarin P X^ een Gly of Ser groep voorstelt, Y^ een (CH^)4 of -S-S-CH^-CH- groep weer- nh2 5 geeft, waarbij de laatste groep via het eindstandige zwavel- atoom aan de aangrenzende -CH,-groep in formule 1 is gehecht en z p een polypeptidegroep weergeeft, die uit 24 aminozuren is samengesteld en die overeenkomt met die op de plaatsen 8-31 van een in de natuur voorkomend calcitonine of van 10 een derivaat of analogon daarvan met hypocalcemische werking en waarin alle aminozuurgroepen, waaronder die op de plaatsen die met * zijn gemerkt^de L-configuratie bezitten, in vrije vorm of in de vorm van een zout of complex.

4. Verbindingen met formule 1 . .volgens pa 15 conclusie 1, waarin X" een NH groep of een binding voorstelt, doch indien m" = 0 slechts een binding is, Y^" de groep voorstelt die aan het a-kool-stofatoom van een in de natuur voorkomend aminozuur is gebonden, Y2" de groep weergeeft die aan het a-kool-20 stofatoom van een in de natuur voorkomend α-aminozuur is gebonden of -CH2-S-S-CH2-CH-COOH, -CH2-S-S-CH2-CH2-COOH, -(CH2)p"-COOH m2 of -CE^-S-Y^" voorstelt, Y^" een alkylgroep met 1-4 koolstofatomen is, 25 m" = 0 of 1, n" = 0-3, p" = 3-5, en 2" de polypeptidegroep voorstelt die is samengesteld uit 24 aminozuren en die overeenkomt met de groep op 30 de plaatsen 8-31 van een in de natuur voorkomend calcitonine of van een derivaat of analogon daarvan met een hypocalcemische werking, waarbij de 1-4 Υ^''-groepen in formule 1 al of niet dezelfde betekenissen kunnen hebben en alle aminozuren in formule 1, onafhankelijk van elkaar, de L- of D-configuratie kunnen bezitten, 35 in vrije vorm of in de vorm van een zout of complex. 8802350 -*v

5 Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-N^ > waarin Ag, Ag en Ag de geschikte groepen in formule 1 in zuur-additiezoutvorm of complexvorm zijn.

5. H-Leu-Ser-Thr-Cys(H-Cys-OH)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-N^ in vrije vorm of in de vorm van een zout of complex. 5

6. H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-(H-dys-OB)- Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH^ in vrije vorm of in de vorm van een zout of complex. a

7. N -Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-

8. N -Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-

9. Verbindingen volgens conclusie 1 met formule A-Leu-Ser-Thr-A^-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-N^ 20 indien A en A^ de geschikte groepen in formule 1 zijn^ in vrije vorm, in zoutvorm of complex vorm.

10. Een verbinding volgens conclusie 9, waarin A is H-Ser-Asn- en A? is Cys.

10 Gly-Lys-Leu-Ser-Gin-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr- Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH^ in vrije vorm of in de vorm van een zout of complex. a

11. Een verbinding volgens conclusie 9, 25 waarin A een H-Ser-Asn-groep voorstelt en A^ een Cys(-S-CH^^H^-COOB) groep weergeeft.

12. Een verbinding volgens conclusie 9, waarin A een H-Ser-Asn- groep voorstelt en A^ een Asu groep is.

• 13. Een verbinding volgens conclusie 9, 30 waarin A een H-Asn- groep voorstelt en A^ een Cys(H-3ys-OH) groep is.

14. Een verbinding volgens conclusie 9, waarin A een H-Ser-Asn- groep voorstelt en A^ een Glu groep weergeeft.

15. Een verbinding volgens conclusie 9, waarin A een H-Ser-Asn- groep voorstelt en Ay een Ala groep weer- 8602950 > V -id - geeft.

15 Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-N^ in vrije vorm of in de vorm van een zout of complex.

