DE69915160T2

DE69915160T2 - Verfahren zur Herstellung des Somatostatin Analogons Octreotide

Info

Publication number: DE69915160T2
Application number: DE69915160T
Authority: DE
Inventors: Francisco Javier Clemente Rodriguez; Berta Ponsati Obiols; Gemma Jodas Farres; Marc Canas Poblet
Original assignee: Lipotec SA
Current assignee: BCN PEPTIDES SA, ES
Priority date: 1998-01-29
Filing date: 1999-01-27
Publication date: 2005-01-20
Anticipated expiration: 2019-01-28
Also published as: DE69915160D1; EP0953577B1; US6346601B1; ES2144357A1; ES2144357B1; ES2217717T3; EP0953577A1

Description

Erfindungsbereich
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Somatostatin-Analogons Octreotid und dessen pharmazeutisch verträglicher Salze, die durch Säurezusatz gebildet werden, oder der Komplexe davon. Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung von Zwischenverbindungen, die bei der Synthese des erfindungsgemäßen Octreotids zweckmäßig sind.
Grundlage der Erfindung
Somatostatin weist ein sehr breites therapeutisches Potential auf und könnte bei einer Vielzahl von klinischen Anwendungen verabreicht werden. Seine mittlere Lebensdauer in Plasma ist jedoch außerordentlich kurz, wodurch die Anzahl der möglichen Anwendungen herabgesetzt wird. Dieser Nachteil hat eine Reihe von Forschungsgruppen veranlasst, das Ziel ihrer Forschung auf ein stabileres und leistungsfähigeres Analogon des Somatostatin auszurichten. Eine dieser Gruppen führte eine Anzahl von Tests mit zyklischen Octapeptiden durch. Eines dieser Octapeptide brachte eine vortreffliche biologische Aktivität sowohl in vivo als auch in vitro hervor (Pless J., Metabolism, 41, 5–6, (1992)). Dieses Analogon ist Octreotid. Die Struktur von Octreotid ist nachfolgend dargestellt:
Die Anwesenheit von D-Phenylanalin am terminalen N-Ende und einem Aminoalkohol am terminalen C-Ende gemeinsam mit einem D-Tryptophanrest und der Disulfidbrücke macht das Molekül äußerst widerstandsfähig gegenüber einem metabolischen Abbau. Das Octreotid erlaubt eine 24 Sunden lange Inkubation in einem aggressiven Medium, beispielsweise in Magensäften oder in der Darmschleimhaut.
Octreotid hemmt Wachstumshormone über einen längeren Zeitraum hinweg. Es hemmt die Absonderung von Glukagon weniger stark und die Insulinabsonderung nur kurzzeitig. Es ist daher bei der Regelung der Wachstumshormone im Körper selektiver als andere Somatostatin-Analoga und wird daher derzeit bei der Akromegalie indiziert, um den Plasmaanteil solcher Hormone zu steuern und zu verringern. Es wird ferner bei der Behandlung von zellulären Alterationen gastroenteropankreatischen Ursprungs und von bestimmten Tumoren verwendet.
Stand der Technik
Die erste beschriebene Darstellung von Octreotid ist eine klassische Synthese (Bauer W., Pless J., (Sandoz) Eur. Pat. Appl. 29, 579. Eidem U. S. Pat. 4,395,403 (1981, 1983)). Anschließend wurden Festkörpersynthesen beschrieben (Mergler et al., Alsina et al., Neugebauer). Die ihnen allen gemeinsame Aufgabe besteht darin, die vollständige Peptidkette durch Festkörpersynthese auszubilden, wobei die Synthese mit dem Threoninolrest begonnen wird. Diese Verfahrensweise macht den Schutz dieses Restes erforderlich.
Der erste Verfasser (Mergler M., Hellstern H., Wirth W., Langer W., Gysi P. und Prikoszovich W., Peptides: Chemistry and Biology. Proceedings of the 12th American Peptide Symposium. Smith, J. A. und Rivier J. E. Eds ESCOM, Leiden, Poster 292 Presentation, (1991)) beschreibt ein Syntheseverfahren unter der Verwendung eines Aminomethylharzes an das der Threoninolrest angebunden wird, wobei die beiden funktionalen Alkoholgruppen in Form eines Acetats geschützt sind. Bei der Synthese wird ein Fmoc/tBu-Schutzverfahren verfolgt, wobei die Disulfidbrücke am Harz durch Oxidation der Thiolgruppen der Cysteinreste ausgebildet wird, die zuvor von Schutzgruppen befreit wurden. Mit einer 20%igen Mischung von TFA/DCM werden die Schutzgruppen entfernt und das Peptid wird freigesetzt.
Anfang 1997 beschrieben Alsina et al. (Alsina J., Chiva C., Ortiz M., Rabanal F., Giralt E. und Albericio F., Tetrahedron Letters, 38, 883–886, (1997)) das Anbinden eines Threoninolrestes an aktive Carbonatharze, wobei die Aminogruppe durch die Boc-Gruppe und die Seitenketten durch eine Bzl-Gruppe geschützt wurden. Die Synthese wurde anschließend unter Anwendung einer Boc/Bzl-Strategie fortgesetzt. Die Ausbildung der Disulfidbrücke erfolgte direkt am Harz unter Verwendung von Jod. Durch HF/Ansiol 9/1 wurde das Peptid vom Harz freigesetzt. Gleichzeitig wurden die Schutzgruppen seiner Seitenketten entfernt. Abschließend wurde die Formylgruppe mit einer Piperidin/DMF-Lösung entfernt. Neugebauer (Neugebauer W., Lefevre M. R., Laprise R., Escher E., Peptides: Chemistry, Structure and Biology, S. 1017, Marshal G. R. and Rivier J. E. Eds. ESCOM, Leiden (1990)) beschrieb eine lineare Synthese mit einer Ausbeute von lediglich 7%.
Edwards et al. (Edwards B. W., Fields C. G., Anderson C. J., Pajeau T. S., Welch M. J., Fields G. B., J. Med. Chem. 37 3749–3757 (1994)) zeigten eine andere Herangehensweise vom Typ der Festkörpersynthese auf. Am Harz wurde Schritt für Schritt das Peptid D-Phe-Cys(Acm)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-HMP-Harz synthesiert. Anschließend wurde das Disulfid am Harz ausgebildet und schließlich das Peptid vom Harz mittels einer Aminolyse mit Threoniol freigesetzt, wobei eine Gesamtausbeute von lediglich 14% erhalten wurde.
Bei allen diesen Verfahren wird die Disulfidbrücke entweder an dem von Schutzgruppen vollständig befreiten Peptid oder am Harz ausgebildet.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Erhalt von Octreotid und von dessen pharmazeutisch verträglichen Salzen durch Säurezusatz oder von Komplexen davon mittels einer Feststoffsynthese auf Polymerträgern und unter Eingriff von Schutzgruppen des Typs Fmoc/tBu bereit, wobei es die folgenden Schritte umfasst:

1) Synthetisieren des aus sieben Aminosäuren bestehenden linearen Peptids Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Cl-trityl-R, wobei das besagte Peptid zweckmäßig geschützt wird (die Cysteine werden mit der Tritylgruppe, das Lysin mit einer Boc-Gruppe und das Threonin mit einer tBu-Gruppe geschützt) und auf einem Harz des Typs 2-Chlorotrityl-R verankert wird, wobei R ein in DCM und DMF unlösliches Polymer, ein vernetztes Polystyren oder dergleichen ist.
2) Selektives Auftrennen der Peptidharzverbindung, ohne Beeinträchtigung der Schutzgruppen des terminalen Aminoendes oder der Schutzgruppen der Seitenketten für die trifunktionalen Aminosäuren, oder
3a) Aktivieren der terminalen Carboxygruppe des geschützten Petids und Anbinden des Threoninol-Restes ohne irgendeine Art der Aktivierung; und
4a) Ringschluss durch Bilden einer Disulfidbrücke durch eine Reaktion mit Jod; oder
3b) Ringschluss durch Bilden einer Disulfidbrücke durch eine Reaktion mit Jod; und
4b) Aktivieren der terminalen Carboxygruppe des geschützten Peptids mit der bereits ausgebildeten Disulfidbrücke und Anbinden des Threoninol-Restes ohne irgendeinen Schutz.
5) Entfernen der Schutzgruppen von den seitlichen Ketten und von dem terminalen Aminoende unter Erhalt von Octreotid.
6) Reinigen des unbehandelten Octreotids mittels einer preparativen HPLC.

