DD135078B1 - Verfahren zur herstellung von lh-rh und seiner analoga - Google Patents

Description

Anweridungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von LHRH und seiner Analoga. Das erfindungsgemä3 hergestellte LH-RH bzw. seine Analoga finden als Brunst Synchronisationsmittel in der Veterinärmedisin sowie unter anderem als Mittel bei Fertilitätosto'rungen in der Humanmedizin Anwendung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt» daß LHRH und Feine Analoga sowohl konventionell (R. GEIGER, et el., Biochem. biophys. Res. Сопяпип, 45, 761(1971); H, SIEVERTSSON et al., J. Kea. Chern. 15, 22?(197?); J.K* CHANG et al., J. Med. Chem. 15, 6230 97?) ale auch am polyneren Träger (H,MATSUO et al., Biochem. Biophys. Reв. Commun. 45, 822(1971); H. SIEVERTSSON et al,, Biochem. Piophys. Res. Commun. 44, 1566(1971), R. RIVAILLE et al., HeIv. Chim. Act a 54, 2772(1971); I.I.V/. FONAHAN et al., Biochem. Biophys, Res. Commun. 48, 1100(1972); nach verschiedenen Verfahren hergestellt v/erdpn kann.

So sind Verfahren zur Herstellung von LHRH am polymeren Träger beschrieben worden. Diese Verfahren haben gegenüber konventionellen Methoden Vorteile durch die Möglichkeit der Automatisierbar" keit und kürzerer Synthesezeiten.

Nachteilig an diesen Verfahren ist die schlechtere Qualität des Endproduktes infolge fehlender Zv/ischenreinigungen, wodurch eine geringere Ausbeute on reinem LHRH verbunden ist. Insbesondere beeinträchtigt die Bildung von Fehlsequenzen bei der Kupplung der Aminosäuren Trp, His, pOiu die Ausbeute nach den angeführten Verfahren.

Es wurde bereits vorgeschlagen (US-PS 3 953 416),zur Herstellung von LHRH ein Heptapeptid Ser-Tyr-Gly~Leu~Arg-Pro-Gly am Chlormethylpolystyrolträger aufzubauen, dieses durch Aminolyse vom Träger abzuspalten und mit einem konventionell hergestellten Tripeptid pGlu-His-Trp nach konventioneller Methodik zu kuppeln. Auch bei dem nach diesem Verfahren hergestellten LHRH ist ein großer Aufwand an Reinigungsoperationen erforderlich und die Ausbeute niedrig.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren aufzuzeigen, das gegenüber den vorgenannten folgende Vorteile aufweist: Es soll ein möglichst geringer Reinigungsaufwand für das Endprodukt und eine hohe Ausbeute erzielt werden, wobei durch eine günstige Verfahrensführung eine hohe Effektivität des Verfahrens gewährleistet werden soll«

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von LHRH und seiner Analoga aufzuzeigen, das durch die Verwendung eines geeigneten Trägermaterials die Herstellung des Tripeptids pGlu-His-Trp nach der Pestphasenmethode, die Umsetzung des am Träger aufgebauten und gebundenen Heptapeptids Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Gly bzw«, des Hexapeptids Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro mit vom Träger abgelösten Tripeptid zum geschützten am Träger gebundenen LHRH bzw. seiner Analoga erfolgt. Nach Abspaltung der Schutzgruppen durch Behandlung mit verflüssigtem HP soll ein relativ reines Produkt in hoher Ausbeute vorliegen« Der Aufbau des Peptids erfolgt an polymeren Trägern bekannter Art, deren Grundgerüst aus vernetzten Polyvinyl-Kohlenwasserstoffen besteht. Mittels geeigneter Methoden werden aktive Zentren in das Polymere eingeführt, an die die C-terminale geschützte Aminosäure oder ein entsprechendes Di- oder Tripeptid gebunden wird, das dann die Basis für den weiteren Peptidaufbau darstellt. Als reaktive Zentren werden vorzugsweise die Benshydrylamin- oder die Chlormethyl-Gruppe verwendet«

Erfindungsgemäß erfolgt die Herstellung des LHRH oder seiner Analoga in mehreren Teilschritten.

An einem Benzhydrylaminharz wird die Aminosäure Glycin in geeigneter geschützter Form unter Verwendung bekannter Kupplungsmethoden;, vorzugsweise der symmetrischen Anhydridmethode verankert und nacheinander werden die Aminosäuren Pro, Arg\ Leu _t Xl Tyr und Ser oder entsprechende Peptidfragmente in geeigneter geschützter Form nach der gleichen Methode verknüpft» Beim- Aufbau der verkürzten Sequenz

Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro

wird an ein chlorinethyliertes Harz ein in geeigneter Form geschütztes Pro nach bekannten Methoden gebunden und die anderen Aminosäuren oder entsprechenden Peptidfragmente werden in geeigneter geschützter Form nacheinander gekuppelt.

