DE3788910T2

DE3788910T2 - Methode für die Synthese eines Peptides, das eine nicht peptidartige Bindung enthält.

Info

Publication number: DE3788910T2
Application number: DE3788910T
Authority: DE
Inventors: David H Coy; Simon J Hocart
Original assignee: Tulane University
Current assignee: Tulane University
Priority date: 1986-06-27
Filing date: 1987-06-26
Publication date: 1994-07-21
Anticipated expiration: 2007-06-27
Also published as: US4803261A; EP0257742B1; ATE100815T1; GR880300166T1; ES2004472A4; DE3788910D1; JP2679786B2; DE257742T1; EP0257742A2; ES2004472T3; CA1307623C; JPS6322600A; EP0257742A3

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Synthese von Polypeptidketten, die nicht peptidartige Bindungen enthalten, und die chemische Modifikation von Polypeptidketten.
Normalerweise sind Aminosäuren in einer Peptidkette durch eine kovalente Peptidbindung mit der Formel -CO-NH- verbunden. Eine Reihe von Enzymen (Proteasen) kann auf diese Bindung wirken und diese hydrolysieren, so daß die Polypeptidkette in zwei oder mehr Fragmente gebrochen wird.
Szelke et al. (1982, Nature 299: 555) beschreiben die Bildung von Analogen von Angiotensinogen durch die chemische Modifizierung von Peptidbindungen in dem Polypeptid Angiotensinogen. Die modifizierten Bindungen haben die Formel -CH&sub2;-NM- und bei einigen der Analoge, die diese Bindungen enthalten, wurde festgestellt, daß sie im Vergleich zu nativem Angiotensinogen eine erhöhte Potenz aufweisen. Es wurde angenommen, daß diese erhöhte Potenz auf die Unfähigkeit der Proteasen, die nicht peptidartige Bindung zu spalten, zurückzuführen ist. Einige der Analoge wurden von Dipeptiden synthetisiert, die in Lösung durch reduktive Alkylierung einer Aminosäure mit einem Aminoaldehyd unter Verwendung von NaCNBH&sub3; gebildet worden waren. Das Dipeptid wurde vor Vollendung der Synthese des Analogs durch Gelfiltration und Ionenaustauschchromatographie gereinigt.