Das zweite Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch das folgende Diagramm zusammengefasst:
Der grundsätzliche Unterschied gegenüber den bereits beschriebenen Verfahren besteht darin, dass die Einführung des Threoninols an der geschützten Peptidstruktur (harzfrei) durchgeführt wird, die bei geeigneter Aktivierung quantitativ, ohne einen temporären Schutz oder Derivate des Threoninols einführen zu müssen, zum geschützten Vorgänger des Octreotids führt, der dann durch Anwendung einer einfachen Säurebehandlung Octreotid in sehr großen Ausbeuten ergibt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Genauer betrachtet stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhalt von Octreotid bereit, dass auf einer Festkörpersynthese unter Anwendung der Schutzgruppentechnik vom Typ Fmoc/tBu bei einem Typ-2-Chlorotrityl und dem Einsatz von Boc-D-Phe für das terminale Aminoende des Fragments 1–7 und der nachfolgenden Anbindung des Threoninolrestes als solches beruht.
Die Festkörpersynthese wird unter Einsatz des 2-Chlorotritylchloridharzes (Barlos et al., Tetrahedron Letters 30, 3943–3946 (1989), Barlos et al., Tetrahedron Letters 30, 3947–3950 (1989)) durchgeführt, wobei zunächst ein Fmoc Cys(Trt) angebunden wird.
Dieses Gerüst stellt auf Grund seiner hohen sterischen Behinderung die Anbindung des Fmoc-Cys-(Trt)-Restes ohne Racemisierung sicher, und zwar weder während des Ankoppelns selbst noch während der nachfolgenden Grundbehandlungen mit 20% Piperidin in DMF, die zum Entfernen der Fmoc-Schutzgruppen eingesetzt werden.
Nachdem das Peptidskelett
bereitgestellt wurde, hängt die vorliegende Erfindung Boc-D-Phenylalanin an das terminale N-Ende der Peptidkette an, um das lineare Skelett zu erhalten:
Anschließend wird das geschützte Peptidfragment mit Hilfe einer Säure, vorzugsweise Essigsäure vom Harz abgespalten, wobei weder die Schutzgruppen des terminalen Aminoendes noch die Schutzgruppen der Seitenketten beeinträchtigt werden. Beim dem erhaltenen Erzeugnis Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-COOH kann der Ringschluss unter Ausbildung einer Disulfidbrücke mit Iod in der gleichen Lösung unter gleichzeitiger Entfernung der beiden Tritylgruppen (3a) vollzogen und anschließend der Threoninolrest angebunden werden (4a). Alternativ kann das besagte Erzeugnis jedoch auch bis zur Trockne eingedampft werden, um anschließend direkt mit der Anbindung der Threoninolgruppe unter Aktivierung des terminalen Carboxyl-Endes (3b) und der anschließenden Oxidation der gesamten Peptidkette fortzufahren.
Der letzte Schritt besteht in Entfernung sowohl der Schutzgruppe des terminalen Aminoendes des D-Phenylanalins (Boc) als auch der Schutzgruppen der Seitenketten für Thr(t-Bu) und Lys(Boc) mittels einer Behandlung mit 70–95% TFA unter der Anwesenheit von Radikalfängern.
Das unbehandelte Octreotid wird mit Hilfe einer HPLC gereinigt. Alle homogenen Fraktionen werden vereinigt und lypophilisiert, wodurch Octreotid mit einem Reinheitsgrad von 99% und einer Ausbeute des Reinigungsschrittes von 60% erhalten wird.
Obwohl zunächst erwartet wurde, dass die Aktivierung des Cys-Restes am terminalen C-Ende, die zum Ankoppeln des Threoninols erforderlich ist, einen beträchtlichen Anteil an (D-Cys)-Octreotid ergeben würde, erfolgte diese Reaktion stets mit einer Epimerisierung von weniger als 1%. Kurz gesagt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, das im Vergleich zu den Synthesestrategien, die auf bereits vorliegende Verfahren zurückgreifen und als Stand der Technik beschrieben sind, neu und erfinderisch ist und das eine Gesamtsynthese mit einer Reinigungsausbeute von über 40% darstellt.
Der Erfolg der Erfindung liegt in diesem Merkmal begründet, das ein klares und wettbewerbsfähiges Verfahren für die Synthese von Octreotid in sich birgt.