Das Tripeptid pGlu-His-Trp wird am Chlormethylharz aufgebaut, wobei Trp in geeignet geschützter Form als Cs-SaIz o. ä. mit dein Chlormethylharz verknüpft wird. Die anderen Aminosäuren Hiз und pGlu werden in geschützter Form unter Verwendung oben angeführter Kondensationsnethoden nacheinander verknüpft, Das Tripeptid wird vom Träger abgelöst und mit dem sich am Benzhydrylaminharz befindenden geschützten Heptapeptid bzw. mit dem sich am Chlormethyl-Harz befindenden Hexapeptid gekuppelt„ Das LHRH bzw. seine Analoga werden entweder unter gleichzeitiger Abspaltung der Schutzgruppen vom Träger mittels verflüssigtem HF oder durch Ablösung des Peptids auf bekannte Weise, vorzugsweise durch Ammonolyse und anschließende Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen bevorzugt mit verflüssigtem HP freigesetzt.

Das so erhaltene LHRH bzw. seine Analoga haben bereits einen Gehalt von 70 - 80 %l Zur Anwendung im veterinärmedizinischen Bereich genügt eine Reinigungsoperation in Form einer Fällung als schwerlösliches SäureadditionsBalz mit anschließender Freisetzung mittels Ionenaustauscher. Man erhält so ein biologisch hochaktives Präparat.

Für humanmedizinische Zwecke wird eine weitere Reinigungsoperation z. B· eine säulenchromatographische Reinigung durchgeführt.

nachfolgendes Formelschena soll der näheren Erläuterimg des erfindungsgemäßen Verfahrens an Hand der Synthese der LH-RH-Homalsequenz dienen.

Trp (P

+ Boc-His + pGlu

pGlü~His-Tr-p-fP + HP

pGlu-His-Trp-OH

Gly-Ш

+ Boe~Pro

+ Bo oArg (IiO₂)

+ Boc-Leu

+ Boc-Gly

+ Boc-Tyr(-OBzl) + Boc-Ser-("OBzI)

Ser(-0Bzl)-Tyr(-0Bzl)-Gly-Leu-Arg(lI0₂)-Pro-

Gly-Tffi- tö

pGlu—Kis~Trp-Ser(.OBzl )-!Cyr(-QEsl )· + Hj?¹

LHRH

,)-Pr₀-GIy-UH-(J

IJach dein angegebenen erfindungsgemäßen Verfahren können außer den LHRH u.a. folgende Analoga der allgemeinen Formel

P-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y

in der X-GIy, D-Trp, D-AIa, D-Leu, D-Ser(O-R), D-Phe, D-Tyr worin R - tert.-Eutyl-, Benzyl und H und in der Y - GIy-IIH₂ und HH-R₁

worin R₁ - Alkyl, vorzugsweise -Äthyl und i-Propyl und 2$ykloalkyl, vorzugsweise Zyklopropyl bedeutet, hergestellt werden.

Bei der Synthese werden an der Reaktion nichtbeteiligte, freie funktioneile Gruppen zwecknäßigenveise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion oder flüssigen Fluorwasserstoff leicht abspaltbare Reste, wobei die für die Peptidsynthese bekannten Gruppen verwendet werden, z_e B· die Benzyl-, p-Chiorbenzyl-, 2,6-Dichlorbenzyl-, p-Hitrobenzyl-, p-Hethoxybensyl-, Benzhydryl-, tertiär-Butyl-, Tosyl-, Dinitrophenyl- und die ITitro-Gruppe*

Als Aminoschutzgruppen sind beispielsweise zu nennen: A-liphatische Oxycarbonylgruppen, wie z. B· Cyclohexyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl- und in erster linie tertiär-Butyloxycarbonyl-(Boc-), oder sich von der Kohlensäure bzw« Thiokohlensäure ableitende Gruppen, wie gegebenenfalls im aromatischen Rest substituierte Carbobenzoxygruppen (z. B, Carbobenzoxy-, p-Brom- oder p-Chlorcarbobenzoxy-, p-Methozycarbobenzoxy-), ferner o-Nitrophenylsulfenyl- und gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppen (z. B. Diphenylmethyl- oder Triphcnylmethylgruppen). Zur Abspaltung der ^ -Amino-Schutzgruppen während der Synthese finden Trifluoressigsäure/Dichlormethan, Trifluoressigsäure, HCl in Eisessig oder Dioxan bevorzugt Anwendung· Andere Spaltungsreagentien und deren Abspaltungsbedingungen zur Entfernung spezifischer Amino-Schutzgruppen sind in E. SCHRÖDER und K. LÜBKE, The Peptides I, Academic Press, 1965 S· 72-75 beschrieben.