Zusammenfassung der Erfindung

In einem ersten Merkmal beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Festphasen-Synthese eines Polypeptids, das eine nicht peptidartige Bindung enthält. Das Verfahren beinhaltet die Bereitstellung eines Aminoaldehyds der Formel:
wobei X eine Schutzgruppe umfaßt und R&sub1; eine Seitengruppe einer Aminosäure ist; die Bereitstellung eines Komplexes der Formel:
wobei Y eine Festphase umfaßt und R&sub2; eine Seitengruppe einer Aminosäure ist; und
Reaktion zwischen dem Aminoaldehyd und dem Komplex in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid zur Bildung von
Es können dann nach Wunsch zusätzliche Aminosäuren der Kette zugefügt und das Peptid von der Festphase abgespalten werden, 50 daß das Polypeptid freigegeben wird, welches dann gereinigt wird.
In einem zweiten Merkmal beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur chemischen Festphasen-Modifikation eines Peptids. Das Verfahren beinhaltet die Bereitstellung einer carbonylhältigen Verbindung der Formel:
wobei R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander Wasserstoff; eine verzweigt- oder geradkettige niedrige (C&sub1;-C&sub6;) Alkylgruppe, z. B. Methyl; oder Arylgruppe, z. B.
Phenyl, p-Chloro-phenyl oder Naphthyl enthalten; Bereitstellung eines Komplexes der Formel
wobei Y eine Festphase umfaßt und R&sub5; eine Seitengruppe einer Aminosäure ist; und
Reaktion zwischen der carbonylhältigen Verbindung und dem Komplex in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid zur Bildung von:
Dann können je nach Wunsch zusätzliche Aminosäuren zu der Kette hinzugefügt werden, und das Peptid wird von der Festphase abgespalten, um das Peptid freizugeben, welches dann gereinigt wird. In bevorzugten Ausführungsbeispielen ist die carbonylhältige Verbindung Formaldehyd (R&sub3; = R&sub4; = H).
In einem dritten Merkmal beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur chemischen Festphasen-Modifikation eines Peptids, das Aminosäureuntereinheiten enthält, die NH&sub2;-haltige Seitengruppen enthalten. Das Verfahren umfaßt die Bereitstellung einer carbonylhältigen Verbindung der Formel:
wobei R&sub6; und R&sub7; unabhängig voneinander Wasserstoff; eine verzweigt oder geradkettige niedrige (C&sub1;-C&sub6;) Alkylgruppe, z. B. Methyl; oder Arylgruppe, z. B. Phenyl, p-Chloro-phenyl oder Naphthyl enthalten; Bereitstellung eines Komplexes der Formel:
wobei X eine Schutzgruppe umfaßt, Y eine Festphase beinhaltet und R&sub8;-NH&sub2; eine Seitengruppe von Lys, Ornithin oder Diaminobuttersäure ist; Reaktion zwischen der carbonylhältigen Verbindung und dem Komplex in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid zur Bildung von:
Abspalten der Festphase zur Freigabe des Peptids; und Reinigung des Peptids. In bevorzugten Ausführungsbeispielen ist die carbonylhältige Verbindung Aceton und die R&sub8;-NH&sub2; Seitengruppe eine Seitengruppe von Lys.
In den obengenannten Formeln (2), (5) und (8) kann Y jede Anzahl von Aminosäuren enthalten, die bereits sequentiell an eine Festphase, z. B. ein Harz, gebunden sind, oder Y kann nur aus der Festphase bestehen. Mit anderen Worten, die nicht peptidartige Bindung kann jedes Paar Aminosäuren des Peptids verbinden und kann auch mehr als ein Paar von Aminosäuren in demselben Peptid verbinden. Gleichermaßen kann X in den Formeln (1) und (8) eine oder zwei Aminosäuren enthalten, obwohl wegen der einfacheren Automatisierung bevorzugt wird, daß X nur aus einer Schutzgruppe besteht.
Das Verfahren kann zur Schaffung eines erhöhten Widerstandes gegenüber dem proteolytischen Abbau, und somit von längeren Halbwertszeiten in vivo für alle zweckmäßigen synthetischen Peptide, z. B. menschlichen Hormonen wie LHRH und Somatostatin, und Analogen davon verwendet werden. Bei dem Verfahren ist die Ausbeute, die Geschwindigkeit und die Einfachheit der Durchführung deutlich größer als bei früheren Verfahren, welche die Flüssigphasen-Synthese anwandten. Da das Verfahren zur chemischen Modifikation von Polypeptiden in situ verwendet werden kann, stellt das Verfahren zusätzlich ein einfaches, rasches und billiges Mittel zum Einfügen einer Reihe von Alkyl- und Arylgruppen in alle zweckdienlichen synthetischen Polypeptide, z. B. Hormone und Hormonanaloge, z. B. Somatostatin und LHRH und ihre therapeutischen Analoge, dar.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsbeispiele und aus den Ansprüchen hervor.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele

Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Synthese eines Peptids der Erfindung, das eine nichtpeptidartige Bindung aufweist.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung der Synthese eines chemisch modifizierten Peptids der Erfindung, das eine α-N-Methylgruppe aufweist.
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung der Synthese eines chemisch modifizierten Peptids der Erfindung, das eine &epsi;-Isopropylgruppe aufweist.

Struktur

Nicht peptidartige Bindung

Mit nicht peptidartiger Bindung wird ein -CH&sub2;-NH-Teil zwischen zwei oder mehr Aminosäuren in einer Polypeptidkette bezeichnet.

Schutzgruppe

Es kann jede geeignete Standard-Aminosäureschutzgruppe verwendet werden. Beispiele für solche Schutzgruppen sind FMOC (Fluorenylmethyloxycarbonyl) und Butyloxycarbonyl (Boc). Diese Gruppen verhindern die nichtspezifische Reaktion der Aminosäuren während der Synthese einer Polypeptidkette.

Festphase

Die Festphase kann jede Verbindung sein, an die eine Aminosäure oder Polypeptidkette reversibel chemisch gekoppelt werden kann und an welcher eine Synthese eines Polypeptids durchgeführt werden kann. Beispiele für solche Festphasen sind Harze, z. B. Chloromethylharz und Benzhydrylamin-Polystyrolharz (Vega Biochemical, Inc.).