15 Y^ een alkylgroep met 1-4 koolstofatomen of een benzylgroep die desgewenst door methyl of methoxy is gesubstitueerd, of CH3CO-NH-CH2- voorstelt, n = 1-4, Ag een Thr of D-Thr groep weergeeft, 20 p = 3-5, A_ de aminoacylgroep van een neutraal, O lipofiel L-a-aminozuur voorstelt, Ag de aminoacylgroep van een neutraal, lipofiel L- of D-a-aminozuur weergeeft, 25. een polypeptidegroep die overeenkomt met de polypeptidegroep op de plaatsen 10-31 van een in de natuur voorkomend calcitonine of derivaat of analogon daarvan met een hypocalcemisch effect is, waarbij, indien meer dan één Y^-groep aanwezig is, deze al of niet gelijk zijn, en, met uitzondering 30 van de A_-groep, alle aminozuurgroepen onafhankelijk van elkaar O de L- of D-configuratie kunnen bezitten, onder de voorwaarde dat indien Y2 een -CH2SH-groep voorstelt en n = 4, de N-eindstandige acylgroep een andere betekenis heeft dan H-CyS, in vrije vorm of in de vorm van een zout of complex.

16. Een verbinding volgens conclusie 9, waarin A een H-Ser-Asn- groep voorstelt en A^ een Ser groep is.

17. Een verbinding volgens conclusie 9, 5 waarin A een H-Gly-Asn- groep weergeeft en A^ een Cys(H-Cys-OH) groep is.

18. Een verbinding volgens conclusie 9, waarin A een H-Ser-Asn- groep is en A^ een Cys(Me) groep voorstelt.

19. Een verbinding volgens conclusie 9, 10 waarin A een H-Ser- groep weergeeft en A^ een Cys(H-Cys-OH) groep voorstelt.

20. Een verbinding volgens conclusie 9, waarin A een waterstofatoom is en A^ een Ala groep weergeeft.

20 NH2 -CH2-S-S-CH2-CH2-COOH groep voorstelt, hetzij een verbinding met formule 2 in een beschermde of onbeschermde vorm te laten reageren met een verbinding met formule 3, waarin R^ een groep voorstelt die de vorming van een S-S-brug met het zwavelatoom van de 25 -CH2SH-groep in het polypeptide met formule 2 vergemakkelijkt, R2 een waterstofatoom, een aminogroep of een beschermde amino-groep weergeeft en R^ een hydroxylgroep of een beschermende groep voor de carboxylgroep is, hetzij een verbinding met formule 4 in een 30 beschermde of onbeschermde vorm, waarin R^ een hiervoor aangegeven betekenis heeft, te laten reageren met een verbinding met formule 5 en daarna desgewenst stap a) van de werkwijze uit te voeren en indien nodig het aldus verkregen polypeptide in een vrije vorm, of in de vorm van een zuuradditiezout of een complex om te zet-35 ten.

21. Een verbinding volgens conclusie 9, 15 waarin A een H-Ser-Asn- groep voorstelt en A^ een Cys(Acm) groep weergeeft.

22. Een verbinding volgens conclusie 9, waarin A een H-Ser-Asn- groep voorstelt en A^ een Lys groep is.

23. Een verbinding volgens conclusie 9, 20 waarin A een H-Ser-Asn- groep weergeeft en A^ een Arg groep is.

24. Een verbinding volgens conclusie 11, waarin A een waterstofatoom voorstelt en A^ een D-Ala groep weergeeft.

25. Een verbinding volgens conclusie 9, 25 waarin A een CH^CO-groep weergeeft en A^ een Ala groep is.

26. Een verbinding volgens conclusie 9, waarin A een waterstofatoom en A^ een Phe-groep voorstellen.

27. Een verbinding volgens conclusie 1 met formule A-Thr-A^-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Leu-Gln-

28. Een verbinding volgens conclusie 27, waarin A een H-Ser-Asn-Ser groep voorstelt en A^ een

29. Een verbinding volgens conclusie 27, 1602950 '3- waarin A een H-Ser en A^ een Cys(H-Cys-OH) groep voorstellen.

30. Een verbinding volgens conclusie 27, waarin A een H-Ser-Asn-Leu groep en A^ een dys(H-Cys-OH) groep voorstellen.

30 Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH^/ waarin A en A^ de geschikte groepen in formule 1 in vrije vorm, in de vorm van een zout of in complexvorm voorstellen.