Kachlet da* gewünschte Peptid aufgebaut wurde, kann die Bindung mit dem polymeren Trägermaterial auf bekannte w'eisf, wie lulx Bromwasserstoff/Eisessig, durch Alkoholype^ r^i^^imolyse» Hydrogenolyse bevorzugt aber durch Aimnonolyse oder mit Hilfe von verflüssigtem Fluorwasserstoff bei 0 ⁰C bis Raumtemperatur, gegebenenfalls unter Zusatz von z. B, Anisol oder/und Mercaptoäthanol aufgespalten werden.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachstehend an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert v/erden.

Beispiel 1

20 g Benzhydrylaminharz, hergestellt nach I. RIVIER et al., J· Med. Chem. 16, 545 (1973) bzw. P. PIETTA et al., J. Org. Chem. 2Ѣ 44 (1974) wurden mit 12,3 g Boc-Gly in Methylenchlorid unter Zusatz von 7»0 g Dieyclohexylcarbodiirnid nach der symmetrischen Anhydridmethode umgesetzt« Der Gehalt an Boc-Gly betrug 0,28 mMol/g Harz. Die Anhydride der folgenden Aminosäuren wurden in 3-facher menge eingesetzt.

Вое-Pro, BoC-APg(NO₂), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Tyr(-OBzl), Boc-Ser(-OBzl).

Nach der Anesterung mit Boc-Gly kam folgender Waschzyklus zur Anwendung:

1) 3 x 80 ml Methylenchlorid (je 3')

2) 2 χ 80 ml Trifluoressigsäure-Methylenchlorid (1:1) Qe 20')

3) 3 x 80 ml Methylenchlorid (je 3')

4) 3 x 80 ml Methylenchlorid-Chloroform (1:1) (Oe 3')

5) 3 x 80 ml Chloroform (je 3¹)

6) 1 χ 80 ml Chlorofoim-Triäthylamin (9:1) (10·)

7) 3 x 80 ml Chloroform (je 3')

8) 3 x 80 ml Methylenchlorid (je V)

9) 1 x 80 ml 0,3 m Pyridin-HCl-Methylenchlorid (3')

10) 3 x 80 ml Methylenchlorid (3¹)

11) 3 x 80 ml Äthanol (V)

12) 3 = ^ al Chloroform (V)

13) 1 x 80 ml Chloroform-Triäthylamin (9:1) (10')

14) 3 x 80 ml Chloroform (3^f)

15) 3 x 80 ml Methylenchlorid (3')

Nach Ankondensation des Boc-^-Benzylserins resultierten 24 g O-Benzylseryl-C-benzyltyrosy1-glycyl-leucy1-nitroarginyl-proIyI-glycinharz.

Beispiel 2

3 g Boc-Tryptophan-Hars, hergestellt aus dem Chlormethylharz (7 % Cl) und dem Cs-SaIz des Boc-Tryptophans mit einem Gehalt von 0,91 mMol/g Harz vmrde nach der Methode der symmetrischen Anhydride nach jeweiliger Deblockierung mit der dreifachen Menge der Anhydride der folgenden Aminosäuren umgesetzt:

Boc-His, p-Glu.

Der vVaschzyklus entspricht dem aus Beispiel 1· Die Menge an p-Glu-His-Trp- ^P; betrug 3*45 g· 1 g Tripeptid-Harz wurden nach SAKAKIBARA mit 15 ml HF und 1,5 ml Anisol bei 0 ⁰C umgesetzt.

_ 7 —

Nach Abdestillation der HP wurde rait Äther gewaschen und der Rückstand in 1 %iger Essigsäure gelöst. Durch Austausch mit Wofatit AD 41 (Acetatform) wurde in das Tripeptidacetat überführt und anschließend lyophilisiert. Die Menge an p-Glu-Ніз-Тгр betrug 220 mg.

Beispiel 3

Pyroglutamylhistidinhydrazid wurde nach GTLLESEN et al. , HeIv. Chim. Act a 53, 60 (1970 hergestellt und nach Überführung in das Azid nach GILLESEN et al., HeIv. Chim. Acta 53, 60 (1970) mit Tryptophanbenzylester nach US-PS 3 888 838 zum Pyroglutamylhietidyltryptophanbenzylester umgesetzt. Die Hydrierung erfolgte nach H. Sievertsson et al. J. Med. Chem. ν?., 222 (1972) mit Palladium-Bsriumsulfat als Katalysator.