Aminoaldehyd

Aminoaldehyde haben die allgemeine Formel:
wobei X und R&sub1; wie oben beschreiben sind. Diese Verbindungen werden allgemein wie von Fehrentz et al. (1983, Synthesis 676) beschrieben, synthetisiert.

Carbonylhältige Verbindung

Carbonylhältige Verbindungen haben die allgemeine Formel:
wobei R&sub3;, R&sub4;, R&sub6; und R&sub7; wie oben beschrieben sind. Diese Verbindungen sind im Handel erhältlich oder können unter Verwendung herkömmlicher Techniken synthetisiert werden.

Somatostatinanaloge

Somatostatin und seine Analoge sind Polypeptide mit einer Hemmaktivität für die Wachstumshormonfreisetzung. Einige Somatostatinanaloge wurden in Coy et al. U.S. Patent 4.485. 101 beschrieben, welches hiemit durch Bezugnahme eingeführt wird; und in Coy et al. U.S.S.N. 775.488, eingereicht am 12. September 1985, das auf denselben Rechtsnachfolger wie die vorliegende Anmeldung übertragen wurde und hiemit durch Bezugnahme eingeführt wird.

Synthese

A. Nicht peptidartige Analoge von Polypeptiden

Im allgemeinen umfaßt die Synthese von nicht peptidartigen Analogen von Polypeptiden die Synthese einer harzgebundenen geschützten Aminosäure oder Polypeptidkette und eines geschützten Aminoaldehyds und ihre Reaktion in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid. Wenn die Reaktion beendet ist, kann das nicht peptidartige Analog weiter wachsen oder wird von dem Harzträger abgespalten und durch Standardverfahren gereinigt.

Beispiel 1

Synthese von D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-CH&sub2;-NH-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2;

Mit Bezugnahme auf Fig. 1 wurde Boc-D-Trp Aldehyd (Boc-D-Trp-CHO, 387 mg, 1,25 mMol) durch das Verfahren von Fehrentz et al (id.) (Reaktionsschritte I und II) hergestellt und in 5 ml trockenem IMF aufgelöst. Dies umfaßt kurz gesagt die Reaktion zwischen Boc-D-Trp und CH&sub3;NH(OCH&sub3;)·HCl in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) zur Bildung eines Zwischenprodukts, welches dann mit LiAlH&sub4; in Tetrahydrofuran (THF) zur Bildung des gewünschten Aldehyds zur Reaktion gebracht wurde. Boc-Lys(Cl-Z)-Val-Cys(MeBzl)-Thr(Bzl)-Benzhydylaminharz (0,5 mMol) wurde durch Standardverfahren unter Verwendung eines Beckman 990B automatischen Peptidsynthetisierers hergestellt. Die Boc-Schutzgruppe wurde durch Behandlung mit 33% TFA in Methylenchlorid entfernt, und das Harz-TFA-Salz (TFA NH&sub2;Lys(Cl-Z)-Val-Cys(MeBzl)-Thr(Bzl)-Benzhydrylaminharz) wurde in trockenem Dimethylformamid, enthaltend 1% Essigsäure (AcOH), suspendiert.
Der obengenannte Aldehyd und das Harz-TFA-Salz wurden vermischt und 100 mg (2 mMol) Natriumcyanoborhydrid zugegeben (Reaktion III). Nach einstündigem Rühren erwies sich die Harzmischung bei der Ninhydrinreaktion als negativ, was auf eine vollständige Derivatisierung der freien Aminogruppe hinweist.
Die verbleibenden Aminosäuren des Somatostatin Octapeptids (Tyr, Cys und Phe) wurden dann durch Standardtechniken, die protektive Schritte, Carbodiimidkopplungen und TFA-Deprotektion enthielten, vereinigt (Reaktion IV).
Das freie Peptidamid wurde von dem Träger durch Behandlung mit Fluorwasserstoff (HF)/Anisol unter Standardbedingungen abgespalten und wurde durch Behandlung mit einem geringen Überschuß Iod (I&sub2;) in 90% Essigsäure/Wasser (Reaktion V) cyclisiert. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde das rohe Peptid durch Elution auf G-25 in Sephadex Säulen in 2M Essigsäure und anschließende Umkehrphasen-Verteilungschromatographie auf C&sub1;&sub8;-Silica unter Verwendung eines linearen Gradienten aus 10-30% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure gereinigt. Das gereinigte Peptid (die Ausbeute betrug 63,4 mg) war durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) und Dünnschichtchromatographie (TLC) in mehreren Lösungsmittelsystemen homogen. Das Material ergab die erwarteten Verhältnisse nach der Aminosäureanalyse eines Methansulfonsäure/Tryptaminhydrolysats. Die Gegenwart des D-Trp-CH&sub2;NH-Lys Pseudodipeptids im korrekten Verhältnis wurde durch den Vergleich mit der Elutionsposition einer authentischen Probe des Dipeptids auf dem Aminosäureanalysator nachgewiesen.