Nachfolgend sind die Bedeutungen der in der vorliegenden Beschreibung verwendeten Abkürzungen angegeben:

AcOH:	Essigsäure
Acm:	Acetamidomethyl
Boc:	tert-Butoxycarbonyl
Cys:	L-Cystein
Cis:	L-Hemicystein
D-Phe:	D-Phenylalanin
D-Trp:	D-Tryptophan
DCM:	Dichlormethan
DIEA:	N,N'-Diisopropyethylamin
DIPCDI:	Diisopropylcarbodiimid
DMF:	N,N-Dimethylformamid
Fmoc:	9-Fluorenylmethoxycarbonyl
HMP-Harz:	Hydroxymethylphenoxyacetyl-Harz
HOBT:	N-Hydroxybenzotriazol
HPLC:	Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (High-Performance Liquid Chromatography)
Lys:	L-Lysin
μL:	Mikroliter
μmol:	Mikromol
tBu:	tert-Butyl
TFA:	Trifluoressigsäure
TFE:	Trifluorethanol
Thr:	L-Threonin
Throl:	L-Threoninol
Trt:	Trityl

Die Erfindung wird anschließend mit den folgenden den Schutzbereich nicht einschränkenden Beispielen verdeutlicht.
BEISPIEL 1
Anbinden der ersten Aminosäure. Erhalt von Fmoc Cys-Cl-trityl-Harz.
Das Anbinden des Fmoc-Cys(Trt)-OH-Restes an dem 2-Cl-Trt-Harz wird mit einem Überschuss von 1 Äquivalent Fmoc Cys(Trt) und 2,5 Äquivalenten DIEA erreicht.
2,93 g (5,0 mmol) Fmoc-Cys(Trt) werden an 5 g Harz (f = 1,28 mmol/g des Harzes, 6,4 mmol) angebunden. Das Harz und die Aminosäuren werden in verschiedenen Behältnissen ausgewogen und bis zur Trockne wenigsten 2 Stunden lang im Vakuum mit KOH belassen. Eine 1/1-Lösung von DIEA und DCM (getrocknet an einem 4 A Sieb) wird hergestellt. Die bereits trockene Aminosäure wird in trockenem DCM (an einem 4 A Sieb) mit einer Konzentration von 0,1 g Harz je Milliliter gelöst, wobei eine minimale Menge eingesetzt wurde, um gerade vollständig aufzulösen. Ein Drittel der 1,8 ml (12,5 mmol) an DIEA-Lösung wird dieser transparenten Lösung in 1,8 ml DCM zugesetzt. Dies wird gründlich homogenisiert und dem trockenen Harz zugesetzt. Es wird 5 Minuten lang einer kräftigen magnetischen Agitation ausgesetzt und das restliche DIEA der Reaktion zugesetzt. Eine Reaktion der Mischung über 40 Minuten oder mehr wird ermöglicht. Anschließend werden 4 ml an trockenem MeOH zugesetzt und eine 10 Minuten lange Reaktion zugelassen, nach welcher der Harz auf einer Filterplatte mit Passform gefiltert und das nachfolgend beschriebene Waschen durchgeführt wird.
BEISPIEL 2
Anbinden der verschiedenen Aminosäuren. Erhalt von Boc-D-Phe-Cys(Trt)-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Cl-trityl-Harz.
Das Anbinden der Aminosäuren wird unter Befolgung des zuvor beschriebenen Syntheseprogamms durchgführt, wobei ein Überschuss von 2,5 Äquivalenten Fmoc-Aminosäure, HOBt und DIPCDI eingesetzt wird. Anschließend wird die Fmoc-Schutzgruppe durch Einsatz von 20% Piperidin/DMF über eine Zeitdauer von einer Stunde und 5 Minuten hinweg entfernt.
Kontrolle durch Ninhydrin-Test; falls +, zurück zu 5; falls –, befolge Schritt 1 mit der nächsten Amiosäure.
Die Ausbeuten am Ende der Synthese sind zum Erhalt von Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-2Cl-trityl-Harz quantitativ.
BEISPIEL 3
Herstellung von Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)
250 mg (113 μmol) Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-2Cl-trityl-Harz werden mit 6,36 ml einer Mischung von DCM/TFE/AcOH in einem Verhältnis von 7/2/1 oder 5,5/0,5/4 zwei Stunden lang unter magnetischer Agitation behandelt. Die Suspension wird anschließend gefiltert und mit 0,2 ml, 0,2 ml und 0,2 ml einer Mischung von DCM/TFE/AcOH in einem Verhältnis von 7/2/1 gewaschen. Die Lösung wird unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingedampft (falls nicht gewünscht wird, mit der Oxidation fortzufahren) und der erhaltene Feststoff mit Wasser gewaschen. Die Ausbeute ist quantitativ.
BEISPIEL 4
Erhalt des Rings^(2–7) Boc-D-Phe-Cis-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cis-OH (Oxidiertes Fragment 1–7).
250 mg (113 mmol) Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-COOH, das in 7 ml einer Mischung von DCM/TFE/AcOH im Verhältnis 7/2/1 gelöst wurde, wird langsam zu 290 mg (1,13 mmol) Jod in einer Mischung von DCM/TFE/AcOH mit dem Verhältnis 7/2/1 mit einer Konzentration von 0,8 M gegeben. Die Reaktion wird 15 Minuten lang zugelassen. 4,3 ml einer 1 N Lösung von Na₂S₂O₇ wird zur Entfernung des überschüssigen Jods zugesetzt. Die wässerige Phase wird extrahiert und dreimal mit 1 ml DCM gewaschen. Die organischen Phasen werden alle gemeinsam mit einer Zitronensäure/Wasser-Lösung extrahiert und unter reduziertem Druck bis zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Feststoff wird mit Hilfe einer Filterplatte und Wasser gewaschen. Die Ausbeute schwankt zwischen 85% und 95%.