Beispiel 4

1 g des urjter Beispiel 1 angeführten O-Benzylseryl-O-benzyltyro^- glycyl-nitroarginyl-prclyl -^l yciriharzes mit einem Go^-It -ron 0,23 mMol/g Harz wurde in Dimethylformamid mit 0,6y roMol des nach 1-eispiel 2 bz\4. 3 erhaltenen Pyxo-iutanyl-histidyl-tryptophans unter Zusatz von 0,69 irJuol Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt. Nach Y/aschung mit Dimethylformamid, Chloroform, Methanol und Methylenchlor" betrug die Gesamtmenge 1,20 g.

1,2 g Dekapeptidpolymer wurden nach SAKAKIBARA mit 15 ml HP und 1,5 ml Anisol (und/oder Mercaptoäthanol) 1 Std, bei O⁰C umgesetzt. Nach Abdestillation der HP wurde der Rückstand mit Äther gewarchcn und in 1 ^iger Essigsäure gelöst. Durch Austousch mit Wofatit AO wurde in das Dekapeptidacetat überführt und anschließend lyophilieiert. Es wurden 254 mg LH-RH-diасеtat-monohydrat erhalten.

Beispiel 5

250 mg rohes LH-RH wurden zur Reinigung in 10 ml Y/aoner gelöst, mit 0,25 ml Essigsäure versetzt und mit 25 ml gesätt., wässriger Styphninsäurelösung gefüllt. Die Pällung wurde mit Styphninsäurelösung gewaschen, in einem Aceton-Y/asser-CemischO : 1 ) aufgelöst und mit Wofatit AD 41 (Acetatform) in LH-RH-diacetat rückgeführt. Nach Lyophilisation wurden 188 mg reines LH-RH erhalten.

Claims (8)

Erf indungsansgruch

1. Verfahren zur Herstellung von LH-RH und seiner Analoga der allgemeinen Formel

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y 1 2345678 9' 10

worin X = GIy, D-Phe, D-Tyr, D-AIa, D-Leu, D-Ser(O-R),

D-Trp

worin R = tert. Butyl-, Benzyl- und H und Y = GIy-IIH₂ oder KH-R-,

worin R.J = Alkyl, vorzugsweise Äthyl - und

i-Propyl- und Zykloalkyl-, vorzugsweise Zyklo-

propyl

bedeutet, gekennzeichnet dadurch, daß eine Kupplung der Peptidfragmente 1 bis 3 und 4 bis 10 bzw. 4 bis 9derart erfolgt, daß man zunächst die Kupplung der ersten C terminalen geschützten Aminosäure bzw. de>~ geschützten kurskeltigc" Peptides en еіпеЩ, polymeren Träger vominr.t, anschließend nach bekannter, "ßthnden dπ e Kupplung der geschützten Aminosäuren oder Peptidfragmente, unter AbIösung der Ii '-Schutzgruppen nach jedem Kupplungsschritt, ausführt und darauffolgend die Ablösung der Sequenz 1 bis 3 vom Träger und deren Kupplung mit der noch am Träger befindlichen geschützten Sequenz 4 bis 10 bzw. 4 bis 9 durchführt, worauf schließlich die Ablösung des Kupplungsproduktes vom Träger und dessen Reinigung erfolgt.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als polymere Träger Benzhydrylaminharz für die Sequenz 4 bis 10 und Chlormethylharz für die Sequenzen 1 bis 3 und 4 bis 9 eingesetzt v:erden.

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Kondensationsmethode die symmetrische Anhydridmethode angewendet wird.

4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Kondensation unter Verwendung vor- Dicyclohexylcarbodiinid durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet, dadurch, daß die Ablösung der N^'-Schutzgruppe!;! unter Verwendung von Trif luoressigeäure/Mehl orzia than, Trifluoressigsäure, KCl in Eisessig oder Dioxan erfolgt.

6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Ablösung vom polymeren Träger durch verflüssigten Fluorwasserstoff erfolgt.

7r Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Ablösung des Deka- bzw.

Nonapeptido vom polymeren Träger durch AmionoIyse erfolgt und anschließend die Abspaltung der SeitenkettenschutzgruBpen mit verflüssigtem jPluorwa α s e rs toff e rf "о Ig t,

8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Reinigung dee Endproduktes durch yr'.llung als Snureaddioul^ "··· ''. noirie \/iecerfreisetzur:g erfolgt.