Beispiel 2

Synthese von D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-CH&sub2;NH-Val-Cys-Thr-NH&sub2;

Benzhydrylamin-Polystyrolharz (1,30 g, 0,5 mMol) in der Chloridionform wurde in das Reaktionsgefäß eines Beckman 990B Peptidsynthetisierers eingebracht, der zur Durchführung des folgenden Reaktionszyklus programmiert war: (a) Methylenchlorid; (b) 33% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (zweimal jeweils 1 und 25 Min.); (c) Methylenchlorid; (d) Ethanol; (e) Methylenchlorid; (f) 10% Triethylamin in Chloroform.
Das neutralisierte Harz wurde mit Boc-O-Benzyl-Thr und Diisopropylcarbodiimid (jeweils 1,5 mMol) in Methylenchlorid 1 Stunde gerührt, und das erhaltene Aminosäureharz durchläuft dann die Schritte (a) bis (f) des obengenannten Waschprogramms. Die folgenden Aminosäuren (1,5 mMol) wurden dann der Reihe nach durch dasselbe Verfahren gekoppelt: Boc-s-Methylbenzyl-Cys, Boc-Val. Die Boc-Gruppe wurde dann durch Behandlung mit TFA (Trifluoressigsäure) entfernt. Der Boc-Lys (Carbenzoxy)-Aldehyd (1,25 mMol), der durch das Verfahren von Fehrentz et al. (id.) hergestellt worden war, wurde in 5 ml trockenem DMF (Dimethylformamid) gelöst und der Harz-TFA-Salzsuspension zugegeben, worauf eine Zugabe von 100 mg (2 mMol) Natriumcyanoborhydrid folgte. Nach einstündigem Rühren erwies sich die Harzmischung bei der Ninhydrinreaktion (1 Min.) als negativ, was auf eine vollständige Derivatisierung der freien Aminogruppe hinweist.
Die verbleibenden Aminosäuren Boc-D-Trp, Boc-tyr, Boc-s-Methylbenzyl-Cys, Boc-D-Phe des Somatostatin Octapeptids wurden dann durch Standardtechniken, die Carbodiimidkopplungen und TFA-Deprotektion enthielten, vereinigt. Nach dem Waschen und Trocknen wog das fertiggestellte Harz 1,87 g.
Das Harz wurde mit Anisol (4 ml) und wasserfreiem Fluorwasserstoff (36 ml) bei 0ºC vermischt und 45 Min. gerührt, um das Peptid von dem Harzträger abzuspalten. Überschüssiger Fluorwasserstoff wurde rasch unter einem Strom von trockenem Stickstoff verdampft, und das freie Peptid wurde ausgefällt und mit Ether gewaschen. Das rohe Peptid wurde dann cyclisiert, indem es in 800 ml 90% Essigsäure aufgelöst wurde, der I&sub2; in Methanol beigegeben wurde, bis eine ständige braune Farbe beobachtet wurde. Die Lösung wurde 1 Stunde gerührt, bevor das Lösungsmittel in vacuo entfernt wurde. Das erhaltene Öl wurde in einem Minimalvolumen von 50% Essigsäure gelöst und auf einer Säule (2,5 · 100 mm) aus Sephadex G-25 eluiert. Fraktionen, die eine Hauptkomponente enthielten, wie durch UV (Ultraviolett-) Absorption und Dünnschichtchromatographie bestimmt wurde, wurden dann vereinigt, auf ein kleines Volumen verdampft und auf eine Säule (2,5 · 50 cm) aus Whatman LRP-1 Octadecylsilan (15-20 uM) aufgebracht und mit einem linearen Gradienten von 10-50% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser eluiert. Die Fraktionen wurden durch TLC und analytische HPLC untersucht und für eine maximale Reinheit vereinigt. Die wiederholte Lyophilisierung der Lösung von Wasser ergab 78 mg Produkt als weißes lockeres Pulver.
Das Produkt wurde mit HPLC und TLC als homogen befunden. Die Aminosäureanalyse eines Säurehydrolysats bestätigte die Zusammensetzung des Octapeptids.