31. Een verbinding volgens conclusie 27, waarin A H-Ser-Leu en A^ een Cys(H-Cys-OH) groep weergeven.

32. Een verbinding volgens conclusie 27, waarin A een H-Leu-DAla en A_, een Ala groep zijn.

33. Een verbinding volgens conclusie 27, 10 waarin A een H-DLeu-Ser greep en A_, een Ala groep voorstellen.

34. Een verbinding volgens conclusie 27, waarin A een H-Phe-Ser en A^ een Ala groep weergeven.

35. Een verbinding volgens conclusie 27, waarin A een H-Leu-DSer en A_, een Ala groep zijn.

35 Cys(H-Cys-OH) groep weergeeft.

36. Een verbinding volgens conclusie 27, waarin A een Adamantanylacetyl-Ser en A^ een Ala groep voorstellen.

37. Een verbinding volgens conclusie 27, waarin A een H-Leu-Ala- groep en A^ een Ala groep weergeven.

38. Een verbinding volgens conclusie 27, 20 waarin A een Η-Leu groep en A„ een Ala groep zijn.

39. Een verbinding volgens conclusie 27, waarin A een H-Cha-Ser groep en A^ een Ala groep voorstellen.

40. Een verbinding volgens conclusie 27, waarin A een CH^CO-Ser groep en A.-, een Ala groep weergeven.

41. Een verbinding volgens conclusie 27, waarin A een H-Ala-Ser groep en A? een Ala groep voorstellen.

42. Een verbinding volgens conclusie 27, waarin A een H-Pro-Ser groep en A_, een Ala groep weergeven.

43. Een verbinding volgens conclusie 27, 30 waarin A een Cyclohexylpropionyl-Ser groep en A^ een Ala groep zijn.

44. Een verbinding volgens conclusie 27, waarin A een Cyclopentyl-CO-Ser groep en A^ een Ala groep voorstellen.

45. Een verbinding volgens conclusie 27, waarin A een Pyroglutamoyl-Ser groep en A^ een Ala groep weergeven. 8602950 -3O -

46. Een verbinding volgens conclusie 27, waarin A een Decanoyl-Ser en een Ala groep weergeven.

47. Een verbinding volgens conclusie 1 met formule H-Leu-Ser-A -Ala-A0-A -Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-o o y

48. Een verbinding volgens conclusie 47, waarin A, een Thr-groep, A„ een Gly groep en An een Leu groep o o y 10 voorstellen.

49. Een verbinding volgens conclusie 47, waarin Ag een Thr, Ag een Val en Ag een DLeu groep weergeven.

50. Een verbinding volgens conclusie 47, waarin Ag een DThr groep, Ag een Val-groep en Ag een Leu groep 15 zijn.

51. Een verbinding volgens conclusie 47, waarin A een Thr-groep, A0 een Val-groep en AQ een Phe-groep co y voorstellen.

52. Een verbinding volgens conclusie 47, 20 waarin Ag een Thr-groep, Ag een Aib-groep en Ag een Leu-groep weergeven.

53. Een verbinding volgens conclusie 1, ?2 waarin de -NH-CH-CO- groep een neutrale, lipofiele, a-amino-25 acylgroep is. Ï2

54. Een verbinding volgens conclusie 53, waarin de -NH-CH-CO- groep = Ala.

55. Een verbinding volgens conclusie 1, waarin n = 2 en R een waterstofatoom of een R'CO groep voorstelt, 30 of n = en R een R'CO groep voorstelt.

56. Een verbinding volgens een der voorgaande conclusies als hydraat.

57. Een verbinding volgens een der voorgaande conclusies in de vorm van een zuuradditiezout.

58. Een verbinding volgens een der voor gaande conclusies in vrije vorm of in de vorm van een farmaceu- 8602950 -3i - tisch aanvaardbaar zout of complex voor toepassing als hvpocalce-misch middel, voor de behandeling van de ziekte van Paget of osteoporose, pijn in het beendergestel dat daarmede gepaard gaat, een neurodystrofische aandoening, pancreatis of maag-darm-5 kwalen.

59. Farmaceutische preparaten die één of een aantal verbindingen volgens een der voorgaande conclusies in vrije vorm, en/of in de vorm van een farmaceutisch aanvaardbaar zout en/of in complexvorm, desgewenst tezamen met een vloeibare 10 of vaste drager, bevatten.

60. Verbindingen en werkwijzen als beschreven in de beschrijving en/of voorbeelden. 15 -o-o-o-o- 5 0