BEISPIEL 5
Anbinden von Throl an den Ring ^(2–7) Boc-D-Phe-Cis-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cis-OH (Oxidiertes Fragment 1–7).
Über 250 mg (230 μmol) ^(2–7) Boc-D-Phe-Cis-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cis-OH (Oxidiertes Fragement 1–7), 103 mg (690 μmol) HOBt und 72 mg (690 μmol) Threoninol werden ausgewogen und in 10 ml trockenem DMF/trockenem DCM (1 : 1) gelöst, wobei unter kräftiger Agitation 111 μl (690 μmol) DIPCDI zugesetzt werden. Die Mischung reagiert über 5 Stunden hinweg bei Raumtemperatur. Sie wird zur Trockne eingedampft, bis ein Öl erhalten wird. Wasser wird zugesetzt. Schließlich wird die Mischung mittels Ultraschall gut homogenisiert und lyphophiliert. Die Anbindung ist quantitativ.
BEISPIEL 6
Anbinden von Throl an den Ring ^(2–7) Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-OH (Reduziertes Fragment 1–7).
Über 250 mg (149 μmol) ^(2–7) Boc-D-Phe-Cis-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cis-OH (Oxidiertes Fragement 1–7), 67 mg (447 μmol) HOBt und 47 mg (447 μmol) Threoninol werden ausgewogen und in 10 ml trockenem DMF/ trockenem DCM (1 : 1) gelöst, wobei unter kräftiger Agitation 70 μl [sic] (447 μmol) DIPCDI zugesetzt werden. Die Mischung reagiert über 5 Stunden hinweg bei Raumtemperatur. Sie wird zur Trockne eingedampft, bis ein Öl erhalten wird. Wasser wird zugesetzt. Schließlich wird die Mischung mittels Ultraschall gut homogenisiert und lyphophiliert. Die Anbindung ist quantitativ.
BEISPIEL 7
Anbinden des Salzes aus HOBt und behandeltem Threoninol an den Ring ^(2–7) Boc-D-Phe-Cis-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)- Cis-OH (Oxidiertes Fragment 1–7).
In diesem Beispiel wird das gleiche wie in Beispiel 5 beschriebene Verfahren verfolgt, jedoch wird in diesem Fall das Salz Hthrol⁺ Obt^– und DIPCDI in trockenem DMF mit einer Konzentration von 25 mg/ml verwendet. Die Reaktion wird bei 47°C durchgeführt. Das Anbinden ist quantitativ.
BEISPIEL 8
Anbinden des Salzes aus HOBt und behandeltem Threoninol an Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-OH (Reduziertes Fragment 1–7).
In diesem Beispiel wird das gleiche wie in Beispiel 6 beschriebene Verfahren verfolgt, jedoch wird in diesem Fall das Salz Hthrol⁺ Obt^– und DIPCDI in trockenem DMF mit einer Konzentration von 25 mg/ml verwendet. Die Reaktion wird bei 47°C durchgeführt. Das Anbinden ist quantitativ.
BEISPIEL 9
Oxidation von Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Throl. Erhalt des Rings ^(2–7) Boc-D-Phe-Cis-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cis-Throl (Oxidiertes Fragment 1–8).
250 mg (147 mmol) Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Throl, das in 8,26 ml einer Mischung aus DCM/TFE/AcOH im Verhältnis 7/2/1 gelöst wurde, wird langsam zu 290 mg (1,47 mmol) Jod in einer Mischung von DCM/TFE/AcOH in dem Verhältnis 7/2/1 mit einer Konzentration von 0,8 M gegeben. Die Reaktion wird 15 Minuten lang zugelassen. 4,3 ml einer 1 N Lösung von Na₂S₂O₇ wird zur Entfernung des überschüssigen Jods zugesetzt. Die wässerige Phase wird extrahiert und dreimal mit 1 ml DCM gewaschen. Die organischen Phasen werden alle gemeinsam mit einer Lösung aus Zitronensäure und Wasser extrahiert und unter reduziertem Druck bis zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Feststoff wird mit Hilfe einer Filterplatte und Wasser gewaschen.
BEISPIEL 10
Entfernung der Schutzgruppen. Erhalt von Octreotid.
230 mmol des Rings ^(2–7) Boc-D-Phe-Cis-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cis-Throl (Oxidiertes Fragment 1–8), das gemäß den Beispielen 5, 7 und 9 erhalten wurde, wird mit 2 ml TFA/H₂O (95 : 5) fünf Stunden lang bei Umgebungstemperatur behandelt. Anschließend wird das Filtrat auf trockenen und kalten Diethylether getropft und der erhaltene weiße Niederschlag noch einmal zentrifugiert. Der Feststoff wird von neuem in Dieethylether suspendiert und erneut zentrifugiert. Dieses Verfahren wird fünf weitere Male durchgeführt. Das unbehandelte Peptid wird durch eine preparative HPLC bei 25% CH₃CH/H₂O mit 0,01% TFA in einer 10 μm, 25 × 5 cm Kromosil C₈ Säule gereinigt. Die Endausbeute des Erzeugnisses, das eine Reinheit von < 99% aufweist, übersteigt 40%.