Beispiel 3

Synthese von D-Phe-Cys-CH&sub2;-NH-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2;

Dieses Peptid wurde auf Benzhydrylaminharz bei den in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen unter Verwendung von Boc-O-Benzyl-Thr, Boc-S-Methylbenzyl-Cys, Boc-Val, Boc-Lys, N-Benzyloxycarbonyl-Lys, Boc-D-Trp und 2-Bromocarbenoxy-Tyr aufgebracht. Boc-Cys(Methylbenzyl)-Aldehyd wurde dann gemeinsam mit NaCNBH&sub3; dem Harz wie in Beispiel 2 zugegeben. Die verbleibende Aminosäure, Boc-tert-Butyloxycarbonyl-D-Phe wurde dann wie in Beispiel 2 zugegeben. Das endgültige Harz wog 1,84 g.
Das Harz wurde einer Fluorwasserstoffspaltung und I&sub2;-Cyclisierung, wie in Beispiel 2 beschrieben, unterzogen. Das lyophilisierte Produkt wog 89 mg und wurde mit HPLC und TLC als homogen befunden. Die Aminosäureanalyse eines Säurehydrolysats bestätigte die Zusammensetzung des Octapeptids.
Die obengenannte reduktive Aminierungsmethode ist besonders bei Peptiden anwendbar, die Trp und Cys-Reste enthalten und ist auch bei Schutzgruppen mit Bzl und Cbz-artigen Seitenketten angemessen.

B. α-N-R-Analoge von Polypeptiden

Im allgemeinen umfaßt die Synthese von α-N-R-Analogen von Polypeptiden, wobei R eine Alkyl- oder Arylgruppe ist, die Synthese einer harzgebundenen geschützten Aminosäure oder Polypeptidkette und einer carbonylhältigen Verbindung und ihre Reaktion in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid. Der Nettoeffekt der Reaktion ist die Umwandlung der Carbonylgruppe ( ) zu einer CH-Gruppe, die an das Stickstoffatom der α-Aminogruppe der harzgebundenen Aminosäure oder des Polypeptids gebunden ist. Wenn zum Beispiel die Carbonylverbindung Formaldehyd (H H) ist, produziert die Reaktion einen α-N-Methylteil. Wenn die Natriumcyanoborhydridreaktion vollständig ist, kann das modifizierte Peptid weiter wachsen oder wird von dem Harzträger abgespalten und durch Standardverfahren gereinigt.

Beispiel 1

Synthese des LHRH-Agonisten

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Aia-N-Me-Leu-Arg-Pro-Gly-NH&sub2;

Mit Bezugnahme auf Fig. 2 wurde TFA·NH&sub2;-Leu-Arg (Tos)-Pro-Gly-Benzhydrylaminharz (0,5 mMol) durch Standardverfahren unter Verwendung eines Beckman 990B automatischen Peptidsynthetisierers bereitet. Das Harz-TFA-Salz wurde dann mit 2 ml Formaldehyd (37% Formalin) vermischt und 1,5 mMol Natriumcyanoborhydrid in DMF (Dimethylformamid)/1% ACOH (Essigsäure) zugegeben. Die Harzmischung wurde gerührt, bis sie bei der Ninhydrinreaktion negativ war, was auf eine vollständige Derivatisierung der freien Aminogruppe zur Bildung einer N-Methylaminogruppe hinweist.
Die verbleibenden Aminosäuren des Polypeptids (D-Ala, Tyr, Ser, Trp, His und pGlu) wurden dann durch Standardtechniken, die protektive Schritte, Carbodiimidkopplungen und TFA-Deprotektion enthielten, vereinigt.
Das freie Peptidamid wurde dann durch Behandlung mit HF/Anisol von dem Träger abgespalten und unter Standardbedingungen gereinigt, um das gewünschte Polypeptid zu erhalten.

C. Seitengruppen-N-R-Analoge von Polypeptiden

Im allgemeinen umfaßt die Synthese von Seitengruppen-N-R-Analogen von Polypeptiden, wobei R eine Alkyl oder Arylgruppe ist, die Reaktion einer harzgebundenen geschützten Aminosäure, die eine Seitenkette aufweist, welche eine freie Aminogruppe enthält, oder einer harzgebundenen Polypeptidkette, die eine derartige Aminosäureuntereinheit enthält, mit einer carbonylhältigen Verbindung in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid. Aminosäuren, die eine Seitenkette aufweisen, welche eine freie Aminogruppe enthält, umfassen Lys, Ornithin und Diaminobuttersäure. Der Nettoeffekt der Reaktion ist die Umwandlung der Carbonylgruppe ( ) zu einer CH-Gruppe, die an den Stickstoff der freien Seitenkette-Aminogruppe der harzgebundenen Aminosäure oder des Polypeptids gebunden ist. Wenn zum Beispiel die Carbonylverbindung Aceton (CH&sub3;C H&sub3;) und die Aminosäure mit der freien aminohaltigen Seitenkette Lys (Seitenkette = -(CH&sub2;)&sub3;-CH&sub2;NH&sub2;) ist, ergibt die Reaktion einen &epsi;-N-Isopropylteil. Wenn die Natriumcyanoborhydridreaktion beendet ist, wird das modifizierte Peptid von dem Harzträger abgespalten und durch Standardverfahren gereinigt.
Die obengenannte Synthese kann zur Herstellung von LHRH-Antagonisten, wie in der Folge beschrieben, verwendet werden.

Beispiel 1

Synthese des LHRH-Antagonisten

Ac-D-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(iPr)-Phe-Lys(iPr)-Pro-Ala-NH&sub2;

Mit Bezugnahme auf Fig. 3 wurde Ac-D-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser(Bzl)-Tyr (Bzl)-D-Lys(FMOC)-Phe-D-Lys(FMOC)-Pro-D-Ala-Benzhydrylamin (0,25 mMol) Harz durch Standardmethoden in einem Beckman 990B automatischen Peptidsynthetisierer unter Verwendung von 33% TFA zur Entfernung der O-BOC Schutzgruppen verwendet. Die &epsi;-FMOC Schutzgruppen auf dem Lys-Rest sind bei diesen sauren Bedingungen und bei den folgenden Neutralisierungsschritten mit 10% Triethylamin in Chloroform vollkommen stabil. Das Harz wurde dann mit 50 ml einer 50% Lösung aus Piperidin in DMF (Dimethylformamid) etwa 12h behandelt, um die FMOC Schutzgruppe von den Lys-Resten zu entfernen.
Zur Reaktion der freien &epsi;-Aminogruppe der Lys-Reste wurde das Harz mit 5 ml Aceton gemischt und 1 mMol Natriumcyanoborhydrid in DMF/1% Essigsäure zugegeben. Dann wurde die Harzmischung gerührt, bis sie bei der Ninhydrinreaktion negativ war (etwa 3 Stunden); die negative Ninhydrin-Reaktion weist darauf hin, daß die freie &epsi;-Aminogruppe zu N-Isopropylaminogruppen umgewandelt worden war.
Das Harz wurde dann von dem Träger durch Behandlung mit HF/Anisol abgespalten und unter Standardbedingungen gereinigt, um das gewünschte Polypeptid zu erhalten.
Ac-D-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(iPr)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-Amid wird auf analoge Weise unter Verwendung geeigneter Modifizierungen des obenbeschriebenen Verfahrens bereitet.

Anwendung

Das Verfahren der Erfindung kann zur Modifizierung jeglicher Peptide von therapeutischem oder veterinärischem Interesse, z. B. Hormonen wie LHRH, TRH und Somatostatin, und Analogen davon verwendet werden. Solche Modifizierungen können die chemische Stabilität und Potenz der Peptide erhöhen. Zusätzlich verringert die Einfügung von N-Alkyl oder Arylgruppen unerwünschte Nebenwirkungen, z. B. Hautreizung, die oftmals auftreten, wenn die nichtalkylierten oder nichtarylierten Peptide an menschliche Patienten verabreicht werden. Ferner ermöglicht die Erfindung die Zugabe von Seitengruppen (z. B. Isopropyl) zu Aminosäuren auf eine im Vergleich zu Verfahren billige Weise, in welchen die teure vorderivatisierte Aminosäure selbst verwendet wird.
Andere Ausführungsbeispiele sind im Bereich der folgenden Ansprüche.