Claims

Verfahren zum Erhalt von Octreotid und von dessen pharmazeutisch verträglichen Salzen durch Säurezusatz oder von Komplexen davon mittels einer Feststoffsynthese auf einem Polymerträger und unter Eingriff von Schutzgruppen des Typs Fmoc/tBu, das die Schritte aufweist: a) Synthetisieren des aus 7 Aminosäuren bestehenden linearen Peptids Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Cl-trityl-R, wobei Cys(Trt) ein mit einer Tritylgruppe geschütztes Cystein, Lys(Boc) ein mit einer Boc-Gruppe geschütztes Lysin und Thr(tBu) ein mit einer tBu-Gruppe geschütztes Threonin ist und wobei das besagte Peptid auf einem Harz des Typs 2-Chlorotrityl-R verankert wird, wobei R ein in DCM und DMF unlösliches Polymer wie vernetztes Polystyren ist; b) Behandeln des erhaltenen Peptidharzes mit Säure zum Abtrennen des Peptids vom Harz, wobei die anderen Schutzgruppen zum Erhalt von Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-COOH beibehalten werden; c) Ringschluss des Peptids durch Bilden einer Disulfidbrücke über eine Reaktion mit Jod; d) Entfernen der Schutzgruppen von den Seitenketten mit 70 bis 95%iger TFA in der Anwesenheit von Radikalfängern; und das weiterhin einen Schritt e) umfasst, der zwischen den Schritten b) und c) oder zwischen den Schritten c) und d) durchgeführt wird, wobei der besagte Schritt e) aus dem Anbinden eines Threoninol-Restes in Lösung an das caboxylseitige Ende des Peptids besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Heptapeptid Boc-D-Phe Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Cl-trityl-R aus 2-Chlorotrityl-Harz gewonnen wird, wobei in einer ersten Phase der Rest Fmoc-Cys(Trt) vor dem Einbau der anderen sechs Arminosäuren eingebaut wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der dem Abspalten des Peptids entsprechende Schritt b) durch Behandeln mit AcOH durchgeführt wird, die in einer Mischung aus TFE, MeOH und/oder DCM zu verschiedenen Anteilen gelöst ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Threoninol vor dem Ringschluss des Peptids durch Aktivieren der Carboxylgruppe des Cysteinrestes eingebaut wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Threoninol nach dem Ringschluss des Peptids durch Aktivieren der Carboxylgruppe des Cysteinrestes eingebaut wird.