Claims

1. Verfahren zur Festphasen-Synthese eines Polypeptids, das eine nicht peptidartige Bindung enthält, umfassend folgende Schritte:

(a) Bereitstellung eines Aminoaldehyds der Formel

wobei X eine Schutzgruppe umfaßt und R&sub1; eine Seitengruppe einer Aminosäure ist;

(b) Bereitstellung eines Komplexes der Formel

wobei Y eine Festphase umfaßt und R&sub2; eine Seitengruppe einer Aminosäure ist; und

(c) Reaktion zwischen dem Aminoaldehyd und dem Komplex in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid zur Bildung von

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Aminoaldehyd Trp-Aldehyd, Lys-Aldehyd oder Cys-Aldehyd ist.

3. Verfahren zur chemischen Festphasen-Modifikation eines Peptids, imfassend folgende Schritte:

(a) Bereitstellung einer carbonylhaltigen Verbindung der Formel

wobei R&sub3; und R&sub4; unabhängig voneinander Wasserstoff, eine verzweigt- oder geradkettige niedrige Alkylgruppe oder Arylgruppe sind;

(b) Bereitstellung eines Komplexes der Formel

wobei Y eine Festphase umfaßt und R&sub5; eine Seitengruppe einer Aminosäure ist; und

(c) Reaktion zwischen der carbonylhältigen Verbindung und dem Komplex in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid zur Bildung von

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die carbonylhältige Verbindung Formaldehyd ist.

5. Verfahren zur chemischen Festphasen-Modifikation eines Peptids, umfassend folgende Schritte:

(a) Bereitstellung einer carbonylhältigen Verbindung der Formel

wobei R&sub6; und R&sub7; unabhängig voneinander Wasserstoff, eine verzweigt- oder geradkettige niedrige Alkylgruppe oder Arylgruppe sind; (b)Bereitstellung eines Komplexes der Formel

wobei X eine Schutzgruppe umfaßt, Y eine Festphase umfaßt und R&sub8;-NH&sub2; eine Seitengruppe von Lys, Ornithin oder Diaminobuttersäure ist;

(c) Reaktion zwischen der carbonylhaltigen Verbindung und dem Komplex in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid zur Bildung von

(d) Abspalten der Festphase zur Freigabe des Peptids; und

(e) Reinigung des Peptids.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die carbonylhaltige Verbindung Aceton ist.

7. Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei die R&sub8;-NH&sub2; Seitengruppe eine Seitengruppe von Lys ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin Y entweder allein eine Festphase darstellt oder eine Festphase, an welche bereits eine oder mehrere Aminosäuren sequentiell gebunden sind.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin X eine Schutzgruppe oder eine Schutzgruppe mit einer oder zwei Aminosäuren ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Festphase ein Harz ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Harz Chlormethyl-Harz oder Benzhydrylamin-Polystyrol-Harz ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, welches weiters den Schritt der Cyclisierung des Polypeptids umfaßt. (Reaktion bis negativer Kaiser-Test)

Abkürzungen:

TFA: Trifluoressigsäure

THF: Tetrahydrofuran

MeBzl: Methylbenzyl

Bzl: Benzyl

Cl-Z: 4-Chlorocabenzoxy

DMAP: 4-Dimethylaminipyridin

DCC: Dicyclohexylcarbodiimid

DIC: Diisopropylcarbodiimid

HF: Fluorwasserstoff

I-V: Reaktionsschritte

Fig. 1 (Reaktion bis negativer Kaiser-Test)

Abkürzungen:

TFA: Trifluoressigsäure

DIC: Diisopropylcarbodiimid

HP: Fluorwasserstoff

Tos: Tosyl

Bzl: Benzyl

Fig. 2

Abkürzungen:

FMOC: Fluorenylmethyloxycarbonyl

iPr: Epsilon-Isopropyl

Bzl: Benzyl

Fig. 3